WO2021060443A1 - 非対称分岐型分解性ポリエチレングリコール誘導体 - Google Patents

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宏樹 吉岡
順規 大坂間
西山　伸宏
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Tokyo Institute of Technology NUC
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    • C08G83/002—Dendritic macromolecules
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Definitions

  • the present invention relates to a branched degradable polyethylene glycol derivative that decomposes intracellularly and is used for modifying biological substances.
  • bio-related substances such as hormones, cytokines, antibodies, and enzymes are usually rapidly excreted from the body by glomerular filtration in the kidney and uptake by macrophages in the liver and spleen when administered into the body. It ends up. Therefore, the half-life in blood is short, and it is often difficult to obtain a sufficient pharmacological effect.
  • hydrophilic polymers such as sugar chains and polyethylene glycol, albumin, and the like.
  • modification with polyethylene glycol has effects such as reduction of toxicity and antigenicity of biorelated substances and improvement of solubility of poorly water-soluble drugs.
  • Bio-related substances modified with polyethylene glycol are covered with a hydration layer formed by ether bonds of polyethylene glycol and hydrogen bonds with water molecules, which increases the molecular size and thus avoids glomerular filtration in the kidneys. be able to. Furthermore, it is known that the interaction with opsonin and the cell surface constituting each tissue is reduced, and the transfer to each tissue is reduced. Polyethylene glycol is an excellent material that prolongs the half-life of biological substances in the blood, and it has been found that the higher the molecular weight, the higher the effect. So far, many studies have been conducted on bio-related substances modified with high molecular weight polyethylene glycol having a molecular weight of 40,000 or more, and the results have been obtained that the half-life in blood can be significantly extended.
  • Polyethylene glycol is regarded as the optimum standard among modifiers used to improve the performance of biological substances, and currently, multiple polyethylene glycol modified preparations have been put on the market and are used in medical practice.
  • EMA European Medicines Agency
  • Non-Patent Document 2 when a large excess amount of polyethylene glycol was administered alone to an animal for a long period of time as compared with the usual dose of a polyethylene glycol modified preparation, no vacuole was observed at a molecular weight of 20,000, and the molecular weight was 40,000. Occurrence of vacuoles has been confirmed in. As one of the means for suppressing vacuoles, it is conceivable to reduce the molecular weight of polyethylene glycol, but if the molecular weight is reduced, there arises a problem that the half-life of biological substances in blood cannot be sufficiently improved.
  • Patent Document 1 describes a polyethylene glycol derivative having a sulfide bond or a peptide bond site that is cleaved in a living body. There is a description that the polyethylene glycol derivative is decomposed in vivo to a molecular weight suitable for excretion from the kidney. However, no specific data on degradation have been shown, and there is no data that renal excretion was promoted. Furthermore, there is no description about cell vacuoles.
  • Patent Document 2 describes a polyethylene glycol derivative having an acetal moiety that can be hydrolyzed in a low pH environment in a living body. There is a description that the polyethylene glycol derivative is decomposed in vivo to a molecular weight suitable for excretion from the kidney. However, there is no specific data that the excretion from the kidney was promoted, and there is no description about cell vacuoles. Further, it is known that these acetal sites capable of hydrolysis are gradually decomposed even in blood, and it is expected that the half-life of the modified biological substance in blood cannot be sufficiently improved.
  • Non-Patent Document 3 describes a polyethylene glycol derivative having an oligopeptide site that is degraded by an enzyme.
  • the oligopeptide is introduced as a linker between the anticancer agent and polyethylene glycol, and it has been reported that the oligopeptide is decomposed by an enzyme specifically expressed around the tumor to efficiently release the anticancer agent.
  • the purpose is the release of anti-cancer agents, not the degradability of polyethylene glycol for the purpose of suppressing cell vacuoles.
  • Non-Patent Document 4 describes a hydrogel using a crosslinked molecule having an oligopeptide site that is decomposed by an enzyme and a multi-branched polyethylene glycol derivative.
  • the oligopeptide is used as a cross-linking molecule that connects multi-branched polyethylene glycol derivatives, and can further impart enzymatic degradability to the hydrogel.
  • the purpose is to prepare a degradable hydrogel, not to impart degradability to polyethylene glycol for the purpose of suppressing cell vacuoles.
  • Patent Document 3 describes a branched polyethylene glycol derivative having an oligopeptide as a skeleton.
  • the oligopeptide is used as the basic skeleton of the polyethylene glycol derivative, and does not impart enzymatic degradability.
  • oligopeptides are characterized by containing amino acids such as lysine and aspartic acid that have amino and carboxyl groups in their side chains, and the purpose is to synthesize branched polyethylene glycol derivatives that utilize them in the reaction. is there. It is not a polyethylene glycol derivative intended to suppress cell vacuoles.
  • polyethylene glycol derivatives used for modifying bio-related substances generally have a linear type and a branched type, and in Non-Patent Document 5, the branched type is significantly more bio-related than the linear type. There is a description that it prolongs the half-life in blood. In recent years, most of the polyethylene glycol modified preparations on the market have adopted the branched type. However, there have been no reports on branched polyethylene glycol derivatives that suppress cell vacuoles in this field.
  • An object of the present invention is to provide a high molecular weight branched polyethylene glycol derivative that does not cause cell vacuoles. More specifically, a branched degradable polyethylene glycol derivative that can be effectively used for modifying a biological substance, is stable in the blood in the living body, and is decomposed in the cell is industrially used. It is to be provided by a manufacturing method that can be produced in Japan.
  • the present inventors have invented a branched degradable polyethylene glycol derivative having an oligopeptide that decomposes intracellularly.
  • the present invention provides a branched degradable polyethylene glycol derivative represented by the following formula (1).
  • a branched degradable polyethylene glycol derivative represented by the following formula (1) which has an oligopeptide that decomposes intracellularly in the molecule.
  • k 1 and k 2 are independently 1 to 12, j 1 and j 2 are independently 45 to 950, respectively, R is a hydrogen atom, and the number of carbon atoms is 1 which is substituted or not substituted.
  • X is an active ester group, an active carbonate group, an aldehyde group, an isocyanate group, an isothiocyanate group, an epoxy group, a maleimide group, a vinylsulfonyl group, an acrylic group, a sulfonyloxy group, a carboxy group, a thiol group, a dithiopyridyl group,
  • the branched type according to any one of [1] to [5], which is selected from the group consisting of an ⁇ -haloacetyl group, an alkynyl group, an allyl group, a vinyl group, an amino group, an oxyamino group, a hydrazide group and an azide group.
  • Degradable polyethylene glycol derivative is an active ester group, an active carbonate group, an aldehyde group, an isocyanate group, an isothiocyanate group, an epoxy group, a maleimide group, a vinylsulfony
  • the present invention also provides, as another embodiment, a branched degradable polyethylene glycol derivative represented by the following formula (2).
  • a branched degradable polyethylene glycol derivative represented by the following formula (2) [6] A branched degradable polyethylene glycol derivative represented by the following formula (2).
  • k 1 and k 2 are independently 1 to 12, j 1 and j 2 are independently 45 to 950, respectively, R is a hydrogen atom, and the number of carbon atoms is 1 which is substituted or not substituted. It is an alkyl group of ⁇ 4, a substituted aryl group, an aralkyl group or a heteroalkyl group, W is an oligopeptide of 5 to 47 residues having a symmetrical structure centered on glutamate or lysine, and a is 2 to 8.
  • X is a functional group capable of reacting with a bio-related substance, and L 1 and L 2 are independently single-bonded or divalent spacers, respectively.
  • Q is a residue of glutamic acid or lysine
  • Z is a 2-5 residue degradable oligopeptide consisting of neutral amino acids excluding cysteine.
  • L 1 and L 2 independently contain a single bond, a urethane bond, an amide bond, an ether bond, a thioether bond, a secondary amino group, a urea bond, or a bond and / or group thereof.
  • X is an active ester group, an active carbonate group, an aldehyde group, an isocyanate group, an isothiocyanate group, an epoxy group, a maleimide group, a substituted maleimide group, a vinylsulfonyl group, an acrylic group, a substituted sulfonate group, a sulfonyloxy group and a carboxy group.
  • the branched degradable polyethylene glycol derivative of the present invention is stable in blood in vivo and has an oligopeptide in its structure that is degraded by intracellular enzymes. Therefore, the branched degradable polyethylene glycol derivative is stable in blood and can impart a half-life in blood equivalent to that of a conventional non-degradable polyethylene glycol derivative to a biological substance. Furthermore, when the branched degradable polyethylene glycol derivative is taken up into cells, the oligopeptide site is rapidly degraded, so that it is possible to suppress the generation of cell vacuoles, which has been a problem until now. it can. Further, by limiting the oligopeptide to be introduced into polyethylene glycol to an oligopeptide having glycine as a C-terminal amino acid, impurities generated in the production process can be reduced and industrial production becomes possible.
  • branched degradable polyethylene glycol derivative according to the present invention is represented by the following formula (1).
  • k 1 and k 2 are independently 1 to 12, j 1 and j 2 are independently 45 to 950, respectively, and R is a hydrogen atom, substituted or unsubstituted carbon. It is an alkyl group of numbers 1 to 12, a substituted aryl group, an aralkyl group or a heteroalkyl group, Z is an oligopeptide that is decomposed by an intracellular enzyme, X is a functional group that can react with a bio-related substance, and L. 1 and L 2 are independently single-bonded or divalent spacers, respectively.
  • the total molecular weight of the polyethylene glycol derivative of the formula (1) of the present invention is usually 4,000 to 160,000, preferably 10,000 to 120,000, and more preferably 20,000 to 80,000. Is.
  • the polyethylene glycol derivative of the formula (1) of the present invention has a total molecular weight of 20,000 or more.
  • the molecular weight referred to here is a number average molecular weight (Mn).
  • K 1 and k 2 in the formula (1) are usually 1 to 12 independently of each other, preferably 1 to 6 independently of each other, and more preferably 1 to 2 independently of each other.
  • J 1 and j 2 in the formula (1) are the number of repeating units of polyethylene glycol, respectively, and are usually 45 to 950 independently, preferably 110 to 690 independently, and more preferably 110 to 690, respectively. It is 220 to 480 independently.
  • R in the formula (1) is a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 12 carbon atoms which is not substituted or substituted, a substituted aryl group, an aralkyl group or a heteroalkyl group.
  • a "heteroalkyl group” is an alkyl group containing 1 to 5 heteroatoms selected from nitrogen, oxygen and sulfur atoms.
  • R is preferably a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, more preferably a hydrogen atom, a methyl group or an ethyl group, and further preferably a hydrogen atom.
  • L 1 and L 2 in the formula (1) are independently single-bonded or divalent spacers, respectively, but these spacers are not particularly limited as long as they are groups capable of forming a covalent bond, but are preferable. Is a phenylene group, an amide bond, an ether bond, a thioether bond, a urethane bond, a secondary amino group, a carbonyl group, a urea bond, or an alkylene group which may contain these bonds and / or a group, more preferably.
  • s in the equation indicates an integer of 0 to 10, preferably an integer of 0 to 6, and more preferably an integer of 0 to 3. Further, in (z2) to (z11), s in the equation may be the same or different.
  • L 1 in the formula (1) is a single bond or group (I) (z2), (z3), (z4), (z6), (z7), (z8), (z9), (z10), The combination of (z2) and (z6) is preferable, and the combination of single bond, (z3), (z6), (z9), (z10), (z2) and (z6) is more preferable.
  • L 2 in the formula (1) is (z1), (z2), (z3), (z4), (z5), (z6), (z7), (z8), (z11) of the group (I). Is preferable, and (z3), (z5), and (z11) are more preferable.
  • Z in the formula (1) is not particularly limited as long as it is an oligopeptide that is stable in the blood in the living body and decomposed by an intracellular enzyme, but is 2 to 8 residues consisting of neutral amino acids excluding cysteine.
  • the oligopeptide of the group is preferable, an oligopeptide of 2 to 6 residues consisting of a neutral amino acid excluding cysteine is more preferable, and an oligopeptide of 2 to 4 residues consisting of a neutral amino acid excluding cysteine is further preferable.
  • Z in the formula (1) may be an oligopeptide composed of an amino acid having an amino group or a carboxyl group in the side chain, specifically, a neutral amino acid containing no lysine, aspartic acid or glutamic acid. preferable.
  • the amino acid used here is an ⁇ -amino acid and is basically L-type.
  • Z in the formula (1) is an oligopeptide composed of a neutral amino acid containing no cysteine. It is desirable to have.
  • Z in the formula (1) is preferably an oligopeptide having glycine as a C-terminal amino acid.
  • glycine glycine
  • achiral glycine as the C-terminal amino acid of the oligopeptide, a high-purity target product without by-products of the stereoisomer can be obtained.
  • Z in the formula (1) is an oligopeptide having at least one hydrophobic neutral amino acid having a hydropathy index of 2.5 or more, specifically, phenylalanine, leucine, valine, and isoleucine. Is preferable, and an oligopeptide having phenylalanine is more preferable.
  • the hydropathy index which is created by Kyte and Doolittle and quantitatively indicates the hydrophobicity of amino acids, indicates that the larger the value, the more hydrophobic the amino acid (Kyte J & Doolittle RF, 1982, J Mol. Biol, 157: 105-132.).
  • Z in the formula (1) may be an oligopeptide having 2 to 8 residues consisting of neutral amino acids excluding cysteine, which is stable in the blood in the living body and has the ability to be decomposed by intracellular enzymes.
  • Alanin-glycine glycine-glycine-glycine, phenylalanine-glycine, etc., preferably glycine-phenylalanine-leucine-glycine, glycine-glycine-phenylalanine-glycine, glycine-phenylalanine-glycine, glycine-glycine, valine-citrulin.
  • valine-alanine-glycine valine-alanine-glycine, phenylalanine-glycine, more preferably glycine-phenylalanine-leucine-glycine, glycine-phenylalanine-glycine, valine-citrulin-glycine, valine-alanine-glycine, and even more preferably.
  • X in the formula (1) is particularly limited as long as it is a functional group that forms a covalent bond by reacting with a functional group existing in a biorelated substance such as a physiologically active protein, peptide, antibody, or nucleic acid to be chemically modified.
  • a biorelated substance such as a physiologically active protein, peptide, antibody, or nucleic acid to be chemically modified.
  • the "functional group capable of reacting with a bio-related substance” represented by X in the formula (1) is a functional group such as an amino group, a mercapto group, an aldehyde group, a carboxy group, an unsaturated bond or an azido group possessed by the bio-related substance. It is not particularly limited as long as it is a functional group capable of chemically bonding with.
  • Alkinyl group allyl group, vinyl group, amino group, oxyamino group, hydrazide group and azide group, more preferably active ester group, active carbonate group, aldehyde group, maleimide group, oxyamino group and amino group. Yes, particularly preferably an active ester group, an active carbonate group, an aldehyde group, a maleimide group and an oxyamino group.
  • such functional groups X can be classified into the following groups (II), group (III), group (IV), group (V), group (VI) and group (VII). it can.
  • Group (II) Functional groups capable of reacting with amino groups of biological substances The following (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (j) ), Or the group represented by (k).
  • Group (III) Functional groups capable of reacting with mercapto groups of bio-related substances The following (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h) ), (I), (j), (k), or (l).
  • Group (IV) Functional groups capable of reacting with aldehyde groups contained in biological substances Examples thereof include groups represented by (h), (m), (n), or (p) below.
  • Group (V) Functional group capable of reacting with a carboxyl group possessed by a biological substance Examples thereof include groups represented by (h), (m), (n), or (p) below.
  • Group (VI) Functional groups capable of reacting with unsaturated bonds of bio-related substances Examples thereof include groups represented by (h), (m), or (o) below.
  • Group (VII) Functional groups capable of reacting with azide groups possessed by biological substances Examples thereof include the groups represented by (l) below.
  • W 1 in the formula represents a halogen atom such as a chlorine atom (Cl), a bromine atom (Br) or an iodine atom (I), preferably Br, or I, more preferably I. ..
  • Y 1 and Y 3 in the formula independently represent a hydrogen atom or a hydrocarbon group having 1 to 5 carbon atoms, preferably 1 carbon atom. It is a hydrocarbon group of ⁇ 5. Specific examples of the hydrocarbon group having 1 to 5 carbon atoms include a methyl group, an ethyl group, a propyl group, an isopropyl group, a butyl group, a tertiary butyl group and the like, and a methyl group or an ethyl group is preferable. is there.
  • Y 2 in the formula represents a hydrocarbon group having 1 to 10 carbon atoms which may contain a fluorine atom, and specifically, a methyl group, an ethyl group, a propyl group, and the like.
  • Isopropyl group butyl group, tertiary butyl group, hexyl group, nonyl group, vinyl group, phenyl group, benzyl group, 4-methylphenyl group, trifluoromethyl group, 2,2,2-trifluoroethyl group, 4- Examples thereof include a (trifluoromethoxy) phenyl group, preferably a methyl group, a vinyl group, a 4-methylphenyl group, or a 2,2,2-trifluoroethyl group.
  • the active ester group is an ester group having an alkoxy group having a high desorption ability.
  • the alkoxy group having high desorption ability include an alkoxy group derived from nitrophenol, N-hydroxysuccinimide, pentafluorophenol and the like.
  • the active ester group is preferably an ester group having an alkoxy group derived from N-hydroxysuccinimide.
  • the active carbonate group is a carbonate group having an alkoxy group having a high desorption ability.
  • the alkoxy group having high desorption ability include an alkoxy group derived from nitrophenol, N-hydroxysuccinimide, pentafluorophenol and the like.
  • the active carbonate group is preferably a carbonate group having an alkoxy group derived from nitrophenol or N-hydroxysuccinimide.
  • the substituted maleimide group is a maleimide group in which a hydrocarbon group is bonded to one carbon atom of the double bond of the maleimide group.
  • a hydrocarbon group include a methyl group, an ethyl group, a propyl group, an isopropyl group, a butyl group, a tertiary butyl group and the like, and a methyl group or an ethyl group is preferable.
  • the substituted sulfonate group is a sulfonate group in which a hydrocarbon group which may contain a fluorine atom is bonded to the sulfur atom of the sulfonate group.
  • a hydrocarbon group which may contain a fluorine atom
  • the hydrocarbon group that may contain a fluorine atom include a methyl group, an ethyl group, a propyl group, an isopropyl group, a butyl group, a tertiary butyl group, a hexyl group, a nonyl group, a vinyl group, and a phenyl group.
  • Benzyl group 4-methylphenyl group, trifluoromethyl group, 2,2,2-trifluoroethyl group, 4- (trifluoromethoxy) phenyl group and the like, preferably methyl group, vinyl group, 4- It is a methylphenyl group or a 2,2,2-trifluoroethyl group.
  • branched degradable polyethylene glycol derivative of the formula (1) of the present invention include the following branched degradable polyethylene glycol derivatives.
  • k 1 and k 2 are 1 to 2 independently of each other; j 1 and j 2 are 220-480, respectively;
  • R is a hydrogen atom;
  • Z is a 2-8 residue oligopeptide consisting of neutral amino acids excluding cysteine (eg, phenylalanine-glycine);
  • X is an active ester group (eg, N-succinimidyloxycarbonyl group), an aldehyde group (eg, N- (formylethyl) carbamoyl group), a carboxyl group, a maleimide group (eg, N- (N-maleimi)).
  • L 1 and L 2 are alkylene groups (eg, propylene groups) that may independently contain a secondary amino group and / or a carbonyl group;
  • the branched degradable polyethylene glycol derivative represented by the formula (1) can be produced, for example, by the following steps.
  • a in Reaction 1 is a leaving group, and R, j 1 , k 1 , and k 2 are synonymous with the above.
  • a in the formula (3) is a leaving group, and is not particularly limited as long as it is a leaving group having a reactivity in the coupling reaction.
  • Chloromethanesulfonate group and the like are examples of the following groups.
  • reaction 1 the polyethylene glycol derivative represented by the formula (3) and the compound represented by the formula (4) are coupled in an anhydrous solvent in the presence of a strong base catalyst, and the polyethylene represented by the formula (5) is reacted. This is a step of obtaining a glycol derivative.
  • the strong base catalyst in the coupling reaction is not particularly limited as long as it is a strong base catalyst in which the reaction proceeds, and examples thereof include potassium hydroxide, sodium hydroxide, sodium methoxide, and sodium ethoxide.
  • the anhydrous solvent in the coupling reaction is not particularly limited as long as it is a solvent that does not react with the compounds represented by the formulas (3) and (4), and for example, tetrahydrofuran, acetonitrile, DMF, dichloromethane, chloroform and the like can be used. Examples include aprotic polar solvents and mixtures thereof. It is preferable to purify and remove impurities produced as a by-product in the reaction, compounds remaining unconsumed in the reaction, and a strong base catalyst. Purification is not particularly limited, but purification can be performed by extraction, recrystallization, adsorption treatment, reprecipitation, column chromatography, supercritical extraction and the like.
  • Pro in Reaction 2 is a protecting group
  • Peptide is an oligopeptide
  • L 3 is a single bond or divalent spacer synonymous with L 1 and L 2
  • j 2 is synonymous with the above.
  • Pro in Reaction 2 is a protecting group, where the protecting group is a component that prevents or prevents the reaction of a specific chemically reactive functional group in the molecule under certain reaction conditions.
  • Protecting groups vary depending on the type of chemically reactive functional group protected, the conditions used and the presence of other functional or protecting groups in the molecule. Specific examples of protecting groups can be found in many common books, such as "Wuts, P. G. M .; Greene, T. W. Protective Groups in Organic Synthesis, 4th ed .; Wiley. -Interscience: New York, 2007 ”. Further, the functional group protected by the protecting group can be regenerated by deprotecting, that is, chemically reacting with the reaction conditions suitable for each protecting group. Typical deprotection conditions for protecting groups are described in the aforementioned literature.
  • the protecting group for the N-terminal amino group of the oligopeptide is not particularly limited, and examples thereof include an acyl-based protecting group and a carbamate-based protecting group, specifically, a trifluoroacetyl group and 9-fluorenylmethyloxycarbonyl. Examples include a group (Fmoc), a tert-butyloxycarbonyl group and the like.
  • the condensation reaction is not particularly limited, but a reaction using a condensing agent is desirable.
  • a condensing agent such as dicyclohexylcarbodiimide (DCC) or 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) may be used alone, or N-hydroxysuccinimide may be used alone. It may be used in combination with a reagent such as (NHS), 1-hydroxybenzotriazole (HOBt), 1-hydroxy-7-azabenzotriazole (HOAt).
  • NHS 1-hydroxybenzotriazole
  • HOAt 1-hydroxy-7-azabenzotriazole
  • HATU HATU
  • HBTU HBTU
  • TATU TATU
  • TBTU TBTU
  • COMU 4- (4,6-dimethoxy-1,3,5-triazine-2-yl) -4-methylmorpholinium chloride n-hydrate.
  • a condensing agent such as (DMT-MM) may be used.
  • a base such as triethylamine or dimethylaminopyridine may be used.
  • Impurities produced as a by-product in the reaction, or oligopeptides and condensing agents remaining unconsumed in the reaction are preferably purified and removed. Purification is not particularly limited, but can be purified by extraction, recrystallization, adsorption treatment, reprecipitation, column chromatography, supercritical extraction and the like.
  • Peptide, L 3 and j 2 are synonymous with the above.
  • the deprotection 3 is a step of deprotecting the protecting group of the polyethylene glycol derivative represented by the formula (8) obtained in the reaction 2 to obtain the polyethylene glycol derivative represented by the formula (9).
  • the deprotection reaction can be a conventionally known method, it is necessary to use the conditions divalent spacer oligopeptide or L 3 is not decomposed. Further, this step can also be carried out as a part of the step of reaction 2.
  • Impurities produced by the deprotection reaction are preferably purified and removed. Purification is not particularly limited, but can be purified by extraction, recrystallization, adsorption treatment, reprecipitation, column chromatography, supercritical extraction and the like.
  • K 3 in Reaction 4 is an integer from 1 to 6, and Peptide, j 2 and L 3 are synonymous with the above.
  • K 3 in the formula (8) is an integer of 1 to 6, preferably an integer of 2 to 4.
  • Reaction 4 is a step of reacting the terminal amino group of the polyethylene glycol derivative represented by the formula (9) obtained by deprotection 3 with the compound represented by the formula (10) in the presence of a base catalyst to convert it into a carboxyl group. Is.
  • Purification is not particularly limited, but can be purified by extraction, recrystallization, adsorption treatment, reprecipitation, column chromatography, supercritical extraction and the like.
  • Peptide, L 3 , k 3 , and j 2 in Reaction 5 are synonymous with the above.
  • the polyethylene glycol derivative represented by the formula (11) obtained in the reaction 4 was reacted with the compound represented by the formula (12) in the presence of a base catalyst, and the active ester group was introduced into the reaction 5 according to the formula (13). It is a step of obtaining the polyethylene glycol derivative represented, and this step can also be carried out as a part of the step of Reaction 4.
  • Peptide, R, L 3 , j 1 , j 2 , k 1 , k 2 , and k 3 in Reaction 6 are synonymous with the above.
  • Impurities produced by the reaction or polyethylene glycol derivatives remaining unconsumed in the reaction are preferably purified and removed. Purification is not particularly limited, but purification can be performed by extraction, recrystallization, adsorption treatment, reprecipitation, column chromatography, supercritical extraction and the like.
  • the desired product when it is desired to convert the terminal carboxyl group of the polyethylene glycol derivative represented by the formula (15) into a maleimide group, the desired product can be obtained by subjecting it to a condensation reaction with N- (2-aminoethyl) maleimide in the presence of a base catalyst. Obtainable.
  • N- (9-H-fluorolen-9-ylmethoxycarbonyl) -1,2-ethanediamine and a base It can be obtained by conducting a condensation reaction in the presence of a catalyst and then performing a deprotection reaction.
  • reaction reagents are low molecular weight reagents and have significantly different solubility from polyethylene glycol derivatives which are high molecular weight polymers, they can be easily removed by general purification methods such as extraction and crystallization.
  • branched degradable polyethylene glycol derivative represented by the following formula (2) is provided.
  • k 1 and k 2 are independently 1 to 12, j 1 and j 2 are independently 45 to 950, respectively, and R is a hydrogen atom, substituted or unsubstituted carbon. It is an alkyl group of numbers 1 to 4, a substituted aryl group, an aralkyl group or a heteroalkyl group, W is an oligopeptide having a symmetrical structure centered on glutamate or lysine and has a symmetric structure of 5 to 47 residues, and a is 2 to 8.
  • X is a functional group capable of reacting with a bio-related substance
  • L 1 and L 2 are independently single-bonded or divalent spacers, respectively.
  • the total molecular weight of the polyethylene glycol derivative of the formula (2) of the present invention is usually 4,000 to 160,000, preferably 10,000 to 120,000, and more preferably 20,000 to 80,000. Is.
  • the polyethylene glycol derivative of the formula (2) of the present invention has a total molecular weight of 20,000 or more.
  • the molecular weight referred to here is a number average molecular weight (Mn).
  • K 1 and k 2 in the formula (2) are usually 1 to 12 independently of each other, preferably 1 to 6 independently of each other, and more preferably 1 to 2 independently of each other.
  • J 1 and j 2 in the formula (2) are the number of repeating units of polyethylene glycol, respectively, and are usually 45 to 950 independently of each other, preferably 110 to 690 independently of each other, and more preferably 110 to 690, respectively. It is 220 to 480 independently.
  • W in the formula (2) is an oligopeptide having a symmetrical structure centered on glutamic acid or lysine, with 5 to 47 residues, preferably 5 to 27 residues, more preferably 5 to 19 residues, and is in vivo.
  • the amino acids that make up the oligopeptide are those other than glutamic acid or lysine that make up the central part, except for cysteine. It preferably consists of sex amino acids.
  • the oligopeptide having a symmetrical structure centered on glutamate or lysine is a peptide having the same peptide as the ⁇ -position carboxyl group and ⁇ -position carboxyl group of glutamate or the ⁇ -position amino group and ⁇ -position amino group of lysine. It means a bound compound, and is an oligopeptide in which a pair of peptides centered on glutamate or lysine has a symmetrical structure.
  • the composition ratio (number of neutral amino acids / number of glutamic acid) between the number of neutral amino acids and the number of glutamic acid or lysine in the oligopeptide is usually 2 to 10, preferably 2 to 8, and even more preferably. It is 2 to 6.
  • the amino acids that make up W are basically L-type.
  • Q is a residue of glutamic acid or lysine
  • Z is a 2-5 residue degradable oligopeptide consisting of neutral amino acids excluding cysteine.
  • a in the formula (2) is the number of polyethylene glycol chains bound to the oligopeptide represented by W, usually 2 to 8, preferably 2 or 4 or 8, and more preferably 2. Or 4.
  • R, X, L 1 , L 2 and Z in (w1) to (w2) are as described in the above formula (1).
  • branched degradable polyethylene glycol derivative of the formula (2) of the present invention include the following branched degradable polyethylene glycol derivatives.
  • k 1 and k 2 are 1 to 2 independently of each other; j 1 and j 2 are 220-480, respectively;
  • R is a hydrogen atom;
  • W is a 5-9 residue oligopeptide with a symmetrical structure centered on glutamic acid or lysine (eg, glycine-phenylalanine-glutamic acid-phenylalanine-glycine); a is 2 or 4;
  • X is the carboxyl group;
  • L 1 and L 2 are alkylene groups (eg, propylene group, pentylene group) which may independently contain an ether bond, a secondary amino group and / or a carbonyl group;
  • a branched degradable polyethylene glycol derivative of the formula (2) are alkylene groups (eg, propylene group, pentylene group) which may independently contain an
  • the branched degradable polyethylene glycol derivative of the present invention can be produced, for example, by the following steps when Q is a residue of glutamic acid.
  • Reaction 7 has two carboxyls, an amino group of the polyethylene glycol derivative represented by the formula (9) obtained by deprotection 3 and a glutamate derivative in which the amino group represented by the formula (17) is protected by a protecting group.
  • This is a step of bonding groups by a condensation reaction to obtain a branched polyethylene glycol derivative represented by the formula (18), which has a structure in which two degradable polyethylene glycol chains are linked by glutamate residues.
  • a reaction using a condensing agent is desirable, and in order to accelerate the reaction, a base such as triethylamine or dimethylaminopyridine may be used.
  • the protecting group for the amino group of glutamic acid is not particularly limited, and examples thereof include an acyl-based protecting group and a carbamate-based protecting group, and specific examples thereof include a trifluoroacetyl group, a 9-fluorenylmethyloxycarbonyl group and a t-. Examples include a butyloxycarbonyl group.
  • Impurities produced as a by-product in the reaction or polyethylene glycol derivatives remaining unconsumed in the reaction are preferably purified and removed. Purification is not particularly limited, but can be purified by extraction, recrystallization, adsorption treatment, reprecipitation, column chromatography, supercritical extraction and the like.
  • the deprotection 8 is a step of deprotecting the protecting group of the polyethylene glycol derivative represented by the formula (18) obtained in the reaction 7 to obtain the polyethylene glycol derivative represented by the formula (19).
  • the reaction and purification are possible under the same conditions as the deprotection 3.
  • the purification techniques described in JP-A-2014-208786 and JP-A-2011-79934 are used. Can be done.
  • the amino group of the polyethylene glycol derivative represented by the formula (19) obtained by deprotection 8 and the glutamate derivative in which the amino group represented by the formula (17) is protected by a protecting group are two carboxyls.
  • the reaction and purification are possible under the same conditions as in Reaction 2.
  • the deprotection 10 is a step of deprotecting the protecting group of the polyethylene glycol derivative represented by the formula (20) obtained in the reaction 9 to obtain the polyethylene glycol derivative represented by the formula (21).
  • the reaction and purification are possible under the same conditions as the deprotection 8. Further, this step can also be carried out in a series of steps of reaction 9.
  • Peptide, L 3 , j 2 and k 3 in Reaction 11 are synonymous with the above.
  • a tetrabranched polyethylene glycol derivative represented by the formula (21) obtained by deprotection 10 is used as a raw material.
  • a 4-branched polyethylene glycol derivative represented by the following formula (24) can be obtained.
  • Peptide, L 3 , j 2 and k 3 of the formula (24) are synonymous with the above.
  • Peptide, L 3 , j 2 and k 3 in Reaction 12 are synonymous with the above.
  • reaction 12 the hydroxyl group of the bifurcated polyethylene glycol derivative represented by the formula (23) obtained in the reaction 11 was reacted with the compound represented by the formula (25), and the active carbonate group was introduced into the reaction 12 (26). It is a step of obtaining the bifurcated polyethylene glycol derivative represented by the above, and this step can be carried out as a part of the affirmation of the reaction 11, and the reaction and purification can be carried out under the same conditions as the reaction 5.
  • Peptide, L 3 , j 2 and k 3 of the formula (27) are synonymous with the above.
  • Peptide, R, L 3 , j 1 , j 2 , k 1 , k 2 and k 3 in Reaction 13 are synonymous with the above.
  • Peptide, R, L 3 , j 1 , j 2 , k 1 , k 2 and k 3 in formula (29) are synonymous with the above.
  • the terminal carboxyl group of the branched polyethylene glycol derivative represented by the formula (28) or the formula (29) into a maleimide group it is condensed with N- (2-aminoethyl) maleimide in the presence of a base catalyst. By reacting, the desired product can be obtained.
  • N- (9-H-fluorolen-9-ylmethoxycarbonyl) -1, 2 -It can be obtained by conducting a condensation reaction with ethanediamine in the presence of a base catalyst and then performing a deprotection reaction.
  • reaction reagents are low molecular weight reagents and have significantly different solubility from polyethylene glycol derivatives which are high molecular weight polymers, they can be easily removed by general purification methods such as extraction and crystallization. ..
  • the branched degradable polyethylene glycol obtained through the above steps is required to be stable in blood and have the ability to decompose only intracellularly.
  • the following tests can be carried out to evaluate the stability of branched degradable polyethylene glycol in blood and its degradability in cells.
  • all the evaluation samples were unified to the polyethylene glycol derivative having one amino group.
  • the test method for evaluating the stability of the branched degradable polyethylene glycol derivative in blood is not particularly limited, and examples thereof include tests using sera of mice, rats, humans and the like.
  • the polyethylene glycol derivative is dissolved in serum to a concentration of 1 to 10 mg / mL, incubated at 37 ° C. for 96 hours, and then the polyethylene glycol derivative contained in the serum is recovered and GPC is measured.
  • the decomposition rate can be evaluated with.
  • the decomposition rate is calculated from the peak area% of the GPC membrane of the polyethylene glycol derivative before the stability test and the peak area% of the GPC membrane of the polyethylene glycol derivative after the stability test. Specifically, the following formula is used.
  • Decomposition rate (Peak area% before test-Peak area% after test) ⁇ Peak area% before test x 100
  • the test method for evaluating the intracellular degradability of the branched degradable polyethylene glycol derivative is not particularly limited, but for example, a medium containing the branched degradable polyethylene glycol derivative is used in the cells.
  • Examples include a test for culturing.
  • the cells and medium used here are not particularly limited, but specifically, a polyethylene glycol derivative is dissolved in RPMI-1640, which is a medium, so as to have a concentration of 1 to 20 mg / mL, and this medium is used.
  • RPMI-1640 which is a medium, so as to have a concentration of 1 to 20 mg / mL, and this medium is used.
  • the decomposition rate is calculated by using the peak area% of the GPC membrane of the polyethylene glycol derivative before and after the test, as in the stability test. For example, suppose that the peak area% of the GPC membrane of the branched degradable polyethylene glycol derivative before the degradability test using cells was 95%, and the peak area% of the GPC membrane after the test was 5%.
  • Non-Patent Document 2 describes that the vacuolation of cells by high molecular weight polyethylene glycol is related to the accumulation of polyethylene glycol in tissues.
  • the test method for evaluating the accumulation of the degradable polyethylene glycol derivative in cells is not particularly limited, but can be evaluated based on the above-mentioned intracellular degradability.
  • the 1 H-NMR obtained in the following examples was obtained from JNM-ECP400 or JNM-ECA600 manufactured by JEOL Datum Co., Ltd.
  • the deuterated solvent using CDCl 3 and d 6-DMSO containing tetramethylsilane (TMS) as D 2 O, or internal standard.
  • TMS tetramethylsilane
  • the molecular weight and terminal functional group purity of the obtained polyethylene glycol derivative were calculated using liquid chromatography (GPC and HPLC).
  • GPC and HPLC liquid chromatography
  • “HLC-8320GPC EcoSEC” manufactured by Tosoh Corporation was used for GPC
  • "ALLIANCE" manufactured by WATERS Co., Ltd. was used for HPLC.
  • Average molecular weight 20,000, "SUNBRIGHT MEH-20T" (manufactured by Nichiyu Co., Ltd.) (10 g) was dissolved in toluene (40 g), dehydrated by reflux at 110 ° C. for 1 hour, cooled to 40 ° C., and triethylamine (80 mg). ), Methanesulfonyl chloride (84 mg) was added, and the mixture was reacted at 40 ° C. for 3 hours. After completion of the reaction, the mixture was diluted with toluene (100 g), hexane (100 g) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 30 minutes to precipitate the product.
  • the precipitate was collected by suction filtration using a 5A filter paper, dissolved in ethyl acetate (200 g), hexane (100 g) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 15 minutes to precipitate the product.
  • the precipitate was collected by suction filtration using a 5A filter paper, washed with hexane (100 g), suction filtered using a 5A filter paper, and vacuum dried to obtain compound (p1). Yield 8.9g.
  • Example 1-4 The compound (p4) (6.0 g), sodium acetate (49 mg), and glutaric anhydride (51 mg) obtained in Example 1-4 were dissolved in toluene (25 g), and the mixture was dissolved in toluene (25 g) at 40 ° C. for 7 hours in a nitrogen atmosphere. It was reacted. After completion of the reaction, the mixture was diluted with toluene (20 g), suction filtered using a 5A filter paper, hexane (30 g) was added to the obtained filtrate, and the mixture was stirred at room temperature for 15 minutes to precipitate the product. The precipitate was collected by suction filtration using a 5A filter paper.
  • the obtained precipitate was dissolved in ethyl acetate (100 g), hexane (50 g) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 15 minutes to precipitate the product.
  • the precipitate was collected by suction filtration using a 5A filter paper, washed with hexane (50 g), suction filtered using a 5A filter paper, and vacuum dried to obtain the above compound (p5). Yield 4.8g.
  • Example 1-5 The compound (p5) (4.5 g) and N-hydroxysuccinimide (103 mg) obtained in Example 1-5 were dissolved in toluene (25 g). Then, dicyclohexylcarbodiimide (139 mg) was added, and the mixture was reacted at 40 ° C. under a nitrogen atmosphere for 3 hours. After completion of the reaction, toluene (50 g) was added to dilute the mixture, suction filtration was performed using a 5A filter paper, hexane (50 g) was added to the obtained filtrate, and the mixture was stirred at room temperature for 15 minutes to precipitate the product. It was.
  • the concentrate was dissolved in ethyl acetate (100 g), hexane (50 g) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 15 minutes to precipitate the product.
  • the precipitate was collected by suction filtration using a 5A filter paper, then dissolved again in ethyl acetate (100 g), hexane (50 g) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 15 minutes to precipitate the product.
  • suction filtration using 5A filter paper to collect the precipitate it is washed with hexane (50 g) containing 2,6-di-tert-butyl-p-cresol (BHT) (10 mg) and 5A filter paper.
  • BHT 2,6-di-tert-butyl-p-cresol
  • Example 1-7 The compound (p7) (300 mg) obtained in Example 1-7 was dissolved in acetonitrile (2 g). Then, N-hydroxysuccinimide (6 mg) and dicyclohexylcarbodiimide (6 mg) were added, and the mixture was reacted at 40 ° C. under a nitrogen atmosphere for 3 hours. Then, triethylamine (3 mg) and N- (2-aminoethyl) maleimide hydrochloride (5 mg) were added, and the mixture was reacted at 40 ° C. under a nitrogen atmosphere for 3 hours.
  • Example 1-7 The compound (p7) (800 mg) obtained in Example 1-7 was dissolved in toluene (7 g) by heating at 40 ° C., then 3-aminopropionaldehyde diethyl acetal (9 mg) was added, and the temperature was 50 ° C. The reaction was carried out in a nitrogen atmosphere for 2 hours. After completion of the reaction, ethyl acetate (100 g) was added, the mixture was stirred until uniform, hexane (50 g) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 15 minutes to precipitate the product.
  • Example 5-1 The compound (p11) (600 mg) obtained in Example 5-1 was dissolved in a phosphate buffer solution (6.0 g) adjusted to pH 1.90, and reacted at room temperature in a nitrogen atmosphere for 3 hours. After the reaction, a 0.1N aqueous sodium hydroxide solution was added to adjust the pH to 6.5, and then sodium chloride (1.5 g) was added and dissolved. A 0.1N aqueous sodium hydroxide solution was added to the obtained solution to adjust the pH to 7.10, then chloroform (10 g) containing BHT (2 mg) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 20 minutes to form an organic layer. The product was extracted in.
  • chloroform (20 g) containing BHT (4 mg) was added to the aqueous layer again, and the mixture was stirred at room temperature for 20 minutes to extract the product into the organic layer. ..
  • the organic layers obtained in the first and second extractions were combined and concentrated at 40 ° C., the obtained concentrate was dissolved in ethyl acetate (50 g), hexane (30 g) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 15 minutes. The product was precipitated.
  • the reaction solution was diluted with toluene (80 g), hexane (40 g) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 15 minutes to precipitate the product.
  • suction filtration using 5A filter paper to collect the precipitate it was dissolved again in toluene (100 g), hexane (50 g) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 15 minutes to precipitate the product.
  • suction filtration using a 5A filter paper to collect the precipitate the mixture was washed with hexane (50 g) containing BHT (10 mg), suction filtered using a 5A filter paper, and vacuum dried to obtain the above compound (p13). Obtained. Yield 1.6g.
  • ⁇ -Caprolactone (114 mg) was dissolved in 1N NaOH (0.8 mL) and reacted for 2 hours to prepare an aqueous 6-hydroxycaproic acid solution (0.88 M). Further, the compound (p13) (1.5 g) obtained in Example 6-1 was dissolved in acetonitrile (6 g). Then, the above 6-hydroxycaproic acid aqueous solution (80 ⁇ L), diisopropylethylamine (15 mg) and DMT-MM (16 mg) were added, and the mixture was reacted at room temperature in a nitrogen atmosphere for 1 hour. After completion of the reaction, the reaction solution was concentrated at 40 ° C., and chloroform (30 g) was added to the obtained concentrate to dissolve it.
  • a saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution (15 g) was added, and the mixture was washed by stirring at room temperature for 15 minutes. After separating the aqueous layer and the organic layer, a saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution (15 g) was added to the organic layer again, and the mixture was washed by stirring at room temperature for 15 minutes to recover the organic layer.
  • Magnesium sulfate (5 g) was added to the obtained chloroform solution, and the mixture was stirred for 30 minutes to dehydrate, and then suction filtration was performed using a 5A filter paper.
  • the obtained filtrate was concentrated at 40 ° C., ethyl acetate (50 g) was added to the concentrate and stirred to make it uniform, then hexane (25 g) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 15 minutes to produce the product. Was precipitated.
  • the precipitate was collected by suction filtration using a 5A filter paper, then dissolved again in ethyl acetate (50 g), hexane (25 g) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 15 minutes to precipitate the product.
  • Example 6-2 The compound (p14) (500 mg) obtained in Example 6-2 was dissolved in dichloromethane (3.5 g). Then, di (N-succinimidyl) (51 mg) and pyridine (20 mg) were added, and the mixture was reacted at room temperature in a nitrogen atmosphere for 8 hours. After completion of the reaction, the reaction solution was washed with 5% saline (5 g), magnesium sulfate (0.1 g) was added, the mixture was stirred at 25 ° C. for 30 minutes, and then suction filtration was performed using a 5A filter paper.
  • the obtained filtrate was concentrated, ethyl acetate (100 g) was added to the concentrate to dissolve it, hexane (50 g) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 15 minutes to precipitate the product. After suction filtration using a 5A filter paper to collect the precipitate, the mixture was washed with hexane (25 g) containing BHT (5 mg), suction filtered using a 5A filter paper, and vacuum dried to obtain the above compound (p15). It was. Yield 286 mg.
  • Active carbonate purity is 91% ( 1 1 H-NMR) 1 H-NMR (CDCl 3) : 1.38ppm (m, 2H, Succinimide-OCO-CH 2 -CH 2 - CH 2 -CH 2 -CH 2 -CO-NH -), 1.59ppm (m, 2H, succinimide-OCO-CH 2 -CH 2 -CH 2 - CH 2 -CH 2 -CO-NH -), 1.75ppm (m, 6H), 1.85ppm (m, 1H), 2.13ppm (m, 2H , succinimide-OCO-CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 2 - CH 2 -CO-NH -), 2.83ppm (s, 4H, -CO- CH 2 -CH 2 -CO -), 3.01ppm (m, 1H), 3.19ppm ( m, 6H), 3.38ppm (s, 6H, -CO-NH-CH 2 -CH 2 -CH 2
  • the concentrate was dissolved in ethyl acetate (100 g), hexane (50 g) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 15 minutes to precipitate the product. After suction filtration using a 5A filter paper to collect the precipitate, the mixture was washed with hexane (20 g) containing BHT (4 mg), suction filtered using a 5A filter paper, and vacuum dried to obtain the above compound (p16). Obtained. Yield 242 mg.
  • Example 8 Stability test in serum 1 mL of mouse or human serum was added to a 1.5 mL Eppendorf tube, and the compound (p8) which is a branched degradable polyethylene glycol derivative obtained in Example 2 was prepared in Comparative Example 1-2.
  • the compound (p18), which is a non-degradable polyethylene glycol derivative obtained in the above, and methoxyPEGamine 40 kDa were added at a concentration of 5.0 mg / mL, respectively. After incubation at 37 ° C. for 96 hours, 200 ⁇ L was sampled, acetonitrile was added thereto, and the mixture was stirred with vortex for 1 minute to precipitate proteins in serum, centrifuged, and the supernatant was recovered.
  • the compound (p8) which is a branched degradable polyethylene glycol derivative is decomposed in serum like the compound (p18) which is a non-degradable polyethylene glycol derivative and methoxyPEGamine 40 kDa. I could't. That is, it was shown that the degradable polyethylene glycol derivative is stable in blood.
  • Example 9 Degradability test using cells Using 10 mL of medium RPMI-1640 (10% FBS Pn / St), RAW264.7 was seeded on a 100 mm dish in 10 ⁇ 106 cells, cultured at 37 ° C. for 24 hours, and then obtained in Example 2.
  • the cells After culturing, the cells are dissolved in 1% SDS solution, diluted with PBS, acetonitrile is added thereto, and the mixture is stirred with vortex for 1 minute to precipitate proteins in the cell lysate, centrifuged, and then above. Qing was recovered. Next, in order to remove hydrophobic substances such as fatty acids, hexane was added to the recovery liquid, the mixture was stirred with a vortex for 1 minute, centrifuged, and the lower layer was recovered. This solution was concentrated under vacuum conditions to recover the polyethylene glycol derivative from the cells.
  • the branched degradable polyethylene glycol derivative of the present invention is a high molecular weight polyethylene glycol derivative that does not cause cell vacuoles, and can be effectively used for modifying bio-related substances in the blood in the living body. It is stable and is degraded intracellularly.

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Abstract

細胞の空胞を引き起こさない高分子量の分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体を提供すること。細胞内にて分解するオリゴペプチドを分子内に有する下式（１）で示される分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体。 （式中、ｋ１およびｋ２はそれぞれ独立して１～１２であり、ｊ１及びｊ２はそれぞれ独立して４５～９５０であり、Ｒは水素原子、置換もしくは置換されていない炭素数１～１２のアルキル基、置換アリール基、アラルキル基またはヘテロアルキル基であり、Ｚは細胞内の酵素で分解するオリゴペプチドであり、Ｘは生体関連物質と反応可能な官能基であり、Ｌ１及びＬ２はそれぞれ独立して単結合もしくは２価のスペーサーである。）

Description

非対称分岐型分解性ポリエチレングリコール誘導体
　本発明は、生体関連物質を修飾する用途に使用される細胞内で分解する分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体に関する発明である。
　ホルモンやサイトカイン、抗体、酵素などの生体関連物質を用いた医薬品は、通常生体内へ投与されると腎臓における糸球体濾過や肝臓や脾臓などにおけるマクロファージによる取り込みによって、生体内から速やかに排出されてしまう。そのため血中半減期が短く、十分な薬理効果を得ることが困難であることが多い。この問題を解決するため、生体関連物質を糖鎖やポリエチレングリコールなどの親水性高分子やアルブミンなどによって化学修飾する試みが行われている。その結果、分子量の増大や水和層の形成などにより生体関連物質の血中半減期を延長することが可能となる。また、ポリエチレングリコールで修飾することで、生体関連物質の毒性や抗原性の低下、難水溶性薬剤の溶解性向上などの効果が得られることも良く知られている。
　ポリエチレングリコールで修飾された生体関連物質は、ポリエチレングリコールのエーテル結合と水分子との水素結合で形成される水和層で覆われ、分子サイズが大きくなることから、腎臓における糸球体濾過を回避することができる。さらにオプソニンや各組織を構成する細胞表面との相互作用が低下し、各組織への移行が減少することが知られている。ポリエチレングリコールは生体関連物質の血中半減期を延長させる優れた素材であり、その性能は分子量が大きいほど効果が高いことが分っている。これまで、分子量４万以上の高分子量のポリエチレングリコールで修飾した生体関連物質の研究が多数行なわれており、有意にその血中半減期を延長できる結果が得られている。
　ポリエチレングリコールは生体関連物質の性能改善に用いられる修飾剤の中で至適基準とされており、現在ではポリエチレングリコール修飾製剤が複数上市され、医療現場で使用されている。一方で、2012年に欧州医薬品庁(EMA)から、分子量４万以上の高分子量のポリエチレングリコールで修飾した生体関連物質を一定の投与量以上で長期間動物に投与すると、一部の組織の細胞内に空胞が発生するとの現象が報告された(非特許文献１)。現時点において、空胞の発生自体が人体に悪影響を与えるとの報告はなく、また、先のEMAの報告において用いられた投与量は、医療現場において一般的に適用される投与量と比べて極めて高用量であること等を考慮すれば、現在製造販売されている分子量が４万以上のポリエチレングリコールで修飾された治療製剤の安全性は問題ないといえる。しかしながら、非常に特殊な疾患（例えば、小人症など）の治療においては、ポリエチレングリコール修飾製剤を高用量、且つ、長期間に患者へ投与する治療プロトコルが採用されることも想定され得る。従って、かかる特殊な状況においても適用可能な、細胞に空胞を発生させないポリエチレングリコール修飾製剤の開発には潜在的な需要があると予想される。
　非特許文献２においては、通常のポリエチレングリコール修飾製剤の投与量に比べ、大過剰量のポリエチレングリコールを単独で動物に長期間投与したところ、分子量２万では空胞は見られず、分子量４万において空胞の発生が確認されている。空胞を抑制する手段の一つとして、ポリエチレングリコールの分子量を小さくすることが考えられるが、分子量を小さくすると生体関連物質の血中半減期を十分に改善することができないという問題が生じる。
　高分子量のポリエチレングリコールを体内で低分子量のポリエチレングリコールに分解し、腎臓からの排出を促進する技術については報告例がある。特許文献１には、生体内で切断されるスルフィド結合やペプチド結合部位を有したポリエチレングリコール誘導体に関する記載がなされている。当該ポリエチレングリコール誘導体は、生体内で腎臓からの排出に適した分子量まで分解されるとの記載がある。しかし、具体的な分解に関するデータは全く示されておらず、腎臓からの排出が促進されたというデータもない。さらに細胞の空胞に関する記載はない。
　特許文献２には、生体内の低pH環境下において加水分解可能なアセタール部位を有したポリエチレングリコール誘導体に関する記載がなされている。当該ポリエチレングリコール誘導体は、生体内で腎臓からの排出に適した分子量まで分解されるとの記載がある。しかし、具体的に腎臓からの排出が促進されたというデータは無く、さらに細胞の空胞に関する記載もない。また、これら加水分解が可能なアセタール部位は血中でも徐々に分解することが知られており、修飾した生体関連物質の血中半減期を十分に改善することができないと予想される。
　一方で、薬物を効果的にリリースするために分解性のオリゴペプチドを導入したポリエチレングリコール誘導体や体内で分解するハイドロゲルなどの報告例はある。
　非特許文献３には、酵素によって分解するオリゴペプチド部位を有したポリエチレングリコール誘導体に関する記載がなされている。ここではオリゴペプチドは抗癌剤とポリエチレングリコールの間のリンカーとして導入されており、腫瘍周辺に特異的に発現している酵素によってオリゴペプチドが分解し、効率よく抗癌剤をリリースすることが報告されている。目的は抗癌剤のリリースであり、細胞の空胞を抑制する目的でポリエチレングリコールに分解性を付与するものではない。
　非特許文献４には、酵素によって分解するオリゴペプチド部位を有した架橋分子と多分岐型のポリエチレングリコール誘導体を用いたハイドロゲルに関する記載がなされている。ここではオリゴペプチドは多分岐型のポリエチレングリコール誘導体を繋ぎ合わせる架橋分子として用いられ、さらに酵素による分解性をハイドロゲルに付与することができる。目的は分解性のハイドロゲルの調製であり、細胞の空胞を抑制する目的でポリエチレングリコールに分解性を付与するものではない。
　特許文献３には、オリゴペプチドを骨格とした分岐型のポリエチレングリコール誘導体に関する記載がなされている。ここではオリゴペプチドはポリエチレングリコール誘導体の基本骨格として用いられており、酵素による分解性を付与するものではない。また、オリゴペプチドにリジンやアスパラギン酸など、側鎖にアミノ基やカルボキシル基を有したアミノ酸を含むことが特徴であり、それらを反応に利用した分岐型のポリエチレングリコール誘導体を合成することが目的である。細胞の空胞を抑制する目的のポリエチレングリコール誘導体ではない。
　さらに生体関連物質を修飾する用途に用いられるポリエチレングリコール誘導体においては、一般的に直鎖型と分岐型があり、非特許文献５には、直鎖型よりも分岐型のほうが有意に生体関連物質の血中半減期を延長させるとの記載がある。近年、上市されたポリエチレングリコール修飾製剤のほとんどは分岐型が採用されている。しかし、これまで当該分野において、細胞の空胞を抑制する分岐型のポリエチレングリコール誘導体に関する報告はない。
　以上のように、血中では安定で、修飾した生体関連物質の血中半減期を改善し、細胞に取り込まれた際に細胞内で特異的に分解して、細胞の空胞の発生を抑制することができる分岐型の高分子量のポリエチレングリコール誘導体が求められている。
特表２００９－５２７５８１号公報 ＷＯ２００５／１０８４６３ ＷＯ２００６／０８８２４８
EMA/CHMP/SWP/647258/2012 Daniel G. Rudmann, et al., Toxicol. Pathol., 41, 970－983(2013) Francesco M Veronese, et al., Bioconjugate Chem., 16, 775－784(2005) Jiyuan Yang, et al., Marcomol. Biosci., 10(4), 445－454(2010) Yulia Vugmeysterang, et al., Bioconjugate Chem., 23, 1452－1462(2012)
　本発明の課題は、細胞の空胞を引き起こさない高分子量の分岐型ポリエチレングリコール誘導体を提供することにある。より具体的には、生体関連物質を修飾する用途に効果的に用いることができ、生体内の血中で安定であり、且つ細胞内で分解される分岐型分解性ポリエチレングリコール誘導体を、工業的に生産可能な製法にて提供することにある。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、細胞内にて分解するオリゴペプチドを有した分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体を発明した。
　即ち、本発明は、下式（１）で示される分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体を提供する。
　［１］細胞内にて分解するオリゴペプチドを分子内に有する下式（１）で示される分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
（式中、ｋ１およびｋ２はそれぞれ独立して１～１２であり、ｊ１及びｊ２はそれぞれ独立して４５～９５０であり、Ｒは水素原子、置換もしくは置換されていない炭素数１～１２のアルキル基、置換アリール基、アラルキル基またはヘテロアルキル基であり、Ｚは細胞内の酵素で分解するオリゴペプチドであり、Ｘは生体関連物質と反応可能な官能基であり、Ｌ１及びＬ２はそれぞれ独立して単結合もしくは２価のスペーサーである。）
　［２］Ｚの分解性オリゴペプチドが、Ｃ末端のアミノ酸としてグリシンを有するオリゴペプチドである［１］記載の分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
　［３］Ｚの分解性オリゴペプチドが、ハイドロパシー指標が２．５以上である疎水性の中性アミノ酸を少なくとも１つ有するオリゴペプチドである［１］～［２］のいずれか１項記載の分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
　［４］総分子量が２０，０００以上である［１］～［３］のいずれか１項記載の分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
　［５］Ｌ１及びＬ２がそれぞれ独立して、単結合、ウレタン結合、アミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、２級アミノ基、ウレア結合、またはこれらの結合および／または基を含んでいてもよいアルキレン基である［１］～［４］のいずれか１項記載の分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
　［６］Ｘが活性エステル基、活性カーボネート基、アルデヒド基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、エポキシ基、マレイミド基、ビニルスルホニル基、アクリル基、スルホニルオキシ基、カルボキシ基、チオール基、ジチオピリジル基、α－ハロアセチル基、アルキニル基、アリル基、ビニル基、アミノ基、オキシアミノ基、ヒドラジド基およびアジド基よりなる群から選択される、［１］～［５］のいずれか１項記載の分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
　本発明はまた、他の態様として、下式（２）で示される分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体を提供する。
　［６］下式（２）で示される分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
（式中、ｋ１およびｋ２はそれぞれ独立して１～１２であり、ｊ１及びｊ２はそれぞれ独立して４５～９５０であり、Ｒは水素原子、置換もしくは置換されていない炭素数１～４のアルキル基、置換アリール基、アラルキル基またはヘテロアルキル基であり、Ｗはグルタミン酸またはリジンを中心とした対称構造の５～４７残基のオリゴペプチドであり、ａは２～８であり、Ｘは生体関連物質と反応可能な官能基であり、Ｌ１及びＬ２はそれぞれ独立して単結合もしくは２価のスペーサーである。）
　［７］Ｗのグルタミン酸またはリジンを中心とした対称構造のオリゴペプチドが、以下のｗ１またはｗ２の構造を有するオリゴペプチドである［６］記載の分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
（式中、Ｑはグルタミン酸またはリジンの残基であり、およびＺはシステインを除く中性アミノ酸からなる２～５残基の分解性オリゴペプチドである。）
　［８］Ｚの分解性オリゴペプチドが、Ｃ末端のアミノ酸としてグリシンを有するオリゴペプチドである［７］記載の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
　［９］Ｚの分解性オリゴペプチドが、ハイドロパシー指標が２．５以上である疎水性の中性アミノ酸を少なくとも1つ有するオリゴペプチドである［７］または［８］のいずれか１項記載の分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
　［１０］総分子量が２０，０００以上である［６］～［９］のいずれかに記載の分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
　［１１］Ｌ１およびＬ２がそれぞれ独立して、単結合、ウレタン結合、アミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、２級アミノ基、ウレア結合、またはこれらの結合および／または基を含んでいてもよいアルキレン基である［６］～［１０］のいずれか１項記載の分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
　［１２］Ｘが活性エステル基、活性カーボネート基、アルデヒド基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、エポキシ基、マレイミド基、置換マレイミド基、ビニルスルホニル基、アクリル基、置換スルホネート基、スルホニルオキシ基、カルボキシ基、メルカプト基、ピリジルジチオ基、α－ハロアセチル基、アルキルカルボニル基、ヨードアセトアミド基、アルケニル基、アルキニル基、置換アルキニル基、アミノ基、オキシアミノ基、ヒドラジド基およびアジド基からなる群より選択される、［６］～［１１］のいずれか１項記載の分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
　本発明の分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体は、生体内の血中では安定であり、細胞内の酵素によって分解するオリゴペプチドを構造内に有している。そのため、当該分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体は、血中では安定であり、従来の分解性を有さないポリエチレングリコール誘導体と同等の血中半減期を生体関連物質に付与することができる。さらに、当該分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体は、細胞内に取り込まれた場合、オリゴペプチド部位が速やかに分解されるため、これまで課題とされていた細胞の空胞の発生を抑制することができる。また、ポリエチレングリコールに導入するオリゴペプチドを、Ｃ末端のアミノ酸としてグリシンを有するオリゴペプチドなどに限定することで、製造工程中で発生する不純物を低減させ、工業的に製造することが可能となる。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明に係る分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体は、下式（１）で示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　式（１）中、ｋ１およびｋ２はそれぞれ独立して１～１２であり、ｊ１及びｊ２はそれぞれ独立して４５～９５０であり、Ｒは水素原子、置換もしくは置換されていない炭素数１～１２のアルキル基、置換アリール基、アラルキル基またはヘテロアルキル基であり、Ｚは細胞内の酵素で分解するオリゴペプチドであり、Ｘは生体関連物質と反応可能な官能基であり、Ｌ１及びＬ２はそれぞれ独立して単結合もしくは２価のスペーサーである。
　本発明の式（１）のポリエチレングリコール誘導体の総分子量は、通常は４，０００～１６０，０００であり、好ましくは１０，０００～１２０，０００であり、更に好ましくは２０，０００～８０，０００である。本発明の１つの好ましい実施形態では、本発明の式（１）のポリエチレングリコール誘導体の総分子量は２０，０００以上である。ここでいう分子量とは数平均分子量（Ｍｎ）である。
　式（１）中のｋ１およびｋ２は、通常はそれぞれ独立して１～１２であり、好ましくはそれぞれ独立して１～６であり、更に好ましくはそれぞれ独立して１～２である。
　式（１）中のｊ１およびｊ２は、それぞれポリエチレングリコールの繰り返しユニット数であり、通常それぞれ独立して４５～９５０であり、好ましくはそれぞれ独立して１１０～６９０であり、更に好ましくはそれぞれ独立して２２０～４８０である。
　式（１）中のＲは、水素原子、置換もしくは置換されていない炭素数１～１２のアルキル基、置換アリール基、アラルキル基またはヘテロアルキル基である。「ヘテロアルキル基」とは、窒素原子、酸素原子および硫黄原子から選択される１～５個のヘテロ原子を含むアルキル基である。Ｒは、好ましくは水素原子もしくは炭素数１～３のアルキル基であり、より好ましくは水素原子、メチル基またはエチル基であり、更に好ましくは水素原子である。
　式（１）中のＬ１及びＬ２は、それぞれ独立して、単結合もしくは２価のスペーサーであるが、これらのスペーサーは共有結合を形成し得る基であれば特に制限は無いが、好ましくは、フェニレン基、アミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ウレタン結合、２級アミノ基、カルボニル基、ウレア結合、またはこれらの結合および／または基を含んでいてもよいアルキレン基であり、より好ましくは、アルキレン基、アミド結合、エーテル結合、ウレタン結合、２級アミノ基、またはカルボニル基とアルキレン基とが結合して形成される基であり、特に好ましい態様は、下記の群（Ｉ）に示されるものである。また、群（Ｉ）のスペーサーを２つから５つ組み合わせても良い。２価のスペーサーとしてエステル結合とカーボネート結合は生体内の血中で徐々に分解するため適さない。
　群（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　（ｚ１）～（ｚ１１）において、式中のｓは０～１０の整数を示し、好ましくは０～６の整数を示し、更に好ましくは０～３の整数を示す。また、（ｚ２）～（ｚ１１）において、式中のｓは同一でも、異なっていてもよい。
　式（１）中のＬ１は、単結合もしくは群（Ｉ）の（ｚ２）、（ｚ３）、（ｚ４）、（ｚ６）、（ｚ７）、（ｚ８）、（ｚ９）、（ｚ１０）、（ｚ２）と（ｚ６）の組み合わせが好ましく、単結合、（ｚ３）、（ｚ６）、（ｚ９）、（ｚ１０）、（ｚ２）と（ｚ６）の組み合わせがより好ましい。
　式（１）中のＬ２は、群（Ｉ）の（ｚ１）、（ｚ２）、（ｚ３）、（ｚ４）、（ｚ５）、（ｚ６）、（ｚ７）、（ｚ８）、（ｚ１１）が好ましく、（ｚ３）、（ｚ５）、（ｚ１１）がより好ましい。
　式（１）中のＺは、生体内の血中で安定であり、かつ細胞内の酵素で分解するオリゴペプチドであれば特に制限はないが、システインを除く中性アミノ酸からなる２～８残基のオリゴペプチドが好ましく、システインを除く中性アミノ酸からなる２～６残基のオリゴペプチドがより好ましく、システインを除く中性アミノ酸からなる２～４残基のオリゴペプチドが更に好ましい。
　また、式（１）中のＺは、側鎖にアミノ基やカルボキシル基を持つアミノ酸、具体的には、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸を含まない中性アミノ酸で構成されるオリゴペプチドであることが好ましい。ここで使用されるアミノ酸は、α－アミノ酸であり、また基本的にはＬ型である。
　さらに、中性アミノ酸であるシステインはチオール基を有しており、他のチオール基とジスルフィド結合を形成するため、式（１）中のＺは、システインを含まない中性アミノ酸からなるオリゴペプチドであることが望ましい。
　加えて、式（１）中のＺは、Ｃ末端のアミノ酸としてグリシンを有するオリゴペプチドであることが好ましい。Ｃ末端のカルボキシル基とポリエチレングリコール誘導体を反応させる際は、基本的にＣ末端のカルボキシル基を縮合剤などで活性化する必要がある。この活性化の工程にて、グリシン以外のアミノ酸ではエピメリ化が起こりやすく、立体異性体が副生することが知られている。オリゴペプチドのＣ末端のアミノ酸をアキラルなグリシンとすることで、立体異性体の副生の無い、高純度な目的物を得ることができる。
　さらに、式（１）中のＺは、ハイドロパシー指標が２．５以上である疎水性の中性アミノ酸、具体的には、フェニルアラニン、ロイシン、バリン、イソロイシンを少なくとも１つ有するオリゴペプチドであることが好ましく、フェニルアラニンを有するオリゴペプチドであることが更に好ましい。Kyte と Doolittleにより作成された、アミノ酸の疎水性を定量的に示すハイドロパシー指標(hydropathy index)は、値が大きいほど疎水的なアミノ酸であることを示す（Kyte J & Doolittle RF, 1982, J Mol Biol, 157:105－132.）。
　式（１）中のＺは、生体内の血中で安定であり、かつ細胞内の酵素で分解する性能を有し、システインを除く中性アミノ酸からなる２～８残基のオリゴペプチドであれば特に制限は無いが、具体的な例としては、グリシン－フェニルアラニン－ロイシン－グリシン、グリシン－グリシン－フェニルアラニン－グリシン、グリシン－フェニルアラニン－グリシン、グリシン－ロイシン－グリシン、バリン－シトルリン－グリシン、バリン－アラニン－グリシン、グリシン－グリシン－グリシン、フェニルアラニン－グリシンなどであり、好ましくはグリシン－フェニルアラニン－ロイシン－グリシン、グリシン－グリシン－フェニルアラニン－グリシン、グリシン－フェニルアラニン－グリシン、グリシン－グリシン－グリシン、バリン－シトルリン－グリシン、バリン－アラニン－グリシン、フェニルアラニン－グリシンであり、より好ましくはグリシン－フェニルアラニン－ロイシン－グリシン、グリシン－フェニルアラニン－グリシン、バリン－シトルリン－グリシン、バリン－アラニン－グリシンであり、さらにより好ましくはグリシン－フェニルアラニン－ロイシン－グリシン、バリン－シトルリン－グリシンである。
　式（１）中のＸは、化学修飾の対象となる生理活性タンパク質、ペプチド、抗体、核酸などの生体関連物質に存在する官能基と反応して共有結合を形成する官能基であれば特に制限されない。例えば、「Harris, J. M. Poly(Ethylene Glycol) Chemistry; Plenum Press: New York, 1992」、「Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques, 2nd ed.; Academic Press: San Diego, CA, 2008」および「PEGylated Protein Drugs: Basic Science and Clinical Applications; Veronese, F. M., Ed.; Birkhauser: Basel, Switzerland,2009」などに記載されている官能基が挙げられる。
　式（１）中のＸで示される「生体関連物質と反応可能な官能基」は、生体関連物質が有するアミノ基、メルカプト基、アルデヒド基、カルボキシ基、不飽和結合またはアジド基などの官能基と化学結合可能な官能基であれば特に制限されない。
　具体的には、活性エステル基、活性カーボネート基、アルデヒド基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、エポキシ基、カルボキシ基、メルカプト基、マレイミド基、置換マレイミド基、ヒドラジド基、ジチオピリジル基、置換スルホネート基、ビニルスルホニル基、アミノ基、オキシアミノ基（Ｈ２Ｎ－Ｏ－基）、ヨードアセトアミド基、アルキルカルボニル基、アルケニル基（例えば、アリル基、ビニル基）、アルキニル基、置換アルキニル基（例えば、後記の炭素数１～５の炭化水素基で置換されたアルキニル基）、アジド基、アクリル基、スルホニルオキシ基（例えば、アルキルスルホニルオキシ基）、α－ハロアセチル基などが挙げられ、好ましくは、活性エステル基、活性カーボネート基、アルデヒド基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、エポキシ基、マレイミド基、置換マレイミド基、ビニルスルホニル基、アクリル基、スルホニルオキシ基（例えば、炭素数１～５のアルキル－スルホニルオキシ基）、置換スルホネート基、カルボキシ基、メルカプト基、ピリジルジチオ基、α－ハロアセチル基、アルキニル基、置換アルキニル基（例えば、後記の炭素数１～５の炭化水素基で置換された炭素数２～５のアルキニル基）、アリル基、ビニル基、アミノ基、オキシアミノ基、ヒドラジド基およびアジド基であり、より好ましくは活性エステル基、活性カーボネート基、アルデヒド基、マレイミド基、オキシアミノ基およびアミノ基であり、特に好ましくは活性エステル基、活性カーボネート基、アルデヒド基、マレイミド基およびオキシアミノ基である。
　別の好適な実施形態において、かかる官能基Ｘは、下記の群（ＩＩ）、群（ＩＩＩ）、群（ＩＶ）、群（Ｖ）、群（ＶＩ）および群（ＶＩＩ）に分類することができる。
　群（ＩＩ）：生体関連物質が有するアミノ基と反応可能な官能基
　下記の (a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(j)、または(k)で示される基が挙げられる。
　群（ＩＩＩ）：生体関連物質が有するメルカプト基と反応可能な官能基
　下記の(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、または(l)で示される基が挙げられる。
　群（ＩＶ）：生体関連物質が有するアルデヒド基と反応可能な官能基
　下記の(h)、(m)、(n)、または(p)で示される基が挙げられる。
　群（Ｖ）：生体関連物質が有するカルボキシル基と反応可能な官能基
　下記の(h)、(m)、(n)、または(p)で示される基が挙げられる。
　群（ＶＩ）：生体関連物質が有する不飽和結合と反応可能な官能基
　下記の(h)、(m)、または(o)で示される基が挙げられる。
　群（ＶＩＩ）：生体関連物質が有するアジド基と反応可能な官能基
　下記の(l)で示される基が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　官能基(j)において、式中のＷ１は塩素原子（Ｃｌ）、臭素原子（Ｂｒ）またはヨウ素原子（Ｉ）などのハロゲン原子を示し、好ましくはＢｒ、またはＩ、より好ましくはＩである。
　また、官能基(e)および官能基(l)において、式中のＹ１、Ｙ３は、それぞれ独立して、水素原子または炭素数１～５の炭化水素基を示し、好ましくは炭素数１～５の炭化水素基である。炭素数１～５の炭化水素基としては、具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、第三ブチル基などが挙げられ、好ましくはメチル基、またはエチル基である。
　また、官能基(k)において、式中のＹ２はフッ素原子を含んでいてもよい炭素数が１～１０の炭化水素基を示し、具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、第三ブチル基、ヘキシル基、ノニル基、ビニル基、フェニル基、ベンジル基、４－メチルフェニル基、トリフルオロメチル基、２，２，２－トリフルオロエチル基、４－（トリフルオロメトキシ）フェニル基などが挙げられ、好ましくはメチル基、ビニル基、４－メチルフェニル基、または２，２，２－トリフルオロエチル基である。
　活性エステル基とは、脱離能の高いアルコキシ基を有したエステル基である。脱離能の高いアルコキシ基としては、ニトロフェノール、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、ペンタフルオロフェノールなどから誘導されるアルコキシ基が挙げられる。活性エステル基は、好ましくはＮ－ヒドロキシスクシンイミドから誘導されるアルコキシ基を有したエステル基である。
　活性カーボネート基とは、脱離能の高いアルコキシ基を有したカーボネート基である。脱離能の高いアルコキシ基としては、ニトロフェノール、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、ペンタフルオロフェノールなどから誘導されるアルコキシ基が挙げられる。活性カーボネート基は、好ましくはニトロフェノールまたはＮ－ヒドロキシスクシンイミドから誘導されるアルコキシ基を有したカーボネート基である。
　置換マレイミド基とは、マレイミド基の二重結合の片方の炭素原子に炭化水素基が結合しているマレイミド基である。炭化水素基は、具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、第三ブチル基などが挙げられ、好ましくはメチル基、またはエチル基である。
　置換スルホネート基とは、スルホネート基の硫黄原子にフッ素原子を含んでいてもよい炭化水素基が結合しているスルホネート基である。フッ素原子を含んでいてもよい炭化水素基としては、具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、第三ブチル基、ヘキシル基、ノニル基、ビニル基、フェニル基、ベンジル基、４－メチルフェニル基、トリフルオロメチル基、２，２，２－トリフルオロエチル基、４－（トリフルオロメトキシ）フェニル基などが挙げられ、好ましくはメチル基、ビニル基、４－メチルフェニル基、または２，２，２－トリフルオロエチル基である。
　本発明の式（１）の分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体の好適な例としては、以下の分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体が挙げられる。
［分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体（１－１）］
　ｋ１およびｋ２が、それぞれ独立して１～２であり；
　ｊ１およびｊ２が、それぞれ独立して２２０～４８０であり；
　Ｒが、水素原子であり；
　Ｚが、システインを除く中性アミノ酸からなる２～８残基のオリゴペプチド（例、フェニルアラニン－グリシン）であり；
　Ｘが、活性エステル基（例、Ｎ－スクシンイミジルオキシカルボニル基）、アルデヒド基（例、Ｎ－（ホルミルエチル）カルバモイル基）、カルボキシル基、マレイミド基（例、Ｎ－（Ｎ－マレイミジルエチルカルボニルアミノエチル）カルバモイル基）およびアミノ基（例、Ｎ－（アミノエチル）カルバモイル基）よりなる群から選択され；
　Ｌ１およびＬ２が、それぞれ独立して、２級アミノ基および／またはカルボニル基を含んでいてもよいアルキレン基（例、プロピレン基）である；
式（１）の分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
　式（１）で示される分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体は、例えば、次のような工程で製造することができる。
反応１
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
　反応１中のＡは脱離基であり、Ｒ、ｊ１、ｋ１、ｋ２は前記と同義である。
　式（３）におけるＡは、脱離基であり、カップリング反応において反応性を有する脱離基であれば特に制限はないが、例えば、クロロ基、ブロモ基、ヨード基、メシラート基、トシラート基、クロロメタンスルホナート基などが挙げられる。
　反応１は、式（３）で表されるポリエチレングリコール誘導体と式（４）で表される化合物を無水溶媒中、強塩基触媒存在下でカップリング反応させ、式（５）で表されるポリエチレングリコール誘導体を得る工程である。
　前記カップリング反応における強塩基触媒としては、反応が進行する強塩基触媒であれば特に制限は無いが、例えば水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシドなどが挙げられる。
　前記カップリング反応における無水溶媒としては、式（３）および式（４）で表される化合物と反応しない溶媒であれば特に制限は無いが、例えば、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、ＤＭＦ、ジクロロメタン、クロロホルム等の非プロトン性極性溶媒、及びこれらの混合物が挙げられる。
　反応で副生した不純物、また反応で消費されずに残存した化合物、強塩基触媒の精製除去を行うのが好ましい。精製は特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
反応２
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
　反応２中のＰｒｏは保護基であり、Ｐｅｐｔｉｄｅはオリゴペプチドであり、Ｌ３は前記Ｌ１およびＬ２と同義の単結合もしくは２価のスペーサーであり、およびｊ２は前記と同義である。
　反応２中のＰｒｏは、保護基であり、ここで保護基とは、ある反応条件下で分子中の特定の化学反応可能な官能基の反応を防止または阻止する成分である。保護基は、保護される化学反応可能な官能基の種類、使用される条件および分子中の他の官能基もしくは保護基の存在により変化する。保護基の具体的な例は多くの一般的な成書に見出すことができるが、例えば「Wuts, P. G. M.; Greene, T. W. Protective Groups in Organic Synthesis, 4th ed.; Wiley－Interscience: New York, 2007」に記載されている。また、保護基で保護された官能基は、それぞれの保護基に適した反応条件を用いて脱保護、すなわち化学反応させることで、元の官能基を再生させることができる。保護基の代表的な脱保護条件は前述の文献に記載されている。
　反応２は、式（６）で表されるＮ末端のアミノ基が保護基で保護されたオリゴペプチドのカルボキシル基と、式（７）で表される片末端がメトキシ基であるポリエチレングリコール誘導体のアミノ基を縮合反応にて結合させ、式（８）で表されるポリエチレングリコール誘導体を得る工程である。
　オリゴペプチドのＮ末端のアミノ基の保護基は、特に制限は無いが、例えばアシル系保護基およびカーバメート系保護基が挙げられ、具体的にはトリフルオロアセチル基、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）、ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル基などが挙げられる。
　縮合反応としては、特に制限は無いが、縮合剤を用いる反応が望ましい。縮合剤としては、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）などのカルボジイミド系の縮合剤を単独で使用しても良く、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）などの試薬と併用しても良い。また、より反応性の高いＨＡＴＵやＨＢＴＵ、ＴＡＴＵ、ＴＢＴＵ、ＣＯＭＵ、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリドｎ水和物（ＤＭＴ－ＭＭ）などの縮合剤を使用しても良い。また反応を促進するため、トリエチルアミンやジメチルアミノピリジンなどの塩基を用いても良い。
　反応で副生した不純物、または反応で消費されず残存したオリゴペプチドや縮合剤などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
脱保護３
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
　Ｐｅｐｔｉｄｅ、Ｌ３およびｊ２は前記と同義である。
　脱保護３は、反応２で得られた式（８）で表されるポリエチレングリコール誘導体の保護基を脱保護して、式（９）で表されるポリエチレングリコール誘導体を得る工程である。脱保護反応としては、従来公知の方法を用いることができるが、オリゴペプチドやＬ３の２価のスペーサーが分解しない条件を用いる必要がある。また、本工程は、反応２の工程の一環として実施することも可能である。
　脱保護反応で副生した不純物などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
　反応４
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
　反応４中のｋ３は１～６の整数であり、Ｐｅｐｔｉｄｅ、ｊ２、およびＬ３は前記と同義である。
　式（８）中のｋ３は１～６の整数であり、好ましくは２～４の整数である。
　反応４は脱保護３で得られた式（９）で表されるポリエチレングリコール誘導体の末端のアミノ基を塩基触媒存在下で式（１０）で表される化合物と反応させカルボキシル基に変換する工程である。
　反応４で副生した不純物などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
反応５
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
　反応５中のＰｅｐｔｉｄｅ、Ｌ３、ｋ３、およびｊ２は前記と同義である。
　反応５は反応４で得られた式（１１）で表されるポリエチレングリコール誘導体に式（１２）で表される化合物を塩基触媒存在下で反応させ、活性エステル基を導入した式（１３）で表されるポリエチレングリコール誘導体を得る工程であり、本工程は反応４の工程の一環として実施することも可能である。
反応６
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
　反応６中のＰｅｐｔｉｄｅ、Ｒ、Ｌ３、ｊ１、ｊ２、ｋ１、ｋ２、およびｋ３は前記と同義である。
　反応６は反応１で得られた式（５）で表されるポリエチレングリコール誘導体のアミノ基と反応５で得られた式（１３）で表されるポリエチレングリコール誘導体の活性エステル基を反応で結合させ、式（１４）で表される分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体を得る工程である。
　反応で副生した不純物、または反応で消費されず残存したポリエチレングリコール誘導体などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
　式（１４）で表されるポリエチレングリコール誘導体の末端カルボキシル基を他の官能基に変換する工程について、典型的な例を以下に説明するが、変換方法はこれに限定されるものではない。
　例えば、式（１５）で表されるポリエチレングリコール誘導体の末端カルボキシル基をマレイミド基に変換したい場合は、Ｎ－（２－アミノエチル）マレイミドと塩基触媒存在下で縮合反応させることで、目的物を得ることができる。
　例えば、式（１４）で表されるポリエチレングリコール誘導体の末端カルボキシル基をアミノ基に変換したい場合は、Ｎ－（９－Ｈ－フロオレン－９－イルメトキシカルボニル）－１、２－エタンジアミンと塩基触媒存在下で縮合反応させた後、脱保護反応させることで得ることができる。
　これらの反応試薬は、低分子量の試薬であり、高分子量ポリマーであるポリエチレングリコール誘導体とは大きく溶解性が異なるため、抽出や晶析などの一般的な精製方法にて容易に除去可能である。
　本発明のさらに他の態様として、下式（２）で示される分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体を提供する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
　式（２）中、ｋ１およびｋ２はそれぞれ独立して１～１２であり、ｊ１及びｊ２はそれぞれ独立して４５～９５０であり、Ｒは水素原子、置換もしくは置換されていない炭素数１～４のアルキル基、置換アリール基、アラルキル基またはヘテロアルキル基であり、Ｗはグルタミン酸またはリジンを中心とした対称構造の５～４７残基のオリゴペプチドであり、ａは２～８であり、Ｘは生体関連物質と反応可能な官能基であり、Ｌ１及びＬ２はそれぞれ独立して単結合もしくは２価のスペーサーである。
　本発明の式（２）のポリエチレングリコール誘導体の総分子量は、通常は４，０００～１６０，０００であり、好ましくは１０，０００～１２０，０００であり、更に好ましくは２０，０００～８０，０００である。本発明の１つの好ましい実施形態では、本発明の式（２）のポリエチレングリコール誘導体の総分子量は２０，０００以上である。ここでいう分子量とは数平均分子量（Ｍｎ）である。
　式（２）中のｋ１およびｋ２は、通常はそれぞれ独立して１～１２であり、好ましくはそれぞれ独立して１～６であり、更に好ましくはそれぞれ独立して１～２である。
　式（２）中のｊ１およびｊ２は、それぞれポリエチレングリコールの繰り返しユニット数であり、通常それぞれ独立して４５～９５０であり、好ましくはそれぞれ独立して１１０～６９０であり、更に好ましくはそれぞれ独立して２２０～４８０である。
　式（２）中のＷは、グルタミン酸またはリジンを中心とした対称構造の５～４７残基、好ましくは５～２７残基、より好ましくは５～１９残基のオリゴペプチドであり、生体内の血中で安定であり、かつ細胞内の酵素で分解するオリゴペプチドであれば特に制限はないが、オリゴペプチドを構成するアミノ酸としては、中心部分を構成するグルタミン酸またはリジン以外は、システインを除く中性アミノ酸からなることが好ましい。ここでいうグルタミン酸またはリジンを中心とした対称構造のオリゴペプチドとは、グルタミン酸のα位のカルボキシル基とγ位のカルボキシル基またはリジンのα位のアミノ基とε位のアミノ基に同一のペプチドが結合した化合物を意味し、グルタミン酸またはリジンを中心に対となるペプチドが対称構造をとるオリゴペプチドである。当該オリゴペプチド中の中性アミノ酸とグルタミン酸またはリジンの数の構成比（中性アミノ酸の数／グルタミン酸の数）としては、通常は２～１０であり、好ましくは２～８であり、更に好ましくは２～６である。Ｗを構成するアミノ酸は基本的にはＬ型である。
　Ｗの特に好ましい態様は、下記の群（ＶＩＩＩ）に示されるものである。
群（ＶＩＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
（式中、Ｑはグルタミン酸またはリジンの残基であり、Ｚはシステインを除く中性アミノ酸からなる２～５残基の分解性オリゴペプチドである。）
　式（２）中のａは、Ｗで示されるオリゴペプチドと結合しているポリエチレングリコール鎖の本数であり、通常は２～８であり、好ましくは２または４または８であり、更に好ましくは２または４である。
　なお、Ｒ、Ｘ、Ｌ１、Ｌ２及び（ｗ１）～（ｗ２）中のＺの好ましい態様は、前記の式（１）について説明した通りである。
　式（２）の好ましい態様の１つは、Ｗがｗ１であり、ａ＝２の下式（１５）で示される３分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
（式中、Ｑ、Ｚ、Ｒ、ｋ１、ｋ２、ｊ１、ｊ２、Ｘ、Ｌ１及びＬ２は、前記と同義である。）
　式（２）の好ましい態様の１つは、Ｗがｗ２であり、ａ＝４の下式（１６）で示される５分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
（式中、Ｑ、Ｒ、Ｚ、ｋ１、ｋ２、ｊ１、ｊ２、Ｘ、Ｌ１及びＬ２は、前記と同義である。）
　本発明の式（２）の分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体の好適な例としては、以下の分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体が挙げられる。
［分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体（２－１）］
　ｋ１およびｋ２が、それぞれ独立して１～２であり；
　ｊ１およびｊ２が、それぞれ独立して２２０～４８０であり；
　Ｒが、水素原子であり；
　Ｗが、グルタミン酸またはリジンを中心とした対称構造の５～９残基のオリゴペプチド（例、グリシン－フェニルアラニン－グルタミン酸－フェニルアラニン－グリシン）であり；
　ａが、２または４であり；
　Ｘが、カルボキシル基であり；
　Ｌ１およびＬ２が、それぞれ独立して、エーテル結合、２級アミノ基および／またはカルボニル基を含んでいてもよいアルキレン基（例、プロピレン基、ペンチレン基）である；
式（２）の分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
　本発明の分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体は、Ｑがグルタミン酸の残基の場合に、例えば、次のような工程で製造することができる。
反応７
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
　反応７中のＰｒｏ、Ｐｅｐｔｉｄｅ、Ｌ３およびｊ２は前記と同義である。
　反応７は、脱保護３で得られた式（９）で表されるポリエチレングリコール誘導体のアミノ基と、式（１７）で表されるアミノ基が保護基で保護されたグルタミン酸誘導体の二つのカルボキシル基を縮合反応で結合させ、２本の分解性ポリエチレングリコール鎖がグルタミン酸残基で繋がれた構造である式（１８）で表される分岐型のポリエチレングリコール誘導体を得る工程である。
　前記反応２と同様に、縮合剤を用いた反応が望ましく、反応を促進するため、トリエチルアミンやジメチルアミノピリジン等の塩基を用いても良い。
　グルタミン酸のアミノ基の保護基は、特に制限は無いが、例えばアシル系保護基およびカーバメート系保護基が挙げられ、具体的にはトリフルオロアセチル基、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基およびｔ－ブチルオキシカルボニル基等が挙げられる。
　反応で副生した不純物、または反応で消費されず残存したポリエチレングリコール誘導体などは、精製除去を行うのが好ましい。精製は、特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出等で精製することができる。
脱保護８
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
　脱保護８中のＰｅｐｔｉｄｅ、Ｌ３およびｊ２は前記と同義である。
　脱保護８は、反応７で得られた式（１８）で表されるポリエチレングリコール誘導体の保護基を脱保護して、式（１９）で表されるポリエチレングリコール誘導体を得る工程である。前記脱保護３と同条件で反応と精製が可能である。
　式（１９）で表されるポリエチレングリコール誘導体の中から、分子量や官能基の異なるポリエチレングリコール不純物を除去する手法としては、特開２０１４－２０８７８６、特開２０１１－７９９３４に記載の精製技術を用いることができる。
反応９
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
　反応９中のＰｒｏ、Ｐｅｐｔｉｄｅ、Ｌ３およびｊ２は前記と同義である。
　反応９は、脱保護８で得られた式（１９）で表されるポリエチレングリコール誘導体のアミノ基と、式（１７）で表されるアミノ基が保護基で保護されたグルタミン酸誘導体の二つのカルボキシル基を縮合反応で結合させ、４本の分解性ポリエチレングリコール鎖がグルタミン酸残基で繋がれた構造である式（２０）で表される分岐型のポリエチレングリコール誘導体を得る工程である。前記反応２と同条件で反応と精製が可能である。
脱保護１０
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
　脱保護１０中のＰｅｐｔｉｄｅ、Ｌ３およびｊ２は前記と同義である。
　脱保護１０は、反応９で得られた式（２０）で表されるポリエチレングリコール誘導体の保護基を脱保護して、式（２１）で表されるポリエチレングリコール誘導体を得る工程である。前記脱保護８と同条件で反応と精製が可能である。また、本工程は、反応９の一連の工程にて実施することも可能である。
反応１１
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
　反応１１中のＰｅｐｔｉｄｅ、Ｌ３、ｊ２およびｋ３は前記と同義である。
　反応１１は脱保護８で得られた式（１９）で表される２分岐型のポリエチレングリコール誘導体の末端のアミノ基を塩基触媒存在下で式（２２）で表される化合物と反応させ水酸基に変換し、式（２３）で表される２分岐型のポリエチレングリコール誘導体を得る工程である。前記反応４と同条件で反応と精製が可能である。
　さらに、反応１１中の式（１９）で表される２分岐型のポリエチレングリコール誘導体の代わりに脱保護１０で得られた式（２１）で表される４分岐型のポリエチレングリコール誘導体を原料とすることで、下式（２４）で表される４分岐型のポリエチレングリコール誘導体を得ることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
　式（２４）のＰｅｐｔｉｄｅ、Ｌ３、ｊ２およびｋ３は前記と同義である。
反応１２
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
　反応１２中のＰｅｐｔｉｄｅ、Ｌ３、ｊ２およびｋ３は前記と同義である。
　反応１２は反応１１で得られた式（２３）で表される２分岐型のポリエチレングリコール誘導体の水酸基と式（２５）で表される化合物を反応させ、活性カーボネート基を導入した式（２６）で表される２分岐型のポリエチレングリコール誘導体を得る工程であり、本工程は反応１１の肯定の一環として実施することも可能であり、前記反応５と同条件で反応と精製が可能である。
　さらに、反応１２中の式（２３）で表される２分岐型のポリエチレングリコール誘導体の代わりに式（２４）で表される４分岐型のポリエチレングリコール誘導体を原料とすることで、下式（２７）で表される４分岐型のポリエチレングリコール誘導体を得ることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
　式（２７）のＰｅｐｔｉｄｅ、Ｌ３、ｊ２およびｋ３は前記と同義である。
反応１３
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
　反応１３中のＰｅｐｔｉｄｅ、Ｒ、Ｌ３、ｊ１、ｊ２、ｋ１、ｋ２およびｋ３は前記と同義である。
　反応１３は反応１で得られた式（５）で表されるポリエチレングリコール誘導体のアミノ基と反応１２で得られた式（２６）で表されるポリエチレングリコール誘導体の活性エステル基を反応で結合させ、式（２８）で表される３分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体を得る工程であり、前記反応６と同条件で反応と精製が可能である。
　さらに、反応１３中の式（２６）で表される２分岐型のポリエチレングリコール誘導体の代わりに式（２７）で表される４分岐型のポリエチレングリコール誘導体を原料とすることで、下式（２９）で表される５分岐型のポリエチレングリコール誘導体を得ることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
　式（２９）のＰｅｐｔｉｄｅ、Ｒ、Ｌ３、ｊ１、ｊ２、ｋ１、ｋ２およびｋ３は前記と同義である。
　式（２８）または式（２９）で表される分岐型のポリエチレングリコール誘導体の末端カルボキシル基を他の官能基に変換する工程について、典型的な例を以下に説明するが、変換方法はこれに限定されるものではない。
　例えば、式（２８）または式（２９）で表される分岐型のポリエチレングリコール誘導体の末端カルボキシル基をマレイミド基に変換したい場合は、Ｎ－（２－アミノエチル）マレイミドと塩基触媒存在下で縮合反応させることで、目的物を得ることができる。
　例えば、式（２８）または式（２９）で表されるポリエチレングリコール誘導体の末端カルボキシル基をアミノ基に変換したい場合は、Ｎ－（９－Ｈ－フロオレン－９－イルメトキシカルボニル）－１、２－エタンジアミンと塩基触媒存在下で縮合反応させた後、脱保護反応させることで得ることができる。
　これら反応試薬は、低分子量の試薬であり、高分子量のポリマーであるポリエチレングリコール誘導体とは大きく溶解性が異なるため、抽出や晶析等の一般的な精製方法にて容易に除去が可能である。
　以上のような工程を経て、得られた分岐型の分解性ポリエチレングリコールは、血中で安定であり、細胞内でのみ分解する性能を有することが求められる。その性能を適切に評価するため、例えば、以下に示すような試験を実施し、分岐型の分解性ポリエチレングリコールの血中での安定性、そして細胞内での分解性を評価することができる。
　なお、これらの評価においてポリエチレングリコール誘導体が有する官能基の種類による影響を考慮し、評価試料はすべて、アミノ基を１つ有したポリエチレングリコール誘導体に統一して試験を実施した。
　分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体の血中での安定性を評価するための試験方法については、特に制限は無いが、例えば、マウス、ラット、ヒトなどの血清を用いた試験等が挙げられる。具体的には、ポリエチレングリコール誘導体を１～１０ｍｇ／ｍＬの濃度になるように血清に溶解し、３７℃で９６時間インキュベート後、血清中に含まれるポリエチレングリコール誘導体を回収し、ＧＰＣを測定することで分解率を評価することができる。分解率は、安定性試験前のポリエチレングリコール誘導体のＧＰＣメインフラクションのピーク面積％と、安定性試験後のポリエチレングリコール誘導体のＧＰＣメインフラクションのピーク面積％から算出する。具体的には以下の式を用いる。
分解率　＝　（試験前のピーク面積％　－　試験後のピーク面積％）　÷　試験前のピーク面積％　×　１００
　例えば、安定性試験前の分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体のＧＰＣメインフラクションのピーク面積％が９５％であり、試験後のＧＰＣメインフラクションのピーク面積％が９０％だったとすると、分解率は以下のように算出される。
分解率　＝　（９５－９０）÷９５×１００　＝　５．２６（％）
　分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体は、血中で分解してしまうと、目的とする血中半減期を得ることができないため、安定性試験において、９６時間後の分解率は、１０％以下が好ましく、５％以下がさらに好ましい。
　分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体の細胞内での分解性を評価するための試験方法については、特に制限は無いが、例えば、分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体を含有した培地を用いて、細胞を培養させる試験等が挙げられる。ここで使用する細胞や培地については、特に制限は無いが、具体的には、ポリエチレングリコール誘導体を１～２０ｍｇ／ｍＬの濃度になるように培地であるＲＰＭＩ－１６４０に溶解し、この培地を用いて、マクロファージ細胞ＲＡＷ２６４．７を３７℃で９６時間培養後、細胞中のポリエチレングリコール誘導体を回収し、ＧＰＣを測定することで分解率を評価することができる。分解率は、安定性試験と同様に、試験前後のポリエチレングリコール誘導体のＧＰＣメインフラクションのピーク面積％を用いて算出する。
　例えば、細胞を用いた分解性試験前の分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体のＧＰＣメインフラクションのピーク面積％が９５％であり、試験後のＧＰＣメインフラクションのピーク面積％が５％だったとすると、分解率は以下のように算出される。
分解率　＝　（９５－５）÷９５×１００　＝　９４．７（％）
　分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体は、細胞内で効率よく分解されないと、目的とする細胞の空胞を抑制できないため、分解性試験において、９６時間後の分解率は、９０％以上が好ましく、９５％以上がさらに好ましい。
　非特許文献２では、高分子量のポリエチレングリコールによる細胞の空胞化は、ポリエチレングリコールの組織への蓄積と関係があるとの記載がある。分解性ポリエチレングリコール誘導体の細胞への蓄積性を評価するための試験方法については、特に制限は無いが、上記の細胞内での分解性により評価することができる。
　以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限られるものではない。
　下記実施例で得られた１Ｈ－ＮＭＲは、日本電子データム（株）製ＪＮＭ－ＥＣＰ４００またはＪＮＭ－ＥＣＡ６００から得た。測定にはφ５ｍｍチューブを用い、重水素化溶媒には、Ｄ２Ｏまたは内部標準物質としてテトラメチルシラン（ＴＭＳ）を含有するＣＤＣｌ３およびｄ６－ＤＭＳＯを用いた。得られたポリエチレングリコール誘導体の分子量および末端官能基純度は、液体クロマトグラフィー（ＧＰＣおよびＨＰＬＣ）を用いて算出した。液体クロマトグラフィーのシステムは、ＧＰＣには東ソー（株）製「ＨＬＣ－８３２０ＧＰＣ　ＥｃｏＳＥＣ」を用い、ＨＰＬＣにはＷＡＴＥＲＳ社製「ＡＬＬＩＡＮＣＥ」を用いた。
［実施例１］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
［実施例１－１］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
　平均分子量＝２０，０００、日油株式会社製「ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ　ＭＥＨ－２０Ｔ」）（１０ｇ）をトルエン（４０ｇ）に溶解し、１１０℃で１時間還流脱水した後、４０℃まで冷却してトリエチルアミン（８０ｍｇ）、塩化メタンスルホニル（８４ｍｇ）を添加し、４０℃で３時間反応させた。反応終了後、トルエン（１００ｇ）で希釈した後、ヘキサン（１００ｇ）を加えて、室温にて３０分攪拌し生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、酢酸エチル（２００ｇ）に溶解し、ヘキサン（１００ｇ）を加えて室温にて１５分攪拌して生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、ヘキサン（１００ｇ）で洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して化合物（ｐ１）を得た。収量８．９ｇ。
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：３．０８ｐｐｍ（ｓ、３Ｈ、－Ｏ－ＳＯ２－ＣＨ ３ ）３．３８ｐｐｍ（ｓ、３Ｈ、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｊ－Ｏ－ＣＨ ３ ）、３．６４ｐｐｍ（ｍ、約１，９００Ｈ、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ ２ －ＣＨ ２ ）ｊ－Ｏ－ＣＨ３）
［実施例１－２］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
　塩酸グリシン（５ｇ）を、イオン交換水（５０ｇ）に溶解した。ＮａＯＨ（３．０ｇ）を、前記グリシン水溶液に加え、ｐＨを１０．８に調整した。その後、実施例１－１で得られた化合物（ｐ１）（８ｇ）を前記水溶液に添加し、その溶液を４０℃で７２時間反応させた。反応後、塩酸溶液で反応液のｐＨを約７に中和した。中和後、クロロホルム（５０ｇ）を添加し、室温で１５分攪拌した後、有機層を回収した。有機層を濃縮し、酢酸エチル（１００ｇ）に再溶解してヘキサン（５０ｇ）を添加し、室温で１５分攪拌して生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、ヘキサン（５０ｇ）で洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して化合物（ｐ２）を得た。収量６．８ｇ。
１Ｈ－ＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）：２．７２ｐｐｍ（ｔ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＨ ２ －ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｊ－Ｏ－ＣＨ３）３．２４ｐｐｍ（ｓ、３Ｈ、－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｊ－Ｏ－ＣＨ ３ ）、３．４８ｐｐｍ（ｍ、約１，９００Ｈ、－ＣＨ ２ －ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －（Ｏ－ＣＨ ２ －ＣＨ ２ ）ｊ－Ｏ－ＣＨ３）、５．５２ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＯＯＨ）
［実施例１－３］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
　Ｎ末端を９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）で保護したＬ－フェニルアラニル－グリシン（Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ）（０．４４ｇ）と平均分子量＝２０，０００、日油株式会社製「ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ　ＭＥＰＡ－２０Ｔ」（１０ｇ）にアセトニトリル（４０ｇ）を添加して溶解した。その後、ジイソプロピルエチルアミン（１．５６ｇ）と４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリドｎ水和物（ＤＭＴ－ＭＭ）（０．２２ｇ）を添加し、室温にて窒素雰囲気下で１時間反応させた。反応終了後、４０℃にて濃縮し、濃縮物にトルエン（１００ｇ）を添加して均一になるように攪拌した後、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過した。得られたろ液にヘキサン（１００ｇ）を加えて、室温にて１５分攪拌し生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、再度トルエン（１００ｇ）に溶解し、ヘキサン（１００ｇ）を加えて、室温にて１５分攪拌し生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、ヘキサン（５０ｇ）で洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物（ｐ３）を得た。収量８．６ｇ。
１Ｈ－ＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）：１．６２ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｊ－ＣＨ３）、２．８０ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、３．０４ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、３．１０ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｊ－ＣＨ３）、３．２４ｐｐｍ（ｓ、３Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｊ－ＣＨ ３ ）、３．４８ｐｐｍ（ｍ、約１，９００Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｊ－ＣＨ３）、４．２０ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ）、７．３３ｐｐｍ（ｍ、９Ｈ）、７．６６ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、Ａｒ）、７．８８ｐｐｍ（ｄ、２Ｈ、Ａｒ）、８．２７ｐｐｍ（ｔ、１Ｈ）
［実施例１－４］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
　化合物（ｐ３）（８．０ｇ）をアセトニトリル（４０ｇ）に溶解した。その後、ピペリジン（０．８６ｇ）を添加し、室温にて窒素雰囲気下で２時間反応させた。反応終了後、２０％食塩水（８０ｇ）を添加し、室温にて１５分攪拌して洗浄を行った。有機層と水層を分離後、再度、有機層に２０％食塩水（８０ｇ）を添加し、室温にて１５分攪拌して洗浄を行い、有機層を回収した。得られた有機層を４０℃にて濃縮し、濃縮物にトルエン（２００ｇ）、硫酸マグネシウム（１０ｇ）を添加し、室温にて３０分攪拌して脱水した後、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過した。得られたろ液にヘキサン（１００ｇ）を添加して室温にて１５分攪拌し、生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、ヘキサン（１００ｇ）で洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物（ｐ４）を得た。収量７．２ｇ。
ＨＰＬＣ：アミン純度９２％。
１Ｈ－ＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）：１．６２ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｊ－ＣＨ３）、１．６４ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、２．５９ｐｐｍ（ｄｄ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、２．９８ｐｐｍ（ｄｄ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、３．１０ｐｐｍ（ｑ、２Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｊ－ＣＨ３）、３．２４ｐｐｍ（ｓ、３Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｊ－ＣＨ ３ ）、３．４８ｐｐｍ（ｍ、約１，９００Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｊ－ＣＨ３）、７．２４ｐｐｍ（ｍ、６Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ 、－ＮＨ－）、７．７３ｐｐｍ（ｔ、１Ｈ）、８．１２ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）
［実施例１－５］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
　実施例１－４で得られた化合物（ｐ４）（６．０ｇ）、酢酸ナトリウム（４９ｍｇ）、無水グルタル酸（５１ｍｇ）をトルエン（２５ｇ）に溶解し、窒素雰囲気下で４０℃にて７時間反応させた。反応終了後、トルエン（２０ｇ）で希釈し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、得られたろ液にヘキサン（３０ｇ）を添加して室温にて１５分攪拌し、生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した。得られた析出物を酢酸エチル（１００ｇ）に溶解し、ヘキサン（５０ｇ）を添加して室温にて１５分攪拌し、生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収し、ヘキサン（５０ｇ）で洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物（ｐ５）を得た。収量４．８ｇ。
１Ｈ－ＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）：１．６２ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｊ－ＣＨ３）、１．６４ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、２．０５ｐｐｍ（ｄｄ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＯＯＨ）２．３０ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＯＯＨ）、２．５９ｐｐｍ（ｄｄ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、２．９８ｐｐｍ（ｄｄ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、３．１０ｐｐｍ（ｑ、２Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｊ－ＣＨ３）、３．２４ｐｐｍ（ｓ、３Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｊ－ＣＨ ３ ）、３．４８ｐｐｍ（ｍ、約１，９００Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｊ－ＣＨ３）、７．２４ｐｐｍ（ｍ、６Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ 、－ＮＨ－）、７．７３ｐｐｍ（ｔ、１Ｈ）、８．１２ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）
［実施例１－６］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
　実施例１－５で得られた化合物（ｐ５）（４．５ｇ）およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（１０３ｍｇ）をトルエン（２５ｇ）に溶解した。その後、ジシクロヘキシルカルボジイミド（１３９ｍｇ）を添加し、４０℃にて窒素雰囲気下で３時間反応させた。反応終了後、トルエン（５０ｇ）を添加して希釈し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、得られたろ液にヘキサン（５０ｇ）を添加し、室温にて１５分攪拌し、生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、酢酸エチル（１００ｇ）に溶解し、ヘキサン（５０ｇ）を添加して室温にて１５分攪拌し、生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、ヘキサン（５０ｇ）で洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物（ｐ６）を得た。収量３．５ｇ。
活性エステル純度は９８％（１Ｈ－ＮＭＲ）。
１Ｈ－ＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）：１．６２ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｊ－ＣＨ３）、１．６４ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、２．０５ｐｐｍ（ｄｄ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＯ－）、２．３０ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＯＯ－）、２．５９ｐｐｍ（ｄｄ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、２．７２ｐｐｍ（ｓ、４Ｈ、－ＣＯ－ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －ＣＯ－）、２．９８ｐｐｍ（ｄｄ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、３．１０ｐｐｍ（ｑ、２Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｊ－ＣＨ３）、３．２４ｐｐｍ（ｓ、３Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｊ－ＣＨ ３ ）、３．４８ｐｐｍ（ｍ、約１，９００Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｊ－ＣＨ３）、７．２４ｐｐｍ（ｍ、６Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ 、－ＮＨ－）、７．７３ｐｐｍ（ｔ、１Ｈ）、８．１２ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）
［実施例１－７］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
　実施例１－２で得られた化合物（ｐ２）（３．０ｇ）と実施例１－６で得られた化合物（ｐ６）（３．０ｇ）をジクロロメタン（６０ｇ）に溶解した後、トリエチルアミン（９５ｍｇ）を添加して室温にて８時間反応させた。反応後、２０％食塩水（５０ｇ）を添加し、室温にて１５分攪拌し、反応液を洗浄した後、有機層を回収した。有機層に硫酸マグネシウム（１０ｇ）を添加し、室温で１５分攪拌した後、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過した。得られたろ液を濃縮後、濃縮物を酢酸エチル（１００ｇ）に溶解し、ヘキサン（５０ｇ）を添加し、室温にて１５分攪拌し、生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、再度、酢酸エチル（１００ｇ）に溶解し、ヘキサン（５０ｇ）を添加して室温にて１５分攪拌し、生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、２，６－ジ－ｔｅｒｔ－ブチル－ｐ－クレゾ－ル（ＢＨＴ）（１０ｍｇ）を含有したヘキサン（５０ｇ）で洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物（ｐ７）を得た。収量４．２ｇ。
ＨＰＬＣ：カルボン酸純度は９５％。
１Ｈ－ＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）：１．６２ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｊ－ＣＨ３）、１．６４ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、２．０５ｐｐｍ（ｄｄ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＯ－）、２．３０ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＯ－）、２．５９ｐｐｍ（ｄｄ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、２．９８ｐｐｍ（ｄｄ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、３．２４ｐｐｍ（ｓ、３Ｈ、－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｊ－Ｏ－ＣＨ ３ ）、３．４８ｐｐｍ（ｍ、約３，８００Ｈ、－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ ２ －ＣＨ ２ ）ｊ－Ｏ－ＣＨ３）、４．６１ｐｐｍ（－ＣＨ ２ －ＣＯＯＨ）、７．２４ｐｐｍ（ｍ、６Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ 、－ＮＨ－）、７．７３ｐｐｍ（ｔ、１Ｈ）、８．１２ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ））
［実施例２］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
　実施例１－７で得られた化合物（ｐ７）（２．０ｇ）とＮ－Ｆｍｏｃ－エチレンジアミン（３２ｍｇ）をアセトニトリル（５．０ｇ）に溶解した。その後、ジイソプロピルエチルアミン（１６ｍｇ）とＤＭＴ－ＭＭ（４１５ｍｇ）を添加し、室温にて窒素雰囲気下で２時間反応させた。その後、ピペリジン（１０７ｍｇ）を添加し、室温にて窒素雰囲気下で２時間反応させた。反応終了後、濃縮し、濃縮物をクロロホルム（５０ｇ）に再溶解し、２０％食塩水（２５ｇ）を添加し、室温にて１５分攪拌して洗浄を行い、有機層を回収した。得られた有機層に硫酸マグネシウム（１０ｇ）を添加し、室温にて３０分攪拌して脱水した後、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過した。得られたろ液を４０℃にて濃縮し、濃縮物にトルエン（１００ｇ）を添加して溶解し、ヘキサン（５０ｇ）を添加して室温にて１５分攪拌し、生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、ＢＨＴを６ｍｇ含有したヘキサン（３０ｇ）で洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物（ｐ８）を得た。収量１．３ｇ。
ＨＰＬＣ：アミン純度は９３％。
１Ｈ－ＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）：１．６２ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｊ－ＣＨ３）、１．６４ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、２．０５ｐｐｍ（ｄｄ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＯ－）、２．３０ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＯ－）、２．５９ｐｐｍ（ｄｄ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、２．７６ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＮＨ２）、２．９８ｐｐｍ（ｄｄ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、３．２４ｐｐｍ（ｓ、３Ｈ、－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｊ－Ｏ－ＣＨ ３ ）、３．４８ｐｐｍ（ｍ、約３，８００Ｈ、－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ ２ －ＣＨ ２ ）ｊ－Ｏ－ＣＨ３）、７．２４ｐｐｍ（ｍ、６Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ 、－ＮＨ－）、７．７３ｐｐｍ（ｔ、１Ｈ）、７．８０ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、８．１２ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）
［実施例３］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000042
　実施例１－７で得られた化合物（ｐ７）（３００ｍｇ）をアセトニトリル（２ｇ）に溶解した。その後、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（６ｍｇ）とジシクロヘキシルカルボジイミド（６ｍｇ）を添加し、４０℃にて窒素雰囲気下で３時間反応させた。その後、トリエチルアミン（３ｍｇ）とＮ－（２－アミノエチル）マレイミド塩酸塩（５ｍｇ）を添加し、４０℃にて窒素雰囲気下で３時間反応させた。反応終了後、濃縮し、濃縮物を酢酸エチル（５０ｇ）に溶解し、ヘキサン（３０ｇ）を添加して室温にて１５分攪拌して生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、再度酢酸エチル（５０ｇ）に溶解し、ヘキサン（３０ｇ）を添加して室温にて１５分攪拌し、生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過紙、析出物を回収した後、ＢＨＴ（６ｍｇ）を含有したヘキサン（３０ｇ）で洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物（ｐ９）を得た。収量２６４ｍｇ。マレイミド純度は９２％（１Ｈ－ＮＭＲ）。
１Ｈ－ＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）：１．６２ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｊ－ＣＨ３）、１．６４ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、２．０５ｐｐｍ（ｄｄ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＯ－）、２．３０ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＯ－）、２．５９ｐｐｍ（ｄｄ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、２．６６ｐｐｍ（ｔ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ ２ －ＣＨ２－Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）、２．９８ｐｐｍ（ｄｄ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、３．２４ｐｐｍ（ｓ、３Ｈ、－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｊ－Ｏ－ＣＨ ３ ）、３．４８ｐｐｍ（ｍ、約３，８００Ｈ、－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ ２ －ＣＨ ２ ）ｊ－Ｏ－ＣＨ３）、４．７６ｐｐｍ（ｔ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）、６．９８ｐｐｍ（ｓ、２Ｈ、－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ－ＣＯ－）、７．２４ｐｐｍ（ｍ、６Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ 、－ＮＨ－）、７．７３ｐｐｍ（ｔ、１Ｈ）、７．８０ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、８．０１ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ，１Ｈ）、８．１２ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）
［実施例４］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000043
　実施例１－７で得られた化合物（ｐ７）（１．２ｇ）にトルエン（６ｇ）を添加し、４０℃で加温溶解した。その後、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（２４ｍｇ）とジシクロヘキシルカルボジイミド（２４ｍｇ）を添加し、４０℃にて窒素雰囲気下で３時間反応させた。反応終了後、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、得られたろ液を酢酸エチル（１００ｇ）で希釈し、ヘキサン（５０ｇ）を添加して室温にて３０分攪拌し生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、ＢＨＴ（１０ｍｇ）を含有したヘキサン（５０ｇ）で洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物（ｐ１０）を得た。収量１．０ｇ。活性エステル純度は９１％（１Ｈ－ＮＭＲ）。
１Ｈ－ＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）：１．６２ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｊ－ＣＨ３）、１．６４ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、２．０５ｐｐｍ（ｄｄ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＯ－）、２．３０ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＯ－）、２．５９ｐｐｍ（ｄｄ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、２．７２ｐｐｍ（ｓ、４Ｈ、－ＣＯ－ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －ＣＯ－）、２．９８ｐｐｍ（ｄｄ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、３．２４ｐｐｍ（ｓ、３Ｈ、－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｊ－Ｏ－ＣＨ ３ ）、３．４８ｐｐｍ（ｍ、約３，８００Ｈ、－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ ２ －ＣＨ ２ ）ｊ－Ｏ－ＣＨ３）、４．６１ｐｐｍ（－ＣＨ ２ －ＯＣＯ－Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）、７．２４ｐｐｍ（ｍ、６Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ 、－ＮＨ－）、７．７３ｐｐｍ（ｔ、１Ｈ）、８．１２ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）
［実施例５］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000044
［実施例５－１］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000045
　実施例１－７で得られた化合物（ｐ７）（８００ｍｇ）をトルエン（７ｇ）に４０℃にて加温溶解した後、３－アミノプロピオンアルデヒドジエチルアセタール（９ｍｇ）を添加し、５０℃にて窒素雰囲気下で２時間反応させた。反応終了後、酢酸エチル（１００ｇ）を添加し、均一になるまで攪拌し、ヘキサン（５０ｇ）を添加し、室温にて１５分攪拌して生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、ＢＨＴ（１０ｍｇ）を含有したヘキサン（５０ｇ）で洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物（ｐ１１）を得た。収量６８４ｍｇ。
１Ｈ－ＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）：１．２０ｐｐｍ（ｔ、６Ｈ（ＣＨ ３ －ＣＨ２－Ｏ）２－ＣＨ－）１．６２ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｊ－ＣＨ３）、１．６４ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、１．８５ｐｐｍ（ｄｄ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ３）２）、２．０５ｐｐｍ（ｄｄ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＯ－）、２．３０ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＯ－）、２．５９ｐｐｍ（ｄｄ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、２．９８ｐｐｍ（ｄｄ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、３．２４ｐｐｍ（ｓ、３Ｈ、－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｊ－Ｏ－ＣＨ ３ ）、３．４８ｐｐｍ（ｍ、約３，８００Ｈ、－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ ２ －ＣＨ ２ ）ｊ－Ｏ－ＣＨ３）、３．９１ｐｐｍ（－ＣＨ ２ －ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ３）２）、４．５５ｐｐｍ（ｔ、１Ｈ、－ＣＨ－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ３）２）７．２４ｐｐｍ（ｍ、６Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ 、－ＮＨ－）、７．７３ｐｐｍ（ｔ、１Ｈ）、８．１２ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）
［実施例５－２］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000046
　実施例５－１で得られた化合物（ｐ１１）（６００ｍｇ）をｐＨ１．９０に調整したりん酸緩衝液（６．０ｇ）に溶解し、室温にて窒素雰囲気下で３時間反応させた。反応後、０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を添加し、ｐＨ６．５に調整した後、塩化ナトリウム（１．５ｇ）を添加し溶解した。得られた溶液に０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を添加し、ｐＨを７．１０に調整した後、ＢＨＴ（２ｍｇ）含有のクロロホルム（１０ｇ）を添加して室温にて２０分攪拌し、有機層に生成物を抽出した。有機層と水層を分離し、有機層を回収した後、水層に再度ＢＨＴ（４ｍｇ）含有のクロロホルム（２０ｇ）を添加して、室温で２０分攪拌し、有機層に生成物を抽出した。抽出１回目と２回目で得られた有機層を合わせて４０℃で濃縮し、得られた濃縮物を酢酸エチル（５０ｇ）に溶解し、ヘキサン（３０ｇ）を加えて室温にて１５分攪拌して生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、ＢＨＴ（６ｍｇ）を含有したヘキサン（３０ｇ）で洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物（ｐ１２）を得た。収量４５７ｍｇ。アルデヒド純度は９０％（１Ｈ－ＮＭＲ）。
１Ｈ－ＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）：１．６２ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｊ－ＣＨ３）、１．６４ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、２．０５ｐｐｍ（ｄｄ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＯ－）、２．３０ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＯ－）、２．５９ｐｐｍ（ｄｄ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、２．６６ｐｐｍ（ｄｄ、２Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨＯ）、２．９８ｐｐｍ（ｄｄ、１Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、３．２４ｐｐｍ（ｓ、３Ｈ、－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｊ－Ｏ－ＣＨ ３ ）、３．４８ｐｐｍ（ｍ、約３，８００Ｈ、－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ ２ －ＣＨ ２ ）ｊ－Ｏ－ＣＨ３）、３．９１ｐｐｍ（ｓ、２Ｈ、－ＣＨ ２ －ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨＯ）７．２４ｐｐｍ（ｍ、６Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ 、－ＮＨ－）、７．７３ｐｐｍ（ｔ、１Ｈ）、８．１２ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、９．７２ｐｐｍ（ｓ、１Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨＯ）
［実施例６］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000047
［実施例６－１］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000048
　Ｎ末端を９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）で保護したＬ－グルタミン酸（Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ－ＯＨ）（１６．０ｍｇ）と実施例１－４で得られた化合物（ｐ４）（２．０ｇ）にアセトニトリル（１０ｇ）を添加し、３０℃で加温溶解した。その後、ジイソプロピルエチルアミン（１５ｍｇ）とＤＭＴ－ＭＭ（３９．０ｍｇ）を添加し、室温にて窒素雰囲気下で１時間反応させた。その後、ピペリジン（１１１ｍｇ）を添加し、室温にて窒素雰囲気下で２時間反応させた。反応終了後、反応液をトルエン（８０ｇ）で希釈した後、ヘキサン（４０ｇ）を加えて、室温にて１５分攪拌し生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、再度トルエン（１００ｇ）に溶解し、ヘキサン（５０ｇ）を加えて、室温にて１５分攪拌し生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、ＢＨＴ（１０ｍｇ）を含有したヘキサン（５０ｇ）で洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物（ｐ１３）を得た。収量１．６ｇ。
ＨＰＬＣ：アミン純度９２％。
１Ｈ－ＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）：１．５４ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ（ＮＨ２）－ＣＨ ２ －ＣＨ２－）、１．６２ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－）、１．９７ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ（ＮＨ２）－ＣＨ２－ＣＨ ２ －）、２．７４ｐｐｍ（ｄｄ、１Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、２．８１ｐｐｍ（ｄｄ、１Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ ２ －Ｃ６Ｈ５）、３．１１ｐｐｍ（ｍ、１１Ｈ）、３．２４ｐｐｍ（ｓ、６Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｊ－ＣＨ ３ ）、３．６４ｐｐｍ（ｍ、約３，８００Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｊ－ＣＨ３）、４．４９ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ６Ｈ５）、４．５７ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ６Ｈ５）、７．２５ｐｐｍ（ｍ、１０Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）、７．７４ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、８．４４ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、８．６１ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）
［実施例６－２］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000049
　ε－カプロラクトン（１１４ｍｇ）を１Ｎ　ＮａＯＨ（０．８ｍＬ）に溶解し２時間反応させ、６－ヒドロキシカプロン酸水溶液（０．８８Ｍ）を調製した。また、実施例６－１で得られた化合物（ｐ１３）（１．５ｇ）をアセトニトリル（６ｇ）に溶解した。その後、上記６－ヒドロキシカプロン酸水溶液（８０μＬ）とジイソプロピルエチルアミン（１５ｍｇ）とＤＭＴ－ＭＭ（１６ｍｇ）を添加し、室温にて窒素雰囲気下で１時間反応させた。反応終了後、反応液を４０℃にて濃縮し、得られた濃縮物にクロロホルム（３０ｇ）を添加して溶解した。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１５ｇ）を添加し、室温にて１５分攪拌して洗浄を行った。水層と有機層を分離後、再度、有機層に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１５ｇ）を添加し、室温にて１５分攪拌して洗浄を行い、有機層を回収した。得られたクロロホルム溶液に硫酸マグネシウム（５ｇ）を添加し、３０分攪拌して脱水した後、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過を行った。得られたろ液を４０℃にて濃縮し、濃縮物に酢酸エチル（５０ｇ）を添加して均一になるように攪拌した後、ヘキサン（２５ｇ）を加えて、室温にて１５分攪拌し生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、再度酢酸エチル（５０ｇ）に溶解し、ヘキサン（２５ｇ）を加えて、室温にて１５分攪拌し生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、ＢＨＴ（１０ｍｇ）含有のヘキサン（５０ｇ）で洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物（ｐ１４）を得た。収量１．２ｇ。
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：１．３７ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、ＨＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＯ－ＮＨ－）、１．５５ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、ＨＯ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＯ－ＮＨ－）、１．７７ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｊ－ＣＨ３）、１．８５ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、２．０１ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、ＨＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＯ－ＮＨ－）、３．０１ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、３．２４ｐｐｍ（ｍ、８Ｈ）、３．３８ｐｐｍ（ｓ、６Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｊ－ＣＨ ３ ）、３．６４ｐｐｍ（ｍ、約３，８００Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｊ－ＣＨ３）、４．０３ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ）、４．１４ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、４．４８ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ６Ｈ５）、６．９５ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．００ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．２６ｐｐｍ（ｍ、１０Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）、７．６６ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、８．２９ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）
［実施例６－３］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000050
　実施例６－２で得られた化合物（ｐ１４）（５００ｍｇ）をジクロロメタン（３．５ｇ）に溶解した。その後、炭酸ジ（Ｎ－スクシンイミジル）（５１ｍｇ）とピリジン（２０ｍｇ）を添加し、室温にて窒素雰囲気下で８時間反応させた。反応終了後、５％食塩水（５ｇ）で反応液を洗浄し硫酸マグネシウム（０．１ｇ）を加えて、２５℃で３０分撹拌した後、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過を行った。得られたろ液を濃縮後、濃縮物に酢酸エチル（１００ｇ）を添加して溶解した後、ヘキサン（５０ｇ）を加えて室温にて１５分攪拌し生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、ＢＨＴ（５ｍｇ）含有のヘキサン（２５ｇ）で洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物（ｐ１５）を得た。収量２８６ｍｇ。活性カーボネート純度は９１％（１Ｈ－ＮＭＲ）
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：１．３８ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ－ＯＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＯ－ＮＨ－）、１．５９ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ－ＯＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＯ－ＮＨ－）、１．７５ｐｐｍ（ｍ、６Ｈ）、１．８５ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、２．１３ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ－ＯＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＯ－ＮＨ－）、２．８３ｐｐｍ（ｓ、４Ｈ、－ＣＯ－ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －ＣＯ－）、３．０１ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、３．１９ｐｐｍ（ｍ、６Ｈ）、３．３８ｐｐｍ（ｓ、６Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｊ－ＣＨ ３ ）、３．６４ｐｐｍ（ｍ、約３，８００Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｊ－ＣＨ３）、４．０３ｐｐｍ（ｍ、３Ｈ）、４．１８ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、４．３１ｐｐｍ（ｔ、２Ｈ、Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ－ＯＣＯ－ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＯ－ＮＨ－）、４．５０ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ６Ｈ５）、６．９８ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．１５ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．２６ｐｐｍ（ｍ、１０Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）、７．８１ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、８．３７ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）
［実施例６－４］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000051
　実施例１－２で得られた化合物（ｐ２）（１２５ｍｇ）と実施例６－３で得られた化合物（ｐ１５）（２５０ｍｇ）をジクロロメタン（５０ｇ）に溶解した後、トリエチルアミン（０．５ｇ）を添加して室温にて８時間反応させた。反応後、２０％食塩水（２０ｇ）を添加し、室温にて１５分攪拌し、反応液を洗浄した後、有機層を回収した。有機層に硫酸マグネシウム（５ｇ）を添加し、室温で１５分攪拌した後、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過した。得られたろ液を濃縮後、濃縮物を酢酸エチル（１００ｇ）に溶解し、ヘキサン（５０ｇ）を添加し、室温にて１５分攪拌し、生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、ＢＨＴ（４ｍｇ）を含有したヘキサン（２０ｇ）で洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物（ｐ１６）を得た。収量２４２ｍｇ。
ＨＰＬＣ：カルボン酸純度は９０％
１Ｈ－ＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）：１．２９ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＨ２－ＯＣＯ－）、１．５８ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＯＣＯ－）、１．７５ｐｐｍ（ｍ、６Ｈ）、１．８５ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、２．１３ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＯＣＯ－）、３．０１ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、３．１９ｐｐｍ（ｍ、６Ｈ）、３．３８ｐｐｍ（ｓ、６Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｊ－ＣＨ ３ ）、３．６４ｐｐｍ（ｍ、約５，７００Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ）ｊ－ＣＨ３）、３．９０ｐｐｍ（ｔ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＯＣＯ－）４．０３ｐｐｍ（ｍ、３Ｈ）、４．１８ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、４．３７ｐｐｍ（ｓ、２Ｈ、－ＣＨ ２ －ＣＯＯＨ）４．５０ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ６Ｈ５）、６．９８ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．１５ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、７．２６ｐｐｍ（ｍ、１０Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ－ＣＨ２－Ｃ ６ Ｈ ５ ）、７．８１ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）、８．３７ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ）
［比較例１］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000052
［比較例１－１］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000053
　実施例１－２で得られた化合物（１ｇ）と平均分子量が２０，０００である日油株式会社製「ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ　ＭＥ－２００ＧＳ３」（１ｇ）をジクロロメタン（２０ｇ）に溶解した後、トリエチルアミン（０．２ｇ）を添加して室温にて８時間反応させた。反応後、２０％食塩水（１０ｇ）を添加し、室温にて１５分攪拌し、反応液を洗浄した後、有機層を回収した。有機層に硫酸マグネシウム（３ｇ）を添加し、室温で１５分攪拌した後、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過した。得られたろ液を濃縮後、濃縮物を酢酸エチル（１００ｇ）に溶解し、ヘキサン（５０ｇ）を添加し、室温にて１５分攪拌し、生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、ＢＨＴ（６ｍｇ）を含有したヘキサン（３０ｇ）で洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物（ｐ１７）を得た。収量１．２ｇ。
ＨＰＬＣ：カルボン酸純度は９３％。
１Ｈ－ＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）：１．７３ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｊ－）、２．０３ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＯ－Ｎ－）、２．３４ｐｐｍ（ｔ、４Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＯ－Ｎ－）、３．４０ｐｐｍ（ｓ、６Ｈ、－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｊ－Ｏ－ＣＨ ３ ）、３．５５ｐｐｍ（ｍ、約３，８００Ｈ、－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ ２ －ＣＨ ２ ）ｊ－Ｏ－ＣＨ３）、４．６１ｐｐｍ（ｓ、２Ｈ、－ＣＨ ２ －ＣＯＯＨ）、７．７０ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ、－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＯ－）
［比較例１－２］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000054
　比較例１－１で得られた化合物（ｐ１７）（１．０ｇ）とＮ－Ｆｍｏｃ－エチレンジアミン（１６ｍｇ）をアセトニトリル（２．５ｇ）に溶解した。その後、ジイソプロピルエチルアミン（８ｍｇ）とＤＭＴ－ＭＭ（２０８ｍｇ）を添加し、室温にて窒素雰囲気下で２時間反応させた。その後、ピペリジン（１０７ｍｇ）を添加し、室温にて窒素雰囲気下で２時間反応させた。反応終了後、濃縮し、濃縮物をクロロホルム（５０ｇ）に再溶解し、２０％食塩水（２５ｇ）を添加し、室温にて１５分攪拌して洗浄を行い、有機層を回収した。得られた有機層に硫酸マグネシウム（１０ｇ）を添加し、室温にて３０分攪拌して脱水した後、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過した。得られたろ液を４０℃にて濃縮し、濃縮物にトルエン（１００ｇ）を添加して溶解し、ヘキサン（５０ｇ）を添加して室温にて１５分攪拌し、生成物を析出させた。５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、析出物を回収した後、ＢＨＴを６ｍｇ含有したヘキサン（３０ｇ）で洗浄し、５Ａろ紙を用いて吸引ろ過し、真空乾燥して上記化合物（ｐ８）を得た。収量５８１ｍｇ。
ＨＰＬＣ：アミン純度は９０％。
１Ｈ－ＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）：１．７３ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｊ－）、２．０３ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＯ－Ｎ－）、２．３４ｐｐｍ（ｔ、４Ｈ、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＣＯ－Ｎ－）、２．７６ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＣＨ２－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ ２ －ＮＨ２）、３．４０ｐｐｍ（ｓ、６Ｈ、－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｊ－Ｏ－ＣＨ ３ ）、３．５５ｐｐｍ（ｍ、約３，８００Ｈ、－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ ２ －ＣＨ ２ ）ｊ－Ｏ－ＣＨ３）、３．６６ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、－ＣＨ２－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ ２ －ＣＨ２－ＮＨ２）、３．９１ｐｐｍ（ｓ、２Ｈ、－Ｎ－ＣＨ ２ －ＣＯ－ＮＨ－）、７．７０ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ、－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＯ－）、７．８３ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ、１Ｈ、－ＣＨ２－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ２）
［実施例８］
血清中での安定性試験
　１．５ｍLのエッペンドルフチューブに、マウスまたはヒト血清１ｍＬを加え、実施例２で得られた分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体である化合物（ｐ８）、比較例１－２で得られた非分解性ポリエチレングリコール誘導体である化合物（ｐ１８）、およびメトキシＰＥＧアミン４０ｋＤａをそれぞれ５．０ｍｇ／ｍＬの濃度になるように添加した。３７℃で９６時間インキュベ－ション後、２００μＬをサンプリングし、そこにアセトニトリルを添加し、ボルテックスにて１分間撹拌し、血清中のたんぱく質を析出させ、遠心分離後、上清を回収した。次に脂肪酸等の疎水性物質を除去するため、回収液にヘキサンを添加し、ボルテックスにて１分間撹拌し、遠心分離後、下層を回収した。この溶液を真空条件にて濃縮し、血清中からポリエチレングリコール誘導体の回収を行った。その後、ＧＰＣ分析を行い、分解性ポリエチレングリコール誘導体の分解率を算出した。
　分解率は以下の式にて算出した。
分解率　＝　(試験前の40kDaのピーク面積％　－　試験後の40kDaのピーク面積％)　÷　(試験前の40kDaのピーク面積％)　×　１００
　結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000055
　表１によれば、分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体である化合物（ｐ８）は、非分解性のポリエチレングリコール誘導体である化合物（ｐ１８）、メトキシＰＥＧアミン４０ｋＤａと同様に、血清中において分解はみられなかった。つまり、当該分解性ポリエチレングリコール誘導体が血中では安定であることが示された。
［実施例９］
細胞を用いた分解性試験
　培地ＲＰＭＩ－１６４０（１０％ＦＢＳ　Ｐｎ／Ｓｔ）１０ｍＬを用いて、１００ｍｍディッシュにＲＡＷ２６４．７を１０×１０６ｃｅｌｌ播種し、３７℃で２４時間培養後、実施例２で得られた分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体である化合物（ｐ８）、比較例１－２で得られた非分解性のポリエチレングリコール誘導体である化合物（ｐ１８）およびメトキシＰＥＧアミン４０ｋＤａを１０ｍｇ／ｍＬの濃度になるよう溶解した培地にそれぞれ交換し、３７℃で９６時間培養した。培養後、細胞を１％ＳＤＳ溶液にて溶解し、ＰＢＳにて希釈し、そこにアセトニトリルを添加し、ボルテックスにて１分間撹拌し、細胞溶解液中のたんぱく質を析出させ、遠心分離後、上清を回収した。次に脂肪酸等の疎水性物質を除去するため、回収液にヘキサンを添加し、ボルテックスにて１分間撹拌し、遠心分離後、下層を回収した。この溶液を真空条件にて濃縮し、細胞内からポリエチレングリコール誘導体の回収を行った。
　また、細胞培養に使用した培地中での分解を確認するため、各種ポリエチレングリコール誘導体を１０ｍｇ／ｍＬの濃度になるよう溶解した培地のみで３７℃で９６時間培養し、上記と同操作にてポリエチレングリコール誘導体の回収を行った。
　その後、回収した各種ポリエチレングリコール誘導体のＧＰＣ分析を行い、実施例８と同じ計算式にて分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体の分解率を算出した。
　結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000056
　表２によれば、分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体である化合物（ｐ８）は、細胞内にて効果的に分解し（分解率９９％）、分子量４万から２万に分解することが確認できた。分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体は、細胞培養で用いた培地では分解しないことから、細胞内で特異的に分解されたことが確認できた。一方で、非分解性のポリエチレングリコール誘導体である化合物（ｐ１８）およびメトキシＰＥＧアミン４０ｋＤａにおいては、いずれも細胞内での分解はみられなかった。
　本発明の分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体は、細胞の空胞を引き起こさない高分子量のポリエチレングリコール誘導体であり、生体関連物質を修飾する用途に効果的に用いることができ、生体内の血中で安定であり、且つ細胞内で分解される。
　本出願は、日本で出願された特願２０１９－１７６２５１を基礎としており、その内容は本明細書にすべて包含されるものである。

Claims (12)

  1. 　細胞内にて分解するオリゴペプチドを分子内に有する下式（１）で示される分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式中、ｋ１およびｋ２はそれぞれ独立して１～１２であり、ｊ１及びｊ２はそれぞれ独立して４５～９５０であり、Ｒは水素原子、置換もしくは置換されていない炭素数１～１２のアルキル基、置換アリール基、アラルキル基またはヘテロアルキル基であり、Ｚは細胞内の酵素で分解するオリゴペプチドであり、Ｘは生体関連物質と反応可能な官能基であり、Ｌ１及びＬ２はそれぞれ独立して単結合もしくは２価のスペーサーである。）
  2. 　Ｚのオリゴペプチドが、システインを除く中性アミノ酸からなる２～８残基の分解性オリゴペプチドである請求項１記載の分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
  3. 　Ｚのオリゴペプチドが、Ｃ末端のアミノ酸にグリシンを有するペプチドである請求項１～２のいずれか１項記載の分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
  4. 　Ｚのオリゴペプチドが、ハイドロパシー指標が２．５以上である疎水性のアミノ酸を少なくとも1つ有するオリゴペプチドである請求項１～３のいずれか１項記載の分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
  5. 　Ｌ１及びＬ２がそれぞれ独立して、単結合、ウレタン結合、アミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、２級アミノ基、ウレア結合、またはこれら結合および／または基を含んだアルキレン基である請求項１～４のいずれか１項記載の分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
  6. 　Ｘが活性エステル基、活性カーボネート基、アルデヒド基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、エポキシ基、マレイミド基、ビニルスルホニル基、アクリル基、スルホニルオキシ基、カルボキシ基、チオール基、ジチオピリジル基、α－ハロアセチル基、アルキニル基、アリル基、ビニル基、アミノ基、オキシアミノ基、ヒドラジド基およびアジド基よりなる群から選択される、請求項１～５のいずれか１項記載の分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
  7. 　下式（２）で示される分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （式中、ｋ１およびｋ２はそれぞれ独立して１～１２であり、ｊ１及びｊ２はそれぞれ独立して４５～９５０であり、Ｒは水素原子、置換もしくは置換されていない炭素数１～４のアルキル基、置換アリール基、アラルキル基またはヘテロアルキル基であり、Ｗはグルタミン酸またはリジンを中心とした対称構造の５～４７残基のオリゴペプチドであり、ａは２～８であり、Ｘは生体関連物質と反応可能な官能基であり、Ｌ１及びＬ２はそれぞれ独立して単結合もしくは２価のスペーサーである。）
  8. 　Ｗのグルタミン酸またはリジンを中心とした対称構造のオリゴペプチドが、以下のｗ１またはｗ２の構造を有するオリゴペプチドである請求項７記載の分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     （式中、Ｑはグルタミン酸またはリジンの残基であり、Ｚはシステインを除く中性アミノ酸からなる２～５残基の分解性オリゴペプチドである。）
  9. 　Ｚの分解性オリゴペプチドが、Ｃ末端のアミノ酸としてグリシンを有するオリゴペプチドである請求項８の分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
  10. 　Ｚの分解性オリゴペプチドが、ハイドロパシー指標が２．５以上である疎水性の中性アミノ酸を少なくとも１つ有するオリゴペプチドである請求項８～９のいずれか１項記載の分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
  11. 　Ｌ１及びＬ２がそれぞれ独立して、単結合、ウレタン結合、アミド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、２級アミノ基、ウレア結合、またはこれらの結合および／または基を含んでいてもよいアルキレン基である請求項７～１０のいずれか１項記載の分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
  12. 　Ｘが活性エステル基、活性カーボネート基、アルデヒド基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、エポキシ基、マレイミド基、ビニルスルホニル基、アクリル基、スルホニルオキシ基、カルボキシ基、チオール基、ジチオピリジル基、α－ハロアセチル基、アルキニル基、アリル基、ビニル基、アミノ基、オキシアミノ基、ヒドラジド基およびアジド基よりなる群から選択される、請求項７～１１のいずれか１項記載の分岐型の分解性ポリエチレングリコール誘導体。
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