WO2021066113A1 - 細胞培養用組成物の製造方法、それにより得られる細胞培養用組成物及びそれを用いた細胞培養方法 - Google Patents

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透 朝日
裕太 岡本
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    • C12N2523/00—Culture process characterised by temperature

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a cell culture composition, a cell culture composition obtained thereby, and a cell culture method using the same.
  • Mammalian cells are used in various research and industrial fields such as medicine, pharmacy, science and technology, agriculture, and veterinary medicine. Research has elucidated the etiology and led to the development of treatments for them. Biopharmacy and vaccines produced by cells are used for the treatment / prevention of various diseases. Furthermore, cultured cells have greatly contributed to the development of basic academic fields such as cell biology, biochemistry, genetics, physiology, and molecular biology. More recently, cultured muscle cells have been used as a cell source for "cultured meat.” The protein production efficiency of "cultured meat” is much more efficient than the production by conventional livestock breeding, and by changing the meat production from the conventional livestock breeding to the cultured meat production system, up to 99% of land use can be used.
  • Medium is indispensable for culturing mammalian cells, and a large amount of medium is used for cell research.
  • the medium contains various nutrients, the main ones being glucose and amino acids. These nutrients are generally derived from cereals and heterotrophic microorganisms, which also require various nutrients derived from cereals. Cultivation of grains requires a lot of chemical fertilizers and pesticides, requires a huge amount of energy, and can cause greenhouse gas (GHG) generation and environmental pollution. Conversely, grain production is greatly affected by environmental changes such as global warming and environmental pollution.
  • Non-Patent Documents 1 to 3 wastewater treatment utilizing the nitrogen assimilation ability of microalgae and fixation of carbon dioxide gas generated from combustion of fossil fuels.
  • Microalgae synthesize nutrients such as carbohydrates (sugars) and lipids from carbon dioxide by photosynthesis, and produce amino acids using nitrogen gas / ammonia / nitrate. Microalgae produce various nutrients by utilizing solar energy and inorganic substances. Those nutrients produced by microalgae are vigorously utilized in the energy and food industry fields. For example, lipids extracted from microalgae are expected as an alternative energy to petroleum (Non-Patent Document 4). Moreover, glucose extracted from microalgae is used as a nutrient for yeast that produces bioethanol (Non-Patent Documents 5 to 6).
  • Microalgae are generally considered to be photosynthetic organisms that synthesize nutrients most efficiently with almost no residue (Non-Patent Document 11).
  • Patent Documents 1 and 2 describe that extracts of microalgae can partially substitute the function of serum in cell culture.
  • a synthetic medium eg, inorganic salt medium
  • An object of the present invention is to establish a novel cell culture system that reduces the risk of environmental load and influence on environmental changes.
  • the present inventors have conducted research and development by examining from various angles in order to solve the above problems. As a result, it was surprisingly found that cells can be cultured in a medium supplemented with nutrients extracted from microalgae (for example, a medium containing no amino acids and / or vitamins). That is, the present invention includes the following aspects.
  • a cell culture composition containing algae-derived components The components are as follows: (1) A step of subjecting algae to an acid hydrolysis treatment and / or an alkali hydrolysis treatment, and (2) a step of neutralizing the hydrolysis product obtained by the above step (1).
  • the composition which is obtained by a step including.
  • Items 1 to 3 in which the algae are selected from the group consisting of unicellular green algae, unicellular indigo algae, unicellular red algae, unicellular axle algae, and unicellular Aosa algae network. The composition according to any one of the above.
  • the algae are Chlorococcum littorale, Sticococcus sp., Chlorella vulgaris Beijerinck, Euglena glassi sul salis salis salis ), The composition according to any one of items 1 to 4, which is selected from the group consisting of Arthrospira platensis.
  • the components are as follows: (1) A step of subjecting algae to an acid hydrolysis treatment and / or an alkali hydrolysis treatment, and (2) a step of neutralizing the hydrolysis product obtained by the above step (1).
  • a method characterized in that it is obtained by a process comprising.
  • the method according to item 8 wherein the cell is an animal cell.
  • the algae are unicellular algae.
  • the algae are Chlorococcum littorale, Sticococcus sp., Chlorella vulgaris Beijerinck, Euglena vulgaris spirulina glass ), The method according to any one of items 8 to 11, wherein one or more is selected from the group consisting of Arthrospira platensis. [13] The method according to any one of items 8 to 12, wherein the step (1) is carried out under pressure. [14] The method according to any one of items 8 to 13, wherein the step (1) is carried out at 60 ° C to 200 ° C.
  • a method for producing a composition for cell culture Less than: (1) A step of subjecting algae to an acid hydrolysis treatment and / or an alkali hydrolysis treatment; and (2) a step of neutralizing the hydrolysis product obtained by the above step (1) to obtain an algae extract; (3) A step of mixing the algae extract with a cell culture medium, wherein the cell culture medium does not substantially contain L-glutamine.
  • the production method [16]
  • the cell culture medium further contains L-arginine, L-cystine, glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-leucine, L-lysine, L-methionine, L-phenylalanine, L-serine, and the like. 15.
  • the method according to any one of items 15 to 18, wherein the cell culture medium is an inorganic salt medium.
  • the method according to any one of items 15 to 19, wherein the cells to be cultured are animal cells.
  • the method of the present invention it is possible to easily extract nutrients necessary for cell culture from microalgae, and to provide a new cell culture system that is inexpensive and reduces the environmental load.
  • DMEM Dulbecco's improved Eagle's medium supplemented with 10% fetal bovine serum and 1% penicillin / streptomycin. Glucose extraction from microalgae.
  • DMEM Dulbecco's improved Eagle's medium supplemented with 10% fetal bovine serum and 1% penicillin / streptomycin. Amino acid extraction from microalgae.
  • DMEM Dulbecco's improved Eagle's medium supplemented with 10% fetal bovine serum and 1% penicillin / streptomycin. Effect of glutamine and glutamic acid on mammalian cell culture.
  • the data expressed the relative viable cell number calculated from the absorbance as an average ⁇ SD (n 7). Culturing mammalian cells using nutrient-deficient medium and algae extract.
  • C C2C12 mouse myoblasts were cultured in glucose / amino acid-free medium with / without addition of an extract from Chlorella vulgaris (C. vulgaris).
  • E C2C12 mouse myoblasts with / without the addition of extracts from Chlorellaccum littorale (C. littorale), Chlorella bulgaris (C.
  • Bovine muscle tissue-derived cells with or without DMEM with or without addition of 10% fetal bovine serum (FBS), or with addition of an extract from 10% fetal bovine serum (FBS) or Chlorella vulgaris (C. vulgaris) / Cultivated in an inorganic salt culture without accompanying.
  • FBS fetal bovine serum
  • FBS Chlorella vulgaris
  • the present invention provides a cell culture composition comprising an algae-derived component.
  • the components derived from algae contained in the composition of the present invention are as follows: (1) A step of subjecting algae to an acid hydrolysis treatment and / or an alkali hydrolysis treatment, and (2) a step of neutralizing the hydrolysis product obtained by the above step (1). It is obtained by a step including.
  • the present invention provides a method for producing a composition for cell culture, and the following: (1) A step of subjecting algae to an acid hydrolysis treatment and / or an alkali hydrolysis treatment; and (2) a step of neutralizing the hydrolysis product obtained by the above step (1) to obtain an algae extract; (3) A step of mixing the algae extract with a cell culture medium, wherein the cell culture medium does not substantially contain L-glutamine. including.
  • the cell culture medium that can be used in the present invention further includes L-arginine, L-cystine, glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-leucine, L-lysine, L-lysine. It can be a cell culture medium that is substantially free of one or more amino acids selected from the group consisting of methionine, L-phenylalanine, L-serine, L-threonine, L-tryptophane, L-tyrosine, and L-valine. ..
  • the cell culture medium that can be used in the present invention can be a cell culture medium that is substantially free of vitamins.
  • the vitamin-free cell culture media that can be used in the present invention include, for example, pantothenic acid, choline chloride, folic acid, i-inositol, niacinamide, pyridoxine, riboflavin, thiamine, and their pharmaceuticals. It may be substantially free of vitamins selected from the group consisting of acceptable salts.
  • the cell culture medium that can be used in the present invention may be a cell culture medium that is substantially free of glucose, and is a cell culture medium that is substantially free of pyruvate. You may.
  • substantially free means that the substance is hardly contained, but does not mean that the substance is not contained at all, for example.
  • Glucose may be contained in less than 10 mg / L, which is the lower limit of quantification, and for example, amino acids (for example, L-glutamine, etc.) may be contained in less than 0.1 mg / L, which is the lower limit of quantification.
  • amino acids for example, L-glutamine, etc.
  • it may be contained in less than 1 ⁇ g / L, which is the lower limit of quantification.
  • algae is a general term for organisms that produce oxygen by photosynthesis, excluding moss plants, fern plants, and seed plants that mainly inhabit the ground. Algae can produce oxygen and nutrients (for example, glucose and amino acids) by themselves and can grow if the environment necessary for photosynthesis is prepared.
  • the present invention has been completed by finding that cells can be cultured in a medium supplemented with a composition containing a component extracted from algae.
  • the algae used in one embodiment of the present invention may be "unicellular algae (also referred to as” microalgae ").
  • the term "unicellular algae” refers to algae in which an individual is composed of a single cell, and also includes a single-celled algae in which a plurality of unicellular algae individuals gather to form a colony.
  • green algae with chlorophyll a and b as the main pigments of chloroplasts unicellular cyanobacteria with chlorophyll d as the main pigment
  • unicellular red algae with chlorophyll a and phycobilin protein as the main pigments.
  • An example of single-celled algae is given.
  • Chlamydomonas reinhardti Japanese name: Chlamydomonas
  • Dunaliella salina Japanese name: Donariella
  • Dunaliella salina Japanese name: Donariella
  • Chlamydomonas reinhardtii Japanese name: Chlamydomonas reinhardtii
  • Chlamydomonas reinhardtii Japanese name: Chlamydomonas reinhardtii
  • Chlamydomonas reinhardtii Volvox carteri (Japanese name: Volvox), Chlamydomonas chlorococcum littorale
  • Chlamydomonas hydrodiction reticleatum Japanese name: Hydrodictyon reticulatum
  • Pediastrum duplex Japanese name: Chlamydomonas
  • Senedesmus dimorphus Japanese names: Scenedesmus
  • Chlamydomonas chlorella Chlamydomonas chlorella
  • Chlamydomonas chlorella Chlamydomonas
  • Examples of unicellular cyanobacteria include Acariochloris marina of the phylum Cyanobacteria, Spirulina subsalsa, and Arthrospira platensis.
  • Cyanidium caldarium Japanese name: Cyanidiophyceae
  • Cyanidiophyceae Cyanidiophyceae
  • Cyanidiophyceae Cyanidiophyceae
  • Cyanidiophyceae Cyanidiophyceae
  • Cyanidiophyceae Cyanidiophyceae
  • Cyanidiophyceae Cyanidiophyceae
  • Cyanidiophyceae Cyanidiophyceae
  • Cyanidiophyceae Cyanidiophyceae
  • Cyanidiophyceae Cyanidiophyceae
  • Cyanidiophyceae Cyanidiophyceae
  • Cyanidiophyceae Cyanidiophyceae
  • Cyanidiophyceae Cyanidiophyceae
  • Cyanidiophyceae Cyanidiophyceae
  • Cyanidiophyceae Cyanidiophyceae
  • unicellular axle algae examples include the genus Sticococcus sp. Of the order Charales Klebsormidium of the phylum Green algae. Further, Filamentous-ulvophyte, which is a unicellular Ulvophytes algae, can be mentioned.
  • the algae used in the present invention may be a genetically modified product of the above-mentioned algae, and is not limited to the above-mentioned algae.
  • natural algae may be used, or algae grown by a known culture method may be used.
  • the algae-derived component contained in the composition used in the present invention can be extracted by carrying out a step of subjecting the algae to an acid hydrolysis treatment and / or an alkali hydrolysis treatment.
  • biopolymers such as proteins and polysaccharides are organic or inorganic with water added under heating (eg, 60 ° C. to 200 ° C., preferably 80 ° C. to 180 ° C., more preferably 90 ° C. to 150 ° C.).
  • the "acid hydrolysis treatment” means a hydrolysis treatment using a strong acid
  • the "alkali hydrolysis treatment” means a hydrolysis treatment using a strong alkali
  • the reaction time can be adjusted according to the type, amount, or concentration of the algae used, or the pH and temperature of the reaction solution, and the reaction time can be adjusted, for example, 1. It may be carried out for ⁇ 1440 minutes, 3 to 720 minutes, 5 to 360 minutes, 5 to 120 minutes, or 5 to 30 minutes.
  • only acid hydrolysis treatment may be carried out, only alkali hydrolysis treatment may be carried out, and acid hydrolysis treatment and alkali hydrolysis treatment may be carried out. Both processes may be carried out.
  • the acid hydrolysis treatment and the alkali hydrolysis treatment are carried out, the acid hydrolysis treatment may be followed by the alkali hydrolysis, or the alkali hydrolysis treatment may be followed by the acid hydrolysis treatment.
  • a neutralization treatment may be carried out between the acid hydrolysis treatment and the alkali hydrolysis treatment.
  • the algae used in step (1) may be subjected to a drying treatment before being subjected to an acid hydrolysis treatment and / or an alkali hydrolysis treatment.
  • step (1) may be carried out under pressure.
  • under pressure means atmospheric pressure, that is, a pressure condition higher than 1 atm, for example, 1.1 atm or more, 1.5 atm or more, 1.8 atm or more, or 2 atm or more. It may be carried out at. For example, it may be 1.1 to 300 atm, 1.5 to 200 atm, 1.8 to 100 atm, 2 to 50 atm, for example, 2 to 20 atm.
  • the pressurizing condition may be carried out by any device or method, and for example, the pressurizing condition can be realized by using an autoclave.
  • the composition of the present invention is obtained by carrying out a step (step (2)) of neutralizing the hydrolyzate obtained in the step (1).
  • step (2) the hydrolyzate is neutralized and can be used for cell culture.
  • a basic substance or an aqueous solution thereof for example, sodium hydroxide, potassium hydroxide or an aqueous solution thereof
  • a basic substance or an aqueous solution thereof for example, sodium hydroxide, potassium hydroxide or an aqueous solution thereof
  • step (1) when alkaline hydrolysis is finally carried out, an acidic substance (for example, sodium hydroxide, potassium hydroxide, etc.) or an aqueous solution thereof (hydrochloric acid, sulfuric acid, trifluoroacetic acid, p-toluene) Sulfuric acid, methanesulfonic acid, etc.) may be added to neutralize.
  • an acidic substance for example, sodium hydroxide, potassium hydroxide, etc.
  • aqueous solution thereof hydroochloric acid, sulfuric acid, trifluoroacetic acid, p-toluene
  • Sulfuric acid, methanesulfonic acid, etc. may be added to neutralize.
  • compositions of the present invention are used to culture cells such as prokaryotic cells (eg, Escherichia coli, lactic acid bacteria, bacilli, cyanobacteria, etc.) and eukaryotic cells (yeast, plant cells, insect cells, animal cells, etc.), especially animal cells. Can be used for.
  • prokaryotic cells eg, Escherichia coli, lactic acid bacteria, bacilli, cyanobacteria, etc.
  • eukaryotic cells eukaryotic cells
  • yeast plant cells, insect cells, animal cells, etc.
  • the origins of mammalian cells are, for example, mice, rats, rabbits, humans. , Horses, cows, monkeys, pigs, dogs, sheep, cats, goats, etc., but not limited to these.
  • it may be a primary cell collected from a living tissue, a cell that has been established, and a pluripotent stem cell (for example, ES cell, ntES cell, Muse cell, iPS cell) or a tissue stem cell (for example, ES cell, ntES cell, Muse cell, iPS cell) or tissue stem cell (for example, ES cell, ntES cell, Muse cell, iPS cell).
  • a pluripotent stem cell for example, ES cell, ntES cell, Muse cell, iPS cell
  • a tissue stem cell for example, ES cell, ntES cell, Muse cell, iPS cell
  • tissue stem cell for example, ES cell, ntES cell, Muse cell, iPS cell
  • it may be a mesenchymal stem cell) or a cell whose differentiation is induced from them.
  • the composition used in the present invention may contain one or more algae-derived components, and may contain, for example, two or more algae-derived components.
  • it may be a composition containing a combination of a component derived from algae containing a large amount of glucose and a component derived from algae containing a large amount of amino acids constituting a protein.
  • the present invention is a method for culturing cells in a medium to which a cell culture composition containing algae-derived components is added.
  • the components are as follows: (1) A step of subjecting algae to an acid hydrolysis treatment and / or an alkali hydrolysis treatment, and (2) a step of neutralizing the hydrolysis product obtained by the above step (1).
  • the method for culturing cells according to the present invention is (3) a step of mixing the algae extract with a cell culture medium, wherein the cell culture medium contains L-glutamine. It may include steps, which are substantially non-existent.
  • the medium to which the composition containing the algae-derived component is added may be appropriately selected depending on the type of cells to be cultured, but a medium having a buffering action is preferable, for example, phosphate buffering.
  • a medium having a buffering action is preferable, for example, phosphate buffering.
  • glucose and / or protein-constituting amino acids eg, L-glutamine, L-arginine, L-cystine, glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-leucine, L-lysine, etc. It is substantially free of (one or more amino acids selected from the group consisting of L-methionine, L-phenylalanine, L-serine, L-threonine, L-tryptophane, L-tyrosine, and L-valine). May be good.
  • the medium may be a liquid medium or a solid medium.
  • the composition containing the algae-derived component of the present invention By adding the composition containing the algae-derived component of the present invention to the medium, nutrients necessary for cell survival (for example, glucose and proteinogenic amino acids, vitamins, etc.) are supplied, and cell culture becomes possible. ..
  • the ratio of adding the composition containing the algae-derived component to the medium may be appropriately adjusted according to the type of cells to be cultured, and for example, the total volume of the medium to which the composition containing the algae-derived component is added.
  • the composition containing the algae-derived component was 0.1 to 99% (v / v), 1 to 80% (v / v), 2 to 50% (v / v), and 3 to 20%. (V / v), 3 to 15%, or 3 to 12% (v / v) may be contained.
  • Example 1 1. Materials and methods 1-1. Microalgae culture In this study, the green alga Chlorococcum littoral (C.littorale) (NBRC 102761), Sticococcus sp. (NBRC 102709) (Independent Chemical Corporation, Product Evaluation Technology Infrastructure Organization (NITE) ), Chiba Prefecture, Japan), Chlorella vulgaris Beijerinck (C. vulgaris) (NIES-2170) and Euglena gracilis (E. gracilis) (NIES-49) Eukaryotic microalgae and Spirulina subsalsa (S. subsalsa) (NIES-3373) and Arthrospira platensis (A.
  • Microalgae were cultured in a suspension culture flask (AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka Prefecture, Japan) under continuous lighting (about 500 to 700 lux) at room temperature (25 ° C.) [Reference 1]. Phase-difference images of these microalgae were acquired by a microscope (ELIPSE TS2, Nikon Corporation, Tokyo, Japan) using software (NIS-Ellipses BR, Nikon).
  • C2C12 cells were seeded in 96-well plates (AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japan) at a density of 10,000 cells / well and overnight in DMEM supplemented with 10% FBS and 1% P / S. It was cultured. After culturing overnight, the medium was discarded and washed twice with phosphate buffered saline (PBS, Sigma-Aldrich). The cells were then cultured using algae extract or a nutrient-deficient medium containing / without glucose / glutamic acid. The cells to which the solution was added were incubated for 2 days.
  • APC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japan a density of 10,000 cells / well and overnight in DMEM supplemented with 10% FBS and 1% P / S. It was cultured. After culturing overnight, the medium was discarded and washed twice with phosphate buffered saline (PBS, Sigma-Aldrich). The cells were then cultured
  • each solution was taken immediately prior to performing the XTT assay, 100 ⁇ L of 10% FBS and 1% P / S were added, followed by 50 ⁇ L of XTT reagent. Subsequent cell life / death discrimination tests were performed according to the protocol.
  • Glucose-free DMEM Invitrogen
  • glucose / glutamine-free DMEM Invitrogen
  • glucose / amino acid-free DMEM United State Biological, Massachusetts, USA
  • the medium used in Examples 1 and 2 had the following composition.
  • Glycine 30 mg / L -L-histidine: 42 mg / L -L-isoleucine: 105 mg / L -L-leucine: 105 mg / L -L-lysine: 146 mg / L ⁇ L-Methionine: 30 mg / L -L-Phenylalanine: 66 mg / L -L-serine: 42 mg / L -L-threonine: 95 mg / L ⁇
  • Inorganic salt medium By using algae extract, sugar (glucose / pyruvate), amino acids (L-arginine, L-cystine, L-glutamine, glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-leucine, L-lysine, L-methionine, L-phenylalanine, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine, L-valine) and vitamins (pantothenic acid, choline chloride, folic acid, i-inositol, niacinamide, Pyridoxin, riboflavin, thiamine) were used to show that they could be substituted.
  • amino acids L-arginine, L-cystine, L-glutamine, glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-leucine, L-lysine, L-methionine, L-phenylalanine, L
  • the concentration of glucose extracted from the littoral was 2.4 ⁇ 0.3 g / L at 10 g / L and 13.1 ⁇ 1.5 g / L at 50 g / L.
  • the glucose concentration extracted from platensis was 1.9 ⁇ 0.3 g / L at 10 g / L and 10.8 ⁇ 0.6 g / L at 50 g / L (FIG. 1C). This result indicates that the glucose concentration also increased in proportion to the concentration of microalgae.
  • the algae extracts contained 3-4 times more glucose than conventional mammalian culture medium (DMEM supplemented with 10% FBS and 1% P / S) (Fig. 1C).
  • Amino acid extraction from microalgae DMEM contains 15 of 20 proteinogenic amino acids. These 15 amino acids are the amino acids from arginine to valine, shown on the left side of FIG.
  • C.I. Amino acids in the extract from littoral were quantitatively analyzed. The concentrations of all 15 amino acids in the algal extract were lower than those in the medium (Fig. 2A).
  • a 24-hour heat treatment has been used for efficient acid hydrolysis of proteins [Reference 4]. Therefore, in order to improve the extraction efficiency, amino acids were extracted using 1N sulfuric acid at 100 ° C. for 24 hours. This method increased the concentration of extracted amino acids (Fig. 2A).
  • microalgae having the highest amino acid yield among the 6 species of microalgae were examined.
  • C.I. The extract obtained from vulgaris was found to contain the most abundant amino acids (Fig. 2B). This result is based on C.I. Consistent with the relatively high protein concentration of vulgaris.
  • most of the amino acids contained in any algae species were recovered at the same or higher amino acid concentrations as those contained in the medium for mammalian cells. Was shown (Fig. 2B).
  • the initial algae concentration was increased from 10 g / L to 50 g / L in order to obtain a microalgae extract with a higher amino acid concentration.
  • the concentration of each amino acid was further increased by increasing the algae concentration (Fig. 2C).
  • Glutamine was not extracted by the acid hydrolysis method, but DMEM contains a large amount of glutamine (Fig. 2).
  • glutamic acid was contained in the microalgae extract, but DMEM did not contain glutamic acid (Fig. 2).
  • the trace amounts of glutamic acid detected in FIG. 2 appear to be derived from supplemented 10% FBS or resulting from the degradation of glutamine. Therefore, it was investigated whether glutamic acid could be used as a substitute for glutamine (surrogate) in mammalian cell culture.
  • the algae extract functioned as a nutrient substitute for the culture of mammalian cells. Since the use of cereals for the production of biofuels competes with food, microalgae that do not compete with food are promising in the field [Reference 7]. This study showed the possibility of novel cell culture systems that reduce environmental impact and protect against environmental changes, as well as the potential of microalgae to replace any grain-dependent culture system. ..
  • Example 2 An extract was prepared from Chlorella vulgaris Beijerinck by the method described in Example 1-2. Using DMEM or an inorganic salt medium as the medium, the effect of the chlorella-derived algae extract on the culture results of bovine muscle tissue-derived cells was investigated. The experimental method was carried out by the method described in 1-3 of Example 1. As the bovine muscle tissue-derived cells, bovine cheek muscle cells purchased from Tokyo Meat Market Co., Ltd. were treated with protease and isolated cells were used.
  • Example 3 An extract was prepared from Chlorella vulgaris Beijerinck by the method described in Example 1-2. Using DMEM or an inorganic salt medium as the medium, it was investigated what kind of effect the presence or absence of chlorella-derived algae extract and the presence or absence of fetal bovine serum (FBS) had on the culture results of bovine muscle tissue-derived cells. The experimental method was carried out by the method described in 1-3 of Example 1.
  • FBS fetal bovine serum
  • Example 4 An extract was prepared from Chlorella vulgaris Beijerinck by the method described in Example 1-2. Using DMEM or inorganic salt medium as the medium, the presence or absence of chlorella-derived algae extract and the presence or absence of fetal bovine serum (FBS) bring about what effect the culture results of bovine muscle tissue-derived cells, especially the cell growth phase, have. I checked. The experimental method was carried out by the method described in 1-3 of Example 1.
  • FBS fetal bovine serum

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Abstract

本発明は、細胞培養用組成物の製造方法であって、　以下： （１）藻類を、酸加水分解処理及び／又はアルカリ加水分解処理に供する工程；及び （２）前記工程（１）により得られる加水分解産物を中和し、藻類抽出物を得る工程； （３）前記藻類抽出物を細胞培養用培地と混合する工程であって、前記細胞培養用培地はＬ－グルタミンを実質的に含まないものである、 を含む、方法を提供する。

Description

細胞培養用組成物の製造方法、それにより得られる細胞培養用組成物及びそれを用いた細胞培養方法
　本発明は、細胞培養用組成物の製造方法、それにより得られる細胞培養用組成物、及びそれを用いた細胞培養方法に関する。
　哺乳類細胞は医学、薬学、科学技術、農学、獣医学等といった様々な研究・産業分野において利用されている。研究は病因を解明し、それらの治療法の開発に至った。様々な疾患の治療／予防のために、細胞により生産されたバイオ医薬やワクチンが利用されている。更に、培養細胞は、細胞生物学、生化学、遺伝学、生理学、分子生物学等といった基礎的学術分野の進展にも大きく貢献した。より最近になって、培養した筋細胞が「培養肉」の細胞源として利用されている。「培養肉」のタンパク質生産効率は従来の家畜飼育による生産に比べはるかに効率的であり、食肉生産を従来の家畜飼育によるものから培養肉生産システムに変えることで、最大で９９％の土地利用、９６％の水消費、９６％の温室効果ガス排出、４５％のエネルギー消費を削減できるとの報告もある。そのため今後培養細胞を用いた食肉生産が持続可能な食料生産システムとして世界的に広がってくると考えられている。将来、食料としての培養哺乳類細胞の使用により、莫大な量の細胞が必要になるであろう。
　哺乳類細胞の培養には培地が不可欠であり、大量の培地が細胞研究に用いられる。培地は様々な栄養素を含むが、主なものはグルコースとアミノ酸である。それらの栄養素は一般に穀物や従属栄養微生物に由来し、それらの微生物も穀物に由来する様々な栄養素を必要とする。穀物の栽培は多くの化学肥料と農薬を必要とし、莫大な量のエネルギーを要し、温室効果ガス（ＧＨＧ）の発生と環境汚染を引き起こす恐れがある。逆に、穀物生産は地球温暖化や環境汚染などの環境変化により大きく影響を受ける。
　現在のところ、１５０，０００種以上の藻類がＡｌｇａｅＢａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｌｇａｅｂａｓｅ．ｏｒｇ／）に登録されており、この数は日々更新されている。種の多様性のため、藻類の形質は多岐にわたり、純水か海水のいずれか又はその両方の環境で生育する種から、好塩基性及び好アルカリ性種にまで及ぶ。それらの特徴に応じ、多様な用途が現在開発されつつある。その中には、微細藻類の窒素同化能を利用する排液処理や、化石燃料の燃焼から発生する二酸化炭素ガスの固定が含まれる（非特許文献１～３）。
　微細藻類は、炭水化物（糖類）や脂質をはじめとする栄養素を光合成により二酸化炭素から合成し、窒素ガス／アンモニア／硝酸塩を使ってアミノ酸を産生する。微細藻類は太陽エネルギーと無機物を利用することによって様々な栄養素を生産する。微細藻類によって生産されたそれらの栄養素は、エネルギー及び食品産業分野において精力的に利用される。例えば、微細藻類から抽出された脂質は、石油に代わる代替エネルギーとして期待されている（非特許文献４）。その上、微細藻類から抽出されたグルコースは、バイオエタノールを生産する酵母の栄養素として利用されている（非特許文献５～６）。更に、微細藻類により生産されたアミノ酸を含む栄養素は、栄養補助食品、ペットフード、土壌用の肥料として利用されている（非特許文献７～１０）。微細藻類は、ほとんど残留物なく最も効率的に栄養素を合成する光合成生物であると一般に考えられている（非特許文献１１）。
　インビトロにおいて細胞を培養するためには、アミノ酸、ビタミン、ミネラル等を含む合成培地に加えて、多くの場合は、牛の胎児、ウシの新生児、馬、ニワトリ、ウサギ等の血清が必要とされている。血清には増殖因子などの細胞の増殖に必要な因子が含まれており、これらが細胞の増殖に不可欠となる場合が多い。しかしながら、血清は、ロット毎に品質が異なっており、安定しておらず、高価であるなどの課題を抱えており、これらを代替する物質が求められていた。そのような課題に対して、特許文献１及び２では、微細藻類の抽出物が、細胞培養において、血清の機能を一部代替し得ることが記載されている。しかしながら、微細藻類の抽出物が、細胞培養に必須であるアミノ酸（特に、グルタミン等）やビタミン等の成分を含まない合成培地（例えば、無機塩培地）との混合によって、細胞を培養し得るかについては全く記載されていない。
特開昭５７－６５１７９号 特開昭５７－２０６３８４号
L. Wang, M. Min, Y. Li, P. Chen, Y. Chen, et al., Cultivation of green algae Chlorella sp. in different wastewaters from municipal wastewater treatment plant. Appl. Biochem. Biotechnol. 162 (2010) 1174-1186. F. Rossi, E.J. Olguin, L. Diels, R. De Philippis, Microbial fixation of CO2 in water bodies and in drylands to combat climate change, soil loss and desertification. N. Biotechnol. 32 (2015) 109-120. J. Cheng, Y. Zhu, Z. Zhang, W. Yang, Modification and improvement of microalgae strains for strengthening CO2 fixation from coal-fired flue gas in power plants. Bioresour. Technol. (2019) doi: 10.1016/j.biortech.2019.121850. I. Ajjawi, J. Verruto, M. Aqui, L.B. Soriaga, J. Coppersmith, et al., Lipid production in Nannochloropsis gaditana is doubled by decreasing expression of a single transcriptional regulator. Nat. Biotechnol.35 (2017) 647-652. S.H. Ho, S.W. Huang, C.Y. Chen, T. Hasunuma, A. Kondo, et al., Bioethanol production using carbohydrate-rich microalgae biomass as feedstock. Bioresour. Technol. 135 (2013) 191-198. G.E. Lakatos, K. Ranglova, J.C. Manoel, T. Grivalsky, J. Kopecky, et al., Bioethanol production from microalgae polysaccharides. Folia Microbiol. (Praha). (2019) doi: 10.1007/s12223-019-00732-0. S. McCusker, P.R. Buff, Z. Yu, A.J Fascetti, Amino acid content of selected plant, algae and insect species: a search for alternative protein sources for use in pet foods. J. Nutr. Sci. 3 (2014) e39. G. Gutierrez-Salmean, L. Fabila-Castillo, G. Chamorro-Cevallos, Nutritional and toxicological aspects of Spirulina (Arthrospira). Nutr. Hosp. 32 (2015) 34-40. E.T. Alori, O.O. Babalola, Microbial inoculants for improving crop quality and human health in Africa. Front. Microbiol. 9 (2018) 2213. M.I. Khan, J.H. Shin, J.D. Kim, The promising future of microalgae: current status, challenges, and optimization of a sustainable and renewable industry for biofuels, feed, and other products. Microb. Cell Fact.17 (2018) 36. A.K. Singh, M.P. Singh, Importance of algae as a potential source of biofuel. Cell Mol. Biol. (Noisy-le-grand). 60 (2014) 106-109.
　本発明は、環境負荷と環境変化への影響のリスクを減らす新規細胞培養系を確立することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために、種々の角度から検討を加えて研究開発を行ってきた。その結果、驚くべきことに、微細藻類から抽出された栄養素を添加した培地（例えば、アミノ酸及び／又はビタミン類を含有しない培地）において、細胞を培養可能であることを見出した。すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
　［１］　藻類由来の成分を含む細胞培養用組成物であって、
　前記成分が、以下：
（１）藻類を、酸加水分解処理及び／又はアルカリ加水分解処理に供する工程、及び
（２）前記工程（１）により得られる加水分解産物を、中和する工程、
を含む工程により得られることを特徴とする、組成物。
　［２］　前記細胞が、動物細胞である、項目１に記載の組成物。
　［３］　前記藻類が、単細胞藻類である、項目１又は２に記載の組成物。
　［４］　前記藻類が、単細胞性の緑藻類、単細胞性の藍藻類、単細胞性の紅藻類、単細胞性の車軸藻類及び単細胞性のアオサ藻網からなる群から１以上選択される、項目１～３のいずれか１項に記載の組成物。
　［５］　前記藻類が、クロロコックム・リトラレ（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ　ｌｉｔｔｏｒａｌｅ）、スティココックス属（Ｓｔｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．）、クロレラ・ブルカリス・ベイエリンク（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ　ｖｕｌｇａｒｉｓ　Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋ）、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ　ｇｒａｃｉｌｉｓ）、スピルリナ・サブサルサ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ　ｓｕｂｓａｌｓａ）、アルスロスピラ・プラテンシス（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ　ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）からなる群から１以上選択される、項目１～４のいずれか１項に記載の組成物。
　［６］　前記工程（１）が、加圧下において実施される、項目１～５のいずれか１項に記載の組成物。
　［７］　前記工程（１）が、６０℃～２００℃で実施される、項目１～６のいずれか１項に記載の組成物。
　［８］　藻類由来の成分を含む細胞培養用組成物を添加した培地において、細胞を培養する方法であって、
　前記成分が、以下：
（１）藻類を、酸加水分解処理及び／又はアルカリ加水分解処理に供する工程、及び
（２）前記工程（１）により得られる加水分解産物を、中和する工程、
を含む工程により得られることを特徴とする、方法。
　［９］　前記細胞が、動物細胞である、項目８に記載の方法。
　［１０］　前記藻類が、単細胞藻類である、項目８又は９に記載の方法。
　［１１］　前記藻類が、単細胞性の緑藻類、単細胞性の藍藻類、単細胞性の紅藻類、単細胞性の車軸藻類及び単細胞性のアオサ藻網からなる群から１以上選択される、項目８～１０のいずれか１項に記載の方法。
　［１２］　前記藻類が、クロロコックム・リトラレ（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ　ｌｉｔｔｏｒａｌｅ）、スティココックス属（Ｓｔｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．）、クロレラ・ブルカリス・ベイエリンク（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ　ｖｕｌｇａｒｉｓ　Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋ）、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ　ｇｒａｃｉｌｉｓ）、スピルリナ・サブサルサ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ　ｓｕｂｓａｌｓａ）、アルスロスピラ・プラテンシス（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ　ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）からなる群から１以上選択される、項目８～１１のいずれか１項に記載の方法。
　［１３］　前記工程（１）が、加圧下において実施される、項目８～１２のいずれか１項に記載の方法。
　［１４］　前記工程（１）が、６０℃～２００℃で実施される、項目８～１３のいずれか１項に記載の方法。
　［１５］　細胞培養用組成物の製造方法であって、
　以下：
（１）藻類を、酸加水分解処理及び／又はアルカリ加水分解処理に供する工程；及び
（２）前記工程（１）により得られる加水分解産物を中和し、藻類抽出物を得る工程；
（３）前記藻類抽出物を細胞培養用培地と混合する工程であって、前記細胞培養用培地はＬ－グルタミンを実質的に含まないものである、
を含む、前記製造方法。
　［１６］　前記細胞培養用培地は、さらに、Ｌ－アルギニン、Ｌ－シスチン、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、及びＬ－バリンからなる群から１又は複数選択されるアミノ酸を実質的に含まない、項目１５に記載の方法。
　［１７］　前記細胞培養用培地が、ビタミン類を実質的に含まない、項目１５又は１６に記載の方法。
　［１８］　前記細胞培養用培地が、グルコースを実質的に含まない、項目１５～１７のいずれか１項に記載の方法。
　［１９］　前記細胞培養用培地が、無機塩培地である、項目１５～１８のいずれか１項に記載の方法。
　［２０］　培養される細胞が、動物細胞である、項目１５～１９のいずれか１項に記載の方法。
　［２１］　前記藻類が、単細胞藻類である、項目１５～２０のいずれか１項に記載の方法。
　［２２］　前記藻類が、単細胞性の緑藻類、単細胞性の藍藻類、単細胞性の紅藻類、単細胞性の車軸藻類及び単細胞性のアオサ藻網からなる群から１以上選択される、項目１５～２１のいずれか１項に記載の方法。
　［２３］　前記藻類が、クロロコックム・リトラレ（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ　ｌｉｔｔｏｒａｌｅ）、スティココックス属（Ｓｔｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．）、クロレラ・ブルカリス・ベイエリンク（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ　ｖｕｌｇａｒｉｓ　Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋ）、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ　ｇｒａｃｉｌｉｓ）、スピルリナ・サブサルサ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ　ｓｕｂｓａｌｓａ）、アルスロスピラ・プラテンシス（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ　ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）からなる群から１以上選択される、項目１５～２２のいずれか１項に記載の方法。
　［２４］
　前記工程（１）が、加圧下において実施される、項目１５～２３のいずれか１項に記載の方法。
　［２５］　前記工程（１）が、６０℃～２００℃で実施される、項目１５～２４のいずれか１項に記載の方法。
　［２６］　項目１５～２５のいずれか１項に記載の方法により得られる、細胞培養用組成物。
　［２７］　項目１５～２５のいずれか１項に記載の方法により得られる細胞培養用組成物を用いる、細胞の培養方法。
　本発明の方法によれば、細胞の培養に必要な栄養素を微細藻類から容易に抽出可能であり、安価であり、かつ環境負荷を低減させる新たな細胞培養系を提供することが可能となる。
微細藻類からのグルコース抽出。（Ａ）グルコースはオートクレーブ条件により緑藻クロロコックム・リトラレ（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ　ｌｉｔｔｏｒａｌｅ）から効率的に抽出された。データは平均±ＳＤ（ｎ＝３～６）として表した。 微細藻類からのグルコース抽出。（Ｂ）グルコースは６種の微細藻類の中でも２つの微細藻類（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ　ｌｉｔｔｏｒａｌｅ及びＡｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ　ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）からより効率的に抽出された（硫酸規定度：０．３６Ｎ；反応温度：１３０℃；反応時間：２０分）。データは平均±ＳＤ（ｎ＝３～６）として表した。ＤＭＥＭ：１０％ウシ胎仔血清と１％ペニシリン／ストレプトマイシンが補充されたダルベッコ改良イーグル培地。 微細藻類からのグルコース抽出。（Ｃ）初期藻類濃度に依存して高グルコース収率が得られた（硫酸規定度：０．３６Ｎ；反応温度：１３０℃；反応時間：２０分）。データは平均±ＳＤ（ｎ＝３～６）として表した。ＤＭＥＭ：１０％ウシ胎仔血清と１％ペニシリン／ストレプトマイシンが補充されたダルベッコ改良イーグル培地。 微細藻類からのアミノ酸抽出。（Ａ）大部分のアミノ酸が１Ｎ塩酸、100℃で24時間によりＣｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ　ｌｉｔｔｏｒａｌｅから最も効率的に抽出された。データは平均±ＳＤ（ｎ＝３～７）として表した。ＤＭＥＭ：１０％ウシ胎仔血清と１％ペニシリン／ストレプトマイシンが補充されたダルベッコ改良イーグル培地。 微細藻類からのアミノ酸抽出。（Ｂ）大部分のアミノ酸が６種の微細藻類の中でもＣｈｌｏｒｅｌｌａ　ｖｕｌｇａｒｉｓ　Ｂｅｉｊｅｒｉｎｓｋから最も効率的に抽出された（塩酸規定度：１Ｎ；反応温度１００℃；反応時間：２４時間）。データは平均±ＳＤ（ｎ＝３～４）として表した。ＤＭＥＭ：１０％ウシ胎仔血清と１％ペニシリン／ストレプトマイシンが補充されたダルベッコ改良イーグル培地。 微細藻類からのアミノ酸抽出。（Ｃ）初期藻類濃度に依存して高アミノ酸収率が得られた（塩酸規定度：１Ｎ；反応温度：１００℃；反応時間：２４時間）。データは平均±ＳＤ（ｎ＝３～４）として表した。ＤＭＥＭ：１０％ウシ胎仔血清と１％ペニシリン／ストレプトマイシンが補充されたダルベッコ改良イーグル培地。 哺乳類細胞培養に対するグルタミンとグルタミン酸の効果。Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞を、グルコース（最終濃度：２５ｍＭ）／グルタミン（最終濃度：４ｍＭ）含有哺乳類細胞培地により、又はグルコース（最終濃度：２５ｍＭ）もしくはグルコース／グルタミン酸（最終濃度：４ｍＭ）の添加を伴う／伴わない、グルコース／グルタミン不含有培地により培養した。データは吸光度から算出した相対生細胞数を平均±ＳＤ（ｎ＝７）として表した。 栄養素欠損培地及び藻類抽出物を使った哺乳類細胞の培養。（Ａ）Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞を、Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ　ｌｉｔｔｏｒａｌｅ（Ｃ．ｌｉｔｔｏｒａｌｅ）からの抽出物の添加を伴う／伴わない、グルコース不含有の哺乳類細胞培地中で培養した。データは吸光度から算出した相対生細胞数を平均±ＳＤ（ｎ＝３～１２）として表した。 栄養素欠損培地及び藻類抽出物を使った哺乳類細胞の培養。（Ｂ）Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞を、Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ　ｌｉｔｔｏｒａｌｅ（Ｃ．ｌｉｔｔｏｒａｌｅ）からの抽出物の添加を伴う／伴わない、グルコース／アミノ酸不含有培地中で培養した。データは吸光度から算出した相対生細胞数を平均±ＳＤ（ｎ＝３～１２）として表した。 栄養素欠損培地及び藻類抽出物を使った哺乳類細胞の培養。（Ｃ）Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞を、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ　ｖｕｌｇａｒｉｓ（Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ）からの抽出物の添加を伴う／伴わない、グルコース／アミノ酸不含有培地中で培養した。データは吸光度から算出した相対生細胞数を平均±ＳＤ（ｎ＝３～１２）として表した。 栄養素欠損培地及び藻類抽出物を使った哺乳類細胞の培養。（Ｄ）Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞を、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ　ｐｌａｔｅｎｓｉｓ（Ａ．ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）からの抽出物の添加を伴う／伴わない、グルコース／アミノ酸不含有培地中で培養した。データは吸光度から算出した相対生細胞数を平均±ＳＤ（ｎ＝３～１２）として表した。 栄養素欠損培地及び藻類抽出物を使った哺乳類細胞の培養。（Ｅ）Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞を、Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ　ｌｉｔｔｏｒａｌｅ（Ｃ．ｌｉｔｔｏｒａｌｅ）、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ　ｖｕｌｇａｒｉｓ（Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ）又はＡｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ　ｐｌａｔｅｎｓｉｓ（Ａ．ｐｌａｔｅｎｓｉｓ））からの抽出物の添加を伴う／伴わない、グルコース／アミノ酸不含有培地中で培養した。データは吸光度から算出した相対生細胞数を平均±ＳＤ（ｎ＝３～１２）として表した。 実施例で使用した微細藻類の写真。（Ａ）緑藻クロロコックム・リトラレ（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ　ｌｉｔｔｏｒａｌｅ）、（Ｂ）スティココックス属（Ｓｔｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．）、（Ｃ）クロレラ・ブルガリス・ベイエリンク（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ　ｖｕｌｇａｒｉｓ　Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋ）、（Ｄ）ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ　ｇｒａｃｉｌｉｓ）、（Ｅ）スピルリナ・サブサルサ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ　ｓｕｂｓａｌｓａ）、（Ｆ）アルスロスピラ・プラテンシス（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ　ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）。目盛：５０μｍ。 無機塩培地及び藻類抽出物を使った哺乳類細胞の培養。ウシ筋肉組織由来細胞を、ＤＭＥＭ、又はＣｈｌｏｒｅｌｌａ　ｖｕｌｇａｒｉｓ（Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ）からの抽出物の添加を伴う／伴わない無機塩培中で培養した。データは吸光度から算出した相対生細胞数を平均±ＳＤ（ｎ＝６）として表した。 無機塩培地及び藻類抽出物を使った哺乳類細胞の培養。ウシ筋肉組織由来細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）の添加を伴う／伴わないＤＭＥＭ、あるいは、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）又はＣｈｌｏｒｅｌｌａ　ｖｕｌｇａｒｉｓ（Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ）からの抽出物の添加を伴う／伴わない無機塩培中で培養した。データは吸光度から算出した相対生細胞数を平均±ＳＤ（ｎ＝３）として表した。 無機塩培地及び藻類抽出物を使った哺乳類細胞の培養。ウシ筋肉組織由来細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）の添加を伴う／伴わないＤＭＥＭ、あるいは、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）又はＣｈｌｏｒｅｌｌａ　ｖｕｌｇａｒｉｓ（Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ）からの抽出物の添加を伴う／伴わない無機塩培中で培養した。データは生細胞数を平均±ＳＤ（ｎ＝４）として表した。
　以下、本発明の実施形態について、必要に応じて図面を参照にしながら説明する。実施形態の構成は例示であり、本発明の構成は、実施形態の具体的構成に限定されない。
　一実施態様において、本発明は、藻類由来の成分を含む細胞培養用組成物を提供する。本発明の組成物に含まれる、藻類由来の成分は、以下：
（１）藻類を、酸加水分解処理及び／又はアルカリ加水分解処理に供する工程、及び
（２）前記工程（１）により得られる加水分解産物を、中和する工程、
を含む工程により得られる。
　また、一実施態様において、本発明は、細胞培養用組成物の製造方法を提供するものであり、以下：
（１）藻類を、酸加水分解処理及び／又はアルカリ加水分解処理に供する工程；及び
（２）前記工程（１）により得られる加水分解産物を中和し、藻類抽出物を得る工程；
（３）前記藻類抽出物を細胞培養用培地と混合する工程であって、前記細胞培養用培地はＬ－グルタミンを実質的に含まないものである、
を含む。
　また、他の実施態様において、本発明に用いられ得る細胞培養用培地は、さらに、Ｌ－アルギニン、Ｌ－シスチン、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、及びＬ－バリンからなる群から１又は複数選択されるアミノ酸を実質的に含まない細胞培養用培地であり得る。
　他の実施態様において、本発明に用いられ得る細胞培養用培地は、ビタミン類を実質的に含まない細胞培養用培地であり得る。本発明に用いられ得る、ビタミン類を実質的に含まない細胞培養用培地とは、例えば、パントテン酸、塩化コリン、葉酸、ｉ－イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、及びこれらの薬学的に許容し得る塩からなる群から１又は複数選択されるビタミン類を実質的に含まないものであってもよい。
　他の実施態様において、本発明に用いられ得る細胞培養用培地は、グルコースを実質的に含まない細胞培養用培地であってもよく、さらにピルビン酸を実質的に含まない細胞培養用培地であってもよい。
　本明細書において、「実質的に含まない」とは、該当する物質がほとんど含まれていないことを意味しているが、該当する物質が全く含まれていないことを意味するのではなく、例えば、グルコースであれば定量下限の１０ｍｇ／Ｌ未満含まれるものであってもよく、例えばアミノ酸（例えば、Ｌ－グルタミン等）であれば、定量下限の０．１ｍｇ／Ｌ未満含まれるものであってもよく、又はビタミン類であれば定量下限の１μｇ／Ｌ未満含まれるものであってもよい。
　本明細書において、「藻類」とは、光合成により酸素を産生する生物のうち、主に地上に生息するコケ植物、シダ植物、種子植物を除いたものの総称をいう。藻類は光合成に必要な環境が整えば、酸素、栄養分（例えば、グルコース、アミノ酸）を自ら作り出すことができ、増殖することができる。本発明は、藻類から抽出された成分を含む組成物を添加した培地において、細胞を培養可能であることを見出したことにより完成したものである。
　本発明の一実施態様において用いられる藻類は、「単細胞藻類（「微細藻類」ともいう。）であってもよい。本明細書において、「単細胞藻類」とは、藻類の中でも、個体が単一の細胞からなる藻類をいい、複数の単細胞藻類個体が集まり、群体を形成する単細胞藻類も含む。例えば、クロロフィルａ及びｂを葉緑体の主要色素とする緑藻類、クロロフィルｄを主要色素とする単細胞性の藍藻類（シアノバクテリア）、クロロフィルａ及びフィコビリンタンパク質を主要色素とする単細胞性の紅藻類が単細胞藻類の例として挙げられる。さらに詳しく例を挙げると、緑藻類では、緑藻綱クラミドモナス目のクラミドモナス・レインハルドティ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ　ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）（和名：クラミドモナス）、ドナリエラ目のドナリエラ・サリナ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ　ｓａｌｉｎａ）（和名：ドナリエラ）、オオヒゲマワリ目のボルボックス・カルテリ（Ｖｏｌｖｏｘ　ｃａｒｔｅｒｉ）（和名：ボルボックス）、クロロコックム目のクロロコックム・リットラレ（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ　ｌｉｔｔｏｒａｌｅ）、ヨコワミドロ目のヒドロディクティオン・レティキュラツム（Ｈｙｄｒｏｄｉｃｔｙｏｎ　ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）（和名：アミミドロ）、ペディアストラム・デュプレックス（Ｐｅｄｉａｓｔｒｕｍ　ｄｕｐｌｅｘ）（和名：クンショウモ）、セネデスムス・ディモルファウス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ　ｄｉｍｏｒｐｈｕｓ）（和名：イカダモ）、トレボウキシア藻綱クロレラ目のクロレラ・ベイエリンク（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ　ｖｕｌｇａｒｉｓ　Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋ）（和名：クロレラ）、ユーグレナ植物門ユーグレナ藻綱ユーグレナ目のユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ　ｇｒａｃｉｌｉｓ）及びユーグレナ　プロキシマ（Ｅｕｇｌｅｎａ　ｐｒｏｘｉｍａ）（和名：ミドリムシ）などが挙げられる。単細胞性の藍藻類では、シアノバクテリア門のアカリオクロリス・マリナ（Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ　ｍａｒｉｎａ）、スピルリナ・サブサルサ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ　ｓｕｂｓａｌｓａ）、アルスロスピラ・プラテンシス（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ　ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）などが挙げられる。単細胞性の紅藻類では、紅藻植物門イデユコゴメ綱イデユコゴメ目のシアニジウム　カルダリウム（Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ　ｃａｌｄａｒｉｕｍ）（和名：イデユコゴメ）又は紅藻植物門イデユコゴメ綱イデユコゴメ目のガルディエリア　パルティータ（Ｇａｌｄｉｅｒｉａ　ｐａｒｔｉｔａ）などが挙げられる。単細胞性の車軸藻類では、緑色植物門の車軸藻網クレブソルミディウム目のスティココックス属（Ｓｔｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．）が挙げられる。また、単細胞性のアオサ藻網の藻類であるフィラメントス－ウルボフィテ（Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ－ｕｌｖｏｐｈｙｔｅ）が挙げられる。本発明に用いられる藻類は、上記で挙げられた藻類の遺伝子操作が行われた遺伝子組換え体であってもよく、上記の藻類に限定されない。
　本発明に用いられる藻類は、天然の藻類を用いても良く、公知の培養法によって増殖させた藻類を用いても良い。
　本発明において用いられる組成物に含まれる藻類由来の成分は、藻類を、酸加水分解処理及び／又はアルカリ加水分解処理に供する工程を実施することによって抽出することができる。
　一般に、タンパク質や多糖などの生体高分子は、加熱下（例えば、６０℃～２００℃、好ましくは８０℃～１８０℃、より好ましくは９０℃～１５０℃）、で、水を加えた有機又は無機の強酸（塩酸、硫酸、トリフルオロ酢酸、ｐ－トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸など）、或いは強アルカリ（水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなど）と混合することで加水分解され、オリゴマーやモノマー（タンパク質においてはペプチドやアミノ酸、多糖においてはオリゴ糖、単糖）を生じる。従って、本明細書において、「酸加水分解処理」とは、強酸を用いた加水分解処理をいい、「アルカリ加水分解処理」とは、強アルカリを用いた加水分解処理をいう。本発明の組成物を得るために、公知の「酸加水分解処理」及び／又は「アルカリ加水分解処理」を用いることができる。「酸加水分解処理」又は「アルカリ加水分解処理」は、用いられる藻類の種類、量、又は濃度、あるいは反応溶液のｐＨ、温度などの条件によって、反応時間を調整することができ、例えば、１～１４４０分、３～７２０分、５～３６０分、５～１２０分、又は５～３０分実施されてもよい。
　一実施態様において、藻類由来の成分を含む組成物を得るために、酸加水分解処理のみが実施されてもよく、アルカリ加水分解処理のみが行われてもよく、酸加水分解処理及びアルカリ加水分解処理の両方が実施されてもよい。酸加水分解処理及びアルカリ加水分解処理が実施される場合、酸加水分解処理に続いてアルカリ加水分解が行われても良く、アルカリ加水分解処理に続いて酸加水分解処理が行われてもよい。酸加水分解処理とアルカリ加水分解処理の間に、中和処理が実施されてもよい。
　一実施態様において、工程（１）で用いられる藻類は、酸加水分解処理及び／又はアルカリ加水分解処理に供される前に、乾燥処理に供されてもよい。
　一実施態様において、工程（１）は、加圧下で実施されてもよい。本明細書において、「加圧下」とは、大気圧、すなわち１気圧よりも高い気圧条件をいい、例えば、１．１気圧以上、１．５気圧以上、１．８気圧以上、又は２気圧以上で実施されてもよい。例えば、１．１～３００気圧、１．５～２００気圧、１．８～１００気圧、２～５０気圧、例えば２～２０気圧であってもよい。加圧条件は、任意の装置や方法によって実施されてもよく、例えば、オートクレーブを用いることによって加圧条件を実現することができる。
　本発明の組成物は、工程（１）により得られる加水分解産物を、中和する工程（工程（２））を実施することによって得られる。これにより、加水分解産物が中和され、細胞の培養に用いることが可能となる。例えば、工程（１）において、最終的に酸加水分解が実施された場合は、塩基性物質又はその水溶液（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム又はその水溶液など）を添加し、中和してもよい。例えば、工程（１）において、最終的にアルカリ加水分解が実施された場合は、酸性物質（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなど）又はその水溶液（塩酸、硫酸、トリフルオロ酢酸、ｐ－トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸など）を添加し、中和してもよい。
　本発明の組成物は、細胞、例えば原核細胞（例えば、大腸菌、乳酸菌、枯草菌、シアノバクテリアなど）及び真核細胞（酵母菌、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞など）、特に動物細胞の培養に用いることができる。一実施 態様において、本発明で培養可能な動物細胞の由来は、例えば、哺乳類、鳥類、両生類、爬虫類、魚類であってもよく、哺乳類動物細胞の由来は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒト、ウマ、ウシ、サル、ブタ、イヌ、ヒツジ、ネコ、ヤギなどであってもよく、これらに限定されない。また、生体組織から採取された初代細胞であってもよく、株化された細胞であってもよく、多能性幹細胞（例えば、ＥＳ細胞、ｎｔＥＳ細胞、Ｍｕｓｅ細胞、ｉＰＳ細胞）若しくは組織幹細胞（例えば、間葉系幹細胞）又はそれらから分化誘導された細胞であってもよい。
　本発明に用いられる組成物は、１以上の藻類由来の成分を含むものであってもよく、例えば、２以上の藻類由来の成分を含むものであってもよい。例えば、グルコースを多く含む藻類由来の成分と、タンパク質を構成するアミノ酸を多く含む藻類由来の成分とを組み合わせて含む組成物であってもよい。
　本発明は、藻類由来の成分を含む細胞培養用組成物を添加した培地において、細胞を培養する方法であって、
　前記成分が、以下：
（１）藻類を、酸加水分解処理及び／又はアルカリ加水分解処理に供する工程、及び
（２）前記工程（１）により得られる加水分解産物を、中和する工程、
を含む工程により得られることを特徴とする、方法を提供する。
　また、他の実施態様において、本発明にかかる細胞を培養する方法は、さらに（３）前記藻類抽出物を細胞培養用培地と混合する工程であって、前記細胞培養用培地はＬ－グルタミンを実質的に含まない、工程、を含んでもよい。
　本発明の細胞を培養する方法において、藻類由来の成分を含む組成物を添加する培地は、培養する細胞の種類によって適宜選択すればよいが、緩衝作用を有する媒体が好ましく、例えば、リン酸緩衝液、イーグル培地、ダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＤＭＥＭ：Ｆ１２培地、グラスゴー最小必須培地、グレース昆虫培地、ハム培地、イスコフ改良イーグル培地、ＲＰＭＩ－１６４０培地、Ｌ－１５培地、マッコイ５Ａ培地などであってもよく、これらの培地において、グルコース及び／又はタンパク質構成アミノ酸（例えば、Ｌ－グルタミン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－シスチン、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、及びＬ－バリンからなる群から選択される１以上のアミノ酸）を実質的に含まないものであってもよい。培地は、液体培地であってもよく、固形培地であってもよい。本発明の藻類由来の成分を含む組成物を培地に添加することによって、細胞の生存に必要な栄養素（例えば、グルコース、及びタンパク質構成アミノ酸、ビタミン類など）が供給され、細胞培養が可能となる。藻類由来の成分を含む組成物を培地に添加する割合は、培養する細胞の種類などに応じて適宜調整すればよいが、例えば、藻類由来の成分を含む組成物が添加された培地の全容量に対して、藻類由来の成分を含む組成物が、０．１～９９％（ｖ／ｖ）、１～８０％（ｖ／ｖ）、２～５０％（ｖ／ｖ）、３～２０％（ｖ／ｖ）、３～１５％、又は３～１２％（ｖ／ｖ）含まれていてもよい。
　以下に、本発明を実施例に基づいて更に詳しく説明するが、これらは本発明を何ら限定するものではない。
＜実施例１＞
１．材料と方法
１－１．微細藻類培養
　本研究では、緑藻クロロコックム・リトラレ（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ　ｌｉｔｔｏｒａｌｅ）（Ｃ．ｌｉｔｔｏｒａｌｅ）（ＮＢＲＣ　１０２７６１）、スティココックス属（Ｓｔｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．）（ＮＢＲＣ　１０２７０９）（独立化学法人、製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）、千葉県、日本）、クロレラ・ブルカリス・ベイエリンク（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ　ｖｕｌｇａｒｉｓ　Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋ）（Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ）（ＮＩＥＳ－２１７０）及びユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ　ｇｒａｃｉｌｉｓ）（Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）（ＮＩＥＳ－４９）の４種の真核微細藻類と、スピルリナ・サブサルサ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ　ｓｕｂｓａｌｓａ）（Ｓ．ｓｕｂｓａｌｓａ）（ＮＩＥＳ－３３７３）及びアルスロスピラ・プラテンシス（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ　ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）（Ａ．ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）（ＮＩＥＳ－３９）（国立環境研究所、茨城県、日本）の２種の原核微細藻類を使用した（図５）。Ｃ．ｌｉｔｔｏｒａｌｅとＳｔｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属は、Ｄａｉｇｏ　ＩＭＫ培地（日本製薬株式会社、東京都、日本）とＤａｉｇｏ人工海水ＳＰ（富士フィルム和光純薬株式会社）の混合物により培養した。Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｓ．ｓｕｂｓａｌｓａ、Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ及びＡ．ｐｌａｔｅｎｓｉｓはそれぞれＣ培地、ＭＡ培地、ＡＦ－６培地及びＳＯＴ培地（国立環境研究所、茨城県、日本）により培養した。微細藻類は浮遊培養フラスコ（ＡＧＣテクノグラス株式会社、静岡県、日本）を使って連続採光（約５００～７００ルクス）下で室温にて（２５℃）培養した［参考文献１］。それらの微細藻類の位相差画像は、顕微鏡（ＥＬＩＰＳＥ　ＴＳ２、株式会社ニコン、東京都、日本）によりソフトウェア（ＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔｓ　ＢＲ、ニコン）を使って取得した。
１－２．微細藻類からの栄養素抽出
　微細藻類から栄養素を抽出するために加水分解法を用いた。上述したフラスコ中で培養した微細藻類は、培養期間を考慮せずにスクリュー瓶（アズワン株式会社、大阪府、日本）中に収集し、オーブン（タイテック株式会社、埼玉県、日本）中で乾燥した。乾燥後、乾燥重量を秤量し、純水を加えて至適濃度（１０ｇ／Ｌ又は５０ｇ／Ｌ）になるよう調整した。次いで酸／アルカリ加水分解反応を実施した。オートクレーブ（株式会社トミー精工、東京都、日本）、ヒートブロック（Ｌａｂｎｅｔ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｃ．，ニュージャージー州、米国）又は乾熱滅菌器（アドバンテック株式会社、東京都、日本）を使って加熱した。加熱条件は次の通りであった：温度、２０～１８０℃；加熱時間、１０～１４４０分；硫酸濃度、０．００３６～１．８規定（Ｎ）；塩酸及び水酸化ナトリウム濃度、０．３６～１Ｎ。実験は、温度、時間及び試薬濃度の条件を組み合わせて行った。加熱処理後、塩酸又は水酸化ナトリウムにより中和した。グルコースとアミノ酸の濃度は、それぞれ、ヘキソキナーゼ法［参考文献２］及び液体クロマトグラフィー－質量分析法を使った定量分析により測定した。
１－３．細胞培養と細胞生死判別試験
　Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞（住友大日本製薬、東京都、日本）を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｃｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，マサチューセッツ州、米国）と１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州、米国）が補充されたダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，ミズーリ州、米国）により３７℃で５％ＣＯ２を含む湿潤雰囲気下で培養した［参考文献３］。細胞増殖と生存率は、ＸＴＴアッセイ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｉｅｓ，コネチカット州、米国）により評価した。Ｃ２Ｃ１２細胞を９６ウェルプレート（ＡＧＣテクノグラス株式会社、静岡県、日本）中に１０，０００細胞／ウェルの密度で播種し、１０％ＦＢＳと１％Ｐ／Ｓが補充されたＤＭＥＭ中で一晩培養した。一晩培養後、培地を捨て、リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）で２回洗浄した。その後、藻類抽出物又はグルコース／グルタミン酸含有／不含有の栄養素欠損培地を用いて細胞を培養した。前記溶液を添加した細胞を２日間インキュベートした。各溶液中の色素による吸光度の差をなくすために、ＸＴＴアッセイを実施する直前に、各溶液を取り、１００μＬの１０％ＦＢＳと１％Ｐ／Ｓを加え、次いで５０μＬのＸＴＴ試薬を添加した。それに続く細胞生死判別試験はプロトコル通り実施した。グルコース不含ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、グルコース／グルタミン不含ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びグルコース／アミノ酸不含ＤＭＥＭ（Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，マサチューセッツ州、米国）を栄養素欠損培地として使用した。必要であれば、グルコース（関東化学株式会社、東京都、日本）又はグルタミン酸（富士フィルム和光純薬株式会社）をそれらの培地に添加した。
　なお、実施例１及び２で用いられた培地は、特に断りがない限り、以下の組成のものを用いた。
（Ａ）通常の動物細胞培養に用いられる培地ＤＭＥＭの栄養素・ミネラル組成
（ｉ）糖質
　・グルコース：１０００ｍｇ／Ｌまたは４５００ｍｇ／Ｌ
　・ピルビン酸：１１０ｍｇ／Ｌ
（ｉｉ）アミノ酸
　・Ｌ－アルギニン：８４ｍｇ／Ｌ
　・Ｌ－シスチン：４８ｍｇ／Ｌ
　・Ｌ－グルタミン：５８４ｍｇ／Ｌ
　・グリシン：３０ｍｇ／Ｌ
　・Ｌ－ヒスチジン：４２ｍｇ／Ｌ
　・Ｌ－イソロイシン：１０５ｍｇ／Ｌ
　・Ｌ－ロイシン：１０５ｍｇ／Ｌ
　・Ｌ－リジン：１４６ｍｇ／Ｌ
　・Ｌ－メチオニン：３０ｍｇ／Ｌ
　・Ｌ－フェニルアラニン：６６ｍｇ／Ｌ
　・Ｌ－セリン：４２ｍｇ／Ｌ
　・Ｌ－トレオニン：９５ｍｇ／Ｌ
　・Ｌ－トリプトファン：１６ｍｇ／Ｌ
　・Ｌ－チロシン：７１ｍｇ／Ｌ
　・Ｌ－バリン：９４ｍｇ／Ｌ
（ｉｉｉ）ビタミン
　・パントテン酸：４ｍｇ／Ｌ
　・塩化コリン：４ｍｇ／Ｌ
　・葉酸：４ｍｇ／Ｌ
　・ｉ－イノシトール：７．２ｍｇ／Ｌ
　・ナイアシンアミド：４ｍｇ／Ｌ
　・ピリドキシン：４ｍｇ／Ｌ
　・リボフラビン：０．４ｍｇ／Ｌ
　・チアミン：４ｍｇ／Ｌ
（ｉｖ）ミネラル
　・ＣａＣｌ２：２００ｍｇ／Ｌ
　・ＫＣｌ：４００ｍｇ／Ｌ
　・Ｆｅ（ＮＯ３）３・９Ｈ２Ｏ：０．１０ｍｇ／Ｌ
　・ＭｇＳＯ４：９８ｍｇ／Ｌ
　・ＮａＣｌ：６４００ｍｇ／Ｌ
　・ＮａＨＣＯ３：３７００ｍｇ／Ｌ
　・ＮａＨ２ＰＯ４：１０９ｍｇ／Ｌ
　・フェノールレッド：１５ｍｇ／Ｌ
（Ｂ）藻類抽出液を用いた動物細胞培養実験で使用した培地組成
（１）ＤＭＥＭ（グルコース不含）
　藻類抽出液を用いることで糖質（グルコース・ピルビン酸）を代替可能であることを示すために用いた。
（ｉ）糖質
　・グルコース：０ｍｇ／Ｌ
　・ピルビン酸：０ｍｇ／Ｌ
（ｉｉ）アミノ酸
　・Ｌ－アルギニン：８４ｍｇ／Ｌ
　・Ｌ－シスチン：４８ｍｇ／Ｌ
　・Ｌ－グルタミン：５８４ｍｇ／Ｌ
　・グリシン：３０ｍｇ／Ｌ
　・Ｌ－ヒスチジン：４２ｍｇ／Ｌ
　・Ｌ－イソロイシン：１０５ｍｇ／Ｌ
　・Ｌ－ロイシン：１０５ｍｇ／Ｌ
　・Ｌ－リジン：１４６ｍｇ／Ｌ
　・Ｌ－メチオニン：３０ｍｇ／Ｌ
　・Ｌ－フェニルアラニン：６６ｍｇ／Ｌ
　・Ｌ－セリン：４２ｍｇ／Ｌ
　・Ｌ－トレオニン：９５ｍｇ／Ｌ
　・Ｌ－トリプトファン：１６ｍｇ／Ｌ
　・Ｌ－チロシン：７１ｍｇ／Ｌ
　・Ｌ－バリン：９４ｍｇ／Ｌ
（ｉｉｉ）ビタミン
　・パントテン酸：４ｍｇ／Ｌ
　・塩化コリン：４ｍｇ／Ｌ
　・葉酸：４ｍｇ／Ｌ
　・ｉ－イノシトール：７．２ｍｇ／Ｌ
　・ナイアシンアミド：４ｍｇ／Ｌ
　・ピリドキシン：４ｍｇ／Ｌ
　・リボフラビン：０．４ｍｇ／Ｌ
　・チアミン：４ｍｇ／Ｌ
（ｉｖ）ミネラル
　・ＣａＣｌ２：２００ｍｇ／Ｌ
　・ＫＣｌ：４００ｍｇ／Ｌ
　・Ｆｅ（ＮＯ３）３・９Ｈ２Ｏ：０．１０ｍｇ／Ｌ
　・ＭｇＳＯ４：９８ｍｇ／Ｌ
　・ＮａＣｌ：６４００ｍｇ／Ｌ
　・ＮａＨＣＯ３：３７００ｍｇ／Ｌ
　・ＮａＨ２ＰＯ４：１０９ｍｇ／Ｌ
　・フェノールレッド：１５ｍｇ／Ｌ
（２）ＤＭＥＭ（グルコース・アミノ酸不含）
　藻類抽出液を用いることで糖質（グルコース・ピルビン酸）およびアミノ酸（Ｌ－アルギニン、Ｌ－シスチン、Ｌ－グルタミン、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－セリン、Ｌ－トレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン）を代替可能であることを示すために用いた。
（ｉ）糖質
　・グルコース：０ｍｇ／Ｌ
　・ピルビン酸：０ｍｇ／Ｌ
（ｉｉ）アミノ酸
　・Ｌ－アルギニン：０ｍｇ／Ｌ
　・Ｌ－シスチン：０ｍｇ／Ｌ
　・Ｌ－グルタミン：０ｍｇ／Ｌ
　・グリシン：０ｍｇ／Ｌ
　・Ｌ－ヒスチジン：０ｍｇ／Ｌ
　・Ｌ－イソロイシン：０ｍｇ／Ｌ
　・Ｌ－ロイシン：０ｍｇ／Ｌ
　・Ｌ－リジン：０ｍｇ／Ｌ
　・Ｌ－メチオニン：０ｍｇ／Ｌ
　・Ｌ－フェニルアラニン：０ｍｇ／Ｌ
　・Ｌ－セリン：０ｍｇ／Ｌ
　・Ｌ－トレオニン：０ｍｇ／Ｌ
　・Ｌ－トリプトファン：０ｍｇ／Ｌ
　・Ｌ－チロシン：０ｍｇ／Ｌ
　・Ｌ－バリン：０ｍｇ／Ｌ
（ｉｉｉ）ビタミン
　・パントテン酸：４ｍｇ／Ｌ
　・塩化コリン：４ｍｇ／Ｌ
　・葉酸：４ｍｇ／Ｌ
　・ｉ－イノシトール：７．２ｍｇ／Ｌ
　・ナイアシンアミド：４ｍｇ／Ｌ
　・ピリドキシン：４ｍｇ／Ｌ
　・リボフラビン：０．４ｍｇ／Ｌ
　・チアミン：４ｍｇ／Ｌ
（ｉｖ）ミネラル
　・ＣａＣｌ２：２００ｍｇ／Ｌ
　・ＫＣｌ：４００ｍｇ／Ｌ
　・Ｆｅ（ＮＯ３）３・９Ｈ２Ｏ：０．１０ｍｇ／Ｌ
　・ＭｇＳＯ４：９８ｍｇ／Ｌ
　・ＮａＣｌ：６４００ｍｇ／Ｌ
　・ＮａＨＣＯ３：３７００ｍｇ／Ｌ
　・ＮａＨ２ＰＯ４：１０９ｍｇ／Ｌ
　・フェノールレッド：１５ｍｇ／Ｌ
（３）無機塩培地
　藻類抽出液を用いることで糖質（グルコース・ピルビン酸）、アミノ酸（Ｌ－アルギニン、Ｌ－シスチン、Ｌ－グルタミン、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－セリン、Ｌ－トレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン）およびビタミン（パントテン酸、塩化コリン、葉酸、ｉ－イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン）を代替可能であることを示すために用いた。
（ｉ）糖質
　・グルコース：０ｍｇ／Ｌ
（ｉｉ）アミノ酸
　・Ｌ－アルギニン：０ｍｇ／Ｌ
　・Ｌ－シスチン：０ｍｇ／Ｌ
　・Ｌ－グルタミン：０ｍｇ／Ｌ
　・グリシン：０ｍｇ／Ｌ
　・Ｌ－ヒスチジン：０ｍｇ／Ｌ
　・Ｌ－イソロイシン：０ｍｇ／Ｌ
　・Ｌ－ロイシン：０ｍｇ／Ｌ
　・Ｌ－リジン：０ｍｇ／Ｌ
　・Ｌ－メチオニン：０ｍｇ／Ｌ
　・Ｌ－フェニルアラニン：０ｍｇ／Ｌ
　・Ｌ－セリン：０ｍｇ／Ｌ
　・Ｌ－トレオニン：０ｍｇ／Ｌ
　・Ｌ－トリプトファン：０ｍｇ／Ｌ
　・Ｌ－チロシン：０ｍｇ／Ｌ
　・Ｌ－バリン：０ｍｇ／Ｌ
（ｉｉｉ）ビタミン
　・パントテン酸：０ｍｇ／Ｌ
　・塩化コリン：０ｍｇ／Ｌ
　・葉酸：０ｍｇ／Ｌ
　・ｉ－イノシトール：０ｍｇ／Ｌ
　・ナイアシンアミド：０ｍｇ／Ｌ
　・ピリドキシン：０ｍｇ／Ｌ
　・リボフラビン：０ｍｇ／Ｌ
　・チアミン：０ｍｇ／Ｌ
（ｉｖ）ミネラル
　・ＣａＣｌ２：２００ｍｇ／Ｌ
　・ＫＣｌ：４００ｍｇ／Ｌ
　・Ｆｅ（ＮＯ３）３・９Ｈ２Ｏ：０．１０ｍｇ／Ｌ
　・ＭｇＳＯ４：９８ｍｇ／Ｌ
　・ＮａＣｌ：６４００ｍｇ／Ｌ
　・ＮａＨＣＯ３：３７００ｍｇ／Ｌ
　・ＮａＨ２ＰＯ４：１０９ｍｇ／Ｌ
　・フェノールレッド：１５ｍｇ／Ｌ
１－４．データ解析
　図面の全てのデータは、平均±ＳＤとして示されている。２つの群を比較する際には、対応のないスチューデントｔ検定（ｕｎｐａｉｒｅｄ　Ｓｔｕｄｅｎｔ　ｔ－ｔｅｓｔ）を行い、複数の群の比較には事後（ｐｏｓｔ－ｈｏｃ）テューキーＨＳＤ検定を伴う一方向ＡＮＯＶＡを用いた。
２．結果
２－１．微細藻類からのグルコース抽出
　最初に、哺乳類細胞の培地における重要な栄養素であるグルコースを抽出することを試みた。予備実験では、硫酸を使った酸加水分解によるグルコースの抽出効率は、図５に示される６種の微細藻類の中でクロロコックム（Ｃ．ｌｉｔｔｏｒａｌｅ）が最も高かった。従って、Ｃ．ｌｉｔｔｏｒａｌｅを使うことによって最適条件を検討した。グルコースは、オートクレーブを使った加圧下での高温処理により、微細藻類から効率的に抽出された（硫酸濃度：０．１８規定～０．３６規定；温度：１３０～１３５℃；反応時間：１０～２０分）（図１Ａ）。他方で、乾熱滅菌器を用いた加圧を伴わない加熱処理（１３０℃）によるグルコース収率は、同温でのオートクレーブ処理よりも低かった（図１Ａ）。この結果は、温度に加えて圧力が効率的なグルコース抽出に重要であることを示唆している。
　次に、６種の微細藻類、Ｃ．ｌｉｔｔｏｒａｌｅ、Ｓｔｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．、Ｓ．ｓｕｂｓａｌｓａ、Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ、及びＡ．ｐｌａｔｅｎｓｉｓの中で最高グルコース収率を有する微細藻類を調べた（図５）。試験した全ての微細藻類からグルコースを回収することができたが、Ｃ．ｌｉｔｔｏｒａｌｅとＡ．ｐｌａｔｅｎｓｉｓから、より効率的にグルコースが抽出された（図１Ｂ）。
　次に、高グルコース濃度を有する微細藻類抽出液を獲得するために、初期藻類濃度を１０ｇ／Ｌから５０ｇ／Ｌに増加させた。Ｃ．ｌｉｔｔｏｒａｌｅから抽出されたグルコースの濃度は、１０ｇ／Ｌでは２．４±０．３ｇ／Ｌであり、５０ｇ／Ｌでは１３．１±１．５ｇ／Ｌであった。Ａ．ｐｌａｔｅｎｓｉｓから抽出されたグルコース濃度は１０ｇ／Ｌでは１．９±０．３ｇ／Ｌであり、５０ｇ／Ｌでは１０．８±０．６ｇ／Ｌであった（図１Ｃ）。この結果は、グルコース濃度も微細藻類の濃度に比例して増加したことを示している。それらの藻類抽出液は、従来の哺乳類培養培地（１０％ＦＢＳと１％Ｐ／Ｓが補充されたＤＭＥＭ）の３～４倍のグルコースを含有していた（図１Ｃ）。
２－２．微細藻類からのアミノ酸抽出
　ＤＭＥＭは２０種のタンパク質構成アミノ酸のうち、１５種を含有する。それらの１５種のアミノ酸は、図２の左側に示される、アルギニンからバリンまでのアミノ酸である。次に、０．３６規定（Ｎ）の硫酸を使って１３０℃で２０分間、Ｃ．ｌｉｔｔｏｒａｌｅからの抽出物中のアミノ酸を定量分析した。藻類抽出物中の１５種のアミノ酸全ての濃度が、培地のものよりも低かった（図２Ａ）。タンパク質の効率的な酸加水分解のために、従来２４時間の加熱処理が使用されている［参考文献４］。よって、抽出効率を高めるために、１Ｎ硫酸を使って１００℃で２４時間、アミノ酸を抽出した。この方法により抽出アミノ酸の濃度が増加された（図２Ａ）。次に、１Ｎ塩酸又は１Ｎ水酸化ナトリウムを使用して更に抽出効率を増加させようと試みた。分析結果は、塩酸で抽出された全てのアミノ酸が、硫酸で抽出されたアミノ酸よりも高かった（図２Ａ）。しかしながら、ＤＭＥＭ中に含まれているグルタミンとトリプトファンは、いずれの条件下でも検出されなかった（図２Ａ）。酸加水分解の間に、グルタミンがグルタミン酸に加水分解されたため、抽出物中にグルタミンが検出不可能であり、代わりに高濃度のグルタミン酸が検出された。水酸化ナトリウムを用いた場合でもアミノ酸が効率的に検出されたが、ＤＭＥＭ中に含まれた３種のアミノ酸（アルギニン、シスチン及びヒスチジン）は、酸加水分解によってのみ検出された。従って、アミノ酸を抽出するために、１００℃で２４時間１Ｎ塩酸を用いる酸加水分解を使用することにした。
　次に、６種の微細藻類（図５）の中で最高のアミノ酸収率を有する微細藻類を調べた。それらの微細藻類の中で、Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓから獲得した抽出物が、最も豊富なアミノ酸を含むことが分かった（図２Ｂ）。この結果は、以前の研究［参考文献５、６］におけるＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓの比較的高いタンパク質濃度と一致した。更に、加水分解により分解されるアミノ酸以外に、任意の藻類種に含まれる大部分のアミノ酸が、哺乳類細胞用の培地中に含まれるものと同じか、又はそれより高いアミノ酸濃度で回収されたことを示した（図２Ｂ）。
　次に、より高いアミノ酸濃度を有する微細藻類抽出物を得るために、初期藻類濃度を１０ｇ／Ｌから５０ｇ／Ｌに増加させた。グルコース抽出の場合と同様に、藻類濃度を増加させることにより各アミノ酸の濃度も更に増加した（図２Ｃ）。
　酸加水分解法によりグルタミンは抽出されなかったが、ＤＭＥＭ中には多量のグルタミンが含まれている（図２）。一方で、グルタミン酸は微細藻類抽出物中に含まれていたが、ＤＭＥＭにはグルタミン酸を含んでいない（図２）。図２において検出されたごく微量のグルタミン酸は、補充された１０％ＦＢＳに由来するか又はグルタミンの分解から生じたと思われる。よって、グルタミン酸が哺乳類細胞の培養においてグルタミンの代用物（サロゲート）として利用可能かどうかを調べた。
　２日後、グルコースとグルタミンを含まない培地を使った培養により、大部分のＣ２Ｃ１２マウス筋芽細胞が死滅した（図３）。グルコースの添加により細胞生存率が部分的に増加し、そしてグルタミン酸の添加により更に増加した（図３）。この結果は、グルタミン酸が哺乳類細胞の培養においてグルタミンの代用物として利用されたことを示唆している。しかしながら、グルタミン酸の添加による増加は、グルタミンを含む培地によるものよりも少なかった（図３）。グルタミン酸の過剰な添加が必要になると推定された。
２－３．微細藻類抽出物を使った細胞培養
　次に、哺乳類細胞培養の栄養素として藻類抽出物が利用可能かどうかを調べた。Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞を、グルコース不含培地を使って培養した場合、２日後に大部分の細胞が死滅した（図４Ａ）。しかしながら、Ｃ．ｌｉｔｔｏｒａｌｅから抽出された抽出物を５％、１０％及び２０％添加することにより細胞生存率が回復し（図４Ａ）、１０％添加でプラトーに達した。この結果は、藻類抽出物が、哺乳類細胞の培養に、重要な栄養素であるグルコースの代用物として利用されることを証明した。
　最後に、藻類抽出物がアミノ酸の代用物としても利用可能かどうかを調べた。ここでは、グルコースとアミノ酸を含まない培地を使用した。この培地を使って２日間培養した結果、大部分の細胞は死滅した（図４Ｂ、４Ｃ及び４Ｄ）。しかしながら、細胞生存率は５％及び１０％微細藻類抽出物の添加により救済された（図４Ｂ、４Ｃ及び４Ｄ）。Ｃ．ｌｉｔｔｏｒａｌｅ由来の抽出物を、５％、１０％及び２０％添加した場合、細胞生存率が、添加なしの場合よりも高い傾向があった（図４Ｂ）。他方、Ａ．ｐｌａｔｅｎｓｉｓとＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓの場合、抽出物の過剰添加（２０％）によって細胞生存率は回復しなかった（図４Ｃ及び４Ｄ）。
　グルコースに富むＣ．ｌｉｔｔｏｒａｌｅとアミノ酸に富むＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ及びグルコースに富むＡ．ｐｌａｔｅｎｓｉｓとアミノ酸に富むＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓの抽出物の組み合わせで、細胞を培養した（図４Ｅ）。前記抽出物の組み合わせは両方とも、それらの抽出物を添加しない場合よりも高い生存率を有した（図４Ｅ）。これらの結果は、藻類抽出物が、細胞培養のために重要な栄養素であるアミノ酸の代用物（サロゲート）として利用され得ることを証明した。
　以上の結果より、微細藻類から抽出された栄養素が哺乳類細胞のためのグルコースとアミノ酸の代用物として利用され得ることを証明した。
　上記の結果では、グルコースとアミノ酸のみの分析結果を示した。脂質はＤＭＥＭ中に含まれていない。他方で、８種のビタミンＢ分子がＤＭＥＭ中に含まれているが、それらの量はグルコース及びアミノ酸の量よりずっと低い濃度である。本発明者らの実験は、それらの８種のビタミンＢ分子が微細藻類から抽出され得ることも見出した。従って、哺乳類細胞培養に必要な全ての栄養素とビタミン類が微細藻類から供給され得ると考えられる。
　藻類抽出物は哺乳類細胞の培養のための栄養素の代用物として機能した。バイオ燃料の生産のための穀物の使用は食料と競合するため、食料と競合しない微細藻類はその分野において有望である［参考文献７］。本研究は、環境への影響を減らし、かつ環境変化に対して保護するような新規な細胞培養系の可能性だけでなく、あらゆる穀物依存培養系に取って代わる微細藻類の可能性も示した。
＜実施例２＞
　実施例１の１－２に記載の方法でクロレラ・ブルカリス・ベイエリンク（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ　ｖｕｌｇａｒｉｓ　Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋ）から抽出液を調製した。培地として、ＤＭＥＭ又は無機塩培地を用い、クロレラ由来の藻類抽出物がウシ筋肉組織由来細胞の培養結果にどのような効果をもたらすか調べた。実験方法は、実施例１の１－３に記載の方法により行った。なお、ウシ筋肉組織由来細胞は、東京食肉市場株式会社から購入したウシ頬の筋肉細胞をプロテアーゼで処理し、単離した細胞を用いた。
　その結果、無機塩培地に藻類抽出液を添加することでＤＭＥＭと　同様にウシ筋肉組織由来細胞の維持培養が可能となった（図６）。
＜実施例３＞
　実施例１の１－２に記載の方法でクロレラ・ブルカリス・ベイエリンク（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ　ｖｕｌｇａｒｉｓ　Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋ）から抽出液を調製した。培地として、ＤＭＥＭ又は無機塩培地を用い、クロレラ由来の藻類抽出物の有無及びウシ胎児血清（ＦＢＳ）の有無が、ウシ筋肉組織由来細胞の培養結果にどのような効果をもたらすか調べた。実験方法は、実施例１の１－３に記載の方法により行った。
　その結果、無機塩培地に藻類抽出液を添加し、さらに血清を添加することでウシ筋肉組織由来細胞の相対生細胞数が増加する傾向が認められた（図７）。
＜実施例４＞
　実施例１の１－２に記載の方法でクロレラ・ブルカリス・ベイエリンク（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ　ｖｕｌｇａｒｉｓ　Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋ）から抽出液を調製した。培地として、ＤＭＥＭ又は無機塩培地を用い、クロレラ由来の藻類抽出物の有無及びウシ胎児血清（ＦＢＳ）の有無が、ウシ筋肉組織由来細胞の培養結果、特に細胞増殖期にどのような効果をもたらすか調べた。実験方法は、実施例１の１－３に記載の方法により行った。
その結果、無機塩培地に藻類抽出液を添加し、さらに血清添加することで１０％ＦＢＳ　ＤＭＥＭと同程度のウシ筋肉組織由来細胞の増殖が認められた（図８）。
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Claims (13)

  1. 　細胞培養用組成物の製造方法であって、
    　以下：
    （１）藻類を、酸加水分解処理及び／又はアルカリ加水分解処理に供する工程；及び
    （２）前記工程（１）により得られる加水分解産物を中和し、藻類抽出物を得る工程；
    （３）前記藻類抽出物を細胞培養用培地と混合する工程であって、前記細胞培養用培地はＬ－グルタミンを実質的に含まないものである、
    を含む、前記製造方法。
  2. 　前記細胞培養用培地は、さらに、Ｌ－アルギニン、Ｌ－シスチン、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、及びＬ－バリンからなる群から１又は複数選択されるアミノ酸を実質的に含まない、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記細胞培養用培地が、ビタミン類を実質的に含まない、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　前記細胞培養用培地が、グルコースを実質的に含まない、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　前記細胞培養用培地が、無機塩培地である、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　培養される細胞が、動物細胞である、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 　前記藻類が、単細胞藻類である、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　前記藻類が、単細胞性の緑藻類、単細胞性の藍藻類、単細胞性の紅藻類、単細胞性の車軸藻類及び単細胞性のアオサ藻網からなる群から１以上選択される、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 　前記藻類が、クロロコックム・リトラレ（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ　ｌｉｔｔｏｒａｌｅ）、スティココックス属（Ｓｔｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．）、クロレラ・ブルカリス・ベイエリンク（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ　ｖｕｌｇａｒｉｓ　Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋ）、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ　ｇｒａｃｉｌｉｓ）、スピルリナ・サブサルサ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ　ｓｕｂｓａｌｓａ）、アルスロスピラ・プラテンシス（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ　ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）からなる群から１以上選択される、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 　前記工程（１）が、加圧下において実施される、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 　前記工程（１）が、６０℃～２００℃で実施される、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 　請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法により得られる、細胞培養用組成物。
  13. 　請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法により得られる細胞培養用組成物を用いる、細胞の培養方法。
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