WO2021066167A1 - ヘパリン様物質の製造方法、組換え細胞及びその製造方法 - Google Patents

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    • C12Y208/02—Sulfotransferases (2.8.2)
    • C12Y208/02023—[Heparan sulfate]-glucosamine 3-sulfotransferase 1 (2.8.2.23)

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a heparin-like substance, recombinant cells, and a method for producing the same.
  • Heparin is an indispensable drug used in medical settings such as dialysis and extracorporeal circulation as an anticoagulant. Heparin is used in an injectable form, for example as a prophylactic or therapeutic agent for thromboembolism. Heparin is also used to form anticoagulant surfaces on various experimental and medical devices, such as renal dialysis machines.
  • Heparin is a polysaccharide that is one of the four major subfamilies of glycosaminoglycans (hereinafter, also abbreviated as GAG).
  • GAG is a long polysaccharide consisting of repetitive disaccharide units.
  • GAG is mainly (1) heparan sulfate (hereinafter, also abbreviated as HS) / heparin, (2) keratan sulfate (KS), (3) chondroitin / dermatan sulfate (CS / DS), (4) hyaluronic acid or hyaluronan. It is classified into four subfamilies of (HA).
  • the GAG subfamilies differ from each other in monosaccharide components, glycosylation, and the position and degree of sugar. With the exception of HA, GAG is covalently bound to the core protein, and GAG covalently bound to the core protein is known as a proteoglycan.
  • Heparin and HS are heterogeneous compounds of acidic mucopolysaccharides, and heparin is a type of HS.
  • Heparin / HS consists of disaccharides of uronic acid ( ⁇ -D-glucuronic acid and ⁇ -L-iduronic acid) and glucosamine (DN-acetylglucosamine and DN-glucosamine sulfate) as one unit. Is a linear polysaccharide in which ⁇ or ⁇ -1,4 bonds are repeated tens to hundreds of times. The molecular weight varies from 3 to 30 kDa depending on the difference in chain length, and averages 12 to 15 kDa.
  • Modifications to heparin / HS include, for example, O-sulfation of the 2-position of uronic acid, O-sulfation of the 3- and 6-positions of glucosamine, and N-sulfation of the amino group at the 2-position.
  • HS regulates cell growth and development by regulating growth factors such as fibroblast growth factor (FGF) family, platelet-derived growth factor (PDGF), and vascular endothelial growth factor (VEGF).
  • FGF fibroblast growth factor
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • heparin is mainly produced by mast cells.
  • Heparin used in pharmaceutical products is mainly extracted and purified from the small intestine of pigs or the lungs of cattle.
  • heparin obtained from these sources is associated with some adverse events due to contamination with persulfated chondroitin sulfate (Non-Patent Document 1).
  • the isolation of heparin from animal tissues carries the risk of transmitting disease pathogens such as viruses, bacteria and infectious spongiform encephalopathy from animals to humans. Therefore, it is desired to develop a new production technique for heparin that does not use animal-derived tissues.
  • heparin can be synthesized by chemical or chemoenzymatic methods, it is difficult to produce heterogeneous populations present in animal-derived heparin.
  • Cindecane is a family of four proteoglycans on the cell surface with retained plasma membrane domain and cytoplasmic domain. Covalently bound glycosaminoglycan chains are present in the extracellular domain. They are mainly heparan sulfate (HS) and also include chondroitin sulfate (CS) (Non-Patent Document 2).
  • HS heparan sulfate
  • CS chondroitin sulfate
  • an object of the present invention is to provide a production method for efficiently producing a heparinoid substance without using an animal-derived tissue.
  • the present inventors have found that the above-mentioned problems can be solved by introducing a gene encoding the extracellular domain of Cindecane into mammalian cells producing a heparinoid substance, and have completed the present invention.
  • the present invention is as follows. 1.
  • a method for producing a heparinoid substance which comprises the following steps (1) to (3).
  • An extracellular domain of Cindecane (hereinafter abbreviated as SDC) is added to a mammalian cell that produces a heparin-like substance prepared in step (1).
  • Steps of preparing recombinant cells into which the gene encoding the above is introduced (3) Steps of culturing the recombinant cells prepared in step (2) in a medium and recovering a heparin-like substance from the obtained culture supernatant.
  • the mammalian cells that produce the heparin-like substance include a gene encoding bifunctional heparan sulfate N-deacetylase / N-sulfate transferase (hereinafter abbreviated as NDST2) and heparan sulfate glucosamine 3 sulfate transfer.
  • NDST2 bifunctional heparan sulfate N-deacetylase / N-sulfate transferase
  • Hs3st1 heparan sulfate glucosamine 3 sulfate transfer.
  • NDST2 is a protein containing the amino acid sequence of any one of (1a) to (1c) below and having the function of NDST2.
  • Hs3st1 is a protein containing the amino acid sequence of any one of (2a) to (2c) below and having the function of Hs3st1.
  • Nucleotide sequence complementary to the base sequence and base sequence that hybridizes under stringent conditions (2D) Base sequence having 80% or more homology with the base sequence shown in SEQ ID NO: 5.
  • the gene encoding the extracellular domain of SDC is the base sequence of any one of (3A) to (3D) below, and the base sequence encoding the amino acid sequence of the protein having the function of the extracellular domain of SDC.
  • the production method according to any one of 1 to 9 above, which comprises.
  • Nucleotide sequence complementary to the base sequence and base sequence that hybridizes under stringent conditions (3D) Base sequence having 80% or more homology with the base sequence shown in SEQ ID NO: 6. Recombinant cells in which a gene encoding the extracellular domain of SDC is introduced into mammalian cells that produce heparinoids. 12. 11.
  • the recombinant cell according to 11 above wherein the mammalian cell producing the heparin-like substance is a cell into which at least one of a gene encoding NDST2 and a gene encoding Hs3st1 has been introduced. 13.
  • the recombinant cell according to 11 or 12 wherein the mammalian cell is a CHO cell.
  • a method for producing a cell that secretes and produces a heparin-like substance which comprises a step of introducing a recombinant expression vector containing a gene encoding the extracellular domain of SDC into a mammalian cell that produces a heparin-like substance.
  • a gene encoding the extracellular domain of Cindecane is introduced into a mammalian cell producing a heparin-like substance to secrete and produce the heparin-like substance in a culture supernatant.
  • the heparin-like substance can be recovered from the culture supernatant.
  • FIG. 1 is a diagram showing the results of measuring the amount of sGAG in the culture supernatant of CHO / NH-SRGN cells and CHO / NH-SDC cells by the sGAG assay.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of measuring the amount of sGAG in the culture supernatant of CHO / NH-SRGN cells and CHO / NH-SDC cells by HPLC.
  • 3A and 3B are diagrams showing the results of analysis of the sugar chain structure of heparin in the culture supernatants of CHO / NH-SRGN cells and CHO / NH-SDC cells using HPLC.
  • FIG. 3 (A) shows the results of quantifying the heparin-like sugar chain concentration
  • FIG. 3 (A) shows the results of quantifying the heparin-like sugar chain concentration
  • FIG. 3 (B) shows the results of quantifying the ratio to sulfate.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of measuring the amount of sGAG after serum-free acclimation.
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of calculating the production rate of sGAG after serum-free acclimation.
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of measuring the expression level of the target protein by ELISA.
  • 7 (A) to 7 (C) are the results of measuring the expression level of the introduced gene by qRT-PCR.
  • FIG. 7 (A) shows the expression level of the NDST2 gene
  • FIG. 7 (B) shows the expression level of the Hs3st1 gene
  • FIG. 7 (C) shows the expression level of the SDC gene.
  • FIG. 7 (A) shows the expression level of the NDST2 gene
  • FIG. 7 (B) shows the expression level of the Hs3st1 gene
  • FIG. 7 (C) shows the expression level of the SDC gene
  • FIG. 8 shows the results of quantifying the sGAG of the sample used for the analysis of the sugar chain structure by HPLC.
  • FIG. 9 shows a standard heparin-derived unsaturated disaccharide (HS-standard) and a chromatogram obtained by HPLC obtained from each sample.
  • 10 (A) and 10 (B) are diagrams showing the results of analysis of the sugar chain structure of heparin in the culture supernatant of each cell using HPLC.
  • FIG. 10 (A) shows the results of quantifying the heparin-like sugar chain concentration
  • FIG. 10 (B) shows the results of quantifying the ratio to sulfate.
  • FIG. 11 shows a calibration curve used for evaluating the anticoagulant activity.
  • the method for producing a heparin-like substance of the present invention is characterized by including the following steps (1) to (3).
  • Step of preparing a mammalian cell that produces a heparin-like substance (2) A set in which a gene encoding the extracellular domain of Cindecane is introduced into a mammalian cell that produces a heparin-like substance prepared in step (1).
  • Steps for preparing replacement cells (3) Steps for culturing the recombinant cells prepared in step (2) in a medium and recovering a heparin-like substance from the obtained culture supernatant The following steps will be described.
  • Step (1) Preparation of mammalian cells that produce heparin-like substances
  • heparin is introduced by introducing a gene encoding a protein required for heparin biosynthesis into a host mammalian cell. This is the step of preparing mammalian cells that produce similar substances.
  • the "heparin-like substance" refers to a mixture of heparin and HS.
  • mammalian cells examples include Chinese hamster ovary cell CHO cells [Journal of Experimental Medicine, 108, 945 (1958); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 1275 (1968); Genetics, 55, 513. (1968); Chromosoma, 41, 129 (1973); Methods in Cell Science, 18, 115 (1996); Radiation Research, 148, 260 (1997); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980) ); Proc. Natl. Acad. Sci., 60, 1275 (1968); Cell, 6, 121 (1975); Molecular Cell Genetics, Appendix I, II (pp.
  • CHO / DG44 cells Defective CHO cells (CHO / DG44 cells) [Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,4216 (1980)], CHO-K1 (ATCC CCL-61), DUkXB11 (ATCC CCL-9096), Pro-5 (ATCC CCL-1781), CHO-S (Life Technologies, Cat # 11619), Pro-3, human umbilical vein endothelial cells (HUVEC), human umbilical artery endothelial cells (HUAEC), human lung microvascular endothelial cells (HLMVEC) , Human aortic endothelial cells (HAoEC), human coronary endothelial cells (HCAEC), human pulmonary artery endothelial cells (HPAEC), human fetal kidney (HEK), rat myeloma cells YB2 / 3HL.
  • HAVEC human umbilical vein endothelial cells
  • HAAEC human umbilical artery
  • G11.16Ag. 20 also referred to as YB2 / 0
  • monkey cell COS cell mouse myeloma cell NSO
  • mouse myeloma cell SP2 / 0-Ag14
  • Syrian hamster cell BHK or HBT5637 Japanese Patent Laid-Open No. 63-000299
  • CHO cells CHO / DG44 cells or CHO-K1 (ATCC CCL-61) are preferable, and CHO cells are more preferable.
  • proteins required for heparan biosynthesis include bifunctional heparan sulfate N-deacetylase / N-sulfate transferase (hereinafter abbreviated as NDST2), heparan sulfate glucosamine 3 sulfate transferase 1 (hereinafter abbreviated). , Hs3st1), heparan sulfate 2-O-sulfate transferase, C5-epimerase, heparan sulfate 6-O-sulfate transferase, and the like.
  • NDST2 and Hs3st1 are preferable.
  • These proteins may be variants of the protein as long as they have the activity required for heparin biosynthesis.
  • These proteins are preferably of mammalian origin, more preferably of mouse or human origin.
  • Examples of the protein required for heparin biosynthesis include proteins that are not expressed in wild-type mammalian cells.
  • the mammalian cell is a CHO cell
  • CHO cells that produce heparin-like substances can be obtained (Bail JY et al., Metab Eng 14: 81-90, 2012).
  • NDST2 examples include proteins containing the amino acid sequence of any one of (1-a) to (1-c) below and having the function of NDST2.
  • Hs3st1 include proteins containing the amino acid sequence of any one of (2-a) to (2-c) below and having the function of Hs3st1.
  • (2-a) Amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 or the amino acid sequence of NCBI accession number NP_034604.1
  • (2-b) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 or the amino acid sequence of NCBI accession number NP_034604.1.
  • more preferably 90% or more most preferably 95% or more amino acid sequence having homology
  • a polypeptide having an amino acid sequence in which one to several amino acids are deleted, substituted or added in the target amino acid sequence is a site-specific mutagenesis method [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory. Press (1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997), Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982), Gene , 34, 315 (1985), Molecular Acids Research, 13, 4431 (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)], for example, amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 3. It can be obtained by introducing a site-specific mutation into a DNA encoding a polypeptide containing.
  • the range of "1 to several” in “deletion, substitution, addition of 1 to several amino acids” of the amino acid sequence is not particularly limited. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 or 20, preferably 1, 2 per unit It means about 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10, more preferably about 1, 2, 3, 4 or 5.
  • amino acid deletion means missing or eliminating an amino acid residue in the sequence
  • amino acid substitution means that an amino acid residue in the sequence has been replaced with another amino acid residue.
  • Additional of amino acids means that new amino acid residues have been added to the sequence for insertion.
  • substitution, substitution, addition of 1 to several amino acids there is an embodiment in which 1 to several amino acids are replaced with another chemically similar amino acid.
  • a case where one hydrophobic amino acid is replaced with another hydrophobic amino acid, a case where a certain polar amino acid is replaced with another polar amino acid having the same charge, and the like can be mentioned.
  • Such chemically similar amino acids are known in the art for each amino acid.
  • non-polar (hydrophobic) amino acids such as alanine, valine, glycine, isoleucine, leucine, proline, tryptophan, phenylalanine, and methionine.
  • polar (neutral) amino acids include serine, threonine, tyrosine, glutamine, asparagine, and cysteine.
  • positively charged basic amino acids include arginine, histidine, and lysine.
  • negatively charged acidic amino acids include aspartic acid and glutamic acid.
  • the amino acid sequence having deletions, substitutions, additions, etc. of one to several amino acids includes an amino acid sequence having a certain degree of sequence identity with the amino acid sequence of the target protein.
  • the amino acid sequence of the protein of interest is 60% or more, preferably 65% or more, preferably 70% or more, preferably 75% or more, preferably 80% or more, preferably 85% or more, more preferably.
  • Examples include amino acid sequences having 90% or more, more preferably 95% or more sequence identity.
  • the gene encoding NDST2 is a gene having the base sequence of any one of (1-A) to (1-D) below and containing the base sequence encoding the amino acid sequence of the protein having the function of NDST2. Can be mentioned.
  • (1-A) The nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4 or the nucleotide sequence of NCBI Accession No. NM_003635.3
  • (1-B) In the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4 or the nucleotide sequence of NCBI Accession No. NM_003635.3. Nucleotide sequence and stringent complementary to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4 or the nucleotide sequence of NCBI Accession No.
  • NM_003635.3 in which 1 to several bases are deleted, substituted or added.
  • Nucleotide sequence (1-D) that hybridizes under various conditions A nucleotide sequence having at least 60% or more homology with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 or the nucleotide sequence of NCBI Accession No. NM_003635.3, preferably 80%.
  • the gene encoding Hs3st1 is a gene having the base sequence of any one of (2-A) to (2-D) below and containing the base sequence encoding the amino acid sequence of the protein having the function of Hs3st1. Can be mentioned.
  • NM_010474.2 in which 1 to several nucleotides are deleted, substituted or added.
  • Nucleotide sequence (2-D) that hybridizes under various conditions A nucleotide sequence having at least 60% or more homology with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 or the nucleotide sequence of NCBI Accession No. NM_010474.2, preferably 80%.
  • a colony hybridization method As the base sequence that hybridizes under stringent conditions, a colony hybridization method, a plaque hybridization method, a Southern blot hybridization method, or a DNA microarray method using a DNA containing the target base sequence as a probe. It refers to the base sequence of hybridizable DNA obtained by the above.
  • 0.7 to 1.0 mol / L sodium chloride is present using a filter or slide glass on which DNA derived from hybridized colonies or plaques, or PCR product or oligo DNA having the sequence is immobilized.
  • Hybridization method at 65 ° C. [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997), DNA Cloning 1: CoreTech , A Practical Approach, Second Edition, Oxford University, (1995)]
  • 0.1 to 2 times the concentration of SSC solution the composition of the 1 times concentration of SSC solution is 150 mmol / L sodium chloride, 15 mmol / L.
  • the base sequence of DNA that can be identified by washing the filter or slide glass under 65 ° C. conditions using (consisting of sodium chloride) can be mentioned.
  • DNA containing a base sequence that hybridizes under stringent conditions examples include DNA having a certain degree of sequence identity with the base sequence of DNA having the base sequence of the gene to be used as a probe. For example, DNA having at least 60% or more homology with the target base sequence, preferably DNA having 80% or more homology, and more preferably 95% or more homology. Further, for example, assuming that the number of bases in the base sequence is 100 as one unit, in the base sequence of the target gene, 1 to several, preferably 1 to 40, preferably 1 to 35 per unit.
  • a DNA containing a base sequence having a deletion, substitution, addition, etc. of 10, more preferably 1, 2, 3, 4 or 5 bases can be mentioned.
  • Base deletion means that a base in the sequence is missing or missing
  • base substitution means that the base in the sequence has been replaced with another base
  • base replacement means that a new base has been added to insert.
  • Gene polymorphisms are often found in the base sequences of genes encoding eukaryotic proteins.
  • the gene used in the present invention also contains a gene in which a small mutation has occurred in the base sequence due to such a polymorphism.
  • the default parameters are 5 when G (Cost to open gap) is a base sequence, 11 when it is an amino acid sequence, 2 when -E (Cost to extend gap) is a base sequence, and 1 when it is an amino acid sequence.
  • -Q (Penalty for nucleotide mismatch) is -3
  • -r (reward for nucleotide match) is 1
  • -e (expect value) is 10
  • -W (wordsize) is 11 residues
  • amino acid sequence In the case of, 3 residues
  • -y [Dropoff (X) for blast extensions in bits] is 20, if it is blastn 7, 7 in programs other than blastn
  • -X (X dropoff value for gapped sequences in bits) is 15 and-
  • Z final X dropoff value for gapped alignment in bits) is blastn, it is 50, and for programs other than blastn, it is 25 (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cg
  • Mammalian cells producing heparin-like substances are obtained by introducing a recombinant vector containing a cDNA encoding the full length or a partial length of a protein required for heparin biosynthesis into a mammalian cell as a host cell. be able to.
  • any one that can autonomously replicate in the host cell to be used or integrate into the chromosome and contains an appropriate promoter at a position where the DNA encoding the polypeptide can be transcribed is used. be able to.
  • the transcription termination sequence is not always necessary for the recombinant vector, but it is preferable to place the transcription termination sequence directly under the structural gene.
  • the recombinant vector may contain a gene that controls a promoter.
  • the recombinant vector it is preferable to use a plasmid in which the Kozak sequence, which is a ribosome-binding sequence, is appropriately arranged around the start codon.
  • the base in the base sequence of DNA, can be replaced so as to be the optimum codon for expression in the host, thereby improving the production rates of the target NDST2 and Hs3st1.
  • any one that can exert its function in animal cells can be used.
  • any promoter that can exert its function in animal cells can be used.
  • a promoter of the cytomegalovirus (CMV) immediate early (IE) gene an initial promoter of SV40, and a promoter of retrovirus.
  • an enhancer of the IE gene of human CMV may be used together with a promoter.
  • the recombinant vector may contain a selectable marker.
  • a "selectable marker” is a gene that allows the selection of cells containing the gene. "Positive selection” refers to the process by which positive selection occurs and the cells containing the selectable marker are selected.
  • An example of a selectable marker with positive drug resistance is that cells containing the marker survive in the drug-containing culture medium and cells without the marker die.
  • Selectable markers include drug resistance genes such as neo, which confer G418 resistance; hygr, which confer hygromycin resistance; and puro, which confer puromycin resistance.
  • Other positive selectable marker genes include genes that allow identification or screening of cells containing the marker.
  • genes include, among others, surface markers such as the fluorescent protein (GFP and GFP-like chromophore, luciferase) gene, the lacZ gene, the alkaline phosphatase gene, and CD8.
  • surface markers such as the fluorescent protein (GFP and GFP-like chromophore, luciferase) gene, the lacZ gene, the alkaline phosphatase gene, and CD8.
  • Negative selection refers to the process of killing cells containing a negative selectable marker by exposure to the appropriate negative selectable agent.
  • HSV-tk herpes simplex virus thymidine kinase
  • GANC drug ganciclovir
  • the gpt gene makes cells 6-thioxanthine sensitive.
  • any method for introducing DNA into an animal cell can be used.
  • the electroporation method [Cytotechnology, 3, 133 (1990)]
  • the calcium phosphate method Japanese Patent Laid-Open No. 02-227075
  • the lipofection method [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987). )] And so on.
  • Step (2) A step of preparing a recombinant cell in which a gene encoding the extracellular domain of Cindecane is introduced into a mammalian cell producing a heparin-like substance prepared in Step (1).
  • Step (2) is a step of preparing a recombinant cell of Cindecane. This is a step of preparing a recombinant cell in which a recombinant vector containing a gene encoding an extracellular domain is introduced into a mammalian cell producing a heparin-like substance prepared in step (1).
  • Cindecane consists of an extracellular domain, a transmembrane domain and a cytoplasmic domain.
  • the extracellular domain of Cindecane contains the glycosaminoglycan binding site. It is preferable to have at least a glycosaminoglycan binding site as the extracellular domain of Cindecane.
  • the extracellular domain of Cindecane is preferably of mammalian origin, more preferably of mouse or human origin.
  • Examples of the extracellular domain of Cindecane include proteins containing the amino acid sequence of any one of (3-a) to (3-c) below and having the function of the extracellular domain of Cindecane.
  • the added amino acid sequence (3-c) is an amino acid sequence having 60% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, most preferably 95% or more homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is the 1st to 229th amino acid sequence from the N-terminal of the amino acid sequence (total length 310 amino acids) of NCBI accession number NP_001006947.1.
  • the gene encoding the extracellular domain of Cindecane is the amino acid sequence of a protein having the base sequence of any one of (3-A) to (3-D) below and having the function of the extracellular domain of Cindecane. Examples include genes containing a base sequence encoding.
  • NM_001006946.1 in which 1 to several nucleotides are deleted, substituted or added.
  • Nucleotide sequence (3-D) that hybridizes under various conditions A nucleotide sequence having at least 60% or more homology with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 or the nucleotide sequence of NCBI Accession No. NM_001006946.1, preferably 80%.
  • a heparin-like substance prepared in step (1) is produced by preparing a recombinant vector containing a gene encoding the extracellular domain of Cindecane and cDNA encoding the total length or a partial length of the extracellular domain of Cindecane.
  • a recombinant cell capable of secreting a heparin-like substance into a culture supernatant is obtained.
  • the method for introducing the recombinant vector and the recombinant vector into the host cell is the same as in step (1).
  • step (3) A step of culturing the recombinant cells prepared in step (2) in a medium and recovering a heparin-like substance from the obtained culture supernatant.
  • step (3) the recombinant cells prepared in step (2) are used. This is a step of secreting and producing a heparin-like substance in a medium by culturing in a medium, and recovering the heparin-like substance from the obtained culture supernatant.
  • the recombinant cells are preferably cultured under conditions that promote the production of heparin-like substances. Specifically, for example, it is preferable to culture the recombinant cells in a medium that enables the production of heparin-like substances in the recombinant cells and promotes the secretion of the heparin-like substances from the recombinant cells to the culture supernatant. ..
  • the medium contains at least sufficient carbon, nitrogen, oxygen and other nutrients, growth factors, buffers, cofactors and any other substance to maintain cell viability and allow the expression of heparin-like substances. It is preferable to contain it.
  • the medium may further comprise an inducer.
  • the medium examples include RPMI or DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum (FCS), and tissue culture medium supplemented with factors such as antibacterial agents, growth factors, and other cytokines (for example, Cell Biology (eg, Cell Biology). Third Edition) A Laboratory Handbook, vol. 1, 2006, Elsevier Inc.). Specific examples thereof include medium preparations known to those skilled in the art, such as RPMI, IMDM, DMEM, DMEM / F12, serum-free or low-serum EMEM. These media may contain additional dietary supplements such as antibiotics, lipids, transferrin, insulin, amino acids, and optionally cofactors.
  • FCS fetal bovine serum
  • tissue culture medium supplemented with factors such as antibacterial agents, growth factors, and other cytokines (for example, Cell Biology (eg, Cell Biology). Third Edition) A Laboratory Handbook, vol. 1, 2006, Elsevier Inc.). Specific examples thereof include medium preparations known to those skilled in the art, such as RPMI,
  • the medium preferably contains at least one selected from glucose, sulfate and phosphoric acid.
  • concentration of glucose in the medium is usually preferably 5 to 75 mM, more preferably 10 to 60 mM, still more preferably 15 to 35 mM.
  • concentration of sulfate in the medium is usually preferably 0.5 to 50 mM, more preferably 10 to 50 mM, and even more preferably 30 to 50 mM.
  • concentration of phosphate in the medium is usually preferably 0.5 to 50 mM, more preferably 1 to 50 mM, still more preferably 10 to 50 mM.
  • a heparin-like substance can be produced by producing and accumulating a heparin-like substance in the culture supernatant and collecting it from the culture supernatant.
  • the method of culturing the recombinant cells in the medium can be carried out according to a usual method. Culturing is usually carried out for 1 to 7 days under conditions such as pH 6 to 8, 30 to 40 ° C. and the presence of 5% CO 2.
  • the secretory production of heparin-like substances from recombinant cells is for unsaturated disaccharide analysis after enzyme treatment by adding an enzyme solution containing heparin lyases I, II, and III to the culture supernatant, as described later in Examples. It can be confirmed by quantifying by HPLC. Specifically, 2SNS6, glucuronic acid in which the amino group of glucosamine and 3 sulfate groups are bonded to the 6-position in the culture supernatant of recombinant cells as compared with the culture supernatant of control (wild type) cells.
  • the amount of at least one selected from 2SNS in which a sulfate group is bonded to the 2-position and the glucosamine amino group, NS6S in which the amino group of glucosamine and two sulfates are bonded to the 6-position, and NS in which the sulfate group is bonded to glucosamine N increases. If so, it is assumed that a heparin-like substance is secreted and produced in the culture supernatant from the recombinant cells. The secretory production of heparinoids from recombinant cells can also be confirmed by measuring the amount of sGAG (sulfated GAG) in the culture supernatant, as will be described later in the examples.
  • sGAG sulfated GAG
  • proteoglycan which is a glycoprotein containing a core protein bound to a heparin-like substance that is GAG, is secreted from the recombinant cells into the culture supernatant. Isolation of the protein from the culture supernatant is carried out by a method conventionally known in the art.
  • tags that facilitate the isolation of heparinoids such as affinity tags, may be used.
  • Tags include, for example, polyhistidine (His6 tag), nickel matrix, chitin binding protein (CBP), maltose binding protein (MBP), glutathione-S-transferase (GST), FLAG tag or epitope tag.
  • Isolation of heparinoids from core proteins is performed by methods conventionally known in the art. For example, enzymatic digestion using heparinase, treatment with sodium hydroxide or boron borohydride can be mentioned.
  • the isolated heparinoid substance preferably contains 50% or more, more preferably 60% or more, further preferably 70% or more, and particularly preferably 80% or more of sulfated disaccharides.
  • the isolated heparinoids include, for example, the following (1) to (20). (1) 10 to 50% trisulfated disaccharide, 30 to 50% disulfated disaccharide and 10 to 30% monosulfated disaccharide. (2) 10-40% trisulfated disaccharide, 35-45% disulfated disaccharide and 10-25% monosulfated disaccharide. (3) 15-40% trisulfated disaccharide, 35-45% disulfated disaccharide and 10-25% monosulfated disaccharide. (4) 5 to 25% trisulfated disaccharide, 30 to 50% disulfated disaccharide and 10 to 20% monosulfated disaccharide.
  • Heparinoids can contain repeating structures of disaccharide units of various lengths. Heparin-like substances are UA-GlcNAc (6S), UA (2S) -GlcNAc, UA- (2S) -GlcNAc (6S), UA-GlcNS, UA-GlcNS (6S), UA (2S) -GlcNS, UA ( It preferably contains any of 2S) -GlcNS (6S), which may be present in the heparin-like substance in any order.
  • UA is a uronic acid residue (ie, glucuronic acid or iduronic acid)
  • Ac is acetyl
  • GlcNAc is N-acetylglucosamine
  • GlcNS is glucosamine-N-sulfate
  • 2S is 2-O-sulfate
  • 6S is 6. -O-sulfate.
  • One aspect of the present invention is a recombinant cell in which a gene encoding the extracellular domain of SDC is introduced into a mammalian cell producing a heparin-like substance.
  • the recombinant cell prepares a mammalian cell that produces a heparin-like substance in the same manner as described above in the steps (1) and (2) of the section ⁇ Method for producing a heparin-like substance>, and prepares the mammalian cell. It can be prepared by introducing a gene encoding the extracellular domain of Cindecane into a cell.
  • a method for producing a cell secreting and producing a heparin-like substance which comprises a step of introducing a recombinant expression vector containing a gene encoding the extracellular domain of SDC into a mammalian cell producing a heparin-like substance.
  • a mammalian cell producing a heparin-like substance is prepared in the same manner as described above in the steps (1) and (2) of the section ⁇ Method for producing a heparin-like substance>, and the mammalian cell is prepared. It can be carried out by introducing a gene encoding the extracellular domain of Cindecane into.
  • ⁇ Pharmaceutical composition> is a pharmaceutical composition containing a heparin-like substance or a fragment thereof produced by the method described in the present specification.
  • the heparinoid or fragment thereof may be bound to the core protein.
  • the pharmaceutical composition may contain other therapeutic agents.
  • Pharmaceutical compositions can also be formulated using, for example, conventional vehicles or diluents, as well as pharmaceutical additives of the type suitable for the desired method of administration (eg, excipients, binders, preservatives).
  • Examples of the form of the pharmaceutical composition include sterile aqueous agents for injection.
  • Aqueous sterile injectables can be formulated according to known techniques using suitable dispersants or wetting and suspending agents.
  • the sterile injectable aqueous agent may be a sterile injectable solution or suspension in a non-toxic parenterally acceptable diluent or solvent, such as a solution in 1,3-butanediol.
  • Acceptable vehicles and solvents that can be used are water, Ringer's solution and isotonic saline.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition is not particularly limited, and a wide variety of dosage forms can be used.
  • Examples of the dosage form for administering the pharmaceutical composition include tablets, capsules, sachets, lozenges, pills, powders, granules, elixirs, tinctures, solutions, suspensions, etc.
  • Examples include administration in the form of elixirs, syrups, ointments, creams, intravenous administration or injection, pastes, emulsions or solutions.
  • transdermal administration by a patch mechanism or an ointment can be mentioned. Any of these may be modified to sustained release and / or sustained release formulations.
  • Pharmaceutically acceptable carriers include vehicles, adjuvants, surfactants, suspensions, emulsifiers, inert fillers, diluents, excipients, wetting agents, binders, lubricants, buffers, disintegration agents. Includes, but is not limited to, agents and carriers.
  • the pharmaceutically acceptable carrier is chemically inert to the active compound and has no adverse side effects or toxicity under conditions of use. The properties of the pharmaceutically acceptable carrier may vary depending on the particular dosage form and other characteristics of the composition used.
  • One aspect of the invention involves or by blood coagulation in a subject in need thereof, comprising administering a heparin-like substance or fragment thereof produced by the methods described herein. Examples include methods of treating or preventing the condition that is caused.
  • the heparinoid or fragment thereof may be bound to the core protein.
  • Conditions associated with or caused by blood coagulation or blood coagulation include, for example, acute coronary syndrome, atrial fibrillation, deep vein thrombosis or pulmonary embolism.
  • Mammals include, for example, humans, primates, domestic animals (eg, sheep, cows, horses, donkeys, pigs), companion animals (eg, dogs, cats), laboratory test animals (eg, mice, rabbits, rats). , Guinea pigs, hamsters), captured wild animals (eg, foxes, deer). Mammals are typically humans or primates, and more typically humans.
  • the dose and timing are preferably doses and timings that provide therapeutic benefits in the treatment, prevention or management of blood coagulation or conditions associated with blood coagulation.
  • the specific effective dose and timing of administration may vary depending on factors such as the subject's condition, medical history, physique, body weight, and age.
  • the vector PB513B-1_SRGN-IRES-EGFP used for the production of CHO / NH-SRGN cells is based on PiggyBac Transposon Vector PB513B-1 and has a Chinese hamster EF1 ⁇ promoter, an IRES element, and a mycHis tag sequence at the C-terminal. Is.
  • the DNA encoding hSRGN (the base sequence represented by SEQ ID NO: 7) is co-expressed with the screening markers EGFP gene and puromycin resistance gene. Introduced to do.
  • CHO / NH-SRGN cells in which DNA encoding human seriglycin (SRGN) (base sequence represented by SEQ ID NO: 7) was introduced into CHO / NH # 3 cells using the vector PB513B-1_SRGN-IRES-EGFP, and CHO / NH-SRGN cells.
  • CHO / NH-SDC cells were prepared by introducing the DNA of the extracellular domain of human syndecane (SDC) (the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6) using the vector PB513B-1_SDC-IRES-EGFP.
  • the vector PB513B-1_SDC-IRES-EGFP used to prepare CHO / NH-SDC cells is based on PiggyBac Transposon Vector PB513B-1 and has a Chinese hamster EF1 ⁇ promoter, an IRES element, and a mycHis tag sequence at the C-terminus. It is a vector.
  • the DNA encoding SRGN (the base sequence represented by SEQ ID NO: 7) is co-expressed with the screening markers EGFP gene and puromycin resistance gene. Introduced to do.
  • the culture supernatant of each cell prepared as described above was analyzed to evaluate the heparin-producing ability.
  • sGAG assay refers to an assay in which the total amount of sGAG in a solution is colorimetrically quantified using a dye (1,9-dimethylmethylene blue) that specifically binds to a sulfated sugar chain. The results are shown in FIG.
  • heparin To confirm the production of heparin, first take 20 ⁇ L of the sample solution directly, add 10 ⁇ L of a buffer solution and 10 ⁇ L of an enzyme solution containing 10 mU of each of heparin liase I, II, and III, and perform enzyme treatment at 37 ° C. for 3 hours to complete the reaction. After that, the enzyme was inactivated at 100 ° C. for 5 minutes, and after freeze-drying, 20 ⁇ L of water was added and quantified by HPLC for unsaturated disaccharide analysis. The results are shown in FIGS. 3 (A) and 3 (B).
  • WT is a wild-type CHO cell
  • # 3 is a CHO-NH # 3 cell
  • SRGN is a DNA encoding SRGN (base sequence represented by SEQ ID NO: 7) in the CHO cell.
  • CHO-SRGN cells introduced using the vector PB513B-1_SRGN-IRES-EGFP
  • # 3SRGN is CHO / NH-SRGN cells
  • SDC is CHO cells with DNA of the extracellular domain of SDC (base sequence represented by SEQ ID NO: 6).
  • Is introduced using the vector PB513B-1_SDC-IRES-EGFP.
  • CHO-SDC cells are shown.
  • CHO / NH-SDC cells were cultured in a serum-containing medium to form an adhesive state, and cloning was performed on a collagen-coated 96-well plate by the limiting dilution method. At this time, since the cells were cultured from one cell, the cells were cultured without adding a drug in consideration of toxicity to the cells.
  • the collagen coat was scaled up to a 24- or 6-well plate, and a plurality of clones were cultured to establish 36 clones.
  • each cell was seeded on a normal 6-well plate at 0.6 ⁇ 10 6 cells / well, and the amount of sGAG in the culture supernatant was measured using the culture supernatant collected 3 days later without medium exchange as a sample.
  • Top 6 clones (# 5, # 20, # 26, # 29, # 30, # 34) were subjected to serum-free acclimation.
  • the evaluated 6 clones have the same or higher SDC secretion-producing ability as those of CHO / NH-SDC cells, and # 5 is 1. of CHO / NH-SDC cells. It was 5 times or more and showed the highest expression level.
  • FIG. 7 (A) shows the expression level of the NDST2 gene
  • FIG. 7 (B) shows the expression level of the Hs3st1 gene
  • FIG. 7 (C) shows the expression level of the SDC gene.
  • ⁇ Analysis conditions> As a pretreatment of the sample, 400 ⁇ L of two-stage distilled water (Double Distilled Water, DDW) was added to the upper layer obtained by centrifuging 400 ⁇ L of the culture supernatant of various CHO cells at 10,000 rpm for 10 minutes, and freeze-dried. Then, 20 ⁇ L was separated from the 40 ⁇ L sample and treated with Heparin lyase I, II and III, 80 ⁇ L of DDW was added, and 20 ⁇ L was subjected to HPLC.
  • DDW Double Distilled Water
  • the treatment with the specific degrading enzyme was as follows. Acetic acid buffer [0.1MCH 3 COONa, 10 mM (CH 3 COO) 2Ca (pH 7.0)] 20 ⁇ L, 0.5 mU / ⁇ L Heparinase 5 ⁇ L, 0.5 mU / ⁇ L Heparitinase I 5 ⁇ L, 0.5 mU / ⁇ L Heparitinase II 5 ⁇ L at the same time.
  • heparin-like sugar chains were decomposed into unsaturated disaccharides by incubating at 37 ° C. for 16 hours. The enzyme was inactivated by heating in a boiling water bath for 3 minutes, lyophilized, dissolved in water, and subjected to unsaturated disaccharide analysis by HPLC.
  • FIG. 8 The result of quantifying sGAG in the sample used for the analysis by HPLC is shown in FIG. 8, and the standard heparin-derived unsaturated disaccharide (HS-Standards) and the chromatogram obtained from the sample are shown in FIG.
  • FIGS. 10 (A) and 10 (B) The results of quantifying the content of heparin-like sugar chains and the ratio of each sugar chain to sulfate by HPLC are shown in FIGS. 10 (A) and 10 (B), respectively.
  • Table 1 shows the concentration of sulfated sugar chains (HS) and the ratio of sulfated sugar chains in the detected heparin-like substance.
  • Antithrombin III agent Antithrombin III (human origin) 3.
  • Factor Xa agent Factor Xa (derived from bovine) 4.
  • Buffer solution 2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol buffer solution 5.
  • Normal plasma agent Human normal plasma
  • anticoagulant activity was determined using the calibration curve shown in FIG. The results are shown in Table 2.

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Abstract

本発明は、動物由来組織を用いずに、ヘパリン様物質を効率的に生産する製造方法を提供することを目的とする。本発明は、（１）ヘパリン様物質を産生する哺乳動物細胞を調製する工程、（２）工程（１）で調製したヘパリン様物質を産生する哺乳動物細胞に、シンデカンの細胞外ドメインをコードする遺伝子を導入した組換え細胞を調製する工程、（３）工程（２）で調製した組換え細胞を培地中で培養し、得られる培養上清からヘパリン様物質を回収する工程を含むヘパリン様物質の製造方法等に関する。

Description

ヘパリン様物質の製造方法、組換え細胞及びその製造方法
　本発明は、ヘパリン様物質の製造方法、組換え細胞及びその製造方法に関する。
　ヘパリンは抗血液凝固薬として、人工透析や体外循環などの医療現場で使用されている必要不可欠な薬剤である。ヘパリンは、例えば血栓塞栓症の予防又は治療薬として、注射可能な形態で使用される。ヘパリンはまた、例えば腎臓透析機などの様々な実験用および医療用装置上に抗凝固剤表面を形成するためにも使用される。
　ヘパリンは、グリコサミノグリカン（以下、ＧＡＧとも略す。）の４つの主要なサブファミリーの１つである多糖類である。ＧＡＧは、反復二糖単位からなる長い多糖である。ＧＡＧは主に、（１）ヘパラン硫酸（以下、ＨＳとも略す。）／ヘパリン、（２）ケラタン硫酸（ＫＳ）、（３）コンドロイチン／デルマタン硫酸（ＣＳ／ＤＳ）、（４）ヒアルロン酸またはヒアルロナン（ＨＡ）の４つのサブファミリーに分類される。
　ＧＡＧのサブファミリーは、単糖成分、グリコシル結合、並びに糖の位置及び程度が互いに異なる。ＨＡを除いて、ＧＡＧはコアタンパク質に共有結合しており、ＧＡＧがコアタンパク質と共有結合したものは、プロテオグリカンとして知られている。
　ヘパリン及びＨＳは酸性ムコ多糖類の不均一な混成物であり、ヘパリンはＨＳの一種である。ヘパリン／ＨＳは、ウロン酸（β－Ｄ－グルクロン酸およびα－Ｌ－イズロン酸）とグルコサミン（Ｄ－Ｎ－アセチルグルコサミンおよびＤ－Ｎ－硫酸グルコサミン）の二糖が１単位となって、それらがα又はβ－１，４結合を数十から数百回繰り返した直鎖状の多糖である。分子量は鎖長の違いによって３から３０ｋＤａと様々であり、平均１２～１５ｋＤａである。ヘパリン／ＨＳに対する修飾としては、例えば、ウロン酸の２位のＯ－硫酸化、グルコサミンの３位及び６位のＯ－硫酸化、２位のアミノ基のＮ－硫酸化が挙げられる。
　ほとんどすべての哺乳動物細胞は、細胞外マトリックスに存在する細胞関連糖鎖中のプロテオグリカンに組み込まれて組織形態および機能を規定するＧＡＧを産生する。ＨＳは、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリー、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、および血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）などの増殖因子を調節することによって細胞の増殖および発生を調節する。一方、ヘパリンは主に肥満細胞で産生される。
　医薬品等に用いられるヘパリンは、主にブタの小腸又はウシの肺から抽出、精製されている。しかしながら、これらの供給源から得られたヘパリンは、過硫酸化コンドロイチン硫酸の混入によるいくつかの有害事象と関連している（非特許文献１)。また、動物組織からのヘパリンの単離は、動物からヒトへ、例えばウイルス、バクテリアおよび伝染性海綿状脳症（Transmissible Spongiform Encephalopathy）のような疾病病原体が伝播する危険性がある。したがって、動物由来組織を用いないヘパリンの新しい生産技術の開発が望まれている。ヘパリンを化学的又は化学酵素的な手法により合成することも可能であるが、動物由来のヘパリンに存在する不均一な構造の集団を製造することは困難である。
　一方、シンデカンは、保持された原形質膜ドメインと細胞質ドメインを持った細胞表面の４種のプロテオグリカンファミリーである。細胞外ドメインには、共有結合したグリコサミノグリカン鎖が存在している。それらは主としてヘパラン硫酸（ＨＳ）であり、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）も含まれる（非特許文献２)。
Guerrini et al, Nat. Biotechnol., 2008, 26, pp.669-675 Trends in Glycoscience and Glycotechnology, 1993, Vol.5, No.22, pp.107-120
　上述したように、動物由来組織を用いないヘパリンの新しい生産技術の開発が望まれている。本発明者らは、ヘパリン様物質を産生する哺乳動物細胞を用いたヘパリン様物質の産生を試みたところ、該哺乳動物細胞から生産されるヘパリン様物質を含有するプロテオグリカンが細胞膜に付着し、培養上清中に分泌されにくいことを見出した。そのため、複雑な精製工程が必要となり、ヘパリン様物質の工業生産化にあたり大きな課題となる。したがって、本発明は、動物由来組織を用いずに、ヘパリン様物質を効率的に生産する製造方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、ヘパリン様物質を産生する哺乳動物細胞に、シンデカンの細胞外ドメインをコードする遺伝子を導入することにより、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成させた。
　本発明は、以下の通りである。
１．以下の工程（１）～（３）を含むヘパリン様物質の製造方法。
（１）ヘパリン様物質を産生する哺乳動物細胞を調製する工程
（２）工程（１）で調製したヘパリン様物質を産生する哺乳動物細胞に、シンデカン（以下、ＳＤＣと略す。）の細胞外ドメインをコードする遺伝子を導入した組換え細胞を調製する工程
（３）工程（２）で調製した組換え細胞を培地中で培養し、得られる培養上清からヘパリン様物質を回収する工程
２．前記へパリン様物質を産生する哺乳動物細胞は、両機能性ヘパラン硫酸エステルＮ－脱アセチラーゼ／Ｎ－硫酸転移酵素（以下、ＮＤＳＴ２と略す。）をコードする遺伝子及びへパラン硫酸エステルグルコサミン３　硫酸転移酵素１（以下、Ｈｓ３ｓｔ１と略す。）をコードする遺伝子の少なくとも一方が導入された細胞である、前記１に記載の製造方法。
３．前記哺乳動物細胞はチャイニーズ・ハムスター由来卵巣（以下、ＣＨＯと略す。）細胞である、前記１又は２に記載の製造方法。
４．ＮＤＳＴ２が以下の（１ａ）～（１ｃ）のいずれか１のアミノ酸配列を含み、かつＮＤＳＴ２の機能を有するタンパク質である、前記２又は３に記載の製造方法。
（１ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列
（１ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列
（１ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列
５．Ｈｓ３ｓｔ１が以下の（２ａ）～（２ｃ）のいずれか１のアミノ酸配列を含み、かつＨｓ３ｓｔ１の機能を有するタンパク質である、前記２～４のいずれか１に記載の製造方法。
（２ａ）配列番号３に記載のアミノ酸配列
（２ｂ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列
（２ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列
６．ＳＤＣの細胞外ドメインが以下の（３ａ）～（３ｃ）のいずれか１のアミノ酸配列を含み、かつＳＤＣの細胞外ドメインの機能を有するタンパク質である、前記１～５のいずれか１に記載の製造方法。
（３ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列
（３ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列
（３ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列
７．ＮＤＳＴ２及びＨｓ３ｓｔ１がマウス又はヒト由来である、前記２～６のいずれか１に記載の製造方法。
８．ＮＤＳＴ２をコードする遺伝子が、以下の（１Ａ）～（１Ｄ）のいずれか１の塩基配列であって、かつＮＤＳＴ２の機能を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、前記２～７のいずれか１に記載の製造方法。
（１Ａ）配列番号４に記載の塩基配列
（１Ｂ）配列番号４に記載の塩基配列において、１から数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列
（１Ｃ）配列番号４に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（１Ｄ）配列番号４に記載の塩基配列と８０％以上の相同性を有する塩基配列
９．Ｈｓ３ｓｔ１をコードする遺伝子が、以下の（２Ａ）～（２Ｄ）のいずれか１の塩基配列であって、かつＨｓ３ｓｔ１の機能を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、前記２～８のいずれか１に記載の製造方法。
（２Ａ）配列番号５に記載の塩基配列
（２Ｂ）配列番号５に記載の塩基配列において、１から数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列
（２Ｃ）配列番号５に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（２Ｄ）配列番号５に記載の塩基配列と８０％以上の相同性を有する塩基配列
１０．ＳＤＣの細胞外ドメインをコードする遺伝子が、以下の（３Ａ）～（３Ｄ）のいずれか１の塩基配列であって、かつＳＤＣの細胞外ドメインの機能を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、前記１～９のいずれか１に記載の製造方法。
（３Ａ）配列番号６に記載の塩基配列
（３Ｂ）配列番号６に記載の塩基配列において、１から数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列
（３Ｃ）配列番号６に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（３Ｄ）配列番号６に記載の塩基配列と８０％以上の相同性を有する塩基配列
１１．ヘパリン様物質を産生する哺乳動物細胞に、ＳＤＣの細胞外ドメインをコードする遺伝子が導入された組換え細胞。
１２．前記へパリン様物質を産生する哺乳動物細胞は、ＮＤＳＴ２をコードする遺伝子及びＨｓ３ｓｔ１をコードする遺伝子の少なくとも一方が導入された細胞である、前記１１に記載の組換え細胞。
１３．前記哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞である、前記１１又は１２に記載の組換え細胞。
１４．ヘパリン様物質を産生する哺乳動物細胞に、ＳＤＣの細胞外ドメインをコードする遺伝子を含む組換え発現ベクターを導入する工程を含む、ヘパリン様物質を分泌産生する細胞の製造方法。
　本発明のヘパリン様物質の製造方法によれば、ヘパリン様物質を産生する哺乳動物細胞に、シンデカンの細胞外ドメインをコードする遺伝子を導入することにより、ヘパリン様物質を培養上清に分泌生産させて、該培養上清からヘパリン様物質を回収することができる。このことにより、生産物であるヘパリン様物質が細胞膜に付着するという問題点を解決し、複雑な精製工程を要しない。したがって、本発明の製造方法によれば、動物由来組織を用いずに、ヘパリン様物質を効率的に生産することができる。
図１は、ＣＨＯ／ＮＨ－ＳＲＧＮ細胞及びＣＨＯ／ＮＨ－ＳＤＣ細胞の培養上清におけるｓＧＡＧ量をｓＧＡＧアッセイにより測定した結果を示す図である。 図２は、ＣＨＯ／ＮＨ－ＳＲＧＮ細胞及びＣＨＯ／ＮＨ－ＳＤＣ細胞の培養上清におけるｓＧＡＧ量をＨＰＬＣにより測定した結果を示す図である。 図３（Ａ）及び（Ｂ）は、ＣＨＯ／ＮＨ－ＳＲＧＮ細胞及びＣＨＯ／ＮＨ－ＳＤＣ細胞の培養上清におけるヘパリンの糖鎖構造を、ＨＰＬＣを用いて解析した結果を示す図である。図３（Ａ）はヘパリン様糖鎖濃度を、図３（Ｂ）は硫酸化に占める割合を、それぞれ定量した結果を示す。 図４は、無血清馴化後におけるｓＧＡＧ量を測定した結果を示す図である。 図５は、無血清馴化後におけるｓＧＡＧの産生速度を算出した結果を示す図である。 図６は、ＥＬＩＳＡにより目的タンパク質の発現量を測定した結果を示す図である。 図７（Ａ）～（Ｃ）は、ｑＲＴ－ＰＣＲにより、導入した遺伝子の発現量を測定した結果である。図７（Ａ）はＮＤＳＴ２遺伝子、図７（Ｂ）はＨｓ３ｓｔ１遺伝子、図７（Ｃ）はＳＤＣ遺伝子の発現量をそれぞれ示す。 図８は、ＨＰＬＣによる糖鎖構造の解析に用いたサンプルのｓＧＡＧを定量した結果を示す。 図９は、標準ヘパリン由来不飽和二糖（ＨＳ－ｓｔａｎｄａｒｄ）及び各試料から得られたＨＰＬＣによるクロマトグラムを示す図である。 図１０（Ａ）及び（Ｂ）は、各細胞の培養上清におけるヘパリンの糖鎖構造を、ＨＰＬＣを用いて解析した結果を示す図である。図１０（Ａ）はヘパリン様糖鎖濃度を、図１０（Ｂ）は硫酸化に占める割合を、それぞれ定量した結果を示す。 図１１は、抗凝固活性の評価に用いた検量線を示す。
　以下、本明細書において使用される用語は特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味を有する。
＜ヘパリン様物質の製造方法＞
　本発明のヘパリン様物質の製造方法は、以下の工程（１）～（３）を含むことを特徴とする。
（１）ヘパリン様物質を産生する哺乳動物細胞を調製する工程
（２）工程（１）で調製したヘパリン様物質を産生する哺乳動物細胞に、シンデカンの細胞外ドメインをコードする遺伝子を導入した組換え細胞を調製する工程
（３）工程（２）で調製した組換え細胞を培地中で培養し、得られる培養上清からヘパリン様物質を回収する工程
　以下各工程について説明する。
工程（１）：ヘパリン様物質を産生する哺乳動物細胞を調製する工程
　工程（１）は、ヘパリン生合成に必要となるタンパク質をコードする遺伝子を宿主となる哺乳動物細胞に導入することにより、ヘパリン様物質を産生する哺乳動物細胞を調製する工程である。
　本発明において、「ヘパリン様物質」とは、ヘパリン及びＨＳの混合物をいう。
　哺乳動物細胞としては、例えば、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞ＣＨＯ細胞［Journal of Experimental Medicine, 108, 945 (1958); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60 , 1275 (1968); Genetics, 55, 513 (1968); Chromosoma, 41, 129 (1973); Methods in Cell Science, 18, 115 (1996); Radiation Research, 148, 260 (1997); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980); Proc. Natl. Acad. Sci., 60, 1275 (1968); Cell, 6, 121 (1975); Molecular Cell Genetics, Appendix I, II (pp. 883-900)］、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子が欠損したＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞）［Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,4216(1980)］、ＣＨＯ－Ｋ１（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ－６１）、ＤＵｋＸＢ１１（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ－９０９６）、Ｐｒｏ－５（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ－１７８１）、ＣＨＯ－Ｓ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ＃１１６１９）、Ｐｒｏ－３、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、ヒト臍帯動脈内皮細胞（ＨＵＡＥＣ）、ヒト肺微小血管内皮細胞（ＨＬＭＶＥＣ）、ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡｏＥＣ）、ヒト冠状動脈内皮細胞（ＨＣＡＥＣ）、ヒト肺動脈内皮細胞（ＨＰＡＥＣ）、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）、ラットミエローマ細胞ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０（またはＹＢ２／０ともいう）、サル細胞ＣＯＳ細胞、マウスミエローマ細胞ＮＳＯ、マウスミエローマ細胞ＳＰ２／０－Ａｇ１４、シリアンハムスター細胞ＢＨＫまたはＨＢＴ５６３７（日本国特開昭６３－０００２９９号公報）などが挙げられる。生産効率の点から、これらの中でも、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞又はＣＨＯ－Ｋ１（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ－６１）は好ましく、ＣＨＯ細胞がより好ましい。
　ヘパリン生合成に必要となるタンパク質としては、例えば、両機能性ヘパラン硫酸エステルＮ－脱アセチラーゼ／Ｎ－硫酸転移酵素（以下、ＮＤＳＴ２と略す。）、へパラン硫酸エステルグルコサミン３　硫酸転移酵素１（以下、Ｈｓ３ｓｔ１と略す。）、ヘパラン硫酸２－Ｏ－硫酸転移酵素、Ｃ５－エピメラーゼ、ヘパラン硫酸６－Ｏ－硫酸転移酵素などが挙げられる。これらの中でもＮＤＳＴ２及びＨｓ３ｓｔ１が好ましい。これらのタンパク質は、ヘパリン生合成に必要となる活性を有していれば、変種のタンパク質であってもよい。これらのタンパク質は、哺乳動物由来であることが好ましく、マウス又はヒト由来であることがより好ましい。
　前記ヘパリン生合成に必要なタンパク質としては、野生型の哺乳動物細胞においては発現がみられないタンパク質が挙げられる。具体的には、例えば、哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞である場合、ヘパリン生合成に必要であり、ＣＨＯ細胞では発現がみられない、ＮＤＳＴ２及びＨｓ３ｓｔ１をコードする遺伝子の少なくとも一方を導入することにより、ヘパリン様物質を産生するＣＨＯ細胞を得ることができる（Bail JY et al., Metab Eng14:81-90, 2012）。
　ＮＤＳＴ２としては、以下の（１－ａ）～（１－ｃ）のいずれか１のアミノ酸配列を含み、かつＮＤＳＴ２の機能を有するタンパク質が挙げられる。
（１－ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列又はＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００３６２６．１のアミノ酸配列
（１－ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列又はＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００３６２６．１のアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列
（１－ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列又はＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００３６２６．１のアミノ酸配列と６０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列
　Ｈｓ３ｓｔ１としては、以下の（２－ａ）～（２－ｃ）のいずれか１のアミノ酸配列を含み、かつＨｓ３ｓｔ１の機能を有するタンパク質が挙げられる。
（２－ａ）配列番号３に記載のアミノ酸配列又はＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０３４６０４．１のアミノ酸配列
（２－ｂ）配列番号３に記載のアミノ酸配列又はＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０３４６０４．１のアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列
（２－ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列又はＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０３４６０４．１のアミノ酸配列と６０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列
　目的とするアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドは、部位特異的変異導入法［Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)、Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)、Gene, 34, 315 (1985)、Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)］などを用いて、例えば配列番号１～３のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするＤＮＡに、部位特異的変異を導入することにより得ることができる。
　アミノ酸配列の「１から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加」における「１から数個」の範囲は特に限定されないが、例えば、アミノ酸配列におけるアミノ酸数１００個を一単位とすれば、該一単位あたり、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個程度、より好ましくは１、２、３、４又は５個程度を意味する。
　「アミノ酸の欠失」とは配列中のアミノ酸残基の欠落又は消失を意味し、「アミノ酸の置換」は配列中のアミノ酸残基が別のアミノ酸残基に置き換えられていることを意味し、「アミノ酸の付加」とは配列中に新たなアミノ酸残基が挿入するように付け加えられていることを意味する。
　「１から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加」の具体的な態様としては、１から数個のアミノ酸が別の化学的に類似したアミノ酸で置き換えられた態様がある。例えば、ある疎水性アミノ酸を別の疎水性アミノ酸に置換する場合、ある極性アミノ酸を同じ電荷を有する別の極性アミノ酸に置換する場合などを挙げることができる。このような化学的に類似したアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において知られている。
　具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ塩基性アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ酸性アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
　対象となるタンパク質が有するアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加などを有するアミノ酸配列としては、対象となるタンパク質が有するアミノ酸配列と一定以上の配列同一性を有するアミノ酸配列が挙げられ、例えば、対象となるタンパク質が有するアミノ酸配列と６０％以上、好ましくは６５％以上、好ましくは７０％以上、好ましくは７５％以上、好ましくは８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。
　ＮＤＳＴ２をコードする遺伝子としては、以下の（１－Ａ）～（１－Ｄ）のいずれか１の塩基配列であって、かつＮＤＳＴ２の機能を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子が挙げられる。
（１－Ａ）配列番号４に記載の塩基配列又はＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００３６３５．３の塩基配列
（１－Ｂ）配列番号４に記載の塩基配列又はＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００３６３５．３の塩基配列において、１から数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列
（１－Ｃ）配列番号４に記載の塩基配列又はＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００３６３５．３の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（１－Ｄ）配列番号４に記載の塩基配列又はＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００３６３５．３の塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有する塩基配列、好ましくは８０％以上の相同性を有する塩基配列、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列
　Ｈｓ３ｓｔ１をコードする遺伝子としては、以下の（２－Ａ）～（２－Ｄ）のいずれか１の塩基配列であって、かつＨｓ３ｓｔ１の機能を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子が挙げられる。
（２－Ａ）配列番号５に記載の塩基配列又はＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０１０４７４．２の塩基配列
（２－Ｂ）配列番号５に記載の塩基配列又はＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０１０４７４．２の塩基配列において、１から数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列
（２－Ｃ）配列番号５に記載の塩基配列又はＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０１０４７４．２の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（２－Ｄ）配列番号５に記載の塩基配列又はＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０１０４７４．２の塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有する塩基配列、好ましくは８０％以上の相同性を有する塩基配列、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列
　ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列としては、対象となる塩基配列を含むＤＮＡをプローブに用いた、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、サザンブロット・ハイブリダイゼーション法またはＤＮＡマイクロアレイ法などにより得られるハイブリダイズ可能なＤＮＡの塩基配列のことをいう。
　具体的には、ハイブリダイズしたコロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡ、または該配列を有するＰＣＲ産物若しくはオリゴＤＮＡを固定化したフィルター若しくはスライドガラスを用いて、０．７～１．０ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーション法［Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)、DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University, (1995)］を行った後、０．１～２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターまたはスライドガラスを洗浄することにより同定できるＤＮＡの塩基配列を挙げることができる。
　ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡとしては、プローブとして使用する対象となる遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列と一定以上の配列同一性を有するＤＮＡが挙げられる。例えば、対象となる塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。また、例えば、塩基配列における塩基数１００個を一単位とすれば、対象となる遺伝子の塩基配列において、該一単位あたり、１から数個、好ましくは１～４０個、好ましくは１～３５個、好ましくは１～３０個、好ましくは１～２５個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１５個、さらに好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個、なおさらに好ましくは１、２、３、４又は５個の塩基の欠失、置換、付加などを有する塩基配列を含むＤＮＡが挙げられる。
　「塩基の欠失」とは配列中の塩基に欠落又は消失があることを意味し、「塩基の置換」は配列中の塩基が別の塩基に置き換えられていることを意味し、「塩基の付加」とは新たな塩基が挿入するように付け加えられていることを意味する。
　真核生物のタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列には、しばしば遺伝子の多型が認められる。本発明において用いられる遺伝子に、このような多型によって塩基配列に小規模な変異を生じた遺伝子も該遺伝子に含有される。
　本発明における相同性の数値は、特に明示した場合を除き、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であってよいが、塩基配列については、ＢＬＡＳＴ［J. Mol. Biol., 215, 403 (1990)］においてデフォルトのパラメータを用いて算出される数値など、アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴ２［Nucleic Acids Res.,25, 3389 (1997),Genome Res., 7, 649 (1997), https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch&BLAST_SPEC=blast2seq&LINK_LOC=align2seq］においてデフォルトのパラメータを用いて算出される数値などが挙げられる。
　デフォルトのパラメータとしては、Ｇ（Ｃｏｓｔ　ｔｏ　ｏｐｅｎ　ｇａｐ）が塩基配列の場合は５、アミノ酸配列の場合は１１、－Ｅ（Ｃｏｓｔ　ｔｏ　ｅｘｔｅｎｄ　ｇａｐ）が塩基配列の場合は２、アミノ酸配列の場合は１、－ｑ（Ｐｅｎａｌｔｙ　ｆｏｒ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｍｉｓｍａｔｃｈ）が－３、－ｒ（ｒｅｗａｒｄ　ｆｏｒ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｍａｔｃｈ）が１、－ｅ（ｅｘｐｅｃｔ　ｖａｌｕｅ）が１０、－Ｗ（ｗｏｒｄｓｉｚｅ）が塩基配列の場合は１１残基、アミノ酸配列の場合は３残基、－ｙ［Ｄｒｏｐｏｆｆ（Ｘ）ｆｏｒ　ｂｌａｓｔ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎｓ　ｉｎ　ｂｉｔｓ］がｂｌａｓｔｎの場合は２０、ｂｌａｓｔｎ以外のプログラムでは７、－Ｘ（Ｘ　ｄｒｏｐｏｆｆ　ｖａｌｕｅ　ｆｏｒ　ｇａｐｐｅｄ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｉｎ　ｂｉｔｓ）が１５および－Ｚ（ｆｉｎａｌ　Ｘ　ｄｒｏｐｏｆｆ　ｖａｌｕｅ　ｆｏｒ　ｇａｐｐｅｄ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｉｎ　ｂｉｔｓ）がｂｌａｓｔｎの場合は５０、ｂｌａｓｔｎ以外のプログラムでは２５である（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch）。
　ヘパリン様物質を産生する哺乳動物細胞は、ヘパリン生合成に必要となるタンパク質の全長又はその部分長をコードするｃＤＮＡを含む組換えベクターを、宿主細胞となる哺乳動物細胞に導入することにより、得ることができる。
　組換えベクターとしては、使用する宿主細胞における自律複製又は染色体中への組込みが可能で、ポリペプチドをコードするＤＮＡを転写できる位置に、適当なプロモーターを含有しているものであればいずれも用いることができる。
　組換えベクターには、転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。さらに、該組換えベクターには、プロモーターを制御する遺伝子を含んでいてもよい。
　組換えベクターとしては、リボソーム結合配列であるコザック配列を開始コドン周辺に適当に配置したプラスミドを用いることが好ましい。
　ＤＮＡの塩基配列において、宿主内での発現に最適なコドンとなるように塩基を置換することができ、これにより目的とするＮＤＳＴ２およびＨｓ３ｓｔ１の生産率を向上させることができる。
　組換えベクターとしては、動物細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができ、例えば、ｐｃＤＮＡ  Ｉ、ｐｃＤＭ８（フナコシ社）、ｐＡＧＥ１０７［日本国特開平０３－２２９７９号公報； Cytotechnology, 3, 133 (1990)］、ｐＡＳ３－３（日本国特開平０２－２２７０７５号公報）、ｐｃＤＭ８［Nature, 329, 840 (1987)］、ｐｃＤＮＡ Ｉ／Ａｍｐ（インビトロジェン社）、ｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社）、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社）、ｐＡＧＥ１０３［J. Biochemistry, 101, 1307 (1987)］、ｐＡＧＥ２１０、ｐＭＥ１８ＳＦＬ３、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（国際公開第９７／１０３５４号）、Ｎ５ＫＧ１ｖａｌ（米国特許第６００１３５８号明細書）、ＩＮＰＥＰ４（Ｂｉｏｇｅｎ－ＩＤＥＣ社）およびトランスポゾンベクター（国際公開第２０１０／１４３６９８号）などが挙げられる。
　プロモーターとしては、動物細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のｉｍｍｅｄｉａｔｅ　ｅａｒｌｙ（ＩＥ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター、又はモロニーマウス白血病ウイルスのプロモーター若しくはエンハンサーが挙げられる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
　組換えベクターは選択マーカーを含む場合がある。「選択マーカー」は、遺伝子を含有する細胞の選択を可能にする遺伝子である。「正の選択」とは、正の選択が起こって、選択マーカーを含有する細胞を選択するプロセスを指す。薬剤耐性が正の選択マーカーの一例であり、マーカーを含有する細胞は薬剤含有培養培地中で生存し、マーカーのない細胞は死滅する。選択マーカーとしては、Ｇ４１８耐性を与えるｎｅｏ；ハイグロマイシン耐性を与えるｈｙｇｒ；およびピューロマイシン耐性を与えるｐｕｒｏなどの薬剤耐性遺伝子が挙げられる。他の正の選択マーカー遺伝子には、マーカーを含有する細胞の同定またはスクリーニングを可能にする遺伝子が含まれる。これらの遺伝子としては、とりわけ、蛍光タンパク質（ＧＦＰおよびＧＦＰ様発色団、ルシフェラーゼ）遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、アルカリ性ホスファターゼ遺伝子、およびＣＤ８などの表面マーカーが挙げられる。「負の選択」とは、適切な負の選択薬剤に曝露して、負の選択マーカーを含有する細胞を死滅させるプロセスを指す。例えば、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）遺伝子を含有する細胞［Wigler et al, Cell 11:223 (1977)］は薬剤ガンシクロビル（ＧＡＮＣ）に対して感受性である。同様に、ｇｐｔ遺伝子は細胞を６－チオキサンチン感受性にする。
　宿主細胞への組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができる。例えば、エレクトロポレーション法［Cytotechnology、3、133(1990)］、リン酸カルシウム法（日本国特開平０２－２２７０７５号公報）、又はリポフェクション法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)］などが挙げられる。  
工程（２）：工程（１）で調製したヘパリン様物質を産生する哺乳動物細胞に、シンデカンの細胞外ドメインをコードする遺伝子を導入した組換え細胞を調製する工程
　工程（２）は、シンデカンの細胞外ドメインをコードする遺伝子を含有する組換えベクターを、工程（１）で調製したヘパリン様物質を産生する哺乳動物細胞に導入した組換え細胞を調製する工程である。
　シンデカンの構造は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインからなる。このうち、シンデカンの細胞外ドメインはグリコサミノグリカン結合部位を含んでいる。シンデカンの細胞外ドメインとして、少なくともグリコサミノグリカン結合部位を有することが好ましい。シンデカンの細胞外ドメインは、哺乳動物由来であることが好ましく、マウス又はヒト由来であることがより好ましい。
　シンデカンの細胞外ドメインとしては、以下の（３－ａ）～（３－ｃ）のいずれか１のアミノ酸配列を含み、かつシンデカンの細胞外ドメインの機能を有するタンパク質が挙げられる。
（３－ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列又はＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００１００６９４７．１のアミノ酸配列
（３－ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列
（３－ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と６０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列
　配列番号１に記載のアミノ酸配列はＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００１００６９４７．１のアミノ酸配列（全長３１０アミノ酸）のＮ末端から第１～２２９番目のアミノ酸配列である。
　シンデカンの細胞外ドメインをコードする遺伝子としては、以下の（３－Ａ）～（３－Ｄ）のいずれか１の塩基配列であって、かつシンデカンの細胞外ドメインの機能を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子が挙げられる。
（３－Ａ）配列番号６に記載の塩基配列又はＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００１００６９４６．１の塩基配列
（３－Ｂ）配列番号６に記載の塩基配列又はＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００１００６９４６．１の塩基配列において、１から数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列
（３－Ｃ）配列番号６に記載の塩基配列又はＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００１００６９４６．１の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
（３－Ｄ）配列番号６に記載の塩基配列又はＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００１００６９４６．１の塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有する塩基配列、好ましくは８０％以上の相同性を有する塩基配列、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列
　工程（２）においては、シンデカンの細胞外ドメインをコードする遺伝子をシンデカンの細胞外ドメインの全長又はその部分長をコードするｃＤＮＡを含む組換えベクターを工程（１）で調製したヘパリン様物質を産生する哺乳動物細胞に導入することにより、ヘパリン様物質を培養上清中に分泌し得る組換え細胞を得る。
　組換えベクター及び宿主細胞への組換えベクターの導入方法としては、工程（１）と同様とする。
（３）工程（２）で調製した組換え細胞を培地中で培養し、得られる培養上清からヘパリン様物質を回収する工程
　工程（３）は、工程（２）で調製した組換え細胞を培地中で培養することにより、組換え細胞にヘパリン様物質を培地中に分泌生産させて、得られる培養上清からヘパリン様物質を回収する工程である。
　工程（３）においては、組換え細胞は、ヘパリン様物質の産生を促進する条件下で培養することが好ましい。具体的には例えば、組換え細胞のへパリン様物質の産生を可能にし、かつ組換え細胞から培養上清へのヘパリン様物質の分泌を促進する培地中で組換え細胞を培養することが好ましい。
　培地は、少なくとも細胞の生存率を維持し、ヘパリン様物質の発現を可能にするために十分な炭素、窒素、酸素および他の栄養素、成長因子、緩衝剤、補因子および他の任意の物質を含有することが好ましい。ヘパリン様物質をコードする遺伝子が誘導性プロモーターの制御下にあるか、または誘導性プロモーターを含む実施形態では、培地はさらにインデューサーを含んでもよい。
　培地としては、例えば、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を添加したＲＰＭＩまたはＤＭＥＭ、並びに抗菌剤、増殖因子、他のサイトカインなどの因子を添加した組織培養培地中が挙げられる（例えば、Cell Biology (Third Edition) A Laboratory Handbook, vol. 1, 2006, Elsevier Inc.）。具体的には例えば、当業者に公知の培地製剤、例えば、ＲＰＭＩ、ＩＭＤＭ、ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、無血清または低血清のＥＭＥＭが挙げられる。これらの培地は、抗生物質、脂質、トランスフェリン、インスリン、アミノ酸などの追加の栄養補助食品、および必要に応じて補因子を含んでもよい。
　ヘパリン様物質の産生を促進する観点から、培地は、グルコース、硫酸塩及びリン酸から選ばれる少なくとも１を含有することが好ましい。培地におけるグルコースの濃度は、通常５～７５ｍＭであることが好ましく、より好ましくは１０～６０ｍＭ、さらに好ましくは１５～３５ｍＭである。培地における硫酸塩の濃度は、通常０．５～５０ｍＭであることが好ましく、より好ましくは１０～５０ｍＭ、さらに好ましくは３０～５０ｍＭである。培地におけるリン酸塩の濃度は、通常０．５～５０ｍＭであることが好ましく、より好ましくは１～５０ｍＭ、さらに好ましくは１０～５０ｍＭである。
　培養上清中にヘパリン様物質を生成蓄積させ、培養上清から採取することにより、ヘパリン様物質を製造することができる。組換え細胞を培地中で培養する方法は、通常の方法に従って行うことができる。培養は、通常ｐＨ６～８、３０～４０℃、５％ＣＯ２存在下などの条件下で１～７日間行う。
　組換え細胞からのヘパリン様物質の分泌生産は、実施例において後述するように、培養上清にヘパリンリアーゼＩ、ＩＩ、ＩＩＩを含む酵素溶液を添加して酵素処理後、不飽和二糖分析用ＨＰＬＣで定量することにより確認できる。具体的には、コントロール（野生型）の細胞の培養上清と比較して、組換え細胞の培養上清における、グルコサミンのアミノ基と６位に３個の硫酸基が結合した２ＳＮＳ６、グルクロン酸２位とグルコサミンアミノ基に硫酸基が結合した２ＳＮＳ、グルコサミンのアミノ基と６位に２個の硫酸が結合したＮＳ６Ｓ、グルコサミンＮに硫酸基が結合したＮＳから選ばれる少なくとも１の量が増加している場合に、組換え細胞から培養上清中にヘパリン様物質が分泌生産されているとする。組換え細胞からのヘパリン様物質の分泌生産は、実施例において後述するように、培養上清中におけるｓＧＡＧ（硫酸化されたＧＡＧ）量を測定することによっても確認できる。
　工程（３）においては、組換え細胞から培養上清中に、ＧＡＧであるヘパリン様物質に結合したコアタンパク質を含む糖タンパク質であるプロテオグリカンが分泌される。培養上清からのタンパク質の単離は、当該分野で従来公知の方法により行う。例えば、アフィニティータグのようなヘパリン様物質の単離を容易にするタグを用いてもよい。タグとしては、例えば、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ６タグ）、ニッケルマトリックス、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ＦＬＡＧタグ又はエピトープタグが挙げられる。
　コアタンパク質からのヘパリン様物質の単離は、当該技術分野において従来公知の方法により行う。例えば、ヘパリナーゼを用いた酵素消化法、水酸化ナトリウム又はアルカリ水素化ホウ素による処理が挙げられる。
　単離されるヘパリン様物質は、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、特に好ましくは８０％以上が硫酸化された二糖類を含むことが好ましい。
　単離されるヘパリン様物質は、例えば、以下の（１）～（２０）を含む。
（１）１０～５０％の三硫酸化二糖、３０～５０％の二硫酸化二糖及び１０～３０％の一硫酸化二糖。
（２）１０～４０％の三硫酸化二糖、３５～４５％の二硫酸化二糖及び１０～２５％の一硫酸化二糖。
（３）１５～４０％の三硫酸化二糖、３５～４５％の二硫酸化二糖及び１０～２５％の一硫酸化二糖。
（４）５～２５％の三硫酸化二糖、３０～５０％の二硫酸化二糖及び１０～２０％の一硫酸化二糖。
（５）１～３０％の三硫酸化二糖、２５～５５％の二硫酸化二糖、および５～４０％の一硫酸化二糖。  
（６）１５～４０％の三硫酸化二糖類。
（７）３５～４５％の二硫酸化二糖類。
（８）１０～２５％の一硫酸化二糖類。
（９）１０～５０％の三硫酸化二糖類。
（１０）３０～５０％の二硫酸化二糖類。
（１１）１０～３０％の一硫酸化二糖類。
（１２）１５～３０％の三硫酸化二糖類。
（１３）４０～４５％の二硫酸化二糖類。
（１４）１０～１５％の一硫酸化二糖類。
（１５）５～２５％の三硫酸化二糖類。
（１６）１～３０％の三硫酸化二糖類。
（１７）３０～５０％二硫酸化二糖類。
（１８）２５～５５％の二硫酸化二糖類。
（１９）１０～２０％の一硫酸化二糖類。
（２０）５～４０％の一硫酸化二糖類。
　ヘパリン様物質は、様々な長さの二糖単位の繰り返し構造を含み得る。ヘパリン様物質は、ＵＡ－ＧｌｃＮＡｃ（６Ｓ）、ＵＡ（２Ｓ）－ＧｌｃＮＡｃ、ＵＡ－（２Ｓ）－ＧｌｃＮＡｃ（６Ｓ）、ＵＡ－ＧｌｃＮＳ、ＵＡ－ＧｌｃＮＳ（６Ｓ）、ＵＡ（２Ｓ）－ＧｌｃＮＳ、ＵＡ（２Ｓ）－ＧｌｃＮＳ（６Ｓ）のいずれかを含むことが好ましく、これらはヘパリン様物質中に任意の順序で存在してもよい。
　上記において、ＵＡはウロン酸残基（すなわち、グルクロン酸またはイズロン酸）、Ａｃはアセチル、ＧｌｃＮＡｃはＮ－アセチルグルコサミン、ＧｌｃＮＳはグルコサミン－Ｎ－硫酸、２Ｓは２－Ｏ－硫酸塩、６Ｓは６－Ｏ－硫酸塩である。
＜組換え細胞＞
　本発明の一態様として、ヘパリン様物質を産生する哺乳動物細胞に、ＳＤＣの細胞外ドメインをコードする遺伝子が導入された組換え細胞が挙げられる。該組換え細胞は、＜ヘパリン様物質の製造方法＞の項の工程（１）及び工程（２）において上述したのと同様に、ヘパリン様物質を産生する哺乳動物細胞を調製し、該哺乳動物細胞にシンデカンの細胞外ドメインをコードする遺伝子を導入することにより作製できる。
＜ヘパリン様物質を分泌産生する細胞の製造方法＞
　本発明の一態様として、ヘパリン様物質を産生する哺乳動物細胞に、ＳＤＣの細胞外ドメインをコードする遺伝子を含む組換え発現ベクターを導入する工程を含むヘパリン様物質を分泌産生する細胞の製造方法が挙げられる。該製造方法は、＜ヘパリン様物質の製造方法＞の項の工程（１）及び工程（２）において上述したのと同様に、ヘパリン様物質を産生する哺乳動物細胞を調製し、該哺乳動物細胞にシンデカンの細胞外ドメインをコードする遺伝子を導入することにより実施することができる。
＜医薬組成物＞
　本発明の一態様として、本明細書に記載の方法により製造されたヘパリン様物質又はその断片を含む医薬組成物が挙げられる。本態様において、ヘパリン様物質又はその断片は、コアタンパク質に結合していてもよい。医薬組成物は他の治療薬を含有してもよい。また、医薬組成物は、例えば、慣用のビヒクルまたは希釈剤、ならびに所望の投与方法に適したタイプの医薬添加剤（例えば賦形剤、結合剤、保存剤）を使用することにより処方され得る。
　医薬組成物の形態としては、例えば、滅菌注射用水性剤が挙げられる。滅菌注射用水性剤は、適切な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を使用して、既知の技術に従って処方することができる。滅菌注射用水性剤は、例えば１，３－ブタンジオール中の溶液のような、無毒の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の滅菌注射用溶液または懸濁液であってもよい。使用可能な許容されるビヒクルおよび溶媒は、水、リンゲル液および等張食塩水である。
　医薬組成物の剤型は特に限定されず、多種多様な剤型とすることができる。医薬組成物を投与するための剤型としては、例えば、組成物は、錠剤、カプセル剤、サシェ剤、トローチ剤、丸剤、散剤、顆粒剤、エリキシル剤、チンキ剤、液剤、懸濁剤、エリキシル剤、シロップ剤、軟膏剤、クリーム剤などの形態での投与、静脈内投与若しくは注射、ペースト、エマルジョンまたは溶液が挙げられる。また、例えば、パッチメカニズムまたは軟膏による経皮投与が挙げられる。これらのいずれも、徐放および／または持続放出製剤に改変してもよい。
　薬学的に許容される担体には、ビヒクル、アジュバント、界面活性剤、懸濁剤、乳化剤、不活性充填剤、希釈剤、賦形剤、湿潤剤、結合剤、滑沢剤、緩衝剤、崩壊剤および担体が含まれるがこれらに限定されない。典型的には、薬学的に許容される担体は活性化合物に対して化学的に不活性であり、そして使用条件下で有害な副作用または毒性を有さない。薬学的に許容される担体の性質は、使用される特定の剤形および組成物の他の特徴に応じて異なり得る。
＜治療方法及び予防方法＞
　本発明の一態様として、本明細書に記載の方法により製造されたヘパリン様物質又はその断片を投与することを含む、それを必要とする被験体における血液凝固または血液凝固に関連するまたはそれによって引き起こされる状態を治療または予防する方法が挙げられる。本態様において、ヘパリン様物質又はその断片は、コアタンパク質に結合していてもよい。血液凝固または血液凝固に関連するまたはそれによって引き起こされる状態としては、例えば、急性冠症候群、心房細動、深部静脈血栓症または肺塞栓症が挙げられる。
　前記被験体は哺乳動物をいう。哺乳動物としては、例えば、ヒト、霊長類、家畜動物（例えば、ヒツジ、ウシ、ウマ、ロバ、ブタ）、コンパニオンアニマル（例えば、イヌ、ネコ）、実験室試験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット、ハムスター）、捕獲野生動物（例えば、キツネ、シカ）が挙げられる。哺乳動物は、典型的にはヒトまたは霊長類であり、より典型的にはヒトである。
　投与量及び投与時期は、血液凝固または血液凝固に関連する状態の治療、予防または管理において治療上の利益を提供する投与量及び時期であることが好ましい。有効である具体的な投与量及び投与時期は、被験体の状態、病歴、体格、体重、年齢などの要因に応じて変動し得る。
　以下に実施例を示すが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
１．ＣＨＯ／ＮＨ－ＳＲＧＮ細胞およびＣＨＯ／ＮＨ－ＳＤＣ細胞におけるヘパリン生産能の評価
＜ＣＨＯ／ＮＨ－ＳＲＧＮ細胞及びＣＨＯ／ＮＨ－ＳＤＣ細胞の作製＞
　Bail JY et al., Metab Eng14:81-90, 2012に基づき、ＮＤＳＴ２をコードするＤＮＡ（配列番号４で表される塩基配列）およびＨｓ３ｓｔ１コードするＤＮＡ（配列番号５で表される塩基配列）を共導入してＣＨＯ／ＮＨ細胞のクローン＃３（ＣＨＯ－ＮＨ＃３細胞）を得た。
　ＣＨＯ／ＮＨ－ＳＲＧＮ細胞の作製に用いた、ベクターＰＢ５１３Ｂ－１＿ＳＲＧＮ－ＩＲＥＳ－ＥＧＦＰはＰｉｇｇｙＢａｃ　Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ　Ｖｅｃｔｏｒ　ＰＢ５１３Ｂ－１をベースとして、チャイニーズ・ハムスターのＥＦ１αプロモーター、ＩＲＥＳエレメント、Ｃ末端におけるｍｙｃＨｉｓタグ配列を有するベクターである。ベクターＰＢ５１３Ｂ－１＿ＳＲＧＮ－ＩＲＥＳ－ＥＧＦＰにおいては、ＥＦ１αプロモーターの制御下に、ｈＳＲＧＮをコードするＤＮＡ（配列番号７で表される塩基配列）を、スクリーニングマーカーであるＥＧＦＰ遺伝子及びピューロマイシン耐性遺伝子と共発現するように導入した。
　ＣＨＯ／ＮＨ＃３細胞にヒトセリグリシン（ＳＲＧＮ）をコードするＤＮＡ（配列番号７で表される塩基配列）をベクターＰＢ５１３Ｂ－１＿ＳＲＧＮ－ＩＲＥＳ－ＥＧＦＰを用いて導入したＣＨＯ／ＮＨ－ＳＲＧＮ細胞、及びヒトシンデカン（ＳＤＣ）の細胞外ドメインのＤＮＡ（配列番号６で表される塩基配列）をベクターＰＢ５１３Ｂ－１＿ＳＤＣ－ＩＲＥＳ－ＥＧＦＰを用いて導入したＣＨＯ／ＮＨ－ＳＤＣ細胞を作製した。
　ＣＨＯ／ＮＨ－ＳＤＣ細胞の作製に用いた、ベクターＰＢ５１３Ｂ－１＿ＳＤＣ－ＩＲＥＳ－ＥＧＦＰは、ＰｉｇｇｙＢａｃ　Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ　Ｖｅｃｔｏｒ　ＰＢ５１３Ｂ－１をベースとして、チャイニーズ・ハムスターのＥＦ１αプロモーター、ＩＲＥＳエレメント、Ｃ末端におけるｍｙｃＨｉｓタグ配列を有するベクターである。ベクターＰＢ５１３Ｂ－１＿ＳＤＣ－ＩＲＥＳ－ＥＧＦＰにおいては、ＥＦ１αプロモーターの制御下に、ＳＲＧＮをコードするＤＮＡ（配列番号７で表される塩基配列）を、スクリーニングマーカーであるＥＧＦＰ遺伝子及びピューロマイシン耐性遺伝子と共発現するように導入した。
　上記のようにして作製した各細胞の培養上清を解析しヘパリン生産能の評価を行った。
＜ＣＨＯ／ＮＨ－ＳＲＧＮ細胞及びＣＨＯ／ＮＨ－ＳＤＣ細胞の培養上清におけるｓＧＡＧ量の測定＞
　各細胞を増殖性のよい状態で培養した後、６ウェルプレートに０．６×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、培地交換を行わず３日後に回収した培養上清を試料として、ｓＧＡＧ量をｓＧＡＧアッセイにより測定した。ｓＧＡＧアッセイとは、硫酸化糖鎖に特異的に結合する色素（１，９－ジメチルメチレンブルー）を用いて溶液中の全ｓＧＡＧ量を比色定量するアッセイをいう。結果を図１に示す。
＜ＨＰＬＣによる糖鎖構造の解析結果＞
　ｓＧＡＧアッセイによって培養上清中へのヘパリン産生が示唆されたことから、同サンプルについて、ＨＰＬＣによる糖鎖構造の解析をした。解析に使用したサンプルのｓＧＡＧ定量結果を図２に示す。なお、ＣＨＯ／ＮＨ－ＳＤＣ細胞のサンプルについては濃度が低く解析に十分な糖鎖があるか確認できなかったことから、スピンカラムによる濃縮操作を行った。
　ヘパリンの産生の確認については、まず試料溶液を直接２０μＬとり、緩衝液１０μＬ、各１０ｍＵのヘパリンリアーゼＩ、ＩＩ、ＩＩＩを含む酵素溶液１０μＬを添加して３時間３７℃で酵素処理し、反応終了後１００℃、５分間で酵素を失活、凍結乾燥後２０μＬの水を加えて不飽和二糖分析用ＨＰＬＣで定量した。結果を図３（Ａ）及び（Ｂ）に示す。
　図３（Ａ）及び（Ｂ）において、ＷＴは野生型ＣＨＯ細胞、＃３はＣＨＯ－ＮＨ＃３細胞、ＳＲＧＮはＣＨＯ細胞にＳＲＧＮをコードするＤＮＡ（配列番号７で表される塩基配列）をベクターＰＢ５１３Ｂ－１＿ＳＲＧＮ－ＩＲＥＳ－ＥＧＦＰを用いて導入したＣＨＯ－ＳＲＧＮ細胞、＃３ＳＲＧＮはＣＨＯ／ＮＨ－ＳＲＧＮ細胞、ＳＤＣはＣＨＯ細胞にＳＤＣの細胞外ドメインのＤＮＡ（配列番号６で表される塩基配列）をベクターＰＢ５１３Ｂ－１＿ＳＤＣ－ＩＲＥＳ－ＥＧＦＰを用いて導入したＣＨＯ－ＳＤＣ細胞を示す。
　図３（Ａ）及び（Ｂ）に示すように、ＳＲＧＮ導入細胞（ＳＲＧＮ、＃３ＳＲＧＮ）の培養上清において、ＷＴ又は＃３と比較して、ヘパリン様物質の検出の増加は検出されなかった。一方で、ＳＤＣ導入細胞（ＳＤＣ、＃３ＳＤＣ）の培養上清においては、ヘパリン様物質の産生がＷＴ又は＃３と比較して、増加していた。以上の結果より、ＣＨＯ／ＮＨ－ＳＤＣ細胞がよりヘパリン様物質の産生に適した細胞であると考え、クローニング及び各クローンにおける解析を実施した。
２．無血清馴化後におけるＧＡＧ量の測定結果
　ヘパリンに特徴的な糖鎖構造が見られたことからＣＨＯ／ＮＨ－ＳＤＣ細胞のクローニングと各クローンにおける解析を実施した。
＜クローニングおよび無血清馴化＞
　血清入り培地を用いてＣＨＯ／ＮＨ－ＳＤＣ細胞を培養して接着状態にし、限界希釈法によってコラーゲンコート９６ウェルプレートでクローニングを行った。この際、１細胞からの培養のため、細胞への毒性を考慮して、薬剤添加は行わずに培養した。コラーゲンコート２４、６ウェルプレートとスケールアップし、複数のクローンを培養させ、３６個のクローンを樹立した。その後、各細胞をノーマル６ウェルプレートに０．６×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、培地交換を行わず３日後に回収した培養上清を試料として、培養上清中のｓＧＡＧ量を測定し、上位６クローン（＃５、＃２０、＃２６、＃２９、＃３０、＃３４）について無血清馴化を行った。
＜無血清馴化後におけるｓＧＡＧ量、ｓＧＡＧ産生速度、ＳＤＣ量の測定＞
　無血清馴化後、各細胞をノーマル６ウェルプレートに０．６×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、培地交換を行わず３日後に回収した培養上清を試料として、培養上清中のｓＧＡＧ量を測定した。結果を図４に示す。また、ｓＧＡＧの産生速度を計算した結果を図５に、ＥＬＩＳＡにより培養上清中のＳＤＣ量を定量した結果を図６にそれぞれ示す。
　図６に示すように、評価した６クローンは、ＣＨＯ／ＮＨ－ＳＤＣ細胞と比較して、同等以上のＳＤＣの分泌産生能を有しており、＃５がＣＨＯ／ＮＨ－ＳＤＣ細胞の１．５倍以上であり最も高い発現量を示した。
＜ｑＲＴ－ＰＣＲによる導入遺伝子発現量の解析＞
　各細胞を６ウェルプレートに０．６×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、培地交換を行わず３日間培養した細胞からＲＮＡの抽出及びｃＤＮＡの作製を行い、ｑＲＴ－ＰＣＲにより導入遺伝子（ＮＤＳＴ２、Ｈｓ３ｓｔ１及びＳＤＣ）の発現量を定量した。図７（Ａ）はＮＤＳＴ２遺伝子、図７（Ｂ）はＨｓ３ｓｔ１遺伝子、図７（Ｃ）はＳＤＣ遺伝子の発現量をそれぞれ示す。
　図７（Ａ）～（Ｃ）に示すように、＃５において各遺伝子の高い発現レベルが確認できた一方で、＃２６では発現が認められなかった。＃２６は抗凝固活性においても他のクローンと比較して低い活性を示しており、ＮＤＳＴ２およびＨｓ３ｓｔ１によってＡＴＩＩＩ認識特異配列が形成されていることが示唆された。
３．ＨＰＬＣによる糖鎖構造の解析
　各種ＣＨＯ細胞により産生されたヘパリン様物質の糖鎖構造をＨＰＬＣにより解析した。
＜分析条件＞
　試料の前処理として、各種ＣＨＯ細胞の培養上清４００μＬを１０，０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離した上層に４００μＬの二段蒸留水（Ｄｏｕｂｌｅ　Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ　Ｗａｔｅｒ、ＤＤＷ）を加え、凍結乾燥させた。その後、４０μＬのサンプルから２０μＬを分取し、Ｈｅｐａｒｉｎ　ｌｙａｓｅ　Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩ処理をした後、８０μＬのＤＤＷを加え、２０μＬをＨＰＬＣに供した。
　特異的分解酵素による処理は、次の通りとした。酢酸緩衝液［０．１ＭＣＨ３ＣＯＯＮａ、１０ｍＭ（ＣＨ３ＣＯＯ）２Ｃａ（ｐＨ７．０）］２０μＬ、０．５ｍＵ／μＬ　Ｈｅｐａｒｉｎａｓｅ　５μＬ、０．５ｍＵ／μＬ　ＨｅｐａｒｉｔｉｎａｓｅＩ　５μＬ、０．５ｍＵ／μＬ　ＨｅｐａｒｉｔｉｎａｓｅＩＩ　５μＬを同時に加え、３７℃にて１６時間インキュベーションすることでヘパリン様糖鎖を不飽和二糖に分解した。沸騰水浴中３分間加熱して酵素を失活させ、凍結乾燥した後水に溶解しＨＰＬＣによる不飽和二糖分析に供した。
＜ＨＳ及びＣＳの二糖組成分析＞
　下記に示す装置及び解析ソフトを用いてＨＳ及びＣＳの二糖組成分析を行った。
溶離液のポンプ：島津製作所製ＬＩＱＵＩＤ　ＣＨＲＯＭＡＴＯＧＲＡＰＨＹ　ＬＣ－１０Ａｉ
検出器：ＪＡＳＣＯ製Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ｄｅｔｅｃｔｏｒ　ＦＰ－９２０Ｓ
ポスト反応用ポンプ：日本精密科学株式会社製ＭＩＮＩＣＨＥＭＩ　ＰＵＭＰ　ＮＰ－ＦＸ（ＩＩ）－１Ｕ
インテグレーター：日立製作所製Ｃｈｒｏｍａｔｏ　Ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ　Ｄ－２５００
インジェクター：Ｒｅｏｄｙｎｅ社製ｓａｍｐｌｅ　ｉｎｊｅｃｔｏｒ（ｍｏｄｅｌ　７７２５）
カラム：センシュー科学製Ｓｅｎｓｈｕ　Ｐａｋ　ＤＯＣＯＳＩＬ（４．６ｍｍ　ｉ．ｄ．ｘ１５０ｍｍ）　
カラムオーブン：日立製作所製　Ｌ－７３００
ドライ反応槽：島村計器製作所製Ｄｒｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｂａｔｈ　ＤＢ－５
解析ソフト：株式会社ランタイムインスツルメンツ製Ｃｈｒｏｍａｔｏ－ＰＲＯ
　解析に用いた試料中のｓＧＡＧをＨＰＬＣにより定量した結果を図８に、標準ヘパリン由来不飽和二糖（ＨＳ－Ｓｔａｎｄａｒｄｓ）及び試料から得られたクロマトグラムを図９に示す。また、ヘパリン様糖鎖の含有量、硫酸化に占める各糖鎖の割合をＨＰＬＣにより定量した結果をそれぞれ図１０（Ａ）及び（Ｂ）に示す。表１に検出されたヘパリン様物質中硫酸化糖鎖（ＨＳ）の濃度及び硫酸化糖鎖の比率を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に示すように、作製したクローン（＃５、＃２０、＃２６、＃２９、＃３０、＃３４）から得られたサンプルから検出された糖鎖の硫酸化度はヘパリンと同程度であり、ヘパリン様糖鎖の産生がコントロール（ＣＨＯ－Ｓ、ＳＤＣ）と比較して、顕著に増加していた。
＜抗ファクターＸａ活性の測定＞
　積水メディカル株式会社製テストチームヘパリンＳ測定キット（http://www.info.pmda.go.jp/tgo/pack/13A2X00197218081_A_01_10/）を用いて測定した。標準品ヘパリンは医療用ヘパリン（１０１ＩＵ／ｍｇ）を用いて調製した。測定原理の概要は以下の通りとした。
構成試薬名、成分：
１．基質剤：Ｎ－ベンゾイル－Ｌ－イソロイシル－Ｌ－グルタミル（γ－ＯＲ）－グリシル－Ｌ－アルギニル－ｐ－ニトロアニリド・塩酸塩（Ｓ－２２２２）
２．アンチトロンビンＩＩＩ剤：アンチトロンビンＩＩＩ（ヒト由来）
３．ファクターＸａ剤：ファクターＸａ（ウシ由来）
４．緩衝液：２－アミノ－２－ヒドロキシメチル－１，３－プロパンジオール緩衝液
５．正常血漿剤：ヒト正常血漿
　抗凝固能の検証
　上記ＨＰＬＣ結果において硫酸化度が高いクローン（＃２０、＃２６、＃２９、＃３０、＃３４）について図１１に示す検量線を用いて抗凝固活性（抗ＦＸａ活性９を調べた。結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２に示すように、＃２０、＃２９、＃３０、＃３４から得られた試料において、培地１ｍＬあたりおよそ０．１ＩＵの抗ＦＸａ活性が確認できた。この結果から、ＮＤＳＴ２およびＨｓ３ｓｔ１の導入によってアンチトロンビン結合性配列が培養上清中のヘパリン様糖鎖に含まれていることが示唆された。
　本発明を特定の態様を用いて詳細に説明したが、本発明の意図と範囲を離れることなく様々な変更および変形が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお、本出願は、２０１９年１０月２日付けで出願された日本特許出願（特願２０１９－１８２４６７）に基づいており、その全体が引用により援用される。

Claims (14)

  1. 　以下の工程（１）～（３）を含むヘパリン様物質の製造方法。
    （１）ヘパリン様物質を産生する哺乳動物細胞を調製する工程
    （２）工程（１）で調製したヘパリン様物質を産生する哺乳動物細胞に、シンデカン（以下、ＳＤＣと略す。）の細胞外ドメインをコードする遺伝子を導入した組換え細胞を調製する工程
    （３）工程（２）で調製した組換え細胞を培地中で培養し、得られる培養上清からヘパリン様物質を回収する工程
  2. 　前記へパリン様物質を産生する哺乳動物細胞は、両機能性ヘパラン硫酸エステルＮ－脱アセチラーゼ／Ｎ－硫酸転移酵素（以下、ＮＤＳＴ２と略す。）をコードする遺伝子及びへパラン硫酸エステルグルコサミン３　硫酸転移酵素１（以下、Ｈｓ３ｓｔ１と略す。）をコードする遺伝子の少なくとも一方が導入された細胞である、請求項１に記載の製造方法。
  3. 　前記哺乳動物細胞はチャイニーズ・ハムスター由来卵巣（以下、ＣＨＯと略す。）細胞である、請求項１又は２に記載の製造方法。
  4. 　ＮＤＳＴ２が以下の（１ａ）～（１ｃ）のいずれか１のアミノ酸配列を含み、かつＮＤＳＴ２の機能を有するタンパク質である、請求項２又は３に記載の製造方法。
    （１ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列
    （１ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列
    （１ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列
  5. 　Ｈｓ３ｓｔ１が以下の（２ａ）～（２ｃ）のいずれか１のアミノ酸配列を含み、かつＨｓ３ｓｔ１の機能を有するタンパク質である、請求項２～４のいずれか１項に記載の製造方法。
    （２ａ）配列番号３に記載のアミノ酸配列
    （２ｂ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列
    （２ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列
  6. 　ＳＤＣの細胞外ドメインが以下の（３ａ）～（３ｃ）のいずれか１のアミノ酸配列を含み、かつＳＤＣの細胞外ドメインの機能を有するタンパク質である、請求項１～５のいずれか１項に記載の製造方法。
    （３ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列
    （３ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列
    （３ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列
  7. 　ＮＤＳＴ２及びＨｓ３ｓｔ１がマウス又はヒト由来である、請求項２～６のいずれか１項に記載の製造方法。
  8. 　ＮＤＳＴ２をコードする遺伝子が、以下の（１Ａ）～（１Ｄ）のいずれか１の塩基配列であって、かつＮＤＳＴ２の機能を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、請求項２～７のいずれか１項に記載の製造方法。
    （１Ａ）配列番号４に記載の塩基配列
    （１Ｂ）配列番号４に記載の塩基配列において、１から数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列
    （１Ｃ）配列番号４に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
    （１Ｄ）配列番号４に記載の塩基配列と８０％以上の相同性を有する塩基配列
  9. 　Ｈｓ３ｓｔ１をコードする遺伝子が、以下の（２Ａ）～（２Ｄ）のいずれか１の塩基配列であって、かつＨｓ３ｓｔ１の機能を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、請求項２～８のいずれか１項に記載の製造方法。
    （２Ａ）配列番号５に記載の塩基配列
    （２Ｂ）配列番号５に記載の塩基配列において、１から数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列
    （２Ｃ）配列番号５に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
    （２Ｄ）配列番号５に記載の塩基配列と８０％以上の相同性を有する塩基配列
  10. 　ＳＤＣの細胞外ドメインをコードする遺伝子が、以下の（３Ａ）～（３Ｄ）のいずれか１の塩基配列であって、かつＳＤＣの細胞外ドメインの機能を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の製造方法。
    （３Ａ）配列番号６に記載の塩基配列
    （３Ｂ）配列番号６に記載の塩基配列において、１から数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列
    （３Ｃ）配列番号６に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
    （３Ｄ）配列番号６に記載の塩基配列と８０％以上の相同性を有する塩基配列
  11. 　ヘパリン様物質を産生する哺乳動物細胞に、ＳＤＣの細胞外ドメインをコードする遺伝子が導入された組換え細胞。
  12. 　前記へパリン様物質を産生する哺乳動物細胞は、ＮＤＳＴ２をコードする遺伝子及びＨｓ３ｓｔ１をコードする遺伝子の少なくとも一方が導入された細胞である、請求項１１に記載の組換え細胞。
  13. 　前記哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞である、請求項１１又は１２に記載の組換え細胞。
  14. 　ヘパリン様物質を産生する哺乳動物細胞に、ＳＤＣの細胞外ドメインをコードする遺伝子を含む組換え発現ベクターを導入する工程を含む、ヘパリン様物質を分泌産生する細胞の製造方法。
     
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