WO2021071164A1 - 생물학적 시료의 간 조직 유래 여부를 판별하는 방법 - Google Patents

생물학적 시료의 간 조직 유래 여부를 판별하는 방법 Download PDF

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김영준
김다원
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    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/154—Methylation markers

Definitions

  • the present invention relates to a method for determining whether a biological sample of unknown origin is derived from liver tissue, and a composition comprising a liver tissue-specific DNA methylation marker for performing the same.
  • the cells in the human body have the same genetic information, but the functions and shapes of each cell are very diverse. This is because a specific gene is expressed for each cell, and accordingly, the cell differentiation process is different, resulting in a difference in cell phenotype.
  • Several factors, such as DNA methylation, histone modification, and tissue-specific transcription factors, are involved in the expression of these specific genes.
  • DNA methylation, specifically methylation of the CpG site is an essential element of cell-specific gene expression and is known to have unique DNA methylation characteristics for each cell or tissue. Therefore, the DNA methylation characteristic can be used to easily identify the origin of the cell or tissue.
  • circulating cell free DNA may be present in blood circulating in a living body
  • circulating tumor DNA ctDNA
  • cfDNA circulating cell free DNA
  • ctDNA circulating tumor DNA
  • a process of additionally confirming the tissue from which the ctDNA originated is required, and in this process, the diagnosis of cancer is delayed.
  • early diagnosis of cancer becomes possible if the originating tissue can be identified while detecting the corresponding ctDNA, and a method of revealing the origin of a biological sample is increasingly required for early diagnosis of not only cancer but also other diseases.
  • the present inventors completed the present invention by identifying a marker having a high methylation level specifically for liver tissue.
  • an aspect of the present invention provides a method of determining whether a biological sample is of liver tissue origin, comprising the following steps:
  • the subject may be a human, and the biological sample includes tissues, tissue fragments, cells, cell fragments, blood, plasma, body fluids, feces, urine, etc. isolated from the subject. It is not limited. The tissues, tissue fragments, cells and cell fragments, etc. may be separated from blood, plasma, body fluid, urine, and the like collected from the subject.
  • the DNA may be DNA isolated from tissues, cells, etc., cell free DNA (cfDNA) floating in blood, plasma, body fluid, etc., or circulating tumor DNA (ctDNA) flowing from tumor cells.
  • cfDNA cell free DNA
  • ctDNA circulating tumor DNA
  • methylation refers to the attachment of a methyl group (-CH 3 ) to a base constituting DNA, and preferably refers to methylation occurring in the cytosine of a specific CpG site of a specific DNA.
  • methylation level means a quantitative evaluation of the methylation status of a CpG site present in a specific DNA sequence, and the methylation status is the presence or absence of 5-methyl-cytosine at one or more CpG sites in the DNA sequence. Means.
  • CpG site refers to a sequence in which cytosine (C) and guanine (G) are linked by a phosphate group, and a promoter region, a protein coding region (open reading frame, ORF), and It may exist in a DNA sequence including a terminator region or the like. Methylation of the CpG site is known to be involved in maintaining genome stability and regulating gene expression.
  • the methylation level is high in normal liver tissue and liver cancer tissue samples, and the methylation level is low in other tissues including blood cg12137206 (SEQ ID NO: 1), cg03792768 (SEQ ID NO: 2) Markers were discovered.
  • the target methylation site of the two markers is a CpG site located at the 61st nucleotide in the sequence represented by SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, respectively.
  • the methylation level of all CpG sites present in the sequences represented by SEQ ID NOs: 1 and 2, including the target CpG site can be measured.
  • (b) is PCR, methylation specific PCR, real time methylation specific PCR, MethyLight PCR, MehtyLight digital PCR, EpiTYPER, methylation specific DNA PCR using binding protein, quantitative PCR, DNA chip, molecular beacon, MS-HRM (Methylation-sensitive high resolution melting), asymmetric PCR, asymmetric PCR MS-HRMA (asymmetric PCR methylation-sensitive high) resolution melting analysis), Recombinase Polymerase Amplification, LAMP method (Loop-Mediated Isothermal Amplification), Eclipse probe, next-generation sequencing panel (NGS panel), pyrosequencing and bisulfite sequencing. It can be carried out in a method selected from the group consisting of.
  • the methylation level may be identified by a microarray, and the microarray may use a probe immobilized on a solid surface.
  • the probe may include a sequence complementary to a sequence of 10 to 100 consecutive nucleotides including the CpG site.
  • the method may further include (c) after step (b), comparing the methylation level with the methylation level of a normal control group. For example, by comparing the methylation level of a biological sample with the methylation level of a normal control, if the methylation level is high, it can be determined that the biological sample is derived from liver tissue, and if the methylation level is low or similar, the biological sample is It can be determined that it originated from other organizations except for it.
  • Another aspect of the present invention provides a method for detecting DNA derived from liver tissue in a biological sample comprising the following steps:
  • the liver tissue-derived DNA detection method may be used in combination with an existing liver cancer diagnosis method.
  • compositions for determining the origin of liver tissue of a biological sample comprising an agent capable of measuring the methylation level of the sequence represented by SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2.
  • the CpG site may be one or more including a CpG site located at nucleotide 61 in the sequence represented by SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2.
  • the agent capable of measuring the methylation level may be a primer, a probe or an antisense nucleic acid that binds to the CpG site of the sequence represented by SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, and the primer, probe Alternatively, the antisense nucleic acid may be used as a hybridizable array element and immobilized on a substrate.
  • sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 may be genomic DNA, or a sequence in which unmethylated cytosine is converted to uracil by treatment with sulfonic acid.
  • the gas is a suitable rigid or semi-rigid support, and may include, for example, membranes, filters, chips, slides, wafers, fibers, magnetic or non-magnetic beads, gels, tubing, plates, polymers, microparticles and capillaries. have.
  • the hybridization array element may be immobilized on a gas phase through a chemical bonding method, a covalent bonding method such as UV, or a linker (eg, ethylene glycol oligomer and diamine).
  • DNA isolated from a biological sample may be applied to a hybridization array to hybridize with an array element, and hybridization conditions may be variously changed, and detection and analysis of the degree of hybridization It can be implemented in various ways according to techniques known in the art.
  • the sample DNA and/or primer, probe, or antisense nucleic acid may be labeled to provide a signal for confirming hybridization, and may be linked to an oligonucleotide.
  • the label is a fluorophore (e.g., fluorescein, phycoerythrin, rhodamine, lissamine, Cy3 and Cy5 (Pharmacia), chromophore, chemiluminescent group, magnetic particle, radioisotope ( P32 and S35), enzymes (alkaline phosphatase or horseradish peroxidase), cofactors, substrates for enzymes, heavy metals (e.g. gold), antibodies, streptavidin, biotin, digoxigenin And a hapten having a specific binding partner such as a chelating group, but is not limited thereto.
  • fluorophore e.g., fluorescein, phycoerythrin, rhodamine, lissamine, Cy3 and Cy5 (Pharmacia)
  • chromophore e.g., chromophore, chemiluminescent group, magnetic particle, radioisotope
  • the hybridization of the primer, probe or antisense nucleic acid and the sample DNA is various factors such as reaction temperature, hybridization and washing time, buffer components and their pH and ionic strength, length of nucleotide, nucleotide sequence, amount of GC sequence, etc.
  • reaction temperature hybridization and washing time
  • buffer components buffer components and their pH and ionic strength
  • length of nucleotide nucleotide sequence
  • amount of GC sequence etc.
  • Depends on Detailed conditions for the hybridization are Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001); And M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. See N.Y. (1999).
  • a hybridization signal generated through the hybridization reaction may be detected.
  • the probe is labeled with an enzyme, it is possible to confirm whether or not hybridization has occurred by reacting a substrate of the enzyme with a result of a hybridization reaction.
  • the enzymes and substrates are peroxidase (e.g. horseradish peroxidase), chloronaphthol, aminoethylcarbazole, diaminobenzidine, D-luciferin, lucigenin (bis-N-methylacridinium nitrate), resorupine Benzyl ether, luminol, Amplex Red reagent (10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine), HYR (p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB (tetramethylbenzidine), ABTS (2,2'-Azine- di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-phenylenediamine (OPD) and naphthol/pyronine; Alkaline phosphatase and bromochloroindolyl phosphate (BCIP), nitro blue tetrazolium (NBT), naphthol-AS-B
  • liver-specific methylation marker can be used as a major marker that can confirm the origin of the tissue, and will be used as an index that can improve the accuracy of monitoring and early detection of liver-related diseases in the future.
  • the method for determining whether a biological sample of the present invention is derived from liver tissue and a composition for performing the same use a liver tissue-specific DNA methylation marker, and the liver tissue-specific marker has a low methylation level in tissues other than the liver tissue. , Since the methylation level is high in normal liver tissue and liver cancer tissue, whether or not a biological sample is derived from liver tissue can be determined with excellent accuracy.
  • FIG. 1 schematically shows the process of discovering a liver tissue-specific marker according to the present invention.
  • A is a result of confirming the methylation levels of the finally selected cg12137206 and cg03792768 markers in normal liver tissue (Liver N) and liver cancer tissue (Liver T)
  • B is a normal liver tissue (LIHC_N) and liver cancer tissue (LIHC_T) of a liver cancer sample.
  • FIG. 5 shows the results of confirming the methylation level of the cg12137206 marker in various normal tissues (A) and cancer tissues (B).
  • FIG. 6 shows the results of confirming the methylation level of the cg03792768 marker in various normal tissues (A) and cancer tissues (B).
  • Figure 7 shows the results of confirming the methylation levels of cg12137206 and cg03792768 markers in major normal and cancer tissues: bladder (BL), breast (breast, BR), cervix (CE), colon, CO ), esophagus (ES), glioblastoma (GB), head and neck (HN), kidney (KI), liver (LI), lung (Lung, LU), and pancreas (pancreas, PA), paraganglioma (PC), prostate (PR), rectum (rectum, RE), sarcoma (SA), skin (skin, SK), stomach (stomach, ST), thymus (thymus, TH), uterine (UC) and blood (B).
  • Example 1 Identification of liver tissue-specific methylation markers
  • TCGA Cancer Genome Atlas
  • an unmethylated CpG site in 90% of the pan-tumor excluding liver cancer, and an unmethylated CpG site in 90% of the pan-normal tissue excluding liver were additionally added. Were selected.
  • FIG. 1 schematically shows a process of discovering a liver tissue-specific marker according to the present invention.
  • FIG. 2 A variable importance plot (Varimp Plot) of the liver tissue-specific marker discovered in Example 1 was prepared by the random forest method, and it is shown in FIG. 2.
  • the X-axis MeanDecreaseAccuracy indicates the degree to which each marker contributes to the improvement of accuracy in the classification of liver tissue/other tissue
  • the Y-axis MeanDecreaseGini indicates the degree to which each marker contributes to the improvement of the impurity in the classification of liver/other tissue. Show. That is, the larger the value, the more clearly the marker can distinguish between liver tissue and other tissues.
  • liver tissue-specific markers were 0.9988 for accuracy, 0.9884 for sensitivity, 0.9994 for specificity, and 0.9999 for area under the curve (AUC).
  • cg12137206 and cg03792768 markers were finally selected as liver tissue-specific markers.
  • Tables 4 and 5 information and sequences of the cg12137206 and cg03792768 markers are described.
  • Probe_ID order cg12137206 GGGGACACGACTGCCCCAGCAACTTGCAGGAGTCGCACCACCTCCATGCACTTGTCCCGG[CG]CTCCCGGCCCGAGTAGCCTCCCGCAGCCCACACCTGCCCTGGCAGTTCGCACCCTAGCAG (SEQ ID NO: 1) cg03792768 TTCCCATTGGTTGAGACAGCACCGCCCAGCCAAAGCCCCCTTGTCCTCGCGCGGGTGCGC[CG]CCTGGACTCCCACCCTGGCCAGTCCCGGGCCCACCACCACTCTGGCATCCCCAGCCTGTC (SEQ ID NO: 2)
  • [CG] refers to the target methylation site of each probe.
  • liver tissues and other tissues were confirmed. As a result, it was found that both markers were methylated at high levels in both normal liver tissue (Liver N) and liver cancer tissue (Liver T) as shown in FIG. 4A, and as shown in FIG. 4B, both markers It was found that the methylation level was low in all other cancer tissues and other normal tissues.
  • the cg12137206 and cg03792768 markers have a high level of methylation in liver tissue and a low level of methylation in other tissues, so the two markers can be used as liver tissue specific markers.

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Abstract

본 발명은 기원을 모르는 생물학적 시료의 간 조직 유래 여부를 판별하는 방법 및 이를 수행하기 위한 간 조직 특이적 DNA 메틸화 마커를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 상기 간 조직 특이적 DNA 메틸화 마커는 간 조직을 제외한 다른 조직에서는 메틸화 수준이 낮고, 정상 간 조직 및 간암 조직에서는 메틸화 수준이 높으므로 우수한 정확도로 생물학적 시료가 간 조직에서 유래했는지 여부를 판별할 수 있다.

Description

생물학적 시료의 간 조직 유래 여부를 판별하는 방법
본 발명은 기원을 모르는 생물학적 시료의 간 조직 유래 여부를 판별하는 방법 및 이를 수행하기 위한 간 조직 특이적 DNA 메틸화 마커를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
사람 몸에 있는 세포들은 동일한 유전자 정보를 가지고 있지만, 각 세포들의 기능과 형태는 매우 다양하다. 이는 각 세포마다 특정한 유전자가 발현되고, 이에 따라 세포 분화 과정이 상이하여 최종적으로 세포 표현형의 차이를 보이기 때문이다. 이러한 특정 유전자의 발현에는 DNA 메틸화, 히스톤 변형, 조직 특이적 전사 인자 등 여러 요인들이 관여한다. 특히 DNA 메틸화, 구체적으로 CpG 부위의 메틸화는 세포 특이적 유전자 발현의 필수요소로 세포 또는 조직마다 고유한 DNA 메틸화 특징을 갖는 것으로 알려져 있다. 따라서, DNA 메틸화 특징을 이용하면 세포 또는 조직이 유래한 기원을 용이하게 확인할 수 있다.
세포 또는 조직의 기원을 확인하는 것은 질병의 조기 진단을 가능하게 하고, 진단의 정확도를 높일 수 있다. 예를 들어, 생체를 순환하는 혈액 속에는 순환 세포유리 DNA(cell free DNA, cfDNA)가 존재하고, 이중에는 종양세포에서 흘러나온 순환 종양 DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)가 있을 수 있다. 액체 생검으로 ctDNA의 존재를 검출한다고 하더라도 암을 정확히 진단하기 위해서는 해당 ctDNA가 기원한 조직을 추가로 확인하는 과정이 필요하며, 이러한 과정에서 암의 진단은 늦어지게 된다. 그러나 해당 ctDNA를 검출하면서 기원한 조직을 같이 확인할 수 있다면 암의 조기 진단이 가능해지며, 생물학적 시료의 기원을 밝히는 방법은 암뿐만 아니라 다른 질병의 조기 진단에 점점 필요해지고 있다.
본 발명자들은 DNA 메틸화 데이터를 기반으로 기원을 모르는 조직 및 세포의 기원을 밝히는 방법을 연구한 결과, 간 조직 특이적으로 메틸화 수준이 높은 마커를 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 기원이 불분명한 생물학적 시료가 간 조직에서 유래했는지 여부를 판별하는 방법 및 상기 방법을 수행하기 위한 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 양상은 하기 단계를 포함하는 생물학적 시료의 간 조직 기원 여부를 판별하는 방법을 제공한다:
(a) 대상체(subject)의 분리된 생물학적 시료에서 DNA를 분리하는 단계; 및
(b) 상기 분리된 DNA에서 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 서열의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 대상체는 인간일 수 있고, 상기 생물학적 시료는 상기 대상체에서 분리된 조직, 조직 단편, 세포, 세포 단편, 혈액, 혈장, 체액, 대변 및 소변 등을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 조직, 조직 단편, 세포 및 세포 단편 등은 대상체에서 채취된 혈액, 혈장, 체액, 소변 등에서 분리될 것일 수 있다. 또한, 상기 DNA는 조직, 세포 등에서 분리한 DNA일 수 있고, 혈액, 혈장, 체액 등에 부유하는 세포유리 DNA(cell free DNA, cfDNA) 또는 종양세포에서 흘러나온 순환 종양 DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)일 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어, "메틸화(methylation)”는 DNA를 구성하는 염기에 메틸기(-CH 3)가 부착되는 것을 의미하며, 바람직하게는 특정 DNA의 특정 CpG 부위의 시토신에서 일어나는 메틸화를 의미한다. 용어, "메틸화 수준"은 특정 DNA 염기서열 내에 존재하는 CpG 부위의 메틸화 상태를 정량적으로 평가한 것을 의미하며, 메틸화 상태는 DNA 염기서열 내의 하나 이상의 CpG 부위에서 5-메틸-시토신의 존재 또는 부존재를 의미한다.
본 명세서에 사용된 용어, "CpG 부위"는 시토신(cytosine, C)과 구아닌 (guanine, G)이 인산기(phosphate)로 연결된 서열을 말하며, 프로모터 영역, 단백질 코딩 영역(open reading frame, ORF) 및 터미네이터 영역 등을 포함하는 DNA 서열 내에 존재할 수 있다. CpG 부위의 메틸화는 유전체의 안정성 유지, 유전자의 발현 조절 등에 관여하는 것으로 알려져 있다.
본 발명자들은 간 조직 특이적 메틸화 마커를 발굴하기 위해 노력한 결과, 정상 간 조직, 간암 조직 샘플에서는 메틸화 수준이 높고, 혈액을 포함한 기타 조직에서는 메틸화 수준이 낮은 cg12137206 (서열번호 1), cg03792768(서열번호 2) 마커를 발굴하였다. 상기 두 마커의 타겟 메틸화 부위는 각각 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 서열에서 61번째 뉴클레오티드에 위치하는 CpG 부위이다. 그러나 상기 타겟 메틸화 부위 이외에 다른 CpG 부위에서도 메틸화가 일어날 수 있으므로 본 발명에서는 상기 타겟 CpG 부위를 포함하여 서열번호 1 및 2로 표시되는 서열에 존재하는 전체 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 (b)는 PCR, 메틸화 특이 PCR(methylation specific PCR), 실시간 메틸화 특이 PCR(real time methylation specific PCR), MethyLight PCR, MehtyLight digital PCR, EpiTYPER, 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 정량 PCR, DNA 칩, 분자 비콘(molecular beacon), MS-HRM (Methylation-sensitive high resolution melting), 비대칭 PCR (asymmetric PCR), 비대칭 PCR MS-HRMA (asymmetric PCR Methylation-sensitive high resolution melting analysis), 재조합효소-중합효소 증폭법 (Recombinase Polymerase Amplification), LAMP법(Loop-Mediated Isothermal Amplification), Eclipse probe, 차세대 염기서열분석 패널(NGS panel), 파이로시퀀싱 및 바이설파이트 시퀀싱으로 이루어진 군에서 선택되는 방법으로 수행될 수 있다.
예를 들어, 상기 메틸화 수준은 마이크로어레이에 의해 식별될 수 있고, 상기 마이크로어레이는 고상표면에 고정화된 프로브를 이용할 수 있다. 상기 프로브는 상기 CpG 부위를 포함하는 10 내지 100개의 연속 뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 방법은 (c) 상기 (b) 단계 이후에, 상기 메틸화 수준을 정상 대조군의 메틸화 수준과 비교하는 단계;를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어 생물학적 시료의 메틸화 수준을 정상 대조군의 메틸화 수준과 비교하여 메틸화 수준이 높은 경우 상기 생물학적 시료가 간 조직으로부터 유래한 것으로 판별할 수 있고, 메틸화 수준이 낮거나 유사한 경우 상기 생물학적 시료는 간을 제외한 기타 조직에서 유래한 것으로 판별할 수 있다.
본 발명의 다른 양상은 하기 단계를 포함하는 생물학적 시료에서 간 조직 유래 DNA를 검출하는 방법을 제공한다:
(a) 대상체의 분리된 생물학적 시료에서 DNA를 분리하는 단계; 및
(b) 상기 분리된 DNA에서 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 서열의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계.
상기 방법은 생물학적 시료의 간 조직 기원 여부를 판별하는 방법과 동일한 서열의 메틸화 수준을 측정하는 기술을 사용하므로 두 방법 사이에 중복되는 내용은 명세서의 과도한 기재를 피하기 위하여 생략한다.
본 발명에서, 상기 간 조직 유래 DNA 검출 방법은 기존의 간암 진단 방법과 병용하여 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상은 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 서열의 메틸화 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 생물학적 시료의 간 조직 기원 여부 판별용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 CpG 부위는 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 서열에서 61번째 뉴클레오티드에 위치하는 CpG 부위를 포함하는 1개 내지 복수개가 될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 메틸화 수준을 측정할 수 있는 제제는 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 서열의 CpG 부위에 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 핵산일 수 있으며, 상기 프라이머, 프로브 또는 안티센스 핵산은 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로 이용될 수 있고 기체(substrate) 상에 고정화될 수 있다.
또한, 상기 서열번호 1 또는 2로 표시되는 서열은 게놈 DNA일 수 있고, 술폰산(bisulfite)이 처리되어 비메틸화된 시토신이 우라실로 전환된 서열일 수 있다.
상기 기체는 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함할 수 있다. 상기 혼성화 어레이 요소는 화학적 결합 방법, UV와 같은 공유 결합 방법 또는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기체 상에 고정될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 생물학적 시료로부터 분리된 DNA(시료 DNA)는 혼성화 어레이에 적용되어 어레이 요소와 혼성화될 수 있으며, 혼성화 조건은 다양하게 변경될 수 있고, 혼성화 정도의 검출 및 분석은 당업계에 알려진 기술에 따라 다양하게 실시될 수 있다. 또한, 상기 시료 DNA 및/또는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 핵산은 혼성화 여부를 확인케 하는 신호를 제공하기 위해 표지(labeling)될 수 있고, 올리고뉴클레오티드에 연결될 수 있다.
상기 표지는 형광단(예컨대, 플루오리신(fluorescein), 피코에리트린 (phycoerythrin), 로다민, 리사민(lissamine), Cy3 및 Cy5(Pharmacia), 발색단, 화학발광단, 자기입자, 방사성동위원소(P32 및 S35), 효소(알칼린 포스파타아제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제), 조인자, 효소에 대한 기질, 중금속(예를 들어, 금), 항체, 스트렙타비딘, 바이오틴, 디곡시게닌(digoxigenin)과 킬레이팅기와 같은 특정 결합 파트너를 갖는 햅텐을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 프라이머, 프로브 또는 안티센스 핵산과 시료 DNA의 혼성화는 반응 온도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기, 뉴클레오티드의 길이, 뉴클레오티드 서열, GC 서열의 양 등의 다양한 인자에 의존한다. 상기 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., MolecularCloning, A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, NucleicAcid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)을 참조할 수 있다.
상기 혼성화 반응 이후에, 혼성화 반응을 통하여 나오는 혼성화 시그널을 검출할 수 있다. 예를 들어, 상기 프로브가 효소에 의해 표지된 경우, 상기 효소의 기질을 혼성화 반응 결과물과 반응시켜 혼성화 여부를 확인할 수 있다.
상기 효소 및 기질은 퍼옥시다아제(예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다아제)와 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR (p-phenylenediamine-HCl 및 pyrocatechol), TMB (tetramethylbenzidine), ABTS (2,2'-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌; 알칼린 포스파타아제와 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트 (naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF 기질; 글루코오스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate)가 사용될 수 있다.
본 발명에서는 DNA 메틸화를 기반으로 간 조직 특이적인 마커를 발굴하였다. 구체적으로 혈액 내의 다양한 세포 타입, 여러 장기 샘플의 메틸화 분석을 진행하여 간 조직을 제외한 다른 장기에서는 메틸화가 낮고, 간 조직 특이적으로 메틸화가 높은 마커를 선별하고, 기계학습 기법으로 선별한 마커의 효율을 확인했다. 선별된 마커는 독립적 코호트인 정상 간 조직에서 간암까지 이르는 모든 샘플에서 메틸화 수준이 높았고, 혈액을 포함하여 다른 조직에서는 메틸화가 낮았으며, 2개 마커만으로도 99% 이상의 정확도로 간 특이성을 갖는 것을 검증하였다. 해당 마커의 유전자 발현 또한 간 특이적으로 높은 경향성을 확인했다. 간 특이적 메틸화 마커를 통해 조직의 기원을 확인할 수 있는 주요 마커로 활용될 수 있음을 규명했고, 향후 간 관련 질환의 모니터링 및 조기 검출의 정확도를 향상시킬 수 있는 지표로 활용하고자 한다.
본 발명의 생물학적 시료의 간 조직 유래 여부를 판별하는 방법 및 이를 수행하기 위한 조성물은 간 조직 특이적 DNA 메틸화 마커를 이용하며, 상기 간 조직 특이적 마커는 간 조직을 제외한 다른 조직에서는 메틸화 수준이 낮고, 정상 간 조직 및 간암 조직에서는 메틸화 수준이 높으므로 생물학적 시료가 간 조직에서 유래했는지 여부를 우수한 정확도로 판별할 수 있다.
도 1은 본 발명의 간 조직 특이적 마커 발굴 과정을 개략적으로 나타낸다.
도 2는 발굴한 간 조직 특이적 마커의 변수 중요도 플랏(variable importance plot, VarImp Plot)을 나타낸다.
도 3은 발굴한 간 조직 특이적 마커의 수에 따른 성능을 확인한 결과를 나타낸다.
도 4에서 A는 최종 선별한 cg12137206, cg03792768 마커의 메틸화 수준을 정상 간 조직(Liver N) 및 간암 조직(Liver T)에서 확인한 결과, B는 간암 샘플의 정상 간 조직(LIHC_N)과 간암 조직(LIHC_T), 간을 제외한 기타 정상 조직(Pan_N) 및 암 조직 (Pan_T)에서 확인한 결과를 나타낸다.
도 5는 cg12137206 마커의 메틸화 수준을 다양한 정상 조직(A)과 암 조직(B)에서 확인한 결과를 나타낸다.
도 6은 cg03792768 마커의 메틸화 수준을 다양한 정상 조직(A)과 암 조직(B)에서 확인한 결과를 나타낸다.
도 7은 cg12137206 및 cg03792768 마커의 메틸화 수준을 주요 정상 조직과 암 조직에서 확인한 결과를 나타낸다: 방광 (bladder, BL), 유방(breast, BR), 자궁 경부 (cervis, CE), 대장(colon, CO), 식도 (esophagus, ES), 교모세포종 (glioblastoma, GB), 두부 및 경부 (head and neck, HN), 신장(kidney, KI), 간(liver, LI), 폐(lung, LU), 이자 (pancreas, PA), 부신경절종 (paraganglioma, PC), 전립선 (prostate, PR), 직장 (rectum, RE), 육종 (sarcoma, SA), 피부 (skin, SK), 위 (stomach, ST), 흉선 (thymus, TH), 자궁 (uterine, UC) 및 혈액(blood, B).
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 간 조직 특이적 메틸화 마커 발굴
암유전체지도(The Cancer Genome Atlas; 이하, TCGA로 기재함)로부터 다양한 암종 및 정상 조직에 대한 DNA 메틸화 데이터를 다운로드하였다. TCGA에서 다운로드한 데이터로부터 간암 조직 샘플(n=379)에서 메틸화된 CpG 사이트를 선별하고, 이중에서 다른 조직의 암종 샘플(n=7,260)에서는 비메틸화된 CpG 사이트를 추가로 선별하였다. 이때 기준은 50% 이상의 샘플에서 메틸화된 경우는 메틸화, 90% 이상의 샘플에서 비메틸화된 경우는 비메틸화로 분류하였다.
이후 상기 추가 선별된 CpG 사이트로부터 간암을 제외한 암종 샘플(pan-tumor)의 90%에서 비메틸화된 CpG 사이트, 간을 제외한 정상 조직(pan-normal)의 90%에서 비메틸화된 CpG 사이트를 추가로 선별하였다.
도 1에 본 발명의 간 조직 특이적 마커의 발굴 과정을 개략적으로 도시하였다.
실시예 2: 간 조직 특이적 메틸화 마커의 성능 검증
랜덤 포레스트 방법으로 상기 실시예 1에서 발굴한 간 조직 특이적 마커의 변수 중요도 플랏(variable importance plot, VarImp Plot)을 작성하고, 이를 도 2에 도시하였다. 도 2에서 X축의 MeanDecreaseAccuracy는 간 조직/기타 조직의 구분에 있어 각 마커가 정확도 개선에 기여하는 정도, Y축의 MeanDecreaseGini는 간 조직/기타 조직의 구분에 있어 각 마커가 불순도 개선에 기여하는 정도를 나타낸다. 즉, 값이 클수록 그 마커가 간 조직과 기타 조직을 명확히 구분할 수 있음을 의미한다.
다음으로 실시예 1에서 사용한 암 조직의 메틸화 데이터를 무작위로 훈련 데이터와 검증 데이터로 구분하여 간 조직 특이적 마커를 테스트하였다. 그 결과, 아래 표 1에 기재된 바와 같이 발굴한 마커들이 간 조직과 기타 조직을 높은 효율과 정확도로 구분하는 것을 확인할 수 있었다. 간 조직 특이적 마커의 성능은 정확도(accuracy) 0.9988, 민감도(sensitivity) 0.9884, 특이도(specificity) 0.9994, 곡선 아래 면적(area under the curve, AUC) 0.9999로 나타났다.
유형 기타 조직 간 조직
훈련 데이터 기타 조직 6345 3
간 조직 7 337
검증 데이터 기타 조직 1586 1
간 조직 1 85
또한, 마커의 수에 따른 성능을 확인하기 위하여 마커의 수를 다르게 하여 5번씩 테스트하고, 평균값을 확인하였다. 그 결과, 표 2 및 도 3에 나타낸 바와 같이 2개 이상의 마커를 사용한 경우 성능이 0.999에 수렴하는 것을 알 수 있었다.
1개 2개 3개 4개 5개 6개
Accuracy 0.9916 0.9976 0.99736 0.99784 0.99796 0.9982
Kappa 0.9142 0.97526 0.97264 0.97762 0.97886 0.98142
Sensitivity 0.923036 0.969686 0.965034 0.96963 0.971954 0.976718
Specificity 0.995338 0.999118 0.999118 0.99937 0.99937 0.999362
Pos Pred Value 0.915048 0.983764 0.983764 0.988172 0.988318 0.988428
Neg Pred Value 0.995844 0.998364 0.998112 0.998364 0.99849 0.998742
Balanced Accuracy 0.959188 0.984402 0.982078 0.9845 0.985664 0.988048
또한, 변수 중요도 플랏에서 중요도가 높은 것으로 나온 2개 마커 (cg12137206, cg03792768)의 성능을 추가로 검증하였다. 그 결과, 아래 표 3에 기재된 바와 같이 상기 마커가 간 조직과 기타 조직을 명확하게 구분하는 것을 확인할 수 있었다. 정확도 0.9982, 민감도 0.9647, 특이도 1, 곡선 아래 면적(AUC) 0.9939로 나타났다.
유형 기타 조직 간 조직
훈련 데이터 기타 조직 6340 8
간 조직 11 333
검증 데이터 기타 조직 1587 3
간 조직 0 82
상기 결과들을 근거로 cg12137206, cg03792768 마커를 간 조직 특이적 마커로 최종 선별하였다. 아래 표 4 및 표 5에 cg12137206, cg03792768 마커의 정보 및 서열을 기재하였다.
Probe_ID CGRC_ID Gene_ID chr start end CGI CGI_loci
cg12137206 CGRC_LTO.1 GPAM chr10 113943397 113943398 chr10:113943283-113943657 pCGI
cg03792768 CGRC_LTO.2 BDH1 chr3 197281934 197281935 chr3:197281605-197283128 pCGI
Probe_ID 서열
cg12137206 GGGGACACGACTGCCCCAGCAACTTGCAGGAGTCGCACCACCTCCATGCACTTGTCCCGG[CG]CTCCCGGCCCGAGTAGCCTCCCGCAGCCCACACCTGCCCTGGCAGTTCGCACCCTAGCAG (서열번호 1)
cg03792768 TTCCCATTGGTTGAGACAGCACCGCCCAGCCAAAGCCCCCTTGTCCTCGCGCGGGTGCGC[CG]CCTGGACTCCCACCCTGGCCAGTCCCGGGCCCACCACCACTCTGGCATCCCCAGCCTGTC (서열번호 2)
- 상기 표에서 [CG]는 각 프로브의 타겟 메틸화 부위를 의미함
실시예 3: 최종 선별한 간 조직 특이적 마커의 검증
최종 선별한 cg12137206, cg03792768 마커의 간 조직, 다른 조직에서의 메틸화 수준을 확인하였다. 그 결과, 도 4의 A에 나타난 바와 같이 정상 간 조직(Liver N)과 간암 조직(Liver T) 모두에서 두 마커가 높은 수준으로 메틸화되는 것을 알 수 있었고, 도 4의 B에 나타난 바와 같이 두 마커 모두 기타 암 조직 및 기타 정상 조직에서는 메틸화 수준이 낮은 것을 알 수 있었다.
도 5 내지 도 7에 간 조직과 기타 조직에서 확인한 cg12137206, cg03792768 마커의 메틸화 수준을 도시하였고, 표 6 내지 8에는 상기 마커의 교차 검증 결과를 기재하였다.
조직 샘플수 정확도_N 정확도_T
혈액(whole blood, B) KNIH 400 1 NA
GEO_WBset 107 1 NA
간 종양 형성 (liver tumorigenesis) GSE48325 79 1 NA
GSE49542 59 1 NA
간세포암(HCC) GSE43091 54 1 0.94
GSE54503 132 1 0.9851
GSE56588 234 1 0.9872
GSE60753 66 0.9412 0.9375
TCGA_LIHC 379 1 0.9921
CGRC_HCC 307 1 0.9835
TCGA_CHOL 45 1 0.5278
다른 조직 CGRC_CRC 709 1 1
CGRC_lung 42 NA 1
조직 TCGA 샘플수 정확도_N 정확도_T
방광 (bladder, BL) BLCA 434 1 1
유방 (breast, BR) BRCA 869 1 1
자궁 경부 (cervis, CE) CESC 312 1 1
대장 (colon, CO) COAD 335 1 1
직장 (rectum, RE) READ 106 1 1
식도 (esophagus, ES) ESCA 202 1 1
교모세포종 (glioblastoma, GB) GBM 154 1 1
두부 및 경부 (head and neck, HN) HNSC 580 1 1
신장 (kidney, KI) KIRC 480 1 1
신장 (kidney, KI) KIRP 321 1 1
폐 (lung, LU) LUAD 492 1 1
폐 (lung, LU) LUSC 412 1 1
이자 (pancreas, PA) PAAD 195 1 1
부신경절종 (paraganglioma, PC) PCPG 187 1 1
전립선 (prostate, PR) PRAD 549 1 1
위 (stomach, ST) STAD 397 1 1
육종 (sarcoma, SA) SARC 269 1 1
피부 (skin, SK) SKCM 475 1 1
흉선 (thymus, TH) THCA 574 1 1
흉선 (thymus, TH) THYM 126 1 1
자궁 (uterine, UC) UCEC 466 1 1
조직 GEO # 샘플수 정확도
방광 (BL) GSE52955 30 1
유방 (BR) GSE52865 57 1
GSE39451 20 1
GSE60185 285 1
자궁 경부 (CE) GSE46306 44 1
대장 (colon, CO) GSE39958 45 1
GSE42752 63 1
GSE48684 147 1
식도 (ES) GSE52826 12 1
교모세포종 (GB) GSE36278 142 0.9787
GSE58298 40 1
GSE60274 77 0.987
두부 및 경부 (HN) GSE40005 24 1
GSE38266 42 0.9286
신장 (KI) GSE50874 85 1
GSE61441 92 1
폐 (LU) GSE39279 444 1
GSE52401 244 1
GSE56044 136 1
이자 (PA) GSE49149 196 1
부신경절종 (PC) GSE43293 24 1
전립선 (PR) GSE47915 8 1
GSE55598 48 1
위 (ST) GSE34387 76 0.9867
흉선 (TH) GSE55111 11 1
자궁 (UC) GSE45187 9 1
지금까지의 결과를 통하여, cg12137206, cg03792768 마커는 간 조직에서는 메틸화 수준이 높고, 기타 조직에서는 메틸화 수준이 낮은 것을 알 수 있으며, 따라서 상기 두 마커는 간 조직 특이적 마커로 사용될 수 있다.

Claims (6)

  1. (a) 대상체(subject)로부터 분리된 생물학적 시료에서 DNA를 분리하는 단계; 및
    (b) 상기 분리된 DNA에서 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 서열의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계;를 포함하는 생물학적 시료의 간 조직 기원 여부를 판별하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 대상체로부터 분리된 조직, 조직 단편, 세포, 세포 단편, 혈액, 혈장, 체액, 대변 및 소변으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 생물학적 시료의 간 조직 기원 여부를 판별하는 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 (b) 단계는 PCR, 메틸화 특이 PCR(methylation specific PCR), 실시간 메틸화 특이 PCR(real time methylation specific PCR), MethyLight PCR, MehtyLight digital PCR, EpiTYPER, 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 정량 PCR, DNA 칩, 분자 비콘(molecular beacon), MS-HRM (Methylation-sensitive high resolution melting), 비대칭 PCR (asymmetric PCR), 비대칭 PCR MS-HRMA (asymmetric PCR Methylation-sensitive high resolution melting analysis), 재조합효소-중합효소 증폭법 (Recombinase Polymerase Amplification), LAMP법(Loop-Mediated Isothermal Amplification), Eclipse probe, 차세대 염기서열분석 패널(NGS panel), 파이로시퀀싱 및 바이설파이트 시퀀싱으로 이루어진 군에서 선택되는 방법으로 수행되는 것인, 생물학적 시료의 간 조직 기원 여부를 판별하는 방법.
  4. (a) 대상체로부터 분리된 생물학적 시료에서 DNA를 분리하는 단계; 및
    (b) 상기 분리된 DNA에서 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 서열의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계;를 포함하는 생물학적 시료에서 간 조직 유래 DNA를 검출하는 방법.
  5. 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 서열의 메틸화 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 생물학적 시료의 간 조직 기원 여부 판별용 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 메틸화 수준을 측정할 수 있는 제제는 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 서열의 CpG 부위에 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 핵산인 것인 생물학적 시료의 간 조직 기원 여부 판별용 조성물.
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