WO2021080020A1 - 核酸送達促進剤 - Google Patents

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cationic oligopeptide
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pancreatic cancer
shrna
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猛 和田
倫太朗 原
佐藤　一樹
一憲 高木
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Kochi University NUC
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Tokyo University of Science
Kochi University NUC
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Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid delivery promoter for delivering a nucleic acid molecule such as siRNA into a cell.
  • the present invention also relates to agents that can be used for the treatment of diseases and the like by utilizing RNA interference (RNAi).
  • RNAi RNA interference
  • the present invention relates to a nucleic acid preparation having an antitumor effect on pancreatic cancer and capable of effectively suppressing tumor growth, infiltration, and metastasis of pancreatic cancer, and a pharmaceutical composition containing the same.
  • Pancreatic cancer is said to have the worst prognosis of all cancers.
  • the cause is that the pancreas is a retroperitoneal organ, which makes early detection difficult, and the motility of pancreatic cancer cells is extremely high, so there is a tendency for peritoneal invasion and metastasis to blood vessels, gastrointestinal tract, nerves, etc. It can be strong.
  • RNA interference RNA interference
  • SiRNA small interfering RNA
  • RNAi RNA interference
  • siRNA has a problem in terms of intracellular delivery because of its structure, which is highly anionic and has low cell membrane permeability.
  • the present inventors first prepared a siRNA-folic acid-polyethylene glycol (PEG) -chitosan oligosaccharide lactic acid (COL) nanoparticles complex, and promoted the uptake of siRNA into cells by the nanoparticles. We are confirming the effect. It has also been reported that siRNA for mRNA having IGF2BP3 binding ability incorporated into pancreatic cancer cells suppresses infiltration and metastasis of pancreatic cancer (Non-Patent Document 1).
  • Non-Patent Document 2 Non-Patent.
  • Non-Patent Document 2 Non-Patent.
  • Document 3 We are also studying the use of complexes containing vitamin E and cationic sugars for the delivery of RNAi molecules.
  • RNAi molecules such as siRNA as a nucleic acid drug to cells
  • delivery of RNAi molecules such as siRNA as a nucleic acid drug to cells is a very important issue for enhancing the practicality of the nucleic acid drug.
  • issues to be achieved such as not only delivery but also specific delivery to the target cell and not inhibiting the effect of the nucleic acid drug after being taken up into the cell.
  • siRNA and shRNA can be specifically delivered into cells having a folic acid receptor by using a complex of folic acid and a cationic oligopeptide. I found it.
  • pancreatic cancer cells are targeted, and siRNA or shRNA is effectively taken up by the targeted pancreatic cancer cells, and the expression of a specific RNA is knocked down, so that the tumor grows against pancreatic cancer.
  • siRNA or shRNA is effectively taken up by the targeted pancreatic cancer cells, and the expression of a specific RNA is knocked down, so that the tumor grows against pancreatic cancer.
  • the present invention provides the following. 1.
  • a delivery promoter of siRNA or shRNA composed of a folic acid-cationic oligopeptide complex, wherein the cationic oligopeptide contains a portion in which at least two consecutive amino acid residues of the following formula (I) are contiguous, and the following formula (The delivery enhancer comprising a cationic oligopeptide site consisting of 8 to 40 amino acids, which is one other amino acid residue that is not contiguous except for the contiguous portion of the amino acid residue of I).
  • R 1 is a group represented by the group H 3 N + -CH 2- or the group (II), and in R 2 , R 1 is a group H 3 N + -CH 2- In the case of, it is an alkylene group that does not exist or has 1 to 3 carbon atoms, and if R 1 is a group represented by the formula (II), it is an alkylene group having 1 to 4 carbon atoms. In one cationic oligopeptide, R 1 and R 2 are all the same.
  • R 3 , R 4 and R 5 are the same or different, and are hydrogen atoms or methyl groups.
  • 3. 3. The cationic oligopeptide sites are L-2,3-diaminopropionic acid (Dap), L-2,4-diaminobutyric acid (Dab), L-ornithine (Orn), L-lysine (Lys), L-2-
  • the delivery promoter according to 1 or 2 above which is a homomultimer of amino-3-guanidinopropionic acid (Agp), L-2-amino-4-guanidinobutyric acid (Agb), or L-arginine (Arg).
  • An antitumor agent comprising siRNA or shRNA capable of binding to mRNA or snoRNA expressed in pancreatic cancer cells and inhibiting its expression, and a delivery promoter according to any one of 1 to 8 above. 10.
  • IGF2BP3 insulin-like growth factor 2 mRNA-binding protein 3
  • the antitumor agent according to 9 or 10 wherein the mRNA or snoRNA expressed in pancreatic cancer cells is selected from the group consisting of SNORA18 snoRNA, NUP85 mRNA, WASF2 mRNA, and SNORA22 snoRNA. 12.
  • the antitumor agent according to any one of 9 to 11 above which comprises 0.5 to 10 equivalents of a folic acid-cationic oligopeptide complex relative to siRNA or shRNA.
  • the siRNA or shRNA contains a modified base, a modified sugar, and / or a modified nucleoside bond.
  • the antitumor agent according to 14 above, wherein the modification of the modified sugar is a 2'-OMe modification.
  • Formulations containing peptide complexes [In the formula (I), R 1 is a group represented by the group H 3 N + -CH 2- or the group (II), and in R 2 , R 1 is a group H 3 N + -CH 2- In the case of, it is an alkylene group that does not exist or has 1 to 3 carbon atoms, and if R 1 is a group represented by the formula (II), it is an alkylene group having 1 to 4 carbon atoms. In one cationic oligopeptide, R 1 and R 2 are all the same.
  • [In formula (II), R 3 , R 4 and R 5 are the same or different, and are hydrogen atoms or methyl groups. ]
  • R 1 is a group represented by the group H 3 N + -CH 2- or the group (II), and in R 2 , R 1 is a group H 3 N + -CH 2- In the case of, it is an alkylene group that does not exist or has 1 to 3 carbon atoms, and if R 1 is a group represented by the formula (II), it is an alkylene group having 1 to 4 carbon atoms. In one cationic oligopeptide, R 1 and R 2 are all the same.
  • [In formula (II), R 3 , R 4 and R 5 are the same or different, and are hydrogen atoms or methyl groups.
  • a pharmaceutical kit for the treatment of pancreatic cancer including. This specification includes the disclosure of Japanese Patent Application No. 2019-194646, which is the basis of the priority of the present application.
  • the present invention provides a nucleic acid preparation capable of effectively delivering siRNA or shRNA specifically to pancreatic cancer cells and suppressing tumor growth, infiltration and metastasis of pancreatic cancer.
  • the HPLC analysis result of the crude product containing Fol-Dab8A and Fol-Dab8B is shown.
  • the effects of 1-3 equivalents of Dab8, Fol-Dab8A and Fol-Dab8B on RNase A resistance of siRNA are shown by changes in fluorescence intensity due to fluorescence resonance energy transfer (FRET).
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • A A confocal microscope image showing the uptake of siRNA labeled with Alexa488 into S2-013 pancreatic cancer cells in the presence of a folic acid-cationic oligopeptide complex is shown.
  • B Confocal microscopic images showing uptake of S2-013 pancreatic cancer cells in the absence of folic acid-cationic oligopeptide complex of siRNA labeled with Alexa488.
  • the data show the band amplified by RT-PCR as a relative intensity with the band intensity of 1 in the combination of control siRNA and Dab8.
  • B Shows the number of infiltrating cells in the Matrigel assay with the combination of scrambled control siRNA or SNORA18 siRNA and folic acid-cationic peptide complex (Fol-Dab8A and Fol-Dab8B).
  • A The combined use of a scrambled control siRNA or NUP85 siRNA with a cationic oligopeptide or a folic acid-cationic oligopeptide complex exhibits an effect of suppressing the expression of NUP85.
  • the data show the band amplified by RT-PCR as a relative intensity with the band intensity of 1 in the combination of control siRNA and Dab8.
  • B Shows the number of infiltrating cells in the Matrigel assay with the combination of scrambled control siRNA or NUP85 siRNA and folic acid-cationic peptide complex (Fol-Dab8A and Fol-Dab8B).
  • A Shows the effect of suppressing the expression of WASF2 by the combined use of scrambled control siRNA or WASF2 siRNA and a cationic oligopeptide or a folic acid-cationic oligopeptide complex.
  • the data show the band amplified by RT-PCR as a relative intensity with the band intensity of 1 in the combination of control siRNA and Dab8.
  • B Shows the number of infiltrating cells in the Matrigel assay with the combination of scrambled control siRNA or WASF2 siRNA and folic acid-cationic peptide complex (Fol-Dab8A and Fol-Dab8B).
  • A Shows the effect of suppressing the expression of SNORA22 by the combined use of scrambled control siRNA or SNORA22 siRNA and a cationic oligopeptide or a folic acid-cationic oligopeptide complex.
  • the data show the band amplified by RT-PCR as a relative intensity with the band intensity of 1 in the combination of control siRNA and Dab8.
  • B Shows the number of infiltrating cells in the Matrigel assay with the combination of scrambled control siRNA or SNORA22 siRNA and folic acid-cationic peptide complex (Fol-Dab8A and Fol-Dab8B).
  • Alexa488-labeled SNORA22 siRNA and folic acid-cationic oligopeptide complex were added to the culture medium and incubated overnight for S2-013 pancreatic cancer cells (A) and HPNE normal pancreatic duct epithelial cells (HPNE normal pancreatic duct epithelial cells). It is a confocal microscope image which shows the staining of the folic acid receptor (FOLR1) and SNORA22 siRNA in B).
  • Serum mixed with unmodified SNORA22 siRNA (A) or chemically modified SNORA22 siRNA (B) with a cationic oligopeptide (Dab8) or a folic acid-cationic oligopeptide complex (Fol-Dab8A or Fol-Dab8B) The stability of siRNA immediately after (0), 3 hours (3) or 6 hours (6) after addition to (10% FCS / PBS) is shown by the results of SDS-PAGE using a non-reducing gel. -: No FCS (PBS only), Control: Each SNORA22 siRNA was added alone.
  • S2-013 The results of imaging the delivery of chemically modified SNORA22 siRNA to pancreatic cancer tissue of mice carrying human pancreatic cancer organoids derived from pancreatic cancer cells by in vivo imager are shown.
  • 1-3 equivalents of Dab8 are added to AC: SNORA22 siRNA
  • 1-3 equivalents of Fol-Dab8A is added to DF: SNORA22 siRNA
  • Fol is added to GI: SNORA22 siRNA.
  • S2-013 Shows antitumor effect by co-administration of SNORA22 siRNA and folic acid-cationic oligopeptide complex on pancreatic cancer tumor in mice carrying human pancreatic cancer organoid derived from pancreatic cancer cells.
  • Non-administered control group SNORA22-Dab8: SNORA22 siRNA administered with folic acid-cationic oligopeptide complex
  • Scr-Fol-Dab8B Scrambled control siRNA administered
  • SNORA22-Fol-Dab8B SNORA22 siRNA A group administered with a folic acid-cationic oligopeptide complex. * Indicates that there is a significant difference at P ⁇ 0.05.
  • S2-013 The results of imaging the delivery of chemically modified SNORA18 siRNA to pancreatic cancer tissue of mice carrying human pancreatic cancer organoids derived from pancreatic cancer cells by in vivo imager are shown.
  • nucleic acid delivery promoter comprising a folic acid-cationic oligopeptide complex.
  • Folic acid is one of the water-soluble B vitamins and has the following structure. It has been reported that folic acid receptors are expressed at high concentrations on the surface of tumor cells. The present inventors have previously reported the intracellular delivery of siRNA using a complex containing folic acid, in which the folic acid receptor is expressed in the pancreatic cancer cell line S2-013 (Oncotarget, 2019, Vol. .10, No. 30, pp. 2869-2886).
  • folic acid used to prepare the complex with the cationic oligopeptide in the present invention folic acid having the above structure may be used, and the binding to the cationic oligopeptide and the binding to the folic acid receptor It may be a folate or a folic acid derivative that retains its properties.
  • the folic acid molecule has two carbosyl groups, amino groups, imino groups and the like, these functional groups that are not involved in the binding to the cationic oligopeptide are used in the art.
  • Known substituents can be added and labeled compounds can be attached to folic acid.
  • cationic oligonucleotide that can be used in the present invention, those disclosed in International Publication No. WO2014 / 148620 and Bioorganic & Medicinal Chemistry 21 (2013) 1717-1723 can be appropriately used.
  • the cationic oligonucleotide used in the present invention may contain 8 or more amino acid residues having an amino group or a guanidino group.
  • the cationic oligopeptide that can be used in the present invention contains at least two contiguous portions of amino acid residues of the following formula (I), and contiguous portions of the amino acid residues of the following formula (I). It can be an oligopeptide consisting of 8-40 amino acids, including a cationic oligopeptide site that is one other amino acid residue that is not contiguous except.
  • R 1 is a group represented by the group H 3 N + -CH 2- or the group (II), and in R 2 , R 1 is a group H 3 N + -CH 2- In the case of, it is an alkylene group that does not exist or has 1 to 3 carbon atoms, and if R 1 is a group represented by the formula (II), it is an alkylene group having 1 to 4 carbon atoms. In one cationic oligopeptide, R 1 and R 2 are all the same. ]
  • R 3 , R 4 and R 5 are the same or different, and are hydrogen atoms or methyl groups. ]
  • amino acid residue of formula (I) is not limited, but specifically, for example, L-2,3-diaminopropionic acid (Dap) and L-2,4-diaminobutyric acid (Dab). ), L-ornithine (Orn), L-lysine (Lys), L-2-amino-3-guanidinopropionic acid (Agp), L-2-amino-4-guanidinobutyric acid (Agb), or L-arginine ( Arg) can be mentioned.
  • amino acids having a proline skeleton include, but are not limited to, L-aminoproline and L-guanidinenoproline.
  • the cationic oligopeptide site can be a heteromultimer containing the above "other amino acid residues". In another aspect, the cationic oligopeptide site can be a homomultimer without the "other amino acid residues" described above. Considering the convenience of synthesizing the cationic oligopeptide and the stabilizing effect of siRNA and shRNA confirmed by the present inventors, the cationic oligopeptide site is a homomultimer composed of a single amino acid. It is preferable to do so.
  • the amino acid as a monomer may be a natural amino acid or an unnatural amino acid.
  • the amino acids may be L-type or D-type, and they may be mixed in the oligopeptide molecule.
  • cationic oligopeptides include, for example, L-2,3-diaminopropionic acid (Dap), L-2,4-diaminobutyric acid (Dab), L-ornithine (Orn), L-lysine (Lys), L- It may have a homomultimer of 2-amino-3-guanidinopropionic acid (Agp), L-2-amino-4-guanidinobutyric acid (Agb), or L-arginine (Arg) as a partial structure.
  • the cationic oligopeptide may be in the form of a salt, and examples of salts that can be preferably used include hydrochlorides, acetates, trifluoroacetates and the like, but the salts are not particularly limited.
  • a and type B double-stranded nucleic acids
  • DNA / DNA double-stranded nucleic acid it has a B-type double helix structure with a main groove width of 13 to 18 ⁇ .
  • the width of the main groove has an A-type double helix structure of 7 to 14 ⁇ and 8 to 15 ⁇ , respectively. Since the present invention is intended to improve the stability of siRNA, it is necessary to use a cationic oligopeptide capable of binding to an RNA / RNA strand having a type A double helix structure.
  • the number of amino acid residues constituting the cationic oligopeptide should be 8 to 12 in order to improve the stability of siRNA generally consisting of 21 to 23 bases and shRNA that results in such siRNA. Good.
  • the cationic oligopeptide site can be an octamer of diaminobutyric acid having the following structure, which was actually examined in the following examples and gave favorable results.
  • the bond between folic acid and the cationic oligopeptide is preferably a covalent bond.
  • the covalent bond can be a direct or linker-mediated bond to the N-terminus, C-terminus or side chain of the cationic oligopeptide.
  • linker those usually used in the art for producing conjugates can be appropriately used, and without particular limitation, a peptide linker composed of amino acids such as glycine and serine can be used. ..
  • the peptide linker can be a peptide consisting of 1 to 4 glycine residues.
  • a linker consisting of three glycine residues can be mentioned as one that was actually examined in the following examples and gave favorable results.
  • the ratio of folic acid to the cationic oligopeptide can be 1: 1 in consideration of the interaction with the folic acid receptor and the interaction with the double-stranded nucleic acid. It is not particularly limited.
  • the folic acid molecule has two carboxylic groups
  • the following two isomers can be produced when Dab8 having the above structure is bonded via a reaction with the carboxyl group of folic acid.
  • these compounds are referred to as Fol-Dab8A and Fol-Dab8B for convenience.
  • the linker In the above-mentioned Fol-Dab8A and Fol-Dab8B, three glycines are used as the linker, but the length of the linker can be changed as appropriate.
  • the folic acid-cationic oligopeptide complex may be obtained in the form of a salt. Examples of salts that can be preferably used include hydrochlorides, acetates, trifluoroacetates and the like, but are not particularly limited.
  • the folic acid-cationic oligopeptide complex enhances the stability of siRNA and shRNA and enables targeted delivery to cells having a folic acid receptor.
  • the cationic oligopeptide Dab8 having no folic acid is used as a control compound showing the effectiveness of Fol-Dab8A and Fol-Dab8B, but tyrosine (tyrosine) for enabling UV detection and quantification.
  • the N-terminal is protected by an acetyl group) and 3 glycines are provided at the N-terminal, and in the examples, this is referred to as Dab8 for convenience.
  • the nucleic acid delivery promoter of the present invention can promote the delivery of siRNA or shRNA to cells in vitro and in vivo, as demonstrated in Examples.
  • the nucleic acid delivery promoter of the present invention can specifically promote delivery to cells that highly express the folic acid receptor, particularly cancer cells.
  • the present invention also provides a nucleic acid preparation containing siRNA or shRNA capable of binding to mRNA or snoRNA expressed in pancreatic cancer cells and inhibiting its expression, and the delivery promoter of the present invention.
  • the nucleic acid preparation of the present invention can effectively suppress tumor growth, invasion, and metastasis of pancreatic cancer. Therefore, the nucleic acid preparation of the present invention has an action as a tumor growth inhibitor, an infiltration / metastasis inhibitor, and an antitumor agent for pancreatic cancer.
  • the siRNA or shRNA and the folic acid-cationic oligopeptide complex can be bound via a further covalent bond, but the negative charge of the siRNA or shRNA and the cation are not mediated by the covalent bond. Due to the interaction provided by the positive charge of the sex oligopeptide, the folic acid-cationic oligopeptide complex can partially enter the main groove of the siRNA or shRNA and have a stable structure, which is stable. It is not intended to be bound by the mechanism of cation effect.
  • RNAi molecule It is known that siRNA and shRNA target specific mRNAs and block their translation (expression) by a mechanism called RNA interference.
  • the number of bases in the target sequence is not particularly limited and can be selected in the range of 15 to 500 bases.
  • SiRNA is a short double-stranded RNA molecule
  • shRNA is a hairpin-type RNA that can be processed by a dicer in vivo to produce siRNA.
  • siRNA and shRNA may be included and referred to as "RNAi molecule”.
  • the siRNA is a double-stranded RNA in which a sense strand that is homologous to the partial base sequence of the target RNA and an antisense strand that can hybridize with the sense strand are hybridized, and usually the 3'end remains OH.
  • the 5'end is phosphorylated and the 3'end side may protrude from 1 base to 4 bases.
  • the region of the sense strand homologous to the partial base sequence of the target mRNA and the region of the antisense strand capable of hybridizing with the sense strand are bound by the linker region.
  • the shRNA may have a 3'end protruding from 1 base to 4 bases or less, and the 3'protruding end may be composed of DNA.
  • the shRNA is degraded intracellularly as described above and causes RNA interference in the same manner as siRNA. Therefore, shRNA may be used instead of siRNA.
  • the siRNA or shRNA used for the purpose of the present invention is a siRNA or shRNA that can bind to mRNA or SNORNA expressed in pancreatic cancer cells and inhibit its expression.
  • mRNA or snoRNA expressed in pancreatic cancer cells is not particularly limited, but may bind to insulin-like growth factor 2 mRNA-binding protein 3 (IGF2BP3).
  • IGF2BP3 insulin-like growth factor 2 mRNA-binding protein 3
  • human IGF2BP3 is present in the cell membrane process, and various mRNAs are bound to this IGF2BP3 and accumulated in the cell membrane process.
  • RNA interference By inhibiting mRNA bound to IGF2BP3 in these cell membrane processes by RNA interference, tumor growth, invasion, and metastasis in pancreatic cancer can be effectively suppressed.
  • RNA interference examples include mRNAs of NUP85, WASF2, ARHGEF4, CCDC88A, LAMTOR2, and mTOR. Can be done.
  • NUP85 is a protein belonging to the nucleoporin protein family, which is a component of the nuclear pore complex that forms the entrance and exit that regulates the movement of polymers between the cell nucleus and cytoplasm.
  • Information such as the amino acid sequence of human NUP85 and the base sequence of mRNA encoding the same is listed in a database such as NCBI as Gene ID: 79902, NCBI reference sequence: NM_024844 and the like.
  • Wiskott-Aldrich syndrome a type of primary immunodeficiency, is a disease characterized by thrombocytopenia, eczema, and susceptibility to infection with reduced size.
  • Whiscot Aldrich Syndrome Protein Family Member 2 belongs to the Wiscot Aldrich Syndrome Protein Family, which forms a multiprotein complex that connects receptor kinase and actin, and contains the amino acid sequence of human WASF2 and the mRNA encoding it. Information such as the base sequence is listed in a database such as NCBI as Gene ID: 10163, NCBI reference sequence: NM_006990, and the like.
  • ARHGEF4 (Rho guanine nucleotide exchange factor 4, Rho guanine nucleotide exchange factor 4) is a protein involved in intracellular processes initiated by stimuli that function through G protein-coupled states. Information such as the amino acid sequence of human ARHGEF4 and the base sequence of mRNA encoding the same is listed in a database such as NCBI as Gene ID: 50649, NCBI reference sequence: NM_015320 and the like.
  • CCDC88A (88A containing a coiled coil domain) is a gene encoding a Gildin protein, which is an actin-binding protein.
  • Information such as the base sequence of mRNA of human CCDC88A is listed in a database such as NCBI as Gene ID: 55704, NCBI reference sequence: NM_001135597 and the like.
  • LAMTOR2 (late endosome / lysosomal adapter, MAPK and mTOR activator 2) is a regulator of Langerhans cell homeostasis and has been reported to be involved in signal transduction and mTOR cascade. Information such as the amino acid sequence of human LAMTOR2 and the base sequence of mRNA encoding the same is listed in a database such as NCBI as Gene ID: 28956, NCBI reference sequence: NM_014017 and the like.
  • mTOR (mammalian target of rapamycin kinase, a mammalian target for rapamycin kinase) is a type of protein kinase involved in intracellular signal transduction in mammals and the like. Information such as the amino acid sequence of human mTOR and the base sequence of mRNA encoding the same is listed in a database such as NCBI as Gene ID: 2475, NCBI reference sequence: NM_004958 and the like.
  • mRNA is RNA that is transcribed from a gene (DNA) and contains information encoding a protein.
  • siRNA which is usually double-stranded, forms a complex called RISC (RNA-Induced-Silencing-Complex) together with a specific protein after the double strand is dissociated.
  • RISC RNA-Induced-Silencing-Complex
  • RISC recognizes and binds to mRNA having a sequence homologous to the base sequence of the sense strand of siRNA, and cleaves the mRNA by RNaseIII-like enzymatic activity.
  • shRNA can give rise to siRNA after processing in the delivered cell and then function similarly.
  • snoRNA is a non-coding RNA (small nuclear RNA) existing in the nucleolus, and is a group of RNA molecules having functions such as deriving methylation and pseudouridine formation of ribosomal RNA and other RNAs.
  • SNORA18 and SNORA22 which belong to such snoRNA, have a binding ability to IGF2BP3 and are involved in the motility or infiltration of pancreatic cancer cells. It was also found that snoRNA binds to the KH-type splicing regulatory protein (KHSRP) and is localized in the cytoplasmic P-bodies (Oncotarget, 2020, Vol. 11, No. 2, pp). : 131-147). The present inventors have found that siRNA or shRNA for these snoRNAs can also suppress tumor growth, invasion, and metastasis of pancreatic cancer by recognizing, binding to, and knocking down snoRNA.
  • KHSRP KH-type splicing regulatory protein
  • RNA SNORA18 has been reported as a member of RNA that guides the site of uridine-to-pseudouridine modification. Information such as the base sequence of human SNORA18 is listed in a database such as NCBI as Gene ID: 677805, NCBI reference sequence: NR_002959 and the like.
  • RNA SNORA22 has also been reported as a member of RNA that guides the site of uridine-to-pseudouridine modification.
  • Information such as the base sequence of human SNORA22 is listed in a database such as NCBI as Gene ID: 677807, NCBI reference sequence: NR_002961 and the like.
  • the mRNA or snoRNA expressed in pancreatic cancer cells that can be targeted by siRNA or shRNA in the present invention includes, for example, a group consisting of SNORA18 snoRNA, NUP85 mRNA, WASF2 mRNA, and SNORA22 snoRNA. More selected ones can be mentioned.
  • the target mRNA to which siRNA or shRNA can hybridize may include 3'UTR, 5'UTR, exon, intron, coding region, translation initiation region, translation termination region or other nucleic acid region.
  • siRNA and shRNA used in the present invention can knock down mRNA or snoRNA and inhibit its function. Therefore, more specifically, the siRNA and shRNA of the present invention consist of a base sequence that is substantially complementary to a specific base sequence of the target RNA. However, siRNA and shRNA may have about 1 to 2 mismatches with respect to the target base sequence. If a person skilled in the art has obtained the base sequence of the target mRNA or snoRNA, it is not homologous to the base sequence of a nucleic acid other than the target sequence and is suitable for inhibiting / knocking down the expression of the target sequence. Regions can be selected to design and synthesize suitable siRNAs and shRNAs with high specificity.
  • siRNA has the following conditions: (1) The 5'end of the antisense strand is A or U, RNA interference effect when (2) the 5'end of the sense strand is G or C and (3) 4 or more bases out of 7 bases at the 5'end of the antisense strand are A or U. Is known to be high. Therefore, the siRNA used in the present invention may have such a base sequence, but is not limited thereto. Similarly, the shRNA used in the present invention may, but is not limited to, produce such siRNA after intracellular processing. Determining valid siRNA and shRNA sequences for a target sequence can also be performed using a program available via the internet.
  • inhibition / inhibition of expression or knockdown refers to degradation of target mRNA or snoRNA, inhibition / inhibition of translation into a encoded protein. Inhibition increased the amount of target mRNA / snoRNA in cells or cell groups (pancreatic cancer tissue) by 20% or more, 30% or more, 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80, as compared with the control. Includes a reduction of% or more, or 90% or more. Inhibition / suppression or knockdown of expression may be determined by any method known in the art, for example, by a method based on RT-PCR.
  • the siRNA and shRNA may be composed of only natural (unmodified) nucleotides, but may be partially or completely modified.
  • the chemical stability of siRNA and shRNA can be increased by using any of the modifications known in the art. However, it is not desirable that the modification reduces the intended activity of siRNA and shRNA. For example, it is understood that no modifications are used that interfere with the intracellular processing of shRNA. Modifications as unnatural nucleotides can be sugar and / or base modifications.
  • Modifications of the sugar include, but are not limited to, bicyclic sugars, 5'-vinyl, 5'-methyl, 4'-S, 2'-F, 2'-OCH 3 (2'-OMe). ), And 2'-O (CH 2 ) 2 OCH 3 substituents and the like.
  • Bicyclic sugars are commonly referred to as crosslinked nucleic acids (Bridged Nucleic Acids, BNAs), such as, but not limited to, LNAs (Locked Nucleic Acids®), 2,4-BNA, ENA (ethylene).
  • Oxy (4- (CH 2 ) 2- O-2) BNA) and the like can be mentioned, or the sugar may contain deoxyribose in part instead of ribose, in which case one or one of siRNA or DNA and RNA may be mixed in both oligonucleotide strands or the oligonucleotide strand of shRNA.
  • siRNA is an RNA / RNA double strand
  • shRNA is preferably an RNA strand.
  • 2'-OMe modification can be preferably used as the sugar modification.
  • a base modification for example, but not limited to Cytosine 5-methylation, 5-fluorolation, 5-bromolation, 5-iodolation, N4-methylation, N6-methylation, 8-bromolation of adenine, N2-methylation, 8-bromolation of guanine, Examples thereof include 5-fluorolation, 5-bromoization, 5-iodolation and 5-hydroxylation of uracil.
  • siRNA and shRNA can have sugar and base modifications as described above.
  • SiRNAs and shRNAs can also contain modified nucleoside linkages.
  • Modified internucleoside bonds are those that exist in place of the naturally occurring phosphodiester bonds, such as phosphorothioate bonds, phosphorodithioate bonds, boranophosphate bonds, phosphorodiamidate bonds and phosphoramidate bonds. possible.
  • At least one of the nucleoside linkages of siRNA and shRNA can be a modified nucleoside linkage.
  • at least two, three, four, or more nucleoside linkages of siRNA and shRNA can be modified nucleoside linkages.
  • the modified internucleoside bond is preferably a phosphorothioate bond.
  • nucleotides in the same strand can independently undergo different modifications.
  • the same nucleotide can also have a modified nucleoside bond (eg, a phosphorothioate bond) and a modified sugar (eg, a bicyclic sugar).
  • the same nucleotide can also have a modified nucleobase (eg, 5-methylcytosine) and further have a modified sugar (eg, 2'-OMe modified, bicyclic sugar, etc.).
  • siRNA and shRNA of the present invention can be produced by a method known in the art.
  • siRNA and shRNA can be produced by synthesizing using a commercially available automatic nucleic acid synthesizer and then purifying using an ion exchange column, a reverse phase column, or the like.
  • siRNA and shRNA can be obtained by ordering from a manufacturer (for example, Gene Design Co., Ltd.) by specifying the nucleic acid base sequence and the modification site and type.
  • a labeled compound fluorescent protein, luciferase, etc.
  • a purification compound biotin, avidin, His tag peptide, GST tag peptide, FLAG tag peptide, etc.
  • the bond may be a direct bond or an indirect bond via another substance, but it is preferably a direct bond such as a covalent bond.
  • the antitumor agent of the present invention is, but is not limited to, 0.5 to 10 equivalents, preferably 1 to 5 equivalents, and more preferably 1 to 3 equivalents of a folic acid-cationic oligopeptide with respect to one siRNA or shRNA molecule. It can include a complex.
  • the combined use of siRNA or shRNA with a folic acid-cationic oligopeptide complex can significantly suppress tumor growth and infiltration of pancreatic cancer. Since the folic acid-cationic oligopeptide complex of the present invention exerts a sufficient effect only by adding a small amount of about 1 to 3 equivalents to siRNA or shRNA, it is expected to be an extremely useful therapeutic means for pancreatic cancer. Will be done.
  • the antitumor agent according to the present invention is not particularly limited as long as the active ingredient is delivered to the pancreatic cancer tissue as the target site, and may be, for example, an injection, a liquid, or a sustained-release agent.
  • Water is preferable as the solvent for these preparations, but it is preferable to use physiological saline, PBS, serum albumin solution or the like so that the preparation finally becomes an isotonic solution or a substantially isotonic solution.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition containing one or more of the antitumor agents of the present invention.
  • the target site of the antitumor agent according to the present invention may be not only the pancreas but also lymph nodes or other organs to which pancreatic cancer cells have metastasized.
  • an injection is preferable as the dosage form in order to more reliably deliver the active ingredient to the target site.
  • compositions are carriers, excipients, stabilizers, disintegrants, surfactants, binders, lubricants, emulsifiers, suspensions, antioxidants, odorants, fillings commonly used in the pharmaceutical field.
  • Agents, solubilizers, coatings, colorants, flavoring agents, preservatives, buffers and the like can be included.
  • the pharmaceutical composition can be orally or parenterally administered to the subject.
  • Parenteral administration includes, but is not limited to, subcutaneous, intravenous, intraperitoneal, intratumoral, etc. injection or injection, and administration during endoscopic or laparoscopic treatment.
  • the dose and frequency of administration of the pharmaceutical composition of the present invention may be appropriately adjusted according to each dosage form, the age, sex, body weight, severity of disease, etc. of the patient.
  • the pharmaceutical composition contains 0.001 mg / kg / day to 1 mg / kg / day, 0.005 mg / kg / day to 0.5 mg / kg / day, or 0.01 mg / kg body weight / day of siRNA or shRNA.
  • the amount of the folic acid-cationic oligopeptide complex can be determined to be ⁇ 0.1 mg / kg / day, and 0.5 to 10 equivalents can be determined and administered.
  • the pharmaceutical composition can be administered once or multiple times, eg, at intervals of 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, 1 week, 2 weeks, 3 weeks, 1 month, etc. Can be administered at.
  • Subjects to whom the pharmaceutical composition is administered can be mammals such as primates such as humans and monkeys, and non-primates such as cows, pigs, sheep, horses, cats, dogs, guinea pigs, rats and mice. More preferably, it is a human.
  • the subject may be, for example, a pancreatic cancer model animal transplanted with human pancreatic cancer cells, which can be used for evaluation of efficacy in humans.
  • the pancreatic cancer model animal is not particularly limited, but for example, a non-human animal transplanted with the cancer organoid described in JP-A-2018-10575 can be used.
  • the "organoid” is an organ three-dimensionally produced in vitro, and refers to an aggregate of cells specific to a specific organ. Organoids of various organs have already been produced in this field.
  • the "cancer organoid” described in JP-A-2018-110575 is an organoid that reproduces the microenvironment of cancer tissue.
  • the research group including the inventor of the present application has modified the method of JP-A-2018-10575 to create a human pancreatic cancer mouse model useful for determining the effect of a pancreatic cancer therapeutic agent (Japanese Patent Application No. 2020-). 078771), this mouse model can also be suitably used for evaluating the efficacy of the antitumor drug and pharmaceutical composition of the present invention on humans.
  • the present invention also includes siRNA or ThenRNA that can bind to and inhibit the expression of mRNA or snoRNA expressed in the above-mentioned pancreatic cancer cells, and the above-mentioned folic acid-cationic oligopeptide complex, and tumor growth / invasion of pancreatic cancer. -Provide a combination preparation for suppressing metastasis.
  • the siRNA or shRNA and the folic acid-cationic oligopeptide complex are not covalently linked and are not mechanism-constrained, but are the main components of the siRNA or shRNA. It is intended that the folic acid-cationic oligopeptide complex is partially inserted into the groove to stabilize the siRNA or shRNA.
  • the siRNA or shRNA and the folic acid-cationic oligopeptide complex do not have to be contained in the same composition in advance. That is, a preparation containing siRNA or shRNA and a preparation containing a folic acid-cationic oligopeptide complex may be prepared separately and combined prior to administration.
  • the above two preparations can be administered separately.
  • these two formulations are not administered at different times or on different routes of administration, but simultaneously (or sequentially). It is preferable to administer the drug by the same route of administration.
  • the present invention also comprises a siRNA or shRNA capable of binding to and inhibiting the expression of mRNA or snoRNA expressed in the above-mentioned pancreatic cancer cells and the above-mentioned folic acid-cationic oligopeptide complex, and a medicament for the treatment of pancreatic cancer.
  • a kit can include siRNA or shRNA and a folic acid-cationic oligopeptide complex, as well as instructions for other drugs, carriers, administration methods, etc. that can be administered simultaneously or are suitable for administration.
  • Example 1 Synthesis of folic acid-cationic oligopeptide complex
  • a folic acid-cationic oligopeptide complex was synthesized as shown below.
  • the reagents and analyzers used in this example are as shown below.
  • the Fmoc amino acid derivative and the resin as the peptide solid phase synthesis carrier were purchased from Watanabe Chemical Industry Co., Ltd., and folic acid was purchased from Tokyo Kasei Co., Ltd. and used as they were.
  • Each peptide chain was synthesized using Fmoc-NH-SAL-PEG resin as a solid-phase carrier using the Fmoc solid-phase synthesis method.
  • Fmoc-AA-OH reagent Fmoc-Dab (Boc) -OH, Fmoc-Gly-OH, and Fmoc-Tyr (t-Bu) -OH were used.
  • Step 1 Coupling operation>
  • an octamer of L-2,4-diaminobutyric acid (Dab8) was synthesized by Fmoc solid-phase synthesis.
  • a solid-phase carrier was added to PetiSizer (Hypep Research Institute) so that the introduced amino group became 13 ⁇ mol, washed 5 times with 1.3 mL of dimethylformamide (DMF), and then 1.3 mL of DMF was added to 1 The carrier was allowed to stand for more than an hour to swell the carrier.
  • DMF dimethylformamide
  • Step 2 Deprotection / resin removal and purification>
  • the resin was washed 5 times each with DMF and CHCl 3 , and dried under reduced pressure in a desiccator.
  • the resulting resin at room temperature with trifluoroacetic acid (TFA) - triisobutyl pyromellitic pills silane -H 2 O mixed solvent (96.5 / 1.0 / 2.5, v / v / v) in 1 hour 30 minutes Stirring was performed to remove protection and resin.
  • TFA trifluoroacetic acid
  • silane -H 2 O mixed solvent 96.5 / 1.0 / 2.5, v / v / v
  • Stirring was performed to remove protection and resin.
  • the resin was removed by filtration, the solvent was vaporized under an argon air stream, and then Et 2 O was added to precipitate the peptide.
  • the Et 2 O was vaporized argon stream, the crude product - was obtained (folate cationic oligopeptide).
  • the obtained crude product was dissolved in 1 mL of Otsuka distilled water (manufactured by Otsuka Pharmaceutical Factory) and then purified by reverse phase HPLC using the following conditions.
  • FIG. 1 shows the results of HPLC analysis of the crude product of Fol-Dab8. Due to the fact that folic acid contains two carboxy groups, folic acid-introduced Dab8 (described as Fol-Dab8) was eluted in two peaks. In the HPLC analysis, the one eluted first was designated as Fol-Dab8A, and the one eluted thereafter was designated as Fol-Dab8B. Each chemical structural formula is shown below.
  • the solution separated by HPLC was lyophilized to obtain a yellow powder.
  • Purified Fol-Dab8A or Fol-Dab8B is dissolved in Otsuka distilled water, the molar extinction coefficient of folic acid is calculated in advance (molar extinction coefficient at wavelength 368 nm: 7967 L / mol ⁇ cm), and the yield is calculated from the UV absorption of folic acid. did.
  • DAb8 is after synthesizing the NH 2 -GGG-dAb8 on a solid support, N end performs a coupling operation of tyrosine protected with an acetyl group, purified by HPLC after the operation of the ⁇ Step 2> As a result, it was obtained as a white powder, and the yield was calculated from the UV absorption of Tyrosine.
  • ESI-MS mass spectrometry
  • Example 2 Melting temperature (Tm) analysis
  • Tm Melting temperature
  • a cationic oligopeptide (Dab8) or a folic acid-cationic oligopeptide (Fol-Dab8A or Fol-Dab8B) is added to the annealed RNA double strand, and the melting temperature (Tm value) is measured.
  • Tm value melting temperature
  • an oligonucleotide pair consisting of the following sequences was used as the siRNA. 5'-r (GUCAUCACACUGAAUACCA) dTdT-3'(SEQ ID NO: 1)
  • 5'-r (UGGUAUUCAGUGUGAUGAC) dTdT-3'(SEQ ID NO: 2)
  • 144 ⁇ L of a 50 ⁇ M nucleic acid aqueous solution was prepared, kept at 95 ° C. for 5 minutes, and then slowly cooled to 4 ° C. at ⁇ 0.5 ° C./min. This is added to a mixed solution of a pH 7.0 buffer containing 200 mM NaCl, 20 mM Na 2 HPO 4- NaH 2 PO 4 , Otsuka distilled water, and a 0.1 mM peptide aqueous solution, and the final concentration is 10 mM Na 2 HPO 4- NaH 2 Samples were adjusted to PO 4 , 100 mM NaCl, 4 ⁇ M nucleic acid double chain, 0, 4, 8, 12, 16, 20 ⁇ M peptides (0, 1, 2, 3, 4, 5 equivalents, respectively).
  • the temperature was raised from 20 ° C. to 95 ° C. at 0.5 ° C./min, the absorbance at 260 nm was measured, and the melting curve was obtained.
  • the absorbance at 320 nm was measured to remove background noise, a melting curve was created by subtracting the absorbance at 320 nm from the absorbance at 260 nm, and the Tm value was determined by the median method.
  • RNA-degrading enzyme resistance test of the nucleic acid duplex was performed in the presence of a cationic oligopeptide.
  • peptides were added to the annealed RNA duplex to form a complex, and the rate of RNA degradation was measured.
  • -FAM-r (GUCAUCACACUGAAUACCA) dTdT-3', SEQ ID NO: 1) aqueous solution, 0.1 mM Dabcyl-modified single-stranded RNA with a quenching group at the 3'end (5'-r (UGGUAUUCAGUGUGAUGAC) dTdT-dabcyl- 3', SEQ ID NO: 2)
  • Aqueous solutions were mixed in equal amounts to prepare the final concentrations of 10 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, and 10 ⁇ M siRNA. Subsequently, the mixture was kept at 95 ° C. for 5 minutes and then slowly cooled to 4 ° C. at ⁇ 0.5 ° C./min.
  • 10 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 10 ⁇ M siRNA aqueous solution, and 0.1 mM cationic oligopeptide aqueous solution are added to the quartz cell, and the final concentration is 10 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 10 nM siRNA, 0, 10, 20, 30 nM peptide ( The volume was adjusted to 0, 1, 2, and 3 equivalents, respectively) to 3 mL.
  • bovine pancreas-derived RNase A manufactured by Roche was added with stirring at 37 ° C., and the measurement of fluorescence intensity was started to track the change with time (excitation wavelength: 490 nm; measurement wavelength: 520 nm; measurement). Time: 60 minutes).
  • RNA duplex When the RNA duplex is dissociated, the fluorescence intensity increases because the distance between the fluorescent group and the quenching group increases. Therefore, when 1 equivalent or more of any of Dab8, Fol-Dab8A, and Fol-Dab8B is added, the fluorescence intensity becomes high. The rate of increase was slower, suggesting that Fol-Dab8A and B, like Dab8, improved the resistance of RNA duplexes to degrading enzymes.
  • Pancreatic cancer cell line S2-013 (Medical Cell Resource Center, Cell Bank, Institute of Aging Medicine, Tohoku University, ID: TKG0709) was seeded in a 4-well chamber slide (Thermo Fisher Scientific) at a cell density of 2 x 10 4 cells / well. Then, Dab8, Fol-Dab8A, and Fol-Dab8B were added to the scrambled control siRNA (SEQ ID NOs: 3 and 4) labeled with Alexa647 (Thermo Fisher Scientific) in an amount of 1 to 3 equivalents and cultured for 48 hours.
  • the concentration of siRNA was 8.28 ⁇ g / mL, and 25 ⁇ L was used, and the concentration of Dab8, Fol-Dab8A, and Fol-Dab8B was undiluted solution (Dab8: 119.3 ⁇ g / mL, Fol-Dab8A, Fol-Dab8B: 141.2 ⁇ g / mL).
  • the amounts corresponding to 1, 2, and 3 equivalents with respect to siRNA are 3.9 ⁇ L, 7.8 ⁇ L, and 11.7 ⁇ L, respectively.
  • the hybrid cell count function of the keyence analysis software BZ-X800 Analyzer was used to count the cells into which siRNA was taken up in the presence of Dab8, Fol-Dab8A, and Fol-Dab8B. For the judgment, one-third or more of the cell nuclei were deeply dyed and one with a dark lump around the cell nucleus was measured.
  • Example 5 Knockdown effect by folic acid-cationic peptide-added siRNA
  • Table 2 shows the siRNA sequences used in this example. As each siRNA, the one in which the sense strand and the antisense strand shown in Table 2 were double-stranded was used as is usually performed in the art.
  • 6-well plate (Thermo Fisher Scientific) S2-013 cells were added to the culture medium (1.0 ⁇ 10 5 cells / well), and the cells were collected after 48 hours. A semi-quantitative RT-PCR method was performed using the RNA of the recovered cells, and the knockdown effect of SNORA18, NUP85, WASF2, and SNORA22 on the cells was confirmed.
  • RNA obtained from S2-013 cells was reverse transcribed using StrataScript reverse transcriptase (Agilent) and random primers. Appropriate dilutions of each single-stranded cDNA were prepared for subsequent PCR amplification. GAPDH mRNA was used as an internal quantitative control.
  • the primer sequences used to amplify SNORA18, NUP85, WASF2 and SNORA22 are listed in Table 3 below.
  • the PCR reaction is performed on the TakaRa PCR Thermal Cycler Dice Gradient at 94 ° C for 2 minutes of initial denaturation, followed by 94 ° C for 30 seconds, 58 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 1 minute for 21 cycles (for GAPDH) or 25. It was performed in cycles (for SNORA18, NUP85, WASF2 and SNORA22). Scanning and densitometry analysis for band intensity measurements was performed using the Quantity One analysis system (Bio-Rad).
  • Example 6 Folic acid-cationic oligopeptide complex + effect of inhibiting cell infiltration by siRNA.
  • Each of the scrambled control siRNA, SNORA18 siRNA, NUP85 siRNA, WASF2 siRNA, and SNORA22 siRNA (all used in Example 5) to which the folic acid-cationic oligopeptide complex was added was added to the culture medium of S2-013 cells. A Matrigel infiltration assay was performed 48 hours later.
  • Figures 4B, 5B, 6B, and 7B show the upper part of an assay in which a scrambled control siRNA or any of SNORA18 siRNA, NUP85 siRNA, WASF2 siRNA, and SNORA22 siRNA was added to cells with a folic acid-cationic oligopeptide complex. The number of cells that have moved from the chamber to the lower chamber is shown. “*” Indicates that there was a significant difference in P ⁇ 0.05 with respect to the control in the t-test.
  • siRNA added to the culture medium of cultured cells in combination with the folic acid-cationic oligopeptide complex is taken up into S2-013 cells and inhibits the expression of snoRNA and mRNA involved in cell infiltration. I was able to confirm that it was there.
  • Example 7 Effect on chemically modified siRNA Chemically modified siRNAs were prepared to enhance stability and the effects of the folic acid-cationic oligopeptide complex were investigated. Table 4 shows the sequences of the sense strand and antisense strand of siRNA used in this example. Each contains a chemically modified base and contains a phosphorothioate bond at the 3'end.
  • SiRNA (2.5 ⁇ g / mL) labeled with Alexa488 (Thermo Fisher Scientific) in the culture medium (2 ⁇ 10 4 cells / well) of the pancreatic cancer cell line S2-013 in culture, and 1, 2, 3 equivalents of Dab8, Fol-Dab8A, Fol-Dab8B were added.
  • a Matrigel infiltration assay was performed.
  • the number of cells transferred from the upper chamber to the lower chamber is shown. “*” Indicates that there was a significant difference in P ⁇ 0.05 with respect to the control in the t-test.
  • Example 8 Confirmation of uptake of chemically modified siRNA into pancreatic cancer cells 1
  • the chemically modified SNORA22 siRNA (SEQ ID NOs: 27 and 28) prepared in Example 7 was labeled with Alexa488 (Thermo Fisher Scientific) and together with the folic acid-cationic oligopeptide complex (Fol-Dab8B, 2 equivalents) in a 4-well chamber (2 equivalents).
  • Alexa488 Thermo Fisher Scientific
  • folic acid-cationic oligopeptide complex Fol-Dab8B, 2 equivalents
  • Folic acid receptor (FOLR1) and siRNA (Alexa488) were observed.
  • FIG. 10 shows the introduction efficiency (%) of SNORA22 siRNA into S2-013 pancreatic cancer cells and HPNE normal pancreatic duct epithelial cells in the coexistence of a folic acid-cationic oligopeptide complex (Fol-Dab8B, 2 equivalents).
  • the uptake of SNORA22 siRNA into S2-013 pancreatic cancer cells showed a value nearly three times that of normal cells.
  • Alexa488-labeled chemically modified SNORA22 siRNA SEQ ID NOs: 27 and 28
  • folic acid-cationic oligopeptide complex Fol-Dab8A or Fol-Dab8B, 2 eq
  • S2 in a 4-well chamber
  • -013 Pancreatic cancer cells were added to the culture medium (2 ⁇ 10 4 cells / well) and incubated overnight, and staining of lysosomes (stained with LysoTracker, Thermo Fisher Scientific) and siRNA (Alexa488) was observed.
  • Chemically modified SNORA22 siRNA (SEQ ID NOs: 11 and 12) or chemically modified SNORA22 siRNA (SEQ ID NOs: 27 and 28) and a cationic oligopeptide (Dab8) or a folic acid-cationic oligopeptide complex (Fol-Dab8A or After mixing with Fol-Dab8B) and allowing to stand at room temperature for 15 minutes, 1 ⁇ L was added to PBS or 10% FCS / PBS and mixed (final 20 ⁇ M). As a control, each SNORA22 siRNA was added alone.
  • a human pancreatic cancer organoid was prepared using S2-013 pancreatic cancer cells by modifying the method described in JP-A-2018-10575. Specifically, S2-013 pancreatic cancer cells (20 ⁇ 10 4 ), human mesenchymal stem cells MSC (LONZA, 40 ⁇ 10 4 ), and human umbilical vein endothelial cells HUVEC (LONZA, 14 ⁇ 10 4 ). was added to the DMEM / Matrigel mixed solution in a 48-well plate (Thermo Fisher Scientific) and incubated in a CO 2 incubator at 37 ° C. for 30 minutes. Then, 300 ⁇ L / well of DMEM / EGM mixed solution was added, and the mixture was incubated again at 37 ° C. for 24 hours to prepare one pancreatic cancer organoid in each well.
  • S2-013 pancreatic cancer cells (20 ⁇ 10 4 ), human mesenchymal stem cells MSC (LONZA, 40 ⁇ 10 4 ), and human umbilical vein end
  • the chemically modified SNORA22 siRNA (SEQ ID NOs: 27 and 28, 5 ⁇ g) labeled with Alexa-594 was added to the cationic oligopeptide (Dab8) or the folic acid-cationic oligopeptide complex (Fol-Dab8A or Fol).
  • -Dab8B was administered by tail vein injection with 1 eq, 2 eq or 3 eq. Twenty-four hours later, the image was taken in vivo imager.
  • Measuring equipment Spectrum In vivo Imaging System (PerkinElmer, Waltham, MA) Measurement conditions: kexc 640nm, kemi 680nm
  • Example 12 Confirmation of antitumor effect
  • SNORA22 siRNA SEQ ID NOs: 27 and 28, 5 ⁇ g
  • a cationic oligopeptide Dab8
  • a folic acid-cationic oligopeptide complex Fol-Dab8B, 2 equivalents
  • scrambled control siRNAs SEQ ID NOs: 3 and 4
  • were administered with the folic acid-cationic oligopeptide complex Fol-Dab8B, 2 eq).
  • the non-administered control group Control
  • the scrambled control siRNA-administered group Scr-Fol-Dab8B
  • the cationic oligo Significant tumor growth inhibitory effect after 8 weeks in the group (SNORA22-Fol-Dab8B) in which SNORA22 siRNA was administered with the folic acid-cationic oligopeptide complex as compared with the group administered with the peptide (SNORA22-Dab8).
  • Example 13 In vivo uptake of siRNA 2
  • Example 14 In vivo uptake of siRNA 3
  • a folic acid-cationic oligopeptide complex Fol-Dab8A or Fol-Dab8B
  • the present invention provides a therapeutic means capable of effectively suppressing tumor growth, invasion and metastasis of pancreatic cancer, which is said to have the worst prognosis among cancers.
  • the antitumor agent of the present application is effectively delivered specifically to pancreatic cancer cells, and when combined with other anticancer agents and / or anticancer treatments, the therapeutic effect of pancreatic cancer can be dramatically enhanced. All publications, patents and patent applications cited herein are incorporated herein by reference in their entirety.

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Abstract

膵癌細胞特異的にｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを送達し、膵癌の腫瘍増大、浸潤及び転移を抑制し得る新規な抗腫瘍剤の提供。　本発明は、葉酸－カチオン性オリゴペプチド複合体からなる、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを細胞内に送達するための核酸送達促進剤を提供する。本発明はまた、膵癌細胞で発現するｍＲＮＡ又はｓｎｏＲＮＡに結合してその発現を阻害し得るｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡと、葉酸－カチオン性オリゴペプチド複合体とを含む、抗腫瘍剤を提供する。ｓｉＲＮＡは、例えばＳＮＯＲＡ１８ ｓｎｏＲＮＡ、ＮＵＰ８５ ｍＲＮＡ、ＷＡＳＦ２ ｍＲＮＡ、及びＳＮＯＲＡ２２ ｓｎｏＲＮＡからなる群より選択されるＲＮＡに結合し得るものである。

Description

核酸送達促進剤
　本発明は、ｓｉＲＮＡ等の核酸分子を細胞内に送達するための核酸送達促進剤に関する。本発明はまた、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用して疾患の治療等に用いることができる薬剤に関する。特に、本発明は、膵癌に対して抗腫瘍効果を有し、膵癌の腫瘍増大・浸潤・転移を有効に抑制できる核酸製剤及びこれを含有する医薬組成物に関する。
　膵癌は、癌の中で最も予後が悪いと言われている。その原因としては、膵臓が後腹膜臓器であるために早期発見が困難であることに加え、膵癌細胞の運動性が極めて高いため、腹膜浸潤や血管・消化管・神経等に転移をする傾向が強いことがある。
　本発明者等はこれまで、膵癌の浸潤及び転移のメカニズムを検討する中で、通常は核小体で見出され、インスリン様成長因子ＩＩのｍＲＮＡの５’非翻訳領域に結合してインスリン様成長因子ＩＩの翻訳を阻害することが知られているインスリン様成長因子２ｍＲＮＡ結合タンパク質３（Ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　２　ｍＲＮＡ－Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　３、ＩＧＦ２ＢＰ３）が、膵癌細胞では細胞膜突起中に存在し、このＩＧＦ２ＢＰ３に様々なｍＲＮＡが結合し、細胞膜突起中に集積していることを見出している。そして、これらのｍＲＮＡをＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により阻害することで、膵癌細胞の浸潤及び転移が有効に抑制されることを報告している（特許文献１）。
　近年新たな治療薬として注目されているＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用した核酸医薬において代表的なものであるｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）は、一般的に２１～２３塩基対からなる低分子二本鎖ＲＮＡである。しかしながら、ｓｉＲＮＡはその構造からアニオン性が高く、細胞膜透過性が低いために細胞内への送達という点で課題を有するものであった。この課題に対し、本発明者等は先に、ｓｉＲＮＡ－葉酸－ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－キトサンオリゴ糖乳酸（ＣＯＬ）ナノ粒子複合体を作製し、このナノ粒子によるｓｉＲＮＡの細胞への取り込みの促進効果を確認している。そして、膵癌細胞に取り込まれたＩＧＦ２ＢＰ３結合能を有するｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡが、膵癌の浸潤及び転移を抑制することも報告している（非特許文献１）。
　一方、本発明者等は、側鎖にアミノ基又はグアニジノ基を有するカチオン性オリゴペプチドが、二重鎖ＲＮＡの細胞内への送達に有用であることを見出している（特許文献２、非特許文献２）。また、ＲＮＡｉ分子の送達のために、ビタミンＥとカチオン性の糖とを含む複合体の利用についても検討している（非特許文献３及び４）。
国際公開ＷＯ２０１６／００２８４４号 国際公開ＷＯ２０１４／１４８６２０号
Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，２０１９，Ｖｏｌ.１０，Ｎｏ．３０, ｐｐ.２８６９－２８８６ Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２１（２０１３）１７１７－１７２３ Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２２（２０１４）１３９４－１４０３ Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２５（２０１５）８１５－８１９
　上記の通り、核酸医薬としてのｓｉＲＮＡ等のＲＮＡｉ分子の細胞への送達は、核酸医薬の実用性を高めるうえで非常に重要な課題である。単に送達するのみならず、標的となる細胞に特異的に送達されること、細胞内に取り込まれた後の核酸医薬の効果を阻害しないこと等、達すべき課題は数多く残されている。
　上記の課題に鑑み検討を重ねた結果、本発明者等は、葉酸とカチオン性オリゴペプチドとの複合体を用いることで、葉酸受容体を有する細胞内にｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡを特異的に送達できることを見出した。また、この手法を用いて、膵癌細胞を標的とし、効果的にｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを標的とする膵癌細胞に取り込ませ、特定のＲＮＡの発現をノックダウンすることによって、膵癌に対して腫瘍の増大、浸潤及び転移を抑制し得る新たな治療戦略を見出し、本発明を完成するに到った。
　すなわち、本発明は以下を提供するものである。
１．　葉酸－カチオン性オリゴペプチド複合体からなる、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡの送達促進剤であって、カチオン性オリゴペプチドが、下記式（Ｉ）のアミノ酸残基が少なくとも２個連続する部分を含み、下記式（Ｉ）のアミノ酸残基の連続する部分以外は連続しない１個の他のアミノ酸残基である、８～４０個のアミノ酸からなるカチオン性オリゴペプチド部位を含む、上記送達促進剤。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 ［式（Ｉ）において、Ｒ１は、基Ｈ３Ｎ＋－ＣＨ２－、又は、式（II）で示される基であり、Ｒ２は、Ｒ１が基Ｈ３Ｎ＋－ＣＨ２－の場合は、存在しない、若しくは、炭素原子数１～３のアルキレン基であり、Ｒ１が式（II）で示される基の場合は炭素原子数１～４のアルキレン基である。一つのカチオン性オリゴペプチドにおいてＲ１及びＲ２は全て同一である。］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 ［式（II）中、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、同一又は異なって、水素原子若しくはメチル基である。］
２．　カチオン性オリゴペプチド部位が、８～１２個のアミノ酸からなる、上記１記載の送達促進剤。
３．　カチオン性オリゴペプチド部位が、Ｌ－２，３－ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）、Ｌ－２，４－ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）、Ｌ－オルニチン（Ｏｒｎ）、Ｌ－リジン（Ｌｙｓ）、Ｌ－２－アミノ－３－グアニジノプロピオン酸（Ａｇｐ）、Ｌ－２－アミノ－４－グアニジノ酪酸（Ａｇｂ）、又はＬ－アルギニン（Ａｒｇ）のホモ多量体である、上記１又は２記載の送達促進剤。
４．　カチオン性オリゴペプチドが、下記の構造を有するジアミノ酪酸の８量体を部分構造として有する、上記１～３いずれか記載の送達促進剤。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
５．　葉酸が、カチオン性オリゴペプチドのＮ末端、Ｃ末端若しくは側鎖にリンカーを介して又は介さずに連結されている、上記１～４のいずれか記載の送達促進剤。
６．　葉酸－カチオン性オリゴペプチド複合体が、リンカーを介して連結されており、リンカーがペプチドリンカーである、上記５記載の送達促進剤。
７．　ペプチドリンカーが、１～４個のグリシン残基からなるペプチドである、上記６記載の送達促進剤。
８．　葉酸－カチオン性オリゴペプチド複合体が、下記の構造を有するＦｏｌ－Ｄａｂ８Ａ及び／又はＦｏｌ－Ｄａｂ８Ｂである、上記４記載の送達促進剤。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
９．　膵癌細胞で発現するｍＲＮＡ又はｓｎｏＲＮＡに結合してその発現を阻害し得るｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡと、上記１～８のいずれか記載の送達促進剤とを含む、抗腫瘍剤。
１０．　膵癌細胞で発現するｍＲＮＡ又はｓｎｏＲＮＡが、インスリン様成長因子２ｍＲＮＡ結合タンパク質３（ＩＧＦ２ＢＰ３）に結合するものである、上記９記載の抗腫瘍剤。
１１．　膵癌細胞で発現するｍＲＮＡ又はｓｎｏＲＮＡが、ＳＮＯＲＡ１８ ｓｎｏＲＮＡ、ＮＵＰ８５ ｍＲＮＡ、ＷＡＳＦ２ ｍＲＮＡ、及びＳＮＯＲＡ２２ ｓｎｏＲＮＡからなる群より選択される、上記９又は１０記載の抗腫瘍剤。
１２．　ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡに対して０．５～１０当量の葉酸－カチオン性オリゴペプチド複合体を含む、上記９～１１のいずれか記載の抗腫瘍剤。
１３．　ｓｉＲＮＡが、ＲＮＡ／ＲＮＡ二本鎖である、上記９～１２のいずれか記載の抗腫瘍剤。
１４．　ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡが、修飾された塩基、修飾された糖、及び／又は改変されたヌクレオシド結合を含む、上記９～１３のいずれか記載の抗腫瘍剤。
１５．上記修飾された糖の修飾が２’－ＯＭｅ修飾である、上記１４記載の抗腫瘍剤。
１６．上記改変されたヌクレオシド結合が、ホスホロチオエート結合である、上記１４又は１５記載の抗腫瘍剤。
１７．　上記９～１６のいずれか記載の抗腫瘍剤を含有する医薬組成物。
１８．　以下：
（ａ）膵癌細胞で発現するｍＲＮＡ又はｓｎｏＲＮＡに結合してその発現を阻害し得るｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを含む製剤、及び
（ｂ）下記式（Ｉ）のアミノ酸残基が少なくとも２個連続する部分を含み、下記式（Ｉ）のアミノ酸残基の連続する部分以外は連続しない１個の他のアミノ酸残基である、８～４０個のアミノ酸からなるカチオン性オリゴペプチド部位を含む、葉酸－カチオン性オリゴペプチド複合体を含む製剤：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
 ［式（Ｉ）において、Ｒ１は、基Ｈ３Ｎ＋－ＣＨ２－、又は、式（II）で示される基であり、Ｒ２は、Ｒ１が基Ｈ３Ｎ＋－ＣＨ２－の場合は、存在しない、若しくは、炭素原子数１～３のアルキレン基であり、Ｒ１が式（II）で示される基の場合は炭素原子数１～４のアルキレン基である。一つのカチオン性オリゴペプチドにおいてＲ１及びＲ２は全て同一である。］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
 ［式（II）中、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、同一又は異なって、水素原子若しくはメチル基である。］
を含む、組合せ製剤。
１９．　以下：
（ａ）膵癌細胞で発現するｍＲＮＡ又はｓｎｏＲＮＡに結合してその発現を阻害し得るｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ、及び
（ｂ）下記式（Ｉ）のアミノ酸残基が少なくとも２個連続する部分を含み、下記式（Ｉ）のアミノ酸残基の連続する部分以外は連続しない１個の他のアミノ酸残基である、８～４０個のアミノ酸からなるカチオン性オリゴペプチド部位を含む、葉酸－カチオン性オリゴペプチド複合体：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
 ［式（Ｉ）において、Ｒ１は、基Ｈ３Ｎ＋－ＣＨ２－、又は、式（II）で示される基であり、Ｒ２は、Ｒ１が基Ｈ３Ｎ＋－ＣＨ２－の場合は、存在しない、若しくは、炭素原子数１～３のアルキレン基であり、Ｒ１が式（II）で示される基の場合は炭素原子数１～４のアルキレン基である。一つのカチオン性オリゴペプチドにおいてＲ１及びＲ２は全て同一である。］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
 ［式（II）中、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、同一又は異なって、水素原子若しくはメチル基である。］
を含む、膵癌治療のための医薬キット。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2019-194646号の開示内容を包含する。
　本発明により、膵癌細胞特異的にｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを効果的に送達し、膵癌の腫瘍増大、浸潤及び転移を抑制し得る核酸製剤が提供される。
Ｆｏｌ-Ｄａｂ８Ａ及びＦｏｌ－Ｄａｂ８Ｂを含む粗生成物のＨＰＬＣ解析結果を示す。 ｓｉＲＮＡのＲＮａｓｅ Ａ耐性に対する１～３当量のＤａｂ８、Ｆｏｌ－Ｄａｂ８Ａ及びＦｏｌ－Ｄａｂ８Ｂの影響を蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）による蛍光強度変化によって示す。 Ａ：Ａｌｅｘａ４８８で標識したｓｉＲＮＡの葉酸－カチオン性オリゴペプチド複合体存在下におけるＳ２－０１３膵癌細胞への取り込みを示す共焦点顕微鏡画像を示す。Ｂ：Ａｌｅｘａ４８８で標識したｓｉＲＮＡの葉酸－カチオン性オリゴペプチド複合体非存在下におけるＳ２－０１３膵癌細胞への取り込みを示す共焦点顕微鏡画像を示す。Ｃ：カチオン性オリゴペプチド又は葉酸－カチオン性オリゴペプチド複合体存在下でのＳ２－０１３膵癌細胞へのｓｉＲＮＡの取り込み効率を示す。結果は平均及び標準誤差を示す。Ｄａｂ８－１はカチオン性オリゴペプチドＤａｂ８を１当量で添加したことを示し、Ｆｏｌ－Ｄａｂ８Ｂ－３は葉酸－カチオン性オリゴペプチド複合体Ｄａｂ８Ｂを３当量で添加したことを示す。 Ａ：スクランブル対照ｓｉＲＮＡ又はＳＮＯＲＡ１８ ｓｉＲＮＡと、カチオン性オリゴペプチド又は葉酸－カチオン性オリゴペプチド複合体の併用によるＳＮＯＲＡ１８の発現抑制効果を示す。データはＲＴ－ＰＣＲで増幅されたバンドについて、対照ｓｉＲＮＡとＤａｂ８との組み合わせにおけるバンド強度を１とした相対強度で示す。Ｂ：スクランブル対照ｓｉＲＮＡ又はＳＮＯＲＡ１８ ｓｉＲＮＡと葉酸－カチオン性ペプチド複合体（Ｆｏｌ－Ｄａｂ８Ａ及びＦｏｌ－Ｄａｂ８Ｂ）の併用によるマトリゲルアッセイでの浸潤細胞数を示す。 Ａ：スクランブル対照ｓｉＲＮＡ又はＮＵＰ８５ ｓｉＲＮＡと、カチオン性オリゴペプチド又は葉酸－カチオン性オリゴペプチド複合体の併用によるＮＵＰ８５の発現抑制効果を示す。データはＲＴ－ＰＣＲで増幅されたバンドについて、対照ｓｉＲＮＡとＤａｂ８との組み合わせにおけるバンド強度を１とした相対強度で示す。Ｂ：スクランブル対照ｓｉＲＮＡ又はＮＵＰ８５ ｓｉＲＮＡと葉酸－カチオン性ペプチド複合体（Ｆｏｌ－Ｄａｂ８Ａ及びＦｏｌ－Ｄａｂ８Ｂ）の併用によるマトリゲルアッセイでの浸潤細胞数を示す。 Ａ：スクランブル対照ｓｉＲＮＡ又はＷＡＳＦ２ ｓｉＲＮＡと、カチオン性オリゴペプチド又は葉酸－カチオン性オリゴペプチド複合体の併用によるＷＡＳＦ２の発現抑制効果を示す。データはＲＴ－ＰＣＲで増幅されたバンドについて、対照ｓｉＲＮＡとＤａｂ８との組み合わせにおけるバンド強度を１とした相対強度で示す。Ｂ：スクランブル対照ｓｉＲＮＡ又はＷＡＳＦ２ ｓｉＲＮＡと葉酸－カチオン性ペプチド複合体（Ｆｏｌ－Ｄａｂ８Ａ及びＦｏｌ－Ｄａｂ８Ｂ）の併用によるマトリゲルアッセイでの浸潤細胞数を示す。 Ａ：スクランブル対照ｓｉＲＮＡ又はＳＮＯＲＡ２２ ｓｉＲＮＡと、カチオン性オリゴペプチド又は葉酸－カチオン性オリゴペプチド複合体の併用によるＳＮＯＲＡ２２の発現抑制効果を示す。データはＲＴ－ＰＣＲで増幅されたバンドについて、対照ｓｉＲＮＡとＤａｂ８との組み合わせにおけるバンド強度を１とした相対強度で示す。Ｂ：スクランブル対照ｓｉＲＮＡ又はＳＮＯＲＡ２２ ｓｉＲＮＡと葉酸－カチオン性ペプチド複合体（Ｆｏｌ－Ｄａｂ８Ａ及びＦｏｌ－Ｄａｂ８Ｂ）の併用によるマトリゲルアッセイでの浸潤細胞数を示す。 スクランブル対照ｓｉＲＮＡ（Ａ）、ＳＮＯＲＡ１８ ｓｉＲＮＡ（Ｂ）、ＮＵＰ８５ ｓｉＲＮＡ（Ｃ）、ＷＡＳＦ２ ｓｉＲＮＡ（Ｄ）、又はＳＮＯＲＡ２２ ｓｉＲＮＡ（Ｅ）と、カチオン性オリゴペプチド（Ｄａｂ８）又は葉酸－カチオン性ペプチド複合体（Ｆｏｌ－Ｄａｂ８Ａ及びＦｏｌ－Ｄａｂ８Ｂ）の併用によるマトリゲルアッセイでの浸潤細胞数を示す。 Ａｌｅｘａ４８８で標識したＳＮＯＲＡ２２　ｓｉＲＮＡと葉酸－カチオン性オリゴペプチド複合体（Ｆｏｌ－Ｄａｂ８Ｂ、２当量）を培養液中に添加して一晩インキュベートしたＳ２－０１３膵癌細胞（Ａ）およびＨＰＮＥ正常膵管上皮細胞（Ｂ）における葉酸レセプター（ＦＯＬＲ１）及びＳＮＯＲＡ２２　ｓｉＲＮＡの染色を示す共焦点顕微鏡画像である。 葉酸－カチオン性オリゴペプチド複合体（Ｆｏｌ－Ｄａｂ８Ｂ、２当量）共存下でのＳ２－０１３膵癌細胞及びＨＰＮＥ正常膵管上皮細胞へのＳＮＯＲＡ２２　ｓｉＲＮＡの導入効率（％）を示す。結果は平均及び標準誤差を示す。＊はP<0.05で有意差があることを示す。 Ａｌｅｘａ４８８で標識したＳＮＯＲＡ２２　ｓｉＲＮＡと葉酸－カチオン性オリゴペプチド複合体（Ｆｏｌ－Ｄａｂ８Ａ（Ａ）又はＦｏｌ－Ｄａｂ８Ｂ（Ｂ）、２当量）を培養液中に添加して一晩インキュベートしたＳ２－０１３膵癌細胞におけるリソソーム（ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ）及びＳＮＯＲＡ２２　ｓｉＲＮＡの染色を示す共焦点顕微鏡画像である。Ｍｅｒｇｅ／ＤＡＰＩはＡｌｅｘａ４８８染色とＤＡＰＩ染色を合わせた画像である。 化学修飾されていないＳＮＯＲＡ２２　ｓｉＲＮＡ（Ａ）又は化学修飾ＳＮＯＲＡ２２　ｓｉＲＮＡ（Ｂ）と、カチオン性オリゴペプチド（Ｄａｂ８）又は葉酸－カチオン性オリゴペプチド複合体（Ｆｏｌ－Ｄａｂ８Ａ若しくはＦｏｌ－Ｄａｂ８Ｂ）と混合して血清（10％ ＦＣＳ／ＰＢＳ）に添加した直後（０）、３時間後（３）又は６時間後（６）後のｓｉＲＮＡの安定性を非還元ゲルを用いたＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果で示す。－：ＦＣＳなし（ＰＢＳのみ）、対照：各ＳＮＯＲＡ２２　ｓｉＲＮＡを単独で添加。 Ｓ２－０１３膵癌細胞由来ヒト膵癌オルガノイドを担持するマウスの膵癌組織への化学修飾ＳＮＯＲＡ２２　ｓｉＲＮＡの送達をｉｎ ｖｉｖｏ ｉｍａｇｅｒにて撮影した結果を示す。Ａ－Ｃ：ＳＮＯＲＡ２２　ｓｉＲＮＡに対してＤａｂ８を１－３当量付加した場合、Ｄ－Ｆ：ＳＮＯＲＡ２２　ｓｉＲＮＡに対してＦｏｌ－Ｄａｂ８Ａを１－３当量付加した場合、Ｇ－Ｉ：ＳＮＯＲＡ２２　ｓｉＲＮＡに対してＦｏｌ－Ｄａｂ８Ｂを１－３当量付加した場合。 Ｓ２－０１３膵癌細胞由来ヒト膵癌オルガノイドを担持するマウスにおける膵癌腫瘍に対するＳＮＯＲＡ２２　ｓｉＲＮＡと葉酸－カチオン性オリゴペプチド複合体との共投与による抗腫瘍効果を示す。Ｃｏｎｔｒｏｌ：非投与対照群、ＳＮＯＲＡ２２－Ｄａｂ８：ＳＮＯＲＡ２２　ｓｉＲＮＡを葉酸－カチオン性オリゴペプチド複合体と共に投与した群、Ｓｃｒ－Ｆｏｌ－Ｄａｂ８Ｂ：スクランブル対照ｓｉＲＮＡを投与した群、ＳＮＯＲＡ２２－Ｆｏｌ－Ｄａｂ８Ｂ：ＳＮＯＲＡ２２　ｓｉＲＮＡを葉酸－カチオン性オリゴペプチド複合体と共に投与した群。＊はP<0.05で有意差があることを示す。 Ｓ２－０１３膵癌細胞由来ヒト膵癌オルガノイドを担持するマウスの膵癌組織への化学修飾ＳＮＯＲＡ１８　ｓｉＲＮＡの送達をｉｎ ｖｉｖｏ ｉｍａｇｅｒにて撮影した結果を示す。Ａ－Ｃ：ＳＮＯＲＡ１８　ｓｉＲＮＡに対してＦｏｌ－Ｄａｂ８Ａを１－３当量付加した場合、Ｄ－Ｆ：ＳＮＯＲＡ１８　ｓｉＲＮＡに対してＦｏｌ－Ｄａｂ８Ｂを１－３当量付加した場合。 Ｓ２－０１３膵癌細胞由来ヒト膵癌オルガノイドを担持するマウスの膵癌組織への化学修飾ＷＡＳＦ２　ｓｉＲＮＡの送達をｉｎ ｖｉｖｏ ｉｍａｇｅｒにて撮影した結果を示す。Ａ－Ｃ：ＷＡＳＦ２　ｓｉＲＮＡに対してＦｏｌ－Ｄａｂ８Ａを１－３当量付加した場合、Ｄ－Ｆ：ＷＡＳＦ２　ｓｉＲＮＡに対してＦｏｌ－Ｄａｂ８Ｂを１－３当量付加した場合。
　以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
＜核酸送達促進剤＞
　本発明は、葉酸－カチオン性オリゴペプチド複合体からなる、核酸送達促進剤を提供する。
＜葉酸＞
　葉酸は、水溶性ビタミンＢ群の１種であり、下記の構造を有する。腫瘍細胞表面には葉酸受容体が高濃度に発現していることが報告されている。本発明者等は先に、膵癌細胞株であるＳ２－０１３において葉酸受容体が発現しており、葉酸を含む複合体を用いたｓｉＲＮＡの細胞内送達を報告している（Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ， ２０１９, Ｖｏｌ.１０, Ｎｏ．３０, ｐｐ.２８６９－２８８６）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
　本発明においてカチオン性オリゴペプチドとの複合体を作製するために使用される葉酸は、上記の構造を有する葉酸を用いても良く、またカチオン性オリゴペプチドとの結合性及び葉酸受容体との結合性を保持した葉酸塩若しくは葉酸誘導体であっても良い。
　例えば、上記の構造から理解される通り、葉酸分子には２個のカルボシキル基、アミノ基、イミノ基等が存在するため、カチオン性オリゴペプチドとの結合に関与しないこれらの官能基に当分野で知られる置換基を付加することもでき、また標識化合物を葉酸に結合させることもできる。
＜カチオン性オリゴペプチド＞
　本発明において使用可能なカチオン性オリゴヌクレオチドは、国際公開ＷＯ２０１４／１４８６２０号、並びにＢｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２１ （２０１３） １７１７－１７２３に開示されたものを適宜使用することができる。
　具体的には、本発明において使用するカチオン性オリゴヌクレオチドは、アミノ基又はグアニジノ基を有するアミノ酸残基を８個以上含むものであり得る。
　より具体的には、本発明において使用可能なカチオン性オリゴペプチドは、下記式（Ｉ）のアミノ酸残基が少なくとも２個連続する部分を含み、下記式（Ｉ）のアミノ酸残基の連続する部分以外は連続しない１個の他のアミノ酸残基であるカチオン性オリゴペプチド部位を含む、８～４０個のアミノ酸からなるオリゴペプチドであり得る。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
 ［式（Ｉ）において、Ｒ１は、基Ｈ３Ｎ＋－ＣＨ２－、又は、式（II）で示される基であり、Ｒ２は、Ｒ１が基Ｈ３Ｎ＋－ＣＨ２－の場合は、存在しない、若しくは、炭素原子数１～３のアルキレン基であり、Ｒ１が式（II）で示される基の場合は炭素原子数１～４のアルキレン基である。一つのカチオン性オリゴペプチドにおいてＲ１及びＲ２は全て同一である。］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
 ［式（II）中、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、同一又は異なって、水素原子若しくはメチル基である。］
　上記の「式（Ｉ）のアミノ酸残基」としては、限定するものではないが、具体的には例えばＬ－２，３－ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）、Ｌ－２，４－ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）、Ｌ－オルニチン（Ｏｒｎ）、Ｌ－リジン（Ｌｙｓ）、Ｌ－２－アミノ－３－グアニジノプロピオン酸（Ａｇｐ）、Ｌ－２－アミノ－４－グアニジノ酪酸（Ａｇｂ）、又はＬ－アルギニン（Ａｒｇ）を挙げることができる。
　上記の「他のアミノ酸残基」は特に限定されず、適宜選択することができる。例えばグリシン、Ｌ－アラニン、Ｌ－プロリンの他、プロリン骨格を有するアミノ酸として、Ｌ－アミノプロリン、Ｌ－グアニジノプロリン等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
　一態様では、カチオン性オリゴペプチド部位は、上記の「他のアミノ酸残基」を含むヘテロ多量体であり得る。別の一態様では、カチオン性オリゴペプチド部位は、上記の「他のアミノ酸残基」を含まないホモ多量体であり得る。カチオン性オリゴペプチドの合成の簡便性、及び本発明者等が確認したｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡの安定化効果等を考慮すれば、カチオン性オリゴペプチド部位は、単一のアミノ酸から構成されるホモ多量体とすることが好ましい。
　この場合、単量体としてのアミノ酸は、天然のアミノ酸であっても非天然のアミノ酸であっても良い。また、アミノ酸はＬ型であってもＤ型であっても良く、それらがオリゴペプチド分子中に混在していても良い。
　従って、カチオン性オリゴペプチドは、例えばＬ－２，３－ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）、Ｌ－２，４－ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）、Ｌ－オルニチン（Ｏｒｎ）、Ｌ－リジン（Ｌｙｓ）、Ｌ－２－アミノ－３－グアニジノプロピオン酸（Ａｇｐ）、Ｌ－２－アミノ－４－グアニジノ酪酸（Ａｇｂ）、又はＬ－アルギニン（Ａｒｇ）のホモ多量体を部分構造として有するものであり得る。
　カチオン性オリゴペプチドは、塩の形態であっても良く、好適に使用できる塩としては、塩酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩等を挙げることができるが、特に限定するものではない。
　二本鎖核酸には、らせん構造の異なるＡ型とＢ型とがあり、ＤＮＡ／ＤＮＡ二本鎖の場合には主溝の幅が１３～１８ÅのＢ型二重らせん構造を有しているのに対して、ＲＮＡ／ＲＮＡ二本鎖及びＤＮＡ／ＲＮＡ鎖の場合には主溝の幅がそれぞれ７～１４Å及び８～１５ÅのＡ型二重らせん構造を有している。本発明はｓｉＲＮＡの安定性向上を意図するものであるため、Ａ型二重らせん構造のＲＮＡ／ＲＮＡ鎖に結合可能なカチオン性オリゴペプチドを用いることが必要となる。
　カチオン性オリゴペプチドを構成するアミノ酸残基の数は、一般的に２１～２３塩基からなるｓｉＲＮＡ、及びそのようなｓｉＲＮＡをもたらすｓｈＲＮＡの安定性を向上させるためには、８～１２個とすればよい。
　具体的な一態様として、下記の実施例において実際に検討し、好ましい結果をもたらしたものとして、カチオン性オリゴペプチド部位は、下記の構造を有するジアミノ酪酸の８量体とすることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
＜葉酸－カチオン性オリゴペプチド複合体＞
　葉酸とカチオン性オリゴペプチドとの結合は、共有結合とすることが好ましい。共有結合は、カチオン性オリゴペプチドのＮ末端、Ｃ末端若しくは側鎖に直接又はリンカーを介した結合とすることができる。
　リンカーとしては、コンジュゲートの作製のために当分野で通常使用されるものを適宜用いることができ、特に限定するものではないが、例えばグリシンやセリン等のアミノ酸からなるペプチドリンカーとすることができる。例えば、ペプチドリンカーは、１～４個のグリシン残基からなるペプチドであり得る。例えば、下記の実施例において実際に検討し、好ましい結果をもたらしたものとして、３個のグリシン残基からなるリンカーを挙げることができる。
　葉酸－カチオン性オリゴペプチド複合体において、葉酸とカチオン性オリゴペプチドの比率は、葉酸受容体との相互作用、並びに二本鎖核酸との相互作用を考慮すると１：１とすることができるが、特に限定するものではない。
　上記の通り、葉酸分子には２個のカルボシキル基が存在するため、上記の構造のＤａｂ８を葉酸のカルボキシル基との反応を介して結合させた場合、以下の２通りの異性体が生じ得る。本明細書においては、便宜上、これらの化合物をＦｏｌ－Ｄａｂ８Ａ、及びＦｏｌ－Ｄａｂ８Ｂと表記する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
　上記のＦｏｌ－Ｄａｂ８Ａ、及びＦｏｌ－Ｄａｂ８Ｂでは、リンカーとして３個のグリシンを使用しているが、リンカーの長さは適宜変更することができる。
　複合体形成に用いたカチオン性オリゴペプチドの種類に応じて、葉酸－カチオン性オリゴペプチド複合体は、塩の形態として得られたものであっても良い。好適に使用できる塩としては、塩酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩等を挙げることができるが、特に限定するものではない。
　葉酸－カチオン性オリゴペプチド複合体とすることで、ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡの安定性を高めると共に、葉酸受容体を有する細胞への標的化送達が可能となる。
　なお、実施例では、Ｆｏｌ－Ｄａｂ８Ａ及びＦｏｌ－Ｄａｂ８Ｂの有効性を示す対照化合物として、葉酸を有さないカチオン性オリゴペプチドＤａｂ８を用いているが、ＵＶ検出と定量を可能にするためのチロシン（Ｎ端がアセチル基で保護されている）とグリシン３個をＮ端に有するものとしており、実施例ではこれを便宜上、Ｄａｂ８と称する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
 ［式中、Ａｃ－ＹＧＧＧはＮ－アセチル－Ｌ－チロシン－グリシン－グリシン－グリシンを示す］
　本発明の核酸送達促進剤は、実施例において実証される通り、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏにおいて、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡの細胞への送達を促進することができる。本発明の核酸送達促進剤は、葉酸受容体を高発現する細胞、特に癌細胞への送達を特異的に促進することができる。
＜抗腫瘍剤＞
　本発明はまた、膵癌細胞で発現するｍＲＮＡ又はｓｎｏＲＮＡに結合してその発現を阻害し得るｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡと、上記本発明の送達促進剤とを含む核酸製剤を提供する。本発明の核酸製剤は、膵癌の腫瘍増大・浸潤・転移を効果的に抑制することができる。従って、本発明の核酸製剤は、膵癌に対する腫瘍増大抑制剤、浸潤・転移抑制剤、抗腫瘍剤としての作用を有する。
　本発明において、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡと葉酸－カチオン性オリゴペプチド複合体とは、更なる共有結合を介して結合することもできるが、共有結合を介さずに、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡの有する負電荷と、カチオン性オリゴペプチドの有する正電荷とでもたらされる相互作用により、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡの主溝内に葉酸－カチオン性オリゴペプチド複合体が部分的に入り込むようにして安定した構造を有し得るが、この安定化効果のメカニズムには拘束されることを意図しない。
＜ＲＮＡｉ分子＞
　ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡは、ＲＮＡ干渉と呼ばれるメカニズムにより、特定のｍＲＮＡを標的として、その翻訳（発現）を阻止することが知られている。標的配列の塩基数は特に限定されず、１５～５００塩基の範囲で選択され得る。ｓｉＲＮＡは、短鎖二本鎖ＲＮＡ分子であり、ｓｈＲＮＡは、生体内でダイサーによってプロセシングされてｓｉＲＮＡを生成することができるヘアピン型ＲＮＡである。本明細書において、ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡを含めて「ＲＮＡｉ分子」と記載する場合がある。
　ｓｉＲＮＡは、標的ＲＮＡの部分塩基配列と相同なセンス鎖と、当該センス鎖とハイブリダイズ可能なアンチセンス鎖がハイブリダイズした二本鎖ＲＮＡであり、通常、３’末端はＯＨのままである一方で５’末端がリン酸化され、３’末端側は１塩基以上４塩基以下突出していてもよい。
　これに対して、一本鎖ＲＮＡからなるｓｈＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの部分塩基配列と相同なセンス鎖の領域と、当該センス鎖とハイブリダイズ可能なアンチセンス鎖の領域がリンカー領域により結合されており、全体としてヘアピン状の構造を有している。ｓｈＲＮＡは３’末端が１塩基以上４塩基以下突出していてもよく、また、当該３’突出末端はＤＮＡで構成されていてもよい。ｓｈＲＮＡは、上記のように細胞内で分解され、ｓｉＲＮＡと同様にＲＮＡ干渉を引き起こす。従って、ｓｉＲＮＡの代わりにｓｈＲＮＡを用いても良い。
　本発明の目的のために用いるｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡは、膵癌細胞で発現するｍＲＮＡ又はｓｎｏＲＮＡに結合してその発現を阻害し得るｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡである。
　本明細書において記載する「膵癌細胞で発現するｍＲＮＡ又はｓｎｏＲＮＡ」は、特に限定するものではないが、インスリン様成長因子２ｍＲＮＡ結合タンパク質３（ＩＧＦ２ＢＰ３）に結合するものであり得る。
　上記の通り、膵癌細胞ではヒトＩＧＦ２ＢＰ３が細胞膜突起中に存在し、このＩＧＦ２ＢＰ３に様々なｍＲＮＡが結合し、細胞膜突起中に集積している。これらの細胞膜突起中のＩＧＦ２ＢＰ３に結合しているｍＲＮＡをＲＮＡ干渉により阻害することで、膵癌における腫瘍増大・浸潤・転移が有効に抑制され得る。
　膵癌細胞で発現するｍＲＮＡであって、本発明者等がＲＮＡ干渉を利用して膵癌に対する抗腫瘍効果を確認したものとしては、例えばＮＵＰ８５、ＷＡＳＦ２、ＡＲＨＧＥＦ４、ＣＣＤＣ８８Ａ、ＬＡＭＴＯＲ２、ｍＴＯＲのｍＲＮＡを挙げることができる。
＜ＮＵＰ８５＞
　ＮＵＰ８５（ヌクレオポリン８５）は、細胞核と細胞質の間の高分子の移動を調節する出入口を形成している核膜孔複合体の構成要素となるヌクレオポリン（ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｉｎ）タンパク質ファミリーに属するタンパク質である。ヒトＮＵＰ８５のアミノ酸配列及びこれをコードするｍＲＮＡの塩基配列等の情報は、ＮＣＢＩ等のデータベースにＧｅｎｅ　ＩＤ：７９９０２、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿０２４８４４等として収載されている。
＜ＷＡＳＦ２＞
　原発性免疫不全症の一種であるウィスコット・アルドリッチ症候群は、サイズの減少を伴う血小板減少、湿疹、易感染性を特徴とする疾患である。ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質ファミリーメンバー２（ＷＡＳＦ２）は、受容体キナーゼとアクチンをつなぐ多タンパク質複合体を形成するウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質ファミリーに属し、ヒトＷＡＳＦ２のアミノ酸配列及びこれをコードするｍＲＮＡの塩基配列等の情報は、ＮＣＢＩ等のデータベースにＧｅｎｅ　ＩＤ：１０１６３、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００６９９０等として収載されている。
＜ＡＲＨＧＥＦ４＞
　ＡＲＨＧＥＦ４（Ｒｈｏ　ｇｕａｎｉｎｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｅｘｃｈａｎｇｅ　ｆａｃｔｏｒ　４、Ｒｈｏグアニンヌクレオチド交換因子４）は、Ｇタンパク質共役状態を介して機能する刺激によって開始する細胞内プロセスに関与するタンパク質である。ヒトＡＲＨＧＥＦ４のアミノ酸配列及びこれをコードするｍＲＮＡの塩基配列等の情報は、ＮＣＢＩ等のデータベースにＧｅｎｅ　ＩＤ：５０６４９、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿０１５３２０等として収載されている。
＜ＣＣＤＣ８８Ａ＞
　ＣＣＤＣ８８Ａ（コイルドコイルドメイン含有８８Ａ）は、アクチン結合タンパク質であるＧｉｒｄｉｎタンパク質をコードする遺伝子である。ヒトＣＣＤＣ８８ＡのｍＲＮＡの塩基配列等の情報は、ＮＣＢＩ等のデータベースにＧｅｎｅ　ＩＤ：５５７０４、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００１１３５５９７等として収載されている。
＜ＬＡＭＴＯＲ２＞
　ＬＡＭＴＯＲ２（ｌａｔｅ　ｅｎｄｏｓｏｍａｌ／ｌｙｓｏｓｏｍａｌ　ａｄａｐｔｏｒ，ＭＡＰＫ　ａｎｄ　ｍＴＯＲ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　２）は、ランゲルハンス細胞の恒常性のレギュレーターであり、シグナル伝達及びｍＴＯＲカスケードに関与していると報告されている。ヒトＬＡＭＴＯＲ２のアミノ酸配列及びこれをコードするｍＲＮＡの塩基配列等の情報は、ＮＣＢＩ等のデータベースにＧｅｎｅ　ＩＤ：２８９５６、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿０１４０１７等として収載されている。
＜ｍＴＯＲ＞
　ｍＴＯＲ（ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｔａｒｇｅｔ　ｏｆ　ｒａｐａｍｙｃｉｎ　ｋｉｎａｓｅ、ラパマイシンキナーゼの哺乳動物標的）は、哺乳動物等の細胞内シグナル伝達に関与するタンパク質キナーゼの１種である。ヒトｍＴＯＲのアミノ酸配列及びこれをコードするｍＲＮＡの塩基配列等の情報は、ＮＣＢＩ等のデータベースにＧｅｎｅ　ＩＤ：２４７５、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００４９５８等として収載されている。
　当分野において周知の通り、ｍＲＮＡは、遺伝子（ＤＮＡ）から転写され、タンパク質をコードする情報を含むＲＮＡである。通常二本鎖であるｓｉＲＮＡは、その二本鎖が解離した後に一方の鎖（アンチセンス鎖）が特定のタンパク質と共にＲＩＳＣ（ＲＮＡ－Ｉｎｄｕｃｅｄ－Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ－Ｃｏｍｐｌｅｘ）と呼ばれる複合体を形成することが知られている。ＲＩＳＣはｓｉＲＮＡのセンス鎖の塩基配列との相同配列を有するｍＲＮＡを認識して結合し、ＲＮａｓｅＩＩＩ様の酵素活性によりｍＲＮＡを切断する。一方、ｓｈＲＮＡは、送達された細胞内でのプロセシング後にｓｉＲＮＡを生じ、その後同様に機能し得る。
　これに対してｓｎｏＲＮＡは、核小体に存在するノンコーディングＲＮＡ（ｓｍａｌｌ　ｎｕｃｌｅａｒ　ＲＮＡ）であり、リボソームＲＮＡ及びその他のＲＮＡのメチル化やシュードウリジン化の化学修飾を導く等の機能を有するＲＮＡ分子群であることが報告されている（例えばＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ，２００４，１５：２８１－２９３；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２０１５，２９０：１１７４１－１１７４８）。
　本発明者等は最近、こうしたｓｎｏＲＮＡに属するＳＮＯＲＡ１８とＳＮＯＲＡ２２がＩＧＦ２ＢＰ３に対する結合能を有し、膵癌細胞の運動又は浸潤に関与することを見出している。また、ｓｎｏＲＮＡはＫＨ型スプライシング調節タンパク質（ＫＨＳＲＰ）と結合し、細胞質のＰボディ（Ｐ－ｂｏｄｙ）中に局在することも見出された（Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，２０２０，Ｖｏｌ．１１，Ｎｏ．２，ｐｐ：１３１－１４７）。
　本発明者等は、これらのｓｎｏＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡも、ｓｎｏＲＮＡを認識して結合し、ノックダウンすることで、膵癌の腫瘍増大・浸潤・転移を抑制することができることを見出した。
＜ＳＮＯＲＡ１８＞
　小核小体ＲＮＡ　ＳＮＯＲＡ１８は、ウリジンからシュードウリジンへの修飾部位をガイドするＲＮＡのメンバーとして報告されている。ヒトＳＮＯＲＡ１８の塩基配列等の情報は、ＮＣＢＩ等のデータベースにＧｅｎｅ　ＩＤ：６７７８０５、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＲ＿００２９５９等として収載されている。
＜ＳＮＯＲＡ２２＞
　小核小体ＲＮＡ　ＳＮＯＲＡ２２も、ウリジンからシュードウリジンへの修飾部位をガイドするＲＮＡのメンバーとして報告されている。ヒトＳＮＯＲＡ２２の塩基配列等の情報は、ＮＣＢＩ等のデータベースにＧｅｎｅ　ＩＤ：６７７８０７、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＲ＿００２９６１等として収載されている。
　従って、特に限定するものではないが、本発明においてｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡが標的とすることができる膵癌細胞で発現するｍＲＮＡ又はｓｎｏＲＮＡとしては、例えばＳＮＯＲＡ１８ ｓｎｏＲＮＡ、ＮＵＰ８５ ｍＲＮＡ、ＷＡＳＦ２ ｍＲＮＡ、及びＳＮＯＲＡ２２ ｓｎｏＲＮＡからなる群より選択されるものが挙げられる。
　ｍＲＮＡを標的とする場合、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡがハイブリダイズし得る標的ｍＲＮＡは、３’ＵＴＲ、５’ＵＴＲ、エキソン、イントロン、コード領域、翻訳開始領域、翻訳終結領域又は他の核酸領域を含み得る。
　本発明において使用するｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡは、ｍＲＮＡ又はｓｎｏＲＮＡをノックダウンして、その機能を阻害し得るものである。従って、より具体的には、本発明のｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡは、標的ＲＮＡの特定の塩基配列に対して実質的に相補的な塩基配列からなる。しかしながら、ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡは、標的の塩基配列に対して１～２個程度のミスマッチがあっても良い。当業者であれば、標的となるｍＲＮＡ又はｓｎｏＲＮＡの塩基配列が取得されている場合、標的配列以外の核酸の塩基配列と相同性がなく、標的配列の発現の阻害／ノックダウンのために好適な領域を選択し、特異性の高い適切なｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡを設計し、合成することができる。
　例えば、ｓｉＲＮＡは、以下の条件：
（１）アンチセンス鎖の５’末端がＡ又はＵであり、
（２）センス鎖の５’末端がＧ又はＣであり、且つ
（３）アンチセンス鎖の５’末端部の７塩基中の４塩基以上はＡ又はＵである
を満たす場合に、ＲＮＡ干渉効果が高いことが知られている。従って、本発明で使用するｓｉＲＮＡは、かかる塩基配列を有するものであり得るが、これに限定するものではない。同様に、本発明で使用するｓｈＲＮＡは、細胞内でのプロセシング後にこうしたｓｉＲＮＡを生じるものであり得るが、これに限定するものではない。
　ある標的配列に対して有効なｓｉＲＮＡ配列及びｓｈＲＮＡ配列の決定は、インターネットを介して利用可能なプログラムを使用して実施することもできる。
　本明細書において、発現の阻害／抑制又はノックダウンとは、標的ｍＲＮＡ又はｓｎｏＲＮＡの分解、コードされるタンパク質への翻訳の阻害／抑制をいう。抑制は、対照と比較して、細胞又は細胞群（膵臓癌組織）における標的ｍＲＮＡ／ｓｎｏＲＮＡ量を２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、又は９０％以上低減させることを含む。発現の阻害／抑制又はノックダウンは、当技術分野で公知のいずれの方法で決定しても良く、例えばＲＴ－ＰＣＲに基づく方法で決定することができる。
　ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡは、天然(非修飾)ヌクレオチドのみから構成されるものであっても良いが、一部又は全てのヌクレオチドが修飾されたものであっても良い。当分野で知られるいずれかの修飾を用いることで、ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡの化学的安定性が増大し得る。しかしながら、修飾によってｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡの意図する活性が低下することは望ましくない。例えば、ｓｈＲＮＡの細胞内でのプロセシングを妨げるような修飾は用いないことは理解される通りである。非天然ヌクレオチドとしての修飾は、糖及び／又は塩基の修飾であり得る。
　糖の修飾としては、例えば、限定するものではないが、二環式糖、５'－ビニル、５'－メチル、４'－Ｓ、２'－Ｆ、２'－ＯＣＨ３（２’－ＯＭｅ）、及び２'－Ｏ（ＣＨ２）２ＯＣＨ３置換基等が挙げられる。二環式糖は、一般に架橋化核酸（Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ、ＢＮＡ）と称され、例えば、限定されないが、ＬＮＡ（ロックド核酸（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（登録商標））、２，４－ＢＮＡ、ＥＮＡ（エチレンオキシ（４－（ＣＨ２）２－Ｏ－２）ＢＮＡ）などが挙げられる。あるいはまた、糖は、リボースの代わりに一部にデオキシリボースを含んでいても良く、この場合、ｓｉＲＮＡの一方又は双方のオリゴヌクレオチド鎖、又はｓｈＲＮＡのオリゴヌクレオチド鎖中にＤＮＡとＲＮＡとが混在していても良い。好ましくは、ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ／ＲＮＡ二本鎖である。また、ｓｈＲＮＡは好ましくはＲＮＡ鎖である。糖の修飾として、例えば２’－ＯＭｅ修飾が好適に使用し得る。
　塩基の修飾として、例えば、限定するものではないが、
　　シトシンの５－メチル化、５－フルオロ化、５－ブロモ化、５－ヨード化、Ｎ４－メチル化、
　　アデニンのＮ６－メチル化、８－ブロモ化、
　　グアニンのＮ２－メチル化、８－ブロモ化、
　　ウラシルの５－フルオロ化、５－ブロモ化、５－ヨード化、５－ヒドロキシル化
などが挙げられる。
　ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡ中の同一のヌクレオチド又は異なるヌクレオチドが、上記のような糖及び塩基の修飾を有することができる。
　ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡはまた、改変されたヌクレオシド間結合を含むことができる。
　改変されたヌクレオシド間結合とは、天然に存在するホスホジエステル結合の代わりに存在する、例えばホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、ボラノホスフェート結合、ホスホロジアミデート結合及びホスホロアミデート結合などであり得る。
　ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡのヌクレオシド間結合の少なくとも１つが、改変されたヌクレオシド間結合であり得る。あるいは、ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡのヌクレオシド間結合の少なくとも２個、３個、４個、又はそれ以上が、改変されたヌクレオシド間結合であり得る。改変されたヌクレオシド間結合は、好ましくはホスホロチオエート結合である。
　ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡにおいて、同一鎖中の異なるヌクレオチドが、独立して異なる修飾を受けることできる。また、同一のヌクレオチドは、修飾ヌクレオシド間結合(例えば、ホスホロチオエート結合)を有し、さらに、修飾糖(例えば、二環式糖)を有することができる。同一のヌクレオチドはまた、修飾核酸塩基(例えば、５－メチルシトシン)を有し、さらに、修飾糖(例えば、２’－ＯＭｅ修飾、二環式糖等)を有することができる。
　本発明のｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡは、当技術分野で公知の方法によって製造することができる。例えば、ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡは、市販の自動核酸合成装置を使用して合成し、その後、イオン交換カラムや逆相カラムなどを用いて精製することにより製造することができる。あるいは、ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡは、核酸塩基配列並びに修飾部位及び種類を指定して、製造業者(例えば、株式会社ジーンデザイン)に注文し、入手することもできる。
　また、ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡには標識化合物（蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ等）、精製用化合物（ビオチン、アビジン、Ｈｉｓタグペプチド、ＧＳＴタグペプチド、ＦＬＡＧタグペプチド等）等の機能性分子が結合していてもよい。結合は、直接的な結合であってもよく、他の物質を介した間接的な結合であってもよいが、共有結合等で直接的に結合していることが好ましい。
　本発明の抗腫瘍剤は、限定するものではないが、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ１分子に対して０．５～１０当量、好ましくは１～５当量、より好ましくは１～３当量の葉酸－カチオン性オリゴペプチド複合体を含むことができる。
　実施例において実証されるように、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡと葉酸-カチオン性オリゴぺプチド複合体を併用することで、顕著に膵癌の腫瘍増大及び浸潤を抑制することができる。本発明の葉酸―カチオン性オリゴペプチド複合体はｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡに対して１～３当量程度の少量を添加するだけで十分な効果を発揮するため、極めて有用な膵癌の治療手段となることが期待される。
　本発明に係る抗腫瘍剤は、標的部位である膵癌組織に有効成分が送達されるものであれば特に制限されず、例えば、注射剤、液剤、徐放剤とすることができる。これら製剤の溶媒としては水が好ましいが、生理食塩水、ＰＢＳ、血清アルブミン溶液を用いるなどして製剤が最終的に等張液又は略等張液となるようにすることが好ましい。
＜医薬組成物＞
　本発明はまた、本発明の抗腫瘍剤を１種以上含む医薬組成物を提供する。
　本発明に係る抗腫瘍剤の標的部位は、膵臓のみならず、膵癌細胞が転移したリンパ節や他の臓器であってもよい。また、標的部位ヘ有効成分をより確実に送達するために、剤形としては注射剤が好ましい。
　医薬組成物は、製剤分野で通常使用される担体、賦形剤、安定化剤、崩壊剤、界面活性剤、結合剤、滑沢剤、乳化剤、懸濁剤、抗酸化剤、矯臭剤、充填剤、溶解補助剤、コーティング剤、着色剤、矯味剤、保存剤、緩衝剤等を含めることができる。具体的には、水、生理食塩水、他の水性溶媒、製薬上許容される有機溶媒、マンニトール、ラクトース、デンプン、微結晶セルロース、ブドウ糖、カルシウム、ポリビニルアルコール、コラーゲン、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、水溶性デキストリン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、アラビアゴム、キサンタンガム、カゼイン、ゼラチン、寒天、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、グリセリン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ソルビトールなどが挙げられる。
　医薬組成物は、経口的又は非経口的に被験体に投与できる。非経口的投与としては、限定されないが、皮下、静脈内、腹腔内、腫瘍内等への注射又は注入、及び内視鏡又は腹腔鏡を介した処置時の投与が挙げられる。
　本発明の医薬組成物の投与量や投与頻度は、それぞれの剤形や、患者の年齢、性別、体重、疾患の重篤度などにより適宜調整すればよい。例えば、医薬組成物は、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡが０．００１ｍｇ／ｋｇ／日～１ｍｇ／ｋｇ／日、０．００５ｍｇ／ｋｇ／日～０．５ｍｇ／ｋｇ／日、又は０．０１ｍｇ／体重ｋｇ／日～０．１ｍｇ／ｋｇ／日となる量とし、これに対して０．５～１０当量となるように葉酸－カチオン性オリゴペプチド複合体の量を決定して、投与することができる。
　医薬組成物は、単回投与又は複数回投与することができ、例えば１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、３週間、１ヶ月などの間隔で投与することができる。
　医薬組成物を投与する被験体は、哺乳動物、例えばヒト、サルなどの霊長類、及び非霊長類、例えばウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ネコ、イヌ、モルモット、ラット及びマウスであり得るが、より好ましくはヒトである。また、被験体は、ヒトへの有効性の評価のために使用可能な、例えばヒト膵癌細胞を移植した膵癌モデル動物であってよい。
　膵癌モデル動物としては、特に限定するものではないが、例えば特開２０１８－１１０５７５号に記載された癌オルガノイドを移植された非ヒト動物を用いることができる。ここで、「オルガノイド」とは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで３次元的に作製された臓器であり、特定の臓器に特異的な細胞の集合体をいう。当分野において、既に種々の臓器のオルガノイドが作製されている。特開２０１８－１１０５７５号に記載されている「癌オルガノイド」は、癌組織の微小環境を再現したオルガノイドである。本出願の発明者を含む研究グループでは、特開２０１８－１１０５７５号の手法を改変して、膵癌治療薬の効果を判定するために有用なヒト膵癌マウスモデルを作製しており（特願２０２０－０７８７７１）、このマウスモデルも、本発明の抗腫瘍薬及び医薬組成物のヒトへの有効性の評価のために好適に使用することができる。
＜組合せ製剤＞
　本発明はまた、上記の膵癌細胞で発現するｍＲＮＡ又はｓｎｏＲＮＡに結合してその発現を阻害し得るｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡと、上記の葉酸－カチオン性オリゴペプチド複合体とを含む、膵癌の腫瘍増大・浸潤・転移の抑制のための組合せ製剤を提供する。
　本明細書の記載から理解される通り、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡと葉酸－カチオン性オリゴペプチド複合体とは、共有的に結合されてはおらず、メカニズムに拘束されるものではないが、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡの主溝に葉酸－カチオン性オリゴペプチド複合体が部分的に挿入され、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡが安定化されることを意図するものである。
　従って、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡと葉酸－カチオン性オリゴペプチド複合体とは、予め同じ組成物中に含まれていなくても良い。すなわち、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを含有する製剤と、葉酸－カチオン性オリゴペプチド複合体を含有する製剤とを別個に調製し、投与に先立って組み合わせるようにしても良い。
　あるいはまた、上記の２種の製剤は、別個に投与することもできる。しかしながら、葉酸－カチオン性オリゴペプチド複合体によるｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡの安定化を考慮すると、これら２種の製剤は、異なる時点で投与する、あるいは異なる投与経路で投与するのではなく、同時に（若しくは連続して）、かつ同じ投与経路で投与することが好ましい。
＜キット＞
　本発明はまた、上記の膵癌細胞で発現するｍＲＮＡ又はｓｎｏＲＮＡに結合してその発現を阻害し得るｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡと、上記の葉酸－カチオン性オリゴペプチド複合体とを含む、膵癌治療のための医薬キットを提供する。キットには、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ及び葉酸－カチオン性オリゴペプチド複合体の他、同時に投与することができるか投与が適切な他の薬剤、担体、投与方法等についての説明書等を含めることができる。
　本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
［実施例１　葉酸－カチオン性オリゴペプチド複合体の合成］
　下記に示すようにして葉酸－カチオン性オリゴペプチド複合体を合成した。尚、本実施例において使用した試薬及び分析装置は以下に示す通りである。
＜試薬＞
　Ｆｍｏｃアミノ酸誘導体およびペプチド固相合成担体としての樹脂は渡辺化学工業株式会社より、また、葉酸は東京化成株式会社より購入し、そのまま用いた。各ペプチド鎖はFmoc固相合成法を用い、Ｆｍｏｃ-ＮＨ-ＳＡＬ-ＰＥＧ樹脂を固相担体として合成した。Ｆｍｏｃ-ＡＡ-ＯＨ試薬にはＦｍｏｃ-Ｄａｂ（Ｂｏｃ）-ＯＨ、Ｆｍｏｃ-Ｇｌｙ-ＯＨ、Ｆｍｏｃ-Ｔｙｒ（ｔ-Ｂｕ）-ＯＨを使用した。
＜ＥＳＩ ＭＳ＞
　Ｖａｒｉａｎ ９１０-ＭＳ（ＪＡＳＣＯ）
＜紫外可視分光光度計＞
　Ｖ-５５０（ＪＡＳＣＯ）
＜温度可変紫外可視分光光度計＞
　ＵＶ-１６５０ＰＣ（ＳＩＭＡＤＺＵ）
＜分光蛍光光度計＞
　ＦＰ-６５００（ＪＡＳＣＯ）
＜ＨＰＬＣ＞
　ポンプ：ＰＵ-２０８０ｉ ｐｌｕｓ（ＪＡＳＣＯ）
　検出器：ＵＶ-２０７５ｉ ｐｌｕｓ（ＪＡＳＣＯ）
　低圧グラジエントユニット：ＬＧ-２０８０-０２（ＪＡＳＣＯ）
　デガッサ：ＤＧ-２０８０-５３（ＪＡＳＣＯ）
　逆相カラム：μ-Ｂｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ １５０×３．９ｍｍ Ｃ１８ ５μｍ １００Å（Ｗａｔｅｒｓ）, ＳｕｎＦｉｒｅ Ｃ１８ ＯＢＤ ５μｍ １９×１５０ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ）
＜工程１：カップリング操作＞
　まず、Ｆｍｏｃ固相合成により、Ｌ－２，４－ジアミノ酪酸の８量体（Ｄａｂ８）を合成した。ＰｅｔｉＳｙｚｅｒ（ハイペップ研究所）に、導入されたアミノ基が１３μｍｏｌになるように固相担体を加えて、１．３ｍＬのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で５回洗浄した後、ＤＭＦを１．３ｍＬ加えて１時間以上静置し、担体を膨潤させた。
　（ｉ）膨潤後、１．３ｍＬのＤＭＦで５回洗浄した後、２５％ピぺリジン／ＤＭＦ溶液を１．３ｍＬ加えて５分間反応させ、Ｆｍｏｃ基を除去した。その際、数回に分けてボルテックスミキサーで攪拌した。
　（ｉｉ）続いて１．３ｍＬのＤＭＦで５回洗浄した後、樹脂上のアミノ基に対し５当量のＦｍｏｃ-アミノ酸（Ｆｍｏｃ－ＡＡ－ＯＨ）、縮合試薬として、Ｎ-［（１Ｈ-ベンゾトリアゾール-１-イル)(ジメチルアミノ)メチレン]-Ｎ-メチルメタンアミニウムヘキサフルオロオスフェート-Ｎ-オキシド（Ｎ-［（１Ｈ-ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌ-１-ｙｌ）（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ］-Ｎ-ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｎ ａｍｉｎｉｕｍｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ-Ｎ-ｏｘｉｄｅ）(ＨＡＴＵ・Ｈ２Ｏ、５当量)、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、１０当量）、反応溶媒としてDMFを合計１．３ｍＬになるように加え、１５分間縮合反応させた。その際、数回に分けてボルテックスミキサーで攪拌した。
　Ｎ末端のアミノ酸まで（ｉ）及び（ｉｉ）の操作を繰り返したのち、再び（ｉ）の操作を行い、Ｆｍｏｃ基を除去することで、固相担体上にＮＨ２－ＧＧＧ－Ｄａｂ８を合成した。続いて１．３ｍＬのＤＭＦで５回洗浄した後、樹脂上のアミノ基に対し２当量の葉酸および２当量のＮ，Ｎ'－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ)をＤＭＦ-ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）混合溶媒（１:１, ｖ／ｖ）１．５ ｍＬに溶かし、６時間静置しておいたものを１．３ｍＬ加え、１４時間縮合反応させた。
＜工程２：脱保護・脱樹脂および精製＞
　樹脂をＤＭＦ及びＣＨＣｌ３でそれぞれ５回洗浄し、デシケーター中で減圧乾燥した。得られた樹脂を室温でトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）－トリイソピロピルシラン－Ｈ２Ｏ混合溶媒（９６．５／１．０／２．５, ｖ／ｖ／ｖ）中、１時間３０分攪拌し、脱保護・脱樹脂を行った。樹脂を濾去し、溶媒をアルゴン気流下気化させた後、Ｅｔ２Ｏを加えてペプチドを沈殿させた。遠心分離機にかけて上澄みを除去する操作を３回繰り返したのち、Ｅｔ２Ｏをアルゴン気流下気化させ、粗生成物（葉酸－カチオン性オリゴペプチド）を得た。
　得られた粗生成物を１ｍＬの大塚蒸留水（大塚製薬工場製）に溶解した後、以下の条件を用いる逆相ＨＰＬＣにより精製した。
　勾配サイクル：溶媒Ａ（Ｈ２Ｏ－０．０５％ ＴＦＡ）中の溶媒Ｂ（ＣＨ３ＣＮ－０．０５％ ＴＦＡ）の比率　直線勾配で５分間で０％～５％；４０分間で５％～２５％；５分間で２５％～１００％
　測定温度：３０℃
　流速：０．５ｍＬ/分
　図１に、Ｆｏｌ－Ｄａｂ８粗生成物のＨＰＬＣ解析結果を示す。葉酸が２つのカルボキシ基を含むことに起因し、葉酸を導入したＤａｂ８（Ｆｏｌ－Ｄａｂ８と記載する）については、２つのピークに分かれて溶出した。ＨＰＬＣ解析において先に溶出されたものをＦｏｌ－Ｄａｂ８Ａ、その後に溶出されたものをＦｏｌ－Ｄａｂ８Ｂとした。それぞれの化学構造式を下記に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
　ＨＰＬＣにおいて分取した溶液を凍結乾燥し、黄色粉末として得られた。精製したＦｏｌ－Ｄａｂ８Ａ若しくはＦｏｌ－Ｄａｂ８Ｂを大塚蒸留水に溶解させ、予め、葉酸のモル吸光係数を算出し（波長３６８ｎｍのモル吸光係数：７９６７Ｌ／ｍｏｌ・ｃｍ）、葉酸のＵＶ吸収から収量を算出した。Ｄａｂ８は固相担体上にＮＨ２－ＧＧＧ－Ｄａｂ８を合成した後に、Ｎ端がアセチル基で保護されたチロシンとのカップリング操作を行い、＜工程２＞の操作を行った後にＨＰＬＣで精製することで白色粉末として得、ＴｙｒのＵＶ吸収から収量を算出した。各ペプチドは質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）によって同定を行った（Ｄａｂ８の［Ｍ＋Ｈ］＋ｍ／ｚ 計算値：１１９４．６８１、実測値：１１９４．６８２；Ｆｏｌ－Ｄａｂ８Ａの［Ｍ＋Ｈ］＋ ｍ／ｚ 計算値：１４１２．７３７、実測値：１４１２．７３８；Ｆｏｌ－Ｄａｂ８Ｂの［Ｍ＋Ｈ］＋ｍ／ｚ 計算値：１４１２．７３７、実測値：１４１２．７３９）。
［実施例２　融解温度（Ｔｍ）解析］
　実施例１で合成したカチオン性オリゴペプチド又は葉酸－カチオン性オリゴペプチド複合体の存在下及び非存在下での核酸二重鎖の融解温度を測定した。
　本実施例では、アニーリングされたＲＮＡ二本鎖に対してカチオン性オリゴペプチド（Ｄａｂ８）又は葉酸－カチオン性オリゴペプチド（Ｆｏｌ－Ｄａｂ８Ａ若しくはＦｏｌ－Ｄａｂ８Ｂ）を添加し、融解温度（Ｔｍ値）を測定した。ＲＮＡ二本鎖として、以下の配列からなるオリゴヌクレオチド対をｓｉＲＮＡとして使用した。
　　5'-r(GUCAUCACACUGAAUACCA)dTdT-3'（配列番号１）
　　5'-r(UGGUAUUCAGUGUGAUGAC)dTdT-3'（配列番号２）
　５０μＭ核酸水溶液１４４μＬを調製し、９５℃で５分間保った後、－０．５℃／分で４℃まで徐冷した。これを、２００ｍＭ　ＮａＣｌ、２０ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４－ＮａＨ２ＰＯ４を含むｐＨ７．０のバッファー、大塚蒸留水、０．１ｍＭペプチド水溶液の混合溶液に加え、最終濃度が１０ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４－ＮａＨ２ＰＯ４、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、４μＭ核酸二重鎖、０、４、８、１２、１６、２０μＭペプチド（それぞれ０、１、２、３、４、５当量）になるようにサンプルを調整した。
　２０℃から９５℃まで０．５℃／分で昇温して２６０ｎｍの吸光度を測定し、融解曲線を求めた。バックグラウンドによるノイズを除くために３２０ｎｍの吸光度を測定し、２６０ｎｍの吸光度から３２０ｎｍの吸光度を引いた値で融解曲線を作成し、中線法でＴｍ値を求めた。
　その結果、表１に示すように、ＲＮＡ二重鎖に対してカチオン性オリゴペプチドを添加していない場合、Ｔｍ値は７２．３℃であったのに対し、Ｄａｂ８、Ｆｏｌ－Ｄａｂ８Ａ、又はＦｏｌ－Ｄａｂ８Ｂを１当量以上加えると、いずれもＴｍ値は上昇した。すなわち、Ｆｏｌ－Ｄａｂ８Ａ及びＢはいずれも、Ｄａｂ８と同様、ＲＮＡ二重鎖に結合してその熱力学的安定性を向上させることが示唆された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000030
［実施例３　ＲＮａｓｅＡ耐性の評価］
　カチオン性オリゴペプチド存在下における核酸二重鎖のＲＮＡ分解酵素耐性試験を行った。
　本実施例では、アニーリングされたＲＮＡ二重鎖に対してペプチドを添加して複合体を形成させ、ＲＮＡの分解の速さを測定した。
　ＰＣＲチューブに大塚蒸留水、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１Ｍ　ＮａＣｌバッファー（ｐＨ７．３）を加えた後、０．１ｍＭの５’末端が蛍光基である６－ＦＡＭ修飾された一本鎖ＲＮＡ（5'-FAM-r(GUCAUCACACUGAAUACCA)dTdT-3'、配列番号１）水溶液、０．１ｍＭの３’末端が消光基であるＤａｂｃｙｌ修飾された一本鎖ＲＮＡ （5'-r(UGGUAUUCAGUGUGAUGAC)dTdT-dabcyl-3'、配列番号２）水溶液をそれぞれ等量混合し、最終濃度が１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、１０μＭ　ｓｉＲＮＡになるように調製した。続いて９５℃で５分保った後、－０．５℃／分で４℃まで徐冷した。
　石英セルに１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、１０μＭ　ｓｉＲＮＡ水溶液、及び０．１ｍＭカチオン性オリゴペプチド水溶液を加え、最終濃度が１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、１０ｎＭ　ｓｉＲＮＡ、０、１０、２０、３０ｎＭペプチド（それぞれ０、１、２、３当量）になるように、３ｍＬに調製した。その後、３７℃で攪拌しながら１００μｇ／ｍＬ　ウシ膵臓由来ＲＮａｓｅ　Ａ（Ｒｏｃｈｅ社製）を１５μＬ加え、蛍光強度の測定を開始して経時変化を追跡した（励起波長：４９０ｎｍ；測定波長：５２０ｎｍ；測定時間：６０分）。
　結果を図２に示す。ＲＮＡ二重鎖が解離すると、蛍光基と消光基との距離が離れるために蛍光強度が高くなることから、Ｄａｂ８、Ｆｏｌ－Ｄａｂ８Ａ、Ｆｏｌ－Ｄａｂ８Ｂのいずれも、１当量以上加えると、蛍光強度の増大速度が緩やかになっており、Ｄａｂ８と同様に、Ｆｏｌ－Ｄａｂ８Ａ及びＢによって、ＲＮＡ二重鎖の分解酵素耐性が向上したことが示唆された。
[実施例４　膵癌細胞へのｓｉＲＮＡの取り込みの確認]
　フローサイトメトリーでは標識が細胞内に取り込まれたものと取り込まれていないものとの識別が困難であるため、膵癌細胞へのｓｉＲＮＡの取り込みを共焦点顕微鏡を用いて観察した。
　膵癌細胞株Ｓ２－０１３（東北大学加齢医学研究所　医用細胞資源センター・細胞バンク、ＩＤ：ＴＫＧ０７０９）を２×１０４個／ウェルの細胞密度で４ウェルチャンバースライド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に播種し、これにＡｌｅｘａ６４７（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で標識したスクランブル対照ｓｉＲＮＡ（配列番号３及び４）に対してＤａｂ８、Ｆｏｌ－Ｄａｂ８Ａ、Ｆｏｌ－Ｄａｂ８Ｂを１～３当量で添加して４８時間培養した。ｓｉＲＮＡの濃度は８．２８μｇ/ｍＬとして２５μＬ使用し、Ｄａｂ８、Ｆｏｌ－Ｄａｂ８Ａ、Ｆｏｌ－Ｄａｂ８Ｂの濃度は原液（Ｄａｂ８：１１９．３μｇ／ｍＬ、Ｆｏｌ－Ｄａｂ８Ａ，Ｆｏｌ－Ｄａｂ８Ｂ：１４１．２μｇ／ｍＬ)を２５倍希釈して使用した。ｓｉＲＮＡに対して１、２、３当量に相当する量はそれぞれ３．９μＬ、７．８μＬ、１１．７μＬである。
　翌日、４％パラホルムアルデヒドにて固定し、ＤＡＰＩ入り封入剤で封入してからオールインワン蛍光顕微鏡（ＢＺ－Ｘ８００，ｋｅｙｅｎｃｅ）による観察を行った。その結果、図３Ａに示すように、Ａｌｅｘａ６４７の蛍光により、ｓｉＲＮＡの細胞内への取り込みが確認された。一方、ｓｉＲＮＡのみを膵癌細胞株Ｓ２－０１３の培養液中に付加して培養した場合、Ａｌｅｘａ６４７による蛍光で確認して、ｓｉＲＮＡが細胞にほとんど取り込まれていないことが認められた（図３Ｂ）。
　取り込みを数値化するために、ｋｅｙｅｎｃｅ解析ソフト ＢＺ-Ｘ８００ Ａｎａｌｙｚｅｒのハイブリッドセルカウント機能を使用し、Ｄａｂ８、Ｆｏｌ－Ｄａｂ８Ａ、Ｆｏｌ－Ｄａｂ８Ｂの存在下でｓｉＲＮＡが取り込まれた細胞のカウントを行った。判定は、細胞核の１／３以上が濃く染まっているものと、細胞核の周辺部に濃いかたまりがあるものを測定した。
　その結果、図３Ｃに示すように、カチオン性オリゴペプチド（Ｄａｂ８）、並びに葉酸－カチオン性オリゴペプチド複合体（Ｆｏｌ－Ｄａｂ８Ａ、Ｆｏｌ－Ｄａｂ８Ｂ）を用いた場合、添加したｓｉＲＮＡに対して２０～４０％の細胞内への取り込みが確認された。また、Ｆｏｌ－Ｄａｂ８Ａでは３当量、Ｆｏｌ－Ｄａｂ８Ｂでは１当量において最も導入効率が高く、１～３当量を付加したＤａｂ８よりも導入効率が良好であった。
［実施例５　葉酸-カチオン性ペプチド付加ｓｉＲＮＡによるノックダウン効果］
　カチオン性オリゴペプチド又は葉酸－カチオン性オリゴペプチド複合体の存在下における、ＳＮＯＲＡ１８、ＮＵＰ８５、ＷＡＳＦ２、ＳＮＯＲＡ２２それぞれに対するｓｉＲＮＡのノックダウン効果を検討した。
　表２に、本実施例で使用したｓｉＲＮＡの配列を示す。各ｓｉＲＮＡは、当分野で通常行われる通り、表２に示すセンス鎖とアンチセンス鎖とが二本鎖形成したものを使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000031
　Ｄａｂ８とｓｉＲＮＡの複合体は１当量、Ｆｏｌ－Ｄａｂ８ＡとｓｉＲＮＡの複合体は３当量、Ｆｏｌ－Ｄａｂ８ＢとｓｉＲＮＡの複合体は１当量のカチオン性オリゴペプチド又は葉酸-カチオン性ペプチドを付加したスクランブル対照ｓｉＲＮＡ（配列番号３及び４）、ＳＮＯＲＡ１８　ｓｉＲＮＡ（配列番号５及び６）、ＮＵＰ８５　ｓｉＲＮＡ（配列番号７及び８）、ＷＡＳＦ２　ｓｉＲＮＡ（配列番号９及び１０）、ＳＮＯＲＡ２２　ｓｉＲＮＡ（配列番号１１及び１２）のそれぞれを、６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のＳ２－０１３細胞の培養液（１．０×１０５個／ウェル）中に添加し、４８時間後に細胞を回収した。
　回収した細胞のＲＮＡを用いて半定量ＲＴ－ＰＣＲ法を行い、細胞におけるＳＮＯＲＡ１８、ＮＵＰ８５、ＷＡＳＦ２、ＳＮＯＲＡ２２のノックダウン効果について確認した。
　具体的には、Ｓ２－０１３細胞から得た全ＲＮＡを、ＳｔｒａｔａＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素（Ａｇｉｌｅｎｔ）およびランダムプライマーを用いて逆転写した。その後のＰＣＲ増幅のために各一本鎖ｃＤＮＡの適切な希釈液を調製した。ＧＡＰＤＨ　ｍＲＮＡを内部定量対照として用いた。ＳＮＯＲＡ１８、ＮＵＰ８５、ＷＡＳＦ２およびＳＮＯＲＡ２２を増幅するために使用されるプライマー配列は、以下の表３に記載する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000032
　ＰＣＲ反応は、ＴａＫａＲａ　ＰＣＲ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　Ｄｉｃｅ　Ｇｒａｄｉｅｎｔ上で、９４℃で２分間の初期変性、続いて９４℃で３０秒間、５８℃で３０秒間、７２℃で１分間の２１サイクル（ＧＡＰＤＨについて）又は２５サイクル（ＳＮＯＲＡ１８、ＮＵＰ８５、ＷＡＳＦ２およびＳＮＯＲＡ２２について）で行った。バンド強度の測定のためのスキャニングおよびデンシトメトリー分析は、Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎe分析システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて行った。
　その結果、図４Ａ、５Ａ、６Ａ、および７Ａにそれぞれ示すように、対照ｓｉＲＮＡとＤａｂ８、Ｆｏｌ－Ｄａｂ８Ａ又はＦｏｌ－Ｄａｂ８Ｂの組合せでは、ＳＮＯＲＡ１８、ＮＵＰ８５、ＷＡＳＦ２およびＳＮＯＲＡ２２のいずれもノックダウン効果が見られないのに対して、ＳＮＯＲＡ１８　ｓｉＲＮＡ、ＳＮＯＲＡ２２　ｓｉＲＮＡ、ＮＵＰ８５　ｓｉＲＮＡ、およびＷＡＳＦ２　ｓｉＲＮＡをＦｏｌ－Ｄａｂ８Ａ又はＦｏｌ－Ｄａｂ８Ｂと組み合わせて添加した場合、いずれも顕著なノックダウン効果が確認された。このノックダウン効果は、葉酸が含まれていないＤａｂ８では見られなかった。
［実施例６　葉酸－カチオン性オリゴペプチド複合体＋ｓｉＲＮＡによる細胞浸潤阻害効果］
　葉酸－カチオン性オリゴペプチド複合体を付加したスクランブル対照ｓｉＲＮＡ、ＳＮＯＲＡ１８ｓｉＲＮＡ、ＮＵＰ８５　ｓｉＲＮＡ、ＷＡＳＦ２　ｓｉＲＮＡ、ＳＮＯＲＡ２２　ｓｉＲＮＡ（いずれも実施例５で使用したもの）のそれぞれをＳ２－０１３細胞の培養液中に添加し、４８時間後にマトリゲル浸潤アッセイを行った。
　無血清培地に懸濁した４．０×１０４個の細胞を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ　Ｉｎｖａｓｉｏｎ　Ｃｈａｍｂｅｒ（２４ウェルプレート、孔径：８μｍ、Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ製）の上部チャンバーに播種した。５％ウシ胎児血清を含む溶媒を下部チャンバーに添加した。細胞を上部チャンバー内で２０時間インキュベートした後、３つの独立した領域を顕微鏡で観察し、下部チャンバーに浸潤した細胞を計数した。同様の実験を３回繰り返し、それぞれのｓｉＲＮＡが取り込まれたＳ２－０１３細胞の細胞浸潤能を比較した。
　図４Ｂ、５Ｂ、６Ｂ、および７Ｂには、スクランブル対照ｓｉＲＮＡ、又はＳＮＯＲＡ１８　ｓｉＲＮＡ、ＮＵＰ８５　ｓｉＲＮＡ、ＷＡＳＦ２　ｓｉＲＮＡ、及びＳＮＯＲＡ２２　ｓｉＲＮＡのいずれかを葉酸－カチオン性オリゴペプチド複合体と共に細胞に添加したアッセイにおいて、上部チャンバーから下部チャンバーへ移動した細胞の数を示す。「＊」はｔ－テストで対照に対してＰ＜０．０５で有意差があったことを示す。
　その結果、ＳＮＯＲＡ１８ｓｉＲＮＡ、ＮＵＰ８５　ｓｉＲＮＡ、ＷＡＳＦ２　ｓｉＲＮＡ、又はＳＮＯＲＡ２２　ｓｉＲＮＡが取り込まれたＳ２－０１３細胞では、対照ｓｉＲＮＡが取り込まれたＳ２－０１３細胞に比べて有意に細胞浸潤が抑制された。
　以上の結果より、培養細胞の培地に葉酸-カチオン性オリゴペプチド複合体と組み合わせて添加されたｓｉＲＮＡが、Ｓ２－０１３細胞内に取り込まれ、細胞浸潤に関与するｓｎｏＲＮＡおよびｍＲＮＡの発現を阻害していることを確認できた。
［実施例７　化学修飾ｓｉＲＮＡに対する効果］
　安定性を高めるために化学修飾したｓｉＲＮＡを作製し、葉酸－カチオン性オリゴペプチド複合体による効果を検討した。
　表４に、本実施例で使用したｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖の配列を示す。それぞれ化学修飾された塩基を含むと共に、３’末端にホスホロチオエート結合を含む。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000033
　スクランブル対照ｓｉＲＮＡ（配列番号３及び４）、及び上記のｓｉＲＮＡを用いて、実施例４と同様にして細胞への取り込みを検討した。
　培養中の膵癌細胞株Ｓ２－０１３の培養液（２×１０４個／ウェル）中にＡｌｅｘａ４８８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で標識したｓｉＲＮＡ（２．５μｇ／ｍＬ）と、これに対して１、２、３当量のＤａｂ８、Ｆｏｌ－Ｄａｂ８Ａ、Ｆｏｌ－Ｄａｂ８Ｂを添加した。
　次いで、実施例５と同様にして、膵癌細胞の浸潤に対する化学修飾ｓｉＲＮＡの効果を葉酸－カチオン性オリゴペプチド複合体の存在下又は非存在下で検討した。
　培養中の膵癌細胞株Ｓ２－０１３の培養液中に、スクランブル対照ｓｉＲＮＡ（配列番号３及び４）、ＳＮＯＲＡ１８　ｓｉＲＮＡ（配列番号２１及び２２）、ＮＵＰ８５　ｓｉＲＮＡ（配列番号２３及び２４）、ＷＡＳＦ２　ｓｉＲＮＡ（配列番号２５及び２６）、ＳＮＯＲＡ２２　ｓｉＲＮＡ（配列番号２７及び２８）のそれぞれを、２当量のＤａｂ８、Ｆｏｌ－Ｄａｂ８Ａ、Ｆｏｌ－Ｄａｂ８Ｂと共に添加した。対照として、対照ｓｉＲＮＡ、ＳＮＯＲＡ１８　ｓｉＲＮＡ、ＮＵＰ８５　ｓｉＲＮＡ、ＷＡＳＦ２　ｓｉＲＮＡ、ＳＮＯＲＡ２２　ｓｉＲＮＡのそれぞれを単独でＳ２－０１３細胞の培養液中に添加した。
　４８時間培養した後、マトリゲル浸潤アッセイを行った。マトリゲル浸潤アッセイにおいて、上部チャンバーから下部チャンバーへ移動した細胞の数を示す。「＊」はｔ－テストでコントロールに対してＰ＜０．０５で有意差があったことを示す。
　その結果、図８に示すように、Ｆｏｌ－Ｄａｂ８Ａ、Ｆｏｌ－Ｄａｂ８Ｂの存在下では、ＳＮＯＲＡ１８　ｓｉＲＮＡ、ＮＵＰ８５　ｓｉＲＮＡ、ＷＡＳＦ２　ｓｉＲＮＡ、又はＳＮＯＲＡ２２　ｓｉＲＮＡのいずれを用いた場合も、Ｆｏｌ－Ｄａｂ８Ａ、Ｆｏｌ－Ｄａｂ８Ｂの存在下でスクランブル対照ｓｉＲＮＡを添加したＳ２－０１３細胞、およびｓｉＲＮＡ単独で添加した場合と比較して、Ｓ２－０１３細胞の浸潤が有意に抑制された。葉酸を含まないＤａｂ８の存在下では、ＳＮＯＲＡ１８　ｓｉＲＮＡ、ＮＵＰ８５　ｓｉＲＮＡ、ＷＡＳＦ２　ｓｉＲＮＡ、又はＳＮＯＲＡ２２　ｓｉＲＮＡによるＳ２－０１３細胞の浸潤に対する抑制効果が認められたが、Ｆｏｌ－Ｄａｂ８Ａ、Ｆｏｌ－Ｄａｂ８Ｂを添加した場合と比較すると抑制効果は弱かった。
［実施例８　膵癌細胞への化学修飾ｓｉＲＮＡの取り込みの確認１］
　実施例７で作製した化学修飾ＳＮＯＲＡ２２　ｓｉＲＮＡ（配列番号２７及び２８）をＡｌｅｘａ４８８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で標識し、葉酸－カチオン性オリゴペプチド複合体（Ｆｏｌ－Ｄａｂ８Ｂ、２当量）と共に、４ウェルチャンバー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中のＳ２－０１３膵癌細胞又はＨＰＮＥ正常膵管上皮細胞（ＡＴＣＣ）の培養液（５×１０４個／ウェル）中に添加して３７℃で一晩インキュベートした後、ＤＮＡ（ＤＡＰＩ）、葉酸レセプター（ＦＯＬＲ１）及びｓｉＲＮＡ（Ａｌｅｘａ４８８）の染色を観察した。
　その結果、図９に示す通り、Ｓ２－０１３膵癌細胞では、ＨＰＮＥ正常膵管上皮細胞と比較して、葉酸レセプターの染色強度が高く、同時に細胞内に取り込まれたＳＮＯＲＡ２２　ｓｉＲＮＡの染色強度が強かった。このことは、葉酸レセプターをより多く発現する膵癌細胞でより多くのＳＮＯＲＡ２２　ｓｉＲＮＡが取り込まれていることを示す。
　図１０に、葉酸－カチオン性オリゴペプチド複合体（Ｆｏｌ－Ｄａｂ８Ｂ、２当量）共存下でのＳ２－０１３膵癌細胞およびＨＰＮＥ正常膵管上皮細胞へのＳＮＯＲＡ２２　ｓｉＲＮＡの導入効率（％）を示す。Ｓ２－０１３膵癌細胞へのＳＮＯＲＡ２２　ｓｉＲＮＡの取り込みは、正常細胞と比較して３倍近い数値を示した。
［実施例９　膵癌細胞への化学修飾ｓｉＲＮＡの取り込みの確認２］
　細胞内にエンドサイトーシスで取り込まれたｓｉＲＮＡはエンドソーム内に取り込まれてリソソームへ融合することが知られている。本発明のｓｉＲＮＡとＦｏｌ－Ｄａｂ８Ａ又はＦｏｌ－Ｄａｂ８Ｂの複合体がエンドサイトーシスを介して取り込まれているかについて検証するため、リソソームの染色とｓｉＲＮＡの染色の共焦点顕微鏡画像を取得した。
　Ａｌｅｘａ４８８で標識した化学修飾ＳＮＯＲＡ２２　ｓｉＲＮＡ（配列番号２７及び２８）、及び葉酸－カチオン性オリゴペプチド複合体（Ｆｏｌ－Ｄａｂ８Ａ又はＦｏｌ－Ｄａｂ８Ｂ、２当量）を、４ウェルチャンバー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中のＳ２－０１３膵癌細胞の培養液（２×１０４個／ウェル）中に添加して一晩インキュベートし、リソソーム（ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃを用いて染色）及びｓｉＲＮＡ（Ａｌｅｘａ４８８）の染色を観察した。
　その結果、図１１に示すように、ＳＮＯＲＡ２２　ｓｉＲＮＡはＳ２－０１３膵癌細胞に取り込まれ、リソソームに局在することが示され、ｓｉＲＮＡと葉酸－カチオン性オリゴペプチド複合体がエンドサイトーシスで取り込まれていることが示唆された。
［実施例１０　化学修飾によるｓｉＲＮＡの安定性向上の確認］
　本実施例では、ｓｉＲＮＡの血清中での安定性が化学修飾によって向上するか否かを検討した。
　化学修飾されていないＳＮＯＲＡ２２　ｓｉＲＮＡ（配列番号１１及び１２）、又は化学修飾ＳＮＯＲＡ２２　ｓｉＲＮＡ（配列番号２７及び２８）と、カチオン性オリゴペプチド（Ｄａｂ８）又は葉酸－カチオン性オリゴペプチド複合体（Ｆｏｌ－Ｄａｂ８Ａ若しくはＦｏｌ－Ｄａｂ８Ｂ）と混合し、室温で１５分間静置した後、ＰＢＳ若しくは10％ ＦＣＳ／ＰＢＳ中に1μLずつ添加し、混合した（最終２０μＭ）。対照として、各ＳＮＯＲＡ２２　ｓｉＲＮＡを単独で添加した。
　混合直後、３時間又は６時間経過後にサンプリングし、液体窒素にて凍らせた後、－８０℃に保管した。全てのサンプルが得られた後、非還元ゲルを用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、ＳＹＢＲ　ＧＯＬＤ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にて検出した。
　その結果、図１２に示すように、化学修飾のないｓｉＲＮＡの場合はカチオン性オリゴペプチド又は葉酸－カチオン性オリゴペプチド複合体が共存する場合も速やかに分解し得ることが示されたが、ｓｉＲＮＡの化学修飾により、血清中での安定性が向上し、ＲＮａｓｅからの分解をほぼ抑制できることが示唆された。
［実施例１１　ｉｎ　ｖｉｖｏにおけるｓｉＲＮＡの取り込み１］
　特開２０１８－１１０５７５に記載された方法を改変し、Ｓ２－０１３膵癌細胞を用いてヒト膵癌オルガノイドを作製した。
　具体的には、Ｓ２－０１３膵癌細胞（２０×１０４個）、ヒト間葉系幹細胞ＭＳＣ（ＬＯＮＺＡ、４０×１０４個）、及びヒト臍帯静脈内皮細胞ＨＵＶＥＣ（ＬＯＮＺＡ、１４×１０４個）を４８ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中のＤＭＥＭ／マトリゲル混合溶液中に加えて３７℃のＣＯ２インキュベータで３０分間インキュベートした。
　その後、ＤＭＥＭ／ＥＧＭ混合溶液３００μＬ／ウェルを添加して、再び３７℃で２４時間インキュベートした、各ウェル内に膵癌オルガノイドを1個ずつ作製した。
　次いで、ヌードマウス（６週齢のＢＡＬＢ／ｃＳｌｃ－ｎｕ／ｎｕ（Ｐａｔｈｏｇｅｎ－ｆｒｅｅ　ｆｅｍａｌｅ　ａｔｈｙｍｉｃ　ｎｕｄｅ　ｍｉｃｅ）、日本エスエルシー株式会社）の脇腹の皮膚を切開し、上記で得られた膵癌オルガノイドを皮下に移植した（各群２匹）。
　移植後６週目に、Ａｌｅｘａ－５９４で標識した化学修飾ＳＮＯＲＡ２２　ｓｉＲＮＡ（配列番号２７及び２８、５μｇ）を、カチオン性オリゴペプチド（Ｄａｂ８）又は葉酸－カチオン性オリゴペプチド複合体（Ｆｏｌ－Ｄａｂ８Ａ若しくはＦｏｌ－Ｄａｂ８Ｂ）を１当量、２当量又は３当量と共に、尾静脈注射にて投与した。２４時間後、ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｍａｇｅｒにて撮影した。
　　測定機器：Ｓｐｅｃｔｒｕｍ　Ｉｎ　Ｖｉｖｏ　Ｉｍａｇｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）
　　測定条件：ｋｅｘｃ　６４０ｎｍ、ｋｅｍｉ　６８０ｎｍ
　その結果、図１３に示すように、Ｄａｂ８を用いた場合（Ａ－Ｃ）と比較して、Ｆｏｌ－Ｄａｂ８Ａを用いた場合（Ｄ－Ｆ）、及びＦｏｌ－Ｄａｂ８Ｂを用いた場合（Ｇ－Ｉ）にＳＮＯＲＡ２２　ｓｉＲＮＡの膵癌組織への送達が促進されており、特にＦｏｌ－Ｄａｂ８Ａを３当量付加した場合（Ｆ）、Ｆｏｌ－Ｄａｂ８Ｂを２当量付加した場合（Ｈ）に高濃度に送達されていた。
　尚、本実験から、ｓｉＲＮＡの肝臓への移行・蓄積はほとんど観察されず、腎臓から排泄されていることも確認された。
［実施例１２　抗腫瘍効果の確認］
　実施例１１において作製したヒト膵癌オルガノイドをヌードマウス皮下に移植した1週後から、化学修飾ＳＮＯＲＡ２２　ｓｉＲＮＡ（配列番号２７及び２８、５μｇ）を、週１回の頻度で、カチオン性オリゴペプチド（Ｄａｂ８、２当量）又は葉酸－カチオン性オリゴペプチド複合体（Ｆｏｌ－Ｄａｂ８Ｂ、２当量）と共に尾静脈注射にて投与し、ノギスを用いて毎週腫瘍体積を計測した（各群ｎ＝８）。対照として、スクランブル対照ｓｉＲＮＡ（配列番号３及び４）を葉酸－カチオン性オリゴペプチド複合体（Ｆｏｌ－Ｄａｂ８Ｂ、２当量）と共に投与した。
　その結果、図１４に示すように、投与開始から９週間後までの計測結果から、非投与の対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、スクランブル対照ｓｉＲＮＡを投与した群（Ｓｃｒ－Ｆｏｌ－Ｄａｂ８Ｂ）、及びカチオン性オリゴペプチドと共に投与した群（ＳＮＯＲＡ２２－Ｄａｂ８）と比較して、ＳＮＯＲＡ２２　ｓｉＲＮＡを葉酸－カチオン性オリゴペプチド複合体と共に投与した群（ＳＮＯＲＡ２２－Ｆｏｌ－Ｄａｂ８Ｂ）において、８週目以降で有意な腫瘍増大抑制効果を認めた。
［実施例１３　ｉｎ　ｖｉｖｏにおけるｓｉＲＮＡの取り込み２］
　実施例１１と同様にして、葉酸－カチオン性オリゴペプチド複合体（Ｆｏｌ－Ｄａｂ８Ａ若しくはＦｏｌ－Ｄａｂ８Ｂ）と共に投与した場合の化学修飾ＳＮＯＲＡ１８　ｓｉＲＮＡ（配列番号２１及び２２）の膵癌担持マウスへの送達をｉｎ ｖｉｖｏ ｉｍａｇｅｒにて撮影した。
　その結果、図１５に示すように、Ｆｏｌ－Ｄａｂ８Ａ及びＦｏｌ－Ｄａｂ８ＢのいずれもＳＮＯＲＡ１８　ｓｉＲＮＡの膵癌組織への送達を促進することが確認され、特にＦｏｌ－Ｄａｂ８Ａを１当量（Ａ）又は３当量（Ｃ）付加した場合に高濃度に送達されていた。
［実施例１４　ｉｎ　ｖｉｖｏにおけるｓｉＲＮＡの取り込み３］
　実施例１１及び１３と同様にして、葉酸－カチオン性オリゴペプチド複合体（Ｆｏｌ－Ｄａｂ８Ａ若しくはＦｏｌ－Ｄａｂ８Ｂ）と共に投与した場合の化学修飾ＷＡＳＦ２　ｓｉＲＮＡ（配列番号２５及び２６）の膵癌担持マウスへの送達をｉｎ ｖｉｖｏ ｉｍａｇｅｒにて撮影した。
　その結果、図１６に示すように、Ｆｏｌ－Ｄａｂ８Ａ及びＦｏｌ－Ｄａｂ８ＢのいずれもＷＡＳＦ２　ｓｉＲＮＡの膵癌組織への送達を促進することが確認され、特にＦｏｌ－Ｄａｂ８Ｂを１当量（Ｄ）又は３当量（Ｆ）付加した場合に高濃度に送達されていた。
　本発明により、癌の中で最も予後が悪いと言われている膵癌に対して、腫瘍増大、浸潤及び転移を効果的に抑制することができる治療手段が提供される。本願の抗腫瘍剤は、膵癌細胞特異的に効果的に送達され、また他の抗癌剤及び／又は抗癌治療と組み合わせることで、膵癌の治療効果を飛躍的に高めることが可能となる。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (20)

  1. 　膵癌細胞で発現するｍＲＮＡ又はｓｎｏＲＮＡに結合してその発現を阻害し得るｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡと、葉酸－カチオン性オリゴペプチド複合体からなるｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡの送達促進剤とを含む抗腫瘍剤であって、該複合体におけるカチオン性オリゴペプチドが、下記式（Ｉ）のアミノ酸残基が少なくとも２個連続する部分を含み、下記式（Ｉ）のアミノ酸残基の連続する部分以外は連続しない１個の他のアミノ酸残基である、８～４０個のアミノ酸からなるカチオン性オリゴペプチド部位を含む、上記抗腫瘍剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［式（Ｉ）において、Ｒ１は、基Ｈ３Ｎ＋－ＣＨ２－、又は、式（II）で示される基であり、Ｒ２は、Ｒ１が基Ｈ３Ｎ＋－ＣＨ２－の場合は、存在しない、若しくは、炭素原子数１～３のアルキレン基であり、Ｒ１が式（II）で示される基の場合は炭素原子数１～４のアルキレン基である。一つのカチオン性オリゴペプチドにおいてＲ１及びＲ２は全て同一である。］
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     ［式（II）中、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、同一又は異なって、水素原子若しくはメチル基である。］
  2. 　葉酸－カチオン性オリゴペプチド複合体からなる、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡの送達促進剤であって、カチオン性オリゴペプチドが、下記式（Ｉ）のアミノ酸残基が少なくとも２個連続する部分を含み、下記式（Ｉ）のアミノ酸残基の連続する部分以外は連続しない１個の他のアミノ酸残基である、８～４０個のアミノ酸からなるカチオン性オリゴペプチド部位を含む、上記送達促進剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     ［式（Ｉ）において、Ｒ１は、基Ｈ３Ｎ＋－ＣＨ２－、又は、式（II）で示される基であり、Ｒ２は、Ｒ１が基Ｈ３Ｎ＋－ＣＨ２－の場合は、存在しない、若しくは、炭素原子数１～３のアルキレン基であり、Ｒ１が式（II）で示される基の場合は炭素原子数１～４のアルキレン基である。一つのカチオン性オリゴペプチドにおいてＲ１及びＲ２は全て同一である。］
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     ［式（II）中、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、同一又は異なって、水素原子若しくはメチル基である。］
  3. 　カチオン性オリゴペプチド部位が、８～１２個のアミノ酸からなる、請求項２記載の送達促進剤。
  4. 　カチオン性オリゴペプチド部位が、Ｌ－２，３－ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）、Ｌ－２，４－ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）、Ｌ－オルニチン（Ｏｒｎ）、Ｌ－リジン（Ｌｙｓ）、Ｌ－２－アミノ－３－グアニジノプロピオン酸（Ａｇｐ）、Ｌ－２－アミノ－４－グアニジノ酪酸（Ａｇｂ）、又はＬ－アルギニン（Ａｒｇ）のホモ多量体である、請求項２又は３記載の送達促進剤。
  5. 　カチオン性オリゴペプチドが、下記の構造を有するジアミノ酪酸の８量体を部分構造として有する、請求項２～４いずれか１項記載の送達促進剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
  6. 　葉酸が、カチオン性オリゴペプチドのＮ末端、Ｃ末端若しくは側鎖にリンカーを介して又は介さずに連結されている、請求項２～５のいずれか１項記載の送達促進剤。
  7. 　葉酸－カチオン性オリゴペプチド複合体が、リンカーを介して連結されており、リンカーがペプチドリンカーである、請求項６記載の送達促進剤。
  8. 　ペプチドリンカーが、１～４個のグリシン残基からなるペプチドである、請求項７記載の送達促進剤。
  9. 　葉酸－カチオン性オリゴペプチド複合体が、下記の構造を有するＦｏｌ－Ｄａｂ８Ａ及び／又はＦｏｌ－Ｄａｂ８Ｂである、請求項５記載の送達促進剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
  10. 　膵癌細胞で発現するｍＲＮＡ又はｓｎｏＲＮＡに結合してその発現を阻害し得るｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡと、請求項２～９のいずれか１項記載の送達促進剤とを含む、抗腫瘍剤。
  11. 　膵癌細胞で発現するｍＲＮＡ又はｓｎｏＲＮＡが、インスリン様成長因子２ｍＲＮＡ結合タンパク質３（ＩＧＦ２ＢＰ３）に結合するものである、請求項１０記載の抗腫瘍剤。
  12. 　膵癌細胞で発現するｍＲＮＡ又はｓｎｏＲＮＡが、ＳＮＯＲＡ１８ ｓｎｏＲＮＡ、ＮＵＰ８５ ｍＲＮＡ、ＷＡＳＦ２ ｍＲＮＡ、及びＳＮＯＲＡ２２ ｓｎｏＲＮＡからなる群より選択される、請求項１０又は１１記載の抗腫瘍剤。
  13. 　ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡに対して０．５～１０当量の葉酸－カチオン性オリゴペプチド複合体を含む、請求項１０～１２のいずれか１項記載の抗腫瘍剤。
  14. 　ｓｉＲＮＡが、ＲＮＡ／ＲＮＡ二本鎖である、請求項１０～１３のいずれか１項記載の抗腫瘍剤。
  15. 　ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡが、修飾された塩基、修飾された糖、及び／又は改変されたヌクレオシド結合を含む、請求項１０～１４のいずれか１項記載の抗腫瘍剤。
  16. 　上記修飾された糖の修飾が２’－ＯＭｅ修飾である、請求項１５記載の抗腫瘍剤。
  17. 　上記改変されたヌクレオシド結合が、ホスホロチオエート結合である、請求項１５又は１６記載の抗腫瘍剤。
  18. 　請求項１０～１７のいずれか１項記載の抗腫瘍剤を含有する医薬組成物。
  19. 　以下：
    （ａ）膵癌細胞で発現するｍＲＮＡ又はｓｎｏＲＮＡに結合してその発現を阻害し得るｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを含む製剤、及び
    （ｂ）下記式（Ｉ）のアミノ酸残基が少なくとも２個連続する部分を含み、下記式（Ｉ）のアミノ酸残基の連続する部分以外は連続しない１個の他のアミノ酸残基である、８～４０個のアミノ酸からなるカチオン性オリゴペプチド部位を含む、葉酸－カチオン性オリゴペプチド複合体を含む製剤：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
     ［式（Ｉ）において、Ｒ１は、基Ｈ３Ｎ＋－ＣＨ２－、又は、式（II）で示される基であり、Ｒ２は、Ｒ１が基Ｈ３Ｎ＋－ＣＨ２－の場合は、存在しない、若しくは、炭素原子数１～３のアルキレン基であり、Ｒ１が式（II）で示される基の場合は炭素原子数１～４のアルキレン基である。一つのカチオン性オリゴペプチドにおいてＲ１及びＲ２は全て同一である。］
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
     ［式（II）中、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、同一又は異なって、水素原子若しくはメチル基である。］
    を含む、組合せ製剤。
  20. 　以下：
    （ａ）膵癌細胞で発現するｍＲＮＡ又はｓｎｏＲＮＡに結合してその発現を阻害し得るｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ、及び
    （ｂ）下記式（Ｉ）のアミノ酸残基が少なくとも２個連続する部分を含み、下記式（Ｉ）のアミノ酸残基の連続する部分以外は連続しない１個の他のアミノ酸残基である、８～４０個のアミノ酸からなるカチオン性オリゴペプチド部位を含む、葉酸－カチオン性オリゴペプチド複合体：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
     ［式（Ｉ）において、Ｒ１は、基Ｈ３Ｎ＋－ＣＨ２－、又は、式（II）で示される基であり、Ｒ２は、Ｒ１が基Ｈ３Ｎ＋－ＣＨ２－の場合は、存在しない、若しくは、炭素原子数１～３のアルキレン基であり、Ｒ１が式（II）で示される基の場合は炭素原子数１～４のアルキレン基である。一つのカチオン性オリゴペプチドにおいてＲ１及びＲ２は全て同一である。］
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
     ［式（II）中、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、同一又は異なって、水素原子若しくはメチル基である。］
    を含む、膵癌治療のための医薬キット。
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