WO2021101416A2 - Способ и устройство для спектроскопии живой ткани - Google Patents

Способ и устройство для спектроскопии живой ткани Download PDF

Info

Publication number
WO2021101416A2
WO2021101416A2 PCT/RU2020/050324 RU2020050324W WO2021101416A2 WO 2021101416 A2 WO2021101416 A2 WO 2021101416A2 RU 2020050324 W RU2020050324 W RU 2020050324W WO 2021101416 A2 WO2021101416 A2 WO 2021101416A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
molecule
intercellular
glucose
biopolymer
substance
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/RU2020/050324
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2021101416A3 (ru
Inventor
Рамиль Фаритович МУСИН
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to EP20890729.5A priority Critical patent/EP4108169A4/en
Priority to CN202080094313.1A priority patent/CN115135240A/zh
Publication of WO2021101416A2 publication Critical patent/WO2021101416A2/ru
Publication of WO2021101416A3 publication Critical patent/WO2021101416A3/ru
Priority to US17/747,380 priority patent/US20220369958A1/en
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N25/00—Investigating or analyzing materials by the use of thermal means
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B5/00—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons
    • A61B5/145—Measuring characteristics of blood in vivo, e.g. gas concentration or pH-value ; Measuring characteristics of body fluids or tissues, e.g. interstitial fluid or cerebral tissue
    • A61B5/1455—Measuring characteristics of blood in vivo, e.g. gas concentration or pH-value ; Measuring characteristics of body fluids or tissues, e.g. interstitial fluid or cerebral tissue using optical sensors, e.g. spectral photometrical oximeters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B5/00—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons
    • A61B5/0059—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons using light, e.g. diagnosis by transillumination, diascopy, fluorescence
    • A61B5/0075—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons using light, e.g. diagnosis by transillumination, diascopy, fluorescence by spectroscopy, i.e. measuring spectra, e.g. Raman spectroscopy, infrared absorption spectroscopy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B5/00—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons
    • A61B5/145—Measuring characteristics of blood in vivo, e.g. gas concentration or pH-value ; Measuring characteristics of body fluids or tissues, e.g. interstitial fluid or cerebral tissue
    • A61B5/14532—Measuring characteristics of blood in vivo, e.g. gas concentration or pH-value ; Measuring characteristics of body fluids or tissues, e.g. interstitial fluid or cerebral tissue for measuring glucose, e.g. by tissue impedance measurement
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B5/00—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons
    • A61B5/145—Measuring characteristics of blood in vivo, e.g. gas concentration or pH-value ; Measuring characteristics of body fluids or tissues, e.g. interstitial fluid or cerebral tissue
    • A61B5/14546—Measuring characteristics of blood in vivo, e.g. gas concentration or pH-value ; Measuring characteristics of body fluids or tissues, e.g. interstitial fluid or cerebral tissue for measuring analytes not otherwise provided for, e.g. ions, cytochromes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N25/00—Investigating or analyzing materials by the use of thermal means
    • G01N25/20—Investigating or analyzing materials by the use of thermal means by investigating the development of heat, i.e. calorimetry, e.g. by measuring specific heat, by measuring thermal conductivity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Definitions

  • the present group of inventions relates to medicine and medical technology, in particular, to methods and devices for monitoring blood glucose levels by measuring the heat effect and metabolic rate of a local area of living tissue using a calorimetric method. Also, the present invention relates to methods for producing a biopolymer molecule with desired biological properties and a given spatial structure. The use of a group of inventions will make it possible to carry out non-invasive monitoring of blood sugar levels in patients with diabetes, including for early diagnosis of diabetes mellitus.
  • diabetes mellitus the most common form of which, accounting for more than 90-95% of the total number of diabetics, is type 2 diabetes mellitus (DM2), which is one of the most pressing problems of modern medicine.
  • DM2 diabetes mellitus DM2 diabetes mellitus
  • the social significance of this chronic disease is determined by several factors, the most important of which is the high prevalence of the disease throughout the world, insufficiently high efficiency of methods of treating the disease, ways of curing which are still under development. According to the forecast of the International Diabetes Federation (IDF), the number of patients with diabetes will increase to 592 million by 2035 from 422 million in 2018.
  • Diabetes often leads to the development of complications such as blindness, renal impairment, nervous disease, and cardiovascular disease. Diabetes is the leading disease leading to blindness between the ages of 20 and 74. Between 12,000 and 24,000 people lose their eyesight due to diabetes each year. Diabetes is the leading cause of kidney disease, accounting for about 40% of new cases. Approximately 40-60% of diabetic patients have a predisposition to various forms of nervous diseases that can lead to limb amputation. Patients with diabetes are approximately 2-4 times more prone to heart disease, in particular, myocardial infarction. Diabetes is a disease associated with insufficient production or ineffective use of insulin by the cells of the body. Although the causes of the disease are not fully understood, several factors, such as genetic, environmental, viral, have been identified.
  • type 1 There are two main types of diabetes: type 1 and type 2.
  • Type 1 diabetes (known as insulin-dependent diabetes) is an autoimmune disorder in which the production of insulin stops completely, and most often develops during childhood and adolescence. People with type 1 diabetes require daily injections of insulin.
  • Type 2 diabetes is a metabolic disease caused by the body being unable to produce enough insulin or using it inefficiently. Patients with type 2 diabetes account for approximately 90-95% of the total number of diabetics. In the United States, the incidence of type 2 diabetes is approaching epidemiological thresholds, mainly due to the increase in the number of older Americans and the prevalence of a sedentary lifestyle leading to obesity.
  • Insulin promotes the penetration of glucose into the cell, followed by its breakdown to provide energy for all metabolic processes. In diabetics, glucose cannot enter the cell, accumulating in the blood, and the cells experience an energy hunger.
  • Insulin is usually obtained from porcine pancreas or chemically synthesized.
  • non-invasive (bloodless) method for monitoring blood sugar in patients with diabetes and the creation on its basis of a medical device that can replace industrial invasive glucometers, is one of the urgent unsolved problems of modern medicine and healthcare.
  • the task of developing new methods and devices of preventive medicine for early diagnosis of diabetes mellitus based on noninvasive continuous recording of sugar curves is closely related to the development of wearable electronic devices for noninvasive continuous monitoring of blood sugar based on biosensors and new generation biotechnologies.
  • An invasive commercial blood glucose meter is a biosensor that uses an enzyme called glucose oxidase to break down glucose in the blood.
  • the enzyme first oxidizes glucose and uses two electrons to reduce FAD (a component of the enzyme) to FAD-H2, which, in turn, is oxidized in several steps by an electrode. The resulting current is proportional to the glucose concentration.
  • the electrode is a converter, and the enzyme is a bioselective element.
  • the calorimetry method is known to be widely used in biology to study thermal processes at the molecular and cellular levels [1-10].
  • the microcalorimetry method is also successfully used to study thermal processes (heat release and absorption) in individual organs, in particular, in active muscles and nerve fibers.
  • the known methods of physiological calorimetry are the following methods: direct calorimetry and indirect calorimetritis
  • the method of direct calorimetry provides direct determination of the total amount of heat released using a calorimetric camera for living objects.
  • the method of indirect calorimetry makes it possible to determine the amount of heat generated in an indirect way, based on taking into account the dynamics of respiratory gas exchange using respiratory chambers and various systems.
  • the indirect calorimetry method There are two possible modifications of the indirect calorimetry method: the method of complete gas analysis (taking into account the absorbed O2 and released CO2) and the method of incomplete gas analysis (taking into account the absorbed O2).
  • a known method for measuring the rate of basal metabolic rate of the human body using a whole body calorimeter described in US 4386604 A, publ. 06/07/1983.
  • direct calorimetry By measuring the air temperature and the total amount of water evaporating from the surface of the whole body, the total heat transfer of the whole body is determined and the basal metabolic rate is calculated.
  • the main disadvantage of the x method is that it requires bulky, stationary and expensive whole-body calorimetric chambers.
  • the direct calorimetry method is characterized by low accuracy.
  • the metabolic rate is determined by measuring the total amount of water evaporating in the process of imperceptible perspiration from the surface of a local area of the skin, and measuring the temperature and humidity of the surrounding air.
  • the mentioned measurement method allows realizing high accuracy in laboratory conditions with controlled parameters of the microclimate (temperature and humidity) of the room in which the measurement is carried out, with constant values of the climatic parameters of the external environment (temperature and humidity of the environment, atmospheric pressure).
  • the main disadvantage of the above method limiting its practical application, is that the measurement results depend on the physical and climatic factors of the environment; in each case, when climatic factors change, with constant values of the microclimate parameters of the room in which the measurements are carried out, a new calibration of the measuring channel is required.
  • Spectral methods are known for non-invasive measurement of blood glucose concentration [1].
  • the main disadvantage of known non-invasive devices for measuring blood glucose concentration based on diffuse reflectance spectroscopy and absorption spectroscopy is a high measurement error due to a low signal-to-noise ratio, which limits the accuracy of spectral measurements at the characteristic frequencies of blood glucose molecules in blood vessels. capillaries located at a depth of 0.5-1 mm from the surface of the epidermis.
  • the known method of optical-calorimetric spectroscopy which is based on the absorption of light with the excitation of energy levels of molecules of the substance of a biological object, the subsequent nonradiative relaxation of levels and heating of the object.
  • the temperature of a substance is a variable; the information parameter in this method is the change in the temperature of the sample under study.
  • the degree of heating is determined by the absorption capacity of the substance, the intensity of light, and the efficiency of competing processes (fluorescence, photochemical and photoelectric effects).
  • the main advantage of optical calorimetric methods is the possibility of recording absorption spectra of strongly scattering media, which is very important in biology and medicine. Since the measured parameter is the temperature change, nonselective radiation detectors are used as detectors, i.e. there is no restriction on wavelengths from the receiver side.
  • the technical problem and the technical result of the present invention consist in the development of a fundamentally new method of spectroscopy of living tissue in vivo - absorption isothermal calorimetric spectroscopy, which allows to determine in real time the content of biochemical components of living tissue, and a device that allows this method to be implemented.
  • the developed method and device for non-invasive continuous monitoring of blood sugar are used for early diagnosis of diabetes mellitus and monitoring of blood sugar in the course of antihyperglycemic therapy and are based on the use of new generation biosensors.
  • An additional technical problem and technical result of the present invention is the creation of a new class of biosensors and biological catalysts for use in various fields of human activity, in addition to early diagnosis of diabetes: in the development of new generation drugs, biomedicine and protein and genetic engineering, food industry, safety and monitoring the quality of the environment.
  • glucokinase is one of the promising targets for the creation of new antidiabetic agents.
  • An additional technical problem and technical result of the present invention is the development of a method for producing a biopolymer molecule with predetermined biological properties and a predetermined spatial structure.
  • the proposed method of obtaining a biopolymer molecule allows you to determine the primary structure of a biopolymer molecule, which, with a given biochemical composition of the solvent, under certain conditions (temperature, pressure, acidity), can fold into a biopolymer molecule with a heterophase structure, which has the functions of a biosensor and / or biological catalyst, with bioselectivity to a given molecule S of a solvent that catalyzes a biochemical reaction with the participation of a given molecule S.
  • the polymer chain of a biopolymer molecule with desired properties, the structure of which is determined by the proposed method, is synthesized by protein and / or genetic engineering at the next stage of the technological chain.
  • the proposed method includes the step of determining the three-dimensional spatial structure and biological properties of the biopolymer molecule.
  • the proposed method for determining the three-dimensional spatial structure and biological properties of a biopolymer molecule based on the known primary structure of the polymer chain has important practical application for the development of new drugs and new treatment methods.
  • the problem of predicting the spatial structure of a biopolymer molecule and its relationship with biological function is one of the largest unsolved problems of modern science, the solution of which made it possible to create fundamentally new biotechnologies that can be used in protein and genetic engineering.
  • the proposed method and device for its implementation focused on non-invasive continuous monitoring of blood sugar, allow you to determine the blood sugar content by measuring using a fundamentally new method of spectroscopy of living tissue in vivo - absorption isothermal calorimetric spectroscopy, which allows you to determine in real time the content of biochemical components living tissue.
  • the magnitude of the power of electromagnetic radiation at the characteristic frequency of the investigated biochemical component, absorbed in the local volume of the substance of living tissue, is measured not by the change in the temperature of the tissue, but by the change in the magnitude of the osmotic pressure (or the amount of water in the intercellular space), which characterizes the volume of the intercellular substance in the heterophase condensed state at the phase transition temperature (corresponding to thermodynamic equilibrium crystalline and liquid phases of the intercellular substance).
  • the magnitude of the absorbed power of electromagnetic radiation falling on the surface of the investigated local area of the epidermis of living tissue is determined by the amount of intercellular substance that has changed the phase state (melting of the globular phase of hyaluronic acid), by measuring in real time the osmotic pressure of the intercellular substance.
  • the proposed method for early diagnosis and therapy of diabetes mellitus can be implemented using a fundamentally new method of spectroscopy of living tissue in vivo - absorption isothermal calorimetric spectroscopy, which allows to determine in real time the content of biochemical components of living tissue.
  • the specified technical result is achieved by implementing the method of isothermal calorimetric spectroscopy of biochemical components of the patient's living tissue, including the following stages:
  • the intensity of the electromagnetic radiation can be constant or variable, varying at a constant rate and / or modulated in frequency and / or amplitude.
  • the physiological parameter characterizing the thermodynamic phase state of the intercellular substance is the osmotic pressure of the intercellular substance and / or the amount of water in the intercellular space of the tissue and / or the elastic pressure of the living tissue under the applicator.
  • the biochemical components of the intercellular and / or intracellular substance are selected from the group including water, hyaluronic acid, glucose, triglycerides and other biochemical components of the intercellular substance, cells and blood.
  • the wavelength of the tissues of electromagnetic radiation are selected from the range of electromagnetic radiation, which is determined by the characteristic absorption frequencies of biochemical components of living tissue in the optical and / or near infrared and / or mid and far infrared and / or terahertz and / or microwave ranges.
  • the concentration of the biochemical component of the intercellular substance and / or intercellular fluid and / or blood is additionally measured based on the diffuse reflectance spectroscopy method.
  • the concentration of the biochemical component of the intercellular substance and / or intercellular fluid and / or blood is additionally measured based on the Raman spectroscopy method.
  • the biochemical component is blood glucose, the concentration of which is determined by the concentration of glucose associated with the monomers of the polymer chain of the intercellular substance.
  • the osmotic pressure of the intercellular substance or the amount of water in the intercellular space is determined on the basis of spectral measurements at wavelengths corresponding to the characteristic absorption frequencies of the biochemical components of the intercellular and / or intracellular substance.
  • spectral measurements are based on the method of dual-frequency spectroscopy, in which the wavelength of electromagnetic radiation is selected according to the characteristic frequency of the hyaluronic acid tetramer of the intercellular substance in the terahertz region, and the wavelength of the spectral sensor of the osmotic pressure of the intercellular substance is selected according to the characteristic frequencies of water absorption in the stratum corneum epidermis in the infrared region.
  • the osmotic pressure of the intercellular substance or the amount of water in the intercellular space is determined by the amount of water in the stratum corneum of the epidermis based on measuring the physical characteristics of the stratum corneum of the epidermis, which are selected from the group including electrophysical characteristics, spectral and optical-acoustic characteristics, thermophysical characteristics.
  • the osmotic pressure of the intercellular substance or the amount of water in the intercellular space is determined by the amount of water in the stratum corneum of the epidermis based on measurements of the spectral characteristics of the stratum corneum of the epidermis at wavelengths corresponding to the characteristic frequencies of water in the stratum corneum using a spectral method that is selected from the group including: IR spectroscopy, Raman - spectroscopy, optical-acoustic spectroscopy, differential two-beam spectroscopy.
  • the osmotic pressure of the intercellular substances or the amount of water in the intercellular space is determined by the amount of water in the stratum corneum of the epidermis by measuring the electrical characteristics of the stratum corneum of the epidermis, which are selected from the group including the transverse electrical conductivity of the stratum corneum on direct and / or alternating current and dielectric constant.
  • the blood glucose concentration is determined based on the temporal dynamics of the physiological parameter, the physiological parameter being the osmotic pressure of the intercellular substance of the tissue region by the iodine applicator, and the said intercellular substance under the applicator is a natural biosensor with a heterophase structure with selectivity to the glucose molecule and sensitivity to external heat fluxes, while the individual calibration of the local area of the patient's tissue is determined by the content of hyaluronic acid in the intercellular substance and the amount of water in the tissue volume under the applicator, measured by the spectral method.
  • the method is applicable for early diagnosis of diabetes mellitus based on the temporal dynamics of the concentration of the biochemical component.
  • the method is applicable for the early diagnosis of diabetes mellitus based on the temporal dynamics of the osmotic pressure of the intercellular substance.
  • the specified technical result is also achieved through the development and creation of a device for isothermal calorimetric spectroscopy of biochemical components of living tissue, containing heat and a waterproof applicator made with the possibility of applying a metered pressure to the patient's skin, a temperature sensor, one or more sensors of physiological parameters characterizing the thermodynamic phase the state of the intercellular substance under the applicator, one or more sources of electromagnetic radiation, a device for creating a calibration effect, while the physiological parameters sensors are located under the applicator, while the signals from the above sensors are sequentially fed to the inputs of the amplifier unit and / or synchronous detector and / or analog digital converter installed on the upper surface of the applicator, into the information processing unit and the information display unit.
  • the source of electromagnetic radiation is configured to emit with constant and / or modulated intensity and / or frequency modulation.
  • the sensors of physiological parameters characterizing the thermodynamic state of the intercellular substance under the applicator are made in the form of sensors for the osmotic pressure of the intercellular substance or sensors for the amount of water in the intercellular space of the tissue in the local volume under the applicator and / or elastic pressure sensor of living tissue under the applicator.
  • the device for creating a calibration effect is a heat power source made in the form of a resistor and / or a Peltier element and / or a source of electric current and / or voltage; a device for creating a metered pressure on the surface of the applicator.
  • the range of radiation of the sources of electromagnetic radiation is selected from the group including optical and / or near infrared; medium infrared; far infrared and / or terahertz; microwave radiation range.
  • the sensor of the osmotic pressure of the intercellular substance or the sensor of the amount of water in the intercellular space of the tissue in the local volume under the applicator is an electrometric sensor based on measuring the electrophysical characteristics of the stratum corneum of the epidermis and tissue under the applicator, the measurement principle of which is selected from the group including measurement transverse electrical conductivity of the stratum corneum of the epidermis in direct and / or alternating current; measurement of the dielectric constant of the oral layer of the epidermis; measurement of conductivity and / or dielectric constant of tissue under the applicator.
  • the sensor of the osmotic pressure of the intercellular substance or the sensor of the amount of water in the intercellular space of the tissue in the local volume under the applicator is an electrometric sensor based on measuring the electrophysical characteristics of the stratum corneum of the epidermis and tissue under the applicator, the measurement principle of which is selected from the group including measurement transverse electrical conductivity of the stratum corneum of the epidermis in direct and / or alternating current; measurement of the dielectric constant of the stratum corneum of the epidermis; measurement of conductivity and / or dielectric constant of tissue under the applicator.
  • the wavelengths of the electromagnetic radiation of the spectral sensor source are determined by the characteristic frequencies of absorption of biochemical components of the intercellular substance and / or intracellular substance, which are selected from the group including water, hyaluronic acid, glucose and other biochemical components of the intercellular substance and intercellular fluid ...
  • the osmotic pressure sensor of the intercellular substance is a spectral sensor based on spectral measurements of the characteristics of the intercellular substance in the terahertz range at a wavelength corresponding to the energy of cross-linking between the monomers of the polymer chain of hyaluronic acid.
  • the spectral sensor is based on a spectral measurements of the amount of water in the stratum corneum of the epidermis by the characteristic frequencies of water in the stratum corneum based on the spectral method, which is selected from the group including isothermal calorimetric spectroscopy, absorption spectroscopy, diffusion reflectance spectroscopy, Raman spectroscopy, optoacoustic spectroscopy.
  • the device according to the invention further comprises a spectral device including a source and a receiver of electromagnetic radiation for spectral measurements based on diffusion reflectance spectroscopy.
  • the sensor of physiological parameters characterizing the thermodynamic phase state of the intercellular substance under the applicator is made on a piezoelectric measurement method.
  • the device is applicable for the early diagnosis of diabetes mellitus based on the temporal dynamics of the concentration of the biochemical parameter and / or the value of the osmotic pressure of the intercellular substance.
  • the specified technical result is also achieved by implementing a method for obtaining a biopolymer molecule with desired biological properties and a given spatial structure, consisting of one or more subunits, capable of spontaneous folding into a spatial configuration with a heterophase structure having specificity for one or more given molecules of the substrate S, when a certain composition of the solvent, under certain conditions for temperature and pressure, which consists in the fact that the number of subunits is determined on the basis of the three-dimensional spatial structure of the macromolecule, while the primary structure of each subunit of the biopolymer molecule is determined as follows:
  • the monomers that form the primary structure of each subunit of the biopolymer macromolecule are identified, namely, at least a pair of monomers A and B, forming a repeating monomer -A-B- of the polymer chain, in which A is a monomer containing a group with a negative electric charge, and B is a neutral uncharged monomer with which the substrate molecule S can form a hydrogen bond, the energy of which corresponds to a given equilibrium constant;
  • univalent solvent ions corresponding to two different compounds capable of forming a weak ionic bond with a charged monomer, while one of the ions, the M ion, is selected with an equilibrium constant close to the substrate equilibrium constant S;
  • monomer A of the polymer chain has a positive charge
  • the ion M of the solvent has a negative charge
  • the ion M of the solvent is a monovalent positively charged metal ion.
  • the primary structure of a biopolymer macromolecule consisting of one subunit is a polysaccharide chain, the repeating monomer of which contains at least one type of disaccharide pair formed by one monosaccharide A with a negatively charged group and one neutral monosaccharide B. group.
  • the primary structure of the biopolymer macromolecule is the polymer chain of hyaluronic acid
  • the substrate molecule is a glucose molecule
  • the monovalent metal ion M is sodium ion
  • the chemical composition of the solvent is close to the chemical composition of blood plasma and the intercellular medium of living systems under physiological conditions in vivo.
  • a divalent ion and / or a substance is added to the solvent composition, the molecule of which has the ability to form a divalent ionic bond with negatively charged monomers of the polymer chain of hyaluronic acid.
  • the biopolymer molecule consisting of one subunit is a polypeptide chain of amino acids, with repeating monomers containing at least one amino acid with a negatively charged R group and one amino acid with a neutral uncharged group R h .
  • the monovalent metal ion M is a potassium ion, while the chemical composition of the solvent is close to the chemical composition of the intracellular environment of a living system under physiological conditions in vivo.
  • additional divalent metal ions or divalent compounds are added to the solvent composition, which are chosen from the group including the magnesium ion Mg +2 , manganese Mn +2 , ions of other metals and compounds.
  • the substrate is a D-glucose molecule and / or another monosaccharide molecule.
  • a biopolymer molecule with a heterophase structure is a biosensor with selectivity for a given substrate molecule S, active in an aqueous medium, converting the signal of the concentration of the substrate S into a signal proportional to the volume of the macromolecule and / or intramolecular osmotic pressure, which is measured by an electronic device.
  • the biopolymer molecule is a hyaluronic acid polysaccharide with selectivity for a glucose molecule.
  • a biopolymer molecule with desired biological properties consisting of two subunits, capable of spontaneous folding into a spatial configuration with a heterophase structure, having specificity for a given substrate molecule S, at a certain solvent composition, under certain conditions in temperature and pressure, and the method consists in the fact that for each of the two subunits the primary structure is determined as follows:
  • the monomers that form the primary structure of the first subunit of the biopolymer macromolecule are identified, namely, at least a pair of monomers A1 and B1.
  • A1 is a monomer containing a group with a negative electric charge
  • B1 is a neutral uncharged monomer, with which the substrate molecule S can form a hydrogen bond, the energy of which corresponds to a given equilibrium constant;
  • A2 is a monomer containing a group with a positive electric charge
  • B2 is a neutral uncharged monomer, with which the substrate molecule S can form a hydrogen bond, the energy of which corresponds to a given equilibrium constant
  • the monovalent ions of the solvent are identified, corresponding to two different compounds or substances capable of forming a weak ionic bond with charged monomer, while one of the ions, ion M, is chosen with an equilibrium constant close to the equilibrium constant of the substrate S;
  • the subunits are polypeptide chains of amino acids.
  • the location in the chain of repeating monomers characterizing the interaction between the subunits, forming a unique amino acid configuration of the active center of the protein molecule, which is formed during spatial folding in the region of the space between the domains of the subunits, is determined.
  • a bionolymer molecule with a heterophase structure is a biological catalyst with specified characteristics and selectivity for a given substrate molecule S, active in an aqueous medium, catalyzing biochemical reactions involving the substrate molecule S.
  • the biopolymer molecule is an enzyme with specified characteristics based on a biopolymer molecule with a heterophasic structure.
  • the primary structure of a biopolymer molecule with specified biological properties is determined by the characteristics of the hexokinase enzyme, the equilibrium constant and the rate of the biochemical reaction catalyzed by the enzyme.
  • the primary structure of a biopolymer molecule with specified biological properties is determined by the characteristics of the glucokinase enzyme, the equilibrium constant and the rate of the biochemical reaction catalyzed by the enzyme.
  • the quaternary spatial structure of the macromolecule is determined as follows:
  • the structure of the elementary chain of interaction is determined, which characterizes the interaction of the polymer chain with the solvent; for this, the substrate molecule is determined and the monovalent ion in the solvent composition is identified for each subunit;
  • the biopolymer molecule is an oligomeric protein.
  • the present invention also includes a biogulimer molecule with a heterophase structure, which is a biosensor with selectivity for a given substrate molecule and obtained by the method according to the invention, exhibiting activity in an aqueous medium.
  • the present invention also includes a biopolymer molecule with a heterophase structure having selectivity for a given biological substrate molecule S, which is a biological catalyst for catalyzing a biochemical reaction involving a substrate molecule S obtained by the method of the invention.
  • the biopolymer molecule is characterized by specificity for the glucose molecule, and also in that:
  • biopolymer molecule is a copolymer, which is a hyaluronic acid polysaccharide
  • the components of the solvent with a given acidity are simultaneously sodium and potassium ions, a glucose molecule.
  • the biopolymer molecule is characterized by specificity for a glucose molecule, and is characterized in that the biopolymer molecule is a polypeptide chain, the repeating monomer of which contains an amino acid with a negatively charged side group selected from the group consisting of glutamic acid, aspartic acid, glycine , cysteine, tyrosine, while the amino acid with an uncharged side group is selected from the group containing serine, asparagine, threonine, glutamine.
  • the amino acid with a negative charge of the side group is glutamic acid; amino acid with an uncharged side group is asparagine; the substrate of the biochemical reaction is D-glucose.
  • the negatively charged side group amino acid is aspartic acid; an amino acid with an uncharged side group is an amino acid selected from the group of asparagine, threonine, cysteine, serine; the substrate of the biochemical reaction is D-glucose.
  • the polypeptide chain additionally contains amino acids with positively charged side groups, which are selected from the group of lysine, arginine, histidine.
  • the solvent further contains a divalent metal ion, which is selected from the group consisting of magnesium ion Mg +2 , manganese Mn +2 , ions of other metals and compounds, or another compound.
  • the polypeptide chain of the first subunit contains an amino acid with a negatively charged side residue group
  • the polypeptide chain of the second subunit contains an amino acid with a positively charged side residue group
  • the amino acids of the active site of the protein are serine, the side residue of which has a negatively charged group, and histidine, the side residue of which has a positively charged group.
  • the biopolymer molecule is a molecule for creating a biopolymer substance or pharmaceutical composition based on hyaluronic acid for the treatment of wounds and tissue inflammation.
  • the biopolymer molecule is a molecule for creating a drug or pharmaceutical composition for the treatment of diabetes mellitus.
  • Figure 1 shows the spatial (tertiary) structure of a globular protein.
  • In fig. Za shows a graph of the dependence of the osmotic pressure of the intercellular substance of the human epidermis on the power of the incident infrared thermal radiation (with a maximum spectral power at a wavelength of l ⁇ 10 ⁇ m).
  • In fig. 36 shows a graph of the dependence of the osmotic pressure of the intercellular substance of the human epidermis on the concentration of glucose in the blood.
  • the abscissa shows the glucose concentration in mmol / liter; the ordinate function Po - P Osm where Po- constant whose value is determined by the individual calibration, P 0C m- osmotic pressure of the intercellular matter epidermis.
  • Figure 7 shows the microscopic forms (G) of the tetramer corresponding to different numbers of hydrogen bonds and discrete values of the tetramer binding energy.
  • Figure 7a shows the configuration (G) of the tetramer in equilibrium conformations (R) and (T), transforming into each other during thermal motion.
  • fig. 76 depicts the equilibrium configuration of a (Na) tetramer formed from 6 units (1-6) of non-adjacent chain regions (1-5-4 and 2-6-3).
  • FIG. 8 shows a random distribution of equally possible configurations of a tetramer (Na) in microscopic cells T (R 4 ), D (R 2 ), M (Ro), a unit cell: configuration R 4 in a cell T (2).
  • FIG. 10 depicts the isomeric conformations of the (Na) tetramer formed via hydrogen bonds.
  • On the right is a schematic diagram of a possible three-dimensional configuration of the isomeric conformation (s) formed from 6 units of the polymer network located on a plane oriented perpendicular to a straight line passing through 2 glucose molecules.
  • Figure 10a shows the distribution of monomers in the volume of a microscopic cell at concentrations of 2 and 3 monomers / 1 microcell.
  • Figure 11a shows the graph of the relative entropy of the polymer chain in the most probable configuration corresponding to the minimum free energy of the elementary volumetric interaction for thermodynamic phases (l) and (s) versus the glucose concentration of the solvent.
  • In fig. 116 is a graph of the free energy of volumetric interactions versus glucose concentration.
  • FIG. 12 shows a diagram of the energy levels of tetramers (l, s, g) of the polymer network of a natural macromolecule.
  • fig. 14 shows the graphs of the distribution functions ⁇ g (a) of unpopulated (l, s, g) tetramers: (l) tetramer - red curve; (s) tetramer - blue curve; (g) tetramer - purple curve.
  • FIG. 15 shows the graphs of the distribution function of dimers and tetramers (l, g, s): (l) tetramer - violet ⁇ a (a) and red ⁇ 2 l (a) curves; (g) tetramer - blue ⁇ i (a) and blue ⁇ 2 (a) curves; (s) tetramer - dark green ⁇ i s (a) and green ⁇ 2 S (a) curves.
  • FIG. 16 shows the graphs of the repulsive energy function of an ideal gas of free monomers in condensed phases (g, l, s): U g ,, ⁇ , (a) - phase G (green); U, ,, ⁇ , (a - phase l (red); U s rep (a) - phase s (blue).
  • Figure 17 shows a graph of the energy function of the elementary volumetric interaction (repulsion) Ux srep (a) of free monomers in phases (l, s).
  • Figure 18 shows the graphs of the energy functions of pair interactions and the internal energy of an ideal gas of free monomers for each condensed phase (l, s, g).
  • the figure shows graphs of 6 functions: 3 functions of attraction energy U g attr (ci), U s attr (ci), Ux attr (ci), 3 functions of repulsive energy U g , n , (a, U, ,, ⁇ , ( a, (L, n , (a.
  • FIG. 25 shows a diagram explaining the principle of an isothermal microcalorimeter of living tissue.
  • FIG. 26 is a block diagram explaining the principle of operation of the intercellular substance glucose biosensor.
  • FIG. 27 shows a schematic diagram of a spectral device for isothermal calorimetric spectroscopy (ICS) of biochemical components of the intercellular substance of living tissue in vivo.
  • ICS isothermal calorimetric spectroscopy
  • Fig. 29 shows a diagram of isothermal calorimetric spectroscopy of biochemical components of a living cell.
  • FIG. 30 is a schematic diagram of isothermal absorption calorimetric spectroscopy of a living cell.
  • fig. 32 shows the absorption spectra of glucose in the NC region and transmission in the near NC region in the wavelength range from 1.428 ⁇ m (7000 cm 1 ) to 20 ⁇ m (500 cm 4 ).
  • fig. 33 depicts the absorption spectrum of D-glucose in the near infrared region for different values of glucose concentration.
  • FIG. 34 schematically shows the structure of the intercellular substance, representing a branched macromolecule of hyaluronic acid, having the configuration of a polymer network surrounding a living cell.
  • fig. 36 shows the IR spectra of hyaluronic acid, glucose, protein and lipid: 1- fatty acid triglyceride (mutton fat); 2-hyaluronic acid; 3- protein (egg albumin); 4- glucose.
  • FIG. 37 shows a fragment of the IR spectra: 1 - fatty acid triglyceride (mutton fat), 2 - glucose, 3 - hyaluronic acid, 4 - protein (egg albumin).
  • FIG. 38 shows a diagram of diffuse reflectance spectroscopy for measuring the content of hyaluronic acid and free fatty acids in the intercellular substance of the surface layer of the epidermis of living tissue.
  • FIG. 42 is a schematic representation of the lipid matrix of the stratum corneum.
  • FIG. 43 shows a schematic diagram of a spectral device for implementing the method of spectroscopy of the intercellular substance of a local area of living tissue.
  • FIG. 44 shows a diagram of diffuse reflection spectroscopy for determining the osmotic pressure of the intercellular substance based on spectral measurement of the temporal dynamics of the amount of water in the stratum corneum of the epidermis at a wavelength corresponding to the characteristic frequency of water (1190, 1455, 1945, 945 nm).
  • Figure 45 shows photographs of a prototype and a proposed design for a commercial instrument.
  • fig. 46 shows the characteristic spasmodic temporal dynamics of blood sugar in patient D with type 1 diabetes mellitus (33 years old, male).
  • fig. 47 shows the spasmodic dynamics of blood sugar in the form of a single pulse, recorded using an isothermal microcalorimeter, and the temporal dynamics of the level of insulin in the blood, calculated on the basis of the sugar curve.
  • FIG. 48 shows the characteristic sugar curves (a, b) with a jump-like time dynamics in a patient with type 2 diabetes mellitus (66 years old, male): characteristic dynamics of blood sugar in the form of a time sequence of single impulses.
  • FIG. 49 shows the temporal dynamics of the osmotic pressure of the intercellular substance during the isothermal phase transition of living tissue (a patient with type 2 diabetes mellitus) during the dissolution of the crystalline (globular) phase of the intercellular substance.
  • fig. 50 shows characteristic monitoring curves of the osmotic pressure of the intercellular substance of a healthy patient and a patient with type 2 diabetes mellitus.
  • fig. 51 shows examples of sugar curves with a jump-like temporal dynamics: Fig. 51 a (test N ° 6 patient N ° 24), Fig. 51 6 (test N ° 1 patient N ° 41), Fig. 51 in (test N ° 5 nauHCHTJVM 1). Fig. 51 g (test N ° 6 patient ⁇ 41). In all graphs, the results of invasive measurements are shown with green circles, and the results of non-invasive monitoring with a purple curve.
  • fig. 54 shows the results of tests performed on a group of 42 patients (252 tests, 756 invasive measurements), obtained by combining the results of subgroup 1 and subgroup 2.
  • FIG. 58 schematically shows the main stages of the enzymatic reaction: a) diffusion of the ATP molecule from the liquid phase into the crystalline phase; B) attachment of a phosphate group (red) to a D-glucose molecule (yellow) to form a G6P molecule as a result of a chemical reaction in the crystalline phase of the enzyme; d) conformational transition of a tetramer with a bound G6P molecule from the crystalline phase to the liquid through the energy barrier separating the liquid from the crystalline phase; g) destruction of the tetramer in the liquid phase with the release of the product molecule G6P.
  • fig. 60a shows the curves of saturation and the rate of the enzymatic reaction of hexokinase, depending on the concentration of glucose.
  • fig. 60b is a graph of the energy barrier of hexokinase.
  • Heat transfer is a spontaneous and irreversible process of heat transfer due to a temperature gradient. There are the following types of heat transfer: thermal conductivity, convection, radiant heat transfer, heat transfer during phase transformations.
  • Heat transfer is heat exchange between the surface of the body and the medium in contact with it - the heat carrier (liquid, gas).
  • Evaporative cooling is heat exchange between the tissue and the environment due to the evaporation of water coming to the surface of the epidermis from the deep layers of the tissue.
  • the heat flux is determined by the product of the heat of vaporization (heat of vaporization) by the flux density of water evaporating from the surface.
  • Radiant heat transfer is the transfer of energy from one body to another, due to the processes of emission, propagation, scattering and absorption of electromagnetic radiation. Each of these processes is subject to certain patterns.
  • radiant heat transfer and other types of heat transfer (convection, thermal conductivity) is that it can proceed in the absence of a material medium separating the heat transfer surfaces, since electromagnetic radiation also propagates in vacuum.
  • Planck's law of radiation establishes a relationship between radiation intensity, spectral distribution and blackbody temperature. As the temperature rises, the radiation energy increases. The radiation energy depends on the wavelength. The total energy emitted by a black body measured by a non-contact infrared thermometer is the total energy emitted at all wavelengths. It is proportional to the integral of the Planck equation over wavelengths and is described in physics by the Stefan-Boltzmann law.
  • Thermal conductivity is one of the types of heat transfer from warmer parts of the body to less heated ones. Thermal conductivity leads to temperature equalization. With thermal conductivity, energy is transferred as a result of the direct transfer of energy from particles with higher energy to particles with lower energy. If the relative change in temperature T at the distance of the mean free path of particles is small, then the basic law of thermal conductivity (Fourier's law) is fulfilled: the heat flux density is proportional to the temperature gradient DT:
  • W AT -l c DT
  • l is the coefficient of thermal conductivity or thermal conductivity, independent of DT.
  • the coefficient l depends on the state of aggregation of the substance, its molecular structure, temperature, pressure, composition, etc.
  • Convection is the transfer of heat in liquids and gases by flows of matter. Convection leads to equalization of the temperature of the substance. With a stationary supply of heat to a substance, stationary convection flows arise in it. The intensity of convection depends on the temperature difference between the layers, thermal conductivity and viscosity of the medium.
  • Evaporative cooling is heat exchange between the tissue and the environment due to the evaporation of water coming to the surface of the epidermis from the deep layers of the tissue through the transport of water through the intercellular space.
  • the heat flux is determined by the product of the heat of vaporization (heat of vaporization) by the flux of water evaporating from the surface.
  • Imperceptible perspiration of water is observed in the temperature range in which the subject does not experience subjective thermal sensations (comfortable temperature range):
  • Atmospheric pressure 999-1001 hPa rt. pillar.
  • the intensity of the evaporative cooling process under comfortable conditions is normally 400-700 ml / day or 10 8 -10 7 g / sec cm 2 . This corresponds to the values of thermal flows 1-10 mW / cm 2 .
  • the threshold of sensitivity of the process to heat fluxes is 0.1 mW / cm 2 , which is equivalent to the sensitivity of the process to temperature drops in the external environment, equal to 0.05 degrees.
  • Glucose is oxidized in the body to form carbon dioxide and water; it is one of the most universal processes that underlies the processes of respiration and digestion. With the destruction of each glucose molecule, accompanied by a decrease in free energy, enough energy is released to form 93 ATP molecules by attaching phosphate groups to ADP molecules. It turns out that not all 93 molecules are actually formed. Moreover, the whole process includes a large number of enzymatic reactions. Nutrients (carbohydrates, fatty acids and amino acids) enter into a series of reactions that form the Krebs cycle (or tricarboxylic acid cycle), during which the carbon backbone of the molecules breaks down to form CCl, but ATP is not formed here.
  • Krebs cycle or tricarboxylic acid cycle
  • the amount of heat production, or thermal power, of the body can be quantified based on the following simple considerations.
  • the energy value of human nutrition is about 2400 kcal per day.
  • ATP an energy donor for the process of muscle contraction, in the course of reaction with myosin, allows you to receive a maximum of 50 Jhg 1 of energy.
  • an ideal muscular system i.e., with an efficiency equal to 100%
  • muscle efficiency is around 30-40%, the rest is released as heat.
  • glucose is the main energy substrate.
  • the normal concentration of glucose in human blood plasma depending on nutritional conditions, is maintained within the range of 50-120 mg%. After a meal, during the absorption phase, the concentration of glucose in the portal vein system can reach more than 270 mg%. An increase in blood glucose always causes an increase in insulin secretion.
  • the rate of glucose metabolism averages 140 mg / h per 1 kg of body weight, and approximately 50% of glucose is consumed by the brain, 20% - by muscles, 20% - by erythrocytes and kidneys, 20% - by muscles and only 10% of glucose remains on other tissues.
  • the rate of utilization (metabolic rate) of glucose in a healthy person is a linear function of plasma glucose concentration.
  • the mathematical dependence of glucose utilization on its concentration in the blood in normal people is expressed by the equation:
  • R u 0.004448C + 2.006, where R u is the rate of glucose utilization, mg / min per 1 kg of body weight, and C is the concentration of glucose in blood plasma, mg%.
  • utilization of glucose in the physiological sense means the rate of transfer of glucose from the blood into the general pool of tissue glucose and release from it in the course of metabolism. From a biochemical point of view, the rate of glucose utilization is determined by transport across the cytoplasmic membrane and intracellular oxidative phosphorylation of glucose.
  • turnover rate “assimilation” and “consumption” of glucose, widely used in the literature, are synonymous with the concept of “utilization” of glucose and are equivalent in any respect.
  • the object of this study is biopolymer molecules capable of spatial self-organization and acquiring a stable molecular structure due to weak intramolecular volumetric interactions of a non-valence nature.
  • biopolymer molecules capable of spatial self-organization under physiological conditions are polysaccharides and protein molecules with a polypeptide chain.
  • the behavior of proteins is entirely determined by the exclusive, inherent only to them spatial structural organization, which is due to non-valence interactions and is determined by extremely weak volumetric interactions. Losing it, proteins lose all their biological properties.
  • Protein chains are capable of spontaneously folding into strictly determined structures, the geometry and conformational dynamics of which under physiological (native) conditions are completely determined by the amino acid sequence.
  • the three-dimensional structures of proteins are individualized, very complex, and have a strict order, which, however, cannot be reduced to periodicity.
  • Figure 1 schematically shows the process of self-organization (folding) of a biopolymer molecule, which occurs spontaneously, as a phase transition of a statistical system of many interacting particles into a spatial configuration with a heterophase structure with a minimum free energy.
  • the ability of a natural polypeptide chain to self-organize in space and acquire a certain molecular structure is the most striking feature of proteins, which is absent in artificial polymer molecules, including human-derived poly-a-amino acids.
  • Biosensor based on a biopolymer molecule with a heterophase structure.
  • High molecular weight hyaluronic acid polysaccharide is the main component of the intercellular substance surrounding a living cell, which plays an important role in the self-organization of physicochemical processes of cellular metabolism, the most important of which is the process of physical thermoregulation of living tissue, which maintains a constant temperature.
  • the main intercellular component of which is the biopolymer molecule hyaluronic acid, the structure of which has remained unchanged in the process of long biological evolution, have a similar body temperature (36-38 ° C), which directly indicates the heterophase state of the intercellular substance , due to the thermodynamic properties of the biopolymer hyaluronic acid molecule.
  • thermodynamic properties of the biopolymer of hyaluronic acid can be carried out in vivo based on non-invasive measurements of the characteristics of the intercellular substance of the human epidermis using sensors located on the surface of the skin epidermis.
  • biopolymer hyaluronic acid molecule has the simplest primary structure, shown in Fig. 2, consisting of identical repeating monomers (disaccharides), consisting of 2 types of sugar residues (units), in contrast to the more complex primary structure of globular proteins (consisting of 20 types of units) , DNA and RNA (consisting of 4 types of units), therefore it is a unique model object of a biopolymer molecule for theoretical research.
  • thermodynamic properties of the intercellular substance were studied, in which the dependence of the osmotic pressure of the intercellular substance of the epidermis of human living tissue, which characterizes the thermodynamic phase state of the intercellular substance in a local area under a heat-resistant applicator (applied with dosed pressure on the skin surface and forming a closed living tissue system in the local area under the applicator), from external heat flow, external pressure and glucose concentration in the blood.
  • Fig. Za shows the experimental dependence of the osmotic pressure of the intercellular substance of the epidermis, which was measured by a non-invasive method in real time, on the power of external incident infrared thermal radiation (with a maximum spectral power at a wavelength of l ⁇ 10 ⁇ m) at a constant blood sugar level (in the time interval of the experiment) ...
  • 5 measurements were performed corresponding to different values of the incident power (in units of mW / cm 2 ): 10; 5.5; 3; 2; 0.5.
  • the threshold sensitivity of the intercellular substance is limited by intrinsic fluctuations of the osmotic pressure of the intercellular substance and is ⁇ 100 ⁇ W / cm 2 for observation times of 10 2 s; the obtained threshold value of sensitivity is equivalent to the difference in ambient temperature by 0.08 C °.
  • thermodynamic reversibility and isothermal nature of the heat exchange of a substance with the external environment are fundamental properties of a real substance, which manifest themselves at a triple point, in which the substance is in a heterophase state.
  • thermodynamic equilibrium between three phases of a substance is realized is a mixture of water, ice and steam at a triple point.
  • a mixture of water and ice at 273.16 K two phases are in equilibrium, and the processes of melting and freezing proceed reversibly at constant entropy: when the mixture is heated, ice melts, and when cooled, on the contrary, crystallization occurs - the formation of ice from liquid phase, while the water temperature remains constant (isothermal property).
  • Fig. 36 shows the dependence of the osmotic pressure of the intercellular substance on blood glucose concentration obtained experimentally in a clinical study on a group of 50 patients.
  • the reciprocal of the osmotic pressure of the intercellular substance linearly depends on the concentration of sugar in the blood in the concentration range 3 mmol / liter - 25 mmol / liter.
  • the experimental conditions are described in detail in the "Practical Application" section.
  • thermodynamic reversibility of transitions of the intercellular substance from one state to another has been experimentally proved - reversible changes in the concentration of glucose in the blood and, as a consequence, in the metabolic rate of living tissue, lead to reversible changes in the osmotic pressure of the intercellular substance: reversible physiological changes in the concentration of glucose in the blood lead to reversible changes osmotic pressure, similar to reversible changes in reversible osmotic pressure in the process of heat exchange of living tissue with the environment - a decrease in glucose concentration leads to an increase in osmotic pressure, and vice versa, an increase in blood glucose concentration leads to a decrease in osmotic pressure - a parameter response similar to a response to cooling of a substance.
  • thermodynamic reversibility of transitions of a substance from one state to another is a fundamental property of a real substance in a heterophase state at a triple point; therefore, the property of thermodynamic reversibility of the intercellular substance of living tissue, discovered experimentally, is direct evidence of the heterophase state of the intercellular substance under physiological conditions.
  • the intercellular substance of living tissue is thus a natural biosensor of glucose, consisting of two elements - a molecular recognizer and a transducer, which converts changes in glucose concentration into changes osmotic pressure of the intercellular substance.
  • Figure 26 shows a block diagram explaining the principle of operation of the intercellular substance glucose biosensor.
  • the results of experimental studies in vivo prove the unique biosensory properties of the intercellular substance of living tissue, due to the heterophase structure of the biopolymer molecule of hyaluronic acid - the intercellular substance is a unique natural biosensor with the property of thermodynamic reversibility and bioselectivity to the glucose molecule and extremely high sensitivity to external heat fluxes.
  • thermodynamic reversibility and selectivity makes the polysaccharide molecule of hyaluronic acid similar to protein molecules, in particular, with enzymes that have unique selectivity for certain substrate molecules and the property of catalyzing biochemical reactions involving these molecules.
  • enzymes that have unique selectivity for certain substrate molecules and the property of catalyzing biochemical reactions involving these molecules.
  • the term "substrate S” refers to a solvent molecule that interacts with the monomers of the polymer chain through the formation of a weak non-valence bond.
  • the solvent according to the invention is an aqueous solution of sodium, chlorine, potassium and glucose ions, while the difference between the sodium and chlorine concentrations is about 40 mmol / liter (excess of sodium ions), and the glucose content in the heterophasic interval can vary widely range from 3 to 15 mmol / liter.
  • the term "monomer” refers to repeating units (structural units) in the composition of a biopolymer molecule.
  • An example of monomer A is D-glucuronic acid containing a negatively charged group
  • an example of monomer B is O-Nacstylglucosamine. neutrally charged, forming a repeating disaccharide of the polymer chain of hyaluronic acid.
  • examples of monomers A are negatively charged glutamic acid and aspartic acid, and positively charged lysine, arginine, histidine
  • examples of monomers B are uncharged serine, threonine, glutamine, asparagine.
  • micromolecule with a heterophase structure means ... one - the only biopolymer molecule in the volume of which, under certain conditions, several thermodynamic phases can coexist - crystalline phase (globule), liquid (molten globule), gaseous (coil).
  • macromolecule with "specified biological properties and a given spatial structure” means a biopolymer molecule that has uniquely defined biochemical characteristics (equilibrium constant, rate of biochemical reaction) and a uniquely defined three-dimensional spatial structure.
  • solvent is understood. a substance capable of dissolving other solid, liquid or gaseous substances without changing them chemically. Typically, at atmospheric pressure and room temperature, the solvent is a liquid. Examples are water, sea water, glucose solution.
  • polypeptide chain which, together with other components, assembles into a multimeric or oligomeric protein complex.
  • Many naturally occurring enzymes and other proteins are composed of multiple protein subunits.
  • biological catalyst with specified characteristics refers to a catalyst with specific values of the rate constant and the rate of biochemical reaction that catalyzes.
  • enzyme with specified characteristics refers to a protein macromolecule with a uniquely defined three-dimensional spatial structure and certain values of the rate constant and the rate of biochemical reaction catalyzed by this enzyme.
  • biosensor with selectivity for a given substrate molecule refers to a biopolymer molecule that has selectivity (specificity) for a particular solvent molecule.
  • the property of isotherm in warm-blooded animals is the relative constancy of temperature, with reversible physiological changes in the concentration of glucose in the blood (which determines the rate of cellular metabolism and the intensity of heat production) and the heat balance of living tissue with the environment in the field of physical thermoregulation of the body, has a physical nature and is due to thermodynamic properties intercellular substance of the local microvolume of living tissue.
  • the intercellular substance in the physiological norm, is in a heterophase condensed state, in which a crystalline solid phase (globule) is in thermodynamic equilibrium with a metastable liquid phase (molten globule) and a gaseous phase (coil).
  • the heat introduced into the local volume of the substance leads to the melting of the solid phase of the substance - the phase transformation of the substance from the solid state “globule” to the liquid state “molten globule”; process melting of the globular phase of hyaluronic acid proceeds as a first-order phase transition with a change in the volume of a substance (which has changed its state of aggregation), caused by a change in the osmotic pressure of the substance.
  • a change in the osmotic pressure of the intercellular substance (the amount of water in the intercellular space), as a result of melting of the globular phase, leads to a change in the intensity of intercellular microcirculation - micro hydrodynamics (microfluidics) directed to the surface of the epidermis, providing isothermal heat exchange between tissue and the environment during evaporative cooling with an intensity W n ;
  • the heat balance of a reversible isothermal process, at constant entropy has the form:
  • thermodynamic equilibrium between three phases of matter is realized is a mixture of water, ice and steam at a triple point.
  • two phases are in equilibrium, and the processes of melting and freezing proceed reversibly at constant entropy: when the mixture is heated, ice melts, and when cooled, on the contrary, crystallization occurs - the formation of ice from the liquid phase, while the water temperature remains constant (isothermal property).
  • isothermal calorimetry is a measurement of the amount of heat introduced into the volume of a substance at a phase transition temperature.
  • the principle of isothermal calorimetry is used in practice in a well-known device - an isothermal phase transition calorimeter, in which the introduced heat does not change the temperature of the calorimetric system, but causes a change in the aggregate state of the substance that forms part of this system (for example, ice melting in the Bunsen ice calorimeter).
  • the amount of introduced heat is calculated in this case by the mass of the substance that has changed the state of aggregation (for example, the mass of melted ice, which can be measured by the change in the volume of the mixture of ice and water), and the heat of the phase transition.
  • the principle of operation of the ice calorimeter is that the amount of heat introduced into the calorimeter is measured not by the change in temperature, as in variable temperature calorimeters, but by the change in the volume of the water-ice mixture at the ice melting temperature.
  • the diagram of an isothermal ice calorimeter is shown in Fig. 24.
  • the amount of introduced heat is calculated by the mass of melted ice, which can be measured by the change in the volume of the mixture of ice and water and the heat of the phase transition.
  • the principle of operation of the isothermal calorimeter of living tissue is similar to the principle of the ice calorimeter and consists in the fact that the amount of heat introduced into the local volume living tissue or formed in this volume in the process of cellular metabolism, is measured not by the change in the temperature of living tissue, as in variable temperature calorimeters, but by the change in the volume of the intercellular substance, determined by the volume of the mixture globule (crystalline phase) - molten globule (liquid phase) located at the melting point of the hyaluronic acid globule. Changes in the volume of the extracellular substance can be determined by measuring the osmotic pressure of the extracellular substance.
  • FIG. 25 A diagram explaining the principle of an isothermal microcalorimeter of living tissue is shown in Fig. 25.
  • the change in the volume of the intercellular substance during the melting of the crystalline (globular) phase of hyaluronic acid of the substance, caused by the absorption of heat, is determined by measuring the osmotic pressure of the intercellular substance.
  • the biopolymer of hyaluronic acid of the intercellular substance of living tissue is a natural isothermal biosensor with high sensitivity to thermal energy due to the small value of the binding energy of ⁇ 3.5 kW of the molecular complex of the tetramer: thermal energy (amount of heat) introduced into the volume of the substance leads to isothermal melting of the crystalline phase substances flowing with energy absorption ”, and, as a consequence, to a change in the osmotic pressure of the intercellular substance, which can be measured using a sensor located on the surface of the epidermis of the skin.
  • the conformational transition of the Na-tetramer from the conformation (s) of the crystalline phase to the conformation (l) of the liquid phase can proceed only with the absorption of an energy quantum of 1 kW per tetramer.
  • the amount of heat that must be communicated to one unit mass of a crystalline substance in an equilibrium isobaric-isothermal process in order to transfer it from a solid (crystalline) state to a liquid is defined as the specific heat of fusion (enthalpy of fusion).
  • the principle of operation of the isothermal calorimeter of living tissue is that the amount of heat introduced into the calorimeter is measured not by the change in temperature, as in variable temperature calorimeters, but by the change in the volume of the intercellular substance, consisting of a mixture of crystalline (globule) and liquid (molten globule) phases, at temperature melting of the crystalline globular phase.
  • Fig. Za shows the experimental dependence of the osmotic pressure of the intercellular substance of the epidermis on the power of external incident infrared thermal radiation (with a maximum spectral power at a wavelength of l ⁇ 10 ⁇ m) at a constant blood sugar level (in the time interval of the experiment).
  • 5 measurements were performed corresponding to different values of the incident power (in units of mW / cm 2 ): 10; 5.5; 3; 2; 0.5.
  • the threshold sensitivity of the calorimetric spectrometer is limited by intrinsic fluctuations of the osmotic pressure of the intercellular substance and is ⁇ 100 ⁇ W / cm 2 for observation times of 10 2 s.
  • the flow rate of the intercellular fluid through the epidermis is determined by the gradient of the osmotic pressure of the intercellular substance.
  • the slope of the graph in Fig. Za corresponds to the coefficient of mass transfer of the epidermis, the value of which is determined by the concentration of glucose in the blood, an increase in which leads to an increase in the proportion of the crystalline phase of the substance in the intercellular space.
  • the concentration of glucose in the blood can be determined by the deep ' slope of the graph of the dependence of the osmotic pressure of the intercellular substance of the epidermis on the power of the external incident thermal radiation; the slope of the graph is determined by the concentration of glucose in the intercellular fluid (in the blood).
  • the peculiarity of the isothermal microcalorimeter of living tissue is that the intercellular substance of living tissue, along with an extremely high sensitivity to heat flow, is selective for the glucose molecule, the concentration of which determines the concentration of tetramers (crosslinks) of the polymer chain of hyaluronic acid and, as a consequence, determines the fractional ratio between the crystalline (globule) and liquid (molten globule) thermodynamic phases of the substance.
  • the intercellular substance of living tissue is a glucose biosensor, which consists of two elements - a molecular recognizer (tetramer) and a transducer, which converts changes in glucose concentration into changes in osmotic pressure of the intercellular substance.
  • Figure 26 shows a block diagram explaining the principle of operation of the intercellular substance glucose biosensor.
  • Substance of living tissue is a natural biosensor of glucose, which consists of two elements: a molecular recognizer, the role of which is played by the crystalline phase of the macromolecule, and a transducer, the role of which is played by the liquid phase, which converts changes in glucose concentration into changes in the osmotic pressure of the intercellular substance, which are recorded using a sensor located on the surface epidermis.
  • Caloric equation The caloric equation of state connecting the variables of the thermodynamic state of living tissue in a local volume under heat and a waterproof applicator in an isothermal calorimeter is determined from the basic equation of thermodynamics in the following way.
  • equation (44a) which relates the flows of conjugate processes of energy and matter transfer, which are measured in a real experiment, the following designations are adopted:
  • WMET is the power of the heat production process, which is determined from the requirement
  • AQMET ⁇ (W ME r) dt when integrated in the range from 0 to t.
  • the heat transfer component in the tissue volume under the applicator caused by the difference in blood pressure, depending on the sign of the mass transfer flow, can have a positive value (heat is injected into the system), negative value (heat is removed from the system), or zero.
  • K & t, Km, K p - constants, phenomenological coefficients which are determined by calibration.
  • Equation (44a) The equation of state connecting the powers of the coupled processes of energy and substance transfer under the applicator, which are measured in a real experiment, follows from equation (44a) by dividing all terms by dt and has the following form:
  • Equation (4a) can be written as an expression for calculating the magnitude of the heat effect of metabolism:
  • ⁇ is the enthalpy of the surface layer
  • ⁇ po is the temperature of the surface layer
  • M me the amount of water in the surface layer
  • the parameters KAT, K M , Kp correspond to the proportionality coefficients and are equal to the constants, which are determined by the calibration method.
  • the value of enthalpy is determined by the amount of water in a unit volume, which, at given values of climatic parameters, depends on the content of hyaluronic acid in the intercellular substance, which can change in diabetes and other chronic diseases, therefore it is an individual characteristic of a patient that can be determined by the calibration method.
  • the amount of water per unit volume of tissue, on the other hand, for a given hyaluronic acid content, is determined by climatic parameters.
  • the magnitude of the power of electromagnetic radiation at the characteristic frequency of the investigated biochemical component, absorbed in the local volume of the substance of living tissue, is measured not by the change in the temperature of the tissue, but by the change in the magnitude of the osmotic pressure (or the amount of water in the intercellular space), which characterizes the volume of the intercellular substance at the temperature of the phase transition (corresponding to the thermodynamic equilibrium of the crystalline and liquid phases of the intercellular substance).
  • the characteristic frequencies of the biochemical components of the substance of living tissue which include the components of the intercellular substance (hyaluronic acid, water, glucose, etc.), as well as intracellular biochemical molecules and organelles, form the electromagnetic absorption spectrum of the substance of living tissue, which in vivo can be determined by the isothermal calorimetric spectroscopy (ICS - isothermal calorimetric spectroscopy).
  • the method of isothermal calorimetric spectroscopy of living tissue is based on determining the magnitude of the absorbed power of electromagnetic radiation falling on the surface of the investigated local area of the epidermis of living tissue, by the amount of intercellular substance that changed the phase state (melting of the globular phase of hyaluronic acid), by measuring the amount of water in real time or osmotic pressure of the intercellular substance.
  • a schematic diagram of a spectral device based on the principle of isothermal calorimetric spectroscopy is shown in Fig. 27.
  • a source of electromagnetic radiation with a wavelength corresponding to the characteristic frequency of the biochemical component of living tissue is integrated into an isothermal microcalorimeter.
  • the following designations have been introduced: 1 - an applicator (heat and waterproof) designed to be applied to the skin with a metered pressure, forming a closed thermodynamic system of living tissue; 2 - a source of electromagnetic radiation with a tunable wavelength; 3 - sensor of osmotic pressure of intercellular substance or micro-flow of intercellular hydrodynamics.
  • the radiation is amplitude modulated.
  • the iodine applicator excites fluctuations in the elastic pressure of the intercellular substance, caused by fluctuations in the osmotic pressure at the modulation frequency of the radiation.
  • the magnitude of the absorbed power of electromagnetic radiation can be determined by measuring the elastic pressure of the tissue under the applicator at the modulation frequency of the radiation.
  • the closest analogue of the described method is the well-known method of optical-acoustic (OA) spectroscopy, based on the effect that manifests itself in the form of gas pressure pulsations in a closed volume upon absorption of radiation modulated at an acoustic frequency.
  • the appearance of this effect is associated with the conversion of a part of the energy excited by the radiation of molecules into the thermal energy of the medium due to no radiative transitions.
  • the optical-acoustic effect arises due to the conversion of a part of the absorbed energy into thermal energy, which leads to the formation of acoustic vibrations in the sample itself or in the gas in contact with it. Registration of acoustic vibrations directly in the substance is carried out by a piezoelectric sensor (liquid and solid samples) or a microphone (gases).
  • the additivity principle is used, according to which the absorption of an individual substance does not depend on other substances that have their own absorption. Therefore, at a given wavelength, the spectral density of a solution from a mixture of components that do not interact with each other is equal to the sum of the spectral densities of individual components at the same wavelength.
  • the intensity of the radiation flux passed through this solution is compared with the intensity of the radiation passed through the reference solution-blank.
  • the spectral signal (radiation intensity) at a wavelength corresponding to the characteristic frequency of the test compound is compared with the spectral signal due to the absorption of pure water at a given wavelength, the intensity of which can be estimated based on the spectral measurements at a different frequency corresponding to the absorption peak of water, which does not coincide with the absorption peaks of the investigated substance.
  • Terahertz (THz) spectroscopy of living tissue is based on measuring the magnitude of the absorbed power of terahertz radiation incident on the surface of the investigated local area of the epidermis of living tissue, by the amount of intercellular substance that has changed the state of aggregation, by measuring in real time the amount of water or osmotic pressure of the intercellular substance.
  • terahertz radiation makes it possible to study the role of water in biological processes, as well as characteristic oscillatory processes that can characterize the state of a biosystem.
  • An important advantage of terahertz spectroscopy from the point of view of medicine is that this method is non-contact and non-invasive - radiation in this spectral range does not cause ionization (like ultraviolet light) and significant heating of the object (like microwave).
  • the terahertz range makes it possible to determine the level of connectivity of water molecules in biological systems, the level of solvation of ions in solution and the level of surface hydration at the phase boundary.
  • Fig. 12 schematically shows the diagram of the energy levels (l, g, s) of the tetramer of hyaluronic acid of the intercellular substance, which makes it possible to calculate the quantum energy of terahertz radiation.
  • the obtained value of the wavelength corresponds to the terahertz (THz) range of the electromagnetic spectrum, which is located in the wavelength interval between 10Omkm (far PC) and 1 mm (microwave).
  • THz terahertz
  • the spatial distribution of biochemical components in the microvolume of living tissue is not uniform: hyaluronic acid, which is the main component of the intercellular substance, is not part of the intracellular substance; the concentration of glucose in the intercellular space is higher than its concentration inside the cell, in which the glucose oxidation reaction is taking place; the total amount of water in the intercellular space of a unit volume of living tissue is much less than the total amount of intracellular water, since the cell volume is much larger than the volume of the intercellular space.
  • Radiation energy which is absorbed by intracellular water (and / or other intracellular molecules) in the isothermal process, is converted into the energy of thermal movement of molecules in the volume of the cell and the intercellular space surrounding the cell; the interaction of the tetramer of the intercellular substance with a quantum of thermal energy (thermal collision of the molecule of the substance with the tetramer), which is formed in the volume of the cell, leads to an isothermal change in the osmotic pressure of the intercellular substance, as a result of the dissociation of the tetramer.
  • Thermal energy arising in the volume of the intercellular substance as a result of absorption of the energy of external electromagnetic radiation leads to isothermal melting of the crystalline phase of the intercellular substance.
  • a living cell surrounded by an intercellular substance is an isothermal calorimetric power detector that converts electromagnetic energy absorbed in the cell volume (or arising in a cell during metabolism) into the osmotic pressure of the intercellular substance.
  • FIG. 29 shows a diagram of isothermal calorimetric spectroscopy of biochemical components of a living cell.
  • a living biological cell surrounded by intercellular substance is a natural isothermal microcalorimeter of the power of electromagnetic radiation, which makes it possible to determine the absorption spectrum of the substance of living tissue on the basis of measuring the dependence of the osmotic pressure of the intercellular substance on the spectral power of the incident radiation (1, 2, 3, 4, 5): 1 - electromagnetic radiation at the characteristic frequency of hyaluronic acid; 2 electromagnetic radiation at the characteristic frequency of glucose; 3, 4 - electromagnetic radiation at the characteristic frequency of water; 5 - electromagnetic radiation at the characteristic frequency of intracellular biochemical molecules or organelles.
  • Electromagnetic radiation with a wavelength corresponding to the characteristic frequency of water is absorbed in the volume of the cell: the energy of such radiation is converted into the energy of thermal movement of water molecules and free links of the polymer chain, which leads to dissociation of the tetramer of hyaluronic acid and isothermal change in the osmotic pressure of the intercellular substance.
  • a living cell surrounded by intercellular substance is an isothermal power calorimeter that converts electromagnetic energy absorbed in the volume of the cell (or generated in the cell during metabolism) into the osmotic pressure of the intercellular substance.
  • the response of the osmotic pressure of the intercellular substance of a local area of living tissue to terahertz radiation with a wavelength of l ⁇ 152 ⁇ m will consist of two contributions: the spectral response of the intercellular substance tetramer and the spectral response to the absorption of this radiation by water molecules.
  • the spectral contribution due to the absorption of water exceeds the spectral contribution due to the absorption of electromagnetic energy by the tetromer, since, in a unit volume of living tissue, the volume of the intracellular substance significantly exceeds the volume of the intercellular substance.
  • a three-beam (three-wave) spectroscopy scheme can be used, in which the wavelengths correspond to the local extremum of the absorption peak (l ⁇ 152 ⁇ m) and two side frequencies corresponding to the minima of the peak.
  • the contribution to the signal due to the absorption of intracellular water is determined at a wavelength corresponding to the lateral frequencies of the absorption peak of the hyaluronic acid tetramer.
  • spectral measurement assumes that the spectrum of hyaluronic acid does not contain other absorption peaks near the absorption line of the tetramer l ⁇ 152 ⁇ m, due to other fragments of hyaluronic acid.
  • the method of isothermal calorimetric spectroscopy can be used in practice to determine in vivo the content of biochemical components (intercellular and intracellular substance) of living tissue.
  • the method makes it possible to determine the concentration of glucose in the blood based on measuring the concentration of hyaluronic acid tetramers of the extracellular substance, which is proportional to the concentration of glucose bound by hyaluronic acid.
  • 1/3 of the total number of glucose molecules in the volume of the hyaluronic acid macromolecule is in a free state, and the remaining 2/3 of glucose molecules are bound to monomers of the polymer chain of hyaluronic acid, of which 1/3 of glucose molecules are linked directly in the molecular complex tetramer.
  • the concentration of free (unbound) glucose in the intercellular fluid can be determined by measuring the concentration of glucose bound in tetramers of the intercellular substance (or the concentration of glucose bound to the polymer chain of hyaluronic acid).
  • the additivity principle is used, according to which the absorption of an individual substance does not depend on other substances that have their own absorption. Therefore, at a given wavelength, the spectral density of a solution from a mixture of components that do not interact with each other is equal to the sum of the spectral densities of individual components at the same wavelength.
  • the intensity of the radiation flux passed through this solution is compared with the intensity of the radiation that passed through the reference solution — blank.
  • the spectral signal (radiation intensity) at a wavelength corresponding to the characteristic frequency of the test compound is compared with the spectral signal due to the absorption of pure water at a given wavelength.
  • the development of a method for real-time measurement of the water content in living tissue is an urgent task of practical and fundamental importance.
  • the method of isothermal calorimetric spectroscopy allows in vivo determination of the water content (in the intercellular space and cell volume) of a local area of living tissue by measuring the electromagnetic absorption spectrum at wavelengths corresponding to the characteristic frequencies of water, which have now been studied in sufficient detail for pure water.
  • the absorption spectrum of water in a wide frequency range is shown in Fig. 31.
  • the energy of the incident electromagnetic radiation is absorbed in the volume of the cell and is converted into the energy of the thermal motion of water molecules (the principle of an isothermal calorimeter), which leads to an isothermal change in the osmotic pressure of the intercellular substance as a result of melting of the crystalline phase of the intercellular substance.
  • the distribution of the spectral power of the absorption peak can be determined using a three-beam (three-wave) spectroscopy scheme, in which the wavelengths correspond to the local extremum of the peak (the wavelength corresponding to the maximum peak of 3339 cm 1 (2.99 nm) and two side frequencies 3250 and 2750 cm 1 , corresponding to the minima of the peak
  • the amount of heat absorbed at a given wavelength in the frequency range 2750 cm ! - 3250 1 cm 1 is determined by the magnitude of the change in the osmotic pressure of the intercellular substance.
  • the absorption coefficient of water can be assumed constant, since in the absorption spectrum of water near the characteristic frequency (l ⁇ 152 ⁇ m) of the tetramer of the intercellular substance, as follows from Fig. 31, no local absorption peaks are observed.
  • Osmotic pressure and the amount of water in the intercellular substance are determined by the concentration of glucose and the magnitude of the external heat flux falling on the surface of the epidermis, determined by climatic parameters.
  • the method of isothermal calorimetric spectroscopy which makes it possible to measure the amount of water in a local microvolume of living tissue, can be used in practice to determine the concentration of glucose in the intercellular substance and blood.
  • the concentration of glucose in the blood can be determined from the experimental dependence of the osmotic pressure on the power of the incident infrared thermal radiation, presented in Fig. For, according to the slope of the graph of the dependence of the osmotic pressure of the intercellular substance of the epidermis on the power of the incident thermal radiation.
  • the microcalorimetric spectroscopy method described above makes it possible to determine the dependence of osmotic pressure on thermal power in another way, using modulated electromagnetic radiation (with amplitude or frequency modulation).
  • modulated electromagnetic radiation with amplitude or frequency modulation.
  • radiation is applied at a wavelength corresponding to the selected characteristic frequency of the water, with amplitude (intensity) modulation.
  • An important feature of the spectral measurement method using radiation with amplitude modulation is that the method makes it possible to exclude the dependence of the osmotic pressure signal on low-frequency fluctuations of climatic parameters.
  • the method of spectral measurement with amplitude modulation makes it possible to calibrate the measuring device in a non-invasive way, by determining the enthalpy and other calibration parameters using the caloric equation (45).
  • spectral measurements are carried out at several wavelengths corresponding to the characteristic absorption frequencies of water. Measurement of the response of the osmotic pressure of the intercellular substance to electromagnetic radiation (with the same power) at several different wavelengths, for which the absorption coefficients are preliminarily determined and known, makes it possible to determine the dependence of the signal of the osmotic pressure of the intercellular substance on the power of electromagnetic radiation absorbed in the local area of living tissue under the applicator ...
  • the dependence of the osmotic pressure on the absorbed power, obtained by the described spectral method using modulated radiation, makes it possible to determine the concentration of glucose in the blood.
  • An important feature of the method is that the spectral method of measurement at several frequencies (at least two), which can be performed in real time, makes it possible to exclude the contribution to the signal of osmotic pressure caused by low-frequency fluctuations of climatic parameters.
  • Factors limiting the accuracy of the described spectral method for measuring glucose concentration include the proximity of the absorption peaks of water with the absorption peaks of other molecules, for example, hyaluronic acid and glucose.
  • the spectral absorption lines of water, the intensity of the peaks of which is determined by the volume of intracellular water, are located near the absorption lines of glucose.
  • the resulting signal of osmotic pressure is mainly determined by the absorption of the radiation power by intracellular water, the contribution of which to the signal exceeds the contribution due to the absorption of the power of electromagnetic energy by the biochemical components of the intercellular substance (hyaluronic acid and glucose), since the volume of the intracellular substance, in a unit volume, significantly exceeds the volume of the intercellular substance ...
  • the scheme of spectral measurements at the characteristic frequencies of water, taking into account the absorption spectrum of glucose makes it possible to increase the signal-to-noise ratio in the measuring circuit.
  • Fig. 32 The absorption spectra of glucose in the IR region and transmission in the near IR region in the range of wavelengths from 1.428 ⁇ m (7000 cm ! ) to 20 ⁇ m (500 cm 1 ), which are currently investigated in sufficient detail, are shown in Fig. 32.
  • Fig. 33 shows the absorption spectra of glucose in the near infrared region in the wavelength range of 1.428 ⁇ m (7000 cm 1 ) - 2.5 ⁇ m (4000 cm 1 ).
  • fluctuations in blood glucose concentration lead to fluctuations in the intensity of glucose uptake peaks.
  • the wavelength can be selected in one of the intervals between the glucose absorption peaks, for example, 7000 cm 1 (1.428 ⁇ m), 5000 cm 1 (2 , 0 ⁇ m), 4000 cm 1 (2.5 ⁇ m).
  • the concentration of glucose in the blood can be determined on the basis of isothermal calorimetric spectroscopy in two different ways: the method of terahertz spectroscopy - measuring the concentration of hyaluronic acid tetramers of the intercellular substance (proportional to the concentration of bound glucose in the intercellular substance) at a wavelength of terahertz radiation (l ⁇ 152 ⁇ m), corresponding to the characteristic frequency of the tetramer; method of infrared spectroscopy - measurement of the concentration of hyaluronic acid tetramers based on the dependence of the osmotic pressure of the intercellular substance on the absorbed radiation power, which is determined in real time on the basis of spectral measurements using radiation with amplitude modulation at one wavelength (or at several wavelengths) corresponding to the characteristic frequency of water in the infrared or other region of the electromagnetic spectrum.
  • the signal-to-noise ratio in the spectral measurement scheme described above can be improved by additional measurement of other biochemical components of the extracellular substance, in particular, the content of hyaluronic acid. Spectroscopy of hyaluronic acid and other components of the intercellular substance is discussed below. Isothermal calorimetric spectroscopy of the intercellular substance.
  • the absorption spectrum of the intercellular substance (which is a multicomponent biopolymer) has a more complex structure of spectral absorption lines, in comparison with the spectrum of pure water, since, along with intense absorption peaks of water (mainly intracellular), it contains absorption peaks corresponding to the characteristic frequencies of the biochemical components of the intercellular substance, the main the components of which are water, hyaluronic acid and glucose associated with monomers of the polymer chain of hyaluronic acid, intercellular (tissue) fluid, similar in composition to blood plasma, which consists of water, amino acids, sugars, fatty acids, coenzymes, hormones, neurotransmitters, salts as well as cell waste.
  • the characteristic binding energies of molecules of various pharmaceutical compounds, as well as molecules of compounds and foreign inclusions in condensed media of the intercellular substance, physiologically incompatible with the metabolism of living tissue can also appear in the infrared and terahertz ranges of the electromagnetic spectrum and appear in the absorption spectra of the intercellular substances.
  • the spectral signal (radiation intensity) at a wavelength corresponding to the characteristic frequency of the test compound is compared with the spectral signal due to the absorption of pure water at a given wavelength.
  • Figure 34 schematically shows the structure of the intercellular substance, which is a branched hyaluronic acid macromolecule with the configuration of a polymer network surrounding a living cell.
  • Crosslinks of the polymer network are formed as a result of bulk interactions of monomers of the polymer chain with glucose of the solvent (intercellular fluid) in the configuration of a tetramer - a molecular complex consisting of two non-adjacent disaccharides of the polymer chain of hyaluronic acid and two D-glucose molecules.
  • a living cell surrounded by an intercellular substance is a natural isothermal power calorimeter that makes it possible to determine the absorption spectrum of the intercellular and intracellular substance of living tissue based on measuring the dependence of the osmotic pressure of the intercellular substance on the spectral density of electromagnetic radiation on different wavelengths (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7): 1- terahertz radiation at the characteristic frequency (l ⁇ 152 ⁇ m) of hyaluronic acid tetramer; 2 - radiation at characteristic frequencies of glucose associated with monomers of the polymer chain of hyaluronic acid; 3, 4 - radiation at characteristic frequencies of hyaluronic acid disaccharide; 5, 6 - radiation at the characteristic frequencies of water; 7 - electromagnetic radiation at the characteristic frequency of an intracellular molecule.
  • the absorption of terahertz radiation leads to dissociation of the molecular complex of the tetramer with the conversion of electromagnetic energy into the energy of thermal movement of molecules, as a result of which an isothermal change in the osmotic pressure of the intercellular substance occurs.
  • the energy of the incident electromagnetic radiation is absorbed in the bulk of the substance and is converted into the kinetic energy of the thermal movement of molecules, which leads to a change in the osmotic pressure of the intercellular substance as a result of the dissociation of the tetramer of hyaluronic acid.
  • Figure 32 shows a graph explaining the nature of the characteristic frequencies of the glucose molecule in the infrared region.
  • Hyaluronic acid and free fatty acid spectra Hyaluronic acid and free fatty acid spectra.
  • Infrared spectra of the studied substances which are components of the constituent parts of biological tissues (glucose, hyaluronic acid, protein - egg albumin, lipid - rendered lamb fat), in the frequency range 4000 - 600 cm -1 , obtained in this study on an IR Fourier spectrometer (Tensor 37 from Bruker) are shown in Fig. 36.
  • the structure of the spectrum in the lower-frequency region of the IR spectrum can be analyzed on the basis of the selected fragment of the spectra of all the components under consideration, shown in Figure 37.
  • a very intense narrow band of carboxyl carbonyls 1743 cm 1 (5.7 ⁇ m) and less intense 1553 cm 1 (6.4 microns) is present in the spectrum of lipid (lamb rendered fat); these two bands, which are also present in the spectra of all animal fats (lamb fat, pork, chicken, marmot, fish and vegetable oils - olive, almond, linseed, cottonseed, sunflower, etc.), are due to the frequencies of triglyceride of fatty (mainly unsaturated) acids ...
  • Measurement of the content of hyaluronic acid in living tissue is an urgent task of independent practical importance in cosmetology, dermatology, regenerative medicine, etc .; the urgency of the problem is due to the need to monitor hyaluronic acid for early diagnosis of diabetes, as well as in the process of non-invasive monitoring of blood sugar in patients with diabetes mellitus.
  • the absorption lines of hyaluronic acid and glucose are located near the intense peak of water absorption in the region (4000-3000 cm 1 ), while the intensity of the water absorption peak is determined by the absorption in the cell volume, therefore, it is many times higher than the intensity of the glucose peaks
  • the spectroscopy of hyaluronic acid and glucose which are components of the intercellular substance, is reduced to the isolation of weak spectral absorption peaks of the components of the intercellular substance against the background of an intense spectral peak of water caused by the absorption of water in the volume of the cell, which is many times higher than the intensity of spectral peaks of glucose and hyaluronic acid of the intercellular substance;
  • the problem of spectral measurement of the biochemical components of the intercellular substance is a more complex experimental problem in comparison with the problem of spectral measurement of the amount of water per unit volume of living tissue.
  • IR spectroscopy of hyaluronic acid As you know, the distribution of hyaluronic acid is uneven throughout the thickness of the epidermis, its content in the stratum corneum and the upper layers of the epidermis is higher than its content in the dermis; the authors of the study assume that the transport of hyaluronic acid into the stratum corneum is carried out from keratinocytes located directly under the stratum corneum of the epidermis; keratinocytes - the main cells of the human epidermis (make up approximately 90% of all cells of the epidermis), which are contained in the basal, prickly, granular, shiny stratum corneum of the epidermis.
  • FIG. 38 shows a diagram of diffuse reflectance spectroscopy for measuring the content of hyaluronic acid and free fatty acids in the intercellular substance of the surface layer of the epidermis of living tissue. Radiation diffusely reflected from the surface layer of the epidermis is collected at a wide angle and transmitted to the detector.
  • hyaluronic acid in the surface layer of the epidermis, it is possible to use near electromagnetic radiation of the near infrared (or optical) region with a wavelength corresponding to the characteristic frequency of hyaluronic acid. For example, you can select the frequency in the range of the absorption peak 7000 cm 1 (1.43 ⁇ m), which is located on the spectrum near the absorption peak of glucose 6000 cm 1 (1.67 ⁇ m).
  • the NIR spectrum of hyaluronic acid is shown in Fig. 32.
  • Fig. 40 shows the absorption spectra of hyaluronic acid in the IR and near-IR regions of the spectrum, from which it follows that the absorption peaks of hyaluronic acid near 3500 cm-1 (2.8 ⁇ m) and 7000 cm-1 (1.43 ⁇ m) are superimposed on the absorption peaks of water (Fig. 31).
  • a single-beam (one wavelength) combined spectral method is used, which is obtained as a result of a combination of two methods - isothermal calorimetric spectroscopy, which makes it possible to determine the water content in the epidermis (since the intensity of the absorption peak of intracellular water is many times higher than the absorption intensity of intercellular hyaluronic acid), and diffuse reflection spectroscopy, which allows you to determine the total content of water and hyaluronic acid in the surface layer of the epidermis.
  • the contribution of hyaluronic acid is isolated from the resulting spectral signal of diffuse reflection by subtracting from the total signal the temporal dynamics of the amount of water in the stratum corneum of the epidermis under the applicator impermeable to water and heat applied to the surface with metered pressure.
  • the measurement is carried out according to the scheme of single-beam spectroscopy at one wavelength corresponding to one of the characteristic frequencies of hyaluronic acid, which is selected in the frequency range of the spectrum in which the absorption peaks of hyaluronic acid are superimposed (or are closely located) on the absorption peaks of water (UV, optical, near IR, IR, far IR).
  • the use of an additional spectral measuring channel based on the registration of electromagnetic radiation diffusely reflected from the surface layer of the epidermis, as well as the use of a measuring method for synchronous detection of signals makes it possible to increase the signal-to-noise ratio of the measuring channels.
  • the dependence of the response of the osmotic pressure on the power of the incident electromagnetic radiation with amplitude modulation at a wavelength corresponding to the characteristic frequency of water allows determining the glucose concentration based on the method described above.
  • the use of a combination of two spectral methods allows to obtain a better separation of signals and to determine the content of three biochemical components of living tissue, glucose, hyaluronic acid and water, using measurements at the same wavelength. corresponding to one of the characteristic frequencies of hyaluronic acid (single-beam spectroscopy).
  • the combined spectral method described above based on two-beam spectroscopy (at two wavelengths) corresponding to the characteristic frequencies of glucose and hyaluronic acid (near the absorption peak of water), allows to obtain better signal separation and, with a higher signal-to-noise ratio, to determine the glucose concentration, and also the content of two other components, hyaluronic acid and water, the low-frequency temporal dynamics of which directly affects the signal-to-noise ratio when measuring glucose concentration.
  • Spectral measurement at each wavelength is carried out in two ways (isothermal calorimetric spectroscopy and diffuse reflectance spectroscopy), the combination of which in one spectral device allows to obtain better separation of signals.
  • a wavelength of 6000 cm 1 (1.67 ⁇ m) corresponding to the characteristic frequency of glucose and a wavelength of 7000 cm 1 (1.43 ⁇ m) corresponding to the characteristic frequency of hyaluronic acid can be selected.
  • the glucose concentration is determined using the caloric equation (45), in which the value of the enthalpy AH, which depends on the content of hyaluronic acid in the intercellular substance (and has individual values for different patients) and the amount of water in a unit volume of tissue, which depends on climatic parameters, is determined by the spectral method according to the absorption lines of hyaluronic acid and water.
  • the glucose concentration is determined using the three-beam spectroscopy scheme at 3 wavelengths corresponding to the isolated absorption peaks of glucose, water and hyaluronic acid.
  • Spectral measurements are carried out in the following spectral ranges: in the interval 3550-3050 cm 1 (2.8 - 3.3 ⁇ m) at one frequency of 3339 cm ! (2.99 nm) corresponding to the absorption peak of water (or three frequencies corresponding to the absorption peaks of water, hyaluronic acid and glucose); at a frequency of 1637 cm 1 (6.08 ⁇ m), corresponding to the second peak of glucose uptake; at a frequency of 1553 cm 1 (6.4 ⁇ m), corresponding to the third peak of glucose uptake.
  • Spectral absorption lines of glucose in the optical and near infrared regions of the spectrum are also located near the intense peaks of absorption of water (Fig. 31).
  • Fig. 41 shows the theoretical absorption spectra of glucose, melanin and water in the red and near infrared range.
  • the method for measuring glucose concentration in the red and near infrared range is based on the single-beam combination scheme described above.
  • a single-beam combined spectral method is used, which is obtained as a result of a combination of two methods - isothermal calorimetric spectroscopy, which makes it possible to determine the water content in the epidermis (since the intensity of the absorption peak of intracellular water repeatedly higher than the absorption intensity of intercellular hyaluronic acid), and diffuse reflection spectroscopy, which allows you to determine the total content of water and glucose in the surface layer of the epidermis.
  • the combination of two spectral methods allows to obtain a better separation of signals and to determine the content of two biochemical components of living tissue, glucose and water, using measurements at one wavelength corresponding to one of the characteristic frequencies of glucose ( single-beam spectroscopy).
  • the measurement channel based on isothermal calorimetric spectroscopy makes it possible to determine the water content in the volume of the epidermis, since the intensity of the absorption peak of intracellular water is many times higher than the absorption intensity of glucose, the concentration of which in the cell volume is significantly lower than its concentration in the intercellular space, as a result of the process of glucose oxidation in the volume of the cell; the second measurement channel, based on diffuse reflectance spectroscopy, makes it possible to determine the total content of water and glucose in the surface layer of the epidermis.
  • two wavelengths are used, for example, a wavelength in the range of 930-1050 nm, corresponding to the width of the absorption peak of water, and a wavelength in the range of 1000-1100 nm, corresponding to the absorption peak of glucose; additionally, a wavelength in the range of 900-970nm can be used, corresponding to the second peak of water absorption.
  • the content of hyaluronic acid is additionally determined at a wavelength that is selected in the same frequency range, or in another near-IR region, for example, 7000 cm 1 (1.43 ⁇ m).
  • the scheme of spectral measurements in the optical range should be developed taking into account the need for individual calibration for the content of skin melanin.
  • Electromagnetic radiation with a wavelength corresponding to the characteristic frequencies of free fatty acids will be intensively absorbed in the lipid layer of the epidermis located under the stratum corneum, as well as in the volume of the fat layer located under the dermis.
  • the lipid layer of the epidermis, located under the stratum corneum is 10-25 layers of cells oriented parallel to the surface and immersed in a lipid matrix, which makes up about 10% of its volume, having a unique structure and chemical composition.
  • the skin contains both free fatty acids and fatty acids bound to triglycerides, phospholipids and ceramides.
  • Epidermal lipids mainly consist of: ceramides (50%); cholesterol and its esters (25%) of saturated fatty acids (10%).
  • a spectral method can be used, which is a combination of two spectral methods, isothermal calorimetric spectroscopy (for probing the fatty layer of the skin located under the dermis) and diffuse reflection spectroscopy, based on the registration of electromagnetic radiation diffusely reflected from the intercellular substance of the lipid a layer of the epidermis with a high content of free fatty acids located under the stratum corneum; which is 10 - 25 layers of cells oriented parallel to the surface and immersed in a lipid matrix, which makes up about 10% of its volume, having a unique structure and chemical composition.
  • Epidermal lipids mainly consist of: ceramides (50%); cholesterol and its esters (25%); saturated fatty acids (10%) (Fig. 42).
  • the content of fatty acid triglyceride and hyaluronic acid in living tissue can be determined using isothermal calorimetric single-beam spectroscopy at wavelengths corresponding to the characteristic frequencies of fatty acid triglyceride 1743 cm 1 (5.7 ⁇ m) and / or 3040-2853 cm 1 (3.3 - 3.5 microns).
  • a spectral method for measuring the content of triglyceride of a fatty acid is based on the use of a two-beam spectral scheme at wavelengths corresponding to one of the characteristic frequencies of hyaluronic acid (the combined method described above), for example, 3500 cm 1 (2.8 ⁇ m) - 3000 cm 1 (3.3 ⁇ m), and one of the characteristic frequencies of the fatty acid triglyceride, for example, 3040 cm '-2853 cm 1 (3.3-3.5 ⁇ m).
  • the spectral measurement in the range 2.8 ⁇ m - 3.3 ⁇ m is carried out on the basis of a combined method (combining isothermal calorimetric spectroscopy and diffuse reflectance spectroscopy), and the measurement at the triglyceride wavelength is carried out according to the diffuse reflectance spectroscopy scheme, which makes it possible to determine the triglyceride content in the surface lipid layer of the epidermis or according to the scheme of isothermal calorimetric spectroscopy, which makes it possible to determine the triglyceride content in the fat layer under the dermis.
  • the described measurement scheme allows recording a signal proportional to the triglyceride content, or a total signal proportional to the total content of glucose and lipids, which characterizes the rate of glucose and free fatty acid metabolism.
  • the glucose concentration can be determined on the basis of a three-beam spectroscopy scheme, which uses modulated radiation spectroscopy at a wavelength corresponding to the characteristic frequencies of water, by adding a dual-beam spectroscopy scheme at wavelengths corresponding to the characteristic frequencies of hyaluronic acid and fatty acid triglyceride.
  • the advantage of this scheme is that the intensity of the absorption peaks practically does not change during the course of the experiments during the day (and the week); therefore, the measurement is reduced to the scheme of two-beam spectroscopy at two wavelengths corresponding to the characteristic frequencies of water and hyaluronic acid.
  • a single-beam scheme of a spectral device at a wavelength corresponding to a characteristic frequency of 1743 cm-1 (5.7 ⁇ m) can be used to monitor the content of hyaluronic acid in living tissue.
  • microcalorimetric spectroscopy makes it possible to determine the concentration of macromolecules of an intracellular substance using electromagnetic radiation with frequencies (wavelengths) that coincide with the characteristic frequencies of the tetramers of intracellular macromolecules (proteins, RNA, DNA).
  • the characteristic frequencies of intracellular proteins fall into the far infrared range of the electromagnetic spectrum.
  • the characteristic binding energies in the macromolecule of the globular enzyme glucokinase and other intracellular enzymes have values of the order of 7 kcal / mol - 20 kcal / mol or 10 kT - 30 kT, corresponding to the wavelength range of 20 - 70 ⁇ m in the far IR spectral region.
  • the concentration of the main biochemical components of the intercellular substance in the general case, can be determined using a differential method according to the scheme of four-beam (four-wave) spectroscopy, which uses wavelengths corresponding to the characteristic frequencies of the 3 main components of the intercellular substance, hyaluronic acid, glucose, water molecules, as well as the wavelength corresponding to the characteristic frequency of the intracellular macromolecule or complex; in the measurement scheme, each of the four biochemical compounds can be represented by a set of 1 (or more) characteristic frequencies. Therefore, the number of wavelengths characterizing a group of 2 biochemical components of the intercellular substance, a water molecule and 1 investigated intracellular molecule, can be more than 4.
  • Block diagram of a spectral device for isothermal calorimetric spectroscopy of biochemical components of living tissue includes 1- an applicator impermeable to water and heat; 2 - sensor of osmotic pressure of the intercellular substance; 3 - a source of electromagnetic radiation with constant and / or modulated intensity; 4 - physiological parameter sensor; 5 - block of instrumental amplifiers and / or synchronous detector and / or analog-to-digital converter (ADC); 6 - information processing unit; 7 - information display unit.
  • the device contains several sensors for measuring physiological parameters, one of which is designed to measure the osmotic pressure of the intercellular substance, as well as one or more sources of electromagnetic radiation with constant or modulated intensity.
  • the device includes an applicator 1 (impervious to heat and water, having upper and lower surfaces), made with the possibility of applying to the surface of the epidermis with metered pressure, one or more sources 3 of electromagnetic radiation, with constant or modulated intensity, with a wavelength corresponding to the characteristic frequency of the investigated biochemical component of living tissue, a device for creating a calibration effect on a controlled area of tissue under the applicator, a sensor of osmotic pressure of the intercellular substance (2), sensors of temperature and other physiological parameters (4) located under the applicator, from the inner side of the applicator on the surface of the ESR , while the signals from the above sensors are fed sequentially to the inputs of the amplifier unit 5 and / or the synchronous detector and / or analog-to-digital converter (hereinafter ADC) installed on the upper surface of the applicator 1; block 6 of information processing; block 7 displaying information.
  • ADC analog-to-digital converter
  • the information processing unit 6 is a microprocessor for real-time processing of signals from sensors of physiological parameters of the local tissue area under the applicator and sensors of climatic parameters of the environment.
  • the information processing unit 6 is located on the upper surface of the applicator 1, in the other it is remote and is wired to the ADC.
  • the information display unit 7 is a smartphone or a personal computer. At the same time, the connection of the multi-sensor device with the information display unit 7 can be in various embodiments both wireless and wired (via a USB channel).
  • At least osmotic pressure sensor 2 is used, with which the amount of water in the intercellular space of the tissue in the local volume under the applicator is determined at a controlled depth at which local thermodynamic equilibrium is established; sensor 4 of the temperature RSE with which determine the temperature of the skin surface under the applicator and the sensor of elastic tissue pressure under the applicator.
  • the signals from the physiological parameters sensors (osmotic pressure sensor 2, temperature sensor 3 and elastic pressure sensor 4) located on the inner surface of the applicator 1 are fed to the inputs of instrumental amplifiers and / or an analog-to-digital converter (block 10), after which they enter the processing unit information 11, in which signal processing is in progress.
  • the processed information is transmitted to the display device 12, on the screen of which the current values of the measured parameters and / or the metabolic rate of the parameters are displayed in real time.
  • the method of synchronous (coherent) detection of AM signals is used, which can significantly increase the signal-to-noise ratio of the recorded signal and reduce its distortion.
  • the synchronous detection of the signal at the output of the osmotic pressure sensor is carried out using an instrumentation amplifier (with a built-in synchronous detection circuit) at the AM modulation frequency of electromagnetic radiation.
  • Fig. 44 Scheme of diffuse reflection spectroscopy to determine the osmotic pressure of the intercellular substance based on spectral measurement of the temporal dynamics of the amount of water in the stratum corneum of the epidermis at a wavelength corresponding to the characteristic frequency of water (1190, 1455, 1945, 945 nm).
  • Radiation diffusely reflected from the epidermis is collected at a wide angle and transmitted to the detector.
  • 1 - radiation source at a wavelength corresponding to the characteristic frequency of water in the stratum corneum of the epidermis; 2 - an applicator, impervious to water and heat; 3 - radiation at a wavelength corresponding to the characteristic frequency of the investigated biochemical component of the epidermis (living tissue); 4- receiver of electromagnetic radiation.
  • industrial certified sensors for measuring climatic parameters can be used, as well as certified sensors for measuring the temperature of the stratum corneum and elastic pressure of the epidermis.
  • Honeywell sensors can be used as a sensor for measuring the temperature of the stratum corneum.
  • sensors based on a piezoelectric element can be used.
  • the osmotic pressure sensor 2 which records the dynamics of water transfer in the epidermis by recording the temporal dynamics of the water content in the stratum corneum of the epidermis, can be based on different physical-chemical methods based on different physical principles.
  • electrometric methods based on the measurement of the electrophysical characteristics of the ESR (electrical conductivity, dielectric constant) are applicable; spectral methods based on the measurement of spectral characteristics (reflection and absorption coefficients); optical-acoustic methods; thermophysical methods based on measuring thermophysical characteristics (thermal conductivity, heat capacity); electrochemical methods, etc.
  • the sensor of the amount of water can be based on measuring elastic pressure. Quantity measuring devices water in the epidermis are described in the patent [10].
  • the amount of water in the epidermis can be determined by measuring the electrical characteristics (electrical conductivity and / or dielectric constant) of the stratum corneum with alternating or direct current.
  • the amount of water in the epidermis can be determined by measuring the spectral characteristics (reflection coefficient and / or absorption coefficient) of the stratum corneum for electromagnetic radiation with a wavelength near the absorption line due to the water content in the ESR.
  • the temporal dynamics of the swelling of the intercellular substance can be recorded by the temporal dynamics of the reflection coefficient of the stratum corneum of the epidermis.
  • the spectral sensor can be based on a method in which the osmotic pressure of the intercellular substance or the amount of water in the intercellular space is determined by measuring the spectral characteristics of the intercellular substance in the range of the electromagnetic radiation spectrum, which is determined by the characteristic absorption frequencies of the intercellular substance, and is selected from the group including characteristic frequency of water in the optical and / or infrared and / or microwave range; group frequencies of intercellular substance hyaluronic acid in the infrared and / or terahertz and / or microwave range.
  • the spectral sensor is based on a method for determining the osmotic pressure of the intercellular substance by measuring the amount of water in the stratum corneum of the epidermis by measuring the physical characteristics of the stratum corneum of the epidermis, which are selected from the group including electrophysical characteristics, spectral and optoacoustic characteristics, thermophysical characteristics.
  • the osmotic pressure of the intercellular substance or the amount of water in the intercellular space is determined by the amount of water in the stratum corneum of the epidermis by measuring the spectral characteristics of the stratum corneum of the epidermis at the characteristic frequencies of water absorption in the stratum corneum using a spectral method, which is selected from the group including, IR spectroscopy, Raman - spectroscopy, optoacoustic spectroscopy, difference (differential) two-beam spectroscopy.
  • a spectral method which is selected from the group including, IR spectroscopy, Raman - spectroscopy, optoacoustic spectroscopy, difference (differential) two-beam spectroscopy.
  • the dosed calibration action is selected from the group including external pressure, local decompression, heating, cooling, electric current or voltage, and magnetic field.
  • a device 8 for creating a calibration effect you can use, for example, a device that generates pulses of electric voltage or current through the RSE, which make it possible to determine the current value and direction of tissue fluid microflows in the intercellular substance of the deep layer of the epidermis by measuring the kinetic characteristics of mass transfer due to electrokinetic phenomena, in particular, electro-osmosis.
  • the device for creating a calibration effect is a heat power source made in the form of a resistor or a Peltier element, or a device for creating a metered pressure on the applicator surface.
  • Industrial laser diodes (based on quantum-well heterostructures and other types), which are widespread and produced with a wide variety of radiation characteristics, specialized for certain applications, can be used as sources of electromagnetic radiation in the optical and infrared regions. There are no official standards for the types and sizes of laser diode packages, but sometimes large manufacturers agree to standardize packages. In addition, there are customer-specific design services for the emitter housing.
  • photo receivers As a receiver of electromagnetic radiation in the optical and infrared ranges, photo receivers, which are produced by the industry, can be used.
  • the world's leading companies produce quite a few types of microcircuits in which a radiation receiver (photodetector) and an amplifier are combined in one package.
  • a radiation receiver photodetector
  • Such systems are widely used in infrared remote control systems (such modules are also called IR Receivers.
  • the leading companies in the world produce quite a few types of such microcircuits.
  • LED Microsensor NT LLC and “AIBI” LLC (IBSG Co., Ltd.) produces a wide range of optoelectronic devices in the mid-infrared range - light-emitting diodes, LED matrices, photodiodes for the spectral range from 1.6 ⁇ m to 5.0 microns, as well as electronic devices for working with them (drivers for LEDs and amplifiers for photodiodes).
  • LEDs can also be used in the optical and near-IR ranges: SIM-012ST (950-970 nm); OIS-150-1020 (1020-1060 nm);
  • KM2520F3C03 (930-950nm); EDEF-1LS3 (740-760nm); EDEI-1LS3 (830-850 nm).
  • Sources and receivers of terahertz radiation are not yet produced by the world industry and are at the R&D stage.
  • scientists from Princeton University Xue Wu; Kaushik Sengupta, Department of Electrical Engineering, Integrated Microsystems Research Lab, Princeton University, Princeton, NJ, USA
  • Xue Wu Xue Wu; Kaushik Sengupta, Department of Electrical Engineering, Integrated Microsystems Research Lab, Princeton University, Princeton, NJ, USA
  • Such devices can become an important part of medical diagnostics, communication and drug development.
  • Two papers by scientists on this topic have been published in the IEEE Journal of Solid State Circuits. In the article, the scientists explained how they managed to create a miniature microcircuit to generate terahertz radiation.
  • the process of measuring begins immediately at the moment of pressing at least one heat- and waterproof applicator to the surface of the RSE or with a delay in 10-50 seconds from the moment of pressing.
  • the temporal dynamics of physiological parameters in the local closed tissue area under the applicator is measured in the "microcalorimeter" mode, namely, at least the heat flux through the epidermis area under the applicator or the temperature of the skin surface under the applicator, elastic tissue pressure under the applicator, the pressure created by the applicator on the skin surface, the amount of water in the intercellular space of the tissue at a controlled depth at which local thermodynamic equilibrium is established.
  • the heat flux through the area of the epidermis under the applicator or the temperature at the controlled depth T S km, at which the local thermodynamic equilibrium is established is measured at a fixed pressure of the applicator P sensor .
  • a calibration procedure is carried out and calibration parameters are determined in order to determine the constant coefficients necessary for calculating the heat metabolism effect of the local area of living tissue and calculating the blood glucose level proportional to the value of the thermal metabolism of the local area of living tissue.
  • the number of sensors of the multisensor device described above can be increased by including in the device additional sensors and sensors of physiological parameters characterizing the metabolism of a local area of living tissue, in particular, sensors of blood biochemical parameters (for example, blood lactate content), blood acidity, the frequency of cardiovascular contractions. Additional sensors for transdermal measurements can be installed on the inside of the applicator and integrated with the physiological and climatic parameters described above into a single measuring circuit as part of a multi-sensor device.
  • additional sensors and sensors of physiological parameters characterizing the metabolism of a local area of living tissue in particular, sensors of blood biochemical parameters (for example, blood lactate content), blood acidity, the frequency of cardiovascular contractions.
  • Additional sensors for transdermal measurements can be installed on the inside of the applicator and integrated with the physiological and climatic parameters described above into a single measuring circuit as part of a multi-sensor device.
  • IGT impaired glucose tolerance
  • Fig. 46a shows a characteristic continuous (with a frequency of 1 measurement per second) non-invasive sugar curve of a healthy patient during NTG, which differs from the sugar curves of diabetics and is characterized by the presence of an increase in blood sugar concentration (lasting about 30 minutes) and a falling region (lasting about 30 minutes). minutes).
  • the level of glucose in the blood in healthy patients is determined by the level of insulin, which is produced by the cells of the pancreas in proportion to the level of glucose in the blood, the dynamics of which is usually monotonous without jumps. Deviation of the mechanism of the pancreas from the norm can lead to an uneven spasmodic flow of insulin into the blood and, as a result, to spasmodic dynamics of blood sugar.
  • Fig. 46 s shows the jump-like dynamics of blood sugar in the form of a single pulse, recorded using a prototype isothermal microcalorimeter, and the temporal dynamics of the level of insulin in the blood, calculated on the basis of the sugar curve.
  • Figure 47 shows the characteristic sugar curves (a, b) with an abrupt temporal dynamics in a patient with type 2 diabetes mellitus (66 years old, male): characteristic dynamics of blood sugar in the form of a time sequence of single impulses.
  • the blood sugar monitoring method based on the isothermal calorimetry method can be used in practice for the early diagnosis of diabetes mellitus (type 1 and type 2) based on the features of the abrupt dynamics of the sugar curve.
  • a method for diagnosing diabetes mellitus based on monitoring the enthalpy of living tissue The method of isothermal microcalorimetry of living tissue makes it possible to determine at an early stage diabetes mellitus (pre-diabetes) of patients by the content of hyaluronic acid in the epidermis, which is determined on the basis of monitoring the osmotic pressure of the intercellular substance (or the amount of water in the intercellular space).
  • the intercellular substance in the area of the physiological norm, the boundaries of which are determined by the critical value of the concentration of disaccharides (monomers) of hyaluronic acid (critical contour length of the polymer chain), at physiological temperature, is in a heterophase state, in which the crystalline (globular) phase of the substance is in thermodynamic equilibrium with meta-tabi-lvn is a liquid (molten globule) phase, in which the concentration of monomers corresponds to the concentration of a saturated solution of the polymer chain of hyaluronic acid.
  • the value of the enthalpy of the intercellular substance of the patient is determined by the content of hyaluronic acid, which can change in chronic diseases.
  • the content of hyaluronic acid can change as a result of a change in the contour length (number of disaccharides) of the polymer chain; therefore, the content of hyaluronic acid in the intercellular substance is a biochemical parameter, the monitoring of which makes it possible to diagnose diabetes mellitus at an early stage.
  • An increase in the number of links in the polymer chain which is equivalent to the introduction of an additional amount of hyaluronic acid disaccharides into the solvent, at a fixed volume of the substance, does not lead to an increase in its concentration in the liquid phase (solution oversaturation) - but leads to an increase in the number of monomers in the crystalline phase during crystallization (process separation of the solid phase from the solution).
  • An increase in the volume of a substance due to an increase in the volume of a solvent water containing glucose and sodium ions
  • the dissolution process, as well as the melting process leads to the process of destruction of the crystal lattice, which is usually accompanied by cooling of the solution. Dissolution can take place under isothermal conditions, but in this case it is necessary to supply heat from outside.
  • the value of the enthalpy of the intercellular substance in the course of a clinical study carried out on a group of patients with diabetes mellitus, it was found that the value of the enthalpy of the intercellular substance, the value of which was determined on the basis of comparing the non-invasive readings of the prototype device with the invasive readings of a certified glucometer (calibration method), can be used in diabetics (type 2) abnormal values - abnormally low or abnormally high;
  • the enthalpy of the intercellular substance of the living tissue of patients with diabetes mellitus is characterized by 2 enthalpy values corresponding to 2 different states of the intercellular substance with different values of the enthalpy of the intercellular substance, which may differ in some patients by more than an order of magnitude.
  • HA hyaluronic acid
  • the content of hyaluronic acid (HA) in the intercellular substance increases, as a result of an increase in the rate of HA synthesis under conditions of hyperglycemia (high blood sugar) and, as a consequence, leads to the appearance of an excess amount of hyaluronic acid in the crystalline (globular) phase of the intercellular substance of the epidermis, the upper layer which is characterized by a low content of solvent in the intercellular space.
  • a change in the amount of solvent in the intercellular space of the tissue under the applicator, during the transition to the state of local thermodynamic equilibrium, can lead to a phase transition of the substance from the crystalline (globular) state to the liquid (molten globule) state with an increase in the intercellular volume as a result of dissolution of the crystalline (globular) phase in a metastable state; the dissolution process proceeds due to the supply of heat, into the volume of tissue under the applicator, by the flow of intercellular fluid.
  • An abrupt change in the concentration of glucose and mineral ions in the blood can also lead to a violation of the thermodynamic phase equilibrium of the intercellular substance.
  • the proportion of free glucose in the local volume of the intercellular substance can increase due to a decrease in the proportion of bound glucose in the crystalline phase without increasing the concentration of insulin and, as a consequence, can lead to an increase in the concentration of glucose in the intercellular fluid ...
  • the value of the enthalpy of the intercellular substance therefore, is an individual characteristic of the patient's muscle tissue, which has a high diagnostic value.
  • Continuous measurement of intercellular substance enthalpy by monitoring the content of hyaluronic acid and / or monitoring osmotic pressure during insulin (or other sugar-lowering) therapy can be used in practice for early diagnosis of diabetes, as well as for real-time diagnosis of insulin resistance of living tissue in patients with diabetes. (and monitoring the effectiveness of sugar-lowering therapy) based on monitoring the content of hyaluronic acid in the epidermis.
  • the characteristic temporal dynamics of the osmotic pressure of the intercellular substance (characterizing the amount of water in the intercellular space), which is recorded in the process of spontaneous transition of the intercellular substance of living tissue under the applicator into a state of local thermodynamic equilibrium (corresponding to the maximum entropy); the transition of living tissue to a new state with a high enthalpy value arises as a result of the process of dissolution of the crystalline (globular) phase of the intercellular substance, which occurs due to the supply of heat by the flow of the intercellular fluid, and is accompanied by an increase in the volume and osmotic pressure of the intercellular substance.
  • the osmotic pressure of the intercellular substance corresponding to the equilibrium value of enthalpy, which is established during the transition of the tissue under the applicator to the state of local thermodynamic equilibrium, exceeds the initial value of osmotic pressure (corresponding to the initial value of enthalpy) by more than two orders of magnitude (100 times).
  • the reason for the phase transition of the intercellular substance can be jumps in the level of sugar in the blood and possibly other biochemical and physiological parameters, and external physical factors (pressure, heat flow, etc.).
  • the abnormal content (excess) of hyaluronic acid in the intercellular substance in diabetics due to the increased rate of hyaluronic acid synthesis, leads to crystallization of the intercellular substance, which is accompanied by increased glucose binding in the crystalline phase and an increase in the transfer coefficients of the intercellular substance for the transfer of glucose and insulin from the capillary to the cell. therefore, may be one of the reasons leading to the development of type 2 diabetes mellitus and other cardiovascular diseases associated with chronic diabetes diseases.
  • phase transition of the intercellular substance into an aggregate state with an abnormally high osmotic pressure also leads to an increase in insulin resistance and is accompanied by an increase in blood pressure due to clamping (collapse) of the capillaries, caused by an increase in the osmotic pressure of the substance surrounding the capillary.
  • the isothermal calorimetry method allows detecting at an early stage by the nature of the temporal dynamics of the osmotic pressure of the intercellular substance and predicting the presence of signs of insulin resistance and diabetic state in undiagnosed type 2 patients.
  • the method of isothermal calorimetric spectroscopy, described above, also makes it possible to determine at an early stage the diabetic state on the basis of spectral measurements of the content of hyaluronic acid in the local volume of living tissue.
  • the surges in the osmotic pressure of the extracellular substance, which are observed in patients with diabetes mellitus, can lead to surges in blood pressure.
  • the influence of some external factors, physiological and physical, on the tissue can lead to reversible transitions of living tissue from one phase state to another. These factors include, in particular, muscle stress and temperature effects. External influences that cause reversible transitions of tissue changes include influences that lead to reversible changes in the phase state of the intercellular substance. These external physical factors include: external pressure; local decompression; outside temperature; electromagnetic radiation, which causes volumetric heating of the tissue; weak constant electric current; constant magnetic field; local muscle load on tissue, etc.
  • the method of isothermal microcalorimetry supplemented by the influence of an external physical factor, makes it possible to determine the value of enthalpy and diagnose diabetes mellitus at an early stage, based on measuring the dependence of osmotic pressure on an external physical factor.
  • the method of isothermal calorimetry of living tissue allows one to determine NTG and tissue sensitivity to insulin by the nature of the temporal dynamics of the osmotic pressure of the intercellular substance (the amount of water in the intercellular space), without determining the absolute value of enthalpy (without calibration).
  • a characteristic jump-like dynamics of the osmotic pressure of the intercellular substance caused by the jump-like dynamics of the glucose concentration in the intercellular substance with tissue insulin resistance: in type 2 diabetics with high insulin resistance, abnormally low values of tissue enthalpy corresponding to the predominance of the crystalline phase are observed in the intercellular substance.
  • Fig. 50 Typical monitoring curves of the osmotic pressure of the intercellular substance of a healthy patient and a patient with type 2 diabetes mellitus.
  • Time dynamics osmotic pressure in a patient with diabetes mellitus has a spasmodic character due to spasmodic dynamics of glucose concentration in the intercellular substance and in the blood, in contrast to the temporal dynamics of a healthy patient, characterized by smooth monotonic changes caused by smooth monotonic changes in the glucose concentration in the intercellular fluid and blood.
  • the osmotic pressure monitoring method is applicable for the early diagnosis of cardiovascular diseases, in particular, hypertension.
  • the method of isothermal calorimetric spectroscopy also makes it possible to determine at an early stage diabetes and cardiovascular diseases associated with diabetes mellitus, based on spectral measurements of the content of hyaluronic acid in a local volume of living tissue.
  • a method for measuring the metabolic rate and assessing the energy value of food intake is provided.
  • the method of isothermal calorimetric spectroscopy makes it possible to determine the energy value of food intake on the basis of spectral measurements of the content of glucose and triglyceride of free fatty acids in the local volume of living tissue.
  • Energy value or caloric value is the amount of energy released in the human body from food during digestion, provided it is completely absorbed.
  • the energy value of a product is measured in kilocalories (kcal) or kilojoules (kJ) per 100 g of product.
  • the kilocalorie used to measure the energy value of food is also called food calorie, so the prefix “kilo” is often omitted when specifying calories in kilocalories.
  • the nutritional value of a product is the content of carbohydrates, fats and proteins in it per 100 grams of the product.
  • the method of isothermal calorimetry and spectroscopy makes it possible to determine the physiological state of the skin on the basis of spectral measurements of the content of hyaluronic acid and triglyceride of free fatty acids (and other biochemical components) in the local volume of living tissue.
  • a group of 41 patients with diabetes mellitus (types 1 and 2) was divided into two subgroups of 27 patients (subgroup 1) and 14 patients (subgroup 2), each of which includes patients of types 1 and 2, for the purpose of the study.
  • the sample of patients is random.
  • the aim of the study with the participation of 27 patients from the first subgroup was to confirm the effectiveness of the method, to study the reproducibility of test results and to assess the possibility of individual calibration.
  • Fig. 51 shows examples of sugar curves with a jump-like temporal dynamics: Fig. 51a (test N ° 6 patient N ° 24), Fig. 516 (test N ° 1 patient N ° 41), Fig. 51c (test N ° 5 patient 1H ° 41), Fig. 51g (test N ° 6 patient 1H ° 41).
  • Fig. 51a test N ° 6 patient N ° 24
  • Fig. 516 test N ° 1 patient N ° 41
  • Fig. 51c test N ° 5 patient 1H ° 41
  • Fig. 51g test N ° 6 patient 1H ° 41.
  • the indicator of the effectiveness of the method in the first assessment method is the correlation, within the error interval of 15%, of the results of non-invasive measurements with the results of invasive measurements, at fixed values of the individual scale factor of a given patient (individual calibration).
  • the results of tests of subgroup 1 are presented in Fig. 52.
  • zone A the boundaries of which are determined from the following conditions:
  • the aim of the study with the participation of 14 patients from the second subgroup was to evaluate the effectiveness of the method when measured by a blind method.
  • Each patient underwent 6 tests of 35 minutes duration (with three invasive measurements) over two days, of which the results of the first 3 tests (1,2,3) were used for calibration.
  • the results of the first 3 tests (1,2,3) were used for calibration.
  • an individual calibration was carried out, during which, according to the results of the first 3 tests (lasting 35 minutes), the values of the individual scale factors of the given patient K01 and K02 were determined.
  • results of comparative measurements obtained on patients of subgroup 2 by semi-blind and blind methods are in accordance with the requirements of the ISO 15197 standard in terms of accuracy.
  • results of tests performed on a group of 41 patients (227 tests, 683 invasive measurements), obtained by combining the results of subgroup 1 and subgroup 2 are presented in Fig. 53.
  • results of a clinical study performed on a group of 41 patients with type 1 and type 2 diabetes are in accordance with the requirements of the ISO 15197 standard for accuracy.
  • Protein folding is the process of spatial packaging of a protein molecule, acceptance by a protein strictly defined form in which it performs its functions; the process of self-organization of a protein molecule - spontaneous folding of a polymer chain under certain conditions into a certain spatial structure, is schematically shown in Fig. 1.
  • Protein molecules are linear polymers consisting of amino acid residues (which are monomers); proteins may also include modified amino acid residues and non-amino acid components, for example, glycoproteins characterized by a low carbohydrate content, a carbohydrate residue (an oligosaccharide with an irregular structure and containing glucose, mannose, galactose and their amino derivatives, as well as N-acetylneuraminic acid) is attached to the amino acids of the protein chain either by an N-glycosidic bond - to the amide nitrogen of asparagine, or by an O-glycosidic bond - to the hydroxyl group of serine, threonine, hydroxylysine residues.
  • modified amino acid residues and non-amino acid components for example, glycoproteins characterized by a low carbohydrate content, a carbohydrate residue (an oligosaccharide with an irregular structure and containing glucose, mannose, galactose and their amino derivatives, as well as N
  • peptide bonds are formed as a result of the interaction of the a-carboxyl group (-COOH) of one amino acid with the a-amino group (-NH2) of another amino acid.
  • -COOH a-carboxyl group
  • -NH2 a-amino group
  • the ends of the protein are called the N- and C-terminus, depending on which of the groups of the terminal amino acid residue is free: -NH2 or -COOH, respectively.
  • a glucose molecule can form a glycosidic valence bond also with amino acids of protein molecules.
  • a carbohydrate residue an oligosaccharide with an irregular structure and containing glucose, mannose, galactose and their amino derivatives, as well as N-acetylneuraminic acid
  • N-acetylneuraminic acid is attached to the amino acids of the protein chain or an N-glycoside bond - to the amide nitrogen of asparagine, or by O-glycosidic bond - to the hydroxyl group of serine, threonine, hydroxylysine residues.
  • the structural formulas of the glycosidic bond with amino acids are shown in Fig. 61.
  • the configuration of the tetramer in the biopolymer hyaluronic acid molecule is formed with the participation of sodium ions, the concentration of which in the intercellular space is much higher than the concentration of potassium ions.
  • the ionic composition of cells differs from the ionic composition of the environment.
  • the most significant difference is the asymmetric distribution of monovalent ions Na + H K + : cells actively accumulate K and release Na into the environment. This creates a concentration difference monovalent cations on the cell membrane.
  • the monovalent metal ion M which forms an ionic bond with the charged link of the polymer chain -R b -M of protein molecules localized in the plasma membrane and cytoplasm of the cell, is the monovalent ion K + ⁇
  • the universal model of a biopolymer molecule on the basis of which the properties of the hyaluronic acid macromolecule are described, which, as noted, is a unique model object for studying the properties of biopolymer molecules, makes it possible to predict, on the basis of an accurate statistical description, the thermodynamic properties of an arbitrary natural macromolecule, in particular, protein and enzyme macromolecules.
  • a biopolymer protein molecule capable of spatial self-organization and acquiring a stable molecular heterophase structure due to weak bulk interactions of a non-valence nature
  • a linear polypeptide chain of amino acids -NH-CH ( R) -CO- the repeating monomer of which consists of two (or more) types of monomeric units - amino acids AR a and AR b , with different side residues R a , Ri ,. one of which (for example, the AR b unit) contains a charged (negatively or positively) group R b , and the side R ,, residue of the second unit (AR ,,) is uncharged.
  • the composition of the solvent includes at least 3 components: one component is a molecule (monomeric) substrate (solvent) S, for example, a glucose molecule, and two (or several) low molecular weight monovalent ions M ⁇ and M2, for example sodium ions and potassium, which have different affinity for the monomer, the electric charge of which is opposite to the charge of the side residue AR b , the monomeric molecule of the solvent (substrate) S can form two hydrogen bonds with the monomer units of the polymer chain - R a -S-Rb -; -Ra-S-Rb - R a -S-; -S-Rb; low-molecular monovalent ions M ⁇ and Mg can form an ionic bond with the charged units of the polymer chain -R b -M ⁇ .
  • solvent for example, a glucose molecule
  • M2 low molecular weight monovalent ions
  • M ⁇ and M2 for example sodium ions and potassium
  • the energy of longitudinal covalent bonds Eo of neighboring links of the polymer chain is much higher than the characteristic thermal energy, at physiological temperatures Eo / kT>> 1.
  • the energy of the transverse hydrogen bonds of the R a and R b links with the monomer (substrate) molecule S of the solvent is much less than the energy of the longitudinal valence bonds Es «Eo of the polymer chain.
  • the low-molecular M ⁇ ion can be adsorbed by the monomer of the polymer chain Rb, with the formation of a weak ionic bond —Rb — Mi.
  • a repeating fragment of a polymer chain can consist of the same pairs - A - B - or several types of repeating pairs of monomer units -A-B-, -C-B-, ..., which have the ability to form hydrogen bonds with substrate molecules.
  • Hydrogen Bonds Determining the Most Likely Configuration of a Bound Pair elementary chains corresponding to the minimum free energy of bulk interactions and, as a consequence, the most probable spatial configuration of a tetramer formed by a pair of non-adjacent monomers of the polymer chain and a pair of solvent molecules with the participation of ions, can be defined as conjugated non-valence bonds or conjugated hydrogen bonds of a biopolymer molecule.
  • the unit cell corresponding to a coupled pair of elementary chains (in its most probable configuration) forms a conjugated system - a closed system of conjugated hydrogen bonds with a delocalized electron density; As is known, a common feature of all conjugated systems is the spreading of the electron density of hydrogen bonds over the entire conjugated system.
  • Magnesium is known to function as a cofactor in over 300 known enzymatic reactions involved in a wide range of metabolic activities. Energy production, glucose metabolism, fatty acid oxidation and amino acid activation all require magnesium. Magnesium is one of the most important minerals, being the main intracellular element, activates enzymes that regulate carbohydrate metabolism, stimulates the formation of proteins, regulates the storage and release of energy in ATP, reduces excitation in nerve cells, and relaxes the heart muscle.
  • a bivalent metal ion (Mg 2+ , Mi 2+ ) cannot participate in the formation of a tetramer - crosslinking from 2 non-adjacent monomers of the polymer chain, 2 substrate molecules and 2 monovalent cations of the solvent, however, it can form crosslinks between two non-adjacent monomers of the polymer chain without participation of solvent molecules.
  • Figure 62 schematically shows the crosslinking formed by the 2 valence magnesium ion between non-adjacent monomers of the polymer chain through ionic bond.
  • Common classification In accordance with the generally accepted classification, there are 4 levels of protein structural organization: primary, secondary, tertiary and quaternary protein structure.
  • the primary structure (sequence of amino acid residues) of a polypeptide is determined by the structure of its gene or genetic code, and higher-order structures are formed during protein folding.
  • the spatial structure of a protein as a whole is determined by its amino acid sequence, it is rather labile and can depend on external conditions; therefore, it is more correct to speak about the preferred or most energetically favorable conformation of the protein.
  • Primary structure a sequence of amino acid residues in a polypeptide chain, which is usually described using one-letter or three-letter designations for amino acid residues. Important features of the primary structure are conservative motifs - stable combinations of amino acid residues that perform a specific function and are found in many proteins. Conservative motives persist throughout the evolution of species, and they often predict the function of an unknown protein.
  • Secondary structure - local ordering of a fragment of the polypeptide chain, stabilized by hydrogen bonds.
  • a - spirals tight turns around the long axis of the molecule.
  • One turn is 3.6 amino acid residues
  • the helix pitch is 0.54 nm (there is 0.15 nm for one amino acid residue).
  • the helix is stabilized by hydrogen bonds between H and O peptide groups spaced 4 units apart;
  • b - sheets (folded layers) - several zigzag polypeptide chains in which hydrogen bonds are formed between relatively distant from each other (0.34 nm per amino acid residue) amino acids in the primary structure or different protein chains (and not closely spaced, as is the case be in a - spiral).
  • Tertiary structure the spatial structure of the polypeptide chain, is formed when the polypeptide is folded into a compact three-dimensional system (in the case of enzymes, this is usually a spherical globule). Structurally, it consists of secondary structure elements stabilized by various types of interactions, in which hydrophobic interactions play an important role.
  • volumetric interactions of a simple polymer chain with a solvent can be described as a pairwise volumetric interaction of elementary chains that form a linked pair, the most probable configuration of which is shown in Fig. 5a.
  • the folding motif is determined by the mutual arrangement of secondary structure elements (a-helices and b-strands) within the protein domain - a compact globule that can exist either by itself or be part of a larger protein along with other domains.
  • Quaternary structure (or subunit, domain) - the relative position of several polypeptide chains in a single protein complex.
  • Protein molecules that are part of a protein with a quaternary structure, are formed on the ribosomes separately and only after the end of the synthesis form a common supramolecular structure.
  • the composition of a protein with a quaternary structure can include both identical and different polypeptide chains. The same types of interactions are involved in the stabilization of the quaternary structure as in the stabilization of the tertiary.
  • Supramolecular protein complexes can consist of tens of molecules.
  • a protein domain is an element of the tertiary structure of a protein, which is a fairly stable and independent protein substructure, the folding of which takes place independently of other parts; the tertiary structure of a protein molecule is formed when the polypeptide is folded into a compact three-dimensional system (in the case of enzymes, this is usually a spherical globule).
  • a domain usually contains several elements of the secondary structure. Structurally similar domains are found not only in related proteins (for example, in the hemoglobins of different animals), but also in completely different proteins. Quite often, domains are assigned separate names, since their presence directly affects the biological functions performed by the protein - for example, the Ca 2+ -binding domain of caldomulin, the homeodomain responsible for binding to DNA in various transcription factors, etc.
  • each of the polypeptide chains that form a subunit is characterized by its own secondary and tertiary structure.
  • these proteins have another conformational level called the quaternary structure; this term is understood as the location of the polypeptide chains that are part of the individual polypeptide chains, relative to each other, i.e. the way of their joint folding and packing with the formation of the native conformation of the oligomeric protein.
  • domains are quite “autonomous” in the formation of their structure and performance of their function, with the help of genetic engineering it is possible to "sew" a domain belonging to another to one of the proteins (thus creating a protein - a chimera). Such a chimera, if lucky, will combine the functions of both proteins.
  • a chimera if lucky, will combine the functions of both proteins.
  • by fusion of the Cas9 DNA-binding domain with various regulatory domains it was possible to obtain artificial transcription factors (crisprTF), selectively targeting the desired regions of the genome using custom-made "RNA guides".
  • crisprTF transcription factors
  • RNA guides custom-made "RNA guides”.
  • Saeb-doms it is also possible to design artificial restriction endonucleases, repressors, epigenome-modifying enzymes such as DNA methylases and demethylases.
  • the most probable linear configuration of the elementary chain differs from the configuration of the primary structure of the polymer chain and is formed as a result of the interaction of the polymer chain with the solvent in the equilibrium configuration of the macromolecule corresponding to the minimum free energy volumetric interactions.
  • the volume of a substance in a condensed state under given external conditions (pressure, temperature, and other characteristics), is determined exclusively by the forces of volumetric interactions; therefore, the three-dimensional spatial configuration of a biopolymer molecule can be calculated based on the configuration of a bound pair of elementary chains, which characterizes the equilibrium configuration of an elementary volumetric interactions.
  • the chain of a biopolymer molecule can have a more complex primary structure, consisting of several interconnected simple chains (subunits, protomers).
  • Oligomeric proteins are proteins containing 2 or more polypeptide chains (up to several thousand subunits).
  • each of the polypeptide chains forming a subunit (protomer) is characterized by its secondary and tertiary spatial structure. Examples of biopolymer molecules with multiple subunits are shown in Figure 56.
  • the polypeptide chains in oligomeric proteins can be either the same or different.
  • the number of polypeptide chains in an oligomeric protein can be determined by the number of amino-terminal residues per protein molecule.
  • An oligomeric protein consisting of four polypeptide chains, say hemoglobin, should have four terminal residues, one for each chain.
  • the insulin molecule has two chains linked to each other by covalent cross-links.
  • proteins in addition to the polypeptide part, also contain a non-protein - prosthetic group, which can be associated with the protein part both by covalent and weak non-covalent bonds.
  • fig. 56 shows a quaternary structure - the mutual arrangement of protein subunits in space, typical for proteins consisting of several polypeptide chains; arises from the association of several protein subunits in space.
  • each of the polypeptide chains that form a subunit is characterized by its own secondary and tertiary structure.
  • Fig. 57 shows a diagram explaining the effect of conformational change of the hexokinase enzyme molecule in the process of glucose molecule binding.
  • biopolymer molecules can interact not only with small molecules, but can form complexes with biomolecules (most often a protein, for example, a cell receptor, but sometimes, for example, with DNA) and produce, due to such binding, those or other biochemical, physiological, or pharmacological effects.
  • a chemical compound (which is often, but not always, a small molecule) that forms a complex with a particular biomolecule in biochemistry and pharmacology is called a ligand.
  • the ligand is usually a small signaling molecule that binds to a specific binding site on the target protein (eg, a receptor).
  • the ligand In the case of ligand binding to DNA, the ligand is usually also a small molecule or ion or protein that binds to the DNA double helix. Binding or association of a ligand with a receptor (the so-called “docking" of a ligand into a specific "niche” in the receptor) is usually reversible and short-lived. The reverse process is called the dissociation of the ligand from the bond with the receptor.
  • the simplest example of supramolecular structures is host-guest complexes.
  • the host is usually a large organic molecule with a cavity in the center, and the guest is a simpler molecule or ion.
  • cyclic polyesters of various sizes bind alkali metal ions quite tightly.
  • supramolecular biochemical structure An example of a supramolecular biochemical structure are enzymes - host molecules. The active center of each enzyme is designed in such a way that only that substance (substrate) that corresponds to it in size and energy can enter it; the enzyme will not react with other substrates.
  • Another example of supramolecular biochemical structures are DNA molecules in which two polynucleotide chains are complementary to each other through multiple hydrogen bonds. Each chain is both a guest and a host for the other chain.
  • the physics of the heterophase condensed state of biopolymer molecules described above allows the interaction of molecules in supramolecular complexes.
  • the interaction between macromolecules with the formation of supramolecular structures occurs according to a mechanism similar to the mechanism of interaction between the subunits of an oligomeric protein, as a result of the formation of hydrogen bonds between the ligand molecule and the protein molecule and ionic bonds between solvent ions and charged sites of the monomers of the polymer chain.
  • the three-dimensional domain spatial structure of a protein is calculated using the method described above and consists of the following steps:
  • - three-dimensional spatial configuration (quaternary structure) is defined as the most probable spatial configuration of independent domains corresponding to the minimum free energy of bulk interactions in the local region between domains.
  • heterophase catalysis a change in the rate of a chemical reaction under the action of catalysts that form an independent phase and are separated from the reacting substances by an interface.
  • a solid catalyst contact
  • the catalytic reaction usually occurs on the surface of a solid catalyst and is caused by the activation of reagent molecules upon interaction with the surface. Therefore, to carry out heterophase catalysis, it is necessary to adsorb the components of the reaction mixture from the bulk phase on the catalyst surface.
  • Chemical catalysts that accelerate vital biochemical reactions (about ten thousand) that take place in the cell are enzymes - protein molecules, the polymer (polypeptide) chain of which consists of amino acids.
  • ribozymes ribonucleic acids
  • Interest in this group of enzymes has sharply increased in connection with the development of methods for molecular selection of nucleic acids, which made it possible, in particular, to begin the directed construction of ribozymes with various types of catalytic activity.
  • IUPAC modern concepts
  • the specificity and catalytic activity of an enzyme molecule is determined by the active center - a special region of the molecule with a unique combination of amino acid residues (and possibly non-protein groups) that provide direct binding of the enzyme molecule to the substrate molecule and direct participation in catalysis.
  • the process of binding of the substrate molecule to the active center of the enzyme is accompanied by a change in the spatial structure of the enzyme molecule.
  • the active site of an enzyme as a rule, has the form of a narrow depression or gap that appears between adjacent domains.
  • a diagram explaining the effect of changing the conformation of the hexokinase enzyme molecule in the process of glucose molecule binding is shown in Fig. 57.
  • the active centers of enzymes include functional groups of such amino acids:
  • NH is a histidine group
  • a biopolymer molecule with a heterophase structure which is selective for the substrate G molecule, is capable of catalyzing a biochemical reaction with the participation of this molecule. Acceleration of the biochemical reaction occurs due to the convergence of molecules in the crystalline phase of a biopolymer molecule with a heterophase structure.
  • the enzymatic reaction of the first stage of glycolysis which is catalyzed by both of these enzymes (hexokinase and glucokinase), has the form:
  • the rate of a chemical reaction in the general case, is determined by the law of mass action (Guldberg and Baage) - the rate of the chemical reaction A + B ⁇ C. with the formation of a new substance C from two substances A n B, is proportional to the product of the concentrations of the reacting substances (all other conditions being the same) :
  • the kinetic scheme of reaction (50), during which the phosphate group P is transferred from the ATP molecule to the glucose G molecule (which cannot proceed spontaneously without a catalyst) can be represented as the following enzymatic reaction: where E is a monomer of the polymer chain, which can form a weak ionic bond with the monovalent ion M of the solvent or a hydrogen bond with the substrate molecule G of the solvent.
  • Fig. 58a diffusion of ATP molecules (only the phosphate group of ATP in red is shown) and glucose G from the solvent into the region of the active site of the enzyme (the region of the gaseous phase of a heterogeneous enzyme molecule with a low substrate concentration).
  • a tetramer complex can be defined as a substrate - an enzyme complex, which for the reaction under consideration can be denoted by the symbol E2G2, where G denotes a glucose molecule.
  • This stage is reversible and is not accompanied by any chemical changes in the substrate.
  • 58 shows the main stages of the enzymatic reaction: a) diffusion of the ATP molecule from the liquid phase into the crystalline phase; B) attachment of a phosphate group (red) to a D-glucose molecule (yellow) to form a G6P molecule as a result of a chemical reaction in the crystalline phase of the enzyme; d) conformational transition of a tetramer with a bound G6P molecule from the crystalline phase to the liquid through the energy barrier separating the liquid from the crystalline phase; g) destruction of the tetramer in the liquid phase with the release of the product molecule G6P.
  • the formula for the rate constant k can be derived from the following considerations.
  • M is the molecular weight of glucose (substrate); h is Planck's constant.
  • v kVT / h ⁇ , h is Planck's constant.
  • Hydrogen bond as a type of covalent valence bond with delocalized electron density, is electromagnetic in nature.
  • the hydrogen bond energy is determined by the energy pair interaction of a glucose molecule with a monomer of a polymer chain, which, as shown, is quantized by a discrete portion of energy, which is a multiple of the thermal energy quantum kT.
  • the vibration frequency V of the valence bond in the general case, is determined by the frequency of the electromagnetic quantum, which can be calculated from the requirement that in the equilibrium state the quantum of the electromagnetic energy of the valence bond hv is equal to a multiple of the number of quanta of the thermal energy of the PU to VT.
  • Expression (54) for the rate of reaction (50) thus has the following form:
  • Formula (54d) for the reaction rate of reagents [G] and [P] is universal, applicable for calculating the rate of an arbitrary biochemical reaction, the catalyst of which is a biopolymer molecule with a heterophase structure with selectivity to the substrate molecule G.
  • thermodynamic functions of an arbitrary enzyme in particular, hexokinase isomers, can be obtained using the universal distribution functions (14), based on the known values of the Michaelis equilibrium constant for these enzymes.
  • 1 lnjokinase (EC 2.7.1.2) - isotype IV of the enzyme hexokinase (monomeric protein of 465 amino acids and molecular weight 50 kDa), mainly present in hepatocytes, as well as in cells of the pancreas. It catalyzes the phosphorylation of only D-glucose by transferring the phosphate group to glucose due to ATP.
  • Glucokinase is characterized by an equilibrium constant K t ⁇ 10 mmol / L [31] and causes rapid absorption of glucose from the blood in the liver during the absorption period.
  • glucose enters the hepatocytes through transporters of the GLUT2 type, whose activity is not regulated by the level of insulin, but whose affinity for glucose is low (K t ⁇ 10 mmol / l).
  • Insulin affects the absorption of glucose by the liver only indirectly - it induces the synthesis of glucokinase in hepatocytes.
  • glucokinase is designed to quickly convert the excess blood glucose that arose after a meal into glycogen.
  • the saturation curves of the glucokinase enzyme obtained using the universal distribution function of the biopolymer molecule are shown in Fig. 59a.
  • the height of the energy barrier Eb E max - E tt . separating the crystalline and liquid phases in the glucokinase molecule can be determined directly from the graph of the free energy Ux s anr (ci) of glucokinase tetramer versus concentration shown in Fig. 59b, which can be obtained from the glucokinase distribution functions shown in Fig. 59a.
  • the bond energy Eb is determined by the internal entropy of the tetramer in the configuration R 2 with 2 hydrogen bonds, which can be calculated using the expression:
  • the reaction rate is:
  • the factor 1.1735 in calculating the reaction rate appears as a result of a change in the mass of the glucose molecule after the attachment of the phosphate group.
  • D - glucose molecule G
  • attaches a phosphate group PO3III with a molecular weight of 80 and turns into glucose-6-phosphate (a GP molecule) with a molecular weight of 260 180 + 80.
  • Hexokinase (AT-dependent D-hexose-b-phosphotransferase) (EC 2.7.1.1) is a cytoplasmic enzyme of the class of transferases, a subclass of phosphotransferases, the first enzyme of the glycolysis pathway.
  • the first isozyme most typical for the brain, consists of one subunit, the amino acid composition of which has been established. The question of the subunit structure of the remaining isozymes remains open. For the manifestation of catalytic activity, it requires Mg 2+ ions . The true substrate for this enzyme is not ATP4, but the MgATP2 complex.
  • the active site includes serine and histidine residues.
  • SH groups of the polypeptide chain play an important role in the mechanism of catalytic action.
  • hexokinase is activated by vitamins, insulin, as well as by binding to some biological membranes, for example, mitochondrial; inhibited by glucose-6-phosphate and corticosteroids.
  • hexokinase Unlike glucokinase, the Michaelis constant of hexokinase is 0.01 mmol / L, therefore, hexokinase, localized in the cells of most tissues of the human body, literally "catches" glucose from blood plasma, while glucokinase catalyzes the phosphorylation of glucose only at high concentrations.
  • glucokinase and hexokinase provide a redistribution of glucose flow in the body: during the absorption of nutrients from the intestine, the concentration of glucose in the blood plasma increases, and glucose is sent to the liver, where it is exposed to the action of glucokinase; at the end of digestion, against the background of a decrease in glucose concentration, it is sent to skeletal muscles, where hexokinase acts on it.
  • Glucose metabolism begins with an irreversible hexokinase (or glucokinase) reaction, in which the transfer of the phosphate group of ATP to glucose is catalyzed to form glucose-6-phosphate.
  • the hexokinase reaction serves not only as a trigger, but also as the main limiting reaction among other glycolysis reactions.
  • the substrate specificity of hexokinase (EC 2.7.1.1) is relative - in addition to glucose, fructose, mannose, galactose, glucosamine and some nonmetabolizing sugars such as 2-deoxyglucose are phosphorylated.
  • Hexokinase is localized in the plasma membrane, cytoplasm and is partially associated with mitochondria, and in the brain the activity of this fraction can reach 50% of the total enzyme activity. It has been experimentally established that a potassium ion participates in the excitation of hexokinase, which is also involved in the excitation of other enzymes - pyruvate kinase, which accelerates the transport of phosphoric acid from pyruvate to adenosine diphosphate, enzymes involved in the Krebs cycle, including enzymes that help in the synthesis of adenosine triphosphate during oxidative ...
  • Fig. 60a shows the saturation curves and the rate of the enzymatic reaction of hexokinase versus the dimensionless glucose concentration, scaled by dividing the concentration by 0.5 mmol / liter.
  • the barrier height per one hydrogen bond is
  • E max - E mm 3.4436 in.
  • the magnitude of the quantum of the interaction energy in units of the quantum of thermal energy kW can be determined from the graph of the energy barrier shown in Fig. 60b.
  • the value of the activation energy can be determined from the graph:
  • the dissociation constant of a tetramer can be calculated using the expression:
  • the magnitude of the energy quantum in in this case, can take quantized values 8 réelle n : corresponding to different integer values of the quantum number n:
  • the energy of the hydrogen bond in this case, is split into an infinite number of interaction quanta, the energies of which are determined by the quantization condition (53), and, as a consequence, the energy level of the energy barrier is split into an infinite number of closely spaced energy levels.
  • the amino acid with a negative charge of the side group is glutamic acid (Glu, E), the side group of which consists of 3 monomeric units; the amino acid with an uncharged side group is asparagine (Asi, N), the side group of which consists of 3 monomeric units; in the case of glucokinase, the amino acid with the negative charge of the side group is aspartic acid (Aci, D), the side group of which consists of 2 monomer units; an amino acid with an uncharged side group is an amino acid selected from the group threonine, cysteine, serine, the side groups of which consist of 2 monomeric units.
  • Hexokinase The active site of hexokinase includes serine and histidine residues. SH groups of the polypeptide chain play an important role in the mechanism of catalytic action. Hexokinase is activated by vitamins, insulin, as well as by binding with some biol. membranes; inhibited by glucose-6-phosphate and corticosteroids.
  • the second difference between hexokinase and glucokinase is that the substrate specificity of hexokinase (EC 2.7.1.1) is relative - in addition to glucose, fructose, mannose, galactose, glucosamine and some non-metabolizing sugars such as 2-deoxyglucose are phosphorylated. It can be assumed that the quantization of the hydrogen bond energy (53) makes it possible to explain the relative substrate specificity of hexokinase by the fact that the listed sugar molecules form hydrogen bonds with monomers of the polypeptide chain with close but different energy values, which correspond to different values of the distance between tetramer monomers.
  • the equilibrium configuration R 2 with 2 hydrogen bonds, corresponding to the minimum free energy at a ⁇ 1, in accordance with the scale invariance condition (), can be realized when the condition dS / ds r 0 is satisfied, which can be realized in a unique way as a result of splitting into e quanta of each quantum of the internal entropy of the tetramer, the number of which corresponds to the number of admissible configurations of hydrogen bonds in the tetramer.
  • the maximum interaction energy (the top of the energy barrier), as shown, is achieved at a glucose concentration corresponding to a particular point G of the process; the tetramer is in the R 2 conformation with 2 hydrogen bonds, which can equally likely be converted to the R 4 or Ro conformation.
  • the bond energy Eb which must be spent for the detachment of two complexes EG (a glucose molecule G linked by one hydrogen bond to monomer E), forming a tetramer complex [E 2 G 2 ] in the configuration R 2 with 2 hydrogen bonds, can be calculated using the expression:
  • the factor 4 in the formula corresponds to the number of hydrogen bonds in the tetramer complex.
  • the reaction rate is:
  • the chemical bond in the tetramer between the substrate molecules and the monomers of the polymer chain can be defined as a delocalized hydrogen bond.
  • a covalent bond is considered to be localized if its electron pair is in the field of two nuclei and binds only two atoms. If the electron density of a chemical bond is distributed between three or more nuclei, then such a bond is called three-center, multicenter, and in the general case, delocalized.
  • a delocalized bond is a bond, an electron pair of which is dispersed between several (more than 2) atomic nuclei (similar to a metal bond). The nature of the delocalization of electrons of a chemical bond can, in turn, differ in the dimension of space.
  • bonds that are delocalized in one dimension delocalized in the plane, and delocalized in three-dimensional space.
  • the well-known metallic bond from the standpoint of the above classification is a short-range and long-range, non-polar, highly delocalized (in three dimensions) bond.
  • the chemical bond depending on the distance at which it manifests itself, is divided into short-range and long-range.
  • the strength of a long-range communication is tens of times less than the strength of a short-range communication.
  • Long range bond is also called weak or intermolecular bond.
  • a short-range bond manifests itself at distances close to the size of atoms. It is carried out between atoms in a molecule, a crystal in the range from 74 to 400 nyms.
  • the breaking energy of a short-range chemical bond is in the range from 40 to 1000 kJ / mol.
  • a long-range chemical bond manifests itself when a substance passes from the gas phase into a liquid or solid state.
  • Short-range bonds are formed as a result of such an interaction that each electron can be described by an independent wave function - the one-electron approximation.
  • Long-range connections are the result of the collective movement of electrons.
  • thermodynamic properties of a biopolymer molecule can be described on the basis of a statistical model, as a result of the interaction of monomers of the polymer chain with molecules and solvent ions, as a result of which tetramers are formed in the volume of a macromolecule - molecular complexes consisting of 2 non-neighboring monomers of the polymer chain and 2 molecules solvent glucose, hydrogen bonded, which can be considered as a type of weak delocalized covalent bond between the glucose molecule and the monomers of the polymer chain.
  • a glucose molecule can form a glycosidic valence bond also with amino acids of protein molecules.
  • a carbohydrate residue an oligosaccharide with an irregular structure and containing glucose, mannose, galactose and their amino derivatives, as well as N-acetylneuraminic acid
  • N-acetylneuraminic acid is attached to the amino acids of the protein chain or an N-glycoside bond - to the amide nitrogen of asparagine , or by O-glycosidic bond - to the hydroxyl group of serine, threonine, hydroxylysine residues.
  • the structural formulas of the glycosidic bond with amino acids are shown in Fig. 61.
  • glycosidic bond The bond between an amino group or other group containing a nitrogen atom with a sugar is often also called a glycosidic bond, although SHRAC does not recommend this.
  • the bond between sugar and nitrogenous base in a nucleoside is called a glycosidic bond.
  • the structural formulas of the glycosidic bond in nucleosides are shown in Fig. 62.
  • compositions based on hyaluronic acid are provided.
  • compositions and preparations based on hyaluronic acid are widely used in medicine and cosmetology: regeneration of skin cells in aesthetic cosmetology; healing of wounds and burns; protecting the structures of the eye and ensuring the depth of the anterior chamber during surgery in ophthalmic surgery and in the manufacture of contact lenses; accelerated multiplication of bone cells and rapid bone fusion in fractures; delivery of drugs to the site of inflammation in pathological foci and control over the dosed release of the drug; accelerated multiplication of bone cells and rapid bone fusion in fractures.
  • thermodynamic properties of the intercellular substance based on a new method for calculating the polymer macromolecule of hyaluronic acid, allows the development of fundamentally new pharmaceutical compositions based on hyaluronic acid.
  • the invention also relates to pharmaceutical compositions that contain a biopolymer molecule and one or more pharmaceutically acceptable carriers, adjuvants, diluents and / or excipients, such that can be administered to a patient together with the biopolymer molecule that is the essence of this invention, and which do not destroy the activity of the biopolymer molecule, and are non-toxic in amounts sufficient to deliver the required amount of the biopolymer molecule.
  • Hyaluronic acid which is currently used in practice, in cosmetology and medicine, is obtained by biochemical synthesis.
  • bacterial cultures are used, specifically streptococci grown on a plant basis (wheat broth). This method is based on the ability of some microorganisms to synthesize hyaluronic acid.
  • the biochemical method makes it possible to achieve a large amount of a substance with the desired molecular weight and with an acceptable structure.
  • the hyaluronic acid molecule is very sensitive. It reacts sharply to chemical modification: thermal or mechanical; for this reason, preparations should be properly stored during chemical reactions.
  • Stabilized hyaluronic acid is obtained by biochemical synthesis, followed by a crosslinking process called stabilization (the formation of intersecting crosslinks between hyaluronic acid molecules).
  • Hyaluronic acid molecules are crosslinked to prevent their rapid degradation. This hyaluronic acid exhibits long-term clinical effects when it is incorporated into the skin. After crosslinking, the resulting gels are purified, which is a very painstaking process and is a decisive factor in the pricing of stabilizing hyaluronic acid preparations.
  • gels of various viscosities are produced to eliminate various aesthetic problems: slightly stabilized - to eliminate fine wrinkles, more stabilized and more viscous - to correct nasolabial folds and restore lost volumes.
  • Stabilized hyaluronic acid is used in contouring practice and in reinforcing the face, since this type of hyaluronate (sodium salt of hyaluronic acid) holds volume well. That is, when it is necessary to replenish the lost volumes, for example, of the cheeks, to push out the nasolabial folds from the outside, to model the face contour and fill in the gaps on the face, stabilized hyaluronic acid is used.
  • Hyaluronic acid must be stabilized and have the characteristics which are manifested in the native state of living tissue, under normal physiological conditions, under which the intercellular substance is in a heterophasic state. It has been shown that normal physiological characteristics of living tissue are achieved at physiological values of temperature and acidity, at the following concentrations of biochemical components in the intercellular substance: glucose concentration (mmol / liter) 5.0; temperature 36.447 ... C. concentration of hyaluronic acid monomers (mmol / liter) 45.0; [Na] - [Cl] (sodium excess, mmol / liter) 40.0; external overpressure (mm.pm.cm.) 14.6; the range of glucose concentrations (mmol / liter) 3.7 - 13.67.
  • biopolymer molecules described in this invention can be used for the prevention and / or treatment of human diseases, for example, in the form of the following formulations (by "biopolymer molecule” is meant an active ingredient that is a biopolymer molecule according to the invention in a heterophasic state).
  • the concentration of the active ingredient in the preparation in particular the equivalent concentration of hyaluronic acid monomers of 45 mmol / liter, is 15 mg / ml.
  • the concentration of glucose in the preparation is equivalent to the concentration of free (unbound by polymer) glucose 5 mmol / liter, in the range of 5 - 15 mg / ml.
  • the concentration of sodium and potassium ions in an aqueous solution with a pH of 7, 0-7, 5 is 40 mmol / liter and 5 mmol / liter, respectively.
  • Enzyme-based therapeutic compositions are Enzyme-based therapeutic compositions.
  • Type 2 diabetes mellitus is an urgent problem of modern health care.
  • oral hypoglycemic drugs today there is a great need for the creation and introduction into clinical practice of new effective and safe drugs.
  • GK glucokinase
  • Glucokinase activators represent a new class of antidiabetic drugs with reliable hypoglycemic effects, proven in preclinical trials.
  • glucokinase activators do not cause clinically significant hypoglycemia when using experimental models of diabetes mellitus and do not affect lipid levels and do not increase body weight.
  • GK low-molecular-weight activator
  • GKA for lowering glucose in animal models of type 2 diabetes.
  • Screening of 120,000 compounds identified a compound with allosteric GK activator properties.
  • the active R enantiomer of this compound, R082881675 increased the enzymatic activity of GK, when administered orally reduced blood glucose levels in wild-type mice and in diabetes models, accelerated glucose metabolism in the liver and glucose-induced insulin secretion in isolated pancreatic islets rats.
  • the search for and characterization of other low molecular weight GKA became one of the main directions in the development of antidiabetic drugs over the next decade.
  • Musin R.F. RF patent for invention N ° 2629796 “Method and multisensor device for non-invasive monitoring of blood glucose levels”.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Surgery (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Measurement Of The Respiration, Hearing Ability, Form, And Blood Characteristics Of Living Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

Настоящая группа изобретений относится к медицине и медицинской технике, в частности, к неинвазивным способам и устройствам для мониторинга уровня глюкозы в крови на основе абсорбционной изотермической калориметрической спектроскопии, позволяющей определять в реальном времени содержание биохимических компонентов живой ткани. Также настоящее изобретение относится к способам получения биополимерной молекулы с заданными биологическими свойствами и заданной пространственной структурой. Использование группы изобретений позволит осуществлять неинвазивный мониторинг уровня сахара в крови пациентов, страдающих диабетом, в том числе для ранней диагностики сахарного диабета.

Description

СПОСОБ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ СПЕКТРОСКОПИИ ЖИВОЙ ТКАНИ
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящая группа изобретений относится к медицине и медицинской технике, в частности, к способам и устройствам для мониторинга уровня глюкозы в крови путем измерения с помощью калориметрического метода теплового эффекта и скорости метаболизма локального участка живой ткани. Также настоящее изобретение относится к способам получения биополимерной молекулы с заданными биологическими свойствами и заданной пространственной структурой. Использование группы изобретений позволит осуществлять неинвазивный мониторинг уровня сахара в крови пациентов, страдающих диабетом, в том числе для ранней диагностики сахарного диабета.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Одним из широко распространенных и опасных заболеваний современности является сахарный диабет, наиболее распространенная форма которого, составляющая более 90-95% от общего числа диабетиков, это - сахарный диабет 2-го типа (СД2), который является одной из самых актуальных проблем современной медицины. Социальная значимость этого хронического заболевания определяется несколькими факторами, важнейшим из которых является высокая распространенность заболевания во всем мире недостаточно высокая эффективность методов лечения заболевания, способы излечения которого на сегодняшний день все еще находятся в стадии разработки. Согласно прогнозу Международной федерации диабета (IDF), число пациентов, страдающих диабетом, к 2035 увеличится мире до 592 млн. человек с 422 млн. в 2018.
Федеральная статистика по здоровью США показала, что 12,3 % американцев возрастом 20 лет и выше живет с диабетом. Причем около 3 % об этом даже не подозревают, тем самым усугубляя свое положение. Другие 37 % живут с пре-диабетом (состояние, характеризующееся повышенным уровнем сахар в крови). Для сравнения, 10 лет назад этот показатель составлял всего 27 % вместо 37. Исследователи из Центров по Контролю Заболеваний США утверждают, если человек с пре- диабетом не меняет свой образ жизни в лучшую сторону, то в 30 % случаев у него развивается диабет 2 типа в течение 5 лет. Согласно прогнозу Международной федерации диабета (IDF), расходы мирового здравоохранения на лечение диабета к 2035 вырастут до 936 млрд долларов с 586 млрд в 2012.
Диабет часто приводит к развитию осложнений, таких как слепота, почечные нарушения, нервные заболевания и сердечно-сосудистые заболевания. Диабет является ведущим заболеванием, приводящим к слепоте в возрасте от 20 до 74 лет. Примерно от 12000 до 24000 человек в год теряют зрение по причине диабета. Диабет является ведущей причиной заболеваний почек, примерно в 40% новых случаев. Примерно 40-60% больных диабетом имеют предрасположенность к различным формам нервных заболеваний, которые могут привести к ампутации конечностей. Больные диабетом примерно в 2-4 раза более предрасположены к сердечным заболеваниям, в частности, инфаркту миокарда. Диабет представляет собой заболевание, связанное с недостаточной продукцией или неэффективным использованием инсулина клетками организма. Несмотря на то, что причины заболевания поняты не полностью, некоторые факторы, такие как генетические, окружающей среды, вирусные, идентифицированы.
Существует две основных разновидности диабета: 1 типа и 2 типа.
Диабет 1 типа (известный как инсулин - зависимый диабет) является аутоиммунным заболеванием, при котором выработка инсулина полностью прекращается, и чаще всего развивается в детстве и юности. Больные диабетом 1 типа нуждаются в ежедневных инъекциях инсулина.
Диабет 2 типа является метаболическим заболеванием, вызванным тем, что организм не в состоянии производить достаточное количество инсулина или неэффективно использует его. Больные диабетом 2 типа составляют примерно 90-95% от общего числа диабетиков. В США заболеваемость диабетом 2 типа приближается к эпидемиологическому порогу, в основном благодаря увеличению числа американцев пожилого возраста и преобладанию малоподвижного образа жизни, ведущего к ожирению.
Инсулин способствует проникновению глюкозы в клетку с последующим ее расщеплением для получения энергии для всех метаболических процессов. У диабетиков глюкоза не может проникнуть в клетку, накапливаясь в крови, а клетки испытывают энергетический голод.
Больные диабетом 1 типа самостоятельно вводят инсулин с помощью специального шприца и картриджа. Также возможна непрерывная подкожная инъекция инсулина посредством имплантированной помпы. Инсулин обычно получают из поджелудочной железы свиньи или синтезируют химически.
Общепринятые медицинские методы лечения диабета предписывают пациентам, принимающим инсулин, осуществлять самостоятельный мониторинг содержания сахара в крови. Опираясь на знание уровня сахара в крови, пациенты могут регулировать дозу инсулина при очередной инъекции. Регулировка необходима, поскольку уровень сахара в крови меняется в течение дня и день ото дня в силу различных причин. Несмотря на важность такого мониторинга, несколько проведенных исследований показали, что доля пациентов, которые осуществляют такой мониторинг хотя бы раз в день, падает с возрастом. Это падение происходит в основном из-за того, что метод мониторинга, который сегодня используется, связан с инвазивным отбором пробы крови из пальца. Многие пациенты считают взятие пробы крови из пальца более болезненной процедурой, чем инъекция инсулина.
Научно-исследовательские и опытно -конструкторские разработки (НИОКР), направленные на решение проблемы сахарного диабета, активно ведутся в следующих технологических направлениях:
1) Создание не инвазивного (бескровного) метода непрерывного мониторинга сахара крови пациентов; 2) Создание инвазивных методов измерения сахара крови на основе биосенсоров нового поколения;
3) Разработка носимых электронных устройств превентивной медицины для ранней диагностики сахарного диабета на основе биосенсоров и биотехнологий нового поколения;
4) Создание и внедрении в клиническую практику новых эффективных и безопасных противодиабетических лекарственных средств.
Таким образом, создание неинвазивного (бескровного) метода мониторинга сахара крови пациентов, страдающих диабетом, и создание на его основе медицинского прибора, способного заменить промышленные инвазивные глюкометры, является одной из актуальных нерешенных проблем современной медицины и здравоохранения. Задача разработки новых методов и устройств превентивной медицины для ранней диагностики сахарного диабета, основанных на неинвазивной непрерывной регистрации сахарных кривых, тесно связано с разработкой носимых электронных устройств для неинвазивного непрерывного мониторинга сахара крови на основе биосенсоров и биотехнологий нового поколения.
Коммерческий глюкометр для измерения уровня глюкозы в крови инвазивным способом, представляет из себя биосенсор, в котором используется фермент глюкозоксидаза для расщепления содержащейся в крови глюкозы. В процессе расщепления фермент сначала окисляет глюкозу и использует два электрона для восстановления ФАД (компонент фермента) в ФАД-Н2, который, в свою очередь, окисляется в несколько ступеней электродом. Результирующий ток пропорционален концентрации глюкозы. В этом случае электрод является преобразователем, а фермент - биоселективным элементом.
Известны способы и устройства для определения уровня сахара крови неинвазивным способом: [1-10].
Метод калориметрии, как известно, широко используется в биологии для изучения тепловых процессов на молекулярном и клеточном уровнях [1-10]. Метод микрокалориметрии также успешно используется для исследования тепловых процессов (выделения и поглощения тепла) в отдельных органах, в частности, в активных мышцах и нервных волокнах.
Возросшая за последнее десятилетие активность исследований, направленных на создание метода микрокалориметрии для изучения в физиологических условиях in vivo, тепловых процессов, сопряженных с метаболизмом локального участка живой ткани человека, в значительной степени обусловлена работами по созданию неинвазивного метода мониторинга сахара крови (неинвазивного глюкометра) основанного на мониторинге теплопродукции локального участка ткани человека.
Известными методами физиологической калориметрии являются методы: прямой калориметрии и непрямой калориметриит Метод прямой калориметрии предусматривает непосредственное определение суммарного количества выделяемого тепла с помощью калориметрической камеры для живых объектов.
Метод непрямой калориметрии позволяет определять количество выделяемого тепла косвенным путем, на основе учета динамики дыхательного газообмена с помощью респираторных камер и различных систем. Различают две возможные модификации метода непрямой калориметрии: метод полного газового анализа (учет поглощенного О2 и выделенного СО2) и метод неполного газового анализа (учет поглощенного Ог).
Известен способ измерения скорости базального метаболизма человеческого организма с помощью калориметра всего тела (прямая калориметрия), описанный в US 4386604 А, опубл. 07.06.1983. По измерению температуры воздуха и суммарного количества воды, испаряющейся с поверхности всего тела, определяют суммарную теплоотдачу всего тела и вычисляют скорость базального метаболизма. Основным недостатком х способа является то, что для его реализации требуются громоздкие, стационарные и дорогостоящие калориметрические камеры всего тела. Кроме того, метод прямой калориметрии характеризуется низкой точностью.
Известен способ и устройство для микрокалориметрического измерения скорости локального метаболизма ткани, содержания воды межклеточной ткани, концентрации биохимических компонентов крови и давления в сердечно-сосудистой системе, описанный в [11], в котором по измерению теплового эффекта и скорости метаболизма локального участка ткани определяют содержание сахара в крови (RU 2396897). Величина скорости метаболизма определяется путем измерения суммарного количества воды, испаряющейся в процессе неощутимой перспирации с поверхности локального участка кожи, и измерения температуры и влажности окружающего воздуха. Упомянутый способ измерения позволяет реализовать высокую точность в лабораторных условиях с контролируемыми параметрами микроклимата (температура и влажность воздуха) помещения, в котором проводится измерение, при неизменных значениях климатических параметров внешней среды (температура и влажность окружающей среды, атмосферное давление). Основным недостатком упомянутого способа, ограничивающим его практическое применение, является то, что результаты измерений зависят от физико-климатических факторов окружающей среды; в каждом случае при изменении климатических факторов, при неизменных значениях параметров микроклимата помещения, в котором проводятся измерения, требуется новая калибровка измерительного канала.
Известны спектральные методы для неинвазивного измерения концентрации глюкозы в крови [1]. Основным недостатком известных не инвазивных устройств для измерения концентрации глюкозы в крови, основанных на методах спектроскопии диффузного отражения и абсорбционной спектроскопии, является высокая погрешность измерений, обусловленная низким отношением регистрируемого сигнала к шуму, которое ограничивает точность при спектральных измерениях на характеристических частотах молекул глюкозы крови в кровеносных капиллярах, расположенных на глубине 0,5-1 мм от поверхности эпидермиса.
Известен метод оптико-калориметрической спектроскопии, в основе которого лежит поглощение света с возбуждением уровней энергии молекул вещества биологического объекта, последующая безызлучательная релаксация уровней и нагрев объекта. В отличие от метода изотермической калориметрической спектроскопии, описанной выше, в методе оптико- калориметрической спектроскопии температура вещества является переменной величиной; информационным параметром в этом методе является изменение температуры исследуемого образца. Степень нагрева определяется величиной поглощающей способности вещества, интенсивностью света и эффективностью конкурирующих процессов (флуоресценции, фотохимического и фотоэлектрического эффектов). Главное достоинство оптико- калориметрических методов состоит в возможности регистрации спектров поглощения сильно рассеивающих сред, что очень важно в биологии и медицине. Поскольку измеряемым параметром является изменение температуры, то в качестве детекторов применяются неселективные приемники излучения, т.е. отсутствует ограничение по длинам волн со стороны приемника.
Однако, ни одна из существующих неинвазивных непрерывных методик мониторинга сахара в крови не позволяет в реальном времени точно отслеживать содержание и временную динамику биохимических компонентов живой ткани, которые являются основным фактором, используемым для ранней диагностики и терапии сахарного диабета.
РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Техническая задача и технический результат настоящего изобретения состоят в разработке принципиально нового метода спектроскопии живой ткани в условиях in vivo - абсорбционной изотермической калориметрической спектроскопии, позволяющей определять в реальном времени содержание биохимических компонентов живой ткани, и устройства, позволяющего осуществить этот метод.
Разработанные способ и устройство для неинвазивного непрерывного мониторинга сахара в крови применяются для ранней диагностики сахарного диабета и мониторинга сахара в крови в процессе сахаропонижающей терапии и основаны на использовании биосенсоров нового поколения.
Дополнительной технической задачей и техническим результатом настоящего изобретения является создание нового класса биосенсоров и биологических катализаторов для применения в самых разных областях человеческой деятельности, помимо ранней диагностики диабета: в сферах разработки лекарственных препаратов нового поколения, биомедицины и белковой и генной инженерии, пищевой промышленности, безопасности и мониторинга качества окружающей среды.
Одним из перспективных направлений применения группы изобретений является создание и внедрение в клиническую практику новых эффективных и безопасных лекарственных средств, в частности, одной из перспективных мишеней для создания новых противодиабетических средств является глюкокиназа. Дополнительной технической задачей и техническим результатом настоящего изобретения является разработка способа получения биополимерной молекулы с заданными биологическими свойствами и заданной пространственной структурой. Предлагаемый способ получения биополимерной молекулы позволяет определить первичную структуру биополимерной молекулы, которая при заданном биохимическом составе растворителя, при определенных условиях (температура, давление, кислотность), может свернуться в биополимерную молекулу с гетерофазной структурой, обладающую функциями биосенсора и/или биологического катализатора, с биоселективностью к заданной молекуле S растворителя, катализирующего биохимическую реакцию с участием заданной молекулы S. Полимерная цепь биополимерной молекулы с заданными свойствами, структура которой определяется предлагаемым способом, на следующем этапе технологической цепочки синтезируется методами белковой и/или генной инженерии. На основе биополимерных молекул с гетерофазной структурой, полученных предлагаемым способом, могут быть созданы новое поколение биологических катализаторов и эффективных и безопасных лекарственных средств для терапии, в частности, сахарного диабета и других хронических социально значимых заболеваний. Кроме того, предлагаемый способ включает этап определения трехмерной пространственной структуры и биологических свойств биополимерной молекулы. Предлагаемый метод определения трехмерной пространственной структуры и биологических свойств биополимерной молекулы на основе известной первичной структуры полимерной цепи имеет важное практическое применение для разработки новых лекарственных препаратов и новых методов лечения. Проблема предсказания пространственной структуры биополимерной молекулы и ее связь с биологической функцией является одной из крупнейших нерешенных проблем современной науки, решение которой сделало возможным создание принципиально новых биотехнологий, которые могут применяться в белковой и генной инженерии.
Предлагаемый способ и устройство для его осуществления, ориентированные на неинвазивный непрерывный мониторинг сахара крови, позволяют определять содержание сахара в крови путем измерения с помощью принципиально нового метода спектроскопии живой ткани в условиях in vivo - абсорбционной изотермической калориметрической спектроскопии, позволяющая определять в реальном времени содержание биохимических компонентов живой ткани. Величина мощности электромагнитного излучения на характеристической частоте исследуемого биохимического компонента, поглощенной в локальном объеме вещества живой ткани, измеряется не по изменению температуры ткани, а по изменению величины осмотического давления (или количества воды в межклеточном пространстве), характеризующего объем межклеточного вещества, находящегося в гетерофазном конденсированном состоянии, при температуре фазового перехода (соответствующей термодинамическому равновесию кристаллической и жидкой фаз межклеточного вещества). При этом величина поглощенной мощности электромагнитного излучения, падающей на поверхность исследуемого локального участка эпидермиса живой ткани, определяется по количеству межклеточного вещества, изменившего фазовое состояние (плавление глобулярной фазы гиалуроновой кислоты), методом измерения в реальном времени осмотического давления межклеточного вещества.
Предлагаемый способ ранней диагностики и терапии сахарного диабета может быть реализован с помощью принципиально нового метода спектроскопии живой ткани в условиях in vivo - абсорбционной изотермической калориметрической спектроскопии, позволяющая определять в реальном времени содержание биохимических компонентов живой ткани.
Указанный технический результат достигается путем осуществления способа изотермической калориметрической спектроскопии биохимических компонентов живой ткани пациента, включающего следующие этапы:
- накладывают на поверхность кожи пациента с дозированным давлением по меньшей мере один тепло- и водонепроницаемый аппликатор, образующий закрытую систему в локальной области ткани под аппликатором;
-оказывают локальное воздействие на участок ткани под аппликатором электромагнитным излучением на одной или нескольких длинах волн, соответствующих характеристическим частотам поглощения биохимических компонентов межклеточного и/или внутриклеточного вещества;
-измеряют величину физиологического параметра, характеризующего термодинамическое фазовое состояние межклеточного вещества под аппликатором и ее временную динамику, в зависимости от мощности падающего электромагнитного излучения;
-определяют концентрацию биохимического компонента межклеточного вещества и/или межклеточной жидкости и /или крови и ее временную динамику на основе временной динамики измеренного физиологического параметра.
В частных вариантах воплощения изобретения интенсивность электромагнитного излучения может быть постоянной или переменной, изменяющейся с постоянной скоростью и/или модулированной частотой и/или амплитудой.
В частных вариантах воплощения изобретения физиологическим параметром, характеризующим термодинамическое фазовое состояние межклеточного вещества, является осмотическое давление межклеточного вещества и/или количество воды в межклеточном пространстве ткани и /или эластическое давление живой ткани под аппликатором.
В частных вариантах воплощения изобретения биохимические компоненты межклеточного и/или внутриклеточного вещества выбирают из группы, включающей в себя воду, гиалуроновую кислоту, глюкозу, триглицериды и другие биохимические компоненты межклеточного вещества, клетки и крови.
В частных вариантах воплощения изобретения длину волны воздействующего на участок ткани электромагнитного излучения выбирают из диапазона электромагнитного излучения, который определяют по характеристическим частотам поглощения биохимических компонентов живой ткани в оптическом и/или ближнем инфракрасном и/или среднем и дальнем инфракрасном и/или терагерцовом и/или микроволновом диапазоне.
В частных вариантах воплощения изобретения концентрацию биохимического компонента межклеточного вещества и/или межклеточной жидкости и /или крови дополнительно измеряют на основе метода спектроскопии диффузного отражения.
В частных вариантах воплощения изобретения концентрацию биохимического компонента межклеточного вещества и/или межклеточной жидкости и /или крови дополнительно измеряют на основе метода спектроскопии комбинационного рассеяния света.
В частных вариантах воплощения изобретения биохимическим компонентом является глюкоза в крови, концентрацию которой определяют по концентрации глюкозы, связанной с мономерами полимерной цепи межклеточного вещества.
В частных вариантах воплощения изобретения осмотическое давление межклеточного вещества или количество воды в межклеточном пространстве определяют на основе спектральных измерений на длинах волн, соответствующих характеристическим частотам поглощения биохимических компонентов межклеточного и/или вну триклеточного вещества.
В частных вариантах воплощения изобретения спектральные измерения основаны на методе двухчастотной спектроскопии, в которой длина волны электромагнитного излучения выбирается по характеристической частоте тетрамера гиалуроновой кислоты межклеточного вещества в терагерцовой области, а длина волны спектрального датчика осмотического давления межклеточного вещества выбирается по характеристическим частотам поглощения воды в роговом слое эпидермиса в инфракрасной области.
В частных вариантах воплощения изобретения осмотическое давление межклеточного вещества или количество воды в межклеточном пространстве определяют по количеству воды в роговом слое эпидермиса на основе измерения физических характеристик рогового слоя эпидермиса, которые выбирают из группы, включающей в себя электрофизические характеристики, спектральные и оптико-акустические характеристики, теплофизические характеристики.
В частных вариантах воплощения изобретения осмотическое давление межклеточного вещества или количество воды в межклеточном пространстве определяют по количеству воды в роговом слое эпидермиса на основе измерений спектральных характеристик рогового слоя эпидермиса на длинах волн, соответствующих характеристическим частотам воды в роговом слое, с помощью спектрального метода, который выбирают из группы, включающей: ИК спектроскопию, Раман - спектроскопию, оптико -акустическая спектроскопию, разностную двухлучевую спектроскопию .
В частных вариантах воплощения изобретения осмотическое давление межклеточного вещества или количество воды в межклеточном пространстве определяют по количеству воды в роговом слое эпидермиса путем измерения электрических характеристик рогового слоя эпидермиса, которые выбирают из группы, включающей в себя поперечную электропроводность рогового слоя на постоянном и/или переменном токе и диэлектрическую проницаемость.
В частных вариантах воплощения изобретения концентрацию глюкозы в крови определяют по на основе временной динамики физиологического параметра, причем физиологическим параметром является осмотического давления межклеточного вещества области ткани иод аппликатором, причем указанное межклеточное вещество под аппликатором является природным биосенсором с гетерофазной структурой с селективностью к молекуле глюкозы и чувствительностью к внешним тепловым потокам, при этом индивидуальную калибровку локальной области ткани пациента определяют по содержанию гиалуроновой кислоты в межклеточном веществе и количества воды в объеме ткани под аппликатором, измеряемых спектральным методом.
В частных вариантах воплощения изобретения способ применим для ранней диагностики сахарного диабета на основе временной динамики концентрации биохимического компонента.
В частных вариантах воплощения изобретения способ применим для ранней диагностики сахарного диабета на основе временной динамики осмотического давления межклеточного вещества.
Указанный технический результат также достигается за счет разработки и создания устройства для изотермической калориметрической спектроскопии биохимических компонентов живой ткани, содержащего тепло и водонепроницаемый аппликатор, выполненный с возможностью наложения на кожу пациента с дозированным давлением, датчик температуры, один или несколько датчиков физиологических параметров, характеризующих термодинамическое фазовое состояние межклеточного вещества под аппликатором, один или несколько источников электромагнитного излучения, устройство для создания калибровочного воздействия, при этом датчики физиологических параметров расположены под аппликатором, при этом сигналы с вышеуказанных датчиков поступают последовательно на входы блока усилителей и/или синхронного детектора и/или аналогово-цифрового преобразователя, установленных на верхней поверхности аппликатора, в блок обработки информации и блок отображения информации.
В частных вариантах воплощения изобретения источник электромагнитного излучения выполнен с возможностью излучения с постоянной и/или модулированной интенсивностью и/или частотной модуляцией .
В частных вариантах воплощения изобретения датчики физиологических параметров, характеризующие термодинамическое состояние межклеточного вещества под аппликатором, выполнены в виде датчиков осмотического давления межклеточного вещества или датчиков количества воды в межклеточном пространстве ткани в локальном объеме под аппликатором и /или датчика эластического давления живой ткани под аппликатором.
В частных вариантах воплощения изобретения устройство для создания калибровочного воздействия представляет собой источник тепловой мощности, выполненный в виде резистора и/или элемента Пельтье и/или источник электрического тока и/или напряжения; устройство для создания дозированного давления на поверхность аппликатора.
В частных вариантах воплощения изобретения диапазон излучения источников электромагнитного излучения выбирают из группы, включающей в себя оптический и/или ближний инфракрасный; средний инфракрасный; дальний инфракрасный и/или терагерцовый; микроволновый диапазон излучения.
В частных вариантах воплощения изобретения датчиком осмотического давления межклеточного вещества или датчиком количества воды в межклеточном пространстве ткани в локальном объеме под аппликатором представляет собой электрометрический датчик, основанный на измерении электрофизических характеристик рогового слоя эпидермиса и ткани под аппликатором, принцип измерения которого выбирается из группы, включающей измерение поперечной электропроводности рогового слоя эпидермиса на постоянном и/ или переменном токе; измерение диэлектрической проницаемости ротового слоя эпидермиса; измерение электропроводности и/или диэлектрической проницаемости ткани под аппликатором.
В частных вариантах воплощения изобретения датчиком осмотического давления межклеточного вещества или датчиком количества воды в межклеточном пространстве ткани в локальном объеме под аппликатором представляет собой электрометрический датчик, основанный на измерении электрофизических характеристик рогового слоя эпидермиса и ткани под аппликатором, принцип измерения которого выбирается из группы, включающей измерение поперечной электропроводности рогового слоя эпидермиса на постоянном и/или переменном токе; измерение диэлектрической проницаемости рогового слоя эпидермиса; измерение электропроводности и/или диэлектрической проницаемости ткани под аппликатором.
В частных вариантах воплощения изобретения длин волны электромагнитного излучения источника спектрального датчика определяют ио характеристическим частотам поглощения биохимических компонентов межклеточного вещества и/или внутриклеточного вещества, которые выбирают из группы, включающей в себя воду, гиалуроновую кислоту, глюкозу и другие биохимические компоненты межклеточного вещества и межклеточной жидкости.
В частных вариантах воплощения изобретения датчиком осмотического давления межклеточного вещества является спектральный датчик, основанный на спектральных измерениях характеристик межклеточного вещества в терагерцовом диапазоне на длине волны, соответствующей энергии поперечной связи между мономерами полимерной цепи гиалуроновой кислоты.
В частных вариантах воплощения изобретения спектральный датчик основан ыа спектральных измерениях количества воды в роговом слое эпидермиса по характеристическим частотам воды в роговом слое на основе спектрального метода который выбирают из группы включающей в себя изотермическую калориметрическую спектроскопию, абсорбционную спектроскопию, спектроскопию диффузионного отражения, спектроскопию комбинационного рассеяния, оптико-акустическую спектроскопию.
В частных вариантах воплощения устройство по изобретению дополнительно содержит спектральное устройство, включающее источник и приемник электромагнитного излучения, для спектральных измерений на основе диффузионной отражательной спектроскопии.
В частных вариантах воплощения изобретения датчик физиологических параметров, характеризующего термодинамическое фазовое состояние межклеточного вещества под аппликатором, выполнен на пьезоэлектрическом способе измерения.
В частных вариантах воплощения изобретения устройство применимо для ранней диагностики сахарного диабета на основе временной динамики концентрации биохимического параметра и/или величины осмотического давления межклеточного вещества.
Указанный технический результат также достигается путем осуществления способа получения биополимерной молекулы с заданными биологическими свойствами и заданной пространственной структурой, состоящей из одной или нескольких субъединиц, способной к самопроизвольной укладке в пространственную конфигурацию с гетерофазной структурой, обладающей специфичностью к одной или нескольким заданным молекулам субстрата S, при определенном составе растворителя, при определенных условиях по температуре и давлению, заключающийся в том, что число субъединиц определяют на основе трехмерной пространственной структуры макромолекулы, при этом первичную структуру каждой субъединицы биополимерной молекулы определяют следующим образом:
- определяют или задают константу равновесия процесса связывания молекулы субстрата S с мономером полимерной цепи биополимерной молекулы посредством образования водородной связи;
- определяют энергию активации и/или энергию водородной связи молекулы субстрата S с мономером полимерной цепи биополимерной молекулы, соответствующую величине константы равновесия;
- по величине энергии активации и/или энергии связи идентифицируют мономеры, которые образуют первичную структуру каждой субъединицы биополимерной макромолекулы, а именно, по меньшей мере, пару мономеров А и В, образующих повторяющийся мономер -А- В- полимерной цепи, в которой А - мономер, содержащая группу, обладающую отрицательным электрическим зарядом, и В - нейтрально незаряженный мономер, с которым молекула субстрата S может образовать водородную связь, энергия которой соответствует заданной константе равновесия;
- по величине энергии активации и /или энергии связи идентифицируют одновалентные ионы растворителя, соответствующие двум разным соединениям, способным образовать слабую ионную связь с заряженным мономером, при этом один из ионов, ион М, выбирается с константой равновесия близкой к константе равновесия субстрата S;
- определяют кислотность растворителя pH, определяющую отрицательный заряд мономера А, концентрации ионов, температуру и давление;
- определяют число мономеров в цепи;
- получают биополимерную молекулу с заданной первичной структурой с помощью методов генной и/или белковой инженерии;
- получают раствор биополимерной молекулы в растворителе, пространственная структура и характеристики которого соответствуют заданным.
В частных вариантах воплощения изобретения мономер А полимерной цепи обладает положительным зарядом, а ион М растворителя обладает отрицательным зарядом.
В частных вариантах воплощения изобретения ионом М растворителя является одновалентным положительно заряженный ион металла.
В частных вариантах воплощения изобретения первичной структурой биополимерной макромолекулы, состоящей из одной субъединицы, является полисахаридная цепь, повторяющийся мономер которого содержит, по меньшей мере, одну разновидность дисахаридной пары, образованной одним моносахаридом А с отрицательно заряженной группой и одним нейтральным моносахаридом В. не обладающим заряженной группой.
В частных вариантах воплощения изобретения первичной структурой биополимерной макромолекулы, состоящей из одной субъединицы, является полимерная цепь гиалуроновой кислоты, молекулой субстрата является молекула глюкозы, одновалентным ионом металла М является ион натрия, при этом химический состав растворителя близок к химическому составу плазмы крови и межклеточной среды живой системы, при физиологических условиях in vivo.
В частных вариантах воплощения изобретения в состав растворителя добавляют двухвалентный ион и/или вещество, молекула которого обладает способностью образовать двухвалентную ионную связь с отрицательно заряженными мономерами полимерной цепи гиалуроновой кислоты .
В частных вариантах воплощения изобретения биополимерной молекулой, состоящей из одной субъединицы, является полипептидная цепь из аминокислот, с повторяющимися мономерами, содержащими по меньшей мере одну аминокислоту с отрицательно заряженной группой R., и одну аминокислоту с нейтральной незаряженной группой Rh. одновалентным ионом металла М является ион калия, при этом химический состав растворителя близок к химическому составу внутриклеточной среды живой системы при физиологических условиях in vivo.
В частных вариантах воплощения изобретения в состав растворителя добавляют дополнительные двухвалентные ионы металла или двухвалентные соединения, которые выбирают из группы, включающей ион магния Mg+2, марганца Мп+2, ионы других металлов и соединений.
В частных вариантах воплощения изобретения субстратом является молекула D- глюкозы и/ или молекула другого моносахарида.
В частных вариантах воплощения изобретения биополимерная молекула с гетерофазной структурой представляет собой биосенсор с избирательностью к заданной молекуле субстрата S, активный в водной среде, преобразующий сигнал концентрации субстрата S в сигнал, пропорциональный объему макромолекулы и/или внутримолекулярному осмотическому давлению, который измеряется электронным устройством.
В частных вариантах воплощения изобретения биополимерной молекулой является полисахарид гиалуроновой кислоты, обладающий избирательностью к молекуле глюкозы.
В частных вариантах воплощения изобретения биополимерная молекула с заданными биологическими свойствами, состоящая из двух субъединиц, способная к самопроизвольной укладке в пространственную конфигурацию с гетерофазной структурой, обладающая специфичностью к заданной молекуле субстрата S, при определенном составе растворителя, при определенных условиях по температуре и давлению, и способ заключается в том, что для каждой из двух субъединиц определяется первичная структура следующим образом:
- определяют или задают константу равновесия процесса связывания молекулы субстрата S с мономером полимерной цепи биополимерной молекулы посредством образования водородной связи;
- определяют энергию активации и/или энергию водородной связи молекулы субстрата S с мономером полимерной цепи биополимерной молекулы, соответствующую величине константы равновесия;
- по величине энергии связи идентифицируют мономеры, которые образуют первичную структуру первой субъединицы биополимерной макромолекулы, а именно, по меньшей мере, пару мономеров А1 и В1. образующих повторяющийся мономер -А1- В1- полимерной цепи, в которой А1 - мономер, содержащая группу, обладающую отрицательным электрическим зарядом, и В1 - нейтрально незаряженный мономер, с которым молекула субстрата S может образовать водородную связь, энергия которой соответствует заданной константе равновесия;
- идентифицируют мономеры, которые образуют первичную структуру второй субъединицы биополимерной макромолекулы, а именно, по меньшей мере, пару мономеров А2 и В2. образующих повторяющийся мономер -А 2- В2- полимерной цепи, в которой А2 - мономер, содержащая группу, обладающую положительным электрическим зарядом, и В2 - нейтрально незаряженный мономер, с которым молекула субстрата S может образовать водородную связь, энергия которой соответствует заданной константе равновесия;
- по величине энергии связи идентифицируют одновалентные ионы растворителя, соответствующие двум разным соединениям или веществам, способным образовать слабую ионную связь с заряженными мономером, при этом один из ионов, ион М, выбирается с константой равновесия близкой к константе равновесия субстрата S;
- определяют кислотность растворителя pH, определяющую отрицательный заряд мономера А, концентрации ионов, температуру и давление;
- определяют число мономеров в цепи;
- получают биополимерную цепь, состоящую из двух субъединиц, с заданной первичной структурой с помощью методов генной и/или белковой инженерии;
- получают раствор биополимерной молекулы в растворителе, характеристики которого соответствуют заданным.
В частных вариантах воплощения изобретения субъединицами являются полипептидные цепи из аминокислот.
В частных вариантах воплощения изобретения для каждой субъединицы определяют расположение в цепи повторяющихся мономеров, характеризующих взаимодействие между субъединицами, образующих уникальную аминокислотную конфигурацию активного центра белковой молекулы, который образуется в процессе пространственной укладки в области пространства между доменами субъединиц.
В частных вариантах воплощения изобретения бионолимерная молекула с гетерофазной структурой представляет собой биологический катализатор с заданными характеристиками и избирательностью к заданной молекуле субстрата S, активный в водной среде, катализирующий биохимические реакции с участием молекулы субстрата S.
В частных вариантах воплощения изобретения биополимерная молекула представляет собой фермент с заданными характеристиками на основе биополимерной молекулы с гетерофазной структурой.
В частных вариантах воплощения изобретения первичная структура биополимерной молекулы с заданными биологическими свойствами определяется по характеристикам фермента гексокиназы, константе равновесия и скорости биохимической реакции, которую катализирует фермент.
В частных вариантах воплощения изобретения первичная структура биополимерной молекулы с заданными биологическими свойствами определяется по характеристикам фермента глюкокиназы, константе равновесия и скорости биохимической реакции, которую катализирует фермент.
В частных вариантах воплощения изобретения при заданном составе растворителя и заданной первичной структуре биополимерной молекулы, состоящей из 2 и более субъединиц, определяют четвертичную пространственную структуру макромолекулы следующим образом:
- определяют аминоконцевые группы белковой биополимерной молекулы, которыми отделены полипептидные цепи субъединиц, образующих первичную структуру белковой биополимерной молекулы;
- определяют для каждой субъединицы структуру элементарной цепочки взаимодействия, характеризующей взаимодействие полимерной цепи с растворителем; для этого определяют молекулу субстрата и идентифицируют одновалентный ион в составе растворителя для каждой субъединицы;
- для каждой субъединицы вычисляют константу равновесия, энергию активации и определяют объем трехмерного домена;
- определяют наиболее вероятную трехмерную пространственную конфигурацию доменов, соответствующих субъединицам.
В частных вариантах воплощения изобретения биополимерной молекулой, первичная структура которой состоит из 2 и более субъединиц, является олигомерный белок.
Настоящее изобретение также включает биогюлимерыую молекулу с гетерофазной структурой, представляющую собой биосенсор с селективностью к заданной молекуле субстрата и полученная способом по изобретению, проявляющая активность в водной среде.
Настоящее изобретение также включает биополимерную молекула с гетерофазной структурой, обладающая избирательностью к заданной биологической молекуле субстрата S, представляющую собой биологический катализатор для катализа биохимической реакции с участием молекулы субстрата S, полученную способом по изобретению. Биополимерная молекула с гетерофазной структурой, обладающая избирательностью к заданной молекуле субстрата S, представляющая собой фермент для катализа биохимической реакции с участием молекулы субстрата S, полученная способом по изобретению.
В частных вариантах воплощения изобретения биополимерная молекула характеризуется специфичностью к молекуле глюкозы, а также тем, что:
- биополимерная молекула представляет собой сополимер, которым является полисахарид гиалу роновой кислоты ;
- компонентами растворителя с заданной кислотностью одновременно являются ионы натрия и калия, молекула глюкоза.
В частных вариантах воплощения изобретения биополимерная молекула характеризуется специфичностью к молекуле глюкозы, и отличается тем, что биополимерная молекула представляется собой полипептидную цепь, повторяющийся мономер которой содержит аминокислоту с отрицательно заряженной боковой группой, которую выбирают из группы, состоящей из глутаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты, глицина, цистеина, тирозина, при этом, аминокислоту с незаряженной боковой группой выбирают из группы, содержащей серин, аспарагин, треонин, глутамин.
В частных вариантах воплощения изобретения аминокислотой с отрицательным зарядом боковой группы является глутаминовая кислота; аминокислотой с незаряженной боковой группой является аспарагин; субстратом биохимической реакции является D-глюкоза.
В частных вариантах воплощения изобретения аминокислотой с отрицательным зарядом боковой группы является аспарагиновая кислота; аминокислотой с незаряженной боковой группой является аминокислота, которую выбирают из группы аспарагин, треонин, цистеин, серин; субстратом биохимической реакции является D-глюкоза.
В частных вариантах воплощения изобретения полипептидная цепь дополнительно содержит аминокислоты с положительно заряженными боковыми группами, которые выбирают из группы лизин, аргинин, гистидин.
В частных вариантах воплощения изобретения растворитель дополнительно содержит двухвалентный ион металла, который выбирают из группы, включающей ион магния Mg+2, марганца Мп+2, ионы других металлов и соединений или другое соединение.
В частных вариантах воплощения изобретения полипептидная цепь первой субъединицы содержит аминокислоту с отрицательно заряженной группой бокового остатка, а полипептидная цепь второй субъединицы содержит аминокислоту с положительно заряженной группой бокового остатка.
В частных вариантах воплощения изобретения аминокислотами активного центра белка являются серин, боковой остаток которого обладает отрицательно заряженной группой, и гистидин, боковой остаток которого обладает положительно заряженной группой.
В частных вариантах воплощения изобретения биополимерная молекула является молекулой для создания биополимерного вещества или фармацевтической композиции на основе гиалуроновой кислоты для лечения ран и воспалений тканей.
В частных вариантах воплощения изобретения биополимерная молекула является молекулой для создания лекарственного препарата или фармацевтической композиции для лечения сахарного диабета.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Прилагаемые чертежи, которые включены в состав настоящего описания и являются его частью, иллюстрируют варианты осуществления группы изобретения и совместно с общим описанием группы изобретения и нижеприведенным подробным описанием вариантов осуществления служат для пояснения принципов настоящего изобретения.
На рисунке 1 показана пространственная (третичная) структура глобулярного белка.
На рис. 2 изображен повторяющийся дисахар идный мономер полимерной цепи гиалуроновой кислоты.
На рис. За изображен график зависимости осмотического давления межклеточного вещества эпидермиса человека от мощности падающего инфракрасного теплового излучения (с максимумом спектральной мощности на длине волны l~ 10 мкм). На рис. 36 изображен график зависимости осмотического давления межклеточного вещества эпидермиса человека от концентрации глюкозы в крови. По оси абсцисс отложена концентрация глюкозы в ммоль/литр; по оси ординат отложена функция Ро - Росм, где Ро- константа, значение которой определяется индивидуальной калибровкой, Р0См- осмотическое давление межклеточного вещества эпидермиса.
На рис. 4 изображен график зависимости температуры произвольного вещества от количества введенного в систему тепла ( heating curve).
На рис. 5 изображена наиболее вероятная конфигурация объединенной системы (слева) полимерная цепь - растворитель, которая реализуется равномерным распределением N/2 адсорбированных ионов Na+ по узлам цепи и однородным распределением N/2 свободных ионов Na+ и N/2 свободных отрицательно заряженных мономеров М в объеме макромолекулы; справа показана наименее вероятная конфигурация максимальной линейной плотности энтропии (справа).
На рис. 6 показана конфигурации полимерной сетки и сетки водородных связей воды. Сшивки полимерной сетки посредством водородных связей могут реализоваться в разных возможных конфигурациях тетрамера.
На рис.7 изображена микроскопические формы (G) тетрамера, соответствующие разным числам водородных связей и дискретным значениям энергии связи тетрамера.
На рис.7а изображена конфигурация (G) тетрамера в равновесных конформациях (R) и (Т), переходящих друг в друга в процессе теплового движения.
На рис. 76 изображена равновесная конфигурация (Na) тетрамера, образованного из 6 звеньев (1-6) не соседних участков цепи (1-5-4 и 2-6-3).
На рис. 8 изображена наиболее вероятная равновесная конфигурация полимерной цепи в растворителе с избытком ионов Na и К, при нулевой концентрации глюкозы: узлы с ионами К, показаны желтым, узлы с ионами Na показаны синим.
На рис. 8а изображена наиболее вероятная конфигурация взаимодействующих элементарных цепочек, которая реализуется в результате спаривания цепочек посредством водородных связей в конфигурации R4 (I = 4) тетрамера;
На рис. 86 изображена конфигурация квантования внутримолекулярного пространства, возникающая в результате объемных взаимодействий пары элементарных цепочек.
На рис. 8 изображено случайное распределение равновозможных конфигураций тетрамера (Na) в микроскопических ячейках T(R4), D(R2), M(Ro), элементарной ячейки: конфигурация R4 в ячейке Т (2).
На рис. 9 изображена функции распределения Q(a, g = 8) и Q(a, g =139,740210...), полученные из универсальной функции распределения Q(a, g), описывающей зависимость энтропии (свободной энергии объемных взаимодействий) полимерной цепи, от состава растворителя, для разных значений константы взаимодействия (параметра порядка) у; безразмерная концентрация глюкозы a = C/KR выражена в единицах микроскопической константы равновесия KR.
На рис. 10 изображены изомерные конформации (Na) тетрамера образованные посредством водородных связей. Справа схематически показана возможная трехмерная конфигурация изомерной конформации (s), образованной из 6 звеньев полимерной сети, расположенных на плоскости, ориентированной перпендикулярно к прямой, проходящей через 2 молекулы глюкозы.
На рис.10а изображено распределение мономеров в объеме микроскопической ячейки при концентрациях 2 и 3 мономера/ 1 микроячейка.
На рис.11а изображен график относительной энтропии полимерной цепи в наиболее вероятной конфигурации, соответствующей минимуму свободной энергии элементарного объемного взаимодействия, для термодинамических фаз (l) и (s) от концентрации глюкозы растворителя.
На рис. 116 изображен график свободной энергии объемных взаимодействий в зависимости от концентрации глюкозы.
На рис. 12 изображена диаграмма энергетических уровней тетрамеров (l, s, g) полимерной сетки природной макромолекулы.
На рис. 13 изображены графики функций распределения (g) процесса: ©ig (а) - зеленая кривая; ©2g (а) - синяя кривая; ©3g (а) - красная кривая.
На рис. 14 изображены графики функций распределения ©г(а) незаселенных (l, s, g) тетрамеров: (l) тетрамер - красная кривая; (s) тетрамер - синяя кривая; (g) тетрамер - фиолетовая кривая.
На рис. 15 изображены графики функции распределения димеров и тетрамеров (l, g, s): (l) тетрамер - фиолетовая ©а(а) и красная ©2l(a) кривые; (g) тетрамер - голубая ©i (a) и синяя ©2 (a) кривые; (s) тетрамер - темно зеленая ©is(a) и зеленая ©2S(a) кривые.
На рис. 16 изображены графики функции энергия отталкивания идеального газа свободных мономеров в конденсированных фазах (g, l, s): Ug ,,Ί, (a) - фаза G (зеленая); U, ,,Ί, (a - фаза l (красная); Us rep(a) - фаза s (синяя).
На рис.17 изображен график функции энергии элементарного объемного взаимодействия (отталкивания) Uxsrep( а) свободных мономеров в фазах (l , s).
На рис.18 изображены графики функций энергии парных взаимодействий и внутреней энергия идеального газа свободных мономеров для каждой конденсированной фазы (l, s, g). На рисунке показаны графики 6 функций: 3 функции энергии притяжения Ug attr(ci), Us attr(ci), Uxattr(ci), 3 функции энергии отталкивания Ug ,п, (a , U, ,,Ί, (а , (Л ,п, (а .
На рис. 19 изображены графики энергии элементарного объемного взаимодействия от концентрации глюкозы растворителя: энергия отталкивания точно равна энергии притяжения при любых концентрациях глюкозы растворителя Uxs ,,„, (a) + Uxs ,,Ί, (a) X 0. На рисунке показаны графики 2 функций, энергии притяжения Uxs attr(aC) и энергии отталкивания Uxs rep( а), которые точно равны при любых концентрациях глюкозы растворителя.
На рис. 20 изображен график осмотического давления Psm xVos, в зависимости от концентрации глюкозы растворителя, при критическом значении микроскопической константы равновесия к = 5,032...
На рис. 21 изображены графики энергии элементарных объемных взаимодействий Uxs(a ) (кривая красного цвета) и обратимая работа сжатия А (а ) (синяя кривая), совершаемая за счет свободной химической энергии (водородных связей) мономеров (G) над идеальным газом свободных мономеров, при критическом значении микроскопической константы равновесия кх = 5,032...
На рис. 22 изображен график функции энтальпии макромолекулы от концентрации глюкозы растворителя, при критическом значении константы равновесия кх 2= 5,032....
На рис. 23 изображен график изотермы энтальпия - концентрация глюкозы в трехфазной области макромолекулы, при критическом значении микроскопической константы равновесия k, = 5,032..., при которой газообразная, жидкая и кристаллические формы могут сосуществовать; газообразная фаза - идеальный газ свободных мономеров полимерной цепи, конденсированная жидкая фаза (l), конденсированная кристаллическая фаза (s).
На рис. 24 приведена схема изотермического калориметра фазового перехода.
На рис. 25 изображена схема, поясняющая принцип изотермического микрокалориметра живой ткани.
На рис. 26 показана блок схема, поясняющая принцип работы биосенсора глюкозы межклеточного вещества.
На рис. 27 представлена схема спектрального устройства для изотермической калориметрической спектроскопии (ICS) биохимических компонентов межклеточного вещества живой ткани in vivo.
На рис. 28 изображена диссоциация тетрамера, в результате поглощения кванта энергии терагерцового электромагнитного излучения, сопровождается образованием кванта тепловой энергии
На Рис. 29 показана схема изотермической калориметрической спектроскопии биохимических компонентов живой клетки.
На рис. 30 представлена схема абсорбционной изотермической калориметрической спектроскопии живой клетки.
На рис. 31 изображен спектр поглощения воды в широком диапазоне частот (от ультрафиолетового до микроволнового).
На рис. 32 изображены спектры поглощения глюкозы в НК области и пропускания в ближней НК области в интервале длин волн от 1,428 мкм (7000 см 1) до 20 мкм (500 см4). На рис. 33 изображен спектр поглощения D-глюкозы в ближней ИК области для разных значений концентрации глюкозы.
На рис. 34 схематически показана структура межклеточного вещества, представляющего разветвленную макромолекулу гиалуроновой кислоты, имеющую конфигурацию полимерной сетки, окружающей живую клетку.
На рис. 35 изображены спектральные линии поглощения глюкозы в инфракрасной области спектра, соответствуют характеристическим частотам валентных связей молекулы: С - Н; О - Н; С= О.
На рис. 36 представлены ИК спектры гиалуроновой кислоты, глюкозы, белка и липида: 1- триглицерид жирной кислоты (бараний жир); 2-гиалуроновая кислота; 3- белок (яичный альбумин); 4- глюкоза.
На рис. 37 представлен фрагмент ИК спектров : 1- триглицерид жирной кислоты (бараний жир), 2 - глюкоза, 3 - гиалуроновая кислота, 4 - белок (яичный альбумин).
На рис. 38 изображена схема спектроскопии диффузного отражения для измерения содержания гиалуроновой кислоты и свободных жирных кислот в межклеточном веществе поверхностного слоя эпидермиса живой ткани.
На рис. 39 представлен спектр гиалуроновой кислоты в ближней ИК области.
На рис. 40 представлены спектры поглощения гиалуроновой кислоты в ближней ИК области и спектр пропускания в ИК области.
На рис. 41 -пред став лены теоретические спектры поглощения глюкозы, меланина и воды в красном и ближнем инфракрасном диапазоне.
На рис. 42 представлено схематическое изображение липидного матрикса рогового слоя.
На рис. 43 изображена принципиальная схема спектрального устройства для реализации способа спектроскопии межклеточного вещества локального участка живой ткани.
На рис. 44 представлена схема спектроскопии диффузного отражения для определения осмотического давления межклеточного вещества на основе спектрального измерения временной динамики количества воды в роговом слое эпидермиса на длине волны, соответствующей характеристической частоте воды (1190, 1455, 1945, 945 нм).
На рис.45 представлены фотографии прототипа и предполагаемый дизайн коммерческого прибора.
На рис. 46 представлена характерная скачкообразная временная динамика сахара крови у пациента Д с сахарным диабетом 1 типа (33 лет, муж.).
На рис. 47 показана скачкообразная динамика сахара крови в форме одиночного импульса, зарегистрированная с помощью изотермического микрокалориметра, и временная динамика уровня инсулина в крови, рассчитанная на основе сахарной кривой.
На рис. 48 представлены характерные сахарные кривые (а, б) со скачкообразной временной динамикой у пациента с сахарным диабетом 2 типа (66 лет, муж.): характерная динамика сахара крови в форме временной последовательности одиночных импульсов.
На рис. 49 представлена временная динамика осмотического давления межклеточного вещества в процессе изотермического фазового перехода живой ткани (пациента с сахарным диабетом 2 типа) в процессе растворения кристаллической (глобулярной) фазы межклеточного вещества.
На рис. 50 представлены характерные мониторинговые кривые осмотического давления межклеточного вещества здорового пациента и пациента с сахарным диабетом 2 типа.
На рис. 51 (а-д) показаны примеры сахарных кривых со скачкообразной временной динамикой: Рис. 51 а (тест N° 6 пациент N° 24), Рис. 51 6 (тест N° 1 пациент N°41), Рис. 51 в (тест N°5 nauHCHTJVM 1 ). Рис. 51 г (тест N°6 пациент^ 41). На всех графиках результаты инвазивных измерений показаны кружочками зеленого цвета, а результаты неинвазивного мониторинга фиолетовой кривой.
На рис. 52 представлены результаты тестов на 27 пациентах с сахарным диабетом 1 и 2 типа.
На рис. 53 представлены результаты тестов на 14 пациентов с диабетом 1 и 2 типа.
На рис. 54-представлены результаты тестов, выполненных на группе из 42 пациентов (252 тестов, 756 инвазивных измерения), полученные путем объединения результатов подгруппы 1 и подгруппы 2.
На рис. 55 показаны структурные формулы аминокислот.
На рис. 56 показана четвертичная структура белков, состоящих из нескольких полипептидных цепей, возникающая в результате ассоциации нескольких субъединиц белка в пространстве.
На рис. 57 схематически показано изменение пространственной структуры белкового фермента гексокиназы в результате связывания молекулы глюкозы.
На рис. 58 схематически показаны основные этапы ферментативной реакции: а) диффузия молекулы АТФ из жидкой фазы в кристаллическую фазу; Ь) присоединение фосфатной группы (красный) к молекуле D- глюкозы (желтый) с образованием молекулы G6P в результате химической реакции в кристаллической фазе фермента; d) конформационный переход тетрамера со связанной молекулой G6P из кристаллической фазы в жидкую через энергетический барьер, разделяющий жидкую фазу с кристаллической; g) разрушение тетрамера в жидкой фазе с освобождением молекулы продукта G6P.
На рис. 59а представлены кривые насыщения и скорости ферментативной реакции глюкокиназы, в зависимости от концентрации глюкозы.
На рис. 59Ь представлен график энергетического барьера глюкокиназы.
На рис. 60а представлены кривые насыщения и скорости ферментативной реакции гексокиназы, в зависимости от концентрации глюкозы. На рис. 60b представлен график энергетического барьера гексокиназы.
На рис. 61 представлены структурные формулы гликозидной связи е аминокислотами.
На рис. 62 представлены структурные формулы гликозидной связи в нуклеозидах.
На рис. 63 схематически показаны ионные связи двухвалентного иона металла в макромолекуле .
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Физические основы теплообмена живой ткани с окружающей средой.
Теплообмен представляет собой самопроизвольный и необратимый процесс переноса теплоты, обусловленный градиентом температуры. Различают следующие виды теплообмена: теплопроводность, конвекция, лучистый теплообмен, теплообмен при фазовых превращениях.
Теплоотдача представляет собой теплообмен между поверхностью тела и соприкасающейся с ней средой - теплоносителем (жидкостью, газом).
Испарительное охлаждение представляет собой теплообмен между тканью и окружающей средой, обусловленный испарением воды, поступающей к поверхности эпидермиса из глубинных слоев ткани. Плотность теплового потока, определяется произведением теплоты испарения (теплоты парообразования) на плотность потока воды, испаряющейся с поверхности.
Лучистый теплообмен (радиационный теплообмен, лучистый перенос) представляет собой перенос энергии от одного тела к другому, обусловленный процессами испускания, распространения, рассеяния и поглощения электромагнитного излучения. Каждый из этих процессов подчиняется определенным закономерностям.
Так, в условиях равновесного теплового излучения испускание и поглощение подчиняются закону излучения Планка, закону излучения Стефана-Больцмана, закону излучения Киргоффа.
Существенное отличие лучистого теплообмена от других видов теплообмена (конвекции, теплопроводности) заключается в том, что он может протекать при отсутствии материальной среды, разделяющей поверхности теплообмена, так как электромагнитное излучение распространяется и в вакууме.
Закон излучения Планка устанавливает связь между интенсивностью излучения, спектральным распределением и температурой черного тела. При увеличении температуры, энергия излучения возрастает. Энергия излучения зависит от длины волны. Суммарная энергия, излучаемая черным телом и измеряемая бесконтактным инфракрасным термометром, является суммарной энергией, излучаемой на всех длинах волн. Она пропорциональна интегралу уравнения Планка по длинам волн и описывается в физике законом Стефана-Больцмана.
Лучистый теплообмен между поверхностью ткани и окружающей средой определяется соотношением :
AWR = bc(T8Kh 4 - Tair 4) = W0x[4x(Tskin- Tair)/Tskm] DT << Tskin,
Tskin - температура поверхности кожи,
Tair — температура окружающего воздуха.
Wo = PxTskin4·
AWR - тепловое излучение с поверхности ткани в окружающую среду.
Теплопроводность представляет собой один из видов переноса теплоты от более нагретых частей тела к менее нагретым. Теплопроводность приводит к выравниванию температуры. При теплопроводности перенос энергии осуществляется в результате непосредственной передачи энергии от частиц, обладающих большей энергией, частицам с меньшей энергией. Если относительное изменение температуры Т на расстоянии средней длины свободного пробега частиц мало, то выполняется основной закон теплопроводности (закон Фурье): плотность теплового потока пропорциональна градиенту температуры DT:
WAT = -lcDT, где l - коэффициент теплопроводности или теплопроводность, не зависящий от DT. Коэффициент l зависит от агрегатного состояния вещества, его молекулярного строения, температуры, давления, состава и т.д.
Конвекция представляет собой перенос теплоты в жидкостях и газах потоками вещества. Конвекция приводит к выравниванию температуры вещества. При стационарном подводе теплоты к веществу в нем возникают стационарные конвекционные потоки. Интенсивность конвекции зависит от разности температур между слоями, теплопроводности и вязкости среды.
Испарительное охлаждение, как было отмечено выше, представляет собой теплообмен между тканью и окружающей средой, обусловленный испарением воды, поступающей к поверхности эпидермиса из глубинных слоев ткани посредством транспорта воды по межклеточному пространству. Плотность теплового потока определяется произведением теплоты испарения (теплоты парообразования) на плотность потока воды, испаряющейся с поверхности.
Как известно, в комфортной зоне температур в нормальных условиях транспорт воды посредством потоотделения практически отсутствует и основной вклад в процесс испарительного охлаждения определяется транспортом воды к поверхности тела. В физиологии и медицине этот процесс известен как процесс неощутимой перспирации.
Неощутимая перспирация воды наблюдается в диапазоне температур, в котором у испытуемого не возникает субъективных тепловых ощущений (комфортный температурный диапазон):
Температура окружающей среды: 18-23°С,
Атмосферное давление: 730-770 мм. рт. столба.
Известно, что интенсивность процесса испарительного охлаждения в комфортных условиях в норме составляет 400-700 мл/сутки или 108-107 г/секхсм2. Это соответствует значениям тепловых потоков 1-10 мВт/см2.
Известно, что физиологический процесс неощутимой перспирации обладает высокой чувствительностью к внешним тепловым потокам. Порог чувствительности процесса к тепловым потокам составляет 0,1 мВт/см2, что эквивалентно чувствительности процесса к перепадам температуры внешней среды, равным 0,05 градуса.
Важным следствием высокой чувствительности физиологического процесса неощутимой перспирации к внешним тепловым потокам, имеющим практическое значение, является зависимость физических характеристик эпидермиса кожи человека от внешних физико- климатических факторов, в частности, от температуры и влажности окружающей среды и атмосферного давления. В частности, результаты измерений физиологического параметра эпидермиса кожи человека - скорости неощутимой перспирации, при неизменных значениях микроклимата помещения, в котором проводятся измерения, оказываются зависящими от физико- климатических факторов окружающей среды (температура и влажность окружающей среды, атмосферное давление). Низкочастотные флуктуации температуры внешнего воздуха в пределах даже одного градуса, при неизменных параметрах микроклимата помещения, в котором проводится измерение, приводят к значимым низкочастотным флуктуациям измеряемого физиологического параметра и, как следствие, увеличению погрешности измерений.
Физиологические и биохимические основы теплопродукции живой ткани
Процесс окисления глюкозы, одного из основных поставщиков энергии в организме, может быть представлен в виде следующего уравнения:
Глюкоза + Кислород => ССЬ + ГЬО.
Изменение стандартной свободной энергии в этой реакции при физиологических условиях равно:
D G = -686 ккал/моль.
Для сравнения, мужчина весом в семьдесят килограмм, поднимаясь по лестнице в течение часа, затрачивает примерно 1000 ккал. Отсюда ясно, что упомянутые выше 686 ккал представляют собой огромное количество энергии. Разумеется, работа, производимая человеком, значительно меньше расходуемой при этом энергии, так как при необратимом процессе не все изменение свободной энергии преобразуется в работу. Реальная эффективность этого преобразования, как будет пояснено ниже, не выше 40%. Более того, пища не “сгорает” сразу и непосредственно в кислороде, высвобождая энергию в форме тепла, а это высвобождение происходит поэтапно и включает ряд довольно сложных химических превращений, каждая из которых дает небольшую “порцию” энергии.
Глюкоза окисляется в организме, образуя диоксид углерода и воду; это один из самых универсальных процессов, который лежит в основе процессов дыхания и пищеварения. При разрушении каждой молекулы глюкозы, сопровождающемся понижением свободной энергии, высвобождается энергия, достаточная для образования 93 молекул АТФ путем присоединения фосфатных групп к молекулам АДФ. Оказывается, что реально образуются не все 93 молекулы. При этом, весь процесс включает большое число ферментативных реакций. Питательные вещества (углеводы, жирные кислоты и аминокислоты) вступают в серию реакций, образующих цикл Кребса (или цикл трикарбоновых кислот), в процессе которого углеродный остов молекул распадается с образованием ССЬ, но АТФ здесь не образуется. На следующих этапах реакции происходит перенос электронов с помощью специальных ферментов (дыхательная цепь). На этих этапах синтезируется АТФ, а последний шаг на пути длительного процесса переноса электрона заключается в присоединении его к молекулярному кислороду. Процесс переноса электрона по дыхательной цепи в целом, приводящий к накоплению энергии в молекулах АТФ, называется окислительным фосфорилированием. В результате этого процесса образуется 38 молекул АТФ в расчете на каждую потребленную молекулу глюкозы. Эффективность такого преобразования равна 38/93=40%.
Величину теплопродукции, или тепловой мощности, организма можно количественно оценить исходя из следующих простых соображений.
Энергетическая ценность питания человека составляет около 2400 ккал в сутки. В первом приближении, 2400ккал = 104 Дж, 1сутки (24часа) = 86400 секунд = 105 секунд.
Тогда энергия, потребляемая организмом человека в секунду, составит 104/105=0,1 кДжхс 1 или 100 Джхс 1 = 100 Вт; следовательно, тепловая мощность человека приблизительно равна мощности электрической лампочки, имеющей мощность 100 Вт.
При мышечном сокращении АТФ, донор энергии для процесса мышечного сокращения, в ходе реакции с миозином позволяет получать максимум 50 Джхг 1 энергии. Это означает, что идеальной мышечной системе (т.е. с коэффициентом полезного действия, равным 100%) для подъема груза массой 1кг на высоту 5 м понадобилось бы израсходовать 2х 103 моль АТФ. На самом деле, коэффициент полезного действия мышц составляет около 30-40%, остальная же часть высвобождается в виде тепла.
В нормальных условиях жизнедеятельности организма глюкоза является основным энергетическим субстратом. Нормальная концентрация глюкозы в плазме крови человека, в зависимости от условий питания, поддерживается в пределах 50-120 мг %. После еды, в течение фазы всасывания, концентрация глюкозы в системе воротной вены может достигать более 270 мг %. Повышение содержания глюкозы в крови всегда вызывает увеличение секреции инсулина.
В организме человека в состоянии покоя натощак скорость обмена глюкозы составляет в среднем 140 мг/ч на 1 кг массы тела, причем примерно 50% глюкозы потребляется головным мозгом, 20% - мышцами, 20% - эритроцитами и почками, 20% - мышцами и только 10% глюкозы остается на другие ткани. Скорость утилизации (скорость обмена) глюкозы у здорового человека является линейной функцией концентрации глюкозы в плазме крови. Математическая зависимость утилизации глюкозы от ее концентрации в крови у нормальных людей выражается уравнением:
Ru = 0,02554С + 0,0785,
А у больных некетотическим диабетом:
Ru = 0,004448С + 2,006, где Ru - скорость утилизации глюкозы, мг/ мин на 1кг массы тела, а С - концентрация глюкозы в плазме крови, мг % .
Термин “утилизация” глюкозы в физиологическом смысле означает скорость переноса глюкозы из крови в общий фонд глюкозы тканей и выхода из него в процессе метаболизма. С биохимической точки зрения скорость утилизации глюкозы определяется транспортом через цитоплазматическую мембрану и внутриклеточным окислительным фосфорилированием глюкозы. Широко распространенные в литературе термины “скорость оборота”, “ассимиляция” и “потребление” глюкозы являются синонимами понятия “утилизация” глюкозы и в любом отношении равнозначны.
Практически во всех тканях в физиологических условиях транспорт глюкозы из межклеточной среды во внутрь клетки представляет собой первичную лимитирующую реакцию в утилизации глюкозы клетками, так как в отсутствие инсулина поток переносимой глюкозы всегда меньше скорости фосфорилирования глюкозы. Равновесие между скоростью транспорта и фосфорилированием глюкозы наступает только при больших концентрациях глюкозы (400-500 мг %). При дальнейшем увеличении концентрации глюкозы лимитирующей реакцией становится фосфорилирование. Другими словами, скорость транспорта глюкозы из межклеточной среды через цитоплазматическую мембрану во внутриклеточную среду является процессом, лимитирующим скорость утилизации глюкозы живой тканью.
Исходя из сделанного выше рассмотрения, представляется логичным и вполне обоснованным заключение о том, что теплопродукция, также, как и скорость утилизации глюкозы, является линейной функцией концентрации глюкозы в крови и, измерение величины локальной теплопродукции позволяет определить уровень глюкозы в крови.
Физика конденсированного состояния биополимерной молекулы.
Объектом настоящего исследования, выполненного в рамках работы над группой изобретений, являются биополимерные молекулы, способные к пространственной самоорганизации и обретению устойчивой молекулярной структуры, обусловленной слабыми внутримолекулярными объемными взаимодействиями не валентной природы.
Примерами биополимерных молекул, способных к пространственной самоорганизации при физиологических условиях, являются полисахариды и белковые молекулы с полипептидной цепью. Поведение белков всецело определяется исключительной, присущей только им пространственной структурной организацией, которая обусловлена не валентными взаимодействиями и определяется исключительно слабыми объемными взаимодействиями. Лишаясь ее, белки теряют все свои биологические свойства.
Белковые цепи способны самопроизвольно свертываться в строго детерминированные структуры, геометрия и конформационная динамика которых в физиологических (нативных) условиях полностью определяются аминокислотной последовательностью. Трехмерные структуры белков индивидуализированы, очень сложны и имеют строгий порядок, не сводящийся, однако, к периодичности. На Рис.1 схематично показан процесс самоорганизации (фолдинга) биополимерной молекулы, который происходит самопроизвольно, как фазовый переход статистической системы многих взаимодействующих частиц в пространственную конфигурацию с гетерофазной структурой с минимальной свободной энергией. Способность природной полипептидной цепи к пространственной самоорганизации и обретению определенной молекулярной структуры - самая яркая особенность белков, отсутствующая у молекул искусственных полимеров, в том числе у полученных человеком поли-а-аминокислот.
Отсюда следует понимание чрезвычайной сложности задачи экспериментального исследования свойств биополимерных молекул в условиях in vitro. Многие экспериментальные методы исследования структуры вещества, эффективные при исследованиях молекул (структура которых определена ковалентными связями), имеют ограниченную применимость для исследования биополимерных молекул, пространственная структура которых определяется слабыми не валентными взаимодействиями.
Современные методы позволяют определить первичную структура биополимерных молекул, состоящую из последовательности мономеров, связанных прочными ковалентными связями, в то время как, определение пространственной структуры таких молекул продолжает оставаться сложнейшей проблемой. Например, число последовательностей (первичная структура) белковых молекул в базе данных UniPare (на август 2016) составляло более 124 миллионов, в то время как количество структур в базе данных PDB ( Protein Data Bank ) - лишь чуть больше 121 тысячи, что составляет менее 0,1% от всех известных последовательностей, причем разрыв между двумя этими показателями стремительно нарастает и, вероятно, будет расти и дальше. Такое сильное отставание связано с относительной сложностью современных методов определения структуры.
Другая сторона проблемы заключается в недостаточно глубоком понимании фундаментальной природы слабых не валентных внутримолекулярных взаимодействий. К моменту настоящего исследования, человечество со всеми своими вычислительными мощностями и арсеналом экспериментальных данных до сих пор не научилось строить модели, которые бы описывали процесс белкового фолдинга и предсказывать трехмерную структуру белка на основе его первичной структуры (то есть аминокислотной последовательности), что прямо указывает на отсутствие понимания фундаментальной природы слабых объемных взаимодействий, определяющих биологические свойства биополимерных молекул.
Таким образом, пространственная структура биополимерной молекулы и ее связь с биологической функцией является одной из крупнейших нерешенных проблем современной науки, решение которой возможно при условии достижения прогресса в фундаментальных исследованиях физико-химической природы слабых объемных взаимодействий, определяющих трехмерную структуру биополимерной молекулы.
Следует отметить, что решение проблемы фолдинга прямо связано с научной проблемой биологического катализа - уникального явления, физико-химическая природа которой продолжает оставаться неясной.
Отсюда следует понимание вывода, что решение проблемы фолдинга и биологического синтеза напрямую связано с созданием новых физико-химических методов исследования in vivo биополимерных молекул и возможностью достижения реального прогресса в области физики конденсированного состояния биополимерных структур
В рамках настоящего исследования данная научная проблема была решена за счет сочетания экспериментального исследования , которое было выполнено с помощью уникального экспериментального метода, основанного на неинвазивных измерениях характеристик межклеточного вещества в условиях in vivo, и теоретического исследования конденсированного состояния биополимерной молеку лы, которое было выполнено на основе методов статистической физики с целью обобщения полученных экспериментальных данных.
Биосенсор на основе биополимерной молекулы с гетерофазной структурой.
Уникальным модельным объектом для исследований в области физики конденсированного состояния биополимерных молекул, способных к самоорганизации пространственной структуры, как оказалось, является биополимерная молекула полисахарида гиалуроновой кислоты, выбор которой в качестве объекта исследования был обусловлен следующими соображениями:
Высокомолекулярный полисахарид гиалуроновой кислоты является основным компонентом межклеточного вещества, окружающего живую клетку, выполняющего важную роль в самоорганизации физико- химических процессов клеточного метаболизма, важнейшим из которых является процесс физической терморегуляции живой ткани, поддерживающей постоянство температуры. Как известно из опыта, все многообразие млекопитающих организмов, основным межклеточным компонентом которых является биополимерная молекула гиалуроновая кислота, структура которой оставалась неизменной в процессе длительной биологической эволюции, имеют близкую температуру тела (36- 38°С), что прямо указывает на гетерофазное состояние межклеточного вещества, обусловленное термодинамическими свойствами биополимерной молекулы гиалуроновой кислоты.
Экспериментальное исследование термодинамических свойств биополимера гиалуроновой кислоты можно проводить в условиях in vivo на основе неинвазивных измерений характеристик межклеточного вещества эпидермиса человека с помощью датчиков, расположенных на поверхности эпидермиса кожи. биополимерная молекула гиалуроновой кислоты обладает простейшей первичной структурой, показанной на Рис.2, состоящей из одинаковых повторяющихся мономеров (дисахаридов), состоящих из 2 типов сахарных остатков (звеньев), в отличие от более сложной первичной структуры глобулярных белков (состоящих из 20 типов звеньев), ДНК и РНК (состоящих из 4 типов звеньев), поэтому является уникальным модельным объектом биополимерной молекулы для теоретического исследования.
С целью исследования термодинамических свойств межклеточного вещества были проведены экспериментальные исследования in vivo, в которых исследовалась зависимость осмотического давления межклеточного вещества эпидермиса живой ткани человека, характеризующего термодинамическое фазовое состояние межклеточного вещества в локальной области под теплонепроницаемым аппликатором ( накладываемым с дозированным давлением на поверхность кожи и образующим замкнутую систему живой ткани в локальной области под аппликатором), от внешнего теплового потока, внешнего давления и концентрации глюкозы в крови.
Экспериментальные исследования зависимости осмотического давления межклеточного от мощности внешнего электромагнитного излучения, падающего на поверхность эпидермиса кожи человека, были проведены в широком диапазоне частот от оптического до микроволнового: оптическое и ближнее инфракрасное излучение 0,4 - 0,9 мкм; инфракрасное излучение 1-10 мкм; микроволновое излучение 5-10 мм.
На Рис. За представлена экспериментальная зависимость осмотического давления межклеточного вещества эпидермиса, которое измерялось неинвазивным методом в реальном времени, от мощности внешнего падающего инфракрасного теплового излучения (с максимумом спектральной мощности на длине волны l~ 10 мкм) при постоянном уровне сахара в крови (во временном интервале эксперимента). В одном эксперименте на одном пациенте (с фиксированным положением датчика на поверхности эпидермиса) было выполнено 5 измерений, соответствующих разным значениям падающей мощности (в единицах мВт/см2): 10; 5,5; 3; 2; 0,5. Пороговая чувствительность межклеточного вещества ограничивается собственными флуктуациями осмотического давления межклеточного вещества и составляет < 100мкВт/см2 для времен наблюдения 102с.; полученное пороговое значение чувствительности эквивалентно перепаду температуры окружающей среды на 0,08 С°.
Экспериментально было доказано, что процесс теплообмена между локальным участком эпидермиса живой ткани и окружающей средой является обратимым и изотермическим: обратимые изменения мощности падающего теплового излучения в эксперименте приводят к обратимым изотермическим изменениям осмотического давления в реальном времени.
Как известно, термодинамическая обратимость и изотермический характер теплообмена вещества с внешней средой являются фундаментальными свойствами реального вещества, которые проявляются в тройной точке, в которой вещество находится в гетерофазном состоянии. На рисунке 4 показан график зависимости температуры произвольного вещества от количества введенного в систему тепла ( heating curve), наблюдаются участки постоянной температуры вблизи фазовых переходов, в которых вещество находится в гетерофазном состоянии, которые обусловлены тем, что в процессе плавления вещества количество теплоты, равное скрытой теплоте плавления (или испарения) АН, поглощается системой без изменения температуры, но с изменением энтропии АН/Т = AS; эффективная теплоемкость вещества, находящегося в гетерофазном состоянии, равна бесконечности.
Примером системы, в которой реализуется термодинамическое равновесие между тремя фазами вещества, является смесь воды, льда и пара в тройной точке. Как известно, в смеси воды и льда при 273,16 К две фазы находятся в равновесии, и процессы плавления и замерзания протекают обратимо при постоянной энтропии: при нагревании смеси происходит плавление льда, а при охлаждении, наоборот, происходит кристаллизация - образование льда из жидкой фазы, при этом температура воды остается постоянной (свойство изотермии).
Таким образом, результаты экспериментов по измерению порога чувствительности межклеточного вещества к тепловым потокам на основе неинвазивного измерения осмотического давления межклеточного вещества прямо доказывают вывод о гетерофазной структуре межклеточного вещества живой ткани, при физиологической температуре тела 36,6 С°. Отсюда следует понимание обобщения, что одинаковая температура теплокровных организмов является следствием гетеро фазного состояния межклеточного вещества теплокровных, которое является фундаментальным свойством межклеточного вещества этих организмов, обусловленным термодинамическими свойствами биополимерной молекулы гиалуроновой кислоты.
Селективность молекулы гиалуроновой кислоты к глюкозе. Особенность биополимерной молекулы гиалуроновой кислоты с гетерофазной структурой заключается в том, что наряду с экстремально высокой чувствительностью к тепловым потокам, молекула обладает избирательностью к молекуле глюкозы, обусловленной связыванием образованием водородных связей между молекулой глюкозы растворителя и мономерами полимерной цепи. С целью исследования избирательности биополимерной молекулы гиалуроновой кислоты к молекуле глюкозы были проведены экспериментальные исследования зависимости осмотического давления межклеточного вещества эпидермиса от концентрации глюкозы в крови.
На Рис. 36 представлена зависимость осмотического давления межклеточного вещества от концентрации глюкозы в крови, полученная экспериментально в клиническом исследовании на группе из 50 пациентов. Как следует из представленного графика, обратная величина осмотического давления межклеточного вещества линейно зависит от концентрации сахара в крови в интервале концентраций 3 ммоль/литр - 25 ммоль/литр. Условия эксперимента описаны подробно в разделе «Практическое применение»
Экспериментально доказано свойство термодинамической обратимости переходов межклеточного вещества из одного состояния в другое - обратимые изменения концентрации глюкозы в крови и, как следствие, скорости метаболизма живой ткани, приводят к обратимым изменениям осмотического давления межклеточного вещества: обратимые физиологические изменения концентрации глюкозы в крови приводят к обратимым изменениям осмотического давления, аналогичным обратимым изменениям обратимым осмотического давления в процессе теплообмена живой ткани с окружающей средой - уменьшение концентрации глюкозы приводит к увеличение осмотического давления, и наооботот, увеличение концентрации глюкозы в крови приводит к уменьшению осмотического давления - отклику параметра, аналогичному отклику на охлаждение вещества.
Свойство термодинамической обратимости переходов вещества из одного состояния в другое является фундаментальным свойством реального вещества, находящегося в гетерофазном состоянии в тройной точке, поэтому свойство термодинамической обратимости межклеточного вещества живой ткани, обнаруженное экспериментально, является прямым доказательством гетерофазного состояния межклеточного вещества при физиологических условиях.
Межклеточное вещество живой ткани, свойства которой определяются термодинамическими свойствами биополимерной молекулы гиалуроновой кислоты с гетерофазной структурой, таким образом, является природным биосенсором глюкозы, состоящим из двух элементов - распознающего элемента (molecular recogniser) и трансдьюсера (transducer), который преобразует изменения концентрации глюкозы в изменения осмотического давления межклеточного вещества. На рисунке 26 ниже показана блок схема, поясняющая принцип работы биосенсора глюкозы межклеточного вещества.
Таким образом, результаты экспериментальных исследований in vivo доказывают уникальные биосенсорные свойства межклеточного вещества живой ткани, обусловленные гетерофазной структурой биополимерной молекулы гиалуроновой кислоты - межклеточное вещество является уникальным природным биосенсором, обладающим свойством термодинамической обратимости и биоселективностью к молекуле глюкозы и экстремально высокой чувствительностью к внешним тепловым потокам.
Теоретическое исследование было проведено с целью выяснения физико-химического механизма избирательности биополимерной молекулы гиалуроновой кислоты к глюкозе и статистического механизма гетерофазного конденсированного состояния объединенной системы биополимерной молекулы с растворителем вблизи границы фазового перехода на основе обобщения экспериментальных результатов. Описание статистического метода и основные результаты исследования приведены ниже.
Свойство термодинамической обратимости и избирательности роднит полисахаридную молекулу гиалуроновой кислоты с белковыми молекулами, в частности, с ферментами, которые обладают уникальной избирательностью к определенным молекулам субстрата и свойством катализировать биохимические реакции с участием этих молекул. Отсюда следует понимание вывода, что свойство биологической специфичности ферментов, доказанное на основе результатов большого числа биохимических исследований, и избирательность гиалуроновой кислоты к глюкозе имеют единую физико-химическую природу.
В рамках теоретического исследования было выполнено обобщение для ферментных молекул, на основе статистического метода, с помощью которого были получены точные решения для термодинамических фаз вещества в объеме макромолекулы. С этой целью было проведено теоретическое исследование физико-химического механизма ферментов, на примере, ферментов гексокиназы, которые обладают избирательностью к молекуле глюкозы и катализируют биохимическую реакцию с участием глюкозы. Полученные результаты доказали гетерофазный статистический механизм ферментативного катализа.
В данном документе под термином «субстрат S» понимается молекула растворителя, взаимодействующая с мономерами полимерной цепи путем образования слабой не валентной связи. В частности, растворитель по изобретению представляет собой водный раствор ионов натрия, хлора, калия и глюкозы, при этом, разница между концентрациями натрия и хлора равно примерно 40 ммоль/литр (избыток ионов натрия), а содержание глюкозы в интервале гетерофазности может изменяться в широком диапазоне от 3 до 15 ммоль/литр.
В данном документе под термином «мономер» понимается повторяющиеся звенья (структурные единицы) в составе биополимерной молекулы. Примером мономера А является D- глюкуроновая кислота, содержащая отрицательно заряженную группу, примером мономера В является О-Ыацстилглюкозамина. нейтрально заряженная, образующие повторяющийся дисахарид полимерной цепи гиалуроновой кислоты. В случае полимерной цепи белковой молекулы, примерами мономеров А являются отрицательно заряженные глутаминовая кислота и аспарагиновая кислота, и положительно заряженные лизин, аргинин, гистидин, примерами мономеров В являются не заряженные серин, треонин, глутамин, аспарагин.
В данном документе под термином “макромолекула с гетерофазной структурой” понимается... одна - единственная биополимерная молекула в объеме которой при определенных условиях могут сосуществовать несколько термодинамических фаз - кристаллическая фаза (глобула), жидкая (расплавленная глобула), газообразная (клубок).
В данном документе под термином макромолекула с «заданные биологические свойства и заданная пространственная структура» понимается биополимерная молекула, обладающая однозначно определенными биохимическими характеристиками (константа равновесия, скорость биохимической реакции) и однозначно определенной трехмерной пространственной структурой.
В данном документе под термином «растворитель» понимается . вещество, способное растворять другие твёрдые, жидкие или газообразные вещества, не изменяя их химически. Как правило, при атмосферном давлении и комнатной температуре растворитель является жидким веществом. Примерами являются вода, морская вода, раствор глюкозы.
В данном документе под термином «субъединица» понимается биополимерная
(полипептидная) цепь, которая вместе с другими компонентами собирается в мультимерный или олигомерный белковый комплекс. Многие природные ферменты и другие белки состоят из нескольких белковых субъединиц.
В данном документе под термином «биологический катализатор с заданными характеристиками» понимается катализатор с определенными значениями константы скорости и скорости биохимической реакции, которую катализирует.
В данном документе под термином «фермент с заданными характеристиками» понимается белковая макромолекула с однозначно определенной трехмерной пространственной структурой и определенными значениями константы скорости и скорости биохимической реакции, которую катализирует данный фермент.
В данном документе под термином «биосенсор с селективностью к заданной молекуле субстрата» понимается биополимерная молекула, обладающая избирательностью (специфичностью) к определенной молекуле растворителя.
Неравновесная термодинамика конденсированного состояния биополимерной молекулы.
Изотермический микрокалориметр живой
Figure imgf000034_0001
Как было показано, свойство изотермии теплокровных - относительное постоянство температуры, при обратимых физиологических изменениях концентрации глюкозы в крови (определяющей скорость клеточного метаболизма и интенсивность теплопродукции) и теплового баланса живой ткани с окружающей средой в области физической терморегуляции организма, имеет физическую природу и обусловлено термодинамическими свойствами межклеточного вещества локального микрообъема живой ткани. Межклеточное вещество, в области физиологической нормы, находится в гетерофазном конденсированном состоянии, в котором кристаллическая твердая фаза (глобула) находится в термодинамическом равновесии с метастабильной жидкой фазой (расплавленная глобула) и газообразной фазой (клубок). Теплота, введенная в локальный объем вещества, в результате воздействия на локальный участок поверхности эпидермиса внешнего теплового потока Wnora, приводит к плавлению твердой фазы вещества - фазовому преобразованию вещества из твердого состояния “глобула” в жидкое состояние “расплавленная глобула”; процесс плавления глобулярной фазы гиалуроновой кислоты протекает, как фазовый переход первого рода с изменением объема вещества (изменившего агрегатное состояние), обусловленным изменением осмотического давления вещества. Изменение осмотического давления межклеточного вещества (количества воды в межклеточном пространстве), в результате плавления глобулярной фазы, приводит к изменению интенсивности межклеточной микроциркуляции - микро гидродинамики (микрофлюидики), направленной к поверхности эпидермиса, обеспечивающей изотермический теплообмен ткани с окружающей средой в процессе испарительного охлаждения с интенсивностью W n ; тепловой баланс обратимого изотермического процесса, при постоянной энтропии, имеет вид:
\ W ::о!л ~ \'Ά .
Физическим аналогом системы, в которой реализуется термодинамическое равновесие между тремя фазами вещества, является смесь воды, льда и пара в тройной точке. Как известно [12 , в смеси воды и льда при 273,16 К две фазы находятся в равновесии, и процессы плавления и замерзания протекают обратимо при постоянной энтропии: при нагревании смеси происходит плавление льда, а при охлаждении, наоборот, происходит кристаллизация - образование льда из жидкой фазы, при этом температура воды остается постоянной (свойство изотермии).
Процесс плавления вещества, при температуре фазового перехода, происходит изотермически, без изменения температуры; количество теплоты, введенной в систему, можно определить измеряя количество вещества, перешедшего в процессе плавления в жидкое состояние (изотермическая калориметрия - измерение количества теплоты, введенной в объем вещества, при температуре фазового перехода). Принцип изотермической калориметрии на практике используется в известном устройстве - изотермическом калориметре фазового перехода, в котором введённая теплота не изменяет температуры калориметрической системы, а вызывает изменение агрегатного состояния вещества, составляющего часть этой системы (например, таяние льда в ледяном калориметре Бунзена). В процессе плавления вещества количество теплоты, равное скрытой теплоте плавления АН, поглощается системой без изменения температуры, но с изменением энтропии АН/Т = AS. Количество введённой теплоты рассчитывается в этом случае по массе вещества, изменившего агрегатное состояние (например, массе растаявшего льда, которую можно измерить по изменению объёма смеси льда и воды), и теплоте фазового перехода. Принцип действия ледяного калориметра заключается в том, что количество введенной в калориметр теплоты измеряется не по изменению температуры, как в калориметрах переменной температуры, а по изменению объема смеси вода-лед, находящейся при температуре плавления льда. Схема изотермического ледяного калориметра показана на Рис. 24. Количество введённой теплоты рассчитывается по массе растаявшего льда, которую можно измерить по изменению объёма смеси льда и воды и теплоте фазового перехода.
Принцип действия изотермического калориметра живой ткани аналогичен принципу ледяного калориметра и заключается в том, что количество теплоты, введенной в локальной объем живой ткани или образовавшейся в этом объеме в процессе клеточного метаболизма, измеряется не по изменению температуры живой ткани, как в калориметрах переменной температуры а по изменению объема межклеточного вещества, определяемого объемом смеси глобула (кристаллическая фаза) -расплавленная глобула (жидкая фаза), находящейся при температуре плавления глобулы гиалуроновой кислоты. Изменения объема межклеточного вещества можно определить путем измерения осмотического давления межклеточного вещества. Схема, поясняющая принцип изотермического микрокалориметра живой ткани, представлена на Рис. 25. Изменение объема межклеточного вещества в процессе плавления кристаллической (глобулярной) фазы гиалуроновой кислоты вещества, вызванного поглощением тепла, определяется методом измерения осмотического давления межклеточного вещества.
Биополимер гиалуроновой кислоты межклеточного вещества живой ткани является природным изотермическим биосенсором с высокой чувствительностью к тепловой энергии, обусловленной маленькой величиной энергии связи ~ 3,5 квТ молекулярного комплекса тетрамера: тепловая энергия (количество теплоты), введенная в объем вещества, приводит к изотермическому плавлению кристаллической фазы вещества, протекающему с поглощением энергии», и, как следствие, к изменению осмотического давления межклеточного вещества, которое можно измерить с помощью датчика, расположенного на поверхности эпидермиса кожи. Как показано выше, конформационные переход Na-тетрамера из конформации (s) кристаллической фазы в конформацию (l) жидкой фазы может протекать только с поглощением кванта энергии 1 квТ в расчете на один тетрамер. Количество теплоты, которое необходимо сообщить одной единице массы кристаллического вещества в равновесном изобарно-изотермическом процессе, чтобы перевести его из твёрдого (кристаллического) состояния в жидкое (то же количество теплоты выделяется при кристаллизации вещества) определяется как удельная теплота плавления (энтальпия плавления).
Были проведены экспериментальные исследования зависимости осмотического давления межклеточного от мощности внешнего электромагнитного излучения, падающего на поверхность эпидермиса кожи человека, в широком диапазоне частот от оптического до микроволнового: оптическое и ближнее инфракрасное излучение 0,4 - 0,9 мкм; инфракрасное излучение 1-10 мкм; микроволновое излучение 5-10 мм. На Рис. За показана экспериментальная зависимость осмотического давления межклеточного вещества от мощности падающего на поверхность эпидермиса инфракрасного теплового излучения при постоянной концентрации сахара в крови (в интервале эксперимента 30-60 минут уровень сахара практически не изменяется). Принцип действия изотермического калориметра живой ткани заключается в том, что количество введенной в калориметр теплоты измеряется не по изменению температуры, как в калориметрах переменной температуры, а по изменению объема межклеточного вещества, состоящего из смеси кристаллической (глобула) и жидкой (расплавленная глобула ) фаз, находящегося при температуре плавления кристаллической глобулярной фазы.
На Рис. За представлена экспериментальная зависимость осмотического давления межклеточного вещества эпидермиса от мощности внешнего падающего инфракрасного теплового излучения (с максимумом спектральной мощности на длине волны l ~ 10 мкм) при постоянном уровне сахара в крови (во временном интервале эксперимента). В одном эксперименте на одном пациенте (с фиксированным положением датчика на поверхности эпидермиса) было выполнено 5 измерений, соответствующих разным значениям падающей мощности (в единицах мВт/см2): 10; 5,5; 3; 2; 0,5. Пороговая чувствительность калориметрического спектрометра ограничивается собственными флуктуациями осмотического давления межклеточного вещества и составляет < 100мкВт/см2 для времен наблюдения 102с.
Скорость потока межклеточной жидкости через эпидермис (скорость масеопереноса) определяется градиентом осмотического давления межклеточного вещества. Угол наклона графика на Рис. За соответствует коэффициенту масеопереноса эпидермиса, значение которог о определяется концентрацией глюкозы в крови, увеличение которой приводит к увеличению доли кристаллической фазы вещества в межклеточном пространстве. Концентрацию глюкозы в крови можно определить по у глу' наклона графика зависимости осмотического давления межклеточного вещества эпидермиса от мощности внешнего падающего теплового излучения; угол наклона графика определяется концентрацией глюкозы в межклеточной жидкости (в крови).
Селективность межклеточного вещества к глюкозе. Особенность изотермического микрокалориметра живой ткани заключается в том, что межклеточное вещество живой ткани, наряду с экстремально высокой чувствительностью к тепловому потоку, обладает селективностью к молекуле глюкозы, концентрация которой определяет концентрацию тетрамеров (сшивок) полимерной цепи гиалуроновой кислоты и, как следствие, определяет долевое соотношение между кристаллической (глобула) и жидкой (расплавленная глобула) термодинамическими фазами вещества. Увеличение концентрации глюкозы в жидкой фазе межклеточного вещества приводит к процессу кристаллизации вещества, которая сопровождается уменьшением объема и осмотического давления; уменьшение концентрации глюкозы приводит к обратному процессу - растворению, которое сопровождается увеличением объема и осмотического давления. Отсюда следует понимание вывода, что увеличение концентрации глюкозы в веществе приводит к отклику вещества, аналогичному отклику на охлаждение.
Межклеточное вещество живой ткани является биосенсором глюкозы, который состоит из двух элементов - распознающего элемента (molecular recogniser) (тетрамер) и трансдьюсера (transducer), который преобразует изменения концентрациии глюкозы в изменения осмотического давления межклеточного вещества. На рисунке 26 показана блок схема, поясняющая принцип работы биосенсора глюкозы межклеточного вещества.
Вещество живой ткани представляет природный биосенсор глюкозы, который состоит из двух элементов: распознающего элемента (molecular recogniser), роль которого выполняет кристаллическая фаза макромолекулы, и трансдьюсера (transducer), роль которого выполняет жидкая фаза, который преобразует изменения концентрации глюкозы в изменения осмотического давления межклеточного вещества, которые регистрируются с помощью датчика, расположенного на поверхности эпидермиса.
Калорическое уравнение. Калорическое уравнение состояния, связывающее переменные термодинамического состояния живой ткани в локальном объеме под тепло и водонепроницаемым аппликатором в изотермическом калориметре, определяется из основного уравнения термодинамики, следующим путем.
Основное уравнение термодинамики, описывающее обратимые квазистатические изменения состояния замкнутой системы под аппликатором во временном интервале Dΐ = t, равном постоянной времени переходного процесса, можно преобразовать и представить в виде уравнения, описывающего обратимые изменения системы во временном интервале At = dt -^0, в котором потоки можно считать постоянными:
AHxdt/t = (WMET)xdt + (W&T)xdt +KM X(AM/At)xdt +Kp xApxdt =
= (WMEr)xdt + К&тх (ATskin x/Af) x dt + KM X(AM/At)xdt - Kp xApxdt (44a)
В уравнении (44a), связывающем потоки сопряженных процессов переноса энергии и вещества, которые измеряются в реальном эксперименте, приняты следующие обозначения:
WMET - мощность процесса теплопродукции, которая определяется из требования
AQMET = \(WMEr)dt при интегрировании в интервале от 0 до t.
W&T - мощность процесса теплопереноса, поступающего в систему из глубинного слоя, обусловленный разностью температур THn = Т.- , - Т„ое., которая определяется из требования AQ&T = i(W,\r)dt = K,\rx)( \Tskn// \t)dt при интегрировании в интервале от 0 до t.
KM X(AM/Af) = J - мощность процесса массопереноса, поступающего в систему из глубинного слоя, обусловленного разностью количества вещества AM = Мглуб - М„ое., которая определяется из требования mAN = КмхАМ = jl(t)dt. при интегрировании в интервале от 0 до t, где m - химический потенциал, N - количество вещества, J(t)- поток вещества.
Кр хАр = WKpoe - мощность процесса теплопереноса, который осуществляется капиллярным кровотоком, обусловленным разностью гидравлического давления в системе микроциркуляции Ар = Рартер - Рвепул., которая определяется из требования V \р = J Кр хАр dt =iW^0B.(t)i/t, при интегрировании в интервале от 0 до t.
Компонента теплопереноса в объеме ткани под аппликатором, обусловленная разностью кровяного давления, в зависимости от знака потока массопереноса, может иметь положительное значение (тепло вводится в систему), отрицательное значение (тепло выводится из системы) или равно нулю. Константа этого процесса определяется выражением Кр = V - V о > 0, где Vo - объем межклеточного вещества, при нулевом потоке J = 0. Объем вещества V > УЬ, при положительном потоке J > 0; объем вещества V < УЬ, при отрицательном потоке J < 0.
К&т, Км, Кр - константы, феноменологические коэффициенты, которые определяются путем калибровки.
Уравнение состояния, связывающее мощности сопряженных процессов переноса энергии и вещества под аппликатором, которые измеряются в реальном эксперименте, вытекает из уравнения (44а) путем деления всех членов на dt и имеет следующий вид:
\Н/х = WMET+ WAT + Кмх(АМ/ At) - WKp0e = WMET+ KAT {ATMP / At ) + Кмх(АМ/ At) - Kr cAr (44b)
Следует отметить, что основное уравнение термодинамики является интегральной формой уравнения (44Ь), связывающего потоки процессов переноса энергии и массы. Интегрирование уравнения (44а) в интервале времени от to = 0, соответствующего наложению аппликатора с дозированным давлением на поверхность рогового слоя эпидермиса до t = t приводит к исходному виду основного уравнения термодинамики (3), описывающего обратимые изменения системы в интервале At = t, равном постоянной времени переходного процесса:
AHx\dt/ = \(WMEr)dt + \(WAr)dt +Км \(КМ/ i)dt - Kp x\pdt =
= АН = TcA ( SMET + SAT ) +/uAN + VAp = AQMET + AQAT + / AN + VAp.
Уравнение (4a) можно записать в виде выражения для расчета величины теплового эффекта метаболизма:
WMET — АН/х — КАТ ATskin — Км cAM + Kr cAr. (45)
Последнее уравнение (5) можно представить в следующем виде:
Figure imgf000039_0001
В уравнениях выше приняты следующие обозначения:
Нглуб - энтальпия глубинного слоя,
Нпо, - энтальпия поверхностного слоя,
Тглуб - температура глубинного слоя,
Тпо, - температура поверхностного слоя,
М гпуб - количество воды в глубинном слое, M me - количество воды в поверхностном слое,
Рартер - гидростатическое давление на входе капилляра (в системе микроциркуляции),
Реенул - гидростатическое давление на выходе капилляра (в системе микроциркуляции),
Параметры КАТ, КМ, Кр соответствуют коэффициентам пропорциональности и равны константам, которые определяются методом калибровки.
Величина энтальпии определяется количеством воды в единичном объеме, которое при заданных значениях климатических параметров, зависит от содержания гиалуроновой кислоты в межклеточном веществе, которая может изменяться при сахарном диабете и других хронических заболеваниях, поэтому является индивидуальной характеристикой пациента, которую можно определить методом калибровки. Количество воды в единичном объеме ткани, с другой стороны, при заданном содержании гиалуроновой кислоты, определяется климатическими параметрами.
Метод изотермической калориметрической спектроскопии живой ткани.
На основе метода изотермической микрокалориметрии (измерение величины поглощенной живой тканью мощности электромагнитного излучения с помощью изотермического микрокалориметра фазового перехода), описанного выше, может быть создан принципиально новый метод спектроскопии живой ткани в условиях in vivo - абсорбционная изотермическая калориметрическая спектроскопия, позволяющая определять в реальном времени содержание биохимических компонентов живой ткани на основе спектральных измерений на характеристических частотах исследуемых молекул.
Величина мощности электромагнитного излучения на характеристической частоте исследуемого биохимического компонента, поглощенной в локальном объеме вещества живой ткани, измеряется не по изменению температуры ткани, а по изменению величины осмотического давления (или количества воды в межклеточном пространстве), характеризующего объем межклеточного вещества, находящегося при температуре фазового перехода (соответствующей термодинамическому равновесию кристаллической и жидкой фаз межклеточного вещества).
Характеристические частоты биохимических компонентов вещества живой ткани, к которым относятся компоненты межклеточного вещества (гиалуроновая кислота, вода, глюкоза и др ), а также внутриклеточные биохимические молекулы и органоиды, образуют электромагнитный спектр поглощения вещества живой ткани, который в условиях in vivo можно определить методом изотермической калориметрической спектроскопии (ICS - isothermal calorimetric spectroscopy).
Метод изотермической калориметрической спектроскопии живой ткани базируется на определении величины поглощенной мощности электромагнитного излучения, падающей на поверхность исследуемого локального участка эпидермиса живой ткани, по количеству межклеточного вещества, изменившего фазовое состояние (плавление глобулярной фазы гиалуроновой кислоты), методом измерения в реальном времени количества воды или осмотического давления межклеточного вещества. Схема спектрального устройства, основанного на принципе изотермической калориметрической спектроскопии, показана на Рис. 27.
Источник электромагнитного излучения с длиной волны, соответствующей характеристической частоте биохимического компонента живой ткани, интегрирован в изотермический микрокалориметр. Введены следующие обозначения: 1 -- аппликатор (тепло и водонепроницаемый), выполненный с возможностью наложения на кожу с дозированным давлением, образующий замкнутую термодинамическую систему живой ткани; 2 - источник электромагнитного излучения с перестраиваемой длиной волны; 3 - датчик осмотического давления межклеточного вещества или микро-потока межклеточной гидродинамики.
Зависимость отклика осмотического давления межклеточного вещества от длины волны падающего излучения (при фиксированной мощности) прямо коррелирует со спектром поглощения вещества; отклик (изменения) осмотического давления на мощность падающего излучения возникает пропорционально величине поглощенной мощности, и имеет большую величину на тех длинах волн, энергия которых соответствует энергиям возбуждения колебаний в изучаемых молекулах
В некоторых вариантах осуществления изобретения излучение модулировано по амплитуде. В спектральной схеме с применением электромагнитного излучения с амплитудной модуляцией в объеме ткани иод аппликатором возбуждаются колебания эластического давления межклеточного вещества, обусловленные колебаниями осмотического давления на частоте модуляции излучения. В этом варианте, величину поглощенной мощности электромагнитного излучения можно определить способом измерения эластического давления ткани под аппликатором на частоте модуляции излучения. Ближайшим аналогом описанного метода является известный метод оптико- акустической (ОА) спектроскопии, основанный на эффекте, проявляющемся в виде пульсаций давления газа в замкнутом объеме при поглощении модулированного на звуковой частоте излучения. Возникновение этого эффекта связано с преобразованием части энергии возбу жденны излучением молекул в тепловую энергию среды за счет без излучательных переходов. Оптико- акустический эффект возникает за счёт преобразования части поглощённой энергии в тепловую, что приводит к образованию акустических колебаний в самом образце либо соприкасающемся с ним газе. Регистрация акустических колебаний непосредственно в веществе осуществляется пьезоэлектрическим датчиком (жидкие и твёрдые образцы) или микрофоном (газы).
При спектральном измерении многокомпонентной системы в биохимии используют принцип аддитивности, согласно которому поглощение отдельного вещества не зависит от других веществ, обладающих собственным поглощением. Поэтому, при данной длине волны спектральная плотность раствора из смеси компонентов, не взаимодействующих между собой, равна сумме спектральных плотностей отдельных компонентов при той же длине волны. Для оценки степени поглощения исследуемого раствора, содержащего какое-либо соединение, проводится сравнение интенсивности потока излучения, прошедшего через этот раствор, с интенсивностью излучения, прошедшего через раствор сравнения -бланк.
В случае спектроскопии живой ткани для оценки пика поглощения исследуемого соединения, проводится сравнение спектрального сигнала (интенсивности излучения) на длине волны, соответствующей характеристической частоте исследуемого соединения, со спектральным сигналом, обусловленным поглощением чистой воды на данной длине волны, интенсивность которого можно оценить на основе спектрального измерения на другой частоте, соответствующей пику поглощения воды, который не совпадает с пиками поглощения исследуемого вещества.
Возможность практической реализации метода изотермической калориметрической спектроскопии биохимических компонентов живой ткани была подтверждена нами в экспериментах, в которых измерялась зависимость отклика осмотического давления межклеточного вещества эпидермиса от длины волны и мощности падающего электромагнитного излучения; исследовалась зависимость осмотического давления на электромагнитное излучение в оптическом и ближнем инфракрасном (0,4 - 0,9 мкм), инфракрасном ( 1мкм - 10 мкм) и микроволновом диапазонах ( 5мм - 10мм). Зависимость осмотического давления от мощности инфракрасного излучения (с максимумом спектральной мощности на длине волны l ~ 10 мкм) показана на Рис. 3
Метод терагерцовой (ΊΉz) калориметрической спектроскопии.
Терагерцовая (THz) спектроскопия живой ткани основана на измерении величины поглощенной мощности терагерцового излучения, падающего на поверхность исследуемого локального участка эпидермиса живой ткани, по количеству межклеточного вещества, изменившего агрегатное состояние, методом измерения в реальном времени количества воды или осмотического давления межклеточного вещества.
В отношении биологических систем терагерцовое излучение дает возможность изучать роль воды в биологических процессах, а также характерные колебательные процессы, которые могут дать характеристику состояния биосистемы. Важным преимуществом терагерцовой спектроскопии с точки зрения медицины является то, что этот метод является бесконтактным и неинвазивным - излучение этого спектрального диапазона не вызывает ионизации (как ультрафиолет) и значительного нагрева объекта (как СВЧ). Обладая высокой чувствительностью к фазовому состоянию воды и вещества живой ткани, терагерцовый диапазон позволяет выяснить уровень связанности молекул воды в биологических системах, уровень сольватации ионов в растворе и уровень гидратации поверхностей на фазовой границе. Как известно, наиболее эффективно спектральные измерения в терагерцовой области проводятся с образцами, представляющими собой плоско - параллельные слои различной толщины (от нескольких миллиметров до десятков микрометров или сотен ангстрем). На Рис. 12 схематически показана диаграмма энергетических уровней (l, g, s) тетрамера гиалуроновой кислоты межклеточного вещества, позволяющая рассчитать энергию кванта терагерцового излучения. Энергия перехода между уровнями тетрамера, равная энергии связи АЕ ~ 1квТ/2 = Ъ,5квТ ~ 0,115 эВ молекулярного комплекса тетрамера, определяет характеристическую частоту тетрамера, которой соответствует длина волны электромагнитного излучения l ~ 152 мкм (65,78 см 1) в терагерцовой области спектра.
Энергия связи тетрамера определяется высотой энергетического барьера между (l, s) конформациями Na- тетрамера: АЕ = Етах - Ет„ ~ 3,5 квТ, где Ет„ - минимальное значение энергии справа от энергетического барьера.
Длина волны электромагнитного излучения, соответствующая энергии перехода тетрамера в возбужденное состояние АЕ == Етах - Ет„ ~ 3,5 квТ, определяется только физиологической температурой: l = cxh/AE = сх!г/3,5квТ = 532мкм/3,5 ~ 152 мкм (65,78 см 1), где с - скорость света, h - постоянная Планка.
Полученное значение длины волны, соответствует терагерцовому (ТГц) диапазону электромагнитного спектра, который расположен в интервале длин волн между ЮОмкм (дальнее ПК) и 1 мм (микроволновый).
Воздействие электромагнитного излучения, с длиной волны l ~ 152 мкм, соответствующей энергии возбуждения тетрамера 3,5 квТ, приводит к разрыву водородных связей тетрамера и конформационному переходу Na - тетрамера из конформации (s) кристаллической фазы в конформацию (l) жидкой фазы, который сопровождается поглощением кванта тепловой энергии, величину которого можно определить с помощью Рис.16 по высоте энергетического барьера между (l, s) конформациями Na- тетрамер
АЕ = ( Етах - Emm) - ( Етах - Е0)= 3,5 квТ- 2,5 квТ = \квТ, где Е0- минимальное значение энергии слева от энергетического барьера.
Чувствительность живой ткани к тепловым потокам.
Особенность природного биосенсора живой ткани заключается в том, что тетрамер гиалуроновой кислоты (распознающий элемент, molecular recogniser) обладает высокой чувствительностью не только к электромагнитным квантам hv на характеристической частоте тетрамера (l ~ 152 мкм), соответствующей энергии диссоциации тетрамера АЕ =3,5 квТ, но также обладает экстремально высокой чувствительностью к квантам тепловой энергии, которые образуются в веществе в результате поглощения электромагнитного излучения на частотах, которые не совпадают с характеристической частотой тетрамера (l ~ 152 мкм). Например, кванты тепловой энергии образуются в межклеточном веществе в результате поглощения электромагнитного излучения на линиях поглощения воды.
Как известно, пространственное распределение биохимических компонентов в микрообъеме живой ткани неоднородно: гиалуроновая кислота, которая является основным компонентом межклеточного вещества, не входит в состав внутриклеточного вещества; концентрация глюкозы в межклеточном пространстве выше, чем ее концентрация внутри клетки, в которой протеакает реакция окисления глюкозы; суммарное количество воды в межклеточном пространстве единичного объема живой ткани намного меньше суммарного количества внутриклеточной воды, поскольку объем клетки много больше объема межклеточного пространства. Отсюда следует понимание вывода, что мощность электромагнитного излучения с длиной волны, соответствующей характеристическим частотам тетрамера гиалуроновой кислоты и других фрагментов этой полимерной макромолекулы, а также частотам молекулы глюкозы, поглощается в основном в объеме межклеточного вещества. С другой стороны, электромагнитное излучение с длиной волны, соответствующей характеристическим частотам воды, в основном поглощается в объеме клетки. Энергия излучения, которая поглощается внутриклеточной водой (и/или другими внутриклеточными молекулами) в изотермическом процессе преобразуется в энергию теплового движения молекул в объеме клетки и межклеточного пространства, окружающего клетку; взаимодействие тетрамера межклеточного вещества с квантом тепловой энергии (тепловое соударение молекулы вещества с тетрамером), который образовался в объеме клетки, приводит изотермическому изменению осмотического давления межклеточного вещества, в результате диссоциации тетрамера. Тепловая энергия, возникающая в объеме межклеточного вещества в результате поглощения энергии внешнего электромагнитного излучения, приводит к изотермическому плавлению кристаллической фазы межклеточного вещества.
Таким образом, живая клетка, окруженная межклеточным веществом, при физиологических условиях, является изотермическим калориметрическим детектором мощности, который преобразует электромагнитную энергию, поглощенную в объеме клетки (или возникающую в клетке в процессе метаболизма), в осмотическое давление межклеточного вещества.
На Рис. 29 показана схема изотермической калориметрической спектроскопии биохимических компонентов живой клетки. Живая биологическая клетка, окруженная межклеточным веществом, является природным изотермическим микрокалориметром мощности электромагнитного излучения, позволяющим определить спектр поглощения вещества живой ткани на основе измерения зависимости осмотического давления межклеточного вещества от спектральной мощности падающего излучения (1, 2, 3, 4, 5): 1 -электромагнитное излучение на характеристической частоте гиалуроновой кислоты; 2 электромагнитное излучение на характеристической частоте глюкозы; 3, 4 - электромагнитное излучение на характеристической частоте воды; 5 - электромагнитное излучение на характеристической частоте внутриклеточных биохимических молекул или органелл. Электромагнитное излучение е длиной волны, соответствующей характеристической частоте воды, поглощается в объеме клетки: энергия такого излучения преобразуется в энергию теплового движения молекул воды и свободных звеньев полимерной цепи, которая приводит к диссоциации тетрамера гиалуроновой кислоты и изотермическому изменению осмотического давления межклеточного вещества. Живая клетка, окруженная межклеточным веществом, является изотермическим калориметром мощности, который преобразует электромагнитную энергию, поглощенную в объеме клетки (или возникающую в клетке в процессе метаболизма), в осмотическое давление межклеточного вещества.
Таким образом, в спектрах поглощения вещества живой ткани (межклеточного и внутриклеточного) наряду с характеристической частотой тетрамера гиалуроновой кислоты в терагерцовой области (l ~ 152 мкм), будут проявляются другие частоты, соответствующие различным группам гиалуроновой кислоты, воды, глюкозы и других биохимических молекул. Схема спектрального измерения, по этой причине, должна быть разработана с учетом взаимного влияния на результаты спектральных измерений поглощения мощности близко расположенными линиями поглощения, в частности, терагерцовое излучение вблизи области пика поглощения тетрамера, также будет поглощаться молекулами воды, основная часть которой в живой ткани находится в объеме клетки. По этой причине, отклик осмотического давления межклеточного вещества локального участка живой ткани на терагерцовое излучение с длиной волны l ~ 152 мкм будет состоять из двух вкладов: спектрального отклика тетрамера межклеточного вещества и спектрального отклика на поглощение этого излучения молекулами воды. Спектральный вклад, обусловленный поглощением воды, превышает спектральный вклад, обусловленный поглощением электромагнитной энергии тетромером, поскольку, в единичном объеме живой ткани, объем внутриклеточного вещества значительно превышает объем межклеточного вещества. Спектр воды в терагерцовой области интенсивного пика поглощения вблизи характеристической частоты тетрамера, поэтому применение дифференциального метода двухлучевой спектроскопии позволяет выделить сигнал осмотического давления, обусловленный поглощением излучения тетрамером межклеточного вещества, за счет вычитания из общего сигнала вклада, обусловленного поглощением внутриклеточной воды. Для выделения спектрального сигнала тетрамера, необходимо с помошью описанного метода определить интенсивность пика поглощения тетрамера; для повышения точности можно использовать трехлучевую (трехволновую) схему спектроскопии, в которой длины волн соответствуют локальным экстремума пика поглощения (l ~ 152 мкм) и двум боковым частотам, соответствующим минимумам пика. При этом вклад в сигнал, обусловленный поглощением внутриклеточной воды, определяют на длине волны, соответсвующей боковым частотам пика поглощения тетрамера гиалуроновой кислоты. Из результирующего спектрального распределения сигнала, измеренного трехлучевым способом, имеющего форму пика, вычитают постоянный сигнал, соответствующий вкладу поглощения молекул воды. В описанной схеме спектрального измерения предполагается, что спектр гиалуроновой кислоты не содержит вблизи линии поглощения тетрамера l ~ 152 мкм других пиков поглощения, обусловленных другими фрагментами гиалуроновой кислоты.
THz спектроскопия для определения концентраци глюкозы в крови.
Метод изотермической калориметрической спектроскопии, можно использовать на практике для определения в условиях in vivo содержания биохимических компонентов (межклеточного и внутриклеточного вещества) живой ткани. В частности, метод позволяет определить концентрацию глюкозы в крови на основе измерения концентрации тетрамеров гиалуроновой кислоты межклеточного вещества, пропорциональной концентрации глюкозы, связанной гиалуроновой кислотой. Как было показано, 1/3 от общего числа молекул глюкозы в объеме макромолекулы гиалуроновой кислоты, находится в свободном состоянии, а оставшиеся 2/3 молекул глюкозы связаны с мономерами полимерной цепи гиалуроновой кислоты, из которых 1/3 молекул глюкозы связана непосредственно в молекулярном комплексе тетрамера. Отсюда следует, что концентрацию свободной (не связанной) глюкозы в межклеточной жидкости (и в крови) можно определить путем измерения концентрации глюкозы, связанной в тетрамерах межклеточного вещества (или концентрации глюкозы, связанной с полимерной цепью гиалуроновой кислоты).
Изотермическая ТНх калориметрическая спектроскопия воды в живой ткани.
Как известно, при спектральном измерении многокомпонентной системы в биохимии используют принцип аддитивности, согласно которому поглощение отдельного вещества не зависит от других веществ, обладающих собственным поглощением. Поэтому, при данной длине волны спектральная плотность раствора из смеси компонентов, не взаимодействующих между собой, равна сумме спектральных плотностей отдельных компонентов при той же длине волны. Для оценки степени поглощения исследуемого раствора, содержащего какое-либо соединение, проводится сравнение интенсивности потока излучения, прошедшего через этот раствор, с интенсивностью излучения, прошедшего через раствор сравнения - бланк.
В случае спектроскопии живой ткани для оценки пика поглощения исследуемого биохимического соединения, проводится сравнение спектрального сигнала (интенсивности излучения) на длине волны, соответствующей характеристической частоте исследуемого соединения, со спектральным сигналом, обусловленным поглощением чистой воды на данной длине волны.
Разработка метода измерения в реальном времени содержания воды в живой ткани, с другой стороны, является актуальной задачей, имеющей прикладное и фундаментальное значение. Метод изотермической калориметрической спектроскопии позволяет в условиях in vivo определять содержание воды (в межкле точном пространстве и объеме клетки) локального участка живой ткани путем измерения электромагнитного спектра поглощения на длинах волн, соответствующих характеристическим частотам воды, которые в настоящее время изучены достаточно подробно для чистой воды. Спектр поглощения воды в широком диапазоне частот (от ультрафиолетового до микроволнового) показан на Рис. 31.
Энергия падающего электромагнитного излучения, длина волны которой соответствует характеристическим частотам воды, поглощается в объеме клетки и преобразуется в энергию теплового движения молекул воды (принцип изотермического калориметра), которое приводит к изотермическому изменению осмотического давления межклеточного вещества в результате плавления кристаллической фазы межклеточного вещества.
Рассмотрим для примера метод спектрального измерения вблизи линии поглощения воды на характеристической частоте 3339 см 1 (2,99 мкм) в интервале 3250 см 1 - 3750 см 1, показанный на Рис. 31.
Распределение спектральной мощности пика поглощения можно определить с помощью схемы трехлучевой (трехволновой) спектроскопии, в которой длины волн соответствуют локальным экстремума пика (длина волны, соответствующая максимуму пика 3339 см 1 (2,99 нм) и две боковые частоты 3250 и 2750 см 1, соответствующие минимумам пика. Количество теплоты, поглощенной на заданной длине волны в частотном интервале 2750 см ! - 3250 1 см 1 определяется по величине изменения осмотического давления межклеточного вещества.
В случае спектральных измерений в терагерагерцовой области (l ~ 152 мкм), рассмотренном выше, коэффициент поглощения воды можно принять постоянным, поскольку в спектре поглощения воды вблизи характеристической частоты (l ~ 152мкм) тетрамера межклеточного вещества, как следует из Рис. 31, не наблюдаются локальных пиков поглощения.
Спектральный способ определения концентрации глюкозы по линиям поглощения воды.
Осмотическое давление и количество воды в межклеточном веществе, как показано, определяется концентрацией глюкозы и величиной внешнего теплового потока, падающего на поверхность эпидермиса, определяемой климатическими параметрами. Метод изотермической калориметрической спектроскопии, позволяющий измерить количество воды в локальном микрообъеме живой ткани, может применяться на практике для определения концентрации глюкозы в межклеточном веществе и крови. Как было показано, концентрацию глюкозы в крови можно определить по экспериментальной зависимости осмотического давления от мощности падающего инфракрасного теплового излучения, представленной на Рис. За, по углу наклона графика зависимости осмотического давления межклеточного вещества эпидермиса от мощности падающего теплового излучения.
Метод микрокалориметрической спектроскопии, описанный выше, позволяет определить зависимость осмотического давления от тепловой мощности другим способом, с применением модулированного электромагнитного излучения (с амплидной или частотной модуляцией). В схеме измерения с амплитудной модуляциией, применяется излучение на длине волны, соответствующей выбранной характеристической частоте воды, с модуляцией амплитуды (интенсивности). Важная особенность спектрального метода измерения с применением излучения с амплитудной модуляцией, заключается в том, что метод позволяет исключить зависимость сигнала осмотического давления от низкочастотных флуктуаций климатических параметров. Метод спектрального измерения с амплитудной модуляцией позволяет выполнить калибровку измерительного устройства неинвазивным способом, путем определения величины энтальпии и других калибровочных параметров с помощью калорического уравнения (45).
В варианте частотной модуляции, спектральные измерения проводятся на нескольких длинах волн, соответствующих характеристическим частотам поглощения воды. Измерение отклика осмотического давления межклеточного вещества на электромагнитное излучение (с одинаковой мощностью) на нескольких разных длинах волн, для которых предварительно определены и известны коэффициенты поглощения, позволяет определить зависимость сигнала осмотического давления межклеточного вещества от мощности электромагнитного излучения, поглощенной в локальной области живой ткани под аппликатором.
Зависимость осмотического давления от поглощенной мощности, полученная описанным спектральным методом с использованием модулированного излучения, позволяет определить концентрацию глюкозы в крови. Важная особенность метода, заключается в том, что спектральный способ измерения на нескольких частотах (по крайней мере на двух), которые можно выполнить в реальном масштабе времени, позволяет исключить вклад в сигнал осмотического давления, обусловленный низкочастотными флуктуациями климатических параметров.
К факторам, ограничивающим точность описанного спектрального метода для измерения концентрации глюкозы, относится близость пиков поглощения воды с пиками поглощения других молекул, например, гиалуроновой кислоты и глюкозы. Как было отмечено выше, в живой биологической ткани спектральные линии поглощения воды, интенсивность пиков которых определяется объемом внутриклеточной воды, расположены вблизи линий поглощения глюкозы. Результирующий сигнал осмотического давления в основном определяется поглощением мощности излучения внутриклеточной водой, вклад которого в сигнал превышает вклад, обусловленный поглощением мощности электромагнитной энергии биохимическими компонентами межклеточного вещества (гиалуроновой кислоты и глюкозы), поскольку объем внутриклеточного вещества, в единичном объеме, значительно превышает объем межклеточного вещества. Схема спектральных измерений на характеристических частотах воды, учитывающая спектр поглощений глюкозы, позволяет увеличить отношение сигнал/шум в измерительной схеме.
Спектры поглощения глюкозы в ИК области и пропускания в ближней ИК области в интервале длин волн от 1,428 мкм (7000 см !) до 20 мкм (500 см 1), которые в настоящее время исследованы достаточно подробно, показаны на Рис. 32. На Рис. 33 представлены спектры поглощения глюкозы в ближней ИК области в интервале длин волн 1,428 мкм (7000 см 1) - 2,5 мкм (4000 см 1). Как видно из приведенных графиков, колебания концентрации глюкозы в крови приводит к колебаниям интенсивности пиков поглощения глюкозы.
Для определения зависимости осмотического давления межклеточного вещества от мощности падающего электромагнитного излучения, в однолучевой схеме измерений с амплитудной модуляцией излучения, длину волны можно выбрать в одном из интервалов между пиками поглощения глюкозы, например, 7000 см 1 (1,428 мкм), 5000 см 1 (2,0 мкм), 4000 см 1 (2,5 мкм).
В дифференциальной двухлучевой схеме измерений с применением излучения с частотной модуляцией, на двух (или более) длинах волн, можно выбрать частоты, не попадающие в интервалы пиков поглощения глюкозы, боковыми частотами пика поглощения глюкозы, например, 7000 см 1 (1,428 мкм), 5000 см 1(2,0 мкм), 4000 см 1 (2,5 мкм)
В описанной выше схеме спектрального измерения с применением модулированного излучения не учитывается возможный вклад в результирующий сигнал пиков поглощения межклеточной гиалуроновой кислоты, которые расположены вблизи пиков поглощения воды, однако дают в результирующий сигнал вклад, который значительно меньше вклада, обусловленного поглощением на частотах воды, поскольку объем внутриклеточного вещества, в единичном объеме живой ткани, значительно превышает объем межклеточного вещества.
Таким образом, концентрацию глюкозы в крови можно определить на основе изотермической калориметрической спектроскопии двумя разными способами: метод терагерцовой спектроскопии - измерение концентрации тетрамеров гиалуроновой кислоты межклеточного вещества (пропорциональной концентрации связанной глюкозы в межклеточном веществе) на длине волны терагерцового излучения (l ~ 152 мкм), соответствующего характеристической частоте тетрамера; метод инфракрасной спектроскопии - измерение концентрации тетрамеров гиалуроновой кислоты на основе зависимости осмотического давления межклеточного вещества от поглощенной мощности излучения, которую определяют в реальном времени на основе спектральных измерений с применением излучения с амплитудной модуляцией на одной длине волны (или на нескольких длинах волн), соответствующей характеристической частоте воды в инфракрасной или другой области электромагнитного спектра.
Отношение сигнал/шум в схеме спектрального измерения, описанной выше, можно улучшить за счет дополнительного измерения других биохимических компонентов межклеточного вещества, в частности, содержания гиалуроновой кислоты. Спектроскопия гиалуроновой кислоты и других компонентов межклеточного вещества рассмотрена ниже. Изо ермическая калориметрическая спектроск пий межклеточного вещества.
Спектр поглощения межклеточного вещества (являющегося многокомпонентным биополимером) имеет более сложную структуру спектральных линий поглощения, по сравнению со спектром чистой воды, поскольку наряду с интенсивными пиками поглощения воды (в основном внутриклеточной), содержит пики поглощения, соответствующие характеристическим частотам биохимических компонентов межклеточного вещества, основными компонентами которого являются вода, гиалуроновая кислота и глюкоза, связанная с мономерами полимерной цепи гиалуроновой кислоты, межклеточная (тканевая) жидкость, схожая по составу с плазмой крови, которая состоит из воды, аминокислот, сахаров, жирных кислот, коферментов, гормонов, нейромедиаторов, солей, а также отходов жизнедеятельности клеток.
Следует также отметить, что характеристические энергии связи молекул различных фармацевтических соединений, а также молекулы соединений и инородных включений в конденсированных средах межклеточного вещества, физиологически не совместимых с метаболизмом живой ткани, также могут оказаться в инфракрасном и терагерцовом диапазоне электромагнитного спектра и проявляться в спектрах поглощения межклеточного вещества.
Для оценки пиков поглощения исследуемой биохимической компоненты межклеточного вещества живой ткани, проводится сравнение спектрального сигнала (интенсивности излучения) на длине волны, соответствующей характеристической частоте исследуемого соединения, со спектральным сигналом, обусловленным поглощением чистой воды на данной длине волны.
На рисунке 34 ниже схематически показана структура межклеточного вещества, представляющего разветвленную макромолекулу гиалуроновой кислоты, имеющую конфигурацию полимерной сетки, окружающей живую клетку. Сшивки полимерной сетки образуются в результате объемных взаимодействий мономеров полимерной цепи с глюкозой растворителя (межклеточной жидкости) в конфигурации тетрамера - молекулярного комплекса, состоящего из двух не соседних дисахаридов полимерной цепи гиалуроновой кислоты и двух молекул D-глюкозы. Наряду с основной характеристической частотой (l ~ 152 мкм) в терагерцовой области спектра, соответствующей энергии диссоциации молекулярного комплекса сшивки, в спектре поглощения межклеточного вещества будут проявляться пики поглощения, соответствующие характеристическим частотам дисахаридов гиалуроновой кислоты и молекулы D-глюкозы, связанной мономерами полимерной цепи межклеточного вещества.
Живая клетка, окруженная межклеточным веществом, является природным изотермическим калориметром мощности, позволяющим определить спектр поглощения межклеточного и внутриклеточного вещества живой ткани на основе измерения зависимости осмотического давления межклеточного вещества от спектральной плотности электромагнитного излучения на разных длинах волн (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7): 1- терагерцовое излучение на характеристической частоте (l ~ 152 мкм) тетрамера гиалуроновой кислоты; 2- излучение на характеристических частотах глюкозы связанной с мономерами полимерной цепи гиалуроновой кислоты; 3, 4 - излучение на характеристических частотах дисахарида гиалуроновой кислоты; 5, 6 - излучение на характеристических частотах воды; 7 - электромагнитное излучение на характеристической частоте внутриклеточной молекулы .
Поглощение терагерцового излучения, длина волны которой соответствует характеристической частоте тетрамера гиалуроновой кислоты (l ~ 152 мкм), приводит к диссоциации молекулярного комплекса тетрамера с преобразованием электромагнитной энергии в энергию теплового движения молекул, в результате которого происходит изотермическое изменение осмотического давления межклеточного вещества. Энергия падающего электромагнитного излучения, длина волны которой отличается от характеристической частоты тетрамера, но соответствует характеристическим частотам биохимических компонентов межклеточного вещества (гиалуроновая кислота, глюкоза, вода и др.), поглощается в объеме вещества и преобразуется в кинетическую энергию теплового движения молекул, которое приводит к изменению осмотического давления межклеточного вещества в результате диссоциации тетрамера гиалуроновой кислоты.
Спектры глюкозы.
На рисунке 32 показан график, поясняющий природу характеристических частот молеку лы глюкозы в инфракрасной области.
Спектры гиалуроновой кислоты и свободных жирных кислот.
Инфракрасные спектры исследованных веществ, являющихся компонентами составных частей биологических тканей (глюкоза, гиалуроновая кислота, белок - яичный альбумин, липид - топленый бараний жир), в частотном диапазоне 4000 - 600 см-1, полученные в этом исследовании на ИК Фурье спектрометре (Tensor 37 фирмы Bruker), представлены на Рис. 36.
В высокочастотной ИК области спектра 4000 см 1 (2,5 мкм) - 3000 см 1 (3,3 мкм), в которой наблюдается интенсивный пик поглощения воды (Рис. 31), в спектрах гиалуроновой кислоты, глюкозы и белка, также наблюдаются интенсивные пики поглощения, обусловленные характеристическими частотами валентной связи О-Н групп. В этой области (4000-3000 см4) отсутствует пик поглощения жира, который наблюдается рядом в интервале 3040 см 1 (3,29 мкм) - 2853 см 1 (3,5 мкм), в которую попадают также линии поглощения всех рассматриваемых компонентов, обусловленные частотами СНп-группировок, присутствующих в структуре этих молекул.
Структуру спектра в более низкочастотной области ИК спектра можно проанализировать на основе выделенного фрагмента спектров всех рассматриваемых компонентов, представленного на рисунке 37. Очень интенсивная узкая полоса карбоксильных карбонилов 1743 см 1 (5,7 мкм) и менее интенсивная 1553 см 1 (6,4 мкм ) присутствует в спектре липида (бараньего топленого жира); эти две полосы, присутствующие также в спектрах всех животных жиров (бараньего топленого жира, свиного, куриного, суркового, рыбьего и растительных масел - оливкового, миндального, льняного, хлопкового, подсолнечного и др.), обусловлены частотами триглицерида жирных (преимущественно ненасыщенных) кислот.
Полоса карбоксильных карбонилов 1743 см 1 (5,7 мкм) присутствует в спектре гиалуроновой кислоты (рисунок 37, кривая 3), полимерная цепь которой состоит из большого числа повторяющихся мономеров, каждый из которых состоит из дисахарида, имеющего в структуре группу -СООН. Обе полосы карбонилов 1743 см 1 (5,7 мкм) и 1553 см 1 (6,4 мкм) отсутствуют в спектре глюкозы (фруктозы, сахарозы, целлюлозы, крахмала) (рисунок 37, кривая 2). Полоса карбоксильных карбонилов 1553 см 1 (6,4 мкм) наблюдается только в спектре белка (яичного альбумина (рисунок 37, кривая 4), что позволяет отнести ее к проявлению С=0 групп полипептидной связи (1600 см '-1550 см 1).
Спектральный метод измерения содержания гиалуроновой кислоты.
Измерение содержания гиалуроновой кислоты в живой ткани является актуальной задачей, имеющей самостоятельное практическое значение в косметологии, дерматологии, регенерационной медицине и др.; актуальность задачи обусловлена необходимостью мониторинга гиалуроновой кислоты с целью ранней диагностики диабета, а также в процессе неинвазивного мониторинга сахара крови у пациентов с сахарным диабетом. В процессе клинических исследований на группе пациентов с сахарным диабетом нами было обнаружено влияние динамики содержания гиалуроновой кислоты на временную динамику осмотического давления, при постоянной концентрации глюкозы в крови, во временном интервале эксперимента.
Как видно из сравнения спектров (Рис. 37 линии поглощения гиалуроновой кислоты и глюкозы находятся вблизи интенсивного пика поглощения воды в области (4000-3000 см 1), при этом интенсивность пика поглощения воды, определяется поглощением в объеме клетки, поэтому многократно превышает интенсивность пиков глюкозы и гиалуроновой кислоты межклеточного вещества. По этой причине спектроскопия гиалуроновой кислоты и глюкозы, являющихся компонентами межклеточного вещества, сводится к выделению слабых спектральных пиков поглощения компонентов межклеточного вещества на фоне интенсивного спектрального пика воды, обусловленного поглощением воды в объеме клетки, многократно превышающего интенсивность спектральных пиков глюкозы и гиалуроновой кислоты межклеточного вещества; задача спектрального измерения биохимических компонентов межклеточного вещества является более сложной экспериментальной проблемой по сравнению с задачей спектрального измерения количества воды в единице объема живой ткани.
ИК спектроскопия гиалуроновой кислоты. Как известно, распределение гиалуроновой кислоты неравномерно по толщине эпидермиса, ее содержание в роговом слое и верхних слоях эпидермиса выше, чем ее содержание в дерме; авторами исследования предполагается, что транспорт гиалуроновой кислоты в роговой слой осуществляется из кератиноцитов, расположенных непосредственно под роговым слоем эпидермиса; кератиноциты - основные клетки эпидермиса человека (составляют примерно 90% всех клеток эпидермиса), которые содержатся в базальном, шиповатом, зернистом, блестящем роговом слоях эпидермиса.
Для измерения содержания гиалуроновой кислоты в верхних слоях эпидермиса можно применить метод спектроскопии диффузного отражения, основанный на регистрации электромагнитного излучения, диффузно отраженного от верхних слоев эпидермиса. Схема спектрального измерения содержания гиалуроновой кислоты в эпидермисе, основанная на приеме диффузно отраженного от эпидермиса электромагнитного излучения, показана на Рис. 38.
На рис. 38 изображена схема спектроскопии диффузного отражения для измерения содержания гиалуроновой кислоты и свободных жирных кислот в межклеточном веществе поверхностного слоя эпидермиса живой ткани. Диффузно отраженное от поверхностного слоя эпидермиса излучение собирается под широким углом и передается на детектор.
Для измерения содержания гиалуроновой кислоты в поверхностном слое эпидермиса можно использовать ближнее электромагнитное излучение ближней инфракрасной (или оптической) области с длиной волны, соответствующей характеристической частоте гиалуроновой кислоты. Например, можно выбрать частоту в интервале пика поглощения 7000 см 1 (1,43 мкм), который расположен на спектре рядом с пиком поглощения глюкозы 6000 см 1 (1,67 мкм). Спектр гиалуроновой кислоты в ближней ИК области показан на Рис.32.
На рис. 39 представлены спектры поглощения гиалуроновой кислоты в ближней ИК области и спектр пропускания в ИК области.
С другой стороны, пики поглощения гиалуроновой кислоты, как было отмечено, наблюдаются вблизи интенсивных пиков поглощения воды. На Рис. 40 представлены спектры поглощения гиалуроновой кислоты в ИК и ближней ИК области спектра, из которых следует, что пики поглощения гиалуроновой кислоты вблизи 3500см- 1 (2,8 мкм) и 7000 см-1 (1,43 мкм), накладываются на пики поглощения воды (Рис. 31).
Для выделения спектрального сигнала, соответствующего пику поглощения гиалуроновой кислоты, на фоне интенсивного пика поглощения воды, используют однолучевой (одна длина волны) комбинированный спектральный метод, который получается в результате комбинации двух методов - изотермической калориметрической спектроскопии, который позволяет определить содержание воды в эпидермисе (поскольку интенсивность пика поглощения внутриклеточной воды многократно выше интенсивности поглощения межклеточной гиалуроновой кислоты), и спектроскопии диффузного отражения, который позволяет определить суммарное содержание воды и гиалуроновой кислоты в поверхностном слое эпидермиса. Вклад гиалуроновой кислоты выделяют из результирующего спектрального сигнала диффузного отражения путем вычитания из суммарного сигнала временной динамики количества воды в роговом слое эпидермиса под аппликатором, непроницаемом для воды и тепла, приложенном к поверхности с дозированным давлением. Измерение проводится по схеме однолучевой спектроскопии на одной длине волны, соответствующей одной из характеристических частот гиалуроновой кислоты, которую выбирают в частотном интервале спектра, в котором пики поглощения гиалуроновой кислоты накладываются (или близко расположены) на пики поглощения воды (УФ, оптическая, ближняя ИК, ИК, дальняя ИК). В ближней ИК области можно выбрать, например, длину волны 7000 см 1 (1,43 мкм), в ИК области длину волны 3500см 1 (2,8 мкм). В рассмотренном варианте комбинированной схемы, применение дополнительного спектрального измерительного канала, основанного на регистрации электромагнитного излучения, диффузно отраженного от поверхностного слоя эпидермиса, а также применение измерительного метода синхронного детектирования сигналов, позволяет увеличить отношение сигнал /шум измерительных каналов. Зависимость отклика осмотического давления от мощности падающего электромагнитного излучения с амплитудной модуляцией на длине волны, соответствующей характеристической частоте воды, позволяет определить концентрацию глюкозы на основе метода, описанного выше.
Таким образом, применение комбинации двух спектральных методов (изотермической калориметрической спектроскопии и спектроскопии диффузного отражения) в одном спектральном устройстве позволяет получить лучшее разделение сигналов и определить содержание трех биохимических компонентов живой ткани, глюкозы, гиалуроновой кислоты и воды, с помощью измерений на одной длине волны, соответствующей одной из характеристических частот гиалуроновой кислоты (однолучевая спектроскопия).
Спектральный двухлучевой метод измерения содержания глюкозы.
Комбинированный спектральный метод, описанный выше, основанный на двухлучевой спектроскопии (на двух длинах волн), соответствующих характеристическим частотам глюкозы и гиалуроновой кислоты (вблизи пика поглощения воды), позволяет получить лучшее разделение сигналов и с более высоким отношением сигнал/шум определить концентрацию глюкозы, а также содержание двух других компонентов, гиалуроновой кислоты и воды, низкочастотная временная динамика которых непосредственно влияет на отношение сигнал/шум при измерении концентрации глюкозы. Спектральное измерение на каждой длине волны проводится двумя способами (изотермической калориметрической спектроскопии и спектроскопии диффузного отражения), комбинация которых в одном спектральном устройстве позволяет получить лучшее разделение сигналов. В ближней ИК области можно выбрать, например, длину волны 6000 см 1 (1,67 мкм), соответствующую характеристической частоте глюкозы, и длину волны 7000 см 1 (1,43 мкм), соответствующую характеристической частоте гиалуроновой кислоты. В другом варианте двухлучевой схемы измерения, концентрацию глюкозы определяют с помощью калорического уравнения (45), в котором величину энтальпии АН, которая зависит от содержания гиалуроновой кислоты в межклеточном веществе (и имеет индивидуальные значения для разных пациентов) и количества воды в единичном объеме ткани, которая зависит от климатических параметров, определяют спектральным методом по линиям поглощения гиалуроновой кислоты и воды.
В другом варианте, концентрацию глюкозы определяют по схеме трехлучевой спектроскопии на 3 длинах волн, соответствующих выделенным пикам поглощения глюкозы, воды и гиалуроновой кислоты. Спектральные измерения проводятся в следующих диапазонах спектра: в интервале 3550-3050 см 1 (2,8 - 3,3 мкм) на одной частоте 3339 см ! (2,99 нм), соответствующей пику поглощения воды (или трех частотах, соответствующих пикам поглощения воды, гиалуроновой кислоты и глюкозы); на частоте 1637 см 1 (6,08 мкм) , соответствующей второму пику поглощения глюкозы; на частоте 1553 см 1 (6,4 мкм), соответствующей третьему пику поглощения глюкозы.
Спектральные линии поглощения глюкозы в оптической и ближней инфракрасной области спектра также находятся вблизи интенсивных пиков поглощения воды (Рис. 31). На Рис. 41 показаны теоретические спектры поглощения глюкозы, меланина и воды в красном и ближнем ИК диапазоне.
Метод измерения концентрации глюкозы в красном и ближнем ИК диапазоне основывается на однолучевой комбинированной схеме, описанной выше. Для выделения спектрального сигнала, соответствующего пику поглощения глюкозы, на фоне интенсивного пика поглощения воды, используют однолучевой комбинированный спектральный метод, который получается в результате комбинации двух методов - изотермической калориметрической спектроскопии, который позволяет определить содержание воды в эпидермисе (поскольку интенсивность пика поглощения внутриклеточной воды многократно выше интенсивности поглощения межклеточной гиалуроновой кислоты), и спектроскопии диффузного отражения, который позволяет определить суммарное содержание воды и глюкозы в поверхностном слое эпидермиса. Комбинация двух спектральных методов (изотермической калориметрической спектроскопии и спектроскопии диффузного отражения) в одном спектральном устройстве позволяет получить лучшее разделение сигналов и определить содержание двух биохимических компонентов живой ткани, глюкозы и воды, с помощью измерений на одной длине волны, соответствующей одной из характеристических частот глюкозы (однолучевая спектроскопия).
Канал измерения на основе изотермической калориметрической спектроскопии позволяет определить содержание воды в объеме эпидермиса, поскольку интенсивность пика поглощения внутриклеточной воды многократно выше интенсивности поглощения глюкозы, концентрация которой в объеме клетки существенно меньше ее концентрации в межклеточном пространстве, в результате процесса окисления глюкозы в объеме клетки; второй канал измерения, на основе спектроскопии диффузного отражения, позволяет определить суммарное содержание воды и глюкозы в поверхностном слое эпидермиса.
В варианте двухлучевой спектроскопии, для получения лучшего разделения, используют две длины волны, например, длина волны в интервале 930-1050 нм, соответствующей ширине пика поглощения воды, и длина волны в интервале 1000-1100 нм, соответствующая пику поглощения глюкозы; дополнительно может использоваться длина волны в интервале 900-970нм, соответствующая второму пику поглощения воды. В варианте трехлучевой спектроскопии, дополнительно определяют содержание гиалуроновой кислоты, на длине волны, которую выбирают в этом же диапазоне частот, или в другой области ближнего ИК, например, 7000 см 1 (1,43 мкм).
Схема спектральных измерений в оптическом диапазоне должна быть разработана с учетом необходимости индивидуальной калибровки на содержание меланина кожи.
Метод измерения содержания триглицерида жирной кислоты.
Электромагнитное излучение с длиной волны, соответствующей характеристическим частотам свободных жирных кислот, будет интенсивно поглощаться в липидном слое эпидермиса, расположенном под роговым слоем, а также в объеме жирового слоя, расположенного под дермой. Липидный слой эпидермиса, расположенный под роговым слоем, представляет собой 10-25 слоев клеток, ориентированных параллельно поверхности и погруженных в липидный матрикс, составляющий около 10 % его объема, имеющий уникальную структуру и химический состав. Кожа содержит, как свободные жирные кислоты, так и жирные кислоты, связанные в триглицериды, фосфолипиды и церамиды. Липиды эпидермиса в основном состоят из: церамидов (50%); холестирина и его эфиров (25%) насыщенных жирных кислот (10%).
С целью определения содержания свободных жирных кислот можно применить спектральный метод, который является комбинацией двух спектральных методов, изотермической калориметрической спектроскопии (для зондирования жирового слоя кожи, расположенного под дермой) и спектроскопии диффузного отражения, основанной на регистрации электромагнитного излучения, диффузно отраженного от межклеточного вещества липидного слоя эпидермиса с высоким содержанием свободных жирных кислот, расположенного под роговым слоем; представляющего собой 10 - 25 слоев клеток, ориентированных параллельно поверхности и погруженных в липидный матрикс, составляющий около 10 % его объема, имеющий уникальную структуру и химический состав. Липиды эпидермиса в основном состоят из: церамидов (50%); холестирина и его эфиров (25%); насыщенных жирных кислот (10%) (рис. 42).
Как видно спектров (Рис. 36), два пика поглощения гиалуроновой кислоты попадают в полосы интенсивных пиков поглощения триглицерида жирных кислот 1743 см 1 (5,7 мкм) и 3040 см '-2853 см 1 (3,3- 3,5 мкм), которые находятся в интервале между двумя пиками поглощения воды 1645 см 1 (6,08 мкм) и 3339 ем 1 (3,0 мкм).
Содержание в живой ткани триглицерида жирных кислот и гиалуроновой кислоты можно определить с помощью метода изотермической калориметрической однолучевой спектроскопии на длинах волн, соответствующих характеристическим частотам триглицерида жирной кислоты 1743 см 1 (5,7 мкм) и/или 3040-2853 см 1 (3,3- 3,5 мкм).
В другом варианте, спектральный метод для измерения содержания триглицерида жирной кислоты, основан на применении двухлучевой спектральной схемы на длинах волн, соответствующих одной из характеристических частот гиалуроновой кислоты (комбинированный метод, описанной выше), например, 3500см 1 (2,8 мкм) - 3000 см 1 (3,3 мкм), и одной из характеристических частот триглицерида жирной кислоты, например, 3040 см '-2853 см 1 (3,3- 3,5 мкм). В этом варианте, спектральное измерение в интервале 2,8 мкм - 3,3 мкм проводят на основе комбинированного метода (объединяющего изотермическую калориметрическую спектроскопию и спектроскопию диффузного отражения), а измерение на длине волны триглицерида проводят по схеме спектроскопии диффузного отражения, позволяющей определить содержание триглицерида в поверхностном липидном слое эпидермиса или по схеме изотермической калориметрической спектроскопии, позволяющей определить содержание триглицерида в жировом слое под дермой. Описанная схема измерения позволяет регистрировать сигнал, пропорциональный содержанию триглицерида, или суммарный сигнал, пропорциональный суммарному содержанию глюкозы и липидов, характеризующий интенсивность метаболизма глюкозы и свободных жирных кислот.
Метод трехлучевой спектроскопии глюкозы, гиалуроновой кислоты и триглицерида жирной кислоты.
Концентрацию глюкозы можно определить на основе схемы трех лучевой спектроскопии, в которой применяется метод спектроскопии с помощью модулированного излучения на длине волны, соответствующей характеристическим частотам воды, путем добавления схемы двухлучевой спектроскопии на длинах волн, соответствующих характеристическим частотам гиалуроновой кислоты и триглицерида жирной кислоты. Преимущество этой схемы в том, что интенсивность пиков поглощения практически не меняется за время проведения экспериментов в течении дня (и недели), поэтому измерение сводится к схеме двухлучевой спектроскопии на двух длинах волн, соответствующих характеристическим частотам воды и гиалуроновой кислоты. Однолучевая схема спектрального прибора на длине волны, соответствующей характеристической частоте 1743 см-1 (5,7 мкм) может применяться для мониторинга содержания гиалуроновой кислоты живой ткани.
Метод спектроскопии внутриклеточных биохимических макромолекул и органелл
Метод микрокалориметрической спектроскопии, описанный выше, в общем случае, позволяет определить концентрацию макромолекул внутриклеточного вещества с применением электромагнитного излучения с частотами (длинами волн), которые совпадает с характеристическими частотами тетрамеров внутриклеточных макромолекул (белки, РНК, ДНК).
Характеристические частоты внутриклеточных белков попадают в дальний инфракрасный диапазон электромагнитного спектра. Например, характерные энергии связи в макромолекуле глобулярного фермента глюкокиназы и других внутриклеточных ферментов имеют величины порядка 7 ккал/моль - 20 ккал/моль или 10 квТ - 30 квТ, соответствующих интервалу длин волн 20 - 70 мкм в дальней ИК области спектра.
Концентрацию основных биохимических компонентов межклеточного вещества, в общем случае, можно определять с помощью дифференциального метода по схеме четырех лучевой (четырех волновой) спектроскопии, в котороой используются длины волн, соответствующие характеристическим частотам 3 основных компонентов межклеточного вещества, гиалуроновой кислоты, глюкозы, молекулы воды, а также длина волны, соответствующая характеристической частоте внутриклеточной макромолекулы или комплекса; в схеме измерения, каждая из четырех биохимических соединений, может быть представлена набором из 1 (или более) характеристических частот. Поэтому, число длин волн, характеризующих группу из 2 биохимических компонентов межклеточного вещества, молекулы воды и 1 исследуемой внутриклеточной молекулы, может быть больше 4.
Поглощение внутриклеточными макромолекулами (и биохимическими комплексами) падающего электромагнитного излучения с длинами волн, соответствующих характеристическим частотам внутриклеточных биохимических компонент, будет приводить к изменению теплового баланса в контролируемой области живой ткани под аппликатором (нагреву) и, как следствие, к изменению осмотического давления межклеточного вещества в результате разрыва внутренних межмолекулярных связей тетрамеров гиалуроновой кислоты межклеточного вещества, имеющих характерную энергию связи порядка квТ.
ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Предлагаемый способ спектроскопии межклеточного вещества локального участка живой ткани может быть реализован при помощи спектрального устройства, принципиальная схема которого показана на рис. 43. Блок - схема спектрального устройства для изотермической калориметрической спектроскопии биохимических компонентов живой ткани (изотермический калориметрический спектрометр) включает 1- аппликатор, непроницаемый для воды и тепла; 2 - датчик осмотического давления межклеточного вещества; 3 - источник электромагнитного излучения с постоянной и/или модулированной интенсивностью; 4 - датчик физиологического параметра; 5 - блок инструментальных усилителей и/или синхронный детектор и/или аналогово- цифровой преобразователь (АЦП); 6 - блок обработки информации; 7 - блок отображения информации. Устройство содержит несколько датчиков для измерения физиологических параметров, один из которых предназначен для измерения осмотического давления межклеточного вещества, а также один или несколько источников электромагнитного излучения с постоянной или модулированной интенсивностью.
Устройство включает в себя аппликатор 1 (непроницаемый для тепла и воды, имеющий верхнюю и нижнюю поверхности), выполненный с возможностью наложения на поверхность эпидермиса с дозированным давлением, один или несколько источников 3 электромагнитного излучения, с постоянной или модулированной интенсивностью, с длиной волны, соответствующей характеристической частоте исследуемого биохимического компонента живой ткани, устройство для создания калибровочного воздействия на контролируемый участок ткани под аппликатором, датчик осмотического давления межклеточного вещества (2), датчики температуры и других физиологических параметров (4), расположенные под аппликатором, с внутренней стороны аппликатора на поверхности РСЭ, при этом сигналы с вышеуказанных датчиков поступают последовательно на входы блока 5 усилителей и/или синхронного детектора и/или аналогово- цифрового преобразователя (далее АЦП), установленных на верхней поверхности аппликатора 1; блока 6 обработки информации; блока 7 отображения информации.
Блоком 6 обработки информации является микропроцессор для обработки в реальном времени сигналов от датчиков физиологических параметров локальной области ткани под аппликатором и датчиков климатических параметров окружающей среды.
В одном из вариантов осуществления блок 6 обработки информации расположен на верхней поверхности аппликатора 1, в другом - является удаленным и связан проводной связью с АЦП.
Блоком 7 отображения информации является смартфон или персональный компьютер. При этом связь мультисенсорного устройства с блоком 7 отображения информации может быть в различных вариантах осуществления как беспроводной, так и проводной (посредством USB канала).
В качестве датчиков для измерения динамики физиологических параметров локальной области ткани под аппликатором используют по меньшей мере датчик 2 осмотического давления, с помощью которого определяют количество воды в межклеточном пространстве ткани в локальном объеме под аппликатором на контролируемой глубине, на которой устанавливается локальное термодинамическое равновесие; датчик 4 температуры РСЭ с помощью которого определяют температуру поверхности кожи под аппликатором и датчик эластического давления ткани под аппликатором.
Сигналы датчиков физиологических параметров (датчик осмотического давления 2, датчик температуры 3 и датчик эластического давления 4), расположенных на внутренней поверхности аппликатора 1, поступают на входы инструментальных усилителей и/или аналогово-цифрового преобразователя (блок 10), после которых поступают в блок обработки информации 11, в котором производится обработка сигналов. Обработанная информация передается в устройство отображения 12, на экране которого в реальном времени отображаются текущие значения измеряемых параметров и/или скорости метаболизма параметров.
В случае использования электромагнитного излучения с амплитудной модуляцией сигнала, с целью повышения отношения сигнал /шум применяется метод синхронного (когерентного) детектирования AM сигналов, который позволяет существенно повысить отношение сигнал/шум регистрируемого сигнала и уменьшить его искажения. В этом случае, синхронное детектирование сигнала на выходе датчика осмотического давления осуществляется с помощью инструментального усилителя (со встроенной схемой синхронного детектирования) на частоте AM модуляции электромагнитного излучени .
Рис. 44. Схема спектроскопии диффузного отражения для определения осмотического давления межклеточного вещества на основе спектрального измерения временной динамики количества воды в роговом слое эпидермиса на длине волны, соответствующей характеристической частоте воды (1190, 1455, 1945, 945 нм). Диффузно отраженное от эпидермиса излучение собирается под широким углом и передается на детектор. 1- источник излучения на длине волны, соответствующей характеристической частоте воды в роговом слое эпидермиса; 2 - аппликатор, непроницаемый для воды и тепла; 3- излучение на длине волны, соответствующей характеристической частоте исследуемой биохимической компоненты эпидермиса (живой ткани) ; 4- приемник электромагнитного излучения.
Для практической реализации мультисенсорного устройства могут использоваться промышленные сертифицированные датчики для измерения климатических параметров, а также сертифицированные сенсоры для измерения температуры рогового слоя и эластического давления эпидермиса. Например, в качестве датчика для измерения температуры рогового слоя могут быть использованы сенсоры фирмы Honeywell.
В качестве датчика для измерения эластического давления могут использовать сенсоры на основе пьезоэлектрического элемента.
Датчик осмотического давления 2, регистрирующий динамику переноса воды в эпидермисе путем регистрации временной динамики содержания воды в роговом слое эпидермиса, может быть основан на разных физическо-химических методах, основанных на разных физических принципах. В частности, для измерения количества воды в роговом слое применимы методы электрометрии, основанные на измерении электрофизических характеристик РСЭ (электропроводность, диэлектрическая проницаемость); спектральные методы, основанные на измерении спектральных характеристик (коэффициенты отражения и поглощения); оптико-акустические методы; теплофизические методы, основанные на измерении теплофизических характеристик (теплопроводность, теплоемкость); электрохимические методы и др. Также датчик количества воды может быть основан на измерении эластического давления. Устройства для измерения количества воды в эпидермисе описаны в патенте [10].
В случае применения электрометрического датчика, количество воды в эпидермисе можно определить путем измерения электрических характеристик (электропроводности и/или диэлектрической проницаемости) рогового слоя на переменном или постоянном токе.
В случае применения спектрального датчика, количество воды в эпидермисе можно определить путем измерения спектральных характеристик (коэффициента отражения и/или коэффициента поглощения) рогового слоя для электромагнитного излучения с длиной волны вблизи линии поглощения, обусловленной содержанием воды в РСЭ. В частности, временную динамику процесса набухания межклеточного вещества можно регистрировать по временной динамике коэффициента отражения рогового слоя эпидермиса. Увеличение количества воды в межклеточном пространстве приводит к изменению спектральной характеристики рогового слоя, обусловленному изменением количества воды в РСЭ.
Спектральный датчик может основываться на способе, в котором осмотическое давление межклеточного вещества или количество воды в межклеточном пространстве определяют путем измерения спектральных характеристик межклеточного вещества в диапазоне спектра электромагнитного излучения, который определяют по характеристическим частотам поглощения межклеточного вещества, и выбирают из группы, включающей в себя характеристические частоты воды в оптическом и/или инфракрасном и/или микроволновом диапазоне; групповые частоты гиалуроновой кислоты межклеточного вещества в инфракрасном и/или терагерцовом и /или микроволновом диапазоне.
В другом варианте, спектральный датчик основывается на способе определения осмотического давления межклеточного вещества методом измерения количества воды в роговом слое эпидермиса путем измерения физических характеристик рогового слоя эпидермиса, которые выбирают из группы, включающей электрофизические характеристики, спектральные и оптико- акустические характеристики, теплофизические характеристики.
В случае спектрального метода, осмотическое давление межклеточного вещества или количество воды в межклеточном пространстве определяют по количеству воды в роговом слое эпидермиса путем измерения спектральных характеристик рогового слоя эпидермиса на характеристических частотах поглощения воды в роговом слое с помощью спектрального метода, который выбирают из группы, включающей, ИК спектроскопию, Раман - спектроскопия, оптико- акустическая спектроскопия, разностная (дифференциальная) двухлучевая спектроскопия.
Дозированное калибровочное воздействие выбрано из группы, включающей в себя внешнее давление, локальную декомпрессию, нагрев, охлаждение, электрический ток или напряжения и магнитное поле.
В качестве устройства 8 для создания калибровочного воздействия можно использовать, например, устройство, генерирующее импульсы электрического напряжения или тока через РСЭ, которые позволяют определить текущее значение и направление микропотоков тканевой жидкости в межклеточном веществе глубинного слоя эпидермиса путем измерения кинетических характеристик массопереноса, обусловленного электрокинетическими явлениями, в частности, электро-осмосом.
В альтернативных вариантах осуществления устройством для создания калибровочного воздействия является источник тепловой мощности, выполненный в виде резистора или элемента Пельтье, или устройство для создания дозированного давления на поверхность аппликатора.
В качестве источников электромагнитного излучения в оптической и инфракрасной областях могут использовать промышленные лазерные диоды (на основе квантово- размерных гетеро-структур и других типов), которые широко распространены и производятся с большим разнообразием характеристик излучения, специализированных для определенных применений. Официальных стандартов по типам и размерам корпусов лазерных диодов не существует, однако иногда крупные производители заключают соглашения об унификации корпусов. Кроме того, существуют услуги по разработке корпуса излучателя по требованиям заказчика.
В качестве приемника электромагнитного излучения в оптическом и инфракрасном диапазоне могут использоваться фото приемники, которые выпускаются промышленностью. Ведущими компаниями мира выпускается довольно много типов микросхем, в которых приемник излучения (фотоприемник) и усилитель объединены в одном корпусе. Такие системы широко используются в системах дистанционного управления на ИК - лучах (такие модули также называются ИК -ресиверами (IR Receiver). Ведущими компаниями мира выпускается довольно много типов таких микросхем.
Отечественной промышленностью, например, компаниями ООО «ЛЕД Микросенсор НТ» и ООО "АИБИ" (IBSG Со., Ltd.), выпускается широкий спектр оптоэлектронных приборов среднего инфракрасного диапазона - светоизлучающих диодов, светодиодных матриц, фотодиодов для спектрального диапазона от 1,6мкм до 5,0 мкм, а также электронных устройств для работы с ними (драйверов для светодиодов и усилителей для фотодиодов).
В оптическом и ближнем ИК диапазоне также можно использовать светодиоды отечественного производства: SIM-012ST (950-970 нм); OIS-150-1020 (1020-1060 нм);
KM2520F3C03 (930-950нм); EDEF-1LS3 (740-760нм); EDEI-1LS3 (830-850 нм). В качестве приемника оптического излучения использован фотодиод, чувствительный к оптическому излучению в диапазоне длин волн от 740нм до1060 нм, например, фотодиод типа BPW34.
Источники и приемники терагерцового излучения, миниатюрные по размерам и с характеристиками излучения, приемлемыми для практических применений, пока не выпускаются мировой промышленностью и находятся на стадии НИОКР. В частности, ученые из Принстонского университета (Xue Wu; Kaushik Sengupta, Department of Electrical Engineering, Integrated Micro- systems Research Lab, Princeton University, Princeton, NJ, USA) добились радикального уменьшения аппаратуры для работы с электромагнитным излучением терагерцового диапазона. Подобные устройства могут стать важным элементом медицинской диагностики, коммуникаций и разработки лекарств. Две работы ученых на эту тему опубликованы в журнале IEEE Journal of Solid State Circuits. В статье ученые объяснили, как им удалось создать миниатюрную микросхему для генерации терагерцового излучения. Она пока работает в узком диапазоне, однако исследователи поняли, что это препятствие можно преодолеть, создавая сразу несколько волн различных длин на одной микросхеме и комбинируя их, используя точную синхронизацию. Дэниэл Миттлман, вице- председатель Международного общества инфракрасных, миллиметровых и терагерцового излучения, сказал, что работа «очень инновационна и потенциально имеет множество применений», а также отметил, что еще предстоит много работы до внедрения этих разработок в повседневные устройства, они являются перспективными.
Непроницаемый для воды и тепла аппликатор (1) с закрепленными на его нижней поверхности датчиками количества воды (межклеточного осмотического давления 2), температуры 3 и эластического давления эпидермиса на аппликатор 4, фиксируется на поверхности рогового слоя эпидермиса, например, на поверхности кисти руки, с внешним дозированным давлением и прикрепляется в одном из вариантов осуществления с помощью ремешков. Следует, что измерение можно производить на любом участке поверхности тела человека, свободном от волосяного покрова, за исключением участков тела, в которых расположены потовые железы, которые активируются в результате эмоционального воздействия. Примером такого участка являются ладони рук.
Предполагаемые размер, внешний вид и дизайн мультисенсорного устройства показаны на
Рис. 45.
Процесс измерения (записи сигналов) начинается непосредственно в момент прижима по меньшей мере одного тепло- и водонепроницаемого аппликатора к поверхности РСЭ или с задержкой через 10-50 секунд с момента прижима.
После наложения аппликатора на поверхность кожи измеряют временную динамику физиологических параметров в локальной замкнутой области ткани под аппликатором в режиме «микрокалориметр», а именно, по меньшей мере тепловой поток через участок эпидермиса под аппликатором или температуру поверхности кожи под аппликатором, эластическое давление ткани под аппликатором, давление, создаваемое аппликатором на поверхность кожи, количество воды в межклеточном пространстве ткани на контролируемой глубине, на которой устанавливается локальное термодинамическое равновесие. Измеряют тепловой поток через участок эпидермиса под аппликатором или температуру на контролируемой глубине TSkm, на которой устанавливается локальное термодинамическое равновесие, при фиксированном давлении аппликатора Psensor.
Для вычисления уровня глюкозы в крови проводят процедуру калибровки и определяют калибровочные параметры с целью определения постоянных коэффициентов, необходимых для вычисления теплового эффекта метаболизма локального участка живой ткани и вычисляют уровень глюкозы в крови, пропорциональный величине теплового метаболизма локального участка живой ткани.
Число датчиков мультисенсорного устройства, описанного выше, может быть увеличено за счет включения в состав устройства дополнительных сенсоров и датчиков физиологических параметров, характеризующих метаболизм локального участка живой ткани, в частности, датчиков биохимических параметров крови (например, содержания лактата в крови), кислотности крови, частоты сердечно сосудистых сокращений. Дополнительные датчики для через-кожных измерений могут быть установлены на внутренней стороне аппликатора и интегрированы с датчиками физиологических и климатических параметров, описанными выше, в единую измерительную схему в составе мультисенсорного устройства.
Методы ранней диагностики сахарного диабета.
Способ диагностики сахарного диабета по динамике сахарной кривой. Современные руководства по медицине определяют нарушение толерантности к глюкозе (НТГ), как концентрации глюкозы в крови в ходе перорального теста толерантности к глюкозе, лежащие в промежутке между нормальными и диабетическими значениями (через 2 часа после приема 75 г глюкозы — от 7,8 до 11,0 ммоль/л); концентрацию глюкозы в процессе теста толерантности измеряют инвазивным методом с помощью глюкометра по нескольким пробам крови, которые берутся в процессе перорального теста. Предполагается, что НТГ является признаком преддиабетического состояния, хотя не у всех лиц с НТГ развивается диабет. В США НТГ имеется у каждого десятого взрослого, причем его частота увеличивается с возрастом, достигая каждого четвертого среди лиц в возрасте 65-74 лет.
Метод изотермической калориметрии живой ткани, описанный выше, открывает новые возможности для создания методов ранней диагностики сахарного диабета, в частности, позволяет определить временную динамику сахара крови в процессе НТГ в режиме непрерывного мониторинга (сахарная кривая). На Рис. 46 а показана характерная непрерывная (с частотой 1 измерение в секунду) неинвазивная сахарная кривая здорового пациента в процессе НТГ, которая отличается от сахарных кривых диабетиков и характеризуется наличием участка роста концентрации сахара в крови (продолжительностью примерно 30 минут) и падающего участка (продолжительностью примерно 30 минут).
В процессе клинического исследования, выполненного на группе пациентов с сахарным диабетом, было обнаружено, что сахарные кривые пациентов с сахарным диабетом, регистрируемые непрерывно (с частотой 1 измерение в секунду) с помощью прототипа изотермического микрокалориметра, имеют скачкообразную динамику. Характерные сахарные кривые со скачкообразной временной динамикой, записанные в процессе клинического исследования, показаны на рисунке 46Ь. Уровень сахара крови у пациента Д с сахарным диабетом 1 типа (33 лет, муж.) изменяется самопроизвольно скачком в моменты времени 800 сек и 1400 сек.
Как известно, уровень глюкозы в крови у здоровых пациентов определяется уровнем инсулина, который вырабатывается клетками поджелудочной железы пропорционально уровню глюкозы в крови, динамика которой как правило имеет монотонный характер без скачков. Отклонение механизма поджелудочной железы от нормы может привести к неравномерному скачкообразному поступлению инсулина в кровь и, как следствие, к скачкообразной динамике сахара в крови. На Рис. 46 с показана скачкообразная динамика сахара крови в форме одиночного импульса, зарегистрированная с помощью прототипа изотермического микрокалориметра, и временная динамика уровня инсулина в крови, рассчитанная на основе сахарной кривой.
В процессе исследования было обнаружено, что скачкообразная динамика сахара крови может приводить к скачкообразной динамике концентрации сахара в межклеточной жидкости в форме последовательности одиночных импульсов; характерная сахарная кривая показана на рисунке 47. На рисунке 47 представлены характерные сахарные кривые (а, б) со скачкообразной временной динамикой у пациента с сахарным диабетом 2 типа (66 лет, муж.): характерная динамика сахара крови в форме временной последовательности одиночных импульсов.
Метод мониторинга сахара крови на основе метода изотермической калориметрии может применяться на практике для ранней диагностики сахарного диабета ( 1 и 2 типа) по особенностям скачкообразной динамики сахарной кривой.
Способ диагностики сахарного диабета на основе мониторинга энтальпии живой ткани. Метод изотермической микрокалориметрии живой ткани позволяет определить на ранней стадии сахарный диабет (пред диабет) пациентов по содержанию гиалуроновой кислоты в эпидермисе, которая определяется на основе мониторинга осмотического давления межклеточного вещества (или количества воды в межклеточном пространстве).
В процессе клинического исследования, выполненного с помощью прототипа изотермического микрокалориметра живой ткани, нами было установлено, что величина энтальпии межклеточного вещества у практически здоровых пациентов, значение которого определялось экспериментально (при заданной мощности внешнего теплового потока, обусловленного климатическими параметрами окружающей среды) на основе сравнения неинвазивных показаний прототипа с инвазивными показаниями сертифицированного глюкометра (метод калибровки), не изменяется или изменяется очень медленно со временем, с характерной постоянной времени, превышающей один месяц и более. Результат, полученный экспериментально, находится в хорошем согласии с выводами, полученными на основе теоретического исследования термодинамики конденсированного состояния биополимерной молекулы, описанной выше, которые предсказывают постоянство величины энтальпии в интервале параметров, соответствующем физиологической норме Рис. 22, 23. Межклеточное вещество, в области физиологической нормы, границы которой определяются критическим значением концентрации дисахаридов (мономеров) гиалуроновой кислоты (критическая контурная длина полимерной цепи), при физиологической температуре, находится в гетерофазном состоянии, в котором кристаллическая (глобулярная) фаза вещества находится в термодинамическом равновесии с ме-тае-таби-лвнен жидкой (расплавленная глобула) фазой, в которой концентрация мономеров соответствует концентрации насыщенного раствора полимерной цепи гиалуроновой кислоты. Величина энтальпии межклеточного вещества пациента определяется содержанием гиалуроновой кислоты, которое может изменятся при хронических заболеваниях. В частности, при возникновении диабетического состояния, содержание гиалуроновой кислоты может изменяться в результате изменения контурной длины (числа дисахаридов) полимерной цепи; поэтому, содержание гиалуроновой кислоты в межклеточном веществе является биохимическим параметром, мониторинг которого позволяет диагностировать на ранней стадии сахарный диабет.
Увеличение числа звеньев в полимерной цепи, эквивалентное введению в растворитель дополнительного количества дисахаридов гиалуроновой кислоты, при фиксированном объеме вещества, не приводит к увеличению его концентрации в жидкой фазе ( пересыщение раствора) - но приводит к увеличению числа мономеров в кристаллической фазе в процессе кристаллизации (процесс выделения из раствора твердой фазы). Увеличение объема вещества за счет увеличения объема растворителя (вода с содержанием глюкозы и ионов натрия) будет приводить к процессу обратному кристаллизации - растворению (переходу вещества из кристаллической фазы в жидкую). Процесс растворения, также, как и процесс плавления, приводит к процессу разрушения кристаллической решетки, который обычно сопровождается охлаждением раствора. Растворение может происходить в изотермических условиях, но в таком случае необходим подвод тепла из вне.
В процессе клинического исследования, выполненного на группе пациентов с сахарным диабетом, было установлено, что величина энтальпии межклеточного вещества, значение которого определялось на основе сравнения неинвазивных показаний прототипа прибора с инвазивными показаниями сертифицированного глюкометра (метод калибровки), может принимать у диабетиков (2 типа) аномальные значения - аномально низкие или аномально высокие; таким образом, энтальпия межклеточного вещества живой ткани пациентов с сахарным диабетом характеризуется 2 значениями энтальпии, соответствующими 2 разным состояниям межклеточного вещества с разными значениям величины энтальпии межклеточного вещества, которые могут у некоторых пациентов могут отличаться более чем на порядок.
Полученные результаты исследования привели к пониманию вывода, что аномально высокое значение энтальпии межклеточного вещества, наблюдаемые у пациентов с сахарным диабетом, связано с повышенным содержанием (избытком) гиалуроновой кислоты в межклеточном веществе эпидермиса исследованных диабетических пациентов. Как известно, при диабете 2 типа содержание гиалуроновой кислоты (НА) в межклеточном веществе повышается, в результате возрастания скорости синтеза НА в условиях гипергликемии (повышенного уровня сахара крови) и, как следствие, приводит к возникновению избыточного количества гиалуроновой кислоты в кристаллической (глобулярной) фазе межклеточного вещества эпидермиса, верхний слой которого характеризуется малым содержанием растворителя в межклеточном пространстве.
Изменение количества растворителя в межклеточном пространстве ткани под аппликатором, в процессе перехода в состояние локального термодинамического равновесия, может привести к фазовому переходу вещества из кристаллического (глобулярного) состояния в жидкое (расплавленная глобула) состояние с увеличением межклеточного объема в результате растворения кристаллической (глобулярной) фазы, находящейся в метастабильном состоянии; процесс растворения, протекает за счет подвода тепла, в объем ткани под аппликатором, потоком межклеточной жидкости. К нарушению термодинамического фазового равновесия межклеточного вещества также могут привести скачкообразное изменения концентрации глюкозы и минеральных ионов в крови.
В процессе клинического исследования у диабетиков 2 типа нами была обнаружена корреляция величины энтальпии межклеточного вещества с инсулинорезистентностью ткани: у диабетиков 2 типа с высокой инсулинорезистентностью наблюдаются аномально низкие значения величины энтальпии ткани, соответствующие преобладанию кристаллической фазы в межклеточном веществе; увеличение доли кристаллической компоненты в веществе приводит к увеличению резистентности межклеточного пространства, обусловленной увеличением коэффициентов переноса вещества для переноса глюкозы и инсулина из капилляра в клетку и увеличению доли связанной глюкозы. В агрегатном состоянии (расплавленная глобула) с аномально высоким уровнем осмотического давления доля свободной глюкозы в локальном объеме межклеточного вещества может увеличивается за счет уменьшения доли связанной глюкозы в кристаллической фазе без увеличения концентрации инсулина и, как следствие, может привести к увеличению концентрации глюкозы в межклеточной жидкости.
Величина энтальпии межклеточного вещества, таким образом, является индивидуальной характеристикой мышечной ткани пациента, имеющей высокую диагностическую ценность. Непрерывное измерение энтальпии межклеточного вещества путем мониторинга содержания гиалуроновой кислоты и/или мониторинга осмотического давления в процессе инсулиновой (или другой сахар понижающей) терапии может быть использовано на практике для ранней диагностики диабета, а также для диагностики в реальном времени инсулинорезистентности живой ткани пациентов с сахарным диабетом (и контроля эффективности сахаро понижающей терапии) на основе мониторинга содержания гиалуроновой кислоты в эпидермисе. На Рис. 49 представлена характерная временная динамика осмотического давления межклеточного вещества (характеризующего количество воды в межклеточном пространстве), которая регистрируется в процессе самопроизвольного перехода межклеточного вещества живой ткани под аппликатором в состояние локального термодинамического равновесия (соответствующего максимуму энтропии); переход живой ткани в новое состояние с высоким значением энтальпии, возникает в результате процесса растворения кристаллической (глобулярной) фазы межклеточного вещества, протекающего за счет подвода тепла потоком межклеточной жидкости, и сопровождается увеличением объема и осмотического давления межклеточного вещества. Осмотическое давление межклеточного вещества, соответствующее равновесному значению энтальпии, которое устанавливается в процессе перехода ткани под аппликатором в состояние локального термодинамического равновесия, превышает исходное значение осмотического давления (соответствующее исходному значению энтальпии) более чем на два порядка (в 100 раз). Причиной фазового перехода межклеточного вещества могут быть скачки уровня сахара в крови и возможно других биохимических и физиологических параметров, и внешних физических факторов (давление, тепловой поток и др.).
Как известно, при инсулинорезистентности чувствительность мышечных клеток к инсулину снижается. В результате нарушается способность глюкозы проникать в клетки мышечной ткани. Глюкоза накапливается в плазме крови. В ответ поджелудочная железа вырабатывает инсулин в еще большем количестве, и его содержание в крови увеличивается выше нормальных значений. В результате глюкоза откладывается в виде жира, ведь жировые клетки хорошо восприимчивы к инсулину, а глюкозе нужно куда-то деваться из крови. Создается своеобразный замкнутый круг.
Аномальное содержание (избыток) гиалуроновой кислоты в межклеточном веществе у диабетиков, обусловленное повышенной скоростью синтеза гиалуроновой кислоты, приводит к кристаллизации межклеточного вещества, которое сопровождается повышенным связыванием глюкозы в кристаллической фазе и увеличением коэффициентов переноса межклеточного вещества для переноса глюкозы и инсулина из капилляра в клетку, поэтому может быть одной из причин, приводящих к развитию сахарного диабета 2 типа и других сердечно-сосудистых заболеваний, связанных с диабетом хронических заболеваний. Фазовый переход межклеточного вещества в агрегатное состояние с аномально высоким значением осмотического давления также приводит к повышению инсулинорезистентности и сопровождается повышением кровяного давления за счет пережатия (охлопывания) капилляров, обусловленного повышением осмотического давления вещества, окружающего капилляр.
Таким образом, метод изотермической калориметрии позволяет по характеру временной динамики осмотического давления межклеточного вещества обнаружить на ранней стадии и предсказать наличие признаков инсулинорезистентности и диабетического состояния у не диагностированных пациентов 2 типа. Метод изотермической калориметрической спектроскопии, описанный выше, также позволяет определить на ранней стадии диабетическое состояние на основе спектральных измерений содержания гиалуроновой кислоты в локальном объеме живой ткани. Скачки осмотического давления межклеточного вещества, которые наблюдаются у пациентов с сахарным диабетом, могут приводить к скачкам кровяного давления. В частности, скачки осмотического давления внеклеточного вещества в сердце и мозге могут являться возможной причиной инфарктов и инсультов. Скачки осмотического давления в поджелудочной железе могут служить причиной неоднородной концентрации инсулина в крови, в результате скачкообразной динамики скорости образования инсулина в поджелудочной железе. Отсюда следует понимание вывода о природе взаимосвязи между сахарным диабетом и сердечно сосудистыми заболеваниями, которая сегодня доказана клинически. Метод изотермической калориметрии, описанный выше, также позволяет обнаружить на ранней стадии сердечно- сосудистые заболевания, обусловленные сахарным диабетом.
Воздействие некоторых внешних факторов, физиологических и физических, на ткань может приводить к обратимым переходам живой ткани из одного фазового состояния в другое. К числу таких факторов, относятся, в частности, мышечная нагрузка и температурные воздействия. К внешним воздействиям, которые вызывают обратимые переходы ткани изменения, относятся воздействия, которые приводят к обратимым изменениям фазового состояния межклеточного вещества. К числу таких внешних физических факторов относятся: внешнее давление; локальная декомпрессия; внешняя температура; электромагнитное излучение, вызывающее объемный нагрев ткани; слабый постоянный электрический ток; постоянное магнитное поле; локальная мышечная нагрузка на ткань и др. Метод изотермической микрокалориметрии, дополненный воздействием внешним физическим фактором, позволяет определить величину энтальпии и диагностировать на ранней стадии сахарный диабет, на основе измерения зависимости осмотического давления от внешнего физического фактора.
Нарушение толерантности к глюкозе.
Метод изотермической калориметрии живой ткани, описанный выше, позволяет определить НТГ и чувствительность ткани к инсулину по характеру временной динамики осмотического давления межклеточного вещества (количества воды в межклеточном пространстве), без определения абсолютной величины энтальпии (без калибровки). В процессе клинического исследования у диабетиков 2 типа нами была обнаружена характерная скачкообразная динамика осмотического давления межклеточного вещества, обусловленная скачкообразной динамикой концентрации глюкозы в межклеточном веществе с инсулинорезистентностью ткани: у диабетиков 2 типа с высокой инсулинорезистентностью наблюдаются аномально низкие значения величины энтальпии ткани, соответствующие преобладанию кристаллической фазы в межклеточном веществе.
Рис. 50. Характерные мониторинговые кривые осмотического давления межклеточного вещества здорового пациента и пациента с сахарным диабетом 2 типа. Временная динамика осмотического давления у пациента с сахарным диабетом имеет скачкообразный характер, обусловленный скачкообразной динамикой концентрации глюкозы в межклеточном веществе и в крови, в отличии от временной динамики здорового пациента, характеризующейся плавными монотонными изменениями, обусловленными плавными монотонными изменениями концентрации глюкозы в межклеточной жидкости и крови.
Следствием скачкообразной динамики осмотического давления межклеточного вещества, имеющим важное значение для практической медицины, является скачкообразный характер кровяного давления. Метод мониторинга осмотического давления применим для ранней диагностики сердечно сосудистых заболеваний, в частности, гипертонии.
Метод изотермической калориметрической спектроскопии, описанный выше, также позволяет определить на ранней стадии диабет и сердечно-сосудистые заболевания, связанные с сахарным диабетом, на основе спектральных измерений содержания гиалуроновой кислоты в локальном объеме живой ткани.
Способ измерения скорости метаболизма и оценка энергетической ценности принимаемой пищи.
Эпидемиологические исследования, проведенные в разных странах, указывают на тесную связь между НТГ и ожирением. Например, в исследовании, проведенном в США, было обнаружено, что средний ИМТ (избыточная масса тела) у лиц, у которых впоследствии развилось НТГ, был достоверно выше, чем у лиц с нормальным ИМТ. В исследовании, проведенном в Израиле, установили, что высокий ИМТ в анамнезе сопровождался повышенной частотой развития НТГ за период 10 лет.
Метод изотермической калориметрической спектроскопии, описанный выше, позволяет определить энергетическую ценность принимаемой пищи на основе спектральных измерений содержания глюкозы и триглицерида свободных жирных кислот в локальном объеме живой ткани. Энергетическая ценность или калорийность - это количество энергии, высвобождаемой в организме человека из продуктов питания в процессе пищеварения, при условии её полного усвоения. Энергетическая ценность продукта измеряется в килокалориях (ккал) или килоджоулях (кДж) в расчете на 100 г продукта. Килокалория, используемая для измерения энергетической ценности продуктов питания, также носит название «пищевая калория», поэтому, при указании калорийности в килокалориях приставку «кило» часто опускают. Пищевая ценность продукта - это содержание в нём углеводов, жиров и белков из расчёта на 100 грамм продукта.
Способ диагностики состояния кожи.
Метод изотермической калориметрии и спектроскопии, описанный выше, позволяет определить физиологическое состояние кожи на основе спектральных измерений содержания гиалуроновой кислоты и триглицерида свободных жирных кислот (и других биохимических компонентов) в локальном объеме живой ткани.
Примеры практического использования. Результаты клинического исследования.
Внешний вид прототипа изотермического калориметра живой ткани, с помощью которого были выполнены клинические исследования с целью подтверждения метода (proof of concept study) показан на рис. 46.
Оценка эффективности метода выполнена двумя разными методами, описанными в протоколе клинического исследования. Группа из 41 пациентов с сахарным диабетом (1 и 2 типа) для выполнения задачи исследования была разбита на две подгруппы из 27 пациентов (подгруппа 1) и 14 пациентов (подгруппа 2), в каждую из которых входят пациенты 1 и 2 типа. Выборка пациентов случайная.
Целью исследования с участием 27 пациентов из первой подгруппы было подтверждение эффективности метода, изучение воспроизводимости результатов тестов и оценка возможности индивидуальной калибровки. С каждым из пациентов было проведено 5-6 тестов продолжительностью 35 минут (с тремя инвазивными измерениями), в среднем 3 теста в течение дня. Всего на 27 пациентах с диабетом 1 и 2 типа было проведено 144 теста с суммарным числом 434 инвазивных измерения.
На Рис. 51 (а - д) показаны примеры сахарных кривых со скачкообразной временной динамикой: Рис. 51а (тест N° 6 пациент N° 24), Рис. 516 (тест N°1 пациент N°41), Рис. 51в (тест N°5 пациент1Ч°41), Рис. 51г (тест N°6 пациент1Ч°41). На всех графиках результаты инвазивных измерений показаны кружочками зеленого цвета, а результаты неинвазивного мониторинга фиолетовой кривой.
Показателем эффективности метода в первом методе оценки является корреляция, в интервале погрешности 15%, результатов неинвазивных измерений с результатами инвазивных измерений, при фиксированных значениях индивидуального масштабного коэффициента данного пациента (индивидуальная калибровка).
В рамках исследования было показано, что каждый пациент с сахарным диабетом характеризуется двумя значениями индивидуального масштабного коэффициента К01 и К02, которые имеют постоянное индивидуальное значение для данного пациента; однако, при этом, масштабный коэффициент изменяется в широком диапазоне значений от пациента к пациенту от К01 = 0,7 (для пациента N°l) до К01 = 480 (для пациента N° 25). Результаты тестов подгруппы 1 представлены на Рис. 52.
Результаты тестов полгруппы 1 (27 пациентов) представлены на Рис. 52.
В соответствии с международным стандартом ISO 15197 (раздел 6.3.3. Minimum system accuracy performance criteria; Data analysis of clinical study according to Clause 6.3.3 of ISO 15197:2013 [p 12, pdf]) приняты следующие критерии оценки точности инвазивных глюкометров:
95% результатов измерений должны попадать в зону А, границы которой определяются из следующих условий:
± 15% при значениях сахара, равных или превышающих 5,55 ммоль/литр;
± 0,83 ммоль/литр при значениях, меньших 5,55 ммоль/литр;
Целью исследования с участием 14 пациентов из второй подгруппы была оценка эффективности метода при измерении слепым методом. С каждым из пациентов было проведено 6 тестов продолжительностью 35 минут (с тремя инвазивными измерениями) в течение двух дней, из которых результаты первых 3 тестов (1,2,3) были использованы для калибровки. Для каждого испытуемого проводилась индивидуальная калибровка, в процессе которого по результатам первых 3 тестов (продолжительностью 35 минут) определялись значения индивидуальных масштабных коэффициентов данного пациента К01 и К02.
Следующие 3 теста (4, 5, 6) на следующий день проводились и обрабатывались слепым методом. Всего на 14 пациентах с сахарным диабетом 1 и 2 типа было проведено 83 теста с суммарным количеством инвазивных измерений 249. Результаты тестов представлены на Рис. 53т Результаты тестов подгруппы 2: 14 пациентов с диабетом 1 и 2 типа; 83 теста с суммарным количеством 249 инвазивных измерений. Кривые красного цвета ограничивают зону А. В зону А попадают 246 измерений из 249 или 98% результатов.
Таким образом, результаты сравнительных измерений, полученные на пациентах подгруппы 2 полуслепым и слепым методом, находятся в соответствии с требованиями стандарта ISO 15197 по точности. Результаты тестов, выполненных на группе из 41 пациентов (227 тестов, 683 инвазивных измерения), полученные путем объединения результатов подгруппы 1 и подгруппы 2, представлены на Рис. 53.
Результаты тестов объединенной группы: 42 пациентов с диабетом 1 и 2 типа; 227 тестов с суммарным количеством 683 инвазивных измерений. Кривые красного цвета ограничивают зону А, кривые коричневого цвета ограничивают зону В (± 25%).
В зону А + В попадают всего 654 измерений из 664 или 98,3% результатов.
Таким образом, результаты клинического исследования, выполненного на группе из 41 пациента с диабетом 1 и 2 типа, находятся в соответствии с требованиями стандарта ISO 15197 по точности.
Проблема фолдинга белка.
Фолдинг белка - процесс пространственной упаковки белковой молекулы, принятия белком строго определенной формы, в которой он выполняет свои функции; процесс самоорганизации белковой молекулы - самопроизвольное сворачивание полимерной цепи при определенных условиях в определенную пространственную структуру, схематически показан на Рис.1.
Способность природной полипептидной цепи к пространственной самоорганизации и обретению определенной молекулярной структуры, являющейся самой яркой особенностью белков. Процесс самоорганизации белков во многом пока неясен и представляет одну из крупнейших проблем современной науки. Известно, что во многом функции белков можно предсказать по их структуре, хоть и не всегда. Поэтому актуальной научной проблемой является предсказание структуры и, как следствие функции белка, по последовательности аминокислот в полимерной цепи.
Молекулы белков представляют собой линейные полимеры, состоящие из остатков аминокислот (которые являются мономерами), также в состав белков могут входить модифицированные аминокислотные остатки и компоненты не аминокислотной природы, например гликопротеины, характеризующиеся низким содержанием углеводов, углеводный остаток (олигосахарид, имеющий нерегулярную структуру и содержащий глюкозу, маннозу, галактозу и их аминопроизводные, а также N-ацетилнейраминовую кислоту) присоединен к аминокислотам белковой цепи либо N -гликозидной связью - к амидному азоту аспарагина, либо О- гликозидной связью - к гидроксил группе остатков серина, треонина, гидроксилизина. При образовании белка в результате взаимодействия a-карбоксильной группы (-СООН) одной аминокислоты с a-аминогруппой (-NH2) другой аминокислоты образуются пептидные связи. Концы белка называют N- и С-концом, в зависимости от того, какая из групп концевого аминокислотного остатка свободна: -NH2 или -СООН, соответственно.
Как известно, молекула глюкозы может образовать гликозидную валентную связь также с аминокислотами белковых молекул. В гликопротеинах, характеризующихся низким содержанием углеводов, углеводный остаток (олигосахарид, имеющий нерегулярную структуру и содержащий глюкозу, маннозу, галактозу и их аминопроизводные, а также N -ацетилнейраминовую кислоту) присоединен к аминокислотам белковой цепи либо N -гликозидной связью - к амидному азоту аспарагина, либо О-гликозидной связью - к гидроксил группе остатков серина, треонина, гидроксилизина. Структурные формулы гликозидной связи с аминокислотами показаны на Рис.61
Как показано, конфигурация тетрамера в биополимерной молекуле гиалуроновой кислоты образуется с участием ионов натрия, концентрация которых в межклеточном пространстве много больше концентрации ионов калия.
С другой стороны, как известно, ионный состав клеток, до тех пор, пока они проявляют свойства живого, отличается от ионного состава окружающей среды. Наиболее существенным отличием является асимметричное распределение одновалентных ионов Na+H К+: клетки активно накапливают К и выбрасывают в окружающую среду Na. Так создается разность концентраций одновалентных катионов на клеточной мембране.
Отсюда следует понимание вывода, что ионом одновалентного металла М, образующим ионную связь с заряженным звеном полимерной цепи -Rb-M белковых молекул, локализованных в плазматической мембране и цитоплазме клетки, является одновалентный ион К+\
-Rb-M - -Rb- К
Универсальная модель биополимерной молекулы, на основе которой описаны свойства макромолекулы гиалуроновой кислоты, которая как было отмечено, является уникальным модельным объектом для исследования свойств биополимерных молекул, позволяет предсказать на основе точного статистического описания термодинамические свойства произвольной природной макромолекулы, в частности макромолекул белков и ферментов.
В общем виде, структуру биополимерной молекулы белка, способной к пространственной самоорганизации и обретению устойчивой молекулярной гетерофазной структуры, обусловленной слабыми объемными взаимодействиями не валентной природы, можно описать следующим определением: линейная полипептидная цепь из последовательно соединенных амидной (пептидной) связью аминокислот -NH-CH(R)-CO-, повторяющийся мономер которого состоит из двух (или более) типов мономерных звеньев - аминокислот ARa и ARb, с отличающимися боковыми остатками Ra , Ri,. один из которых (например, звено ARb) содержит заряженную (отрицательно или положительно) группу Rb, а боковой остаток R,, второго звена (A R,,) является незаряженным. В состав растворителя, основным компонентом которого является вода, входят как минимум 3 компоненты: один компонент - молекула (мономерная) субстрата (растворителя) S, например молекула глюкозы, и два (или несколько) низкомолекулярных одновалентных ионов М\ и М2, например ионы натрия и калия, обладающих разным сродством к мономеру, электрический заряд которых противоположен заряду бокового остатка ARb, мономерная молекула растворителя (субстрата) S может образовать две водородные связи с мономерными звеньями полимерной цепи - Ra -S- Rb - ; -Ra-S-Rb - Ra -S- ; -S-Rb ; низкомолекулярные одновалентные ионы M\ и Мг могут образовать ионную связь с заряженными звеньями полимерной цепи -Rb-M\. Энергия продольных ковалентных связей Ео соседних звеньев полимерной цепи много больше характерной тепловой энергии, при физиологических температурах Ео/квТ> >1. Энергия поперечных водородных связей звеньев Ra и Rb с молекулой мономера (субстрата) S растворителя много меньше энергии продольных валентных связей Es « Ео полимерной цепи. Низкомолекулярный ион М\ может адсорбироваться мономером полимерной цепи Rb, с образованием слабой ионной связи —Rb— Mi.
В общем случае, повторяющийся фрагмент полимерной цепи может состоять из одинаковых пар - А- В- или нескольких типов повторяющихся пар мономерных звеньев -A-B-, -С-В-, ... , обладающих способность образовать водородные связи с молекулами субстрата.
Водородные связи, определяющие наиболее вероятную конфигурацию связанной пары элементарных цепочек, соответствующую минимальной свободной энергии объемных взаимодействий, и как следствие наиболее вероятную пространственную конфигурацию тетрамера, образованного парой не соседних мономеров полимерной цепи и парой молекул растворителя с участием ионов, можно определить как сопряженные не валентные связи или сопряженные водородные связи биополимерной молекулы. Элементарная ячейка, соответствующая связанной паре элементарных цепочек (в ее наиболее вероятной конфигурации), образует сопряженную систему - замкнутую систему сопряженных водородных связей с делокализованной электронной плотностью; как известно, общая особенность всех сопряженных систем - растекание электронной плотности водородных связей по всей сопряженной системе.
Структурные формулы аминокислот, образующих полипептидные цепи белковых молекул, показаны в таблице на рисунке 55.
Как известно, магний функционирует в качестве кофактора в более чем 300 известных ферментативных реакций, включенных в широкий спектр метаболической активности. Выработка энергии, метаболизм глюкозы, окисление жирных кислот и активизация аминокислот - везде требуется магний. Магний - один из важнейших минералов, являясь основным внутриклеточным элементом, активизирует ферменты, регулирующие углеводный обмен, стимулирует образование белков, регулирует хранение и высвобождение энергии в АТФ, снижает возбуждение в нервных клетках, расслабляет сердечную мышцу.
Как было показано, тетрамер в объеме макромолекулы, полимерная цепь которой содержит отрицательно заряженные группы, может образоваться только с участием одновалентного иона (Na, К). Двух валентный ион металла (Mg2+, Ми2+) не может участвовать в образовании тетрамера - сшивка из 2 не соседних мономеров полимерной цепи, 2 молекул субстрата и 2 одновалентных катионов растворителя, однако может образовать сшивку между двумя не соседними мономерами полимерной цепи без участия молекул растворителя. На рисунке 62 схематично показана сшивка, образованная 2 валентным ионом магния между не соседними мономерами полимерной цепи, посредством ионной связи.
Общепринятая классификация. В соответствии с общепринятой классификацией, выделяют 4 уровня структурной организации белков: первичную, вторичную, третичную и четвертичную структуры белка. Первичная структура (последовательность аминокислотных остатков) полипептида определяется структурой его гена или генетическим кодом, а структуры более высоких порядков формируются в процессе сворачивания белка. Хотя пространственная структура белка в целом определяется его аминокислотной последовательностью, она является довольно лабильной и может зависеть от внешних условий, поэтому более правильно говорить о предпочтительной или наиболее энергетически выгодной конформации белка.
Первичная структура — последовательность аминокислотных остатков в полипептидной цепи, которую, как правило, описывают, используя однобуквенные или трёхбуквенные обозначения для аминокислотных остатков. Важными особенностями первичной структуры являются консервативные мотивы - устойчивые сочетания аминокислотных остатков, выполняющие определённую функцию и встречающиеся во многих белках. Консервативные мотивы сохраняются в процессе эволюции видов, по ним часто удаётся предсказать функцию неизвестного белка.
Вторичная структура - локальное упорядочивание фрагмента полипептидной цепи, стабилизированное водородными связями. Ниже приведены некоторые самые распространённые типы вторичной структуры белков: а - спирали - плотные витки вокруг длинной оси молекулы. Один виток составляет 3,6 аминокислотных остатка, шаг спирали равен 0,54 нм (на один аминокислотный остаток приходится 0,15 нм). Спираль стабилизирована водородными связями между Н и О пептидных групп, отстоящих друг от друга на 4 звена; b - листы (складчатые слои) - несколько зигзагообразных полипептидных цепей, в которых водородные связи образуются между относительно удалёнными друг от друга (0,34 нм на аминокислотный остаток) аминокислотами в первичной структуре или разными цепями белка (а не близко расположенными, как имеет место быть в а - спирали).
Третичная структура - пространственное строение полипептидной цепи, образуется при свертывании полипептидной в компактную трехмерную систему (в случае ферментов это, как правило, сферическая глобула). Структурно состоит из элементов вторичной структуры, стабилизированных различными типами взаимодействий, в которых гидрофобные взаимодействия играют важнейшую роль.
Как показано выше, объемные взаимодействия простой полимерной цепи с растворителем можно описать, как парное объемное взаимодействие элементарных цепочек, образующих связанную пару, наиболее вероятная конфигурация которой показана на Рис. 5а. Наиболее вероятная конфигурация взаимодействующих элементарных цепочек реализуется в результате спаривания цепочек посредством водородных связей в конфигурации R4 (/ = 4) тетрамера; каждая элементарная цепочка находится в своей наиболее вероятной линейной конфигурации с максимальной энтропией, соответствующей минимуму свободной энергии взаимодействия цепочки с растворителем.
Исследования принципов укладки белков показали, что между уровнем вторичной структуры и атомарной пространственной структурой удобно выделять ещё один уровень — мотив укладки (архитектура, структурный мотив). Мотив укладки определяется взаимным расположением элементов вторичной структуры (a-спиралей и b-тяжей) в пределах белкового домена - компактной глобулы, которая может существовать или сама по себе или входить в состав более крупного белка наряду с другими доменами.
Четвертичная структура (или субъединичная, доменная) — взаимное расположение нескольких полипептидных цепей в составе единого белкового комплекса. Белковые молекулы, входящие в состав белка с четвертичной структурой, образуются на рибосомах по отдельности и лишь после окончания синтеза образуют общую надмолекулярную структуру. В состав белка с четвертичной структурой могут входить как идентичные, так и различающиеся полипептидные цепочки. В стабилизации четвертичной структуры принимают участие те же типы взаимодействий, что и в стабилизации третичной. Надмолекулярные белковые комплексы могут состоять из десятков молекул.
Домен белка - элемент третичной структуры белка, представляющий собой достаточно стабильную и независимую подструктуру белка, фолдинг которой проходит независимо от остальных частей; третичная структура белковой молекулы образуется при свертывании полипептидной в компактную трехмерную систему (в случае ферментов это, как правило, сферическая глобула).
В состав домена обычно входит несколько элементов вторичной структуры. Сходные по структуре домены встречаются не только в родственных белках (например, в гемоглобинах разных животных), но и в совершенно разных белках. Достаточно часто доменам присваивают отдельные названия, так как их присутствие непосредственно влияет на выполняемые белком биологической функции — к примеру, Са2+-связывающий домен кальдомулина, гомеодомен, отвечающий за связывание с ДНК в различных факторах транскрипции и др.
В олигомерных белках, каждая из полипептидных цепей, образующих субъединицу, характеризуется свой вторичной и третичной структурой. Однако у этих белков есть еще один конформационный уровень, называемый четвертичной структуро ; под этим термином понимают расположение полипептидных цепей, входящих в состав отдельных полипептидных цепей, относительно друг друга, т.е. способ их совместной укладки и упаковки с образованием нативной конформации олигомерного белка.
Так как домены достаточно «автономны» в формировании своей структуры и выполнении своей функции, с помощью генной инженерии можно «пришить» к одному из белков домен, принадлежащий другому (создав таким образом белок - химеру). Такая химера при удаче будет совмещать функции обоих белков. Так, например, путём слияния ДНК-связывающего домена Cas9 с различными регуляторными доменами удалось получить искусственные факторы транскрипции (crisprTF), избирательно направляемые на нужные участки генома с помощью изготовленных на заказ «РНК-гидов». С помощью Саэб-домсна можно также сконструировать искусственные эндонуклеазы рестрикции, репрессоры, ферменты, модифицирующие эпигеном, такие как ДНК - метилазы и деметилазы.
Метод расчета пространственной структуры белка. Наиболее вероятная линейная конфигурация элементарной цепочки отличается от конфигурации первичной структуры полимерной цепи и образуется в результате взаимодействия полимерной цепи с растворителем в равновесной конфигурации макромолекулы, соответствующей минимальной свободной энергии объемных взаимодействий. С другой стороны, объем вещества в конденсированном состоянии, при заданных внешних условиях (давлении, температуре и других характеристиках), определяется исключительно силами объемных взаимодействий, поэтому трехмерную пространственную конфигурацию биополимерной молекулы можно рассчитать на основе конфигурации связанной пары элементарных цепочек, характеризующей равновесную конфигурацию элементарного объемного взаимодействия.
В случае биополимерной молекулы с простой полимерной цепью, не содержащей субъединиц (протомеров), фолдинг белковой молекулы - процесс формирования вторичной структуры, с пространственной укладкой в компактную глобулу, происходит самопроизвольно, как фазовый переход статистической системы многих взаимодействующих частиц в пространственную конфигурацию с гетерофазной структурой с минимальной свободной энергией объемных взаимодействий. Внутримолекулярную гетерофазную структуру и объем домена белковой молекулы с простой цепью с одной субъединицей можно рассчитать, как показано, на основе конфигурации связанной пары элементарных цепочек взаимодействия.
В общем случае, цепь биополимерной молекулы (например, олигомерный белок) может иметь более сложную первичную структуру, состоящую из нескольких соединенных между собой простых цепей (субъединиц, протомеров). Олигомерные белки - белки, содержащие 2 и большее число полипептидных цепей (до нескольких тысяч субъединиц). В олигомерных белках каждая из полипептидных цепей, образующая субъединицу (протомер), характеризуется своей вторичной и третичной пространственной структурой. Примеры биополимерных молекул, состоящих из нескольких субъединиц, показаны на рисунке 56.
Полипептидные цепи в олигомерных белках могут быть либо одинаковыми, либо разными. Число полипептидных цепей в олигомерном белке можно установить по числу аминоконцевых остатков, приходящихся на одну молекулу белка. Олигомерный белок, состоящий из четырех полипептидных цепей, скажем гемоглобин, должен иметь четыре концевых остатка, по одному на каждую цепь. В молекуле инсулина имеется две цепи, связанные друг с другом ковалентными поперечными связями.
Некоторые белки (сложные белки) кроме полипептидной части содержат ещё и небелковую - простетическую группу, которая может быть связана с белковой частью как ковалентной, так и слабой нековалентной связью. На рис. 56 представлена четвертичная структура - взаимное расположение субъединиц белка в пространстве, характерна для белков, состоящих из нескольких полипептидных цепей; возникает в результате ассоциации нескольких субъединиц белка в пространстве. В олигомерных белках, каждая из полипептидных цепей, образующих субъединицу, характеризуется свой вторичной и третичной структурой.
Взаимодействие между субъединицами макромолекулы. Как известно из опыта, трехмерная пространственная структура сложных белков, состоящих из нескольких субъединиц, может изменяться в процессе взаимодействия полимерных цепей, принадлежащих разным субъединицам, с молекулами растворителя. На Рис.57 показана схема, поясняющая эффект изменения конформации молекулы фермента гексокиназы в процессе связывания молекулы глюкозы.
Объемное взаимодействие между соседними доменами возникает в результате объемных взаимодействий между мономерами (принадлежащими участкам цепей), принадлежащими разным субъединицам: молекула субстрата образует водородную связь с двумя мономерами, которые принадлежат разным субъединицам и имеют разные знаки электрического заряда. Изменение трехмерной пространственной структуры белковой молекулы гексокиназы, состоящей из двух доменов, возникает в результате фазового перехода вещества в локальной области между соседними доменами (соответствующими субъединицам) в гетерофазное конденсированное состояние. Статистический механизм перехода вещества в области между соседними доменами в гетерофазное состояние описан выше в разделе Физика конденсированного состояния полимерной молекулы.
Взаимодействие между биомолекулами.
В общем случае, как известно из опыта, биополимерные молекулы могут взаимодействовать не только с малыми молекулами, но могут образовать комплексы с биомолекулами (чаще всего белком, например клеточным рецептором, но иногда, например, с ДНК) и производить, вследствие такого связывания, те или иные биохимические, физиологические или фармакологические эффекты. Химическое соединение (которое часто, но не всегда, малая молекула), которое образует комплекс с той или иной биомолекулой в биохимии и фармакологии называется лиганд. В случае связывания лиганда с белком лиганд обычно является малой сигнальной молекулой, связывающейся со специфическим участком _ связывания на белке -мишени (например, на рецепторе). В случае связывания лиганда с ДНК лиганд обычно также является малой молекулой или ионом, или белком, который связывается с двойной спиралью ДНК. Связывание или ассоциация лиганда с рецептором (так называемый «докинг» лиганда в специфическую «нишу» в рецепторе) обычно обратима и кратковременна. Обратный процесс называется диссоциацией лиганда из связи с рецептором.
Исследования биополимерных комплексов, возникающих в результате ассоциации нескольких макромолекул, связанных не валентными связями, привели к формированию на рубеже 80-90-х годов новой междисциплинарной области знаний, получившая название " супрамоле кулярная химия" - это химия межмолекулярных связей, изучающая ассоциацию двух и более химических молекул, а также структуру подобных ассоциатов. Она лежит за пределами классической химии, исследующей структуру, свойства и превращения отдельных молекул. Если последняя имеет дело главным образом с реакциями, в которых происходит разрыв и образование валентных связей, то объектами изучения супрамолекулярной химии служат не валентные взаимодействия - водородная связь, электростатические взаимодействия, гидрофобные силы, структуры "без связи".
Простейший пример супрамолекулярных структур — это комплексы типа «хозяин-гость». Хозяином (рецептором) обычно выступает большая органическая молекула с полостью в центре, а гостем — более простая молекула или ион. Например, циклические полиэфиры различного размера (краун -эфиры) довольно прочно связывают ионы щелочных металлов.
Для супрамолекулярных структур характерны следующие свойства: 1. наличие не одного, а нескольких связывающих центров у хозяина (в краун-эфирах эту роль выполняют атомы кислорода, обладающие не поделенными электронными парами); 2. комплементарность: геометрические структуры и электронные свойства хозяина и гостя взаимно дополняют друг друга (в краун-эфирах это проявляется в том, что диаметр полости должен соответствовать радиусу иона). Комплементарность позволяет хозяину осуществлять селективное связывание гостей строго определенной структуры. В супрамолекулярной химии это явление называют «молекулярным распознаванием» (англ. - molecular recognition). 3. Комплексы с большим числом связей между комплементарными хозяином и гостем обладают высокой структурной организацией.
Примером супрамолекулярной биохимической структуры являются ферменты - молекулы- хозяева. Активный центр каждого фермента устроен таким образом, что в него может попасть только то вещество (субстрат), которое соответствует ему по размерам и энергии; с другими субстратами фермент реагировать не будет. Другим примером супрамолекулярных биохимических структур служат молекулы ДНК, в которых две полинуклеотидные цепи комплементарно связаны друг с другом посредством множества водородных связей. Каждая цепь является одновременно и гостем, и хозяином для другой цепи.
Физика гетерофазного конденсированного состояния биополимерных молекул, описанная выше, позволяет взаимодействие молекул в супрамолекулярных комплексах. Взаимодействие между макромолекулами с образованием супрамолекулярных структур, происходит по механизму, аналогичному механизму взаимодействия между субъединицами олигомерного белка, в результате образования водородных связей между молекулой лиганда и белковой молекулой и ионных связей между ионами растворителя и заряженными участками мономеров полимерной цепи.
Метод определения пространственной структуры сложной макромолекулы.
Трехмерная доменная пространственная структура белка рассчитывается с помощью метода, описанного выше, и состоит из следующих шагов:
- определяют число субъединиц по числу аминоконцевых остатков;
- определяют первичную структуру полипептидной цепи каждой субъединицы (протомера);
- определяют структуру простетической группы;
- определяют структуру элементарной цепочки взаимодействия для каждой субъединицы; для этого определяют ион - молекулярную пару растворителя “ молекула субстрата - одновалентный ион” для каждой субъединицы полимерной цепи;
- определяют третичную структуру каждого независимого домена; для этого для каждой субъединицы вычисляют константу равновесия, энергию активации и определяют гетерофазную структуру и объем независимого белкового домена (объем локализации субъединицы полимерной цепи);
- для каждой субъединицы определяют расположение в цепи мономеров, определяющих взаимодействие между субъединицами;
- определяют структуру связанной пары элементарных цепочек, характеризующих взаимодействие между субъединицами.
- трехмерную пространственную конфигурацию (четвертичную структуру) определяют как наиболее вероятную пространственную конфигурацию независимых доменов, соответствующую минимальной свободной энергии объемных взаимодействий в локальной области между доменами.
Г етерофазный-биологический катализ.
Известным эффективным способом ускорения протекания химической реакции неорганических молекул, который широко применяется на практике, является гетерофазный катализ - изменение скорости химической реакции при воздействии катализаторов, образующих самостоятельную фазу и отделенных от реагирующих веществ границей раздела. Например, наиболее распространенный случай, когда твердый катализатор (контакт) ускоряет реакцию между газообразными реагентами или реакцию в растворе. Каталитическая реакция протекает обычно на поверхности твердого катализатора и обусловлена активацией молекул реагентов при взаимодействии с поверхностью. Поэтому для осуществления гетерофазного катализа необходима адсорбция компонентов реакционной смеси из объемной фазы на поверхности катализатора.
Химическими катализаторами, ускоряющими жизненно важные биохимические реакции (около десяти тысяч), протекающие в клетке, являются ферменты - белковые молекулы, полимерная (полипептидная) цепь которых состоит из аминокислот.
Основными признаками ферментативного катализа, отличающими его от лабораторного и производственного катализа, являются строгая избирательность и высокая скорость химической реакции.
До недавнего времени считалось, что обязательным компонентом всех ферментов являются белки. Однако были открыты и стали объектом интенсивных исследований ферменты, построенные из молекул рибонуклеиновых кислот (рибозимы). Интерес к этой группе ферментов резко усилился в связи с разработкой методов молекулярной селекции нуклеиновых кислот, позволившей, в частности, начать направленное конструирование рибозимов с разнообразными типами каталитической активности. Согласно современным представлениям (ИЮПАК), специфичность и каталитическая активность молекулы фермента определяется активным центром - особым участком молекулы с уникальной комбинацией аминокислотных остатков (и возможно небелковых групп), обеспечивающих непосредственное связывание молекулы фермента с молекулой субстрата и прямое участие в катализе. Процесс связывания молекулы субстрата активным центром фермента сопровождается изменением пространственной структуры ферментной молекулы. Активный центр фермента, как правило, имеет форму узкого углубления или щели, возникающей между соседними доменами. Схема, поясняющая эффект изменения конформации молекулы фермента гексокиназы в процессе связывания молекулы глюкозы показана на Рис. 57.
Наиболее часто в состав активных центров ферментов входят функциональные группы таких аминокислот:
ОН - группы серина, треонина, тирозина;
SH - группы цистеина;
NH - группа гистидина;
СООН - группа глутамата и аспартата;
NH2 - группы аргинина и лизина.
Физическая природа явления биологического катализа в настоящее время неизвестна и относится к числу нерешенных проблем современной науки.
Физика гетерофазного конденсированного состояния биополимерной молекулы, основные положения которой описаны выше, позволяет объяснить и описать на основе точного статистического метода основные свойства биологического катализа - высокую скорость химической реакции и строгую избирательность. биополимерная молекула с гетерофазной структурой, обладающая избирательностью к молекуле G субстрата, способна катализировать биохимическую реакцию с участием этой молекулы. Ускорение биохимической реакции происходит за счет сближения молекул в кристаллической фазе биополимерной молекулы с гетерофазной структурой. В объеме элементарной ячейки биополимерной молекулы с гетерофазной структурой, как было показано, 1/3 от общего числа молекул субстрата находится в свободном состоянии в растворителе, а оставшиеся 2/3 молекул субстрата находятся в связанном состоянии с мономерами полимерной цепи фермента. Концентрации всех компонентов системы в конденсированной кристаллической (глобулярной) фазе увеличиваются кратно значению параметра порядка, увеличение которого приводит к многократному возрастанию числа эффективных столкновений за счет эффекта сближения.
Скорость гетерофазного биологического катализа.
Рассмотрим физико-химический механизм биологического катализа, на примере фермента гексокиназа и его изомера глюкокиназа, играющих важную роль в биохимической регуляции метаболизма глюкозы в клетке живой ткани.
Ферментативная реакция первой стадии гликолиза, которая катализируется обоими этими ферментами (гексокиназой и глюкокиназой), имеет вид:
АТФ +- D - глюкоза
Figure imgf000083_0001
АДФ +- D - глюкоза-6-фосфат, AG = - 4,0 ккал. (50)
Скорость химической реакции, в общем случае, определяется законом действующих масс (Гульдберг и Вааге) - скорость химической реакции А+В Ά С. с образованием нового вещества С из двух веществ А п В, пропорциональна произведению концентраций реагирующих веществ (при прочих одинаковых условиях):
W= - k*[A][B], (51) где к - константа скорости, которая не зависит от концентраций А и В.
Кинетическую схему реакции (50), в процессе которой происходит перенос фосфатной группы Р от молекулы АТФ к молекуле глюкозы G (которая не может протекать самопроизвольно без катализатора) можно представить в виде следующей ферментативной реакции:
Figure imgf000083_0002
где Е - мономер полимерной цепи, который может образовать слабую ионную связь с одновалентным ионом М растворителя или водородную связь с молекулой субстрата G растворителя.
Ферментативная реакция (51), в рамках рассматриваемого механизма, протекает в несколько этапов в активном центре ферментной молекулы - локальной области внутримолекулярного пространства между доменами, соответствующими субъединицам макромолекулы.
На первом этапе, схематически показанном на Рис. 58а, происходит диффузия молекул АТФ (показана только фосфатная группа АТФ красным) и глюкозы G из растворителя в область активного центра фермента (область газообразной фазы гетерогенной ферментной молекулы с низкой концентрацией субстрата).
На втором этапе (Рис. 58 Ь), происходит абсорбция молекулы АТФ комплексом тетрамера в кристаллической фазе:
Figure imgf000083_0003
Комплекс тетрамера можно определить, как субстрат - ферментный комплекс, который для рассматриваемой реакции можно обозначить символом E2G2, где G обозначает молекулу глюкозы.
Этот этап является обратимым и не сопровождается какими-либо химическими изменениями субстрата.
Переход фосфатной группы Р от молекулы АТФ к молекуле глюкозы G, которая находится в связанном состоянии в комплексе тетрамера E2G2 в кристаллической (глобулярной) фазе (Рис.44Ь), происходит в процессе химической реакции, которую схематично можно представить в виде:
P + GE -^ PGE. (53b)
На третьем этапе, схематически показанном на Рис. 58 d,g происходит превращение комплекса PGE в продукт GP в результате конформационного перехода тетрамера, который сопровождается переходом молекулы GP через энергетический барьер, разделяющий кристаллическую (глобулярная) фазу, с повышенной концентрацией субстрата, и жидкую (расплавленная глобула) фазу, с пониженной концентрацией субстрата, с последующей десорбцией продукта в результате разрушение комплекса тетрамера (переход из жидкой фазы в газообразную):
PGE -^ PG + E.
В рамках модели биополимерной молекулы с гетерофазной структурой, описанной выше, в образовании комплекса GE участвуют слабые не ковалентные взаимодействия - ионные и водородные связи, что согласуется с общепринятыми представлениями, в рамках которых предполагается, что в образовании фермент-субстратного комплекса (ФСК, комплекс Михаэлиса) принимают участие не ковалентные взаимодействия. На рис. 58 изображены основные этапы ферментативной реакции: а) диффузия молекулы АТФ из жидкой фазы в кристаллическую фазу; Ь) присоединение фосфатной группы (красный) к молекуле D- глюкозы (желтый) с образованием молекулы G6P в результате химической реакции в кристаллической фазе фермента; d) конформационный переход тетрамера со связанной молекулой G6P из кристаллической фазы в жидкую через энергетический барьер, разделяющий жидкую фазу с кристаллической; g) разрушение тетрамера в жидкой фазе с освобождением молекулы продукта G6P.
Скорость W ферментативной реакции (51) можно вычислить по формуле (50), если известна константа скорости; константу скорости к можно вычислить, как будет показано ниже, как отношение двух независящих от концентраций констант с помощью выражения: к = къ/Ко, где къ - скорость прохождения продукта PG через энергетический барьер, разделяющий кристаллическую фазу с жидкой; Ко - константа равновесия процесса образования тетрамера из 2 димеров; в этом случае, УКо - константа диссоциации тетрамера с образованием 2 димеров. Здесь учитывается, что в момент достижения вершины энергетического барьера, на которой реализуется конфигурация R2 тетрамера, взаимное притяжение между димерами тетрамера определяется только вкладом внутренней энтропии, величина которой определяет величину константы диссоциации.
Формулу для константы скорости к можно вывести из следующих соображений.
Реагенты G (молекула глюкозы) и Е (мономер полимерной цепи) находятся в равновесии с димерами EG и тетрамерами E2G2. Константа Кс диссоциации тетрамера с образованием 2 димеров определяется уравнением:
Кс = У Ко = [E2G2]/[GE][GE],
Реагенты GP и Е находятся в равновесии с активированным комплексом EGP (тетрамер- фосфатная группа):
Е + GP -Э EGP -Э Е + GP. (53d)
Константа равновесия КСР реакции (53Ь) определяется уравнением:
KGP = [EGP]/[GP][E],
Константа равновесия реакции G + Р -Э GP, которая не может протекать самопроизвольно, равна константе равновесия ферментативной реакции (53 d):
[GP]/[G][P] = [EGP]/[GP] [Е] = [E2G2]/[GE] [GE] = KGP.
Отсюда следует, что уравнение (50) для скорости реакции можно решить относительно [GP] : W = [GP] х [скорость перехода через барьер] = [GP] xfe, = къхКс х [G] [Р] или W = fexKcpx [G] [Р] = (h/Ko) х [G] [Р] = jfcx [G] [Р] (54)
Скорость реакции (50) равна: к = къ/Ко. (54а)
Константа равновесия Ко определяется, как показано, с помощью выражения (8):
Ко = (1/VQ )хехр ( Еь/квТ) = (1/VQ )*ехр ( Stetr Т/квТ) = (1/VQ )*ехр (Stetr/кв), где Еъ - энергия связи молекулы глюкозы с тетрамером, которая определяется внутренней энтропией тетрамера
Figure imgf000085_0001
VQ - квантовый объем молекулы глюкозы, который определяется с помощью выражения [14]:
VQ = ( It2/2pM квТ) = 5.32/ 102i/(MT) 2c\T= 3.646/ 1024см3. где М - молекулярный вес глюкозы (субстрата); h - постоянная Планка.
Скорость кь прохождения молекулы GP через энергетический барьер, разделяющий изомерные конформации тетрамера в жидкой и кристаллических фазах, определяется двумя факторами - высотой энергетического барьера Еа, величина которой определяет вероятность nin, прохождения молекулы через барьер, и константой v, имеющей размерность частоты, соответствующей частоте электромагнитного кванта с энергией квТ: кь = vxwb = vxexp (-Еа/кцТ). где v = квТ/h·, h - константа Планка.
Водородная связь, как тип ковалентной валентной связи с делокализованной электронной плотностью, имеет электромагнитную природу. Энергия водородной связи определяется энергией парного взаимодействия молекулы глюкозы с мономером полимерной цепи, которая как показано, квантуется дискретной порцией энергии, кратной кванту тепловой энергии квТ. Частота колебаний V валентной связи, в общем случае, определяется частотой электромагнитного кванта, которую можно вычислить из требования, что в равновесном состоянии квант электромагнитной энергии валентной связи hv равен кратному числу квантов тепловой энергии ПУ к вТ. по отношению к которому устанавливается равновесие между электронной парой (осциллятором) и термостатом: nhv = пквТ\ V = квТ/h = 0.75 К)17с, где п = 1. 2. 3, кратность обменного кванта энергии электромагнитного взаимодействия по отношению к кванту тепловой энергии квТ.
Выражение для константы скорости химической реакции имеет вид: к =къ/К0 =[VQxexp ( 8Шг/кв)\х(квТ/1г)хехр (- Еа/квТ) =V<^{kBTlh)*exp\-{Ea-SmrT)lkBT] (54а)
Выражение (54) для скорости реакции (50), таким образом, имеет следующий вид:
И/= (къ/Ко) х [G] [Р] = I V<y(kiiT/h) exp \-(Еа - SmrT)/kBT\ } c [G] [Р] . (54d)
Формула (54d) для скорости реакции реагентов [G] и [Р] является универсальной, применимой для расчета скорости произвольной биохимической реакции, катализатором которой является биополимерная молекула с гетерофазной структурой с избирательностью к молекуле субстрата G.
Следует отметить, что формулу (54 а) можно привести к виду, совпадающему с формулой Аррениуса: k = VQ c[<?cr (5 tetr/kB)] (kBT/h)xexp (- Еа/квТ) = Аехр (- Еа1квТ) , где А = VQ c[<?cr (8шг/кв)\х(квТ/1г).
Расчет фермента глюкокиназы.
Термодинамические функции произвольного фермента, в частности, изомеров гексокиназы, можно получить с помощью универсальной функций распределения (14), на основе известных значений константы равновесия Михаэлиса для этих ферментов. 1 лнжокиназа (КФ 2.7.1.2) - изотип IV фермента гексокиназы (мономерный белок 465 аминокислот и молекулярная масса 50 кДа), в основном присутствующий в гепатоцитах, а также в клетках поджелудочной железы. Катализирует фосфорилирование только D-глюкозы, путем переноса фосфатной группы на глюкозу за счет АТФ.
Глюкокиназа характеризуется константой равновесия Кт ~ 10 ммоль/л [31] и вызывает быстрое поглощение глюкозы из крови в печени в абсорбтивный период. Глюкоза при этом поступает в гепатоциты посредством транспортеров типа GLUT2, активность которых не регулируется уровнем инсулина, но сродство которых к глюкозе мало (Кт ~ 10 ммоль/л). Инсулин воздействует на усвоение глюкозы печенью лишь косвенно - он индуцирует синтез глюкокиназы в гепатоцитах. Таким образом, глюкокиназа призвана быстро перевести лишнюю глюкозу крови, возникшую после приема пищи, в гликоген.
Кривые насыщения фермента глюкокиназы, можно получить из универсальной функции распределения (14), в которой квантовое число для вычисления константы взаимодействия у определяется из условия квантования свободной энергии взаимодействия (31), которое в общем случае можно представить в следующем виде:
Figure imgf000087_0001
где hv - величина кванта энергии электромагнитного взаимодействия, кратная кванту тепловой энергии квТ hv = п кв, где п = 1, 2, 3, ....
Константе равновесия Кт ~ 10 ммоль/л удовлетворяет значение кванта энергии взаимодействия 3 квТ, соответствующего значению квантового числа п = 3. Кривые насыщения фермента глюкокиназы, полученные с помощью универсальной функции распределения биополимерной молекулы, показаны на Рис. 59а. Кривые насыщения и скорость ферментативной реакции глюкокиназы, в зависимости от концентрации глюкозы, приведены в единицах константы равновесия ко= 5,032 ммоль/л (концентрация глюкозы в крови в норме); значению концентрации глюкозы kmgi = 15,096 ммоль/л = 3xkmS2 на оси абсцисс соответствует значение безразмерной концентрации х = 3.
Высоту энергетического барьера Еь = Етах - Етт. разделяющего кристаллическую и жидкую фазы в молекуле глюкокиназы, можно определить непосредственно из графика свободной энергии Uxs anr(ci) тетрамера глюкокиназы от концентрации, представленного на Рис. 59Ь, который можно получить из функций распределения глюкокиназы, представленных на Рис. 59а. Высота энергетического барьера, разделяющего кристаллическую фазу от жидкой фазы, соответствующая энергии одной водородной связи, равна Етах - Е„ш, = 3AΊ х(ЗквТ) ~ 10,41 ккал/моль.
Высоту энергетического барьера Еа в единицах во = ЪквТ, можно определить из графика энергетического барьера, представленного в безразмерных единицах на Рис. 59Ь.
Значения энергии из графика:
Етах = 0,1035...
Д,™ = - 0,188...
Е0 = - 0,160...
Етах - Emin = 0,1035+ 0,188 = 0,2915.
Ео - Emin = - 0,160 + 0,188 = 0,028 = квТ.
Разница между энергией связи прямой и обратной реакции равна:
Emm - Ео = 0,188 - 0,160 = 0,028 = 3 квТ.
Высота энергетического барьера, разделяющего кристаллическую и жидкую фазу:
Еа = 3,4780 = 3,47x(3fe7) = 10,41 *квТ.
Еа = (Ema - Emin)/(E0 - Emin ) = (Етах - Emin)/3kBT = (0,188 + 0,1035)/ 0,028 =10,41.
Для вычисления по формуле (54d) скорости ферментативной реакции (50), катализируемой глюкокиназой, при известной высоте энергетического барьера глюкокиназы Еа = ЗАТ/(ЗкцТ), необходимо определить константу диссоциации тетрамера с образованием 2 димеров, которую можно вычислить с помощью выражения: Ko= [EG][EG]/[E2G2] = (УУо)хехр ( Eb/kBT ).
Здесь Еъ - энергию связи, которую необходимо затратить для отрыва двух комплексов EG (молекула глюкозы G, связанная одной водородной связью с мономером Е), образующих комплекс тетрамера [E2G2] в конфигурации R2 с 2 водородными связями: EG + EG = E2G2.
Энергия связи Еъ определяется внутренней энтропией тетрамера в конфигурации R2 с 2 водородными связями, которую можно вычислить с помощью выражения:
-Еъ= StetrT — AkBT\n g (I = 2) = 4квТ 1п18 = 4c2,89£BG, где Stetr = Аки In g(7 = 2) - внутренняя энтропия тетрамера; g(7 = 2) - число состояний , реализующих микроскопическую форму (конфигурацию) тетрамера R2 с 2 водородными связями. Множитель 4 в формуле соответствует числу водородных связей, возникающих в конфигурации тетрамера R2 в результате делокализации электронной плотности.
Откуда следует, что энергия связи, рассчитанная на одну водородную связь, равна:
Еь /4 = квТ In Ag = квТ 1п18 = 2,ШВТ,
Следует отметить, что термодинамическое равновесие системы устанавливается по отношению к обмену энергией между системой и резервуаром с квантом тепловой энергии квТ, в отличие от электромагнитного равновесия взаимодействующих молекул, которое устанавливается по отношению к кванту электромагнитной энергии во = 3.47 (ЗкцТ).
Энергия связи Еъ равна: Еъ = АквТХп Ag = кцТ In 18 = 11,56 квТ.
Численное выражение для константы равновесия реакции равно:
Ко = (1/VQ) xexp(Sfefr//:B)=l/3, 646* l(724CM3><en,56=10NA/6, 02*3, 646см3хеп’56;
Ко= 4,385 ммоль/литр, где NA = 6,02 х 1023 - число Авогадро.
Расчет скорости ферментативной реакции глюкокиназы.
Скорость ферментативной реакции (50), катализируемой глюко киназой, при известной высоте энергетического барьера глюкокиназы Еа = 3.47 (ЗкцТ) и константе диссоциации 1/ Ко, можно вычислить по формуле (54d).
Высота энергетического барьера Еа в расчете на одну водородную связь, в единицах кванта энергии взаимодействия во = ЗкцТ. как показано, равна Е„ = Етах - Етт = 3,47 во.
Энергия активации в расчете на 4 связи с квантом энергии во = ЗкцТ равна:
Етах — Етт = 4хЗ,443во = 4c3,47c3&b7’ ~ 41,6 квТ.
Скорость прохождения через энергетический барьер равна: vx> Vb = vxexp (- Еа/квТ) = 0,75 c 1013/e416 = 0,75 c 1013/1018= 0,75 MOA
Откуда следует, что численное значение константы скорости равно: к = vxwb/1,735 Ко = 0,75 c 105/ 1,735c4,385 схммоль/литр.
Концентрация глюкозы в элементарной ячейке увеличивается пропорционально увеличению константы взаимодействия (параметра порядка): nom/nog = у = ех(е+1)3 = 139,74... = 1,4х102.
Произведение концентраций реагентов [G] и [Р] равно:
[G][P] = 5 ммоль/литрх 1*2, 08х 103ммоль/литр; где [Р] = 1 ммоль/литр - концентрация АТФ, [G] = 5 - концентрация глюкозы. Здесь учитывается, что концентрация глюкозы и АТФ, при у= 1 , равны соответственно 5 ммоль /литр и 1 ммоль /литр.
Скорость реакции равна:
W = - c|G]|P] = ( V vi’/ /1,735 Ao)x[G][P] = 0,6c 103 (ммоль/литр)/с.
Фактор 1,1735 в расчете скорости реакции, появляется в результате изменения массы молекулы глюкозы после присоединения фосфатной группы. В процессе реакции фосфорилирования D - глюкоза (молекула G) присоединяет фосфатную группу РОзШ с молекулярной массой 80 и превращается в глюкозо-6- фосфат (молекула GP) с молекулярной массой 260 = 180 + 80.
Константы равновесия реакций (53а) и (53Ь) и связаны между собой выражением:
AG/AGP = (MGP/Mg)3/2 = (260/180)3/2 = 1,736...
Здесь учитывается, что энергия связи Еъ молекулы глюкозы с тетрамером, которая определяется внутренней энтропией тетрамера Star, величина которой не зависит от массы молекулы.
Откуда следует, KGP = Кс /1,136 = 1/1,736 Ко.
Расчетное значение согласуется с экспериментальными данными [13], при Кт = 10:
30c 103/0,6c 102х 1(ммоль/литр)/с = 50х105 = 0,5x103(ммоль/литр)/с. ( Vmax = 1x10-3) .
Скорость реакции гексокиназы.
Гексокиназа (АТ -зависимая D-гексоза-б-фоефотрансфераза) (КФ 2.7.1.1) — цитоплазматический фермент класса трансфераз, подкласса фоефотранефераз, первый фермент пути гликолиза.
Молекулярный вес 100000-50000, оптимальное значение pH равно 7, 6-8, 2. Первый изофермент, наиболее характерный для мозга, состоит из одной субъединицы, аминокислотный состав которой установлен. Вопрос о субъединичной структуре остальных изоферментов остается открытым. Для проявления каталитической активности нуждается в ионах Mg2+. Истинным субстратом для этого фермента служит не АТР4, а комплекс MgATP2.
Активность в различных органах (в мкмолях на 1 г влажного веса ткани в 1 мин.) от 23 (мозг) до 3,4 скелетные мышцы.
В активный центр входят остатки серина и гистидина. Важную роль в механизме каталитического действия играют группы SH полипептидной цепи. В организме гексокиназа активируется витаминами, инсулином, а также при связывании с некоторыми биологическими мембранами, например, митохондриальными; ингибируется глюкозо-6-фосфатом и кортикостероидами .
В отличие от глюкокиназы, константа Михаэлиса гексокиназы равна 0,01 ммоль/л, следовательно, гексокиназа, локализованная в клетках большинства тканей организма человека, буквально «вылавливает» глюкозу из плазмы крови, тогда как глюкокиназа катализирует реакцию фосфорилирования глюкозы лишь при высоких её концентрациях. Соответственно, глюкокиназа и гексокиназа обеспечивают перераспределение потока глюкозы в организме: во время всасывания питательных веществ из кишечника концентрация глюкозы в плазме крови увеличивается, и глюкоза направляется в печень, где подвергается действию глюкокиназы; по окончании пищеварения, на фоне снижения концентрации глюкозы, она направляется в скелетные мышцы, где на неё действует гексокиназа.
Метаболизм глюкозы начинается с необратимой гексокиназной (или глюкокиназной) реакции, в которой катализируется перенос фосфатной группы АТФ на глюкозу с образованием глюкозо-6-фосфата. Гексокиназная реакция служит не только пусковой, но и главной лимитирующей реакцией среди других реакций гликолиза. Субстратная специфичность гексокиназы (КФ 2.7.1.1) относительна - фосфорилированию подвергаются, помимо глюкозы, фруктоза, манноза, галактоза, глюкозамин и некоторые неметаболизирующие сахара типа 2- дезоксиглюкозы. Гексокиназа локализована в плазматической мембране, цитоплазме и частично связана с митохондриями, причем в головном мозге активность этой фракции может достигать 50% суммарной активности фермента. Экспериментально установлено, что в возбуждении гексокиназы принимает участие ион калия, который также участвует в возбуждении других ферментов - пируваткиназы, ускоряющей транспорт фосфорной кислоты от пирувата на аденозиндифосфат, ферментов, участвующих в цикле Кребса, в том числе ферментов, помогающих в синтезе аденозинтрифосфата при окислительном фосфорилировании. Вполне очевидно, что зависимость активности гексокиназы от ионов калия указывает на прямую корреляцию между уровнем калия и уровнем макроэргических фосфатов. Таким образом, важность калия для вышеописанных процессов установлена экспериментально, однако принципы активации калием ферментативных систем пока полностью не выяснены.
Константа равновесия Михаэлиса для реакции гексокиназы равна Кьех = 0,02 ммоль/литр; отношение констант равновесия равно Kgj/Khex = 15/0,02 = 750.
На Рис. 60а показаны кривые насыщения и скорость ферментативной реакции гексокиназы, в зависимости от безразмерной концентрации глюкозы, масштабированной делением концентрации на 0,5 ммоль/литр.
Высота барьера в расчете на одну водородную связь, как показано, равна
Етах - Emm = 3,4436 во. Величину кванта энергии взаимодействия во в единицах кванта тепловой энергии квТ можно определить из графика энергетического барьера, представленного на Рис. 60Ь. Высота энергетического барьера одной валентной связи для прямой реакции £о,./„·, = 2,443X8O, для обратной реакции Eosh x = 3,443 cbo; энергия кванта взаимодействия eo = е квТ.
Величину энергии активации можно определить из графика:
Етах = 0,1035...
Е п = - 0,1915...
Е0 = - 0,163...
Етах - Emin = 0,1035+ 0,1915 = 0,295.
Ео - Emin = - 0,161 + 0,1915 = 0,0305 = квТ.
(Етах - ЕттЖЕо - Етт) = 0,295/0,0305 = 9,67 И 3,5во = 3,5 *еквТ.
Разница между энергией связи прямой и обратной реакции равна:
Emin - Ео = 0,1915 - 0,161 = 0,0305 = в0 = е квТ.
Константа диссоциации тетрамера, как показано, можно вычислить с помощью выражения:
К0= (1 /Уо)*ехр(- S tetri кв) = (1/VQ )*ехр(- In gtetr ), где gtetr - число вырожденных внутренних состояний (обладающих одинаковой энергией), реализующих равновесную конфигурацию тетрамера с 4 валентными связями, при выполнении условия компенсации сил притяжения и отталкивания.
Как следует из принципа квантования свободной энергии (6), описанного выше, при концентрациях глюкозы a> 1, равновесная конфигурация тетрамера, реализующаяся максимальным числом микросостояний gtetr = 25, соответствующая минимуму свободной энергии взаимодействия, устанавливается по отношению к кванту энергии взаимодействия во, кратного кванту тепловой энергии во = п квТ, где п = 1 , 2, 3,... ; во > квТ. Микросостояния, реализующие равновесную конфигурацию тетрамера, при концентрациях глюкозы a> 1 обладают одинаковой энергией и являются вырожденными.
Как показано выше (15), изменение свободной энергии перехода (Na) тетрамера из конформации (l) в изомерную конформацию (s) равно:
TAS = квТ*1п (25/9) = квТ*1п 2,777 я квТ.
При концентрациях глюкозы a< 1, соответствующих значениям константы Михазлиеа м < 5 ммоль/литр, пространственная конфигурация с минимальной свободной энергией объемных взаимодействий не может реализоваться с квантом энергии электромагнитного взаимодействия eo, кратным кванту тепловой энергии квТ.
Можно показать, что равновесная конфигурация тетрамера, при a< 1, может реализоваться при значении кванта энергии взаимодействия eo = е квТ, где е - основание натурального логарифма, которое является трансцендентным и иррациональным числом, которое нельзя представить в виде отношения m/п целого числа m к натуральному п, бесконечная непериодическая десятичная дробь, которое приблизительно равна 2,71828.... Число e, как известно, можно представить в виде формулы Эйлера: е = 1+1/1! +1/2! +... 1/п! +...
Величина кванта энергии во, в этом случае, может принимать квантованные значения 8оп:, соответствующие разным целым значениям квантового числа п:
801 = (1+1 )хквТ = 2квТ во2 = (1+1 + У2)*квТ= 5квТ/2· воз = (1+1 + ! + \/6)хквТ = %квТ/Ъ воз = (1+1 + ‘/2+ 1/6+ 1/24 )*квТ= 65 квТ!2\
8оп = (1+1 + ‘/2+ 1/6... + 1/п \)*квТ. (53)
Энергия водородной связи, в этом случае, расщепляются на бесконечное число квантов взаимодействия, энергии которых определяются условием квантования (53), и, как следствие, уровень энергии энергетического барьера расщепляется на бесконечное число близко расположенных энергетических уровней.
В процессе теплового движения могут с равной вероятностью реализоваться конфигурации тетрамера с разными значениями расстояния между мономерами, соответствующие разным значениями энергии son взаимодействия и энергии водородной связи.
Следует отметить, что разные значения межмолекулярных расстояний в тетрамере гексокиназы, в отличии от глюкокиназы, могут образоваться в том случае, если боковые группы аминокислот имеют большую длину за счет дополнительного мономера и дополнительной ковалентной связи, в результате которой появляется гибкость цепочки боковой группы. Отсюда следует понимание вывода, в случае гексокиназы, аминокислотой с отрицательным зарядом боковой группы является глутаминовая кислота (Глу, Е), боковая группа которой состоит из 3 мономерных звеньев; аминокислотой с незаряженной боковой группой является аспарагин (Аси, N), боковая группа которой состоит из 3 мономерных звеньев; в случае глюкокиназы, аминокислотой с отрицательным зарядом боковой группы является аспарагиновая кислота (Аси, D), боковая группа которой состоит из 2 мономерных звеньев; аминокислотой с незаряженной боковой группой является аминокислота, которую выбирают из группы треонин, цистеин, серин, боковые группы которых состоят из 2 мономерных звеньев.
В активный центр гексокиназы входят остатки серина и гистидина. Важную роль в механизме каталитического действия играют группы SH полипептидной цепи. Гексокиназа активируется витаминами, инсулином, а также при связывании с некоторыми био л. мембранами; ингибируется глюкозо-6-фосфатом и кортикостероидами.
Второе отличие гексокиназы от глюкокиназы заключается в том, что субстратная специфичность гексокиназы (КФ 2.7.1.1) относительна - фосфорилированию подвергаются, помимо глюкозы, фруктоза, манноза, галактоза, глюкозамин и некоторые неметаболизирующие сахара типа 2- дезоксиглюкозы. Можно предположить, что квантование энергии водородной связи (53) позволяет объяснить относительную субстратную специфичность гексокиназы, тем, что перечисленные сахарные молекулы образуют с мономерами полипептидной цепи водородные связи с близкими, но отличающимися значениями энергии, которым соответствуют разные значения расстояния между мономерами тетрамера.
Равновесная конфигурация R2 с 2 водородными связями, соответствующая минимальной свободной энергии при a< 1, в соответствии с условием масштабной инвариантности ( ), может реализоваться при выполнении условия dS/ds г 0, которое может реализоваться единственным способом в результате расщепления на е квантов каждого кванта внутренней энтропии тетрамера, число которых соответствует числу допустимых конфигураций водородных связей в тетрамере. Отсюда следует, что S/кв = In es = g, где g - число конфигураций, равное целому числу.
Как показано, при концентрациях глюкозы а > 1, равновесная конфигурация тетрамера, реализующаяся максимальным числом состояний gtetr = 25, соответствующая минимуму свободной энергии взаимодействия, устанавливается по отношению к кванту энергии взаимодействия во = квТ. Максимум энергии взаимодействия (вершина энергетического барьера), как показано, достигается при концентрации глюкозы, соответствующей особой точке G процесса; тетрамер находится в конформации R2 с 2 водородными связями, которая может с равной вероятностью преобразоваться в конформации R4 или Ro.
Число состояний g (/ = 2), реализующих конфигурацию R2 с 2 водородными связями, равно 18, из которых 6 состояний реализуют электронную конфигурацию и 12 состояний реализуют конфигурацию мономеров.
Число состояний g (7 = 2), реализующих конфигурацию R2 с 2 водородными связями, возникающих при расщеплении энергии водородной связи, при концентрациях глюкозы а < 1, равно: g hex = g(l = 2) = 12еб; In ghex = 6 + /и12.
Энергия связи Еь, которую необходимо затратить для отрыва двух комплексов EG (молекула глюкозы G, связанная одной водородной связью с мономером Е), образующих комплекс тетрамера [E2G2] в конфигурации R2 с 2 водородными связями, можно вычислить с помощью выражения:
Еь= 4kBTln g (I = 2) = 4квТ1п\2е6 = 4х( 6 + /и12) хквТ= 4x8,48 хквТ, где g(l = 2) - число состояний , реализующих конфигурацию тетрамера R2 с 2 водородными связями.
Множитель 4 в формуле соответствует числу водородных связей в комплексе тетрамера. Откуда следует, что энергия связи, рассчитанная на одну водородную связь, равна:
Еь /4 = kBTg(l = 2) = 4квТ1п\2е6 = 4х(6 + ln\2)*kBT= 4x8,48 хквТ,
Константа равновесия равна: g hex= g(l = 2) = 12еб; In ghex = 6 + In 12.
Ko/K, c = exp (6 + /и 12)/ ехр(ЫЩ = e 6+2’48/e2’89 = e 6 0’41 = e5’59 = 267,7. Кьех = Хо/267,7 = 4,4/267,7 = 0,016 ммоль/литр. g (I = 2) = 267,7/4 = 66,925 g(Z = 4) = 4x24 = 65,23.
Энергия активации в расчете на 4 связи с квантом энергии во = еквТ равна:
Еа = Етах - Emin = 4c3,443e0 = 4x3,443 хеквТ ~ 1,А квТ.
Скорость прохождения через барьер: vxivb = vxexp (- EalkBT) = 0,75х1013/е37’4= 0,75 c 1013/1,8c 1016= 0,4c 103.
Скорость реакции равна:
W= - Jk[G][P] = (vxivb /1,735 X0)x[G][P] =
=[0,4 c 103/ 1 ,735 c 0,2(c c ммоль/литр)] c0,2c1c 1,4c 102 (ммоль/литр)2 =
=0,32 c 101 (ммоль/литр)/с.
Результат расчета согласуются с экспериментальными данными [13].
Типы химической связи в тетрамерах природных макромолекул
В рамках общепринятой классификации, химическую связь в тетрамере между молекулами субстрата и мономерами полимерной цепи можно определить, как делокализованную водородную связь.
В зависимости от степени обобществления электронной плотности химической связи между несколькими атомами различают локализованную и делокализованную химическую связь. Ковалентная связь считается локализованной, если ее электронная пара находится в поле двух ядер и связывает только два атома. Если электронная плотность химической связи распределена между тремя и более ядрами, то такая связь называется трехцентровой, многоцентровой, а в общем случае - делокализованной. Делокализованная связь - связь, электронная пара которой рассредоточена между несколькими (более 2) ядрами атомов (подобие металлической связи). Характер делокализации электронов химической связи может, в свою очередь, различаться по размерности пространства. Существуют связи, делокализованные в одном измерении, делокализованные в плоскости и делокализованные в трехмерном пространстве. Хорошо известная металлическая связь с позиций изложенной классификации является короткодействующей и дальнодействующей, неполярной, в высшей степени делокализованной (в трех измерениях) связью.
Химическую связь, в зависимости от расстояния, на котором она проявляется, делят на короткодействующую и дальнодействующую . Прочность дальнодействующей связи в десятки раз меньше прочности короткодействующей связи. Дальнодействующую связь также называют слабой или межмолекулярной связью. Короткодействующая связь проявляется на расстояниях, близких к размерам атомов. Она осуществляется между атомами в молекуле, кристалле в пределах от 74 до 400 им. Энергия разрыва короткодействующей химической связи находится в пределах от 40 до 1000 кДж/моль. Дальнодействующая химическая связь проявляется при переходе вещества из газовой фазы в жидкое или твердое состояние. Она возникает между отдельными атомами, молекулами на расстояниях в несколько раз больших, чем длина обычной короткодействующей связи. Короткодействующие связи образуются в результате такого взаимодействия, что каждый электрон может быть описан самостоятельной волновой функцией - одноэлектронное приближение. Дальнодействующие же связи являются результатом коллективного движения электронов.
Гликозидная связь.
Как было показано, термодинамические свойства биополимерной молекулы можно описать на основе статистической модели, как результат взаимодействия мономеров полимерной цепи с молекулами и ионами растворителя, в результате которого в объеме макромолекулы образуются тетрамеры - молекулярные комплексы, состоящие из 2 не соседних мономеров полимерной цепи и 2 молекул глюкозы растворителя, связанных между собой водородной связью, которую можно рассматривать, как тип слабой делокализованной ковалентной связи между молекулой глюкозы и мономерами полимерной цепи.
Как известно, молекула глюкозы может образовать гликозидную валентную связь также с аминокислотами белковых молекул. В глико протеинах, характеризующихся низким содержанием углеводов, углеводный остаток (олигосахарид, имеющий нерегулярную структуру и содержащий глюкозу, маннозу, галактозу и их аминопроизводные, а также N -ацетилнейраминовую кислоту) присоединен к аминокислотам белковой цепи либо N -гликозидной связью - к амидному азоту аспарагина, либо О-гликозидной связью - к гидроксил группе остатков серина, треонина, гидроксилизина. Структурные формулы гликозидной связи с аминокислотами показаны на Рис.61. Связь между аминогруппой или другой группой, содержащей атом азота, с сахаром, часто также называется гликозидной связью, хотя ШРАС этого и не рекомендует. Например, связь между сахаром и азотистым основанием в нуклеозиде называют гликозидной связью. Структурные формулы гликозидной связи в нуклеозидах показаны на Рис. 62.
Фармацевтические композиции на основе гиалуроновой кислоты.
Фармацевтические композиции и препараты на основе гиалуроновой кислоты широко применяются в медицине и косметологии: регенерация клеток кожи в эстетической косметологии; заживление ран и ожогов; защита структур глаза и обеспечения глубины передней камеры в ходе оперативного вмешательства в офтальмо хирургии и при производстве контактных линз; ускоренное размножение клеток костной ткани и быстрое сращивание кости при переломах; доставка лекарств к месту воспаления при патологических очагах и контроль за дозированным высвобождением препарата; ускоренное размножение клеток костной ткани и быстрое сращивание кости при переломах.
Новое понимание термодинамических свойств межклеточного вещества, основанное на новом методе расчета полимерной макромолекулы гиалуроновой кислоты, позволяет разработать принципиально новые фармацевтические композиции на основе гиалуроновой кислоты.
Изобретение также относится с фармацевтическим композициям, которые содержат биополимерную молекулу и один или несколько фармацевтически приемлемых носителей, адъювантов, растворителей и/или наполнителей, таких, которые могут быть введены в организм пациента совместно с биополимерной молекулой, составляющей суть данного изобретения, и которые не разрушают активности биополимерной молекулы, и являются нетоксичными в количествах, достаточных для доставки необходимого количества биополимерной молекулы.
Гиалуроновую кислоту, которая в настоящее время используют на практике, в косметологии и медицине, получают путем биохимического синтеза. Для этих целей используют бактериальные культуры, а конкретно стрептококки, выращенные на растительной основе (пшеничном бульоне). Этот метод базируется на способности некоторых микроорганизмов синтезировать гиалуроновую кислоту. Биохимический метод позволяет добиться большого количества вещества с нужным молекулярным весом и с приемлемой структурой.
Препараты на основе стабилизированной гиалуроновой кислоты, которые применяются в косметологии, долго хранятся в коже, составляют основу препаратов гидрорезерва и запускают регенеративные процессы в дерме. Молекула гиалуроновой кислоты очень чувствительна. Она остро реагирует на химическую модификацию: термическую или механическую; по этой причине препараты следует правильно сохранять в процессе химических реакций. Стабилизированная гиалуроновая кислота получается методом биохимического синтеза, затем следует процесс сшивания, который называется стабилизацией (формирование пересекающихся сшивок между молекулами гиалуроновой кислоты). Молекулы гиалуроновой кислоты подвергаются сшиванию в целях предотвращения их быстрой деградации. Такая гиалуроновая кислота демонстрирует долгие клинические эффекты при ее внедрении в кожу. После сшивания полученные гели проходят очистку, которая представляет собой очень кропотливый процесс и является решающим фактором при ценообразовании препаратов стабилизирующей гиалуроновой кислоты.
В зависимости от уровня стабилизации производятся гели различной вязкости для устранения разнообразных эстетических проблем: мало стабилизированные - для устранения мелких морщин, более стабилизированные и более вязкие - для коррекции носогубных складок и восстановления утраченных объемов.
Стабилизированная гиалуроновая кислота используется в контурной практике и при армировании лица, так как этот вид гиалуроната (натриевая соль гиалуроновой кислоты) хорошо держит объем. То есть, когда надо восполнить утраченные объемы, например, щек, вытолкнуть носогубные складки извне, смоделировать контур лица и заполнить провалы на лице, используется стабилизированная гиалуроновая кислота.
Гиалуроновая кислота должна быть стабилизированной и обладать характеристиками, которые проявляются в нативном состоянии живой ткани, при нормальных физиологических условиях, при которых межклеточное вещество находится в гетерофазном состоянии. Как было показано, нормальные физиологические характеристики живой ткани достигаются, при физиологических значениях температуры и кислотности, при следующих концентрациях биохимических компонентов в межклеточном веществе: концентрация глюкозы (ммоль/литр) 5,0; температура 36,447... С. концентрация мономеров гиалуроновой кислоты (ммоль/литр) 45,0; [Na] - [Cl] (натриевый избыток, ммоль/литр) 40,0; внешнее избыточное давление (мм. pm. cm.) 14,6; интервал концентраций глюкозы (ммоль/литр) 3,7 - 13,67.
Биополимерные молекулы, описанные в данном изобретении, могут быть использованы для профилактики и/или лечения болезней человека, например, в виде следующих составов (под «биополимерное молекулой» понимается активный ингредиент, представляющий собой биополимерную молекулы по изобретению в гетерофазном состоянию).
Концентрация активного ингредиента в препарате, в частности, эквивалентная концентрации мономеров гиалуроновой кислоты 45 ммоль/литр, равна 15 мг/мл. Концентрация глюкозы в препарате, эквивалентная концентрации свободной (несвязанной полимером) глюкозы 5 ммоль/литр, в диапазоне 5 - 15 мг/мл.
Концентрация ионов натрия и калия в водном растворе с pH 7, 0-7, 5 равна 40 ммоль/литр и 5 ммоль/литр соответственно.
Гель мг/мл
Биополимерная молекула 15,0 Глюкоза 5,0
Водный раствор ионов Na и К 980,0 Гель мг/мл
Биополимерная молекула 15,0 Глюкоза 10,0
Водный раствор ионов Na и К 975,0
Гель мг/мл
Биополимерная молекула 15,0 Глюкоза 15,0
Водный раствор ионов Na и К 970,0
15
Лечебные композиции на основе ферментов.
Сахарный диабет 2-го типа является актуальной проблемой современного здравоохранения. Несмотря на широкий выбор пероральных гипогликемических препаратов, на сегодняшний день велика потребность в создании и внедрении в клиническую практику новых эффективных и безопасных лекарственных средств. Одной из перспективных мишеней для создания новых противодиабетических средств является глюкокиназа (GK). Она выступает в качестве «сенсора» глюкозы в панкреатических бета-клетках и контролирует скорость синтеза гликогена в печени. Активаторы глюкокиназы представляют собой новый класс противодиабетических препаратов с надежным гипогликемическим эффектом, доказанным в доклинических испытаниях. Очень важно, что активаторы глюкокиназы не вызывают клинически значимой гипогликемии при использовании экспериментальных моделей сахарного диабета и не влияют на уровень липидов, а также не увеличивают массу тела. В 2003 г. впервые сообщили об успешном применении низкомолекулярного активатора GK
(GKA) для снижения уровня глюкозы в животных моделях сахарного диабета типа 2. Скрининг 120000 соединений позволил идентифицировать соединение, обладающее свойствами аллостерического активатора GK. Активный R энантиомер этого соединения, R082881675, повышал ферментативную активность GK, при пероральном введении снижал уровень глюкозы в крови мышей дикого типа и в моделях диабета, ускорял метаболизм глюкозы в печени и индуцируемую глюкозой секрецию инсулина в изолированных островках поджелудочной железы крысы. Поиск и характеристика других низкомолекулярных GKA стали одним из главных направлений в разработке противодиабетических препаратов в течение следующего десятилетия. К созданию и испытанию таких соединений подключились крупные фармацевтические компании, в том числе “Array Biopharm Inc.”, “Astra Zeneca pic, Merck & Co.”, “OSI Pharmaceuticals Inc./Eli Lilly”, “Pfizer Inc.”, “Roche”, “DaiichiSankyio”, “Takeda”, TransTech Pharma Inc./Forest Laboratories Inc./Novo Nordisk A/S”, “Advinus”, “Hua Medicine”. К 2008 году получено уже более 90 патентов на низкомоле8 кулярные аллостерические GKA. Большая часть этих соединений основана на фармакофоре, схема которого представлена на рис. 2. Большинство этих соединений эффективно снижали уровень глюкозы в крови в разных животных моделях диабета. Более 20 потенциальных сахароснижающих препаратов этого класса были допущены до клинических испытаний, однако в большинстве случаев испытания были приостановлены или прекращены на стадии I или II [16]. Главной причиной прекращения испытаний стал повышенный риск развития гипогликемии. В настоящее время продолжаются клинические испытания лишь пяти препаратов. Это GKM8001 индийской фармацевтической компании “Advinus Therapeutics Ltd.” (фаза II), DS87309 японской компании “Daiichi8Sankyo” (фаза I), HMS5552 китайской компании “Hua Medicine” (фаза I), PF804937319 компании “Pfizer” (фаза II) и ТТР 399 (GK18399) компаний “TransTech Pharma Inc./Forest Laboratories Inc./Novo Nordisk A/S” (фаза II). Дальнейшие перспективы использования низкомолекулярных аллостерических GKA связывают с возможностью создания гепатоселективных препаратов с низким риском развития гипогликемии.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. John L. Smith. The Pursuit of Noninvasive Glucose: “Hunting the Deceitful Turkey”. Fourth Edition, 2015.
2. USP # 5,795,305, August 18,1998, Cho et al. Process and device for non-invasive determination of glucose concentration in parts of human body.
3. USP #5,823,966, October 20, 1998, Buchet. Non - invasive continuous blood glucose monitoring.
4. USP # 5,890,489, April 6, 1999, Elden. Method for non - invasive determination of glucose in body fluids.
5. USP # 5,924,996, July 20, 1999, Cho et al. Process and device for detecting the exchange of heat between the human body and the invented device and its correlation to the glucose concentration in human body.
6. USP # 6,522,903, February 18, 2003, Berman et al. Glucose measurement assessment utilizing non-invasive assessment methods.
7. USP # 6,517,482, February 11, 2003, Elden et al. Method and apparatus for non- invasive determination of glucose in body fluids.
8. USP # 5,040,541, August 20, 1991, Poppendiek. Whole body calorimeter.
9. USP # 4,386,604, June 7, 1993, Hershey. Determination of the basal metabolic rate of humans with a whole -body calorimeter.
10. Мусин Р.Ф. Патент РФ на изобретение N° 2629796 “Способ и мультисенсорное устройство для неинвазивного мониторинга уровня глюкозы в крови”.
11. Мусин Р.Ф. Патент РФ на изобретение N° 2396897.
12. Edsall J.T., Gutfreund Н. BIOTHERMODINAMICS. The Study of Biochemical Processes at Equilibrium. JOHN WILLEY & SONS, 1983.00
13. Кендыш И.Н. Регуляция углеводного обмена. Издательство “Медицина”, Москва.
14. Peusner Leonardo. Concepts in Bioenergetics. Peusner Biomedical Associates, Prentice - Hall, Inc., Englewood Cliffs, New Jersey, 1974.
15. Lehninger A.L. BIOCHEMISTRY. The Johns Hopkins University, School of Medicine. Worth Publishers, Inc., New York, 1972.
16. Atkins P.W. The second law. Scientific American Library, New York, 1984.
17. Мусин Р.Ф., Морозов B.A., Годик Э.Э., Гуляев Ю.В. (1986). Электрические свойства рогового слоя эпидермиса человека и транспорт воды в нем. - Биофизика, т. 31, вып. 3, с.478-480.
18. Forbath N., Hetenyi С. Glucose dynamics in normal subjects and diabetic patients before and after a glucose load. - Diabetes, 1966, vol. 15, # 11, p. 778-789.
19. Hah S. E. H., Saunders J., Sonksen P.H. Glucose and free fatty acid turnover in normal subjects and diabetic patients before and after insulin treatment. - Diabetologia, 1979, vol.16, # 5, p. 297-306.
20. Musin R.F., Godik E.E., Gulyaev Y.V., Morozov V.A. Natural water diffusion through the stratum corneum of the human body epidermis and its electrical properties/ - 3 International conference on water and ions in biological systems. Bucharest, Romania, 1984, p.34.
21. Мусин Р.Ф., Иванова Н.Ю., Мартынов B.A., Морозов В.А., Годик Э.Э., Гуляев Ю.В. (1986). О чувствительности кожи человека к инфракрасным тепловым потокам. - Доклады академии наук СССР, том 289, N°3, с. 718-720.
22. Гуляев Ю.В., Годик Э.Э., Мусин Р.Ф., Морозов В.А., Мартынов В.А., Валиев И.В. (1989). Пороги тепловой чувствительности кожи к электромагнитным излучениям. - Сенсорные системы, том 3, N°2, с.209-212.
23. Годик Э.Э., Морозов В.А., Мусин Р.Ф. (1985). О динамике релаксации трибозаряда на поверхности рогового слоя эпидермиса кожи. - Биофизика, том 30, вып.2, с.309-312.
24. Musin R.F., Godik Е.Е., Gulyaev Y.V., Morozov V.A., Sudarev A.M. Membrane mechanisms of water transport in epidermis. 4 International conference on water and ions in biological systems. Bucharest, Romania, 1988, p.167-172.
25. Мусин Р.Ф., Морозов B.A., Сударев A.M. (1990). О механизмах транспорта воды в эпидермисе. - Биофизика, том 35, вып.4, с.653-656.
26. Yas Kuno. (1959). Human Perspiration. Charles & Thomas Publ., Springfield, Illinois, USA.
27. A.B. Коробков, C.A. Чеснокова. (1986). Атлас по нормальной физиологии. М.: Высшая школа, 351с.
28. Гомеостаз. Под ред. П.Д. Горизонтова. М., “Медицина”, 1976, 464 с., ил.
29. Кальве Э., Прат А. Микрокалориметрия. М.: Изд-во ин. лит. 1963. 477 с.).
30. Ф. Дайсон, Э. Монтролл, М. Кац, М. Фишер. Устойчивость и фазовые переходы. Издательство “Мир”, Москва, 1973.
31. Lehninger A., Biochemistry, Worth Publishers, New York, 1972.
32. C. B. Anfinsen. "Molecular Organization and Biological Function (Modern Perspectives in Biology)". New York. Harper & Row, 1966.
33. C. R. Cantor, Paul R. Schimmel. Biophysical Chemistry. Parts 1, 2, 3. W. H. Freeman and Company. San Francisco. 1980. - 536pp.
34. J.M. Guss, D.W.L. Hukins, P.J.C. Smith, W.T. Winter, S. Arnott, R. Moorhouse, D.A. Rees Hyaluronic Acid, Molecular Conformations and Interactions in Two Sodium Salts, J. Mol. Biol. v. 95, 359 (1975).
35. A.G. Marshall, Biophysical Chemistry, Parts 1,2. John Wiley and Sons, Inc. 1978.
36. L.E. Boltzmann, Lectures on Gas Theory, Berkley, (1964).
37. J.W. Gibbs, Elementary principles in statistical mechanics, developed with especial reference to the rational foundation of thermodynamics, Yale Univ. Press, 1902.
38. J.W. Gibbs, Collected Works, New Haven, (1948).
39. E. Fermi. Thermodynamics. New York, Prentice-Hall, Inc, 1937.
40. E. Fermi, Notes on thermodynamics and statistics, Univ. Chicago Press, 1966.
41. R.P. Feynman. Statistical Mechanics. Set of Lectures. California Institute of Technology. W.A. Benjamin, Inc., Massachusetts (1972).
42. C. Kittel. Thermal Physics. John Willey and Sons, Inc. New York. 1969.
43. C. Bohr, Zbl. Physiologie 17, 682 (1903).
44. J. Monod, J. Wyman, J. P. Changeux, J. Mol., Biol. 12, 88 (1965).
45. J.T. Edsall, H. Gutfreund. Biothermodynamics. John Wiley & Sons, 1983.
46. Paul J. Flory, The Configuration of Real Polymer Chains, J. Chem. Phys. 17, 303 (1949).
47. Гросберг А.Ю., Хохлов A.P. “Статистическая физика макромолекул” -М.: Наука, 1989.
48. A. Yu. Grosberg, A. R. Khokhlov, Statistical Physics of Macromolecules, Springer, 1994.
49. Гросберг А.Ю., Хохлов A.P. Физика цепных молекул. - М.: Знание, 1983.
50. И. М. Лифшиц, А. Ю. Гросберг, А. Р. Хохлов, Объемные взаимодействия в £ШШ Х?^§Ж:?.Й.. ШЖй..поли ещ50Й MaLi o OJKK jib УФН 127 (3) (1979)
51. Ptitsyn О. В. The molten globule state (Review). In: “Protein Folding” (T.E. Creighton, ed.), W.H. Freeman & Co., 1992, 243-300.
52. Hadler N.M. Enhanced Diffusivity of Glucose in a Matrix of Hyaluronic Acid. The Journal of Biological Chemistry. 1980; 255(8): 3532-5.
50. Бродский Я. С. Статистика. Вероятность. Комбинаторика. - М.: Издательство “ Мир и Образование”, 2008. - 544с.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ изотермической калориметрической спектроскопии биохимических компонентов живой ткани пациента, включающий следующие этапы:
- накладывают на поверхность кожи пациента с дозированным давлением по меньшей мере один тепло- и водонепроницаемый аппликатор, образующий закрытую систему в локальной области ткани под аппликатором;
-оказывают локальное воздействие на участок ткани под аппликатором электромагнитным излучением на одной или нескольких длинах волн, соответствующих характеристическим частотам поглощения биохимических компонентов межклеточного и/или внутриклеточного вещества;
-измеряют величину физиологического параметра, характеризующего термодинамическое фазовое состояние межклеточного вещества под аппликатором и ее временную динамику, в зависимости от мощности падающего электромагнитного излучения;
-определяют концентрацию биохимического компонента межклеточного вещества и/или межклеточной жидкости и /или крови и ее временную динамику на основе временной динамики измеренного физиологического параметра.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что интенсивность электромагнитного излучения может быть постоянной или переменной, изменяющейся с постоянной скоростью и/или модулированной частотой и/или амплитудой.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что физиологическим параметром, характеризующим термодинамическое фазовое состояние межклеточного вещества, является осмотическое давление межклеточного вещества и/или количество воды в межклеточном пространстве ткани и /или эластическое давление живой ткани под аппликатором.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что биохимические компоненты межклеточного и/или внутриклеточного вещества выбирают из группы, включающей в себя воду, гиалуроновую кислоту, глюкозу, триглицериды и другие биохимические компоненты межклеточного вещества, клетки и крови.
5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что длину волны воздействующего на участок ткани электромагнитного излучения выбирают из диапазона электромагнитного излучения, который определяют по характеристическим частотам поглощения биохимических компонентов живой ткани в оптическом и/или ближнем инфракрасном и/или среднем и дальнем инфракрасном и/или терагерцовом и/или микроволновом диапазоне.
6. Способ по любому из пунктов 1-5, отличающийся тем, что концентрацию биохимического компонента межклеточного вещества и/или межклеточной жидкости и /или крови дополнительно измеряют на основе метода спектроскопии диффузного отражения.
7. Способ по п.1-5, отличающийся тем, что концентрацию биохимического компонента межклеточного вещества и/или межклеточной жидкости и /или крови дополнительно измеряют на основе метода спектроскопии комбинационного рассеяния света.
8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что биохимическим компонентом является глюкоза в крови, концентрацию которой определяют по концентрации глюкозы, связанной с мономерами полимерной цепи межклеточного вещества.
9. Способ по и. 3, отличающийся тем, что осмотическое давление межклеточного вещества или количество воды в межклеточном пространстве определяют на основе спектральных измерений на длинах волн, соответствующих характеристическим частотам поглощения биохимических компонентов межклеточного и/или внутриклеточного вещества.
10. Способ по и. 9, отличающийся тем, что спектральные измерения основаны на методе двухчастотной спектроскопии, в которой длина волны электромагнитного излучения выбирается по характеристической частоте тетрамера гиалуроновой кислоты межклеточного вещества в терагерцовой области, а длина волны спектрального датчика осмотического давления межклеточного вещества выбирается по характеристическим частотам поглощения воды в роговом слое эпидермиса в инфракрасной области.
11. Способ по и. 3, отличающийся тем, что осмотическое давление межклеточного вещества или количество воды в межклеточном пространстве определяют по количеству воды в роговом слое эпидермиса на основе измерения физических характеристик рогового слоя эпидермиса, которые выбирают из группы, включающей в себя электрофизические характеристики, спектральные и оптико-акустические характеристики, теплофизические характеристики.
12. Способ по и. 3, отличающийся тем, что осмотическое давление межклеточного вещества или количество воды в межклеточном пространстве определяют по количеству воды в роговом слое эпидермиса на основе измерений спектральных характеристик рогового слоя эпидермиса на длинах волн, соответствующих характеристическим частотам воды в роговом слое, с помощью спектрального метода, который выбирают из группы, включающей: ИК спектроскопию, Раман - спектроскопию, оптико-акустическая спектроскопию, разностную двухлучевую спектроскопию.
13. Способ по и. 3, отличающийся тем, что осмотическое давление межклеточного вещества или количество воды в межклеточном пространстве определяют по количеству воды в роговом слое эпидермиса путем измерения электрических характеристик рогового слоя эпидермиса, которые выбирают из группы, включающей в себя поперечную электропроводность рогового слоя на постоянном и/или переменном токе и диэлектрическую проницаемость.
14. Способ по и.8, отличающийся тем, что концентрацию глюкозы в крови и ее физиологических изменений определяют по изменениям осмотического давления межклеточного вещества, находящегося в межклеточном пространстве при физиологических условиях в гетерофазном термодинамическом состоянии, и являющегося природным биосенсором, обладающим селективностью к молекуле глюкозы и чувствительностью к внешним тепловым потокам и внешнему давлению, при этом индивидуальную калибровку локальной области ткани пациента определяют по содержанию гиалуроновой кислоты в межклеточном веществе и/или количества воды в объеме ткани под аппликатором, измеряемых спектральным методом, и/или по значениям климатических параметров.
15. Способ по пунктам 1-5, 8-14, отличающийся тем, что способ применим для ранней диагностики сахарного диабета на основе временной динамики концентрации биохимического компонента.
16. Способ по пунктам 1-5, 8-14, отличающийся тем, что способ применим для ранней диагностики сахарного диабета на основе временной динамики осмотического давления межклеточного вещества.
17. Устройство для изотермической калориметрической спектроскопии биохимических компонентов живой ткани, содержащее тепло и водонепроницаемый аппликатор, выполненный с возможностью наложения на кожу пациента с дозированным давлением, датчик температуры, один или несколько датчиков физиологических параметров, характеризующих термодинамическое фазовое состояние межклеточного вещества под аппликатором, один или несколько источников электромагнитного излучения, устройство для создания калибровочного воздействия, при этом датчики физиологических параметров расположены под аппликатором, при этом сигналы с вышеуказанных датчиков поступают последовательно на входы блока усилителей и/или синхронного детектора и/или аналогово-цифрового преобразователя, установленных на верхней поверхности аппликатора, в блок обработки информации и блок отображения информации.
18. Устройство по п.17, отличающееся тем, что источник электромагнитного излучения выполнен с возможностью излучения с постоянной и/или модулированной интенсивностью и/или частотной модуляцией.
19. Устройство по п. 17, отличающееся тем, что дополнительно содержит климатические датчики, а датчики физиологических параметров, характеризующие термодинамическое состояние межклеточного вещества под аппликатором, выполнены в виде датчиков осмотического давления межклеточного вещества или датчиков количества воды в межклеточном пространстве ткани в локальном объеме под аппликатором и /или датчика эластического давления живой ткани под аппликатором.
20. Устройство по п. 17, отличающееся тем, что устройство для создания калибровочного воздействия представляет собой источник тепловой мощности, выполненный в виде резистора и/или элемента Пельтье и/или источник электрического тока и/или напряжения; устройство для создания дозированного давления на поверхность аппликатора.
21. Устройство по п. 17 отличающееся тем, что диапазон излучения источников электромагнитного излучения выбирают из группы, включающей в себя оптический и/или ближний инфракрасный; средний инфракрасный; дальний инфракрасный и/или терагерцовый; микроволновый диапазон излучения.
22. Устройство по и. 19, в котором датчиком осмотического давления межклеточного вещества или датчиком количества воды в межклеточном пространстве ткани в локальном объеме под аппликатором представляет собой электрометрический датчик, основанный на измерении электрофизических характеристик рогового слоя эпидермиса и ткани под аппликатором, принцип измерения которого выбирается из группы, включающей измерение поперечной электропроводности рогового слоя эпидермиса на постоянном и/или переменном токе; измерение диэлектрической проницаемости рогового слоя эпидермиса; измерение электропроводности и/или диэлектрической проницаемости ткани под аппликатором.
23. Устройство по и. 19, в котором датчиком осмотического давления межклеточного вещества или датчиком количества воды в межклеточном пространстве ткани в локальном объеме под аппликатором является спектральный датчик, основанный на спектральных измерениях характеристик живой ткани под аппликатором, содержащий источник и приемник электромагнитного излучения.
24. Устройство по и 23, отличающееся тем, что длину волны электромагнитного излучения источника спектрального датчика определяют по характеристическим частотам поглощения биохимических компонентов межклеточного вещества и/или внутриклеточного вещества, которые выбирают из группы, включающей в себя воду, гиалуроновую кислоту, глюкозу и другие биохимические компоненты межклеточного вещества и межклеточной жидкости.
25. Устройство по и. 19, отличающееся тем, датчиком осмотического давления межклеточного вещества является спектральный датчик, основанный на спектральных измерениях характеристик межклеточного вещества в терагерцовом диапазоне на длине волны, соответствующей энергии поперечной связи между мономерами полимерной цепи гиалуроновой кислоты.
26. Устройство по и. 23, отличающееся тем, что спектральный датчик основан на спектральных измерениях количества воды в роговом слое эпидермиса по характеристическим частотам воды в роговом слое на основе спектрального метода, который выбирают из группы, включающей в себя изотермическую калориметрическую спектроскопию, абсорбционную спектроскопию, спектроскопию диффузионного отражения, спектроскопию комбинационного рассеяния, оптико-акустическую спектроскопию.
27. Устройство по любому из пунктов 17-26, отличающееся тем, что дополнительно содержит спектральное устройство, включающее источник и приемник электромагнитного излучения, для спектральных измерений на основе диффузионной отражательной спектроскопии.
28. Устройство по и.17, отличающееся тем, что датчик физиологических параметров, характеризующего термодинамическое фазовое состояние межклеточного вещества под аппликатором, выполнен на пьезоэлектрическом способе измерения.
29. Устройство по любому из пунктов 17-27, отличающееся тем, что устройство применимо для ранней диагностики сахарного диабета на основе временной динамики концентрации биохимического параметра и/или величины осмотического давления межклеточного вещества.
30. Способ получения биополимерной молекулы с заданными биологическими свойствами и заданной пространственной структурой, состоящей из одной или нескольких субъединиц, способной к самопроизвольной укладке в пространственную конфигурацию с гетерофазной структурой, обладающей специфичностью к одной или нескольким заданным молекулам субстрата S, при определенном составе растворителя, при определенных условиях по температуре и давлению, заключающийся в том, что число субъединиц определяют на основе трехмерной пространственной структуры макромолекулы, при этом первичную структуру каждой субъединицы биополимерной молекулы определяют следующим образом:
- определяют или задают константу равновесия процесса связывания молекулы субстрата S с мономером полимерной цепи биополимерной молекулы посредством образования водородной связи;
- определяют энергию активации и/или энергию водородной связи молекулы субстрата S с мономером полимерной цепи биополимерной молекулы, соответствующую величине константы равновесия;
- по величине энергии активации и/или энергии связи идентифицируют мономеры, которые образуют первичную структуру каждой субъединицы биополимерной макромолекулы, а именно, по меньшей мере, пару мономеров А и В, образующих повторяющийся мономер А В полимерной цепи, в которой А - мономер, содержащая группу, обладающую отрицательным электрическим зарядом, и В - нейтрально незаряженный мономер, с которым молекула субстрата S может образовать водородную связь, энергия которой соответствует заданной константе равновесия;
- по величине энергии активации и /или энергии связи идентифицируют одновалентные ионы растворителя, соответствующие двум разным соединениям, способным образовать слабую ионную связь с заряженным мономером, при этом один из ионов, ион М, выбирается с константой равновесия близкой к константе равновесия субстрата S;
- определяют кислотность растворителя pH, определяющую отрицательный заряд мономера А, концентрации ионов, температуру и давление;
- определяют число мономеров в цепи;
- получают биополимерную молекулу с заданной первичной структурой с помощью методов генной и/или белковой инженерии;
- получают раствор биополимерной молекулы в растворителе, пространственная структура и характеристики которого соответствуют заданным.
31. Способ по п.30, отличающийся тем, что мономер А полимерной цепи обладает положительным зарядом, а ион M растворите ля обладает отрицательным зарядом.
32. Способ по и.30, отличающийся тем, что ионом М растворителя является одновалентным положительно заряженный ион металла.
33. Способ по п.30, отличающийся тем, что первичной структурой биополимерной макромолекулы, состоящей из одной субъединицы, является полисахаридная цепь, повторяющийся мономер которого содержит, по меньшей мере, одну разновидность дисахаридной пары, образованной одним моносахаридом А с отрицательно заряженной группой и одним нейтральным моносахаридом В, не обладающим заряженной группой.
34. Способ по п.ЗЗ, отличающийся тем, что первичной структурой биополимерной макромолекулы, состоящей из одной субъединицы, является полимерная цепь гиалуроновой кислоты, молекулой субстрата является молекула глюкозы, одновалентным ионом металла М является ион натрия, при этом химический состав растворителя близок к химическому составу плазмы крови и межклеточной среды живой системы, при физиологических условиях in vivo.
35. Способ по и. 34, отличающийся тем, что в состав растворителя добавляют двухвалентный ион и/или вещество, молекула которого обладает способностью образовать двухвалентную ионную связь с отрицательно заряженными мономерами полимерной цепи гиалуроновой кислоты.
36. Способ по и.30, отличающийся тем, что биополимерной молекулой, состоящей из одной субъединицы, является полипептидная цепь из аминокислот, с повторяющимися мономерами, содержащими по меньшей мере одну аминокислоту с отрицательно заряженной группой Ra и одну аминокислоту с нейтральной незаряженной группой 7?ь, одновалентным ионом металлам является ион калия, при этом химический состав растворителя близок к химическому составу внутриклеточной среды живой системы при физиологических условиях in vivo.
37. Способ по и.30, отличающийся тем, что в состав растворителя добавляют дополнительные двухвалентные ионы металла или двухвалентные соединения, которые выбирают из группы, включающей ион магния Mg+2, марганца Мп+2, ионы других металлов и соединений.
38. Способ по и.30, отличающийся тем, что субстратом является молекула D- глюкозы и/ или молекула другого моносахарида.
39. Способ по и.30, отличающийся тем, что биополимерная молекула с гетерофазной структурой представляет собой биосенсор с избирательностью к заданной молекуле субстрата S, активный в водной среде, преобразующий сигнал концентрации субстрата S в сигнал, пропорциональный объему макромолекулы и/или внутримолекулярному осмотическому давлению, который измеряется электронным устройством.
40. Способ по и. 39, отличающаяся тем, что биополимерной молекулой является полисахарид гиалуроновой кислоты, обладающий избирательностью к молекуле глюкозы.
41. Способ по и.30, отличающийся тем, что биополимерная молекула с заданными биологическими свойствами, состоящая из двух субъединиц, способная к самопроизвольной укладке в пространственную конфигурацию с гетерофазной структурой, обладающая специфичностью к заданной молекуле субстрата S, при определенном составе растворителя, при определенных условиях по температуре и давлению, и заключающийся в том, что для каждой из двух субъединиц определяется первичная структура следующим образом:
- определяют или задают константу равновесия процесса связывания молекулы субстрата S с мономером полимерной цепи биополимерной молекулы посредством образования водородной связи;
- определяют энергию активации и/или энергию водородной связи молекулы субстрата S с мономером полимерной цепи биополимерной молекулы, соответствующую величине константы равновесия;
- по величине энергии связи идентифицируют мономеры, которые образуют первичную структуру первой субъединицы биополимерной макромолекулы, а именно, по меньшей мере, пару мономеров А1 и В1, образующих повторяющийся мономер —А1— В1— полимерной цепи, в которой Л I - мономер, содержащая группу, обладающую отрицательным электрическим зарядом, и В1 - нейтрально незаряженный мономер, с которым молекула субстрата S может образовать водородную связь, энергия которой соответствует заданной константе равновесия;
- идентифицируют мономеры, которые образуют первичную структуру второй субъединицы биополимерной макромолекулы, а именно, по меньшей мере, пару мономеров А2 и В2. образующих повторяющийся мономер — А2- В2— полимерной цепи, в которой Л2 - мономер, содержащая группу, обладающую положительным электрическим зарядом, и В2 - нейтрально незаряженный мономер, с которым молекула субстрата S может образовать водородную связь, энергия которой соответствует заданной константе равновесия; по величине энергии связи идентифицируют одновалентные ионы растворителя, соответствующие двум разным соединениям или веществам, способным образовать слабую ионную связь с заряженными мономером, при этом один из ионов, ион М, выбирается с константой равновесия близкой к константе равновесия субстрата S;
- определяют кислотность растворителя pH, определяющую отрицательный заряд мономера А, концентрации ионов, температуру и давление;
- определяют число мономеров в цепи;
- получают биополимерную цепь, состоящую из двух субъединиц, с заданной первичной структурой с помощью методов генной и/или белковой инженерии;
- получают раствор биополимерной молекулы в растворителе, характеристики которого соответствуют заданным.
42. Способ по п.41, отличающийся тем, что субъединицами являются полипептидные цепи из аминокислот.
43. Способ по п.42, отличающийся тем, что для каждой субъединицы определяют расположение в цепи повторяющихся мономеров, характеризующих взаимодействие между субъединицами, образующих уникальную аминокислотную конфигурацию активного центра белковой молекулы, который образуется в процессе пространственной укладки в области пространства между доменами субъединиц.
44. Способ по любому из пп.30, 41, отличающийся тем, что биополимерная молекула с гетерофазной структурой представляет собой биологический катализатор с заданными характеристиками и избирательностью к заданной молекуле субстрата S, активный в водной среде, катализирующий биохимические реакции с участием молекулы субстрата S.
45. Способ по любому из пи. 36, 44, отличающийся тем, что биополимерная молекула представляет собой фермент с заданными характеристиками на основе биополимерной молекулы с гетерофазной структурой.
46. Способ по и. 41, отличающийся тем, что первичная структура биополимерной молекулы с заданными биологическими свойствами определяется по характеристикам фермента гексокиназы, константе равновесия и скорости биохимической реакции, которую катализирует фермент.
47. Способ по и. 41, отличающийся тем, что первичная структура биополимерной молекулы с заданными биологическими свойствами определяется по характеристикам фермента глюкокиназы, константе равновесия и скорости биохимической реакции, которую катализирует фермент.
48. Способ по и.30, отличающийся тем, что при заданном составе растворителя и заданной первичной структуре биополимерной молекулы, состоящей из 2 и более субъединиц, определяют четвертичную пространственную структуру макромолекулы следующим образом:
- определяют аминоконцевые группы белковой биополимерной молекулы, которыми отделены полипептидные цепи субъединиц, образующих первичную структуру белковой биополимерной молекулы;
- определяют для каждой субъединицы структуру элементарной цепочки взаимодействия, характеризующей взаимодействие полимерной цепи с растворителем; для этого определяют молекулу субстрата и идентифицируют одновалентный ион в составе растворителя для каждой субъединицы;
- для каждой субъединицы вычисляют константу равновесия, энергию активации и определяют объем трехмерного домена;
- определяют наиболее вероятную трехмерную пространственную конфигурацию доменов, соответствующих субъединицам.
49. Способ по и.48, отличающийся тем, что биополимерной молекулой, первичная структура которой состоит из 2 и более субъединиц, является олигомерный белок.
50. Биополимерная молекула с гетерофазной структурой, представляющая собой биосенсор с селективностью к заданной молекуле субстрата и полученная способом и. 30, проявляющая активность в водной среде.
51. Биополимерная молекула с гетерофазной структурой, обладающая избирательностью к ПО заданной биологической молекуле субстрата S, представляющая собой биологический катализатор для катализа биохимической реакции с участием молекулы субстрата S, полученная способом по и. 30.
52. Биополимерная молекула с гетерофазной структурой, обладающая избирательностью к заданной молекуле субстрата S, представляющая собой фермент для катализа биохимической реакции с участием молекулы субстрата S, полученная способом по и. 30, 41.
53. Биополимерная молекула по и. 50, характеризующаяся специфичностью к молекуле глюкозы, а также тем, что:
- биополимерная молекула представляет собой сополимер, которым является полисахарид гиалуроновой кислоты;
- компонентами растворителя с заданной кислотностью одновременно являются ионы натрия и калия, молекула глюкоза.
54. Биополимерная молекула по и. 51, характеризующаяся специфичностью к молекуле глюкозы, и отличающаяся тем, что биополимерная молекула представляется собой полипептидную цепь, повторяющийся мономер которой содержит аминокислоту с отрицательно заряженной боковой группой, которую выбирают из группы, состоящей из глутаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты, глицина, цистеина, тирозина, при этом, аминокислоту с незаряженной боковой группой выбирают из группы, содержащей серин, аспарагин, треонин, глутамин.
55. Биополимерная молекула по и.54, отличающаяся тем, что аминокислотой с отрицательным зарядом боковой группы является глутаминовая кислота; аминокислотой с незаряженной боковой группой является аспарагин; субстратом биохимической реакции является D-глюкоза.
56. Биополимерная молекула по и. 55, отличающаяся тем, что аминокислотой с отрицательным зарядом боковой группы является аспарагиновая кислота; аминокислотой с незаряженной боковой группой является аминокислота, которую выбирают из группы аспарагин, треонин, цистеин, серин; субстратом биохимической реакции является D-глюкоза.
57. Биополимерная молекула по и. 54, 55, 56, отличающаяся тем, что полипептидная цепь дополнительно содержит аминокислоты с положительно заряженными боковыми группами, которые выбирают из группы лизин, аргинин, гистидин.
58. Биополимерная молекула по и. 54, 55, 56, отличающаяся тем, что растворитель дополнительно содержит двухвалентный ион металла, который выбирают из группы, включающей ион магния Mg+2, марганца Мп А ионы других металлов и соединений или другое соединение.
59. Биополимерная молекула, состоящая из двух субъединиц, по и. 51, отличающаяся тем, что полипептидная цепь первой субъединицы содержит аминокислоту с отрицательно заряженной группой бокового остатка, а полипептидная цепь второй субъединицы содержит аминокислоту с положительно заряженной группой бокового остатка.
60. Биополимерная молекула, состоящая из двух субъединиц, по и. 517 отличающаяся тем, что аминокислотами активного центра белка являются серин, боковой остаток которого обладает отрицательно заряженной группой, и гистидин, боковой остаток которого обладает положительно заряженной группой.
61. Биополимерная молекула по п. 53, отличающаяся тем, что является молекулой для создания биополимерного вещества или фармацевтической композиции на основе гиалуроновой кислоты для лечения ран и воспалений тканей.
62. Биополимерная молекула, по и. 51, отличающаяся тем, что является молекулой для создания лекарственного препарата или фармацевтической композиции для лечения сахарного диабета.
63. Способ по и.14, отличающийся тем, что дополнительно измеряют изменения эластического давления ткани под аппликатором.
64. Способ по любому из пунктов 14, 63, отличающийся тем, что определяют величину теплового эффекта метаболизма локального объема ткани под аппликатором.
65. Способ по любому из пунктов 14, 63, отличающийся тем, что определяют величину кровяного давления в системе кровеносных капилляров в локальном объеме ткани под аппликатором.
PCT/RU2020/050324 2019-11-18 2020-11-13 Способ и устройство для спектроскопии живой ткани Ceased WO2021101416A2 (ru)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP20890729.5A EP4108169A4 (en) 2019-11-18 2020-11-13 METHOD AND DEVICE FOR SPECTROSCOPY OF LIVING TISSUE
CN202080094313.1A CN115135240A (zh) 2019-11-18 2020-11-13 用于活组织光谱学的方法与装置
US17/747,380 US20220369958A1 (en) 2019-11-18 2022-05-18 Method and device for living tissue spectroscopy

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2019136897A RU2752711C2 (ru) 2019-11-18 2019-11-18 Способ и устройство для спектроскопии живой ткани
RU2019136897 2019-11-18

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US17/747,380 Continuation-In-Part US20220369958A1 (en) 2019-11-18 2022-05-18 Method and device for living tissue spectroscopy

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2021101416A2 true WO2021101416A2 (ru) 2021-05-27
WO2021101416A3 WO2021101416A3 (ru) 2021-07-15

Family

ID=75920150

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2020/050324 Ceased WO2021101416A2 (ru) 2019-11-18 2020-11-13 Способ и устройство для спектроскопии живой ткани

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20220369958A1 (ru)
EP (1) EP4108169A4 (ru)
CN (1) CN115135240A (ru)
RU (1) RU2752711C2 (ru)
WO (1) WO2021101416A2 (ru)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116124733B (zh) * 2022-12-13 2026-04-03 山东大学 一种基于水光谱组学的鉴别不同降解方式透明质酸的方法和应用
CN117942062B (zh) * 2024-03-27 2024-06-11 天津大学四川创新研究院 一种基于太赫兹波段的皮肤屏障破损检测系统及方法
CN120779030B (zh) * 2025-09-11 2025-11-28 天津医科大学总医院空港医院 用于淋巴组织微环境中eb病毒和浆细胞的检测试剂盒及其制备方法和应用
CN121221111B (zh) * 2025-12-02 2026-03-03 重庆联芯致康生物科技有限公司 一种基于非线性补偿模型的cgm传感器校准方法及系统

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4386604A (en) 1981-02-27 1983-06-07 Daniel Hershey Determination of the basal metabolic rate of humans with a whole-body calorimeter
US5040541A (en) 1985-04-01 1991-08-20 Thermonetics Corporation Whole body calorimeter
US5795305A (en) 1993-12-12 1998-08-18 Ok-Kyung Cho Process and device for non-invasive determination of glucose concentration in parts of the human body
US5823966A (en) 1997-05-20 1998-10-20 Buchert; Janusz Michal Non-invasive continuous blood glucose monitoring
US5890489A (en) 1996-04-23 1999-04-06 Dermal Therapy (Barbados) Inc. Method for non-invasive determination of glucose in body fluids
US5924996A (en) 1994-07-06 1999-07-20 Ok Kyung Cho Process and device for detecting the exchange of heat between the human body and the invented device and its correlation to the glucose concentration in human blood
US6517482B1 (en) 1996-04-23 2003-02-11 Dermal Therapy (Barbados) Inc. Method and apparatus for non-invasive determination of glucose in body fluids
US6522903B1 (en) 2000-10-19 2003-02-18 Medoptix, Inc. Glucose measurement utilizing non-invasive assessment methods
RU2396897C2 (ru) 2005-03-09 2010-08-20 Рамиль Фаритович Мусин Способ и устройство для микрокалориметрического измерения скорости локального метаболизма ткани, содержания воды в межклеточной ткани, концентрации биохимических компонентов крови и давления в сердечно-сосудистой системе

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7039446B2 (en) * 2001-01-26 2006-05-02 Sensys Medical, Inc. Indirect measurement of tissue analytes through tissue properties
GR1004180B (el) * 2000-03-28 2003-03-11 ����������� ����� ��������� (����) Μεθοδος και συστημα χαρακτηρισμου και χαρτογραφησης αλλοιωσεων των ιστων
FI122326B (fi) * 2006-12-15 2011-11-30 Jvs Polymers Oy Heterofaasinen biopolymeerikompositio
GB201207392D0 (en) * 2012-04-27 2012-06-13 Univ Bristol Novel compounds
US20150112170A1 (en) * 2013-10-17 2015-04-23 Amerson, Llc Device and method for non-invasive glucose monitoring
RU2629796C1 (ru) * 2016-05-23 2017-09-04 Общество с ограниченной ответственностью "Лаборатория межклеточных технологий "Интерсел Рэнд" (ООО "Интерсел Рэнд") Способ и мультисенсорное устройство для неинвазивного мониторинга уровня глюкозы в крови

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4386604A (en) 1981-02-27 1983-06-07 Daniel Hershey Determination of the basal metabolic rate of humans with a whole-body calorimeter
US5040541A (en) 1985-04-01 1991-08-20 Thermonetics Corporation Whole body calorimeter
US5795305A (en) 1993-12-12 1998-08-18 Ok-Kyung Cho Process and device for non-invasive determination of glucose concentration in parts of the human body
US5924996A (en) 1994-07-06 1999-07-20 Ok Kyung Cho Process and device for detecting the exchange of heat between the human body and the invented device and its correlation to the glucose concentration in human blood
US5890489A (en) 1996-04-23 1999-04-06 Dermal Therapy (Barbados) Inc. Method for non-invasive determination of glucose in body fluids
US6517482B1 (en) 1996-04-23 2003-02-11 Dermal Therapy (Barbados) Inc. Method and apparatus for non-invasive determination of glucose in body fluids
US5823966A (en) 1997-05-20 1998-10-20 Buchert; Janusz Michal Non-invasive continuous blood glucose monitoring
US6522903B1 (en) 2000-10-19 2003-02-18 Medoptix, Inc. Glucose measurement utilizing non-invasive assessment methods
RU2396897C2 (ru) 2005-03-09 2010-08-20 Рамиль Фаритович Мусин Способ и устройство для микрокалориметрического измерения скорости локального метаболизма ткани, содержания воды в межклеточной ткани, концентрации биохимических компонентов крови и давления в сердечно-сосудистой системе

Non-Patent Citations (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Medicine", HOMEOSTASIS, 1976, pages 464
A. YU. GROSBERGA. R. KHOKHLOV: "Statistical Physics of Macromolecules", 1994, SPRINGER
A.V. KOROBKOVS.A. CHESNOKOVA: "Atlas of normal physiology", M.: HIGHER SCHOOL, 1986, pages 351
A.YU. GROSBERGA.R. KHOKHLOV: "Physics of chain molecules", M.: ZNANIE, 1983
A.YU. GROSBERGA.R. KHOKHLOV: "Statistical physics of macromolecules", M.: NAUKA, 1989
C. B. ANFINSEN: "Molecular Organization and Biological Function (Modern Perspectives in Biology", 1966, UNIV. CHICAGO PRESS
C. BOHR, ZBL. PHYSIOLOGIE, vol. 17, 1903, pages 682
C. KITTEL: "Thermal Physics", 1969, JOHN WILLEY AND SONS, INC.
C. R. CANTORPAUL R. SCHIMMEL: "Biophysical Chemistry", 1978, JOHN WILEY AND SONS, INC, pages: 536
E. CALVEA. PRAT: "Microcalorimetry. M.", 1963, FOREIGN LITERATURE PUBLISHING HOUSE, pages: 477
E. FERMI: "Thermodynamics", 1937, PRENTICE-HALL, INC
E.E. GODIKV.A. MOROZOVR.F. MUSIN: "On the dynamics of relaxation of triboelectric charge on the surface of the stratum corneum of the skin epidermis", BIOPHYSICS, vol. 30, no. 2, 1985, pages 309 - 312
EDSALL J.T.GUTFREUND H: "Equilibrium", 1983, JOHN WILLEY & SONS, article "BIOTHERMODINAMICS. The Study of Biochemical Processes"
F. DYSONE. MONTROLLM. CUTZM. FISHER: "Resistance and phase transitions", 1973, MIR PUBLISHING HOUSE
FORBATH N.HETENYI C: "Glucose dynamics in normal subjects and diabetic patients before and after a glucose load", DIABETES, vol. 15, no. 11, 1966, pages 778 - 789
HADLER N.M.: "Enhanced Diffusivity of Glucose in a Matrix of Hyaluronic Acid", THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 255, no. 8, 1980, pages 3532 - 5
HAH S. E. H.SAUNDERS J.SONKSEN P.H.: "Glucose and free fatty acid turnover in normal subjects and diabetic patients before and after insulin treatment", DIABETOLOGIA, vol. 16, no. 5, 1979, pages 297 - 306
I. M. LIFSHITZA. YU. GROSBERGA. R. KHOKHLOV: "Volume interactions in statistical physics of a polymer macromolecule", UNF, vol. 127, 1979, pages 353 - 389
J. MONODJ. WYMANJ. P. CHANGEUX, J. MOL., BIOL, vol. 12, 1965, pages 88
J.M. GUSSD.W.L. HUKINSP.J.C. SMITHW.T. WINTERS. ARNOTTR. MOORHOUSED.A. REES: "Hyaluronic Acid, Molecular Conformations and Interactions in Two Sodium Salts", J. MOL. BIOL., vol. 95, 1975, pages 359, XP024015426, DOI: 10.1016/0022-2836(75)90196-5
J.W. GIBBS: "Elementary principles in statistical mechanics, developed with especial reference to the rational foundation of thermodynamics", 1948, YALE UNIV. PRESS, pages: 1902
JOHN L. SMITH: "The Pursuit of Noninvasive Glucose", HUNTING THE DECEITFUL TURKEY, 2015
L.E. BOLTZMANN: "Lectures on Gas Theory", 1964, BERKLEY
LEHNINGER A.L.: "Set of Lectures", 1972, WORTH PUBLISHERS, INC., article "Statistical Mechanics"
MUSIN R.F.GODIK E.E.GULYAEV Y.V.MOROZOV V.A.: "Natural water diffusion through the stratum corneum of the human body epidermis and its electrical properties", 3 INTERNATIONAL CONFERENCE ON WATER AND IONS IN BIOLOGICAL SYSTEMS. BUCHAREST, ROMANIA, 1984, pages 34
MUSIN R.F.GODIK E.E.GULYAEV Y.V.MOROZOV V.A.SUDAREV A.M.: "Membrane mechanisms of water transport in epidermis", 4 INTERNATIONAL CONFERENCE ON WATER AND IONS IN BIOLOGICAL SYSTEMS. BUCHAREST, ROMANIA, 1988, pages 167 - 172
PAUL J. FLORY: "The Configuration of Real Polymer Chains", J. CHEM. PHYS., vol. 17, 1949, pages 303
PEUSNER LEONARDO: "Carbohydrate metabolism regulation", 1974, MEDICINA PUBLISHING HOUSE
PTITSYN O. B.: "Protein Folding", 1992, W.H. FREEMAN & CO., article "The molten globule state (Review", pages: 243 - 300
R.F. MUSIN, N.YU. IVANOVA, V.A. MARTYNOVA, V.A. MOROZOV, E.E. GODIK, YU.V. GULYAEV: "On the sensitivity of human skin to infrared heat flows", REPORTS OF THE ACADEMY OF SCIENCES OF THE USSR, vol. 289, no. 3, 1986, pages 718 - 720
R.F. MUSINV.A. MOROZOVAA.M. SUDAREV: "On the mechanisms of water transport in the epidermis", BIOPHYSICS, vol. 35, 1990, pages 653 - 656
R.F. MUSINV.A. MOROZOVAE.E. GODIKYU.V. GULYAAEV: "Electrical properties of the stratum corneum of the human epidermis and water transport in it.", BIOPHYSICS, vol. 31, no. 3, 1986, pages 478 - 480
See also references of EP4108169A4
YA. S. BRODSKY: "Statistics. Probability. Combinatorics", 2008, PUBLISHING HOUSE, article "Mir i Obrazovanie", pages: 544
YAS KUNO: "Human Perspiration", 1959, CHARLES & THOMAS PUBL.
YU.V. GULYAEVE.E> GODIKR.F. MUSINV.A. MOROZOVV.A. MARTYNOVAI.V. VALIEV: "Thresholds of thermal sensitivity of the skin to electromagnetic radiation", SENSORY SYSTEMS, vol. 3, no. 2, 1989, pages 209 - 212

Also Published As

Publication number Publication date
EP4108169A2 (en) 2022-12-28
EP4108169A4 (en) 2024-02-07
RU2019136897A (ru) 2021-05-18
WO2021101416A3 (ru) 2021-07-15
RU2019136897A3 (ru) 2021-05-18
RU2752711C2 (ru) 2021-07-30
CN115135240A (zh) 2022-09-30
US20220369958A1 (en) 2022-11-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2021101416A2 (ru) Способ и устройство для спектроскопии живой ткани
Shokrekhodaei et al. Review of non-invasive glucose sensing techniques: optical, electrical and breath acetone
Hina et al. Noninvasive blood glucose monitoring systems using near-infrared technology—A review
Nitzan et al. The various oximetric techniques used for the evaluation of blood oxygenation
Khalil Non-invasive glucose measurement technologies: an update from 1999 to the dawn of the new millennium
Gowers et al. 3D printed microfluidic device with integrated biosensors for online analysis of subcutaneous human microdialysate
CA2911035C (en) Monitor and system for monitoring an organism
La Count et al. Modeling glucose transport from systemic circulation to sweat
Moser et al. Interstitial glucose and physical exercise in type 1 diabetes: integrative physiology, technology, and the gap in-between
Eggleston et al. Hyperinsulinemia rapidly increases human muscle microvascular perfusion but fails to increase muscle insulin clearance: evidence that a saturable process mediates muscle insulin uptake
US20240156374A1 (en) Method and multisensory device for non-invasive blood glucose level monitoring
Cao et al. Photoacoustic imaging in oxygen detection
Davison et al. Recent progress and perspectives on non-invasive glucose sensors
US20070149868A1 (en) Method and Apparatus for Photostimulation Enhanced Analyte Property Estimation
Sukhotinsky et al. Perfusion pressure-dependent recovery of cortical spreading depression is independent of tissue oxygenation over a wide physiologic range
Piras et al. Effects of acute microcurrent electrical stimulation on muscle function and subsequent recovery strategy
Linares et al. Dose response effect of photobiomodulation on hemodynamic responses and glucose levels in men with type 2 diabetes: a randomized, crossover, double-blind, sham-controlled trial
Eilenberger et al. Cytotoxicity, retention, and anti-inflammatory effects of a CeO2 nanoparticle-based supramolecular complex in a 3D liver cell culture model
Goldbeck et al. The effect of water on the rate of conformational change in protein allostery
Saldanha et al. Application of a nitric oxide sensor in biomedicine
Poonprasartporn et al. A study of WZB117 as a competitive inhibitor of glucose transporter in high glucose treated PANC-1 cells by live-cell FTIR spectroscopy
Bai Noninvasive near infrared spectroscopy on living tissue with multivariate calibration approaches
Cottone et al. A Long Journey into the Investigation of the Structure–Dynamics–Function Paradigm in Proteins through the Activities of the Palermo Biophysics Group
Kong Clinical feasibility of Raman spectroscopy for quantitative blood glucose measurement
Lam Clinical evaluation of non-invasive blood glucose measurement by using near infrared spectroscopy via inter-and intra-subject analysis

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 20890729

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2020890729

Country of ref document: EP

Effective date: 20220620