WO2021117840A1 - Ｍｙｃｌの一過性発現による増殖可能な膵島前駆細胞様細胞の誘導とインスリン陽性細胞への分化誘導 - Google Patents

Ｍｙｃｌの一過性発現による増殖可能な膵島前駆細胞様細胞の誘導とインスリン陽性細胞への分化誘導 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a Mycl gene or an insulin production promoter containing pancreatic islet-like cells into which the Mycl gene has been introduced. It also relates to a pharmaceutical composition for preventing / treating diabetes, which comprises a Mycl gene or a gene product thereof, or islet-like cells into which the Mycl gene has been introduced. Furthermore, the present invention relates to a method of inducing proliferative islet progenitor cell-like cells by transient expression of the Mycl gene and inducing differentiation into insulin-producing cells.
  • Non-Patent Document 1 It has been shown that repeated short-term expression of cell reprogramming factors in individual mice causes pancreatic islet cells to proliferate and glucose tolerance to improve.
  • Islet transplantation is a medical treatment that makes it possible to maintain stable blood glucose by transplanting islet tissue for diabetic diseases, but donor shortage has become a serious problem especially in Japan, and various approaches are used. There is an urgent need to develop a method for regenerating pancreatic islet function. In recent years, the establishment of islet-like insulin-producing cells by inducing differentiation of ES / iPS cells has been reported, but the production technology for functional and large amounts of islet insulin-positive cells has not yet been established, and rejection reactions and rejection reactions have occurred. Problems such as autoimmune reaction are also a concern.
  • An object of the present invention is to provide a means for treating diabetes, which comprises removing islet cells from a subject, inducing in vitro proliferative islet progenitor cell-like cells, and then returning the islet cells to the subject. To do. Furthermore, it is an object of the present invention to provide a means for treating diabetes by transiently overexpressing the Mycl gene in islet cells in the body.
  • proliferative islet progenitor cell-like cells can be induced by introducing the Mycl gene into islet cells and expressing the gene.
  • Proliferating cells express the Fev gene, Pax4 gene, and Cck gene expressed in embryonic pancreatic islet precursor cells in the presence of the Mycl gene, and at the same time express somatostatin and proliferate. , Differentiate into insulin-positive cells as proliferation ceases. That is, they have found that proliferative islet progenitor cell-like cells can be induced by transiently inducing the expression of the Mycl gene, and the proliferated islet progenitor cell-like cells can be differentiated into insulin-positive cells.
  • the invention was completed.
  • the present invention has the following aspects.
  • the Mycl gene (1) Nucleic acid containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3; or (2) Hybridizing with nucleic acid containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3 under stringent conditions, and the Mycl gene
  • the insulin production-promoting agent according to [1] which comprises a nucleic acid encoding a polypeptide having an activity of promoting insulin production when expression is induced.
  • Mycl gene product (1) A polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4; or (2) At least 80%, 85%, 90%, 95%, 97% of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4.
  • the insulin production-promoting agent according to [1] which comprises a polypeptide having 98% or 99% sequence identity and having an effect of proliferating pancreatic islet-like cells and / or an activity of promoting insulin production.
  • the insulin production-promoting agent according to any one of [1] to [4], wherein the Mycl gene is transiently expressed.
  • a pharmaceutical composition for preventing and / or treating diabetes and related diseases (I) Mycl gene or its gene product; vector in which the Mycl gene is integrated; and / or pancreatic islet cells into which the Mycl gene or its gene product has been introduced or whose expression has been induced; and (ii) pharmaceutically acceptable.
  • the pharmaceutical composition comprising an excipient, diluent or carrier.
  • Diabetes mellitus and related diseases are selected from diseases, disorders or symptoms related to type I diabetes, type II diabetes, impaired glucose tolerance, hyperglycemia, dyslipidemia, obesity or metabolic syndrome.
  • the pharmaceutical composition according to [8]. [10] The Mycl gene (1) Nucleic acid containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3; or (2) Hybridizing with nucleic acid containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3 under stringent conditions, and the Mycl gene
  • the Mycl gene product (1) A polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4; or (2) At least 80%, 85%, 90%, 95%, 97% of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 3. , 98%, or 99% of the polypeptide having the effect of proliferating pancreatic islet-like cells and / or promoting insulin production, according to either [8] or [9].
  • the pharmaceutical composition described. A kit containing the insulin production promoter according to any one of [1] to [7] or the pharmaceutical composition according to any one of [8] to [11].
  • a kit further containing an activator for activating the Mycl gene.
  • the activator for activating the Mycl gene consists of a group consisting of a promoter, an enhancer, an enzyme or factor that activates the promoter, an enzyme or factor that activates the enhancer, a nucleic acid protein complex, and a low molecular weight compound.
  • the islet-like cell according to [15] wherein the islet cells are derived from primary islet cells, cultured islet cells, or stem cells isolated from the pancreas.
  • a method comprising the step of introducing an episomal vector into pancreatic islet cells.
  • the method for preparing islet-like cells according to [16] which comprises a step of introducing an RNA encoding a Mycl gene or a Mycl protein into islet cells.
  • the present invention by controlling the expression of the extrinsic or endogenous Mycl gene, it is possible to treat diabetes or a related disease in which insulin production is desired.
  • mouse ES cells capable of inducing Mycl expression The establishment of mouse ES cells capable of inducing Mycl expression is shown. It shows an increase in islets due to Mycl overexpression. It shows the proliferation of somatostatin-positive islet cell-like cells due to Mycl overexpression. It shows the proliferation of somatostatin-positive islet cell-like cells due to Mycl overexpression. It shows the proliferation of somatostatin-positive islet cell-like cells due to Mycl overexpression. Somatostatin-positive islet-like cells proliferated by Mycl overexpression resemble embryonic islet progenitor cells. It shows proliferation induction of pancreatic islet progenitor cell-like cells by Mycl overexpression and proliferation arrest by Mycl overexpression arrest.
  • the present invention relates to a Mycl gene or a gene product thereof, or an insulin production promoter containing pancreatic islet-like cells into which the Mycl gene has been introduced.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing / treating diabetes, which comprises these insulin production promoters.
  • the present invention will be described in detail below.
  • pancreatic islet-like cells and their preparation methods are pancreatic islet-like cells and their preparation methods.
  • pancreatic islet-like cells are islet cells into which the Mycl gene or its gene product has been introduced, as used herein. Point.
  • islet-like cells that have transitioned to the proliferative phase due to forced expression of the Mycl gene may be particularly referred to as “islet progenitor cell-like cells”.
  • islet progenitor cell-like cells Furthermore, by stopping the expression of the gene, it is possible to differentiate into cells having an insulin-producing ability (hereinafter, also referred to as "insulin-producing cells”). That is, according to the present invention, transient expression of the Mycl gene can increase the number of islet-like cells and differentiate them into insulin-producing cells.
  • the "islet progenitor cell-like cell” is, for example, at least one, preferably two, of genes selected from Fev, Pax4, Cck, CDK4, and Ki67. More preferably, 3 or more are positive. Focusing on the proteins expressed, it is also characterized by reduced insulin and glucagon production compared to normal islets, or marked somatostatin production.
  • Pancreatic islet cells are generally called Langerhans islets, which are cell aggregates called pancreatic islets that control the endocrine function of the pancreas and occupy about 1 to 2% of all cells in the pancreas. Refers to endocrine cells.
  • islet cells are mainly composed of five types of cells: ⁇ cells, ⁇ cells, ⁇ cells, ⁇ cells, and PP cells.
  • the main cells that make up the cell aggregate are ⁇ -cells, which occupy the central part of the pancreas. Beta cells make up about 60-80% of the cell assembly and secrete insulin, which allows glucose transfer to most cells in the body.
  • Alpha cells occupy about 10-30% of the islets and secrete glucagon released during starvation, which allows glucose to be released from the liver to maintain normal blood glucose.
  • Delta cells make up about 5-10% of islet cells and secrete somatostatin, which further regulates glucose levels.
  • ⁇ cells and PP cells secrete ghrelin and pancreatic polypeptide, respectively.
  • Pancreatic polypeptide-producing cells release hormones that alter exocrine and gastrointestinal function.
  • islet cell types such as endothelial cells, nerve cells, and progenitor cells.
  • pancreatic islet cells include the pancreatic islet cells described above, pancreatic islet progenitor cells, which are precursor cells of pancreatic islet cells, from the process of development into pancreatic islet cells or from somatic stem cells / pluripotent stem cells. It may be an intermediate cell generated up to the pancreatic islet cell or the pancreatic islet progenitor cell generated in the process of inducing differentiation of.
  • the "intermediate cell” is preferably a cell whose fate is determined to differentiate into islet cells.
  • the islet cells may be those produced from islet-like cells or islet progenitor cell-like cells into which the Mycl gene or a gene product thereof has been introduced in the present invention.
  • type I diabetes lymphocyte-based cell infiltration is observed shortly after the onset. Eventually, ⁇ cells selectively disappear, and the volume of islets decreases, and ⁇ cells become the main constituents. Islet insulin secretion has a reserve, and type I diabetes develops when 90-95% of ⁇ -cells are lost. In type II diabetes, basically no morphological changes are observed in the islets, but the insulin secretory capacity of the islets is reduced.
  • the origin or source of the islet cells into which the Mycl gene or the gene product thereof is introduced is not limited, but the primary islet cells isolated from the pancreas of an individual or the islet cells cultured by a known culture method. There may be.
  • Cultured islet cells are not limited to, but are not limited to, islet cells derived from established pancreatic islet cells and stem cells (eg, iPS cells, ES cells, somatic stem cells) (eg, Kimura, A., et al., Cell). Chemical Biology, 2020, doi.org / 10.1016 / j.chembiol.2020.08.018) can be included.
  • the pancreatic islet cell into which the Mycl gene or a gene product thereof is introduced may be a pancreatic islet-like cell and / or a pancreatic islet cell obtained from a pancreatic islet progenitor cell-like cell, and the pancreatic islet-like cell into which the Mycl gene has already been introduced.
  • the Mycl gene or a gene product thereof may be repeatedly introduced into cells and / or pancreatic islet progenitor cell-like cells.
  • either islet cells collected from a donor or stem cell-derived islet cells can be preferably used.
  • the islet cells from the donor used may be autologous or allogeneic to the recipient.
  • the present invention by introducing the Mycl gene into such islet cells, it is possible to treat diabetes by proliferating pancreatic islet progenitor cell-like cells in vitro and returning (transplanting) them to a patient. ..
  • the immunosuppressant can be administered to the patient as appropriate.
  • the above-mentioned islet-like cells, islet progenitor cell-like cells, cells capable of producing insulin, or any combination thereof can be used for transplantation into a patient.
  • the islets as a raw material of the islet cells before the Mycl gene is introduced may be the islets in which most of the ⁇ cells have been shed, in addition to the islets containing a large number of normal ⁇ cells.
  • the present invention can also be used for gene therapy of type I diabetic patients in which ⁇ cells have been lost by using islet-like cells or the like into which the Mycl gene has been introduced.
  • Pluripotent stem cells are cells that have self-renewal ability and pluripotency, and have the ability to form all the cells that make up a living body. To say. "Self-renewal ability” refers to the ability to make the same undifferentiated cells as oneself from one cell. “Differentiation ability” refers to the ability of a cell to differentiate. Examples of pluripotent stem cells include embryonic stem cells (ES cells), induced pluripotent stem cells (iPS cells), and Muse cells (Multi-lineage differentiting cell). (Germline stem cell: GS cell), embryonic germ cell (EMbryonic germ cell: EG cell) and the like are included, but are not limited thereto.
  • the pluripotent stem cells used in the present invention are preferably ES cells.
  • the origin of pluripotent stem cells may be any of mammals, birds, fish, reptiles and amphibians, and is not particularly limited. Mammals include primates (humans, monkeys, etc.), rodents (mouses, rats, guinea pigs, etc.), cats, dogs, rabbits, sheep, pigs, cows, horses, donkeys, goats, ferrets and the like.
  • ES cells are pluripotent stem cells that have the ability to differentiate into all histiocytes that make up an individual that exists early in development and have been strained for in vitro culture. Means things. ES cells can be expanded virtually indefinitely while retaining the ability to differentiate into all the cells that make up an individual, similar to pluripotent stem cells in early embryos. Specifically, mouse ES cells were first described in 1981 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 7634-7638, 1981; Nature 292, 154-156, 1981). ES cells are pluripotent and can generate all the tissues and cell types that make up an individual. Rats (Inanaconns et al., Dev. Biol.
  • Pluripotent embryonic stem cells have been isolated from a wide variety of species, including Sci. USA 92,7844-7848, 1995).
  • the ES cells that can be used in the present invention include, but are not limited to, KH2 cells, RF8 cells, JI cells, CGR8 cells, MG1.19 cells, 129SV cells, C57 / BL6 cells, DBA-1 cells and the like. ..
  • any established ES cell line can be used.
  • a method of producing a cloned embryo using the somatic cells of the individual and establishing an ES cell line from the cloned embryo is used. It is valid. By using this method, it is possible to establish ES cells having the same genetic elements as the individual.
  • somatic cell clone a phenomenon called "reprogramming" occurs in which the nucleus of the somatic cell introduced into the egg changes to the same state as the nucleus of the fertilized egg.
  • ES cells also have an activity similar to that of an egg (Curr. Biol., 11, 1553-1558, 2001). That is, it is expected that somatic cells can be converted into cells such as ES cells by fusing individual somatic cells and ES cells. Since ES cells can be genetically engineered in vitro, by performing this with ES cells in which factors involved in immune rejection such as MHC genes have been engineered in advance, there is no need to use techniques such as somatic cell cloning embryo production. It is expected that rejection can be avoided.
  • iPS cells are obtained by introducing genes for transcription factors such as Oct3 / 4, Sox2, Klf4, and c-Myc into somatic cells. , Means a cell having pluripotency similar to ES cells. iPS cells, like ES cells, can be expanded indefinitely while maintaining pluripotency.
  • the basic method for producing iPS cells is a method of introducing four transcription factors Oct3 / 4, Sox2, Klf4 and c-Myc into cells using a virus (Takahashi K, Yamanaka).
  • cells that can be used for producing iPS cells that is, cells from which iPS cells are derived, lymphocytes (T cells, B cells), fibroblasts, epithelial cells, endothelial cells, mucosal epithelial cells, etc. Examples include lobular stem cells, hematopoietic stem cells, adipose stem cells, dental pulp stem cells, and nerve stem cells.
  • Reprogramming of iPS cells can be performed by a method well known to those skilled in the art, for example, Addgene's Blog / Post, "Delivery Methods for Generating iPSCs" (https://blog.addgene.org/delivery-methods- For-generating-ipscs).
  • the method for introducing the Mycl gene into iPS cells is not limited, but is limited to recombinant viruses (eg, retrovirus, lentivirus, adenovirus, Sendaivirus, etc.), recombinant plasmids, minicircles, or episomes (eg, oriP /).
  • Examples thereof include an introduction method using an Epstein-Barr nuclear antigen-1 (EBNA1) -based episomal vector), or a method of directly introducing an RNA (including mRNA) encoding the Mycl gene or the Mycl protein itself into a cell.
  • EBNA1 Epstein-Barr nuclear antigen-1
  • RNA including mRNA
  • EG cell means any embryonic germ cell produced from a primordial germ cell, and its origin is not particularly limited.
  • GS cell is a germ cell produced from testicular germ cells, and is a cell line capable of culturing sperm stem cells (sperm stem cells) in vitro (Cell. 119,1001-1012, 2004).
  • mGS cells multipotent germline stem cells
  • ES cells embryonic germline stem cells
  • pluripotency pluripotency
  • Mycl gene and its gene product Mycl is one of the members belonging to the family of Myc genes including c-Myc gene and Mycn ("N-Myc" gene). ..
  • the Mycl gene like the c-Myc gene, is an oncogene and is also known as a reprogramming gene.
  • the Mycl gene unlike the c-Myc gene, has been found to have almost no transforming ability (Nakagawa, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 107, p. 14152-14157, 2010).
  • the cDNA sequence information of Mycl mice and humans is the NM of NCBI accession number, respectively. 008506 and NM It can be obtained by reference to 001033081, and one of ordinary skill in the art can easily isolate the cDNA.
  • the isolated Mycl gene and its gene product it is preferable to use the isolated Mycl gene and its gene product.
  • the base sequence of the Mycl gene can be specified by the NCBI accession number, but the Mycl genes that can be used include single-stranded or double-stranded DNA and its RNA complement.
  • DNA includes, for example, naturally occurring DNA, recombinant DNA, chemically synthesized DNA, PCR-amplified DNA, and combinations thereof. DNA is preferable as the nucleic acid used in the present invention.
  • pancreatic islet cells into which the Mycl gene has been introduced are the Mycl genes.
  • the expression is not particularly limited as long as it has an action of causing cell proliferation by expression of the above-mentioned substance and promoting insulin production by stopping the expression of the substance.
  • the Mycl gene is (1) Nucleic acid containing or consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3; or (2) Hybrid with nucleic acid containing or consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3 under stringent conditions. Nucleic acid encoding a polypeptide having the activity of proliferating pancreatic islet-like cells into which the Mycl gene has been introduced; or (3) Nucleic acid containing or consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3 and stringent.
  • stringent conditions means hybridizing under moderate or high stringent conditions.
  • moderate stringent conditions can be readily determined by one of ordinary skill in the art, for example, based on the length of the DNA.
  • the basic conditions are Sambook, J. et al. Et al., Molecular Cloning, A Laboratory Hybrid (3rd edition), Cold Spring Hybrid Laboratory, 7.42-7.45 (2001), but with respect to the nitrocellulose filter, 5 ⁇ SSC, 0.5% SDS, 1.
  • hybridization conditions of other similar hybridization solutions such as's solution
  • washing conditions of about 60 ° C., 0.5 ⁇ SSC, 0.1% SDS are included.
  • High stringent conditions can also be readily determined by one of ordinary skill in the art, eg, based on DNA length. In general, these conditions include hybridization and / or washing at temperatures higher than moderately stringent conditions and / or lower salt concentrations, eg, hybridization conditions as described above, and about 68 ° C. Defined with a 0.2 ⁇ SSC, 0.1% SDS wash. Those skilled in the art will recognize that the temperature and wash solution salt concentration can be adjusted as needed according to factors such as probe length.
  • the homologous nucleic acid cloned by using the nucleic acid amplification reaction or hybridization as described above is at least 30% or more, preferably 50% or more, respectively, with respect to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 3. It has more preferably 70% or more, even more preferably 90% or more, even more preferably 95% or more, and most preferably 98% or more identity.
  • the percentage of identity can be determined by visual inspection and mathematical calculation. Alternatively, the percent identity of the two nucleic acid sequences can be found in Devereux et al., Nucl. Acids Res. , 12, 387 (1984), and determined by comparing sequence information using the GAP computer program (GCG Wisconsin Package, version 10.3) available from the University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). can do.
  • the gene product of the Mycl gene is a polypeptide expressed from the Mycl gene described above.
  • the polypeptide is (1) A polypeptide containing or consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4; or (2) At least 80%, 85%, 90%, 95% with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4. , 97%, 98%, or 99% sequence identity, and can be a polypeptide having the effect of proliferating pancreatic islet-like cells and / or promoting insulin production.
  • the gene product of the Mycl gene may be a variant of the polypeptide defined above, with one or more amino acid deletions, substitutions, or insertions in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4. And / or an amino acid sequence containing an addition.
  • the substitution may be a conservative substitution, which is to replace a particular amino acid residue with a residue having similar physicochemical characteristics.
  • conservative substitutions include substitutions between aliphatic group-containing amino acid residues such as substitutions between Ile, Val, Leu or Ala, between Lys and Arg, Glu and Asp, Gln and Asn. It includes substitutions between polar residues such as substitutions.
  • Variants due to amino acid deletions, substitutions, insertions and / or additions can be added to the Mycl gene, eg, site-directed mutagenesis (eg, Nucleic Acid Research, Vol. 10, No. 20, p. 6487), which is a well-known technique. It can be prepared by applying -6500, 1982).
  • site-directed mutagenesis eg, Nucleic Acid Research, Vol. 10, No. 20, p. 6487
  • the term “one or more amino acids” means amino acids that can be deleted, substituted, inserted and / or added by a site-directed mutagenesis method. Further, in the present specification, "one or more amino acids” may mean one or several amino acids depending on the case.
  • a gene is used as a method of deleting, substituting, inserting and / or adding one or more amino acids while maintaining the activity of the amino acid sequence of the polypeptide.
  • a gene product of the Mycl gene in the present invention is 1 to 10, preferably 9 or less, 7 or less, 5 or less, 3 or less, or 2 or less in SEQ ID NO: 2 or 4.
  • it may be a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which one or less amino acids are deleted, substituted or added, and has an activity of promoting insulin production.
  • the variant further has at least 80% or more, preferably 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more amino acid identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • a protein containing an amino acid sequence having sex which is a polypeptide having an effect of proliferating pancreatic islet-like cells and / or an effect of promoting insulin production.
  • The% identity of the two amino acid sequences may be determined by visual inspection and mathematical calculation. Alternatively, the percent identity of the two protein sequences can be determined by Needleman, S. et al. B. And Wunsch, C.I. D. Determined based on the algorithm of (J. Mol. Biol., 48: 443-453, 1970) and by comparing sequence information using the GAP computer program available from the University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). You may.
  • the preferred default parameters of the GAP program are: (1) Henikoff, S. et al. And Henikoff, J. et al. G. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 10915-10919, 1992), scoring matrix, blossom62; (2) 12 gap weights; (3) 4 gap length weights; And (4) no penalty for end gaps.
  • the method for introducing the Mycl gene into primary islet cells, cultured islet cells, or stem cells is not particularly limited.
  • a method known to the trader can be used.
  • “transformation” or “transfection” is common, which is induced in cells after uptake of exogenous nucleic acid (eg, exogenous DNA or RNA to host cells).
  • exogenous nucleic acid eg, exogenous DNA or RNA to host cells.
  • genetic alterations can be achieved by incorporating the exogenous nucleic acid into the genome of the host cell, or by maintaining the exogenous nucleic acid transiently or stably as an episomal component or independently.
  • the introduced Mycl gene may be in a state of being integrated into the genome of the host cell or exists as an episomal component as long as it can control the on / off of the expression of the gene.
  • the plasmid or vector containing the gene may be present in the cytoplasm as it is.
  • a "vector” is used to introduce an exogenous nucleic acid (preferably DNA) into a host cell.
  • the vector includes viruses, especially attenuated viruses and / or non-replicatable viruses.
  • the viral vector include a retrovirus vector, a lentiviral vector, an adenovirus vector, an adeno-associated virus vector, and a Sendai virus vector.
  • the vector can also contain regulatory sequences such as promoters, enhancers, ribosome binding sequences, terminators, polyadenylation sites, etc. to allow expression of exogenous nucleic acids.
  • promoter also comprises a promoter component sufficient for promoter-dependent gene expression that is cell type-specifically controllable, tissue-specifically controllable, or inducible by an external signal or drug. Is intended. Such components may be located in the 5'or 3'region of the native gene.
  • functionally bound means that the DNA sequence and the control sequence are bound so that they can be expressed when the appropriate molecule (eg, a transcriptionally activated protein) is bound to the control sequence. Means that you are.
  • the introduction of the vector into the host cell is not limited, but the electroporation method (Meiner, V. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 14041-14406 (1996), etc.), calcium phosphate, etc. It is carried out by the method, the DEAE-dextran method, or a method using a lipid for gene transfer (lipofectamine, lipofectin, etc.).
  • the cells into which the vector has been introduced can then be selected based on the characteristics of the marker gene (eg, drug resistance gene).
  • the correct homologous recombination in the selected cells can be confirmed by Southern blotting or the like using a part of the target exogenous nucleic acid as a probe. In this way, a cell containing a gene of interest, specifically, a gene in which a marker gene is knocked into the Mycl gene in a heterozygous manner can be produced.
  • a KH2 strain having a Frt sequence downstream of the Cola1 locus and expressing M2-rtTA, which is a reverse tetracycline-regulated transactivator, under the control of the endogenous Rosa26 promoter can be used ( Beard C, et al., Genesis, vol.44, p.23-28 (2006)).
  • the Mycl gene can be introduced into the ES cells by a method well known to those skilled in the art.
  • the Mycl gene is TA cloned into an entry vector, pCR8-GW-TOPO vector (manufactured by Invitrogen Life Technologies).
  • a Colla1-TetOP-AttR1-ccdbB-AttR2-ires-mCherry vector is subjected to an LR reaction, and the TetOP-Mycl-ires-mCherry vector is used as a gene transfer vector.
  • the "TetOP (operon)" sequence in the vector is a sequence to which a reverse tetracycline-regulating transactivator binds (tetracycline response factor: TRE), and is a reverse tetracycline such as doxycycline (Dox) added to cells.
  • the reverse tetracycline-regulated transactivator expressed from the host cell binds in a dependent manner, and the expression of the gene linked downstream thereof is induced.
  • iris internal ribosome entry site
  • mCherry is a gene (reporter gene) encoding a red fluorescent protein.
  • the present invention can proliferate pancreatic islet-like cells and differentiate into insulin-producing cells by controlling the transient expression of the Mycl gene.
  • the present invention is characterized by transient expression of the Mycl gene, but when the Mycl gene is transiently expressed, the Mycl gene is introduced along with cell division of pancreatic islet-like cells. Since the number of cells decreases relatively, the expression level of the Mycl gene can be naturally decreased or stopped over time. That is, in one embodiment, the present invention achieves the object of the present invention by "on” control of the expression of the Mycl gene. In another embodiment, it is also possible to force the expression of the Mycl gene to be "off” (hereinafter referred to as "on / off” control).
  • the expression of the Mycl gene introduced into the host cell can be controlled on / off. That is, in the presence of reverse tetracycline, the Mycl gene can continue to be expressed intracellularly and proliferate islet-like cells, while removing reverse tetracycline arrests the proliferation of islet-like cells and insulin-producing cells. Can induce differentiation into.
  • the transient expression (on state) of the Mycl gene introduced into islet-like cells is at least 2 days to a maximum of 100 days from the start of cell culture, for example, 90 days, 80 days, 70 days, 60 days. It is preferably a period of days.
  • the islet-like cells into which the Mycl gene has been introduced preferably proliferate during the above period.
  • a "photoregulatory viral vector” (Tahara, M., et al.) That can accurately switch on / off the gene expression and cell proliferation of the viral vector by light irradiation. , PNAS, vol.116, 11587-11589, 2019) can be used.
  • This is a gene in which a gene encoding an optical switch protein called a magnet is introduced into a viral vector, and the expression of the target gene incorporated into the vector can be controlled by using blue light.
  • an episomal vector (Okita K., et al., Nat Methods 2011 May 8 (5): 409-412), Sendai virus, RNA vector ( Warren L., et al., Cell Stem Cell 2010 Nov 7 (5): 618-630) can be mentioned.
  • the method used for the reprogramming (establishment) of iPS cells described above that is, the method for temporarily inducing a gene
  • the method used for the reprogramming (establishment) of iPS cells described above that is, the method for temporarily inducing a gene
  • the object of the present invention can be achieved by forcibly expressing the Mycl gene endogenous to the cell in addition to introducing the isolated exogenous Mycl gene.
  • the means for expressing the endogenous Mycl gene is not limited, but the wild-type promoter or enhancer is replaced with a strong promoter or enhancer for operably inducing the expression of the Mycl gene, and the gene is forcibly expressed. It may be a method. Examples of promoters used for substitution include cytometric (CMV) promoters, which are potent promoters, inducible promoters that function in the presence of an inducer, and the like.
  • CMV cytometric
  • examples of the enhancer used for substitution include SV40 enhancer, herpes B virus enhancer, cytomegalovirus enhancer, ⁇ -fetoprotein enhancer and the like.
  • CRISPR-type II including CRISPR-dCas9, as well as histone modifications, a demethylase capable of activating promoters and / or enhancers on the genome recognition sequences of CRISPR-type I, TALEN, ZFN.
  • a molecule to which an enzyme, a transcriptional activator, specifically VP64, p65, Rta or the like is added can be used.
  • the promoters and enhancers described above, enzymes and factors that activate them, or nucleic acid protein complexes or low molecular weight compounds may be referred to as "activators" for activating the Mycl gene. ..
  • Introduction of Gene Product of Mycl Gene Product into cells can be performed by a general method of introducing a foreign gene or protein into cells.
  • methods include, but are not limited to, transfection reagents, viruses, electroporation, particle gun, sonoporation, liposome fusion, and micromanipulators, laser irradiation. Examples thereof include an introduction method by forming pores in the cell membrane.
  • ES cells into a mammal to prepare a chimeric mammal
  • any medium known to those skilled in the art can be used for culturing ES cells into which the above-mentioned Mycl gene has been introduced.
  • feeder cells for example, MEF (mouse embryonic fibroblasts)
  • the ES cells are cultivated on the feeder cells in an ES cell medium (for example, for example).
  • a mouse will be described as an example of a mammal, but a method for producing a knock-in mouse is well known to those skilled in the art.
  • a chimeric mouse is prepared by injecting the above ES cells into a blastocyst of a mouse (for example, C57BL / 6 or the like) and transplanting it into the uterus of a pseudopregnant female mouse (ICR or the like). be able to.
  • a chimeric mouse and a normal mouse (C57BL / 6, etc.) can be crossed to prepare a heterozygous mutant mouse in which the Mycl gene is heterozygously knocked in.
  • a homozygous mutant mouse in which the Mycl gene is homozygously knocked in can be obtained.
  • ECAT3 knock-in mice (Tokuzawa, Y., et al., Molecular and Cellular Biology, 23 (8): 2699-2708 (2003)), ECAT4 knock-in mice (Mitsui, K., et.) al., Cell, 113: 631-642 (2003)), ECAT5 knock-in mouse (Takahashi, K., K. Mitsui, and S. Yamanaka, Nature, 423 (6939): p541-545 (2003), JP-A-2003). -No. 265166), etc.).
  • the chimeric mammal can be produced not only by the above ES cells but also by using iPS cells.
  • blastocyst complementation techniques can be used to create organs from human iPS cells in non-human mammals.
  • Nakauchi et al. Generated human pancreas derived from human iPS in vivo of apancreatic cloned pigs (Nakauchu, H., et al., PNAS, Vol. 110, No. 1, 4557- 4562 (2013)).
  • the method for inducing the Mycl gene can be selected according to the method described above used for introducing the gene into cells. For example, when the Mycl gene is introduced into a cell using the TetOP-Mycl-ires-mCherry vector as described above as a gene transfer vector, the reverse expressed from the host cell depending on the reverse tetracycline such as Doxycycline (Dox). A tetracycline-regulated trans-activator binds to it, and the Mycl gene linked downstream thereof can be expressed to induce the proliferation of pancreatic islet-like cells.
  • the concentration of Dox added to the cell culture system can be adjusted as appropriate. For example, it may be 1 to 100 mg / mL.
  • the proliferation can be stopped by, for example, substituting with a medium containing no Dox, and cell differentiation such as insulin production can be induced.
  • islet-like cell proliferation can be induced in the pancreas by feeding chimeric non-human mammals, for example, water containing Dox.
  • concentration of Dox when added to water may be, for example, 1 to 100 mg / mL, preferably 2.0 mg / mL.
  • pancreatic Islet Cell or Progenitor Cell thereof Having Insulin Producing Ability a method for producing pancreatic islet cell or progenitor cell thereof having insulin producing ability is provided.
  • a production method is not limited, but using primary pancreatic islet cells, cultured pancreatic islet cells, or pancreatic islet cells derived from stem cells as a raw material, the Mycl gene is introduced into the pancreatic islet cells, and the cells are proliferated by forced expression of the Mycl gene. After that, by stopping the expression of the gene, pancreatic islet cells having an insulin-producing ability or progenitor cells thereof are obtained.
  • the forced expression and arrest of the Mycl gene can be, for example, an alternative means for controlling the expression of the gene on / off (for example, the use of a photoregulatory viral vector), or a doxycycline-sensitive reverse tetracycline control.
  • Sex transactivators can be utilized.
  • islet cell progenitor cells or “islet progenitor cells” are cells (or cell groups) that are in the process of differentiating into insulin-producing islet cells after arrest of Mycl gene expression. ),
  • one or more markers selected from the group consisting of PDX1 positive, PTF1a positive, NKX6.1 positive, Fev positive, Pax4 positive, and Cck gene can be identified as an index.
  • an islet cell amplification promoter an islet function improver, an insulin production promoter containing the Mycl gene or a gene product thereof as an active ingredient; the above active ingredient and other pharmaceutically acceptable ingredients (eg, carrier).
  • Use of the Mycl gene is provided.
  • a method of administering the Mycl gene or its gene product to a subject for the purpose of preventing and / or treating diabetes in vivo method
  • islet-like cells, islet precursors into which the Mycl gene or its gene product has been introduced in vitro A method (exvivo method) of transplanting a cell-like cell, an insulin-producing cell (hereinafter, may be simply referred to as “islet-like cell or the like”) or any combination thereof into a subject is provided.
  • the Exvivo method of the present invention is intended to have a different aspect depending on the cells used.
  • pancreatic islet-like cells obtained by gene transfer into adult pancreatic island-derived cells are produced in allogeneic in vitro or autologous in vitro (exvivo method in a narrow sense including both);
  • pancreatic islet-like cells obtained by inducing differentiation.
  • a mode (in a broad sense) for producing pancreatic islet-like cells obtained by introducing the Mycl gene of pancreatic islet-like cells derived from stem cells (iPS cells, ES cells, somatic stem cells, etc.) in allogeneic in vitro or autologous in vitro.
  • the cells are autologous or allogeneic to the patient, a known method, specifically Nature Medicine volume 22, pages306-311 (2016). , Doi: 10.1038 / nm. 4030, Nature Biomedical Engineering volume 2, pages 810-821 (2016). , DOI: 10.1038 / s41551-018-0275-1, EBioMedine 12 (2016) 255-262. , DOI: https: // doi. org / 10.1016 / j. eviom.
  • the islets to be transplanted may be encapsulated and administered by the method described in 2016.08.034 or the like. By encapsulating the islets to be transplanted, it is possible to use no immunosuppressive drug or reduce the dose of the immunosuppressive drug.
  • the isolated pancreatic islets can be appropriately genetically edited.
  • the gene editing is not particularly limited, but specifically, modification of a mutant gene contained in pancreatic islet cells by genome editing, modification of molecules that cause an immune reaction such as surface antigens such as HLA and GAD protein, Beta-2 Microglobulin and Preferred therapeutic features can be added, such as inducing immune tolerance by deleting the RFX5, RFXANK, RFXAP, and CIITA genes.
  • the method of gene editing is not particularly limited, and examples thereof include transposon vectors such as CRISPR-Cas9, TALEN, ZFN, CRISPR-Cas3, CRISPR-TypeID and variants thereof, and piggyBAC for expressing functional molecules. Listed as
  • Indication disease A disease to which the Mycl gene or its gene product can be applied based on the above-mentioned embodiment is a state in which insulin is not sufficiently functioning in a living body (typically, insulin resistance and decreased insulin secretion). It is a disease. According to the present invention, insulin production can be promoted by the Mycl gene or a gene product thereof, and has an action of lowering blood glucose in, for example, a diabetic patient. Indications are typically diabetes, but more specifically severe hypoglycemia, type I diabetes (including slowly progressive type 1 diabetes or type 1.5 diabetes), type II diabetes, and glucose tolerance.
  • the type of diabetes that can be treated by the method described in the present specification is not particularly limited, but the present method provides a treatment that secretes physiological insulin depending on the blood glucose level and is less likely to cause hypoglycemia.
  • severe hypoglycemia it is known as one embodiment because it is known to those skilled in the art that donor pancreatic islets have a remarkable effect on severe hypoglycemia, although it is not limited.
  • the methods described in the literature can be used.
  • the method described in the known literature referred to here is not limited, but for example, Diabetes Care 2016 Jul; 39 (7): 1230-1240. , DOI: 10.237 / dc15-1988, The New England Journal of Medicine.
  • islet cells, islet-like cells, islet progenitor cell-like cells, or insulin which is not the cell transplantation described in the known literature, but is equal to, preferably more than the islet cell transplantation amount described in the known literature.
  • a method of administering the Mycl gene or a gene product thereof to a subject (in vivo method) capable of amplifying the producing cells can be selected.
  • type I diabetes When used for the treatment of type I diabetes, there is no particular limitation, but as one aspect of the treatment for type I diabetes, for example, insulin in patients with type I diabetes at any time, on an empty stomach, after glucose loading and / or after glucagon stimulation.
  • the number of islet cells, islet-like cells, islet precursor cell-like cells, or insulin-producing cells contained may be adjusted according to the blood glucose level and / or the amount of C-peptide, by the method described herein.
  • the dosage of the agent for performing in vivo treatment may be determined.
  • Patients with type I diabetes who are insulin depleted are at increased risk of developing hypoglycemic symptoms, and from the viewpoint that treatment using the methods described herein is preferred, for example, on an empty stomach and / or during glucagon stimulation. It is possible to treat a type I diabetic patient having a blood C-peptide amount of 0.5 ng / mL or less, preferably 0.2 ng / mL or less, more preferably 0.1 ng / mL or less.
  • the specific dose of the drug may be adjusted with reference to, for example, the transplantation amount of the donor pancreatic islets that are usually transplanted for the indication of severe hypoglycemia.
  • islet cells, islet-like cells, and islet progenitor cells equivalent to 500 IEQ / kg or more, preferably 1000 IEQ / kg or more, more preferably 2000 IEQ / kg or more, and even more preferably 5000 IEQ / kg or more.
  • Islets or insulin-producing cells Alternatively, a method (in vivo method) of administering the Mycl gene or a gene product thereof capable of amplifying islet-like cells, islet progenitor cell-like cells, or insulin-producing cells to the same extent can be selected.
  • type II diabetes when used for the treatment of type II diabetes, there is no particular limitation, but for example, as one embodiment, it can be used as a therapeutic agent for insulin-dependent type II diabetes in which the amount of insulin secreted into the body is insufficient.
  • the number of progenitor cell-like cells or insulin-producing cells may be adjusted, or the dosage of the agent for performing in vivo treatment may be determined by the methods described herein.
  • the amount of C-peptide in blood during fasting and / or glucagon stimulation is 0.5 ng / mL or less, preferably 0.2 ng / mL or less. , More preferably 0.1 ng / mL or less of type II diabetic patients can be treated.
  • the specific dose of the drug may be adjusted with reference to, for example, the transplantation amount of the donor pancreatic islets that is usually transplanted for the indication of severe hypoglycemia.
  • islet cells, islet-like cells, and islet progenitor cells equivalent to 500 IEQ / kg or more, preferably 1000 IEQ / kg or more, more preferably 2000 IEQ / kg or more, and even more preferably 5000 IEQ / kg or more.
  • Islets or insulin-producing cells Alternatively, a method (in vivo method) of administering the Mycl gene or a gene product thereof capable of amplifying islet-like cells, islet progenitor cell-like cells, or insulin-producing cells to the same extent can be selected.
  • the agent contained in the same manner as type I diabetes and / or type II diabetes according to the amount of insulin, blood glucose level and / or C-peptide in the body.
  • the amount can be adjusted.
  • the islet cells, islet-like cells, islet progenitor cell-like cells, or insulin-producing cells amplified by the methods herein are preferably derived from the patient's own cells.
  • the type of autoantibodies and HLA against pancreatic islet cells in the blood is investigated in advance, and before or after falling into an insulin-dependent state and / or an insulin-depleted state.
  • the islet cells of the autologous can be amplified by the method described herein after that, treatment that does not require an immunosuppressant can be performed, and the transition to an insulin-dependent state and / or an insulin-depleted state can be prevented, or Insulin dependence and / or insulin depletion can be treated.
  • the autoantibody against the pancreatic islet cells in the blood and the type of HLA are not particularly limited as long as they are involved in the slowly progressive type I diabetes, but for example, pancreatic islet cells.
  • Known methods include checking whether pancreatic islet-related autoantibodies such as antibody (ICA), GAD antibody, insulin autoantibody (IAA), and IA-2 antibody are duplicated or alone positive.
  • ICA antibody
  • GAD antibody insulin autoantibody
  • IA-2 antibody IA-2 antibody
  • the ex vivo method is preferable for the treatment of severe hypoglycemia, but the islet cells can be amplified in the body (in vivo) by the method described in the present specification. .. Since the islet cells amplified in this way have the same effect as the ex vivo method, a treatment method for amplifying the islets in vivo can be preferably selected as a treatment method for severe hypoglycemia as in the ex vivo method. .. Furthermore, for the treatment of type I diabetes, type II diabetes, and slowly progressive type I diabetes, as in the case of the ex vivo method, the sex, age, body weight, condition of the affected area, condition of the cells used, etc. are taken into consideration in the body. You can choose how to amplify islet cells (in vivo). At this time, a method of amplifying islet cells in the body (in vivo) and an ex vivo method can also be combined.
  • prevention means preventing or delaying the onset / delay of the onset / onset of the disease or its symptoms, or reducing the risk of onset / onset.
  • Treatment includes alleviating (mitigating) the symptoms characteristic of the target disease or associated symptoms, preventing or delaying the exacerbation of the symptoms, and the treatment includes improvement of the disease. .. "Prevention" is
  • the Mycl gene of the present invention or a gene product thereof can be used as a pancreatic islet cell amplification promoter, islet function improver, insulin production promoter or pharmaceutical composition for prevention and treatment of the above-mentioned indication diseases.
  • the islet cell amplification promoter any one of ⁇ cells, ⁇ cells, ⁇ cells, ⁇ cells, and PP cells contained in the islets, preferably any two or more islet cells, is used.
  • one aspect of the islet function improving agent is an agent that improves a part or all of the functions of the islets in the living body by administration, and a part of the functions of the islets is, for example, pancreatic islet cells.
  • Glucagon-regulating action, hypoglycemic action by insulin, glucose production / release action by glucagon, gustrin, secretin, insulin and / or glucagon secretion-suppressing action or gastrointestinal nutrient absorption-suppressing action by somatostatin, appetite-regulating action by grelin, pancreatic Specific examples include the islet contraction-regulating action and the appetite-regulating action of the polypeptide.
  • an agent that promotes physiological insulin secretion according to the blood glucose level which is one of the functions of pancreatic islets in the living body
  • an agent that promotes physiological insulin secretion according to the blood glucose level which is one of the functions of pancreatic islets in the living body
  • other pharmaceutically acceptable ingredients eg, carriers, excipients, disintegration.
  • an activator for activating the Mycl gene may be included.
  • the islet cells derived from the living body into which the Mycl gene or its gene product is introduced may be islet cells of a healthy person, or a type I diabetic patient or terminal type II induction in which some or most of the ⁇ cells have disappeared. It can be islet cells from patients with urinary disease. In this case, the islet cells may be autologous or allogeneic to the recipient.
  • the cell preparation and pharmaceutical composition of the present invention can be obtained by suspending the islet-like cells obtained above in a physiological saline solution or an appropriate buffer solution (for example, phosphate buffered physiological saline solution). ..
  • the number of cells required for treatment can be obtained by forcibly expressing the Mycl gene and appropriately proliferating the cells.
  • pancreatic islet cells pancreatic islet-like cells, pancreatic islet progenitor cell-like cells, or insulin-producing cells in cell preparations and pharmaceutical compositions
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • serum albumin serum albumin
  • an antibiotic or the like may be contained in the cell preparation and the pharmaceutical composition.
  • other pharmaceutically acceptable ingredients eg, carriers, excipients, disintegrants, buffers, emulsifiers, suspensions, soothing agents, stabilizers, preservatives, preservatives, saline, etc.
  • It may be contained in a cell preparation and a pharmaceutical composition.
  • Those skilled in the art can add these factors and agents to cell preparations and pharmaceutical compositions at appropriate concentrations.
  • the number of islet cells, islet-like cells, islet progenitor cell-like cells, or insulin-producing cells contained in the cell preparations and pharmaceutical compositions prepared above is desired in the prevention and / or treatment of diabetes and related diseases.
  • lowering of blood glucose level can be appropriately adjusted in consideration of the sex, age, body weight, condition of the affected area, condition of cells to be used, and the like.
  • the insulin production promoting and pharmaceutical compositions of the present invention can be administered to various subjects, for example, mammals such as primates, humans, dogs, cats, cows, horses, pigs, sheep, etc. are intended and preferably. It is a human.
  • the route of administration to the subject is not limited, but can be administered parenterally, for example, to any place capable of responding to glucose in the body by injection or infusion. Specifically, for example, it can be transplanted or administered intrapancreatically, subcapsularly, preferably subcutaneously, intraperitoneally, more preferably intravascularly, intravenously, and even more preferably intraportally.
  • the method for activating the administered Mycl gene in vivo is not limited, but the above-mentioned “on” control or “on and / or off” control system for Mycl gene expression can be used.
  • the above-mentioned "photoregulatory viral vector” (Tahara, M., et al., PNAS, vol.116, 11587-11589, 2019) may be used.
  • markers specifically expressed in islet cells for example, PDX1, C-peptide, insulin, MafA, Mnx1, Pax4, Pax6, NeuroD1, Isl1, Nkx2). .2, Ngn3, HNF1a, Foxa2, Nkx6.1, glucagon, Arx, MafB, RFX6, IRX1, IRX2, somatostatin
  • the route of administration to the subject when selecting a method of amplifying islet cells in the body (in vivo) is not limited, but is, for example, intrapancreatic, subcutaneous, intraperitoneal, preferably intravascular, intravenous, and even more preferably. Specific examples include the inside of the celiac artery and the inside of the pancreatic duct.
  • a subject having diabetes or a disease related thereto is prevented and / or treated by using the Mycl gene or a gene product thereof, pancreatic islet-like cells, or any combination thereof.
  • the method is provided.
  • an activator for activating the Mycl gene can be administered, and it is administered before, simultaneously with, or after the administration of the insulin production promoter or the pharmaceutical composition. May be good.
  • kits used for preventing and / or treating diabetes or a disease related thereto which comprises an insulin production promoter or a pharmaceutical composition.
  • a kit can include instructions for administration or transplantation of the insulin production promoter or pharmaceutical composition to a subject.
  • the kit may also further include an activator for activating the Mycl gene.
  • Method (i) Establishment of ES cells capable of inducing Myc, Mycn, and Mycl expression in a Dox-dependent manner Cloning of Myc, Mycn, and Mycl cDNAs from ES cell-derived cDNAs was performed, and this cloning fragment was used as a pCR8-GW-TOPO vector. It was inserted into (Invitrogen).
  • the Col1a1-TetOP-Mycl-ires-mCherry vector prepared by performing an LR reaction between the pCR8-Mycl-TOPO vector into which each Myc gene has been inserted and the TetOP-AttR1-ccdbB-AttR2-ires-mCherry vector (hereinafter, "targeting vector").
  • targeting vector was inserted into the Col1a1 locus of KH2-ES cells by using a flip-in recombination system (Beard et al., 2006).
  • hygromycin B (Roche) was selected at 150 ⁇ g / mL, and the formed colonies were picked up to establish an ES cell line capable of inducing the expression of each Myc gene in a Dox-dependent manner.
  • knock out-DMEM containing 15% FBS, 50 U / mL P / S, L-glutamine, NEAA, 2-mercaptoethanol (2ME: GIBCO) and LIF (SIGMA) Gelatin coat (SIGMA) was carried out using the medium to which the above was added, and the feeder cells were cultured in a seeded dish.
  • the cells were treated with 0.25% trypsin / 1 mM EDTA (GIBCO) at 37 ° C. for about 3 minutes, and about 1/10 of the cell suspension was seeded on a new dish.
  • RNA recovery cultured cells were washed with PBS ( ⁇ ) (Nakalai Tasque), and then the cells were lysed with 350 ⁇ L of LBP buffer. Nucreo Spin® RNA Plus (TAKARA) was used for RNA extraction and the recommended protocol was followed. For the synthesis of cDNA, a Primescript single-stranded cDNA synthesis kit (TAKARA) was used and the recommended protocol was followed.
  • X Pancreatic islet culture (three-dimensional culture method using gel) After adding 20 uL of Matrigel (CORNING) containing isolated pancreatic islets to a 96-well plate (CORNING), Matrigel was gelled by incubating at 37 ° C. for 15 minutes. Then, 140 ⁇ L of a medium containing a growth factor (see the table below) was added, and the cells were cultured at 37 ° C. at 5% CO 2.
  • CORNING Matrigel
  • Pancreatic islet culture (suspension culture) 2 mL of medium was added to a 6-well plate, and a cell culture insert (Millipore) was suspended on the medium. The isolated pancreatic islets and 20 ⁇ L of the medium were added on the cell culture insert, and the cells were cultured at 37 ° C. and 5% CO 2.
  • IPGTT Intraperitoneal glucose tolerance test
  • the Mycl expression group and the control group were fasted for 12 to 16 hours. Then, the body weight of each mouse was measured, and the D-glucose solution was injected into the abdominal cavity of the mouse so as to be D-glucose 2 g / kg (mouse). After 15, 30, 60, and 120 minutes, blood from each mouse was collected from the tail, and the blood glucose level was measured using an Antsens table (HORIBA).
  • HORIBA Antsens table
  • mice Preparation of diabetic mice Weigh immunodeficient mice (NOD / SCID) 8 to 12 weeks old and apply streptozotocin solution to 150 mg / kg of streptozotocin (STZ) (Sigma-Aldrich). Was injected intraperitoneally. One week later, the blood glucose level was measured using an Antsens table (Horiba), and mice having a blood glucose level of 250 mg / dL or more were used as diabetic mice at any time.
  • STZ streptozotocin
  • Xiv Islet transplant (subcapsular transplant)
  • Diabetic mice were anesthetized by intraperitoneal injection of Somnopentil (Kyoritsu Seiyaku Co., Ltd.). After laparotomy, the renal capsule was incised using an injection needle. A silicone tube was inserted under the renal capsule and the islets were transplanted under the renal capsule using a Hamilton syringe. After transplantation, the silicone tube was removed and the peritoneum / capsule was sutured.
  • Example 1 Establishment of mouse ES cells capable of inducing Mycl expression Whether or not the ES cell line into which the Mycl gene prepared above is integrated can be expressed in a Dox-dependent manner was examined.
  • the expression of the Mycl gene can be confirmed by the expression of the mCherry gene integrated downstream of the gene.
  • the mCherry gene is a gene encoding a red fluorescent protein, and expression of the gene causes cells to develop a red color.
  • FIG. 1 when the gene expression before and after the addition of Dox was compared, the Mycl gene expression was remarkably increased, and it was found that the Mycl expression-inducible mouse ES cells could be established.
  • Example 2 Proliferation of islet cells due to Mycl overexpression (formation of neuroendocrine tumor) Dox was administered to 8-week-old chimeric mice expressing the Mycl gene prepared above for 8 weeks. Mice were sacrificed 8 weeks after Dox administration, the pancreas was removed, and pancreas sections were histochemically evaluated. As shown by the arrows in FIG. 2, it can be seen that in the pancreatic tissue in which Mycl was overexpressed by induction by Dox, the islet cells proliferated and the islets were enlarged as compared with the normal pancreatic tissue.
  • Example 3 Proliferation of islet progenitor cell-like cells by Mycl overexpression 4 weeks after administration of Dox to chimeric mice, the proliferation of somatostatin-positive cells was examined. As shown in Example 2, by expressing the Mycl gene in the islet cells, it is possible to induce the proliferation of the islet cells. As shown in FIGS. 3 to 6, proliferating cells show gene expression similar to pancreatic islet progenitor cells in the presence of the Mycl gene, and at the same time express and proliferate somatostatin, whereas insulin-positive cells are proliferating. Diminished.
  • Example 4 Proliferation of somatostatin-positive islet cell-like cells by Mycl overexpression
  • proliferation of somatostatin-positive cells and insulin-positive cells was examined 8 weeks after Dox administration.
  • insulin-positive cells decreased and somatostatin-positive cells increased significantly.
  • Example 5 Dedifferentiation into islet progenitor cell-like cells by Mycl overexpression
  • gene expression analysis was performed on the enlarged islets 8 weeks after the administration of Dox. It is thought that islets differentiate into each islet cell from islet progenitor cells using Ngn3 as a marker, via islet progenitor cells using Fev as a marker (FIG. 6).
  • Fv is a marker of progenitor cells
  • Pax4 and Cck which are expressed at the same time
  • Example 6 Insulin-positive cell induction by cessation of Mycl expression
  • Dox administration was stopped after 8 weeks, and then the increase and decrease of insulin-positive cells and somatostatin-positive cells were observed 2 and 4 weeks later. did.
  • FIG. 5 two and four weeks after the Dox administration was stopped, the insulin-positive cells that had decreased once increased, and in contrast, the somatostatin-positive cells that had increased once increased. It decreased (Fig. 8). From this result, it was suggested that the islet progenitor cell-like cells proliferated by Mycl overexpression were transformed into insulin-positive cells by stopping Mycl expression.
  • Ki67 which is known as a target protein for cell proliferation ability
  • the period of Dox administration increased and the number of proliferating cells (Ki-positive cells) increased.
  • the number of cells decreased significantly and cell proliferation stopped (Fig. 7).
  • Example 7 Enhancement of glucose tolerance by transient overexpression of Mycl
  • glucose tolerance when administration of Dox was stopped was evaluated. As shown on the left side of FIG. 9, it can be seen that glucose tolerance is enhanced in the mice in which Dox administration was stopped as compared with the control (“cont.”). In addition, the blood glucose level on an empty stomach was consistently maintained, suggesting that the increased pancreatic islets in vivo are functional islets (Fig. 9, right).
  • Example 8 Induction of islet cell proliferation in vitro by Mycl overexpression (1) Induction of Mycl expression in isolated islets The pancreas was excised from the chimeric mouse, and then the induction of Mycl expression in the isolated islets was examined. .. The Mycl expression was observed over time with the start of Dox addition as day 0, and the results are shown in FIG. Compared with the control, the Dox-added system tended to increase islets over time with the expression of the Mycl gene.
  • Example 9 Evaluation of the functionality of in vitro growth-induced islet cells The functionality of the proliferated islet cells was examined by transplanting the in vitro growth-induced islet cells by Mycl overexpression into diabetic mice. The 30 isolated islets were dispersed and Dox was added for 1 week to induce the growth of islet cells. When these islet cells were collected and transplanted under the renal capsule of diabetic mice, improvement in blood glucose was observed at any time. Two weeks later, the kidneys transplanted with pancreatic islet cells were removed, and the diabetic mice returned to hyperglycemia. Generally, 300 or more islet transplants are required to lower the blood glucose level of diabetic mice. We succeeded in lowering the blood glucose level of diabetic mice with islet-like cells grown from 60 islets.
  • Example 10 Verification of therapeutic effect in a diabetic mouse model by inducing Mycl expression A diabetic mouse model was prepared and the therapeutic effect by inducing Mycl expression was verified. A diabetic mouse model was prepared by intraperitoneally administering streptozotocin (STZ) (toxic to pancreatic ⁇ cells) to an 8-week-old Mycl expression-inducible mouse (KH2-Mycl) at a dose of 150 mg / kg. did. From 2 weeks to 8 weeks after that, the expression of Mycl was induced by Dox administration. The expression of Mycl was stopped by stopping the administration of Dox for another 2 weeks. At this point, a sugar responsiveness test (IPGTT) and histological analysis were performed.
  • STZ streptozotocin
  • KH2-Mycl 8-week-old Mycl expression-inducible mouse
  • IPGTT sugar responsiveness test
  • Example 11 Mycl induces expression of MYC family genes (“Myc”, “Mycn”, and “Mycl”) that do not induce abnormal growth other than pancreatic islets, respectively, in a Dox-dependent manner in vivo. Therefore, these genes are first introduced. ES cells capable of inducing expression were established (upper part of FIG. 15). Chimeric mice were prepared by injecting these ES cells into blastocysts. The expression of the MYC family gene was induced by adding Dox for 4 weeks from the time when the chimeric mouse was 4 weeks old.
  • MYC family genes (“Myc”, “Mycn”, and “Mycl”
  • Myc expression induction showed tumor formation in the liver, and Mycn expression induction showed tumor formation in the liver and intestine, while Mycl expression induction did not show abnormal growth in at least the liver and small intestine (lower part of FIG. 15). This suggests that Mycl proliferates specifically in islets.
  • Example 12 Pancreatic islet hyperplasia in aged mice
  • Pancreatic islet cells were isolated from aged mice (115 weeks old), and lentivirus capable of inducing the expression of Mycl and pZsGreenDR vectors (Takara, cat # 632428) (control group) in a Dox-dependent manner was used.
  • the zsGreenDR used is a short-lived green fluorescent protein in which a proteolytic signal is fused to the C-terminal of zsGreen.
  • pancreatic islet cells were transferred to a three-dimensional culture using Matrigel, and at the same time, Dox was administered to induce the expression of Mycl and zsGreenDR, respectively.
  • the islet cells in which the expression of zsGreenDR was induced did not change in morphology even after 7 days (Fig. 16, right).
  • an increase in islet cells was observed by inducing the expression of Mycl (Fig. 16, left). From this result, it was clarified that pancreatic islet hyperplasia by inducing the expression of Mcyl is possible even in a very old mouse.
  • Example 13 Expression of Mcyl in human islet progenitor cells
  • a paper submitted in 2020 JR Albarez-Dominguez, et al., Circadian Differentiants Migrations Migration of Human In Vitro Islands, Cell, Cell, Cell, Cell, Cell, Cell, Cell. In -122, 2020
  • the molecular profile when human pancreatic ⁇ cells were gradually induced to differentiate from human iPS cells was observed. Therefore, using this data set, gene expression of the MYC family (described above) and H3K27ac (chromatin mark generally indicating transcriptional activation) were observed (FIG. 17).
  • Mycl may contribute to the proliferation of islet cells in human islet cells as well as in mice.
  • Example 14 Confirmation of islet hyperplasia in humans Human islet cells were infected with a lentivirus capable of inducing the expression of Mycl and zsGreenDR (control group) in a Dox-dependent manner. The next day, the islet cells were transferred to a three-dimensional culture using Matrigel, and at the same time, Dox was administered to induce the expression of Mycl and zsGreenDR, respectively.
  • the islet cells in which the expression of zsGreenDR was induced did not change in morphology even after 7 days, but an increase in the islet cells was observed when the expression of MYCL was induced (Fig. 18, lower left). Furthermore, as a result of immunostaining, Ki67 (cell proliferation marker) was detected in cells in which mCherry expression was observed (synonymous with MYCL expression) in the group in which MYCL was overexpressed (Fig. 18 lower right).
  • Example 15 Confirmation of islet hyperplasia in humans by single cell analysis Human islet cells were infected with lentivirus capable of inducing the expression of Mycl, MYCL, and zsGreenDR (control group) in a Dox-dependent manner. The next day, the cells were transferred to suspension culture using a cell culture insert, and at the same time, Dox was administered to induce the expression of Mycl and zsGreenDR, respectively. After 7 days, dead cells were removed, and then single-cell RNA-seq was performed according to a conventional method.
  • ⁇ cells, ⁇ cells, ⁇ cells, pancreatic duct cells (“PP”), mesenchymal cells, vascular endothelial cells, and stellate cells were detected (Fig. 19, left).
  • CDK4 which is a marker of cell proliferation
  • CDK4 was not affected by the induction of zsGreenDR expression, but on the other hand, CDK4 was not affected by the induction of expression of Mycl and MYCL. Expression was induced. From this, it was found that human pancreatic islet cells can also proliferate by inducing the expression of Mycl.
  • the present invention it is necessary to transiently express Mycl in donor-derived islet cells and pluripotent stem cell-derived islet cells, but by introducing an episomal vector, RNA, etc., a large amount can be obtained without genetic modification. It is also possible to establish islet cells. In addition, islet cells proliferated using this technique are expected to be able to proliferate and maintain as islet stock cell lines. The islet stock cell line has the potential to provide long-term, stable, and large quantities of insulin-positive cells. It is expected that inexpensive and high-quality islets can be provided to many diabetic patients in the future.

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Abstract

ＥＳ／ｉＰＳ細胞を分化誘導させることにより膵島様インスリン産生細胞の樹立が報告されているが、機能的かつ大量の膵島インスリン陽性細胞の作製技術確立には至っておらず、また拒絶反応や事故免疫反応等の問題も懸念されている。本発明は、Ｍｙｃｌ遺伝子を導入した膵島様細胞、及びＭｙｃｌ遺伝子の一過性発現によって膵島様細胞を増殖誘導し、インスリン産生細胞へ分解誘導する方法を提供する。

Description

Ｍｙｃｌの一過性発現による増殖可能な膵島前駆細胞様細胞の誘導とインスリン陽性細胞への分化誘導
　本発明は、Ｍｙｃｌ遺伝子、又は該Ｍｙｃｌ遺伝子を導入した膵島様細胞を含むインスリン産生促進剤に関する。また、Ｍｙｃｌ遺伝子若しくはその遺伝子産物、又は該Ｍｙｃｌ遺伝子を導入した膵島様細胞を含む、糖尿病を予防／治療するための医薬組成物に関する。さらに、本発明は、Ｍｙｃｌ遺伝子の一過性発現によって増殖可能な膵島前駆細胞様細胞を誘導し、インスリン産生細胞へ分化誘導する方法に関する。
　マウス個体内で細胞初期化因子の短時間発現を繰り返すと、膵島細胞が増殖し、耐糖能が改善することが示されている（非特許文献１）。
　膵島移植は糖尿病疾患に対して膵島組織を移植することで血糖を安定に保たせることを可能とする医療であるが、特に日本においてはドナー不足が深刻な問題となっており、様々なアプローチによる膵島機能再生方法の開発が早急に求められている。近年では、ＥＳ／ｉＰＳ細胞を分化誘導させることにより膵島様インスリン産生細胞の樹立が報告されているが、機能的かつ大量の膵島インスリン陽性細胞の作製技術確立には至っておらず、また拒絶反応や自己免疫反応等の問題も懸念されている。
Cell, 2016, 167, 1719-1733, e12. doi: 10/1016/j. cell. 2016. 11. 052
　Ｍｙｃｌ遺伝子の一過性発現による膵島インスリン産生細胞の増殖技術は、少数のドナー由来の膵島から機能的かつ大量の膵島インスリン産生細胞を樹立できることが期待される。さらに、ＥＳ／ｉＰＳ細胞から膵島インスリン細胞の誘導過程において本技術を適応すれば、幹細胞からのインスリン陽性細胞の効率的な作製が期待できる。本発明は、膵島細胞を対象から取り出し、インビトロで増殖可能な膵島前駆細胞様細胞を誘導した後に、膵島細胞を対象に戻すことを含む、糖尿病を治療するための手段を提供することを目的とする。さらに、本発明は、体内の膵島細胞にＭｙｃｌ遺伝子を一過的に過剰発現させることによる、糖尿病を治療するための手段を提供することを目的とする。
　本発明者らは、膵島細胞にＭｙｃｌ遺伝子を導入し、該遺伝子を発現させることによって、増殖可能な膵島前駆細胞様細胞を誘導させ得ることを見出した。増殖細胞は、Ｍｙｃｌ遺伝子存在下では胎生期の膵島前駆細胞で発現するＦｅｖ遺伝子、Ｐａｘ４遺伝子、及びＣｃｋ遺伝子を発現しながら、同時にソマトスタチンを発現し増殖しているが、Ｍｙｃｌ遺伝子発現を停止させると、増殖の停止とともにインスリン陽性細胞に分化する。すなわち、一過的にＭｙｃｌ遺伝子を発現誘導させることにより、増殖可能な膵島前駆細胞様細胞を誘導可能であり、増殖させた膵島前駆細胞様細胞はインスリン陽性細胞に分化させる得ることを見出し、本願発明を完成させるに至った。
　すなわち本発明は、以下の態様を有する。
　［１］Ｍｙｃｌ遺伝子又はその遺伝子産物を含む、インスリン産生促進剤。
　［２］Ｍｙｃｌ遺伝子が、
　（１）配列番号１又は３で表される塩基配列を含む核酸；又は
　（２）配列番号１又は３で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＭｙｃｌ遺伝子が発現誘導された場合に、インスリン産生を促進する活性を有するポリペプチドをコードする核酸
を含む、［１］に記載のインスリン産生促進剤。
　［３］
　Ｍｙｃｌ遺伝子産物が、
　（１）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；又は
　（２）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、並びに膵島様細胞を増殖させる効果及び／又はインスリン産生を促進する活性を有するポリペプチド
を含む、［１］に記載のインスリン産生促進剤。
　［４］Ｍｙｃｌ遺伝子又はその遺伝子産物が膵島細胞に導入されている、インスリン産生促進剤。
　［５］Ｍｙｃｌ遺伝子が一過的に発現する、［１］～［４］のいずれかに記載のインスリン産生促進剤。
　［６］膵島細胞が、膵臓から単離された初代膵島細胞、培養膵島細胞、又は幹細胞由来である、［４］又は［５］に記載のインスリン産生促進剤。
　［７］幹細胞が、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、及び体性幹細胞からなる群から選択される、［６］に記載のインスリン産生促進剤。
　［８］糖尿病及びそれに関連する疾患を予防及び／又は治療するための医薬組成物であって、
　（ｉ）Ｍｙｃｌ遺伝子若しくはその遺伝子産物；Ｍｙｃｌ遺伝子が組み込まれたベクター；及び／又はＭｙｃｌ遺伝子若しくはその遺伝子産物が導入された又は発現誘導された、膵島細胞；並びに
　（ｉｉ）薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体を含む、前記医薬組成物。
　［９］糖尿病及びそれに関連する疾患が、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、耐糖能障害、高血糖症、異脂肪血症、肥満症又は代謝症候群に関連する疾患、障害又は症状から選択される、［８］に記載の医薬組成物。
　［１０］Ｍｙｃｌ遺伝子が、
　（１）配列番号１又は３で表される塩基配列を含む核酸；又は
　（２）配列番号１又は３で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＭｙｃｌ遺伝子が発現誘導された場合に、インスリン産生を促進する活性を有するポリペプチドをコードする核酸
を含む、［８］又は［９］のいずれかに記載の医薬組成物。
　［１１］Ｍｙｃｌ遺伝子産物が、
　（１）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；又は
　（２）配列番号２又は３で表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、並びに膵島様細胞を増殖させる効果及び／又はインスリン産生を促進する効果を有するポリペプチド
を含む、［８］又は［９］のいずれかに記載の医薬組成物。
　［１２］［１］～［７］のいずれかに記載のインスリン産生促進剤、又は［８］～[１１］のいずれかに記載の医薬組成物を含むキット。
　［１３］Ｍｙｃｌ遺伝子を活性化させるための活性剤をさらに含むキット。
　［１４］Ｍｙｃｌ遺伝子を活性化させるための活性剤が、プロモーター、エンハンサー、プロモーターを活性化する酵素又は因子、エンハンサーを活性化する酵素又は因子、核酸タンパク質複合体、及び低分子化合物からなる群から選択される、［１３］に記載のキット。
　
　［１５］Ｍｙｃｌ遺伝子又はその遺伝子産物が導入された膵島細胞。
　［１６］膵島細胞が、膵臓から単離された初代膵島細胞、培養膵島細胞、又は幹細胞由来である、［１５］に記載の膵島様細胞。
　［１７］［１６］に記載の膵島様細胞を調製する方法であって、
　（ａ）組換えプラスミド、組換えウイルスベクター、ミニサークル、又はエピソーマルベクターにＭｙｃｌ遺伝子を組み込む工程；及び
　（ｂ）工程（ａ）で得られた組換えプラスミド、組換えウイルスベクター、ミニサークル、又はエピソーマルベクターを膵島細胞に導入する工程
を含む方法。
　［１８］［１６］に記載の膵島様細胞を調製する方法であって、Ｍｙｃｌ遺伝子をコードするＲＮＡ、又はＭｙｃｌタンパク質を膵島細胞に導入する工程を含む方法。
　［１９］Ｍｙｃｌ遺伝子を発現させる工程を含む、［１５］若しくは［１６］に記載の膵島様細胞、又は［１７］若しくは［１８］に記載の方法によって調製された膵島様細胞を増殖させる方法。
　［２０］Ｍｙｃｌ遺伝子の発現が一過的であることを特徴とする、［１９］に記載の方法。
　本発明によれば、外因性又は内因性のＭｙｃｌ遺伝子の発現を制御することによって、インスリン産生が望まれる糖尿病又はその関連疾患を治療することができる。
Ｍｙｃｌ発現を誘導可能なマウスＥＳ細胞の樹立を示す。 Ｍｙｃｌ過剰発現による膵島の増大を示す。 Ｍｙｃｌ過剰発現によるソマトスタチン陽性の膵島細胞様細胞の増生を示す。 Ｍｙｃｌ過剰発現によるソマトスタチン陽性の膵島細胞様細胞の増生を示す。 Ｍｙｃｌ過剰発現によるソマトスタチン陽性の膵島細胞様細胞の増生を示す。 Ｍｙｃｌ過剰発現により増生したソマトスタチン陽性の膵島細胞様細胞は胎生期の膵島前駆細胞に類似する。 Ｍｙｃｌ過剰発現による膵島前駆細胞様細胞の増殖誘導とＭｙｃｌ過剰発現停止による増殖停止を示す。 Ｍｙｃｌ発現停止による膵島前駆細胞様細胞のインスリン陽性細胞への分化を示す。 Ｍｙｃｌ一過性過剰発現による耐糖能の亢進を示す。 単離した膵島における試験管内でのＭｙｃｌ発現の誘導および膵島の増大を示す。 単離した膵島から分散させた細胞における試験管内でのＭｙｃｌ発現誘導と膵島細胞の増殖を示す。 ｃ－Ｍｙｃ遺伝子又はＭｙｃｎ遺伝子発現を誘導可能なマウスＥＳ細胞の樹立を示す。 単離した膵島における試験管内でのｃ－Ｍｙｃ遺伝子又はＭｙｃｎ遺伝子発現による細胞死を示す。 糖尿病マウスモデルにおける治療効果を示す。 Ｍｙｃｌは膵島以外に異常増殖を誘導しないことを示す。 老齢マウスにおける膵島増生を示す。 ヒト膵島前駆細胞におけるＭｃｙｌの発現を示す。 ヒトにおける膵島増生を確認した図を示す。 シングルセル解析によりヒトにおける膵島増生を確認した結果を示す。
　本発明は、Ｍｙｃｌ遺伝子若しくはその遺伝子産物、又は該Ｍｙｃｌ遺伝子を導入した膵島様細胞を含むインスリン産生促進剤に関する。これらインスリン産生促進剤を含む、糖尿病を予防／治療するための医薬組成物に関する。本発明を以下に詳細に説明する。
１．膵島様細胞及びその調製法
（１）膵島様細胞
　本明細書において使用するとき、「膵島様細胞」とは、本明細書において使用するとき、Ｍｙｃｌ遺伝子又はその遺伝子産物が導入された、膵島細胞指す。なお、本明細書では、Ｍｙｃｌ遺伝子の強制発現により、増殖期に移行した膵島様細胞を特に「膵島前駆細胞様細胞」と称することがある。さらに、該遺伝子の発現を停止させることによって、インスリン産生能を有する細胞（以下、「インスリン産生細胞」ともいう）に分化させることができる。すなわち、本発明によれば、Ｍｙｃｌ遺伝子の一過性発現により、膵島様細胞の数を増やし、インスリンを産生させる細胞に分化させることができる。ここで、各細胞に発現したマーカーに着目すると、「膵島前駆細胞様細胞」は、例えば、Ｆｅｖ、Ｐａｘ４、Ｃｃｋ、ＣＤＫ４、及びＫｉ６７から選択される遺伝子のうち少なくとも１つ、好ましくは２つ、より好ましくは３つ以上が陽性である。また、発現されるタンパク質に着目すると、特にインスリン及びグルカゴン産生が通常の膵島で認められる場合に比べ低下しているか、又はソマトスタチン産生が顕著であることによっても特徴付けられる。
（２）膵島細胞
　「膵島細胞」とは、一般的に、ランゲルハンス島とも言われ、膵臓の内分泌機能を司る膵島と呼ばれる細胞集合体であって、膵臓の全細胞の約１～２％を占める内分泌細胞を指す。また、膵島細胞は、主にα細胞、β細胞、δ細胞、ε細胞、及びＰＰ細胞の５種類の細胞から構成される。細胞集合体を構成する主要な細胞は、β細胞であり、膵臓の中心部を占めている。β細胞は、細胞集合体の約６０～８０％を占め、体内のほとんどの細胞へのグルコース移行を可能にするインスリンを分泌する。一方、α細胞は、膵島の約１０～３０％を占め、正常の血糖を維持するためにグルコースの肝臓からの放出を可能にする、飢餓の間に放出されるグルカゴンを分泌する。δ細胞は、膵島細胞の約５～１０％を占め、グルコース濃度をさらに調節するソマトスタチンを分泌する。また、ε細胞及びＰＰ細胞は、それぞれ、グレリン及び膵ポリペプチドを分泌越する。膵ポリペプチド産生細胞（膵島細胞の約５～１０％）は、外分泌機能と胃腸機能を変化させるホルモンを放出する。内皮細胞、神経細胞、及び前駆細胞などといった、その他の膵島細胞タイプもある。
　本明細書において使用される場合、膵島細胞には、上記した膵島細胞、膵島細胞の前駆細胞である膵島前駆細胞が含まれ、膵島細胞への発生の過程又は体性幹細胞／多能性幹細胞からの分化誘導の過程で生じる膵島細胞又は膵島前駆細胞に至るまでに生じる、中間体の細胞であってもよい。ここで、「中間体の細胞」とは、好ましくは膵島細胞へ分化することが運命決定されている細胞である。さらに、膵島細胞とは、本発明において、Ｍｙｃｌ遺伝子又はその遺伝子産物が導入された膵島様細胞又は膵島前駆細胞様細胞から作製されたものであってもよい。
　Ｉ型糖尿病では、発症から間もない時期にリンパ球を主体とする細胞浸潤が認められる。やがてβ細胞が選択的に消失するとともに、膵島はその容積が減少し、α細胞が主体となる。膵島のインスリン分泌には予備能があり、９０～９５％のβ細胞が消失した場合にＩ型糖尿病が発症する。ＩＩ型糖尿病では膵島に形態学的な変化は基本的には認められず、ただ膵島によるインスリン分泌能が低下する。
　本発明において、Ｍｙｃｌ遺伝子又はその遺伝子産物が導入される膵島細胞の由来又は供給源は限定されないが、個体の膵臓から単離された初代膵島細胞、又は公知の培養方法によって培養された膵島細胞であってもよい。培養された膵島細胞には、限定されないが、株化された膵島細胞、幹細胞（例えば、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、体性幹細胞）由来の膵島細胞（例えば、Kimura, A., et al., Cell Chemical Biology, 2020, doi.org/10.1016/j.chembiol.2020.08.018参照）が含まれ得る。さらに、本発明において、Ｍｙｃｌ遺伝子又はその遺伝子産物が導入される膵島細胞は、膵島様細胞及び／又は膵島前駆細胞様細胞から得られた膵島細胞でもよく、すでにＭｙｃｌ遺伝子が導入されている膵島様細胞及び／又は膵島前駆細胞様細胞に、繰り返しＭｙｃｌ遺伝子又はその遺伝子産物を導入してもよい。特に、糖尿病を治療する目的の場合、ドナーから採取された膵島細胞又は幹細胞由来膵島細胞のいずれをも好ましく使用することができる。使用されるドナーからの膵島細胞は、レシピエントに対して、自家又は他家のいずれであってもよい。本発明によれば、このような膵島細胞にＭｙｃｌ遺伝子を導入することにより、インビトロで膵島前駆細胞様細胞を増殖させ、患者に戻す（移植する）ことによって、糖尿病を治療することが可能である。この場合、膵島細胞が、患者に対して他家である症例では、患者に、適宜、免疫抑制剤を投与することができる。また、患者への移植には、上述した膵島様細胞、膵島前駆細胞様細胞、若しくはインスリン産生能を有する細胞、又はそれらの任意の組み合わせを用いることができる。
　上記に関連して、これまでに、少なくともマウスではβ細胞が脱落した場合に、α細胞が増殖し、その後α細胞の一部がβ細胞に分化転換するということが報告されている。したがって、Ｍｙｃｌ遺伝子が導入される前の膵島細胞の原料としての膵島は、通常のβ細胞を多数含む膵島以外にも、大半のβ細胞が脱落した膵島であってもよい。このような観点から、本発明は、Ｍｙｃｌ遺伝子導入した膵島様細胞等の使用により、β細胞が脱落したＩ型糖尿病患者の遺伝子治療にも使用できる。
（３）多能性幹細胞
　本明細書において使用するとき、「多能性幹細胞」とは、自己複製能と多分化能を有する細胞であり、生体を構成するあらゆる細胞を形成する能力を備える細胞をいう。「自己複製能」とは、１つの細胞から自分と同じ未分化な細胞を作る能力のことをいう。「分化能」とは、細胞が分化する能力をいう。多能性幹細胞としては、例えば、胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ：ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ：ｉＰＳ細胞）、Ｍｕｓｅ細胞（Ｍｕｌｔｉ－ｌｉｎｅａｇｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ　Ｓｔｒｅｓｓ　Ｅｎｄｕｒｉｎｇ　ｃｅｌｌ）、精子幹細胞（ｇｅｒｍｌｉｎｅ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ：ＧＳ細胞）、胚性生殖細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｇｅｒｍ　ｃｅｌｌ：ＥＧ細胞）などが含まれるが、これらに限定されない。本発明に用いる多能性幹細胞は、好ましくは、ＥＳ細胞である。なお、多能性幹細胞の由来は、哺乳動物、鳥類、魚類、爬虫類及び両生類のいずれでもよく、特に限定されない。哺乳動物は、霊長類（ヒト、サルなど）、げっ歯類（マウス、ラット、モルモットなど）、ネコ、イヌ、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ、ヤギ、フェレットなどを含む。
　本明細書において使用するとき、「ＥＳ細胞」とは、発生初期に存在する個体を構成するすべての組織細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞を取り出し、インビトロで培養できるように株化したものを意味する。ＥＳ細胞は、初期胚中の多能性幹細胞と同様に個体を構成するすべての細胞に分化する能力を保持したまま事実上無制限に増やすことができる。具体的には、ＥＳ細胞はマウスのものが１９８１年に初めて記載された（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７８，７６３４－７６３８，１９８１；Ｎａｔｕｒｅ　２９２，１５４－１５６，１９８１）。ＥＳ細胞は多分化能を有し、個体を構成するすべての組織及び細胞タイプを発生させ得る。ラット（Ｉａｎｎａｃｏｎｎｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１６３，２８８－２９２，１９９４）、ハムスター（Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１２７，２２４－２２７，１９８８）、ウサギ（Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．３６，４２４－４３３，１９９３）、鳥類、魚類、ブタ（Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｄｅｖ．６，５６３－５６８，１９９４）、ウシ（Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｄｅｖ．６，５５３－５６２，１９９４）、並びに霊長類（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９２，７８４４－７８４８，１９９５）を包含する多種多様な種から多分化能胚性幹細胞が単離されている。なお、本発明において使用可能なＥＳ細胞としては、限定されないが、ＫＨ２細胞、ＲＦ８細胞、ＪＩ細胞、ＣＧＲ８細胞、ＭＧ１．１９細胞、１２９ＳＶ細胞、Ｃ５７／ＢＬ６細胞、ＤＢＡ－１細胞などが挙げられる。
　胚性ヒト組織からのＥＳ細胞及びＥＳ細胞様幹細胞の単離についてもいくつかの研究チームが、成功している。初期の成功例は以下のようなものである。（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８２，１１４５－１１４７，１９９８；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９５，１３７２６－１３７３１，１９９８；Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１８，３９９－４０４，２０００）。これらのＥＳ細胞株は、胚盤胞から分離したＩＣＭをフィーダー細胞上で培養することで樹立されている。他の最近の研究は、胚及び成熟哺乳動物細胞由来の核を脱核卵母細胞中に移植することにより胚及び胚性細胞を得ることが可能であることを示している。
　本発明においては、任意の樹立されたＥＳ細胞株を使用可能である。あるいは、本発明の方法によって作製されたＥＳ細胞を個体に適用した場合の免疫拒絶反応を防ぐためには、個体の体細胞を用いてクローン胚を作成し、そこからＥＳ細胞株を樹立する方法が有効である。この方法を用いれば個体と同一の遺伝的要素をもったＥＳ細胞を樹立することが可能である。
　あるいは、体細胞クローンの作成では卵子に導入された体細胞の核が受精卵の核と同じような状態に変化する、「初期化」と呼ばれる現象が起きると考えられている。卵子のもつこのような活性に類似した活性をＥＳ細胞ももつことが報告されている（Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，１１，１５５３－１５５８，２００１）。つまり、個体の体細胞とＥＳ細胞を融合することで、体細胞をＥＳ細胞のような細胞に変換できることが期待される。ＥＳ細胞はインビトロで遺伝子操作を行うことができるので、ＭＨＣ遺伝子群などの免疫拒絶に関与する因子をあらかじめ操作したＥＳ細胞でこれを行うことで、体細胞クローン胚作成などの手法を用いることなく拒絶反応を回避できることが期待される。
　本明細書において使用するとき、「人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞」とは、体細胞へＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃなどの転写因子の遺伝子を導入することにより得られた、ＥＳ細胞に似た分化多能性を有する細胞を意味する。ｉＰＳ細胞もまた、ＥＳ細胞と同様に、分化多能性を保持したまま無制限に増やすことができる。
　ｉＰＳ細胞を作製するための基本的な手法は、転写因子であるＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ－Ｍｙｃの４因子を、ウイルスを利用して細胞へ導入する方法である（Ｔａｋａｈａｓｈｉ　Ｋ，Ｙａｍａｎａｋａ　Ｓ：Ｃｅｌｌ　１２６（４），６６３－６７６，２００６；Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ，ｅｔ　ａｌ：Ｃｅｌｌ　１３１（５），８６１－７２，２００７）。また、ｉＰＳ細胞の作製に利用可能な細胞、即ち、ｉＰＳ細胞の由来である細胞の例として、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞）、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、粘膜上皮細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、脂肪幹細胞、歯髄幹細胞、神経幹細胞を挙げることができる。
　ｉＰＳ細胞の初期化は、当業者に周知の方法で行うことができ、例えば、Ａｄｄｇｅｎｅ’ｓ　Ｂｌｏｇ／Ｐｏｓｔ, “Ｄｅｌｉｖｅｒｙ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ　ｉＰＳＣｓ”（https://blog.addgene.org/delivery-methods-for-generating-ipscs）に概説されている。Ｍｙｃｌ遺伝子のｉＰＳ細胞への導入方法としては、限定されないが、組換えウイルス（例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、センダイウイルスなど）、組換えプラスミド、ミニサークル、またはエピソーム（例えば、ｏｒｉＰ／Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ核抗原－１（ＥＢＮＡ１）系エピソーマルベクター）を用いた導入方法、あるいは、Ｍｙｃｌ遺伝子をコードするＲＮＡ（ｍＲＮＡを含む）やＭｙｃｌタンパク質自体を直接細胞に導入する方法が挙げられる。
　本明細書において使用するとき、「ＥＧ細胞」は始原生殖細胞から作製される任意の胚性生殖幹細胞を意味し、その起原等は特に限定されない。また、本明細書において使用するとき、「ＧＳ細胞」は、精巣の生殖細胞より作製される生殖幹細胞で、精原幹細胞（精子幹細胞）を体外で培養できるようにした細胞株である（Ｃｅｌｌ．１１９，１００１－１０１２，２００４）。ＧＳ細胞のうち特にＥＳ細胞と同様の性質を有し、分化多能性も有する、ｍＧＳ細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ　ｇｅｒｍｌｉｎｅ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ）が好ましい。
（４）Ｍｙｃｌ遺伝子及びその遺伝子産物
　Ｍｙｃｌ（「Ｌ－Ｍｙｃ」とも呼ばれる）遺伝子は、ｃ－Ｍｙｃ遺伝子及びＭｙｃｎ（「Ｎ－Ｍｙｃ」遺伝子）を含むＭｙｃ遺伝子のファミリーに属するメンバーの１つである。Ｍｙｃｌ遺伝子は、ｃ－Ｍｙｃ遺伝子と同様に癌遺伝子であって、初期化遺伝子としても知られている。また、Ｍｙｃｌ遺伝子は、ｃ－Ｍｙｃ遺伝子と異なり、形質転換能がほとんどないことが分かっている（Nakagawa, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 107, p.14152-14157, 2010）。なお、Ｍｙｃｌのマウス及びヒトのｃＤＮＡ配列情報は、それぞれＮＣＢＩアクセッション番号のＮＭ　００８５０６及びＮＭ　００１０３３０８１を参照することにより取得することができ、当業者は容易にｃＤＮＡを単離することができる。
　本発明によれば、単離されたＭｙｃｌ遺伝子及びその遺伝子産物を使用することが好ましい。Ｍｙｃｌ遺伝子は、上記の通り、ＮＣＢＩアクセッション番号によりその塩基配列を特定することができるが、使用可能なＭｙｃｌ遺伝子としては、一本鎖又は二本鎖型ＤＮＡ、及びそのＲＮＡ相補体も含まれる。ＤＮＡには、例えば、天然由来のＤＮＡ、組換えＤＮＡ、化学合成したＤＮＡ、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ、及びそれらの組み合わせが含まれる。本発明で使用される核酸としてはＤＮＡが好ましい。なお、周知の通り、コドンには縮重があり、１つのアミノ酸をコードする塩基配列が複数存在するアミノ酸もあるが、Ｍｙｃｌ遺伝子が導入された膵島細胞（すなわち、膵島様細胞）が、Ｍｙｃｌ遺伝子の発現により、細胞増殖し、その発現の停止によりインスリン産生を促す作用を有するものであれば、特に限定されない。
　一実施形態において、Ｍｙｃｌ遺伝子は、
　（１）配列番号１又は３で表される塩基配列を含む若しくはそれからなる核酸；又は
　（２）配列番号１又は３で表される塩基配列を含む若しくはそれからなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、並びにＭｙｃｌ遺伝子が導入された膵島様細胞を増殖させる活性を有するポリペプチドをコードする核酸；又は
　（３）配列番号１又は３で表される塩基配列を含む若しくはそれからなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、並びにＭｙｃｌ遺伝子が導入された膵島様細胞を増殖させた結果、インスリン産生細胞を増殖させる効果、ひいてはインスリン産生を促進させる効果を有するポリペプチドをコードする核酸を含む／それからなるものであり得る。
　本明細書において使用するとき、「ストリンジェントな条件下」とは、中程度又は高程度なストリンジェントな条件においてハイブリダイズすることを意味する。具体的には、中程度のストリンジェントな条件は、例えば、ＤＮＡの長さに基づき、一般の技術を有する当業者によって、容易に決定することが可能である。基本的な条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，７．４２－７．４５（２００１）に示されるが、ニトロセルロースフィルターに関し、５×ＳＳＣ、０．５％　ＳＤＳ、１．０ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の前洗浄溶液、約４０～５０℃での、約５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ～６×ＳＳＣ（又は約４２℃での約５０％ホルムアミド中の、スターク溶液（Ｓｔａｒｋ’ｓ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ）などの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）のハイブリダイゼーション条件、及び約６０℃、０．５×ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳの洗浄条件の使用が含まれる。高ストリンジェントな条件もまた、例えばＤＮＡの長さに基づき、当業者によって、容易に決定することが可能である。一般的に、こうした条件は、中程度にストリンジェントな条件よりも高い温度及び／又は低い塩濃度でのハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を含み、例えば上記のようなハイブリダイゼーション条件、及び約６８℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの洗浄を伴うと定義される。当業者は、温度及び洗浄溶液塩濃度は、プローブの長さ等の要因に従って、必要に応じて調整可能であることを認識する。
　上記のような核酸増幅反応又はハイブリダイゼーション等を使用してクローニングされる相同な核酸は、配列番号１又は３に記載の塩基配列に対して、それぞれ、少なくとも３０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、さらにより好ましくは９０％以上、さらになお好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有する。なお、同一性パーセントは、視覚的検査及び数学的計算によって決定することが可能である。あるいは、２つの核酸配列の同一性パーセントは、Ｄｅｖｅｒｅｕｘら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１２，３８７（１９８４）に記載され、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータープログラム（ＧＣＧ　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン１０．３）を用いて、配列情報を比較することによって決定することができる。
　一実施形態において、Ｍｙｃｌ遺伝子の遺伝子産物は、上記されるＭｙｃｌ遺伝子から発現されたポリペプチドである。典型的には、該ポリペプチドは、
　（１）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列を含む若しくはそれからなるポリペプチド；又は
　（２）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、並びに膵島様細胞を増殖させる効果及び／又はインスリン産生を促進させる効果を有するポリペプチドであり得る。
　一実施形態において、Ｍｙｃｌ遺伝子の遺伝子産物は、上記で定義されるポリペプチドの変異体であってもよく、配列番号２又は４のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入及び／又は付加を含むアミノ酸配列であり得る。置換は、保存的置換であってもよく、これは、特定のアミノ酸残基を類似の物理化学的特徴を有する残基で置き換えることである。保存的置換の非限定的な例には、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＡｌａ相互の置換のような脂肪族基含有アミノ酸残基の間の置換、Ｌｙｓ及びＡｒｇ、Ｇｌｕ及びＡｓｐ、Ｇｌｎ及びＡｓｎ相互の置換のような極性残基の間での置換などが含まれる。
　アミノ酸の欠失、置換、挿入および／または付加による変異体は、Ｍｙｃｌ遺伝子に、例えば、周知技術である部位特異的変異誘発（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１０，Ｎｏ．２０，ｐ．６４８７－６５００，１９８２）を施すことにより作成することができる。本明細書において、「１又は複数のアミノ酸」とは、部位特異的変異誘発法により欠失、置換、挿入及び／又は付加できる程度のアミノ酸を意味する。また、本明細書において「１又は複数のアミノ酸」とは、場合により、１又は数個のアミノ酸を意味してもよい。
　なお、ポリペプチドのアミノ酸配列にその活性を保持しつつ１または複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入及び／又は付加を施す方法としては、上記の部位特異的変異誘発の他にも、遺伝子を変異源で処理する方法、及び遺伝子を選択的に開裂し、次に選択されたヌクレオチドを除去、置換、挿入又は付加し、次いで連結する方法もある。限定されるものではないが、本発明におけるＭｙｃｌ遺伝子の遺伝子産物は、配列番号２又は４において１～１０個、好ましくは９個以下、７個以下、５個以下、３個以下、２個以下、より好ましくは１個以下のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、インスリン産生を促進する活性を有するポリペプチドであり得る。
　変異体はさらに、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％以上、好ましくは８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質であって、膵島様細胞を増殖させる効果及び／又はインスリン産生を促進する効果を有するポリペプチドである。
　２つのアミノ酸配列の同一性％は、視覚的検査および数学的計算によって決定してもよい。あるいは、２つのタンパク質配列の同一性パーセントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．及びＷｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３－４５３，１９７０）のアルゴリズムに基づき、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータープログラムを用い配列情報を比較することにより、決定してもよい。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．及びＨｅｎｉｋｏｆｆ，Ｊ．Ｇ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１０９１５－１０９１９，１９９２）に記載されるような、スコアリング・マトリックス、ｂｌｏｓｕｍ６２；（２）１２のギャップ加重；（３）４のギャップ長加重；及び（４）末端ギャップに対するペナルティなし、が含まれる。
（５）Ｍｙｃｌ遺伝子の導入
　本発明によれば、Ｍｙｃｌ遺伝子を初代膵島細胞、培養膵島細胞、又は幹細胞（例えば、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、体性幹細胞）に導入する方法は特に限定されず、当業者に公知の方法を用いることができる。遺伝子導入手段として、「形質転換」又は「トランスフェクション」が一般的であり、これは、外因性の核酸（例えば、宿主細胞に対して外来ＤＮＡ又はＲＮＡ）の取込み後に細胞に誘導される一過的又は安定的な遺伝的変化を意味する。通常、遺伝的変化は、外因性の核酸を宿主細胞のゲノムに取り込むことによって、又はエピソーム成分として、若しくは独立して外因性の核酸を一過的又は安定的に維持することにより達成され得る。本発明によれば、導入されたＭｙｃｌ遺伝子は、該遺伝子の発現のオン／オフを制御することができれば、宿主細胞のゲノムに組み込まれた状態であってもよく、又はエピソーム成分として存在してもよく、又は該遺伝子を含むプラスミド若しくはベクターのまま細胞質に存在してもよい。
　通常、宿主細胞への外因性の核酸（好ましくはＤＮＡ）の導入には、「ベクター」が使用される。一般的に、ベクターとしては、ウイルス、特に弱毒化ウイルス及び／又は複製不能ウイルスが含まれる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクターなどが例示される。また、ベクターは、外因性の核酸の発現が可能なように、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合配列、ターミネーター、ポリアデニル化サイトなどの制御配列を含むことができる。さらに、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子（例えばカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子など）、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン遺伝子などの選択マーカー配列、蛍光タンパク質、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ＦＬＡＧなどのレポーター遺伝子配列などを含むことができる。ここで、「プロモーター」はまた、細胞種特異的に制御可能な、組織特異的に制御可能な、又は外部のシグナルもしくは薬剤で誘導可能な、プロモーター依存性遺伝子発現に十分なプロモーター成分を含むことが意図される。そのような成分は、天然遺伝子の５’領域又は３’領域に位置している可能性がある。また、「機能的に結合された」とは、適切な分子（例えば、転写活性化タンパク質）が制御配列に結合されたときに発現が可能になるように、ＤＮＡ配列と制御配列が結合していることを意味する。
　また、宿主細胞へのベクターの導入は、限定されないが、エレクトロポレーション法（Ｍｅｉｎｅｒ，Ｖ．ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：１４０４１－１４０４６（１９９６）など）、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ－デキストラン法、遺伝子導入用リピッド（リポフェクタミン、リポフェクチンなど）を用いる方法により行われる。その後、ベクターが導入された細胞を、マーカー遺伝子（例えば、薬剤耐性遺伝子）の特性に基づき選択することができる。選択された細胞において正しく相同組換えが起こっていることは対象とする外因性の核酸の一部をプローブとして用いたサザンブロット等により確認することができる。このようにして、対象とする遺伝子、具体的には、Ｍｙｃｌ遺伝子にマーカー遺伝子をノックインした遺伝子をヘテロで含有する細胞を作製することができる。
　ＥＳ細胞としては、Ｃｏｌａ１遺伝子座の下流にＦｒｔ配列を有し、内在性のＲｏｓａ２６プロモーターの制御下でリバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子であるＭ２－ｒｔＴＡを発現するＫＨ２株を用いることができる（Ｂｅａｒｄ　Ｃ，ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅｓｉｓ，ｖｏｌ．４４，ｐ．２３－２８（２００６））。該ＥＳ細胞へのＭｙｃｌ遺伝子の導入は、当業者に周知の方法を用いて行うことができ、例えば、Ｍｙｃｌ遺伝子をＴＡクローニングにより、エントリーベクターであるｐＣＲ８－ＧＷ－ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に挿入後、該ベクターと、例えば、Ｃｏｌｌａ１－ＴｅｔＯＰ－ＡｔｔＲ１－ｃｃｄＢ－ＡｔｔＲ２－ｉｒｅｓ－ｍＣｈｅｒｒｙベクター間でＬＲ反応を行って、ＴｅｔＯＰ－Ｍｙｃｌ－ｉｒｅｓ－ｍＣｈｅｒｒｙベクターを遺伝子導入用ベクターとして使用することができる。ここで、ベクター中の「ＴｅｔＯＰ（オペロン）」配列は、リバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子が結合する配列（テトラサイクリン応答因子：ＴＲＥ）であり、細胞に添加されたドキシサイクリン（Ｄｏｘ）などのリバーステトラサイクリンに依存して宿主細胞から発現したリバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子が結合し、その下流に連結された遺伝子の発現が誘導される。また、「ｉｒｅｓ」（ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｒｉｂｏｓｏｍｅ　ｅｎｔｒｙ　ｓｉｔｅ）はリボソーム内部認識配列であり、「ｍＣｈｅｒｒｙ」は、赤色蛍光タンパク質をコードする遺伝子（レポーター遺伝子）である。該ベクターをｆｌｉｐａｓｅをコードする核酸とともにＫＨ２－ＥＳ細胞に導入することにより、Ｍｙｃｌ遺伝子をＥＳ細胞の染色体に組み込むことができる。また、上記のような「ｉｒｅｓ－ｍＣｈｅｒｒｙ」を含むベクターの他に、耐性遺伝子を含有させた「ｉｒｅｓ－βｇｅｏ（βガラクトシダーゼとネオマイシン耐性遺伝子の融合遺伝子）カセット」（Ｍｏｕｎｔｆｏｒｄ　Ｐ．ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：４３０３－４３０７（１９９４））を含有するｐＢＳＳＫ（－）－ＩＲＥＳ－βｇｅｏ、ＩＲＥＳ－Ｈｙｇｒｏ（ハイグロマイシン耐性遺伝子）カセットを含有する同様のベクターなどを使用してもよい。
　本発明は、Ｍｙｃｌ遺伝子の一過性発現を制御することにより、膵島様細胞の増殖、及びインスリン産生細胞へと分化させることができる。このように、本発明は、Ｍｙｃｌ遺伝子の一過性発現を特徴とするが、Ｍｙｃｌ遺伝子を一過性に発現させた場合、膵島様細胞の細胞分裂に伴って、Ｍｙｃｌ遺伝子が導入されている細胞数が相対的に減少するため、時間とともにＭｙｃｌ遺伝子の発現量を自然と減少又は停止させることができる。すなわち、一実施形態では、本発明は、Ｍｙｃｌ遺伝子の発現の「オン」制御により、本発明の目的が達成される。また、別の実施形態では、Ｍｙｃｌ遺伝子の発現を強制的に「オフ」にすることも可能である（以下、「オン／オフ」制御という）。
　上記のようにリバーステトラサイクリンを用いることにより、宿主細胞に導入されたＭｙｃｌ遺伝子の発現をオン／オフ制御することができる。すなわち、リバーステトラサイクリンの存在下では、Ｍｙｃｌ遺伝子は細胞内で発現し続け、膵島様細胞を増殖させることができ、一方、リバーステトラサイクリンを除くことによって、膵島様細胞の増殖を停止させ、インスリン産生細胞へと分化を誘導させることができる。本発明においては、膵島様細胞に導入されたＭｙｃｌ遺伝子の一過的な発現（オン状態）は、細胞培養開始から少なくとも２日から最大１００日、例えば、９０日、８０日、７０日、６０日の期間であることが好ましい。一方で、Ｍｙｃｌ遺伝子が導入された膵島様細胞は、上記の期間で増殖することが好ましい。
　Ｍｙｃｌ遺伝子の発現をオン／オフ制御する代替の手段として、ウイルスベクターの遺伝子発現及び細胞増殖を光照射で精度よくスイッチオン／オフできる「光制御性ウイルスベクター」（Tahara, M., et al., PNAS, vol.116, 11587-11589, 2019）を用いることができる。これは、マグネットと呼ばれる光スイッチタンパク質をコードする遺伝子がウイルスベクターに導入されたものであり、同ベクターに組み込んだ標的遺伝子の発現を青色光を使用して制御することができるものである。
　Ｍｙｃｌ遺伝子の発現をオン／オフ制御する代替の別の例としては、エピソーマルベクター（Ｏｋｉｔａ　Ｋ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　２０１１　Ｍａｙ　８（５）：４０９－４１２）、センダイウイルス、ＲＮＡベクター（Ｗａｒｒｅｎ　Ｌ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　２０１０　Ｎｏｖ　７（５）：６１８－６３０）が挙げられる。これらに限定されず、上記したｉＰＳ細胞の初期化（樹立）に使用した方法（すなわち、一時的に遺伝子を誘導する方法）を用いることができる。
　本発明によれば、単離された外来性Ｍｙｃｌ遺伝子を導入する他に、細胞に内在するＭｙｃｌ遺伝子を強制的に発現させることによって、本発明の目的を達成することができる。内因性のＭｙｃｌ遺伝子を発現させる手段としては、限定されないが、野生型のプロモーターやエンハンサーを、Ｍｙｃｌ遺伝子を操作可能に発現誘導させるための強力なプロモーターやエンハンサーで置換し、強制的に遺伝子発現させる方法であってもよい。置換に使用されるプロモーターの例としては、強力なプロモーターであるサイトメトリー（ＣＭＶ）プロモーター、インデューサーの存在下で機能する誘導性プロモーターなどが挙げられる。一方、置換に使用されるエンハンサーの例としては、ＳＶ４０エンハンサー、ヘルペスＢウイルスエンハンサー、サイトメガロウイルスエンハンサー、α－フェトプロテインエンハンサーなどが挙げられる。別の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ　ＴｙｐｅＩＩ（ＣＲＩＳＰＲ－ｄＣａｓ９を含む）の他、ＣＲＩＳＰＲ－ｔｙｐｅ　Ｉ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮのゲノム認識配列にプロモーター及び／又エンハンサーを活性化させることができる脱メチル化酵素、ヒストン修飾酵素、転写活性化因子、具体的にはＶＰ６４、ｐ６５、Ｒｔａ等を付加した分子を利用することができる。本明細書においては、上記されるプロモーター、エンハンサー、これらを活性化する酵素及び因子、又は核酸タンパク質複合体若しくは低分子化合物を、Ｍｙｃｌ遺伝子を活性化させるための「活性剤」と呼ぶことがある。
（６）Ｍｙｃｌ遺伝子の遺伝子産物の導入
　Ｍｙｃｌ遺伝子産物の細胞への導入は、外来遺伝子やタンパク質を細胞に導入する一般的な方法により行うことができる。例えば、このような方法には、限定されないが、トランスフェクション試薬を用いる方法、ウイルスを用いる方法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、ソノポレーション法、リポソーム融合法、及びマイクロマニピュレーター、レーザー光照射によって細胞膜に細孔を形成させることによる導入法などが挙げられる。
（７）キメラ哺乳動物の作製
　ＥＳ細胞を哺乳動物に導入して、キメラ哺乳動物を作製する方法は、当業者に周知の方法を用いて行うことができる。まず、上記のＭｙｃｌ遺伝子が導入されたＥＳ細胞の培養には、当業者に知られた如何なる培地を用いることができる。例えば、該ＥＳ細胞をフィーダー細胞上で培養する場合、フィーダー細胞（例えば、ＭＥＦ（マウス胎児繊維芽細胞））を用いることができ、このフィーダー細胞上で該ＥＳ細胞をＥＳ細胞用培地（例えば、１５％ＦＢＳ、５０Ｕ／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン、Ｌ－グルタミン、非必須アミノ酸を含むノックアウトＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）に、２－メルカプトエタノール（２ＭＥ、ＧＩＢＣＯ）及びＬＩＦ（ＳＩＧＭＡ）を添加した培地）を使用することができる。
　次に、上記ＥＳ細胞を哺乳動物に導入してノックアウト動物（Ｍｙｃｌ遺伝子ノックイン動物）を作製する。ここでは、哺乳度物としてマウスを例にして説明するが、ノックインマウスの作製方法は当業者に周知である。具体的には、上記ＥＳ細胞をマウス（例えばＣ５７ＢＬ／６等）の胚盤胞にインジェクトし、偽妊娠させたメスのマウス（ＩＣＲ等）の子宮内に移植することによりキメラマウスを作製することができる。その後、キメラマウスと通常のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６等）とを交配させ、Ｍｙｃｌ遺伝子がヘテロでノックインされたヘテロ変異マウスを作製することができる。ヘテロ変異マウス同士を交配させることにより、Ｍｙｃｌ遺伝子がホモでノックインされたホモ変異マウスを得ることができる。以上のノックインマウスの作製については、ＥＣＡＴ３ノックインマウス（Ｔｏｋｕｚａｗａ，Ｙ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，２３（８）：２６９９－２７０８（２００３））、ＥＣＡＴ４ノックインマウス（Ｍｉｔｓｕｉ，Ｋ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１１３：６３１－６４２（２００３））、ＥＣＡＴ５ノックインマウス（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．，Ｋ．Ｍｉｔｓｕｉ，ａｎｄ　Ｓ．Ｙａｍａｎａｋａ，Ｎａｔｕｒｅ，４２３（６９３９）：ｐ５４１－５４５（２００３）、特開２００３－２６５１６６号公報）等を参考にされたい。
　また、キメラ哺乳動物は、上記のＥＳ細胞に限らず、ｉＰＳ細胞を用いても作製することができる。例えば、胚盤胞補完作法を用いて、非ヒト哺乳動物内でヒトｉＰＳ細胞から臓器（器官）を作製することができる。例えば、中内らは、無膵性クローンブタの生体内で、ヒトｉＰＳから誘導したヒト膵臓を発生させている（Ｎａｋａｕｃｈｕ，Ｈ．，ｅｔ　ａｌ．，ＰＮＡＳ，Ｖｏｌ．１１０，Ｎｏ．１，４５５７－４５６２（２０１３）を参照されたい）。
２．膵島様細胞の増殖及び分化の制御
　本発明によれば、インビトロ及びインビボにおいて、上記で作製した膵島様細胞の増殖及び分化を制御することができる。Ｍｙｃｌ遺伝子の誘導方法は、該遺伝子を細胞に導入するために用いた上述の方法に準じて選択可能である。例えば、上述したようなＴｅｔＯＰ－Ｍｙｃｌ－ｉｒｅｓ－ｍＣｈｅｒｒｙベクターを遺伝子導入用ベクターとして使用して細胞にＭｙｃｌ遺伝子を導入した場合、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）などのリバーステトラサイクリンに依存して宿主細胞から発現したリバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子が結合し、その下流に連結されたＭｙｃｌ遺伝子を発現させて、膵島様細胞の増殖を誘導することができる。細胞培養系にＤｏｘの添加する濃度は、適宜調整され得る。例えば、１～１００ｍｇ／ｍＬなどであってもよい。Ｄｏｘの添加によって膵島様細胞を増殖させた後、例えば、Ｄｏｘ不含の培地に置換することによって増殖を停止し、インスリン産生などの細胞分化を誘導することができる。
　インビボでは、キメラ非ヒト哺乳動物に、例えば、Ｄｏｘ含有の水を与えることによって、膵臓内で膵島様細胞の増殖を誘導することができる。水に添加した場合のＤｏｘの濃度は、例えば、例えば、１～１００ｍｇ／ｍＬなどであってもよく、好ましくは２．０ｍｇ／ｍＬである。キメラ非マウスを用いる場合、生後８週齢までは、膵臓が日齢の増加とともに成長するため、成長が停止した時期、例えば、生後８週齢以降にＤｏｘを投与することが挙げられるが、増殖さえ誘導することができれば、週齢は限定されない。
３．インスリン産生能を有する膵島細胞又はその前駆細胞の製造方法
　本発明によれば、インスリン産生能を有する膵島細胞又はその前駆細胞を製造する方法が提供される。このような製造方法は、限定されないが、初代膵島細胞、培養膵島細胞、又は幹細胞由来である膵島細胞を原料として、Ｍｙｃｌ遺伝子を該膵島細胞に導入し、Ｍｙｃｌ遺伝子の強制発現により細胞を増殖させた後、該遺伝子の発現を停止させることによって、インスリン産生能を有する膵島細胞又はその前駆細胞を得ることを含む。なお、Ｍｙｃｌ遺伝子の強制発現及び停止は、上述したように、例えば、該遺伝子の発現をオン／オフ制御する代替の手段（例えば、光制御性ウイルスベクターの使用）、又はドキシサイクリン感受性のリバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子を利用することができる。本明細書において使用する場合、「膵島細胞の前駆細胞」又は「膵島前駆細胞」は、Ｍｙｃｌ遺伝子の発現停止後、インスリン産生能を有する膵島細胞へと分化していく途中の細胞（又は細胞群）を指し、例えば、ＰＤＸ１陽性、ＰＴＦ１ａ陽性、ＮＫＸ６．１陽性、Ｆｅｖ陽性、Ｐａｘ４陽性、及びＣｃｋ遺伝子からなる群から１つ以上選択されるマーカーを指標として同定され得る。
４．医薬用途
　本発明によれば、導入されたＭｙｃｌ遺伝子の発現を制御することにより、膵島様細胞を増殖させ、インスリン産生を促進させることができる。したがって、一態様では、Ｍｙｃｌ遺伝子又はその遺伝子産物を有効成分として含む膵島細胞増幅促進剤、膵島機能改善剤、インスリン産生促進剤；上記有効成分及び薬学的に許容される他の成分（例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水など）を含有する医薬組成物；上記膵島細胞増幅促進剤、膵島機能改善剤、インスリン産生促進剤又は医薬組成物を用いた糖尿病患者の予防及び／又は治療法；並びに上記膵島細胞増幅促進剤、膵島機能改善剤、インスリン産生促進剤又は医薬組成物を製造するためのＭｙｃｌ遺伝子の使用が提供される。別の態様では、糖尿病の予防及び／又は治療目的で、Ｍｙｃｌ遺伝子又はその遺伝子産物を対象に投与する方法（インビボ法）；及びインビトロでＭｙｃｌ遺伝子又はその遺伝子産物を導入した膵島様細胞、膵島前駆細胞様細胞、若しくはインスリン産生細胞（以下、単に「膵島様細胞等」という場合がある）又はそれらの任意の組み合わせを対象に移植する方法（エクスビボ法）が提供される。
　なお、本発明のエクスビボ法は、使用される細胞により、異なる態様が意図される。例えば、（ｉ）成体の膵島由来の細胞へ遺伝子導入して得られる膵島様細胞を他家インビトロ又は自家インビトロで製造する態様（いずれも含む狭義のエクスビボ法）；（ｉｉ）分化誘導して得られる膵島様細胞、即ち、幹細胞（ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、体性幹細胞など）由来の膵島細胞のＭｙｃｌ遺伝子を導入して得られる膵島様細胞を他家インビトロ又は自家インビトロでの製造する態様（広義のエクスビボ法）；（ｉｉｉ）上記（ｉ）及び（ｉｉ）においてＭｙｃｌ遺伝子が機能発現して、増殖中の膵島前駆細胞様細胞であり得る態様；（ｉｖ）上記（ｉ）～（ｉｉｉ）から分化して生成されるインスリン産生細胞又は膵島細胞（Ｍｙｃｌ遺伝子を含まない）である態様が挙げられる。
　本発明の一態様として、細胞が、患者に対して自家であるか他家であるかを問わず、公知の方法、具体的にはＮａｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　ｖｏｌｕｍｅ　２２，　ｐａｇｅｓ３０６－３１１（２０１６）．，　ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ．４０３０、Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｖｏｌｕｍｅ　２，　ｐａｇｅｓ８１０－８２１（２０１８）．，　ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓ４１５５１－０１８－０２７５－１、ＥＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ　１２　（２０１６）　２５５？２６２．，　ＤＯＩ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｅｂｉｏｍ．２０１６．０８．０３４等に記載の方法により、移植する膵島をカプセル化して投与してもよい。移植する膵島をカプセル化することにより、免疫抑制剤を使用しない、又は免疫抑制剤の投与量を低減することが可能である。
　本明細書の一態様として、単離した膵島について適宜遺伝子編集することができる。遺伝子編集としては特に限定されないが、具体的には、ゲノム編集による膵島細胞に含まれる変異遺伝子の修正、ＨＬＡやＧＡＤタンパク質等の表面抗原等、免疫反応を引き起こす分子の改変、Ｂｅｔａ－２　ＭｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎやＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、ＣＩＩＴＡ遺伝子の欠失により免疫寛容を誘導する等、治療において好ましい特徴を付加することができる。遺伝子編集の方法は特に限定されないが、例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３、ＣＲＩＳＰＲ－ＴｙｐｅＩ－Ｄ及びこれらの改変体や、機能分子を発現させるためのｐｉｇｇｙＢＡＣ等のトランスポゾンベクターが具体的に挙げられる
（１）適応疾患
　Ｍｙｃｌ遺伝子又はその遺伝子産物を上記の態様に基づいて適用され得る疾患は、生体においてインスリンが十分に機能していない状態（典型的には、インスリン抵抗性、インスリン分泌低下）にある疾患である。本発明によれば、Ｍｙｃｌ遺伝子又はその遺伝子産物によりインスリン産生を促進することができ、例えば、糖尿病患者に対して血糖を低下させる作用を有する。適応疾患としては、典型的には、糖尿病であるが、より詳細には、重症低血糖症、Ｉ型糖尿病（緩徐進行１型糖尿病又は１．５型糖尿病を含む）、ＩＩ型糖尿病、耐糖能障害、高血糖症、異脂肪血症、肥満症又は代謝症候群に関連する疾患、障害又は症状、その他の特定の機序や疾患によるものであって、例えば、膵β細胞機能に関与する遺伝子異常、インスリン作用の伝達機構に関与する遺伝子異常、他の疾患や条件に伴うものとして膵外分泌疾患、内分泌疾患、肝疾患、薬剤や化学物質によるもの、感染症、免疫機序による希少な病態など、あるいは妊娠糖尿病などが挙げられる。さらに、糖尿病に起因した糖尿病性合併症（例えば、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経障害など）も適応疾患に含めることができる。また、膵炎や膵臓癌に伴う膵臓全摘出手術又は膵臓部分切除の結果引き起こされるインスリン分泌不全状態も適応疾患に含めることができる。
　さらに、本明細書に記載される方法により治療し得る糖尿病の種類としては特に限定されないが、本方法により、血糖値に依存して生理的なインスリンを分泌する、低血糖症を生じにくい治療を提供することができる。例えば、重症低血糖症の治療に用いる場合には、限定されないが、重症低血糖症に対してドナー膵島が著明な効果を示すことが当業者に知られていることから、一態様として公知の文献に記載の方法を用いることができる。ここでいう公知の文献に記載の方法とは、限定されないが、例えば、Ｄｉａｂｅｔｅｓ　Ｃａｒｅ　２０１６　Ｊｕｌ；　３９（７）：　１２３０－１２４０．，　ＤＯＩ：　１０．２３３７／ｄｃ１５－１９８８、Ｔｈｅ　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．　３４３　（４）：　２３０？２３８．，　ＤＯＩ：１０．１０５６／ＮＥＪＭ２００００７２７３４３０４０１、Ｔｈｅ　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．　３５５　（１３）：　１３１８？１３３０．，　ＤＯＩ：１０．１０５６／ＮＥＪＭｏａ０６１２６７等が具体的に挙げられる。あるいは、公知の文献に記載された細胞移植ではなく、公知の文献に記載された膵島細胞の移植量と同程度、好ましくはそれ以上の膵島細胞、膵島様細胞、膵島前駆細胞様細胞、又はインスリン産生細胞を増幅させることのできる、Ｍｙｃｌ遺伝子又はその遺伝子産物を対象に投与する方法（インビボ法）を選択することができる。
　また、Ｉ型糖尿病の治療に用いる場合、特に限定はないが、Ｉ型糖尿病に対する治療の一態様として、例えば、Ｉ型糖尿病患者の随時、空腹時、糖負荷後及び／又はグルカゴン刺激後のインスリン、血糖値及び／又はＣペプチド量に応じて、含有する膵島細胞、膵島様細胞、膵島前駆細胞様細胞、又はインスリン産生細胞の数を調整してもよく、本明細書中に記載の方法により、インビボ治療を行うための剤の投与量を決定してもよい。インスリン枯渇状態であるＩ型糖尿病患者は、低血糖症状を呈するリスクが高く、本明細書に記載される方法を用いた治療が好ましいという観点からは、例えば、空腹時及び／又はグルカゴン刺激時の血中Ｃペプチド量が０．５ｎｇ／ｍＬ以下、好ましくは０．２ｎｇ／ｍＬ以下、より好ましくは０．１ｎｇ／ｍＬ以下のＩ型糖尿病患者を対象として治療することができる。具体的な剤の投与量は、例えば、通常重症低血糖症を適応として移植されるドナー膵島の移植量を参考にして調整すればよい。具体的には、例えば、５００ＩＥＱ／ｋｇ相当以上、好ましくは１０００ＩＥＱ／ｋｇ相当以上、より好ましくは２０００ＩＥＱ／ｋｇ相当以上、さらにより好ましくは５０００ＩＥＱ／ｋｇ相当以上の膵島細胞、膵島様細胞、膵島前駆細胞様細胞、又はインスリン産生細胞である。あるいは、同程度の膵島様細胞、膵島前駆細胞様細胞、又はインスリン産生細胞を増幅させることのできるＭｙｃｌ遺伝子又はその遺伝子産物を対象に投与する方法（インビボ法）を選択することができる。
　また、ＩＩ型糖尿病の治療に用いる場合、特に限定はないが、例えば一態様として、体内に分泌されるインスリン量が不足する、インスリン依存状態のＩＩ型糖尿病の治療剤として使用することができる。具体的には、例えば、ＩＩ型糖尿病患者の随時、空腹時、糖負荷後及び／又はグルカゴン刺激後のインスリン、血糖値及び／又はＣペプチド量に応じて含有する膵島細胞、膵島様細胞、膵島前駆細胞様細胞、又はインスリン産生細胞の数を調整してもよく、本明細書に記載される方法により、インビボ治療を行うための剤の投与量を決定してもよい。インスリンが不足している病態で好ましい効果が得られるという観点からは、例えば、空腹時及び／又はグルカゴン刺激時の血中Ｃペプチド量が０．５ｎｇ／ｍＬ以下、好ましくは０．２ｎｇ／ｍＬ以下、より好ましくは０．１ｎｇ／ｍＬ以下のＩＩ型糖尿病患者を対象として治療することができる。具体的な剤の投与量は、例えば、通常、重症低血糖症を適応として移植されるドナー膵島の移植量を参考にして調整すればよい。具体的には、例えば、５００ＩＥＱ／ｋｇ相当以上、好ましくは１０００ＩＥＱ／ｋｇ相当以上、より好ましくは２０００ＩＥＱ／ｋｇ相当以上、さらにより好ましくは５０００ＩＥＱ／ｋｇ相当以上の膵島細胞、膵島様細胞、膵島前駆細胞様細胞、又はインスリン産生細胞である。あるいは、同程度の膵島様細胞、膵島前駆細胞様細胞、又はインスリン産生細胞を増幅させることのできるＭｙｃｌ遺伝子又はその遺伝子産物を対象に投与する方法（インビボ法）を選択することができる。
　また、緩徐進行Ｉ型糖尿病の治療剤として使用する場合、限定されないが、Ｉ型糖尿病及び又はＩＩ型糖尿病と同様にして体内のインスリン、血糖値及び／又はＣペプチド量に応じて含有する剤の量を調整することができる。この場合、本明細書の方法により増幅させる膵島細胞、膵島様細胞、膵島前駆細胞様細胞、又はインスリン産生細胞は、好ましくは患者自身の細胞を由来とする。例えば、緩徐進行Ｉ型糖尿病の治療の一態様として、好ましくは、血中の膵島細胞に対する自己抗体やＨＬＡのタイプを事前に調べておき、インスリン依存状態及び／又はインスリン枯渇状態に陥る前又は陥った後に自己の膵島細胞を本明細書の方法により増幅してやることができれば、免疫抑制剤が不要な治療が可能となり、インスリン依存状態及び／又はインスリン枯渇状態への移行を予防することができる、又はインスリン依存状態及び／又はインスリン枯渇状態を治療することができる。緩徐進行Ｉ型糖尿病であるかどうかを判別するためには、血中の膵島細胞に対する自己抗体やＨＬＡのタイプが緩徐進行Ｉ型糖尿病に関与していれば、特に限定されないが、例えば、膵島細胞抗体（ＩＣＡ）、ＧＡＤ抗体、インスリン自己抗体（ＩＡＡ）、ＩＡ－２抗体などの膵島関連自己抗体が重複もしくは単独で陽性を示すかどうかを確認するといった、公知の方法が挙げられる。さらに、ＨＬＡとしてＨＬＡ－ＤＲ４－ＤＱＡ１＊０３０１－Ｂ１＊０４０１等の緩徐進行Ｉ型糖尿病と関連するＨＬＡを保有するかどうかといった、公知の方法により確認してもよい。
　また、ドナー膵島により治療効果が認められるという観点からは、重症低血糖症の治療はエクスビボ法が好ましいが、本明細書に記載の方法により体内で（インビボで）膵島細胞を増幅させることができる。このようにして増幅させた膵島細胞により、エクスビボ法と同様の効果が認められるため、インビボで膵島を増幅させる治療方法もエクスビボ法と同様に重症低血糖症の治療方法として好ましく選択することができる。さらに、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、緩徐進行Ｉ型糖尿病の治療についても、エクスビボ法と同様に、対象の性別、年齢、体重、患部の状態、使用する細胞の状態等を考慮して、体内で（インビボで）膵島細胞を増幅させる方法を選択することができる。この時、体内で（インビボで）膵島細胞を増幅させる方法とエクスビボ法を組み合わせることもできる。
　本発明によれば、このような疾患を予防及び／又は治療することができる。本明細書で使用する場合、用語「予防（する）」とは、上記の疾患又はその症状の発症／発現を防止若しくは遅延すること、又は発症／発現の危険性を低下させることをいう。
「治療」とは、標的疾患に特徴的な症状又は随伴症状を緩和すること（軽症化）、症状の悪化を阻止ないし遅延することなどが含まれ、治療の中には疾患の改善も含まれる。「予防」とは、
（２）インスリン産生促進剤及び医薬組成物
　本発明のＭｙｃｌ遺伝子又はその遺伝子産物は、膵島細胞増幅促進剤、膵島機能改善剤、インスリン産生促進剤又は医薬品組成物として上記適応疾患に対する予防及び治療に提供され得る。ここで、膵島細胞増幅促進剤の一態様としては、膵島に含まれるα細胞、β細胞、δ細胞、ε細胞、ＰＰ細胞のうちいずれか一つ、好ましくは任意の二つ以上の膵島細胞を増殖させる剤をいう。また、膵島機能改善剤の一態様としては、投与することにより、生体における膵島が担う機能の一部または全部を改善させる剤のことをいい、膵島の機能の一部とは例えば、膵島細胞による血糖調節作用、インスリンよる血糖降下作用、グルカゴンによるグルコース産生・放出作用、ソマトスタチンによるガストリン、セクレチン、インスリン及び／又はグルカゴンの分泌抑制作用若しくは消化管における栄養吸収抑制作用等、グレリンによる食欲調節作用、膵ポリペプチドによる胆嚢収縮調節作用や食欲調節作用が具体的に挙げられる。また、インスリン産生促進剤の一態様としては、例えば、生体内で膵島が担う機能の一つである、血糖値に応じた生理的なインスリン分泌を促進する剤が挙げられる。また、医薬組成物として提供される場合、上記の態様で使用されるＭｙｃｌ遺伝子又はその遺伝子産物の有効成分の他に、薬学的に許容される他の成分（例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水など）を含有させることができる。さらに、場合により、Ｍｙｃｌ遺伝子を活性化させるための活性剤を含めてもよい。
　Ｍｙｃｌ遺伝子又はその遺伝子産物が導入される生体由来の膵島細胞は、健常者の膵島細胞であってもよく、又は一部若しくは大部分のβ細胞が消失したＩ型糖尿病患者若しくは終末期ＩＩ型導尿病患者由来の膵島細胞であり得る。この場合、膵島細胞は、レシピエントに対して、自家又は他家であってもよい。
　本発明の細胞製剤及び医薬組成物は、限定されないが、上記で得られた膵島様細胞を生理食塩水や適切な緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）に懸濁させることによって得られる。なお、治療に必要とする細胞数は、Ｍｙｃｌ遺伝子を強制発現させ、適宜細胞を増殖させることにより得ることができる。
　また、膵島細胞、膵島様細胞、膵島前駆細胞様細胞、又はインスリン産生細胞の細胞製剤及び医薬組成物への使用においては、該細胞を保護するためにジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）や血清アルブミン等を、細菌の混入及び増殖を防ぐために抗生物質等を細胞製剤及び医薬組成物に含有させてもよい。さらに、製剤上許容される他の成分（例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水など）を細胞製剤及び医薬組成物に含有させてもよい。当業者は、これら因子及び薬剤を適切な濃度で細胞製剤及び医薬組成物に添加することができる。
　上記で調製される細胞製剤及び医薬組成物中に含有する膵島細胞、膵島様細胞、膵島前駆細胞様細胞、又はインスリン産生細胞の数は、糖尿病及びそれに関連する疾患の予防及び／又は治療において所望の効果（例えば、血糖値の低下）が得られるように、対象の性別、年齢、体重、患部の状態、使用する細胞の状態等を考慮して、適宜、調整することができる。
　本発明のインスリン産生促進及び医薬組成物は、様々な対象に投与することができ、例えば、霊長類、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジなどの哺乳動物が意図され、好ましくはヒトである。また、対象への投与経路としては、限定されないが、非経口投与、例えば、注射又は注入により体内のグルコースに応答し得る任意の場所へ投与することができる。具体的には、例えば、膵臓内、腎被膜下、好ましくは皮下、腹腔内、より好ましくは血管内、静脈内、さらにより好ましくは門脈内に移植又は投与することができる。
　投与されたＭｙｃｌ遺伝子を生体内で活性化させる方法は、限定されないが、上述したＭｙｃｌ遺伝子発現の「オン」制御、又は「オン及び／又はオフ」制御のシステムを利用することができる。例えば、上述した「光制御性ウイルスベクター」（Tahara, M., et al., PNAS, vol.116, 11587-11589, 2019）を用いてもよい。
　また、Ｍｙｃｌ遺伝子の膵臓へのターゲティングを目的とした場合、膵島細胞に特異的に発現しているマーカー（例えば、ＰＤＸ１、Ｃ－ペプチド、インスリン、ＭａｆＡ、Ｍｎｘ１、Ｐａｘ４、Ｐａｘ６、ＮｅｒｕｒｏＤ１、Ｉｓｌ１、Ｎｋｘ２．２、Ｎｇｎ３、ＨＮＦ１ａ、Ｆｏｘａ２、Ｎｋｘ６．１、グルカゴン、Ａｒｘ、ＭａｆＢ、ＲＦＸ６、ＩＲＸ１、ＩＲＸ２、ソマトスタチン）を標的として遺伝子導入することができる。体内で（インビボで）膵島細胞を増幅させる方法を選択する場合の対象への投与経路としては、限定されないが、例えば、膵臓内、皮下、腹腔内、好ましくは血管内、静脈内、さらにより好ましくは腹腔動脈内、膵管内が具体的に挙げられる。
（３）治療方法
　本発明によれば、Ｍｙｃｌ遺伝子若しくはその遺伝子産物、膵島様細胞等、又はそれらのいずれかの組み合わせを用いて、糖尿病又はそれに関連する疾患を有する対象を予防及び／又は治療する方法が提供される。さらに、本発明によれば、上記治療方法において、Ｍｙｃｌ遺伝子を活性化させるための活性剤を投与することができ、インスリン産生促進剤又は医薬組成物の投与前に、同時に、又は後に投与してもよい。
（４）キット
　本発明によれば、インスリン産生促進剤又は医薬組成物を含む、糖尿病又はそれに関連する疾患を予防及び／又は治療するために使用されるキットが提供される。このようなキットには、上記インスリン産生促進剤又は医薬組成物を対象に投与又は移植するための使用説明書を含むことができる。また、キットには、Ｍｙｃｌ遺伝子を活性化させるための活性剤をさらに含み得る。
　以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
方法
（ｉ）Ｄｏｘ依存的にＭｙｃ、Ｍｙｃｎ、Ｍｙｃｌ発現誘導可能なＥＳ細胞の樹立
　ＥＳ細胞由来のｃＤＮＡからＭｙｃ、Ｍｙｃｎ、及びＭｙｃｌのｃＤＮＡのクローニングを行い、このクローニング断片をｐＣＲ８－ＧＷ－ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）へ挿入した。各Ｍｙｃ遺伝子が挿入されたｐＣＲ８－Ｍｙｃｌ－ＴＯＰＯベクターとＴｅｔＯＰ－ＡｔｔＲ１－ｃｃｄＢ－ＡｔｔＲ２－ｉｒｅｓ－ｍＣｈｅｒｒｙベクター間でＬＲ反応を行い作製したＣｏｌ１ａ１－ＴｅｔＯＰ－Ｍｙｃｌ－ｉｒｅｓ－ｍＣｈｅｒｒｙベクター（以下、「ターゲティングベクター」と呼ぶ）をｆｌｉｐ－ｉｎリコンビネーションシステム（Ｂｅａｒｄ　ｅｔ　ａｌ．，　２００６）を用いることでＫＨ２－ＥＳ細胞のＣｏｌ１ａ１遺伝子座に挿入した。Ｆｌｉｐ－ｉｎリコンビネーションを行う際には、各Ｍｙｃ遺伝子が挿入されたターゲティングベクター５０μｇとｐＦｌａｐａｓｅベクター２５μｇ及び２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｇｉｂｃｏ社）を含む高グルコースＤＭＥＭ（Ｎａｃａｌａｉ　Ｔａｓｑｕｅ社）培地で懸濁した細胞懸濁液をＧｅｎｅ　ｐｕｌｓｅｒ　Ｘｃｅｌｌ　エレクトロポレーションシステム（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を用いてＫＨ２－ＥＳ細胞にエレクトロポレーション（Ｖｏｌｔａｇｅ：５５０　Ｖ，Ｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ：２５μＦ，Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ：∞，Ｃｕｖｅｔｔｅ：４ｍｍ以上の条件で２回パルス供給）した。エレクトロポレーションを行なった２４時間後、ハイグロマイシンＢ（Ｒｏｃｈｅ社）１５０μｇ／ｍＬで選択し、形成されたコロニーを拾い、Ｄｏｘ依存的に各Ｍｙｃ遺伝子を発現誘導可能なＥＳ細胞株を樹立した。
（ｉｉ）細胞の培養方法
　フィーダー細胞（ＭＥＦ；マウス胎仔繊維芽細胞）の培養には、１０％ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ社）、５０Ｕ／ｍＬ　Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｐ／Ｓ；Ｎａｃａｌａｉ　Ｔｅｓｑｕｅ社）、Ｌ－グルタミン（ＧＩＢＣＯ社）、ＮＥＡＡ（Ｎａｃａｌａｉ　Ｔｅｓｑｕｅ社）を含むＤＭＥＭ（Ｎａｃａｌａｉ　Ｔｅｓｑｕｅ社）培地を用いた。
　ＥＳ細胞の培養には、１５％ＦＢＳ、５０Ｕ／ｍＬ　Ｐ／Ｓ、Ｌ－グルタミン、ＮＥＡＡを含むｋｎｏｃｋ　ｏｕｔ－ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）に、２－メルカプトエタノール（２ＭＥ：ＧＩＢＣＯ社）及びＬＩＦ（ＳＩＧＭＡ社）を添加した培地を用いて、ゼラチンコート（ＳＩＧＭＡ）し、フィーダー細胞を播種したディッシュで培養した。ＥＳ細胞の継代の際は、０．２５％トリプシン／１ｍＭ　ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯ）で３７℃にて約３分間処理し、１／１０量程度の細胞懸濁液を新たなディッシュに播種した。
（ｉｉｉ）生体内Ｍｙｃｌ発現誘導可能なマウスの作製
　ドキシサイクリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、以下、「Ｄｏｘ」と記載することがある）依存的にＭｙｃｌの発現を誘導可能なＥＳ細胞をマウス胚盤胞（ＩＣＲ，Ｅ３．５）にインジェクションし、偽妊娠２日目マウス（Ｓｌｃ：ＩＣＲ，清水実験材料）の子宮内に移植することにより、Ｄｏｘ依存的にＭｙｃｌ発現を誘導可能な細胞を有したキメラマウスを作製した。
（ｉｖ）ドキシサイクリンの投与
　８週齢のマウスを使用し、２．０ｍｇ／ｍＬのＤｏｘを含む溶液を飲水投与した。培養細胞においては、終濃度２．０μｇ／ｍＬとなるよう培地に添加した。
（ｖ）マウス諸臓器における病理標本の作製
　マウスを解剖後、各臓器を４％ＰＦＡ（和光純薬社）内において１日振とうした翌日に７０％ＥｔＯＨ（和光純薬１００％ＥｔＯＨを希釈して使用）に移し、さらに１日振とうした。翌日、スピンティッシュプロセッサーＳＴＲ１２０（Ｔｈｅｒｍｏ　ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社）を使用し、推奨プロトコールに従いブロックを作製した。病理標本の作製はバイオゲート株式会社に委託した。
（ｖｉ）免疫染色
　組織切片をキシレン（和光純薬社）、その後、１００％ＥｔＯＨ（和光純薬社）に各３０分以上浸した。水道水で約１０分間洗浄し、沸騰させた抗原賦活化液ｐＨ９（ニチレイバイオサイエンス社、１０倍希釈で使用）内に移し、１０分間抗原賦活化処理を行った。ブロッキング溶液（２％ＢＳＡ＋１×ＰＢＳ）により各倍率で希釈した１次抗体溶液を組織切片上に２００μＬ添加し、３０分～１時間静置した。１×ＰＢＳで２回洗浄した後、２次抗体溶液を組織切片上に２滴添加し、３０分間静置した。１×ＰＢＳで２回洗浄した後、ＤＡＢ染色の場合はＤＡＢ溶液（ニチレイバイオサイエンス社、ＤＡＢ基質キット使用、１ｍＬのＥｌｉｘ水に試薬Ａ及びＢを各１滴ずつ添加・混合後、試薬Ｃを１滴添加・混合したもの）を組織切片上に１５０μＬ添加し、抗原抗体反応を行った後、顕微鏡下で観察を行った。蛍光染色の場合は、組織切片上に封入材を１滴添加し、カバーガラスをかけた後、顕微鏡下で観察を行った。
＜使用した１次抗体（希釈倍率）－２次抗体＞
・抗ｍＣｈｅｒｒｙ抗体（ａｂｃａｍ社、１／５００）－抗ウサギＩｇＧ抗体（ニチレイバイオサイエンス社）
・抗Ｓｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎ抗体（ａｂｃａｍ社、１／５００）－抗ウサギＩｇＧ抗体（ニチレイバイオサイエンス社）
・抗Ｃｈｒｏｍｏｇｒａｎｉｎ　Ａ抗体（ＤＡＫＯ社、１／５００）－抗ウサギＩｇＧ抗体（ニチレイバイオサイエンス社）
・抗Ｋｉ６７抗体（ａｂｃａｍ社、１／２００）－抗ウサギＩｇＧ抗体（ニチレイバイオサイエンス社）
・抗Ｉｎｓｕｌｉｎ抗体（ＤＡＫＯ社）－抗モルモットＩｇＧ抗体（ＢＩＯＴＩＵＭ社）
・抗Ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ抗体（Ｓａｎｔａ　ｃｒｕｚ社、１／３００）－抗マウスＩｇＧ抗体（ＢＩＯＴＩＵＭ社）
・抗Ｇｌｕｃａｇｏｎ抗体（Ｓａｎｔａ　ｃｒｕｚ社、１／３００）－抗マウスＩｇＧ抗体（ＢＩＯＴＩＵＭ社）
（ｖｉｉ）ＲＮＡ回収、ＲＮＡ抽出、及びｃＤＮＡ合成
　ＲＮＡ回収においては、培養細胞をＰＢＳ（－）（Ｎａｋａｌａｉ　Ｔａｓｑｕｅ）で洗浄後、３５０μＬのＬＢＰ緩衝液で細胞を溶解した。ＲＮＡ抽出にはＮｕｃｒｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ＲＮＡ　Ｐｌｕｓ（ＴＡＫＡＲＡ社）を用いて、推奨プロトコールに従った。ｃＤＮＡの合成には、Ｐｒｉｍｅｓｃｒｉｐｔ一本鎖ｃＤＮＡ合成キット（ＴＡＫＡＲＡ社）を用いて推奨プロトコールに従った。
（ｖｉｉｉ）ｑＲＴ－ＰＣＲ
　ＧｏＴａｑ　ｑＰＣＲマスターミックス（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、推奨プロトコールに従った。Ｓｔｅｐｏｎｅ　Ｐｌｕｓシステム（Ｌｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）により解析を行った。プライマー及びＰＣＲ反応条件は以下のものを使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（ｂ）ＰＣＲ反応条件
　・９５℃、２分間
　・９５℃（１５秒）、６０℃（１分）［４０サイクル］
　・９５℃（１５秒）、６０℃（１分）、９５℃（１５秒）
（ｉｘ）膵島単離
　８週齢のマウスにソムノペンチル（共立製薬株式会社）を腹腔内注射することで麻酔した。開腹後、十二指腸総胆管開口部を同定したのち、総胆管上部及び腸管をブルドック鉗子で止めた。総胆管を十二指腸との境目で切れ目を入れ、Ｃｏｌａｌｇｅｎａｓｅ　Ｐ（Ｒｏｃｈｅ社）（２ｍｇ／ｍＬ）を含むＭ１９９培地（Ｇｉｂｃｏ社）２ｍＬを注入した。その後、膵臓を摘出し、３７℃の湯浴槽で１１分３０秒消化処理を行った。１０％ＦＢＳを含むＭ１９９培地２５ｍＬで懸濁し、遠心分離（１０００ｒｐｍ、４℃、２分）を２回行った。上清を捨て、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（ＳＩＧＭＡ社）１０ｍＬで懸濁させた後、その上から１０％ＦＢＳを含むＭ１９９培地１０ｍＬを注ぎ、遠心分離（１０００ｒｐｍ、４℃、３０分）を行った。上清を別の５０ｍＬチューブに移し、さらに１０％ＦＢＳを含むＭ１９９培地２５ｍＬを加えた後、遠心分離（１０００ｒｐｍ、４℃、２分）を行った。
（ｉｘ）膵島の分散
　単離した膵島を１．５ｍＬシリコンチューブに採取し、分散緩衝液（以下表２参照）１００μＬを添加した。３７℃にて１５分で静置後、ピペッティングすることで分散させた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
（ｘ）膵島培養（ゲルを用いた三次元培養法）
　９６ウェルプレート（ＣＯＲＮＩＮＧ社）に単離した膵島を含むマトリゲル（ＣＯＲＮＩＮＧ社）２０ｕＬを添加後、３７℃にて１５分間、インキュベートすることでマトリゲルをゲル化させた。その後、成長因子を含む培地（以下表参照）１４０μＬを添加し、３７℃にて５％ＣＯ2で培養を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
（ｘｉ）膵島培養（浮遊培養）
　６ウェルプレートに培地を２ｍＬ添加し、培地上にセルカルチャーインサート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を浮遊させた。セルカルチャーインサート上に単離した膵島、及び培地２０μＬを添加し、３７℃、５％ＣＯ2で培養を行った。
（ｘｉｉ）腹腔内ブドウ糖負荷試験（ＩＰＧＴＴ）
　Ｍｙｃｌ発現群及び対照群を１２～１６時間絶食した。その後、各マウスの体重を計測し、Ｄ－ｇｌｕｃｏｓｅ　２ｇ／ｋｇ（マウス）になるようにＤ－ｇｌｕｃｏｓｅ溶液をマウスの腹腔内に注射した。１５、３０、６０、１２０分後に各マウスの血液を尻尾から採血し、アントセンス台（Ｈｏｒｉｂａ社）を用いて血糖値を測定した。
（ｘｉｉｉ）糖尿病マウスの作製
　８～１２週齢の免疫不全マウス（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）の体重を測定し、ストレプトゾシン（ＳＴＺ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）１５０ｍｇ／ｋｇになるようにストレプトゾシン溶液をマウスの腹腔内に注射した。１週間後にアントセンス台（Ｈｏｒｉｂａ社）を用いて血糖値を測定し、随時血糖が２５０ｍｇ／ｄＬ以上のマウスを糖尿病マウスとして用いた。
（ｘｉｖ）膵島移植（腎被膜下移植）
　糖尿病マウスにソムノペンチル（共立製薬株式会社）を腹腔内注射することで麻酔した。開腹後、注射針を用いて腎被膜を切開した。シリコンチューブを腎被膜下に挿入し、ハミルトンシリンジを用いて膵島を腎被膜下へ移植した。移植後、シリコンチューブを抜き、腹膜・皮膜を縫合した。
（ｘｖ）腎臓摘出
　膵島を移植したマウスにソムノペンチル（共立製薬株式会社）を腹腔内注射することで麻酔した。開腹後、膵島を移植した腎臓を摘出し腎静脈・腎動脈を結紮糸にて結紮した。腎臓摘出後、腹膜・皮膜を縫合した。
（ｘｖｉ）シングルセル解析
　ＧＥＯデータベースに公開されている解析データ（ＧＳＥ１０１０９９；Ｂｙｒｎｅｓ　ＬＥ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔ　Ｃｏｍｍｕｎ．２０１８　Ｓｅｐ　２５；９（１）：３９２２）を用いて再解析を行った。ｔ－ＳＮＥ解析には、Ｓｅｕｒａｔ　ｖ２．２およびｖ２．３を使用した（Ｓａｔｉｊａ　Ｒ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５　３３：４９５－５０２）。
実施例１：Ｍｙｃｌ発現誘導可能マウスＥＳ細胞の樹立
　上記で作製したＭｙｃｌ遺伝子が組み込まれたＥＳ細胞株が、Ｄｏｘ依存的に発現可能かどうかを検討した。Ｍｙｃｌ遺伝子の発現は、その遺伝子の下流に組み込んだｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子の発現により確認することができる。ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子は、赤色蛍光タンパク質をコードする遺伝子であり、該遺伝子の発現により、細胞は赤色に発色する。図１に示されるように、Ｄｏｘ添加前と添加後の遺伝子発現を比較すると、Ｍｙｃｌ遺伝子発現が顕著に増加していることから、Ｍｙｃｌ発現誘導可能マウスＥＳ細胞が樹立できたことが判明した。
　また、Ｍｙｃ遺伝子及びＭｙｃｎ遺伝子をそれぞれを組み込んだＥＳ細胞株についても同様にＤｏｘ依存的に遺伝子発現が誘導されるかどうかを検討したところ、図１２に示されるように、Ｍｙｃｌ発現誘導と同じく、それぞれの遺伝子発現が観察された。
　一方、細胞増殖の指標としてＫｉ６７タンパク質の発現を観察すると、Ｄｏｘ投与の期間が長くなるとともに増殖細胞（Ｋｉ６７陽性細胞）が増加し、Ｄｏｘ投与を停止後の２週間では、Ｋｉ６７陽性細胞の数が顕著に減少し、細胞増殖が停止した（図７）。上記の結果から、Ｍｙｃｌ遺伝子が導入されたＥＳ細胞は、Ｄｏｘによって遺伝子発現が誘導され、細胞増殖することが判明した。
実施例２：Ｍｙｃｌ過剰発現による膵島細胞の増殖（神経内分泌腫瘍の形成）
　上記で作製したＭｙｃｌ遺伝子を発現する８週齢のキメラマウスにＤｏｘを８週間投与した。Ｄｏｘ投与から８週後にマウスを屠殺し、膵臓を摘出し、膵臓切片を組織化学的に評価した。図２において矢印で示されるように、Ｄｏｘによる誘導によりＭｙｃｌを過剰発現させた膵臓組織では、正常の膵臓組織と比較して、膵島細胞が増殖し、膵島が肥大していることが分かる。
実施例３：Ｍｙｃｌ過剰発現による膵島前駆細胞様細胞の増生
　キメラマウスにＤｏｘを投与してから４週間後に、ソマトスタチン陽性細胞の増生について検討した。実施例２で示したように、膵島細胞にＭｙｃｌ遺伝子を発現させることで、膵島細胞の増殖の誘導が可能である。図３から図６に示されるように、増殖細胞はＭｙｃｌ遺伝子存在下では膵島前駆細胞に類似した遺伝子発現を示し、同時にソマトスタチンを発現し増殖しているが、これに対して、インスリン陽性細胞が減少した。
実施例４：Ｍｙｃｌ過剰発現によるソマトスタチン陽性の膵島細胞様細胞の増生
　実施例２と同様の実験系において、Ｄｏｘ投与から８週間後にソマトスタチン陽性細胞及びインスリン陽性細胞の増殖を検討した。図４及び図５に示されるように、インスリン陽性細胞は減少し、ソマトスタチン陽性細胞が顕著に増加した。
実施例５：Ｍｙｃｌ過剰発現による膵島前駆細胞様細胞への脱分化
　実施例２と同様の実験系において、Ｄｏｘ投与から８週間後の肥大した膵島における遺伝子発現解析を行った。膵島はＮｇｎ３をマーカーとする膵島前駆細胞からＦｅｖをマーカーとする膵島前駆細胞を経て、各膵島細胞へと分化すると考えられている（図６）。Ｍｙｃｌの過剰発現によって増殖した膵島細胞における遺伝子発現を解析したところ、前駆細胞のマーカーであるＦｅｖや同時期に発現するＰａｘ４、Ｃｃｋの発現上昇が観察された（図１３）。この結果から、Ｍｙｃｌ過剰発現によって増殖可能な膵島前駆細胞様細胞を誘導可能であることが示唆された。
実施例６：Ｍｙｃｌ発現停止によるインスリン陽性細胞誘導
　実施例２で使用した実験系において、Ｄｏｘ投与を８週間後に停止させ、それから２週間後及び４週間後にインスリン陽性細胞及びソマトスタチン陽性細胞の増減を観察した。図５に示されるように、Ｄｏｘ投与を停止してから２週間後及び４週間後には、一度は減少したインスリン陽性細胞が増加し、これとは対照的に、一度は増加したソマトスタチン陽性細胞が減少した（図８）。この結果から、Ｍｙｃｌ過剰発現によって増殖した膵島前駆細胞様細胞は、Ｍｙｃｌ発現を停止させたことにより、インスリン陽性細胞に変化したことが示唆された。
　また、細胞増殖能の標的タンパク質として公知であるＫｉ６７の発現を観察すると、Ｄｏｘ投与の期間が長くなるとともに増殖細胞（Ｋｉ陽性細胞）が増加し、Ｄｏｘ投与を停止後の２週間では、Ｋｉ陽性細胞の数が顕著に減少し、細胞増殖が停止した（図７）。
　実施例７：Ｍｙｃｌ一過性過剰発現による耐糖能の亢進
　キメラマウスにおいて、Ｄｏｘ投与を停止した場合の耐糖能を評価した。図９左に示されるように、対照（「ｃｏｎｔ．」）と比較して、Ｄｏｘ投与を停止したマウスでは、耐糖能が亢進していることが分かる。また、空腹時における血糖値は一貫して維持されており、生体内において増大した膵島は機能性を持った膵島であることが示唆された（図９右）。
　実施例８：Ｍｙｃｌ過剰発現による試験管内での膵島細胞の増殖誘導
（１）単離した膵島におけるＭｙｃｌ発現誘導
　キメラマウスから膵臓を摘出し、その後、単離した膵島についてＭｙｃｌの発現誘導を検討した。Ｄｏｘの添加開始時を０日として、Ｍｙｃｌ発現を経時的に観察して結果を図１０に示す。対照と比較して、Ｄｏｘを添加された系では、Ｍｙｃｌ遺伝子の発現とともに、経時的に膵島が増大する傾向にあった。
（２）単離した膵島から分散させた細胞におけるＭｙｃｌ発現誘導
　単離した膵島から分散させた細胞について、上記（１）と同様にＭｙｃｌ遺伝子の発現を検討した。Ｄｏｘを添加してから１４日目の細胞においてＭｙｃｌ遺伝子を観察すると、添加１日目と比較して、各細胞においてＭｙｃｌ遺伝子が発現していることがわかった（図１１）。
（３）単離した膵島における試験管内でのｃ－Ｍｙｃ、Ｍｙｃｎの発現誘導
　上記で作製したｃ－Ｍｙｃ及びＭｙｃｎが組み込まれたＥＳ細胞がドキシサイクリン依存的に発現誘導可能であることを確認した。このＥＳ細胞を用いてキメラマウスを作製した。作製したキメラマウスから単離した膵島細胞において、インビトロでドキシサイクリンを１週間添加することでｃ－Ｍｙｃ及びＭｙｃｎの発現誘導を行った。その結果、ｃ－ＭｙｃおよびＭｙｃｎの発現誘導により、増殖は促進するものの、Ｍｙｃｌとは異なり細胞死が誘導されることがわかった（図１２）（Pelengaris S, Khan M, Evan GI., Cell 2002; 109(3):321-334参照）。
実施例９：試験管内で増殖誘導した膵島細胞の機能性評価
　試験管内でＭｙｃｌ過剰発現により増殖誘導を行った膵島細胞を糖尿病マウスに移植することで、増殖した膵島細胞の機能性を検討した。単離した３０個の膵島を分散させ、１週間Ｄｏｘを添加することで膵島細胞の増殖誘導を行った。この膵島細胞を回収し、糖尿病マウスの腎被膜下に移植したところ、随時血糖の改善が認められた。また、２週間後に膵島細胞を移植した腎臓を摘出したところ、糖尿病マウスが再び高血糖に戻った。一般的に糖尿病マウスの血糖値を低下させるためには３００個以上の膵島移植が必要である。60個の膵島から増殖させた膵島様細胞で糖尿病マウスの血糖値を低下させることに成功した。
実施例１０：Ｍｙｃｌ発現誘導による糖尿病マウスモデルにおける治療効果の検証
　糖尿病マウスモデルを作製し、Ｍｙｃｌの発現誘導による治療効果を検証した。８週齢のＭｙｃｌ発現誘導可能なマウス（ＫＨ２－Ｍｙｃｌ）に１５０ｍｇ／ｋｇとなるようにストレプトゾシン（ＳＴＺ）（膵β細胞に毒性を有する）を腹腔内に投与することにより糖尿病マウスモデルを作製した。その２週間後から８週間、Ｄｏｘ投与によるＭｙｃｌの発現誘導を行った。さらに２週間、Ｄｏｘ投与を停止することによりＭｙｃｌの発現を停止させた。この時点で糖応答性試験（ＩＰＧＴＴ）及び組織学的解析を行った。
　結果を図１４に示す。対照群（ＳＴＺのみ投与）ではＳＴＺ投与後から血糖が増加した一方で、ＤｏｘによるＭｙｃｌの発現誘導を行った群（ＳＴＺ＋Ｍｙｃｌ）ではＤｏｘ投与後から血糖の減少が見られ、またＤｏｘ投与を停止した後も正常血糖を示した（図１４左上）。さらに、糖応答性試験を行った結果、Ｍｙｃｌの発現誘導を行った群で速やかな血糖値の減少が観察された（図１４左下）。
　さらに、インスリン（「Ｉｎｓ」）、グルカゴン（「Ｇｏｇ」）、及びソマトスタチン（「Ｓｓｔ」）の発現について組織学的解析を行ったところ、対照群（ＳＴＺのみ投与）ではインスリン陽性細胞の割合が減少していた。一方、Ｍｙｃｌを発現誘導した群（ＳＴＺ＋Ｍｙｃｌ）では、膵島細胞の増大とインスリン産生細胞の割合の増加が観察された。以上の結果から、Ｍｙｃｌの発現誘導により、糖尿病疾患の治療効果が期待される。
実施例１１：Ｍｙｃｌは膵島以外に異常増殖を誘導しない
　ＭＹＣファミリー遺伝子（「Ｍｙｃ」、「Ｍｙｃｎ」、及び「Ｍｙｃｌ」）をそれぞれ生体内でＤｏｘ依存的に発現誘導させるため、最初にこれらの遺伝子を発現誘導可能なＥＳ細胞を樹立した（図１５上段）。このＥＳ細胞を胚盤胞にインジェクションすることによりキメラマウスを作製した。このキメラマウスが４週齢となった時点から４週間、Ｄｏｘを添加することによりＭＹＣファミリー遺伝子の発現誘導を行った。
　Ｍｙｃの発現誘導は肝臓において、Ｍｙｃｎの発現誘導は肝臓及び腸管において腫瘍の形成を認めた一方で、Ｍｙｃｌの発現誘導は少なくとも肝臓及び小腸において異常な増殖を認めなかった（図１５下段）。このことから、Ｍｙｃｌは膵島に特異的に増殖することが示唆された。
実施例１２：老齢マウスにおける膵島増生
　老齢マウス（１１５週齢）から膵島細胞を単離し、Ｄｏｘ依存的にＭｙｃｌ及びｐＺｓＧｒｅｅｎＤＲベクター（Ｔａｋａｒａ、ｃａｔ＃６３２４２８）（対照群）を発現誘導可能なレンチウイルスを感染させた。使用したｚｓＧｒｅｅｎＤＲは、ｚｓＧｒｅｅｎのＣ末端にタンパク質分解シグナルを融合させた短寿命型の緑色蛍光タンパク質である。
　感染の翌日、この膵島細胞をマトリゲルを用いた三次元培養に移行し、同時にＤｏｘを投与することによりＭｙｃｌ及びｚｓＧｒｅｅｎＤＲをそれぞれ発現誘導した。ｚｓＧｒｅｅｎＤＲを発現誘導した膵島細胞は、７日間経過しても形態に変化を認めなかった（図１６右）。一方、Ｍｙｃｌを発現誘導することで、膵島細胞の増大が観察された（図１６左）。この結果から、非常に老齢なマウスにおいてもＭｃｙｌの発現誘導による膵島増生が可能であることが判明した。
実施例１３：ヒト膵島前駆細胞におけるＭｃｙｌの発現
　２０２０年に投稿された論文（ＪＲ　Ａｌｖａｒｅｚ－Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ，ｅｔ　ａｌ．，Ｃｉｒｃａｄｉａｎ　Ｅｎｔｒａｉｎｍｅｎｔ　Ｔｒｉｇｇｅｒｓ　Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｉｓｌｅｔｓ．，Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ，２６（１），１０８－１２２，２０２０）では、ヒトｉＰＳ細胞から段階的にヒト膵β細胞を分化誘導させたときの分子プロファイルを観察した。そこで、このデータセットを用いて、ＭＹＣファミリー（上述）の遺伝子発現及びＨ３Ｋ２７ａｃ（一般的に転写活性化を示すクロマチンマーク）を観察した（図１７）。
　Ｍｙｃファミリー遺伝子の発現は多能性幹細胞（「ｈＰＳＣ」）で高く、分化と共に減少する傾向があったが、Ｍｙｃｌに関しては、「ＥＮ」（内分泌前駆細胞、すなわち膵島前駆細胞）において一過性に発現上昇が認められた。このことから、マウスと同様にヒト膵島細胞においてもＭｙｃｌが膵島細胞の増殖に寄与している可能性が示唆された。
実施例１４：ヒトにおける膵島増生の確認
　ヒト膵島細胞において、Ｄｏｘ依存的にＭｙｃｌ及びｚｓＧｒｅｅｎＤＲ（対照群）を発現誘導可能なレンチウイルスを感染させた。翌日、この膵島細胞をマトリゲルを用いた三次元培養に移行し、同時にＤｏｘを投与することによりＭｙｃｌ及びｚｓＧｒｅｅｎＤＲをそれぞれ発現誘導した。
　ｚｓＧｒｅｅｎＤＲを発現誘導した膵島細胞は７日間経過しても形態に変化を認めなかったが、ＭＹＣＬを発現誘導させた場合には膵島細胞の増大が観察された（図１８左下）。さらに、免疫染色を行った結果、ＭＹＣＬを過剰発現させた群は、ｍＣｈｅｒｒｙの発現が認められた細胞（ＭＹＣＬが発現したことと同義である）においてＫｉ６７（細胞増殖マーカー）が検出された（図１８右下）。
実施例１５：シングルセル解析によりヒトにおける膵島増生の確認
　ヒト膵島細胞において、Ｄｏｘ依存的にＭｙｃｌ、ＭＹＣＬ、及びｚｓＧｒｅｅｎＤＲ（対照群）をそれぞれ発現誘導可能なレンチウイルスを感染させた。翌日、細胞培養インサートを用いた浮遊培養に移行し、同時にＤｏｘを投与することによりＭｙｃｌ及びｚｓＧｒｅｅｎＤＲをそれぞれ発現誘導した。７日後、死細胞を除去後、常法に従ってシングルセルＲＮＡ－ｓｅｑを行った。
　シングルセルＲＮＡ－ｓｅｑの結果、α細胞、β細胞、δ細胞、膵管細胞（「ＰＰ」）、間葉系細胞、血管内皮細胞、及び星細胞が検出された（図１９左）。このうち、β細胞にのみ着目し、細胞増殖のマーカーであるＣＤＫ４の発現を解析した結果、ｚｓＧｒｅｅｎＤＲの発現誘導ではＣＤＫ４に影響を与えなかったが、一方、Ｍｙｃｌ、ＭＹＣＬの発現誘導においてはＣＤＫ４の発現を誘導した。このことから、ヒト膵島細胞においてもＭｙｃｌの発現誘導により細胞増殖し得ることが判明した。
　ドナーから単離された膵島に本発明技術を応用すれば、試験管内で膵島インスリン陽性細胞数を増殖させることが可能であり、本発明における膵島ドナーの不足が解消できる可能性がある。ＥＳ／ｉＰＳ細胞からの膵島インスリン陽性細胞の分化誘導系に本技術を用いることで、多能性幹細胞からの効率的な膵島インスリン陽性細胞の分化誘導が可能となる。さらに、胚盤胞補完法による多能性幹細胞からの膵島作製技術に応用することで、作製臓器中でのインスリン陽性再増数を増加させることが可能である。本発明はドナー由来の膵島細胞や多能性幹細胞由来膵島細胞に対して一過性的にＭｙｃｌを発現させる必要があるが、エピソーマルベクターやＲＮＡ等を導入することで遺伝子改変なしに大量に膵島細胞を樹立することも可能と考えられる。またこの技術を用いて増殖させた膵島細胞は、膵島ストック細胞株として増殖維持できることが期待される。膵島ストック細胞株により、長期的、安定的に、かつ大量にインスリン陽性細胞を供給できる可能性がある。将来的に多くの糖尿病患者に対して安価かつ高品質な膵島を提供できることが期待される。
　本明細書に引用する全ての刊行物及び特許文献は、参照により全体として本明細書中に援用される。なお、例示を目的として、本発明の特定の実施形態を本明細書において説明したが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、種々の改変が行われる場合があることは、当業者に容易に理解されるであろう。

Claims (20)

  1. 　Ｍｙｃｌ遺伝子又はその遺伝子産物を含む、インスリン産生促進剤。
  2. 　Ｍｙｃｌ遺伝子が、
    　（１）配列番号１又は３で表される塩基配列を含む核酸；又は
    　（２）配列番号１又は３で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＭｙｃｌ遺伝子が発現誘導された場合に、インスリン産生を促進する活性を有するポリペプチドをコードする核酸
    を含む、請求項１に記載のインスリン産生促進剤。
  3. 　Ｍｙｃｌ遺伝子産物が、
    　（１）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；又は
    　（２）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、並びに膵島様細胞を増殖させる効果及び／又はインスリン産生を促進する活性を有するポリペプチド
    を含む、請求項１に記載のインスリン産生促進剤。
  4. 　Ｍｙｃｌ遺伝子又はその遺伝子産物が膵島細胞に導入されている、インスリン産生促進剤。
  5. 　Ｍｙｃｌ遺伝子が一過的に発現する、請求項１～４のいずれか１項に記載のインスリン産生促進剤。
  6. 　膵島細胞が、膵臓から単離された初代膵島細胞、培養膵島細胞、又は幹細胞由来である、請求項４又は５に記載のインスリン産生促進剤。
  7. 　幹細胞が、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、及び体性幹細胞からなる群から選択される、請求項６に記載のインスリン産生促進剤。
  8. 　糖尿病及びそれに関連する疾患を予防及び／又は治療するための医薬組成物であって、
    　（ｉ）Ｍｙｃｌ遺伝子若しくはその遺伝子産物；Ｍｙｃｌ遺伝子が組み込まれたベクター；及び／又はＭｙｃｌ遺伝子若しくはその遺伝子産物が導入された又は発現誘導された、膵島細胞；並びに
    　（ｉｉ）薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体を含む、前記医薬組成物。
  9. 　糖尿病及びそれに関連する疾患が、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、耐糖能障害、高血糖症、異脂肪血症、肥満症又は代謝症候群に関連する疾患、障害又は症状から選択される、請求項８に記載の医薬組成物。
  10. 　Ｍｙｃｌ遺伝子が、
    　（１）配列番号１又は３で表される塩基配列を含む核酸；又は
    　（２）配列番号１又は３で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＭｙｃｌ遺伝子が発現誘導された場合に、インスリン産生を促進する活性を有するポリペプチドをコードする核酸
    を含む、請求項８又は９のいずれかに記載の医薬組成物。
  11. 　Ｍｙｃｌ遺伝子産物が、
    　（１）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；又は
    　（２）配列番号２又は３で表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、並びに膵島様細胞を増殖させる効果及び／又はインスリン産生を促進する効果を有するポリペプチド
    を含む、請求項８又は９のいずれかに記載の医薬組成物。
  12. 　請求項１～７のいずれか１項に記載のインスリン産生促進剤、又は請求項８～１１のいずれか１項に記載の医薬組成物を含むキット。
  13. 　Ｍｙｃｌ遺伝子を活性化させるための活性剤をさらに含むキット。
  14. 　Ｍｙｃｌ遺伝子を活性化させるための活性剤が、プロモーター、エンハンサー、プロモーターを活性化する酵素又は因子、エンハンサーを活性化する酵素又は因子、核酸タンパク質複合体、及び低分子化合物からなる群から選択される、請求項１３に記載のキット。
  15. 　Ｍｙｃｌ遺伝子又はその遺伝子産物が導入された膵島細胞。
  16. 　膵島細胞が、膵臓から単離された初代膵島細胞、培養膵島細胞、又は幹細胞由来である、請求項１５に記載の膵島様細胞。
  17. 　請求項１６に記載の膵島様細胞を調製する方法であって、
    　（ａ）組換えプラスミド、組換えウイルスベクター、ミニサークル、又はエピソーマルベクターにＭｙｃｌ遺伝子を組み込む工程；及び
    　（ｂ）工程（ａ）で得られた組換えプラスミド、組換えウイルスベクター、ミニサークル、又はエピソーマルベクターを膵島細胞に導入する工程
    を含む方法。
  18. 　請求項１６に記載の膵島様細胞を調製する方法であって、Ｍｙｃｌ遺伝子をコードするＲＮＡ、又はＭｙｃｌタンパク質を膵島細胞に導入する工程を含む方法。
  19. 　Ｍｙｃｌ遺伝子を発現させる工程を含む、請求項１５若しくは１６に記載の膵島様細胞、又は請求項１７若しくは１８に記載の方法によって調製された膵島様細胞を増殖させる方法。
  20. 　Ｍｙｃｌ遺伝子の発現が一過的であることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
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