WO2021123480A1 - Solución acuosa que comprende un complejo de inclusión, método de obtención y su uso para aplicación en cultivos y la mejora de su rendimiento - Google Patents

Solución acuosa que comprende un complejo de inclusión, método de obtención y su uso para aplicación en cultivos y la mejora de su rendimiento Download PDF

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acid
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Celia ANDRÉS JUAN
Laura BUZÓN DURÁN
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Universidad de Valladolid
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Definitions

  • the invention presented is framed in the field of Biochemistry and finds its application in the agricultural sector. Specifically, it deals with a complex of natural origin, which is a binary complex formed by high molecular weight chitosan and one or more biologically active compounds (CBA) applicable in agriculture, and of natural origin that are generally present in plant extracts.
  • CBA biologically active compounds
  • Biochemistry is a field of remarkable breadth and in continuous technological progress, applicable to the pharmaceutical, food, agricultural and cosmetic industries, which need to evolve to improve the effectiveness of the substances applied in their intended use, providing solutions adapted to each needs. more and more demanding.
  • Each field of application requires specific conditions to be able to use these substances, and the first one is their toxicity, since all those that may be dangerous to health to a greater or lesser extent must be discarded; something that, for example, happens with most known essential oils.
  • basic substances which are natural, innocuous, food grade and not classified as phytosanitary, are configured as the most acceptable use for this purpose. If they are accepted for a certain use (due to lack of toxicity), the effectiveness of the active substances depends mainly on their bioavailability.
  • bioavailability of active ingredients improves with solubility, and having solutions without turbidity is essential to increase their bioavailability and physical use.
  • bioactive substances applicable in the field of agriculture such as those of natural origin, there are a large number of them that are not soluble in water, or that are only partially so, so they are not effective in practice.
  • These substances include a series of phytochemical compounds, naturally present in plants or their derivatives (for example, flour), such as polyphenols, terpenes and very few essential oils, quinones and anthraquinones, flavonoids, proteins, lignans and others, who have activity antimicrobial and whose solubility is practically nil and, therefore, in its normal formulation, it is not usable inside the organisms to which it is applied, since its absorption occurs naturally through water.
  • the concept of bioavailability is essential to guarantee that the compound applied has an advantage on the part of the organism and is useful for the intended purpose.
  • the best known techniques to improve the bioavailability of hydrophobic or partially insoluble compounds in water are: the reduction of the particle size, the preparation of a solid dispersion, the use of surfactants, and the formation of inclusion, emulsification and encapsulation complexes in liposomes. .
  • a known encapsulating agent is cyclodextrin, which can be of type a (with a 6-glucoses ring), b (7-glucoses ring) and y (8 glucoses). Cyclodextrin plus soluble in water is a derivative of b, called hydroxypropyl beta-cyclodextrin.
  • the CBA is housed inside the toroid formed by the glucose, but has the disadvantage of the difficulty in making said CBA available and, thus, making it active.
  • patents for example, EP0422497B1 that describe this method, but it has not been transferred to the commercial scale due to the mentioned drawback.
  • chitosan Another well-known encapsulating agent, and relevant in the case of the present invention as it is a basic substance approved under article 23 of Regulation (EC) No. 1107/2009, is chitosan, also called chitosan.
  • This use of the compound is not well developed at an industrial level, although it has been described in the technical literature.
  • CBAs active compounds
  • crosslinking agents such as tripolyphosphate
  • chitosan is emerging as an advantageous substance, since it is not chemotherapeutic (as phytosanitary products are) but it does induce the plant's defenses; It is currently considered a basic substance for use in agriculture, harmless and without phytosanitary connotations.
  • the present invention tries to overcome the drawbacks raised so far in the use and application of biologically active compounds for the treatment of crops in agriculture, through a new preparation, a complex formed by two natural substances (high molecular weight chitosan and at least one bioactive compound of variable solubility), in the proportions established below, which is totally soluble and capable of being successively diluted in water, to be applied in a foliar or root form.
  • the advantage of this formulation lies in the exclusive use of basic natural polymers, without the need to use surfactants. Description of the invention
  • a first object of the invention is an aqueous solution of an inclusion complex that comprises: a chitosan with a molecular weight comprised between 100,000 to 300,000 g / mol (that is, high molecular weight), as a carrier agent, and at least one compound biologically active (CBA) application in agriculture selected from the group consisting of: Equisetum arvense (Horsetail) extract, Urtica spp (Nettle) extract, an amino acid and any combination thereof.
  • CBA compound biologically active
  • Both components, chitosan and CBA, are linked together by hydrogen bonds and, in the specific case of amino acids, additionally by the formation of quaternary ammonium salts between an amino group (present in the molecular structure of chitosan) and a carboxylic acid present in amino acids.
  • the complex described apart from being in an aqueous solution that is harmless, has a natural composition (without synthetic polymers and without the need to use surfactants, as is usual in the state of the art), the compounds that form it are also recognized as generally safe (GRAS), which totally favors its use in the treatment of crops, as it is a chemical complex that respects the environment and does not damage ecosystems by not including synthetic or toxic substances. Furthermore, as they are dissolved in aqueous solution, thanks to their solubility being significantly increased, they are thus fully available for application.
  • GRAS generally safe
  • CBAs biologically active or bioactive compounds
  • GRAS generally safe
  • EC basic substances approved under article 23 of the Regulation.
  • CBAs are usually defined by their antimicrobial activity but, from a broader point of view, those that act inside plants as growth inducers or strengtheners of the immune system can be defined in the same way, by promoting the phytoalexin production. They can be obtained individually, although in many cases they are in the form of an extract or essential oil, and are in combination with others, although the use of most of these oils is not allowed in agriculture due to their toxicity (except, for example, from onion oil or sunflower oil, classified as basic substances).
  • the CBA of the present invention which meets all these conditions, is limited to three specific cases, due to the properties observed when complexing with the high molecular weight chitosan: on the one hand, the two extracts, Equisetum arvense (Horsetail) and Urtica spp (Nettle), whose composition is characterized by the high content of phenols and polyphenols (such as flavonoids), and on the other, amino acids, which can be selected from the group consisting of : Alanine, Arginine, Asparagine, Aspartic Acid, Cysteine, Glutamine, Glutamic Acid, Glycine, Histidine, Isoleucine, Leucine, Lysine, Methionine, Phenylalanine, Proline, Serine, Threonine, Tryptophan, Tyrosine and Valine; and more preferably it can be selected from Proline and Glycine.
  • Equisetum arvense (Horsetail) and Urtica spp (Nettle) extracts contain active substances that are insoluble or partially soluble in water, so the formation of the inclusion complex with chitosan, according to the present invention, is essential. to increase the bioavailability of its components, flavonoids (quercetin and isoquercitrin, kaempferol, galuteolin and equisethrin, among the most important), polyphenols, aloin and feluric acid, among the most important.
  • the complex contains a combination of both CBAs, Equisetum arvense (Horsetail) and Urtica spp (Nettle). The better synergistic effect with this combination of the complex on the growth of the plant and the production of its biomass, as shown in the examples.
  • the advantage is not only that the CBA becomes bioavailable, but that by forming a complex with the high molecular weight chitosan and being in aqueous solution, the effects achieved when applied to plants is much greater than expected.
  • another very important advantage of the complex is that its properties and, therefore, its advantageous effects are not altered when diluted in large amounts of water, having also verified the total solubilization of the CBAs in these situations, which constitutes a result very advantageous, given the simplicity of the procedure and the results obtained.
  • bioactive compounds are insoluble in water, although as a general rule they have a variable degree of solubility in water, from insoluble to partially soluble.
  • the solubility of CBA is significantly improved in the complex described, which also significantly increases the bioavailability of the active components that comprise the two extracts described, such as flavonoids and polyphenols, aloin and feluric acid. among others, that they are insoluble in water, and, in addition, it activates amino acids by protonating them.
  • the technique proposed in the present invention for the formation of the aqueous solution of the complexes increases the aqueous stability and at the same time the solubility of these CBAs in order to protect them and keep them stable during their storage, on the one hand, and facilitate their administration, on the other, which favors its application and effectiveness in the agricultural sector.
  • the hydrogen bond despite being a weak interaction, is a strong electrostatic force when many molecules are bound simultaneously, which provides great stability to the complex, because it retains the bioactive compound (see Figure 1), while allowing its subsequent dilution in large quantities of water.
  • the essential thing is the action of the ultrasound applied, which will be seen in one of the following points referring to the method of obtaining the complex;
  • the present invention is based on the fact that the sonication of the mixture (direct application of ultrasound in the solution containing both compounds) is necessary for the formation of these hydrogen bonds to appear and accelerate, since if they are not applied said ultrasounds, the links do not appear or they do so very slowly, making the industrial process described in this report unfeasible.
  • the new complex described has a synergistic effect on the growth of crops, where it is easily applicable because it is soluble in water although it incorporates CBAs that originally show even a zero degree of solubility, and, what is more important, the activity of the complex is synergistic, since the effects of the bioactive compounds that are part of the complex is greater than that of the separate compounds.
  • the aqueous solution has been analyzed and it has been found that this synergistic effect may be due to the protonation of the CBAs used when combined with the high molecular weight chitosan (in the slightly acidic aqueous solution, pH from 3.5 to 5).
  • the weight ratio between the components, high molecular weight chitosan and the listed CBAs obeys a selected ratio between 1: 1 and 2: 1, although the latter is more preferable because it is more economical, without for this reason being see altered the final result. That is, since the solubility of CBAs increases with the concentration of chitosan by weight, a 1: 1 ratio can be used but the use of stoichiometry (1 CBA: 2 Chitosan) for the formation of supramolecular structures and in which CBA is entrapped by weak or short-range molecular interactions with the amino group of the chitosan polymer. If the concentration of chitosan is increased, the solubilization of the CBA can be increased, but this also implies a greater economic expense over the theoretical concentrations required.
  • the aqueous solution of the complex can present multiple concentrations of the same without, for this reason, the result being altered.
  • it can be from a concentrated aqueous solution (of at least 75-100 grams of complex -50 grams of chitosan for each 25-50 grams of CBA / liter of water) to a dilute aqueous solution, that is, any dilution from the concentration previously given for 1 liter of aqueous solution, with 75-100 grams of complex -50 grams of chitosan for each 25-50 grams of CBA, up to a dilution of 1 liter of aqueous solution for each 200 liters of water.
  • the amount of high molecular weight chitosan in the aqueous solution is equal to or less than 8% by weight with respect to the total volume of the solution.
  • a second object of the present invention is constituted by a method to obtain the aqueous solution of the complexes described above, which comprises the following steps: a) preparing an aqueous solution comprising chitosan with a molecular weight between 100,000 and 300,000 g / mol and a carboxylic acid; b) applying ultrasound to the mixture until a stable and homogeneous chitosan gel is formed; Y c) adding the at least one CBA and applying ultrasound to form the complex in the aqueous solution.
  • the essential method of preparing the complex in aqueous solution is reduced to mixing the components and carrying out a simple stirring assisted by ultrasound by introducing the sonication head in the aqueous solution, to ensure the formation of the complex and facilitate the solubilization of the CBAs.
  • sonication processes direct application of ultrasound on the solution
  • new bioproducts or macromolecules are obtained in liquid form, as weak interactions are generated by the formation of hydrogen bonds between the amino groups present in the chitosan with the CBAs and therefore , of quaternary ammonium salts. This allows its subsequent dilution in large amounts of water, which is also an objective of the present invention.
  • the CBA is completely solubilized.
  • the process is carried out in two stages, and the carboxylic acid is necessary in the first of them to achieve the formation of the chitosan gel before mixing it with the CBA, since the pH must be lowered for the solubilization of the chitosan in water;
  • the pH of the gel that is formed is thus around 4, that is, in particular between 3.5 and 5.
  • Chitosan complex with aloin, an anthraquinone glycoside that is one of the components of horsetail and nettle extracts that are use as biologically active compound in the present invention Chitosan complex with feluric acid, a hydroxycinnamic acid that is one of the components of horsetail and nettle extracts that are used as Chitosan complex with gallic acid, which is one of the components of horsetail and nettle extracts that are used as biologically active compound in the present invention: Chitosan complex with kaempferol, which is one of the components of horsetail and nettle extracts that are used as a biologically active compound in the present invention: Chitosan complex with the amino acid histidine as a biologically active compound: Chitosan complex with the amino acid tyrosine as a biologically active compound: Chitosan complex with the amino acid cysteine as a biologically active compound
  • the weight ratio in the mixture of chitosan and carboxylic acid is 1: 1 (for example, 50 grams of chitosan with 50 grams of the carboxylic acid in one liter of water).
  • the carboxylic acid can be selected from the group consisting of citric acid, acetic acid and propionic acid.
  • steps a) and b) to form the stable chitosan gel are carried out at a temperature between 50-70 ° C, more preferably still at 60 ° C.
  • the weight ratio in the mixture of chitosan and CBA is selected between 1: 1 and 2: 1 (for example, 50 grams of chitosan per 50 grams of CBA, or 50 grams of chitosan per 25 grams of CBA in 1 liter of water), to achieve solubilization of the CBA when the supramolecular structures are formed, the CBA being trapped by weak or short-range molecular interactions with the amino group of the chitosan polymer.
  • the 2: 1 stoichiometric ratio is even more preferable, as the same result is achieved but more economically.
  • the mixture can include more than one CBA, so that together they maintain the previously defined proportion.
  • the amount of chitosan in water is equal to or less than 8% by weight of the total volume of the solution.
  • mixing by sonication that is, direct application of ultrasound in the solution, is carried out at 20 kHZ, first to form the chitosan gel and then to promote the formation of the complex, solubilizing the CBA.
  • the prepared mixtures are dispersed by direct sonication with an ultrasound head, for a time preferably between 3 and 10 min in step b) and between 5 and 15 min in step c), sufficient to form weak intermolecular interactions by bonds. of hydrogen and the formation of quaternary ammonium salts. More preferably, ultrasound is applied for 10 minutes in each of steps b) and c).
  • the above-described method comprises diluting the complex obtained in aqueous solution in water, in one or more successive dilutions, in a ratio between 1: 1 (1 liter of aqueous solution of the complex - containing 50 grams of chitosan per every 25-50 grams of CBA- per 1 liter of water) up to 1: 100 (1 liter of aqueous solution of the complex per 200 liters of water).
  • a third object of the present invention is the use of the aqueous solution of the complex defined above, as a stimulator of plant growth, that is, to enhance plant growth (increase in biomass production). Its application in the field of agriculture seems very relevant, as evidenced by the results of the experiments carried out with the invention.
  • the complex solution in a culture, its production is significantly increased, mainly thanks to the fact that it increases the solubility and bioavailability in water of the bioactive compounds it contains, not only the non-soluble ones, but also of those that are partially soluble in said medium.
  • the complex of the present invention has an activity greater than that obtained from using the components separately, with synergy between the components.
  • An advantage of this complex in aqueous solution is that it does not require the incorporation of emulsifiers or surfactants to improve its solubility and bioavailability, as is usually the case in the prior art.
  • Another object of the invention is the use of the aqueous solution of the complex that has been defined to prevent and treat pathogenic diseases in plants.
  • the type of pathogens whose growth is prevented in plants with the use of the aqueous solution that is the object of the invention is very diverse and wide.
  • the complex is used to prevent grand negative bacteria.
  • the aqueous solution of the complex is used to prevent the growth of fungi, as diverse in their genus as those that cause vine tinder, which cause wood rot, or the fungus Fusar ⁇ um culmorum.
  • the CBA of the complex is proline, a water-insoluble amino acid that, being part of the complex, has a high bioavailability.
  • Both uses preferably comprise applying an aqueous solution of the complex described on the crop, by spraying (foliar) or on the ground (root), although foliar application is always preferred because the efficacy and absorption by the plant is always greater.
  • the use preferably implies the application of a very dilute solution of the complex, of 1 liter of aqueous solution of the complex per 50, 100 or up to 200 liters of water, although logically, as the effect is not altered by the volume of solution can be applied in any of the concentrations protected herein.
  • Figure 1 Experimental plot corresponding to Example 2, in the vicinity of Veguellina de ⁇ rbigo (León). 3 zones are delimited: control where no treatment is applied, and the corresponding application plots 1 and 2.
  • Figure 2 Photographs taken of bean plants collected in each of the analysis plots: a) Plot 1; b) Plot 2; and c) Control plot.
  • Figure 3 Photographs of Petri dishes with results of the application of an aqueous solution of the complex with amino acids as CBA. Specifically, the chitosan complexes with Arginine and Tyrosine have been tested in two different strains of fungi: Diplodia memorita and Fusar ⁇ um culmorum. Various concentrations of the complex (from 100 ppm to 500 ppm) were used in a fungal growth medium (PDA), to determine the Minimum Inhibitory Amount (MIC).
  • PDA fungal growth medium
  • Figure 4 Photographs of Petri dishes with results of the application of an aqueous solution of the complex with amino acids as CBA. Specifically, the complexes of chitosan with Glycine and Histidine have been tested in the same strains of fungi as in the Figure 3: Diplodia memorita and Fusarium culmorum. Various concentrations of the complex (from 100 ppm to 500 ppm) were used in a fungal growth medium (PDA), to determine the Minimum Inhibitory Amount (MIC).
  • PDA fungal growth medium
  • Figure 5 Photographs of Petri dishes with results of the application of an aqueous solution of the complex, formed from a chitosan and citric acid gel with different amino acids such as CBA (arginine, glycine, proline, histidine and tyrosine), to prevent and treat the growth of two fungi: Diplodia memorita and Fusar ⁇ um culmorum.
  • CBA arginine, glycine, proline, histidine and tyrosine
  • Example 1 Methods for obtaining and characterizing an aqueous solution of the complex described in the present invention, with Urtica spp. as CBA and with a combination of Equisetum an / ense and Urtica spp as CBA.
  • Example 2 Use of the aqueous solutions of the complex described in Example 1 to enhance plant growth Experimental studies have been carried out with the aqueous solutions of the complexes described in the previous example (containing as CBA, Urtica spp. In a first case and a combination of Equisetum arvense and Urtica spp in a second case,) in plots with bean and hop cultivation, differentiating between:
  • a valid pod is considered one that has more than 3 grains.
  • Example 3 Use of the aqueous solutions of the complex described in Example 1 to prevent pathogenic diseases
  • Example 4 Obtaining an aqueous solution of the complex described in the present invention, with amino acids.
  • Aqueous solutions were prepared following the same methodology as in Example 1, but where the CBA was an amino acid: in 1 liter of hot water at 60 ° C 50 grams of citric acid and the same amount of chitosan are introduced, the high power ultrasound head (20 kH) is introduced and the chitosan gel is formed corresponding, so that the pH of this gel is from 3.5 to 5. Once all the chitosan has been dissolved, so that no lumps appear and once the gel has stabilized, add 25 to 50 grams of arginine and apply the ultrasound head for at least 10 minutes. At this time the total solubilization in the chitosan gel of the commented extract is verified.
  • Example 5 Application of aqueous solutions with amino acids as CBAs according to
  • Example 4 the results of which are shown in figures 3-5.
  • aqueous solutions of chitosan complexes with Glycine and Histidine were tested in the same fungal strains as in the previous experiment: Diplodia serata and Fusarium culmorum.
  • concentrations were used of the complex (from 100 ppm to 500 ppm of it) in a fungal growth medium (PDA), to determine the Minimum Inhibitory Quantity (MIC).
  • PDA fungal growth medium
  • compositions object of the present invention were prepared with the complexes of CBAs, but where the vehicle agent was glycerin, not chitosan. This allowed us to confirm the effect of chitosan. Thus, it was confirmed that a composition based on glycerin and proline did not work against pathogens.
  • Another composition was also prepared, following the same methodology as previously described, but with proline, glycerin and citric acid. This composition improved the results compared to the previous one (without citric acid), but it did not achieve the same MIC results as with the solutions of the present invention.

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Abstract

La invención se refiere a una solución acuosa de un complejo de inclusión que comprende: un quitosano con peso molecular comprendido entre 100.000 a 300.000 g/mol como agente de vehiculización y al menos un compuesto biológicamente activo de aplicación en agricultura seleccionado dentro del grupo formado por: extracto de Equisetum arvense (Cola de caballo), extracto de Urtica spp (Ortiga), un aminoácido y cualquier combinación de los mismos. Asimismo, se refiere al método de obtención de la solución acuosa del complejo mediante sonicación de un gel previamente obtenido (también por sonicación) de un gel de quitosano con un ácido carboxílico con el CBA. Asimismo, se recoge el uso de la solución acuosa para potenciar el crecimiento de las plantas, así como para prevenir enfermedades patógenas en plantas, usos significativamente mejorados con respecto a los compuestos conocidos gracias al efecto sinérgico encontrado entre sus componentes.

Description

SOLUCIÓN ACUOSA QUE COMPRENDE UN COMPLEJO DE INCLUSIÓN, MÉTODO DE OBTENCIÓN Y SU USO PARA APLICACIÓN EN CULTIVOS Y LA MEJORA DE SU
RENDIMIENTO
DESCRIPCIÓN
Sector técnico de la invención
La invención que se presenta se encuadra en el ámbito de la Bioquímica y halla su aplicación en el sector agrícola. Específicamente, trata de un complejo de origen natural, que es un complejo binario formado por quitosano de alto peso molecular y uno o más compuestos biológicamente activos (CBA) aplicables en agricultura, y de origen natural que generalmente están presentes en los extractos de plantas.
Antecedentes de la invención
La Bioquímica es un campo de notable amplitud y en continuo progreso tecnológico, aplicable a las industrias farmacéutica, alimentaria, agrícola y cosmética, las cuales necesitan evolucionar para mejorar la eficacia de las sustancias aplicadas en el uso pretendido, proporcionando soluciones adaptadas a unas necesidades cada vez más exigentes. Cada campo de aplicación requiere unas condiciones concretas para poder utilizar dichas sustancias, y la primera de ellas es su toxicidad, ya que deben descartarse todas aquellas que pueden ser peligrosas para la salud en mayor o menor medida; algo que, por ejemplo, sucede con la mayoría de los aceites esenciales conocidos. En este sentido, las sustancias básicas, que son naturales, inocuas, de grado alimentario y que no están catalogadas como fitosanitarias, se configuran como las de uso más aceptable para este fin. Si se aceptan para un determinado uso (por ausencia de toxicidad), la eficacia de las sustancias activas depende principalmente de su biodisponibilidad.
Es bien sabido que la biodisponibilidad de los ingredientes activos mejora con la solubilidad, y disponer de soluciones sin turbidez es fundamental para aumentar la biodisponibilidad y aprovechamiento físico de los mismos. Dentro de las sustancias bioactivas aplicables en el campo de la agricultura, como son las de origen natural, existe un gran número de ellas que no son solubles en agua, o que lo son sólo parcialmente, por lo que no son eficaces en la práctica. Entre estas sustancias destacan una serie de compuestos fitoquímicos, presentes de forma natural en las plantas o sus derivados (por ejemplo, la harina), como son los polifenoles, terpenos y muy pocos aceites esenciales, quinonas y antraquinonas, flavonoides, proteínas, lignanos y otros, que tienen actividad antimicrobiana y cuya solubilidad es prácticamente nula y, por tanto, en su formulación normal, no son aprovechables en el interior de los organismos a los que se aplica, ya que su absorción ocurre de forma natural a través del agua. En estos casos, el concepto de biodisponibilidad es esencial para garantizar que el compuesto aplicado tenga un aprovechamiento por parte del organismo y sea útil para el fin pretendido.
Lamentablemente, la administración de muchos de los compuestos mencionados a menudo sufre de problemas de solubilidad y/o permeabilidad (Thanki, K., Gangwal, R.P., Sangamwar, A.T., Jain, S., 2013. Oral delivery of anticancer drugs: challenges and opportunities. J. Control. Release 170, 15-40). El desarrollo de nuevas técnicas de solubilización, encapsulación y vehiculación de estos CBAs aplicables en agricultura, a efectos de su conversión en biodisponibles, es uno de los caballos de batalla de la Química actual y encierra una gran aplicación futura. Las técnicas más conocidas para mejorar la biodisponibilidad de compuestos hidrófobos o parcialmente insolubles en agua son: la reducción del tamaño de partícula, la preparación de una dispersión sólida, el uso de surfactantes, y la formación de complejos de inclusión, emulsificación y encapsulación en liposomas.
En Química se conoce la figura de los complejos de inclusión como aquellos que son capaces de producir complejos anfitrión-huésped mediante la inclusión de moléculas hidrofóbicas. La complejación de diversos monómeros da lugar a cambios importantes de la solubilidad y facilita la misma mediante la formación de radicales libres en medio acuoso. En el diseño de vehículos de acomplejamiento de CBAs es muy importante seleccionar correctamente el material utilizado como agente acomplejante o matriz. Se debe tener en cuenta la forma de administración, la potencial toxicidad, la naturaleza del producto a ser incorporado, su dosis prevista, etc. A este respecto, en el estado de la técnica se ha documentado el uso de polímeros sintéticos y de polímeros naturales como vehículos de acomplejamiento. Sin embargo, la proclividad de los polímeros sintéticos a producir problemas de toxicidad los hace poco recomendables para su utilización, mientras que la alternativa de utilizar polímeros naturales, que no poseen estos inconvenientes, requiere, en cambio, el desarrollo de métodos de producción específicos más complicados y costosos.
Un conocido agente encapsulante es la ciclodextrina, que puede ser del tipo a (con un anillo de 6 glucosas), b (anillo de 7 glucosas) y y (8 glucosas). La ciclodextrina más soluble en agua es un derivado de la b, denominado hidroxipropil betaciclodextrina. En ellas, el CBA se aloja en el interior del toroide formado por las glucosas, pero tiene como inconveniente la dificultad para hacer disponible dicho CBA y, de esta forma, convertirlo en activo. Existen numerosas patentes (por ejemplo, EP0422497B1) que describen este método, pero no se ha trasladado a la escala comercial por el inconveniente mencionado.
Otro conocido agente encapsulante, y relevante en el caso de la presente invención al tratarse de una sustancia básica aprobada bajo el artículo 23 del Reglamento (CE) n° 1107/2009, es el quitosano, también llamado chitosán. Este uso del compuesto no está muy desarrollado a nivel industrial aunque sí descrito en la literatura técnica En la actualidad se dispone en la bibliografía de técnicas de encapsulación de compuestos activos (CBAs) con biopolímeros o polielectrolitos de base quitosano-alginato. Sin embargo, en estos casos se precisan agentes entrecruzadores, como el tripolifosfato, para su formación, y el proceso de preparación requiere un tiempo prolongado. El uso de nanopartículas de quitosano para vehiculizar compuestos activos en el tratamiento de plantas frente a patógenos ha sido analizado en la literatura, véase Malerba, M. and Cerana, R. (2019 ): Recent applications of chitin- and chitosan-based polymers in plants; Polymers (Basel) 11(5): 839. Existen otros documentos que también han analizado el papel encapsulante del quitosano cuando se combina con compuestos biológicamente activos, como los aceites esenciales. Así, Kalagatur et al. (2018): Antifungai Activity of Chitosán Nanoparticles Encapsulated With Cymbopogon martinii Essential OH on Plant Pathogenic Fungí Fusarium graminearum; Frontiers in pharmacology, 9: 610, describen un compuesto sólido formado por nanopartículas de quitosano con un peso molecular de 100.000 g/mol, que se combinan con un aceite esencial de Cymbopogon martinii, a modo de complejo formado por los grupos amino del quitosano y los grupos funcionales de los componentes del aceite (geraniol, limoneno...). Cabe recordar que el uso de estos aceites esenciales no está permitido en agricultura, ya que son citotóxicos. Otra referencia se encuentra en Khalili, S.T. et al. (2015): Encapsulation of Thyme essential oils in chitosan-benzoic acid nanogel with enhanced antimicrobial activity against Aspergillus flavus; LWT - Food Science and Technology, 60(1): 502-508, donde se divulga la formación de un complejo a partir de gel de quitosano y ácido benzoico con aceite esencial de Thymus vulgaris (estos dos últimos no permitidos en agricultura), mediante sonicación a 70 kHz. La obtención de geles de quitosano también se divulga en Hamdine, M. et al. (2005): Effect of organic and inorganic acids on concentrated chitosán Solutions and gels; Int J Biol Macromol. 2005 Nov 15; 37(3): 134-42, aunque no de su acomplejamiento con otras sustancias.
El poder potenciador del quitosano en la solubilidad de los compuestos biológicamente activos ha sido analizado en la solicitud de patente española ES2718225B2 (Univ. Valladolid), de los mismos inventores, donde se emplean oligómeros de quitosano de bajo peso molecular y glucósidos de esteviol como agentes encapsulantes. Dicho complejo se forma por sonicación. Estos oligómeros son difíciles de fabricar, con el coste que conlleva, y requiere un paso previo de formación por hidrólisis enzimática, mientras que el uso del glucósido de esteviol en agricultura no está aprobado.
En definitiva, desde el punto de vista de la biosostenibilidad en la explotación de los cultivos agrícolas, el quitosano se perfila como una sustancia ventajosa, ya que no es quimioterápica (como sí lo son los fitosanitarios) pero consigue inducir las defensas de la planta; es considerada actualmente una sustancia básica para su uso en la agricultura, inocua y sin connotaciones fitosanitarias.
De lo tratado anteriormente, se deduce la necesidad de desarrollar sistemas de solubilización de CBAs que superen los inconvenientes mencionados, no sólo preservando la integridad de dichos compuestos bioactivos sino también vehiculizándolos, en especial para compuestos hidrofóbicos o parcialmente solubles en agua, y más en particular compuestos cuya biodisponibilidad entrañe dificultades, como es el caso de los polifenoles, terpenos, antraquinonas y en general, de los compuestos antioxidantes.
La presente invención trata de superar los inconvenientes planteados hasta el momento en el uso y aplicación de compuestos biológicamente activos para el tratamiento de cultivos en agricultura, a través de un nuevo preparado, un complejo formado por dos sustancias naturales (quitosano de alto peso molecular y al menos un compuesto bioactivo de solubilidad variable), en las proporciones que se establecen a continuación, que es totalmente soluble y capaz de ser diluido en agua de forma sucesiva, para ser aplicado de forma foliar o radicular. La ventaja de esta formulación radica en el uso exclusivo de polímeros naturales de carácter básico, sin la necesidad de emplear surfactantes. Descripción de la invención
Un primer objeto de la invención es una solución acuosa de un complejo de inclusión que comprende: un quitosano con peso molecular comprendido entre 100.000 a 300.000 g/mol (es decir, alto peso molecular), como agente de vehiculización, y al menos un compuesto biológicamente activo (CBA) de aplicación en agricultura seleccionado dentro del grupo formado por: extracto de Equisetum arvense (Cola de caballo), extracto de Urtica spp (Ortiga), un aminoácido y cualquier combinación de los mismos. Ambos componentes, quitosano y CBA, se encuentran unidos entre sí por enlaces de hidrógeno y, en el caso concreto de los aminoácidos, adicionalmente por la formación de sales de amonio cuaternario entre un grupo amino (presente en la estructura molecular del quitosano) y un ácido carboxílico presente en los aminoácidos.
El complejo descrito, aparte de estar en una solución acuosa que es inocua, presenta una composición natural (sin polímeros sintéticos y sin necesidad de emplear surfactantes, como suele ser habitual en el estado de la técnica), siendo además los compuestos que lo forman reconocidos como generalmente seguros (GRAS), lo que favorece totalmente su empleo en el tratamiento de cultivos, al ser un complejo químico que respeta el medio ambiente y que no daña los ecosistemas al no incluir sustancias sintéticas o tóxicas. Además, al estar disueltos en solución acuosa, gracias a que se incrementa significativamente su solubilidad, están así totalmente disponibles para su aplicación.
Respecto al quitosano de alto peso molecular, cabe resaltar que se trata una molécula de gran tamaño, lo que, como se explica más adelante, juega un papel fundamental en la retención y protección de los CBAs seleccionados, y a la vez en el incremento de su biodisponibilidad.
En el ámbito de la presente invención, se denomina compuesto biológicamente activo o bioactivo (CBAs) a aquella sustancia química natural que se encuentra en las plantas, así como en los productos derivados de ellas (por ejemplo, en la harina, en el aceite...), en pequeñas cantidades, y que tienen un efecto (beneficioso o perjudicial) en los organismos vivos. Más concretamente, en el ámbito de la presente invención el término CBA se refiere a compuestos permitidos para su empleo en la agricultura, que como se ha mencionado son generalmente seguros (GRAS) y que están clasificados como sustancias básicas aprobadas bajo el artículo 23 del Reglamento (CE) n° 1107/2009 porque, básicamente, son inocuas, tienen grado alimentario y no están clasificados como compuestos fitosanitarios. Los CBAs habitualmente se definen por su actividad antimicrobiana pero, desde un punto de vista más amplio, se puede definir de la misma manera aquellos que actúan en el interior de las plantas como inductores de crecimiento o fortalecedores del sistema inmunitario, mediante la promoción de la producción de fitoalexinas. Pueden ser obtenidos de forma individual, aunque en muchos casos se encuentran en forma de extracto o aceite esencial, y se encuentran en combinación con otros, aunque el uso de la mayoría de estos aceites no está permitido en agricultura por su toxicidad (a excepción, por ejemplo, del aceite de cebolla o el aceite de girasol, clasificados como sustancias básicas). En el caso concreto de la presente invención el CBA de la presente invención, que cumple todas estas condiciones, se limita a tres casos concretos, por las propiedades observadas al acomplejarse con el quitosano de alto peso molecular: por un lado, los dos extractos, de Equisetum arvense (Cola de caballo) y Urtica spp (Ortiga), cuya composición se caracteriza por el alto contenido de fenoles y polifenoles (como son los flavonoides), y por otro, los aminoácidos, que pueden ser seleccionados dentro del grupo compuesto por: Alanina, Arginina, Asparagina, Ácido aspártico, Cisteína, Glutamina, Ácido glutámico, Glicina, Histidina, Isoleucina, Leucina, Lisina, Metionina, Fenilalanina, Prolina, Serina, Treonina, Triptófano, Tirosina y Valina; y más preferentemente puede ser seleccionado entre Prolina y Glicina.
Los extractos de Equisetum arvense (Cola de caballo) y Urtica spp (Ortiga) contienen sustancias activas que son insolubles o parcialmente solubles en agua, por lo que la formación del complejo de inclusión con el quitosano, de acuerdo con la presente invención, es esencial para aumentar la biodisponibilidad de sus componentes, flavonoides (quercetina e isoquercitrina, kaempferol, galuteolina y equisetrina, entre los más importantes), polifenoles, aloína y ácido felúrico, entre los más importantes. Componentes minoritarios de estos extractos pero importantes para la invención son: trazas de alcaloides (nicotina, 3-metoxipiridina, equisetina, palustrinina y palustrina), taninos, fitosteroles (b-sitosterol, campesterol, isofucosterol), equisetonina (5%), saponina que por hidrólisis produce arabinosa, fructosa y equisetogenina; ácidos grasos (linoleico, linólico, y oleico), ácido aconitínico (ácido equisético), ácido benzoico, ácido málico, ácido gálico, ácido cítrico, ácido péctico, vitamina C, resina, articulina e isoarticulina (esporas), lignanos (ácido cafeico, ácidio ferúlico, dicafeoil-mesotartárico y p-cumarínico).
En una realización preferente del complejo, éste contiene una combinación de ambos CBAs, Equisetum arvense (Cola de caballo) y Urtica spp (Ortiga). Se ha comprobado el mejor efecto sinérgico con esta combinación del complejo en el crecimiento de la planta y la producción de su biomasa, como se muestra en los ejemplos.
La gran innovación de estos complejos y su ventaja en el mundo de la agricultura es que, al encontrarse en solución acuosa pueden aplicarse sobre un cultivo, obteniéndose resultados inesperadamente mejorados: su efecto sobre el crecimiento de las plantas y su capacidad de fortalecer el sistema inmune es muy superior al de los componentes por separado, existiendo sinergia entre ellos, habiendo sido constatado en una mayor producción de fitoalexinas y un aumento del crecimiento foliar y de los frutos de la planta. Este efecto sinérgico no se ha descrito hasta el momento y las pruebas realizadas en campo en diversos cultivos así lo atestiguan, tal como se expone aquí. Es decir, la ventaja no es sólo que se transforme el CBA en biodisponible, sino que al formarse un complejo con el quitosano de alto peso molecular y estar en solución acuosa, los efectos conseguidos al aplicarse a las plantas es mucho mayor de lo esperado. Además, otra ventaja muy importante del complejo es que sus propiedades y, por ende, sus efectos ventajosos no se ven alterados al diluirlo en grandes cantidades de agua, habiéndose también verificado la total solubilización de los CBAs en estas situaciones, lo que constituye un resultado muy ventajoso, dada la sencillez del procedimiento y los resultados obtenidos.
Como se ha dicho en el apartado anterior, muchos compuestos bioactivos son insolubles en agua, aunque por regla general presentan un grado de solubilidad en agua variable, desde insoluble a parcialmente soluble. En todos los casos de la presente invención, la solubilidad del CBA se ve significativamente mejorada en el complejo descrito, lo que incrementa también significativamente la biodisponibilidad de los componentes activos que comprenden los dos extractos descritos, como flavonoides y polifenoles, aloína y ácido felúrico, entre otros, que son insolubles en agua, y, además, activa los aminoácidos al protonarlos. En definitiva, la técnica propuesta en la presente invención para formación de la solución acuosa de los complejos incrementa la estabilidad acuosa y a la vez la solubilidad de estos CBAs con el fin de protegerlos y mantenerlos estables durante su almacenamiento, por un lado, y facilitar su administración, por otro, lo que favorece su aplicación y efectividad en el sector agrícola.
Se ha comprobado que los efectos ventajosos observados en el complejo descrito se fundamentan en las interacciones débiles que se producen por la formación de enlaces por puente de hidrógeno entre los grupos amino del quitosano de alto peso molecular con los CBAs cuando se mezclan (como se verá, por sonicación) y, adicionalmente, gracias a la formación de sales de amonio cuaternario entre un grupo amino y un ácido carboxílico, en el caso de los aminoácidos, lo que favorece su biodisponibilidad.
El enlace de hidrógeno, a pesar de ser una interacción débil, es una fuerza electrostática fuerte cuando muchas moléculas están unidas simultáneamente, lo que proporciona gran estabilidad al complejo, porque retiene el compuesto bioactivo (ver Figura 1), a la vez que permite su posterior dilución en grandes cantidades de agua. En la aparición de estos enlaces lo esencial es la acción de los ultrasonidos que se aplican, lo que se verá en uno de los puntos siguientes referidos al método de obtención del complejo; la presente invención se sustenta en el hecho de que la sonicación de la mezcla (aplicación directa de ultrasonidos en la solución que contiene ambos compuestos) es necesaria para que aparezca y se acelere la formación de estos enlaces de hidrógeno, ya que si no se aplican dichos ultrasonidos, no aparecen los enlaces o lo hacen de forma muy lenta, inviabilizando el proceso industrial que se describe en este informe. Se ha comprobado que las interacciones entre los complejos formados son más débiles que los mostrados con otros complejos como las ciclodextrinas, ya que el tamaño del complejo es superior, al ser el quitosano de alto peso molecular. La consecuencia de esta propiedad es que los bioproductos basados en complejos de quitosano como los aquí descritos presentan mayor capacidad de liberación de los CBA que los que pudieran obtenerse con ciclodextrinas como agente vehiculizante.
El nuevo complejo descrito tiene un efecto sinérgico en el crecimiento de cultivos, donde es fácilmente aplicable porque es soluble en agua aunque incorpore CBAs que en origen muestran incluso un grado de solubilidad nulo, y, lo que es más importante, la actividad del complejo es sinérgica, ya que los efectos de los compuestos bioactivos que forman parte del complejo es mayor que la de los compuestos por separado. Ante lo inesperado del resultado, se ha analizado la solución acuosa y se ha comprobado que este efecto sinérgico se puede deber a que se produce una protonación de los CBAs utilizados al combinarse con el quitosano de alto peso molecular (en la solución acuosa ligeramente ácida, pH desde 3,5 hasta 5). Al formarse el complejo y generarse un medio ácido, se produce una liberación de protones, de tal forma que los compuestos seleccionados, cola de caballo, ortiga y los aminoácidos aumentan su actividad como CBAs. En este caso, y esto es esencial en el caso de los aminoácidos, se verifica que el grupo amino de los mismos se encuentra protonado, es decir, no está en su forma habitual NH2 sino como NH3+. Esta es la clave para que los aminoácidos, que en su forma normal no actúan como CBAs, sí lo hagan en su forma protonada, activándose.
Preferentemente, la proporción en peso entre los componentes, quitosano de alto peso molecular y los CBAs enumerados, obedece a una relación seleccionada entre 1:1 y 2:1, aunque es más preferible ésta última por ser más económica, sin que por ello se vea alterado el resultado final. Es decir, dado que la solubilidad de los CBA se incrementa con la concentración de quitosano en peso, puede emplearse una relación 1:1 pero se recomienda como preferente en esta invención (o más económica) el empleo de la estequiometría (1 CBA : 2 Quitosano) para la formación de estructuras supramoleculares y en los que el CBA queda atrapado por interacciones moleculares débiles o de corto alcance con el grupo amino del polímero de quitosano. Si se incrementa la concentración de quitosano se puede incrementar la solubilización del CBA, pero ello también implica un mayor gasto económico sobre las concentraciones teóricas requeridas.
La solución acuosa del complejo puede presentar múltiples concentraciones del mismo sin que por ello tampoco se vea alterado el resultado. Así puede ser desde una solución acuosa concentrada (de al menos 75-100 gramos de complejo -50 gramos de quitosano por cada 25-50 gramos de CBA/litro de agua) a una solución acuosa diluida, es decir, cualquier dilución desde la concentración antes dada para 1 litro de solución acuosa, con 75-100 gramos de complejo -50 gramos de quitosano por cada 25-50 gramos de CBA, hasta un dilución de 1 litro de solución acuosa por cada 200 litros de agua.
También de manera preferida, la cantidad de quitosano de alto peso molecular en la solución acuosa es igual o inferior a 8% en peso con respecto al volumen total de la solución.
Un segundo objeto de la presente invención lo constituye un método para obtener la solución acuosa de los complejos descrita anteriormente, que comprende las siguientes etapas: a) preparar una solución acuosa que comprende el quitosano de peso molecular comprendido entre 100.000 y 300.000 g/mol y un ácido carboxílico; b) aplicar ultrasonidos a la mezcla hasta formar un gel del quitosano, estable y homogéneo; y c) añadir el al menos un CBA y aplicar ultrasonidos para formar el complejo en la solución acuosa.
El método esencial de preparación del complejo en solución acuosa se reduce a mezclar los componentes y llevar a cabo una simple agitación asistida por ultrasonidos mediante la introducción del cabezal de sonicación en la solución acuosa, para asegurarse de la formación del complejo y facilitar la solubilización de los CBA. Mediante procesos de sonicación (aplicación directa de ultrasonidos sobre la solución) en medio acuoso se obtienen en forma líquida nuevos bioproductos o macromoléculas, al generarse interacciones débiles por formación de enlaces de hidrógeno entre los grupos amino presentes en el quitosano con los CBA y por ende, de sales de amonio cuaternarias. Esto permite su posterior dilución en grandes cantidades de agua, que es también un objetivo de la presente invención. En este momento, el CBA se encuentra completamente solubilizado.
El proceso se lleva a cabo en dos etapas, y el ácido carboxílico es necesario en la primera de ellas para conseguir la formación del gel de quitosano antes de mezclarlo con el CBA, ya que se debe bajar el pH para que se produzca la solubilización del quitosano en agua; el pH del gel que se forma se encuentra así en torno a 4, esto es, particularmente entre 3,5 y 5.
A continuación se representa la estructura química del gel de quitosano formado con el ácido carboxílico, que es ácido cítrico. Se representan las moléculas con las cargas electrostáticas, formando las sales de amonio cuaternario:
A continuación se muestra la estructura química de diferentes complejos de inclusión obtenidos en la solución acuosa en la presente invención: Complejo de quitosano con la aloína, un glicósido antraquinónico que es uno de los componentes de los extractos de cola de caballo y de ortiga que se emplean como compuesto biológicamente activo en la presente invención:
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Complejo de quitosano con ácido felúrico, un ácido hidroxicinámico que es uno de los componentes de los extractos de cola de caballo y de ortiga que se emplean como
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Complejo de quitosano con ácido gálico, que es uno de los componentes de los extractos de cola de caballo y de ortiga que se emplean como compuesto biológicamente activo en la presente invención:
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Complejo de quitosano con kaempferol, que es uno de los componentes de los extractos de cola de caballo y de ortiga que se emplean como compuesto biológicamente activo en la presente invención: Complejo de quitosano con el aminoácido histidina como compuesto biológicamente activo:
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Complejo de quitosano con el aminoácido tirosina como compuesto biológicamente activo: Complejo de quitosano con el aminoácido cisteína como compuesto biológicamente activo:
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Complejo de quitosano con el aminoácido glicina como compuesto biológicamente activo: Complejo de quitosano con el aminoácido arginina como compuesto biológicamente activo:
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- Complejo de quitosano con el aminoácido prolina como compuesto biológicamente activo, unido a dos cadenas diferentes de quitosano de alto peso molecular, y en dos posiciones diferentes:
 La solubilidad y caracterización de los CBAs se han estudiado con un espectrofotómetro de UV-VIS y/o un cromatógrafo-masas HPLC- Masas, y se ha verificado que, de forma sorprendente e inesperada, la solubilidad en agua de los CBAs, incluso en el caso de aquellos que originalmente son insolubles, se mantiene incluso en diluciones consecutivas (de hasta 1 litro de solución acuosa del complejo por 100 litros de agua). Este inesperado resultado es clave para la aplicación del producto en el tratamiento del cultivo, al formularse un producto concentrado y poder comercializarse así, de tal forma que en su aplicación los agricultores puedan diluir 1 litro del complejo en forma acuosa en al menos 100 litros de agua.
Preferentemente, la proporción en peso en la mezcla de quitosano y ácido carboxílico es de 1:1 (por ejemplo, 50 gramos de quitosano con 50 gramos del ácido carboxílico en un litro de agua).
También preferentemente, el ácido carboxílico puede ser seleccionado dentro del grupo compuesto por ácido cítrico, ácido acético y ácido propiónico.
Aunque no es determinante para la preparación de la solución acuosa del complejo, de forma preferida las etapas a) y b) para formar el gel estable de quitosano se llevan a cabo a una temperatura comprendida entre 50-70°C, más preferentemente aún a 60°C.
En una realización preferida de la etapa c), la proporción en peso en la mezcla de quitosano y CBA se selecciona entre 1:1 y 2:1 (por ejemplo, 50 gramos de quitosano por 50 gramos de CBA, o 50 gramos de quitosano por 25 gramos de CBA en 1 litro de agua), para conseguir solubilizar el CBA al formarse las estructuras supramoleculares, quedando el CBA atrapado por interacciones moleculares débiles o de corto alcance con el grupo amino del polímero de quitosano. Como se ha dicho anteriormente, es más preferible aún la relación estequiométrica 2:1, al conseguirse el mismo resultado pero de forma más económica. La mezcla puede incluir más de un CBA, de tal forma que entre ellos en conjunto mantengan la proporción antes definida.
También de manera preferida, la cantidad de quitosano en agua es igual o inferior al 8% en peso del total del volumen de la solución. Preferentemente, en las etapas b) y c), la mezcla por sonicación, es decir, aplicación directa de ultrasonidos en la solución, se lleva a cabo a 20 kHZ, primero para formar el gel de quitosano y después para favorecer la formación del complejo, solubilizando el CBA. Las mezclas preparadas son dispersadas por sonicación directa con un cabezal de ultrasonidos, durante un tiempo comprendido preferentemente entre 3 y 10 min en la etapa b) y entre 5 y 15 min en la etapa c), suficiente para formar las interacciones intermoleculares débiles por enlaces de hidrógeno y la formación de sales de amonio cuaternario. Más preferentemente, se aplican los ultrasonidos durante 10 minutos en cada una de las etapas b) y c).
De manera preferida, el método antes descrito comprende diluir en agua el complejo obtenido en solución acuosa, en una o varias diluciones sucesivas, en una proporción comprendida entre 1:1 (1 litro de solución acuosa del complejo -que contiene 50 gramos de quitosano por cada 25-50 gramos de CBA- por 1 litro de agua) hasta 1:100 (1 litro de solución acuosa del complejo por 200 litros de agua).
Es un tercer objeto de la presente invención el uso de la solución acuosa del complejo que se define anteriormente, como estimulador del crecimiento vegetal, es decir, para potenciar el crecimiento de las plantas (incremento de la producción de biomasa). Su aplicación en el campo de la agricultura se antoja muy relevante, como prueban los resultados de los experimentos llevados cabo con la invención.
Se ha comprobado que al aplicar la solución del complejo en un cultivo, se incrementa de manera significativa su producción, principalmente gracias a que incrementa la solubilidad y biodisponibilidad en el agua de los compuestos bioactivos que contiene, no sólo de los no solubles, sino también de aquellos que son parcialmente solubles en dicho medio. De hecho, el complejo de la presente invención presenta una actividad mayor que la obtenida de utilizarse los componentes por separado, existiendo sinergia entre los componentes. Una ventaja de este complejo en solución acuosa es que no precisa de la incorporación de emulsionantes o surfactantes para mejorar su solubilidad y biodisponibilidad, como suele ocurrir en el arte previo. Además, dicha biodisponibilidad no se ve afectada cuando se realizan, a partir del preparado concentrado del complejo, diluciones consecutivas que permiten su uso en la Agricultura, mediante aplicación foliar o radicular. Por último, otro objeto de la invención es el uso de la solución acuosa del complejo que se ha definido para prevenir y tratar enfermedades patógenas en plantas. El tipo de patógenos cuyo crecimiento se previene en las plantas con el uso de la solución acuosa objeto de la invención es muy diverso y amplio. En un caso preferido, el complejo se usa para prevenir bacterias gran negativas. En otro caso preferido, la solución acuosa del complejo se usa para prevenir el crecimiento de hongos, tan diversos en su género como son los causantes de la yesca de la vid, que originan la pudrición de la madera, o el hongo Fusaríum culmorum. En estos casos particulares, es más preferido que el CBA del complejo sea la prolina, un aminoácido insoluble en agua que, al estar formando parte del complejo, presenta una alta biodisponibilidad.
Ambos usos comprenden preferentemente aplicar una disolución acuosa del complejo descrito sobre el cultivo, mediante pulverización (foliar) o en el suelo (radicular), aunque la aplicación foliar es siempre preferida porque la eficacia y absorción por parte de la planta es siempre mayor. Por cuestiones prácticas y económicas, el uso implica preferentemente la aplicación de una solución del complejo muy diluida, de 1 litro de solución acuosa del complejo por 50, 100 o hasta 200 litros de agua, aunque lógicamente, como el efecto no se ve alterado por el volumen de disolución, puede aplicarse en cualquiera de las concentraciones protegidas en esta memoria.
Breve descripción de las figuras
Figura 1: Parcela de experimentación correspondiente al Ejemplo 2, en las inmediaciones de Veguellina de Órbigo (León). Se delimitan 3 zonas: control donde no se aplica tratamiento, y las correspondientes parcelas de aplicación 1 y 2.
Figura 2: Fotografías tomadas de plantas de alubia recolectadas en cada una de las parcelas de análisis: a) Parcela 1; b) Parcela 2; y c) Parcela control.
Figura 3: Fotografías de placas Petri con resultados de la aplicación de una solución acuosa del complejo con aminoácidos como CBA. En concreto se han testado los complejos de quitosano con Arginina y Tirosina en dos cepas de hongos diferentes: Diplodia seriata y Fusaríum culmorum. Se utilizaron diversas concentraciones del complejo (desde 100 ppm hasta 500 ppm del mismo) en un medio de crecimiento de los hongos (PDA), para determinar la Cantidad Mínima Inhibitoria (MIC).
Figura 4: Fotografías de placas Petri con resultados de la aplicación de una solución acuosa del complejo con aminoácidos como CBA. En concreto se han testado los complejos de quitosano con Glicina e Histidina en las mismas cepas de hongos que en la Figura 3: Diplodia seriata y Fusarium culmorum. Se utilizaron diversas concentraciones del complejo (desde 100 ppm hasta 500 ppm del mismo) en un medio de crecimiento de los hongos (PDA), para determinar la Cantidad Mínima Inhibitoria (MIC).
Figura 5: Fotografías de placas Petri con resultados de la aplicación de una solución acuosa del complejo, formado a partir de un gel de quitosano y ácido cítrico con diferentes aminoácidos como CBA (arginina, glicina, prolina, histidina y tirosina), para prevenir y tratar el crecimiento de dos hongos: Diplodia seriata y Fusaríum culmorum. Aquí se exponen resultados de diferentes mezclas, incluso utilizando glicerina en lugar de quitosano como agente vehiculizante, con prolina y ácido cítrico, y se evaluó su comportamiento en el crecimiento de los hongos.
Ejemplos
Ejemplo 1: Métodos de obtención y caracterización de una solución acuosa del complejo descrito en la presente invención, con Urtica spp. como CBA y con una combinación de Equisetum an/ense y Urtica spp como CBA.
1.1 Primer procedimiento de obtención
En 1 litro de agua caliente a 60°C se introducen 50 gramos de ácido cítrico y la misma cantidad de quitosano, se introduce el cabezal de ultrasonidos (20 kH) de alta potencia y se forma el gel de quitosano correspondiente, de forma que el pH de este gel se encuentra desde 3,5 a 5. Una vez disuelto todo el quitosano, de forma que no aparezcan grumos y una vez estabilizado el gel, se añaden de 25 a 50 gramos de extracto de Equisetum arvense y se aplica al menos durante 10 minutos el cabezal de ultrasonidos. En este momento se verifica la solubilización total en el gel de quitosano del extracto comentado. Para ser aplicado foliar o radicularmente, cada litro de la solución descrita en este ejemplo de realización debe ser disuelta al menos en 100 litros de agua hasta 200 litros de agua.
1.2. Segundo procedimiento de obtención
En 1 litro de agua caliente a 60°C se introducen 50 gramos de ácido acético y la misma cantidad de quitosano, se introduce el cabezal de ultrasonidos (20 kH) de alta potencia y se forma el gel de quitosano correspondiente, de forma que el pH de este gel se encuentra entre 3,5 a 5. Una vez disuelto todo el quitosano, de forma que no aparezcan grumos y estabilizado el gel, se añaden de 25 a 50 gramos de extracto de Urtica spp y se aplica al menos durante 10 minutos el cabezal de ultrasonidos. En este momento se verifica la solubilización total en el gel de quitosano del extracto comentado. Para ser aplicado foliar o radicularmente, cada litro de la solución descrita en este ejemplo de realización debe ser disuelta al menos en 100 litros de agua hasta 200 litros de agua.
1.3. Tercer procedimiento de obtención
En 1 litro de agua caliente a 60°C se introducen 50 gramos de ácido propiónico y la misma cantidad de quitosano, se introduce el cabezal de ultrasonidos (20 kH) de alta potencia y se forma el gel de quitosano correspondiente, de forma que el pH de este gel se encuentra en un valor comprendido ente 3,5 hasta 5. Una vez disuelto todo el quitosano, de forma que no aparezcan grumos y estabilizado el gel, se añaden de 15 a 25 gramos de extracto de Urtica spp y la misma cantidad en peso de extracto de Equisetum arvense y se aplica al menos durante 10 minutos el cabezal de ultrasonidos. En este momento se verifica la solubilización total en el gel de quitosano del extracto comentado. Para ser aplicado foliar o radicularmente, cada litro de la solución descrita en este ejemplo de realización debe ser disuelta al menos en 100 litros de agua hasta 200 litros de agua.
En las tres realizaciones se observa que para la formación del gel de quitosano se pueden usar diferentes ácidos carboxílicos, ya que se busca bajar el pH de forma que se produzca la solubilización del quitosano en agua.
Ejemplo 2: Uso de las soluciones acuosas del complejo descritas en el Ejemplo 1 para potenciar el crecimiento vegetal Se han llevado a cabo estudios experimentales con las soluciones acuosas de los complejos descritos en el ejemplo anterior (que contienen como CBA, Urtica spp. En un primer caso y una combinación de Equisetum arvense y Urtica spp en un segundo caso,) en parcelas con cultivo de alubia y lúpulo, diferenciando entre:
- una parcela control,
- una parcela de aplicación 1, donde el complejo de la solución acuosa comprende quitosano y Urtica spp.] y
- una parcela de aplicación 2, donde el complejo de la solución acuosa comprende quitosano, Equisetum arvense y Urtica spp.
Estas parcelas se muestran en la Figura 1. La aplicación de la solución acuosa en los cultivos fue foliar. Al analizar la producción de biomasa, medida en número de hojas y número de frutos en las plantas de alubia recolectadas en cada una de las parcelas de análisis tras los diferentes tratamientos (sin tratamiento -control-; complejo conteniendo Urtica spp. - parcela de aplicación 1-; y complejo conteniendo Equisetum arvense y Urtica spp. - parcela de aplicación 2-) se obtuvieron los siguientes resultados:
Figure imgf000023_0001
* En el presente estudio, se considera una vaina válida aquella que presenta más de 3 granos.
El análisis comparativo de estos resultados muestran un incremento significativo del 17% en hojas y del 25% en las vainas de la planta en la parcela de aplicación 1 con respecto a la parcela control, y un incremento significativo del 45% en la producción de hojas y del 50% de incremento en la producción de vainas en la parcela de aplicación 2 con respecto a la parcela control. Estos resultados muestran así un efecto sinérgico entre los componentes del complejo en su efecto de favorecer el crecimiento de las plantas.
Ejemplo 3: Uso de las soluciones acuosas del complejo descritas en el Ejemplo 1 Para prevenir enfermedades patógenas
En las parcelas anteriores se comprobó no sólo un mayor crecimiento vegetal, sino que por casualidad se observó una resistencia significativamente mayor frente a patógenos. Así, durante el experimento, las parcelas sufrieron un ataque fuerte de Oídio. Ante esta situación, tras la recolecta, se vio que las parcelas en las que el cultivo fue tratado con el complejo de la presente invención, en sus dos variantes de aplicación aquí, estaban limpias de Oídio, no así en la parcela control.
Ejemplo 4: Obtención de una solución acuosa del complejo descrito en la presente invención, con aminoácidos.
Se procedió a la preparación de soluciones acuosas siguiendo la misma metodología que en el Ejemplo 1, pero donde el CBA era un aminoácido: en 1 litro de agua caliente a 60°C se introducen 50 gramos de ácido cítrico y la misma cantidad de quitosano, se introduce el cabezal de ultrasonidos (20 kH) de alta potencia y se forma el gel de quitosano correspondiente, de forma que el pH de este gel se encuentra desde 3,5 a 5. Una vez disuelto todo el quitosano, de forma que no aparezcan grumos y una vez estabilizado el gel, se añaden de 25 a 50 gramos de arginina y se aplica al menos durante 10 minutos el cabezal de ultrasonidos. En este momento se verifica la solubilización total en el gel de quitosano del extracto comentado.
Este mismo protocolo se aplicó para obtener soluciones acuosas del complejo formado por quitosano y otros aminoácidos, concretamente: glicina, prolina, histidina y tirosina.
Ejemplo 5: Aplicación de las soluciones acuosas con aminoácidos como CBAs según en
Ejemplo 4, cuyos resultados son mostrados en las figuras 3-5.
5.1. Soluciones acuosas de complejos de quitosano con arqinina y con tirosina (por separado) como CBA
En un primer experimento, se han testado los complejos de quitosano con Arginina y Tirosina en dos cepas de hongos de género muy diferente: Diplodia seriata, causante de la yesca de la vid, y Fusarium culmorum. Se utilizaron diversas concentraciones del complejo (desde 100 ppm hasta 500 ppm del mismo) en un medio de crecimiento de los hongos (PDA), para determinar la Cantidad Mínima Inhibitoria (MIC).
Concretamente, de cada una de las dos soluciones acuosas con Arginina y con Tirosina preparadas en el Ejemplo 4, se extrajo por pipeta 1 gramo en peso, y se diluyó en tres volúmenes diferentes de agua: 10 mi, 25 mi y 50 mi. Posteriormente, se extrajo 5 mi de cada dilución y se añadió a otras tantas placas Petri que contenían 15 mi de medio de crecimiento PDA (pectonas y glicósidos) y se mezcló homogéneamente. De las dos placas Petri donde se han cultivado los hongos Diplodia seriata y Fusarium culmorum, se extrajeron muestras de los mismos y se añadieron a las placas con la solución acuosa.
Los resultados se muestran en las Figuras 3. Se observó que la MIC es de 120 ppm para los dos casos estudiados.
5.2. Soluciones acuosas de complejos de quitosano con qlicina y con tirosina (por separado) como CBA
En un segundo experimento, se han testado las soluciones acuosas de complejos de quitosano con Glicina e Histidina en las mismas cepas de hongos que en el experimento anterior: Diplodia seriata y Fusarium culmorum. Se utilizaron diversas concentraciones del complejo (desde 100 ppm hasta 500 ppm del mismo) en un medio de crecimiento de los hongos (PDA), para determinar la Cantidad Mínima Inhibitoria (MIC).
La metodología de preparación del experimento, así como los resultados (mostrados en la Figura 4), se repitieron: se observó que la MIC es de 120 ppm para los dos casos estudiados
5.3. Soluciones acuosas de complejos de quitosano con arqinina, qlicina, prolina, histidina y tirosina (por separado) como CBA Los experimentos 5.1 y 5.2 se repitieron exactamente igual, pero ahora con cada una de las cinco soluciones obtenidas en el Ejemplo 4, donde cada una de ellas se definía por un CBA diferente que era uno de los aminoácidos seleccionado de: arginina, glicina, prolina, histidina y tirosina.
Los resultados, mostrados en la figura 5, se volvieron a repetir: se observó que la MIC es de 120 ppm para los dos casos estudiados.
Para contrastar y confirmar el efecto ventajoso de las composiciones objeto de la presente invención y su efecto sinérgico, se preparó una solución acuosa con los complejos de CBAs, pero donde el agente vehiculizante era glicerina, no el quitosano. Esto ñor permitió confirmar el efecto del quitosano. Así, se confirmó que una composición a base de glicerina y prolina no funcionó frente a los patógenos. Se preparó también otra composición, siguiendo la misma metodología que antes se ha descrito, pero con prolina, glicerina y ácido cítrico. Esta composición mejoró los resultados frente a la anterior (sin ácido cítrico), pero no llegó a alcanzar los mismo resultados de MIC que con las soluciones de la presente invención.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Una solución acuosa de un complejo de inclusión que comprende: un quitosano con peso molecular comprendido entre 100.000 a 300.000 g/mol, como agente de vehiculización, y al menos un compuesto biológicamente activo de aplicación en agricultura seleccionado dentro del grupo formado por: extracto de Equisetum arvense, extracto de Urtica spp, un aminácido y cualquier combinación de los mismos; donde el quitosano y el compuesto biológicamente activo se encuentran unidos entre sí por enlaces de hidrógeno y, en el caso de los aminoácidos, también por la formación de sales de amonio cuaternario entre un grupo amino presente en la estructura molecular del quitosano y un ácido carboxílico presente en dicho aminoácido.
2. La solución acuosa del complejo según la reivindicación anterior, donde el aminoácido es seleccionado dentro del grupo compuesto por: Alanina, Arginina, Asparagina, Ácido aspártico, Cisteína, Glutamina, Ácido glutámico, Glicina, Histidina, Isoleucina, Leucina, Lisina, Metionina, Fenilalanina, Prolina, Serina, Treonina, Triptófano, Tirosina y Valina.
3. La solución acuosa del complejo según la reivindicación anterior, donde el aminoácido es seleccionado entre Prolina y Glicina.
4. La solución acuosa del complejo según la reivindicación 1, donde el compuesto biológicamente activo es una combinación de Equisetum arvense y Urtica spp.
5. La solución acuosa del complejo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde la proporción en peso entre el quitosano de alto peso molecular y el compuesto biológicamente activo presenta una relación seleccionada entre 1:1 y 2:1.
6. La solución acuosa del complejo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que presenta una concentración de complejo desde 75 g-100 g de complejo por 1 litro de agua, donde se mantiene una proporción 1:1 a 2:1 del quitosano y el complejo biológicamente activo, hasta una concentración de 75 g-100 g de complejo por 200 litro de agua.
7. La solución acuosa del complejo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde la cantidad de quitosano de alto peso molecular en la solución acuosa es igual o inferior a 8% en peso con respecto al volumen total de la solución.
8. Un método para obtener la solución acuosa de los complejos definidos en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que comprende las siguientes etapas: a) preparar una solución acuosa que comprende el quitosano de peso molecular comprendido entre 100.000 y 300.000 g/mol y un ácido carboxílico; b) aplicar ultrasonidos a la mezcla hasta formar un gel del quitosano estable y homogéneo; y c) añadir el al menos un CBA y aplicar ultrasonidos para formar el complejo en la solución acuosa.
9. El método según la reivindicación anterior, donde la proporción en peso en la mezcla de quitosano y ácido carboxílico es de 1:1.
10. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 8 ó 9, donde el ácido carboxílico es seleccionado dentro del grupo compuesto por ácido cítrico, ácido acético y ácido propiónico.
11. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, donde las etapas a) y b) para formar el gel estable de quitosano se llevan a cabo a una temperatura comprendida entre 50-70°C.
12. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, donde la proporción en peso en la mezcla de quitosano y el compuesto biológicamente activo se selecciona entre 1:1 y 2:1.
13. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, donde la cantidad de quitosano en agua es igual o inferior al 8% en peso del total del volumen de la solución.
14. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, donde, en las etapas b) y c), la mezcla por sonicación se lleva a cabo a 20 kHZ.
15. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 14, donde la sonicación se aplica durante un tiempo comprendido entre 3 y 10 min en la etapa b) y entre 5 y 15 min en la etapa c).
16. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15, que comprende diluir en agua el complejo obtenido en solución acuosa, en una o varias diluciones sucesivas, en una proporción comprendida entre 1 litro de solución acuosa/1 litro de agua y hasta 1 litro de solución acuosa/200 litros de agua.
17. Uso de la solución acuosa definida en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, como estimulador del crecimiento vegetal para potenciar el incremento de la producción de biomasa.
18. Uso de la solución acuosa definida en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para prevenir enfermedades patógenas en plantas.
19. El uso según la reivindicación 18, donde el patógeno es seleccionado entre un hongo y una bacteria gran negativa.
20. El uso según la reivindicación 19 donde el patógeno es un hongo causante de la yesca de la vid.
21. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20, donde la solución acuosa del complejo se aplica mediante pulverización sobre la planta o mediante aplicación en el suelo.
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