WO2021132592A1 - Ｇｐｘ４阻害剤に対するがん細胞の感受性を予測する方法 - Google Patents

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健史 加島
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Definitions

  • the present invention relates to a method for predicting the susceptibility of cancer cells to GPX4 inhibitors.
  • the present invention also relates to a method for predicting the susceptibility of a cancer patient to treatment with a GPX4 inhibitor, a method for selecting a cancer patient to be treated with a GPX4 inhibitor, a method for suppressing the growth of cancer cells, and the like.
  • the present invention relates to a method for treating cancer, a method for screening compounds used for treating cancer, and a therapeutic agent for cancer.
  • Non-Patent Documents 1 to 3, etc. A treatment method specific to a cancer cell having these gene mutations is expected as a highly selective and highly effective treatment method for cancer.
  • the gene mutations found in human cancer cells include not only the above-mentioned function-acquired type but also function-deficient type gene mutations.
  • Function-deficient gene mutations are difficult to discover in a gene-mutation-specific manner, and require a different therapeutic strategy from treatments targeting cancer cells with function-acquired gene mutations.
  • the SWI / SNF complex is a chromatin remodeling factor composed of 12 to 15 subunits (complex factors).
  • functional suppression such as functional deletion type gene mutation and expression suppression of SWI / SNF complex factor is observed in many human cancers, and its involvement in tumor development and progression is drawing attention. ..
  • These mutations interfere with important functions of the SWI / SNF complex, such as dissociation of DNA stored in nucleosomes and recruitment of transcription factors such as transcription factors and histone deacetylases to DNA. Therefore, it is speculated that there is an important relationship between such functional suppression and the development and progression of cancer, and research is being conducted.
  • Non-Patent Document 4 describes that in non-small cell lung cancer, a deficiency of SMARCA4, which is a SWI / SNF complex factor, has a synthetic lethal relationship with a CDK4 / 6 inhibitor. Described that SMARCA4 deficient lung cancer increased susceptibility to OXPHOS (oxidative phosphorylation of mitochondrial) inhibitors, and Non-Patent Document 6 describes mutations in the SMARCA4 gene in non-small cell lung cancer.
  • SMARCA4 deficient lung cancer increased susceptibility to OXPHOS (oxidative phosphorylation of mitochondrial) inhibitors
  • Non-Patent Document 6 describes mutations in the SMARCA4 gene in non-small cell lung cancer.
  • Non-Patent Document 7 states that a mutation in the gene of ARID1A, which is also a SWI / SNF complex factor, has a synthetic lethal relationship with a GSH synthesis inhibitor. It is stated that there is.
  • An object of the present invention is to develop a therapeutic strategy capable of specifically targeting cancer cells in which the function of the SWI / SNF complex is suppressed, and more specifically, SWI /
  • the purpose of this study is to develop a therapeutic strategy that specifically targets cancer cells in which suppression of SNF complex factor function is detected.
  • the present inventors when the expression suppression or function inhibition of GPX4 is performed in cancer cells in which the function suppression of SWI / SNF complex factor is detected, the cancer concerned. While cell proliferation is significantly suppressed and / or cell death is induced, such proliferation inhibition and / or cell death does not occur in cells in which the function suppression of SWI / SNF complex factor does not occur. I found it.
  • the present inventors conducted comprehensive knockdown experiments on human cancer cell lines, and found that a drug that suppresses the function of any protein causes the function of the SWI / SNF complex factor. We enthusiastically investigated whether it would lead to antitumor activity against cancer cells. As a result, when the expression of GPX4 is suppressed in a cancer cell line having a defective mutation in the gene of SMARCA4, which is a core component of the SWI / SNF complex, and / or the expression of SMARCA4 protein is not detected, It was found that cell death was induced and cell proliferation was significantly suppressed.
  • the present inventors also suppress the expression of GPX4 when the activity of GPX4 is inhibited by using a compound reported to inhibit the enzymatic activity of GPX4 (for example, ML210 and RSL3). Similarly, it was found that cell death was induced in cancer cells in which the function of SMARCA4 was suppressed, and cell proliferation was significantly suppressed.
  • a compound reported to inhibit the enzymatic activity of GPX4 for example, ML210 and RSL3
  • GPX1, GPX2, GPX3, GPX4, GPX5, GPX6, GPX7, and GPX8 eight types of molecules belonging to the GPX family have been reported in humans: GPX1, GPX2, GPX3, GPX4, GPX5, GPX6, GPX7, and GPX8.
  • the present inventors particularly inhibit GPX4 with SMARCA4. It was found that it specifically exhibits antitumor activity against cancer cells in which the function of the tumor is suppressed.
  • SMARCA4 is a protein constituting the SWI / SNF complex
  • GPX4 may be effective against cells in which the functions of other proteins constituting the SWI / SNF complex are suppressed. it was thought. Therefore, in addition to SMARCA4, a cancer cell line in which functional inhibition occurs in other SWI / SNF complex factors (for example, SMARCA2, ARID1A, ARID1B, ARID2, BCL11B) is used to suppress expression and / or inhibit activity of GPX4.
  • SWI / SNF complex factors for example, SMARCA2, ARID1A, ARID1B, ARID2, BCL11B
  • GPX4 was also found in cancer cell lines in which the function of SMARCA4 was suppressed, as well as in cancer cell lines in which the function of other SWI / SNF complex factors was suppressed. It was found that cell proliferation suppression and cell death were remarkably observed by inhibition of cell proliferation.
  • GPX4 is an enzyme that consumes intracellular glutathione and hydrolyzes it
  • other factor groups (proteins) involved in glutathione synthesis also suppress the function of the SWI / SNF complex factor. It was considered that it may show antitumor activity against cells.
  • GCLC gamma-glutamylcysteine synthetase
  • GSS glutathione synthetase
  • GCLM Glutamate-Cysteine Ligase Modifier Subunit
  • MST1 Microsomal Glutathione S-Transferase 1
  • MGST3 Microsomal Glutathione Inhibition of S-Transphase 3
  • GSR Glutathione-Disulfide Reducase
  • G6PD glucose-6-phosphorate dehydogenesis
  • GPX4 inhibition the enzyme activity of GPX4 is inhibited in cancer-bearing mice transplanted with cancer cells in which the function of SWI / SNF complex factor is suppressed. It was clarified that the increase in tumor volume was remarkably suppressed by the administration of the drug), and that the inhibition of GPX4 did show an antitumor effect even in vivo.
  • the present inventors consider that the treatment that inhibits GPX4 (inhibition of expression or activity) is a promising approach for the treatment targeting cancer cells in which the function of SWI / SNF complex factor is suppressed. I found that it would be.
  • cancer patients can be selected based on the functional suppression of SWI / SNF complex factor, and then a GPX4 inhibitor can be administered, so that efficient treatment based on companion diagnostics is possible. Was also revealed.
  • the present inventors have also found that screening of a drug useful for the treatment of SWI / SNF complex factor function-suppressing cancer can be performed using whether or not GPX4 is inhibited as an index, and the present invention has been made. Has been completed.
  • the present invention relates to a therapeutic method that specifically targets cancer cells in which the function of the SWI / SNF complex factor is suppressed and companion diagnostics for the therapeutic method. Provide the invention of.
  • a cancer therapeutic agent that contains a compound that inhibits GPX4 as an active ingredient and is a therapeutic agent for cancer containing cancer cells in which functional suppression of SWI / SNF complex factor is detected.
  • a method of predicting the susceptibility of cancer cells to GPX4 inhibitors A step of predicting that cancer cells in which suppression of SWI / SNF complex factor function in cancer cells is sensitive to a GPX4 inhibitor, Including methods.
  • [5] A method of predicting the susceptibility of cancer cells to GPX4 inhibitors.
  • a step of detecting the presence or absence of functional suppression of the SWI / SNF complex factor in cancer cells and (B) A step of predicting that cancer cells in which functional suppression of the SWI / SNF complex factor is detected is sensitive to a GPX4 inhibitor. Including methods.
  • a method of predicting the susceptibility of cancer patients to treatment with GPX4 inhibitors A step of predicting that a cancer patient in which suppression of SWI / SNF complex factor function is detected in cancer cells contained in a sample derived from a cancer patient is susceptible to treatment with a GPX4 inhibitor. Including methods.
  • [7] A method of predicting the susceptibility of cancer patients to treatment with GPX4 inhibitors.
  • a step of detecting the presence or absence of functional suppression of the SWI / SNF complex factor in cancer cells contained in a sample derived from a cancer patient and
  • B A step of predicting that a cancer patient in which functional suppression of the SWI / SNF complex factor is detected in the cancer cells is susceptible to treatment with a GPX4 inhibitor. Including methods.
  • [9] It is a method of selecting cancer patients to be treated with GPX4 inhibitors.
  • a step of detecting the presence or absence of functional suppression of the SWI / SNF complex factor in cancer cells contained in a sample derived from a cancer patient and
  • B A step of selecting a cancer patient in which functional suppression of the SWI / SNF complex factor is detected in the cancer cells as a target for cancer treatment with a GPX4 inhibitor. Including methods.
  • a screening method for compounds used in the treatment of cancer including cancer cells in which suppression of SWI / SNF complex factor function is detected.
  • SWI / SNF complex factor is at least one selected from the group consisting of SMARCA2, SMARCA4, ARID1A, ARID1B, ARID2, and BCL11B, according to any one of [1] to [3]. Cancer remedy.
  • SWI / SNF complex factor is at least one selected from the group consisting of SMARCA2, SMARCA4, ARID1A, ARID1B, ARID2, and BCL11B. ..
  • the suppression of the function of the SWI / SNF complex factor is a decrease in the activity of the SWI / SNF complex having the SWI / SNF complex factor as a constituent factor and / or a decrease in the expression of the SWI / SNF complex factor [1]. ] To the cancer therapeutic agent according to any one of [3].
  • the suppression of the function of the SWI / SNF complex factor is a decrease in the activity of the SWI / SNF complex having the SWI / SNF complex factor as a constituent factor and / or a decrease in the expression of the SWI / SNF complex factor [4]. ] To [13].
  • a cancer therapeutic agent that is a therapeutic agent for.
  • a method of predicting the susceptibility of cancer cells to GPX4 inhibitors A step of predicting that a cancer cell in which a function-deficient mutation of the SWI / SNF complex factor gene is detected in the cancer cell is sensitive to a GPX4 inhibitor, A method characterized by including.
  • a method of predicting the susceptibility of cancer cells to GPX4 inhibitors (A) A step of detecting the presence or absence of a function-deficient mutation of the SWI / SNF complex factor gene in cancer cells, and (B) A step of predicting that a cancer cell in which a function-deficient mutation of the SWI / SNF complex factor gene is detected is sensitive to a GPX4 inhibitor. Including methods.
  • a method of predicting the susceptibility of cancer patients to treatment with GPX4 inhibitors Cancer patients in which a function-deficient mutation in the SWI / SNF complex factor gene is detected in cancer cells contained in a sample derived from a cancer patient are predicted to be susceptible to treatment with a GPX4 inhibitor. Process, Including methods.
  • a method of predicting the susceptibility of cancer patients to treatment with GPX4 inhibitors (A) A step of detecting the presence or absence of a function-deficient mutation of the SWI / SNF complex factor gene in cancer cells contained in a sample derived from a cancer patient, and (B) A step of predicting that a cancer patient in which a function-deficient mutation of the SWI / SNF complex factor gene is detected in the cancer cells is susceptible to treatment with a GPX4 inhibitor. Including methods.
  • [30] It is a method of selecting cancer patients to be treated with GPX4 inhibitors.
  • a step of detecting the presence or absence of a function-deficient mutation of the SWI / SNF complex factor gene in cancer cells contained in a sample derived from a cancer patient and
  • B A step of selecting a cancer patient in which a function-deficient mutation of the SWI / SNF complex factor gene is detected in the cancer cells as a target for cancer treatment with a GPX4 inhibitor. Including methods.
  • a screening method for compounds used in the treatment of cancer including cancer cells in which a function-deficient mutation in the SWI / SNF complex factor gene is detected.
  • SWI / SNF complex factor is at least one selected from the group consisting of SMARCA2, SMARCA4, ARID1A, ARID1B, ARID2, or BCL11B, according to any one of [22] to [24]. Cancer remedy.
  • SWI / SNF complex factor is at least one selected from the group consisting of SMARCA2, SMARCA4, ARID1A, ARID1B, ARID2, or BCL11B. ..
  • GPX4 efficiently uses the suppression of the function of the SWI / SNF complex factor (for example, gene mutation of the SWI / SNF complex factor represented by SMARCA4, ARID1A, etc. or decreased expression of protein) as an index. It is possible to predict the susceptibility of inhibitors to cancer treatment. Further, according to the present invention, the presence or absence of functional suppression of the SWI / SNF complex factor in a sample derived from a cancer patient is detected, the patient in which the mutation is detected is selected, and then GPX4 inhibition is performed on the patient. Cancer can be treated with drugs. Therefore, it is possible to greatly improve the treatment results of cancer.
  • the SWI / SNF complex factor for example, gene mutation of the SWI / SNF complex factor represented by SMARCA4, ARID1A, etc. or decreased expression of protein
  • companion diagnostics can be made more efficient by detecting the presence or absence of functional suppression of the SWI / SNF complex factor. It becomes possible to do it in a targeted manner.
  • Cell proliferation inhibition rate when expression of GPX4 (# 1, # 2) was suppressed in each cell line of NCI-H1792, MOR, NCI-H2110, NCI-H522, NCI-H23, and SNU-1327 (CGI (CGI) %)) Is a graph showing. It is a graph which shows the cell proliferation inhibition rate (CGI (%)) at the time of suppressing the expression of GPX4 (# 2) in each cell line shown in Table 4. It is a graph which shows the cell proliferation inhibition rate (CGI (%)) at the time of suppressing the expression of GPX4 (# 3) in each cell line shown in Table 4.
  • CGI cell proliferation inhibition rate
  • the present invention (A) A step of detecting the presence or absence of functional suppression of the SWI / SNF complex factor in cancer cells, and (B) A step of predicting that cancer cells in which functional suppression of the SWI / SNF complex factor is detected is sensitive to a GPX4 inhibitor.
  • a method for predicting the susceptibility of cancer cells to a GPX4 inhibitor hereinafter, in some cases, referred to as “cancer cell susceptibility prediction method”.
  • the present invention (A) A step of detecting the presence or absence of functional suppression of the SWI / SNF complex factor in cancer cells contained in a sample derived from a cancer patient, and (B) A step of predicting that a cancer patient in which functional suppression of the SWI / SNF complex factor is detected in the cancer cells is susceptible to treatment with a GPX4 inhibitor.
  • a method for predicting the susceptibility of a cancer patient to treatment with a GPX4 inhibitor hereinafter, in some cases, referred to as a “cancer patient susceptibility prediction method”.
  • the function suppression of the SWI / SNF complex factor is used as an index to inhibit GPX4. It is possible to select patients for whom cancer treatment with a drug is effective and patients for which it is not effective, and to perform efficient treatment. Therefore, the present invention (A) A step of detecting the presence or absence of functional suppression of the SWI / SNF complex factor in cancer cells contained in a sample derived from a cancer patient, and (B) A step of selecting a cancer patient in which functional suppression of the SWI / SNF complex factor is detected in the cancer cells as a target for cancer treatment with a GPX4 inhibitor.
  • a method for selecting a cancer patient to be treated with a GPX4 inhibitor hereinafter, referred to as a “cancer patient selection method” in some cases).
  • malignant neoplasms such as cancer (epithelial tumor), leukemia, malignant lymphoma, myeloma, sarcoma, and carcinosarcoma are collectively referred to as “cancer” or “tumor”, and cells constituting the cancer. Is called “cancer cell”.
  • cancers containing cancer cells that can detect the presence or absence of functional suppression of SWI / SNF complex factors are not particularly limited, and examples thereof include lung cancer, ovarian cancer, uterine cancer, liver cancer, gastric cancer, and esophagus. Hmm, colon cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, bladder cancer, kidney cancer.
  • the "cancer patient” may be not only a person suffering from the cancer but also a person suspected of having the cancer.
  • the cancer patients for which the functional suppression of the SWI / SNF complex factor is detected are not particularly limited, and all cancer patients can be targeted.
  • sample derived from a cancer patient used in the present invention is not particularly limited as long as it is a biological sample capable of detecting the presence or absence of functional suppression of the SWI / SNF complex factor, but is preferably cancerous. It is a sample such as a test sample, blood, urine, body cavity fluid, and circulating DNA derived from tumor cells (circulating tumor DNA: ctDNA). Further, it may be a protein extract or a nucleic acid extract obtained from the sample (mRNA extract, cDNA preparation prepared from mRNA extract, cRNA preparation, etc.). As used herein, "biological sample” includes a sample derived from a cancer patient and a sample derived from a cancer cell culture.
  • the "GPX4 inhibitor” in the present invention represents a composition containing at least one compound that inhibits GPX4 (glutathione peroxidase 4), and even if it comprises only the compound or a combination thereof, the following additive components are added. Further may be included.
  • the "compound that inhibits GPX4" in the present invention includes a compound that inhibits at least one of the activity of GPX4 and the expression of GPX4.
  • GPX4 (also sometimes referred to as" GPX4 protein "in the present specification)", which is a target of the GPX4 inhibitor in the present invention, has a peroxidase activity of oxidizing and cleaving the peroxide structure of glutathione to decompose it into two hydroxy groups. It is one of the glutathione peroxidase isozymes (currently eight types of GPX1 to GPX8 are known), and while other GPXs can reduce hydrogen peroxide and fatty acid peroxide as substrates, GPX4 has. It is an enzyme that also has the function of directly reducing phospholipid peroxide.
  • the nucleotide sequence of a typical human-derived DNA (cDNA) encoding GPX4 is SEQ ID NO: 1 (NCBI reference number: NM_002085.5), and the typical amino acid sequence of a human-derived GPX4 protein is SEQ ID NO: 2 (NCBI reference number: NM_002085.5). NCBI reference number: NP_002076.2), respectively. Even if the DNA encodes GPX4 that has not undergone mutations involving substitution, deletion, insertion, addition, etc. of the amino acid sequence, individual differences may occur in the sequence due to polymorphism or the like.
  • the inhibition of the activity of GPX4 by the compound is confirmed, for example, by adding phosphatidylcholine hydroperoxidase, which is a substrate of GPX4, to the lysate of cells treated with the test compound, and using the reduction thereof as an index.
  • phosphatidylcholine hydroperoxidase which is a substrate of GPX4
  • the reduction thereof as an index.
  • the fact that the compound inhibits the activity of GPX4 means that, for example, the purified GPX4 standard is treated with a test compound, GSH and peroxide, which are substrates of GPX4, Glutathione redox, and NADPH are added, and the compound is activated by an enzyme recycling method. It can also be confirmed by measuring (Shinome et al., Antioxid. Redox Signal.22 (4), 281-293, Expression of Inactive Glutathione Peroxidase 4 Leads to Egyption Technology Technology L. Knock-In Mice, etc.). When the activity of GPX4 is inhibited by the test compound, the consumption of GSH or NADPH decreases.
  • the compound inhibits the expression of GPX4, for example, by detecting the decrease in the expression of GPX4 in the cells treated with the test compound.
  • the expression level of GPX4 is usually detected at the transcription level or the translation level, and compared with a control (for example, the expression level of cells not treated with the test compound). There is also a method of confirming that the expression level is low.
  • RNA or cDNA is prepared from cells treated with the test compound.
  • the method for extracting RNA from the cells is not particularly limited, and a known method can be appropriately selected and used. For example, an extraction method using phenol and a chaotropic salt (more specifically, Trizol (Invitrogen)).
  • RNAPrep total RNA extraction kit manufactured by Beckman Coulter
  • RNeasy Mini manufactured by QIAGEN
  • RNA Extension A method using Kit manufactured by Pharmacia Biotech, etc.
  • the reverse transcriptase used for preparing the cDNA from the extracted RNA is not particularly limited, and for example, a reverse transcriptase derived from a retrovirus such as RAV (Rous assisted virus) or AMV (Avian myeloblastosis virus) can be used.
  • MMLV Mitine leukemia virus
  • other mouse retrovirus-derived reverse transcriptases can be mentioned.
  • the oligonucleotide primer or the oligonucleotide probe is used for the amplification reaction or the hybridization reaction, respectively, and the amplification product or the hybrid product is detected.
  • a method for example, RT-PCR method, Northern blot method, dot blot method, DNA array method, in situ hybridization method, RNase protection assay method, mRNA-seq and the like can be used.
  • Those skilled in the art can design oligonucleotide primers and oligonucleotide probes suitable for each method based on the nucleotide sequence of the cDNA of GPX4 by a conventional method.
  • a protein sample is prepared from cells treated with the test compound.
  • an antigen-antibody reaction is carried out using an antibody specific for the GPX4 protein to detect the GPX4 protein.
  • an antibody specific to the GPX4 protein is added to the protein sample to carry out an antigen-antibody reaction, and the binding of the antibody to the GPX4 protein is detected. .. If an antibody specific for the GPX4 protein is labeled, the GPX4 protein can be detected directly, but if it is not labeled, a labeled molecule that recognizes the antibody (eg, for example).
  • Secondary antibody or protein A can be allowed to act to indirectly detect the GPX4 protein by utilizing the labeling of the molecule.
  • a method for example, an immunohistochemistry (immunostaining) method, a Western blotting method, an ELISA method, a flow cytometry, an imaging cytometry, a radioimmunoassay, an immunoprecipitation method, an analysis method using an antibody array, or the like is used. can do.
  • the type and origin of the antibody to be used are not particularly limited, but a monoclonal antibody is preferable. Oligoclonal antibodies (mixtures of several to dozens of antibodies) and polyclonal antibodies can also be used as long as the GPX4 protein can be detected with sufficient specificity. Also, functional fragments of antibodies such as Fab, Fab', F (ab') 2 , Fv, scFv, sc (Fv) 2 , dsFv, and diabodies and their multimers (eg, dimers, trimmers, tetramers, etc.) Polymer) can also be used. Such an anti-GPX4 protein antibody may be a commercially available product.
  • the GPX4 protein can also be detected using mass spectrometry (MS).
  • MS mass spectrometry
  • analysis by a mass spectrometer (LC / MS) linked with liquid chromatography is advantageous because it is sensitive.
  • Detection by mass spectrometry is, for example, labeling the protein sample, fractionating the labeled protein, subjecting the fractionated protein to mass spectrometry, and identifying the GPX4 protein from the mass spectrometric value. Can be done by.
  • an isotope labeling reagent known in the art can be used, and an appropriate labeling reagent can be obtained as a commercially available product. Fractionation can also be performed by a method known in the art, for example, using a commercially available ion exchange column or the like.
  • the "compound that inhibits GPX4" in the present invention is not particularly limited and may be a known compound or a compound identified by the screening described later, but it may be an organic or inorganic compound molecule or a polypeptide. , And at least one selected from the group consisting of polynucleotides.
  • the compound molecule examples include low molecular weight compounds (molecular weight less than 800) and medium molecular weight compounds (molecular weight 800 to 2,000).
  • the polypeptide includes a full-length polypeptide encoded by a gene, a fragment thereof, a synthesized polypeptide, a cyclic polypeptide, and a glycopeptide.
  • the polypeptide also includes an antibody and an antigenic peptide, and the antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • the antibodies include antibody fragments (eg, Fab, Fab', F (ab') 2 , Fv, scFv, sc (Fv) 2 , dsFv, and diabody, etc.), multimers thereof, and antibodies. It also includes a low molecular weight antibody to which the variable region of the above is bound.
  • the polynucleotide include DNA, RNA, and siRNA, and include full-length polynucleotides, fragments thereof, and synthesized polynucleotides.
  • the "GPX4 inhibitor” in the present invention can be in various dosage forms such as tablets, pills, powders, granules, capsules, and liquids according to its characteristics, and depending on the dosage form, Pharmacologically acceptable sterile water or physiological saline, vegetable oils, solvents, bases, emulsifiers, suspensions, surfactants, stabilizers, flavors, fragrances, excipients, vehicles, preservatives, bonds Addition of agents, diluents, tonicity agents, soothing agents, bulking agents, disintegrants, buffers, coating agents, lubricants, colorants, sweeteners, thickeners, flavoring agents, solubilizing agents, etc. Ingredients may be further contained, and these can be used for production by a known pharmaceutical method.
  • the content of the compound that inhibits GPX4 (if the compound is two or more, the total content thereof) is appropriately adjusted according to the dosage form and the purpose of use. can do.
  • the "SWI / SNF complex” in the present invention is one of the chromatin modeling factors, and is a complex having a function of converting chromatin structure mainly by moving or removing nucleosomes by utilizing the energy of ATP hydrolysis. It is a body and consists of multiple subunits.
  • SWI / SNF complex factor also sometimes referred to as” SWI / SNF complex factor protein "in the present specification
  • SWI / SNF complex factor protein in the present specification
  • SMARCA2 protein in some cases.
  • SMARCA4 ARID1A, ARID1B, ARID2, ACTL6A, ACTL6B, DPF1, DPF2, DPF3, SMARCB1, SMARCC1, SMARCC2, SMARCB1, SMARCD2.
  • SWI / SNF complex factor for detecting functional suppression one of these factors may be used alone or in combination of two or more.
  • the SWI / SNF complex factor according to the present invention is preferably at least one selected from the group consisting of SMARCA2, SMARCA4, ARID1A, ARID1B, ARID2, and BCL11B, and is preferably from the BAF complex factor. It is more preferable that it is at least one selected from the group consisting of SMARCA2, SMARCA4, ARID1A, ARID1B, and BCL11B.
  • SWI / SNF complex factors the sequence number of the base sequence of typical DNA (cDNA) derived from humans encoding each SWI / SNF complex factor and the typical of each SWI / SNF complex factor protein derived from humans.
  • the SEQ ID NOs of the typical amino acid sequences are shown in Tables 1 to 3 below, respectively, but are not limited thereto.
  • Tables 1 to 3 also show the names and reference IDs of each SWI / SNF complex factor in the NCBI RefSeq database (National Center for Biotechnology Information Information Reference Database). Even if the DNA encodes a SWI / SNF complex factor that does not cause mutations involving substitutions, deletions, insertions, additions, etc. of amino acid sequences, individual differences may occur in the sequences due to polymorphisms and the like. ..
  • “Functional suppression of SWI / SNF complex factor” in the present invention includes reduction of activity including inactivation of SWI / SNF complex containing the factor (constituting the factor), and SWI / SNF complex. Includes decreased expression of factors.
  • the method of "detection of direct decrease in activity of SWI / SNF complex" in the present invention is not particularly limited, but for example, the SWI / SNF complex is purified from a biological sample by a method such as immunoprecipitation. It can be confirmed by measuring the chromatin remodeling activity (Michael L. Phelan et al., Molecular Cell, Vol. 3, p. 247-253, February, 1999, Reconstition of a Core Chromatin Remodeling Complex etc). When the activity is reduced in comparison with the control, it can be determined that the reduced activity of the SWI / SNF complex has been detected.
  • the SWI / SNF complex is purified from a biological sample by a technique such as immunoprecipitation, and the consumption of ATP is detected using a commercially available product, for example, ADP-glo (manufactured by Promega).
  • ADP-glo manufactured by Promega
  • SWI / SNF complex factor gene mutations can result from, for example, missense mutations in the SWI / SNF complex factor gene, all-region nonsense mutations, frameshift mutations, or complete or partial deletions of the gene, but SWI / It is not limited to these as long as it causes a decrease in the activity of the SNF complex.
  • SWI / SNF complex factor gene mutations in major cancer cell lines are shown in Table 4 below. Table 4 also shows examples of the presence or absence of SWI / SNF complex factor expression in major cancer cell lines.
  • ARID1A p.
  • examples thereof include Y551Lfs * 72 (Insertion-Frameshift) (COSMIC Legacy Mutation ID: COSM51423), but the present invention is not limited thereto.
  • the method of "detection of mutation of gene of SWI / SNF complex factor" in the present invention is not particularly limited, and examples thereof include the following methods.
  • detecting a mutation means, in principle, detecting a mutation on genomic DNA, but the mutation on the genomic DNA may be a change in a base in a transcript or a change in an amino acid in a translation product. When reflected, it also includes detecting the change in these transcripts and translations (ie, indirect detection).
  • a preferred embodiment of the method of the present invention is a method of detecting a mutation by directly determining the base sequence of the gene region of the SWI / SNF complex factor of a cancer cell.
  • the "gene region of the SWI / SNF complex factor” means a certain region on the genomic DNA containing the gene of the SWI / SNF complex factor.
  • the region also independently includes an expression control region (for example, a promoter region, an enhancer region) of each gene, a 3'end untranslated region of each gene, and the like as untranslated regions.
  • a DNA sample is prepared from a biological sample.
  • the DNA sample include a genomic DNA sample and a cDNA sample prepared by reverse transcription from RNA.
  • the method for extracting genomic DNA or RNA from a biological sample is not particularly limited, and a known method can be appropriately selected and used.
  • the method for extracting genomic DNA is the SDS phenol method (urea).
  • urea A method in which a tissue stored in a solution containing or ethanol is denatured with proteinase K, a surfactant (SDS), and phenol, and DNA is precipitated and extracted from the tissue with ethanol).
  • Clean Colors (registered trademark, manufactured by NexTech), AquaPure (registered trademark, manufactured by Bio-Rad), ZR Precipitation / Seed DNA Kit (registered trademark, manufactured by Zymo Research), AquaGenome Extract (registered trademark, manufactured by MoBio)
  • a DNA extraction method using registered trademark, manufactured by ZyGEM
  • BuccalQuick registered trademark, manufactured by TrimGen
  • RNA from a biological sample As a method of extracting RNA from a biological sample and a method of preparing cDNA from the extracted RNA, the same method as the method described in the method of detecting the expression level of GPX4 at the transcription level can be mentioned.
  • the DNA containing the gene region of the SWI / SNF complex factor is then isolated and the nucleotide sequence of the isolated DNA is determined.
  • Isolation of the DNA includes, for example, PCR using genomic DNA or RNA as a template using a pair of oligonucleotide primers designed to sandwich all or part of the gene region of the SWI / SNF complex factor. Can be done by.
  • the base sequence of the isolated DNA can be determined by a method known to those skilled in the art such as the Makisam Gilbert method and the Sanger method, and the base sequence of the gene can be quickly and comprehensively determined for the isolated DNA and the extracted DNA.
  • a next-generation sequencer or the like capable of analysis that can be read out can also be used.
  • the determined DNA or cDNA base sequence is used as a control (for example, when the biological sample is a sample derived from a cancer patient, the DNA or cDNA base sequence from the same patient's non-cancer tissue or a known base sequence is known. By comparing with the database), it is possible to determine the presence or absence of mutation in the gene region of the SWI / SNF complex factor in the cancer cells of the biological sample.
  • the method for detecting the mutation in the gene region of the SWI / SNF complex factor can be performed by various methods capable of detecting the mutation, in addition to the method of directly determining the base sequence of DNA or cDNA.
  • the mutation in the present invention can be detected by the following method. First, a DNA or cDNA sample is prepared from a biological sample. Next, an oligonucleotide probe having a base sequence complementary to the base sequence containing the mutation site of the gene region of the SWI / SNF complex factor and labeled with the reporter fluorescent dye and the quencher fluorescent dye is prepared. Then, the oligonucleotide probe is hybridized with the DNA or cDNA sample, and the mutation site of the gene region of the SWI / SNF complex factor is used as a template by using the DNA or cDNA sample hybridized with the oligonucleotide probe as a template. Amplifies the containing base sequence.
  • the fluorescence emitted by the reporter fluorescent dye is detected by the decomposition of the oligonucleotide probe accompanying the amplification, and then the detected fluorescence is compared with the control.
  • Examples of such a method include a double die probe method, a so-called TaqMan® probe method.
  • a DNA or cDNA sample is prepared from a biological sample.
  • the base sequence containing the mutation site of the gene region of the SWI / SNF complex factor is amplified using the DNA or cDNA sample as a template.
  • the temperature of the reaction system is changed, the fluctuation of the fluorescence intensity emitted by the intercalator is detected, and the fluctuation of the fluorescence intensity accompanying the detected change in the temperature is compared with the control.
  • HRM high resolution melting
  • a DNA or cDNA sample is prepared from a biological sample.
  • the DNA containing all or part of the gene region of the SWI / SNF complex factor is then amplified. Furthermore, the amplified DNA is cleaved with a restriction enzyme. The DNA fragments are then separated according to their size. The size of the detected DNA fragment is then compared to the control. Examples of such a method include a method using a restriction enzyme fragment length mutation (Restriction Fragment Length Polymorphism / RFLP), a PCR-RFLP method, and the like.
  • a DNA or cDNA sample is prepared from a biological sample.
  • the DNA containing all or part of the gene region of the SWI / SNF complex factor is then amplified. Furthermore, the amplified DNA is dissociated into single-stranded DNA. The dissociated single-stranded DNA is then separated on a non-denatured gel. The mobility of the separated single-stranded DNA on the gel is compared with that of the control. Examples of such a method include the PCR-SCSP (single-strand conformation polymorphism) method.
  • a DNA or cDNA sample is prepared from a biological sample.
  • the DNA containing all or part of the gene region of the SWI / SNF complex factor is then amplified. Further, the amplified DNA is separated on a gel in which the concentration of the DNA denaturant is gradually increased. The mobility of the separated DNA on the gel is then compared to the control. Examples of such a method include a denaturant gradient gel electrophoresis (DGGE) method.
  • DGGE denaturant gradient gel electrophoresis
  • a method using a DNA containing a mutation site of the gene region of the SWI / SNF complex factor prepared from a biological sample and a substrate on which an oligonucleotide probe that hybridizes to the DNA is immobilized.
  • Examples of such a method include a DNA array method and the like.
  • a DNA or cDNA sample is prepared from a biological sample.
  • an oligonucleotide primer having a base sequence complementary to the base on the 1 base 3'side of all or part of the gene region of the SWI / SNF complex factor and the base sequence on the 3'side thereof is prepared. ..
  • the dNTP primer extension reaction is carried out using the DNA as a template and the primer.
  • the primer extension reaction product is subjected to mass spectrometry and mass measurement is performed. Then, the genotype is determined from the result of mass measurement. The determined genotype is then compared to the control. Examples of such a method include the MALDI-TOF / MS method.
  • a DNA or cDNA sample is prepared from a biological sample. Then, 5'-"the base sequence complementary to all or part of the base sequence of the SWI / SNF complex factor and the base sequence on the 5'side thereof"-"all the gene region of the SWI / SNF complex factor"
  • an oligonucleotide probe consisting of a part of the 1-base 3'-side base and the base sequence that does not hybridize with the 3'-side base sequence "-3'(flap) is prepared.
  • an oligonucleotide probe having a base sequence complementary to the base sequence of all or part of the gene region of the SWI / SNF complex factor and the base sequence on the 3'side thereof is prepared.
  • oligonucleotide probes are hybridized with the prepared DNA or cDNA sample.
  • the hybridized DNA is then cleaved with a single-stranded DNA cleaving enzyme to release the flaps.
  • the single-stranded DNA cleaving enzyme is not particularly limited, and examples thereof include clearase.
  • an oligonucleotide probe having a sequence complementary to the flap, which is labeled with reporter fluorescence and quencher fluorescence is then hybridized to the flap. Then, the intensity of the generated fluorescence is measured. The measured fluorescence intensity is then compared to the control. Examples of such a method include the Invader method.
  • a DNA or cDNA sample is prepared from a biological sample.
  • the DNA containing all or part of the gene region of the SWI / SNF complex factor is then amplified.
  • the amplified DNA is dissociated into a single strand, and only one strand of the dissociated single-stranded DNA is separated.
  • an extension reaction is carried out one base at a time from the vicinity of all or some of the bases in the gene region of the SWI / SNF complex factor, and the pyrophosphate produced at that time is enzymatically emitted to emit light, and the intensity of the emission is measured. ..
  • the measured fluorescence intensity is compared with that of the control. Examples of such a method include a Pyrosequencing method.
  • a DNA or cDNA sample is prepared from a biological sample.
  • the DNA containing all or part of the gene region of the SWI / SNF complex factor is then amplified.
  • an oligonucleotide primer having a base sequence complementary to the base on the 1 base 3'side of all or part of the gene region of the SWI / SNF complex factor and the base sequence on the 3'side thereof is prepared. ..
  • the amplified DNA is used as a template, and the prepared primer is used to carry out a single nucleotide extension reaction.
  • the degree of polarization of fluorescence is measured. The degree of polarization of the measured fluorescence is then compared to the control. Examples of such a method include the CycloPrime method.
  • a DNA or cDNA sample is prepared from a biological sample.
  • the DNA containing all or part of the gene region of the SWI / SNF complex factor is then amplified.
  • an oligonucleotide primer having a base sequence complementary to the base on the 1 base 3'side of all or part of the gene region of the SWI / SNF complex factor and the base sequence on the 3'side thereof is prepared. ..
  • the amplified DNA is used as a template, and the prepared primer is used to carry out a single nucleotide extension reaction.
  • the base species used in the single nucleotide extension reaction is determined. The determined base species is then compared to the control. Examples of such a method include the SNuPE method.
  • the sample prepared from the biological sample may be a protein as long as the mutation is accompanied by an amino acid change (eg, substitution, deletion, insertion, addition) in the SWI / SNF complex factor protein. ..
  • an amino acid change eg, substitution, deletion, insertion, addition
  • a method using a molecule for example, an antibody
  • PMF peptide mass fingerprinting method
  • a protein sequencer Edman degradation method
  • a protein sample is prepared from a biological sample.
  • the SWI / SNF complex factor protein is detected by using an antigen-antibody reaction using an antibody specific for the SWI / SNF complex factor protein (anti-SWI / SNF complex factor protein antibody).
  • anti-SWI / SNF complex factor protein antibody an antibody specific for the SWI / SNF complex factor protein
  • the same method as the method mentioned as the method for detecting a protein using an antibody is used for the SWI / SNF complex factor. It can be adjusted according to the protein and appropriately adopted.
  • This method also has the advantage that additional information such as the morphology and distribution of cancer cells in the tissue can be obtained at the same time by immunohistochemistry.
  • the type and origin of the antibody to be used are not particularly limited, but a monoclonal antibody is preferable. Oligoclonal antibodies (mixtures of several to dozens of antibodies) and polyclonal antibodies can also be used as long as the SWI / SNF complex factor protein can be detected with sufficient specificity. Also, functional fragments of antibodies such as Fab, Fab', F (ab') 2 , Fv, scFv, sc (Fv) 2 , dsFv, and diabodies and their multimers (eg, dimers, trimmers, tetramers, etc.) Polymer) can also be used.
  • the anti-SWI / SNF complex factor protein antibody may be a commercially available product.
  • Detection of SWI / SNF complex factor proteins can also be performed using mass spectrometry (MS).
  • MS mass spectrometry
  • analysis by a mass spectrometer (LC / MS) linked with liquid chromatography is advantageous because it is sensitive.
  • LC / MS mass spectrometer
  • As a detection method by mass spectrometry in the method of detecting the expression level of GPX4 at the translation level, the same method as the method mentioned as the detection method by mass spectrometry is appropriately adjusted according to the SWI / SNF complex factor protein. Can be adopted.
  • Decreased expression of SWI / SNF complex factor usually means that the expression level is lower than that of a control (for example, the expression level in a non-cancer tissue of a healthy person or the same patient). ..
  • Examples of the method for detecting "decreased expression of SWI / SNF complex factor” include a method in which the expression level of SWI / SNF complex factor is detected at the transcription level or the translation level and compared with the control.
  • RNA or cDNA is prepared from a biological sample by the above method.
  • the oligonucleotide primer or oligonucleotide probe is then used in the amplification reaction or hybridization reaction, respectively, to detect the amplification product or hybrid product thereof.
  • a method similar to the method described in the method for detecting the expression level of GPX4 at the transcription level can be appropriately adopted after adjusting for the SWI / SNF complex factor.
  • a protein sample is prepared from a biological sample.
  • an antigen-antibody reaction is carried out using an antibody specific for the SWI / SNF complex factor protein to detect the SWI / SNF complex factor protein.
  • the protein detection method using such an antibody is as described in the above-mentioned SWI / SNF complex factor protein detection method.
  • the detection of SWI / SNF complex factor protein can also be performed by using mass spectrometry (MS).
  • MS mass spectrometry
  • the detection method by such mass spectrometry is as described in the above-mentioned method for detecting SWI / SNF complex factor protein.
  • a method of directly detecting a change in the base sequence after bisulfite treatment having an activity of converting methylated cytosine into uracil by base sequence determination or a method before bisulfite treatment
  • a known method such as a method of indirectly detecting using a restriction endonuclease that can recognize (cleave) the base sequence of but cannot recognize (cannot cleave) the base sequence after bisulfite treatment can be used.
  • the biological sample is a cancer cell
  • the cancer cell is susceptible to a GPX4 inhibitor.
  • the biological sample is a cancer cell contained in a sample derived from a cancer patient, the cancer patient in which the mutation is detected in the cancer cell is selected.
  • sensitivity to GPX4 inhibitor and “sensitivity to treatment with GPX4 inhibitor” are indexes indicating whether or not the GPX4 inhibitor can exert a therapeutic effect on cancer cells.
  • the susceptibility includes that the GPX4 inhibitor promotes the death of the cancer cells and suppresses the growth of the cancer cells.
  • the evaluation of whether or not the susceptibility can be expected and the evaluation of the degree of susceptibility (for example, high susceptibility can be expected, moderate susceptibility is expected). Evaluation of possible etc.) is included. Therefore, depending on the type and degree of functional suppression of the SWI / SNF complex factor, for example, patients to be treated for cancer may be selected at a level at which moderate susceptibility can be expected.
  • the patient can be excluded from the target of cancer treatment with the GPX4 inhibitor. This can improve the response rate of treatment.
  • GPX4 Furthermore, if GPX4, which is the target of the GPX4 inhibitor according to the present invention, is not normally expressed, cancer treatment with the GPX4 inhibitor may not be effectively performed. Therefore, in the cancer cell susceptibility prediction method, the cancer patient susceptibility prediction method, and the cancer patient selection method, the detection of mutation and expression reduction of the GPX4 gene can be further added to the index.
  • a method for detecting mutations in the GPX4 gene a method similar to the method described as the method for "detection of mutations in the SWI / SNF complex factor gene" shall be appropriately adopted after adjusting for the mutation in the GPX4 gene. Can be done. Further, the method for detecting the decrease in the expression of GPX4 is as described above.
  • the present invention Suppresses proliferation of cancer cells in which suppression of SWI / SNF complex factor function is detected, including a step of contacting a GPX4 inhibitor with cancer cells in which suppression of SWI / SNF complex factor function is detected.
  • Method hereinafter, sometimes referred to as "cancer cell proliferation suppression method"
  • a step of detecting the presence or absence of functional suppression of the SWI / SNF complex factor in cancer cells contained in a sample derived from a cancer patient and
  • B A step of administering a GPX4 inhibitor to a cancer patient in which functional suppression of the SWI / SNF complex factor is detected in the cancer cells.
  • methods of treating cancer including, as used herein, sometimes referred to as "cancer treatment methods”.
  • the detection of functional suppression of SWI / SNF complex factor and the GPX4 inhibitor are as described above.
  • Suppression of the growth of the cancer cells includes promotion of the death of the cancer cells and suppression of the growth of the cancer cells.
  • the method of bringing the GPX4 inhibitor into contact with the cancer cells is not particularly limited, and examples thereof include a method of adding the GPX4 inhibitor to the culture medium of the cancer cells.
  • the amount of the GPX4 inhibitor that comes into contact with the cancer cells may be an amount effective for inhibiting GPX4 and suppressing the growth of the cancer cells, and the properties of the compound that inhibits GPX4 and the cancer cells It is appropriately selected according to the type and the like.
  • the administration of the GPX4 inhibitor to the cancer patient may be oral administration or parenteral administration (for example, intravenous administration, arterial administration, local administration).
  • the dose of the GPX4 inhibitor to the cancer patient may be an amount effective for inhibiting GPX4 and treating the cancer, and the nature of the compound that inhibits GPX4, the age and weight of the cancer patient, and the like. It cannot be said unconditionally because it is appropriately selected according to the symptom, health condition, cancer progress, etc.
  • the amount of the compound that inhibits GPX4 is used per day. It is 0.001 to 100,000 mg, preferably 0.01 to 5,000 mg.
  • the frequency of administration of the GPX4 inhibitor to cancer patients cannot be unconditionally determined, but for example, it is preferably administered once a day or divided into 2 to 4 times, and repeated at appropriate intervals. The dose and frequency of administration may be appropriately increased or decreased as necessary at the discretion of the doctor.
  • GPX4 is further inhibited in cancer cells having suppression of SWI / SNF complex factor function in cancer patients, and cancer is treated by promoting the death of cancer cells and / or suppressing their growth. Can be done.
  • the cancers to be treated are not particularly limited, and include, for example, lung cancer, ovarian cancer, uterine cancer, liver cancer, gastric cancer, esophageal cancer, colon cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, and bladder. And at least one selected from the group consisting of kidney cancer, among these, at least one selected from the group consisting of lung cancer, ovarian cancer, liver cancer, gastric cancer, and pancreatic cancer. Is preferable.
  • the present invention is a reagent for detecting the presence or absence of functional suppression of the SWI / SNF complex factor in the above method.
  • Oligonucleotide primers that specifically bind to the SWI / SNF complex factor gene
  • an oligonucleotide probe that specifically binds to the SWI / SNF complex factor gene
  • an antibody that specifically binds to the SWI / SNF complex factor protein.
  • a reagent containing any one of the molecules as an active ingredient is provided.
  • the oligonucleotide primer is based on the nucleotide sequence information of the genomic DNA or cDNA of the SWI / SNF complex factor (for example, Tables 1 to 3) so as to be a primer suitable for the above method and the region to be amplified. It may be designed so that amplification products of genes other than the SWI / SNF complex factor gene are not generated as much as possible. Such an oligonucleotide primer design can be carried out by a person skilled in the art by a conventional method.
  • the length of the oligonucleotide primer is usually 15 to 50 bases, preferably 15 to 30 bases, but may be longer or shorter depending on the method and purpose.
  • the oligonucleotide probe is based on the nucleotide sequence information of the genomic DNA and cDNA of the SWI / SNF complex factor (for example, Tables 1 to 3) so as to be a probe suitable for the above method and the region to be hybridized.
  • the SWI / SNF complex factor may be designed so as not to hybridize to a gene other than the gene as much as possible.
  • Such an oligonucleotide probe design can be carried out by a person skilled in the art by a conventional method.
  • the length of the oligonucleotide probe is usually 15 to 200 bases, preferably 15 to 100 bases, more preferably 15 to 50 bases, but may be longer or shorter depending on the method and purpose. ..
  • the oligonucleotide probe is appropriately labeled and used.
  • a labeling method a method of labeling the 5'end of the oligonucleotide by phosphorylating it with 32P using T4 polynucleotide kinase, and a method of labeling by phosphorylating the 5'end of the oligonucleotide with 32P, and using a DNA polymerase such as Klenow enzyme, and using a random hexamer oligonucleotide or the like as a primer.
  • a method of incorporating a substrate base labeled with an isotope such as 32P, a fluorescent dye, or biotin (random prime method or the like) can be exemplified.
  • oligonucleotide primers and oligonucleotide probes can be produced, for example, by a commercially available oligonucleotide synthesizer.
  • the oligonucleotide probe can also be prepared as a double-stranded DNA fragment obtained by restriction enzyme treatment or the like.
  • the oligonucleotide primer and the oligonucleotide probe of the present invention do not have to be composed only of natural nucleotides (deoxyribonucleotide (DNA) and ribonucleotide (RNA)), and are partially or part of non-natural nucleotides. All may be configured.
  • Non-natural nucleotides include PNA (polyamide nucleic acid), LNA (registered trademark, locked nucleic acid), ENA (registered trademark, 2'-O, 4'-C-Ethylene-bridged nucleic acids), and these. Examples include complexes.
  • the antibody that specifically binds to the SWI / SNF complex factor protein is a polyclonal antibody, it immunizes an immune animal with an antigen (SWI / SNF complex factor protein, a partial peptide thereof, or a cell expressing these). Then, the antiserum can be purified and obtained by conventional means (for example, salting out, centrifugation, dialysis, column chromatography, etc.). In addition, the monoclonal antibody can be produced by a hybridoma method or a recombinant DNA method.
  • the hybridoma method include a caller and Milstein method (Kohler & Milstein, Nature 1975; 256: 495).
  • the antibody-producing cells used in the cell fusion step in this method are animals (eg, mice, rats, hamsters, etc.) immunized with an antigen (such as a SWI / SNF complex factor protein, a partial peptide thereof, or cells expressing them).
  • an antigen such as a SWI / SNF complex factor protein, a partial peptide thereof, or cells expressing them.
  • Rabbit, monkey, goat spleen cells, lymph node cells, peripheral blood leukocytes, etc. It is also possible to use antibody-producing cells obtained by allowing an antigen to act on the above-mentioned cells or lymphocytes previously isolated from a non-immunized animal in a medium.
  • myeloma cells can be used as myeloma cells.
  • the antibody-producing cells and myeloma cells may be of different animal species origin, as long as they can be fused, but are preferably of the same animal species origin.
  • Hybridomas are produced, for example, by cell fusion between spleen cells obtained from antigen-immunized mice and mouse myeloma cells, and are subsequently screened for SWI / SNF complex factor protein-specific monoclonal antibodies.
  • a hybridoma that produces the above can be obtained.
  • Monoclonal antibodies to the SWI / SNF complex factor protein can be obtained by culturing hybridomas or from the ascites of mammals to which the hybridomas have been administered.
  • the DNA encoding the above antibody is cloned from a hybridoma, B cell, etc., incorporated into an appropriate vector, and this is incorporated into a host cell (for example, mammalian cell line, Escherichia coli, yeast cell, insect cell, plant cell, etc.). ), And the antibody of the present invention is produced as a recombinant antibody (for example, PJ Delves, Antibody Production: Essential Technologies, 1997 WILEY, P. Shepherd and C. Dean Monoclonal IV PRESS, Vandamme AM et al., Eur. J. Biochem. 1990; 192: 767-775).
  • a host cell for example, mammalian cell line, Escherichia coli, yeast cell, insect cell, plant cell, etc.
  • the antibody of the present invention is produced as a recombinant antibody (for example, PJ Delves, Antibody Production: Essential Technologies, 1997 WILEY, P. Shepherd and C. Dean Monoclonal IV PRESS, Vandam
  • the DNA encoding the heavy chain or the light chain may be separately incorporated into the expression vector to transform the host cell, and the DNA encoding the heavy chain and the light chain may be single.
  • the host cell may be transformed by incorporating it into an expression vector (WO94 / 11523, etc.).
  • the antibody can be obtained in a substantially pure and uniform form by culturing the host cell, separating and purifying it in the host cell or from the culture solution. For the separation and purification of the antibody, the method used in the usual purification of a polypeptide can be used.
  • transgenic animal such as a cow, goat, sheep or pig
  • a transgenic animal production technique a large amount of monoclonal antibody derived from the antibody gene can be obtained from the milk of the transgenic animal. It is also possible to obtain it.
  • the obtained anti-SWI / SNF complex factor protein antibody can be directly obtained from an enzyme, a radioisotope, a fluorescent dye, an avidin-biotin system, or the like. Used by labeling with.
  • the obtained anti-SWI / SNF complex factor protein antibody (primary antibody) is used. ) Does not need to be labeled, and a labeled molecule (for example, secondary antibody or protein A) that recognizes the antibody may be used for detection.
  • the reagent of the present invention can contain other components permitted as a reagent, such as sterilized water, physiological saline, a buffer, and a preservative, if necessary.
  • the present invention A method for screening a compound used for the treatment of cancer including cancer cells in which suppression of the function of SWI / SNF complex factor is detected, which comprises a step of selecting a compound based on whether or not it inhibits GPX4 (hereinafter, case). Also provided (referred to as "compound screening method").
  • a cancer therapeutic agent which contains a compound that inhibits GPX4 as an active ingredient and is a therapeutic agent for cancer containing cancer cells in which functional suppression of SWI / SNF complex factor is detected.
  • the test compound applied to the method for screening a compound of the present invention is not particularly limited, and for example, at least one selected from the group consisting of compound molecules, polypeptides, and polynucleotides listed as compounds that inhibit GPX4 described above. Can be mentioned. More specifically, as the test compound, for example, a synthetic low molecular weight compound library, an expression product of a gene library, a peptide library, siRNA, an antibody, a bacterial release substance, a cell (microorganism, plant cell, animal cell). ) Extracts and culture supernatants, purified or partially purified polypeptides, extracts from marine organisms, plants or animals, random phage peptide display libraries. In addition, the test compound may be a derivative of a known GPX4 inhibitor.
  • the test compound In the method (screening) of selecting a compound using whether or not it inhibits GPX4 as an index, the test compound is allowed to act on the above-mentioned confirmation system for inhibiting the activity or expression of GPX4, and the subsequent GPX4 activity or expression is detected. do it. As a result of the detection, if the activity or expression is decreased as compared with the GPX4 activity or expression in the control (for example, when the test compound is not added), it can be evaluated that GPX4 is inhibited.
  • the compound identified by the compound screening method of the present invention is appropriately mixed with the additive components listed in the above-mentioned GPX inhibitor, which is pharmacologically acceptable, and formulated by a known pharmaceutical method to obtain a pharmaceutical product.
  • a cancer therapeutic agent As a cancer therapeutic agent. In particular, it is effective for cancers containing cancer cells in which suppression of SWI / SNF complex factor function is detected, and for treating cancer patients in which suppression of SWI / SNF complex factor function is detected and / or It can be a therapeutic agent for administration to the patient.
  • NCI-H23, NCI-H522, SBC-5, SK-HEP-1, and SNU-1327 are human cancer cell lines having a shortened deletion mutation in the SMARCA4 gene.
  • NCI-H1703 is a human cancer cell line with a mutation in the splicing site of the SMARCA4 gene.
  • NCI-H1703, NCI-H23, NCI-H522, SBC-5, SK-HEP-1, and NCI-H838 are human cancer cell lines in which expression of SMARCA4 protein is not detected by immunoblot analysis.
  • NCI-H1703, NCI-H23, NCI-H522, and SBC-5 are human cancer cell lines in which the SMARCA2 protein is not detected by immunoblot analysis.
  • B1203L, OVISE, and TOV-21G are human cancer cell lines having a shortened deletion mutation in the ARID1A gene
  • B1203L is a human cancer cell line having a shortened deficiency mutation in the ARID2 gene.
  • NCI-H838 is a human cancer cell line having a shortened deficient mutation in the BCL11B gene.
  • NCI-H358, NCI-H2122, NCI-H2110, NCI-H1792, NCI-H1437, MOR, COV362, and MKN-45 are SWI / SNF complex factor gene function-deficient mutations and protein expression. This is a human cancer cell line for which no information has been published.
  • siRNA buffer (Dharmacon: B-20200-UB-100) was dissolved using a 1 ⁇ siRNA buffer diluted 5-fold with nucleose free water (Ambion: AM9932). ..
  • GPX4 expression suppression test In each cancer cell line shown in Table 4 of (1) above, the cell proliferation inhibitory activity by suppressing the expression of GPX4 was evaluated. Each cell line was seeded on a 96-well plate (manufactured by Greener bio-one) at 100 ⁇ L / well so as to have the seeding number (1) or seeding number (2) shown in Table 5 below.
  • GPX4 siRNA # 1, # 2, # 3
  • negative control ON-TARGET plus Non-targeting Control
  • PLK1 siRNA positive control
  • Each siRNA had a final concentration of 0.1 to 10 nM, and Lipofectamine RNAiMAX (manufactured by Thermo Fisher Scientific, product code: 13778150) was used for transfection. After culturing for 7 days, intracellular ATP, which is a marker of cell survival, was measured using CellTiter-Glo2.0 Cell Viability Assay (manufactured by Promega). The cell proliferation inhibition rate when the expression of GPX4 was suppressed was 0% and 100%, respectively, the values after transfection of the negative control and culture for 7 days and the values after transfection of the positive control and culture for 7 days, respectively. Calculated as.
  • the proliferation inhibition rate (CGI (%)) is shown in FIG.
  • GPX4 siRNA # 2 was used in each cell line (including lung cancer cell line, ovarian cancer cell line, liver cancer cell line, and gastric cancer cell line) shown in Table 4, which was tested at a different time from FIG.
  • the cell proliferation inhibition rate (CGI (%)) when the expression of GPX4 was suppressed is shown in FIG. 2
  • the cell proliferation inhibition rate (CGI (%)) when the expression of GPX4 was suppressed by GPX4 siRNA # 3 is shown in FIG. , Each shown.
  • the GPX4 inhibitor is a small molecule GPX4 inhibitor ML210 (CAS No .: 136705-96-9), which has been reported to be a compound that inhibits the enzymatic activity of GPX4:
  • each of these compounds was added, and each cell line was seeded at 100 ⁇ L / well so as to have the seeding number (2) shown in Table 5 below.
  • intracellular ATP which is a marker of cell survival
  • DMSO Dimethyl sulfoxide
  • the cell viability was calculated with the intracellular ATP amount in each cancer cell line after culturing for 7 days as 100%.
  • An IC50 (50% Inhibition Concentration ( ⁇ M)) was calculated from the cell survival curve obtained from the concentration of each compound and the cell survival rate.
  • FIG. 4 shows the IC50 ( ⁇ M) in each cell line when ML210 was used as the GPX4 inhibitor
  • FIG. 5 shows the IC50 ( ⁇ M) in each cell line when RSL3 was used as the GPX4 inhibitor.
  • siRNA had a final concentration of 5 nM or 10 nM, and Lipofectamine RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific product code: 13778150) was used for transfection. After culturing for 7 days, intracellular ATP, which is a marker of cell survival, was measured using CellTiter-Glo2.0 Cell Viability Assay (manufactured by Promega).
  • the cell proliferation inhibition rate when the expression of each GPX family protein was suppressed was 0%, the value after transfection of the negative control for 7 days and the value after culturing the positive control for 7 days, respectively. And calculated as 100%.
  • FIG. 6 shows the cell proliferation inhibition rate (CGI (%)) when the expression of each GPX family protein in each of the NCI-H2110, NCI-H522, and NCI-H23 cell lines was suppressed.
  • siRNA had a final concentration of 5 nM, and Lipofectamine RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific product code: 13778150) was used for transfection. After culturing for 7 days, intracellular ATP, which is a marker of cell survival, was measured using CellTiter-Glo2.0 Cell Viability Assay (manufactured by Promega).
  • FIG. 7 shows the cell proliferation inhibition rate (CGI (%)) when the expression of each glutathione synthesis-involved protein in each cell line of NCI-H2110, NCI-H522, and NCI-H23 was suppressed.
  • Table 5 shows the number of seeds of each cell line in each test, and the culture medium and source of each cell line.
  • Table 6 shows the sequence number indicating the sequence of each siRNA, and the ID (GENE ID), reference ID (NCBI reference ID), and GI Number in the NCBI RefSeq database of the gene whose expression is suppressed by each siRNA. ..
  • GPX4 activity inhibition test 2 (comparative test with GCLC inhibitor)
  • the cell proliferation inhibitory activity by the GPX4 inhibitor was evaluated.
  • the GPX4 inhibitor the above-mentioned ML210 or RSL3 was used.
  • BSO butionine sulfoximine
  • GCL catalytic subunit of glutamate-cysteine ligase
  • FIG. 8 shows IC50s ( ⁇ M) in each cell line of MOR, NCI-H358, NCI-H23, and NCI-H522 when ML210, RSL3, or BSO was used.
  • SK-HEP-1 a function-suppressing human cancer cell line (SK-HEP-1 cancer-bearing mouse). Specifically, first, SK-HEP-1 was cultured in vitro, and on the day of transplantation to mice, 2.5 g / L-Tripsin / 1 mmol-EDTA Solution (manufactured by Nacalai Tesque, product code: 35554-64).
  • mice SK-HEP-1 cancer-bearing mice
  • 10% Dimethyl suspension manufactured by Wako, product code: 043-
  • 07216 10% Cremophor
  • 15% Polyethylene Glycol 400 manufactured by Wako, product code: 161-09065
  • ML210 is suspended at a predetermined concentration in a mixed solution of product code: 7585-39-9) once a day in a predetermined volume (20 mL / kg), and the dose is 100 mg / day.
  • ML210 was orally administered so as to be kg.
  • the administration of ML210 was started on the 11th day, with the transplantation date of SK-HEP-1 as the 0th day, and the tumor volume was measured on the 11th, 14th, and 18th days.
  • the volume of the tumor was measured by measuring the minor axis and the major axis of the tumor using an electronic caliper (manufactured by Mitutoyo, product code: CD-15AX), and each was calculated by the least squares method.
  • the transplantation date of SK-HEP-1 was set to 0 day, and the administration of Vehicle was performed on the 11th day. Tumor volume was measured on days 11, 14, and 18 after the start. Tumor volume in the group of SK-HEP-1 cancer-bearing mice to which ML210 was administered (ML210) or the group of SK-HEP-1 cancer-bearing mice to which the mixed solution was administered (Vehicle: no administration of ML210).
  • the relationship between this and the time after SK-HEP-1 transplantation is shown in FIG.
  • GPX4 expression suppression test As shown in FIG. 1, in the GPX4 expression suppression test, the gene of SMARCA4, which is a SWI / SNF complex factor, has a deletion mutation and / or SMARCA4 by immunoblot analysis. In the cancer cell line in which the protein was not detected, the cell proliferation inhibition rate was 90% or more, and remarkable cell proliferation inhibition was observed. Further, as shown in FIGS. 2 and 3, in addition to SMARCA4, at least one gene of another SWI / SNF complex factor (for example, SMARCA2, ARID1A, ARID1B, ARID2, BCL11B) is mutated with a defect.
  • SWI / SNF complex factor for example, SMARCA2, ARID1A, ARID1B, ARID2, BCL11B
  • GPX4 activity inhibition test 1 Further, as shown in FIGS. 4 and 5, in the activity inhibition test 1 of GPX4, at least one of the genes of the SWI / SNF complex factor (for example, SMARCA4, SMARCA2, ARID1A, ARID1B, ARID2, BCL11B) was deleted. Suppression of SWI / SNF complex factor when GPX4 inhibitor is added to cancer cell lines that have mutations and / or expression of at least one of these factors is not detected by immunoblot analysis. Significant inhibition of cell proliferation was observed as compared with the cell line in which
  • GPX4 activity inhibition test 2 comparative test with GCLC inhibitor
  • GPX4 activity inhibition test 2 comparative test with GCLC inhibitor
  • FIG. 8 shows that in the activity inhibition test 2 of GPX4, a cancer cell line having a deletion mutation in the gene of SMARCA4 which is a SWI / SNF complex factor and / or not detecting SMARCA4 protein by immunoblot analysis.
  • BSO which is a GCLC inhibitor. From this result as well, it is effective to inhibit GPX4 in order to obtain antitumor activity against cancer cells in which the function of SWI / SNF complex factor (for example, SMARCA4) is suppressed.
  • SWI / SNF complex factor for example, SMARCA4
  • the GPX4 inhibitor has a defective mutation in the gene of SMARCA4, which is a SWI / SNF complex factor, and / or Antitumor activity was also shown in vivo against cancers (tumors) including cancer cells in which SMARCA4 protein was not detected by immunoblot analysis (SMARCA4 function-suppressing cancer cells).
  • SMARCA4 function-suppressing cancer cells Specifically, in the group in which ML210 was administered to SK-HEP-1 cancer-bearing mice, the increase in tumor volume was suppressed and remarkable antitumor activity was observed as compared with the group in which Vehicle was administered. It was.
  • the present invention it is possible to efficiently predict the susceptibility to cancer treatment by a GPX4 inhibitor by using the functional suppression of the SWI / SNF complex factor as an index. Further, according to the present invention, the presence or absence of functional suppression of the SWI / SNF complex factor in a sample derived from a cancer patient is detected, the patient in which the mutation is detected is selected, and then GPX4 inhibition is performed on the patient. Cancer can be treated with drugs. Therefore, it is possible to greatly improve the treatment results of cancer.
  • companion diagnosis can be made more efficient by detecting the presence or absence of functional suppression of the SWI / SNF complex factor. It becomes possible to do it in a targeted manner.
  • SEQ ID NO: 2 ⁇ 223> Xaa represents selenocysteine SEQ ID NO: 59 ⁇ 223> PLK1 SEQ ID NO: 60 ⁇ 223> ON-TARGETplus Non-targeting Control SEQ ID NO: 61 ⁇ 223> GPX1 siRNA # 1 SEQ ID NO: 62 ⁇ 223> GPX1 siRNA # 2 SEQ ID NO: 63 ⁇ 223> GPX2 siRNA # 1 SEQ ID NO: 64 ⁇ 223> GPX2 siRNA # 2 SEQ ID NO: 65 ⁇ 223> GPX3 siRNA # 1 SEQ ID NO: 66 ⁇ 223> GPX3 siRNA # 2 SEQ ID NO: 67 ⁇ 223> GPX4 siRNA # 1 SEQ ID NO: 68 ⁇ 223> GPX4 siRNA # 2 SEQ ID NO: 69 ⁇ 223> GPX5 siRNA # 1 SEQ ID NO: 70 ⁇ 223> GPX5 siRNA

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Abstract

ＧＰＸ４を阻害する化合物を有効成分として含有し、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制が検出されるがん細胞を含むがん治療剤、並びに、がん細胞のＧＰＸ４阻害剤に対する感受性を予測する方法であり、がん細胞におけるＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制が検出されたがん細胞をＧＰＸ４阻害剤に対して感受性があると予測する工程を含む方法。

Description

ＧＰＸ４阻害剤に対するがん細胞の感受性を予測する方法
　本発明は、ＧＰＸ４阻害剤に対するがん細胞の感受性を予測する方法に関する。また本発明は、ＧＰＸ４阻害剤による治療に対するがん患者の感受性を予測する方法、ＧＰＸ４阻害剤によるがん治療の対象とするがん患者を選別する方法、がん細胞の増殖を抑制する方法、がんの治療方法、がんの治療に用いる化合物のスクリーニング方法、及びがん治療剤に関する。
　近年、ゲノムシークエンス技術の急速な進歩によって、がん細胞における固有の遺伝子変異を含むゲノム情報を解読することが可能となっている。その中で、抗がん剤開発では、ＥＧＦＲ遺伝子変異、ＢＲＡＦ遺伝子変異、ＡＬＫ融合遺伝子、ＲＯＳ１融合遺伝子等に代表されるような、機能獲得型の遺伝子変異が生じたがん細胞に特異的に、その機能を阻害する阻害剤の創薬がなされている（非特許文献１～３等）。これらの遺伝子変異を有するがん細胞を標的とする、同がん細胞に特異的な治療方法は、がんへの選択性が高く、効果の高い治療方法として期待されている。
　一方で、ヒトのがん細胞で発見される遺伝子変異には、上記の機能獲得型のみならず、逆に機能欠失型の遺伝子変異も含まれる。機能欠失型の遺伝子変異は、その遺伝子変異特異的な創薬が困難であり、機能獲得型の遺伝子変異を有するがん細胞を標的とする治療とは異なる治療戦略が必要である。
　ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体は、１２～１５個のサブユニット（複合体因子）より構成されるクロマチンリモデリング因子である。近年、多くのヒトがんでＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能欠失型の遺伝子変異や発現抑制といった機能抑制が観察されることが報告されており、腫瘍発生や進行への関与が注目されている。これらの変異によって、ヌクレオソームに格納されたＤＮＡの解離、及び転写因子やヒストン脱アセチル化酵素をはじめとする転写調節因子のＤＮＡへのリクルートといった、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体の重要な機能が妨げられると考えられるため、かかる機能抑制とがんの発生や進行との間には重要な関係があると推察され、研究がなされている。
　例えば、非特許文献４には、非小細胞肺がんにおいて、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子であるＳＭＡＲＣＡ４の欠損がＣＤＫ４／６阻害剤と合成致死関係にあることが記載されており、非特許文献５には、ＳＭＡＲＣＡ４が欠損した肺がんが、ＯＸＰＨＯＳ（ミトコンドリアの酸化的リン酸化）阻害剤に対する感受性を増加させたことが記載されており、非特許文献６には、非小細胞肺がんにおけるＳＭＡＲＣＡ４の遺伝子の変異が、Ａｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤に対する感受性を増加させたことが記載されており、非特許文献７には、同じくＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子であるＡＲＩＤ１Ａの遺伝子の変異がＧＳＨ合成阻害剤と合成致死関係にあることが記載されている。
　しかしながら、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体の機能抑制が生じているがん細胞を特異的に標的とする治療戦略は未だ十分ではない。
Ｍａｋｏｔｏ　Ｍａｅｍｏｎｄｏら，ＮＥＪＭ　２０１０　Ｊｕｎ　２４；３６２（２５），ｐ．２３８０－２３８８ Ｐａｕｌ　Ｂ．Ｃｈａｐｍａｎら，ＮＥＪＭ　２０１１　Ｊｕｎ　３０；３６４（２６），ｐ．２５０７－２５１６ Ｄ．Ｒｏｓｓ　Ｃａｍｉｄｇｅら，Ｊ　Ｔｈｏｒａｃ　Ｏｎｃｏｌ．２０１９　Ｊｕｌ；１４（７），ｐ．１２３３－１２４３ Ｙｉｂｏ　Ｘｕｅら，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．１０：５５７，２０１９ Ｙｏｎａｔｈａｎ　Ｌｉｓｓａｎｕ　Ｄｅｒｉｂｅら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．Ｖｏｌ　２４，Ｊｕｌｙ　２０１８，ｐ．１０４７－１０５７ Ｖｕｒａｌ　Ｔａｇａｌら，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．８：１４０９８，２０１７ Ｈｉｄｅａｋｉ　Ｏｇｉｗａｒａら，２０１９，Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｅｌｌ　３５，ｐ．１７７－１９０
　本発明は上記状況に鑑みてなされたものである。本発明は、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体の機能抑制が生じているがん細胞を特異的に標的とすることが可能な治療戦略の開発を目的とするものであり、より具体的には、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制が検出されるがん細胞を特異的に標的とする治療戦略の開発を目的とするものである。
　本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制が検出されるがん細胞において、ＧＰＸ４の発現抑制や機能阻害を行うと、当該がん細胞の増殖が顕著に抑制及び／又は細胞死が誘導される一方、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制が生じていない細胞においては、このような増殖抑制及び／又は細胞死が生じないことを見出した。
　より具体的に、本発明者らは、ヒトがん細胞株に対する網羅的なノックダウン実験を行い、どのタンパク質の機能抑制をする薬剤がＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制を生じているヒトがん細胞に対する抗腫瘍活性につながるか、鋭意検討した。その結果、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体のコアコンポーネントであるＳＭＡＲＣＡ４の遺伝子に欠損型の変異を有する、及び／又は、ＳＭＡＲＣＡ４タンパク質の発現が検出されないがん細胞株において、ＧＰＸ４の発現を抑制すると、当該がん細胞の細胞死を誘導し、細胞増殖が顕著に抑制されることを見出した。
　また、本発明者らは、ＧＰＸ４の酵素活性を阻害することが報告されている化合物（例えば、ＭＬ２１０、ＲＳＬ３）を用いてＧＰＸ４の活性阻害を行った場合にも、ＧＰＸ４の発現を抑制した場合と同様に、ＳＭＡＲＣＡ４の機能抑制が生じているがん細胞の細胞死を誘導し、細胞増殖が顕著に抑制されることを見出した。
　さらに、ＧＰＸファミリーに属する分子として、ヒトではＧＰＸ１、ＧＰＸ２、ＧＰＸ３、ＧＰＸ４、ＧＰＸ５、ＧＰＸ６、ＧＰＸ７、ＧＰＸ８の８種類が報告されているが、本発明者らはその中でも、特にＧＰＸ４の阻害がＳＭＡＲＣＡ４の機能抑制が生じているがん細胞に対して特異的に抗腫瘍活性を示すことを見出した。
　一方で、ＳＭＡＲＣＡ４はＳＷＩ／ＳＮＦ複合体を構成するタンパク質であることから、ＧＰＸ４はＳＷＩ／ＳＮＦ複合体を構成する他のタンパク質の機能抑制が生じている細胞に対しても有効である可能性が考えられた。そこでＳＭＡＲＣＡ４に加え、他のＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子（例えば、ＳＭＡＲＣＡ２、ＡＲＩＤ１Ａ、ＡＲＩＤ１Ｂ、ＡＲＩＤ２、ＢＣＬ１１Ｂ）に機能抑制が生じているがん細胞株を用いて、ＧＰＸ４の発現抑制及び／又は活性阻害による抗腫瘍活性の評価を行ったところ、ＳＭＡＲＣＡ４の機能抑制が生じているがん細胞株と同様に、他のＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子に機能抑制が生じているがん細胞株においても、ＧＰＸ４の阻害によって顕著に細胞増殖抑制や細胞死が観察されることを見出した。
　また、ＧＰＸ４は細胞内のグルタチオンを消費して加水分解を行う酵素であることから、他のグルタチオン合成に関与する因子群（タンパク質）も、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制が生じているがん細胞に対して抗腫瘍活性を示す可能性が考えられた。しかしながら、他のグルタチオン合成に関連する因子群（例えば、ｇａｍｍａ－ｇｌｕｔａｍｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ　ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（ＧＣＬＣ）、ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（ＧＳＳ）、Ｇｌｕｔａｍａｔｅ－Ｃｙｓｔｅｉｎｅ　Ｌｉｇａｓｅ　Ｍｏｄｉｆｉｅｒ　Ｓｕｂｕｎｉｔ（ＧＣＬＭ）、Ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ　Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　Ｓ－Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　１（ＭＧＳＴ１）、Ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ　Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　Ｓ－Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　３（ＭＧＳＴ３）、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ－Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ　Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ（ＧＳＲ）、ｇｌｕｃｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（Ｇ６ＰＤ））を阻害しても、ＧＰＸ４の阻害に比較して十分な抗腫瘍活性は得られず、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制が生じているがん細胞を標的とした抗腫瘍活性を得るためには、特にＧＰＸ４を阻害することが重要であることが明らかとなった。
　さらに、本発明者らは、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制が生じているがん細胞を移植した担癌マウスにおいては、ＧＰＸ４の酵素活性を阻害することが報告されている化合物（ＧＰＸ４阻害剤）の投与によって腫瘍の体積の増大が顕著に抑制され、ＧＰＸ４の阻害がｉｎ　ｖｉｖｏでも確かに抗腫瘍効果を示すことを明らかにした。
　そのため、本発明者らは、ＧＰＸ４を阻害（発現抑制や活性阻害）する治療が、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制が生じているがん細胞を標的とする治療のための有望なアプローチとなることを見出した。また、この治療戦略においては、がん患者をＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制を指標に選別した上で、ＧＰＸ４阻害剤を投与できるため、コンパニオン診断に基づく効率的な治療が可能であることも明らかとなった。
　さらに、本発明者らは、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制型がんの治療に有用な薬剤のスクリーニングを、ＧＰＸ４を阻害するか否かを指標に行うことができることをも見出し、本発明を完成するに至った。
　したがって、本発明は、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制が生じているがん細胞を特異的に標的とする治療方法及び当該治療方法のためのコンパニオン診断に関するものであり、より詳しくは、以下の発明を提供するものである。
　［１］
　ＧＰＸ４を阻害する化合物を有効成分として含有し、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制が検出されるがん細胞を含むがんの治療剤である、がん治療剤。
　［２］
　ＧＰＸ４を阻害する化合物を有効成分として含有し、がん患者由来の試料に含まれるがん細胞においてＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制が検出されるがん患者を治療するための治療剤である、がん治療剤。
　［３］
　ＧＰＸ４を阻害する化合物を有効成分として含有し、がん患者由来の試料に含まれるがん細胞においてＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制が検出されるがん患者に投与するための治療剤である、がん治療剤。
　［４］
　がん細胞の、ＧＰＸ４阻害剤に対する感受性を予測する方法であり、
　がん細胞におけるＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制が検出されたがん細胞を、ＧＰＸ４阻害剤に対して感受性があると予測する工程、
を含む、方法。
　［５］
　がん細胞の、ＧＰＸ４阻害剤に対する感受性を予測する方法であり、
　（ａ）がん細胞におけるＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制の有無を検出する工程と、
　（ｂ）前記ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制が検出されたがん細胞を、ＧＰＸ４阻害剤に対して感受性があると予測する工程と、
を含む、方法。
　［６］
　がん患者の、ＧＰＸ４阻害剤による治療に対する感受性を予測する方法であり、
　がん患者由来の試料に含まれるがん細胞においてＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制が検出されたがん患者を、ＧＰＸ４阻害剤による治療に対して感受性があると予測する工程、
を含む、方法。
　［７］
　がん患者の、ＧＰＸ４阻害剤による治療に対する感受性を予測する方法であり、
　（ａ）がん患者由来の試料に含まれるがん細胞におけるＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制の有無を検出する工程と、
　（ｂ）前記がん細胞において前記ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制が検出されたがん患者を、ＧＰＸ４阻害剤による治療に対して感受性があると予測する工程と、
を含む、方法。
　［８］
　ＧＰＸ４阻害剤によるがん治療の対象とするがん患者を選別する方法であり、
　がん患者由来の試料に含まれるがん細胞においてＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制が検出されたがん患者を、ＧＰＸ４阻害剤によるがん治療の対象として選別する工程、
を含む、方法。
　［９］
　ＧＰＸ４阻害剤によるがん治療の対象とするがん患者を選別する方法であり、
　（ａ）がん患者由来の試料に含まれるがん細胞におけるＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制の有無を検出する工程と、
　（ｂ）前記がん細胞において前記ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制が検出されたがん患者を、ＧＰＸ４阻害剤によるがん治療の対象として選別する工程と、
を含む、方法。
　［１０］
　ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制が検出されるがん細胞の増殖を抑制する方法であり、
　ＧＰＸ４阻害剤と、前記ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制が検出されるがん細胞とを接触させる工程、
を含む、方法。
　［１１］
　がんを治療する方法であり、
　がん患者由来の試料に含まれるがん細胞においてＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制が検出されたがん患者に対して、ＧＰＸ４阻害剤を投与する工程、
を含む、方法。
　［１２］
　がんを治療する方法であり、
　（ａ）がん患者由来の試料に含まれるがん細胞におけるＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制の有無を検出する工程と、
　（ｂ）前記がん細胞において前記ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制が検出されたがん患者に対して、ＧＰＸ４阻害剤を投与する工程と、
を含む、方法。
　［１３］
　ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制が検出されるがん細胞を含むがんの治療に用いる化合物のスクリーニング方法であり、
　ＧＰＸ４を阻害するか否かを指標として化合物を選別する工程、
を含む、方法。
　［１４］
　前記ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子がＢＡＦ複合体因子である、［１］～［３］のうちのいずれかに記載のがん治療剤。
　［１５］
　前記ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子がＢＡＦ複合体因子である、［４］～［１３］のうちのいずれかに記載の方法。
　［１６］
　前記ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子が、ＳＭＡＲＣＡ２、ＳＭＡＲＣＡ４、ＡＲＩＤ１Ａ、ＡＲＩＤ１Ｂ、ＡＲＩＤ２、及びＢＣＬ１１Ｂからなる群から選択される少なくとも１種である、［１］～［３］のうちのいずれかに記載のがん治療剤。
　［１７］
　前記ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子が、ＳＭＡＲＣＡ２、ＳＭＡＲＣＡ４、ＡＲＩＤ１Ａ、ＡＲＩＤ１Ｂ、ＡＲＩＤ２、及びＢＣＬ１１Ｂからなる群から選択される少なくとも１種である、［４］～［１３］のうちのいずれかに記載の方法。
　［１８］
　前記ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制が、前記ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子を構成因子とするＳＷＩ／ＳＮＦ複合体の活性低下及び／又は前記ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の発現低下である、［１］～［３］のうちのいずれかに記載のがん治療剤。
　［１９］
　前記ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制が、前記ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子を構成因子とするＳＷＩ／ＳＮＦ複合体の活性低下及び／又は前記ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の発現低下である、［４］～［１３］のうちのいずれかに記載の方法。
　［２０］
　前記ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制が、前記ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の遺伝子の機能欠失型変異である、［１］～［３］のうちのいずれかに記載のがん治療剤。
　［２１］
　前記ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制が、前記ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の遺伝子の機能欠失型変異である、［４］～［１３］のうちのいずれかに記載の方法。
　［２２］
　ＧＰＸ４を阻害する化合物を有効成分として含有し、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の遺伝子の機能欠失型変異が検出されるがん細胞を含むがんの治療剤である、がん治療剤。
　［２３］
　ＧＰＸ４を阻害する化合物を有効成分として含有し、がん患者由来の試料に含まれるがん細胞においてＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の遺伝子の機能欠失型変異が検出されるがん患者を治療するための治療剤である、がん治療剤。
　［２４］
　ＧＰＸ４を阻害する化合物を有効成分として含有し、がん患者由来の試料に含まれるがん細胞においてＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の遺伝子の機能欠失型変異が検出されるがん患者に投与するための治療剤である、がん治療剤。
　［２５］
　がん細胞の、ＧＰＸ４阻害剤に対する感受性を予測する方法であり、
　がん細胞におけるＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の遺伝子の機能欠失型変異が検出されたがん細胞を、ＧＰＸ４阻害剤に対して感受性があると予測する工程、
を含むことを特徴とする、方法。
　［２６］
　がん細胞の、ＧＰＸ４阻害剤に対する感受性を予測する方法であり、
　（ａ）がん細胞におけるＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の遺伝子の機能欠失型変異の有無を検出する工程と、
　（ｂ）前記ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の遺伝子の機能欠失型変異が検出されたがん細胞を、ＧＰＸ４阻害剤に対して感受性があると予測する工程と、
を含む、方法。
　［２７］
　がん患者の、ＧＰＸ４阻害剤による治療に対する感受性を予測する方法であり、
　がん患者由来の試料に含まれるがん細胞においてＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の遺伝子の機能欠失型変異が検出されたがん患者を、ＧＰＸ４阻害剤による治療に対して感受性があると予測する工程、
を含む、方法。
　［２８］
　がん患者の、ＧＰＸ４阻害剤による治療に対する感受性を予測する方法であり、
　（ａ）がん患者由来の試料に含まれるがん細胞におけるＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の遺伝子の機能欠失型変異の有無を検出する工程と、
　（ｂ）前記がん細胞において前記ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の遺伝子の機能欠失型変異が検出されたがん患者を、ＧＰＸ４阻害剤による治療に対して感受性があると予測する工程と、
を含む、方法。
　［２９］
　ＧＰＸ４阻害剤によるがん治療の対象とするがん患者を選別する方法であり、
　がん患者由来の試料に含まれるがん細胞においてＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の遺伝子の機能欠失型変異が検出されたがん患者を、ＧＰＸ４阻害剤によるがん治療の対象として選別する工程、
を含む、方法。
　［３０］
　ＧＰＸ４阻害剤によるがん治療の対象とするがん患者を選別する方法であり、
　（ａ）がん患者由来の試料に含まれるがん細胞におけるＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の遺伝子の機能欠失型変異の有無を検出する工程と、
　（ｂ）前記がん細胞において前記ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の遺伝子の機能欠失型変異が検出されたがん患者を、ＧＰＸ４阻害剤によるがん治療の対象として選別する工程と、
を含む、方法。
　［３１］
　ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の遺伝子の機能欠失型変異が検出されるがん細胞の増殖を抑制する方法であり、
　ＧＰＸ４阻害剤と、前記ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の遺伝子の機能欠失型変異が検出されるがん細胞とを接触させる工程、
を含む、方法。
　［３２］
　がんを治療する方法であり、
　がん患者由来の試料に含まれるがん細胞においてＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の遺伝子の機能欠失型変異が検出されたがん患者に対して、ＧＰＸ４阻害剤を投与する工程、
を含む、方法。
　［３３］
　がんを治療する方法であり、
　（ａ）がん患者由来の試料に含まれるがん細胞におけるＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の遺伝子の機能欠失型変異の有無を検出する工程と、
　（ｂ）前記がん細胞において前記ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の遺伝子の機能欠失型変異が検出されたがん患者に対して、ＧＰＸ４阻害剤を投与する工程と、
を含む、方法。
　［３４］
　ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の遺伝子の機能欠失型変異が検出されるがん細胞を含むがんの治療に用いる化合物のスクリーニング方法であり、
　ＧＰＸ４を阻害するか否かを指標として化合物を選別する工程、
を含む、方法。
　［３５］
　前記ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子がＢＡＦ複合体因子である、［２２］～［２４］のうちのいずれかに記載のがん治療剤。
　［３６］
　前記ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子がＢＡＦ複合体因子である、［２５］～［３４］のうちのいずれかに記載のがん治療剤。
　［３７］
　前記ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子が、ＳＭＡＲＣＡ２、ＳＭＡＲＣＡ４、ＡＲＩＤ１Ａ、ＡＲＩＤ１Ｂ、ＡＲＩＤ２、又はＢＣＬ１１Ｂからなる群から選択される少なくとも１種である、［２２］～［２４］のうちのいずれかに記載のがん治療剤。
　［３８］
　前記ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子が、ＳＭＡＲＣＡ２、ＳＭＡＲＣＡ４、ＡＲＩＤ１Ａ、ＡＲＩＤ１Ｂ、ＡＲＩＤ２、又はＢＣＬ１１Ｂからなる群から選択される少なくとも１種である、［２５］～［３４］のうちのいずれかに記載の方法。
　本発明によれば、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制（例えば、ＳＭＡＲＣＡ４やＡＲＩＤ１Ａなどに代表されるＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の遺伝子変異又はタンパク質の発現低下）を指標として、効率的に、ＧＰＸ４阻害剤によるがん治療への感受性を予測することが可能となる。また、本発明によれば、がん患者由来の試料におけるＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制の有無を検出し、当該変異が検出された患者を選別した上で、当該患者に対してＧＰＸ４阻害剤によるがんの治療を施すことができる。このため、がんの治療成績を大きく向上させることが可能となる。また、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の遺伝子に対するプローブやプライマー、及びＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子に対する抗体を用いることで、このようなＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制の有無の検出によるコンパニオン診断を効率的に行うことが可能となる。
ＮＣＩ－Ｈ１７９２、ＭＯＲ、ＮＣＩ－Ｈ２１１０、ＮＣＩ－Ｈ５２２、ＮＣＩ－Ｈ２３、及びＳＮＵ－１３２７の各細胞株における、ＧＰＸ４（＃１、＃２）の発現抑制をした際の細胞増殖阻害率（ＣＧＩ（％））を示すグラフである。 表４に示す各細胞株における、ＧＰＸ４（＃２）の発現抑制をした際の細胞増殖阻害率（ＣＧＩ（％））を示すグラフである。 表４に示す各細胞株における、ＧＰＸ４（＃３）の発現抑制をした際の細胞増殖阻害率（ＣＧＩ（％））を示すグラフである。 ＧＰＸ４阻害剤としてＭＬ２１０を用いたときの表４に示す各細胞株におけるＩＣ５０（μＭ）を示すグラフである。 ＧＰＸ４阻害剤としてＲＳＬ３を用いたときの表４に示す各細胞株におけるＩＣ５０（μＭ）を示すグラフである。 ＮＣＩ－Ｈ２１１０、ＮＣＩ－Ｈ５２２、及びＮＣＩ－Ｈ２３の各細胞株における各ＧＰＸ　ｆａｍｉｌｙタンパク質の発現抑制をした際の細胞増殖阻害率（ＣＧＩ（％））を示すグラフである。 ＮＣＩ－Ｈ２１１０、ＮＣＩ－Ｈ５２２、及びＮＣＩ－Ｈ２３の各細胞株における各グルタチオン合成関与タンパク質の発現抑制をした際の細胞増殖阻害率（ＣＧＩ（％））を示すグラフである。 ＭＬ２１０、ＲＳＬ３、又はＢＳＯを用いたときの、ＭＯＲ、ＮＣＩ－Ｈ３５８、ＮＣＩ－Ｈ２３、及びＮＣＩ－Ｈ５２２の各細胞株におけるＩＣ５０（μＭ）を示すグラフである。 ＳＫ－ＨＥＰ－１担癌マウスの各群（ＭＬ２１０又はＶｅｈｉｃｌｅ）における腫瘍の体積とＳＫ－ＨＥＰ－１移植後の時間との関係を示すグラフである。
　以下、本発明をその好適な実施形態に即して詳細に説明する。
　＜ＧＰＸ４阻害剤に対するがん細胞の感受性を予測する方法、ＧＰＸ４阻害剤による治療に対するがん患者の感受性を予測する方法、ＧＰＸ４阻害剤によるがん治療の対象とするがん患者を選別する方法＞
　本発明において、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制が生じているがん細胞において、ＧＰＸ４を阻害すると、当該がん細胞の増殖を抑制しうることが見出された。この知見に基づけば、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制を指標として、がん細胞の、ＧＰＸ４阻害剤に対する感受性を予測することができる。したがって、本発明は、
　（ａ）がん細胞におけるＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制の有無を検出する工程と、
　（ｂ）前記ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制が検出されたがん細胞を、ＧＰＸ４阻害剤に対して感受性があると予測する工程と、
を含む、がん細胞の、ＧＰＸ４阻害剤に対する感受性を予測する方法（以下、場合により、「がん細胞感受性予測方法」という）を提供する。
　また、上記知見に基づけば、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制を指標として、ＧＰＸ４阻害剤によるがん治療への感受性を予測することができる。したがって、本発明は、
　（ａ）がん患者由来の試料に含まれるがん細胞におけるＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制の有無を検出する工程と、
　（ｂ）前記がん細胞において前記ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制が検出されたがん患者を、ＧＰＸ４阻害剤による治療に対して感受性があると予測する工程と、
を含む、がん患者のＧＰＸ４阻害剤による治療に対する感受性を予測する方法（以下、場合により、「がん患者感受性予測方法」という）を提供する。
　さらに、こうしてＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制が検出された患者は、ＧＰＸ４阻害剤によるがんの治療に適しているといえるため、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制を指標として、ＧＰＸ４阻害剤によるがん治療が有効な患者と有効でない患者とを選別し、効率的な治療を行うことができる。したがって、本発明は、
　（ａ）がん患者由来の試料に含まれるがん細胞におけるＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制の有無を検出する工程と、
　（ｂ）前記がん細胞において前記ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制が検出されたがん患者を、ＧＰＸ４阻害剤によるがん治療の対象として選別する工程と、
を含む、ＧＰＸ４阻害剤によるがん治療の対象とするがん患者を選別する方法（以下、場合により、「がん患者選別方法」という）を提供する。
　（試料等）
　本発明において、癌（上皮性腫瘍）、白血病、悪性リンパ腫、骨髄腫、肉腫、癌肉腫などの悪性新生物を総称して「がん」又は「腫瘍」といい、前記がんを構成する細胞を「がん細胞」という。ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制の有無を検出しうるがん細胞を含むがんとしては、特に制限されないが、例えば、肺がん、卵巣がん、子宮がん、肝臓がん、胃がん、食道がん、大腸がん、膵臓がん、前立腺がん、膀胱がん、腎臓がんが挙げられる。
　本発明において「がん患者」とは、前記がんに罹患しているヒトのみならず、前記がんに罹患していると疑いのあるヒトであってもよい。本発明の方法において、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制を検出する対象となるがん患者としては特に制限はなく、全てのがん患者を対象とすることができる。
　本発明において用いられる「がん患者由来の試料」としては、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制の有無を検出しうる生物学的試料であれば、特に制限はないが、好ましくはがん生検検体、血液、尿、体腔液、腫瘍細胞由来循環ＤＮＡ（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ　ｔｕｍｏｒ　ＤＮＡ：ｃｔＤＮＡ）等の検体である。また、前記検体から得られるタンパク質抽出物や核酸抽出物（ｍＲＮＡ抽出物、ｍＲＮＡ抽出物から調製されたｃＤＮＡ調製物やｃＲＮＡ調製物等）であってもよい。本明細書において、「生物学的試料」には、がん患者由来の試料及びがん細胞培養物由来の試料が含まれる。
　（ＧＰＸ４阻害剤）
　本発明における「ＧＰＸ４阻害剤」は、ＧＰＸ４（グルタチオンペルオキシダーゼ４）を阻害する化合物を少なくとも１種含有する組成物を示し、前記化合物又はその組み合わせのみからなるものであっても、下記の添加成分をさらに含むものであってもよい。本発明における「ＧＰＸ４を阻害する化合物」には、ＧＰＸ４の活性及びＧＰＸ４の発現のうちの少なくともいずれかを阻害する化合物が含まれる。
　本発明においてＧＰＸ４阻害剤の標的となる「ＧＰＸ４（本明細書中、場合により「ＧＰＸ４タンパク質」ともいう）」は、グルタチオンのペルオキシド構造を酸化、切断して２つのヒドロキシ基に分解するペルオキシダーゼ活性を有するグルタチオンペルオキシダーゼのアイソザイム（現在ではＧＰＸ１～ＧＰＸ８の８種が知られている）のうちの１つであり、他のＧＰＸは過酸化水素や過酸化脂肪酸を基質として還元できるのに対し、ＧＰＸ４は過酸化リン脂質を直接還元する機能も有する酵素である。ＧＰＸ４をコードするヒト由来の典型的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の塩基配列を配列番号：１（ＮＣＢＩ参照番号：ＮＭ＿００２０８５．５）に、ヒト由来のＧＰＸ４タンパク質の典型的なアミノ酸配列を配列番号：２（ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿００２０７６．２）に、それぞれ示す。なお、アミノ酸配列の置換、欠失、挿入、及び付加等を伴う変異を生じていないＧＰＸ４をコードするＤＮＡであっても、多型などによって、配列には個体差が生じうる。
　化合物がＧＰＸ４の活性を阻害することは、例えば、被検化合物で処理した細胞の溶解物に対して、ＧＰＸ４の基質であるホスファチジルコリンヒドロペルオキシドを添加して、その還元を指標にすることにより確認することができる（Ｖｉｓｗａｎａｔｈａｎら，Ｎａｔｕｒｅ．２０１７　Ｊｕｌｙ　２７；５４７（７６６４）：４５３－４５７，Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｙ　ｏｆ　ａ　ｔｈｅｒａｐｙ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｓｔａｔｅ　ｏｆ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｌｓ　ｏｎ　ａ　ｌｉｐｉｄ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　ｐａｔｈｗａｙ、Ｙａｎｇら，Ｃｅｌｌ．２０１４　Ｊａｎｕａｒｙ　１６　１５６（０）：３１７－３３１，Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｆｅｒｒｏｐｔｏｔｉｃ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｅｌｌ　Ｄｅａｔｈ　ｂｙ　ＧＰＸ４等）。前記被検化合物によりＧＰＸ４の活性が阻害された場合には、当該基質の還元が生じない若しくは生じにくくなる（還元量が低下する）。
　また、化合物がＧＰＸ４の活性を阻害することは、例えば、精製ＧＰＸ４標品を被験化合物で処理し、ＧＰＸ４の基質であるＧＳＨ及び過酸化物、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　ｒｅｄｕｃｔａｓｅ、ＮＡＤＰＨを加え、酵素リサイクリング法で活性を測定することによっても確認することができる（Ｓｈｉｎｏｍｅら，Ａｎｔｉｏｘｉｄ．Ｒｅｄｏｘ　Ｓｉｇｎａｌ．２２（４），２８１－２９３，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｎａｃｔｉｖｅ　Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　４　Ｌｅａｄｓ　ｔｏ　Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　Ｌｅｔｈａｌｉｔｙ，ａｎｄ　Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｌｏｘ１５　Ｇｅｎｅ　Ｄｏｅｓ　Ｎｏｔ　Ｒｅｓｃｕｅ　Ｓｕｃｈ　Ｋｎｏｃｋ－Ｉｎ　Ｍｉｃｅ等）。前記被検化合物によりＧＰＸ４の活性が阻害された場合には、ＧＳＨ又はＮＡＤＰＨの消費量が低下する。
　また、化合物がＧＰＸ４の発現を阻害することは、例えば、被検化合物で処理した細胞におけるＧＰＸ４の発現低下を検出することにより確認することができる。ＧＰＸ４の発現低下の検出法としては、通常、ＧＰＸ４の発現量を転写レベル又は翻訳レベルで検出し、対照（例えば、被検化合物で処理していない細胞の発現量）との比較において、それよりも発現量が少ないことを確認する方法が挙げられる。
　ＧＰＸ４の発現量を転写レベルで検出する方法においては、先ず、被検化合物で処理した細胞からＲＮＡ又はｃＤＮＡを調製する。前記細胞からＲＮＡを抽出する方法としては特に制限はなく、公知の方法を適宜選択して用いることができ、例えば、フェノールとカオトロピック塩とを用いた抽出方法（より具体的には、トリゾール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、アイソジェン（和光純薬社製）等の市販キットを用いた抽出方法）や、その他市販キット（ＲＮＡＰｒｅｐトータルＲＮＡ抽出キット（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）、ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ＲＮＡ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）等）を用いた方法が挙げられる。さらに、抽出したＲＮＡからのｃＤＮＡの調製に用いる逆転写酵素としては、特に制限されることなく、例えば、ＲＡＶ（Ｒｏｕｓ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｖｉｒｕｓ）やＡＭＶ（Ａｖｉａｎ　ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ　ｖｉｒｕｓ）等のレトロウィルス由来の逆転写酵素や、ＭＭＬＶ（Ｍｏｌｏｎｅｙ　ｍｕｒｉｎｅ　ｌｅｕｋｅｍｉａ　ｖｉｒｕｓ）等のマウスのレトロウィルス由来の逆転写酵素が挙げられる。
　次いで、オリゴヌクレオチドプライマー又はオリゴヌクレオチドプローブをそれぞれ増幅反応又はハイブリダイゼーション反応に用い、その増幅産物又はハイブリッド産物を検出する。このような方法としては、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ法、ノザンブロット法、ドットブロット法、ＤＮＡアレイ法、ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法、ＲＮアーゼプロテクションアッセイ法、ｍＲＮＡ－ｓｅｑなどを利用できる。当業者であれば、ＧＰＸ４のｃＤＮＡの塩基配列を基に、各方法に適したオリゴヌクレオチドプライマーやオリゴヌクレオチドプローブを常法により設計することができる。
　ＧＰＸ４の発現量を翻訳レベルで検出する方法においては、先ず、被検化合物で処理した細胞からタンパク質試料を調製する。次いで、ＧＰＸ４タンパク質に特異的な抗体を用いて抗原抗体反応を行い、ＧＰＸ４タンパク質を検出する。このような抗体を用いたタンパク質の検出法においては、例えば、前記タンパク質試料に対して、ＧＰＸ４タンパク質に特異的な抗体を添加して抗原抗体反応を行い、ＧＰＸ４タンパク質に対する前記抗体の結合を検出する。ＧＰＸ４タンパク質に特異的な抗体が標識されている場合には、直接的にＧＰＸ４タンパク質を検出することができるが、標識されていない場合には、さらに、当該抗体を認識する標識された分子（例えば、二次抗体やプロテインＡ）を作用させて、当該分子の標識を利用して、間接的にＧＰＸ４タンパク質を検出することができる。このような方法としては、例えば、免疫組織化学（免疫染色）法、ウェスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡ法、フローサイトメトリー、イメージングサイトメトリー、ラジオイムノアッセイ、免疫沈降法、抗体アレイを用いた解析法等を利用することができる。
　使用する抗体の種類や由来などは特に制限はないが、好ましくはモノクローナル抗体である。十分な特異性でＧＰＸ４タンパク質を検出可能である限り、オリゴクローナル抗体（数種～数十種の抗体の混合物）やポリクローナル抗体を用いることもできる。また、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、ｄｓＦｖ、及びダイアボディー等の、抗体の機能的断片やその多量体（例えば、ダイマー、トリマー、テトラマー、ポリマー）を用いることもできる。このような抗ＧＰＸ４タンパク質抗体としては、市販品であってもよい。
　また、ＧＰＸ４タンパク質の検出は、質量分析法（ＭＳ）を使用して行うこともできる。特に液体クロマトグラフィーと連結した質量分析計（ＬＣ／ＭＳ）による解析は鋭敏であるため有利である。質量分析法による検出は、例えば、前記タンパク質試料に対して、当該タンパク質を標識し、標識したタンパク質を分画し、分画したタンパク質を質量分析に供し、質量分析値からＧＰＸ４タンパク質を同定することにより、行うことができる。標識としては、当技術分野で公知の同位体標識試薬を用いることができ、適当な標識試薬を市販品として入手することができる。また分画も当技術分野で公知の方法により行うことができ、例えば市販のイオン交換カラム等を用いて行うことができる。
　本発明における「ＧＰＸ４を阻害する化合物」としては特に制限はなく、公知の化合物であってもよく、後述のスクリーニングにより同定される化合物であってもよいが、有機又は無機の化合物分子、ポリペプチド、及びポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましい。
　前記化合物分子としては、低分子化合物（分子量８００未満）、中分子化合物（分子量８００～２，０００）が挙げられる。前記ポリペプチドには、遺伝子にコードされる完全長のポリペプチドの他、その断片や合成したポリペプチド、環状ポリペプチド、糖ペプチドも含まれる。また、前記ポリペプチドには抗体及び抗原ペプチドも含み、前記抗体としては、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。前記抗体には、完全抗体の他、抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、ｄｓＦｖ、及びダイアボディー等）やその多量体、抗体の可変領域を結合させた低分子化抗体も含む。前記ポリヌクレオチドとしては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡが挙げられ、完全長のポリヌクレオチドの他、その断片や合成したポリヌクレオチドも含む。
　本発明における「ＧＰＸ４阻害剤」は、その特性に応じて、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤などの各種剤型とすることができ、また、その剤型に応じて、薬理学上許容される、滅菌水や生理食塩水、植物油、溶剤、基剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、芳香剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤、希釈剤、等張化剤、無痛化剤、増量剤、崩壊剤、緩衝剤、コーティング剤、滑沢剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤などの添加成分をさらに含有していてもよく、これらを用いて公知の製剤学的方法により製造することができる。
　また、本発明に係るＧＰＸ４阻害剤において、ＧＰＸ４を阻害する化合物の含有量（前記化合物が２種以上である場合にはそれらの合計含有量）は、その剤型や使用目的に応じて適宜調整することができる。
　（ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制）
　〔ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子〕
　本発明における「ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体」は、クロマチンモデリング因子の１つであり、主に、ＡＴＰ加水分解のエネルギーを利用してヌクレオソームを移動や除去することによってクロマチン構造を変換する機能を有する複合体であり、複数のサブユニットからなる。
　本発明における「ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子（本明細書中、場合により「ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子タンパク質」ともいう）」は、前記ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体を構成するサブユニットであり、例えば、ＳＭＡＲＣＡ２（本明細書中、場合により「ＳＭＡＲＣＡ２タンパク質」ともいう。以降の各因子において同様）、ＳＭＡＲＣＡ４、ＡＲＩＤ１Ａ、ＡＲＩＤ１Ｂ、ＡＲＩＤ２、ＡＣＴＬ６Ａ、ＡＣＴＬ６Ｂ、ＤＰＦ１、ＤＰＦ２、ＤＰＦ３、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＭＡＲＣＣ１、ＳＭＡＲＣＣ２、ＳＭＡＲＣＤ１、ＳＭＡＲＣＤ２、ＳＭＡＲＣＤ３、ＳＭＡＲＣＥ１、ＳＳ１８、ＳＳ１８Ｌ１、ＢＣＬ７Ａ、ＢＣＬ７Ｂ、ＢＣＬ７Ｃ、ＢＣＬ１１Ａ、ＢＣＬ１１Ｂ、ＢＲＤ７、ＢＲＤ９、ＰＢＲＭ１、ＰＨＦ１０が挙げられる。機能抑制を検出するＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子としては、これらのうちの１種を単独であっても２種以上の組み合わせであってもよい。
　前記ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子のうち、ＳＭＡＲＣＡ２、ＳＭＡＲＣＡ４、ＳＭＡＲＣＣ１、ＳＭＡＲＣＣ２、ＳＭＡＲＣＢ１、ＡＲＩＤ１Ａ、ＡＲＩＤ１Ｂ、ＳＭＡＲＣＤ１、ＳＭＡＲＣＤ２、ＳＭＡＲＣＤ３、ＢＣＬ１１Ｂ、ＳＭＡＲＣＥ１、ＰＨＦ１０、ＤＰＦ１、ＤＰＦ３、ＡＣＴＬ６Ａ、及びＡＣＴＬ６ＢはＢＡＦ複合体を構成するＢＡＦ複合体因子であり、また、ＳＭＡＲＣＡ４、ＳＭＡＲＣＣ１、ＳＭＡＲＣＣ２、ＳＭＡＲＣＢ１、ＡＲＩＤ２、ＰＢＲＭ１、ＢＲＤ７、ＢＣＬ１１Ｂ、ＳＭＡＲＣＥ１、ＰＨＦ１０、ＤＰＦ１、ＤＰＦ３、ＡＣＴＬ６Ａ、及びＡＣＴＬ６Ｂは、ＰＢＡＦ複合体を構成するＰＢＡＦ複合体因子である。本発明に係るＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子としては、これらの中でも、ＳＭＡＲＣＡ２、ＳＭＡＲＣＡ４、ＡＲＩＤ１Ａ、ＡＲＩＤ１Ｂ、ＡＲＩＤ２、及びＢＣＬ１１Ｂからなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましく、ＢＡＦ複合体因子からなる群から選択される少なくとも１種であることがより好ましく、ＳＭＡＲＣＡ２、ＳＭＡＲＣＡ４、ＡＲＩＤ１Ａ、ＡＲＩＤ１Ｂ、及びＢＣＬ１１Ｂからなる群から選択される少なくとも１種であることがさらに好ましい。
　上記のＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子について、各ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子をコードするヒト由来の典型的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の塩基配列の配列番号及びヒト由来の各ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子タンパク質の典型的なアミノ酸配列の配列番号を、それぞれ、下記の表１～３に示すが、これらに限定されるものではない。また、表１～３には、各ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子のＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑデータベース（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄａｔａｂａｓｅ）における名称及び参照ＩＤを併せて示す。なお、アミノ酸配列の置換、欠失、挿入、及び付加等を伴う変異を生じていないＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子をコードするＤＮＡであっても、多型などによって、配列には個体差が生じうる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　本発明における「ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制」には、当該因子を含む（当該因子を構成因子とする）ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体の不活性化を含む活性低下、及びＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の発現低下が含まれる。
　〔ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体の活性低下の検出〕
　「ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体の活性低下」とは、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体が本来有している活性が低下していることを意味し、通常、対照（例えば、健常者や同一患者の非がん組織における活性レベル）との比較において、それよりも活性レベルが低いことを意味する。また、「ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体の活性低下」には、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体の一部又は全部の不活性化及び活性低下の双方が含まれる。
　〈ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体の直接的活性低下の検出〉
　本発明における「ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体の直接的活性低下の検出」の方法としては、特に制限はないが、例えば、生物学的試料からＳＷＩ／ＳＮＦ複合体を免疫沈降等の手法によって精製し、クロマチンリモデリング活性を測定することによって確認することができる（Ｍｉｃｈａｅｌ　Ｌ．　Ｐｈｅｌａｎら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．３，ｐ．２４７－２５３，Ｆｅｂｒｕａｒｙ，１９９９，Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　Ｃｏｒｅ　Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ　Ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ　Ｃｏｍｐｌｅｘ　ｆｒｏｍ　ＳＷＩ／ＳＮＦ　Ｓｕｂｕｎｉｔｓ等）。前記活性が対照との比較において低下している場合、前記ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体の活性低下が検出されたと判定することができる。
　また、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体の直接的活性低下の検出の方法としては、例えば、ＡＴＰアーゼ活性を測定することによっても確認することができる。例えば、生物学的試料からＳＷＩ／ＳＮＦ複合体を免疫沈降等の手法によって精製し、市販品、例えば、ＡＤＰ－ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、そのＡＴＰの消費量を検出する。検出の結果、ＡＴＰの消費量が対照との比較において低下している場合、前記ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体の活性低下が検出されたと判定することができる。
　〈ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の遺伝子の変異の検出〉
　ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体の活性低下は、典型的には、当該複合体を構成するＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の遺伝子（ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子をコードするＤＮＡ）における機能欠失型変異に起因するものである。そのため、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の遺伝子の変異の検出をＳＷＩ／ＳＮＦ複合体の活性低下として検出することができる。
　機能欠失型変異は、例えば、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の遺伝子におけるミスセンス変異、全領域に亘るナンセンス変異、フレームシフト変異、又は遺伝子の全体若しくは部分的な欠失等により生じうるが、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体の活性低下を引き起こす限り、これらに制限されない。主ながん細胞株におけるＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の遺伝子の変異の例を、下記の表４に示す。また、表４には、主ながん細胞株におけるＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の発現の有無の例も併せて示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表４中、「Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ」は、当該遺伝子変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）又は発現の有無（ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）が報告されているデータベースや文献等を示し、「ＣＣＬＥ」は、Ｂｒｏａｄ　ｉｎｓｔｉｔｕｔｅが作成しているデータベース：「Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｅｌｌ　Ｌｉｎｅ　Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ（ｈｔｔｐｓ：／／ｐｏｒｔａｌｓ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｃｃｌｅ）」を、「Ｈｏｆｆｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．２０１４」は文献：「Ｈｏｆｆｍａｎら，ＰＮＡＳ　Ｆｅｂｒｕａｒｙ　２５，２０１４　１１１（８），ｐ．３１２８－３１３３」を、「Ｍａｔｓｕｂａｒａ　ｅｔ　ａｌ．２０１２」は文献：「Ｍａｔｓｕｂａｒａら，Ｃａｎｃｅｒ　Ｓｃｉ、Ｆｅｂｒｕａｒｙ　２０１３，ｖｏｌ．１０４，ｎｏ．２、ｐ．２６６－２７３」を、「Ｏｇｉｗａｒａ　ｅｔ　ａｌ．　２０１９」は文献：「Ｏｇｉｗａｒａら，Ｖｏｌｕｍｅ　３５，Ｉｓｓｕｅ　２，１１　Ｆｅｂｒｕａｒｙ　２０１９，ｐ．１７７－１９０．ｅ８」を、それぞれ示し、「Ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｐａｔｅｎｔ」は、論文上報告のない変異又は発現の情報であり、本発明者らが短縮型の欠損変異を有することを確認したものであることを示す。
　また、他に、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体の活性低下を引き起こす具体的なＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の遺伝子の変異の例としては、例えば、ＡＲＩＤ１Ａ：ｐ．Ｙ５５１Ｌｆｓ＊７２（Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ－Ｆｒａｍｅｓｈｉｆｔ）（ＣＯＳＭＩＣ　Ｌｅｇａｃｙ　Ｍｕｔａｔｉｏｎ　ＩＤ：ＣＯＳＭ５１４２３）等が挙げられるが、これに制限されない。
　本発明における「ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の遺伝子の変異の検出」の方法としては、特に制限はないが、例えば、下記の方法が挙げられる。
　本発明において「変異を検出する」とは、原則として、ゲノムＤＮＡ上の変異を検出することを意味するが、当該ゲノムＤＮＡ上の変異が転写産物における塩基の変化や翻訳産物におけるアミノ酸の変化に反映される場合には、これら転写産物や翻訳産物における当該変化を検出すること（すなわち、間接的な検出）をも含む意味である。
　本発明の方法の好ましい態様は、がん細胞のＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の遺伝子領域の塩基配列を直接決定することにより、変異を検出する方法である。本発明において「ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の遺伝子領域」とは、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の遺伝子を含むゲノムＤＮＡ上の一定領域を意味する。該領域には、それぞれ独立に、翻訳領域以外に非翻訳領域として各遺伝子の発現制御領域（例えば、プロモーター領域、エンハンサー領域）や各遺伝子の３’末端非翻訳領域なども含まれる。
　この方法においては、先ず、生物学的試料からＤＮＡ試料を調製する。ＤＮＡ試料としては、ゲノムＤＮＡ試料、及びＲＮＡからの逆転写によって調製されるｃＤＮＡ試料が挙げられる。
　生物学的試料からゲノムＤＮＡ又はＲＮＡを抽出する方法としては特に制限はなく、公知の方法を適宜選択して用いることができ、例えば、ゲノムＤＮＡを抽出する方法としては、ＳＤＳフェノール法（尿素を含む溶液又はエタノール中に保存した組織を、タンパク質分解酵素（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ）、界面活性剤（ＳＤＳ）、及びフェノールで該組織のタンパク質を変性させ、エタノールで該組織からＤＮＡを沈殿させ抽出する方法）、Ｃｌｅａｎ　Ｃｏｌｕｍｎｓ（登録商標、ＮｅｘＴｅｃ社製）、ＡｑｕａＰｕｒｅ（登録商標、Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）、ＺＲ　Ｐｌａｎｔ／Ｓｅｅｄ　ＤＮＡ　Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）、ＡｑｕａＧｅｎｏｍｉｃＳｏｌｕｔｉｏｎ（登録商標、Ｍｏ　Ｂｉ　Ｔｅｃ社製）、ｐｒｅｐＧＥＭ（登録商標、ＺｙＧＥＭ社製）、ＢｕｃｃａｌＱｕｉｃｋ（登録商標、ＴｒｉｍＧｅｎ社製）を用いるＤＮＡ抽出方法が挙げられる。
　また、生物学的試料からＲＮＡを抽出する方法及び抽出したＲＮＡからｃＤＮＡを調製する方法としては、ＧＰＸ４の発現量を転写レベルで検出する方法において挙げた方法と同様の方法が挙げられる。
　この態様においては、次いで、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の遺伝子領域を含むＤＮＡを単離し、単離したＤＮＡの塩基配列を決定する。該ＤＮＡの単離は、例えば、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の遺伝子領域の全て又は一部を挟み込むように設計された一対のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ゲノムＤＮＡ、或いはＲＮＡを鋳型としたＰＣＲ等によって行うことができる。単離したＤＮＡの塩基配列の決定は、マキサムギルバート法やサンガー法など当業者に公知の方法で行うことができ、単離したＤＮＡや抽出したＤＮＡについては遺伝子の塩基配列を高速かつ網羅的に読み出せる解析が可能な次世代シーケンサー等も用いることができる。
　決定したＤＮＡ若しくはｃＤＮＡの塩基配列を対照（例えば、生物学的試料が、がん患者由来の試料である場合には、同一患者の非がん組織由来のＤＮＡ、又はｃＤＮＡの塩基配列若しくは公知のデータベース）と比較することにより、生物学的試料のがん細胞におけるＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の遺伝子領域の変異の有無を判別することができる。
　ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の遺伝子領域の変異を検出するための方法は、ＤＮＡやｃＤＮＡの塩基配列を直接決定する方法以外に、変異の検出が可能な種々の方法によって行うことができる。
　例えば、本発明における変異の検出は、以下のような方法によっても行うことができる。先ず、生物学的試料からＤＮＡ若しくはｃＤＮＡ試料を調製する。次いで、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の遺伝子領域の変異部位を含む塩基配列に相補的な塩基配列を有し、レポーター蛍光色素及びクエンチャー蛍光色素が標識されたオリゴヌクレオチドプローブを調製する。そして、前記ＤＮＡ若しくはｃＤＮＡ試料に、前記オリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせ、さらに前記オリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズした前記ＤＮＡ若しくはｃＤＮＡ試料を鋳型として、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の遺伝子領域の前記変異部位を含む塩基配列を増幅する。そして、前記増幅に伴うオリゴヌクレオチドプローブの分解により、前記レポーター蛍光色素が発する蛍光を検出し、次いで、検出した前記蛍光を対照と比較する。このような方法としては、例えば、ダブルダイプローブ法、いわゆるＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ法が挙げられる。
　さらに別の方法においては、生物学的試料からＤＮＡ若しくはｃＤＮＡ試料を調製する。次いで、ＤＮＡ二重鎖間に挿入されると蛍光を発するインターカレーターを含む反応系において、前記ＤＮＡ若しくはｃＤＮＡ試料を鋳型として、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の遺伝子領域の変異部位を含む塩基配列を増幅する。そして、前記反応系の温度を変化させ、前記インターカレーターが発する蛍光の強度の変動を検出し、検出した前記温度の変化に伴う前記蛍光の強度の変動を対照と比較する。このような方法としては、例えば、ＨＲＭ（ｈｉｇｈ　ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｍｅｌｔｉｎｇ、高分解融解曲線解析）法が挙げられる。
　さらに別の方法においては、先ず、生物学的試料からＤＮＡ若しくはｃＤＮＡ試料を調製する。次いで、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の遺伝子領域の全て又は一部を含むＤＮＡを増幅する。さらに、増幅したＤＮＡを制限酵素により切断する。次いで、ＤＮＡ断片をその大きさに応じて分離する。次いで、検出されたＤＮＡ断片の大きさを、対照と比較する。このような方法としては、例えば、制限酵素断片長変異（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ　Ｌｅｎｇｔｈ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ／ＲＦＬＰ）を利用した方法やＰＣＲ－ＲＦＬＰ法等が挙げられる。
　さらに別の方法においては、先ず、生物学的試料からＤＮＡ若しくはｃＤＮＡ試料を調製する。次いで、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の遺伝子領域の全て又は一部を含むＤＮＡを増幅する。さらに、増幅したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させる。次いで、解離させた一本鎖ＤＮＡを非変性ゲル上で分離する。分離した一本鎖ＤＮＡのゲル上での移動度を対照と比較する。このような方法としては、例えば、ＰＣＲ－ＳＳＣＰ（ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄ　ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、一本鎖高次構造変異）法が挙げられる。
　さらに別の方法においては、先ず、生物学的試料からＤＮＡ若しくはｃＤＮＡ試料を調製する。次いで、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の遺伝子領域の全て又は一部を含むＤＮＡを増幅する。さらに、増幅したＤＮＡを、ＤＮＡ変性剤の濃度が次第に高まるゲル上で分離する。次いで、分離したＤＮＡのゲル上での移動度を対照と比較する。このような方法としては、例えば、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ｄｅｎａｔｕｒａｎｔ　ｇｒａｄｉｅｎｔ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ＤＧＧＥ）法が挙げられる。
　さらに別の方法としては、生物学的試料から調製したＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の遺伝子領域の変異部位を含むＤＮＡ、及び、該ＤＮＡにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブが固定された基板、を用いる方法がある。このような方法としては、例えば、ＤＮＡアレイ法等が挙げられる。
　さらに別の方法においては、先ず、生物学的試料からＤＮＡ若しくはｃＤＮＡ試料を調製する。また、「ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の遺伝子領域の全て又は一部の塩基の１塩基３’側の塩基及びその３’側の塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー」を調製する。次いで、該ＤＮＡを鋳型とし、該プライマーを用いて、ｄＮＴＰプライマー伸長反応を行う。次いで、プライマー伸長反応産物を質量分析機にかけ、質量測定を行う。次いで、質量測定の結果から遺伝子型を決定する。次いで、決定した遺伝子型を対照と比較する。このような方法としては、例えば、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳ法が挙げられる。
　さらに別の方法においては、先ず、生物学的試料からＤＮＡ若しくはｃＤＮＡ試料を調製する。次いで、５’－「ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の遺伝子領域の全て又は一部の塩基及びその５’側の塩基配列と相補的な塩基配列」－「ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の遺伝子領域の全て又は一部の１塩基３’側の塩基及びその３’側の塩基配列とハイブリダイズしない塩基配列」－３’（フラップ）からなるオリゴヌクレオチドプローブを調製する。また、「ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の遺伝子領域の全て又は一部の塩基及びその３’側の塩基配列と相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプローブ」を調製する。次いで、調製したＤＮＡ若しくはｃＤＮＡ試料に、上記２種類のオリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせる。次いで、ハイブリダイズしたＤＮＡを一本鎖ＤＮＡ切断酵素で切断し、フラップを遊離させる。一本鎖ＤＮＡ切断酵素としては、特に制限はなく、例えばｃｌｅａｖａｓｅが挙げられる。本方法においては、次いで、フラップと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドプローブであって、レポーター蛍光及びクエンチャー蛍光が標識されたオリゴヌクレオチドプローブをフラップにハイブリダイズさせる。次いで、発生する蛍光の強度を測定する。次いで、測定した蛍光の強度を対照と比較する。このような方法としては、例えば、Ｉｎｖａｄｅｒ法が挙げられる。
　さらに別の方法においては、先ず、生物学的試料からＤＮＡ若しくはｃＤＮＡ試料を調製する。次いで、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の遺伝子領域の全て又は一部を含むＤＮＡを増幅する。そして、増幅したＤＮＡを一本鎖に解離させ、解離させた一本鎖ＤＮＡのうち、片鎖のみを分離する。次いで、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の遺伝子領域の全て又は一部の塩基の近傍より１塩基ずつ伸長反応を行い、その際に生成されるピロリン酸を酵素的に発光させ、発光の強度を測定する。そして、測定した蛍光の強度を対照と比較する。このような方法としては、例えば、Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法が挙げられる。
　さらに別の方法においては、先ず、生物学的試料からＤＮＡ若しくはｃＤＮＡ試料を調製する。次いで、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の遺伝子領域の全て又は一部を含むＤＮＡを増幅する。次いで、「ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の遺伝子領域の全て又は一部の塩基の１塩基３’側の塩基及びその３’側の塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー」を調製する。次いで、蛍光ラベルしたヌクレオチド存在下で、増幅したＤＮＡを鋳型とし、調製したプライマーを用いて一塩基伸長反応を行う。そして、蛍光の偏光度を測定する。次いで、測定した蛍光の偏光度を対照と比較する。このような方法としては、例えば、ＡｃｙｃｌｏＰｒｉｍｅ法が挙げられる。
　さらに別の方法においては、先ず、生物学的試料からＤＮＡ若しくはｃＤＮＡ試料を調製する。次いで、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の遺伝子領域の全て又は一部を含むＤＮＡを増幅する。次いで、「ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の遺伝子領域の全て又は一部の塩基の１塩基３’側の塩基及びその３’側の塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー」を調製する。次いで、蛍光ラベルしたヌクレオチド存在下で、増幅したＤＮＡを鋳型とし、調製したプライマーを用いて、一塩基伸長反応を行う。次いで、一塩基伸長反応に使われた塩基種を判定する。次いで、判定された塩基種を対照と比較する。このような方法として、例えば、ＳＮｕＰＥ法が挙げられる。
　なお、変異がＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子タンパク質におけるアミノ酸の変化（例えば、置換、欠失、挿入、付加）を伴うものであれば、生物学的試料から調製される試料はタンパク質であってもよい。このような場合、変異を検出するには、上記変異によりアミノ酸の変化が生じた部位に特異的に結合する分子（例えば、抗体）を用いる方法、ペプチドマスフィンガープリンティング法（ＰＭＦ）、プロテインシーケンサー（エドマン分解法）等を利用することができる。
　例えば、抗体を用いたタンパク質の検出法においては、先ず、生物学的試料からタンパク質試料を調製する。次いで、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子タンパク質に特異的な抗体（抗ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子タンパク質抗体）を用いて抗原抗体反応を用い、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子タンパク質を検出する。このような抗体を用いたタンパク質の検出法としては、ＧＰＸ４の発現量を翻訳レベルで検出する方法において、抗体を用いたタンパク質の検出法として挙げた方法と同様の方法をＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子タンパク質に合わせ調整して適宜採用することができる。この方法においては、免疫組織化学によって組織におけるがん細胞の形態や分布状態などの付加的な情報も同時に入手しうるという利点もある。
　使用する抗体の種類や由来などは特に制限はないが、好ましくはモノクローナル抗体である。十分な特異性でＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子タンパク質を検出可能である限り、オリゴクローナル抗体（数種～数十種の抗体の混合物）やポリクローナル抗体を用いることもできる。また、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、ｄｓＦｖ、及びダイアボディー等の、抗体の機能的断片やその多量体（例えば、ダイマー、トリマー、テトラマー、ポリマー）を用いることもできる。抗ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子タンパク質抗体としては、市販品であってもよい。
　ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子タンパク質の検出は、質量分析法（ＭＳ）を使用して行うこともできる。特に液体クロマトグラフィーと連結した質量分析計（ＬＣ／ＭＳ）による解析は鋭敏であるため有利である。質量分析法による検出法としては、ＧＰＸ４の発現量を翻訳レベルで検出する方法において、質量分析法による検出法として挙げた方法と同様の方法をＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子タンパク質に合わせ調整して適宜採用することができる。
　〔ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の発現低下の検出〕
　「ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の発現低下」とは、通常、対照（例えば、健常者や同一患者の非がん組織における発現レベル）との比較において、これよりも発現量が少ないことを意味する。「ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の発現低下」の検出法としては、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の発現量を転写レベル又は翻訳レベルで検出し、前記対照と比較する方法が挙げられる。
　ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の発現量を転写レベルで検出する方法においては、先ず、上記の方法で生物学的試料からＲＮＡ又はｃＤＮＡを調製する。次いで、オリゴヌクレオチドプライマー又はオリゴヌクレオチドプローブを、それぞれ、増幅反応又はハイブリダイゼーション反応に用い、その増幅産物又はハイブリッド産物を検出する。このような方法としては、ＧＰＸ４の発現量を転写レベルで検出する方法において挙げた方法と同様の方法をＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子に合わせ調整して適宜採用することができる。
　ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の発現量を翻訳レベルで検出する方法においては、先ず、生物学的試料からタンパク質試料を調製する。次いで、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子タンパク質に特異的な抗体を用いて抗原抗体反応を行い、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子タンパク質を検出する。このような抗体を用いたタンパク質の検出法としては、上記のＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子タンパク質の検出法において述べたとおりである。
　ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の発現量を翻訳レベルで検出する方法において、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子タンパク質の検出は、質量分析法（ＭＳ）を使用して行うこともできる。このような質量分析法による検出法としては、上記のＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子タンパク質の検出法において述べたとおりである。
　また、遺伝子の発現低下は、プロモーターの過剰メチル化が要因の一つであることが当該技術分野で公知である。したがって、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制の有無の検出においては、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の遺伝子プロモーターのメチル化を指標として検出することも考えられる。プロモーターのメチル化の検出には、例えば、メチル化されたシトシンをウラシルに変換する活性を有するバイサルファイト処理後の塩基配列の変化を塩基配列決定により直接的に検出する方法や、バイサルファイト処理前の塩基配列は認識できる（切断できる）がバイサルファイト処理後の塩基配列は認識できない（切断できない）制限エンドヌクレアーゼを利用して間接的に検出する方法などの公知の方法を利用することができる。
　（感受性の予測・がん患者の選別）
　こうして生物学的試料からＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制の検出がされた場合、当該生物学的試料ががん細胞である場合には、当該がん細胞は、ＧＰＸ４阻害剤に対して感受性があると予測することができ、また、当該生物学的試料ががん患者由来の試料に含まれるがん細胞である場合には、当該がん細胞において前記変異が検出されたがん患者を、ＧＰＸ４阻害剤による治療に対して感受性があると予測することができ、さらに、当該がん患者を、ＧＰＸ４阻害剤によるがん治療の対象として選別することができる。
　ここで、「ＧＰＸ４阻害剤に対する感受性」及び「ＧＰＸ４阻害剤による治療に対する感受性」は、ＧＰＸ４阻害剤ががん細胞に対して治療的効果を発揮しうるか否かを示す指標である。前記感受性には、前記ＧＰＸ４阻害剤によって前記がん細胞の死滅が促進されること及び増殖が抑制されることが含まれる。当該感受性の予測には、感受性の有無の判定のみならず、感受性が期待できる／できない等の評価、感受性がある場合におけるその程度の評価（例えば、高い感受性が期待できる、中程度の感受性が期待できる等の評価）を含む。したがって、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制の種類や程度に応じて、例えば、中程度の感受性が期待できるレベルで、がん治療の対象となる患者を選別してもよい。
　一方、がん患者由来の試料からＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制が認められなかった場合には、当該患者をＧＰＸ４阻害剤によるがん治療の対象から除外することができる。これにより治療の奏功率を向上させることができる。
　（ＧＰＸ４）
　さらに、本発明に係るＧＰＸ４阻害剤の標的であるＧＰＸ４が正常に発現していない場合には、ＧＰＸ４阻害剤によるがん治療を効果的に実施することができないおそれがある。したがって、がん細胞感受性予測方法、がん患者感受性予測方法、及びがん患者選別方法においては、さらに、ＧＰＸ４の遺伝子の変異及び発現低下の検出も指標に加えることができる。
　ＧＰＸ４の遺伝子の変異の検出法としては、「ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の遺伝子の変異の検出」の方法として挙げた方法と同様の方法をＧＰＸ４の遺伝子の変異に合わせ調整して適宜採用することができる。また、ＧＰＸ４の発現低下の検出法としては、上述のとおりである。
　＜がん細胞の増殖を抑制する方法、がんを治療する方法＞
　本発明は、
　ＧＰＸ４阻害剤と、前記ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制が検出されるがん細胞とを接触させる工程
を含む、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制が検出されるがん細胞の増殖を抑制する方法（以下、場合により「がん細胞増殖抑制方法」という）、並びに、
　（ａ）がん患者由来の試料に含まれるがん細胞におけるＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制の有無を検出する工程と、
　（ｂ）前記がん細胞において前記ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制が検出されたがん患者に対して、ＧＰＸ４阻害剤を投与する工程と、
を含む、がんを治療する方法（本明細書中、場合により「がん治療方法」という）も提供する。
　本発明のがん細胞増殖抑制方法及びがん治療方法において、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制の検出、及びＧＰＸ４阻害剤としては、上述のとおりである。
　前記がん細胞の増殖の抑制には、当該がん細胞の死滅が促進されること及び増殖が抑制されることが含まれる。がん細胞にＧＰＸ４阻害剤を接触させる方法は、特に制限されず、例えば、前記がん細胞の培養培地にＧＰＸ４阻害剤を添加する方法が挙げられる。
　また、がん細胞に接触させるＧＰＸ４阻害剤の量は、ＧＰＸ４を阻害してがん細胞の増殖を抑制するのに有効な量であればよく、ＧＰＸ４を阻害する化合物の性質、がん細胞の種類などに応じて、適宜選択される。
　がん患者に対するＧＰＸ４阻害剤の投与は、経口的な投与であっても非経口的な投与（例えば、静脈投与、動脈投与、局所投与）であってもよい。
　また、がん患者に対するＧＰＸ４阻害剤の投与量は、ＧＰＸ４を阻害してがんを治療するのに有効な量であればよく、ＧＰＸ４を阻害する化合物の性質、がん患者の年齢、体重、症状、健康状態、がんの進行状況などに応じて、適宜選択されるものであるため一概にはいえないが、例えば、ヒトに投与する場合、ＧＰＸ４を阻害する化合物の量で、１日当たり、０．００１～１００，０００ｍｇ、好ましくは、０．０１～５，０００ｍｇである。がん患者に対するＧＰＸ４阻害剤の投与頻度としても同様に、一概にはいえないが、例えば、１日あたり１回、又は２～４回に分けて投与され、適当な間隔で繰り返すのが好ましい。前記投与量及び投与頻度は、医師の判断によって必要により適宜増減されうる。
　これにより、がん患者におけるＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制を有するがん細胞において、さらにＧＰＸ４が阻害され、がん細胞の死滅の促進及び／又は増殖の抑制により、がんを治療することができる。
　治療対象となるがんとしては、特に限定されず、例えば、肺がん、卵巣がん、子宮がん、肝臓がん、胃がん、食道がん、大腸がん、膵臓がん、前立腺がん、膀胱がん、及び腎臓がんからなる群から選択される少なくとも１種が挙げられ、これらの中でも、肺がん、卵巣がん、肝臓がん、胃がん、及び膵臓がんからなる群から選択される少なくとも１種が好ましい。
　＜変異の有無を検出するための試薬＞
　また、本発明は、上記の方法において、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制の有無を検出するための試薬であり、
　（ｉ）ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の遺伝子に特異的に結合するオリゴヌクレオチドプライマー、
　（ｉｉ）ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の遺伝子に特異的に結合するオリゴヌクレオチドプローブ、及び
　（ｉｉｉ）ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子タンパク質に特異的に結合する抗体、
のうちのいずれかの分子を有効成分とする試薬を提供する。
　上記オリゴヌクレオチドプライマーは、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子のゲノムＤＮＡやｃＤＮＡの塩基配列情報（例えば、表１～３）に基づき、上記した方法や増幅する領域に即したプライマーとなるように、また、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の遺伝子以外の遺伝子の増幅産物が極力生じないように設計すればよい。このようなオリゴヌクレオチドプライマー設計は、当業者であれば、常法により行うことができる。オリゴヌクレオチドプライマーの長さは、通常１５～５０塩基長、好ましくは１５～３０塩基長であるが、方法及び目的によってはこれより長くても短くてもよい。
　上記オリゴヌクレオチドプローブは、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子のゲノムＤＮＡやｃＤＮＡの塩基配列情報（例えば、表１～３）に基づき、上記した方法やハイブリダイズさせる領域に即したプローブとなるように、また、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の遺伝子以外の遺伝子へのハイブリダイズが極力生じないように設計すればよい。このようなオリゴヌクレオチドプローブ設計は、当業者であれば、常法により行うことができる。オリゴヌクレオチドプローブの長さは、通常、１５～２００塩基長、好ましくは１５～１００塩基長、さらに好ましくは１５～５０塩基長であるが、方法及び目的によってはこれより長くても短くてもよい。
　オリゴヌクレオチドプローブは、適宜標識して用いることが好ましい。標識する方法としては、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、オリゴヌクレオチドの５’端を３２Ｐでリン酸化することにより標識する方法、及びクレノウ酵素等のＤＮＡポリメラーゼを用い、ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチド等をプライマーとして３２Ｐ等のアイソトープ、蛍光色素、又はビオチン等によって標識された基質塩基を取り込ませる方法（ランダムプライム法等）を例示することができる。
　上記のオリゴヌクレオチドプライマー及びオリゴヌクレオチドプローブは、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成機により作製することができる。オリゴヌクレオチドプローブは、制限酵素処理等によって取得される二本鎖ＤＮＡ断片として作製することもできる。また、本発明のオリゴヌクレオチドプライマー及びオリゴヌクレオチドプローブは、天然のヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）やリボヌクレオチド（ＲＮＡ））のみから構成されていなくともよく、非天然型のヌクレオチドにてその一部又は全部が構成されていてもよい。非天然型のヌクレオチドとしては、ＰＮＡ（ｐｏｌｙａｍｉｄｅ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ）、ＬＮＡ（登録商標、ｌｏｃｋｅｄ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ）、ＥＮＡ（登録商標、２’－Ｏ，４’－Ｃ－Ｅｔｈｙｌｅｎｅ－ｂｒｉｄｇｅｄ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄｓ）、及びこれらの複合体が挙げられる。
　上記ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子タンパク質に特異的に結合する抗体は、ポリクローナル抗体であれば、抗原（ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子タンパク質、その部分ペプチド、又はこれらを発現する細胞など）で免疫動物を免疫し、その抗血清から、従来の手段（例えば、塩析、遠心分離、透析、カラムクロマトグラフィーなど）によって、精製して取得することができる。また、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法や組換えＤＮＡ法によって作製することができる。
　ハイブリドーマ法としては、代表的には、コーラー及びミルスタインの方法（Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，　Ｎａｔｕｒｅ　１９７５；２５６：４９５）が挙げられる。この方法における細胞融合工程に使用される抗体産生細胞は、抗原（ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子タンパク質、その部分ペプチド、又はこれらを発現する細胞など）で免疫された動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、サル、ヤギ）の脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血白血球などである。免疫されていない動物から予め単離された上記の細胞又はリンパ球などに対して、抗原を培地中で作用させることによって得られた抗体産生細胞も使用することが可能である。ミエローマ細胞としては公知の種々の細胞株を使用することが可能である。抗体産生細胞及びミエローマ細胞は、それらが融合可能であれば、異なる動物種起源のものでもよいが、好ましくは、同一の動物種起源のものである。ハイブリドーマは、例えば、抗原で免疫されたマウスから得られた脾臓細胞と、マウスミエローマ細胞との間の細胞融合により産生され、その後のスクリーニングにより、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子タンパク質に特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子タンパク質に対するモノクローナル抗体は、ハイブリドーマを培養することにより、又はハイブリドーマを投与した哺乳動物の腹水から、取得することができる。
　組換えＤＮＡ法は、上記抗体をコードするＤＮＡをハイブリドーマやＢ細胞等からクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主細胞（例えば哺乳類細胞株、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞など）に導入し、本発明の抗体を組換え抗体として産生させる方法である（例えば、Ｐ．Ｊ．Ｄｅｌｖｅｓ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９７　ＷＩＬＥＹ，Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ　ａｎｄ　Ｃ．Ｄｅａｎ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，２０００　ＯＸＦＯＲＤ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ　ＰＲＥＳＳ，Ｖａｎｄａｍｍｅ　ＡＭら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９０；１９２：７６７－７７５）。抗体をコードするＤＮＡの発現においては、重鎖又は軽鎖をコードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換してもよく、重鎖及び軽鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換してもよい（ＷＯ９４／１１５２３号公報等）。抗体は、上記宿主細胞を培養し、宿主細胞内又は培養液から分離・精製し、実質的に純粋で均一な形態で取得することができる。抗体の分離・精製は、通常のポリペプチドの精製で使用されている方法を使用することができる。トランスジェニック動物作製技術を用いて、抗体遺伝子が組み込まれたトランスジェニック動物（ウシ、ヤギ、ヒツジ又はブタなど）を作製すれば、そのトランスジェニック動物のミルクから、抗体遺伝子に由来するモノクローナル抗体を大量に取得することも可能である。
　こうして得られた抗体若しくはその遺伝子を基に、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、ｄｓＦｖ、及びダイアボディー等の、抗体の機能的断片やその多量体（例えば、ダイマー、トリマー、テトラマー、ポリマー）を調製することができる。
　直接的にＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子タンパク質に結合した抗体量を検出する場合、得られた抗ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子タンパク質抗体は、直接、酵素、放射性同位体、蛍光色素又はアビジン－ビオチン系等により標識して用いられる。一方、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子タンパク質に結合した抗体量を、二次抗体などを利用して検出する間接的検出方法を実施する場合、得られた抗ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子タンパク質抗体（一次抗体）は標識する必要はなく、検出に際しては、当該抗体を認識する標識された分子（例えば、二次抗体やプロテインＡ）を用いればよい。
　本発明の試薬においては、有効成分としての上記分子の他、必要に応じて、滅菌水や生理食塩水、緩衝剤、保存剤など、試薬として許容される他の成分を含むことができる。
　＜がんの治療に用いる化合物のスクリーニング方法・がん治療剤＞
　本発明は、
　ＧＰＸ４を阻害するか否かを指標として化合物を選別する工程
を含む、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制が検出されるがん細胞を含むがんの治療に用いる化合物のスクリーニング方法（以下、場合により「化合物のスクリーニング方法」という）も提供する。
　また、上記化合物のスクリーニング方法でスクリーニングされたＧＰＸ４を阻害する化合物を用いて、
　ＧＰＸ４を阻害する化合物を有効成分として含有し、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制が検出されるがん細胞を含むがんの治療剤である、がん治療剤も提供することができる。
　本発明の化合物のスクリーニング方法に適用する被験化合物としては特に制限はなく、例えば、上記のＧＰＸ４を阻害する化合物として挙げた化合物分子、ポリペプチド、及びポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１種が挙げられる。また、前記被検化合物としてより具体的には、例えば、合成低分子化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、ペプチドライブラリー、ｓｉＲＮＡ、抗体、細菌放出物質、細胞（微生物、植物細胞、動物細胞）の抽出液及び培養上清、精製又は部分精製ポリペプチド、海洋生物、植物又は動物由来の抽出物、ランダムファージペプチドディスプレイライブラリーが挙げられる。また、前記被験化合物は、公知のＧＰＸ４阻害剤の誘導体であってもよい。
　ＧＰＸ４を阻害するか否かを指標として化合物を選別する方法（スクリーニング）においては、上記のＧＰＸ４の活性又は発現の阻害の確認系に、被験化合物を作用させて、その後のＧＰＸ４活性又は発現を検出すればよい。検出の結果、対照（例えば、被験化合物を添加しない場合）におけるＧＰＸ４活性又は発現と比較して、当該活性又は発現が低下していれば、ＧＰＸ４が阻害されたと評価することができる。
　前記スクリーニングにおいて、化合物による阻害の有無を評価される「ＧＰＸ４」としては上記のとおりである。
　本発明の化合物のスクリーニング方法により同定された化合物は、薬理学上許容される上記のＧＰＸ阻害剤で挙げた添加成分等と適宜混合し、公知の製剤学的方法で製剤化することにより、医薬品として、がん治療剤とすることができる。特に、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制が検出されるがん細胞を含むがんに有効であり、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制が検出されるがん患者を治療するため及び／又は前記患者に投与するための治療剤とすることができる。
　以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
　１．実験材料及び方法
　（１）細胞株
　上記の表４に記載のがん細胞株、ＮＣＩ－Ｈ３５８、ＮＣＩ－Ｈ２１２２、ＮＣＩ－Ｈ２１１０、ＮＣＩ－Ｈ１７９２、ＮＣＩ－Ｈ１４３７、ＭＯＲ、ＣＯＶ３６２、ＭＫＮ－４５、ＮＣＩ－Ｈ８３８、Ｂ１２０３Ｌ（Ｉｎｔ　Ｊ　Ｃａｎｓｅｒ．　２００６；　１１８：１９９２－７）、ＳＢＣ－５、ＴＯＶ－２１Ｇ、ＮＣＩ－Ｈ１７０３、ＳＮＵ－１３２７、ＮＣＩ－Ｈ２３、ＯＶＩＳＥ、ＮＣＩ－Ｈ５２２、及びＳＫ－ＨＥＰ－１を本発明の試験対象の細胞株として用いた。各細胞株の入手元は下記の表５に示す。上記の表４に示すように、ＮＣＩ－Ｈ２３、ＮＣＩ－Ｈ５２２、ＳＢＣ－５、ＳＫ－ＨＥＰ－１、ＳＮＵ－１３２７は、ＳＭＡＲＣＡ４の遺伝子に短縮型の欠損変異を有するヒトがん細胞株であり、ＮＣＩ－Ｈ１７０３はＳＭＡＲＣＡ４の遺伝子のスプライシングサイトに変異を有するヒトがん細胞株である。また、ＮＣＩ－Ｈ１７０３、ＮＣＩ－Ｈ２３、ＮＣＩ－Ｈ５２２、ＳＢＣ－５、ＳＫ－ＨＥＰ－１、ＮＣＩ－Ｈ８３８は、イムノブロット分析においてＳＭＡＲＣＡ４タンパク質の発現が検出されないヒトがん細胞株である。また、ＮＣＩ－Ｈ１７０３、ＮＣＩ－Ｈ２３、ＮＣＩ－Ｈ５２２、ＳＢＣ－５は、イムノブロット分析においてＳＭＡＲＣＡ２タンパク質が検出されないヒトがん細胞株である。Ｂ１２０３Ｌ、ＯＶＩＳＥ、ＴＯＶ－２１Ｇは、ＡＲＩＤ１Ａの遺伝子に短縮型の欠損変異を有するヒトがん細胞株であり、Ｂ１２０３ＬはＡＲＩＤ２の遺伝子に短縮型の欠損変異を有するヒトがん細胞株であり、ＯＶＩＳＥはＡＲＩＤ１Ｂの遺伝子に短縮型の欠損変異を有するヒトがん細胞株であり、ＮＣＩ－Ｈ８３８はＢＣＬ１１Ｂの遺伝子に短縮型の欠損変異を有するヒトがん細胞株である。他方、ＮＣＩ－Ｈ３５８、ＮＣＩ－Ｈ２１２２、ＮＣＩ－Ｈ２１１０、ＮＣＩ－Ｈ１７９２、ＮＣＩ－Ｈ１４３７、ＭＯＲ、ＣＯＶ３６２、及びＭＫＮ－４５は、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の遺伝子の機能欠失型変異及びタンパク質の発現に関する情報が公表されていないヒトがん細胞株である。
　（２）短鎖干渉（ｓｉ）ＲＮＡ
　ＧＰＸ４の発現抑制には、ＯＮ－ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ　ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ　ｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社製）を用いた。トランスフェクションには、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、商品コード：１３７７８１５０）を用いた。また、陰性対照には非標的化ｓｉＲＮＡ（ＯＮ－ＴＡＲＧＥＴ　ｐｌｕｓ　Ｎｏｎ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　Ｃｏｎｔｒｏｌ、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社商品コード：Ｄ－００１８１０－０１、配列番号：６０）を、陽性対照にはＰＬＫ１（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社商品コード：Ｊ－００３２９０－０９、配列番号：５９）を用いた。各ｓｉＲＮＡの希釈には５×ｓｉＲＮＡ　ｂｕｆｆｅｒ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社製：Ｂ－００２０００－ＵＢ－１００）をｎｕｃｌｅａｓｅ　ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ社製：ＡＭ９９３２）を用いて５倍希釈した１×ｓｉＲＮＡ　ｂｕｆｆｅｒを用いて溶解した。
　（３）ＧＰＸ４の発現抑制試験
　上記（１）の表４に示す各がん細胞株において、ＧＰＸ４の発現抑制による細胞増殖抑制活性を評価した。９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ　ｂｉｏ－ｏｎｅ社製）に各細胞株を下記の表５に記載の播種数（１）又は播種数（２）となるように１００μＬ／ｗｅｌｌずつ播種した。トランスフェクション評価には、下記の表６に示す、ＧＰＸ４　ｓｉＲＮＡ（＃１、＃２、＃３）、陰性対照（ＯＮ－ＴＡＲＧＥＴ　ｐｌｕｓ　Ｎｏｎ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　Ｃｏｎｔｒｏｌ）、陽性対照（ＰＬＫ１　ｓｉＲＮＡ）を用いた。各ｓｉＲＮＡは終濃度０．１～１０ｎＭとし、トランスフェクションには、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、商品コード：１３７７８１５０）を用いた。７日間培養後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ２．０　Ｃｅｌｌ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて細胞生存のマーカーである細胞内ＡＴＰを測定した。ＧＰＸ４の発現抑制をした際の細胞増殖阻害率は、陰性対照をトランスフェクションして７日間培養後の値及び陽性対照をトランスフェクションして７日間培養後の値を、それぞれ、０％及び１００％として算出した。
　ＮＣＩ－Ｈ１７９２、ＭＯＲ、ＮＣＩ－Ｈ２１１０、ＮＣＩ－Ｈ５２２、ＮＣＩ－Ｈ２３、及びＳＮＵ－１３２７の各細胞株（肺がん細胞株）における、ＧＰＸ４　ｓｉＲＮＡ　＃１又は＃２によりＧＰＸ４の発現抑制をした際の細胞増殖阻害率（ＣＧＩ（％））を図１に示す。また、図１とは別時に試験を実施した、表４に示す各細胞株（肺がん細胞株、卵巣がん細胞株、肝臓がん細胞株、胃がん細胞株を含む）における、ＧＰＸ４　ｓｉＲＮＡ　＃２によりＧＰＸ４の発現抑制をした際の細胞増殖阻害率（ＣＧＩ（％））を図２に、ＧＰＸ４　ｓｉＲＮＡ　＃３によりＧＰＸ４の発現抑制をした際の細胞増殖阻害率（ＣＧＩ（％））を図３に、それぞれ示す。
　（４）ＧＰＸ４の活性阻害試験１
　各がん細胞株において、ＧＰＸ４阻害剤による細胞増殖抑制活性を評価した。ＧＰＸ４阻害剤には、ＧＰＸ４の酵素活性を阻害する化合物であることが報告されている、低分子のＧＰＸ４阻害剤であるＭＬ２１０（ＣＡＳ番号：１３６０７０５－９６－９）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
又はＲＳＬ３（ＣＡＳ番号：１２１９８１０－１６－８）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
を用いた。
　これら化合物をそれぞれ添加して各細胞株を下記の表５に記載の播種数（２）となるように１００μＬ／ｗｅｌｌずつ播種した。７日間培養後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ２．０　Ｃｅｌｌ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて細胞生存のマーカーである細胞内ＡＴＰを測定し、前記化合物の溶媒（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ　ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（ＤＭＳＯ）又は水）のみを添加して７日間培養後の各がん細胞株における細胞内ＡＴＰ量を１００％として、細胞生存率を算出した。各化合物の濃度と細胞生存率とから得られた細胞生存曲線からＩＣ５０（５０％　Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（μＭ））を算出した。ＧＰＸ４阻害剤としてＭＬ２１０を用いたときの各細胞株におけるＩＣ５０（μＭ）を図４に、ＧＰＸ４阻害剤としてＲＳＬ３を用いたときの各細胞株におけるＩＣ５０（μＭ）を図５に、それぞれ示す。
　（５）ＧＰＸ　ｆａｍｉｌｙタンパク質の発現抑制試験
　各がん細胞株において、ＧＰＸ　ｆａｍｉｌｙタンパク質であるＧＰＸ１～ＧＰＸ８の発現抑制による細胞増殖抑制活性を評価した。９６ウェルプレートに各細胞株を下記の表５に記載の播種数（２）となるように１００μＬ／ｗｅｌｌずつ播種した。トランスフェクション評価には、下記の表６に示す、ＧＰＸ１　ｓｉＲＮＡ（＃１、＃２）、ＧＰＸ２　ｓｉＲＮＡ（＃１、＃２）、ＧＰＸ３　ｓｉＲＮＡ（＃１、＃２）、ＧＰＸ４　ｓｉＲＮＡ（＃１、＃２）、ＧＰＸ５　ｓｉＲＮＡ（＃１、＃２）、ＧＰＸ６　ｓｉＲＮＡ（＃１、＃２）、ＧＰＸ７　ｓｉＲＮＡ（＃１、＃２）、及びＧＰＸ８　ｓｉＲＮＡ（＃１、＃２）（いずれもＤｈａｒｍａｃｏｎ社）をそれぞれ用いた。各ｓｉＲＮＡは終濃度５ｎＭ又は１０ｎＭとし、トランスフェクションにはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社商品コード：１３７７８１５０）を用いた。７日間培養後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ２．０　Ｃｅｌｌ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて細胞生存のマーカーである細胞内ＡＴＰを測定した。各ＧＰＸ　ｆａｍｉｌｙタンパク質の発現抑制をした際の細胞増殖阻害率は、陰性対照をトランスフェクションして７日間培養後の値及び陽性対照をトランスフェクションして７日間培養後の値を、それぞれ、０％及び１００％として算出した。ＮＣＩ－Ｈ２１１０、ＮＣＩ－Ｈ５２２、及びＮＣＩ－Ｈ２３の各細胞株における各ＧＰＸ　ｆａｍｉｌｙタンパク質の発現抑制をした際の細胞増殖阻害率（ＣＧＩ（％））を図６に示す。
　（６）グルタチオン合成関与タンパク質の発現抑制試験
　各がん細胞株において、グルタチオン合成に関与するタンパク質（グルタチオン合成関与タンパク質）の発現抑制による細胞増殖抑制活性を評価した。９６ウェルプレートに各細胞株を下記の表５に記載の播種数（２）となるように１００μＬ／ｗｅｌｌずつ播種した。トランスフェクション評価には、下記の表６に示す、ＧＰＸ４　ｓｉＲＮＡ（＃１、＃２）、ＧＣＬＣ　ｓｉＲＮＡ（＃１、＃２）、ＧＣＬＭ　ｓｉＲＮＡ（＃１、＃２）、ＧＳＳ　ｓｉＲＮＡ（＃１、＃２）、ＭＧＳＴ１　ｓｉＲＮＡ（＃１、＃２）、ＭＧＳＴ３　ｓｉＲＮＡ（＃１、＃２）、ＧＳＲ　ｓｉＲＮＡ（＃１、＃２）、及びＧ６ＰＤ　ｓｉＲＮＡ（＃１、＃２）（いずれもＤｈａｒｍａｃｏｎ社）をそれぞれ用いた。各ｓｉＲＮＡは終濃度５ｎＭとし、トランスフェクションにはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社商品コード：１３７７８１５０）を用いた。７日間培養後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ２．０　Ｃｅｌｌ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて細胞生存のマーカーである細胞内ＡＴＰを測定した。各グルタチオン合成関与タンパク質の発現抑制をした際の細胞増殖阻害率は、陰性対照をトランスフェクションして７日間培養後の値及び陽性対照をトランスフェクションして７日間培養後の値を、それぞれ、０％及び１００％として算出した。ＮＣＩ－Ｈ２１１０、ＮＣＩ－Ｈ５２２、及びＮＣＩ－Ｈ２３の各細胞株における各グルタチオン合成関与タンパク質の発現抑制をした際の細胞増殖阻害率（ＣＧＩ（％））を図７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　表５には、各細胞株の各試験における播種数、並びに、各細胞株の培養液及び入手元を示す。表６には、各ｓｉＲＮＡの配列を示す配列番号、並びに、各ｓｉＲＮＡが発現抑制をする対象の遺伝子のＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑデータベースにおけるＩＤ（ＧＥＮＥ　ＩＤ）、参照ＩＤ（ＮＣＢＩ参照ＩＤ）、及びＧＩ　Ｎｕｍｂｅｒを示す。
　（７）ＧＰＸ４の活性阻害試験２（ＧＣＬＣ阻害剤との比較試験）
　各がん細胞株において、ＧＰＸ４阻害剤による細胞増殖抑制活性を評価した。ＧＰＸ４阻害剤には、上記のＭＬ２１０又はＲＳＬ３を用いた。また、比較対照として、グルタチオン合成に関与するタンパク質ＧＣＬＣ（グルタチオン合成の律速酵素であるＧｌｕｔａｍａｔｅ－ｃｙｓｔｅｉｎｅ　ｌｉｇａｓｅ（ＧＣＬ）の触媒サブユニット）の阻害剤であるｂｕｔｈｉｏｎｉｎｅ　ｓｕｌｐｈｏｘｉｍｉｎｅ（ＢＳＯ、ＣＡＳ番号：８３７３０－５３－４）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
を用いた。これら化合物をそれぞれ添加して各細胞株を上記の表５に記載の播種数（２）となるように１００μＬ／ｗｅｌｌずつ播種した。７日間培養後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ２．０　Ｃｅｌｌ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて細胞生存のマーカーである細胞内ＡＴＰを測定し、前記化合物の溶媒（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ　ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（ＤＭＳＯ）又は水）のみを添加して７日間培養後の各がん細胞株における細胞内ＡＴＰ量を１００％として、細胞生存率を算出した。各化合物の濃度と細胞生存率とから得られた細胞生存曲線からＩＣ５０（５０％　Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（μＭ））を算出した。
　ＭＬ２１０、ＲＳＬ３、又はＢＳＯを用いたときの、ＭＯＲ、ＮＣＩ－Ｈ３５８、ＮＣＩ－Ｈ２３、及びＮＣＩ－Ｈ５２２の各細胞株におけるＩＣ５０（μＭ）を図８に示す。
　（８）ＳＫ－ＨＥＰ－１担癌マウスに対するＭＬ２１０の薬効試験
　Ｉｎ　ｖｉｖｏでのＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子欠損がんに対するＧＰＸ４阻害剤の有効性を検討するために、ＳＫ－ＨＥＰ－１（ＳＭＡＲＣＡ４の機能抑制型のヒトがん細胞株）を移植したマウス（ＳＫ－ＨＥＰ－１担癌マウス）に対するＭＬ２１０の投与試験を行った。具体的には、先ず、ＳＫ－ＨＥＰ－１をｉｎ　ｖｉｔｒｏで培養し、マウスへの移植当日に２．５ｇ／Ｌ－Ｔｒｉｐｓｉｎ／１ｍｍｏｌ－ＥＤＴＡ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ナカライテスク社製、商品コード：３５５５４－６４）を用いて回収し、Ｈａｎｋｓ’Ｂａｌａｎｃｅｄ　Ｓａｌｔ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製、商品コード：Ｈ９２６９）で希釈したＭａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、商品コード：３５６２３４）溶液（最終濃度５０％）に細胞を２．５Ｅ７　ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁した。調製した細胞懸濁液を、ＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ／ｎｕマウス（ＣＡｎＮ．Ｃｇ－Ｆｏｘｎ１＜ｎｕ＞／ＣｒｌＣｒｌｊ、Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ社）の鼠蹊部に０．２ｍＬずつ移植した。
　次いで、腫瘍（がん細胞）の生着が確認できたマウス（ＳＫ－ＨＥＰ－１担癌マウス）に対して、同確認ができ次第、１０％　Ｄｉｍｅｔｈｙｌ　ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（Ｗａｋｏ社製、商品コード：０４３－０７２１６）、１０％　Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製、商品コード：Ｃ５１３５）、１５％　Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ　Ｇｌｙｃｏｌ　４００（Ｗａｋｏ社製、商品コード：１６１－０９０６５）、及び１５％　ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ－β－ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ（日本食品化工社製、商品コード：７５８５－３９－９）の混合液に、ＭＬ２１０を所定の濃度で懸濁した投与液を１日１回、所定の容量（２０ｍＬ／ｋｇ）で、投与量が１日１００ｍｇ／ｋｇとなるように経口投与した。ＳＫ－ＨＥＰ－１の移植日を０日として、ＭＬ２１０の投与を１１日目に開始し、１１、１４、１８日目に、腫瘍の体積を測定した。腫瘍の体積は、電子ノギス（Ｍｉｔｕｔｏｙｏ社製、商品コード：ＣＤ－１５ＡＸ）を用いて、腫瘍の短径及び長径を測定し、最小二乗法によってそれぞれ算出した。また、ＭＬ２１０を含有しない前記混合液（Ｖｅｈｉｃｌｅ）のみを投与したＳＫ－ＨＥＰ－１担癌マウスについても同様に、ＳＫ－ＨＥＰ－１の移植日を０日として、Ｖｅｈｉｃｌｅの投与を１１日目に開始し、１１、１４、１８日目に、腫瘍の体積を測定した。ＭＬ２１０を投与したＳＫ－ＨＥＰ－１担癌マウスの群（ＭＬ２１０）又は前記混合液を投与したＳＫ－ＨＥＰ－１担癌マウスの群（Ｖｅｈｉｃｌｅ：ＭＬ２１０の投与無し）における腫瘍の体積（Ｔｕｍｏｒ　ｖｏｌｕｍｅ）と、ＳＫ－ＨＥＰ－１移植後の時間（Ｄａｙｓ　ａｆｔｅｒ　ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ）との関係を図９に示す。
　２．結果
　（１）ＧＰＸ４の発現抑制試験
　図１に示したように、ＧＰＸ４の発現抑制試験では、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子であるＳＭＡＲＣＡ４の遺伝子に欠損変異を有する、及び／又は、イムノブロット解析によってＳＭＡＲＣＡ４タンパク質が検出されないがん細胞株において、細胞増殖阻害率が９０％以上と、顕著な細胞増殖阻害が認められた。さらに、図２及び図３に示したように、ＳＭＡＲＣＡ４の他にも、別のＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子（例えば、ＳＭＡＲＣＡ２、ＡＲＩＤ１Ａ、ＡＲＩＤ１Ｂ、ＡＲＩＤ２、ＢＣＬ１１Ｂ）の少なくともいずれかの遺伝子に欠損変異を有する、及び／又は、これら因子の少なくともいずれかの発現がイムノブロット解析によって検出されないがん細胞株においても、ＧＰＸ４の発現抑制をした際の細胞増殖阻害率が９０％以上と、顕著な細胞増殖阻害が認められた。これらの結果から、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制が生じているがん細胞株の生存は、ＧＰＸ４の機能に強く依存していることが示された。
　（２）ＧＰＸ４の活性阻害試験１
　また、図４及び図５に示したように、ＧＰＸ４の活性阻害試験１では、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子（例えば、ＳＭＡＲＣＡ４、ＳＭＡＲＣＡ２、ＡＲＩＤ１Ａ、ＡＲＩＤ１Ｂ、ＡＲＩＤ２、ＢＣＬ１１Ｂ）の少なくともいずれかの遺伝子に欠損変異を有する、及び／又は、これら因子の少なくともいずれかの発現がイムノブロット解析によって検出されないがん細胞株に対して、ＧＰＸ４阻害剤を添加した場合には、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制が生じていない細胞株に比べて、顕著な細胞増殖阻害が認められた。
　上記（１）及び（２）の結果から、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制が生じているがん細胞の増殖を抑制する（抗腫瘍活性を得る）ためには、ＧＰＸ４を阻害（発現抑制や活性阻害）することが有効であることが示された。
　（３）ＧＰＸ　ｆａｍｉｌｙタンパク質の発現抑制試験
　図６に示したように、ＧＰＸ　ｆａｍｉｌｙタンパク質の発現抑制試験では、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子であるＳＭＡＲＣＡ４の遺伝子に欠損変異を有する、及び／又は、イムノブロット解析によってＳＭＡＲＣＡ４タンパク質が検出されないがん細胞株において、ＧＰＸ　ｆａｍｉｌｙタンパク質の中でも、特にＧＰＸ４の発現を抑制した場合にのみ、顕著な細胞増殖阻害が認められた。この結果から、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子（例えば、ＳＭＡＲＣＡ４）の機能抑制が生じているがん細胞に対して抗腫瘍活性を得るためには、ＧＰＸ４を阻害することが重要であることが示された。
　（４）グルタチオン合成関与タンパク質の発現抑制試験
　図７に示したように、グルタチオン合成関与タンパク質の発現抑制試験では、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子であるＳＭＡＲＣＡ４の遺伝子に欠損変異を有する、及び／又は、イムノブロット解析によってＳＭＡＲＣＡ４タンパク質が検出されないがん細胞株において、グルタチオン合成関与タンパク質の中でも、特にＧＰＸ４の発現を抑制した場合にのみ、顕著な細胞増殖阻害が認められた。この結果からも、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子（例えば、ＳＭＡＲＣＡ４）の機能抑制が生じているがん細胞に対して抗腫瘍活性を得るためには、ＧＰＸ４を阻害することが重要であることが示された。
　（５）ＧＰＸ４の活性阻害試験２（ＧＣＬＣ阻害剤との比較試験）
　図８に示したように、ＧＰＸ４の活性阻害試験２では、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子であるＳＭＡＲＣＡ４の遺伝子に欠損変異を有する、及び／又は、イムノブロット解析によってＳＭＡＲＣＡ４タンパク質が検出されないがん細胞株に対して、ＧＰＸ４阻害剤を添加した場合には、ＧＣＬＣ阻害剤であるＢＳＯと比較して顕著な細胞増殖阻害が認められた。この結果からも、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子（例えば、ＳＭＡＲＣＡ４）の機能抑制が生じているがん細胞に対して抗腫瘍活性を得るためには、ＧＰＸ４の阻害をすることが有効であることが示された。
　（６）ＳＫ－ＨＥＰ－１担癌マウスに対するＭＬ２１０の薬効試験
　図９に示したように、ＧＰＸ４阻害剤は、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子であるＳＭＡＲＣＡ４の遺伝子に欠損変異を有する、及び／又は、イムノブロット解析によってＳＭＡＲＣＡ４タンパク質が検出されないがん細胞（ＳＭＡＲＣＡ４の機能抑制型のがん細胞）を含むがん（腫瘍）に対して、ｉｎ　ｖｉｖｏでも抗腫瘍活性を示した。具体的には、ＳＫ－ＨＥＰ－１担癌マウスに対してＭＬ２１０を投与した群においては、Ｖｅｈｉｃｌｅを投与した群と比較して腫瘍の体積の増大が抑制され、顕著な抗腫瘍活性が認められた。
　以上説明したように、本発明によれば、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制を指標として、効率的に、ＧＰＸ４阻害剤によるがん治療への感受性を予測することが可能となる。また、本発明によれば、がん患者由来の試料におけるＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制の有無を検出し、当該変異が検出された患者を選別した上で、当該患者に対してＧＰＸ４阻害剤によるがんの治療を施すことができる。このため、がんの治療成績を大きく向上させることが可能となる。また、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の遺伝子に対するプローブやプライマー、及びＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子に対する抗体を用いることで、このようなＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制の有無の検出によるコンパニオン診断を効率的に行うことが可能となる。
配列番号：２
＜２２３＞　Ｘａａはセレノシステインを示す
配列番号：５９
＜２２３＞　ＰＬＫ１
配列番号：６０
＜２２３＞　ＯＮ－ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ　Ｎｏｎ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　Ｃｏｎｔｒｏｌ
配列番号：６１
＜２２３＞　ＧＰＸ１　ｓｉＲＮＡ　＃１
配列番号：６２
＜２２３＞　ＧＰＸ１　ｓｉＲＮＡ　＃２
配列番号：６３
＜２２３＞　ＧＰＸ２　ｓｉＲＮＡ　＃１
配列番号：６４
＜２２３＞　ＧＰＸ２　ｓｉＲＮＡ　＃２
配列番号：６５
＜２２３＞　ＧＰＸ３　ｓｉＲＮＡ　＃１
配列番号：６６
＜２２３＞　ＧＰＸ３　ｓｉＲＮＡ　＃２
配列番号：６７
＜２２３＞　ＧＰＸ４　ｓｉＲＮＡ　＃１
配列番号：６８
＜２２３＞　ＧＰＸ４　ｓｉＲＮＡ　＃２
配列番号：６９
＜２２３＞　ＧＰＸ５　ｓｉＲＮＡ　＃１
配列番号：７０
＜２２３＞　ＧＰＸ５　ｓｉＲＮＡ　＃２
配列番号：７１
＜２２３＞　ＧＰＸ６　ｓｉＲＮＡ　＃１
配列番号：７２
＜２２３＞　ＧＰＸ６　ｓｉＲＮＡ　＃２
配列番号：７３
＜２２３＞　ＧＰＸ７　ｓｉＲＮＡ　＃１
配列番号：７４
＜２２３＞　ＧＰＸ７　ｓｉＲＮＡ　＃２
配列番号：７５
＜２２３＞　ＧＰＸ８　ｓｉＲＮＡ　＃１
配列番号：７６
＜２２３＞　ＧＰＸ８　ｓｉＲＮＡ　＃２
配列番号：７７
＜２２３＞　ＧＣＬＣ　ｓｉＲＮＡ　＃１
配列番号：７８
＜２２３＞　ＧＣＬＣ　ｓｉＲＮＡ　＃２
配列番号：７９
＜２２３＞　ＧＣＬＭ　ｓｉＲＮＡ　＃１
配列番号：８０
＜２２３＞　ＧＣＬＭ　ｓｉＲＮＡ　＃２
配列番号：８１
＜２２３＞　ＧＳＳ　ｓｉＲＮＡ　＃１
配列番号：８２
＜２２３＞　ＧＳＳ　ｓｉＲＮＡ　＃２
配列番号：８３
＜２２３＞　ＭＧＳＴ１　ｓｉＲＮＡ　＃１
配列番号：８４
＜２２３＞　ＭＧＳＴ１　ｓｉＲＮＡ　＃２
配列番号：８５
＜２２３＞　ＭＧＳＴ３　ｓｉＲＮＡ　＃１
配列番号：８６
＜２２３＞　ＭＧＳＴ３　ｓｉＲＮＡ　＃２
配列番号：８７
＜２２３＞　ＧＳＲ　ｓｉＲＮＡ　＃１
配列番号：８８
＜２２３＞　ＧＳＲ　ｓｉＲＮＡ　＃２
配列番号：８９
＜２２３＞　Ｇ６ＰＤ　ｓｉＲＮＡ　＃１
配列番号：９０
＜２２３＞　Ｇ６ＰＤ　ｓｉＲＮＡ　＃２
配列番号：９１
＜２２３＞　ＧＰＸ４　ｓｉＲＮＡ　＃３

Claims (17)

  1. 　ＧＰＸ４を阻害する化合物を有効成分として含有し、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制が検出されるがん細胞を含むがんの治療剤である、がん治療剤。
  2. 　ＧＰＸ４を阻害する化合物を有効成分として含有し、がん患者由来の試料に含まれるがん細胞においてＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制が検出されるがん患者を治療するための治療剤である、がん治療剤。
  3. 　ＧＰＸ４を阻害する化合物を有効成分として含有し、がん患者由来の試料に含まれるがん細胞においてＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制が検出されるがん患者に投与するための治療剤である、がん治療剤。
  4. 　がん細胞の、ＧＰＸ４阻害剤に対する感受性を予測する方法であり、
    　がん細胞におけるＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制が検出されたがん細胞を、ＧＰＸ４阻害剤に対して感受性があると予測する工程、
    を含む、方法。
  5. 　がん患者の、ＧＰＸ４阻害剤による治療に対する感受性を予測する方法であり、
    　がん患者由来の試料に含まれるがん細胞においてＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制が検出されたがん患者を、ＧＰＸ４阻害剤による治療に対して感受性があると予測する工程、
    を含む、方法。
  6. 　ＧＰＸ４阻害剤によるがん治療の対象とするがん患者を選別する方法であり、
    　がん患者由来の試料に含まれるがん細胞においてＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制が検出されたがん患者を、ＧＰＸ４阻害剤によるがん治療の対象として選別する工程、
    を含む、方法。
  7. 　ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制が検出されるがん細胞の増殖を抑制する方法であり、
    　ＧＰＸ４阻害剤と、前記ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制が検出されるがん細胞とを接触させる工程、
    を含む、方法。
  8. 　がんを治療する方法であり、
    　がん患者由来の試料に含まれるがん細胞においてＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制が検出されたがん患者に対して、ＧＰＸ４阻害剤を投与する工程、
    を含む、方法。
  9. 　ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制が検出されるがん細胞を含むがんの治療に用いる化合物のスクリーニング方法であり、
    　ＧＰＸ４を阻害するか否かを指標として化合物を選別する工程、
    を含む、方法。
  10. 　前記ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子がＢＡＦ複合体因子である、請求項１～３のうちのいずれか一項に記載のがん治療剤。
  11. 　前記ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子がＢＡＦ複合体因子である、請求項４～９のうちのいずれか一項に記載の方法。
  12. 　前記ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子が、ＳＭＡＲＣＡ２、ＳＭＡＲＣＡ４、ＡＲＩＤ１Ａ、ＡＲＩＤ１Ｂ、ＡＲＩＤ２、及びＢＣＬ１１Ｂからなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１～３のうちのいずれか一項に記載のがん治療剤。
  13. 　前記ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子が、ＳＭＡＲＣＡ２、ＳＭＡＲＣＡ４、ＡＲＩＤ１Ａ、ＡＲＩＤ１Ｂ、ＡＲＩＤ２、及びＢＣＬ１１Ｂからなる群から選択される少なくとも１種である、請求項４～９のうちのいずれか一項に記載の方法。
  14. 　前記ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制が、前記ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子を構成因子とするＳＷＩ／ＳＮＦ複合体の活性低下及び／又は前記ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の発現低下である、請求項１～３のうちのいずれか一項に記載のがん治療剤。
  15. 　前記ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制が、前記ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子を構成因子とするＳＷＩ／ＳＮＦ複合体の活性低下及び／又は前記ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の発現低下である、請求項４～９のうちのいずれか一項に記載の方法。
  16. 　前記ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制が、前記ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の遺伝子の機能欠失型変異である、請求項１～３のうちのいずれか一項に記載のがん治療剤。
  17. 　前記ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の機能抑制が、前記ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体因子の遺伝子の機能欠失型変異である、請求項４～９のうちのいずれか一項に記載の方法。
     
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