WO2021133084A1 - 베로 세포 배양용 저혈청 배지 조성물 및 이의 이용 - Google Patents

베로 세포 배양용 저혈청 배지 조성물 및 이의 이용 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a low-serum medium composition for culturing Vero cells, and a method for culturing Vero cells and a virus production method using the same.
  • Vero cells are a continuous cell line widely approved and used for the manufacture of viral vaccines. Vero cells were first isolated from African green monkey kidney cells and are used in the production of an inactivated poliovirus vaccine (IPV), a live oral polio vaccine, and a rabies vaccine. Vero cells have wide susceptibility to various viruses, are reported to be safe from carcinogenesis, and do not pose a threat to human health by the World Health Organization, so Vero cell-derived vaccines are currently being supplied worldwide.
  • IPV inactivated poliovirus vaccine
  • Vero cells have wide susceptibility to various viruses, are reported to be safe from carcinogenesis, and do not pose a threat to human health by the World Health Organization, so Vero cell-derived vaccines are currently being supplied worldwide.
  • a medium to which an animal-derived material eg, serum, trypsin, albumin, etc.
  • an animal-derived material eg, serum, trypsin, albumin, etc.
  • serum contains substances that promote the survival and proliferation of cells, such as nutrients, hormones, growth factors, and cytokines, and plays an essential function in cell growth, protects cells from physical damage or shear force, and adheres cells to the container. Since it facilitates attachment and spreading, there is an advantage that the culture medium can be mimicked similarly to the in vivo environment.
  • Vero cells are adherent cells, and are generally cultured by attaching to a microcarrier in a normal medium containing 10% Fetal Bovine Serum (FBS).
  • FBS Fetal Bovine Serum
  • the main component contained in FBS is albumin, which is known as a protein that plays an important role in cell adhesion.
  • albumin which is known as a protein that plays an important role in cell adhesion.
  • NCS newborn calf serum
  • hydrolysate 1-6 g/L hydrolysate 1-6 g/L
  • medium composition for culturing Vero cells comprising 1 to 6 mg/L of insulin.
  • NCS newborn calf serum
  • NCS newborn calf serum
  • hydrolysate 1-6 g/L hydrolysate 1-6 g/L
  • virus production method comprising the step of culturing Vero cells in a medium composition comprising 1-6 mg/L of insulin.
  • Figure 2 shows the results of Vero cell culture in the medium conditions according to an example (Experiment No. 2) of the present application.
  • Figure 3 shows the results of Vero cell culture in the medium conditions according to an example (Experiment No. 3) of the present application.
  • Figure 4 shows the results of Vero cell culture in the medium conditions according to an example (Experiment No. 4) of the present application.
  • Figure 5 shows the results of Vero cell culture in the medium conditions according to an example (Experiment No. 5) of the present application.
  • Figure 6 shows the results of Vero cell culture in the medium conditions according to an example (Experiment No. 6) of the present application.
  • newborn calf serum (NCS) 1-7% (v/v); hydrolysate 1-6 g/L; And insulin comprising 1-6 mg/L, a medium composition for culturing Vero cells is provided.
  • the medium composition may not include Fetal Bovine Serum (FBS).
  • FBS Fetal Bovine Serum
  • the hydrolyzate may be an animal component-free, protein-free hydrolyzate.
  • the Vero cells may be cultured attached to a microcarrier (microcarrier).
  • the Vero cells may include culturing attached to a microcarrier (microcarrier).
  • the medium may include MEM medium.
  • a method for culturing Vero cells comprising the step of culturing Vero cells in the medium composition.
  • the culture may be performed on a scale of 10mL to 1000L.
  • the method comprising: infecting Vero cells cultured in the medium composition with a virus; and culturing the Vero cells infected with the virus, a virus production method is provided.
  • the culture of Vero cells infected with the virus may be performed on a scale of 10mL to 2000L.
  • Vero cell refers to any Vero cell line or cell line cultured or passaged therefrom, including, but not limited to, genetically modified Vero cells.
  • known Vero cells include VERO (ATCC Number CCL-81), VERO C1008 (ATCC Number CRL-1586), VERO 76 (ATCC Number CRL-1587) and Vero-SF-ACF (ATCC Number CCL-) 81.5) can be exemplified.
  • Vero cell culture includes any procedure in which Vero cells are grown or maintained in a viable state.
  • culturing of Vero cells includes not only a process in which the cells grow or proliferate, but also a process in which the number of cells is not substantially increased but a viable state is maintained.
  • the Vero cells herein may be used as a vehicle for a viral vaccine, or a treatment regimen based on a virus or viral vector.
  • Vero cells may be infected with a virus to produce a virus.
  • the virus that can be produced from Vero cells can be an attenuated virus, a recombinant virus, or an oncolytic virus.
  • viruses that can be produced in Vero cells include poliovirus, enterovirus, IBDV (infectious cyst virus), rotavirus, measles virus, smallpox virus, influenza virus, Japanese encephalitis virus, rabies virus, Newcastle disease virus, respiratory syncytial virus Virus (RSV), Sendai virus, simian virus 40 (SV40), chikungunia virus and dengue virus may be exemplified, but is not limited thereto.
  • culture medium is used for culturing Vero cells and refers to a composition containing the components necessary for growth.
  • any medium generally known in the art such as MEM, DMEM, DMEM/F12, MDSS2, CCM5, Medium 199, or RPMI, may be used as the basal medium.
  • Such culture medium may contain a number of components including amino acids, vitamins, organic and inorganic salts and carbohydrate sources that support the culture of Vero cells.
  • composition comprising (a given component)” can mean comprising or constituting essentially of a component other than the component described. .
  • the medium for Vero cell culture herein is, in the basal medium, newborn calf serum (NCS) 1 to 7% (v/v), hydrolysate 1 to 6 g/L, and insulin 1 Medium supplemented with ⁇ 6 mg/L.
  • NCS newborn calf serum
  • hydrolysate 1 to 6 g/L
  • insulin 1 Medium supplemented with ⁇ 6 mg/L.
  • the medium for Vero cell culture herein is, in the basal medium, newborn calf serum (NCS) 1 to 7% (v/v), for example, 1 to 7% (v/v), 1 to 6% (v/v), 1-5% (v/v), 1-4% (v/v), 1-3% (v/v), 1% (v/v), 2% (v) /v), 3% (v/v), 4% (v/v), 5% (v/v), 6% (v/v) or 7% (v/v); Hydrolysate 1-6 g/L, such as 1-6 g/L, 1-5 g/L, 1-4 g/L, 1-3 g/L, 1-2 g/L, 2-4 g/L, 2-3 g/L or 2 g/L; and insulin 1-6 mg/L, such as 1-6 mg/L, 1-5 mg/L, 1-4 mg/L, 1-3 mg/L, 2-6 mg/L, 2-5 Medium supplemented with mg/L, 2-4 mg/
  • Neonatal calf serum is serum from newborn calves, typically from calves of about 20 days or less, such as about 14 days or less, or about 10 days or less, or about 3 to 10 days old, It is sold at 1/10 the price of fetal bovine serum (FBS). It is essential to have price competitiveness in order for the developed vaccine to enter the bidding market, and the use of neonatal bovine serum (NCS) instead of fetal bovine serum (FBS) has a clear cost reduction effect. In addition, neonatal bovine serum (NCS) is more stable in terms of supply than fetal bovine serum (FBS) and has less lot variation, so consistent experimental results can be obtained, and it is advantageous from the viewpoint of animal ethics.
  • NCS neonatal calf serum
  • FBS calf serum
  • FBS fetal bovine serum
  • concentration range may be appropriately increased or decreased within the level of ordinary skill of those skilled in the art when other culture conditions affecting virus productivity are changed.
  • hydrolysate refers to a substance obtained by breaking a peptide bond of a protein, which is derived from milk (eg, casein, whey protein), or animal-derived. It may be of protein (meat, collagen), or of plant origin.
  • the vegetable hydrolyzate can be, but is not limited to, soybean hydrolyzate, wheat hydrolyzate, potato hydrolyzate, cottonseed hydrolyzate, rice hydrolyzate, pea hydrolyzate, or corn hydrolyzate, and the like.
  • animal component and protein produced by different methods such as digestion and processing (animal component-free, protein-free) hydrolyzate can be used.
  • animal component and protein free hydrolysates specifically Hypep TM 1510, Hypep TM 1511, Hypep TM 5603, Sheff-CHO PF ACF, Sheff-CHO Plus PF ACF, Sheff-VAX PF ACF SheffVax Plus PF ACF, SheffVax Plus PF ACF VP and the like may be exemplified, but the scope of the present application is not limited thereto.
  • the hydrolyzate may be included in an amount of 1 to 10 g/L, but since it may have a negative effect on cell growth under high concentration conditions, the experiment was performed by limiting it to 6 g/L in the present Example. Therefore, in a preferred embodiment, considering the concentration that has a positive effect on cell growth, the hydrolyzate is 1-6 g/L, for example, 1-6 g/L, 1-5 g/L, 1-4 g /L, 1-3 g/L, 1-2 g/L, 2-4 g/L, 2-3 g/L or 2 g/L may be given as preferred concentrations. However, the concentration range may be appropriately increased or decreased within the level of ordinary skill of those skilled in the art when other culture conditions affecting virus productivity are changed.
  • the medium composition herein also includes insulin.
  • the insulin may be natural insulin or recombinant insulin, and more specifically, human recombinant insulin, but is not limited thereto.
  • Insulin in the medium composition of the present application is 1-6 mg/L, 1-5 mg/L, 1-4 mg/L, 1-3 mg/L, 2-6 mg/L, 2-5 mg/L, 2 It may contain ⁇ 4 mg/L, 2-3 mg/L or 3 mg/L. However, the concentration range may be appropriately increased or decreased within the level of ordinary skill of those skilled in the art when other culture conditions affecting virus productivity are changed.
  • Vero cells may be cultured by being attached to a carrier such as a microcarrier.
  • a microcarrier has a micro-level diameter and refers to any solid support matrix to which Vero cells can be attached.
  • cells can be cultured in suspension in a liquid medium by attaching the cells to the surface.
  • the material of the microcarrier include plastics such as polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyester, polycarbonate, polyamide, polyacetal and polyurethane, and copolymers thereof; Glass; ceramic; metal; acrylamide; silica; silicone rubber; polylysine; cellulose; dextran; collagen (gelatin); and glycosaminoglycans may be used, but is not limited thereto.
  • a microcarrier is at least about 100 ⁇ m, at least about 200 ⁇ m, at least about 300 ⁇ m, at least about 400 ⁇ m, at least about 500 ⁇ m, at least about 600 ⁇ m, at least about 700 ⁇ m, at least about 800 ⁇ m, at least about 900 ⁇ m, or about It may have a diameter of 1 mm or more, and may be in the form of beads (spherical), disk, strip, sheet, fiber, filament, rod, disk, cube, tube, etc., but is not limited thereto.
  • the microcarrier may be porous.
  • the culture of Vero cells is 10mL to 1000L or more, for example, 10mL to 2000L or more scale can be performed, and it is possible to produce on a scale of 10mL or more in a bioreactor.
  • Bioreactor refers to any vessel that can be used to culture Vero cells, including a fixed bed bioreactor having a fixed bed containing microcarriers.
  • Vero cells may be cultured on a microcarrier in a bioreactor, and as another example, may be suspension cultured in a bioreactor in a batch process or fed-batch batch process.
  • the medium may be exchanged as needed during the culture period.
  • the pH of the medium is preferably about 6 to 8, and may be about 6.5 to 7.5, or about 7.
  • Cultivation can be carried out for about 5 to 9 days at about 35° C. to 40° C., and aeration or agitation may be added as necessary, but is not limited thereto.
  • the dissolved oxygen concentration (DO) during cell culture may be about 60 to 90%, about 70 to 80%, etc., but is not limited thereto.
  • the Vero cells cultured according to the present invention can be used to produce viruses as a vehicle for a viral vaccine or a treatment regimen based on a virus or a viral vector. Accordingly, the present invention also comprises the steps of infecting the Vero cells cultured in the medium composition as described above with a virus; And it provides a virus production method comprising the step of culturing the virus-infected Vero cells.
  • Virus-infected Vero cells can be cultured under conditions optimized for virus propagation.
  • Vero cells may be cultured at a first temperature prior to infection with the virus and cultured at a second temperature after infection with the virus, wherein the second temperature is lower than the first temperature.
  • Vero cells can be cultured at about 37° C. before infection with the virus, ie, before infection, and cultured at about 29° C. to about 37° C. after infection with the virus, ie, after infection.
  • Vero cells may be cultured at about 33° C. after infection with the virus.
  • Vero cells may be cultured at about 30° C. after infection with the virus.
  • the time of infection may be 1 day, 2 days, or 3 or 4 days after cell inoculation.
  • the microcarrier After completion of the virus culture, the microcarrier can be removed and the virus solution containing the virus can be recovered.
  • the recovered virus solution may be filtered through a filtration membrane or the like to remove cell debris, or may be concentrated and/or purified before or after inactivation.
  • concentration method an ultrafiltration method, ultracentrifugation method, dialysis method, etc. can be exemplified.
  • purification method for example, a method using physical properties such as size, density, sedimentation coefficient, etc. of the object to be purified, chemical or physicochemical A method using a reaction (adsorption/desorption, etc.) may be exemplified, but is not limited thereto.
  • Vero cells were attached to microcarriers and cultured in shake flasks or bioreactors.
  • Insulin Recombinant human insulin (Gibco, USA)
  • FBS Fetal Bovine Serum (Hyclone, USA)
  • NCS newborn calf serum (Hyclone, USA)
  • BRX bioreactor (Model: Biostat B, Sartorius, Germany)
  • Vero cells When the concentration of FBS was reduced and hydrolysate was added, the growth effect of Vero cells was confirmed.
  • Vero cells cells derived from ATCC Number CCL-81 were used.
  • MEM medium containing amino acids, vitamins, minerals, glucose, etc. supplemented with 5% FBS was used, and as an experimental group, 2% FBS + 2.5 g/L Hydrolysate, or 1% FBS + 2.5 g/L Hydrolysate was used. Each supplemented MEM medium was used.
  • Vero cells ATCC Number CCL-81-derived cells were used.
  • MEM medium containing amino acids, vitamins, minerals, glucose, etc. supplemented with 5% FBS was used, and as an experimental group, 2% FBS, 1% FBS, 0% FBS, 2% FBS + 2.5 g/L Hydrolysate was used.
  • sample ID FBS Hydrolysate (g/L) Insulin (mg/L) M5 5 0 0 S1 One 0 0 S2 One 0 6 S3 One 6 0 S4 One 6 6 S5 1.5 3 3 S6 1.5 3 3 S7 1.5 3 3 S8 2 0 0 S9 2 0 6 S10 2 6 0 S11 2 6 6 S12 2 2 0 S13 2 2 3 S14 2 2 6 S15 2 4 0 S16 2 4 3 S17 2 4 6
  • the final cell number was the highest in the case of 6 g/L Hydrolysate condition (S10).
  • the condition (S13) supplemented with 3 mg/L insulin was selected as the condition for culturing in the bioreactor. It was determined that the cell growth rate at the initial stage of the culture was fast, which was more favorable for cell growth when fed-batch culture was performed in the bioreactor (FIG. 3).
  • seed culture and main culture were performed using MEM medium supplemented with 5% FBS (#R02), and as an experimental group, 2% NCS + 2 g/L Hydrolysate + 3 mg/L insulin (#R03), Or 2% FBS + 2 g / L Hydrolysate + 3 mg / L insulin was performed in MEM medium supplemented with seed culture and main culture (#R04) (temperature 37 °C, pH 7.2 ⁇ 0.05, DO 50%, culture method: Fed-batch, culture days: seed culture and main culture 18 days culture progress).
  • the culture scale was changed to 2L, 40L and 1000L with a medium (2% NCS + 2 g/L Hydrolysate + 3 mg/L insulin) selected as a medium composition containing NCS, Hydrolysate, and insulin that can replace FBS. It was checked to see if cell growth was maintained by zooming in. (Temperature 37°C, pH 7.2 ⁇ 0.05, DO 50%, culture method: Fed-batch, number of incubation days: seed culture and main culture for 18 days). Vero cells cultured in each condition were infected with the virus and recovered after culturing for 3 to 4 days to compare virus productivity.
  • a medium 2% NCS + 2 g/L Hydrolysate + 3 mg/L insulin
  • the results of comparing cell growth in the medium condition containing FBS and the medium condition containing NCS, Hydrolysate, and insulin at the 1000L scale are shown in FIG. 8, and it was confirmed that the same or higher cell growth was shown even at the 1000L scale.
  • the virus productivity before and after the change to NCS, Hydrolysate, and Insulin composition medium was compared by culture scale and shown in FIG. 8 . After changing the medium, the virus productivity was further increased, and even when it was expanded to a 2000L culture scale, it was possible to confirm the virus productivity of equal or higher.

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Abstract

본 발명은 베로 세포 배양용 저혈청 배지 조성물 및 이를 이용한 베로 세포의 배양 방법 및 바이러스 생산 방법에 관한 것이다.

Description

베로 세포 배양용 저혈청 배지 조성물 및 이의 이용
관련 출원들과의 상호 인용
본 출원은 2019년 12월 24일자 대한민국 특허출원 제10-2019-0174356호에 기초한 우선권의 이익을 주장하며, 상기 출원의 문헌에 개시된 모든 내용은 본 명세서의 참조로서 포함된다.
본 발명은 베로 세포(Vero cell) 배양용 저혈청 배지 조성물 및 이를 이용한 베로 세포의 배양 방법 및 바이러스 생산 방법에 관한 것이다.
베로 세포(Vero cell)는 바이러스 백신 제조에 널리 승인되고 사용되는 연속 계대 세포주(Continuous cell line) 이다. 베로 세포는 아프리카 초록원숭이 신장세포로부터 처음 분리되었고, 소아마비 바이러스 백신(inactivated poliovirus vaccine, IPV), 경구용 소아마비 생백신, 광견병 백신 등의 생산에 이용되고 있다. 베로 세포는 각종 바이러스에 대해 폭넓은 감수성을 가지고 있고, 발암으로부터 안전하다고 보고되었으며, 세계보건기구에 의해 인간의 건강에 위협을 제시하지 않는 것으로 나타나, 베로 세포 유래 백신들이 현재 전세계로 공급되고 있다.
종래 동물 세포를 이용한 백신 생산은, 세포를 증식시키거나 세포에 바이러스를 감염시켜 바이러스를 증식시키는 단계에 동물 유래 물질(예, 혈청, 트립신, 알부민 등)이 첨가된 배지를 사용하는 것이 일반적이었다. 특히, 혈청은 영양분, 호르몬, 성장 인자, 사이토카인 등 세포의 생존과 증식을 촉진하는 물질들을 포함하며 세포 성장에 필수적인 기능을 하고, 물리적 손상이나 전단력으로부터 세포를 보호하고, 부착성 세포가 용기에 부착하고 퍼지는 것을 용이하게 하므로, 배양 배지를 체내 환경과 유사하게 모방할 수 있는 이점이 있다. 그러나, 혈청의 화학적 조성의 복합성으로, 단일한 제품 생산이 어려워세포 성장에 다양한 변수를 제공하고, 단가가 비싸며, 혈청을 사용하여 생산한 백신의 경우 외인성 병원성 인자의 감염 위험이 있고, 복잡한 정제공정(downstream process)을 필요로 하는 등의 단점이 있다.
베로 세포는 부착성 세포로서, 10%의 우태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS)이 포함된 일반 배지에서 마이크로캐리어(microcarrier)에 부착하여 배양되는 것이 일반적이다. FBS 에 포함된 주요 성분은 알부민으로, 세포 부착에 중요한 역할을 하는 단백질로 알려져 있다. 그러나, 전술한 바와 같은 혈청 배지의 단점으로 인하여, 저혈청(serum-reduced) 또는 무혈청(serum-free) 배지의 필요성이 대두되고 있다.
따라서, 혈청의 양을 줄이는 대신 세포 부착에 도움을 주고 세포 성장을 촉진시킬 수 있는 보충제들이 포함된 조성의 배지 개발이 요구된다.
본원의 일 예는, 신생우아혈청(newborn calf serum, NCS) 1~7%(v/v); 가수분해물 (hydrolysate) 1~6 g/L; 및 인슐린 1~6 mg/L 을 포함하는, 베로 세포의 배양용 배지 조성물을 제공한다.
본원의 다른 예는, 신생우아혈청(newborn calf serum, NCS) 1~7%(v/v); 가수분해물 (hydrolysate) 1~6 g/L; 및 인슐린 1~6 mg/L 을 포함하는 배지 조성물에서 베로 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 베로 세포의 배양 방법을 제공한다.
본원의 다른 예는, 신생우아혈청(newborn calf serum, NCS) 1~7%(v/v); 가수분해물 (hydrolysate) 1~6 g/L; 및 인슐린 1~6 mg/L 을 포함하는 배지 조성물에서 베로 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 바이러스 생산 방법을 제공한다.
도 1은 본원의 일 실시예(실험No.1)에 따른 배지 조건에서의 베로 세포 배양 결과를 나타낸다.
도 2는 본원의 일 실시예(실험No.2)에 따른 배지 조건에서의 베로 세포 배양 결과를 나타낸다.
도 3은 본원의 일 실시예(실험No.3)에 따른 배지 조건에서의 베로 세포 배양 결과를 나타낸다.
도 4는 본원의 일 실시예(실험No.4)에 따른 배지 조건에서의 베로 세포 배양 결과를 나타낸다.
도 5는 본원의 일 실시예(실험No.5)에 따른 배지 조건에서의 베로 세포 배양 결과를 나타낸다.
도 6은 본원의 일 실시예(실험No.6)에 따른 배지 조건에서의 베로 세포 배양 결과를 나타낸다.
도 7은 본원의 일 실시예(실험No.7)에 따른 배지 조건에서의 베로 세포 배양 결과를 나타낸다.
도 8은 본원의 일 실시예(실험No.7)에 따른 배지 조건에서의 베로 세포 배양 결과를 나타낸다.
본 발명의 한 측면에 따라 신생우아혈청(newborn calf serum, NCS) 1~7%(v/v); 가수분해물 (hydrolysate) 1~6 g/L; 및 인슐린 1~6 mg/L 을 포함하는, 베로 세포의 배양용 배지 조성물이 제공된다.
일 구현예로, 상기 배지 조성물은 우태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS)을 포함하지 않을 수 있다.
일 구현예로, 상기 가수분해물이, 동물성 요소 및 단백질이 없는(animal component-free, protein-free) 가수분해물일 수 있다.
일 구현예로, 상기 베로 세포가 마이크로캐리어(microcarrier)에 부착되어 배양될 수 있다.
일 구현예로, 상기 베로 세포가 마이크로캐리어(microcarrier)에 부착되어 배양되는 것을 포함할 수 있다.
일 구현예로, 상기 배지가 MEM 배지를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따라, 상기 배지 조성물에서 베로 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 베로 세포의 배양 방법이 제공된다.
일 구현예로, 상기 배양이 10mL 내지 1000L 의 스케일로 행해지는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따라, 상기 배지 조성물에서 배양된 베로 세포에 바이러스를 감염하는 단계; 및 바이러스가 감염된 베로 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 바이러스 생산 방법이 제공된다.
일 구현예로, 상기 바이러스가 감염된 베로 세포의 배양이 10mL 내지 2000L 의 스케일로 행해지는 것일 수 있다.
이하, 본 발명을 보다 자세히 설명한다.
용어 "베로 세포"는 임의의 베로 세포주 또는 이로부터 배양 또는 계대배양된 세포주를 말하며, 유전적으로 변형된 베로 세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 공지된 베로 세포의 비제한적인 예로는, VERO (ATCC Number CCL-81), VERO C1008 (ATCC Number CRL-1586), VERO 76 (ATCC Number CRL-1587) 및 Vero-SF-ACF (ATCC Number CCL-81.5) 등을 예시할 수 있다.
용어 "베로 세포 배양"이란 베로 세포가 생존가능한 상태로 성장하거나 유지되는 임의의 절차를 포함한다. 예를 들어, 베로 세포의 배양은, 세포가 생장 또는 증식하는 과정뿐 아니라, 세포의 수가 실질적으로 증가하지 않으나 생존가능한 상태가 유지되는 과정도 포함한다.
바람직한 예로, 본원에서 베로 세포는 바이러스 백신, 또는 바이러스나 바이러스 벡터 기반의 치료 요법 등의 매개체로 사용될 수 있다. 일예로, 베로 세포는 바이러스에 감염되어 바이러스를 생산할 수 있다. 베로 세포로부터 생산될 수 있는 바이러스는 약독화 바이러스, 재조합 바이러스, 또는 종양용해성 바이러스일 수 있다. 또한, 베로 세포에서 생산될 수 있는 바이러스는 소아마비 바이러스, 엔테로바이러스, IBDV (전염성 F낭병 바이러스), 로타 바이러스, 홍역 바이러스, 천연두 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 광견병 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV), 센다이 바이러스, 시미안 바이러스40(SV40), 치쿤구니아 바이러스 및 뎅기 바이러스 등을 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
용어, "배양용 배지"는 베로 세포를 배양하는데 사용되며 생장에 필요한 성분들을 포함하고 있는 조성물을 말한다. 본원에서 베로 세포의 배지는, MEM, DMEM, DMEM/F12, MDSS2, CCM5, Medium 199, 또는 RPMI와 같은 당업계에 일반적으로 알려진 임의의 배지를 기본 배지로 할 수 있다. 이러한 배양 배지는 베로 세포의 배양을 지지하는 아미노산, 비타민, 유기 및 무기 염 및 탄수화물 공급원을 포함하는 다수의 성분을 포함 할 수 있다.
본 명세서에 기재된 바로서, "(소정의 성분을) 포함하는"은 기재된 성분 이외의 성분을 포함할 수 있는 것 (comprising) 또는 기재된 성분을 필수적으로 포함 (consisting essentially of)하는 것을 의미할 수 있다.
바람직한 예로, 본원에서 베로 세포 배양용 배지는, 기본 배지에 신생우아혈청(newborn calf serum, NCS) 1~7%(v/v), 가수분해물 (hydrolysate) 1~6 g/L, 및 인슐린 1~6 mg/L이 보충된 배지이다.
다른 예로, 본원에서 베로 세포 배양용 배지는, 기본 배지에 신생우아혈청(newborn calf serum, NCS) 1~7%(v/v), 예를 들어 1~7%(v/v), 1~6%(v/v), 1~5%(v/v), 1~4%(v/v), 1~3%(v/v), 1%(v/v), 2%(v/v), 3%(v/v), 4%(v/v), 5%(v/v), 6%(v/v) 또는 7%(v/v); 가수분해물 (hydrolysate) 1~6 g/L, 예를 들어 1~6 g/L, 1~5 g/L, 1~4 g/L, 1~3 g/L, 1~2 g/L, 2~4 g/L, 2~3 g/L 또는 2 g/L; 및 인슐린 1~6 mg/L, 예를 들어 1~6 mg/L, 1~5 mg/L, 1~4 mg/L, 1~3 mg/L, 2~6 mg/L, 2~5 mg/L, 2~4 mg/L, 2~3 mg/L 또는 3 mg/L 이 보충된 배지이다.
신생우아혈청(NCS)은 신생아 송아지의 혈청, 전형적으로는 생후 약 20일 이하, 예를 들어 약 14일 이하, 또는 약 10일 이하, 또는 약 3일 내지 10일의 송아지에서 채취한 혈청으로, 우태아혈청(FBS)에 비해 1/10 가격에 판매되고 있다. 개발한 백신을 입찰시장에 진출시키기 위해서 가격경쟁력을 가지는 것이 필수적인데 우태아혈청(FBS) 대신 신생우아혈청(NCS)을 사용하는 것은 뚜렷한 원가 절감 효과가 있다. 또한 신생우아혈청(NCS)은 우태아혈청(FBS) 보다 공급 면에서 안정적이고 Lot variation이 덜해 일관성 있는 실험결과를 얻을 수 있으며, 동물 윤리 관점에서도 유리하다.
본원의 배지 조성물에서 신생우아혈청(NCS)이 1~7%(v/v)로 함유되어, 베로 세포 배양에 일반적으로 사용되는 조건인 10% FBS 보다 낮은 농도로 사용가능하다. 본원 실시예에 의하면 1~7%(v/v) NCS 조건에서 세포 성장이 촉진되며 상기 범위 내에서 바이러스 생산성이 유사한 결과를 보이므로, 예를 들어 1~7%(v/v), 1~6%(v/v), 1~5%(v/v), 1~4%(v/v) 또는 1~3%(v/v), 더 구체적으로는 1~3%(v/v) 또는 2%(v/v) 등이 바람직한 농도로 제시될 수 있다. 그러나 상기 농도 범위는, 바이러스 생산성에 영향을 미치는 다른 배양 조건이 변경될 경우 당업자의 통상의 기술 수준 범위 내에서 적절히 증감될 수 있다.
본원에서 "가수분해물 (hydrolysate)"은 단백질의 펩타이드 결합 (peptide bond) 을 분해시켜 획득된 물질로, 이는, 우유 유래이거나 (예를 들어, 카제인 (casein), 유청 (whey protein)), 동물 유래 단백질(고기(meat), 콜라겐(collagen)), 또는 식물 유래일 수 있다. 예를 들어, 식물성 가수분해물은 대두 가수분해물, 밀 가수분해물, 감자 가수분해물, 면실 가수분해물, 쌀 가수 분해물, 완두콩 가수 분해물 또는 옥수수 가수 분해물 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
바람직한 일예로, 가수분해물의 Lot Variation을 줄이고, 정제공정 (downstream process)을 효율적으로 수행할 수 있도록 하기 위하여 Digestion, Processing 등의 방법을 달리하여 생산된 동물성 요소 및 단백질이 없는 (animal component-free, protein-free) 가수분해물을 사용할 수 있다. 상업적으로 이용가능한 동물성 요소 및 단백질이 없는 가수분해물로, 구체적으로는 HypepTM 1510, HypepTM 1511, HypepTM 5603, Sheff-CHO PF ACF, Sheff-CHO Plus PF ACF, Sheff-VAX PF ACF SheffVax Plus PF ACF, SheffVax Plus PF ACF VP 등을 예시할 수 있으나, 본원의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 배지 조성물에서 가수분해물은 1~10 g/L로 포함될 수 있으나, 고농도 조건에서는 세포 생장에 부정적인 영향이 있을 수 있으므로, 본원 실시예에서는 6 g/L 까지로 제한하여 실험을 수행하였다. 따라서, 바람직한 일예로, 세포성장에 긍정적인 영향을 미치는 농도를 고려하여, 가수분해물은 1~6 g/L, 예를 들어 1~6 g/L, 1~5 g/L, 1~4 g/L, 1~3 g/L, 1~2 g/L, 2~4 g/L, 2~3 g/L 또는 2 g/L 이 바람직한 농도로 제시될 수 있다. 그러나 상기 농도 범위는, 바이러스 생산성에 영향을 미치는 다른 배양 조건이 변경될 경우 당업자의 통상의 기술 수준 범위 내에서 적절히 증감될 수 있다.
본원의 배지 조성물은 또한 인슐린을 포함한다. 예를 들어, 인슐린은 천연 인슐린 또는 재조합 인슐린일 수 있고, 더 구체적으로는 인간 재조합 인슐린일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 배지 조성물에서 인슐린은 1~6 mg/L, 1~5 mg/L, 1~4 mg/L, 1~3 mg/L, 2~6 mg/L, 2~5 mg/L, 2~4 mg/L, 2~3 mg/L 또는 3 mg/L로 포함될 수 있다. 그러나 상기 농도 범위는, 바이러스 생산성에 영향을 미치는 다른 배양 조건이 변경될 경우 당업자의 통상의 기술 수준 범위 내에서 적절히 증감될 수 있다.
바람직한 일예로, 베로 세포는 마이크로캐리어(microcarrier) 등의 캐리어에 부착되어 배양될 수 있다. 마이크로캐리어는 마이크로 수준의 지름을 가지며 베로 세포가 부착될 수 있는 임의의 고체 지지체 매트릭스를 말하며, 예컨대 그 표면에 세포를 세포를 부착시켜 액체 배지 중에서 현탁 상태로 세포 배양이 가능하다. 마이크로캐리어의 재료로는 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리카보네이트, 폴리아미드, 폴리아세탈 및 폴리우레탄과 같은 플라스틱 및 이들의 공중합체; 유리; 세라믹; 금속; 아크릴아미드; 실리카; 실리콘 고무; 폴리라이신; 셀룰로오스; 덱스트란; 콜라겐(젤라틴); 및 글리코사미노글리칸 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 마이크로캐리어는 약 100 μm 이상, 약 200 μm 이상, 약 300 μm 이상, 약 400 μm 이상, 약 500 μm 이상, 약 600 μm 이상, 약 700 μm 이상, 약 800 μm 이상, 약 900 μm 이상, 또는 약 1 mm 이상의 지름을 가질 수 있으며, 비즈(구형), 원반, 스트립, 시트, 섬유, 필라멘트, 막대, 디스크, 큐브, 관 등의 형태일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일예로, 마이크로캐리어는 다공성일 수 있다.
바람직한 일예로, 베로 세포의 배양은 배양이 10mL 내지 1000L 또는 그 이상,예를 들어 10mL 내지 2000L 또는 그 이상의 스케일로 행해질 수 있으며, 바이오 리액터에서 10 mL 이상의 규모로 생산이 가능하다. "바이오 리액터(bioreactor)"는 베로 세포를 배양하는데 사용될 수 있는 임의의 용기를 말하며, 마이크로캐리어를 포함하는 고정층(fixed bed)을 가지는 고정층 바이오 리액터를 포함한다. 본원에서 베로 세포는 바이오 리액터 내 마이크로캐리어 상에서 배양될 수 있고, 다른 예로, 배치 공정 또는 유가배양 배치 공정으로 바이오 리액터에서 현탁 배양될 수 있다.
베로 세포의 배양 과정에서, 배지는 배양 기간 중 필요에 따라 교환될 수 있다. 배지의 pH 는 약 6 ∼ 8 인 것이 바람직하고, 약 6.5 ∼ 7.5, 또는 약 7 일 수 있다. 배양은 통상적으로 약 35℃ ∼ 40℃ 에서 약 5 ∼ 9 일간 실시할 수 있고, 필요에 따라 통기나 교반을 추가할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 세포 배양시의 용존 산소 농도 (DO) 는, 약 60 ∼ 90％, 약 70 ∼ 80% 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따라 배양된 베로 세포는 바이러스 백신, 또는 바이러스나 바이러스 벡터 기반의 치료 요법 등의 매개체로서, 바이러스를 생산하는데 사용될 수 있다. 이에, 본 발명은 또한, 전술한 바와 같은 배지 조성물에서 배양된 베로 세포에 바이러스를 감염하는 단계; 및 바이러스가 감염된 베로 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 바이러스 생산 방법을 제공한다.
바이러스가 감염된 베로 세포는 바이러스를 증식하는데 최적화된 조건에서 베로 세포를 배양할 수 있다. 예를 들어, 베로 세포는 바이러스로 감염하기 전에 제1 온도에서 배양되고, 바이러스로 감염한 후에는 제2 온도에서 배양되며, 여기서 제2 온도는 제1온도보다 낮을 수 있다. 예를 들어, 베로 세포는 바이러스로 감염하기 전, 즉 감염 전 약 37℃에서 배양되고, 바이러스로 감염한 후, 즉, 감염 후에는 약 29℃ 내지 약 37℃에서 배양될 수 있다. 다른 예로, 베로 세포는 바이러스로 감염한 후 약 33℃에서 배양될 수 있다. 다른 예로, 베로 세포는 바이러스로 감염한 후 약 30℃에서 배양될 수 있다. 감염 시점은 세포 접종후 1일 후, 2일 후, 또는 3 또는 4일 후 일 수 있다.
바이러스 배양 종료 후, 마이크로캐리어를 제거하고, 바이러스를 함유하는 바이러스액을 회수할 수 있다. 회수된 바이러스액은 여과막 등으로 여과하여 세포 잔해를 제거하거나, 불활화 전 또는 후에 농축 및/또는 정제할 수 있다. 농축 방법으로는, 한외 여과법, 초원심법, 투석법 등을 예시할 수 있고, 정제 방법으로는, 예를 들어, 정제 대상물의 크기, 밀도, 침강 계수 등의 물리적 성질을 이용하는 방법, 화학 또는 물리 화학적 반응 (흡탈착 등) 을 이용하는 방법 등을 예시할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하 본 발명을 다음의 실시예에 의하여 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 이들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것은 아니다.
베로 세포의 최적의 배지 조성 확인
베로 세포의 최적의 배지 조성을 찾기 위하여 다음과 같은 실험을 설계하였다. 베로세포를 마이크로캐리어에 부착하여 쉐이크플라스크 또는 바이오리액터에서 배양하였다.
실험No. 대조군 실험군 실험규모
1 5% FBS - 2% FBS + 2.5 g/L Hydrolysate
- 1% FBS + 2.5 g/L Hydrolysate		 40mL
(쉐이크플라스크)
2 5% FBS - 2% FBS- 1% FBS
- 0% FBS
- 2% FBS + 2.5 g/L Hydrolysate + 3mg/L 인슐린
- 1% FBS + 2.5 g/L Hydrolysate + 3mg/L 인슐린
- 0% FBS + 2.5 g/L Hydrolysate + 3mg/L 인슐린		 30mL
(쉐이크플라스크)
3 5% FBS - 1~2% FBS + 0~6 g/L Hydrolysate + 0~6 mg/L 인슐린 30mL(쉐이크플라스크)
4 5% FBS - 1%, 2% FBS
- 1%, 2%, 5% NCS		 30mL
(쉐이크플라스크)
5 5% FBS - 2% FBS + 2 g/L Hydrolysate + 3mg/L 인슐린
- 2% NCS + 2 g/L Hydrolysate + 3mg/L 인슐린		 2L
(BRX)
6 2% FBS + 2 g/L Hydrolysate + 3mg/L 인슐린 - 2% NCS + 2 g/L Hydrolysate + 3mg/L 인슐린
- 7% NCS + 2 g/L Hydrolysate + 3mg/L 인슐린		 2L
(BRX)
7 2L - 40L
- 1000L		 40L
1000L
실험재료
Hydrolysate (Kerry, Ireland)
인슐린: 재조합 인간 인슐린 (Gibco, USA)
FBS: 우태아혈청(Fetal Bovine Serum) (Hyclone, USA)
NCS: 신생우아혈청(newborn calf serum) (Hyclone, USA)
BRX: 바이오리액터(bioreactor) (Model: Biostat B, Sartorius, Germany)
실험No.1.
FBS 의 농도를 줄이고 가수분해물(hydrolysate)을 첨가한 경우 베로 세포의 성장 효과를 확인하였다. 베로 세포는 ATCC Number CCL-81 유래 세포를 사용하였다. 대조군으로는 5% FBS 가 보충된 아미노산, 비타민, 무기질, 포도당 등이 포함된 MEM 배지를 사용하고, 실험군으로는 2% FBS + 2.5 g/L Hydrolysate, 또는 1% FBS + 2.5 g/L Hydrolysate 가 각각 보충된 MEM 배지를 사용하였다. 상기 준비된 베로 세포를 상기 준비된 배지 40mL 에서 5일간 배양한 결과(37℃, 5% CO2, 80±5% Humidity에서 배양), 2% FBS + 2.5 g/L Hydrolysate 가 보충된 배지에서 대조군과 유사한 세포 성장 프로파일을 확인할 수 있었던 반면, 1% FBS + 2.5 g/L Hydrolysate 가 보충된 배지에서는 대조군보다 세포 성장이 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 1).
실험No.2.
FBS 의 농도를 줄이고 가수분해물(hydrolysate) 및 인슐린을 첨가한 경우 베로 세포의 성장 효과를 확인하였다. 베로 세포는 ATCC Number CCL-81 유래세포를 사용하였다. 대조군으로는 5% FBS 가 보충된 아미노산, 비타민, 무기질, 포도당 등이 포함된 MEM 배지를 사용하고, 실험군으로는 2% FBS, 1% FBS, 0% FBS, 2% FBS + 2.5 g/L Hydrolysate + 3mg/L 인슐린, 1% FBS + 2.5 g/L Hydrolysate + 3mg/L 인슐린, 또는 0% FBS + 2.5 g/L Hydrolysate + 3mg/L 인슐린이 각각 보충된 MEM 배지를 사용하였다. 상기 준비된 베로 세포를 상기 준비된 배지 30mL 에서 14일간 3회 계대배양한 결과(37℃, 5% CO2, 80±5% Humidity 에서 배양), 2% FBS + 2.5 g/L Hydrolysate + 3mg/L 인슐린이 보충된 배지에서 대조군보다 높은 세포 성장 프로파일을 확인할 수 있었던 반면, 1% FBS + 2.5 g/L Hydrolysate + 3mg/L 인슐린이 보충된 배지에서는 대조군보다 세포 성장이 감소하지만, 2% FBS 군보다는 높은 성장 프로파일을 보였으며 Hydrolysate와 인슐린 의한 뚜렷한 성장촉진 효과가 있음을 확인할 수 있었다. FBS가 포함되지 않은 배지조건에서는 Hydrolysate 와 인슐린을 추가하여도 세포성장이 일어나지 않아 1st passage에서 배양을 종료하였다 (도 2).
실험No.3.
가수분해물(hydrolysate) 및 인슐린의 최적 농도를 확인해보았다. 베로 세포는 ATCC Number CCL-81 유래세포를 사용하였다. 다음 표에 나타난 바와 같이, 대조군으로는 5% FBS 가 보충된 MEM 배지를 사용하고, 실험군으로는 0~6 g/L Hydrolysate + 0~6 mg/L 인슐린이 각각 보충된 MEM 배지를 사용하였다.
샘플ID FBS(%) Hydrolysate(g/L) 인슐린(mg/L)
M5 5 0 0
S1 1 0 0
S2 1 0 6
S3 1 6 0
S4 1 6 6
S5 1.5 3 3
S6 1.5 3 3
S7 1.5 3 3
S8 2 0 0
S9 2 0 6
S10 2 6 0
S11 2 6 6
S12 2 2 0
S13 2 2 3
S14 2 2 6
S15 2 4 0
S16 2 4 3
S17 2 4 6
상기 준비된 베로 세포를 상기 준비된 배지 30mL 에서 6일간 배양한 결과(37℃, 5% CO2, 80±5% Humidity에서 배양), 6 g/L Hydrolysate 조건(S10)의 경우 최종세포수는 가장 높았지만 2 g/L Hydrolysate 조건에서는 3mg/L 인슐린이 보충된 조건(S13)을 바이오리액터에서 배양을 진행할 조건으로 선택하였다. 배양 초기 세포 성장속도가 빠른 결과를 보여 바이오리액터에서 유가식 배양을 진행할 때 세포 성장에 더 유리한 조건이라고 판단하였다(도 3).
실험No.4.
FBS 를 NCS로 대체할 수 있는지 농도별로 확인해보았다. 베로 세포는 ATCC Number CCL-81 유래세포를 사용하였다. 대조군으로는 5% FBS 가 보충된 MEM 배지를 사용하고, 실험군으로는 1% 또는 2% FBS, 또는 1%, 2% 또는 5% NCS가 각각 보충된 MEM 배지를 사용하였다. 상기 준비된 베로 세포를 상기 준비된 배지 30 mL 에서 5일간 배양한 결과(37°C, 5% CO2, 80±5% Humidity에서 배양), FBS와 NCS가 각각 같은 농도일 때 유사한 세포 성장 프로파일을 나타내는 것을 확인할 수 있었으며 (도 4), 이는 FBS 를 NCS로 대체할 수 있음을 시사한다.
실험No.5.
실험No.3에서 선택한 조건(2% FBS + 2 g/L Hydrolysate + 3mg/L 인슐린 조건)을 2L 배양기 규모로 확대하여 실험을 진행하고, FBS 를 NCS로 대체할 수 있는지 2% NCS + 2 g/L Hydrolysate + 3 mg/L 인슐린 조건을 추가하여 확인해보았다. 베로 세포는 ATCC Number CCL-81 유래세포를 사용하였다. 대조군으로는 5% FBS 가 보충된 MEM 배지를 사용하여 종배양 및 본배양을 진행하고(#R02), 실험군으로는 2% NCS + 2 g/L Hydrolysate + 3 mg/L 인슐린(#R03), 또는 2% FBS + 2 g/L Hydrolysate + 3mg/L 인슐린이 보충된 MEM 배지에서 종배양 및 본배양을 진행하였다(#R04) (온도 37℃, pH 7.2 ±0.05, DO 50%, 배양방법: 유가식 배양 (Fed-batch), 배양일수: 종배양 및 본배양 18일 배양 진행).
그 결과, 5% FBS가 보충된 MEM 배지를 사용한 조건과 2% FBS + 2 g/L Hydrolysate + 3 mg/L 인슐린이 보충된 배지 조건과 2% NCS + 2 g/L Hydrolysate + 3 mg/L 인슐린 조건에서 유사한 세포 성장 프로파일을 나타내는 것을 확인할 수 있었으며, 이는 5% FBS 조성 대신 2% FBS 또는 NCS에 Hydrolysate와 인슐린이 보충된 조성으로 대체 가능하며 또한 FBS 를 NCS로 대체할 수 있음을 시사한다(도 5).
실험No.6.
실험 No.6 에서 Hydrolysate와 인슐린이 포함된 조성에서 NCS 농도에 따라 세포 성장 및 바이러스 생산성에 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 베로 세포는 ATCC Number CCL-81 유래세포를 사용하였다. 대조군으로는 2% FBS + 2 g/L Hydrolysate + 3mg/L 인슐린이 보충된 MEM 배지를 사용하고(#R02), 실험군으로 2% NCS + 2 g/L Hydrolysate + 3mg/L 인슐린이 보충된 MEM 배지 (#R04), 또는 7% NCS + 2 g/L Hydrolysate + 3mg/L 인슐린이 보충된 MEM 배지(#R03)를 사용하였다. 상기 준비된 베로 세포를 상기 준비된 배지를 사용하여 2L 바이오리액터에서 19일간 배양한 결과(온도 37℃, pH 7.2 ±0.05, DO 50%, 배양방법: 유가식 배양 (Fed-batch), 배양일수: 종배양 및 본배양 19일 배양 진행), 2% NCS + 2 g/L Hydrolysate + 3mg/L 인슐린이 보충된 MEM 배지에서 대조군과 유사한 세포 성장 프로파일이 나타나 FBS 를 NCS 로 대체할 수 있음을 확인하였고, 7% NCS 농도조건에서 2% NCS 조건보다 세포 성장이 증가하는 것을 확인하였다(도 6). 각각의 조건에서 배양한 세포에 바이러스를 감염시켜 4일 배양 후 (온도 32.5℃, pH 7.4±0.1, DO 25%, 배양일수: 4일 배양 진행)에 회수하여 바이러스 농도를 정량하여 생산성을 비교하였다. 7% NCS + 2 g/L Hydrolysate + 3mg/L 인슐린 (#R03) 조건에서 최종세포수가 가장 높았지만, 바이러스 생산성은 2% NCS + 2 g/L Hydrolysate + 3mg/L 인슐린 (#R04) 조건과 비교했을 때 유사한 수준임을 확인하였다. 따라서 베로 세포 배양 성장 및 바이러스 배양을 통한 생산성을 바탕으로 FBS는 NCS로 대체되어 사용될 수 있음을 확인하였고, 2% NCS + 2 g/L Hydrolysate + 3mg/L 인슐린 조성을 선택하여 배양규모 확대실험을 진행하였다 (도 6).
실험No.7.
앞선 실험들을 통해 FBS를 대체할 수 있는 NCS, Hydrolysate, 인슐린이 포함된 배지 조성으로 선택된 배지(2% NCS + 2 g/L Hydrolysate + 3mg/L 인슐린)로 배양 규모를 2L, 40L 및 1000L 로 각각 확대해가며 세포 성장이 유지되는지를 확인해 보았다 (온도 37℃, pH 7.2 ±0.05, DO 50%, 배양방법: 유가식 배양 (Fed-batch), 배양일수: 종배양 및 본배양 18일 배양 진행). 각각의 조건에서 배양한 베로세포에 바이러스를 감염시켜 3~4일 배양한 후 회수하여 바이러스 생산성을 비교하였다.
2L 와 40L의 배양 규모에서의 세포 성장을 비교한 결과를 아래 표와 도 7에 나타내었으며, 40L 규모에서도 동등 이상의 세포 성장결과를 확인할 수 있었다.
배양규모 2L (n=6) 40L (n=3)
최종 세포밀도
(X105 cells/mL)		 15.03 17.95
SGR, D1~4 (day-1) 0.68 0.71
SGR, D1~6 (day-1) 0.53 0.56
* SGR: 비성장율(specific growth rate)
또한, 1000L 규모에서 FBS가 포함된 배지조건 과 NCS, Hydrolysate, 인슐린이 포함된 배지조건에서의 세포 성장을 비교한 결과를 도 8에 나타내었으며, 1000L 규모에서도 동등 이상의 세포 성장을 보이는 것을 확인할 수 있었다. NCS, Hydrolysate, 인슐린 조성 배지로 변경 전과 후 의 바이러스 생산성을 배양 규모별로 비교하여 도 8에 나타내었다. 배지 변경 후에 바이러스 생산성이 더 증가하고 2000L 배양 규모까지 확대했을 때도 동등이상의 바이러스 생산성을 확인할 수 있었다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (9)

  1. 신생우아혈청(newborn calf serum, NCS) 1~7%(v/v),
    가수분해물 (hydrolysate) 1~6 g/L, 및
    인슐린 1~6 mg/L
    을 포함하는, 베로 세포의 배양용 배지 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 우태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS)을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 배지 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 가수분해물이, 동물성 요소 및 단백질이 없는 동물성 요소 및 단백질이 없는(animal component-free, protein-free) 가수분해물인, 배지 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 베로 세포가 마이크로캐리어(microcarrier)에 부착되어 배양되는 것을 포함하는, 배지 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 배지가 MEM 배지를 포함하는, 배지 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 배지 조성물에서 베로 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 베로 세포의 배양 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 배양이 10mL 내지 1000L 의 스케일로 행해지는, 방법.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 배지 조성물에서 배양된 베로 세포에 바이러스를 감염하는 단계; 및
    바이러스가 감염된 베로 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 바이러스 생산 방법.
  9. 제8항에 있어서, 바이러스가 감염된 베로 세포의 배양이 10mL 내지 2000L 의 스케일로 행해지는, 방법.
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