WO2021149945A1 - Pd-l1 단백질이 포함된 융합 단백질 및 이의 용도 - Google Patents

Pd-l1 단백질이 포함된 융합 단백질 및 이의 용도 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a fusion protein comprising a PD-L1 protein and a modified immunoglobulin Fc region and uses thereof.
  • Human programmed cell death-ligand 1 is a ligand for programmed death-1 (PD-1), as well as hematopoietic cells such as T lymphocytes, B lymphocytes, dendritic cells, or macrophages, It is a type 1 transmembrane protein that is also expressed in non-hematopoietic cells such as keratinocytes, islet cells, hepatocytes, and the like.
  • PD-1 programmed death-1
  • hematopoietic cells such as T lymphocytes, B lymphocytes, dendritic cells, or macrophages
  • It is a type 1 transmembrane protein that is also expressed in non-hematopoietic cells such as keratinocytes, islet cells, hepatocytes, and the like.
  • secondary signal stimulation co-stimulation
  • PD-1 programmed death-1 is a secondary signaling factor (immune check point or immune modulator) that regulates secondary signaling activity of T cells, activated T cells (CD8 and/or CD4) or dendritic cells ( dendritic cells), it binds to PD-L1 (programmed cell death ligand 1) or B7.1 (CD80) expressed on the cell surface, thereby inhibiting T cell proliferation and reducing cytokine expression. It can inhibit cell function.
  • PD-L1 programmed cell death ligand 1
  • B7.1 CD80
  • Binding between PD-1:PD-L1 is known to induce the activity of regulatory T cells (Immunol Rev. 2010 Jul; 236:219-42). Using the immune tolerance-inducing function of PD-L1, IgG1 Fc When the fused PD-L1 protein (PD-L1-Ig) was injected into a CIA (collagen-induced arthritis) mouse model, it was observed that arthritis symptoms were alleviated (Rheumatol Int. 2011 Apr; 31(4)). :513-9). Since PD-1 is expressed in activated T cells, PD-L1 protein is expected to be usefully used as a therapeutic agent that specifically targets active immune cells in autoimmune diseases as well as induction of immune tolerance in organ transplantation. .
  • the Fc fusion technology of immunoglobulin (Ig) is one of the technologies for increasing the half-life of protein therapeutics.
  • IgG1 used in the existing Ig fusion technology causes antibody dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) and complement dependent cytotoxicity (CDC) in the body, autoimmune disease treatment or organ transplantation
  • ADCC antibody dependent cell-mediated cytotoxicity
  • CDC complement dependent cytotoxicity
  • the Ig fusion protein as an immune tolerance inducing agent does not play a role in suppressing the inflammatory response, but rather exacerbates inflammation.
  • a fusion protein comprising a programmed cell death-ligand 1 (PD-L1) protein and a modified immunoglobulin Fc region.
  • Another object of the present invention is to provide a nucleic acid molecule encoding the fusion protein.
  • Another object of the present invention is to provide an expression vector comprising the nucleic acid molecule.
  • Another object of the present invention is to provide a host cell comprising the expression vector.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of immune diseases, comprising a fusion protein comprising a PD-L1 protein and a modified immunoglobulin Fc region as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide the use of a fusion protein comprising a PD-L1 protein and a modified immunoglobulin Fc region for producing a pharmaceutical preparation having a preventive or therapeutic effect on an immune disease.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating an immune disease, comprising administering to a subject a fusion protein comprising a PD-L1 protein and a modified immunoglobulin Fc region, and a pharmaceutically acceptable carrier. .
  • the present invention provides a fusion protein comprising a PD-L1 protein and a modified immunoglobulin Fc region.
  • the present invention also provides a nucleic acid molecule encoding the fusion protein.
  • the present invention provides an expression vector comprising the nucleic acid molecule.
  • the present invention provides a host cell comprising the expression vector.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating an immune disease comprising a fusion protein comprising a PD-L1 protein and a modified immunoglobulin Fc region as an active ingredient.
  • the present invention provides the use of a fusion protein comprising a PD-L1 protein and a modified immunoglobulin Fc region for producing a pharmaceutical preparation having an effect of preventing or treating an immune disease.
  • the present invention also provides a method for preventing or treating an immune disease, comprising administering to a subject a fusion protein comprising a PD-L1 protein and a modified immunoglobulin Fc region, and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the fusion protein according to the present invention is a fusion protein in which a PD-L1 protein and a modified immunoglobulin Fc region are linked by a sequence consisting of a GS sequence and an IgG1 hinge, and is flexible while inducing a dimer by connecting the GS sequence and a sequence consisting of an IgG1 hinge. It is characterized by being manufactured to maintain.
  • the fusion protein according to the present invention has significantly higher purity and production yield than the existing fusion protein, has a high binding capacity to PD-1, reduces proliferation of activated T cells, and cytoplasm generated by activated T cells. Inhibits the production of Cain, has the effect of inhibiting the infiltration of T cells or macrophages into the tissue, it can be usefully used in the treatment of immune diseases.
  • FIG. 1 shows the structure of a fusion protein (PD-L1-hyFc21 fusion protein) comprising a PD-L1 protein and a modified immunoglobulin Fc region.
  • Figure 2a is the result of analyzing the cell concentration of cells expressing the PD-L1-hyFc21 fusion protein over time
  • Figure 2b is the purity of the target protein through SE-HPLC in the cell culture medium of the cells expressing the PD-L1-hyFc21 fusion protein. is the result of the analysis.
  • Figure 3a is the result of analyzing the cell concentration over time of cells expressing the PD-L1-hyFc5 fusion protein
  • Figure 3b is the purity of the target protein through SE-HPLC in the cell culture medium of the cells expressing the PD-L1-hyFc5 fusion protein. is the result of the analysis.
  • Figure 5a is a SE-HPLC analysis result of the purified PD-L1-hyFc21 fusion protein
  • 5b is a SE-HPLC analysis result of the purified PD-L1-hyFc5 protein.
  • FIG. 6 is a gel IEF analysis result of purified PD-L1-hyFc21 or PD-L1-hyFc5 fusion protein.
  • DSF 7 is a differential scanning fluorescence (DSF) analysis result of purified PD-L1-hyFc21 or PD-L1-hyFc5 fusion protein.
  • Figure 10a is a comparison result of the inhibition of the proliferation of activated human CD4 T cells by the PD-L1-hyFc21 or PD-L1-hyFc5 fusion protein
  • 10b is the result of comparing the inhibition of cytokine expression of the activated human CD4 T cells. .
  • 11 is a comparison result of cytokine expression inhibition of activated mouse CD4 T cells by PD-L1-hyFc21 or PD-L1-hyFc5 fusion proteins.
  • Figure 12a is the result of measuring the ear thickness of mice after subcutaneous administration of the PD-L1-hyFc21 fusion protein to the IMQ-induced psoriasis mouse model
  • Figure 12b is the result of measuring the ear thickness of the PD-L1-hyFc21 fusion protein in the IMQ-induced psoriasis mouse model. This is the result of measuring the ear thickness of mice after intravenous administration.
  • Figure 13a is the result of confirming the change of the skin epithelial tissue through H&E staining after subcutaneous administration of the PD-L1-hyFc21 fusion protein to the rtTA-Peli1 psoriasis mouse model
  • 13b is the result of measuring the thickness of the skin epithelial layer.
  • rtTA non-psoriasis control
  • rtTA-Peli1 psoriasis mouse model
  • 16 shows the results of measuring the number of K14 + keratinocytes in the skin tissue after subcutaneous administration of the PD-L1-hyFc21 fusion protein to the rtTA-Peli1 psoriasis mouse model.
  • 17 is a result of analyzing the changes in the skin epithelial layer as a score index after intravenous administration of the PD-L1-hyFc21 fusion protein to the rtTA-Peli1 psoriasis mouse model.
  • FIG. 19a is the result of confirming the change of the skin epithelial tissue through H&E staining after intravenous administration of the PD-L1-hyFc21 fusion protein to the rtTA-Peli1 psoriasis mouse model
  • FIG. 19b is the measurement result of the thickness of the skin epithelial layer.
  • Th17 cell-related genes IL-17A and IL-22
  • IL innate immune cell-related genes
  • the present invention provides a fusion protein comprising a PD-L1 protein and a modified immunoglobulin Fc region.
  • the PD-L1 protein may be an extracellular domain of the PD-L1 protein or a fragment thereof.
  • the extracellular domain of the PD-L1 protein may be a polypeptide comprising an Ig V like domain of PD-L1 and an Immunoglobulin C like domain of PD-L1.
  • the extracellular domain of the PD-L1 protein is a protein region exposed outside the cell membrane, and may be a polypeptide consisting of amino acids 19 to 238 of SEQ ID NO: 1 or a polypeptide consisting of amino acids 19 to 239 of SEQ ID NO: 1. .
  • the extracellular domain of the PD-L1 protein contains an Ig V-like (Ig V, Ig V-like) sequence that is a conserved sequence similar to the amino acid sequence of an immunoglobulin (Ig, immunoglobulin), and the conservation is A highly conserved Ig V-like sequence is the amino acid sequence of 68 to 114 of SEQ ID NO: 1.
  • it contains an Ig C-like (Ig C, Ig C like) sequence
  • the highly conserved sequence region is the amino acid sequence of 153 to 210 of SEQ ID NO: 1.
  • the fragment of the extracellular domain of the PD-L1 protein may include all or a part of the Ig V-like domain including the Ig V-like sequence of PD-L1.
  • the Ig V-like domain in the extracellular domain of the PD-L1 protein is a site capable of interacting with PD-1, and may be a polypeptide (SEQ ID NO: 3) consisting of amino acid sequences 19 to 239 of SEQ ID NO: 1 , may be a polypeptide consisting of the amino acid sequence of 21 to 239 of SEQ ID NO: 1. In addition, it may be a polypeptide (SEQ ID NO: 4) consisting of the amino acid sequence of 19 to 133 of SEQ ID NO: 1, it may be a polypeptide consisting of the amino acid sequence of 21 to 133 of SEQ ID NO: 1.
  • polypeptide consisting of the amino acid sequence of 21 to 114 of SEQ ID NO: 1 it may be a polypeptide consisting of the amino acid sequence of 19 to 114 of SEQ ID NO: 1.
  • polypeptide consisting of the amino acid sequence of 21 to 120 of SEQ ID NO: 1 it may be a polypeptide consisting of the amino acid sequence of 19 to 120 of SEQ ID NO: 1.
  • polypeptide (SEQ ID NO: 5) consisting of the amino acid sequence of 19 to 127 of SEQ ID NO: 1
  • polypeptide (SEQ ID NO: 6) consisting of the amino acid sequence of 21 to 127 of SEQ ID NO: 1.
  • polypeptide consisting of the amino acid sequence of 21 to 130 of SEQ ID NO: 1 it may be a polypeptide consisting of the amino acid sequence of 19 to 130 of SEQ ID NO: 1.
  • polypeptide consisting of the amino acid sequence of 21 to 131 of SEQ ID NO: 1 it may be a polypeptide consisting of the amino acid sequence of 19 to 131 of SEQ ID NO: 1.
  • the fragment of the extracellular domain of the PD-L1 protein when the fragment of the extracellular domain of the PD-L1 protein includes an Ig V-like domain or a fragment thereof, it may further include an Ig C-like domain of the extracellular domain of the PD-L1 protein (Immunoglobulin C like domain).
  • the Ig C-like domain may be a polypeptide consisting of the amino acid sequence of 133 to 225 of SEQ ID NO: 1, or a polypeptide consisting of the amino acid sequence of 134 to 225 of SEQ ID NO: 1.
  • the fragment of the extracellular domain of the PD-L1 protein when the fragment of the extracellular domain of the PD-L1 protein includes an Ig V-like domain or a fragment thereof, it may further include a polypeptide or a fragment thereof comprising an Ig C-like domain of the extracellular domain of the PD-L1 protein.
  • the polypeptide comprising the Ig C-like domain refers to the extracellular domain of the PD-L1 protein excluding the Ig V domain, and the polypeptide having amino acids 134 to 239 of SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 7) or SEQ ID NO: 1 It may be a polypeptide having amino acids 134 to 238 of (SEQ ID NO: 8).
  • extracellular domain of the PD-L1 protein or a fragment thereof may be derived from a human or a mouse.
  • the extracellular domain of the human PD-L1 protein is a polypeptide (SEQ ID NO: 3) consisting of amino acid sequences 19 to 239 of SEQ ID NO: 1, and the extracellular domain of the mouse PD-L1 protein is amino acids 19 to 239 of SEQ ID NO: 2 It is a polypeptide consisting of a sequence.
  • the extracellular domain of the PD-L1 protein is about 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93 with the polypeptide sequence consisting of the 19th to 239th amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 %, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% or more homology.
  • the human PD-L1 protein has 290 amino acid residues and includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (Accession Number: Q9NZQ7).
  • the N-terminal amino acid residues 1 to 18 are signal sequences
  • the mature human PD-L1 protein includes the amino acid sequences 19 to 290 of SEQ ID NO: 1.
  • the extracellular domain of the human PD-L1 protein includes amino acid sequences of 19 to 238 of SEQ ID NO: 1 or 19 to 239 of SEQ ID NO: 1.
  • the human PD-L1 protein includes an Ig V-like domain that is amino acids 19 to 127 of SEQ ID NO: 1 and an Ig C-like domain that is amino acids 134 to 226 of SEQ ID NO: 1.
  • Mouse PD-L1 protein is reported to contain 290 amino acids, which includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (Accession Number: Q9EP73). Amino acid residues 1 to 18 of SEQ ID NO: 2 are signal sequences, and the mature mouse PD-L1 protein includes amino acid sequences 19 to 290 of SEQ ID NO: 2. The extracellular domain of the mouse PD-L1 protein includes amino acid sequences 19 to 239 of SEQ ID NO:2. The mouse PD-L1 protein includes an Ig V-like protein having amino acids 19 to 127 of SEQ ID NO: 2 and an Ig C-like domain having amino acids 133 to 224 of SEQ ID NO: 2.
  • the extracellular domain of the PD-L1 protein may include the entirety of an Ig V-like domain or a fragment thereof.
  • the fragment of the extracellular domain of the PD-L1 protein may further include an Ig C-like domain or a polypeptide comprising an Ig C-like domain (the extracellular domain of PD-L1 excluding the Ig V-like domain).
  • the extracellular domain of the PD-L1 protein or fragment thereof may include variously modified proteins or peptides.
  • the modification may be performed by substituting, deleting or adding one or more proteins to the wild-type PD-L1 protein as long as the function of PD-L1 is not altered.
  • These various proteins or peptides can be combined with wild-type proteins by 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99 % homology.
  • extracellular domain of PD-L1 protein is also used as a concept including “extracellular domain of PD-L1 protein and fragments thereof”.
  • protein protein
  • polypeptide peptide
  • PD-L1 fusion protein and "PD-L1-modified immunoglobulin Fc region fusion protein” refer to a PD-L1 protein, an extracellular domain of a PD-L1 protein, or a fragment thereof, which is a modified immune system. It refers to a fusion protein bound to a globulin Fc region.
  • the PD-L1 protein may be fused to the N-terminus or C-terminus of the Fc region of a modified immunoglobulin, and preferably, the PD-L1 protein is the N-terminus of the Fc region of the modified immunoglobulin. -Can be fused to the terminal
  • the PD-L1 protein may be linked to the immunoglobulin Fc region by a linker peptide.
  • the linker is GGGSGGS (SEQ ID NO: 10), AAGSGGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 17), GGSGG (SEQ ID NO: 18), GGSGGSGGS (SEQ ID NO: 19), GGGSGG (SEQ ID NO: 20), (G4S) n (n is an integer from 1 to 10) ), (GGS)n (n is an integer from 1 to 10), (GS)n (n is an integer from 1 to 10), (GSSGGS)n (n is an integer from 1 to 10), KESGSVSSEQLAQFRSLD (SEQ ID NO: 21) , EGKSSGSGSESKST (SEQ ID NO: 22), GSAGSAAGSGEF (SEQ ID NO: 23), (EAAAK) n (n is an integer from 1 to 10), CRRRRRREAEAC (SEQ ID NO: 24), A(EAAAK) 4ALEA(EAAAK) 4A, GGGGGGGG (SEQ ID NO: 25), GGGGGG (
  • PD-L1 and the immunoglobulin Fc region can be linked by a linker peptide consisting of the amino acid sequence of GGGSGGS (SEQ ID NO: 10).
  • linker peptide consisting of the amino acid sequence of GGGSGGS (SEQ ID NO: 10).
  • the fusion protein may exist in a dimer form.
  • the bond between the fusion proteins constituting the dimer may be formed by a disulfide bond by a cysteine present in a linker.
  • the fusion proteins constituting the dimer are identical. That is, the dimer may be a homodimer.
  • the fusion protein may be soluble, in particular, it may be dissolved in purified water or physiological saline.
  • the Fc region of the modified immunoglobulin may be any one or a combination of Fc regions of IgG1, IgG2, IgG3, IgD and IgG4.
  • the Fc region is modified so that binding to the Fc receptor and/or complement (complement) does not occur.
  • the Fc region of the modified immunoglobulin comprises in an N-terminal to C-terminal direction a hinge region, a CH2 domain and a CH3 domain, wherein the hinge region comprises a human IgG1 hinge region (SEQ ID NO: 16), wherein The CH2 domain may include a portion of the amino acid residues of the CH2 domain of human IgD and human IgG4, and the CH3 domain may include a portion of the amino acid residues of the CH3 domain of human IgG4.
  • Fc region includes the heavy chain constant region 2 (CH2) and heavy chain constant region 3 (CH3) of an immunoglobulin, and includes the variable regions of the heavy and light chains of an immunoglobulin. and light chain constant region 1 (CL1). It may further comprise a hinge region of the heavy chain constant region.
  • Hybrid Fc or hybrid Fc fragments are also referred to herein as “hFc” or “hyFc”.
  • the Fc fragment of the present invention may be a native sugar chain, an increased sugar chain compared to the native type, a decreased sugar chain compared to the native type, or a form in which the sugar chain is removed.
  • Immunoglobulin Fc sugar chains can be modified by conventional methods such as chemical methods, enzymatic methods, and genetic engineering methods using microorganisms. Removal of sugar chains from the Fc fragment sharply reduces the binding affinity of the primary complement component C1 to C1q and results in a decrease or loss of ADCC or CDC, thereby not inducing an unnecessary immune response in vivo.
  • the immunoglobulin Fc fragment in a deglycosylated or aglycosylated form may be more suitable for the purpose of the present invention as a drug carrier.
  • deglycosylation refers to enzymatic removal of sugars from an Fc fragment.
  • aglycosylation means that the Fc fragment is produced in an unglycosylated form by prokaryotes, preferably E. coli.
  • the Fc region of the modified immunoglobulin may consist of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 (hereinafter, "hyFc").
  • the fusion protein may be represented by the following structural formula (I).
  • N' is the N terminus of the fusion protein and C' is the C terminus of the fusion protein;
  • X is a PD-L1 protein, an extracellular domain of a PD-L1 protein, or a fragment thereof;
  • L is a linker
  • Y is an immunoglobulin Fc region.
  • the fusion protein may consist of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 13.
  • the fusion protein of the present invention has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 and about 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97 %, 98% or 99% or more.
  • the present invention also provides a nucleic acid molecule encoding the fusion protein.
  • the nucleic acid molecule may be a nucleic acid molecule encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 13.
  • the nucleic acid molecule may additionally include a signal sequence (or signal peptide) or a leader sequence.
  • signal sequence refers to a short peptide present at the N-terminus of a newly synthesized protein classified into a secretory pathway.
  • Signal sequences useful in the present invention include an antibody light chain signal sequence, such as antibody 1418 (Gillies et al., J Immunol Meth 1989 125: 191-202), an antibody heavy chain signal sequence, such as the MOPC141 antibody heavy chain signal sequence ( Sakano et al, Nature 1980 286: 676-683), and other signal sequences known in the art (see, eg, Watson et al, Nucleic Acid Research 1984 12:5145-5164).
  • the signal peptide is well known in the art for its characterization, and is generally known to contain 16 to 30 amino acid residues, and may contain more or fewer amino acid residues.
  • a typical signal peptide consists of three regions: a basic N-terminal region, a central hydrophobic region, and a more polar C-terminal region.
  • the central hydrophobic region contains 4 to 12 hydrophobic residues that anchor the signal sequence through the membrane lipid bilayer during migration of the immature polypeptide.
  • the signal sequence is cleaved in the lumen of the ER by cellular enzymes commonly known as signal peptidases.
  • the signal sequence may be a secretion signal sequence of tPa (tissue plasminogen activation), HSV gDs, or growth hormone.
  • tPa tissue plasminogen activation
  • HSV gDs growth hormone
  • the secretion signal sequence used in higher eukaryotic cells, including mammals may be used, and more preferably, the tPa sequence or the 1st to 18th amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 may be used.
  • the signal sequence of the present invention can be used by substituting a codon having a high expression frequency in the host cell.
  • the present invention provides an expression vector comprising the nucleic acid molecule.
  • vector is understood as a nucleic acid means comprising a nucleotide sequence that can be introduced into a host cell, recombination and insertion into the host cell genome, or can replicate spontaneously as an episome.
  • the vectors include linear nucleic acids, plasmids, phagemids, cosmids, RNA vectors, viral vectors and analogs thereof.
  • examples of viral vectors include, but are not limited to, retroviruses, adenoviruses, and adeno-associated viruses.
  • a useful expression vector may be RcCMV (Invitrogen, Carlsbad) or a variant thereof.
  • Useful expression vectors include the human cytomegalovirus (CMV) promoter to promote continuous transcription of the gene of interest in mammalian cells, and the bovine growth hormone polyadenylation signal sequence to increase the steady-state level of RNA after transcription. can do.
  • the expression vector is pAD15, which is a modified vector of RcCMV.
  • the term "host cell” refers to prokaryotic and eukaryotic cells into which recombinant expression vectors can be introduced.
  • an appropriate host cell may be transformed or transfected with the DNA sequence of the present invention, and may be used for expression and/or secretion of a target protein.
  • Presently preferred host cells that can be used in the present invention are immortal hybridoma cells, NS/0 myeloma cells, 293 cells, Chinese hamster ovary cells (CHO cells), HeLa cells. , CapT cells (human amniotic fluid derived cells) and COS cells.
  • transformation and “transfection” refer to the introduction of a nucleic acid (eg, a vector) into a cell by a number of techniques known in the art.
  • the present invention provides a composition for preventing or treating an immune disease comprising a fusion protein comprising a PD-L1 protein and a modified immunoglobulin Fc region as an active ingredient.
  • the immune disease may be a disease selected from the group consisting of autoimmune diseases, inflammatory diseases, and transplantation rejection diseases of cells, tissues, or organs.
  • the autoimmune disease is arthritis [acute arthritis, chronic rheumatoid arthritis, gouty arthritis, acute gouty arthritis, chronic inflammatory arthritis, degenerative arthritis, infectious arthritis, Lyme arthritis, proliferative arthritis, psoriatic arthritis, spondylolisthesis Arthritis, and juvenile-onset rhematoid arthritis, osteoarthritis, arthritis chronica progrediente, deformans arthritis, polyarthritis chronica primaria, reactive arthritis arthritis), and rheumatoid arthritis such as ankylosing spondylitis], inflammatory hyperproliferative skin diseases, plaque psoriasis, gutatte psoriasis, pustular psoriasis, and psoriasis of the nails of the nails, dermatitis including psoriasis, contact dermatitis, chronic contact dermatitis, allergic dermatitis, allergic contact dermatitis, herpetiformis dermatitis, and atopic
  • ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇
  • NSIP Guillain-Barre syndrome, Berger's disease (IgA nephropathy), idiopathic IgA nephropathy, linear IgA dermatosis, primary biliary Primary biliary cirrhosis, pneumonocirrhosis, autoimmune enteropathy syndrome, celiac disease, coeliac disease, celiac sprue, gluten enteropathy, refractory sprue, idiopathic sprue, cryoglobulinemia, amyotrophic lateral sclerosis; ALS; Autoimmune ear diseases such as Lou Gehrig's disease, coronal artery disease, autoimmune inner ear disease (AGED), autoimmune hearing loss, opsoclonus syndrome myoclonus syndrome (OMS), polychondritis such as refractory or recurrent polychondritis, pulmonary alveolar proteinosis, amyloidosis, scleritis, non-cancerous lymphocytosis primary
  • cyclitis such as Fuch's cyclitis, Henoch-Schonlein purpura, human immunodeficiency virus; HIV) infection, echovirus infection, cardiomyopathy, Alzheimer's disease, parvovirus infection, rubella virus infection, post-vaccination syndromes, congenital Ruvola infection, Epstein-Barr virus infection, mumps, Evan's syndrome, autoimmune gonadal failure, Sydenham's chorea, post strep Poststreptococcal nephritis, thromboangitis ubiterans, thyrotoxicosis, tabes dorsalis, chorioiditis, giant cell polymyalgia, endocrine ophthamopathy , chronic hypersensitivity pneumonitis, keratoconjunctivitis sicca, epidemic keratoconjunctivitis, idiopathic nephritic syndrome, minimal change nephropathy, benign familial reperfusion and ischemia
  • the autoimmune disease is type 1 diabetes, alopecia areata, anti-phospholipid antibody syndrome, rheumatoid arthritis, psoriasis or psoriatic arthritis, multiple sclerosis, Systemic lupus erythematosus, inflammatory bowel disease, Addison's disease, Graves' disease, Sjogren's syndrome, Guillian-Barre syndrome , Hashimoto's thyroiditis, Myasthenia gravis, inflammatory myopathy, autoimmune vasculitis, autoimmune hepatitis, hemolytic anemia, idiopathic thrombocytopenic purpura (idiopathic thrombocytopenic purpura), primary biliary cirrhosis, scleroderma, vitiligo, pernicious anemia, and chronic digestive disorder (celiac disease) may be selected from the group consisting of there is.
  • the inflammatory disease is arthritis, ankylosing spondylitis, reactive arthritis, Reiter's syndrome, crystal arthropathies, Lyme disease, polymyalgia rheumatica (polymyalgia rheumatica), systemic sclerosis, polymyositis, dermatomyositis, polyarteritis nodosa, Wegener's granulomatosis, Churg-Strauss syndrome ), sarcoidosis, atherosclerotic vascular disease, atherosclerosis, ischemic heart disease, myocardial infarction, stroke, peripheral vascular disease (peripheral vascular disease), uveitis (uveitis), corneal disease (corneal disease), ulceris (iritis), iridocyclitis (iridocyclitis) and may be selected from the group consisting of cataracts (cataracts).
  • the transplant rejection disease may be a tissue or organ transplant rejection reaction, and the tissue or organ transplant rejection reaction includes bone marrow transplantation, heart transplantation, corneal transplantation, intestinal transplantation, liver transplantation, lung transplantation, pancreatic transplantation, kidney transplantation and It may be selected from among rejection reactions of skin transplantation.
  • inflammatory skin disease refers to a disease occurring in the skin by an inflammatory reaction.
  • Skin keratinocytes are components that constitute most of the epidermal cells, and they form keratin and are involved in various inflammatory and immune responses by producing various cytokines.
  • TNF- ⁇ tumor necrosis factor- ⁇
  • IL-1 ⁇ interleukin-1 ⁇
  • IL-6 chemokine (CC motif)
  • the inflammatory skin disease may be psoriasis or atopic dermatitis, preferably psoriasis.
  • psoriasis refers to a disease that forms erythematous papules and plaques of various sizes with clear boundaries that are covered with silvery-white scales on the skin. Histologically, it is one of the chronic inflammatory skin diseases characterized by epithelial hyperplasia, showing various clinical features, and repeating exacerbation and improvement.
  • the preferred dosage of the pharmaceutical composition varies depending on the condition and weight of the patient, the degree of disease, the drug form, the route and duration of administration, but may be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the active ingredient may be included in any amount (effective amount) depending on the use, formulation, purpose of formulation, etc., as long as it can exhibit psoriasis therapeutic activity. It will be determined within the range of 0.001 wt % to 20.0 wt % on a weight basis.
  • the term “effective amount” refers to an amount of an active ingredient capable of inducing a psoriasis treatment effect. Such effective amounts can be determined empirically within the ordinary ability of one of ordinary skill in the art.
  • the term “treatment” may be used to include both therapeutic treatment and prophylactic treatment. In this case, prevention may be used in the sense of alleviating or reducing a pathological condition or disease of an individual.
  • the term “treatment” includes any form of administration or application for treating a disease in a mammal, including a human. The term also includes inhibiting or slowing the disease or its progression; restoring or repairing damaged or missing function, partially or completely relieving the disease; or stimulate inefficient processes; It includes the meaning of alleviating serious diseases.
  • terapéuticaally effective amount refers to an amount of a compound or composition effective to prevent or treat a target disease, which is sufficient to treat the disease at a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and It means an amount that does not cause side effects.
  • the level of the effective amount may be determined by the patient's health status, disease type, severity, drug activity, drug sensitivity, administration method, administration time, administration route and excretion rate, treatment period, combination or factors including drugs used concurrently and It may be determined according to factors well known in the medical field.
  • a therapeutically effective amount refers to an amount of a drug effective to treat psoriasis.
  • composition of the present invention may include a pharmaceutically acceptable carrier, and may additionally include a pharmaceutically acceptable adjuvant, excipient or diluent in addition to the carrier.
  • the term "pharmaceutically acceptable” refers to a composition that is physiologically acceptable and does not normally cause gastrointestinal disorders, allergic reactions such as dizziness or similar reactions when administered to humans.
  • carriers, excipients and diluents include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • fillers, anti-agglomeration agents, lubricants, wetting agents, fragrances, emulsifiers and preservatives may be further included.
  • compositions of the present invention may be formulated using methods known in the art to enable rapid, sustained or delayed release of the active ingredient upon administration to a mammal.
  • Formulations include powders, granules, tablets, emulsions, syrups, aerosols, soft or hard gelatin capsules, sterile injectable solutions, and sterile powder forms.
  • composition of the present invention may be formulated in a suitable form together with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • pharmaceutically acceptable carriers include, for example, carriers for parenteral administration such as water, suitable oils, saline, aqueous glucose and glycol, and the like, and may further include stabilizers and preservatives.
  • Suitable stabilizers include antioxidants such as sodium bisulfite, sodium sulfite or ascorbic acid.
  • Suitable preservatives are benzalkonium chloride, methyl- or propyl-paraben and chlorobutanol.
  • composition according to the present invention can be used as a suspending agent, solubilizer, stabilizer, isotonic agent, preservative, adsorption inhibitor, surfactant, diluent, excipient, pH adjuster, analgesic agent, buffer, if necessary depending on the administration method or formulation. , antioxidants and the like may be included as appropriate.
  • Pharmaceutically acceptable carriers and agents suitable for the present invention including those exemplified above, are described in detail in Remington's Pharmaceutical Sciences, latest edition.
  • compositions of the present invention may be sterilized according to commonly known sterilization techniques.
  • the composition may contain pharmaceutically acceptable auxiliary substances and adjuvants required to control physiological conditions such as pH control, toxicity control agents and the like, for example, sodium acetate, sodium chloride ( sodium chloride), potassium chloride, calcium chloride, sodium lactate, and the like.
  • concentration of the fusion protein in such formulations can vary widely, for example up to about 0.5% by weight, typically or at least about 1% to 15% or up to 20%, depending on the particular method of administration selected. Accordingly, the selection may be preferentially based on body fluid volume, viscosities, and the like.
  • a preferred dosage for the composition of the present invention is in the range of 0.01 ⁇ g/kg to 10 g/kg per day, or 0.01 mg/kg to 1 g/kg, depending on the patient's condition, body weight, sex, age, patient's severity, and administration route. kg range. Administration may be performed once or divided into several times a day. Such dosages should not be construed as limiting the scope of the invention in any respect.
  • compositions of the present invention are mammals and humans, particularly preferably humans.
  • the administration route, dosage, and frequency of administration of the fusion protein or fusion protein dimer may be administered to a subject in various ways and amounts depending on the patient's condition and presence or absence of side effects, and the optimal administration method, dosage and frequency of administration are A person skilled in the art can select within an appropriate range.
  • composition of the present invention may be administered by any route.
  • the compositions of the present invention may be provided to an animal either directly (e.g., by injection, implantation, or local administration at a tissue site, topically) or systemically (e.g., parenterally or orally) by any suitable means. there is.
  • the composition of the present invention can be administered intravenously, subcutaneously, ophthalmic, intraperitoneally, intramuscularly, oral, rectal, intraorbital, intracerebral, intracranial, intraspinal, ventricle.
  • the composition When given parenterally, such as intraventricular, intrathecal, intracistenal, intracapsular, intranasal or aerosol administration, the composition is preferably aqueous or It is preferred to include portions of physiologically applicable bodily fluid suspensions or solutions. Accordingly, the carrier or vehicle is physiologically acceptable and thus can be added to the composition and delivered to the patient, without adversely affecting the patient's electrolyte and/or volumetric balance. Therefore, as a body fluid medium for the preparation, it may generally contain a physiological saline (physiologic saline).
  • physiological saline physiological saline
  • a DNA construct (or gene construct) comprising a nucleic acid encoding a fusion protein of the present invention can be used as part of a gene therapy protocol carrying a nucleic acid encoding the fusion protein construct.
  • an expression vector for infecting and expressing the fusion protein in vivo in a specific cell type in order to reconstitute or supplement the desired function of the fusion protein can be administered together with any biologically effective carrier, for example, in vivo.
  • a viral vector comprising a recombinant retrovirus, an adenovirus, an adeno-associated virus, and herpes simplex virus-1, or a recombinant bacterial plasmid
  • the gene of interest may be inserted into a recombinant eukaryotic plasmid.
  • the dosage of the nucleic acid encoding the fusion protein of the present invention is in the range of 0.1 mg to 100 mg in humans, preferably 1 mg to 10 mg, and more preferably 2 mg to 10 mg.
  • the optimal amount and dosage form can be determined by routine experimentation within the skill of the person skilled in the art.
  • the unit dose of the fusion protein of the present invention is 0.1 mg/kg to 1,500 mg/kg in humans, preferably 1 mg/kg to 100 mg/kg, more preferably 5 mg/kg to 20 mg/kg is kg.
  • the unit dose may vary depending on the disease to be treated and the presence or absence of side effects. However, the optimal dosage can be determined using routine experimentation.
  • Administration of the fusion protein may be by periodic bolus injections, or from an external reservoir (eg, intravenous bag) or internal (eg, bioerodable implant). continuous intravenous, subcutaneous, or intraperitoneal administration of
  • composition of the present invention may be administered in combination with other drugs or physiologically active substances having a preventive or therapeutic effect on the disease to be prevented or treated, or may be formulated in the form of a combination formulation with such other drugs.
  • the method of preventing or treating a disease using the fusion protein or composition of the present invention may include administering another drug or physiologically active substance having a preventive or therapeutic effect in combination with the fusion protein or composition of the present invention.
  • the route of concurrent administration, administration timing, and dosage may be determined according to the type of disease, the disease state of the patient, the purpose of treatment or prevention, and other drugs or physiologically active substances used in combination.
  • the present invention provides the use of a fusion protein comprising a PD-L1 protein and a modified immunoglobulin Fc region for producing a pharmaceutical preparation having an effect of preventing or treating an immune disease.
  • the present invention also provides a method for preventing or treating an immune disease, comprising administering to a subject a fusion protein comprising a PD-L1 protein and a modified immunoglobulin Fc region, and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the therapeutically effective amount includes the specific composition including the type and extent of the response to be achieved, whether or not other agents are used if necessary, the individual's age, weight, general health, sex and diet, administration time, administration route, and composition. It is preferable to apply differently depending on various factors including the secretion rate, treatment period, and drugs used together or concurrently with a specific composition and similar factors well known in the pharmaceutical field. Therefore, it is preferable to determine the effective amount of the composition suitable for the purpose of the present invention in consideration of the foregoing.
  • the subject is applicable to any mammal, and the mammal includes not only humans and primates, but also domestic animals such as cattle, pigs, sheep, horses, dogs and cats.
  • Example 1 Preparation of a gene construct for production of fusion protein containing PD-L1 protein and modified immunoglobulin Fc region
  • a gene construct was prepared for producing a fusion protein in which a human programmed cell death-ligand 1 (PD-L1) protein and a modified immunoglobulin Fc domain were fused.
  • PD-L1 gene used a known amino acid sequence (Accession number: Q9NZQ7), and the gene construct including the extracellular domain (19-239 aa) of the PD-L1 protein was prepared by TOP Gene Technologies. (Canada, Quebec).
  • Human PD-L1 protein was prepared to be fused to the N-terminus of the modified immunoglobulin Fc region.
  • the modified immunoglobulin Fc domain (SEQ ID NO: 11) is a hybrid type of human IgD Fc and human IgG4 Fc, and is characterized by including an IgG1 hinge region (SEQ ID NO: 16) composed of 8 amino acids.
  • the fusion protein of the present invention was prepared so that the PD-L1 protein was linked to the modified immunoglobulin Fc region with a peptide linker.
  • a human PD-L1 protein and a modified immunoglobulin Fc region linked by a GS linker (SEQ ID NO: 10) consisting of a 7 amino acid sequence to maintain flexibility while inducing dimerization is included.
  • a fusion protein (hereinafter, “PD-L1-hyFc21” or “PD-L1-hyFc21 fusion protein”, SEQ ID NO: 12 or 13) was prepared.
  • a fusion protein including an immunoglobulin Fc region including the IgD hinge region of SEQ ID NO: 14 (hereinafter, “PD-L1-hyFc5” or “PD-L1-hyFc5 fusion protein”, SEQ ID NO: 15) was used. did.
  • a recombinant expression vector was prepared using the gene construct containing the nucleotide encoding the fusion protein.
  • the prepared recombinant expression vector was transformed using a gene transfer method (NeonTM kit, 10 ⁇ L, Invitrogen Cat. MPK1096) using a DNA solution in which a DNA solution was suspended in the CHO DG44 cell line and passed through a pulse of high direct current to introduce DNA into the cell. did it Thereafter, HT selection (HT supplement, Invitrogen, 11067-030) and MTX (Methotrexate, Sigma, M8407) amplification steps were performed, and cell passage was performed so that only cells with a high expression rate were selected.
  • HT selection HT supplement, Invitrogen, 11067-030
  • MTX Metalhotrexate, Sigma, M8407
  • HT selection is a selection method in which only transformed cells survive by removing HT from the media
  • MTX amplification is a method of amplifying genes by putting MTX at a selected concentration in the passage medium.
  • the selected cell pool was subjected to single cell cloning using the limiting dilution cloning method.
  • cells were aliquoted to 1 cell/well in a 96 well plate, and cell images were stored on days 0, 7, and 14 using a CSI device (clone selection imager, Molecular Devices) to obtain clones derived from one cell. (clone) was traced back.
  • the productivity of the selected single cell-derived cell line was confirmed using Fc ELISA (Human IgG ELISA Quantitation Set, Bethyl, E80-104).
  • the final selected 5-6 clones were subjected to batch culture and long-term stability evaluation, and the clones whose stability was confirmed were prepared as RCB (Research Cell Bank).
  • the target protein was isolated from the cell culture medium produced from the PD-L1-hyFc5 or PD-L1-hyFc21 suspension cell line obtained in Example 1, and Purified.
  • a cell line expressing PD-L1-hyFc21 or PD-L1-hyFc5 fusion protein was used in the same fed-batch culture method in a Glass bioreactor.
  • PD-L1-hyFc21 or PD-L1-hyFc5 fusion proteins were produced by culturing at 15 L for 20 days.
  • the cell viability of the cell line expressing the fusion protein was measured, and size exclusion chromatography (SE-HPLC) was performed to confirm the final expression level and purity of the target protein.
  • the cell line expressing the PD-L1-hyFc21 fusion protein had a maximum cell concentration of 13.9 x 10 6 cells/mL over time (Fig. 2a), and the final The expression level of the recovered fusion protein was confirmed to be 5.6 g/L ( FIG. 2B ).
  • the cell line expressing the PD-L1-hyFc5 fusion protein had a maximum cell concentration of 16.7 x 10 6 cells/mL over time (FIG. 3a), and the final expression level of the recovered fusion protein was confirmed to be 2.2 g/L. (Fig. 3b).
  • the obtained target protein was confirmed for purity and yield through size exclusion chromatography (SE-HPLC) analysis. As a result, it was confirmed that the purity of the PD-L1-hyFc21 fusion protein was 97.3% and the yield was 30.2%. In comparison, it was confirmed that the purity of the PD-L1-hyFc5 fusion protein was 93.2% and the yield was 5.1% (Table 2).
  • the PD-L1-hyFc21 fusion protein showed about 2.5 times higher production than the PD-L1-hyFc5 fusion protein, and the purity of the protein was also high.
  • SDS-PAGE sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis
  • the fusion protein was diluted with deionized water, mixed with NuPAGETMLDS Sample Buffer (Thermo Fisher Scientific), and loaded on 4-12% Bis-Tris gel (Invitrogen) to 3 ⁇ g/well and electrophoresed. was performed. After electrophoresis, the gel was stained by Coomassie staining method.
  • both the purified PD-L1-hyFc21 and PD-L1-hyFc5 fusion proteins were confirmed at a size marker of 98 kDa under non-reducing conditions ( FIG. 4 ).
  • the purified PD-L1-hyFc5 fusion protein contained cleaved low-molecular impurities.
  • the size-exclusion chromatography test method (Size-exclusion) chromatography, SE-HPLC) was performed. Briefly, the fusion protein was diluted with formulation buffer to 1.0 mg/mL, and then the main peak of the fusion protein was separated using a gel filtration chromatography column (TOSOH TSK-GEL G3000SWxL column, 7.8 mm x 300 mm). The area ratio (% Area) was analyzed.
  • Isoelectric point electrophoresis is an electrophoresis method that analyzes separated proteins using the pI value of the protein.
  • the pI value refers to the pH value at which a charged protein becomes electrically neutral, which is called the isoelectric point.
  • isoelectric point electrophoresis the protein that has reached the isoelectric point does not move any more and stays on the gel and is separated.
  • the fusion protein was separated according to the pI value using a pH 3-10 isoelectric point gel (Invitrogen), and the gel after electrophoresis was fixed with a 12% TCA (trichloroacetic acid) solution and then stained with Coomassie staining method. did.
  • both the PD-L1-hyFc21 and PD-L1-hyFc5 fusion proteins had pI values in the range of 5.2 to 6.0 ( FIG. 6 ).
  • the experiment was performed using the PROTEOSTAT® Thermal Shift Stability Assay Kit.
  • the assay kit contains a fluorescent dye that detects protein aggregation, so you can check the temperature at which a large amount of protein aggregates under heat stress conditions.
  • the aggregation temperature (tagg) is an indicator of protein stability, and can confirm the stability of the protein structure.
  • the aggregation temperature of the PD-L1-hyFc21 fusion protein was confirmed to be 55.8 °C, whereas the aggregation temperature of the PD-L1-hyFc5 fusion protein was confirmed to be 50.7 °C (FIG. 7).
  • the PD-L1-hyFc21 fusion protein was structurally superior to heat stability compared to PD-L1-hyFc5.
  • the binding ability of PD-L1-hyFc21 or PD-L1-hyFc5 fusion proteins to PD-1 was analyzed using a Jurkat (SHP-1) cell line expressing PD-1. Briefly, Jurkat cells (PathHunter® Jurkat PD-1 (SHP-1), DiscoverX) were aliquoted in 96-well plates and stabilized in a 37 °C 5% CO 2 incubator for 2 hours. Thereafter, PD-L1-hyFc21 or PD-L1-hyFc5 fusion proteins were added so as to become 75 and 600 nM, respectively, and then reacted in an incubator at 37° C. 5% CO 2 for 1 hour. After completion of the reaction, a reagent (PathHunter® Bioassay Detection Kit, DiscoverX) for detecting SHP-1 expressed by PD-1:PD-L1 signaling response was added to measure the luminescence of SHP-1.
  • a reagent PathHunter® Bioa
  • the group treated with the PD-L1-hyFc21 fusion protein showed a higher degree of luminescence of SHP-1 at both concentrations of 75 and 600 nM compared to the group treated with the PD-L1-hyFc5 fusion protein (FIG. 8) . Accordingly, it was confirmed that the PD-L1-hyFc21 fusion protein had a higher binding ability to PD-1 than the PD-L1-hyFc5 fusion protein. Confirmed.
  • the inhibitory ability of the mixed lymphocyte response by the PD-L1-hyFc21 or PD-L1-hyFc5 fusion protein was analyzed. Briefly, donor and recipient PBMCs (peripheral blood mononuclear cells) were prepared and subjected to CTV (CellTraceTM Violet) and CTR (CellTraceTM Far Red) staining for intracellular proteins. Each of the donor and recipient PBMCs was placed as a response cell and a stimulator cell, mixed at a ratio of 1:1, put in a 96-well U-bottom plate, and 0.5 ⁇ M of PD-L1-hyFc21 or PD-L1-hyFc5 fusion protein was added.
  • CTV CellTraceTM Violet
  • CTR CellTraceTM Far Red
  • PD-L1-hyFc21 or PD-L1-hyFc5 fusion proteins were treated in 96-well plates and coated at 4°C for one day.
  • CD4 T cells were isolated from PBMCs of normal people using microbeads (MACS), CTV (CellTraceTM Violet, 2.5 ⁇ M) staining for intracellular proteins was performed on the isolated CD4 T cells.
  • CD4 T cells stained with CTV were placed on the test plate and cultured in an incubator at 37° C. 5% CO 2 for 3 days. After 4 days, cells from the test plate were harvested and the degree of decrease in CTV fluorescence was analyzed using flow-cytometry.
  • the ability of human T cells to inhibit cytokine expression by PD-L1-hyFc21 or PD-L1-hyFc5 fusion proteins was compared under T cell activation conditions using human PBMCs. Briefly, the PD-L1-hyFc21 or PD-L1-hyFc5 fusion protein with anti-CD3 antibody was diluted to 0.5 ⁇ M and coated in a 48-well plate at 4 °C for one day. CD4 T cells were isolated from normal human PBMCs using microbeads (Miltenyi Biotech). CD4 T cells were isolated from normal human PBMCs using microbeads (MACS).
  • the isolated CD4 T cells were placed in a test plate and cultured in an incubator at 37° C. 5% CO 2 for 3 days.
  • Anti-IFN- ⁇ antibody DuoSet Human IFN-gamma ELISA set, R&D system
  • PBS PBS with 0.05% Tween-20
  • PBS with 1% BSA was added to block the test plate at room temperature for 2 hours.
  • the culture medium was transferred to the CD4 cells on a test plate and reacted at room temperature for 2 hours.
  • the detection antibody was added and reacted for 2 hours at room temperature, followed by washing 5 times with PBST.
  • the amount of IFN- ⁇ produced in activated human CD4 T cells was significantly reduced compared to the control group (no treatment or hyFc treatment group). was confirmed (Fig. 10b).
  • the amount of IFN- ⁇ generated from activated human CD4 T cells was significantly inhibited by about 3 times compared to the group treated with the PD-L1-hyFc5 fusion protein. (Fig. 10b).
  • the ability to inhibit the cytokine expression of mouse T cells by the PD-L1-hyFc21 or PD-L1-hyFc5 fusion protein was compared under the mouse T cell activation condition. Briefly, PD-L1-hyFc21 or PD-L1-hyFc5 fusion protein (0.5 ⁇ M) together with 5 ⁇ g/mL of anti-CD3 antibody was placed in a test plate and coated at 4 °C for one day. CD4 T cells were isolated from lymphocytes isolated from the lymph nodes of mice using microbeads (Miltenyi Biotech). After washing the coated plate with PBS, the isolated CD4 T cells were added and cultured in an incubator at 37° C. 5% CO 2 for 3 days.
  • Anti-IL-2 antibody (Mouse IL-2 ELISA MAXTM Deluxe, Biolegend) and anti-IFN- ⁇ antibody (Mouse IFNgamma ELISA MAXTM Deluxe, Biolegend) were placed in a new test plate and coated at room temperature.
  • the test plate coated the previous day was washed 4 times with washing buffer, and then, assay diluent A was added and blocked at room temperature for 1 hour.
  • the CD4 T cell culture medium was transferred and reacted at room temperature for 2 hours.
  • the detection antibody was added and reacted with shaking at room temperature for 1 hour, and washed 4 times with washing buffer again.
  • IMQ imiquimod
  • IMQ cream was applied to both ears of mice daily at 20 mg/mouse/day for 6 days.
  • the ear thickness of the mice in each group was measured using a caliper every day for 7 days from the 0th day when the IMQ cream was applied to the 6th day, the end date of the test.
  • the changes in the ear thickness of the mice of each group were compared.
  • the PD-L1-hyFc21 fusion protein was administered subcutaneously or intravenously on days 0, 1, 3, and 5.
  • the anti-IL12p40 antibody was administered intravenously (iv) once on the second day of the test.
  • the control group and the experimental group are shown in Table 3 below.
  • the ear thickness was suppressed by 51% on the 6th day, the end of the test.
  • the group subcutaneously administered with the medium and high doses of 10 mg/kg and 30 mg/kg of PD-L1-hyFc21 fusion protein showed 67% and 66% inhibition, respectively, compared to the IMQ-treated group (IMG-vehicle) ( 12a).
  • rtTA-Peli1 psoriasis mouse model In order to evaluate the efficacy of the PD-L1-hyFc21 fusion protein in a psoriasis mouse model of chronic inflammation, the present inventors investigated the administration of Doxycycline in addition to the imiquimod (IMQ)-induced psoriasis mouse model. Accordingly, a psoriasis mouse model (hereinafter, "rtTA-Peli1 psoriasis mouse model”) was used in which long-term chronic psoriasis symptoms were induced by transforming the Peli1 (Pellino homolog 1) gene to be overexpressed.
  • psoriasis lesions of the epidermis an increase in inflammatory responses such as an increase in inflammatory cytokines, an increase in the epithelial cell layer, and phagocytes and dendritic cells in the dermis and increased infiltration of Th17 cells.
  • mice 4-week-old mice were allowed to drink drinking water containing 5% sucrose and 2 mg/mL doxycycline for 6 months. Saline containing doxycycline was continuously supplied during the test period. Mice not transformed with the Peli gene (hereinafter, "rtTA") were used as a control group.
  • the PD-L1-hyFc21 fusion protein was administered subcutaneously once a week for 8 weeks.
  • the average thickness of the epithelial layer was 8.74 ⁇ m in the non-psoriasis control group (rtTA), and the average thickness of the epithelial layer was 48.56 ⁇ m in the psoriasis-induced rtTA-Peli1 group (rtTA-Peli1 Vehicle). It was confirmed that the rtTA-Peli1 group (rtTA-Peli1 Vehicle) increased the thickness of the epithelial layer by about 5.6 times compared to the control group ( FIGS. 13a and 13b ).
  • the average epithelial layer thickness was 38.29 ⁇ m, 40.18 ⁇ m and 31.74 ⁇ m, respectively, in the psoriasis-induced rtTA-Peli1 group (rtTA) -Peli1 Vehicle), it was confirmed that there was an effect of reducing the thickness of the epithelial layer ( FIGS. 13a and 13b ). However, no dose-dependent effect was observed.
  • T cells and macrophages hardly infiltrated into the skin tissue in the control group (rtTA) not induced with psoriasis, and infiltrated into the skin tissue in the psoriasis-induced rtTA-Peli1 group (rtTA-Peli1 Vehicle). It was confirmed that the number of T cells and macrophages increased ( FIG. 14 ). In particular, in the psoriasis-induced rtTA-Peli1 group (rtTA-Peli1 Vehicle), the number of T cells infiltrated into the skin tissue was about 47 ( FIG. 15 ).
  • the number of T cells infiltrated into the skin tissue was about 32, 14, and 7, respectively, in a dose-dependent manner. It was confirmed that the number of T cells was significantly reduced (FIG. 15).
  • the number of K14 + keratinocytes was 59
  • the number of keratin-producing cells was 197.
  • the number of keratin-producing cells increased by about 3.3 times compared to the control group (FIG. 16).
  • the number of keratinocytes was about 179, 150, and 98, respectively, and the number of keratinocytes decreased in a dose-dependent manner. In particular, it was confirmed that the number of keratin-producing cells was significantly reduced at a dose of 30 mg/kg (FIG. 16).
  • the average thickness of the epithelial layer was 23.8 ⁇ m in the non-psoriasis control group (rtTA), and the average epithelial layer thickness was 104.5 ⁇ m in the psoriasis-induced rtTA-Peli1 group (rtTA-Peli1 Vehicle). It was confirmed that the rtTA-Peli1 group (rtTA-Peli1 Vehicle) increased the thickness of the epithelial layer by about 4.4 times compared to the control group ( FIGS. 19a and 19b ).
  • the average epithelial layer thickness was about 97.9 ⁇ m, 86.3 ⁇ m and 73.3 ⁇ m, respectively, in the psoriasis-induced rtTA-Peli1 group. It was confirmed that the thickness of the epithelial layer was dose-dependently reduced compared to (rtTA-Peli1 Vehicle) ( FIGS. 19a and 19b ).
  • Th17 cell-associated genes such as IL-17A and IL-22 and IL-1 ⁇ and IL- 24, qRT-PCR was performed to confirm changes in mRNA expression of innate immune cell-associated genes.
  • the psoriasis-induced rtTA-Peli1 group (rtTA-Peli1 Vehicle) showed increased mRNA expression of Th17 cell-related genes such as L-17A and IL-22 compared to the control group (rtTA), whereas PD In the group administered with the -L1-hyFc21 fusion protein intravenously, it was confirmed that the mRNA expression of the Th17 cell-related gene was reduced ( FIG. 20 ).
  • the mRNA expression of innate immune cell-related genes such as IL-1 ⁇ and IL-24 increased in the psoriasis-induced rtTA-Peli1 group (rtTA-Peli1 Vehicle) compared to the control group (rtTA).
  • the mRNA expression of Th17 cell-related genes showed a tendency to decrease in the group administered intravenously with the PD-L1-hyFc21 fusion protein ( FIG. 20 ).
  • the expression of IL-24 mRNA was significantly reduced in the group administered intravenously with 10 mg/kg of the PD-L1-hyFc21 fusion protein ( FIG. 20 ).
  • the PD-L1-hyFc21 fusion protein inhibits the proliferation of CD4 T cells, which is an important factor in the pathogenesis of autoimmune diseases such as psoriasis, through subcutaneous administration or intravenous administration, and suppresses the expression of inflammatory cytokines accompanying the lesion. It has an inhibitory effect, so it was confirmed that it can be used as a therapeutic agent for immune diseases such as psoriasis.

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Abstract

본 발명은 PD-L1 단백질 및 변형된 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질 및 이의 용도에 관한 것으로서, 상기 융합 단백질은 기존 융합 단백질에 비해 순도 및 생산수율이 현저히 높고, PD-1에 대한 결합능이 높으며, 활성화된 T 세포의 증식을 감소시키고, 활성화된 T 세포에 의해 생성되는 사이토카인의 생성을 억제하며, T 세포 또는 대식세포의 조직으로의 침윤을 억제하는 효과가 있어, 면역질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

PD-L1 단백질이 포함된 융합 단백질 및 이의 용도
본 발명은 PD-L1 단백질 및 변형된 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질 및 이의 용도에 관한 것이다.
인간 PD-L1(programmed cell death-ligand 1)은 PD-1(programmed death-1)에 대한 리간드로서, T 림프구, B 림프구, 수지상 세포(Dendritic cell), 또는 대식 세포와 같은 조혈 세포뿐만 아니라, 케라틴 세포, 췌도 세포, 간세포 등과 같은 비-조혈 세포에서도 발현되는 제1형 막관통 단백질이다. 한편, T 세포가 활성화되기 위해서는 T 세포 수용체(receptor)와 항원의 1차 신호자극 이외에 2차 신호자극(co-stimulation)이 동시에 필요하다. 이 때, 둘 중 하나의 신호라도 없으면 T 세포는 비활성화(anergy) 상태가 된다. PD-1(programmed death-1)은 T 세포의 2차 신호 활성을 조절하는 2차 신호자극인자(immune check point 또는 immune modulator)로서, 활성화된 T 세포(CD8 및/또는 CD4)나 수지상 세포(dendritic cell)와 같이 세포 표면에서 발현하는 PD-L1(programmed cell death ligand 1) 또는 B7.1 (CD80) 등과 결합함으로써, T 세포의 증식을 억제하고, 사이토카인(cytokine) 발현을 감소시키는 등 T 세포의 기능을 억제하는 작용을 할 수 있다.
PD-1:PD-L1 간의 결합은 조절 T 세포의 활성을 유도하는 것으로 알려져 있는데(Immunol Rev. 2010 Jul;236:219-42), 이러한 PD-L1의 면역관용 유도 기능을 이용하여 IgG1의 Fc가 융합된 PD-L1 단백질(PD-L1-Ig)을 CIA(collagen-induced arthritis) 마우스 모델에 주입하였을 때, 관절염 증상이 완화되는 것이 관찰된 바 있다(Rheumatol Int. 2011 Apr; 31(4):513-9). PD-1은 활성화된 T 세포에서 발현되므로, PD-L1 단백질은 자가 면역질환뿐만 아니라 장기이식에서의 면역관용유도에 있어 활성 면역세포를 특이적으로 표적하는 치료제로 유용하게 사용될 수 있을 것으로 예측된다.
현재까지 PD-1/PD-L1 세포신호체계에 대한 치료제는 저해제(antagonist)로서 면역관용을 저해(tolerance breaking)하여 T 세포 활성을 증가시키는 방향으로 개발되어 왔다. 하지만, 활성제(agonist)를 이용한 T 세포 면역관용 유도 기반의 면역치료제는 현재까지 개발되어 있지 않은 실정이다. 이는 PD-1/PD-L1 저해제(antagonist)의 경우 항체 융합 기술을 이용하여 쉽게 개발될 수 있지만, 가용성(soluble) 형태의 단백질로 개발되어야 하는 PD-1/PD-L1 신호 활성제(agonist)는 기술적으로 개발이 쉽지 않기 때문이다.
면역글로불린(immunoglobulin, Ig)의 Fc 융합기술은 단백질 치료제의 체내 반감기를 증가시키기 위한 기술 중 하나이다. 그러나 기존 Ig 융합 기술에 이용되는 IgG1의 경우, 체내에서 항체 의존성 세포 독성(antibody dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC) 및 보체 의존성 독성(complement dependent cytotoxicity, CDC)을 일으키기 때문에, 자가 면역질환 치료제 또는 장기이식에서의 면역관용 유도제로서의 Ig 융합 단백질은 염증 반응을 억제하는 역할을 수행하지 못하고, 오히려 염증을 악화시키는 문제점이 있다.
이에 따라, PD-L1의 반감기를 기존 Ig 융합 단백질 치료제와 유사하게 유지하면서도 ADCC 및 CDC를 유발하지 않도록 함으로써 면역억제제로서의 PD-L1의 치료 효능을 높이는 기술 개발이 필요한 상황이다.
본 발명의 목적은 PD-L1(programmed cell death-ligand 1) 단백질 및 변형된 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 PD-L1 단백질 및 변형된 면역글로불린 Fc 영역이 포함된 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 면역질환의 예방 또는 치료 효과를 가진 의약제제를 생산하기 위한 PD-L1 단백질 및 변형된 면역글로불린 Fc 영역이 포함된 융합 단백질의 사용을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 PD-L1 단백질 및 변형된 면역글로불린 Fc 영역이 포함된 융합 단백질과 약학적으로 허용 가능한 담체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 PD-L1 단백질 및 변형된 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 PD-L1 단백질 및 변형된 면역글로불린 Fc 영역이 포함된 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 면역질환의 예방 또는 치료 효과를 가진 의약제제를 생산하기 위한 PD-L1 단백질 및 변형된 면역글로불린 Fc 영역이 포함된 융합 단백질의 사용을 제공한다.
또한, 본 발명은 PD-L1 단백질 및 변형된 면역글로불린 Fc 영역이 포함된 융합 단백질과 약학적으로 허용 가능한 담체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 융합 단백질은 PD-L1 단백질 및 변형된 면역글로불린 Fc 영역이 GS 서열과 IgG1 힌지로 이루어진 서열로 연결된 융합 단백질로서, GS 서열과 IgG1 힌지로 이루어진 서열로 연결됨으로써 이량체를 유도하면서 유연성을 유지할 수 있도록 제조되었다는 특징이 있다. 또한, 본 발명에 따른 융합 단백질은 기존 융합 단백질에 비해 순도 및 생산수율이 현저히 높고, PD-1에 대한 결합능이 높으며, 활성화된 T 세포의 증식을 감소시키고, 활성화된 T 세포에 의해 생성되는 사이토카인의 생성을 억제하며, T 세포 또는 대식세포의 조직으로의 침윤을 억제하는 효과가 있어, 면역질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 PD-L1 단백질 및 변형된 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질(PD-L1-hyFc21 융합 단백질)의 구조를 나타낸 것이다.
도 2a는 PD-L1-hyFc21 융합 단백질을 발현하는 세포의 시간별 세포 농도를 분석한 결과이고, 2b는 PD-L1-hyFc21 융합 단백질을 발현하는 세포의 세포배양액에서 SE-HPLC를 통해 목적 단백질의 순도를 분석한 결과이다.
도 3a는 PD-L1-hyFc5 융합 단백질을 발현하는 세포의 시간별 세포 농도를 분석한 결과이고, 3b는 PD-L1-hyFc5 융합 단백질을 발현하는 세포의 세포배양액에서 SE-HPLC를 통해 목적 단백질의 순도를 분석한 결과이다.
도 4는 정제된 PD-L1-hyFc21 또는 PD-L1-hyFc5 융합 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과이다.
도 5a는 정제된 PD-L1-hyFc21 융합 단백질의 SE-HPLC 분석 결과이고, 5b는 정제된 PD-L1-hyFc5 단백질의 SE-HPLC 분석 결과이다.
도 6은 정제된 PD-L1-hyFc21 또는 PD-L1-hyFc5 융합 단백질의 Gel IEF 분석 결과이다.
도 7은 정제된 PD-L1-hyFc21 또는 PD-L1-hyFc5 융합 단백질의 시차 주사 형광법(DSF) 분석 결과이다.
도 8은 PD-L1-hyFc21 또는 PD-L1-hyFc5 융합 단백질의 PD-1에 대한 결합능(binding affinity)을 비교한 결과이다.
도 9는 PD-L1-hyFc21 또는 PD-L1-hyFc5 융합 단백질에 의한 혼합 림프구 반응 억제능을 비교한 결과이다.
도 10a는 PD-L1-hyFc21 또는 PD-L1-hyFc5 융합 단백질에 의한 활성화된 인간 CD4 T 세포 증식 억제능을 비교한 결과이고, 10b는 활성화된 인간 CD4 T 세포의 사이토카인 발현 억제능을 비교한 결과이다.
도 11은 PD-L1-hyFc21 또는 PD-L1-hyFc5 융합 단백질에 의한 활성화된 마우스 CD4 T 세포의 사이토카인 발현 억제능을 비교한 결과이다.
도 12a는 IMQ-유도 건선 마우스 모델에 PD-L1-hyFc21 융합 단백질의 피하 투여한 후 마우스의 귀 두께를 측정한 결과이고, 도 12b는 IMQ-유도 건선 마우스 모델에서 PD-L1-hyFc21 융합 단백질의 정맥 투여한 후 마우스의 귀 두께를 측정한 결과이다.
도 13a는 rtTA-Peli1 건선 마우스 모델에 PD-L1-hyFc21 융합 단백질의 피하 투여한 후 피부 상피조직의 변화를 H&E 염색을 통해 확인한 결과이고, 13b는 피부 상피층의 두께를 측정한 결과이다.
도 14는 건선이 유발되지 않은 대조군(rtTA) 또는 건선이 유발된 rtTA-Peli1 건선 마우스 모델에서 T 세포 및 대식세포의 침윤 정도를 면역형광분석법을 통해 나타낸 결과이다 (왼쪽 패널: rtTA; 및 오른쪽 패널: rtTA-Peli1).
도 15는 rtTA-Peli1 건선 마우스 모델에 PD-L1-hyFc21 융합 단백질의 피하 투여한 후 피부조직으로 침윤된 T 세포 및 대식세포의 수를 측정한 결과이다.
도 16은 rtTA-Peli1 건선 마우스 모델에 PD-L1-hyFc21 융합 단백질의 피하 투여한 후 피부조직에서 K14+ 케라틴 생성 세포의 수를 측정한 결과이다.
도 17은 rtTA-Peli1 건선 마우스 모델에 PD-L1-hyFc21 융합 단백질의 정맥 투여한 후 피부 상피층의 변화를 스코어 지수로 분석한 결과이다.
도 18은 rtTA-Peli1 건선 마우스 모델에 PD-L1-hyFc21 융합 단백질의 정맥 투여한 후 배 부위의 피부 두께를 측정한 결과이다.
도 19a는 rtTA-Peli1 건선 마우스 모델에 PD-L1-hyFc21 융합 단백질의 정맥 투여한 후 피부 상피조직의 변화를 H&E 염색을 통해 확인한 결과이고, 도 19b는 피부 상피층의 두께를 측정한 결과이다.
도 20은 rtTA-Peli1 건선 마우스 모델에 PD-L1-hyFc21 융합 단백질의 정맥 투여한 후 qRT-PCR을 통해 Th17 세포-관련 유전자(IL-17A 및 IL-22) 및 선천성 면역세포-관련 유전자(IL-1β 및 IL-24)의 mRNA 발현 변화를 확인한 결과이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 PD-L1 단백질 및 변형된 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
상기 PD-L1 단백질은 PD-L1 단백질의 세포외 도메인(extracellular domain) 또는 이의 단편인 것일 수 있다. PD-L1 단백질의 세포외 도메인은 PD-L1의 Ig V 유사 도메인(Immunoglobulin V like domain) 및 PD-L1의 Ig C 유사 도메인(Immunoglobulin C like domain)을 포함하는 폴리펩티드일 수 있다.
구체적으로, PD-L1 단백질의 세포외 도메인은 세포막 밖으로 노출된 단백질 부위로서, 서열번호 1의 19번 내지 238번 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드 또는 서열번호 1의 19번 내지 239번 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드일 수 있다.
이때, 상기 PD-L1 단백질의 세포외 도메인은 면역글로불린(Ig, immunoglobulin)의 아미노산 서열과 유사한 보존 서열(conserved sequence)인 Ig V 유사(Ig V, Ig V like) 서열을 포함하고 있으며, 보존성이 높은(highly conserved) Ig V 유사 서열은 서열번호 1의 68번 내지 114번의 아미노산 서열이다. 또한, Ig C 유사(Ig C, Ig C like) 서열을 포함하고 있으며, 보존성이 높은(highly conserved) 서열 부위는 서열번호 1의 153번 내지 210번의 아미노산 서열이다. 또한, 상기 PD-L1 단백질의 세포외 도메인의 단편은 PD-L1의 Ig V 유사 서열을 포함하는 Ig V 유사 도메인 전체 또는 일부를 포함할 수 있다.
또한, 상기 PD-L1 단백질의 세포외 도메인에서 Ig V 유사 도메인은 PD-1과 상호작용할 수 있는 부위로서, 서열번호 1의 19번 내지 239번의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드(서열번호 3)일 수 있고, 서열번호 1의 21번 내지 239번의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드일 수 있다. 또한, 서열번호 1의 19번 내지 133번의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드(서열번호 4)일 수 있고, 서열번호 1의 21번 내지 133번의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드일 수 있다. 또한, 서열번호 1의 21번 내지 114번의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드일 수 있고, 서열번호 1의 19번 내지 114번의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드일 수 있다. 또한, 서열번호 1의 21번 내지 120번의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드일 수 있고, 서열번호 1의 19번 내지 120번의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드일 수 있다. 또한, 서열번호 1의 19번 내지 127번의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드(서열번호 5)일 수 있고, 서열번호 1의 21번 내지 127번의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드(서열번호 6)일 수 있다. 또한, 서열번호 1의 21번 내지 130번의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드일 수 있고, 서열번호 1의 19번 내지 130번의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드일 수 있다. 또한, 서열번호 1의 21번 내지 131번의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드일 수 있고, 서열번호 1의 19번 내지 131번의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드일 수 있다.
또한, 상기 PD-L1 단백질의 세포외 도메인의 단편은 Ig V 유사 도메인 또는 이의 단편을 포함할 경우, PD-L1 단백질의 세포외 도메인의 Ig C 유사 도메인(Immunoglobulin C like domain)을 더 포함할 수 있다. 상기 Ig C 유사 도메인은 서열번호 1의 133번 내지 225번의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드이거나, 또는 서열번호 1의 134번 내지 225번의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드일 수 있다.
또한, 상기 PD-L1 단백질의 세포외 도메인의 단편이 Ig V 유사 도메인 또는 이의 단편을 포함할 경우, PD-L1 단백질의 세포외 도메인의 Ig C 유사 도메인을 포함하는 폴리펩티드 또는 이의 단편을 더 포함할 수 있다. 상기 Ig C 유사 도메인을 포함하는 폴리펩티드는 Ig V 도메인을 제외한 PD-L1 단백질의 세포외 도메인을 의미하는 것으로서, 서열번호 1의 134번 내지 239번의 아미노산을 갖는 폴리펩티드(서열번호 7) 또는 서열번호 1의 134번 내지 238번의 아미노산을 갖는 폴리펩티드(서열번호 8)일 수 있다.
또한, 상기 PD-L1 단백질의 세포외 도메인 또는 이의 단편은 인간 또는 마우스에서 유래된 것일 수 있다.
상기 인간 PD-L1 단백질의 세포외 도메인은 서열번호 1의 19 내지 239번째 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드(서열번호 3)이고, 마우스 PD-L1 단백질의 세포외 도메인은 서열번호 2의 19 내지 239번째 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드이다. 또한, 상기 PD-L1 단백질의 세포외 도메인은 서열번호 1의 19 내지 239번째 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드 서열과 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성을 가진 것일 수 있다.
구체적으로, 인간 PD-L1 단백질은 290개의 아미노산 잔기를 가지고 있으며, 서열번호 1(Accession Number: Q9NZQ7)의 아미노산 서열을 포함한다. 서열번호 1의 아미노산 서열에서 N-말단의 1번 내지 18번의 아미노산 잔기는 신호 서열이고, 성숙된 인간 PD-L1 단백질은 서열번호 1의 19번 내지 290번의 아미노산 서열을 포함한다. 인간 PD-L1 단백질의 세포외 도메인(extracellular domain)은 서열번호 1의 19번 내지 238번 또는 서열번호 1의 19번 내지 239번의 아미노산 서열을 포함한다.
인간 PD-L1 단백질은 서열번호 1의 19번 내지 127번의 아미노산인 Ig V 유사 도메인과 서열번호 1의 134번 내지 226번 아미노산인 Ig C 유사 도메인을 포함한다.
마우스 PD-L1 단백질은 290개의 아미노산을 포함하는 것으로 보고되었으며, 이는 서열번호 2(Accession Number: Q9EP73)의 아미노산 서열을 포함한다. 서열번호 2의 1번 내지 18번의 아미노산 잔기는 신호 서열이며, 성숙된 마우스 PD-L1 단백질은 서열번호 2의 19번 내지 290번의 아미노산 서열을 포함한다. 마우스 PD-L1 단백질의 세포외 도메인은 서열번호 2의 19번 내지 239번의 아미노산 서열을 포함한다. 마우스 PD-L1 단백질은 서열번호 2의 19번 내지 127번의 아미노산인 Ig V 유사 단백질과 서열번호 2의 133번 내지 224번의 아미노산인 Ig C 유사 도메인을 포함한다.
상기 PD-L1 단백질의 세포외 도메인은 Ig V 유사 도메인의 전체 또는 이의 단편을 포함할 수 있다. 또한, 상기 PD-L1 단백질의 세포외 도메인의 단편은 추가적으로 Ig C 유사 도메인 또는 Ig C 유사 도메인을 포함하는 폴리펩티드(Ig V 유사 도메인이 제외된 PD-L1의 세포외도메인)를 더 포함할 수 있다.
PD-L1 단백질의 세포외 도메인 또는 이의 단편은 다양하게 변형된 단백질 또는 펩티드를 포함할 수 있다. 상기 변형은 PD-L1의 기능을 변형시키지 않는 이상, 야생형 PD-L1 단백질에 하나 이상의 단백질을 치환, 결실 또는 추가하는 방법을 통하여 수행될 수 있다. 이러한 다양한 단백질 또는 펩티드는 야생형 단백질과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 상동성을 가질 수 있다.
본 발명의 용어, "PD-L1 단백질의 세포외 도메인"은 "PD-L1 단백질의 세포외 도메인 및 이의 단편"을 포함하는 개념으로 사용되기도 한다.
본 발명의 용어, "단백질", "폴리펩티드" 및 "펩티드"는, 별다른 설명이 없는 한, 상호 호환되는 개념으로 사용될 수 있다.
본 발명의 용어, "PD-L1 융합 단백질" 및 "PD-L1-변형된 면역글로불린의 Fc 영역 융합 단백질"은 PD-L1 단백질, PD-L1 단백질의 세포외 도메인 또는 이의 단편이, 변형된 면역글로불린 Fc 영역과 결합된 융합 단백질을 의미한다.
본 발명에서, 상기 PD-L1 단백질은 변형된 면역글로불린의 Fc 영역의 N-말단 또는 C-말단에 융합될 수 있고, 바람직하게는, 상기 PD-L1 단백질은 변형된 면역글로불린의 Fc 영역의 N-말단에 융합될 수 있다. 상기 PD-L1 단백질은 면역글로불린 Fc 영역과 링커 펩티드로 연결될 수 있다. 상기 링커는 GGGSGGS (서열번호 10), AAGSGGGGGSGGGGSGGGGS (서열번호 17), GGSGG (서열번호 18), GGSGGSGGS (서열번호 19), GGGSGG (서열번호 20), (G4S)n (n은 1 내지 10의 정수), (GGS)n (n은 1 내지 10의 정수), (GS)n (n은 1 내지 10의 정수), (GSSGGS)n (n은 1 내지 10의 정수), KESGSVSSEQLAQFRSLD (서열번호 21), EGKSSGSGSESKST (서열번호 22), GSAGSAAGSGEF (서열번호 23), (EAAAK)n (n은 1 내지 10의 정수), CRRRRRREAEAC (서열번호 24), A(EAAAK)4ALEA(EAAAK)4A, GGGGGGGG (서열번호 25), GGGGGG (서열번호 26), AEAAAKEAAAAKA (서열번호 27), PAPAP (서열번호 28), (Ala-Pro)n (n은 1 내지 10의 정수), VSQTSKLTRAETVFPDV (서열번호 29), PLGLWA (서열번호 30), TRHRQPRGWE (서열번호 31), AGNRVRRSVG (서열번호 32), RRRRRRRR (서열번호 33), GFLG (서열번호 34), 및 GSSGGSGSSGGSGGGDEADGSRGSQKAGVDE (서열번호 35) 등이 포함될 수 있다. 바람직하게는, PD-L1 및 면역글로불린 Fc 영역이 GGGSGGS (서열번호 10)의 아미노산 서열로 이루어진 링커 펩티드로 연결될 수 있다. 상기 링커 펩티드를 이용하여 PD-L1 단백질과 면역글로불린 Fc 영역을 연결할 경우, 상기 융합 단백질의 활성, 안정성 및 생산성이 최적화될 수 있다.
또한, 상기 융합 단백질은 이량체 형태로 존재할 수 있다. 이량체를 구성하는 융합 단백질 간의 결합은 링커 내에 존재하는 시스테인에 의해 이황화 결합에 의해 이루어진 것일 수 있다. 이량체를 구성하는 융합 단백질은 동일한 것이다. 즉, 상기 이량체는 동형이량체(homodimer)인 것일 수 있다. 이때, 상기 융합 단백질은 가용성일 수 있으며, 특히, 정제수 또는 생리 식염수에 용해될 수 있다.
상기 변형된 면역글로불린의 Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgD 및 IgG4의 Fc 영역 중 어느 하나 또는 이들의 조합인 것일 수 있다. 상기 Fc 영역은 Fc 수용체와 결합 및/또는 보체(complement) 결합이 일어나지 않도록 변형된 것이다. 특히, 상기 변형된 면역글로불린의 Fc 영역은 N-말단에서 C-말단 방향으로 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하며, 상기 힌지 영역은 인간 IgG1 힌지 영역(서열번호 16)을 포함하고, 상기 CH2 도메인은 인간 IgD와 인간 IgG4의 CH2 도메인의 아미노산 잔기의 부분을 포함하며, 상기 CH3 도메인은 인간 IgG4의 CH3 도메인의 아미노산 잔기의 부분을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 용어, "Fc 영역", "Fc 단편" 또는 "Fc"란 면역글로불린의 중쇄 불변 영역 2(CH2) 및 중쇄 불변 영역 3(CH3)을 포함하며, 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 및 경쇄 불변 영역 1(CL1)은 포함하지 않는 단백질을 말한다. 그것은 중쇄 불변 영역의 힌지 영역을 더 포함할 수 있다. 하이브리드 Fc 또는 하이브리드 Fc 단편은 본 발명에서 "hFc" 또는 "hyFc"로 지칭되기도 한다.
또한, 본 발명의 Fc 단편은 천연형 당쇄, 천연형에 비해 증가된 당쇄, 천연형에 비해 감소한 당쇄, 또는 당쇄가 제거된 형태일 수 있다. 화학적 방법, 효소적 방법 및 미생물을 사용한 유전공학적 엔지니어링 방법 등과 같이 통상적인 방법으로 면역글로불린 Fc 당쇄를 변형시킬 수 있다. Fc 단편으로부터 당쇄의 제거는 1차 보체 구성요소 C1의 C1q에의 결합 친화력을 급격하게 감소시키고, ADCC 또는 CDC의 감소 또는 소실을 가져오며, 그로 인하여 생체 내의 불필요한 면역반응을 유도하지 않는다. 이런 점에서, 당쇄가 제거되거나(deglycosylated) 비당쇄화된(aglycosylated) 형태에서의 면역글로불린 Fc 단편은, 약물의 담체로서 본 발명의 목적에 더 적합할 수 있다. 여기에서 사용된 용어 "당쇄의 제거(deglycosylation)"는 Fc 단편으로부터 효소적으로 당이 제거됨을 의미한다. 또한, 용어 "비당쇄화(aglycosylation)"는 Fc 단편이 원핵 생물, 바람직하게는 E.coli에 의하여 당쇄화 되지 않은(unglycosylated) 형태로 생성됨을 의미한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 변형된 면역글로불린의 Fc 영역은 서열번호 11의 아미노산 서열(이하, "hyFc")로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 융합 단백질은 하기 구조식 I로 표현되는 것일 수 있다.
N' - X - L - Y - C' (구조식 I)
상기에서,
N'은 융합 단백질의 N 말단이고, C'은 융합 단백질의 C 말단이고;
상기 X는 PD-L1 단백질, PD-L1 단백질의 세포외도메인 또는 이의 단편이고;
L은 링커이고;
Y는 면역글로불린 Fc 영역이다.
바람직하게는 상기 융합 단백질은 서열번호 12 또는 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 또한, 본 발명의 융합 단백질은 서열번호 12의 아미노산 서열과 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 상동성을 가지는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
바람직하게는, 상기 핵산 분자는 서열번호 12 또는 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자인 것일 수 있다. 또한, 상기 핵산 분자는 신호 서열(또는 신호 펩티드) 또는 리더 서열을 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 용어, "신호 서열(또는 신호 펩티드)"은 분비 경로로 분류된 새로 합성된 단백질의 N-말단에 존재하는 짧은 펩티드를 말한다. 본 발명에서 유용한 신호 서열은 항체 경쇄 신호 서열, 예를 들면, 항체 1418(Gillies et al., J Immunol Meth 1989 125:191-202), 항체 중쇄 신호 서열, 예를 들면, MOPC141 항체 중쇄 신호 서열(Sakano et al, Nature 1980 286: 676-683), 및 당업계에 알려진 다른 신호 서열(예, Watson et al, Nucleic Acid Research 1984 12:5145-5164를 참조)을 포함한다.
상기 신호 펩티드는 당업계에 그 특징이 잘 알려져 있으며, 통상 16 내지 30 개의 아미노산 잔기를 포함하는 것으로 알려져 있고, 그 보다 더 많은 또는 더 적은 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 통상적인 신호 펩티드는 기본 N-말단 영역, 중심의 소수성 영역, 및 보다 극성인(polar) C-말단 영역의 세 영역으로 구성된다.
중심 소수성 영역은 미성숙 폴리펩티드가 이동하는 동안 막지질 이중층을 통하여 신호 서열을 고정시키는 4 내지 12 개의 소수성 잔기를 포함한다. 개시 이후에, 신호 서열은 흔히 신호 펩티다아제(signal peptidases)로 알려진 세포 효소에 의하여 ER의 루멘(lumen) 내에서 절단된다. 이때, 상기 신호 서열은 tPa(tissue Plasminogen Activation), HSV gDs, 또는 성장 호르몬의 분비신호 서열일 수 있다. 바람직하게, 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵 세포에서 사용되는 분비 신호 서열을 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 tPa 서열 또는 서열번호 1의 1 내지 18번째 아미노산 서열을 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 신호 서열은 숙주세포에서 발현 빈도가 높은 코돈으로 치환하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
본 발명의 용어, "벡터"는 숙주 세포에 도입되어 숙주 세포 유전체 내로 재조합 및 삽입될 수 있거나, 또는 에피좀(episome)으로서 자발적으로 복제될 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 수단으로 이해된다. 상기 벡터는 선형(linear) 핵산, 플라스미드, 파지미드(phagemids), 코스미드(cosmids), RNA 벡터, 바이러스 벡터 및 이의 유사체들을 포함한다. 바이러스 벡터의 예로는 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus) 및 아데노-관련 바이러스(adeno-associated virus)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, 유용한 발현 벡터는 RcCMV(Invitrogen, Carlsbad) 또는 이의 변이체일 수 있다. 유용한 발현 벡터는 포유류 세포에서 목적 유전자의 연속적인 전사를 촉진하기 위한 인간 CMV(cytomegalovirus) 프로모터, 및 전사 후 RNA의 안정상태 수준을 높이기 위한 우태 성장 인자(bovine growth hormone) 폴리아데닐레이션 신호 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구체예로 발현 벡터는 RcCMV의 변형 벡터인 pAD15이다.
본 발명의 용어, "숙주 세포"는 재조합 발현 벡터가 도입될 수 있는 원핵 및 진핵 세포를 나타낸다.
본 발명에서, 적절한 숙주 세포는 본 발명의 DNA 서열로 형질 전환되거나 형질 감염시킬 수 있으며, 목적 단백질의 발현 및/또는 분비에 이용될 수 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 현재 바람직한 숙주 세포는 불멸의 하이브리도마 세포(immortal hybridoma cells), NS/0 골수종 세포(NS/0 myeloma cells), 293 세포, 중국 햄스터 난소 세포(CHO cell), HeLa 세포, CapT 세포(인간 양수 유래 세포) 및 COS 세포를 포함한다.
본 발명의 용어, "형질전환" 및 "형질감염"은 당업계에 공지된 많은 기술에 의해 세포 내로 핵산(예를 들어, 벡터)을 도입하는 것을 의미한다.
또한, 본 발명은 PD-L1 단백질 및 변형된 면역글로불린 Fc 영역이 포함된 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
상기 면역질환은 자가면역질환, 염증성 질환, 및 세포, 조직, 또는 기관의 이식거부(transplantation rejection) 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환일 수 있다.
상기 자가면역질환은 관절염 [급성 관절염, 만성 류머티스 관절염, 통풍성(gouty) 관절염, 급성 통풍성 관절염, 만성 염증성 관절염, 퇴행성 관절염, 감염성 관절염, 라임(Lyme) 관절염, 증식성 관절염, 건선성 관절염, 척추성 관절염, 및 연소성 류마티스 관절염(juvenile-onset rhematoid arthritis), 골관절염, 관절염 크로니카 프로그레디엔테(arthritis chronica progrediente), 변형성(deformans) 관절염, 다발관절염 크로니카 프리마리아(polyarthritis chronica primaria), 반응성 관절염(reactive arthritis), 및 강직성 척수염(ankylosing spondylitis)과 같은 류머티스 관절염], 염증성 과증식 피부 질환, 플라크 건선(plaque psoriasis), 구타테 건선(gutatte psoriasis), 농포성 건선(pustular psoriasis), 및 손톱의 건선(psoriasis of the nails)과 같은 건선, 접촉성 피부염, 만성 접촉성 피부염, 알러지성 피부염, 알러지성 접촉성 피부염, 포진성 피부염(herpetiformis dermatitis), 및 아토피성 피부염(atopic dermatitis)을 포함하는 피부염, X-연관 과 IgM 증후군, 만성 알러지성 두드러기 및, 만성 자가면역 두드러기를 포함하는, 만성 특발성 두드러기(chronic idiopathic urticaria)와 같은 두드러기(urticaria), 다발성근염/피부근염(polymyositis/dermatomyositis), 연소성 피부근염(juvenile dermatomyositis), 중독성 표피박리(toxic epidermal necrolysis), 경피증(scleroderma)(전신성 경피증을 포함), 전신성 경화증(systemic sclerosis), 스피노-옵티컬 MS(spino-optical MS), 원발성 진보성 MS(primary progressive MS; PPMS), 및 재발성 레밋 MS(relapsing remitting MS; RRMS)와 같은 다발성 경화증(multiple sclerosis; MS), 진보성 전신 경화증(progressive systemic sclerosis), 아테롬성 동맥경화증(atherosclerosis), 동맥경화증(arteriosclerosis), 파종성 경화증(sclerosis disseminata), 및 운동성 경화증(ataxic sclerosis)을 포함하는 경화증(sclerosis), 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease; IBD) [예를 들면, 크론 질환, 자가면역-매개 위장질환, 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 궤양 대장염(colitis ulcerosa), 미세 대장염(microscopic colitis), 콜라겐성 대장염(collagenous colitis), 폴리포사 대장염(colitis polyposa), 신생아 괴사성 대장염(necrotizing enterocolitis), 및 경벽 대장염(transmural colitis)과 같은 대장염, 및 자가면역 염증성 장질환(autoimmune inflammatory bowel disease)], 괴저성 농피증(pyoderma gangrenosum), 결정성 홍반(erythema nodosum), 원발성 경화 담관염(primary sclerosing cholangitis, episcleritis)를 성인 또는 급성 호흡장애 증후군(adult or acute respiratory distress syndrome; ARDS)을 포함하는 호흡 장애 증후군(respiratory distress syndrome), 수막염(meningitis), 포도막(uvea)의 전체 또는 부분의 염증, 홍채염(iritis), 맥락막염(choroiditis), 자가면역혈액장애(autoimmune hematological disorder), 류마티즘성 척추염(rheumatoid spondylitis), 급성 청력 상실, 아나필락시스(anaphylaxis) 및 알러지성 및 아토피성 비염과 같은 IgE-매개 질환, 라스무센 뇌염(Rasmussen's encephalitis) 및 변연계 및/또는 뇌줄기 뇌염(limbic and/or brainstem encephalitis)과 같은 뇌염(encephalitis), 앞 포도막염(anterior uveitis), 급성 앞 포도막염, 육아종 포도막염(granulomatous uveitis), 비육아종 포도막염(nongranulomatous uveitis), 파코항원성 포도막염(phacoantigenic uveitis), 뒤 포도막염(posterior uveitis), 또는 자가면역 포도막염(autoimmune uveitis)과 같은 포도막염, 원발성 GN(primary GN)과 같은 만성 또는 급성 사구체신염과 같은 신증후군(nephrotic syndrome)과 함께 또는 없이 사구체신염(glomerulonephritis; GN), 면역-매개 GN, 막성신증(membranous GN, membranous nephropathy), 특발성 막성신증(idiopathic membranous nephropathy) 또는 특발성 막성신증(idiopathic membranous GN), I형 및 II형를 포함한 레나브로-(rnembrano-) 또는 막 증식성 GN(membranous proliferative GN; MPGN), 및 급속한 진행성 GN, 알러지 질병, 알러지 반응, 알러지성 또는 아토피성 습진을 포함한 습진(eczema), 소기관지 천식(asthma bronchiale), 기관지 천식(bronchial asthma) 및 자가면역 천식과 같은 천식, T 세포 침투 및 만성적 염증반응과 관련된 질병, 만성적 폐염증성 질환(pulmonary inflammatory disease), 자가면역 심근염(myocarditis), 백혈구부착결핍증(leukocyte adhesion deficiency), 전신적홍반성루푸스(systemic lupus erythematosus; SLE) 또는 피부 SLE와 같은 전신적홍반성루푸스, 아급성피부홍반성루프스(subacute cutaneous lupus erythematosus), 신생아루푸스증후군(neonatal lupus syndrome; NLE), 홍반성루푸스낭창(lupus erythematosus disseminatus), 루푸스 [신장염(nephritis), 뇌염(cerebritis), 소아(pediatric), 비신장(non-renal), 신장외(extra-renal), 반상(discoid), 탈모(alopecia)를 포함하는], 소아 인슐린-의존 당뇨병(pediatric insulin-dependent diabetes mellitus; IDDM)을 포함하는 유아개시(I 형) 당뇨병(juvenile onset(Type I) diabetes mellitus), 성인개시당뇨병(II 형), 자가면역 당뇨병, 특발성 당뇨병요붕증(idiopathic diabetes insipidus), T 림프구 및 사이토카인에 의해 매개되는 급성 및 지연된 과민성과 관련된 면역반응, 결핵, 사코이도시스(sarcoidosis), 림프종모양육아종증(lymphomatoid granulomatosis)를 포함하는 육아종증(granulomatosis), 웨그너 육아종증(Wegener's granulomatosis), 무과립구증(agranulocytosis), 혈관염(vasculitis) [거대혈관혈관염(다발근육통(polymyalgia rheumatica) 및 거대세포(Takayasu's)동맥염)을 포함하는], 카와사키 질환, 결절성다발성동맥염(polyarteritis nodosa)을 포함하는 중간혈관혈관염, 마이크로스코픽 다발성동맥염(microscopic polyarteritis), CNS 관절염, 괴사성, 피부성, 또는 과민성 혈관염, 전신적괴사성혈관염(systemic necrotizing vasculitis), 척-스트라우스 혈관염(Churg-Strauss vasculitis) 또는 증후군(CSS)와 같은 ANCA-관련 혈관염)을 포함하는 바스큘리티드(vasculitides), 측두동맥염(temporal arteritis), 재생불량성 빈혈(aplastic anemia), 자가면역 재생불량성 빈혈, 쿰스(coombs) 양성 빈혈, 다이아몬드 블랙판 빈혈(Diamond Blackfan anemia), 용혈성 빈혈(hemolytic anemia) 또는 자가면역용혈성빈혈(autoimmune hemolytic anemia; AIHA)을 포함하는 면역 용혈성 빈혈, 악성빈혈(pernicious anemia)(anemia perniciosa), 애디슨 질환(Addison's disease), 순수적혈구빈혈무형성증(pure red cell anemia aplasia; PRCA), 인자 VHI 결핍증, 혈우병 A, 자가면역 호중구감소증(autoimmune neutropenia), 범혈구감소증(pancytopenia), 백혈구감소증(leukopenia), 백혈구 누출증(leukocyte diapedesis)과 관련된 질환, CNS 염증성 장애, 패혈증(septicemia), 외상(trauma), 출혈(hemorrhage)에 대한 2차와 같은 다기관 손상, 항원-항체 복합체-매개 질환, 항-사구체 기저막 질환, 항-인지질 항체 증후군, 알러지 신경염, 베체트 질환(Bechet's 또는 Behcet's disease), 캐슬맨 증후군(Castleman's syndrome), 굿패스쳐증후군(Goodpasture's syndrom), 레이나우드 증후군(Reynaud's syndrome), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 스티븐스-존슨 등후군(Stevens- Johnson syndrome), 수포성 펩피고이드(pemphigoid bullous) 및 피부 펨피고이드(skin pemphigoid)와 같은 펩피고이드(pemphigoid), 천포창(pemphigus) [심상성천포창(pemphigus vulgaris), 낙엽성천포창(pemphigus foliaceus), 천포창 점막 핌피고이드(pemphigus mucus-membrane pemphigoid), 및 홍반성천포창(pemphigus erythematosus)을 포함], 자가면역 다발성내분비병증(autoimmune polyendocrinopathies), 라이터 질환(Reiter's disease) 또는 증후군, 면역복합체 신장염, 항체-매개 신장염, 시속척수염(neuromyelitis optica), 다신경병증(polyneuropathies), IgM 다신경병증 또는 IgM-매개 신경변증과 같은 만성적 신경병증(chronic neuropathy), 혈전성 혈소판감소자반증(thrombotic thrombocytopenic purpura; TTP) 및 만성적 또는 급성 ITP를 포함하는 특발성혈소판감소증(ITP)와 같은 자가면역 또는 면역-매개 혈소판감소증을 포함하는 혈소판감소증(thrombocytopenia)(예를 들면, 심근경색 환자에 의해 발달된), 자가면역 고환염 및 난소염을 포함하는 고환 및 난소의 자가면역 질환, 원발성 갑상선기능저하증(primary hypothyroidism), 자가면역 갑상선염과 같은 갑상선염을 포함하는 갑상선기능저하증, 자가면역내분비질환, 하시모토 질환(Hashimoto's disease), 만성적 갑상선염(Hashimoto's thyroiditis); 또는 아급성 갑상선염, 자가면역 갑상선질환, 특발성 갑상성기능 저하증(idiopathic hypothyroidism), 그레이브 질환(Grave's disease), 자가면역 다분비선 증후군 [또는 다분비선 내분비증후군(polyglandular endocrinopathy syndromes)]과 같은 다분비선 증후군(polyglandular syndrome), 람베르트-이튼 증후군(Lambert-Eaton myasthenic syndrome 또는 Eaton-Lambert syndrome)와 같은 신경부종양증후군을 포함하는 부종양 증후군(paraneoplastic syndromes), 스티프-인간 증후군(stiff-man or stiff-person syndrome), 알러지성 뇌척수염(allergic encephalomyelitis 또는 encephalomyelitis allergica) 및 실험적 알러지성 뇌척수염(experimental allergic encephalomyelitis; EAE)과 같은 뇌척수염(encephalomyelitis), 흉선세포-관련 중증근무력증(thymoma-associated myasthenia gravis)과 같은 중증근무력증(myasthenia gravis), 소뇌변성(cerebellar degeneration), 뉴로미오토니아(neuromyotonia), 옵소클로노스 미오클로노르 증후군(opsoclonus or opsoclonus myoclonus syndrome; OMS), 및 감각신경병증(sensory neuropathy), 다초점운동신경병증(multifocal motor neuropathy), 시한 증후군(Sheehan's syndrome), 자가면역간염, 만성적 간염, 루포이드 간염(lupoid hepatitis), 거대세포간염(giant cell hepatitis), 만성활성간염(chronic active hepatitis) 또는 자가면역 만성활성간염, 림프구성간질성 폐렴(lymphoid interstitial pneumonitis), 세기관지기질화페례(bronchiolitis obliteran, 비이식) 대 NSIP, 길린-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome), 베르게르 질환(Berger's disease, IgA 신장병), 특발성 IgA 신장병, 선형 IgA 피부병, 원발성담즙성간경변(primary biliary cirrhosis), 폐렴간경변(pneumonocirrhosis), 자가면역 창자병 증후군(autoimmune enteropathy syndrome), 셀리악 질환(Celiac disease), 코엘리악 질환(Coeliac disease), 셀리악 스프루(celiac sprue, gluten enteropathy), 불응성 스프루(refractory sprue), 특발성 스프루(idiopathic sprue), 한랭글로불린혈증(cryoglobulinemia), 근육위쪽가측경화증(amyotrophic lateral sclerosis; ALS; Lou Gehrig's disease), 관질환(coronary artery disease), 자가면역속귀질환(autoimmune inner ear disease; AGED)과 같은 자가면역 귀질환(autoimmune ear disease), 자가면역청력상실, 옵소클로그 미오클루스 증후군(opsoclonus myoclonus syndrome; OMS), 불응성(refractory) 또는 재발성 다발연골염과 같은 다발연골염(polychondritis), 폐포단백증(pulmonary alveolar proteinosis), 아밀로이드증(amyloidosis), 공막염(scleritis), 비암성 림프구증(non-cancerous lymphocytosis), 단일클론 B 세포 림프구증 [예를 들면, 양성 단일클론 감마병증 및 결정되지 않은 유의성의 단일클론 가르모병증(monoclonal garnmopathy of undetermined significance; MGUS)]을 포함하는 원발성 림프구증(primary lymphocytosis), 말초신경병증(peripheral neuropathy), 부종양증후군(paraneoplastic syndrome), 간질(epilepsy), 편두통(migraine), 부정맥(arrhythmia), 근육성 장애, 난청(deafness), 실명(blindness), 주기성 근육마비(periodic paralysis), 및 CNS의 채널병증과 같은 채널병증(channelopathies), 자폐증(autism), 염증성 근육병(inflammatory myopathy), 국소분절사구체경화증(focal segmental glomerulosclerosis; FSGS), 내분비 옵탈로모증(endocrine opthalmopathy), 유베오레티니티스(uveoretinitis), 맥락망막염(chorioretinitis), 자가면역 간질환(autoimmune hepatologicai disorder), 근육섬유통(fibromyalgia), 다수내분비실패(multiple endocrine failure), 시미디트 증후군(Schmidt's syndrome), 부신염(adrenalitis), 장무근력증(gastric atrophy), 초로기치매(presenile dementia), 자가면역 탈미엘 짝짓기 질환(autoimmune demyel mating diseases)와 같은 탈미엘린화 질환(demyelinating diseases), 당뇨병증(diabetic nephropathy), 드레스러 증후군(Dressler's syndrome), 알로페시카 그리타(alopecia greata), CREST 증후군(석회증(calcinosis), 레이나우드 증후군(Raynaud's phenomenon), 식도 기능장애(esophageal dysmotility), 수지경화증(sclerodactyl), 및 모세혈관확장증(telangiectasia)), 수컷 및 암컷 불임, 혼합된 연결조직 질환, 샤가스 질환(Chagas' disease), 류마티스 열병(rheumatic fever), 재발성 유산(recurrent abortion), 농장폐(farmer's lung), 다형홍반(erythema multiforme), 심장절개후 증후군(post-cardiotomy syndrome), 쿠싱 증후군(Cushing's syndrome), 새-팬시어 폐(bird-fancier's lung), 알러지성육아성혈관염(allergic granulomatous angiitis), 양성림프구성혈관염(benign lymphocytic angiitis), 알포트 증후군(Alport's syndrome), 알러지성 치조골막염 및 섬유성 골막염과 같은 치조골막염(alveolitis), 폐내부질환(interstitial lung disease), 수혈질환, 나병(leprosy), 말라리아(malaria), 리슈만편모충증(leishmaniasis), 키파노소미아시스(kypanosomiasis), 주혈흡충증(schistosomiasis), 회충증(ascariasis), 아스파라거시스(aspergillosis), 삼터 증후군(Sampter's syndrome), 카플란 증후군(Caplan's syndrome), 뎅기(dengue), 심내막염(endocarditis), 심내막염 섬유증(endomyocardial fibrosis), 확산형 폐내섬유증(diffuse interstitial pulmonary fibrosis), 폐내섬유증(interstitial lung fibrosis), 특발성 폐섬유증(idiopathic pulmonary fibrosis), 시스트 섬유증(cystic fibrosis), 안구내염(endophthalmitis), 지구성융기성 홍반(erythema elevatum et diutinum), 태아적아구증(erythroblastosis fetalis), 호산구성태아증(eosinophilic faciitis), 슐만 증후군(Shulman's syndrome), 펠티 증후군(Felty's syndrome), 플라리라시스(flariasis), 만성적 모양체염, 이종만성적 모양체염, 홍채모양채염(iridocyclitis) 또는 푸치 모양체염(Fuch's cyclitis)과 같은 모양체염(cyclitis), 헤노흐-쉔라인 자반증(Henoch-Schonlein purpura), 인간면역결핍 바이러스(human immunodeficiency virus; HIV) 감염, 에코바이러스 감염, 심근병증(cardiomyopathy), 알츠하이머 질환(Alzheimer's disease), 파보바이러스 감염(parvovirus infection), 루벨라바이러스 감염(rubella virus infection), 백신후 증후군(post-vaccination syndromes), 선천적 루볼라 감염, 엡스타인-바 바이러스 감염(Epstein-Barr virus infection), 이하선염(mumps), 이반 증후군(Evan's syndrome), 자가면역 성선부전증(autoimmune gonadal failure), 시든햄 무도증(Sydenham's chorea), 연쇄상구균후 신장염(poststreptococcal nephritis), 혈전혈관염(thromboangitis ubiterans), 갑상선중독증(thyrotoxicosis), 척수매독(tabes dorsalis), 맥락막염(chorioiditis), 거대세포 다발근육통(giant cell polymyalgia), 내분비 오프타모증(endocrine ophthamopathy), 만성적과민성폐렴(chronic hypersensitivity pneumonitis), 건성각결막염(keratoconjunctivitis sicca), 유행성 각결막염, 특발성 신장염증후군(idiopathic nephritic syndrome), 최소변화신장병증(minimal change nephropathy), 양성 가족(benign familial) 및 허혈성재관류 손상(ischemia-reperfusion injury), 레티날 자가면역(retinal autoimmunity), 관절염증(joint inflammation), 기도염(bronchitis), 만성적폐쇄성기도질환(chronic obstructive airway disease), 규폐증(silicosis), 아프다(aphthae), 아프타성 궤양(aphthous stomatitis), 동맥경화 질환(arteriosclerotic disorders), 아스퍼미오진(aspermiogenese), 자가면역 용혈증(autoimmune hemolysis), 보에크 질환(Boeck's disease), 한냉글로불린혈증(cryoglobulinemia), 두푸이트렌 구축(Dupuytren's contracture), 엔도프탈미아 파코아날피라티카(endophthalmia phacoanaphylactica), 알러지성 장염(enteritis allergica), 나병성 결절성 홍반(erythema nodosum leprosum), 특발성 얼굴마비(idiopathic facial paralysis), 만성피로증후군(chronic fatigue syndrome), 루마티카열(febris rheumatica), 하만-리치 질환(Hamman-Rich's disease), 감각신경 청력상실(sensoneural hearing loss), 해모글로비누리아 파록시마티카(haemoglobinuria paroxysmatica), 성선기능저하증(hypogonadism), 국한성회장염(ileitis regionalis), 백혈구감소증(leucopenia), 모노뉴클레오시스 감염(mononucleosis infectiosa), 트래버스 척수염(traverse myelitis), 원발성 특발성 점액수종(primary idiopathic myxedema), 신장병(nephrosis), 오프탈미아 심파티카(ophthalmia symphatica), 오키티스 육아종(orchitis granulomatosa), 췌장염(pancreatitis), 급성다발신경근염(polyradiculitis acuta), 괴저성 농피증(pyoderma gangrenosum), 퀘르바인 갑상생염(Quervain's thyreoiditis), 후천선 스페닉무근력증(acquired spenic atrophy), 항정자성 항체에 의한 불임(infertility due to antispermatozoan antobodies), 비악성 흉선종(non-malignant thymoma), 비티리고(vitiligo), SCID 및 엡스타인-바 바이러스-관련 질환(Epstein-Barr virus-associated diseases), 후천성 면역결핍증(acquired immune deficiency syndrome; AIDS), 리슈만편모충증(Lesihmania)과 같은 기생충 질환, 독성-쇼크 증후군(toxic-shock syndrome), 발독(food poisoning), T 세포의 침투과 관련된 질병, 백혈구-부착 결핍, 사이토카인 및 T 세포에 의해 매개되는 급성 및 지연된 과민성과 관련된 면역반응, 백혈구 누출과 관련된 질환, 다기관손상증후군(multiple organ injury syndrome), 항원-항체 복합체-매개 질환, 안티글로머룰러 기저막 질환(antiglomerular basement membrane disease), 알러지성 신경염(allergic neuritis), 자가면역 다발성내분비병증(autoimmune polyendocrinopathies), 난소염, 원발성 점액수종(primary myxedema), 자가면역무근력증 장염(autoimmune atrophic gastritis), 교감성안염(sympathetic ophthalmia), 류마티스 질환(rheumatic diseases), 혼합된 연결조직 질환, 신증후군(nephrotic syndrome), 췌도염(insulitis), 다발성내분지 부전(polyendocrine failure), 말초신경병증(peripheral neuropathy), 자가면역 다발생식선 증후군 I형(aut oimmune polyglandular syndrome type I), 성인-개시 특발성 부갑상선기능이상저하증(adult-onset idiopathic hypoparathyroidism; AOIH), 토탈리스 탈모증(alopecia totalis), 확장성심근병증(dilated cardiomyopathy), 에피더모리시스 불로사 에퀴시타(epidermolisis bullosa acquisita; EBA), 혈색소증(hemochromatosis), 심근염증(myocarditis), 신증후군, 원발성 경화성 담관염(primary sclerosing cholangitis), 화농성 또는 비화농성 부비동염(sinusitis), 급성 또는 만성적 부비동염, 사골(ethmoid), 앞 골(frontal), 상악(maxillary), 또는 접형골(sphenoid) 부비동염, 호산구증가증과 같은 호산구-장애, 폐 침투 호산구증가등(pulmonary infiltration eosinophilia), 호산구증가-미아글리아 증후군(eosinophilia-myalgia syndrome), 로플러 증후군(Loffler's syndrome), 만성적 호산구증가 폐렴(chronic eosinophilic pneumonia), 국부성 폐 호산구증가증(tropical pulmonary eosinophilia), 기도폐렴성 아스퍼길로시스(bronchopneumonic aspergillosis), 아스퍼실로마(aspergilloma), 또는 호산구를 포함하는 그라눌로마스(granulomas), 아나필락시스(anaphylaxis), 세로음성 스폰디로아트리티드(seronegative spondyloarthritides), 다발내분지 질환(polyendocrine autoimmune disease),경화성 담관염(sclerosing cholangitis), 공막(sclera), 상공막(episclera), 만성적점막성칸디데이시스(chronic mucocutaneous candidiasis), 브루톤 증후군(Bruton's syndrome), 유아기의 일시적저감마글로불린증(transient hypogammaglobulinemia of infancy), 위코트-알드리히 증후군(Wiskott-Aldrich syndrome), 모세혈관 확장성 운동실조증(ataxia telangiectasia), 콜라겐 질환과 관련이 있는 자가면역 장애, 류마티스, 신경학적 질환, 허혈성재관류 장애, 혈압반응의 감소, 혈관탈기능, 안티기타시스(antgiectasis), 조직손상, 심혈관 허혈(cardiovascular ischemia), 통각과민(hyperalgesia), 뇌동정맥 허혈(cerebral ischemia), 및 혈관화(vascularization)를 동반하는 질환, 알러지성 과민성 장애, 사구체신염(glomerulonephritides), 재관류 손상(reperfusion injury), 심근육 또는 다른 조직의 재관류 손상, 급성염증성 구성요소를 가지는 피부장애(dermatoses), 급성 화농성 수막염(acute purulent meningitis) 또는 다른 중추신경계 염증성 질환, 안구(ocular and orbital) 염증성 질환, 과립구 수혈-관련 증후군(granulocyte transfusion-associated syndromes), 사이토카인-유도 독성, 급성 중증 염증(acute serious inflammation), 만성적 난치성염증(chronic intractable inflammation), 신우염(pyelitis), 폐렴간경변증(pneumonocirrhosis), 당뇨망막병증(diabetic retinopathy), 당뇨병성 거대-동맥 장애(diabetic large-artery disorder), 동백내막과다형성증(endarterial hyperplasia), 소화성궤양(peptic ulcer), 판막염(valvulitis) 및 자궁내막증(endometriosis)으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
바람직하게는, 상기 자가면역질환은 제1형 당뇨병, 원형 탈모증(alopecia areata), 항-인산지질 항체 증후군(antiphospholipid antibody syndrome), 류마티스성 관절염, 건선 또는 건선성 관절염, 다발성 경화증(multiple scelerosis), 전신 홍반 루푸스(systemic lupus erythematosus), 염증성 장질환(inflammatory bowel disease), 애디슨병(Addison's disease), 그레이브병(Graves' disease), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 길랑-바레 증후군(Guillian-Barre syndrome), 하시모토 갑상선염(Hashimoto's thyroiditis), 중증근무력증(Myasthenia gravis), 염증성 근육병(inflammatory myophathy), 자가면역성 혈관염(autoimmune vasculitis), 자가면역성 간염(autoimmune hepatitis), 출혈성 빈혈(hemolytic anemia), 특발성 혈소판감소성 자반(idiopathic thrombocytopenic purpura), 일차성 담즙성 간경화증(primary biliary cirrhosis), 피부경화증(scleroderma), 백반증(vitiligo), 악성 빈혈(pernicious anemia) 및 만성 소화장애(celiac disease)로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
상기 염증성 질환은 관절염(arthritis), 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 반응성 관절염(reactive arthritis), 라이터 증후군(Reiter's syndrome), 결정성 관절병증(crystal arthropathies), 라임 질환(Lyme disease), 류마티스성 다발성 근육통(polymyalgia rheumatica), 전신성 경화증(systemic sclerosis), 다발근육염(polymyositis), 피부근염(dermatomyositis), 결절다발동맥염(polyarteritis nodosa), 베게너육아종증(Wegener's granulomatosis), 처르그-스트라우스 증후군(Churg-Strauss syndrome), 사코이드증(sarcoidosis), 죽상경화 혈관 질환(atherosclerotic vascular disease), 아테롬성 동맥경화증(atherosclerosis), 허혈성심장질환(ischaemic heart disease), 심근경색(myocardial infarction), 뇌졸중(stroke), 말초혈관질환(peripheral vascular disease), 포도막염(uveitis), 각막질환(corneal disease), 홍채염(iritis), 홍채모양채염(iridocyclitis) 및 백내장(cataracts)으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
상기 이식거부질환은 조직 또는 장기의 이식거부반응인 것일 수 있고, 상기 조직 또는 장기의 이식거부반응은 골수 이식, 심장 이식, 각막 이식, 장 이식, 간 이식, 폐 이식, 췌장 이식, 신장 이식 및 피부이식의 거부반응 중에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 용어, "염증성 피부 질환"은 염증 반응에 의해 피부에서 발생하는 질환을 의미한다. 피부 각질형성세포는 표피세포의 대부분을 구성하는 성분으로서 각질을 형성하고 여러 사이토카인(cytokine)들을 생산하여 다양한 염증반응과 면역반응에 관여한다. 피부 각질형성세포가 환경적, 생리적 스트레스에 노출되면 염증반응이 일어나고, 이로 인해 TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-1β(interleukin-1β), IL-6 및 CCL(chemokine(C-C motif) ligand)과 같은 여러 종류의 염증성 사이토카인들을 분비하게 된다. 이러한 사이토카인들은 피부 각질형성세포의 증식 속도를 감소시키고, 진피층의 기질형성을 방해함으로써 손상된 피부의 치유 속도를 저하시키게 된다. 따라서 염증성 피부 질환에서 피부각질형성세포의 증식은 중요한 역할을 수행하며, 피부의 노화, 아토피성 피부염, 건선 등과 같은 염증성 피부 질환과 밀접한 관련이 있다. 따라서, 상기 염증성 피부 질환은 건선 또는 아토피 피부염일 수 있으며, 바람직하게 건선일 수 있다.
본 발명의 용어, "건선"은 피부에 은백색의 비늘로 덮여 있는, 경계가 뚜렷하며 크기가 다양한 홍반성 구진 및 판을 형성하는 질환을 의미한다. 조직학적으로 상피의 과다 증식을 특징으로 하며, 다양한 임상 양상을 보이며 악화와 호전이 반복되는 만성 염증성 피부질환 중 하나이다.
상기 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 건선 치료용 또는 예방용 약학 조성물에서 그 유효성분은 건선 치료 활성을 나타낼 수 있는 한, 용도, 제형, 배합 목적 등에 따라 임의의 양(유효량)으로 포함될 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량 % 내지 20.0 중량% 범위 내에서 결정될 것이다. 여기서 "유효량"이란 건선 치료(treatment) 효과를 유도할 수 있는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.
본 발명의 용어, "치료"는 치료학적 처리 및 예방적 처리를 모두 포함하는 의미로 사용될 수 있다. 이때, 예방은 개체의 병리학적 상태 또는 질환을 완화시키거나 감소시키는 의미로 사용될 수 있다. 일 구체예에서, 용어 "치료"는 인간을 포함한 포유류에서 질환을 치료하기 위한 적용이나 어떠한 형태의 투약을 모두 포함한다. 또한, 상기 용어는 질환 또는 질환의 진행을 억제하거나 늦추는 것을 포함하며; 손상되거나, 결손된 기능을 회복시키거나, 수리하여, 질환을 부분적이거나 완전하게 완화시키거나; 또는 비효율적인 프로세스를 자극하거나; 심각한 질환을 완화하는 의미를 포함한다.
여기서 "치료학적으로 유효한 양" 또는 "약학적으로 유효한 양"이란 대상 질환을 예방 또는 치료하는데 유효한 화합물 또는 조성물의 양으로서, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미한다. 상기 유효량의 수준은 환자의 건강상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 일 구체예에서 치료학적으로 유효한 양은 건선을 치료하는데 효과적인 약물의 양을 의미한다.
본 발명의 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있고, 상기 담체 외에 약학적으로 허용가능한 보조제, 부형제 또는 희석제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 용어, "약학적으로 허용 가능한"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시 벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 포유동물에 투여 시, 활성 성분의 신속한 방출, 또는 지속 또는 지연된 방출이 가능하도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말 형태를 포함한다.
본 발명의 조성물은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 적합한 형태로 제형화될 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 또한, 본 발명에 따른 조성물은 그 투여방법이나 제형에 따라 필요한 경우, 현탁제, 용해보조제, 안정화제, 등장화제, 보존제, 흡착방지제, 계면활성화제, 희석제, 부형제, pH 조정제, 무통화제, 완충제, 산화방지제 등을 적절히 포함할 수 있다. 상기에 예시된 것들을 비롯하여 본 발명에 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 최신판]에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 조성물은 통상적으로 잘 알려진 멸균 기술에 따라 멸균될 수 있다. 조성물은 pH 조절과 같은 생리적 조건을 조절하기 위하여 요구되는 약학적으로 허용가능한 보조 물질 및 보조제, 독성 조절 제제 및 이의 유사체를 포함할 수 있는데, 예를 들면, 아세트산 나트륨(sodium acetate), 염화 나트륨(sodium chloride), 염화 칼륨(potassium chloride), 염화 칼슘(calcium chloride), 젖산 나트륨(sodium lactate) 등이 있다. 이러한 제형에 있어서 융합 단백질 농도는 매우 다양할 수 있는데, 예를 들면 무게에 따라 약 0.5% 이하일 수 있고, 일반적으로 또는 적어도 약 1% 내지 15% 또는 20%까지 일 수 있고, 선택된 특정 투여 방법에 따라 체액 부피, 점성도(viscosities) 등에 우선적으로 기초하여 선택될 수 있다.
본 발명의 조성물에 대한 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 성별, 연령, 환자의 중증도, 투여 경로에 따라 1일 0.01 μg/kg 내지 10 g/kg 범위, 또는 0.01 mg/kg 내지 1 g/kg 범위일 수 있다. 투여는 1일 1회 또는 수회로 나누어 이루어질 수 있다. 이러한 투여량은 어떠한 측면으로든 본원 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니된다.
본 발명의 조성물이 적용(처방)될 수 있는 대상은 포유동물 및 사람이며, 특히 사람인 경우가 바람직하다. 상기 융합 단백질 또는 융합 단백질 이량체의 투여경로, 투여량 및 투여횟수는 환자의 상태 및 부작용의 유무에 따라 다양한 방법 및 양으로 대상에게 투여될 수 있고, 최적의 투여방법, 투여량 및 투여횟수는 통상의 기술자가 적절한 범위로 선택할 수 있다.
본 발명의 조성물은 어떠한 경로로도 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 직접적으로(예, 조직 부위에 주입, 이식 또는 국부적으로 투여함으로써, 국소적으로) 또는 시스템적으로(예, 비경구 또는 경구로) 임의의 적절한 수단에 의하여 동물에게 제공될 수 있다. 본 발명의 조성물이 정맥내, 피하, 눈(ophthalmic), 복강 내, 근육 내, 구강, 직장, 안와 내(intraorbital), 뇌 내(intracerebral), 두개 내(intracranial), 척추 내(intraspinal), 뇌실 내(intraventricular), 수막강 내(intrathecal), 조내(intracistenal), 캡슐 내(intracapsular), 비강 내(intranasal) 또는 에어로졸 투여와 같이 비경구적으로 제공되는 경우, 조성물은 바람직하게는 수성(aqueous)이거나 생리학적으로 적용가능한 체액 현탁액 또는 용액의 부분을 포함하는 것이 바람직하다. 이에 따라, 담체 또는 운반체(vehicle)가 생리학적으로 허용가능하므로 조성물에 첨가하여 환자에게 전달될 수 있고, 이는 환자의 전해질 및/또는 부피 수가(balance)에 악영향을 끼치지 않는다. 따라서, 제제를 위한 체액 배질로서 일반적으로 생리식염수(physiologic saline)를 포함할 수 있다.
본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 DNA 구조물(또는 유전자 구조물)은 상기 융합 단백질 구조물을 코딩하는 핵산을 운반하는 유전자 치료 프로토콜의 일부로 사용될 수 있다.
본 발명은 원하는 상기 융합 단백질의 기능을 재구성하거나 보충하기 위하여 특정 세포 타입에서 상기 융합 단백질을 생체 내 감염 및 발현시키는 발현 벡터를 임의의 생물학적 유효 담체와 함께 투여할 수 있는데, 예를 들면, 생체 내 세포에 원하는 융합 단백질을 코딩하는 유전자 또는 이의 융합 단백질을 효율적으로 운반할 수 있는 임의의 제형 또는 조성물 등이 그것이다.
상기 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 이용한 유전자 치료를 위해서, 재조합 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 및 헤르페스 심플렉스 바이러스-1(herpes simplex virus-1)을 포함하는 바이러스 벡터, 또는 재조합 박테리아 플라스미드 또는 재조합 진핵 플라스미드 내에 대상 유전자를 삽입할 수 있다.
본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 투여량은 인간에 있어서 0.1 mg 내지 100 mg의 범위이고, 바람직하게는, 1 mg 내지 10 mg 이고, 더욱 바람직하게는 2 mg 내지 10 mg 이다. 최적량 및 투여 형태는 당업계의 기술 수준에 속하는 일반적인 실험에 의하여 결정할 수 있다.
본 발명의 융합 단백질의 단위 투여량은 인간에 있어서 0.1 mg/kg 내지 1,500 mg/kg 이고, 바람직하게는 1 mg/kg 내지 100 mg/kg 이고, 더욱 바람직하게는 5 mg/kg 내지 20 mg/kg 이다. 단위 투여량은 치료대상 질환 및 부작용의 유무에 따라 달라질 수 있다. 그러나, 최적의 투여량은 통상적인 실험을 이용하여 결정될 수 있다. 융합 단백질의 투여는 주기적인 급속 주입(periodic bolus injections)에 의하거나, 외측 공급원(external reservoir)(예, 정맥주사 보유 주머니(intravenous bag)) 또는 내측(예, 생체부식성 임플란트(bioerodable implant))으로부터의 지속적인 정맥 내, 피하, 또는 복막 내 투여에 의할 수 있다.
본 발명의 조성물은 예방 또는 치료하고자 하는 질병의 예방 또는 치료효과를 갖는 다른 약물 또는 생리학적 활성물질과 병용하여 투여되거나, 이런 다른 약물과의 조합 제제(combination formulation) 형태로 제형화 될 수 있다.
본 발명의 융합 단백질 또는 조성물을 이용하여 질병을 예방 또는 치료하는 방법은 본 발명의 융합 단백질 또는 조성물과 병용하여 질병의 예방 또는 치료 효과를 갖는 다른 약물 또는 생리학적 활성물질을 투여하는 것도 포함할 수 있는데, 병용 투여의 경로, 투여시기, 및 투여용량은 질병의 종류, 환자의 질병 상태, 치료 또는 예방의 목적, 및 병용되는 다른 약물 또는 생리학적 활성물질에 따라 결정될 수 있다.
또한, 본 발명은 면역질환의 예방 또는 치료 효과를 가진 의약제제를 생산하기 위한 PD-L1 단백질 및 변형된 면역글로불린 Fc 영역이 포함된 융합 단백질의 사용을 제공한다.
또한, 본 발명은 PD-L1 단백질 및 변형된 면역글로불린 Fc 영역이 포함된 융합 단백질과 약학적으로 허용 가능한 담체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
상기 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 개체의 연령, 체중, 일반건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 목적에 적합한 조성물의 유효량은 전술한 사항을 고려하여 결정하는 것이 바람직하다.
상기 개체는 임의의 포유동물에 적용가능하며, 상기 포유동물은 인간 및 영장류뿐만 아니라, 소, 돼지, 양, 말, 개 및 고양이 등의 가축을 포함한다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. PD-L1 단백질 및 변형된 면역글로불린 Fc 영역이 포함된 융합 단백질 생산을 위한 유전자 컨스트럭트 제조
인간 PD-L1(programmed cell death-ligand 1) 단백질 및 변형된 면역글로불린 Fc영역(modified immunoglobulin Fc domain)이 융합된 융합 단백질을 생산하기 위한 유전자 컨스트럭트를 제조하였다. 구체적으로, 인간 PD-L1 유전자는 공지된 아미노산 서열(Accession number: Q9NZQ7)을 이용하였고, PD-L1단백질의 세포외 도메인(extracellular domain, 19-239 aa)이 포함된 유전자 컨스트럭트는 TOP Gene Technologies(Canada, Quebec)에서 제작하였다. 인간 PD-L1 단백질은 변형된 면역글로불린Fc 영역의 N-말단에 융합되도록 제조하였다. 변형된 면역글로불린 Fc 도메인(서열번호 11)은 인간 IgD의 Fc와 인간 IgG4의 Fc의 하이브리드 형으로서, 8개의 아미노산으로 구성된 IgG1 힌지 영역(서열번호 16)을 포함하는 데 특징이 있다.
본 발명의 융합 단백질은 PD-L1 단백질이 변형된 면역글로불린 Fc 영역과 펩티드 링커로 연결되도록 제조하였다. 본 발명에서는 이량체(dimerization)를 유도하면서도 유연성(flexibility)을 유지하기 위하여 7개 아미노산 서열로 이루어진 GS 링커(서열번호 10)에 의해 연결된 인간 PD-L1 단백질 및 변형된 면역글로불린 Fc 영역이 포함된 융합 단백질(이하, "PD-L1-hyFc21" 또는 "PD-L1-hyFc21 융합 단백질", 서열번호 12 또는 13)을 제조하였다. 대조군으로는, 서열번호 14의 IgD 힌지 영역을 포함하는 면역글로불린 Fc 영역이 포함된 융합 단백질(이하, "PD-L1-hyFc5" 또는 "PD-L1-hyFc5 융합 단백질", 서열번호 15)을 사용하였다.
상기 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드가 포함된 유전자 컨스트럭트를 이용하여 재조합 발현 벡터를 제작하였다. 제작된 재조합 발현 벡터는 CHO DG44 세포주에 DNA용액을 현탁하고, 직류 고전압의 펄스를 통과시켜 세포 내에 DNA가 도입되는 것을 이용한 유전자 도입법 (NeonTM kit, 10 μL, Invitrogen Cat. MPK1096)을 이용하여 형질전환시켰다. 이후, HT selection (HT supplement, Invitrogen, 11067-030)과 MTX (Methotrexate, Sigma, M8407) 증폭 단계를 수행하여, 높은 발현율을 보이는 세포만 선별되도록 세포 계대를 수행하였다. 세포는 3일 마다 0.4 X 106 cells/mL의 양으로 계대 진행하였고, cell counting 기기 (Vi-cell, Beckman coulter)를 이용하여 세포의 수와 생존율을 측정하였다. HT selection은 media에 HT를 제거하여 형질전환된 세포만 생존하도록 하는 선별 방법이고, MTX 증폭은 계대 배지에 MTX를 선별한 농도로 넣어 유전자를 증폭시키는 방법이다. 선별된 세포 pool은 한계 희석 클로닝(Limiting Dilution cloning) 방법을 이용하여 단세포 클로닝(Single Cell Cloning)을 수행하였다. 간단히, 96 well plate에 1 cell/well이 되도록 세포를 분주한 후, 0, 7 및 14 일차에 CSI 기기(clone selection imager, Molecular Devices)를 이용하여 세포 이미지를 저장하여 한 개의 세포에서 유래된 클론(clone)을 역추적하였다. 선별된 단세포(single cell) 유래 세포주는 Fc ELISA(Human IgG ELISA Quantitation Set, Bethyl, E80-104)를 이용하여 생산성을 확인하였다. 최종 선별된 5-6개의 클론은 batch culture와 장기 안정성 평가를 진행하고, 안정성이 확인된 클론을 RCB(Research Cell Bank)로 제조하였다.
실시예 2. PD-L1-hyFc21 또는 PD-L1-hyFc5 융합 단백질의 확보
PD-L1-hyFc21 또는 PD-L1-hyFc5 융합 단백질을 대량 생산하기 위하여, 상기 실시예 1에서 확보한 PD-L1-hyFc5 또는 PD-L1-hyFc21 현탁 세포주로부터 생산된 세포 배양액으로부터 목적 단백질을 분리 및 정제하였다.
PD-L1-hyFc21 또는 PD-L1-hyFc5 융합 단백질을 대량 확보하기 위하여, PD-L1-hyFc21 또는 PD-L1-hyFc5 융합 단백질의 발현 세포주를 동일한 유가식 배양(Fed-batch culture) 방법으로 Glass bioreactor 15L에서 20일 동안 배양하여 PD-L1-hyFc21 또는 PD-L1-hyFc5 융합 단백질을 생산하였다. 유가식 배양 시, 융합 단백질을 발현하는 세포주의 세포생존율을 측정하였고, 목적 단백질의 최종 발현량 및 순도를 확인하기 위하여 크기 배제 크로마토그래피(SE-HPLC)를 수행하였다.
발현 세포주의 시간별 최대 세포 농도 및 융합 단백질의 최종 발현량을 확인한 결과, PD-L1-hyFc21 융합 단백질의 발현 세포주는 시간별 최대 세포 농도가 13.9 x 106 cells/mL로 확인되었고 (도 2a), 최종 회수된 융합 단백질의 발현량은 5.6 g/L로 확인되었다 (도 2b). 이에 비해, PD-L1-hyFc5 융합 단백질의 발현 세포주는 시간별 최대 세포 농도가 16.7 x 106 cells/mL로 확인되었고 (도 3a), 최종 회수된 융합 단백질의 발현량은 2.2 g/L로 확인되었다 (도 3b).
또한, 융합 단백질의 순도를 확인한 결과, PD-L1-hyFc21 융합 단백질의 순도는 79.5 % 로서, 고분자 불순물(HMW)이 7.7 %, 저분자 불순물(LMW)이 9.8 %가 포함된 것으로 확인되었다 (표 1). 이에 비해, PD-L1-hyFc5 융합 단백질의 순도는 47.8 % 로서, 고분자 불순물(HMW)이 31.7 %, 저분자 불순물(LMW)이 20.5 %가 포함된 것으로 확인되었다 (표 1).
Area (%) PD-L1-hyFc21 PD-L1-hyFc5
HMW (%) 7.7 31.7
Main (%) 79.5 47.8
LMW (%) 9.8 20.5
*HMW: 고분자 불순물(High Molecular Weight Impurity); Main: 목적 단백질(Target protein); 및 LMW: 저분자 불순물(Low Molecular Weight Impurity).
이후, 고순도의 PD-L1-hyFc21 또는 PD-L1-hyFc5 융합 단백질을 확보하기 위하여, 다음의 3 단계 정제 공정을 수행하였다: 배양액 => 단백질 A 친화성 크로마토그래피(Protein A affinity chromatography) => 음이온 교환 크로마토그래피 1(Anion exchange chromatography 1) => 음이온 교환 크로마토그래피 2(Anion exchange chromatography 2) => 한외여과/정용여과.
확보된 목적 단백질은 크기 배제 크로마토그래피(SE-HPLC) 분석을 통해 순도 및 수득율을 확인하였다. 그 결과, PD-L1-hyFc21 융합 단백질의 순도는 97.3 %, 수득율은 30.2 %로 확인되었다. 이에 비해, PD-L1-hyFc5 융합 단백질의 순도는 93.2 %, 수득율은 5.1 %로 확인되었다 (표 2).
공정 PD-L1-hyFc21 PD-L1-hyFc5
검액명 순도(SE-HPLC) 수율 (%) 순도(SE-HPLC) 수율 (%)
배양액 79.5 100.0 47.8 100.0
최종 정제 97.3 30.2 93.2 5.1
상기 결과로부터, PD-L1-hyFc21 융합 단백질은 PD-L1-hyFc5 융합 단백질에 비해 약 2.5 배의 높은 생산량을 보였고, 단백질의 순도 역시 높았음을 확인하였다.
실시예 3. PD-L1-hyFc21 또는 PD-L1-hyFc5 융합 단백질의 특성 분석
3.1. 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동법 (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)
정제된 PD-L1-hyFc21 또는 PD-L1-hyFc5 융합 단백질의 분자량을 확인하기 위하여, 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동법(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)을 수행하였다. 간단히, 융합 단백질은 탈이온수를 이용하여 희석되었고, NuPAGE™LDS Sample Buffer (Thermo Fisher Scientific)와 섞어 3 μg/well 이 되도록 4-12% Bis-Tris gel (Invitrogen)에 로딩(loading)하여 전기영동을 수행하였다. 전기영동이 끝난 젤은 쿠마시 염색법으로 염색하였다.
그 결과, 정제된 PD-L1-hyFc21 및 PD-L1-hyFc5 융합 단백질 모두 비환원 조건(non-reducing condition)에서 사이즈 마커 (size marker) 98 kDa 부근에서 확인되었다 (도 4). 다만, 정제된 PD-L1-hyFc5 융합 단백질에서는 절단된 형태의 저분자 불순물이 포함되어 있었다.
3.2. 크기 배제 크로마토그래피 시험법(size-exclusion chromatography, SE-HPLC)
정제된 PD-L1-hyFc21 또는 PD-L1-hyFc5 융합 단백질에서 주피크 및 이량체, 다량체 또는 절단된 형태의 이상 펩티드 등의 불순물 피크를 분석하기 위하여, 크기 배제 크로마토그래피 시험법 (Size-exclusion chromatography, SE-HPLC)을 수행하였다. 간단히, 융합 단백질은 제형 완충액으로 희석하여 1.0 mg/mL로 조제한 후, 겔여과 크로마토그래피 컬럼 (TOSOH TSK-GEL G3000SWxL column, 7.8 mm x 300 mm)을 이용하여 분리된 피크 중 융합 단백질의 주피크의 면적비(% Area)를 분석하였다.
그 결과, PD-L1-hyFc21 융합 단백질의 순도는 97.3 %인 것으로 확인되었고 (도 5a), 이에 비해 PD-L1-hyFc5 융합 단백질의 순도는 93.2 %인 것으로 확인되었다 (도 5b).
3.3. 등전점 전기영동법 (isoelectric focusing, IEF)
정제된 PD-L1-hyFc5 및 PD-L1-hyFc21 단백질의 charge variants 및 분포 (distribution)를 확인하기 위하여, 등전점 전기영동법 (Isoelectric focusing, IEF)을 수행하였다. 등전점 전기영동법은 단백질이 갖고 있는 pI 값을 이용하여 분리된 단백질을분석하는 전기영동법으로서, pI 값은 전하를 띤 단백질이 전기적 중성을 띠게 되는 pH 값을 말하며, 이를 등전점이라 한다. 등전점 전기영동에서 등전점에 도달한 단백질은 더 이상 움직이지 않고 젤(gel) 상에 머무르게 되어 분리된다. 간단히, 본 발명에서는 pH 3-10 등전점 젤 (Invitrogen)을 이용하여 pI 값에 따라 융합 단백질을 분리하였으며, 전기영동이 끝난 젤은 12% TCA (trichloroacetic acid) 용액으로 고정시킨 후 쿠마시 염색법으로 염색하였다.
그 결과, PD-L1-hyFc21 및 PD-L1-hyFc5 융합 단백질 모두 pI 값이 5.2~6.0 범위 내에서 확인되었다 (도 6).
3.4. 시차 주사 형광측정법(Differential Scanning Fluorimetry, DSF)
정제된 PD-L1-hyFc21 또는 PD-L1-hyFc5 융합 단백질의 열 안정성을 분석하기 위하여, PROTEOSTAT®열 이동 안정성 분석 키트를 사용하여 실험을 수행하였다. 분석 키트에는 단백질 응집을 감지하는 형광 염료가 포함되어 있어, 열 스트레스 조건에서 대량의 단백질이 응집되는 온도를 확인할 수 있다. 응집 온도(Tagg)는 단백질 안정성의 지표로서, 단백질 구조의 안정성을 확인할 수 있다.
그 결과, PD-L1-hyFc21 융합 단백질의 응집 온도는 55.8 ℃로 확인되었고, 이에 비해 PD-L1-hyFc5 융합 단백질의 응집 온도는 50.7 ℃로 확인되었다 (도 7). 이로써, PD-L1-hyFc21 융합 단백질이 PD-L1-hyFc5 에 비해 구조적으로 열에 대한 안정성이 더 우수한 것을 확인하였다.
실시예 4. PD-L1-hyFc21 또는 PD-L1-hyFc5 융합 단백질의 시험관 내( in vitro ) 활성 분석
4.1. PD-1을 발현하는 Jurkat (SHP-1) 세포주를 이용한 PD-1에 대한 결합능 분석
PD-1을 발현하는 Jurkat (SHP-1) 세포주를 이용하여 PD-L1-hyFc21 또는 PD-L1-hyFc5 융합 단백질의 PD-1에 대한 결합능을 분석하였다. 간단히, 96-well plate에 Jurkat 세포(PathHunter®Jurkat PD-1 (SHP-1), DiscoverX)를 분주하고, 2 시간 동안 37 ℃5% CO2 인큐베이터에서 안정화하였다. 이후, PD-L1-hyFc21 또는 PD-L1-hyFc5 융합 단백질을 각각 75 및 600 nM이 되도록 첨가한 후, 37 ℃5% CO2 인큐베이터에서 1 시간 동안 반응시켰다. 반응 종료 후, PD-1:PD-L1 signaling response에 의해 발현되는 SHP-1을 탐지하는 시약(PathHunter® Bioassay Detection Kit, DiscoverX)을 첨가하여 SHP-1의 발광 정도(luminescence)를 측정하였다.
그 결과, PD-L1-hyFc21 융합 단백질을 처리한 그룹에서는 PD-L1-hyFc5 융합 단백질을 처리한 그룹에 비해 75 및 600 nM 의 농도 모두에서 SHP-1의 발광 정도가 높은 것으로 나타났다 (도 8). 이로써, PD-L1-hyFc21 융합 단백질은 PD-L1-hyFc5 융합 단백질에 비해 PD-1에 대한 결합능이 더 높은 것을 확인하였고, 특히, 농도가 증가함에 따라 PD-1에 대한 결합능이 더욱 증가하였음을 확인하였다.
4.2. 혼합 림프구 반응(Mixed lymphocyte reaction)의 억제능 분석
PD-L1-hyFc21 또는 PD-L1-hyFc5 융합 단백질에 의한 혼합 림프구 반응의 억제능을 분석하였다. 간단히, 공여자와 수여자의 PBMC(peripheral blood mononuclear cells)를 준비하여 세포 내 단백질을 염색하는 CTV (CellTrace™ Violet) 및 CTR (CellTrace™ Far Red) 염색을 실시하였다. 각각의 공여자 및 수여자 PBMC를 반응세포와 자극세포로 두고 1:1의 비율로 섞어 96-well U-bottom 플레이트에 넣고, PD-L1-hyFc21 또는 PD-L1-hyFc5 융합 단백질을 0.5 μM 첨가한 후, 37 ℃5% CO2 인큐베이터에서 5 일 동안 반응시켰다. 반응이 종료된 세포에서 반응세포에 염색된 CTV (CellTrace™ Violet)의 형광이 감소된 정도를 분석하여 PD-L1-hyFc21 또는 PD-L1-hyFc5 융합 단백질에 의해 혼합 림프구 반응이 억제된 정도를 비교하였다.
그 결과, PD-L1-hyFc21 또는 PD-L1-hyFc5 융합 단백질을 처리한 그룹에서는 대조군(Allo, hyFc 처리군)에 비해 혼합 림프구 반응에 의한 활성화된 반응세포의 CD4 T 세포와 CD8 T 세포의 증식(proliferation)이 감소하였음을 확인하였다 (도 9). 특히, PD-L1-hyFc21 융합 단백질을 처리한 그룹에서는 PD-L1-hyFc5 융합 단백질을 처리한 그룹에 비해 동일한 농도 조건에서 활성화된 반응세포의 CD4 T 세포와 CD8 T 세포의 증식이 더욱 현저히 감소하였음을 확인하였다 (도 9).
4.3. 활성화된 인간 T 세포의 증식 억제능(proliferation inhibition) 및 사이토카인 발현 억제능(cytokine production inhibition) 분석
인간 PBMC를 이용하여 T 세포 활성화 조건에서 PD-L1-hyFc21 또는 PD-L1-hyFc5 융합 단백질에 의한 인간 T 세포의 증식 억제능을 비교하였다. 간단히, 항-CD3 항체와 함께 PD-L1-hyFc21 또는 PD-L1-hyFc5 융합 단백질을 96-well plate에 처리하여 4 ℃에서 하루 동안 코팅하였다. 마이크로 비드(microbead, MACS)를 이용하여 정상인의 PBMC에서 CD4 T 세포를 분리한 후, 분리된 CD4 T 세포를 세포 내 단백질을 염색하는 CTV (CellTrace™ Violet, 2.5 μM) 염색을 실시하였다. 코팅이 끝난 플레이트를 PBS로 세척한 후, CTV로 염색된 CD4 T 세포를 시험 플레이트에 넣고 3 일 동안 37 ℃5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 4 일이 지난 후, 시험 플레이트의 세포를 거두어 유세포 분석기(flow-cytometry)를 이용하여 CTV의 형광 감소 정도를 분석하였다.
그 결과, PD-L1-hyFc21 또는 PD-L1-hyFc5 융합 단백질을 처리한 그룹에서는 대조군(no treatment 또는 hyFc 처리군)에 비해 활성화된 인간 T 세포의 증식(proliferation)이 감소하였음을 확인하였다 (도 10a). 특히, PD-L1-hyFc21 융합 단백질을 처리한 그룹에서는 PD-L1-hyFc5 융합 단백질을 처리한 그룹에 비해 활성화된 인간 T 세포의 증식이 약 2배 정도로 현저히 억제되었음을 확인하였다 (도 10a).
또한, 인간 PBMC를 이용하여 T 세포 활성화 조건에서 PD-L1-hyFc21 또는 PD-L1-hyFc5 융합 단백질에 의한 인간 T 세포의 사이토카인 발현 억제능을 비교하였다. 간단히, 항-CD3 항체와 함께 PD-L1-hyFc21 또는 PD-L1-hyFc5 융합 단백질을 0.5 μM로 처리되도록 희석하여 48-well plate에 4 ℃에서 하루 동안 코팅하였다. 정상인의 PBMC에서 마이크로 비드 (microbead, Miltenyi Biotech)를 이용하여 CD4 T 세포를 분리하였다. 마이크로 비드(microbead, MACS)를 이용하여 정상인의 PBMC에서 CD4 T 세포를 분리하였다. 코팅이 끝난 플레이트를 PBS로 세척한 후, 분리된 CD4 T 세포를 시험 플레이트에 넣고 3일 동안 37 ℃5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 항-IFN-γ항체(DuoSet Human IFN-gamma ELISA set, R&D system)를 시험 플레이트에 넣고 상온에서 코팅하였다. 코팅이 완료된 시험 플레이트를 0.05 % Tween-20이 첨가된 PBS(PBST)로 3회 세척 후, 1% BSA가 첨가된 PBS를 첨가하여 2 시간 동안 상온에서 시험 플레이트를 블러킹하였다. 시험 플레이트에 CD4 세포에 배양액을 옮겨 담고, 상온에서 2 시간 동안 반응시켰다. PBST로 5회 세척을 진행하고 탐지 항체를 첨가하여 상온에서 2 시간 반응시킨 후 다시 PBST로 5회 세척을 진행하였다. 세척이 끝난 시험 플레이트에 streptavidin-HRP를 첨가한 후, 상온에서 20 분 동안 반응시켰다. 이후, PBST로 5회 세척하고, TMB substrate를 첨가한 후, 2N 농도의 황산(H2SO4)을 첨가하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도 값을 이용하여 PD-L1-hyFc21 또는 PD-L1-hyFc5 융합 단백질의 활성화된 CD4 T 세포에 의해 생성되는 IFN-γ 생성 억제능을 분석하였다.
그 결과, PD-L1-hyFc21 또는 PD-L1-hyFc5 융합 단백질을 처리한 그룹에서는 대조군(no treatment 또는 hyFc 처리군)에 비해 활성화된 인간 CD4 T 세포에서 생성된 IFN-γ의 양이 현저히 감소하였음을 확인하였다 (도 10b). 특히, PD-L1-hyFc21 융합 단백질을 처리한 그룹에서는 PD-L1-hyFc5 융합 단백질을 처리한 그룹에 비해 활성화된 인간 CD4 T 세포에서 생성된 IFN-γ의 양이 약 3배 정도로 현저히 억제되었음을 확인하였다 (도 10b).
4.4. 활성화된 마우스 T 세포의 사이토카인 발현 억제능(cytokine production inhibition) 분석
마우스 T 세포 활성화 조건에서 PD-L1-hyFc21 또는 PD-L1-hyFc5 융합 단백질에 의한 마우스 T 세포의 사이토카인 발현 억제능을 비교하였다. 간단히, 5 μg/mL의 항-CD3 항체와 함께 PD-L1-hyFc21 또는 PD-L1-hyFc5 융합 단백질(0.5 μM)을 시험 플레이트에 넣고 4 ℃에서 하루 동안 코팅하였다. 마이크로 비드 (microbead, Miltenyi Biotech)를 이용하여 마우스의 림프절에서 분리된 림프구로부터 CD4 T 세포를 분리하였다. 코팅한 플레이트를 PBS로 세척 후, 분리된 CD4 T 세포를 넣고 3일 동안 37 ℃5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 항-IL-2 항체(Mouse IL-2 ELISA MAX™Deluxe, Biolegend) 및 항-IFN-γ항체(Mouse IFNgamma ELISA MAX™Deluxe, Biolegend)를 새로운 시험 플레이트에 넣고 상온에서 코팅하였다. 전날 코팅한 시험 플레이트를 세척 버퍼로 4회 세척 후, assay diluent A를 첨가하여 1 시간 동안 상온에서 블러킹하였다. 시험 플레이트를 다시 세척 버퍼로 4 회 세척한 후, CD4 T 세포 배양액을 옮겨 담고, 상온에서 2 시간 동안 반응시켰다. 세척 버퍼로 4회 세척한 후, 탐지 항체를 첨가하여 상온에서 1 시간 진탕하며 반응시키고, 다시 세척 버퍼로 4회 세척하였다. 세척이 끝난 시험 플레이트에 streptavidin-HRP를 첨가한 후 상온에서 30 분 동안 반응시켰다. 세척 버퍼로 5 회 세척하고, TMB substrate를 첨가한 후, 빛을 차단한 상온에서 30 분 동안 반응시켰다. 반응 종료 용액(stop solution)을 첨가하여 15 분 이내에 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도 값을 이용하여 IL-2 및 IFN-γ의 농도를 계산하였고, PD-L1-hyFc21 또는 PD-L1-hyFc5 융합 단백질의 활성화된 CD4 T 세포에 의해 생성되는 IL-2 및 IFN-γ생성 억제능을 분석하였다.
그 결과, PD-L1-hyFc21 또는 PD-L1-hyFc5 융합 단백질을 처리한 그룹에서는 대조군(no treatment 또는 hyFc 처리군)에 비해 활성화된 마우스 CD4 T 세포에서 생성된 IL-2 및 IFN-γ의 양이 현저히 감소하였음을 확인하였다 (도 11). 특히, PD-L1-hyFc21 융합 단백질을 처리한 그룹에서는 PD-L1-hyFc5 융합 단백질을 처리한 그룹에 비해 활성화된 인간 CD4 T 세포에서 생성된 IL-2의 양이 약 1.8 배 정도로 현저히 억제되었고, IFN-γ의 양이 약 4배 정도로 현저히 억제되었음을 확인하였다 (도 11).
실시예 5. PD-L1-hyFc21 융합 단백질의 생체 내( in vivo ) 활성 분석
5.1. 이미퀴모드(imiquimod, IMQ)-유도 건선 마우스 모델에서 PD-L1-hyFc21 융합 단백질의 효능 평가
건선이 발병되면, TLR7/8 (Toll-like receptor 7/8)에 의해 수지상 세포(dendritic cells)가 활성화되는데, 이미퀴모드(imiquimod, IMQ)는 TLR7과 TLR8의 리간드로서, 마우스 피부에 반복적으로 처리하면, 건선과 같은 염증반응을 일으키는 것으로 알려져 있다. 이미퀴모드(IMQ)는 수지상 세포뿐만 아니라 적응 면역세포(adaptive immune cell)인 T 세포에도 관여하는데, 이중 IL-17(interleukin-17)을 분비하는 γδT 세포(gamma delta T cell, γδT17)가 우선적으로 건선성 염증(psoriatic inflammation)에 관여한다. 따라서, IMQ-유도 건선 마우스 모델은 건선 환자와 비슷한 표현형을 가지며, 건선 치료제 개발에 적합한 모델로 사용될 수 있다.
간단히, 마우스 동물모델에 건선을 유도하기 위하여, 마우스의 양쪽 귀에 IMQ 크림을 6 일 동안 매일 20 mg/mouse/day로 도포하였다. IMQ 크림을 도포한 0 일차부터 시험 종료일인 6 일차까지 매일 7 일 동안 캘리퍼를 이용하여 각 그룹의 마우스들의 귀 두께를 측정하였고, IMQ 크림을 도포하지 않은 마우스(no treatment)의 귀 두께를 기준으로 각 그룹의 마우스들의 변화된 귀 두께 변화를 비교하였다. PD-L1-hyFc21 융합 단백질은 0, 1, 3, 5 일차에 피하 투여 또는 정맥 투여하였다. 또는 anti-IL12p40 antibody는 시험 2 일차에 단회 정맥 투여(iv)하였다. 대조군 및 실험군은 하기 표 3과 같다.
Group Inducer Dose N Route Volume
Control 1 Vehicle - 5 Subcutaneous 3 mL/kg
2 IMQ - 5 3 mL/kg
PD-L1-hyFc21 3 IMQ 3 mg/kg 5 Subcutaneous 3 mL/kg
4 IMQ 10 mg/kg 5 3 mL/kg
5 IMQ 30 mg/kg 5 3 mL/kg
6 IMQ 3 mg/kg 5 Intravenous 5 mL/kg
7 IMQ 10 mg/kg 5 5 mL/kg
8 IMQ 30 mg/kg 5 5 mL/kg
그 결과, IMQ가 처리된 그룹(IMG-vehicle)에서는 IMQ가 처리되지 않은 대조군(No treatment-vehicle)에 비해 시험 종료일인 6 일차에 귀 두께가 약 68 % 증가한 것을 확인하였다 (도 12a). 반면, 3, 10 및 30 mg/kg의 PD-L1-hyFc21 융합 단백질을 피하 투여한 그룹에서는 4 일차부터 마우스의 귀 두께에 차이가 나타났다 (도 12a). 특히, 최저 용량인 3 mg/kg의 PD-L1-hyFc21 융합 단백질을 피하 투여한 그룹에서는 IMQ가 처리된 그룹(IMG-vehicle)에 비해 시험 종료일인 6 일차에서 귀 두께가 51 % 정도 억제되었고, 중용량 및 고용량인 10 mg/kg와 30 mg/kg의 PD-L1-hyFc21 융합 단백질을 피하 투여한 그룹에서는 IMQ가 처리된 그룹(IMG-vehicle)에 비해 각각 67 % 및 66 %의 억제율을 보였다 (도 12a). 또한, 10 mg/kg 또는 30 mg/kg을 투여한 그룹과 3 mg/kg의 저용량을 투여한 그룹 사이에는 용량에 따른 유의적인 차이가 나타났으나, 10 mg/kg을 투여한 그룹과 30 mg/kg을 투여한 그룹 사이에는 유의적인 차이가 나타나지 않았다.
또한, 3, 10 및 30 mg/kg의 PD-L1-hyFc21 융합 단백질을 정맥 투여한 그룹 모두에서는 IMQ가 처리된 그룹(IMG-vehicle)에 비해 시험 종료일인 6 일까지 약 87~92 %로 마우스의 귀 두께가 현저하게 억제되는 효과가 있음을 확인하였다 (도 12b).
5.2. 독시사이클린(Doxycycline)-유도 Peli1 유전자로 형질전환된 건선 마우스 모델에서 PD-L1-hyFc21 융합 단백질의 피하 투여에 따른 효능 평가
본 발명자들은 만성 염증(chronic inflammation)의 건선 마우스 모델에서의 PD-L1-hyFc21 융합 단백질의 효능을 평가하기 위하여, 이미퀴모드(imiquimod, IMQ)-유도 건선 마우스 모델 외에 독시사이클린(Doxycycline)의 투여에 따라 Peli1(Pellino homolog 1) 유전자가 과발현되도록 형질전환시켜 장기간의 만성 건선 증상이 유발된 건선 마우스 모델(이하, "rtTA-Peli1 건선 마우스 모델")을 이용하였다. rtTA-Peli1 건선 마우스 모델은 건선이 유발됨에 따라, 상피(epidermis)의 건선 병변 발생, 염증성 사이토카인(inflammatory cytokine)의 증가와 같은 염증 반응의 증가, 상피 세포층의 증가, 및 진피에 식세포, 수지상 세포 및 Th17 세포의 침윤 증가를 유발시킨다.
간단히, 마우스에 건선을 유도하기 위하여, 4 주령 마우스에 5 % 설탕(sucrose)과 2 mg/mL의 독시사이클린이 포함된 식용수를 6 개월 동안 음용하게 하였다. 독시사이클린이 포함된 식염수는 시험 기간에도 계속하여 공급되었다. Peli 유전자로 형질전환되지 않은 마우스(이하, "rtTA")를 대조군으로 사용하였다. PD-L1-hyFc21 융합 단백질은 8 주 동안 주 1회로 피하 투여하였다.
우선, PD-L1-hyFc21 융합 단백질을 rtTA-Peli1 건선 마우스 모델에 피하 투여한 후, H&E 염색을 통해 피부 상피조직의 변화 및 피부 상피층의 두께를 측정하는 실험을 수행하였다. H&E 염색 결과는 200X 배율로 관찰하였고, 각 사진의 6 부분을 임의로 지정하여 측정하였다. 그 결과, 건선이 유발되지 않은 대조군(rtTA)에서는 상피층의 평균 두께가 8.74 μm이고, 건선이 유발된 rtTA-Peli1 그룹(rtTA-Peli1 Vehicle)에서는 상피층의 평균 두께가 48.56 μm로서, 건선이 유발된 rtTA-Peli1 그룹(rtTA-Peli1 Vehicle)은 대조군에 비해 상피층의 두께가 약 5.6 배 정도 증가되었음을 확인하였다 (도 13a 및 13b). 반면, 3, 10 및 30 mg/kg의 PD-L1-hyFc21 융합 단백질을 피하 투여한 그룹에서는 상피층의 평균 두께가 각각 38.29 μm, 40.18 μm 및 31.74 μm로서, 건선이 유발된 rtTA-Peli1 그룹(rtTA-Peli1 Vehicle)에 비해 상피층의 두께가 감소되는 효과가 있음을 확인하였다 (도 13a 및 13b). 다만, 용량 의존적인 효과가 나타나지는 않았다.
또한, PD-L1-hyFc21 융합 단백질을 rtTA-Peli1 건선 마우스 모델에 피하 투여한 후, 면역형광염색법을 통해 진피층으로의 T 세포 및 대식세포(macrophage)의 침윤 정도를 비교하는 실험을 수행하였다. T 세포의 검출을 위해 anti-CD3 항체를 사용하였고, 대식세포 검출을 위해 anti-F4/80 항체를 사용하였다. 결과는 면역형광현미경의 400X 배율로 관찰하였고, 동일 면적 내 세포들의 수를 산출하였다.
그 결과, 건선이 유발되지 않은 대조군(rtTA)에서는 피부 조직으로 T 세포와 대식세포가 거의 침윤되지 않았음을 확인하였고, 건선이 유발된 rtTA-Peli1 그룹(rtTA-Peli1 Vehicle)에서는 피부 조직으로 침윤된 T 세포 및 대식세포의 수가 증가하였음을 확인하였다 (도 14). 특히, 건선이 유발된 rtTA-Peli1 그룹(rtTA-Peli1 Vehicle)에서는 피부 조직으로 침윤된 T 세포의 수가 약 47개로 확인되었다 (도 15). 반면, 3, 10 및 30 mg/kg의 PD-L1-hyFc21 융합 단백질을 피하 투여한 그룹에서는 피부 조직으로 침윤된 T 세포의 수가 각각 약 32 개, 14 개 및 7 개로서, 용량 의존적으로 침윤된 T 세포의 수가 현저히 감소되었음을 확인하였다 (도 15).
또한, PD-L1-hyFc21 융합 단백질을 rtTA-Peli1 건선 마우스 모델에 피하 투여한 후, anti-K14 항체를 이용한 면역형광염색법을 통해 피부 조직에서 케라틴 생성 세포의 변화를 분석하였다. K14(Keratin 14)의 발현은 증식을 담당하는 기저층(basal layer)에 나타나며, 이들의 발현 증가는 케라틴 생성 세포 중에서 증식을 담당하는 세포가 증가하였다고 해석할 수 있다. 결과는 동일 면적 내 세포수를 측정하여 비교하였다. 그 결과, 건선이 유발되지 않은 대조군(rtTA)에서는 K14+ 케라틴 생성 세포의 수가 59 개이고, 건선이 유발된 rtTA-Peli1 그룹(rtTA-Peli1 Vehicle)에서는 케라틴 생성 세포의 수가 197개 로서, 건선이 유발된 rtTA-Peli1 그룹에서는 대조군에 비해 케라틴 생성 세포의 수가 약 3.3 배 정도 증가하였다 (도 16). 반면, 3, 10 및 30 mg/kg의 PD-L1-hyFc21 융합 단백질을 피하 투여한 그룹에서는 케라틴 생성 세포의 수가 각각 약 179 개, 150 개 및 98 개로서, 용량 의존적으로 케라틴 생성 세포의 수가 감소되었고, 특히, 30 mg/kg의 용량에서는 케라틴 생성 세포의 수가 현저히 감소되었음을 확인하였다 (도 16).
5.3. 독시사이클린(Doxycycline)-유도 Peli1 유전자로 형질전환된 건선 마우스 모델에서 PD-L1-hyFc21 융합 단백질의 정맥 투여에 따른 효능 평가
PD-L1-hyFc21 융합 단백질을 rtTA-Peli1 건선 마우스 모델에 5 주 동안 주 1회로 정맥 투여한 후, 피부 상피층의 변화를 스코어(score) 지수로 분석하고, 캘리퍼(caliper)를 이용하여 배 부위의 피부 두께를 측정하는 실험을 수행하였다. 스코어 지수는 다음과 같이 평가하였다: 0 = normal skin; 1 = keratoplasia appear; 2 = keratoplasia appear on half of back skin, or skin lesions slightly overtop the normal skin; 3 = thickness appear on whole back skin, or skin lesions significantly overtop the normal skin; 4 = skin lesions sclerosis (Biomedicine & Pharmacotherapy, Volume 110, February 2019, Pages 265-274).
그 결과, 건선이 유발된 rtTA-Peli1 그룹(rtTA-Peli1 Vehicle)에서는 대조군(rtTA)에 비해 스코어 지수가 3 가까이 증가한 반면, PD-L1-hyFc21 융합 단백질을 정맥 투여한 그룹에서는 스코어 지수가 rtTA-Peli1 그룹에 비해 감소하였음을 확인하였다 (도 17). 또한, 스코어 지수와 유사하게, 건선이 유발된 rtTA-Peli1 그룹(rtTA-Peli1 Vehicle)에서는 대조군(rtTA)에 비해 배 부위의 피부 두께가 약 100 μm 정도 증가한 반면, PD-L1-hyFc21 융합 단백질을 정맥 투여한 그룹에서는 대조군(rtTA)과 유사한 수준으로 피부 두께가 감소하였음을 확인하였다 (도 18). 다만, 상기 결과에서 용량 의존적인 효과는 확인되지 않았다.
또한, PD-L1-hyFc21 융합 단백질을 rtTA-Peli1 건선 마우스 모델에 정맥 투여한 후, H&E 염색을 통해 피부 상피조직의 변화 및 피부 상피층의 두께를 측정하는 실험을 수행하였다. H&E 염색 결과는 현미경의 400X 배율로 관찰하였고, 상피층의 6 부분을 임의로 지정하였으며, Image J 프로그램을 사용하여 피부 상피층 두께를 측정하였다. 그 결과, 건선이 유발되지 않은 대조군(rtTA)에서는 상피층의 평균 두께가 23.8 μm이고, 건선이 유발된 rtTA-Peli1 그룹(rtTA-Peli1 Vehicle)에서는 상피층의 평균 두께가 104.5 μm로서, 건선이 유발된 rtTA-Peli1 그룹(rtTA-Peli1 Vehicle)은 대조군에 비해 상피층의 두께가 약 4.4 배 정도 증가되었음을 확인하였다 (도 19a 및 19b). 반면, 1, 3 및 10 mg/kg의 PD-L1-hyFc21 융합 단백질을 정맥 투여한 그룹에서는 상피층의 평균 두께가 각각 각각 약 97.9 μm, 86.3 μm 및 73.3 μm로서, 건선이 유발된 rtTA-Peli1 그룹(rtTA-Peli1 Vehicle)에 비해 상피층의 두께가 용량 의존적으로 감소되는 효과가 있음을 확인하였다 (도 19a 및 19b).
또한, PD-L1-hyFc21 융합 단백질을 rtTA-Peli1 건선 마우스 모델에 정맥 투여한 후, IL-17A 및 IL-22와 같은 Th17 세포-관련 유전자(Th17 cell-associated genes)와 IL-1β 및 IL-24와 같은 선천성 면역세포-관련 유전자(innate immune cell-associated genes)의 mRNA 발현 변화를 확인하기 위하여 qRT-PCR을 수행하였다. 그 결과, 건선이 유발된 rtTA-Peli1 그룹(rtTA-Peli1 Vehicle)에서는 대조군(rtTA)에 비해 L-17A 및 IL-22와 같은 Th17 세포-관련 유전자의 mRNA 발현이 증가하는 양상을 나타낸 반면, PD-L1-hyFc21 융합 단백질을 정맥 투여한 그룹에서는 Th17 세포-관련 유전자의 mRNA 발현이 감소하였음을 확인하였다 (도 20). 또한, 이와 유사하게, 건선이 유발된 rtTA-Peli1 그룹(rtTA-Peli1 Vehicle)에서는 대조군(rtTA)에 비해 IL-1β및 IL-24와 같은 선천성 면역세포-관련 유전자의 mRNA 발현이 증가하는 양상을 나타낸 반면, PD-L1-hyFc21 융합 단백질을 정맥 투여한 그룹에서는 Th17 세포-관련 유전자의 mRNA 발현이 감소하는 경향을 보였다 (도 20). 특히, 10 mg/kg의 PD-L1-hyFc21 융합 단백질을 정맥 투여한 그룹에서는 IL-24 mRNA의 발현이 유의하게 감소하였다 (도 20).
상기 결과로부터, PD-L1-hyFc21 융합 단백질은 피하 투여 또는 정맥 투여를 통해 건선과 같은 자가면역질환의 병인에 중요한 요인인 CD4 T 세포의 증식을 억제하고, 병변에 수반하는 염증성 사이토카인의 발현을 억제하는 효과가 있어, 건선과 같은 면역질환의 치료제로 사용될 수 있음을 확인하였다.

Claims (21)

  1. PD-L1(programmed cell death-ligand 1) 단백질 및 변형된 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 PD-L1 단백질은 PD-L1 단백질의 세포외 도메인(extracellular domain) 또는 이의 단편인 것인, 융합 단백질.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 PD-L1 단백질은 서열번호 1 내지 서열번호 6으로 이루어진 그룹에서 선택되는 아미노산 서열로 이루어진 것이거나, 서열번호 1 내지 서열번호 6으로 이루어진 그룹에서 선택되는 아미노산 서열과 70% 이상의 상동성을 가지는 폴리펩티드인 것인, 융합 단백질.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 PD-L1 단백질은 변형된 면역글로불린의 Fc 영역의 N-말단 또는 C-말단에 융합된 것인, 융합 단백질.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 PD-L1 단백질은 변형된 면역글로불린의 Fc 영역과 링커 펩티드로 연결된 것인, 융합 단백질.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 링커 펩티드는 GGGSGGS (서열번호 10), AAGSGGGGGSGGGGSGGGGS (서열번호 17), GGSGG (서열번호 18), GGSGGSGGS (서열번호 19), GGGSGG (서열번호 20), (G4S)n (n은 1 내지 10의 정수), (GGS)n (n은 1 내지 10의 정수), (GS)n (n은 1 내지 10의 정수), (GSSGGS)n (n은 1 내지 10의 정수), KESGSVSSEQLAQFRSLD (서열번호 21), EGKSSGSGSESKST (서열번호 22), GSAGSAAGSGEF (서열번호 23), (EAAAK)n (n은 1 내지 10의 정수), CRRRRRREAEAC (서열번호 24), A(EAAAK)4ALEA(EAAAK)4A, GGGGGGGG (서열번호 25), GGGGGG (서열번호 26), AEAAAKEAAAAKA (서열번호 27), PAPAP (서열번호 28), (Ala-Pro)n (n은 1 내지 10의 정수), VSQTSKLTRAETVFPDV (서열번호 29), PLGLWA (서열번호 30), TRHRQPRGWE (서열번호 31), AGNRVRRSVG (서열번호 32), RRRRRRRR (서열번호 33), GFLG (서열번호 34) 및 GSSGGSGSSGGSGGGDEADGSRGSQKAGVDE (서열번호 35)으로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 융합 단백질.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 링커 펩티드는 GGGSGGS (서열번호 10)의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 융합 단백질.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 변형된 면역글로불린의 Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgD 및 IgG4의 Fc 영역 중 어느 하나 또는 이들의 조합인 것인, 융합 단백질.
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 변형된 면역글로불린의 Fc 영역은 N-말단에서 C-말단 방향으로 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하며,
    상기 힌지 영역은 인간 IgG1 힌지 영역을 포함하고,
    상기 CH2 도메인은 인간 IgD와 인간 IgG4의 CH2 도메인의 아미노산 잔기의 부분을 포함하며,
    상기 CH3 도메인은 인간 IgG4의 CH3 도메인의 아미노산 잔기의 부분을 포함하는 것인, 융합 단백질.
  10. 제 1 항에 있어서,
    상기 변형된 면역글로불린의 Fc 영역은 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 융합 단백질.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 변형된 면역글로불린의 Fc 영역은 서열번호 16의 아미노산 서열로 이루어진 IgG1 힌지 영역을 포함하는 것인, 융합 단백질.
  12. 제 1 항에 있어서,
    상기 융합 단백질은 이량체(dimerization)를 형성하는 것인, 융합 단백질.
  13. 제 1 항에 있어서,
    상기 융합 단백질은 서열번호 12 또는 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 융합 단백질.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자.
  15. 제 14 항에 따른 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
  16. 제 15 항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  17. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  18. 제 17 항에 있어서,
    상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함하는 것인, 약학적 조성물.
  19. 제 17 항에 있어서,
    상기 면역질환은 자가면역질환 및 염증성 질환으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 약학적 조성물.
  20. 제 19 항에 있어서,
    상기 자가면역질환은 제1형 당뇨병, 원형 탈모증(alopecia areata), 항-인산지질 항체 증후군(antiphospholipid antibody syndrome), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 건선(psoriasis), 건선성 관절염(psoriatic arthritis), 다발성 경화증(multiple scelerosis), 전신 홍반 루푸스(systemic lupus erythematosus), 염증성 장질환(inflammatory bowel disease), 애디슨병(Addison's disease), 그레이브병(Graves' disease), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 길랑-바레 증후군(Guillian-Barre syndrome), 하시모토 갑상선염(Hashimoto's thyroiditis), 중증근무력증(Myasthenia gravis), 염증성 근육병(inflammatory myophathy), 자가면역성 혈관염(autoimmune vasculitis), 자가면역성 간염(autoimmune hepatitis), 출혈성 빈혈(hemolytic anemia), 특발성 혈소판감소성 자반(idiopathic thrombocytopenic purpura), 일차성 담즙성 간경화증(primary biliary cirrhosis), 피부경화증(scleroderma), 백반증(vitiligo), 악성 빈혈(pernicious anemia) 및 만성 소화장애(celiac disease)로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 약학적 조성물.
  21. 제 19 항에 있어서,
    상기 염증성 질환은 관절염(arthritis), 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 반응성 관절염(reactive arthritis), 라이터 증후군(Reiter's syndrome), 결정성 관절병증(crystal arthropathies), 라임 질환(Lyme disease), 류마티스성 다발성 근육통(polymyalgia rheumatica), 전신성 경화증(systemic sclerosis), 다발근육염(polymyositis), 피부근염(dermatomyositis), 결절다발동맥염(polyarteritis nodosa), 베게너육아종증(Wegener's granulomatosis), 처르그-스트라우스 증후군(Churg-Strauss syndrome), 사코이드증(sarcoidosis), 죽상경화 혈관 질환(atherosclerotic vascular disease), 아테롬성 동맥경화증(atherosclerosis), 허혈성심장질환(ischaemic heart disease), 심근경색(myocardial infarction), 뇌졸중(stroke), 말초혈관질환(peripheral vascular disease), 포도막염(uveitis), 각막질환(corneal disease), 홍채염(iritis), 홍채모양채염(iridocyclitis) 및 백내장(cataracts)으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 약학적 조성물.
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