WO2021157739A1 - シングルセルＲＮＡ－Ｓｅｑ解析のカウントデータセットの補正方法、シングルセルＲＮＡ－Ｓｅｑの解析方法、細胞種の構成比率の解析方法、並びにこれらの方法を実行するための装置及びコンピュータプログラム - Google Patents

シングルセルＲＮＡ－Ｓｅｑ解析のカウントデータセットの補正方法、シングルセルＲＮＡ－Ｓｅｑの解析方法、細胞種の構成比率の解析方法、並びにこれらの方法を実行するための装置及びコンピュータプログラム Download PDF

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    • G16B40/20—Supervised data analysis

Definitions

  • RNA-Seq Single-cell RNA-Seq or scRNA-Seq
  • Single-cell RNA-Seq Single-cell RNA-Seq or scRNA-Seq
  • a comprehensive gene expression profile is analyzed, and the analysis data is decomposed into single cell expression levels to derive information on changes in single cells (Non-Patent Documents 1 to 5). Therefore, scRNA-Seq is said to be a powerful method for producing detailed normal and pathogenic organ molecular cell atlases.
  • scRNA-Seq has its limits.
  • tissue collected by surgery or the like are often cryopreserved for several months to several years, and such preserved tissues cannot be used for scRNA-Seq.
  • the collection of human tissue is generally a biopsy, and there is a problem that the sample amount is small. Even if the entire organ can be collected by autopsy, it is not impossible to separate individual cells from the entire organ for the purpose of scRNA-Seq in the case of large organs such as the heart and brain. However, it is not realistic.
  • scRNA-Seq also has the problem of experimental artifacts in gene expression. As such an example, it has been reported that the process of cell separation induces abnormal gene expression in the cell.
  • RNA database deconvolution computational deconvolution of whole-organ RNA datasets
  • the whole organ RNA database deconvolution is calculated by computer after extracting RNA from the collected test tissue without performing cell separation for each cell type and obtaining sequence information of RNA expressed by RNA-Seq.
  • This is a method of estimating the expression level of each RNA for each cell type based on the ratio of the cell types contained in the test tissue. This method enables RNA expression analysis using not only fresh tissues but also cryopreserved tissues. This method also allows simultaneous purification of RNA from multiple organs.
  • Non-Patent Document 6-19 RNA-Seq data from almost the entire corresponding organ to calculate the cell type composition of the organ to be analyzed.
  • Non-Patent Document 17 MULti-Subject Single Cell deconvolution (MuSiC) (Non-Patent Document 17), Dampened Weighted Least Squares (DWLS) (Non-Patent Document 18), and Complete Deconvolution for Sequencing data (CDSeq) method (Non-Patent Document 19) have been reported. Was done. These three methods are said to be superior to the previously reported methods described in Non-Patent Documents 6 to 16.
  • Non-Patent Documents 17 to 19 synthetic datasets, cultured cells, mixtures of several tissues, and / or RNA-Seq data from 1 to 4 actual organs. The sex has only been verified. In other words, its applicability to a wider variety of real organs has not been investigated.
  • the present inventor evaluated the performance of MuSiC (Non-Patent Document 17) and the DWLS method (Non-Patent Document 19). These are the two latest methods that have been compared to other previous methods of deconvolution of one to four actual organs and have shown to be superior to other methods.
  • the ratio of cell types calculated by the MuSiC or DWLS method by the computer deviates from the one experimentally estimated by the actual scRNA-Seq study.
  • the degree of divergence also varied.
  • the dissociation was remarkable in the skeletal muscle and the heart.
  • RNA-Seq data for estimating the proportion of each cell type, which is closer to the proportion of various cells in an actual tissue.
  • Another object of the present invention is to provide a deconvolution method for RNA-Seq data that can be applied to a wider variety of tissues.
  • the count data set of the single cell RNA-Seq analysis obtained from the analysis target cell or predicted for the analysis target cell contains the total RNA for each cell type corresponding to the analysis target cell. Concerning how to correct the count dataset for single-cell RNA-Seq analysis, including weighting based on quantity.
  • the weighting is based on the expression of a signature gene set that characterizes each cell type, the signature gene set comprising a predetermined number of genes.
  • the count data set for single-cell RNA-Seq analysis obtained from the cells to be analyzed or predicted for the cells to be analyzed contains total RNA for each cell type corresponding to the cells to be analyzed. Weighting based on quantity and analyzing RNA expression patterns in each cell type that constitutes the organ to be analyzed, including the cells to be analyzed, based on the count data set of the weighted single-cell RNA-Seq analysis.
  • the present invention relates to a method for analyzing single-cell RNA-Seq, including.
  • the count data set of the single-cell RNA-Seq analysis obtained from the analysis target cell or predicted for the analysis target cell contains the total RNA for each cell type corresponding to the analysis target cell.
  • Analysis including weighting based on quantity and analysis of the composition ratio of cell types constituting the analysis target organ including the analysis target cell based on the count data set of the weighted single cell RNA-Seq analysis.
  • the present invention relates to a method for analyzing the composition ratio of cell types constituting the target organ.
  • An embodiment of the present invention relates to a count dataset correction device (10) for single-cell RNA-Seq analysis.
  • the correction device (10) includes a control unit (101).
  • the control unit (101) weights the count data set of the single-cell RNA-Seq analysis obtained from the analysis target cell based on the total RNA content for each cell type corresponding to the analysis target cell.
  • An embodiment of the present invention relates to a single cell RNA-Seq analyzer.
  • the analysis device (20) includes a control unit (201).
  • the control unit (201) includes the total RNA content for each cell type corresponding to the analysis target cell in the count data set of the single cell RNA-Seq analysis obtained from the analysis target cell or predicted for the analysis target cell.
  • the RNA expression pattern in each cell type constituting the analysis target organ including the analysis target cell is analyzed based on the count data set of the weighted single-cell RNA-Seq analysis.
  • An embodiment of the present invention relates to an analyzer for analyzing the composition ratio of cell types constituting the organ to be analyzed.
  • the analysis device (20) includes a control unit (201).
  • the control unit (201) includes the total RNA content for each cell type corresponding to the analysis target cell in the count data set of the single cell RNA-Seq analysis obtained from the analysis target cell or predicted for the analysis target cell. Based on the count data set of the weighted single-cell RNA-Seq analysis, the composition ratio of the cell types constituting the analysis target organ including the analysis target cell is analyzed.
  • the analysis target cell when executed by a computer, the analysis target cell is subjected to a count data set of a single cell RNA-Seq analysis obtained from the analysis target cell or predicted for the analysis target cell.
  • the present invention relates to a correction program for a count dataset for single-cell RNA-Seq analysis, which comprises performing a process comprising a weighting step based on the total RNA content for each corresponding cell type.
  • An embodiment of the present invention when executed by a computer, is applied to the analysis target cell in a count data set of a single cell RNA-Seq analysis obtained from the analysis target cell or predicted for the analysis target cell. Based on the step of weighting based on the total RNA content of each corresponding cell type and the count data set of the weighted single-cell RNA-Seq analysis, each cell type constituting the analysis target organ including the analysis target cell.
  • the present invention relates to a single-cell RNA-Seq analysis program, which comprises performing a process comprising analyzing an RNA expression pattern in.
  • the analysis target cell when executed by a computer, is subjected to a count data set of a single cell RNA-Seq analysis obtained from the analysis target cell or predicted for the analysis target cell. Based on the step of weighting based on the total RNA content of each corresponding cell type and the count data set of the weighted single-cell RNA-Seq analysis, the cell types constituting the analysis target organ including the analysis target cell An analysis program for the composition ratio of cell types that make up the organ to be analyzed, which executes a process including a step for analyzing the composition ratio.
  • the present invention can estimate the proportion of each cell type, which is closer to the proportion of various cells in the actual tissue, from the RNA sequence database.
  • the proportion of each cell type can be estimated in a wider variety of tissues.
  • An example of the hardware configuration of the correction device 10 is shown.
  • the processing flow of the correction program 1042 is shown.
  • An example of the hardware configuration of the analyzer 10 is shown.
  • the processing flow of the analysis program 2042 is shown.
  • Constituent ratio of reference cell type of each cell type present in each organ in aorta, brain, fat, heart, kidney, large intestine, liver, and lung composition ratio of cell type predicted by MuSiC, and predicted by DWLS method
  • the composition ratio of the cell type was shown.
  • the composition ratio of the reference cell type of each cell type present in each organ in the bone marrow, pancreas, skin, skeletal muscle, spleen, and thymus the composition ratio of the cell type predicted by MuSiC, and the cell predicted by the DWLS method.
  • the composition ratio of the species is shown.
  • the comparison between the estimated whole organ RNA-Seq data set obtained from the composition ratio of the reference cell type and the actual scRNA-Seq data of each organ and the actual whole organ RNA-Seq data set is shown.
  • the weighting coefficient of each cell type existing in each organ and its distribution range are shown.
  • the comparison between the estimated whole organ RNA-Seq data set estimated using the cell type-specific weighting coefficient obtained in the present invention and the actual whole organ RNA-Seq data set is shown.
  • w indicates the weight
  • m indicates the RNA count of each gene
  • n indicates the ratio of each cell type.
  • composition ratio of the reference cell type of each cell type present in each organ in the aorta, fat, heart, kidney, liver, lung, colon, bone marrow, skeletal muscle, and spleen, and the composition ratio of each cell estimated by the present invention are shown.
  • the comparison between the estimated transcript count in the aorta, fat, heart, kidney, liver, lung, large intestine, bone marrow, skeletal muscle, and spleen and the gene expression in each cell type in the actual organ is shown.
  • the t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding (t-SNE) analysis result of the estimated scRNA-Seq count data is shown.
  • MI myocardial infarction
  • a indicates the rate of change of the estimated cell type composition ratio with respect to Sham.
  • b shows the variation analysis result of the estimated gene expression profile.
  • RNA-Seq The results of deconvolution of the whole human organ RNA-Seq dataset are shown using the weighting factors calculated using mouse data and the estimated scRNA-Seq count data.
  • a indicates the cell type composition ratio estimated for the human heart and kidney.
  • b shows the t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding (t-SNE) analysis result of the gene expression profile estimated for the human heart and kidney.
  • One embodiment of the present invention relates to a correction method, a correction device, and a correction program of a count data set for single-cell RNA-Seq analysis. 1-1. How to correct the count dataset for single-cell RNA-Seq analysis
  • the method for correcting the count data set for single-cell RNA-Seq (scRNA-Seq) analysis is a single-cell RNA obtained from the cells to be analyzed or predicted for the cells to be analyzed.
  • the count data set for Seq analysis includes weighting based on total RNA content by cell type. 1-1-1.
  • RNA is not limited as long as it is RNA that can be analyzed by RNA-Seq analysis.
  • RNA may include mRNA, untranslated RNA, microRNA and the like.
  • RNA is not restricted as long as it is present in the organism.
  • Organisms are not limited as long as they are multicellular organisms with organs.
  • the organism may be an animal or a plant, but is preferably an animal.
  • the animals are preferably mammals such as humans, mice, rats, dogs, cats, rabbits, cows, horses, goats, sheep and pigs, and birds such as chickens. More preferably, it is a mammal such as human, mouse, dog, cat, cow, horse, pig, etc., still more preferably human, mouse, dog, or cat, and even more preferably human or mouse, and most preferably. Is a human.
  • Organisms also include both diseased and non-diseased organisms.
  • the cells to be analyzed are not limited as long as they are present in the organ of the organism.
  • An organ is preferably a cell whose cell composition within the organ is known.
  • An organ is a collection of tissues existing in an organism that has a certain independent morphology and a specific function.
  • the organs include circulatory organs (heart, arteries, veins, lymph vessels, etc.), respiratory organs (nasal cavity, sinus cavity, laryngeal, trachea, bronchi, lungs, etc.), digestion.
  • Organ organs (lips, cheeks, palate, teeth, gingiva, tongue, salivary glands, pharynx, esophagus, stomach, duodenum, empty intestine, ileum, cecum, wormdrop, ascending colon, transverse colon, sigmoid colon, rectum, anus, liver , Biliary sac, bile duct, biliary tract, pancreas, pancreatic tract, etc.)
  • Female reproductive system organs ovary, oviduct, uterus, vagina, etc.
  • breast male reproductive system organs (penis, prostate, testis, supraclavicular body, sperm duct), endocrine system organs (thin hypothalamus, pituitary gland, pine fruit body) , Thyroid, parathyroid, adrenal, etc.), dermal organs (skin, hair, nails, etc.), hematopoietic organs (blood, bone marrow, spleen, etc.), immune system organs (lymph no
  • the target tissues are preferably heart, cerebral, lung, kidney, adipose tissue, liver, skeletal muscle, testis, spleen, thymus, bone marrow, pancreas, and skin (for example, epidermis above the subcutaneous tissue). Includes papillary and reticular layers. Organs are preferably aorta, brain, fat, heart, kidney, large intestine, liver, lung, bone marrow, pancreas, skin, skeletal muscle, spleen, and thymus.
  • RNA-Seq analysis is a so-called transcriptome analysis, in which a read containing sequence information is comprehensively obtained from RNA existing in a target sample, and the read is mapped to a reference sequence and expressed. This is a method for analyzing the genes that are being used and the number of counts (also called the number of reads). The count number corresponds to the gene expression level.
  • the count data for RNA-Seq analysis may include the gene name and / or registration number of the expressed gene in the gene database and the count number of reads for each gene.
  • RNA-Seq analysis can be performed using a DNA sequencer called a next-generation sequencer or a third-generation sequencer.
  • Next-generation sequencers include, for example, MiSeq9 (registered trademark), HiSeq (registered trademark), NextSeq (registered trademark), MiSeq (registered trademark) of Illumina (San Diego, CA); Thermo Fisher (Walsom, MA). Ion Proton (registered trademark), Ion PGM (registered trademark); GS FLX + (registered trademark) of Roche (Basel, Switzerland), GS Junior (registered trademark), etc. can be mentioned.
  • the third generation sequencer include PacBioSequel TM.
  • the count data set for scRNA-Seq analysis is a set of count data generated based on gene expression analysis expressed in individual cells of an organism and / or gene expression predicted by a computer analysis method.
  • the count data set for scRNA-Seq analysis can be count data obtained from actual individual cells by RNA-Seq analysis.
  • the count data set for scRNA-Seq analysis is, for example, based on the count data obtained by RNA-Seq analysis from the entire organ by the method described in Non-Patent Document 6-19, based on the reference cell composition ratio by a computer analysis method. It may be a count data set predicted by deconvolution or the like.
  • the Complete Deconvolution for Sequencing data (CDSeq) method Non-Patent Document 19
  • CDSeq Complete Deconvolution for Sequencing data
  • the cell composition of each organ can be obtained from the scRNA-Seq data described in Non-Patent Document 5 or Non-Patent Document 2 or from a database registered in NIH or the like.
  • the composition of these cell types is information obtained by actually analyzing the composition of the cell type of the tissue of each organ.
  • Such cell composition of each organ is also called "reference cell type".
  • the reference cell type contains a count data set of scRNA-Seq for genes normally expressed in each cell type.
  • the reference cell type includes the composition ratio (also referred to as reference) of the reference cell type in each organ, and is associated with a label indicating the name or abbreviation of each cell type.
  • the composition of cell types in each organ described in Non-Patent Document 5 refers to the composition of cell types in each organ described in Non-Patent Document 5. It is preferable to use it as the composition ratio.
  • the cell type ratio described in Non-Patent Document 2 it is preferable to use the cell type ratio described in Non-Patent Document 2 as a reference cell type and its constituent ratio.
  • the composition ratio of the reference cell type described in Non-Patent Document 5 it is preferable to modify the composition ratio of the reference cell type described in Non-Patent Document 5 and use it as the composition ratio of the reference cell type according to the separation analysis of cardiomyocytes and non-muscle cells.
  • the composition ratio (3.1%) of cardiomyocytes adopted in Non-Patent Document 5 is the ratio at which consensus is generally obtained in the field of tissue anatomy based on various past studies. Extremely low compared to (30% to 40%). Therefore, in this example, it is preferable to set the composition ratio of cardiomyocytes to 30% and divide the remaining 70% by the composition ratio of the non-muscle cell type to obtain the composition ratio of the reference cell type.
  • the reference cell type and its composition ratio based on the report in NIH (http://www.nervenet.org/papers/BrainRev99.html#Numbers).
  • NIH http://www.nervenet.org/papers/BrainRev99.html#Numbers.
  • the corresponding cell type label of the scRNA-Seq data described in Non-Patent Document 5 was used.
  • the cell type classes in the brain are classified into four classes, "neurons”, “glial cells”, “endothelial cells”, and “others”, and the ratio of each class is 75: 23: 7: Set to 4. This ratio follows the estimated ratio in the mouse brain (http://www.nervenet.org/papers/BrainRev99.html#Numbers).
  • Non-Patent Document 5 "neurons”, “glial cells”, and “others” are further classified into more detailed cell type classes. Specifically, the class of “neurons” is further classified into “neurons-excitatory neurons, and some neural stem cells” and “neurons-inhibitory neurons". The “Other” class is divided into “pericyte cells-NA” and “oligodendrocyte progenitor cells-NA”. The class of "glial cells” is classified based on the following three assumptions. i) According to Non-Patent Document 5, four cell types of "glial cell” are "microglial cell-NA", “astrocyte-NA”, “Bergmann glial cell-NA”, and "oligodendrocyte NA”. Classify into.
  • composition ratios of these four glial cell types are as described in Non-Patent Document 5. iii) Since it is reported that "microglia cells” occupy 10-15% of the cells of the whole brain, the ratio of "microglia cells-NA" of the whole brain is set to 0.1.
  • the ratio of each brain cell type is "macrophages-NA” (about 0.2%), “microglial cell-NA” (10.0%), “astrocyte-NA” (about 2.2%), “ Bergman glia cells-NA (about 2.1%), brain peripheral cells-NA (about 1.5%), endothelial cells-NA (about 6.4%), nerve cells-excitatory neurons, and some "Neuron stem cells” (about 47.5%), “nerve cells-suppressive neurons” (about 21.3%), “poor astrocytes-NA” (about 8.7%), “poor astrocytes-NA” (about 1.9) %), which can be used as the reference cell type of the brain and its constituent ratio.
  • the reference cell types used in the present specification and the composition ratios of the reference cell types are shown in the composition ratio list of the reference cell types at the end of this document.
  • the count data of all these genes may be used, but it is possible to select a gene (signature gene) that can characterize each cell type and calculate the weighting factor using the count data of these gene sets. It is efficient.
  • the signature gene set that characterizes each such cell type can be calculated, for example, by the method described below.
  • the count data for scRNA-Seq analysis includes Rn45s, which has been reported as a non-mRNA artifact, although it significantly affects the count of spike-in genes labeled with ERCC and the total count. It is preferable to delete the counts derived from the three genes Akap5 and Lrrc17. Moreover, RNA count from each gene, the total count for each cell in the scRNA-Seq dataset in terms of 100, 10 3, 10 4, 10 5, 10 6 cases like, previously normalized Is preferable.
  • a classifier generated by training artificial intelligence such as a random forest can be used. Artificial intelligence is trained and classifiers are generated using the composition ratio of reference cell types of each organ and the count data set of scRNA-Seq analysis reported for each reference cell type. For example, when using a random forest as artificial intelligence, the important features of the classifier are extracted as the signature gene name of each cell type, and the "Mean Decrease Gini" value is used as the importance index of each gene, and "Mean Decrease Gini” is used. "Genes with high values were extracted as signature genes. As the signature gene, about 2000 genes can be extracted from 100 genes from the one with the higher "Mean Decrease Gini" value and used as a signature gene set. Next, for each cell type present in each organ, a weighting factor for correcting the count data set of scRNA-Seq analysis with RNA content is calculated.
  • the count data (also referred to as signature gene scRNA-Seq data) of the scRNA-Seq analysis of the signature gene set in each cell type of the reference cell type and all contained in each organ as a whole.
  • Count data obtained by RNA-Seq analysis of RNA also referred to as whole organ RNA-Seq data
  • Both the signature gene scRNA-Seq count data and the whole organ RNA-Seq count data are normalized and used.
  • RNA-Seq analysis count datasets can be used as whole organ RNA-Seq data.
  • Whole organ RNA-Seq data of mice can be obtained from "i-organs.atr.jp”.
  • Whole human organ RNA-Seq data can be obtained from "The Human Protein Atlas”(https://www.proteinatlas.org/; heart (ERR315328) and kidney (ERR315494)).
  • the weighting factor can be calculated according to the following method.
  • n indicates the number of signature genes of each organ.
  • the combination C m of cells to be analyzed is randomly selected under the restriction that the composition ratio of the reference cell type is kept within the total set size m.
  • m indicates a magnification and is determined depending on n. m is set to less than n in each of the following calculations.
  • w j is calculated by solving the quadratic programming problem according to the following equation (2) under the restriction that the value of the result is 0.01 or more.
  • S represents the number of RNA-Seq count datasets for each gene for the entire organ. For example, when using the corresponding whole organ RNA-Seq count datasets taken from two different individuals, S is 2.
  • This quadratic problem can be solved in R using the "quadprog" package. Random selection of cell combinations to be analyzed Both steps of calculation are performed recursively until the number of w j becomes 100 or more, and are performed for all selected cells to be analyzed.
  • the weighting calculates the average and variance of the weighted counts of the genes of each analysis target cell according to the following equation (3).
  • equation (3) Shows the weighted count vector of the gene of the analysis target cell j, the average value of the weighting coefficient of the analysis target cell j, and the variance of the weighting coefficient of the analysis target cell j, respectively. Represents the element-by-element product between two vectors.
  • the mean and variance of the weighting factors in the corresponding cell types follow a Gaussian distribution, the mean and variance of the weighting factors in the corresponding cell types. Is calculated according to the following equation (4).
  • k, C k , and N k indicate the cell type, the group of cells to be analyzed labeled with cell type k, and the number of cells to be analyzed in C k, respectively.
  • the count data set for scRNA-Seq analysis weighted by this method is also called the estimated scRAN-Seq count data set.
  • composition ratio of each organ and analysis of total RNA expression pattern in the cell type 1-1-2 can be analyzed.
  • the analysis of the composition ratio of the cell types constituting the organ to be analyzed is described in 1-1-3. Includes calculating the composition ratio of cell types constituting the analysis target organ including the analysis target cell based on the count data set of the scRNA-Seq analysis weighted in. In other words, the cell type composition ratio obtained by this method is the estimated composition ratio.
  • the above 1-1-2 Using the weighting coefficient calculated in, it is possible to analyze the total RNA expression pattern in the cell types constituting the organ to be analyzed.
  • the analysis of the total RNA expression pattern is to obtain the count data of the estimated scRNA-Seq analysis.
  • the total RNA is intended to include RNA expressed from the signature gene set and other genes.
  • analysis of the composition ratio of cell types and the expression pattern of total RNA in each cell type can be calculated at the same time by designing an algorithm based on Bayes' theorem.
  • the calculation can be performed according to the following equation (5).
  • equation (5) Is the whole organ RNA-Seq data vector, the matrix for which the column is the estimated scRNA-Seq data, which is a weighted count calculated according to the above equation (4) using the weighting coefficient of each cell type, and the cell type.
  • the coefficient vector corresponding to the composition ratio is shown.
  • the count weighted by the weighting coefficient of each cell type calculated according to the above formula (4) is an initial value, and is updated to a new value by the calculation of the formula (7) described later.
  • Bayes' theorem is used to calculate X and r.
  • ⁇ represents a hyperparameter for controlling the degree of variation in distribution when estimating the gene expression pattern of each cell type.
  • the posterior distribution of X and r is obtained as Eq. (7) below.
  • P (X) and P (r) show prior distributions of X and r, respectively.
  • P (X) and P (r) are given as the following equations (8) and (9).
  • ⁇ is a hyperparameter that controls the degree of variation in distribution when estimating the ratio of cell types.
  • the cell type composition ratio and the count of the reference data set weighted by the formula (4) are used.
  • the hyperparameters ⁇ and ⁇ can be set to 10 -3 , 10 -2 , ..., 10 3 for convenience.
  • Signature gene set 100 to 2000 genes that produced high similarity to actual whole organ RNA-Seq (high Pearson and Spearman correlation coefficients, and similarity determined based on low mean square error)
  • the result of the combination of the number of hyperparameters ( ⁇ and ⁇ ) can be selected as the best estimation result.
  • the correction device 10 can be a general-purpose computer.
  • the correction device 10 is communicably connected to the input device 111, the output device 112, and the media drive 113.
  • the correction device 10 includes a CPU 101, a memory 102, a ROM (read only memory) 103, a storage device 104, a communication interface (I / F) 105, an input interface (I / F) 106, and an output interface (I). It includes a / F) 107 and a media interface (I / F) 108.
  • Each configuration in the correction device 10 is connected to each other by a bus 109 so as to be capable of data communication.
  • the storage device 104 is composed of a hard disk, a semiconductor memory element such as a flash memory, an optical disk, or the like.
  • the storage device 104 includes an operating system (OS) 1041, a correction program 1042 described later, an algorithm database (DB) DB1, a reference cell type database (DB) DB2, and an organ-wide RNA-Seq database (DB) DB3. It is stored.
  • the correction program 1042 works with the operating system 1041 to cause the computer to function as the correction device 10.
  • the CPU 101 is also referred to as a control unit 101 in this embodiment.
  • the algorithm database DB1 is described in 1-1-3. Contains the formula for making the corrections described in.
  • the reference cell type database DB2 stores a label indicating the cell type contained in each organ, its composition ratio, and the data count of the scRNA-Seq analysis of each cell type in association with each other. Further, in the reference cell type database DB2, the data count of the corrected scRNA-Seq analysis of each cell type is stored in association with the label indicating the organ name and the label indicating the cell type name.
  • the whole organ RNA-Seq database DB3 count data of RNA-Seq analysis of each whole organ of mouse or human is registered for each organ. These data are 1-1-2. It is generated and stored from the known data described in.
  • the input device 111 is composed of a touch panel, a keyboard, a mouse, a pen tablet, a microphone, and the like, and inputs characters or voices to the correction device 10.
  • the input device 111 may be connected from the outside of the control unit 101 or may be integrated with the correction device 10.
  • the output device 112 is composed of, for example, a display device such as a display, a printer, or the like, and outputs various operation windows, analysis results, and the like.
  • the media drive 113 may be a USB drive, a flexible disk drive, a CD-ROM drive, a DVD-ROM drive, or the like.
  • Communication I / F105 communicates with an external database and other computers.
  • the output I / F 107 transmits information to the output device 112.
  • FIG. 2 shows the processing flow of the correction program 1042.
  • the control unit 101 of the correction device 10 first receives the processing start command input by the operator from the input device 111, and starts the processing. In step S1, the control unit 101 has the above 1-1-2.
  • the signature genes that characterize each cell type of the organ to be analyzed are selected according to the method described in.
  • step S2 the control unit 101 acquires the scRNA-Seq count data of the signature gene set to be acquired in step S1 from the reference cell type database DB2.
  • step S3 the control unit 101 acquires the whole organ RNA-Seq count data from the whole organ RNA-Seq database DB3. Note that step S3 may be before step S2.
  • step S4 the control unit 101 uses the algorithm database DB1 to perform the above 1-1-2.
  • the equation (4) is read from the equation (1) described in the above.
  • the scRNA-Seq count data of the signature gene set acquired in step S2 and the whole organ RNA-Seq count data acquired in step S4 were used in each of the read equations, and the above 1-1-2.
  • the weighting coefficient for each cell type existing in each organ is calculated based on the formula explained in.
  • the control unit 101 stores the calculated weighting coefficient in the algorithm database DB1.
  • step S5 the control unit 101 has 1-1-3. According to this, a count data set of scRNA-Seq analysis weighted for each cell type is acquired and stored in the reference cell type database DB2.
  • control unit 101 may receive the output processing start command input by the operator from the input device 111, and output the weighted scRNA-Seq analysis count data set from the output device 112.
  • steps S1 to S5 are performed by one computer
  • steps S1, steps S2 to S4, and step S5 may be performed by another computer. That is, the first computer selects the signature gene according to step S1, the second computer acquires the information of the signature gene set of each cell type existing in each organ from the first computer, and steps S2 to S4 Is performed to calculate the weighting coefficient.
  • a third computer may obtain a count dataset for the weighted scRNA-Seq analysis.
  • first computer may perform steps S1 to S4, and the second computer may perform step S5.
  • first computer may perform step S1
  • second computer may perform steps S2 to S5.
  • ScRNA-Seq analyzer and analysis device for the composition ratio of cell types that make up the organ to be analyzed As explained in the above, the analysis of scRNA-Seq and the analysis of the composition ratio of the cell types constituting the organ to be analyzed can be performed at the same time. Therefore, the analyzer 20 performs both processes.
  • FIG. 3 shows the hardware configuration of the analysis device 20.
  • the configuration of the analysis device 20 is basically the same as the configuration of the correction device 10 except for the storage device 204.
  • the storage device 204 stores the analysis program 2042, which will be described later, in place of the correction program 1042. Further, the storage device 204 stores the algorithm database (DB) DB1, the reference cell type database (DB) DB2, and the whole organ RNA-Seq database (DB) DB3, similarly to the storage device 104.
  • DB algorithm database
  • DB reference cell type database
  • DB whole organ RNA-Seq database
  • FIG. 4 shows the processing flow of the analysis program 2042.
  • the control unit 201 of the analysis device 20 first receives the processing start command input by the operator from the input device 211, and starts the processing. In step S11, the control unit 201 described the above 2.
  • the algorithm described in the above is read from the algorithm database DB1.
  • step S13 the control unit 201 acquires the whole organ RNA-Seq count data from the whole organ RNA-Seq database DB3.
  • step S13 the control unit 201 described the above 3-2.
  • the count data set of the weighted scRNA-Seq analysis obtained in is read from the reference cell type database DB2 and applied to the algorithm.
  • control unit 201 records the composition ratio of the cell types constituting the analysis target organ estimated by the algorithm and the estimated count data of the scRNA-Seq analysis in the storage device 204 as the estimation result.
  • control unit 201 may output only the composition ratio of the cell types constituting the analysis target organ from the output device 212, and outputs only the estimated count data of the scRNA-Seq analysis from the output device 212. You may. Further, the control unit 201 may output both results from the output device 212.
  • the recording medium on which the computer program is recorded The correction program 1042 and the analysis program 2042 may be recorded on the recording medium.
  • each program is stored in a semiconductor memory element such as a hard disk or a flash memory, or a recording medium such as an optical disk. Further, each program may be stored in a recording medium that can be connected to a network such as a cloud server. Each program may be provided in download format or as a program product recorded on a recording medium.
  • the storage format of the program in the recording medium is not limited as long as each device can read the program.
  • the storage in the recording medium is preferably non-volatile.
  • composition ratio of reference cell type 14 types of organs such as aorta, brain, fat, heart, kidney, colon, liver, lung, bone marrow, pancreas, skin, skeletal muscle, spleen, and thymus are described in Non-Patent Document 5.
  • the composition ratio of the reference cell type was calculated based on the scRNA-Seq data of the above and the database registered in NIH and the like.
  • the ratio of cell types in each organ described in Non-Patent Document 5 was used as the composition ratio of reference cell types.
  • Non-Patent Document 2 For skeletal muscle, the cell type ratio described in Non-Patent Document 2 was used as the composition ratio of the reference cell type.
  • the composition ratio of the cell type described in Non-Patent Document 5 was modified to be the composition ratio of the reference cell type (Referene) in accordance with the separation analysis of the myocardium and the non-muscle cell.
  • the ratio of cardiomyocytes (3.1%) adopted in Non-Patent Document 5 is the ratio that is generally consensus in the field of tissue anatomy based on various past studies (3%). Extremely low compared to 30% to 40%). Therefore, in this example, the ratio of cardiomyocytes was set to 30%, and the remaining 70% was divided by the ratio of non-muscle cell types to obtain the composition ratio of reference cell types.
  • the composition ratio of the reference cell type was determined based on the report in NIH (http://www.nervenet.org/papers/BrainRev99.html#Numbers).
  • NIH http://www.nervenet.org/papers/BrainRev99.html#Numbers.
  • the corresponding cell type label of the scRNA-Seq data described in Non-Patent Document 5 was used.
  • the cell type classes in the brain are classified into four classes, "neurons”, “glial cells”, “endothelial cells”, and “others”, and the ratio of each class is 75: 23: 7: Set to 4. This ratio follows the estimated ratio in the mouse brain (http://www.nervenet.org/papers/BrainRev99.html#Numbers).
  • Non-Patent Document 5 "neurons”, “glial cells”, and “others” were further classified into more detailed cell type classes. Specifically, the class of “neurons” was further classified into “neurons-excitatory neurons, and some neural stem cells” and “neurons-inhibitory neurons". The “Other” class was classified into “cerebral pericyte-NA” and “oligodendrocyte progenitor cell-NA”. The class of "glial cells” was classified based on the following three assumptions. i) According to Non-Patent Document 5, four cell types of "glial cell” are "microglial cell-NA", “astrocyte-NA”, “Bergmann glial cell-NA”, and "oligodendrocyte NA”.
  • the ratio of each brain cell type is "macrophages-NA” (about 0.2%), “microglial cell-NA” (10.0%), “astrosite-NA” (about 2.2%), “ Bergman glia cells-NA (about 2.1%), brain pericutaneous cells-NA (about 1.5%), endothelial cells-NA (about 6.4%), nerve cells-excitatory neurons, and some "Neuron stem cells” (about 47.5%), “nerve cells-suppressive neurons” (about 21.3%), “poor splinter cells-NA” (about 8.7%), “poor splinter progenitor cells-NA” (about 1.9%) %), And these were used as the composition ratio of the reference cell type of the brain. For the human heart and kidney, the composition ratio of the heart cell type and the composition ratio of the kidney cell type in the mouse were used as the composition ratio of the reference cell type.
  • composition ratio of the reference cell type of each organ is shown in the composition ratio list of the reference cell type described later.
  • scRNA-Seq count data for each cell type is registered in a known database.
  • RNA counts from each gene were then converted and normalized when the total count for each cell in the scRNA-Seq dataset was 100. This normalization step was performed similarly for each RNA contained in the whole organ RNA-Seq dataset.
  • RNA-Seq data of mouse and whole organ RNA-Seq of myocardial infarction model mouse were obtained from "i-organs.atr.jp”.
  • Whole human organ RNA-Seq data was taken from "The Human Protein Atlas”(https://www.proteinatlas.org/; heart (ERR315328) and kidney (ERR315494)).
  • scRNA-Seq data was obtained from Non-Patent Document 5 (aorta, brain, fat, heart, kidney, large intestine, liver, lung, bone marrow, pancreas, skin, spleen, thoracic gland) and skeletal muscle of "mouse cell atlas”.
  • RNA counts of all the predicted and calculated genes was normalized to 1 million copies.
  • the normalized count of each gene was rounded to an integer and analyzed using the R package "DESeq2 (version 1.24.0)".
  • the heart is composed of cardiomyocytes and non-muscle cells. Cardiomyocytes occupy the largest volume of the heart. However, when comparing the number of cells, there are more non-muscle cells than cardiomyocytes. Contrary to this fact, the composition of cardiac cell types calculated by the MuSiC or DWLS method is calculated to be 90% occupied by cardiomyocytes. The same tendency was seen in skeletal muscle.
  • RNA content varies from cell to cell, ranging from 50,000 transcripts / cell to 300,000 transcripts / cell.
  • the volume of cardiomyocytes is said to be 20 to 25 times the volume of non-muscle cells such as endothelial cells and fibroblasts. Therefore, the total RNA content per cell can vary significantly between muscle and non-muscle cells. In fact, this possibility is not considered in the MuSiC and DWLS methods. It is considered that such a point led to the deviation of the composition ratio of the cell type presumed to be the reference.
  • Figure 7 shows the estimated whole organ RNA-Seq data.
  • the putative whole organ RNA-Seq data was calculated as the sum of transcript counts for each gene normalized by weighting tissues composed of multiple cell types based on the composition ratio of known reference cell types. ..
  • the result shown in FIG. 7 is the dedicated number (number of genes) of the signature gene according to the number of higher ranks in each cell type of each organ used to identify the cell type of each organ calculated by RF.
  • the top ranks were 100 genes, 300 genes, and 2000 genes among the signature genes.
  • the aorta was compared with 1577 genes instead of 2000 genes, and the kidney was compared with 1461 genes.
  • the similarity / dissimilarity between the actual gene expression profile and the putative gene expression profile of 14 organs is indicated by the Pearson correlation coefficient.
  • the Pearson correlation coefficient was less than 0.75 in 10 organs (aorta, brain, heart, large intestine, liver, lung, pancreas, skin, skeletal muscle, thymus).
  • organs aorta, brain, heart, large intestine, liver, lung, pancreas, skin, skeletal muscle, thymus.
  • the weight coefficient for each cell type existing in each organ was calculated according to the following method. Shows the vector of the normalized whole organ RNA-Seq count, the j weighting factor of each cell to be analyzed, and the matrix of the normalized scRNA-Seq count.
  • n indicates the number of signature genes of each organ. The top 100, 300, or 2,000 genes were selected as signature genes by ranking based on the “Mean Decrease Gini” obtained by RF analysis. All genes were used for organs with a maximum signature gene count of less than 2000 in RF analysis.
  • the combination C m of cells to be analyzed was randomly selected under the restriction that the composition ratio of the reference cell type was kept within the total set size m.
  • Equation (1) m indicates a magnification and is determined depending on n. m is set to less than n in each of the following calculations.
  • w j was calculated by solving the quadratic programming problem according to the following equation (2) under the restriction that the value of the result is 0.01 or more.
  • S represents the number of RNA-Seq count datasets for each gene for the entire organ. In this study, we used the corresponding whole organ RNA-Seq count datasets from two different individuals. Therefore, S is 2. This quadratic problem was solved in R using the "quadprog" package.
  • Equation (3) Shows the weighted count vector of the gene of the analysis target cell j, the average value of the weighting coefficient of the analysis target cell j, and the variance of the weighting coefficient of the analysis target cell j, respectively. Represents the element-by-element product between two vectors.
  • the mean and variance of the weighting factors in the corresponding cell types were calculated according to the following equation (4).
  • k, C k , and N k indicate the cell type, the group of cells to be analyzed labeled with cell type k, and the number of cells to be analyzed in C k, respectively.
  • the weighting coefficient for each cell type existing in each organ, its average value, variance, and quartile are shown in the weighting coefficient list described later.
  • Equation (6) was adopted.
  • ⁇ represents a hyperparameter.
  • the posterior distribution of X and r was obtained as Eq. (7) below.
  • P (X) and P (r) show prior distributions of X and r, respectively.
  • P (X) and P (r) are given as the following equations (8) and (9).
  • the cell type composition ratio and the count of the reference dataset weighted by the formula (4) were used.
  • Hyperparameters ⁇ and ⁇ are set to 10 -3 , 10 -2 ,..., 10 3 for convenience.
  • Signature gene sets (100, 300, 2,000) that produced high similarity to actual whole organ RNA-Seq (high Pearson and Spearman correlation coefficients, and similarity determined based on low mean square error) / 1,577 / 1,461)
  • the result of the combination of the number of hyperparameters ( ⁇ and ⁇ ) was selected as the best estimation result. The outline of this calculation is shown in FIG.
  • the composition ratio of the cell type estimated by the method of the present invention and the comparison result with the reference cell type ratio are shown in FIGS. 11 and 12.
  • the composition ratio of cell types of 10 organs was calculated.
  • the result is shown in FIG. From the 14 organs used in FIGS. 5 and 6, the brain, pancreas, skin, and thymus were excluded from the study for the following reasons. 1) Actual cell type ratios are not available. 2) The pancreas is actually derived from islets. Actual cell type ratios are available for islets, but do not indicate actual pancreatic overall ratios. 3) In the case of skin or thymus, the Pearson correlation coefficient did not exceed 0.8 even when the cell type and specific weighting coefficient were used.
  • the calculated cell type composition ratios of the above 10 organs were similar to the reference cell type composition ratios experimentally determined by actual scRNA-Seq studies (Fig. 11).
  • the abnormally large proportions of cardiomyocytes and skeletal muscle cells estimated by the MuSiC and DWLS methods were improved by V-scRNA-Seq, respectively.
  • the result is shown in FIG.
  • the mean square error (MSE) with respect to the composition ratio of the reference cell type is V-scRNA-Seq in 5 actual organs (fat, heart, large intestine, liver, skeletal muscle) and other organs. It surpassed the method.
  • the method of the present invention is applied to a mouse model of myocardial infarction (MI), and the method according to the present invention is the composition ratio of the cell type in the heart and the already known cell type-dependent gene expression during MI. It was examined whether both changes over time could be detected.
  • the disease model calculation first calculated the weighting factor using sham heart organ-wide RNA-Seq data using the same reference cell type composition of normal mice at each stage (E, M, L). .. Next, using the total cardiac RNA-Seq data of the sham / MI model, the composition ratio and gene expression profile of the cell type at each stage were calculated as described above.
  • RNA-Seq data from sham controls E-sham, M-sham, L-sham
  • composition of reference cell types in normal mouse hearts were used to calculate weighting factors for each cell type. ..
  • the calculated changes in gene expression in each cell type at the time of myocardial infarction were also detected with a plurality of characteristics expected from previous experimental studies (Fig. 15b).
  • RNA-Seq dataset Each of the total counts of RNA expressed from each gene stored in the whole human organ RNA-Seq dataset was first normalized to 100. The mouse gene symbol was then matched to that of the human by extracting a gene with a common name between the mouse and the human. Using these mouse-human common gene sets, the computational techniques described for mouse datasets were applied. Human heart and kidney organ-wide RNA-Seq data were obtained from "The Human Protein Atlas" (https://www.proteinatlas.org/).
  • Fig. 8 The results are shown in Fig. 8. It has been shown that the calculated cell type composition for the human heart and kidney is similar to the cell type composition for the corresponding normal mouse organs (Fig. 16a). Furthermore, t-SNE analysis of estimated human heart and kidney scRNA-Seq data showed that classification based on the gene expression profile of known cell types in each organ was possible (Fig. 16b). These results indicate the cell type-specific weighting factor and the cross-species applicability of the V-scRNASeq framework.
  • Aorta Aorta-endothelial cell-NA: EC: 0.40; Aorta: Aorta-erythrocyte-NA: ERC: 0.21; Aorta: Aorta-fibroblast-NA: FC: 0.22; Aorta: Aorta-professional antigen presenting cell-NA: PAP: 0.16; Brain: Brain_Myeloid-macrophage-NA: MAC: 0.00; Brain: Brain_Myeloid-microglial cell-NA: MI: 0.10; Brain: Brain_Non-Myeloid-astrocyte-NA: AS: 0.02; Brain: Brain_Non-Myeloid-Bergmann glial cell-NA: BGC: 0.00; Brain: Brain_Non-Myeloid-brain pericyte-NA: BP: 0.02; Brain: Brain_Non-Myeloid-endothelial cell-NA: EC: 0.06; Brain: Brain_Non-Myeloid-neuron-excitatory neurons

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Abstract

本明細書には、解析対象細胞から取得した、又は解析対象細胞について予測されたシングルセルRNA-Seq解析のカウントデータセットに、前記解析対象細胞に対応する細胞種ごとの総RNAの含有量に基づいて重み付けすること、を含むシングルセルRNA-Seq解析のカウントデータセットの補正方法が開示される。

Description

シングルセルＲＮＡ－Ｓｅｑ解析のカウントデータセットの補正方法、シングルセルＲＮＡ－Ｓｅｑの解析方法、細胞種の構成比率の解析方法、並びにこれらの方法を実行するための装置及びコンピュータプログラム
　本明細書には、シングルセルRNA-Seq解析のカウントデータセットの補正方法、シングルセルRNA-Seqの解析方法、細胞種の構成比率の解析方法、並びにこれらの方法を実行するための装置及びコンピュータプログラムが開示される。
　ヒトの器官は約１×１０８－３×１０１２細胞で構成されている。器官の細胞構成および／または細胞のフェノタイプの変化は、その機能不全、リモデリングおよび再生と密接に関連している。個々の器官は細胞の混合集団である。このため、シングルセルRNA-Seq（Single-cell RNA-SeqまたはscRNA-Seq）は、器官の細胞構成および／または細胞のフェノタイプの変化を捉えるために、それぞれの器官の細胞の集団に対して包括的な遺伝子発現プロファイルを解析し、その解析データを単一細胞の発現レベルに分解して、単一細胞の変化の情報を導き出している（非特許文献１から非特許文献５）。したがって、scRNA-Seqは、詳細な正常および病的器官の分子細胞アトラスを生成する強力な方法といわれている。
　しかし、scRNA-Seqには、限界がある。まず、scRNA-Seqに供するためには、器官から採取した組織を、消化酵素を使って、又は物理的な破砕により個々細胞を回収しなければならない。この前提として、このような細胞を回収するためには組織が新鮮である必要がある。言い換えると、一般的に手術等で採取された組織は、数ヶ月から数年凍結保存されている場合が多く、このような保存組織は、scRNA-Seqに用いることができない。手術の後の病理組織診断において、希少な疾患であると判明しても、その希少な病理学的サンプルを新たに入手することは困難であり、RNAの発現解析に使用できるサンプルは、凍結保存されたものとなることが一般的である。また、ヒトの組織の採取は、一般的に生検であることが多く、サンプル量が少ないといった問題がある。仮に剖検等を行って器官全体を採取できたとしても、心臓や脳のように大きな器官の場合、scRNA-Seqの目的でそれらの器官全体から個々の細胞を分離することは、不可能ではないが、現実的ではない。
　また、これは多くの場合、薬物効果および／または病因の研究では、同じ被験者の異なる複数の器官において薬物による影響、及び／又は病態を解析することが必要となるが、ヒトの場合、同一者から複数種の器官を採取した解析が難しいという問題もある。
　さらに、scRNA-Seqには、遺伝子発現における実験手法上のアーチファクトの問題もある。このような例として、細胞の分離工程で、細胞内で異常な遺伝子発現を誘発することが報告されている。
　上記課題を解決するために、コンピュータによる器官全体RNAデータベースデコンボリューション（computational deconvolution of whole-organ RNA datasets）が、提唱されている。器官全体RNAデータベースデコンボリューションは、細胞種ごとの細胞分離を行わずに、採取した被験組織からRNAの抽出を行い、RNA-Seqにより発現しているRNAの配列情報を得た後に、コンピュータによって計算された被験組織に含まれる細胞種の割合に基づいて、細胞種ごとの各RNAの発現量を推定する方法である。この方法は、新鮮な組織だけでなく、凍結保存した組織を用いたRNA発現解析が可能である。また、この方法は、多数の器官からのRNAの同時精製も可能である。
　器官全体RNA-Seqデータをデコンボリューションするためのいくつかのコンピュータ解析方法がこれまで提案されている（非特許文献６－１９）。これらの方法は、対応する器官のほぼ全体のRNA-Seqデータを使用して、解析対象の器官の細胞種の組成を計算する。
　最近、MUlti-Subject Single Cell deconvolution（MuSiC）（非特許文献１７）、Dampened Weighted Least Squares（DWLS）（非特許文献１８）、及びComplete Deconvolution for Sequencing data（CDSeq）法（非特許文献１９）が報告された。これら３つの方法は、以前に報告された非特許文献６から非特許文献１６に記載の方法よりも優れているといわれている。
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　しかし、非特許文献１７から非特許文献１９に記載方法、合成データセット、培養細胞、いくつかの組織の混合物、及び／又は１個から４個の実際の器官に由来するRNA-Seqデータにおいて有用性が検証されたに過ぎない。言い換えると、より多様な実際の器官への適用可能性は検討されていない。本発明者は、MuSiC（非特許文献１７）およびDWLS法（非特許文献１９）について性能を評価した。これらは、１個から４個の実際の器官についてデコンボリューションを行う、他の以前の方法と比較され、他の方法よりも優れていることが示された最新の2つの方法である。しかし、後述する効果の検証に示すように、MuSiC又はDWLS法によって、コンピュータにより算出された細胞種の比率が、実際のscRNA-Seqの研究によって実験的に推定されたものから乖離しており、また乖離の程度も様々であった。特に、骨格筋及び心臓では乖離が顕著であった。
　そこで、このよう乖離を解消するために、本発明は、実際の組織における各種細胞の割合により近い、各細胞種の割合を推定するためのRNA-Seqデータのデコンボリューション法を提供することを課題とする。また、より多種の組織に対応可能なRNA-Seqデータのデコンボリューション法を提供することを課題とする。
　本発明のある実施形態は、解析対象細胞から取得した、又は解析対象細胞について予測されたシングルセルRNA-Seq解析のカウントデータセットに、前記解析対象細胞に対応する細胞種ごとの総RNAの含有量に基づいて重み付けすること、を含むシングルセルRNA-Seq解析のカウントデータセットの補正方法に関する。
　好ましくは、前記重み付けが、各細胞種を特徴付けるシグネチャ遺伝子セットの発現に基づいて行われ、前記シグネチャ遺伝子セットは、所定数の遺伝子数を含む。
　本発明のある実施形態は、解析対象細胞から取得した、又は解析対象細胞について予測されたシングルセルRNA-Seq解析のカウントデータセットに、前記解析対象細胞に対応する細胞種ごとの総RNAの含有量に基づいて重み付けすることと、重み付けされたシングルセルRNA-Seq解析のカウントデータセットに基づいて、解析対象細胞を含む解析対象器官を構成する各細胞種におけるRNAの発現パターンを解析すること、と含む、シングルセルRNA-Seqの解析方法に関する。
　本発明のある実施形態は、解析対象細胞から取得した、又は解析対象細胞について予測されたシングルセルRNA-Seq解析のカウントデータセットに、前記解析対象細胞に対応する細胞種ごとの総RNAの含有量に基づいて重み付けすることと、重み付けされたシングルセルRNA-Seq解析のカウントデータセットに基づいて、解析対象細胞を含む解析対象器官を構成する細胞種の構成比率を解析することを含む、解析対象器官を構成する細胞種の構成比率の解析方法に関する。
　本発明のある実施形態は、シングルセルRNA-Seq解析のカウントデータセットの補正装置（１０）に関する。補正装置（１０）は、制御部（１０１）を備える。制御部（１０１）は、解析対象細胞から取得したシングルセルRNA-Seq解析のカウントデータセットに、前記解析対象細胞に対応する細胞種ごとの総RNAの含有量に基づいて重み付けする。
　本発明のある実施形態は、シングルセルRNA-Seqの解析装置に関する。解析装置（２０）は、制御部（２０１）を備える。制御部（２０１）は、解析対象細胞から取得した、又は解析対象細胞について予測されたシングルセルRNA-Seq解析のカウントデータセットに、前記解析対象細胞に対応する細胞種ごとの総RNAの含有量に基づいて重み付けし、重み付けされたシングルセルRNA-Seq解析のカウントデータセットに基づいて、解析対象細胞を含む解析対象器官を構成する各細胞種におけるRNAの発現パターンを解析する。
　本発明のある実施形態は、解析対象器官を構成する細胞種の構成比率の解析装置に関する。解析装置（２０）は、制御部（２０１）を備える。制御部（２０１）は、解析対象細胞から取得した、又は解析対象細胞について予測されたシングルセルRNA-Seq解析のカウントデータセットに、前記解析対象細胞に対応する細胞種ごとの総RNAの含有量に基づいて重み付けし、重み付けされたシングルセルRNA-Seq解析のカウントデータセットに基づいて、解析対象細胞を含む解析対象器官を構成する細胞種の構成比率を解析する。
　本発明のある実施形態は、コンピュータに実行させた時に、コンピュータに、解析対象細胞から取得した、又は解析対象細胞について予測されたシングルセルRNA-Seq解析のカウントデータセットに、前記解析対象細胞に対応する細胞種ごとの総RNAの含有量に基づいて重み付けするステップを備える処理を実行させる、シングルセルRNA-Seq解析のカウントデータセットの補正プログラムに関する。
　本発明のある実施形態は、コンピュータに実行させた時に、コンピュータに、解析対象細胞から取得した、又は解析対象細胞について予測されたシングルセルRNA-Seq解析のカウントデータセットに、前記解析対象細胞に対応する細胞種ごとの総RNAの含有量に基づいて重み付けするステップと、重み付けされたシングルセルRNA-Seq解析のカウントデータセットに基づいて、解析対象細胞を含む解析対象器官を構成する各細胞種におけるRNAの発現パターンを解析するステップと、を備える処理を実行させる、シングルセルRNA-Seqの解析プログラムに関する。
　本発明のある実施形態は、コンピュータに実行させた時に、コンピュータに、解析対象細胞から取得した、又は解析対象細胞について予測されたシングルセルRNA-Seq解析のカウントデータセットに、前記解析対象細胞に対応する細胞種ごとの総RNAの含有量に基づいて重み付けするステップと、重み付けされたシングルセルRNA-Seq解析のカウントデータセットに基づいて、解析対象細胞を含む解析対象器官を構成する細胞種の構成比率を解析するステップと、を備える処理を実行させる、解析対象器官を構成する細胞種の構成比率の解析プログラム。
　本発明は、RNA配列データベースから、実際の組織における各種細胞の割合により近い、各細胞種の割合を推定することができる。また、本発明によれば、より多種の組織において、各細胞種の割合を推定することができる。
補正装置１０のハードウエア構成の例を示す。 補正プログラム１０４２の処理の流れを示す。 解析装置１０のハードウエア構成の例を示す。 解析プログラム２０４２の処理の流れを示す。 大動脈、脳、脂肪、心臓、腎臓、大腸、肝臓、及び肺における各器官に存在する各細胞種の参照細胞種の構成比率と、MuSiCで予測された細胞種の構成比率と、DWLS法で予測された細胞種の構成比率を示す。 骨髄、膵臓、皮膚、骨格筋、脾臓、及び胸腺における各器官に存在する各細胞種の参照細胞種の構成比率と、MuSiCで予測された細胞種の構成比率と、DWLS法で予測された細胞種の構成比率を示す。 参照細胞種の構成比率と各器官の実際のscRNA-Seqデータから得られた推定器官全体RNA-Seqデータセットと、実際の器官全体RNA-Seqデータセットとの比較を示す。 各器官に存在する各細胞種の重み係数とその分布範囲を示す。 本発明で求められた細胞種特異的な重み係数を用いて推定した推定器官全体RNA-Seqデータセットと実際の器官全体RNA-Seqデータセットとの比較を示す。 本発明による器官全体RNA-Seqデータのデコンボリューション法の概要を示す図中ｗは重みを示し、ｍは各遺伝子のRNAのカウントを示し、ｎは各細胞種の比率を示す。 大動脈、脂肪、心臓、腎臓、肝臓、肺、大腸、骨髄、骨格筋、及び脾臓における各器官に存在する各細胞種の参照細胞種の構成比率と、本発明により推定した各細胞の構成比率と、MuSiCで予測された細胞種の構成比率と、DWLS法で予測された細胞種の構成比率を示す。 参照細胞種の構成比率に対する、本発明により推定した各細胞の構成比率と、MuSiCで予測された細胞種の構成比率と、DWLS法で予測された細胞種の構成比率の平均二乗誤差（MSE）を示す。 大動脈、脂肪、心臓、腎臓、肝臓、肺、大腸、骨髄、骨格筋、及び脾臓における推定トランスクリプトカウントと、実際の器官内の各細胞種における遺伝子発現との比較を示す。 推定scRNA-Seqカウントデータのt-Distributed Stochastic Neighbor Embedding（t-SNE）解析結果を示す。 心筋梗塞（MI）のマウスモデルを用いて、本発明により心臓の細胞種の構成比率と、各細胞種における遺伝子発現プロファイルを推定した時の結果を示す。aは、推定した細胞種の構成比率のShamに対する変化率を示す。bは、推定した遺伝子発現プロファイルの変動解析結果を示す。 マウスのデータを使用して算出した重み係数と推定scRNA-Seqカウントデータを用いて、ヒト器官全体RNA-Seqデータセットのデコンボリューションを行った時の結果を示す。aは、ヒトの心臓及び腎臓について推定した細胞種の構成比率を示す。bは、ヒトの心臓及び腎臓について推定した遺伝子発現プロファイルのt-Distributed Stochastic Neighbor Embedding（t-SNE）解析結果を示す。
１．補正方法、解析方法、及び解析対象器官を構成する細胞種の構成比率の解析方法
　本発明のある実施形態は、シングルセルRNA-Seq解析のカウントデータセットの補正方法、補正装置及び補正プログラムに関する。
１－１．シングルセルRNA-Seq解析のカウントデータセットの補正方法
　シングルセルRNA-Seq (scRNA-Seq)解析のカウントデータセットの補正方法（以下、単に「補正方法」とも称する）は、解析対象細胞から取得した、又は解析対象細胞について予測されたシングルセルRNA-Seq解析のカウントデータセットに、細胞種ごとの総RNAの含有量に基づいて重み付けすること、を含む。
１－１－１．RNA-Seq解析
　本明細書において、RNAは、RNA-Seq解析により解析できるRNAである限り制限されない。RNAには、mRNA、非翻訳RNA、microRNA等を含み得る。
　RNAは、生物に存在する限り制限されない。生物は、器官を備える多細胞生物である限り制限されない。生物は、動物であっても植物であってもよいが、好ましくは動物である。動物として好ましくは、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ等の哺乳動物、ニワトリ等の鳥類等である。より好ましくはヒト、マウス、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ等の哺乳動物であり、さらに好ましくはヒト、マウス、イヌ、又はネコ等であり、さらにより好ましくはヒト又はマウスであり、最も好ましくはヒトである。また、生物には疾患を有する生物と有さない生物の両方が含まれる。
　解析対象細胞は、前記生物の器官に存在する限り制限されない。器官は、好ましくは器官内の細胞構成がわかっている細胞である。
　器官とは、生物に存在する、いくつかの組織の集まりで，一定の独立した形態および特定の機能を有するものを意味する。例えば、生物が哺乳類である場合、器官には、循環器系器官（心臓、動脈、静脈、リンパ管等）、呼吸器系器官（鼻腔、副鼻腔、喉頭、気管、気管支、肺等）、消化器系器官（口唇、頬部、口蓋、歯、歯肉、舌、唾液腺、咽頭、食道、胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、虫垂、上行結腸、横行結腸、S状結腸、直腸、肛門、肝臓、胆嚢、胆管、胆道、膵臓、膵管等）、泌尿器系器官（尿道、膀胱、尿管、腎臓）、神経系器官（大脳、小脳、中脳、脳幹、脊髄、末梢神経、自律神経等）、女性生殖器系器官（卵巣、卵管、子宮、膣等）、乳房、男性生殖器系器官（陰茎、前立腺、精巣、精巣上体、精管）、内分泌系器官（視床下部、下垂体、松果体、甲状腺、副甲状腺、副腎等）、外皮系器官（皮膚、毛、爪等）、造血器系器官（血液、骨髄、脾臓等）、免疫系器官（リンパ節、扁桃、胸腺等）、骨軟部器官（骨、軟骨、骨格筋、結合組織、靱帯、腱、横隔膜、腹膜、胸膜、脂肪組織（褐色脂肪、白色脂肪）等）、感覚器系器官（眼球、眼瞼、涙腺、外耳、中耳、内耳、蝸牛等）等を含み得る。本発明において、対象とする組織としては、好ましくは心臓、大脳、肺、腎臓、脂肪組織、肝臓、骨格筋、精巣、脾臓、胸腺、骨髄、膵臓、皮膚（例えば、皮下組織より上層の表皮、乳頭層、網状層を含む。器官として、大動脈、脳、脂肪、心臓、腎臓、大腸、肝臓、肺、骨髄、膵臓、皮膚、骨格筋、脾臓、及び胸腺が好ましい。
　RNA-Seq解析は、いわゆるトランスクリプトーム解析と呼ばれる解析であり、対象とするサンプル内に存在するRNAから、網羅的に配列情報を含むリードを取得し、そのリードを参照配列にマッピングし、発現している遺伝子や、そのカウント数（リード数ともいう）を解析する方法である。カウント数が遺伝子発現量に対応する。RNA-Seq解析のカウントデータには、発現している遺伝子の遺伝子名及び／又は遺伝子データベースへの登録番号と、各遺伝子のリードのカウント数を含み得る。
　RNA-Seq解析は、次世代シーケンサー又は第３世代シーケンサーと呼ばれるDNAシーケンサーを用いて行うことができる。次世代シーケンサーとしては、例えば、イルミナ社（サンディエゴ、ＣＡ）のMiSeq9（登録商標）、HiSeq（登録商標）、NextSeq（登録商標）、MiSeq（登録商標）；サーモ・フィッシャー社（ウォルサム、ＭＡ）のIon Proton（登録商標）、Ion PGM（登録商標）；ロシュ社（バーゼル、スイス）のGS FLX +（登録商標）、GS Junior（登録商標）等が挙げられる。第三世代シーケンサーとしては、PacBio Sequel（商標）等が挙げられる。
　scRNA-Seq解析のカウントデータセットは、生物の個々の細胞に発現する遺伝子発現解析、及び／又はコンピュータ解析方法によって予測された遺伝子発現に基づいて生成されたカウントデータのセットである。例えば、scRNA-Seq解析のカウントデータセットは、RNA-Seq解析によって、実際の個々の細胞から取得されたカウントデータであり得る。また、scRNA-Seq解析のカウントデータセットは、例えば、非特許文献６－１９に記載の方法により器官全体からRNA-Seq解析によって取得したカウントデータを、コンピュータ解析方法によって参照細胞構成比率に基づいてデコンボリューション等することにより予測されたカウントデータセットであってもよい。scRNA-Seq解析のカウントデータセットを予測する方法としては、例えば、Complete Deconvolution for Sequencing data（CDSeq）法（非特許文献１９）が好ましい。
１－１－２．各器官に存在する異なる細胞種におけるRNA含有量に基づく重み係数の算出
　解析対象細胞から取得した、又は解析対象細胞について予測されたシングルセルRNA-Seq解析のカウントデータセットに、細胞種ごとの総RNAの含有量に基づいて重み付けするための重み係数の算出方法について説明する。
　はじめに、重み付けをするにあたり、各器官がどのような細胞種から構成されているかの情報を取得する必要がある。各器官の細胞構成は、非特許文献５又は非特許文献２に記載のscRNA-Seqデータや、NIH等に登録されているデータベースから取得することができる。これらの細胞種の構成は、実際に各器官の組織の細胞種の構成を解析して得られた情報である。このような各器官の細胞構成を「参照細胞種」とも呼ぶ。参照細胞種には、通常各細胞種において発現する遺伝子のscRNA-Seqのカウントデータセットが含まれている。また、参照細胞種には、各器官における参照細胞種の構成比率（レファレンスとも呼ぶ）が含まれており、各細胞種の名称、又は略称を示すラベルと紐付いている。
　重み係数の算出において、大動脈、脂肪、腎臓、大腸、肝臓、肺、骨髄、膵臓、皮膚、脾臓、および胸腺については、非特許文献５に記載の各器官における細胞種の構成を参照細胞種及びその構成比率として使用することが好ましい。
　また、骨格筋については、非特許文献２に記載されている細胞種の比率を参照細胞種とその構成比率を使用することが好ましい。
　心臓については、心筋細胞と非筋肉細胞の分離分析に合わせて、非特許文献５に記載されている参照細胞種の構成比率を修正し参照細胞種の構成比率として用いることが好ましい。具体的には、非特許文献５において採用されている心筋細胞の構成比率（3.1％）は、さまざまな過去の研究に基づいて、組織解剖学の分野で一般的にコンセンサスが得られている比率（30％から40％）と比較して、極端に少ない。したがって、本実施例では、心筋細胞の構成比率を30％に設定し、残りの70％を非筋肉細胞種の構成比率で割って、参照細胞種の構成比率とすることが好ましい。
　脳については、NIH（http://www.nervenet.org/papers/BrainRev99.html#Numbers）における報告に基づいて、参照細胞種及びその構成比率を決定することが好ましい。脳内の各細胞種を示すラベルとして、非特許文献５に記載されているscRNA-Seqデータの対応する細胞種ラベルを使用した。はじめに、まず、脳内の細胞種のクラスを「ニューロン」、「グリア細胞」、「内皮細胞」、「その他」の4つのクラスに分類し、それぞれのクラスの比率をそれぞれ75：23：7：4に設定する。この比率は、マウスの脳内の推定比率（http://www.nervenet.org/papers/BrainRev99.html#Numbers）にしたがっている。次に、非特許文献５にしたがって、「ニューロン」、「グリア細胞」、および「その他」をより詳細な細胞種クラスにさらに分類する。具体的には、「ニューロン」のクラスをさらに「神経細胞－興奮性ニューロン、及びいくつかの神経幹細胞」と「神経細胞－抑制性ニューロン」に分類する。「その他」のクラスは、「脳周皮細胞-NA」と「乏突起膠細胞前駆細胞-NA」に分類する。「グリア細胞」のクラスに関しては、次の３つの前提に基づいて分類する。i）「グリア細胞」は、非特許文献５にしたがって、「ミクログリア細胞-NA」、「アストロサイト-NA」、「バーグマングリア細胞-NA」、及び「乏突起膠細胞NA」の4つの細胞種に分類する。ii）これらの4つのグリア細胞種の構成比率は、非特許文献５の記載にしたがう。iii）脳全体の細胞において「ミクログリア細胞」が10－15％を占めると報告されているため、脳全体の「ミクログリア細胞-NA」の比率は0.1とする。これらの前提に基づいて、各脳細胞種の比率は、「マクロファージ－NA」（約0.2％）、「ミクログリア細胞－NA」（10.0％）、「アストロサイト－NA」（約2.2％）、「バーグマングリア細胞－NA」（約2.1％）、「脳周皮細胞－NA」（約1.5%）、「内皮細胞－NA」（約6.4％）、「神経細胞－興奮性ニューロン、及びいくつかの神経幹細胞」（約47.5％）、「神経細胞－抑制性ニューロン」（約21.3％）、「乏突起膠細胞－NA」（約8.7％）、「乏突起膠細胞前駆細胞－NA」（約1.9％）と設定し、これらを脳の参照細胞種及びその構成比率として用いることができる。
　本明細書において使用する参照細胞種、及びその細胞種の構成比率を、本書末尾の参照細胞種の構成比率リストに示す。
　さらに、重み係数を算出するにあたり、上記、参照細胞種の構成比率に加え、各細胞種における遺伝子発現、すなわち各細胞種における、scRNA-Seq解析のカウントデータが必要になる。しかし、一般的にscRNA-Seq解析の対象となっている遺伝子数は2万から3万ある。
　これら全ての遺伝子のカウントデータを使用してもよいが、各細胞種を特徴付けることができる遺伝子（シグネチャ遺伝子）を選択し、これらの遺伝子セットのカウントデータを使って重み係数を算出することが、効率的である。このような各細胞種を特徴付けるシグネチャ遺伝子セットは、例えば次に述べる方法により、算出することができる。
　はじめに、シグネチャ遺伝子を選択するにあたり、scRNA-Seq解析のカウントデータには、ERCCラベルが付されるスパイクイン遺伝子のカウントや、合計カウントに大きく影響するものの、非mRNAアーチファクトとして報告されているRn45s、Akap5、Lrrc17の3つの遺伝子に由来するカウントは削除することが好ましい。また、各遺伝子に由来するRNAカウントは、scRNA-Seqデータセット内の各細胞の総カウントが１００、１０３、１０４、１０５、１０６である場合等に換算し、正規化しておくことが好ましい。
　シグネチャ遺伝子の選択には、例えば、ランダムフォレスト等の人工知能を訓練して生成した分類器を使用することができる。各器官の参照細胞種の構成比率と、各参照細胞種について報告されているscRNA-Seq解析のカウントデータセットを用いて、人工知能を訓練し、分類器を生成する。例えば、人工知能としてランダムフォレストを使用する場合、分類器の重要な特徴量を各細胞種のシグネチャ遺伝子名として抽出し、“Mean Decrease Gini”値を各遺伝子の重要度指標として、“Mean Decrease Gini”値の高い遺伝子を、シグネチャ遺伝子として抽出した。シグネチャ遺伝子は、“Mean Decrease Gini”値が高い方から、１００遺伝子から２０００遺伝子程度を抽出し、シグネチャ遺伝子セットとして使用することができる。
　次に、各器官に存在する各細胞種について、scRNA-Seq解析のカウントデータセットをRNA含有量で補正するための重み係数を算出する。
　重み係数の算出には、各器官について、参照細胞種の各細胞種におけるシグネチャ遺伝子セットのscRNA-Seq解析のカウントデータ（シグネチャ遺伝子scRNA-Seqデータともいう）と、各器官の全体に含まれる全RNAをRNA-Seq解析したカウントデータ（器官全体RNA-Seqデータともいう）を用いることができる。シグネチャ遺伝子scRNA-Seqカウントデータ及び器官全体RNA-Seqカウントデータはとも正規化して用いる。
　器官全体RNA-Seqデータとして、公開されているRNA-Seq解析のカウントデータセットを使用することができる。マウスの器官全体RNA-Seqデータは「i-organs.atr.jp」から取得することができる。ヒト器官全体RNA-Seqデータは「The Human Protein Atlas」（https://www.proteinatlas.org/;心臓（ERR315328）および腎臓（ERR315494））から取得することができる。
　重み係数は、以下の方法にしたがって、算出することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
 は、それぞれ正規化された器官全体RNA-Seq解析のカウントのベクトル、各解析対象細胞j重み係数、及び正規化されたscRNA-Seq解析のカウントの行列を示す。ここで、nはそれぞれの器官のシグネチャ遺伝子の遺伝子数を示す。加えて、解析対象細胞の組み合わせCmは、参照細胞種の構成比率が合計セットサイズm内に保たれるという制限下でランダムに選択する。また、解析対象細胞について予測されたscRNA-Seqのカウントデータセットを用いる場合には、正規化されたscRNA-Seq解析のカウントの行列にかえて、解析対象細胞について予測されたscRNA-Seqのカウントデータの行列を使用する。
　次に下式（１）について説明する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
 　式（１）においてmは倍率を示し、nに依存して決定される。mは、以下の計算のそれぞれにおいて、n未満に設定される。ここでwjは、結果の値が0.01以上であるという制限の下で下式（２）にしたがって、二次計画問題を解くことにより算出する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
 　式（２）において、Sは、器官全体を対象とする各遺伝子のRNA-Seqのカウントデータセットの数を示す。例えば、異なる２個体から取得した対応する器官全体RNA-Seqのカウントデータセットを使用する場合、Sは２である。この二次計画問題は、Rで「quadprog」パッケージを使用して解くことができる。解析対象細胞の組み合わせのランダム選択と
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000004
 の算出の両方の工程はwjの数が100以上になるまで再帰的に行い選択した解析対象細胞すべてについて行う。
１－１－３．scRNA-Seq解析のカウントデータセットの補正
　算出された重み係数を使用し、解析対象細胞から取得した、又は解析対象細胞について予測されたscRNA-Seqのカウントデータセットに、解析対象細胞に対応する細胞種ごとの総RNAの含有量に基づいて重み付けする。
　重み付けは重み係数の分布がガウス分布にしたがうと仮定して、各解析対象細胞の遺伝子の重み付きカウントの平均と分散を下式（３）にしたがって算出する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000005
 　式（３）において、
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000006
 は、それぞれ解析対象細胞jの遺伝子の重み付きカウントベクトル、解析対象細胞jの重み係数の平均値、及び解析対象細胞jの重み係数の分散を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000007
 は、2つのベクトル間の要素ごとの積を表す。
　算出された各解析対象細胞の重み係数の平均と分散に基づいて、対応する細胞種における重み係数の平均と分散がガウス分布にしたがうと仮定して、対応する細胞種における重み係数の平均と分散を下式（４）にしたがって算出する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000008
　式（４）において、k、Ck、及びNkは、それぞれ細胞種、細胞種kにラベルされた解析対象細胞の群、及びCkにおける解析対象細胞の数を示す。
　上記式（２）にしたがって、算出された各器官に存在する細胞種ごとの重み係数の平均値、分散、四分位数を後述する重み係数リストに示す。
　本法によって重み付けされたscRNA-Seq解析のカウントデータセットは、推定scRAN-Seqカウントデータセットともいう。
２．各器官の細胞種の構成比率の解析と前記細胞種における全RNA発現パターンの解析
　上記１－１－２．で算出された重み係数を使用して、解析対象器官を構成する細胞種の構成比率を解析することができる。解析対象器官を構成する細胞種の構成比率の解析は、上記１－１－３．で重み付けされたscRNA-Seq解析のカウントデータセットに基づいて、解析対象細胞を含む解析対象器官を構成する細胞種の構成比率を算出することを含む。言い換えると、この方法によって取得される細胞種の構成比率は、推定された構成比率である。
　また、上記１－１－２．で算出された重み係数を使用して、解析対象器官を構成する細胞種における全RNA発現パターンの解析を行うことができる。全RNA発現パターンの解析は、推定されたscRNA-Seq解析のカウントデータを取得することである。ここで、全RNAとは、シグネチャ遺伝子セット及びそれ以外の遺伝子から発現されるRNAを含むことを意図する。
　例えば、細胞種の構成比率と、各細胞種における全RNAの発現パターンとの解析は、ベイズの定理に基づいたアルゴリズムを設計し、同時に計算することができる。
　計算は下式（５）にしたがうことができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000009
 　式（５）において、
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000010
 は、それぞれ、器官全体RNA-Seq データベクトル、列を各細胞種の重み係数を用いて上記式（４）にしたがって計算した重み付けしたカウントである推定scRNA-Seqデータとする行列、及び細胞種の構成比率に対応する係数ベクトルを示す。上記式（４）にしたがって計算した各細胞種の重み係数で重み付けしたカウントは、初期値であり、後述する式（７）の計算により新たな値に更新される。Xとrの算出には、ベイズの定理を用いる。ベイズの定理を適用するために、
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000011
 を式（５）に加え、下式（６）に示す確率モデルを採用する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000012
 　式（６）において、βは各細胞種の遺伝子発現パターンを推定する際の分布のばらつきの度合いを制御するためのハイパーパラメータを示す。ベイズの定理にしたがって、X 及び r の事後分布を下式（７）として得る。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000013
 　式（７）において、P(X) 及びP(r) は、それぞれX と rの事前分布を示す。そして、P(X) 及びP(r) は、下式（８）及び（９）として与えられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000014
 　式（９）において、αは細胞種の比率を推定する際の分布のばらつきの度合いを制御するハイパーパラメータである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000015
　最初のrとXとして、細胞種の構成比率と式（４）の計算式により重み付けされた参照データセットのカウントを使用する。ハイパーパラメータαとβは、便宜上１０－３、１０－２、…、１０３に設定することができる。実際の器官全体RNA-Seqと高い類似性（高いピアソン相関係数及びスピアマン相関係数を示し、かつ低い平均二乗誤差に基づいて類似性を決定）を生じたシグネチャ遺伝子セット（100から2000遺伝子）ハイパーパラメーター（αおよびβ）の数の組み合わせの結果を最良の推定結果として選択できる。
３．scRNA-Seq解析のカウントデータセットの補正装置、scRNA-Seqの解析装置、及び解析対象器官を構成する細胞種の構成比率の解析装置
３－１．scRNA-Seq解析のカウントデータセットの補正装置
　図１に、scRNA-Seq解析のカウントデータセットの補正装置１０のハードウエアの構成を示す。
　補正装置１０は、汎用コンピュータであり得る。補正装置１０は、入力デバイス１１１と、出力デバイス１１２と、メディアドライブ１１３と通信可能に接続されている。補正装置１０は、ＣＰＵ１０１と、メモリ１０２と、ＲＯＭ（ｒｅａｄ　ｏｎｌｙ　ｍｅｍｏｒｙ）１０３と、記憶デバイス１０４と、通信インタフェース（Ｉ／Ｆ）１０５と、入力インタフェース（Ｉ／Ｆ）１０６と、出力インタフェース（Ｉ／Ｆ）１０７と、メディアインターフェース（Ｉ／Ｆ）１０８とを備える。補正装置１０内の各構成はバス１０９によって互いにデータ通信可能に接続されている。
　記憶デバイス１０４は、ハードディスク、フラッシュメモリ等の半導体メモリ素子、光ディスク等によって構成される。記憶デバイス１０４には、オペレーティングシステム（ＯＳ）１０４１と、後述する補正プログラム１０４２と、アルゴリズムデータベース（ＤＢ）ＤＢ１と、参照細胞種データベース（ＤＢ）ＤＢ２と、器官全体RNA-Seqデータベース（ＤＢ）ＤＢ３が格納されている。補正プログラム１０４２は、オペレーティングシステム１０４１と協働して、コンピュータを補正装置１０として機能させる。
　ＣＰＵ１０１は、本実施形態において制御部１０１とも呼ばれる。
　アルゴリズムデータベースＤＢ１は、上記１－１－３．で述べた補正を行うための数式を格納している。参照細胞種データベースＤＢ２には、各器官に含まれる細胞種を示すラベルと、その構成比率と、各細胞種のscRNA-Seq解析のデータカウントが紐付けられて格納されている。また、参照細胞種データベースＤＢ２には、補正された各細胞種のscRNA-Seq解析のデータカウントが、器官名を示すラベルと、細胞種名を示すラベルと紐付けられて格納される。器官全体RNA-SeqデータベースＤＢ３には、マウス、またはヒトの各器官全体RNA-Seq解析のカウントデータが器官ごとに登録されている。これらのデータは、１－１－２．で述べた公知のデータから生成され格納されている。
　入力デバイス１１１は、タッチパネル、キーボード、マウス、ペンタブレット、マイク等から構成され、補正装置１０に文字入力又は音声入力を行う。入力デバイス１１１は、制御部１０１の外部から接続されても、補正装置１０と一体となっていてもよい。
　出力デバイス１１２は、例えばディスプレイ等の表示デバイス、プリンタ等で構成され、各種操作ウインドウ、解析結果等を出力する。
　メディアドライブ１１３は、ＵＳＢドライブ、フレキシブルディスクドライブ、ＣＤ－ＲＯＭドライブ、又はＤＶＤ－ＲＯＭドライブ等であり得る。
　通信Ｉ／Ｆ１０５は、外部のデータベースや他のコンピュータとの通信を行う。出力Ｉ／Ｆ１０７は、出力デバイス１１２へ情報の送信を行う。
３－２．補正プログラムの処理
　図２に補正プログラム１０４２の処理の流れを示す。
　補正装置１０の制御部１０１は、はじめにオペレータが入力デバイス１１１から入力した処理開始指令を受け付け、処理を開始する。制御部１０１は、ステップＳ１において、上記１－１－２．に記載した方法にしたがって、解析対象器官の各細胞種を特徴付けるシグネチャ遺伝子を選択する。
　次に、制御部１０１は、ステップＳ２において、参照細胞種データベースＤＢ２からステップＳ１において取得したいシグネチャ遺伝子セットのscRNA-Seqカウントデータを取得する。
　次に、制御部１０１は、ステップＳ３において、器官全体RNA-SeqデータベースＤＢ３から、器官全体RNA-Seqカウントデータを取得する。なお、ステップＳ３は、ステップＳ２の前であってもよい。
　次に、制御部１０１は、ステップＳ４において、アルゴリズムデータベースＤＢ１から、上記１－１－２．で述べた式（１）から式（４）を読み出す。読み出した各式に、ステップＳ２で取得したシグネチャ遺伝子セットのscRNA-SeqカウントデータとステップＳ４で取得した器官全体RNA-Seqカウントデータを使用し、上記１－１－２．で説明した式に基づいて各器官に存在する細胞種ごとの重み係数を算出する。制御部１０１は、算出した重み係数をアルゴリズムデータベースＤＢ１に格納する。
　最後に、制御部１０１は、ステップＳ５において、１－１－３．にしたがって細胞種ごとに重み付けしたscRNA-Seq解析のカウントデータセットを取得し、参照細胞種データベースＤＢ２に格納する。
　さらに、制御部１０１は、オペレータが入力デバイス１１１から入力した出力処理開始指令を受信し、出力デバイス１１２から、重み付けしたscRNA-Seq解析のカウントデータセットを出力してもよい。
　この実施形態では、ステップＳ１からＳ５を一台のコンピュータで行う例を示しているが、例えば、ステップＳ１と、ステップＳ２からステップＳ４と、ステップＳ５は、別のコンピュータが行ってもよい。すなわち、第１のコンピュータがステップＳ１にしたがってシグネチャ遺伝子を選択し、第２のコンピュータが第１のコンピュータから各器官に存在する各細胞種のシグネチャ遺伝子セットの情報を取得し、ステップＳ２からステップＳ４の処理を行い、重み係数を算出する。さらに、第３のコンピュータが重み付けされたscRNA-Seq解析のカウントデータセットを取得してもよい。
　さらに、ステップＳ１からステップＳ４を第１のコンピュータが行い、第２のコンピュータがステップＳ５を行ってもよい。
　また、ステップＳ１を第１のコンピュータが行い、第２のコンピュータがステップＳ２からステップＳ５を行ってもよい。
３－３．scRNA-Seqの解析装置、及び解析対象器官を構成する細胞種の構成比率の解析装置
　上記２．において説明したように、scRNA-Seqの解析と解析対象器官を構成する細胞種の構成比率の解析は同時に行うことができる。したがって、解析装置２０は、両方の処理を行う。
　図３に、解析装置２０のハードウエア構成を示す。解析装置２０の構成は、記憶デバイス２０４を除き、基本的には補正装置１０の構成と同じである。記憶デバイス２０４は、補正プログラム１０４２にかえて、後述する解析プログラム２０４２を格納している。さらに、記憶デバイス２０４は、記憶デバイス１０４と同様に、アルゴリズムデータベース（ＤＢ）ＤＢ１と、参照細胞種データベース（ＤＢ）ＤＢ２と、器官全体RNA-Seqデータベース（ＤＢ）ＤＢ３を格納している。
３－４．解析プログラム処理
　図４に、解析プログラム２０４２の処理の流れを示す。
　解析装置２０の制御部２０１は、はじめにオペレータが入力デバイス２１１から入力した処理開始指令を受け付け、処理を開始する。制御部２０１は、スッテプＳ１１において、上記２．において、説明したアルゴリズムを、アルゴリズムデータベースＤＢ１から読み出す。
　次に、制御部２０１は、ステップＳ１３において、器官全体RNA-SeqデータベースＤＢ３から、器官全体RNA-Seqカウントデータを取得する。
　続いて、制御部２０１は、ステップＳ１３において上記３－２．で取得された重み付けしたscRNA-Seq解析のカウントデータセットを参照細胞種データベースＤＢ２から読み出し、アルゴリズムに適用する。
　次に、制御部２０１は、アルゴリズムによって推定された解析対象器官を構成する細胞種の構成比率と、推定されたscRNA-Seq解析のカウントデータを、推定結果として記憶デバイス２０４に記録する。
　制御部２０１は、推定結果について、解析対象器官を構成する細胞種の構成比率のみを出力デバイス２１２から出力してもよく、推定されたscRNA-Seq解析のカウントデータのみを出力デバイス２１２から出力してもよい。また、制御部２０１は、両方の結果を出力デバイス２１２から出力してもよい。
４．コンピュータプログラムを記録した記録媒体
　補正プログラム１０４２及び解析プログラム２０４２は、記録媒体に記録されていてもよい。
　すなわち、各プログラムは、ハードディスク、フラッシュメモリ等の半導体メモリ素子、光ディスク等の記録媒体に記憶される。また各プログラムは、クラウドサーバ等のネットワークで接続可能な記録媒体に記憶されていてもよい。各プログラムは、ダウンロード形式の、又は記録媒体に記録されたプログラム製品として提供されてもよい。
　前記記録媒体へのプログラムの記憶形式は、前記各装置が前記プログラムを読み取り可能である限り制限されない。前記記録媒体への記憶は、不揮発性であることが好ましい。
　以下に実施例を示して、本発明についてより詳細に説明する。しかし、本発明は実施例に限定して解釈されるものではない。
Ｉ．方法
１．参照細胞種の構成比率の計算
　大動脈、脳、脂肪、心臓、腎臓、大腸、肝臓、肺、骨髄、膵臓、皮膚、骨格筋、脾臓、及び胸腺の14種の器官について、非特許文献５に記載のscRNA-Seqデータや、NIH等に登録されているデータベースに基づいて参照細胞種の構成比率を算出した。
　大動脈、脂肪、腎臓、大腸、肝臓、肺、骨髄、膵臓、皮膚、脾臓、および胸腺については、非特許文献５に記載の各器官における細胞種の比率を参照細胞種の構成比率として使用した。
　骨格筋については、非特許文献２に記載されている細胞種の比率を参照細胞種の構成比率として使用した。
　心臓については、心筋と非筋肉細胞の分離分析に合わせて、非特許文献５に記載されている細胞種の構成比率を修正し参照細胞種の構成比率(Referene)とした。具体的には、非特許文献５において採用されている心筋細胞の比率（3.1％）は、さまざまな過去の研究に基づいて、組織解剖学の分野で一般的にコンセンサスが得られている比率（30%から40%）と比較して、極端に少ない。したがって、本実施例では、心筋細胞の比率を30％に設定し、残りの70％を非筋肉細胞種の割合で割って、参照細胞種の構成比率とした。
　脳については、NIH（http://www.nervenet.org/papers/BrainRev99.html#Numbers）における報告に基づいて、参照細胞種の構成比率を決定した。脳内の各細胞種を示すラベルとして、非特許文献５に記載されているscRNA-Seqデータの対応する細胞種ラベルを使用した。はじめに、まず、脳内の細胞種のクラスを「ニューロン」、「グリア細胞」、「内皮細胞」、「その他」の4つのクラスに分類し、それぞれのクラスの比率をそれぞれ75：23：7：4に設定した。この比率は、マウスの脳内の推定比率（http://www.nervenet.org/papers/BrainRev99.html#Numbers）にしたがっている。次に、非特許文献５にしたがって、「ニューロン」、「グリア細胞」、および「その他」をより詳細な細胞種クラスにさらに分類した。具体的には、「ニューロン」のクラスをさらに「神経細胞－興奮性ニューロン、及びいくつかの神経幹細胞」と「神経細胞－抑制性ニューロン」に分類した。「その他」のクラスは、「脳周皮細胞-NA」と「乏突起膠細胞前駆細胞-NA」に分類した。「グリア細胞」のクラスに関しては、次の３つの前提に基づいて分類した。i）「グリア細胞」は、非特許文献５にしたがって、「ミクログリア細胞-NA」、「アストロサイト-NA」、「バーグマングリア細胞-NA」、及び「乏突起膠細胞NA」の4つの細胞種に分類できる。ii）これらの4つのグリア細胞種の比率は、非特許文献５の記載にしたがう。iii）脳全体の細胞において「ミクログリア細胞」が10-15%を占めると報告されているため、脳全体の「ミクログリア細胞-NA」の比率は0.1とする。これらの前提に基づいて、各脳細胞種の比率は、「マクロファージ-NA」（約0.2％）、「ミクログリア細胞-NA」（10.0％）、「アストロサイト-NA」（約2.2％）、「バーグマングリア細胞-NA」（約2.1％）、「脳周皮細胞-NA」（約1.5％）、「内皮細胞-NA」（約6.4％）、「神経細胞－興奮性ニューロン、及びいくつかの神経幹細胞」（約47.5％）、「神経細胞－抑制性ニューロン」（約21.3％）、「乏突起膠細胞-NA」（約8.7％）、「乏突起膠細胞前駆細胞-NA」（約1.9％）と設定し、これらを脳の参照細胞種の構成比率として用いた。ヒトの心臓と腎臓については、参照細胞種の構成比率として、マウスにおける心臓の細胞種の構成比率と腎臓の細胞種の構成比率を使用した。
　各器官の参照細胞種の構成比率は、後述する参照細胞種の構成比率リストに示す。
　また、各参照細胞種の構成比率リストに示される各細胞種については、公知データベースに細胞種ごとのscRNA-Seqのカウントデータが登録されている。
２．データの前処理とRNAカウントの正規化
　すべてのデータ処理と分析は、ソフトウェア「R」　バージョン3.6.1を使用して実行した。すべての細胞種ラベルは、既報のscRNA-Seq研究において付されたラベルと同様とした。scRNA-Seqデータに付されている遺伝子シンボルは、「org.Mm.eg.db」のRパッケージ内の「org.Mm.egALIAS2EG」に由来するentrez遺伝子IDによって各器官全体RNA-Seqデータに対応付け変換された。ERCCラベルが付された遺伝子はスパイクイン遺伝子であるため削除した。さらに、Rn45s、Akap5、Lrrc17の3つの遺伝子に由来するRNAのカウントも、合計カウントに大きく影響する非mRNAアーチファクトであるため削除した。次に、各遺伝子に由来するRNAカウントを、scRNA-Seqデータセット内の各細胞の総カウントが100である場合に換算し、正規化した。この正規化の工程は、器官全体RNA-Seqデータセットに含まれる各RNAについても同様に行った。
３．細胞種の識別のためのシグネチャ遺伝子セットの選択
　ランダムフォレスト（RF）を使用し、前のセッションで説明した参照細胞種の構成比率データセットとscRNA-Seqデータを用いて、各細胞種のシグネチャ遺伝子をコンピュータで選択した。この選択ではRFによる分類器のチューニングと作成にRの「randomForest」パッケージを使用した。scRNA-Seqデータを最初に2分割し、一方をRFによる分類器を作成するためのトレーニングデータとし、もう一方を分類器の精度を検証するためのF1スコア計算用のテストデータとした。前のセッションで説明した細胞種の構成比率を維持したデータセットでRF分析を行った。分類器の生成に続いて、分類器の重要な特徴量を各細胞種のシグネチャ遺伝子名として抽出し、“Mean Decrease Gini”値を各遺伝子の重要度指標として使用した。
４．データベース
　本実施例では、すべて公開データセットを使用した。マウスの器官全体RNA-Seqデータ、及び心筋梗塞モデルマウスの器官全体RNA-Seqは「i-organs.atr.jp」から取得した。ヒト器官全体RNA-Seqデータは「The Human Protein Atlas」（https://www.proteinatlas.org/;心臓（ERR315328）および腎臓（ERR315494））から取得した。scRNA-Seqデータは、非特許文献５（大動脈、脳、脂肪、心臓、腎臓、大腸、肝臓、肺、骨髄、膵臓、皮膚、脾臓、胸腺）、「マウス細胞アトラス」の骨格筋から取得した。
５．推定遺伝子発現変動解析
　予測計算したすべての遺伝子のRNAカウントの合計を100万コピーに正規化した。 各遺伝子の正規化されたカウントを整数に四捨五入し、Rパッケージ「DESeq2（バージョン1.24.0）」を使用して解析した。
ＩＩ．既報の器官全体RNA-Seqデータのデコンボリューション法の性能検証
　はじめに、既報の方法であるMuSiC（非特許文献１７）およびDWLS法（非特許文献１９）について、それぞれの方法によって算出された細胞種の構成比率と、scRNA-Seqデータ及び過去の報告から得られた参照細胞種の構成比率とのサイド・バイ・サイド比較を行い、各デコンボリューション法の性能を検証した。
１．既報の方法による細胞種の構成比率の算出
　MuSiC（非特許文献１７）およびDWLS法（非特許文献１９）は、それぞれの文献にしたがった。DWLS法でquadratic problem solver を行う際にはsolve.QP (R package: quadprog) をsolve_osqp (R package: osqp)に置き換えた。
２．結果
　MuSiC又はDWLS法によって、コンピュータにより算出された各器官の推定した細胞種の構成比率と上記２．において準備した各器官の参照細胞種の構成比率との比較結果を図５及び図６に示す。MuSiC又はDWLS法によって推定された各器官における推定した細胞種の構成比率と参照細胞種の構成比率は乖離しており、また乖離の程度も様々であった。特に、骨格筋、心臓、膵臓、及び肝臓では乖離が顕著であった。
　心臓は、心筋細胞と非筋肉細胞で構成されている。心筋細胞は心臓の最も広い体積を占める。 しかし、細胞数を比較すると、心筋細胞よりも非筋肉細胞の方が多い。この事実に反して、MuSiC又はDWLS法によって計算された心臓の細胞種の組成は、心筋細胞が90％を占めると算出されている。同じ傾向が、骨格筋にも見られた。
　このように、参照細胞種の構成比率と推定した細胞種の構成比率が乖離する原因の1つとして、異なる細胞種間でのトータルRNAの含有量の差が考えられた。トータルRNAの含有量は、50,000 transcripts/cellから300,000 transcripts/cellの範囲で、細胞ごとに異なることが報告されている。心臓では、心筋細胞の体積は、内皮細胞や線維芽細胞などの非筋肉細胞の体積の20倍から25倍といわれている。したがって、細胞あたりのトータルRNAの含有量は、筋肉細胞と非筋肉細胞で大きく異なる可能性がある。実際、この可能性は、MuSiC及びDWLS法では考慮されていない。このような点が、参照と推定した細胞種の構成比率の乖離につながったものと考えられる。
ＩＩＩ．推定器官全体RNA-Seqデータセットと実際の器官全体RNA-Seqデータセットの乖離原因の検証
　参照細胞種の構成比率と推定した細胞種の構成比率の乖離は、器官の全RNAサンプルを抽出した際に器官から採取した組織に含まれている各細胞種間でのトータルRNAの含有量の差が原因であると仮説を立て、実際の遺伝子発現プロファイルと推定遺伝子発現プロファイルを比較することにより、この仮説を検証した。推定器官全体RNA-Seq データは、I.の１で取得した参照細胞種の構成比率にI. の2. で取得したカウントデータをかけ合わせた結果である。
　図７に推定器官全体RNA-Seqデータを示す。推定器官全体RNA-Seqデータは、複数の細胞種から構成される組織について、既知の参照細胞種の構成比率に基づいて重み付けすることにより正規化した遺伝子ごとのトランスクリプトのカウントの合計として算出した。
　図７に示される結果は、RFによって算出された各器官の細胞種を識別するために使用した各器官の各細胞種における上位ランク数に応じたシグネチャ遺伝子のindicated number（遺伝子数）である。上位ランク数は、シグネチャ遺伝子の中の100遺伝子、300遺伝子、2000遺伝子とした。但し、大動脈及び腎臓ではシグネチャ遺伝子の総数が2000に満たないため、大動脈は2000遺伝子ではなく1577遺伝子で、腎臓は1461遺伝子で比較した。14の器官の実際の遺伝子発現プロファイルと推定遺伝子発現プロファイル間の類似性／非類似性は、ピアソン相関係数によって示す。
　図７に示すように、10個の器官（大動脈、脳、心臓、大腸、肝臓、肺、膵臓、皮膚、骨格筋、胸腺）でピアソン相関係数が0.75未満であった。これらの器官では、器官全体RNA-Seqデータを再構成するには、I.の１で取得した参照細胞種の構成比率にI. の2. で取得したカウントデータをかけ合わせただけでは不十分であることを示している。
ＩＶ．データセット間の乖離を解消するための細胞種特異的な重み係数の設定と検証
　各組織に存在する異なる細胞種におけるRNA含有量を補正するための重み係数を算出し、その精度の検証を行った。
１．細胞種特異的係数の算出
　各器官に存在する細胞種ごとの重み係数は、以下の手法にしたがって算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000016
 は、それぞれ正規化された器官全体RNA-Seqカウントのベクトル、各解析対象細胞j重み係数、及び正規化されたscRNA-Seqカウントの行列を示す。ここで、nはそれぞれの器官のシグネチャ遺伝子の遺伝子数を示す。RF解析によって得られた “Mean Decrease Gini”に基づくランキングによって、上位100、300、又は2,000の遺伝子をシグネチャ遺伝子として選択した。RF解析において最大シグネチャ遺伝子数が2000未満の器官については、すべての遺伝子を使用した。加えて、解析対象細胞の組み合わせCmは、参照細胞種の構成比率が合計セットサイズm内に保たれるという制限下でランダムに選択した。
　次に下式（１）について説明する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000017
 　式（１）においてmは倍率を示し、nに依存して決定される。mは、以下の計算のそれぞれにおいて、n未満に設定される。ここでwjは、結果の値が0.01以上であるという制限の下で下式（２）にしたがって、二次計画問題を解くことにより算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000018
 　式（２）において、 Sは、器官全体を対象とする各遺伝子のRNA-Seqのカウントデータセットの数を示す。今回の検討では、異なる２個体から取得した対応する器官全体RNA-Seqのカウントデータセットを使用した。このため、Sは２である。この二次計画問題は、Rで「quadprog」パッケージを使用して解いた。解析対象細胞の組み合わせのランダム選択と
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000019
 の算出の両方の工程はwjの数が100以上になるまで再帰的に行い選択した解析対象細胞すべてについて行った。
　次に、重み係数の分布がガウス分布にしたがうと仮定して、各解析対象細胞の遺伝子の重み付きカウントの平均と分散を下式（３）にしたがって算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000020
 　式（３）において、
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000021
 は、それぞれ解析対象細胞jの遺伝子の重み付きカウントベクトル、解析対象細胞jの重み係数の平均値、及び解析対象細胞jの重み係数の分散を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000022
 は、2つのベクトル間の要素ごとの積を表す。
　算出された各解析対象細胞の重み係数の平均と分散に基づいて、対応する細胞種における重み係数の平均と分散がガウス分布にしたがうと仮定して、対応する細胞種における重み係数の平均と分散を下式（４）にしたがって算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000023
 　式（４）において、k、Ck、及びNk は、それぞれ細胞種、細胞種kにラベルされた解析対象細胞の群、及びCkにおける解析対象細胞の数を示す。
　上記式（２）にしたがって、算出された各器官に存在する細胞種ごとの重み係数、その平均値、分散、四分位数を後述する重み係数リストに示す。
２．結果
　上記計算式（２）により、各細胞種の重み係数及びその範囲が作成された（図８）。筋細胞の重み係数は、心臓と骨格筋の両方で実際に非筋細胞種よりも高くなった（図８）。これらの細胞種特異的な重み係数を使用して、各細胞種のトランスクリプトカウントに重み付けをした。次に、各器官に含まれる各細胞種の参照細胞種の構成比率にしたがって、重み係数により重み付けされたトランスクリプトカウントにさらに各器官における各細胞種の参照細胞種の構成比率を適用し、RNA-Seqデータセットを生成した。この算出方法を推定器官全体RNA-Seq（v-RNA-Seq）と呼び、推定器官全体RNA-Seqで得られたRNA-Seqデータセットを推定器官全体RNA-Seqデータセットと呼ぶ。
　次に、推定器官全体RNA-Seqデータセットと、対応する実際の器官全体RNA-Seqデータセットとを比較した。その結果を図９に示す。図７と比較して、ほとんどの器官において各データセットが示す遺伝子発現プロファイルの乖離が改善された（ピアソン相関係数= 0.8-1.0）。
Ｖ．各器官の細胞種の構成比率の計算と各器官に含まれる全細胞種の全RNA発現パターンの推定
　上記ＩＶ．において算出された細胞種ごとのRNA含有量に基づく特異的重み係数を使用して、ベイズの定理に基づいたアルゴリズムを設計し、各器官に含まれる各細胞種の比率とその各細胞種における遺伝子発現パターンの両方を同時に計算した。
１．細胞種の構成比率と遺伝子発現パターンの計算
　細胞種の構成比率と遺伝子発現パターンの計算は、下式（５）にしたがった。
各細胞種において重み係数によって重み付けされたトランスクリプトカウントの平均と分散を上記式（４）にしたがって算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000024
 　式（５）において、
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000025
 は、それぞれ、器官全体RNA-Seq データベクトル、列を上記式にしたがって計算された各細胞種の重み係数で重み付けしたカウントとする推定scRNA-Seqデータとする行列、及び細胞種の構成比率に対応する係数ベクトルを示す。Xとrの算出には、ベイズの定理を用いた。ベイズの定理を適用するために、
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000026
 を式（５）に加え、下式（６）に示す確率モデルを採用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000027
 　式（６）において、βはハイパーパラメータを示す。ベイズの定理にしたがって、X 及び r の事後分布を下式（７）として得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000028
 　式（７）において、P(X) 及びP(r) は、それぞれX と rの事前分布を示す。そして、P(X) 及びP(r) は、下式（８）及び（９）として与えられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000029
　最初のrとXとして、細胞種の構成比率と式（４）の計算式により重み付けされた参照データセットのカウントを使用した。ハイパーパラメータαと βは、便宜上10-3,10-2,…,103に設定した。実際の器官全体RNA-Seqと高い類似性（高いピアソン相関係数及びスピアマン相関係数を示し、かつ低い平均二乗誤差に基づいて類似性を決定）を生じたシグネチャ遺伝子セット(100, 300, 2,000/1,577/1,461)ハイパーパラメーター（αおよびβ）の数の組み合わせの結果を最良の推定結果として選択した。この計算の概要を図１０に示す。本発明の方法により推定した細胞種の構成比率及び参照細胞種比率との比較結果を図１１及び図１２に示す。また、本発明の方法により推定したscRNA-Seqカウントデータの実際のscRNA-Seqとの比較結果及びt- Distributed Stochastic Neighbor Embedding（t-SNE）の解析結果を図１３及び図１４に示す。
２．細胞種識別の検証
　上記V.１.において算出した推定scRNA-Seqカウントデータが、各器官に存在する細胞種を識別できているか、t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding（t-SNE）を使用して検証した。各器官に存在するそれぞれの細胞種に属する細胞において、合計サンプリングサイズを3,000に設定し、各細胞種のサンプリングされたセルの数と、細胞種kの推定scRNA-Seqカウントデータを、
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000030
 合計サンプリングサイズが3,000に達するまで、このサンプリングプロセスを繰り返した。次に、Rパッケージ「Rtsne」を使用して、parameter perplexity = 50として、サンプリングされた推定scRNA-Seqカウントデータにt-SNEを適用した。
３．結果
　本発明のおいては、2つのハイパーパラメータαとβを定義して、細胞種の比の組み合わせの影響を考慮した。異なる器官レベルの遺伝子発現パターン、例えば正常な器官と病理器官の遺伝子発現パターンは、異なる場合がある。しかし、この違いには、i)各細胞種における遺伝子発現パターンは一見同じままであるにもかかわらず、各細胞種の比率が異なっている場合、ii)細胞種の比率はおなじであるものの、同じ細胞種間で遺伝子発現パターンの違いが生じている場合、が考えられる。また、i)とii)が組み合わされている可能性もある。そこで、αとβの広範な範囲の包括的な組み合わせを評価して、器官レベルのトランスクリプトームの挙動を説明するために、細胞種の組成と各細胞タイプの重み付けトランスクリプトームカウントの最適な組み合わせを算出した。
　この方法により、10の器官（大動脈、脂肪、心臓、腎臓、肝臓、肺、大腸、骨髄、骨格筋、脾臓）の細胞種の構成比率を計算した。この結果を図１１に示す。図５及び図６で使用した14の器官から脳、膵臓、皮膚、胸腺は、次の理由により検討から除外した。1）実際の細胞種の比率が利用可能でない。 2）膵臓は、実際に膵島に由来する。膵島では実際の細胞種の比率を利用できるが、実際の膵臓全体の比率を示すものではない。3）皮膚または胸腺の場合、細胞種と特異的重み係数を利用してもピアソン相関係数が0.8を超えなかった。
　上記10の器官の計算された細胞種の構成比率は、実際のscRNA-Seq研究によって実験的に決定された参照細胞種の構成比率と類似していた（図１１）。特に、MuSiCとDWLS法によって推定される心筋細胞と骨格筋細胞の異常に大きい比率は、それぞれV-scRNA-Seqによって改善された。この結果を図１１に示す。また、図１２に示すように、参照細胞種の構成比率に対する平均二乗誤差（MSE）は、V-scRNA-Seqが5つの実際の臓器（脂肪、心臓、大腸、肝臓、骨格筋）で他の手法を上回った。
　また、推定器官全体RNA-Seqデータセットに含まれる、骨格筋を除く検討した器官のいずれかで発現していた23,131の遺伝子、及び骨格筋の14,323（骨格筋）の遺伝子について本発明の方法に従って、細胞種特異的重み係数及び参照細胞種の構成比率で補正した推定トランスクリプトカウントを計算し、補正した推定トランスクリプトカウントを実際の10の器官内の各細胞種における遺伝子発現と比較した。
　ピアソン相関係数は、推定トランスクリプトカウントは、すべての細胞種と器官について実際のカウントに匹敵することが示された（図１３）。また、異なる器官間で同じもしくは関連する細胞種のアノテーションの類似性と関連性も示された（図１３）。
　10種の器官のすべてのV-scRNASeqデータを用いたt-SNE解析により、各器官のすべてでそれぞれの細胞種が遺伝子発現プロファイルにしたがって分類できることを示していた（図１４）。
VI.疾患における細胞種比と遺伝子発現の変化の計算
　次に、我々の方法が疾患プロセスに伴う各細胞種の細胞種比と遺伝子発現の変化を検出できるかどうかを評価した。心血管疾患は、世界最大の死因である（https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cardiovascular-diseases-(cvds））。心臓病の間の細胞種構成か経時的に変化することを示す報告が存在する。さらに、心臓は、上述したように、以前に公開されたデコンボリューション法ではなく、本発明に係る方法が細胞種の構成比率とその遺伝子発現パターンの両方を効果的に計算できる器官である。したがって、心筋梗塞（MI）のマウスモデルに本発明の方法を適用し、本発明に係る方法が、心臓における細胞種の構成比率と、既に知られているMI時の細胞種依存的な遺伝子発現の経時的変化の両方を検出できるか検討した。
　疾患モデル計算は、はじめに、各ステージ（E、M、L）の正常マウスの同じ参照細胞種の構成比率を使用して、sham心臓の器官全体RNA-Seqデータを使用して重み係数を計算した。次に、sham/ MIモデルの心臓全RNA-Seqデータを使用して、上記のように各段階の細胞種の構成比率と遺伝子発現プロファイルを計算した。
　図１５にその結果を示す。
　心筋梗塞の動物モデルの作製方法は、公知である。心筋梗塞の3つの段階は、以下の通りである。1）冠動脈結紮後1日（E-MI、早期心筋梗塞段階）、2）冠動脈結紮7日後（M-MI、早期線維症段階）、3）冠動脈結紮後8週間（L-MI、心臓リモデリング段階）。 この解析では、shamコントロール（E-sham、M-sham、L-sham）のRNA-Seqデータと正常なマウス心臓の参照細胞種の構成比率を使用して、各細胞種の重み係数を計算した。
　演算により、予想される2つのMIに関連する主要な細胞種構成の変化、具体的には心筋細胞の減少、線維芽細胞の増加が検出された（図１５a）。本方法により、M-MI期に特徴的である筋線維芽細胞の増加が検出された（図１５a）。これは、報告されている実験結果とも一致していた。
　本発明によって、算出された心筋梗塞時の各細胞種における遺伝子発現変化は、以前の実験研究から予想される複数の特徴も検出された（図１５b）。
　心筋細胞では、Nppb遺伝子、Sparc遺伝子、Col4a1遺伝子の統計的に有意な発現上昇（log2倍の変化> 0.7）、及びMyh6遺伝子の発現低下（log2倍の変化<0.7）が検出された（図１５b）。 線維芽細胞では、Col4a1遺伝子、Col1a1遺伝子、及びSparc遺伝子の統計的に有意な発現上昇（log2倍の変化> 0.7）が検出された（図１５b）。ここで、統計学的に有意とは、adjusted p値<0.001を意味する。これらの既知のMI病態におけるランドマーク遺伝子に加えて、本方法により、各細胞種で病態に依存して発現が変動する他の多くの遺伝子が見つかった（図１５b）。
VII．推定ヒトscRNA-Seqの検証
　マウスの重み係数とV-scRNA-Seqをヒト器官全体RNA-Seqデータセットのデコンボリューションへ応用できることを検証した。心臓および腎臓の公的に入手可能なヒト器官全体RNA-Seqデータを使用して、それらの細胞種の構成比率とトランスクリプトームプロファイルを計算した。
　ヒト器官全体RNA-Seqデータセットに格納されている各遺伝子から発現されているRNAの総カウントのそれぞれを、最初に100に正規化した。次に、マウスとヒトの間で共通な名前の遺伝子を抽出することにより、マウスの遺伝子シンボルをヒトのものに一致させた。これらのマウスとヒトの共通の遺伝子セットを使用して、マウスデータセットについて説明した計算手法を適用した。ヒトの心臓および腎臓の器官全体RNA-Seqデータは、「The Human Protein Atlas」（https://www.proteinatlas.org/）から取得した。
　結果を図８に示す。ヒトの心臓および腎臓について計算された細胞種の構成比率が、対応する正常なマウス器官の細胞種の構成比率と同様であることが示された（図１６a）。さらに、ヒトの心臓および腎臓の推定scRNA-Seqデータのt-SNEの解析結果は、各器官における既知の細胞種の遺伝子発現プロファイルに基づく分類が可能であることを示した（図１６b）。 これらの結果は、細胞種特有の重み係数とV-scRNASeqフレームワークの異種間での適用可能性を示している。
<参照細胞種の構成比率リスト>
下記リストは、Organ:Cell type:Abbreviation:Referenceの順に並んでいる。「；」は各細胞種のデータの区切りを意図している。細胞の構成比率は器官全体が「１」となるように正規化している。ここには、代表的な細胞種を示しているため、各器官における各細胞種の構成比率の合計は必ずしも１にはならない。
Aorta:Aorta-endothelial cell-NA:EC :0.40 ;
Aorta:Aorta-erythrocyte-NA:ERC:0.21 ;
Aorta:Aorta-fibroblast-NA:FC :0.22 ;
Aorta:Aorta-professional antigen presenting cell-NA:PAP:0.16 ;
Brain:Brain_Myeloid-macrophage-NA:MAC:0.00 ;
Brain:Brain_Myeloid-microglial cell-NA:MI :0.10 ;
Brain:Brain_Non-Myeloid-astrocyte-NA:AS :0.02 ;
Brain:Brain_Non-Myeloid-Bergmann glial cell-NA:BGC:0.00 ;
Brain:Brain_Non-Myeloid-brain pericyte-NA:BP :0.02 ;
Brain:Brain_Non-Myeloid-endothelial cell-NA:EC :0.06 ;
Brain:Brain_Non-Myeloid-neuron-excitatory neurons and some neuronal stem cells:NEUR2 :0.47 ;
Brain:Brain_Non-Myeloid-neuron-inhibitory neurons:NEUR1 :0.21 ;
Brain:Brain_Non-Myeloid-oligodendrocyte-NA:OLC:0.09 ;
Brain:Brain_Non-Myeloid-oligodendrocyte precursor cell-NA:OPC:0.02 ;
Fat:Fat-B cell-NA:B:0.10 ;
Fat:Fat-endothelial cell-NA:EC :0.16 ;
Fat:Fat-mesenchymal stem cell of adipose-mesenchymal progenitor:MSA:0.43 ;
Fat:Fat-myeloid cell-NA:MYE:0.20 ;
Fat:Fat-NA-NA:NA :0.01 ;
Fat:Fat-natural killer cell-NA:NK :0.01 ;
Fat:Fat-T cell-NA:T:0.08 ;
Heart:Heart-cardiac muscle cell-NA:CM :0.30 ;
Heart:Heart-endocardial cell-NA:ECC:0.02 ;
Heart:Heart-endothelial cell-NA:EC :0.20 ;
Heart:Heart-fibroblast-NA:FC :0.29 ;
Heart:Heart-leukocyte-NA:LEU:0.13 ;
Heart:Heart-myofibroblast cell-NA:MYF:0.05 ;
Heart:Heart-NA-conduction cells:CC :0.01 ;
Heart:Heart-smooth muscle cell-NA:SM :0.01 ;
Kidney:Kidney-endothelial cell-NA:EC :0.19 ;
Kidney:Kidney-epithelial cell of proximal tubule-NA:PT :0.48 ;
Kidney:Kidney-kidney collecting duct epithelial cell-NA:CD :0.22 ;
Kidney:Kidney-leukocyte-NA:LEU:0.02 ;
Kidney:Kidney-macrophage-NA:MAC:0.09 ;
Large Intestine:Large Intestine-Brush cell of epithelium proper of large intestine-Tuft cell:TUF:0.01 ;
Large Intestine:Large Intestine-enterocyte of epithelium of large intestine-Enterocyte (Distal):EN-D :0.06 ;
Large Intestine:Large Intestine-enterocyte of epithelium of large intestine-Enterocyte (Proximal):EN-P :0.21 ;
Large Intestine:Large Intestine-enteroendocrine cell-Chromaffin Cell:CHR:0.01 ;
Large Intestine:Large Intestine-epithelial cell of large intestine-Lgr5- amplifying undifferentiated cell:EP1:0.16 ;
Large Intestine:Large Intestine-epithelial cell of large intestine-Lgr5- undifferentiated cell:EP2:0.10 ;
Large Intestine:Large Intestine-epithelial cell of large intestine-Lgr5+ amplifying undifferentiated cell (Distal):EP3-D:0.03 ;
Large Intestine:Large Intestine-epithelial cell of large intestine-Lgr5+ amplifying undifferentiated cell (Proximal):EP3-P:0.05 ;
Large Intestine:Large Intestine-epithelial cell of large intestine-Lgr5+ undifferentiated cell (Distal):EP4-D:0.08 ;
Large Intestine:Large Intestine-epithelial cell of large intestine-Lgr5+ undifferentiated cell (Proximal):EP4-P:0.12 ;
Large Intestine:Large Intestine-large intestine goblet cell-Goblet cell (Distal):GB1-D:0.09 ;
Large Intestine:Large Intestine-large intestine goblet cell-Goblet cell (Proximal):GB1-P:0.05 ;
Large Intestine:Large Intestine-large intestine goblet cell-Goblet cell, top of crypt (Distal):GB2-D:0.02 ;
Liver:Liver-B cell-NA:B:0.07 ;
Liver:Liver-endothelial cell of hepatic sinusoid-NA:EC :0.33 ;
Liver:Liver-hepatocyte-NA:HE :0.42 ;
Liver:Liver-Kupffer cell-NA:KUP:0.11 ;
Liver:Liver-natural killer cell-NK/NKT cells:NK2:0.07 ;
Lung:Lung-B cell-NA:B:0.02 ;
Lung:Lung-ciliated columnar cell of tracheobronchial tree-multiciliated cells:CCC:0.01 ;
Lung:Lung-classical monocyte-invading monocytes:CMN:0.07 ;
Lung:Lung-epithelial cell of lung-alveolar epithelial type 1 cells, alveolar epithelial type 2 cells, club cells, and basal cells:EP5:0.06 ;
Lung:Lung-leukocyte-mast cells and unknown immune cells:LEU2 :0.02 ;
Lung:Lung-lung endothelial cell-NA:EC :0.34 ;
Lung:Lung-monocyte-circulating monocytes:MN2:0.07 ;
Lung:Lung-myeloid cell-dendritic cells, alveolar macrophages, and interstital macrophages:MYE2 :0.01 ;
Lung:Lung-NA-lung neuroendocrine cells and unknown cells:NC :0.03 ;
Lung:Lung-natural killer cell-NA:NK :0.02 ;
Lung:Lung-stromal cell-NA:SC :0.33 ;
Lung:Lung-T cell-NA:T:0.03 ;
Marrow:Marrow-B cell-Cd3e+ Klrb1+ B cell:B2 :0.01 ;
Marrow:Marrow-basophil-NA:BAS:0.00 ;
Marrow:Marrow-common lymphoid progenitor-NA:CLP:0.04 ;
Marrow:Marrow-granulocyte-NA:GRA:0.16 ;
Marrow:Marrow-granulocyte monocyte progenitor cell-NA:GMP:0.02 ;
Marrow:Marrow-granulocytopoietic cell-NA:GC :0.05 ;
Marrow:Marrow-hematopoietic precursor cell-NA:HPC:0.08 ;
Marrow:Marrow-immature B cell-NA:IB :0.06 ;
Marrow:Marrow-immature natural killer cell-NA:INK:0.01 ;
Marrow:Marrow-immature NK T cell-NA:INKT :0.01 ;
Marrow:Marrow-immature T cell-NA:IT :0.02 ;
Marrow:Marrow-late pro-B cell-Dntt- late pro-B cell:LPB1 :0.04 ;
Marrow:Marrow-late pro-B cell-Dntt+ late pro-B cell:LPB2 :0.03 ;
Marrow:Marrow-macrophage-NA:MAC:0.03 ;
Marrow:Marrow-mature natural killer cell-NA:MNT:0.01 ;
Marrow:Marrow-megakaryocyte-erythroid progenitor cell-NA:EPC:0.01 ;
Marrow:Marrow-monocyte-NA:MN :0.04 ;
Marrow:Marrow-naive B cell-NA:NBC:0.12 ;
Marrow:Marrow-pre-natural killer cell-NA:PNK:0.00 ;
Marrow:Marrow-precursor B cell-pre-B cell (Philadelphia nomenclature):PB :0.11 ;
Marrow:Marrow-regulatory T cell-NA:RT :0.00 ;
Marrow:Marrow-Slamf1-negative multipotent progenitor cell-NA:MPC1 :0.10 ;
Marrow:Marrow-Slamf1-positive multipotent progenitor cell-NA:MPC2 :0.04 ;
SkMuscle:B cell_Jchain high(Muscle):B3 :0.02 ;
SkMuscle:B cell_Vpreb3 high(Muscle):B4 :0.09 ;
SkMuscle:Dendritic cell(Muscle):DEN:0.01 ;
SkMuscle:Endothelial cell(Muscle):EC :0.02 ;
SkMuscle:Erythroblast_Car1 high(Muscle):ERB1 :0.03 ;
SkMuscle:Erythroblast_Car2 high(Muscle):ERB2 :0.16 ;
SkMuscle:Granulocyte monocyte progenitor cell(Muscle):GMP:0.08 ;
SkMuscle:Macrophage_Ms4a6c high(Muscle):MAC2 :0.13 ;
SkMuscle:Macrophage_Retnla high(Muscle):MAC3 :0.02 ;
SkMuscle:Muscle cell_Tnnc1 high(Muscle):MC1:0.01 ;
SkMuscle:Muscle cell_Tnnc2 high(Muscle):MC2:0.03 ;
SkMuscle:Muscle progenitor cell(Muscle):MPC:0.08 ;
SkMuscle:Neutrophil_Camp high(Muscle):NEUT1 :0.16 ;
SkMuscle:Neutrophil_Prg2 high(Muscle):NEUT2 :0.01 ;
SkMuscle:Neutrophil_Retnlg high(Muscle):NEUT3 :0.12 ;
SkMuscle:Stromal cell(Muscle):SC :0.02 ;
SkMuscle:T cell(Muscle):T:0.01 ;
Pancreas:Pancreas-endothelial cell-NA:EC :0.06 ;
Pancreas:Pancreas-leukocyte-NA:LEU:0.04 ;
Pancreas:Pancreas-pancreatic A cell-pancreatic A cell:A:0.24 ;
Pancreas:Pancreas-pancreatic acinar cell-acinar cell:ACI:0.10 ;
Pancreas:Pancreas-pancreatic D cell-pancreatic D cell:D:0.11 ;
Pancreas:Pancreas-pancreatic ductal cell-ductal cell:DUC:0.12 ;
Pancreas:Pancreas-pancreatic PP cell-pancreatic PP cell:PP :0.05 ;
Pancreas:Pancreas-pancreatic stellate cell-stellate cell:PSC:0.04 ;
Pancreas:Pancreas-type B pancreatic cell-beta cell:BC :0.22 ;
Skin:Skin-basal cell of epidermis-Basal IFE:BE:0.22 ;
Skin:Skin-epidermal cell-Intermediate IFE:EPI :0.12 ;
Skin:Skin-keratinocyte stem cell-Inner Bulge:KSC:0.26 ;
Skin:Skin-keratinocyte stem cell-Outer Bulge:KSC2:0.37 ;
Skin:Skin-leukocyte-NA:LEU:0.01 ;
Skin:Skin-stem cell of epidermis-Replicating Basal IFE:SCE:0.02 ;
Spleen:Spleen-B cell-NA:B:0.77 ;
Spleen:Spleen-macrophage-NA:MAC:0.03 ;
Spleen:Spleen-T cell-NA:T:0.20 ;
Thymus:Thymus-DN1 thymic pro-T cell-DN1 thymocytes:TPT:0.01 ;
Thymus:Thymus-immature T cell-DN4-DP in transition Cd69 negative rapidly dividing thymocytes:IT3:0.15 ;
Thymus:Thymus-immature T cell-DN4-DP in transition Cd69 negative thymocytes:IT2:0.44 ;
Thymus:Thymus-immature T cell-DN4-DP in transition Cd69 positive thymocytes:IT4:0.37 ;
Thymus:Thymus-leukocyte-antigen presenting cell:LEU3:0.02
<参照細胞種の構成比率リスト>
下記リストは、Organ:Singnature.gene.set.number:Cell.type:mean:var:min:first_quantile:Median:third_quantile:maxの順に並んでいる。「；」は各細胞種のデータの区切りを意図している。
Aorta:100:EC :0.151788089:0.320824524:0.01:0.01:0.01:0.020643025:4.333799883;
Aorta:100:ERC:24.67386955:27569.49096:0.01:0.268057658:0.947630617:4.647035248:1361.854647;
Aorta:100:FC :1.120387302:7.507603394:0.01:0.014564004:0.061908957:0.516121627:12.41886869;
Aorta:100:PAP:0.124841086:0.130858196:0.01:0.01:0.01211706:0.032624313:1.661400716;
Aorta:300:EC :0.335653916:0.888982181:0.01:0.01:0.01:0.10214728:5.784560681;
Aorta:300:ERC:20.7856725:15487.87723:0.01:0.132647672:0.943529224:3.121387266:1008.048707;
Aorta:300:FC :1.122992247:3.637888239:0.01:0.103255397:0.318573613:1.121704441:9.938671176;
Aorta:300:PAP:0.16699144:0.283733571:0.01:0.01:0.014927526:0.085629113:3.587288911;
Aorta:1577:EC :0.328052831:2.980101375:0.01:0.01:0.01:0.01:12.65695793;
Aorta:1577:ERC:0.861381942:10.22004111:0.01:0.01:0.01:0.189752138:24.51986069;
Aorta:1577:FC :1.157779979:11.62919843:0.01:0.01:0.011244537:0.227616723:17.14421124;
Aorta:1577:PAP:0.236296791:0.806728782:0.01:0.01:0.01:0.01:4.644598908;
Brain:100:AS :0.434856565:2.615451954:0.01:0.022455987:0.046046996:0.12257169:18.38001032;
Brain:100:BGC:1.072299836:4.247525505:0.052380374:0.193697173:0.441824763:0.815423538:9.813487019;
Brain:100:BP :1.286448516:7.416001166:0.01:0.149224444:0.442108329:1.349882731:20.55492602;
Brain:100:EC :0.155829289:2.482545762:0.01:0.011392245:0.018610335:0.058316551:33.77084044;
Brain:100:MAC:0.048124031:0.004108694:0.01:0.013496606:0.023131426:0.063089991:0.377400612;
Brain:100:MI :0.012961869:2.3118E-05:0.01:0.010033301:0.011173433:0.013679577:0.064623845;
Brain:100:NEUR1 :2.653825355:114.4922959:0.01:0.014365065:0.065192324:0.488780763:74.1873715;
Brain:100:NEUR2 :1.516349011:26.86180756:0.01:0.017777754:0.088547977:0.515962167:38.7956663;
Brain:100:OLC:1.47033239:789.3444746:0.01:0.043020985:0.137535878:0.575570849:1014.927739;
Brain:100:OPC:1.384613588:14.07919044:0.01:0.012646413:0.040728358:0.702904737:25.50241672;
Brain:300:AS :1.74038249:13.24520375:0.01:0.015261047:0.195577225:1.884738702:41.41426285;
Brain:300:BGC:1.341778577:3.944690072:0.045824361:0.224444365:0.549709956:1.458466949:8.815660456;
Brain:300:BP :1.749492174:12.04296246:0.01:0.014499893:0.199956059:1.774169825:17.37539007;
Brain:300:EC :0.205803506:0.364383999:0.01:0.01:0.010304075:0.054289482:7.530690763;
Brain:300:MAC:0.010347881:4.91595E-06:0.01:0.01:0.01:0.01:0.024372891;
Brain:300:MI :0.010016051:1.25293E-07:0.01:0.01:0.01:0.01:0.02439228;
Brain:300:NEUR1 :0.091026428:0.378856142:0.01:0.01:0.01:0.01:5.354404503;
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Spleen:100:MAC:0.033677171:0.000928003:0.01:0.01052609:0.019320469:0.044604965:0.119540695;
Spleen:100:T:0.889478679:2.626844949:0.01:0.028523727:0.229516685:1.134817519:11.21089027;
Spleen:300:B:0.6007074:5.718042953:0.009999997:0.01:0.01:0.014069245:24.35418936;
Spleen:300:MAC:0.110306986:0.104400051:0.01:0.01:0.01:0.017623009:1.695440132;
Spleen:300:T:1.193135349:9.943389873:0.01:0.01:0.01:0.306849232:26.93225583;
Spleen:2000:B:0.527834996:2.847863632:0.01:0.01:0.01:0.026519544:14.2891133;
Spleen:2000:MAC:0.028947532:0.008489124:0.01:0.01:0.01:0.01:0.526640415;
Spleen:2000:T:0.902514553:4.96652535:0.01:0.01:0.01:0.263963255:13.63243794;
Thymus:100:IT2:0.892838408:8.146903544:0.01:0.01:0.01:0.187870672:27.72681703;
Thymus:100:IT3:1.517353985:8.980022847:0.01:0.01:0.087409456:1.088970761:12.81068485;
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Thymus:100:LEU3:0.075703947:0.050678587:0.01:0.01:0.01:0.010156311:0.855605674;
Thymus:100:TPT:0.603227667:0.873439087:0.01:0.02145553:0.26503743:0.596217908:2.432418181;
Thymus:300:IT2:0.569771808:9.930095561:0.01:0.01:0.01:0.01:31.00492796;
Thymus:300:IT3:1.539814872:17.40773119:0.01:0.01:0.01:0.178454647:21.665993;
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Thymus:300:TPT:0.01:5.05421E-28:0.01:0.01:0.01:0.01:0.01;
Thymus:2000:IT2:0.461222048:2.278633079:0.01:0.01:0.01:0.015257748:11.52396779;
Thymus:2000:IT3:1.632787561:11.73465067:0.01:0.01:0.032282811:1.271299967:19.54368881;
Thymus:2000:IT4:0.249174221:1.215448065:0.01:0.01:0.01:0.01:7.965207557;
Thymus:2000:LEU3:1.037253207:2.514034235:0.01:0.04187717:0.257041468:0.893381107:4.991732332;
Thymus:2000:TPT:0.011241477:9.2476E-06:0.01:0.01:0.01:0.01:0.017448864;
１０　補正装置
１０１　制御部
２０　解析装置
２０１　制御部

Claims (10)

  1. 　解析対象細胞から取得した、又は解析対象細胞について予測されたシングルセルRNA-Seq解析のカウントデータセットに、前記解析対象細胞に対応する細胞種ごとの総RNAの含有量に基づいて重み付けすること、を含むシングルセルRNA-Seq解析のカウントデータセットの補正方法。
  2. 　前記重み付けが、各細胞種を特徴付けるシグネチャ遺伝子セットの発現に基づいて行われ、前記シグネチャ遺伝子セットは、所定数の遺伝子数を含む、請求項１に記載の補正方法。
  3. 　解析対象細胞から取得した、又は解析対象細胞について予測されたシングルセルRNA-Seq解析のカウントデータセットに、前記解析対象細胞に対応する細胞種ごとの総RNAの含有量に基づいて重み付けすることと、
    　重み付けされたシングルセルRNA-Seq解析のカウントデータセットに基づいて、解析対象細胞を含む解析対象器官を構成する各細胞種におけるRNAの発現パターンを解析すること、
    と含む、シングルセルRNA-Seqの解析方法。
  4. 　解析対象細胞から取得した、又は解析対象細胞について予測されたシングルセルRNA-Seq解析のカウントデータセットに、前記解析対象細胞に対応する細胞種ごとの総RNAの含有量に基づいて重み付けすることと、
    　重み付けされたシングルセルRNA-Seq解析のカウントデータセットに基づいて、解析対象細胞を含む解析対象器官を構成する細胞種の構成比率を解析することを含む、
    解析対象器官を構成する細胞種の構成比率の解析方法。
  5. 　シングルセルRNA-Seq解析のカウントデータセットの補正装置であって、
    　前記補正装置は、制御部を備え、
    　　前記制御部は、
    　　解析対象細胞から取得したシングルセルRNA-Seq解析のカウントデータセットに、前記解析対象細胞に対応する細胞種ごとの総RNAの含有量に基づいて重み付けする、
    前記補正装置。
  6. 　シングルセルRNA-Seqの解析装置であって、
    　前記解析装置は、制御部を備え、
    　　前記制御部は、
    　　解析対象細胞から取得した、又は解析対象細胞について予測されたシングルセルRNA-Seq解析のカウントデータセットに、前記解析対象細胞に対応する細胞種ごとの総RNAの含有量に基づいて重み付けし、
    　　重み付けされたシングルセルRNA-Seq解析のカウントデータセットに基づいて、解析対象細胞を含む解析対象器官を構成する各細胞種におけるRNAの発現パターンを解析する、
    前記解析装置。
  7. 　解析対象器官を構成する細胞種の構成比率の解析装置であって、
    　前記解析装置は、制御部を備え、
    　　前記制御部は、
    　　解析対象細胞から取得した、又は解析対象細胞について予測されたシングルセルRNA-Seq解析のカウントデータセットに、前記解析対象細胞に対応する細胞種ごとの総RNAの含有量に基づいて重み付けし、
    　　重み付けされたシングルセルRNA-Seq解析のカウントデータセットに基づいて、解析対象細胞を含む解析対象器官を構成する細胞種の構成比率を解析する、
    前記解析装置。
  8. 　コンピュータに実行させた時に、
    　コンピュータに、
    　解析対象細胞から取得した、又は解析対象細胞について予測されたシングルセルRNA-Seq解析のカウントデータセットに、前記解析対象細胞に対応する細胞種ごとの総RNAの含有量に基づいて重み付けするステップを備える処理を実行させる、シングルセルRNA-Seq解析のカウントデータセットの補正プログラム。
  9. 　コンピュータに実行させた時に、
    　コンピュータに、
    　解析対象細胞から取得した、又は解析対象細胞について予測されたシングルセルRNA-Seq解析のカウントデータセットに、前記解析対象細胞に対応する細胞種ごとの総RNAの含有量に基づいて重み付けするステップと、
    　重み付けされたシングルセルRNA-Seq解析のカウントデータセットに基づいて、解析対象細胞を含む解析対象器官を構成する各細胞種におけるRNAの発現パターンを解析するステップと、
    を備える処理を実行させる、シングルセルRNA-Seqの解析プログラム。
  10. 　コンピュータに実行させた時に、
    　コンピュータに、
    　解析対象細胞から取得した、又は解析対象細胞について予測されたシングルセルRNA-Seq解析のカウントデータセットに、前記解析対象細胞に対応する細胞種ごとの総RNAの含有量に基づいて重み付けするステップと、
    　重み付けされたシングルセルRNA-Seq解析のカウントデータセットに基づいて、解析対象細胞を含む解析対象器官を構成する細胞種の構成比率を解析するステップと、
    を備える処理を実行させる、解析対象器官を構成する細胞種の構成比率の解析プログラム。
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