WO2021167029A1 - 架橋型ヌクレオシドおよびそれを用いたヌクレオチド - Google Patents

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卓男 山口
飛々暉 小峯
隆也 杉浦
井上　貴雄
徳幸 吉田
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National Institute of Health Sciences
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Definitions

  • the present invention relates to a crosslinked nucleoside and a nucleotide using the same. More specifically, the present invention relates to a crosslinked nucleoside having good nuclease resistance and which can be efficiently produced, and a nucleotide using the same.
  • an artificial nucleic acid in which a substituent such as a methyl group or a methoxymethyl group is introduced at the 6'position of 2'and 4'-BNA improves the binding affinity for ssRNA and has excellent enzyme resistance. It has been reported (Non-Patent Document 4). However, when these substituents are introduced at the 6'position, isomers may be generated, which requires a complicated separation operation.
  • an artificial nucleic acid in which a cyclopropyl group is introduced at the 6'position can be synthesized by a synthetic pathway that does not require separation of isomers, and has high enzyme resistance while maintaining high binding affinity for ssRNA.
  • Patent Document 1 and Non-Patent Document 5 it cannot be said that the yields of various products obtained in the synthetic pathway of scpBNA are sufficiently satisfactory. It is desired to develop an artificial nucleic acid that can be synthesized in a higher yield that can meet industrial applications.
  • the present invention solves the above-mentioned problems, and an object of the present invention is that a substituent is introduced at the 6'position, which does not require complicated operations such as isomer separation and is higher. It is an object of the present invention to provide a crosslinked nucleoside that can be produced in a yield and a nucleotide using the same.
  • the present invention describes the compound represented by the following formula (I) or a salt thereof:
  • Base represents a purine-9-yl group or 2-oxo-1,2-dihydropyrimidine-1-yl group which may have one or more of any substituents selected from the ⁇ group, where here.
  • the ⁇ group is protected by a hydroxyl group, a hydroxyl group protected by a protective group for nucleic acid synthesis, a linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a linear alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, a mercapto group, and a protective group for nucleic acid synthesis.
  • R 2 and R 3 independently form a hydrogen atom, a protective group for a hydroxyl group in nucleic acid synthesis, an alkyl group having 1 to 7 carbon atoms which may form a branch or a ring, a branch or a ring, respectively.
  • R 4a and R 5a are independently hydroxyl groups, respectively.
  • X 1 is a linear alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, -NHR 4b [where R 4b is a hydrogen atom or a linear alkyl group having 1 to 3 carbon atoms], or -OR 5b [here. R 5b is a hydrogen atom or a linear alkyl group having 1 to 3 carbon atoms], an alkylene group having 2 to 8 carbon atoms; or a linear alkyl group having 1 to 3 carbon atoms. Or -NHR 4b [where R 4b is a hydrogen atom or a linear alkyl group having 1 to 3 carbon atoms] or -OR 5b [where R 5b is a hydrogen atom or a linear alkyl group having 1 to 3 carbon atoms].
  • X 2 is an oxygen atom, a sulfur atom, -NH-, -N (CH 3 )-. Or it is a methylene group).
  • Base represents a purine-9-yl group or 2-oxo-1,2-dihydropyrimidine-1-yl group which may have one or more of any substituents selected from the ⁇ group, where here.
  • the ⁇ group is protected by a hydroxyl group, a hydroxyl group protected by a protective group for nucleic acid synthesis, a linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a linear alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, a mercapto group, and a protective group for nucleic acid synthesis.
  • R 2 and R 3 independently form a hydrogen atom, a protective group for a hydroxyl group in nucleic acid synthesis, an alkyl group having 1 to 7 carbon atoms which may form a branch or a ring, a branch or a ring, respectively.
  • R 4a and R 5a are independently hydroxyl groups, respectively.
  • X 2 is an oxygen atom, a sulfur atom, -NH-, -N (CH 3 )-or a methylene group, and R 6 , R 7 , R 8 , R 9 , R 10 and R 11 are independent of each other. , Hydrogen atom, linear alkyl group with 1 to 3 carbon atoms, -NHR 4b [where R 4b is a hydrogen atom or linear alkyl group with 1 to 3 carbon atoms], or -OR 5b [here, R 5b is a hydrogen atom or a linear alkyl group having 1 to 3 carbon atoms].
  • Base represents a purine-9-yl group or 2-oxo-1,2-dihydropyrimidine-1-yl group which may have one or more of any substituents selected from the ⁇ group, where here.
  • the ⁇ group is protected by a hydroxyl group, a hydroxyl group protected by a protective group for nucleic acid synthesis, a linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a linear alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, a mercapto group, and a protective group for nucleic acid synthesis.
  • R 2 and R 3 independently form a hydrogen atom, a protective group for a hydroxyl group in nucleic acid synthesis, an alkyl group having 1 to 7 carbon atoms which may form a branch or a ring, a branch or a ring, respectively.
  • R 4a and R 5a are independently hydroxyl groups, respectively.
  • X 2 is an oxygen atom, a sulfur atom, -NH-, -N (CH 3 )-or a methylene group
  • R 6 and R 7 are independent hydrogen atoms, linear chains having 1 to 3 carbon atoms, respectively.
  • Alkyl group, -NHR 4b [where R 4b is a hydrogen atom or a linear alkyl group having 1 to 3 carbon atoms]
  • -OR 5b [where R 5b is a hydrogen atom or a linear alkyl group having 1 to 3 carbon atoms. It is a straight chain alkyl group]).
  • the Base is a 6-aminopurine-9-yl group, a 2,6-diaminopurine-9-yl group, a 2-amino-6-chloropurine-9-.
  • Il group 2-amino-6-fluoropurine-9-yl group, 2-amino-6-bromopurine-9-yl group, 2-amino-6-hydroxypurine-9-yl group, 6-amino-2 -Methoxypurine-9-yl group, 6-amino-2-chloropurine-9-yl group, 6-amino-2-fluoropurine-9-yl group, 2,6-dimethoxypurin-9-yl group, 2 , 6-Dichloropurine-9-yl group, 6-mercaptopurine-9-yl group, 2-oxo-4-amino-1,2-dihydropyrimidine-1-yl group, 4-amino-2-oxo-5 -Fluoro-1,2-dihydr
  • the above Base is the following formula:
  • the present invention also includes an oligonucleotide containing at least one nucleoside structure represented by the following formula (II) or a pharmacologically acceptable salt thereof:
  • Base represents a purine-9-yl group or 2-oxo-1,2-dihydropyrimidine-1-yl group which may have one or more of any substituents selected from the ⁇ group, where here.
  • the ⁇ group is protected by a hydroxyl group, a hydroxyl group protected by a protective group for nucleic acid synthesis, a linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a linear alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, a mercapto group, and a protective group for nucleic acid synthesis.
  • X 1 is a linear alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, -NHR 4b [where R 4b is a hydrogen atom or a linear alkyl group having 1 to 3 carbon atoms], or -OR 5b [here.
  • R 5b is a hydrogen atom or a linear alkyl group having 1 to 3 carbon atoms], an alkylene group having 2 to 8 carbon atoms; or a linear alkyl group having 1 to 3 carbon atoms.
  • -NHR 4b [where R 4b is a hydrogen atom or a linear alkyl group having 1 to 3 carbon atoms] or -OR 5b [where R 5b is a hydrogen atom or a linear alkyl group having 1 to 3 carbon atoms]. It is an alkaneylene group having 2 to 8 carbon atoms, which may be substituted with], and X 2 is an oxygen atom, a sulfur atom, -NH-, -N (CH 3 )-. Or it is a methylene group).
  • equation (II) is the following equation:
  • Base represents a purine-9-yl group or 2-oxo-1,2-dihydropyrimidine-1-yl group which may have one or more of any substituents selected from the ⁇ group, where here.
  • the ⁇ group is protected by a hydroxyl group, a hydroxyl group protected by a protective group for nucleic acid synthesis, a linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a linear alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, a mercapto group, and a protective group for nucleic acid synthesis.
  • X 2 is an oxygen atom, a sulfur atom, -NH-, -N (CH 3 )-or a methylene group, and R 6 , R 7 , R 8 , R 9 , R 10 and R 11 are independent of each other.
  • Hydrogen atom linear alkyl group with 1 to 3 carbon atoms, -NHR 4 [where R 4 is a hydrogen atom or linear alkyl group with 1 to 3 carbon atoms], or -OR 5 [here, R 5 is a hydrogen atom or a linear alkyl group having 1 to 3 carbon atoms].
  • equation (II) is the following equation:
  • Base represents a purine-9-yl group or 2-oxo-1,2-dihydropyrimidine-1-yl group which may have one or more of any substituents selected from the ⁇ group, where here.
  • the ⁇ group is protected by a hydroxyl group, a hydroxyl group protected by a protective group for nucleic acid synthesis, a linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a linear alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, a mercapto group, and a protective group for nucleic acid synthesis.
  • X 2 is an oxygen atom, a sulfur atom, -NH-, -N (CH 3 )-or a methylene group, and R 6 and R 7 are independent hydrogen atoms, linear chains having 1 to 3 carbon atoms, respectively.
  • the present invention is also a method for producing the above-mentioned oligonucleotide or a pharmacologically acceptable salt thereof.
  • Base represents a purine-9-yl group or 2-oxo-1,2-dihydropyrimidine-1-yl group which may have one or more of any substituents selected from the ⁇ group, where here.
  • the ⁇ group is protected by a hydroxyl group, a hydroxyl group protected by a protective group for nucleic acid synthesis, a linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a linear alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, a mercapto group, and a protective group for nucleic acid synthesis.
  • R 2 and R 3 independently form a hydrogen atom, a protective group for a hydroxyl group in nucleic acid synthesis, an alkyl group having 1 to 7 carbon atoms which may form a branch or a ring, a branch or a ring, respectively.
  • R 4a and R 5a are independently hydroxyl groups, respectively.
  • X 1 is a linear alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, -NHR 4b [where R 4b is a hydrogen atom or a linear alkyl group having 1 to 3 carbon atoms], or -OR 5b [here. R 5b is a hydrogen atom or a linear alkyl group having 1 to 3 carbon atoms], an alkylene group having 2 to 8 carbon atoms; or a linear alkyl group having 1 to 3 carbon atoms. Or -NHR 4b [where R 4b is a hydrogen atom or a linear alkyl group having 1 to 3 carbon atoms] or -OR 5b [where R 5b is a hydrogen atom or a linear alkyl group having 1 to 3 carbon atoms].
  • a novel crosslinked nucleoside modified at the 6'position having a high binding affinity for ssRNA and high enzyme resistance and a nucleotide using the same are provided. Since the crosslinked nucleoside of the present invention does not require an isomer separation step in its production, it is also excellent in industrial productivity.
  • linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms refers to any linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, specifically, a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, and the like. Refers to an n-butyl group, an n-pentyl group, and an n-hexyl group.
  • linear alkyl group having 1 to 3 carbon atoms refers to any linear alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, and specifically refers to a methyl group, an ethyl group, or an n-propyl group.
  • alkyl group having 1 to 6 carbon atoms refers to any linear, branched chain or cyclic alkyl group having 1 to 6 carbon atoms.
  • linear alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms includes an alkoxy group having an arbitrary linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms.
  • a methoxy group, an ethoxy group, an n-propoxy group and the like can be mentioned.
  • alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms refers to any linear, branched chain or cyclic alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms.
  • linear alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms which may be substituted with a linear alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms
  • linear alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms the above-mentioned “linear alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms”
  • one or more hydrogen atoms constituting the "linear alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms” are replaced with another "linear alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms" which may be the same or different. Alkoxy group.
  • Examples of such a "linear alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms which may be substituted with a linear alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms" include a methoxy group, an ethoxy group, an n-propoxy group, and a methoxymethoxy group. , Ethoxymethoxy group, n-propoxymethoxy group, methoxyethoxy group (for example, 2-methoxyethoxy group), ethoxyethoxy group (for example, 2-ethoxyethoxy group), and n-propoxyethoxy group.
  • cyanoalkoxy group having 1 to 6 carbon atoms is used in which at least one hydrogen atom in any linear, branched or cyclic alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms is substituted with a cyano group. Refers to the group.
  • linear alkylthio group having 1 to 6 carbon atoms includes an alkylthio group having an arbitrary linear alkylthio group having 1 to 6 carbon atoms.
  • a methylthio group, an ethylthio group, an n-propylthio group and the like can be mentioned.
  • alkylthio group having 1 to 6 carbon atoms refers to any linear, branched chain or cyclic alkylthio group having 1 to 6 carbon atoms.
  • linear alkylamino group having 1 to 6 carbon atoms includes an alkylamino group having one or two alkylamino groups having any linear alkylamino group having 1 to 6 carbon atoms. do.
  • a methylamino group, a dimethylamino group, an ethylamino group, a methylethylamino group, a diethylamino group and the like can be mentioned.
  • alkyl group having 1 to 7 carbon atoms which may form a branch or a ring is an arbitrary linear alkyl group having 1 to 7 carbon atoms and any branching having 3 to 7 carbon atoms. It includes a chain alkyl group and any cyclic alkyl group having 3 to 7 carbon atoms. Sometimes referred to simply as a "lower alkyl group".
  • any linear alkyl group having 1 to 7 carbon atoms includes a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an n-butyl group, an n-pentyl group, an n-hexyl group, and an n-heptyl group.
  • Examples of the arbitrary branched chain alkyl group having 3 to 7 carbon atoms include an isopropyl group, an isobutyl group, a tert-butyl group, an isopentyl group and the like, and an arbitrary cyclic alkyl group having 3 to 7 carbon atoms includes an optional cyclic alkyl group having 3 to 7 carbon atoms. Cyclobutyl group, cyclopentyl group, cyclohexyl group and the like can be mentioned.
  • alkenyl group having 2 to 7 carbon atoms which may form a branch or a ring is an arbitrary linear alkenyl group having 2 to 7 carbon atoms and an arbitrary branching having 3 to 7 carbon atoms. Includes chain alkenyl groups and any cyclic alkenyl group with 3-7 carbon atoms. Sometimes simply referred to as a "lower alkenyl group”.
  • any linear alkenyl group having 2 to 7 carbon atoms includes an ethenyl group, a 1-propenyl group, a 2-propenyl group, a 1-butenyl group, a 2-butenyl group, a 1-pentenyl group, a 2-pentenyl group, and the like.
  • Examples thereof include 3-pentenyl group, 4-pentenyl group, 1-hexenyl group and the like
  • examples of any branched alkenyl group having 3 to 7 carbon atoms include isopropenyl group, 1-methyl-1-propenyl group and 1-methyl.
  • -2-propenyl group 2-methyl-1-propenyl group, 2-methyl-2-propenyl group, 1-methyl-2-butenyl group and the like, and as any cyclic alkenyl group having 3-7 carbon atoms.
  • Examples include a cyclobutenyl group, a cyclopentenyl group, a cyclohexenyl group and the like.
  • aryl group having 3 to 10 carbon atoms which may contain a heteroatom refers to any aryl group having 6 to 10 carbon atoms composed only of a hydrocarbon and the aryl group. Includes any heteroaryl group having 3 to 12 carbon atoms in which at least one carbon atom constituting the ring structure is substituted with a heteroatom (for example, a nitrogen atom, an oxygen atom, and a sulfur atom, and a combination thereof). do.
  • Examples of the aryl group having 6 to 10 carbon atoms include a phenyl group, a naphthyl group, an indenyl group, an azulenyl group and the like, and examples of the arbitrary heteroaryl group having 3 to 12 carbon atoms include a pyridyl group and a pyrrolyl group. Examples thereof include a quinolyl group, an indrill group, an imidazolyl group, a frill group, and a thienyl group.
  • examples of the term "aralkyl group having an aryl moiety having 3 to 12 carbon atoms which may contain a hetero atom” include a benzyl group, a phenethyl group, a naphthylmethyl group, a 3-phenylpropyl group, and 2 -Phenylpropyl group, 4-phenylbutyl group, 2-phenylbutyl group, pyridylmethyl group, indolylmethyl group, furylmethyl group, thienylmethyl group, pyrrolylmethyl group, 2-pyridylethyl group, 1-pyridylethyl group, 3 -Examples include a thienylpropyl group.
  • examples of the term "acyl group” include an aliphatic acyl group and an aromatic acyl group.
  • examples of the aliphatic acyl group include a formyl group, an acetyl group, a propionyl group, a butyryl group, an isobutyryl group, a pentanoyl group, a pivaloyl group, a valeryl group, an isovaleryl group, an octanoyl group, a nonanoyl group and a decanoyyl group.
  • aromatic acyl groups include arylcarbonyl groups such as benzoyl groups, ⁇ -naphthoyl groups and ⁇ -naphthoyl groups; halogenoarylcarbonyl groups such as 2-bromobenzoyl groups and 4-chlorobenzoyl groups; 2 , 4,6-trimethylbenzoyl group, lower alkylated arylcarbonyl group such as 4-toluole group; lower alkoxylated arylcarbonyl group such as 4-anisoil group; 2-carboxybenzoyl group, 3-carboxybenzoyl group, 4 -Carboxylated arylcarbonyl groups such as carboxybenzoyl groups; Nitrated arylcarbonyl groups such as 4-nitrobenzoyl groups, 2-nitrobenzoyl groups; Lower alkoxycarbonylated arylcarbonyl groups such as 2- (methoxycarbonyl) benzoyl groups Groups; Examples include arylated aryl
  • alkylene group having 2 to 8 carbon atoms refers to a divalent group having 2 to 8 carbon atoms, which is composed of repeating methylene groups (-CH 2-). Specific examples, -CH 2 CH 2 -, - CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -, and -CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 - and the like.
  • linear alkyl group with 1 to 3 carbon atoms or -NHR 4b [where R 4b is a hydrogen atom or linear alkyl group with 1 to 3 carbon atoms] or -OR 5b [here.
  • R 5b is a hydrogen atom or a linear alkyl group having 1 to 3 carbon atoms], and the alkylene group having 2 to 8 carbon atoms "is from the above-mentioned 2 carbon atoms which have not been substituted.
  • At least one hydrogen atom in a divalent group having 2 to 8 carbon atoms composed only of repeating 8 alkylene groups, that is, a methylene group is a linear alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, -NHR 4b , or. -Refer to the group substituted with OR 5b.
  • R 5b is a hydrogen atom or a linear alkyl group having 1 to 3 carbon atoms], the alkaneylene group having 2 to 8 carbon atoms "means from the above-mentioned 2 carbon atoms which have not been substituted. It refers to a group in which at least one hydrogen atom in the alkaneylene group of 8 is substituted with a linear alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, -NHR 4b , or -OR 5b.
  • sil group examples include a trimethylsilyl group, a triethylsilyl group, an isopropyldimethylsilyl group, a t-butyldimethylsilyl group, a methyldiisopropylsilyl group, a methyldi-t-butylsilyl group and a triisopropylsilyl group.
  • Tri-lower alkylsilyl groups such as; diphenylmethylsilyl groups, butyldiphenylbutylsilyl groups, diphenylisopropylsilyl groups, tri-lower alkylsilyl groups substituted with one or two aryl groups such as phenyldiisopropylsilyl groups, etc. Can be mentioned.
  • a trimethylsilyl group, a triethylsilyl group, a triisopropylsilyl group, a t-butyldimethylsilyl group, a t-butyldiphenylsilyl group are preferable, and a trimethylsilyl group is more preferable.
  • halogen atom includes, for example, a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, or an iodine atom.
  • a fluorine atom or a chlorine atom is preferable.
  • protecting group of amino group of nucleic acid synthesis is a group capable of stably protecting an amino group, a hydroxyl group, a phosphoric acid group or a mercapto group during nucleic acid synthesis. If so, there is no particular limitation.
  • protective group that is stable under acidic or neutral conditions and can be cleaved by chemical methods such as hydrogenation, hydrolysis, electrolysis, and photolysis.
  • protective groups include, for example, lower alkyl groups, lower alkenyl groups, acyl groups, tetrahydropyranyl or tetrahydrothiopyranyl groups, tetrahydrofuranyl or tetrahydrothiofuranyl groups, silyl groups, lower alkoxymethyl groups, lower alkoxys.
  • Lower Alkoxy Methyl Group Harogeno Lower Alkoxy Methyl Group, Lower Alkoxy Alkoxy Group, Ethyl Halcolated Group, Methyl Group Substituted by 1-3 aryl Groups, "Lower Alkoxy Group, Lower Alkoxy Group, Halogen Atomic Or Cyano" "Methyl group substituted with 1 to 3 aryl groups whose aryl ring is substituted with a group", lower alkoxycarbonyl group, "aryl group substituted with halogen atom, lower alkoxy group or nitro group", "halogen atom or Examples thereof include a lower alkoxycarbonyl group substituted with a tri-lower alkylsilyl group, an alkoxyoxycarbonyl group, and an aralkyloxycarbonyl group in which the aryl ring may be substituted with a lower alkoxy or nitro group.
  • the tetrahydropyranyl group or the tetrahydrothiopyranyl group includes a tetrahydropyran-2-yl group, a 3-bromotetrahydropyran-2-yl group, a 4-methoxytetrahydropyran-4-yl group, and a tetrahydro. Examples thereof include a thiopyran-4-yl group and a 4-methoxytetrahydropyran-4-yl group.
  • Examples of the tetrahydrofuranyl group or the tetrahydrothiofuranyl group include a tetrahydrofuran-2-yl group and a tetrahydrothiofuran-2-yl group.
  • Examples of the lower alkoxymethyl group include a methoxymethyl group, a 1,1-dimethyl-1-methoxymethyl group, an ethoxymethyl group, a propoxymethyl group, an isopropoxymethyl group, a butoxymethyl group, a t-butoxymethyl group and the like.
  • Lower Alkoxy Group Examples of the lower alkoxymethyl group include a 2-methoxyethoxymethyl group.
  • Examples of the halogeno lower alkoxymethyl group include a 2,2,2-trichloroethoxymethyl group and a bis (2-chloroethoxy) methyl group.
  • Examples of the lower alkoxylated ethyl group include 1-ethoxyethyl group and 1- (isopropoxy) ethyl group.
  • Examples of the ethyl halide group include a 2,2,2-trichloroethyl group.
  • Methyl groups substituted with 1 to 3 aryl groups include benzyl group, ⁇ -naphthylmethyl group, ⁇ -naphthylmethyl group, diphenylmethyl group, triphenylmethyl group, ⁇ -naphthyldiphenylmethyl group, 9-an. Examples include a thrill methyl group.
  • Examples of the "methyl group substituted with 1 to 3 aryl groups in which the aryl ring is substituted with a lower alkyl group, lower alkoxy group, halogen atom or cyano group" include 4-methylbenzyl group, 2,4,6-.
  • Trimethylbenzyl group 3,4,5-trimethylbenzyl group, 4-methoxybenzyl group, 4-methoxyphenyldiphenylmethyl group, 4,4'-dimethoxytriphenylmethyl group, 2-nitrobenzyl group, 4-nitrobenzyl group , 4-Chlorobenzyl group, 4-bromobenzyl group, 4-cyanobenzyl group and the like.
  • the lower alkoxycarbonyl group include a methoxycarbonyl group, an ethoxycarbonyl group, a t-butoxycarbonyl group, an isobutoxycarbonyl group and the like.
  • Examples of the "aryl group substituted with a halogen atom, a lower alkoxy group or a nitro group” include a 4-chlorophenyl group, a 2-fluorophenyl group, a 4-methoxyphenyl group, a 4-nitrophenyl group and a 2,4-dinitrophenyl group. And so on.
  • Examples of the "lower alkoxycarbonyl group substituted with a halogen atom or a trilower alkylsilyl group” include a 2,2,2-trichloroethoxycarbonyl group and a 2-trimethylsilylethoxycarbonyl group.
  • alkenyloxycarbonyl group examples include a vinyloxycarbonyl group and an aryloxycarbonyl group.
  • alkenyloxycarbonyl group examples include a vinyloxycarbonyl group and an aryloxycarbonyl group.
  • alkenyloxycarbonyl group examples include a vinyloxycarbonyl group and an aryloxycarbonyl group.
  • alkenyloxycarbonyl group examples include a vinyloxycarbonyl group and an aryloxycarbonyl group.
  • aralkyloxycarbonyl group in which the aryl ring may be substituted with a lower alkoxy or nitro group examples include a benzyloxycarbonyl group, 4-methoxybenzyloxycarbonyl group, 3,4-dimethoxybenzyloxycarbonyl group and 2-nitro. Examples thereof include a benzyloxycarbonyl group and a 4-nitrobenzyloxycarbonyl group.
  • protecting groups for hydroxyl groups in nucleic acid synthesis include, for example, aliphatic acyl groups, aromatic acyl groups, methyl groups substituted with 1 to 3 aryl groups, "lower alkyl, lower alkoxy, etc.” Examples thereof include halogen, a methyl group substituted with 1 to 3 aryl groups in which the aryl ring is substituted with a cyano group, and a silyl group.
  • the "protective group for the hydroxyl group in nucleic acid synthesis” includes, for example, an acetyl group, a benzoyl group, a benzyl group, a p-methoxybenzoyl group, a dimethoxytrityl group, a monomethoxytrityl group, a tert-butyldiphenylsilyl.
  • the protecting groups for the "protecting group for nucleic acid synthesis” include, for example, an aliphatic acyl group, an aromatic acyl group, and a "methyl group substituted with 1 to 3 aryl groups". , "Aryl groups substituted with halogen atoms, lower alkoxy groups or nitro groups", lower alkyl groups, and lower alkenyl groups.
  • the protecting groups for the "protecting group for nucleic acid synthesis” include, for example, benzoyl groups, benzyl groups, 2-chlorophenyl groups, 4-chlorophenyl groups, and 2-propenyl groups. Be done.
  • examples of the "protecting group for an amino group in nucleic acid synthesis” include an acyl group, preferably a benzoyl group.
  • the "protective group” of the “protective group of nucleic acid synthesis” includes, for example, a lower alkyl group, a lower alkyl group substituted with a cyano group, an aralkyl group, a "nitro group or”. Included are “aralkyl groups substituted with an aryl ring with a halogen atom” and “aryl groups substituted with a lower alkyl group, halogen atom, or nitro group”.
  • the "protecting group" of the “protecting group for nucleic acid synthesis” includes, for example, 2-cyanoethyl group, 2,2,2-trichloroethyl group, benzyl group, 2 -Chlorophenyl group and 4-chlorophenyl group can be mentioned.
  • examples of the "protecting group” of the “protecting group for nucleic acid synthesis” include aliphatic acyl groups and aromatic acyl groups, preferably benzoyl groups.
  • R 4a and R 5a are independently a hydroxyl group, a hydroxyl group protected by a protective group for nucleic acid synthesis, a mercapto group, and a protective group for nucleic acid synthesis, respectively.
  • the phosphoramidite group is preferably a group represented by the formula-P (OC 2 H 4 CN) (N (iPr) 2 ) or a group represented by the formula -P (OCH 3 ) (N (iPr) 2 ).
  • the groups represented are mentioned.
  • iPr represents an isopropyl group.
  • nucleoside and nucleoside analog refer to an unnatural type of “nucleoside” in which a purine or a pyrimidine base and a sugar are bonded, and an aromatic heterocycle other than purine and pyrimidine. And an aromatic hydrocarbon ring that can be substituted with a purine or pyrimidine base and a sugar bound to it.
  • oligonucleotide in which the same or different "nucleoside” or “nucleoside analog” is bonded, for example, 2 to 50 phosphodiester bonds.
  • Such analogs are preferably sugar derivatives with modified sugar moieties; thioate derivatives with phosphate diester moieties thioated; esters with terminal phosphate moieties esterified; on purine bases. Examples thereof include an amide derivative in which an amino group is amidated.
  • salt thereof refers to a salt of a compound represented by the formula (I) or (II) of the present invention.
  • Such salts include, for example, alkali metal salts such as sodium salt, potassium salt, lithium salt, calcium salt, alkaline earth metal salt such as magnesium salt, aluminum salt, iron salt, zinc salt, copper salt, etc.
  • Metal salts such as nickel salts and cobalt salts; inorganic salts such as ammonium salts, t-octylamine salts, dibenzylamine salts, morpholin salts, glucosamine salts, phenylglycine alkyl ester salts, ethylenediamine salts, N-methylglucamine salts.
  • Amine salts such as organic salts such as (hydroxymethyl) aminomethane salts; halogen atomized hydrorates such as hydrofluoride, hydrochlorides, hydrobromide, hydroiodide, nitrates, excess.
  • Inorganic acid salts such as chlorates, sulfates and phosphates; lower alkane sulfonates such as methane sulfonate, trifluoromethane sulfonate, ethane sulfonate, benzene sulfonate, p-toluene sulfonic acid
  • Organic acid salts such as aryl sulfonates such as salts, acetates, malates, fumarates, succinates, citrates, tartrates, oxalates, maleates; and glycine salts, lysines. Examples include amino acid salts such as salts, arginine salts, ornithine salts, glutamates, asparaginates.
  • the term "the pharmacologically acceptable salt” refers to a salt of an oligonucleotide analog containing at least one nucleoside structure represented by the formula (II) of the present invention.
  • Such salts include, for example, alkali metal salts such as sodium salt, potassium salt, lithium salt, calcium salt, alkaline earth metal salt such as magnesium salt, aluminum salt, iron salt, zinc salt, copper salt, etc.
  • Metal salts such as nickel salts and cobalt salts; inorganic salts such as ammonium salts, t-octylamine salts, dibenzylamine salts, morpholin salts, glucosamine salts, phenylglycine alkyl ester salts, ethylenediamine salts, N-methylglucamine salts.
  • Amine salts such as organic salts such as (hydroxymethyl) aminomethane salts; halogen atomized hydrorates such as hydrofluoride, hydrochlorides, hydrobromide, hydroiodide, nitrates, excess.
  • Inorganic acid salts such as chlorates, sulfates and phosphates; lower alkane sulfonates such as methane sulfonate, trifluoromethane sulfonate, ethane sulfonate, benzene sulfonate, p-toluene sulfonic acid
  • Organic acid salts such as aryl sulfonates such as salts, acetates, malates, fumarates, succinates, citrates, tartrates, oxalates, maleates; and glycine salts, lysines. Examples include amino acid salts such as salts, arginine salts, ornithine salts, glutamates, asparaginates.
  • Crosslinked nucleoside The crosslinked nucleoside of the present invention has the following formula (I):
  • Base represents a purine-9-yl group or 2-oxo-1,2-dihydropyrimidine-1-yl group which may have one or more of any substituents selected from the ⁇ group, where here.
  • the ⁇ group is protected by a hydroxyl group, a hydroxyl group protected by a protective group for nucleic acid synthesis, a linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a linear alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, a mercapto group, and a protective group for nucleic acid synthesis.
  • R 2 and R 3 independently form a hydrogen atom, a protective group for a hydroxyl group in nucleic acid synthesis, an alkyl group having 1 to 7 carbon atoms which may form a branch or a ring, a branch or a ring, respectively.
  • R 4a and R 5a are independently hydroxyl groups, respectively.
  • X 1 is a linear alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, -NHR 4b [where R 4b is a hydrogen atom or a linear alkyl group having 1 to 3 carbon atoms], or -OR 5b [here. R 5b is a hydrogen atom or a linear alkyl group having 1 to 3 carbon atoms], an alkylene group having 2 to 8 carbon atoms; or a linear alkyl group having 1 to 3 carbon atoms. Or -NHR 4b [where R 4b is a hydrogen atom or a linear alkyl group having 1 to 3 carbon atoms] or -OR 5b [where R 5b is a hydrogen atom or a linear alkyl group having 1 to 3 carbon atoms].
  • X 2 is an oxygen atom, a sulfur atom, -NH-, -N (CH 3 )-. Or it is a methylene group).
  • Base is, for example, a purine base (that is, a purine-9-yl group) or a pyrimidine base (that is, a 2-oxo-1,2-dihydropyrimidine-1-yl group).
  • bases are hydroxyl groups, linear alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms, linear alkoxy groups having 1 to 6 carbon atoms, mercapto groups, linear alkylthio groups having 1 to 6 carbon atoms, amino groups, and 1 to 6 carbon atoms. It may have one or more arbitrary substituents selected from the ⁇ group consisting of 6 linear alkylamino groups and halogen atoms.
  • Base examples include an adeninyl group, a guanynyl group, a cytosynyl group, a urasinyl group, and a timyl group, and a 6-aminopurine-9-yl group, a 2,6-diaminopurine-9-yl group, and 2 -Amino-6-chloropurine-9-yl group, 2-amino-6-fluoropurine-9-yl group, 2-amino-6-bromopurine-9-yl group, 2-amino-6-hydroxypurine- 9-yl group, 6-amino-2-methoxypurine-9-yl group, 6-amino-2-chloropurine-9-yl group, 6-amino-2-fluoropurine-9-yl group, 2,6 -Dimethoxypurine-9-yl group, 2,6-dichloropurine-9-yl group, 6-mercaptopurin-9-yl group
  • Base has the following structural formula from the viewpoint of introduction into nucleic acid drugs:
  • Group, 6-aminopurine-9-yl group, 2-amino-6-hydroxypurine-9-yl group, 4-amino-5-methyl-2-oxo-1,2-dihydropyrimidine-1-yl group, And 2-oxo-4-hydroxy-1,2-dihydropyrimidine-1-yl groups are preferred.
  • "Base" preferably has a hydroxyl group and an amino group constituting the above group protected by a protecting group.
  • R 2 , R 3 , and X 2 are similar to those defined in formula (I) above, and R 6 , R 7 , R 8 , R 9 , R 10 and R 11 are independent of each other.
  • R 6 and R 7 in the above formulas (I-1) and (I-4) are both hydrogen atoms.
  • R 6 , R 7 , R 8 and R 9 in the above formulas (I-2) and (I-5) are hydrogen atoms.
  • all of R 6 , R 7 , R 8 , and R 9 , R 10 , and R 11 in the above formulas (I-3) and (I-6) are hydrogen atoms.
  • R 6 and R 7 are independently from the hydrogen atom, carbon number 1, respectively. 3 linear alkyl groups, -NHR 4b [where R 4b is a hydrogen atom or a linear alkyl group having 1 to 3 carbon atoms], or -OR 5b [where R 5b is a hydrogen atom or carbon number. It is a linear alkyl group of 1 to 3]).
  • R 6 and R 7 in the above formulas (I-1) and (I-4) are both hydrogen atoms.
  • R 6 and R 7 are independent hydrogen atoms, directly having 1 to 3 carbon atoms, respectively.
  • R 6 and R 7 in the above formulas (I'-1) and (I'-4) are both hydrogen atoms.
  • the crosslinked nucleoside of the present invention a cyclic substituent is introduced at the 6'position of the formula (I) as described above.
  • the nucleoside of the present invention cannot have an isomer structure at the 6'position, and is freed from the need to separate isomers during its synthesis.
  • the crosslinked nucleoside of the present invention can improve the nuclease resistance performance in the oligonucleotide described later by the cyclic substituent introduced at the 6'position of the formula (I).
  • the ring strain of such a substituent directly affects the conformation of the sugar moiety. Therefore, the crosslinked nucleoside of the present invention can further improve the binding affinity with ssRNA for the oligonucleotide obtained by using the nucleotide.
  • the oligonucleotide uses such a crosslinked nucleoside of the formula (I), for example, the amidite method well known in the art, or M. Kuwahara et al., Nucleic Acids Res., 2008, Vol. 36, 13. It can be easily produced through triphosphorylation as described in No. 4257-4265.
  • oligonucleotide of the present invention or a pharmacologically acceptable salt thereof (hereinafter, these may be collectively referred to as “oligonucleotide of the present invention") is defined by the following formula (II):
  • Base represents a purine-9-yl group or 2-oxo-1,2-dihydropyrimidine-1-yl group which may have one or more of any substituents selected from the ⁇ group, where here.
  • the ⁇ group is protected by a hydroxyl group, a hydroxyl group protected by a protective group for nucleic acid synthesis, a linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a linear alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, a mercapto group, and a protective group for nucleic acid synthesis.
  • X 1 is a linear alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, -NHR 4b [where R 4b is a hydrogen atom or a linear alkyl group having 1 to 3 carbon atoms], or -OR 5b [here.
  • R 5b is a hydrogen atom or a linear alkyl group having 1 to 3 carbon atoms], an alkylene group having 2 to 8 carbon atoms; or a linear alkyl group having 1 to 3 carbon atoms.
  • -NHR 4b [where R 4b is a hydrogen atom or a linear alkyl group having 1 to 3 carbon atoms] or -OR 5b [where R 5b is a hydrogen atom or a linear alkyl group having 1 to 3 carbon atoms]. It is an alkaneylene group having 2 to 8 carbon atoms, which may be substituted with], and X 2 is an oxygen atom, a sulfur atom, -NH-, -N (CH 3 )-. Or it contains at least one nucleoside structure represented by (or a methylene group).
  • Base and X 2 are similar to the groups defined in formula (II) above, and R 6 , R 7 , R 8 , R 9 , R 10 and R 11 are independently from the hydrogen atom, carbon number 1. 3 linear alkyl groups, -NHR 4b [where R 4b is a hydrogen atom or a linear alkyl group with 1 to 3 carbon atoms], or -OR 5b [where R 5b is a hydrogen atom or carbon number. It is a linear alkyl group of 1 to 3]).
  • R 6 and R 7 in the above formulas (II-1) and (II-4) are both hydrogen atoms.
  • R 6 , R 7 , R 8 and R 9 in the above formulas (II-2) and (II-5) are hydrogen atoms.
  • all of R 6 , R 7 , R 8 , and R 9 , R 10 , and R 11 in the above formulas (II-3) and (II-6) are hydrogen atoms.
  • nucleoside structure of formula (II) contained in the oligonucleotide of the present invention is the following formula (II'):
  • formulas (II-1) and (II-4) As another example of the nucleoside structure of formula (II) contained in the oligonucleotide of the present invention:
  • Base and X 2 are similar to the groups defined in formula (II) above, and R 6 and R 7 are independent hydrogen atoms, linear alkyl groups with 1 to 3 carbon atoms, -NHR 4b [here. And R 4b is a hydrogen atom or a linear alkyl group having 1 to 3 carbon atoms], or -OR 5b [where R 5b is a hydrogen atom or a linear alkyl group having 1 to 3 carbon atoms]. There is one represented by).
  • R 6 and R 7 in the above formulas (II-1) and (II-4) are both hydrogen atoms.
  • R 6 and R 7 are independent hydrogen atoms, linear alkyl groups with 1 to 3 carbon atoms, -NHR 4b [where R 4b is a hydrogen atom or a linear alkyl group having 1 to 3 carbon atoms], or -OR 5b [where R 5b is a hydrogen atom or a linear alkyl group having 1 to 3 carbon atoms].
  • R 6 and R 7 in the above formulas (II'-1) and (II'-4) are both hydrogen atoms.
  • the oligonucleotide of the present invention has at least one of the above nucleoside structures at an arbitrary position.
  • the position and number thereof are not particularly limited, and may be appropriately designed according to the purpose.
  • Oligonucleotides containing such a nucleoside structure have dramatically improved nuclease resistance performance as compared with the case of using conventional 2', 4'-BNA / LNA. It also has an ssRNA binding affinity comparable to the known 2', 4'-BNA / LNA.
  • the oligonucleotide of the present invention synthesized by using the crosslinked nucleoside of the present invention is a drug for treating a disease by inhibiting the action of a specific gene, including an antitumor agent and an antiviral agent. It is expected to be useful as an (antisense molecule).
  • the antisense method requires both binding affinity for complementary sense strand RNA and resistance to in vivo DNase.
  • a nucleic acid in a single-stranded state, a nucleic acid has a "fluctuation" between a form in which the sugar portion structure is constantly close to a DNA double strand and a form close to a DNA-RNA double strand or an RNA duplex. exist. By immobilizing this "fluctuation" in advance to the conformation during double chain formation, the binding affinity for the target ssRNA can be improved.
  • nucleic acid degrading enzyme cleaves the phosphate diester portion of the oligonucleic acid, but by introducing a bulky substituent into the sugar portion or the like, the degradation of the oligonucleic acid can be suppressed through steric hindrance.
  • the crosslinked nucleoside of the present invention has a bulky cyclic substituent at the 6'position as described above. Therefore, the oligonucleotide obtained by using this can improve the binding affinity for the ssRNA and have excellent enzyme resistance.
  • the oligonucleotide of the present invention contains, for example, an auxiliary agent commonly used in the pharmaceutical formulation technology field such as an excipient, a binder, a preservative, an oxidation stabilizer, a disintegrant, a lubricant, and a flavoring agent. It can be a parenteral administration preparation or a liposome preparation.
  • a pharmaceutical carrier usually used in the art can be blended to prepare a topical preparation such as a liquid, a cream, or an ointment.
  • Table 1 shows the physical property data of the obtained compound 5.
  • Table 2 shows the physical property data of the obtained compound 6.
  • Table 3 shows the physical property data of the obtained compound 7.
  • Table 4 shows the physical property data of the obtained compound 8.
  • Table 5 shows the physical property data of the obtained compound 9.
  • Table 6 shows the physical property data of the obtained compound 10.
  • Table 7 shows the physical property data of the obtained compound 11.
  • Table 8 shows the physical property data of the obtained compound 12.
  • Table 9 shows the physical property data of the obtained compound 13.
  • Table 10 shows the physical property data of the obtained compound 14.
  • Table 11 shows the physical property data of the obtained compound 15.
  • the total yield of the finally obtained compound 15 was 22% through a series of synthetic routes from the above compound 1 to the acquisition of the compound 15. This is a high value as compared with the total yield (18%) of the final product obtained by the synthetic route of the crosslinked nucleoside (scpBNA) described in Patent Document 1 and Non-Patent Document 5, for example. It can be seen that the crosslinked nucleoside of the example could be efficiently synthesized.
  • Table 12 shows the physical property data of the obtained compound 16.
  • Table 13 shows the physical property data of the obtained compound 17.
  • Table 14 shows the physical property data of the obtained compound 18.
  • Table 15 shows the physical property data of the obtained compound 19.
  • Table 16 shows the physical property data of the obtained compound 20.
  • Example 3 Synthesis and purification of oligonucleotide (1)
  • Compound 15 (scpBNA2nd-T) prepared in Example 1 was used as an amidite block, and oligonucleotides were synthesized as follows. Compounds other than compound 15 constituting the oligonucleotide were purchased from Proligo unless otherwise specified. The following oligonucleotides were synthesized.
  • ON5: 5'-d (TTTTTTTY) -3' ON6: 5'-d (TTTTTTTYT) -3' Y Compound 15 (scpBNA2nd-T)
  • each was prepared as a 0.1 M anhydrous acetonitrile or anhydrous dichloromethane solution, and charged into an nS-8 Oligonucleotide Synthesizer manufactured by GeneDesign. Each synthesis was performed under trityl-on conditions.
  • Activator-42 registered trademark (manufactured by Proligo) (0.25M acetonitrile solution) was used as the activator, and the condensation time was extended from compound 15 to 150 seconds ⁇ 5. For other operations, synthesis was performed according to the usual phosphoramidite method.
  • the product is treated with a 28% aqueous ammonia solution at room temperature for 1.5 hours to cut out from the column carrier, and then allowed to stand at 55 ° C. for 10 hours to deprotect the base portion. went. Then, it was purified by a simple reverse phase column (Sep-Pak (registered trademark) Plus C18 Cartridges manufactured by Waters), and further purified by reverse phase HPLC.
  • a simple reverse phase column Sep-Pak (registered trademark) Plus C18 Cartridges manufactured by Waters
  • the composition of the purified oligonucleotide was determined by MALDI-TOF MS measurement.
  • a matrix (1 ⁇ L) obtained by mixing a 3-hydroxypicolinic acid aqueous solution (10 mg / mL) and a diammonium citrate aqueous solution (1 mg / mL) in a volume ratio of 1: 1 was dried on an anchor tip.
  • An aqueous oligonucleotide solution (50 ⁇ M, 1 ⁇ L) was placed therein and dried again, and then MALDI-TOF MS measurement was performed.
  • Molecular weight measurements were performed in negative mode and oligothymidylic acid (7 mer, 9 mer, 11 mer and 13 mer) was used as an external standard.
  • the synthesized oligonucleotide was quantified by measuring the ultraviolet absorption at 260 nm using an absorbance measuring device (SHIMADZU UV-1800 manufactured by Shimadzu Corporation).
  • Example 4 Evaluation of double chain forming ability The double chain forming ability was examined for ON1 to ON4. As a control, 5'-d (GCGTTTTTTGCT) -3'("ON9": SEQ ID NO: 5) using natural DNA was also used. Single-stranded oligo RNA 5'-r (AGCAAAAAACGC) -3'(SEQ ID NO: 6) and single-stranded oligo DNA 5'-d (AGCAAAAAACGC) -3'(SEQ ID NO: 7) were used as target strands.
  • the double-strand-forming ability of the oligonucleotide was examined by annealing various oligonucleotides and the target strand to form a double-strand, and then measuring the Tm value. More specifically, a mixture of each oligonucleotide (final concentration 4 ⁇ M) and sodium chloride (final concentration 100 mM) phosphate buffer (10 mM, pH 7.2, 130 ⁇ L) was bathed in boiling water and slowly cooled to room temperature. .. Then, the temperature was cooled to 5 ° C. under a nitrogen stream, and the measurement was started. The temperature was raised to 90 ° C. or 110 ° C. at 0.5 ° C./min, and the absorbance at 260 nm was plotted at 0.5 ° C. intervals. The T m value was calculated by the midline method and used as the average value in three independent measurements.
  • results are shown in Table 18.
  • the results for single-strand oligo RNA are shown in “ssRNA”
  • the results for single-strand oligo DNA are shown in “ssDNA”
  • T m variable temperature per base of artificially modified nucleic acid for each oligonucleotide (“ ⁇ T m”). / Mod. ”)
  • RNA selectivity difference between melting temperature for RNA and melting temperature for DNA
  • both single-stranded oligo DNA and single-stranded oligo RNA exhibited higher melting temperatures than the native oligonucleotide (ON9). Furthermore, when compound 15 was used, the Tm value was increased especially for single-stranded oligo RNA as compared with the natural oligonucleotide (ON9), and thus high binding affinity for single-stranded oligo RNA was exhibited. .. Moreover, when compound 15 was used, RNA selectivity was observed.
  • Fig. 1 The results are shown in Fig. 1.
  • the black rhombus represents the result of (1) above
  • the black circle represents the result of (2) above
  • the black triangle represents (3) above.
  • the oligonucleotide having compound 15 ((1) above) has much higher nuclease resistance than the oligonucleotide with phosphorothioated (PS) oligo ((2) above) and the oligonucleotide having spirocyclopropylene BNA ((3) above). It was seen.
  • PS phosphorothioated
  • Example 6 Synthesis and purification of oligonucleotide (2) Compound 15 (scpBNA2nd-T) prepared in Example 1 and compound 20 (scpBNA2nd- Me C) prepared in Example 2 were used as amidite blocks, and the oligonucleotides shown in Table 19 were used in the same manner as in Example 3. Synthesized. Regarding phosphorothioatetization, 0.05 M ((dimethylamino-methylidene) amino) -3H-1,2,4-dithiazolin-3-thione (DDTT) (pyridine / acetonitrile (3: 2)) solution, GLEN RESEARCH Company) was used. The sequences of the obtained oligonucleotides ONs21, ONs22, ONs23 and ONd1 are also shown in SEQ ID NOs: 8 to 11, respectively.
  • Example 7 Evaluation of toxicity reducing effect
  • the test oligonucleotides (20 mg / kg) shown in Table 20 were administered intraperitoneally to 6-week-old mice (C57BL / 6J, male) (5 animals / group). After 96 hours, blood was collected under inhalation anesthesia (isoflurane) and exsanguinated. Then, the activities of aspartate transaminase (AST) and alanine transaminase (ALT) in serum were measured by an automatic analyzer (FUJIFILM FUJIFILM 4000V).
  • ONd1 SEQ ID NO: 11
  • ONd0 SEQ ID NO: 12
  • ONd1 was prepared in the same manner as ONd1 except that compound 15 (scpBNA2nd-T) was not contained in the amidite block.
  • Table 21 shows the activities of aspartate transaminase (AST) and alanine transaminase (ALT) in blood when the test oligonucleotide was administered and when physiological saline was administered.
  • AST aspartate transaminase
  • ALT alanine transaminase
  • Example 8 Evaluation of antisense activity Oligonucleotides (ONs21, ONs22, ONs23) containing compound 15 (scpBNA2nd-T) prepared in Example 1 and compound 20 (scpBNA2nd- Me C) prepared in Example 2 : Prepared in Example 6) and oligonucleotides (ONs01) containing LNA instead of compound 15 and compound 20 were examined for antisense activity in each tissue.
  • ONs01 was synthesized in the same manner as in Example 3 using LNA as an amidite block instead of compound 15 and compound 20.
  • the sequences of ONs21, ONs22, ONs23 and ONs01 are shown in Table 22 below.
  • a test oligonucleotide (20 nmol: 200 ⁇ L of 100 ⁇ M physiological saline solution) was administered to the tail vein of 6-week-old mice (BALB / cAnNCrlCrlj, female) (5 mice / group). After 72 hours, blood was collected under inhalation anesthesia (isoflurane) and exsanguinated. Then, each tissue was collected and RNA extraction (use kit: RNeasy) was performed. The expression level of MALAT1 mRNA in each tissue was measured by real-time PCR (kit used: One Step TB Green (registered trademark) PrimeScript TM RT-PCR Kit (Perfect Real Time), manufactured by Takara Bio Inc.).
  • MALAT1 forward acatctcttaggggtgggaa
  • MALAT1 reverse caccccgcaaaggcctata
  • GAPDH forward tcaccaccatggagaaggc
  • GAPDH reverse gctagactagttgtgtgggtgca (SEQ ID NO: 17)
  • FIGS. 2 and 3 show relative MALAT1 expression levels in various tissues of mice upon administration of various oligonucleotides (FIG. 2: liver, heart, kidney, pancreas, skeletal muscle, lung and stomach, and FIG. 3: spleen, Skin, large intestine, brain, mammary gland, eyeball and cartilage).
  • the "relative MALAT1 expression level” was expressed as a relative value when the expression level was 1 when only physiological saline was administered (without oligonucleotide).
  • the bar indicating the result is displayed as a control (administered with saline only), an oligonucleotide (ONs01) containing LNA instead of compound 15 and compound 20, and an oligonucleotide containing compound 15 and compound 20.
  • a control administered with saline only
  • an oligonucleotide ONs01
  • an oligonucleotide containing compound 15 and compound 20 an oligonucleotide containing compound 15 and compound 20.
  • Oligonucleotides containing compound 15 and compound 20 are equal to or higher targets in many tissues than oligonucleotides containing LNA instead of compound 15 and compound 20 (ONs01). It showed a gene-suppressing effect.
  • a novel crosslinked nucleoside capable of substituting for a phosphorothioate-modified nucleic acid and a nucleotide using the same are provided.
  • the oligonucleotide obtained by using the crosslinked nucleoside of the present invention is useful as a material for, for example, a nucleic acid drug.

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Abstract

架橋型ヌクレオシドおよびそれを用いたヌクレオチドを開示する。本発明のヌクレオシドは、以下の式（Ｉ）：　で表される。本発明の架橋型ヌクレオシドは、特定の臓器への集積などが懸念されるホスホロチオエート修飾核酸の代替とすることができ、工業的生産性にも優れている。

Description

架橋型ヌクレオシドおよびそれを用いたヌクレオチド
　本発明は、架橋型ヌクレオシドおよびそれを用いたヌクレオチドに関する。より詳細には、良好なヌクレアーゼ耐性能を有しかつ効率よく製造することのできる架橋型ヌクレオシドおよびそれを用いたヌクレオチドに関する。
　ＤＮＡやＲＮＡに対して優れた結合親和性を有する人工核酸は、遺伝子診断や核酸医薬への応用が可能であり、これまで様々なタイプの人工核酸が開発されている。中でも核酸糖部の配座を架橋によってＮ型配座に固定化した２’，４’－ＢＮＡ（２’，４’－ｂｒｉｄｇｅｄ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ；別名ＬＮＡ）は、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）に対して優れた結合親和性を有し、アンチセンス法などの様々な応用が可能な核酸医薬として期待されている（非特許文献１および２）。しかし、２’，４’－ＢＮＡは酵素耐性に乏しく、肝毒性を誘発し易いという課題を抱えている（非特許文献３）。
　これに対して、２’，４’－ＢＮＡの６’位にメチル基、メトキシメチル基などの置換基を導入した人工核酸が、ｓｓＲＮＡに対する結合親和性を向上させるとともに優れた酵素耐性能を有することが報告されている（非特許文献４）。しかし、６’位にこれらの置換基を導入すると異性体を生じる場合があり、煩雑な分離操作が必要とされる。
　一方、６’位にシクロプロピル基を導入した人工核酸（ｓｃｐＢＮＡ）は、異性体の分離を必要としない合成経路により合成可能であり、ｓｓＲＮＡに対する高い結合親和性を維持しつつ、高い酵素耐性能を有することが報告されている（特許文献１および非特許文献５）。しかし、ｓｃｐＢＮＡの合成経路において得られる各種生成物の収率は十分に満足し得るものとは言い難い。工業的な応用に応え得るより高収率で合成可能な人工核酸の開発が所望されている。
国際公開第２０１５／１２５７８３号
S. Obikaら, T. Tetrahedron Lett., 1997, 38, 8735-8738 S. Singhら, J. Chem. Commun., 1998, 455-456 E. Swayzeら, Nucleic Acids Res., 2007, 35, 687-700 P.P. Sethら, J. Org. Chem., 2010, 75, 1569-1581 T. Yamaguchiら, Chem. Commun., 2015, 51, 9737-9740
　本発明は、上記課題を解決するものであり、その目的とするところは、６’位に置換基が導入されており、異性体分離などの煩雑な操作を必要とすることなく、かつより高収率で製造することのできる架橋型ヌクレオシドおよびそれを用いたヌクレオチドを提供することにある。
　本発明は、以下の式（Ｉ）で表される化合物またはその塩：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　（式中、
　Ｂａｓｅは、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン－９－イル基または２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり、
　Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して、水素原子、核酸合成の水酸基の保護基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１０のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいシリル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいリン酸基、核酸合成の保護基で保護されたリン酸基、－Ｐ（Ｒ４ａ）Ｒ５ａ［式中、Ｒ４ａおよびＲ５ａは、それぞれ独立して、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１から６のアルコキシ基、炭素数１から６のアルキルチオ基、炭素数１から６のシアノアルコキシ基、または炭素数１から６のアルキル基を有するジアルキルアミノ基を表す］を表し、
　Ｘ１は、炭素数１から３の直鎖アルキル基か、－ＮＨＲ４ｂ［ここで、Ｒ４ｂは水素原子または炭素数１から３の直鎖アルキル基である］か、または－ＯＲ５ｂ［ここで、Ｒ５ｂは水素原子または炭素数１から３の直鎖アルキル基である］かで置換されていてもよい、炭素数２から８のアルキレン基；あるいは炭素数１から３の直鎖アルキル基か、－ＮＨＲ４ｂ［ここで、Ｒ４ｂは水素原子または炭素数１から３の直鎖アルキル基である］か、または－ＯＲ５ｂ［ここで、Ｒ５ｂは水素原子または炭素数１から３の直鎖アルキル基である］かで置換されていてもよい、炭素数２から８のアルケニレン基；であり、そして
　Ｘ２は、酸素原子、硫黄原子、－ＮＨ－、－Ｎ（ＣＨ３）－またはメチレン基である）である。
　１つの実施形態では、上記式（Ｉ）は以下の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　（式中、
　Ｂａｓｅは、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン－９－イル基または２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり、
　Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して、水素原子、核酸合成の水酸基の保護基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１０のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいシリル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいリン酸基、核酸合成の保護基で保護されたリン酸基、－Ｐ（Ｒ４ａ）Ｒ５ａ［式中、Ｒ４ａおよびＲ５ａは、それぞれ独立して、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１から６のアルコキシ基、炭素数１から６のアルキルチオ基、炭素数１から６のシアノアルコキシ基、または炭素数１から６のアルキル基を有するジアルキルアミノ基を表す］を表し、
　Ｘ２は、酸素原子、硫黄原子、－ＮＨ－、－Ｎ（ＣＨ３）－またはメチレン基であり、そして
　Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０およびＲ１１はそれぞれ独立して、水素原子、炭素数１から３の直鎖アルキル基、－ＮＨＲ４ｂ［ここで、Ｒ４ｂは水素原子または炭素数１から３の直鎖アルキル基である］、または－ＯＲ５ｂ［ここで、Ｒ５ｂは水素原子または炭素数１から３の直鎖アルキル基である］である）で表される。
　１つの実施形態では、上記式（Ｉ）は以下の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　（式中、
　Ｂａｓｅは、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン－９－イル基または２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり、
　Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して、水素原子、核酸合成の水酸基の保護基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１０のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいシリル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいリン酸基、核酸合成の保護基で保護されたリン酸基、－Ｐ（Ｒ４ａ）Ｒ５ａ［式中、Ｒ４ａおよびＲ５ａは、それぞれ独立して、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１から６のアルコキシ基、炭素数１から６のアルキルチオ基、炭素数１から６のシアノアルコキシ基、または炭素数１から６のアルキル基を有するジアルキルアミノ基を表す］を表し、
　Ｘ２は、酸素原子、硫黄原子、－ＮＨ－、－Ｎ（ＣＨ３）－またはメチレン基であり、そして
　Ｒ６およびＲ７はそれぞれ独立して、水素原子、炭素数１から３の直鎖アルキル基、－ＮＨＲ４ｂ［ここで、Ｒ４ｂは水素原子または炭素数１から３の直鎖アルキル基である］、または－ＯＲ５ｂ［ここで、Ｒ５ｂは水素原子または炭素数１から３の直鎖アルキル基である］である）で表される。
　１つの実施形態では、上記式（Ｉ）において、上記Ｂａｓｅは、６－アミノプリン－９－イル基、２，６－ジアミノプリン－９－イル基、２－アミノ－６－クロロプリン－９－イル基、２－アミノ－６－フルオロプリン－９－イル基、２－アミノ－６－ブロモプリン－９－イル基、２－アミノ－６－ヒドロキシプリン－９－イル基、６－アミノ－２－メトキシプリン－９－イル基、６－アミノ－２－クロロプリン－９－イル基、６－アミノ－２－フルオロプリン－９－イル基、２，６－ジメトキシプリン－９－イル基、２，６－ジクロロプリン－９－イル基、６－メルカプトプリン－９－イル基、２－オキソ－４－アミノ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、４－アミノ－２－オキソ－５－フルオロ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、４－アミノ－２－オキソ－５－クロロ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、２－オキソ－４－メトキシ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、２－オキソ－４－メルカプト－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、２－オキソ－４－ヒドロキシ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、２－オキソ－４－ヒドロキシ－５－メチル－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、または４－アミノ－５－メチル－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基である。
　１つの実施形態では、上記式（Ｉ）において、上記Ｂａｓｅは、以下の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
で表される基である。
　本発明はまた、以下の式（ＩＩ）で表されるヌクレオシド構造を少なくとも１つ含有するオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
　（式中、
　Ｂａｓｅは、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン－９－イル基または２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり、
　Ｘ１は、炭素数１から３の直鎖アルキル基か、－ＮＨＲ４ｂ［ここで、Ｒ４ｂは水素原子または炭素数１から３の直鎖アルキル基である］か、または－ＯＲ５ｂ［ここで、Ｒ５ｂは水素原子または炭素数１から３の直鎖アルキル基である］かで置換されていてもよい、炭素数２から８のアルキレン基；あるいは炭素数１から３の直鎖アルキル基か、－ＮＨＲ４ｂ［ここで、Ｒ４ｂは水素原子または炭素数１から３の直鎖アルキル基である］か、または－ＯＲ５ｂ［ここで、Ｒ５ｂは水素原子または炭素数１から３の直鎖アルキル基である］かで置換されていてもよい、炭素数２から８のアルケニレン基；であり、そして
　Ｘ２は、酸素原子、硫黄原子、－ＮＨ－、－Ｎ（ＣＨ３）－またはメチレン基である）である。
　１つの実施形態では、上記式（ＩＩ）は以下の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
　（式中、
　Ｂａｓｅは、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン－９－イル基または２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり、
　Ｘ２は、酸素原子、硫黄原子、－ＮＨ－、－Ｎ（ＣＨ３）－またはメチレン基であり、そして
　Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０およびＲ１１はそれぞれ独立して、水素原子、炭素数１から３の直鎖アルキル基、－ＮＨＲ４［ここで、Ｒ４は水素原子または炭素数１から３の直鎖アルキル基である］、または－ＯＲ５［ここで、Ｒ５は水素原子または炭素数１から３の直鎖アルキル基である］である）で表される。
　１つの実施形態では、上記式（ＩＩ）は以下の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
　（式中、
　Ｂａｓｅは、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン－９－イル基または２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり、
　Ｘ２は、酸素原子、硫黄原子、－ＮＨ－、－Ｎ（ＣＨ３）－またはメチレン基であり、そして
　Ｒ６およびＲ７はそれぞれ独立して、水素原子、炭素数１から３の直鎖アルキル基、－ＮＨＲ４ｂ［ここで、Ｒ４ｂは水素原子または炭素数１から３の直鎖アルキル基である］、または－ＯＲ５ｂ［ここで、Ｒ５ｂは水素原子または炭素数１から３の直鎖アルキル基である］である）で表される。
　本発明はまた、上記オリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩の製造方法であって、
　以下の式（Ｉ）で表される化合物またはその薬理学上許容される塩：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
　（式中、
　Ｂａｓｅは、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン－９－イル基または２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり、
　Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して、水素原子、核酸合成の水酸基の保護基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１０のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいシリル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいリン酸基、核酸合成の保護基で保護されたリン酸基、－Ｐ（Ｒ４ａ）Ｒ５ａ［式中、Ｒ４ａおよびＲ５ａは、それぞれ独立して、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１から６のアルコキシ基、炭素数１から６のアルキルチオ基、炭素数１から６のシアノアルコキシ基、または炭素数１から６のアルキル基を有するジアルキルアミノ基を表す］を表し、
　Ｘ１は、炭素数１から３の直鎖アルキル基か、－ＮＨＲ４ｂ［ここで、Ｒ４ｂは水素原子または炭素数１から３の直鎖アルキル基である］か、または－ＯＲ５ｂ［ここで、Ｒ５ｂは水素原子または炭素数１から３の直鎖アルキル基である］かで置換されていてもよい、炭素数２から８のアルキレン基；あるいは炭素数１から３の直鎖アルキル基か、－ＮＨＲ４ｂ［ここで、Ｒ４ｂは水素原子または炭素数１から３の直鎖アルキル基である］か、または－ＯＲ５ｂ［ここで、Ｒ５ｂは水素原子または炭素数１から３の直鎖アルキル基である］かで置換されていてもよい、炭素数２から８のアルケニレン基；であり、そして
　Ｘ２は、酸素原子、硫黄原子、－ＮＨ－、－Ｎ（ＣＨ３）－またはメチレン基である）
　を用いてオリゴヌクレオチドを合成する工程を包含する、方法である。
　本発明によれば、ｓｓＲＮＡに対する高い結合親和性を有し、かつ高い酵素耐性能を有する新規な６’位が修飾された架橋型ヌクレオシドおよびそれを用いたヌクレオチドが提供される。本発明の架橋型ヌクレオシドは、その製造において異性体の分離工程を必要としないため、工業的生産性にも優れている。
５’－ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＸ－３’の配列の各種オリゴヌクレオチドを３’－エキソヌクレアーゼで処理した場合の、未切断オリゴヌクレオチドの割合の経時変化を示すグラフである。 各種オリゴヌクレオチド投与時のマウスの各種組織における相対的ＭＡＬＡＴ１発現レベルを示すグラフである。 各種オリゴヌクレオチド投与時のマウスの各種組織における相対的ＭＡＬＡＴ１発現レベルを示すグラフである。
　まず、本明細書中で用いられる用語を定義する。
　本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖アルキル基」は、炭素数１～６の任意の直鎖アルキル基をいい、具体的にはメチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｎ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、ｎ－ヘキシル基をいう。また、用語「炭素数１から３の直鎖アルキル基」は、炭素数１～３の任意の直鎖アルキル基をいい、具体的にはメチル基、エチル基、ｎ－プロピル基をいう。一方、用語「炭素数１から６のアルキル基」という場合は、炭素数１～６の任意の直鎖、分岐鎖または環状のアルキル基をいう。
　本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖アルコキシ基」は、炭素数１～６の任意の直鎖アルキル基を有するアルコキシ基を包含する。例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ－プロポキシ基などが挙げられる。一方、用語「炭素数１から６のアルコキシ基」という場合は、炭素数１～６の任意の直鎖、分岐鎖または環状のアルコキシ基をいう。また、用語「炭素数１から６の直鎖アルコキシ基で置換されていてもよい炭素数１から６の直鎖アルコキシ基」という場合は、上記「炭素数１から６の直鎖アルコキシ基」、ならびに「炭素数１から６の直鎖アルコキシ基」を構成する１つまたはそれ以上の水素原子が、同一または異なっていてもよい他の「炭素数１から６の直鎖アルコキシ基」で置換されたアルコキシ基をいう。このような「炭素数１から６の直鎖アルコキシ基で置換されていてもよい炭素数１から６の直鎖アルコキシ基」としては、例えばメトキシ基、エトキシ基、ｎ－プロポキシ基、メトキシメトキシ基、エトキシメトキシ基、ｎ－プロポキシメトキシ基、メトキシエトキシ基（例えば２－メトキシエトキシ基）、エトキシエトキシ基（例えば２－エトキシエトキシ基）、およびｎ－プロポキシエトキシ基が挙げられる。
　本明細書において、用語「炭素数１から６のシアノアルコキシ基」は、炭素数１～６の任意の直鎖、分岐鎖または環状のアルコキシ基における少なくとも１つの水素原子がシアノ基で置換された基をいう。
　本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基」は、炭素数１～６の任意の直鎖アルキル基を有するアルキルチオ基を包含する。例えば、メチルチオ基、エチルチオ基、ｎ－プロピルチオ基などが挙げられる。一方、用語「炭素数１から６のアルキルチオ基」という場合は、炭素数１～６の任意の直鎖、分岐鎖または環状のアルキルチオ基をいう。
　本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基」は、炭素数１～６の任意の直鎖アルキル基を有するアルキルアミノ基を１つまたは２つ有するアルキルアミノ基を包含する。例えば、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、エチルアミノ基、メチルエチルアミノ基、ジエチルアミノ基などが挙げられる。
　本明細書において、用語「分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基」は、炭素数１～７の任意の直鎖アルキル基、炭素数３～７の任意の分岐鎖アルキル基、および炭素数３～７の任意の環状アルキル基を包含する。単に、「低級アルキル基」という場合もある。例えば、炭素数１～７の任意の直鎖アルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｎ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、ｎ－ヘキシル基、およびｎ－ヘプチル基が挙げられ、炭素数３～７の任意の分岐鎖アルキル基としては、イソプロピル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、イソペンチル基などが挙げられ、そして炭素数３～７の任意の環状アルキル基としては、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基などが挙げられる。
　本明細書において、用語「分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基」は、炭素数２～７の任意の直鎖アルケニル基、炭素数３～７の任意の分岐鎖アルケニル基、および炭素数３～７の任意の環状アルケニル基を包含する。単に、「低級アルケニル基」という場合もある。例えば、炭素数２～７の任意の直鎖アルケニル基としては、エテニル基、１－プロペニル基、２－プロペニル基、１－ブテニル基、２－ブテニル基、１－ペンテニル基、２－ペンテニル基、３－ペンテニル基、４－ペンテニル基、１－ヘキセニル基などが挙げられ、炭素数３～７の任意の分岐鎖アルケニル基としては、イソプロペニル基、１－メチル－１－プロペニル基、１－メチル－２－プロペニル基、２－メチル－１－プロペニル基、２－メチル－２－プロペニル基、１－メチル－２－ブテニル基などが挙げられ、そして炭素数３～７の任意の環状アルケニル基としては、シクロブテニル基、シクロペンテニル基、シクロヘキセニル基などが挙げられる。
　本明細書において、用語「ヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１０のアリール基」は、炭化水素のみで構成された、炭素数６～１０の任意のアリール基と、当アリール基の環構造を構成する少なくとも１つの炭素原子がヘテロ原子（例えば、窒素原子、酸素原子、および硫黄原子、ならびにこれらの組合せ）で置換された、炭素数３～１２の任意のヘテロアリール基とを包含する。当該炭素数６～１０のアリール基としては、フェニル基、ナフチル基、インデニル基、アズレニル基などが挙げられ、そして当該炭素数３～１２の任意のヘテロアリール基としては、ピリジル基、ピロリル基、キノリル基、インドリル基、イミダゾリル基、フリル基、チエニル基などが挙げられる。
　本明細書において、用語「ヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基」の例としては、ベンジル基、フェネチル基、ナフチルメチル基、３－フェニルプロピル基、２－フェニルプロピル基、４－フェニルブチル基、２－フェニルブチル基、ピリジルメチル基、インドリルメチル基、フリルメチル基、チエニルメチル基、ピロリルメチル基、２－ピリジルエチル基、１－ピリジルエチル基、３－チエニルプロピル基などが挙げられる。
　本明細書において、用語「アシル基」の例としては、脂肪族アシル基および芳香族アシル基が挙げられる。具体的には、脂肪族アシル基の例としては、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、ペンタノイル基、ピバロイル基、バレリル基、イソバレリル基、オクタノイル基、ノナノイル基、デカノイル基、３－メチルノナノイル基、８－メチルノナノイル基、３－エチルオクタノイル基、３，７－ジメチルオクタノイル基、ウンデカノイル基、ドデカノイル基、トリデカノイル基、テトラデカノイル基、ペンタデカノイル基、ヘキサデカノイル基、１－メチルペンタデカノイル基、１４－メチルペンタデカノイル基、１３，１３－ジメチルテトラデカノイル基、ヘプタデカノイル基、１５－メチルヘキサデカノイル基、オクタデカノイル基、１－メチルヘプタデカノイル基、ノナデカノイル基、アイコサノイル基およびヘナイコサノイル基のようなアルキルカルボニル基；スクシノイル基、グルタロイル基、アジポイル基のようなカルボキシ化アルキルカルボニル基；クロロアセチル基、ジクロロアセチル基、トリクロロアセチル基、トリフルオロアセチル基のようなハロゲノ低級アルキルカルボニル基；メトキシアセチル基のような低級アルコキシ低級アルキルカルボニル基；（Ｅ）－２－メチル－２－ブテノイル基のような不飽和アルキルカルボニル基が挙げられる。また、芳香族アシル基の例としては、ベンゾイル基、α－ナフトイル基、β－ナフトイル基のようなアリールカルボニル基；２－ブロモベンゾイル基、４－クロロベンゾイル基のようなハロゲノアリールカルボニル基；２，４，６－トリメチルベンゾイル基、４－トルオイル基のような低級アルキル化アリールカルボニル基；４－アニソイル基のような低級アルコキシ化アリールカルボニル基；２－カルボキシベンゾイル基、３－カルボキシベンゾイル基、４－カルボキシベンゾイル基のようなカルボキシ化アリールカルボニル基；４－ニトロベンゾイル基、２－ニトロベンゾイル基のようなニトロ化アリールカルボニル基；２－（メトキシカルボニル）ベンゾイル基のような低級アルコキシカルボニル化アリールカルボニル基；４－フェニルベンゾイル基のようなアリール化アリールカルボニル基などが挙げられる。好適には、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、ペンタノイル基、ピバロイル基、ベンゾイル基である。
　本明細書において、用語「炭素数２から８のアルキレン基」とは、メチレン基（－ＣＨ２－）の繰り返しにより構成される炭素数２～８の二価の基を指して言う。具体的な例としては、－ＣＨ２ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－、および－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－が挙げられる。さらに、用語「炭素数１から３の直鎖アルキル基か、－ＮＨＲ４ｂ［ここで、Ｒ４ｂは水素原子または炭素数１から３の直鎖アルキル基である］か、または－ＯＲ５ｂ［ここで、Ｒ５ｂは水素原子または炭素数１から３の直鎖アルキル基である］かで置換されていてもよい、炭素数２から８のアルキレン基」とは、未置換の上記炭素数２から８のアルキレン基、すなわちメチレン基の繰り返しのみにより構成される炭素数２～８の二価の基内の少なくとも１つの水素原子が、炭素数１から３の直鎖アルキル基、－ＮＨＲ４ｂ、または－ＯＲ５ｂで置換された基を指して言う。
　本明細書において、用語「炭素数２から８のアルケニレン基」とは、－ＣＨ＝ＣＨ－；および少なくとも１つのメチレン基と、１つの炭素－炭素二重結合（－ＣＨ＝ＣＨ－）との組み合わせにより構成される炭素数２～８の二価の基；を包含して言う。具体的な例としては、－ＣＨ＝ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２－、および－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ２－が挙げられる。さらに、用語「炭素数１から３の直鎖アルキル基か、－ＮＨＲ４ｂ［ここで、Ｒ４ｂは水素原子または炭素数１から３の直鎖アルキル基である］か、または－ＯＲ５ｂ［ここで、Ｒ５ｂは水素原子または炭素数１から３の直鎖アルキル基である］かで置換されていてもよい、炭素数２から８のアルケニレン基」とは、未置換の上記炭素数２から８のアルケニレン基内の少なくとも１つの水素原子が、炭素数１から３の直鎖アルキル基、－ＮＨＲ４ｂ、または－ＯＲ５ｂで置換された基を指して言う。
　本明細書において、用語「シリル基」の例としては、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、イソプロピルジメチルシリル基、ｔ－ブチルジメチルシリル基、メチルジイソプロピルシリル基、メチルジ－ｔ－ブチルシリル基、トリイソプロピルシリル基のようなトリ低級アルキルシリル基；ジフェニルメチルシリル基、ブチルジフェニルブチルシリル基、ジフェニルイソプロピルシリル基、フェニルジイソプロピルシリル基のような１～２個のアリール基で置換されたトリ低級アルキルシリル基などが挙げられる。好適には、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ｔ－ブチルジメチルシリル基、ｔ－ブチルジフェニルシリル基であり、さらに好適にはトリメチルシリル基である。
　本明細書において、用語「ハロゲン原子」としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、またはヨウ素原子が挙げられる。好適には、フッ素原子または塩素原子である。
　本明細書において、用語「核酸合成のアミノ基の保護基」、「核酸合成の水酸基の保護基」、「核酸合成の保護基で保護された水酸基」、「核酸合成の保護基で保護されたリン酸基」、「核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基」の「保護基」とは、核酸合成の際に安定してアミノ基、水酸基、リン酸基またはメルカプト基を保護し得るものであれば、特に制限されない。具体的には、酸性または中性条件で安定であり、加水素分解、加水分解、電気分解、および光分解のような化学的方法により開裂し得る保護基のことをいう。このような保護基としては、例えば、低級アルキル基、低級アルケニル基、アシル基、テトラヒドロピラニルまたはテトラヒドロチオピラニル基、テトラヒドロフラニルまたはテトラヒドロチオフラニル基、シリル基、低級アルコキシメチル基、低級アルコキシ化低級アルコキシメチル基、ハロゲノ低級アルコキシメチル基、低級アルコキシ化エチル基、ハロゲン化エチル基、１～３個のアリール基で置換されたメチル基、「低級アルキル基、低級アルコキシ基、ハロゲン原子またはシアノ基でアリール環が置換された１～３個のアリール基で置換されたメチル基」、低級アルコキシカルボニル基、「ハロゲン原子、低級アルコキシ基またはニトロ基で置換されたアリール基」、「ハロゲン原子またはトリ低級アルキルシリル基で置換された低級アルコキシカルボニル基」、アルケニルオキシカルボニル基、「低級アルコキシまたはニトロ基でアリール環が置換されていてもよいアラルキルオキシカルボニル基」などが挙げられる。
　より具体的には、テトラヒドロピラニル基またはテトラヒドロチオピラニル基としては、テトラヒドロピラン－２－イル基、３－ブロモテトラヒドロピラン－２－イル基、４－メトキシテトラヒドロピラン－４－イル基、テトラヒドロチオピラン－４－イル基、４－メトキシテトラヒドロチオピラン－４－イル基などが挙げられる。テトラヒドロフラニル基またはテトラヒドロチオフラニル基としては、テトラヒドロフラン－２－イル基、テトラヒドロチオフラン－２－イル基が挙げられる。低級アルコキシメチル基としては、メトキシメチル基、１，１－ジメチル－１－メトキシメチル基、エトキシメチル基、プロポキシメチル基、イソプロポキシメチル基、ブトキシメチル基、ｔ－ブトキシメチル基などが挙げられる。低級アルコキシ化低級アルコキシメチル基としては、２－メトキシエトキシメチル基などが挙げられる。ハロゲノ低級アルコキシメチル基としては、２，２，２－トリクロロエトキシメチル基、ビス（２－クロロエトキシ）メチル基などが挙げられる。低級アルコキシ化エチル基としては、１－エトキシエチル基、１－（イソプロポキシ）エチル基などが挙げられる。ハロゲン化エチル基としては、２，２，２－トリクロロエチル基などが挙げられる。１～３個のアリール基で置換されたメチル基としては、ベンジル基、α－ナフチルメチル基、β－ナフチルメチル基、ジフェニルメチル基、トリフェニルメチル基、α－ナフチルジフェニルメチル基、９－アンスリルメチル基などが挙げられる。「低級アルキル基、低級アルコキシ基、ハロゲン原子またはシアノ基でアリール環が置換された１～３個のアリール基で置換されたメチル基」としては、４－メチルベンジル基、２，４，６－トリメチルベンジル基、３，４，５－トリメチルベンジル基、４－メトキシベンジル基、４－メトキシフェニルジフェニルメチル基、４，４’－ジメトキシトリフェニルメチル基、２－ニトロベンジル基、４－ニトロベンジル基、４－クロロベンジル基、４－ブロモベンジル基、４－シアノベンジル基などが挙げられる。低級アルコキシカルボニル基としては、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｔ－ブトキシカルボニル基、イソブトキシカルボニル基などが挙げられる。「ハロゲン原子、低級アルコキシ基またはニトロ基で置換されたアリール基」としては、４－クロロフェニル基、２－フロロフェニル基、４－メトキシフェニル基、４－ニトロフェニル基、２，４－ジニトロフェニル基などが挙げられる。「ハロゲン原子またはトリ低級アルキルシリル基で置換された低級アルコキシカルボニル基」としては、２，２，２－トリクロロエトキシカルボニル基、２－トリメチルシリルエトキシカルボニル基などが挙げられる。アルケニルオキシカルボニル基としては、ビニルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基などが挙げられる。「低級アルコキシまたはニトロ基でアリール環が置換されていてもよいアラルキルオキシカルボニル基」としては、ベンジルオキシカルボニル基、４－メトキシベンジルオキシカルボニル基、３，４－ジメトキシベンジルオキシカルボニル基、２－ニトロベンジルオキシカルボニル基、４－ニトロベンジルオキシカルボニル基などが挙げられる。
　１つの実施形態では、「核酸合成の水酸基の保護基」としては、例えば脂肪族アシル基、芳香族アシル基、１～３個のアリール基で置換されたメチル基、「低級アルキル、低級アルコキシ、ハロゲン、シアノ基でアリール環が置換された１～３個のアリール基で置換されたメチル基」、およびシリル基が挙げられる。あるいは、１つの実施形態では、「核酸合成の水酸基の保護基」としては、例えばアセチル基、ベンゾイル基、ベンジル基、ｐ－メトキシベンゾイル基、ジメトキシトリチル基、モノメトキシトリチル基、ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル基、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基、［（トリイソプロピルシリル）オキシ］メチル（ＴＯＭ）基、［（２－ニトロベンジル）オキシ］メチル（ＮＢＯＭ）基、ビス（アセトキシエトキシ）メチルエーテル（ＡＣＥ）基、テトラヒドロ－４－メトキシ－２Ｈ－ピラン－２－イル（Ｍｔｈｐ）基、１－（２－シアノエトキシ）エチル（ＣＥＥ）基、２－シアノエトキシメチル（ＣＥＭ）基、ｔｅｒｔ－ブチルジチオメチル（ＤＴＭ）基、２－（４－トリルスルホニル）エトキシメチル（ＴＥＭ）基、および４－（Ｎ－ジクロロアセチル－Ｎ－メチルアミノ）ベンジルオキシメチル（４－ＭＡＢＯＭ）基が挙げられる。
　１つの実施形態では、「核酸合成の保護基で保護された水酸基」の保護基としては、例えば脂肪族アシル基、芳香族アシル基、「１～３個のアリール基で置換されたメチル基」、「ハロゲン原子、低級アルコキシ基またはニトロ基で置換されたアリール基」、低級アルキル基、および低級アルケニル基が挙げられる。あるいは、１つの実施形態では、「核酸合成の保護基で保護された水酸基」の保護基としては、例えばベンゾイル基、ベンジル基、２－クロロフェニル基、４－クロロフェニル基、および２－プロペニル基が挙げられる。
　１つの実施形態では、「核酸合成のアミノ基の保護基」としては、例えばアシル基、好適には、ベンゾイル基が挙げられる。
　１つの実施形態では、「核酸合成の保護基で保護されたリン酸基」の「保護基」としては、例えば低級アルキル基、シアノ基で置換された低級アルキル基、アラルキル基、「ニトロ基またはハロゲン原子でアリール環が置換されたアラルキル基」、および「低級アルキル基、ハロゲン原子、またはニトロ基で置換されたアリール基」が挙げられる。あるいは、１つの実施形態では、「核酸合成の保護基で保護されたリン酸基」の「保護基」としては、例えば２－シアノエチル基、２，２，２－トリクロロエチル基、ベンジル基、２－クロロフェニル基、および４－クロロフェニル基が挙げられる。
　１つの実施形態では、「核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基」の「保護基」としては、例えば脂肪族アシル基および芳香族アシル基、好適には、ベンゾイル基が挙げられる。
　本明細書において、－Ｐ（Ｒ４ａ）Ｒ５ａ［式中、Ｒ４ａおよびＲ５ａは、それぞれ独立して、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１から６のアルコキシ基、炭素数１から６のアルキルチオ基、炭素数１から６のシアノアルコキシ基、または炭素数１から６のアルキル基を有するジアルキルアミノ基を表す］で表される基のうち、Ｒ４ａがＯＲ４ｃでありそしてＲ５ａがＮＲ５ｃである基は、「ホスホロアミダイト基」という（ここで、Ｒ４ｃは例えば炭素数１から６のシアノアルコキシ基であり、そしてＲ５ｃは例えば炭素数１から６のアルキル基である）。ホスホロアミダイト基としては、好適には、式－Ｐ（ＯＣ２Ｈ４ＣＮ）（Ｎ（ｉＰｒ）２）で表される基、または式－Ｐ（ＯＣＨ３）（Ｎ（ｉＰｒ）２）で表される基が挙げられる。ここで、ｉＰｒはイソプロピル基を表す。
　本明細書において、用語「ヌクレオシド」および「ヌクレオシド類縁体」とは、プリンまたはピリミジン塩基と糖とが結合した「ヌクレオシド」のうち非天然型のもの、ならびに、プリンおよびピリミジン以外の芳香族複素環および芳香族炭化水素環でプリンまたはピリミジン塩基との代用が可能なものと糖が結合したものをいう。
　本明細書において、用語「人工オリゴヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド類縁体」とは、同一または異なる「ヌクレオシド」または「ヌクレオシド類縁体」がリン酸ジエステル結合で例えば２～５０個結合した「オリゴヌクレオチド」の非天然型誘導体をいう。そのような類縁体としては、好適には、糖部分が修飾された糖誘導体；リン酸ジエステル部分がチオエート化されたチオエート誘導体；末端のリン酸部分がエステル化されたエステル体；プリン塩基上のアミノ基がアミド化されたアミド体が挙げられる。
　本明細書において、用語「その塩」とは、本発明の式（Ｉ）または（ＩＩ）で表される化合物の塩をいう。そのような塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩などの金属塩；アンモニウム塩のような無機塩、ｔ－オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ－メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ－ベンジル－フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニウム塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩のような有機塩等のアミン塩；フッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩のようなハロゲン原子化水素酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩のような低級アルカンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩のようなアリールスルホン酸塩、酢酸塩、リンゴ酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩等の有機酸塩；および、グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩のようなアミノ酸塩が挙げられる。
　本明細書において、用語「その薬理学上許容される塩」としては、本発明の式（ＩＩ）で表されるヌクレオシド構造を少なくとも１つ含有するオリゴヌクレオチド類縁体の塩をいう。そのような塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩などの金属塩；アンモニウム塩のような無機塩、ｔ－オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ－メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ－ベンジル－フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニウム塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩のような有機塩等のアミン塩；フッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩のようなハロゲン原子化水素酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩のような低級アルカンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩のようなアリールスルホン酸塩、酢酸塩、リンゴ酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩等の有機酸塩；および、グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩のようなアミノ酸塩が挙げられる。
　以下、本発明について詳述する。
（架橋型ヌクレオシド）
　本発明の架橋型ヌクレオシドは、以下の式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
　（式中、
　Ｂａｓｅは、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン－９－イル基または２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり、
　Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して、水素原子、核酸合成の水酸基の保護基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１０のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいシリル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいリン酸基、核酸合成の保護基で保護されたリン酸基、－Ｐ（Ｒ４ａ）Ｒ５ａ［式中、Ｒ４ａおよびＲ５ａは、それぞれ独立して、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１から６のアルコキシ基、炭素数１から６のアルキルチオ基、炭素数１から６のシアノアルコキシ基、または炭素数１から６のアルキル基を有するジアルキルアミノ基を表す］を表し、
　Ｘ１は、炭素数１から３の直鎖アルキル基か、－ＮＨＲ４ｂ［ここで、Ｒ４ｂは水素原子または炭素数１から３の直鎖アルキル基である］か、または－ＯＲ５ｂ［ここで、Ｒ５ｂは水素原子または炭素数１から３の直鎖アルキル基である］かで置換されていてもよい、炭素数２から８のアルキレン基；あるいは炭素数１から３の直鎖アルキル基か、－ＮＨＲ４ｂ［ここで、Ｒ４ｂは水素原子または炭素数１から３の直鎖アルキル基である］か、または－ＯＲ５ｂ［ここで、Ｒ５ｂは水素原子または炭素数１から３の直鎖アルキル基である］かで置換されていてもよい、炭素数２から８のアルケニレン基；であり、そして
　Ｘ２は、酸素原子、硫黄原子、－ＮＨ－、－Ｎ（ＣＨ３）－またはメチレン基である）である。
　上記式（Ｉ）において、「Ｂａｓｅ」は、例えばプリン塩基（すなわち、プリン－９－イル基）またはピリミジン塩基（すなわち、２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基）である。これらの塩基は、水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、およびハロゲン原子からなるα群より選択される任意の置換基を１以上有していてもよい。
　上記「Ｂａｓｅ」の具体例としては、アデニニル基、グアニニル基、シトシニル基、ウラシニル基、およびチミニル基、ならびに６－アミノプリン－９－イル基、２，６－ジアミノプリン－９－イル基、２－アミノ－６－クロロプリン－９－イル基、２－アミノ－６－フルオロプリン－９－イル基、２－アミノ－６－ブロモプリン－９－イル基、２－アミノ－６－ヒドロキシプリン－９－イル基、６－アミノ－２－メトキシプリン－９－イル基、６－アミノ－２－クロロプリン－９－イル基、６－アミノ－２－フルオロプリン－９－イル基、２，６－ジメトキシプリン－９－イル基、２，６－ジクロロプリン－９－イル基、６－メルカプトプリン－９－イル基、２－オキソ－４－アミノ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、４－アミノ－２－オキソ－５－フルオロ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、４－アミノ－２－オキソ－５－クロロ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、２－オキソ－４－メトキシ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、２－オキソ－４－メルカプト－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、２－オキソ－４－ヒドロキシ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、２－オキソ－４－ヒドロキシ－５－メチル－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、および４－アミノ－５－メチル－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基が挙げられる。
　あるいは、「Ｂａｓｅ」は、核酸医薬への導入という観点から、以下の構造式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
でそれぞれ表される基、ならびに２－オキソ－４－ヒドロキシ－５－メチル－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、２－オキソ－４－アミノ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、６－アミノプリン－９－イル基、２－アミノ－６－ヒドロキシプリン－９－イル基、４－アミノ－５－メチル－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、および２－オキソ－４－ヒドロキシ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基が好ましい。「Ｂａｓｅ」はまた、オリゴヌクレオチドの合成の際には、上記基を構成する水酸基およびアミノ基が保護基により保護されているものであることが好ましい。
　ここで、１つの実施形態では、式（Ｉ）で表される化合物の一例としては以下の式（Ｉ－１）～（Ｉ－６）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
　（式中、
　Ｂａｓｅ、Ｒ２、Ｒ３、およびＸ２は上記式（Ｉ）で定義されるものと同様であり、そしてＲ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０およびＲ１１はそれぞれ独立して、水素原子、炭素数１から３の直鎖アルキル基、－ＮＨＲ４ｂ［ここで、Ｒ４ｂは水素原子または炭素数１から３の直鎖アルキル基である］、または－ＯＲ５ｂ［ここで、Ｒ５ｂは水素原子または炭素数１から３の直鎖アルキル基である］である）で表される化合物が挙げられる。ここで、例えば、上記式（Ｉ－１）および（Ｉ－４）におけるＲ６およびＲ７はともに水素原子である。あるいは、例えば、上記式（Ｉ－２）および（Ｉ－５）におけるＲ６、Ｒ７、Ｒ８、およびＲ９のすべては水素原子である。あるいは、例えば、上記式（Ｉ－３）および（Ｉ－６）におけるＲ６、Ｒ７、Ｒ８、およびＲ９、Ｒ１０、およびＲ１１のすべては水素原子である。
　あるいは、１つの実施形態では、式（Ｉ）で表される化合物の他の例としては、以下の式（Ｉ’）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
　（式中、Ｂａｓｅ、Ｒ２、Ｒ３、およびＸ１は上記式（Ｉ）で定義されるものと同様である）で表される化合物が挙げられる。
　あるいは、１つの実施形態では、式（Ｉ）で表される化合物の別の例としては以下の式（Ｉ－１）および（Ｉ－４）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
　（式中、Ｂａｓｅ、Ｒ２、Ｒ３、およびＸ２は上記式（Ｉ）で定義されるものと同様であり、そしてＲ６およびＲ７はそれぞれ独立して、水素原子、炭素数１から３の直鎖アルキル基、－ＮＨＲ４ｂ［ここで、Ｒ４ｂは水素原子または炭素数１から３の直鎖アルキル基である］、または－ＯＲ５ｂ［ここで、Ｒ５ｂは水素原子または炭素数１から３の直鎖アルキル基である］である）で表される化合物が挙げられる。ここで、例えば、上記式（Ｉ－１）および（Ｉ－４）におけるＲ６およびＲ７はともに水素原子である。
　あるいは、１つの実施形態では、式（Ｉ）で表される化合物のさらに別の例としては以下の式（Ｉ’－１）および（Ｉ’－４）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
　（式中、Ｂａｓｅ、Ｒ２、およびＲ３は上記式（Ｉ）で定義されるものと同様であり、そしてＲ６およびＲ７はそれぞれ独立して、水素原子、炭素数１から３の直鎖アルキル基、－ＮＨＲ４ｂ［ここで、Ｒ４ｂは水素原子または炭素数１から３の直鎖アルキル基である］、または－ＯＲ５ｂ［ここで、Ｒ５ｂは水素原子または炭素数１から３の直鎖アルキル基である］である）で表される化合物が挙げられる。ここで、例えば、上記式（Ｉ’－１）および（Ｉ’－４）におけるＲ６およびＲ７はともに水素原子である。
　本発明の架橋型ヌクレオシドでは、上記のように式（Ｉ）の６’位に環状の置換基が導入されている。このような構造を有していることにより、本発明のヌクレオシドは当該６’位において異性体の構造を有し得ず、その合成の際に異性体の分離を行う必要性から解放される。さらに、本発明の架橋型ヌクレオシドは、式（Ｉ）の６’位に導入された環状の置換基によって後述するオリゴヌクレオチドにおけるヌクレアーゼ耐性能を向上させることができる。また、このような置換基が有する環のひずみは、糖部のコンホメーションに直接的に影響を及ぼすものである。このため、本発明の架橋型ヌクレオシドは、当該ヌクレオチドを用いて得られたオリゴヌクレオチドに対して、ｓｓＲＮＡとの結合親和性をも一層向上させ得る。
（オリゴヌクレオチド）
　本発明において、オリゴヌクレオチドは、このような式（Ｉ）の架橋型ヌクレオシドを用い、例えば、当該分野において周知のアミダイト法、またはM. Kuwaharaら、Nucleic Acids Res.，2008年，36巻，13号，4257-4265頁に記載されるような三リン酸化を経て容易に製造することができる。
　本発明のオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩（以下、これらをまとめて「本発明のオリゴヌクレオチド」を言うことがある）は、以下の式（ＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
　（式中、
　Ｂａｓｅは、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン－９－イル基または２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり、
　Ｘ１は、炭素数１から３の直鎖アルキル基か、－ＮＨＲ４ｂ［ここで、Ｒ４ｂは水素原子または炭素数１から３の直鎖アルキル基である］か、または－ＯＲ５ｂ［ここで、Ｒ５ｂは水素原子または炭素数１から３の直鎖アルキル基である］かで置換されていてもよい、炭素数２から８のアルキレン基；あるいは炭素数１から３の直鎖アルキル基か、－ＮＨＲ４ｂ［ここで、Ｒ４ｂは水素原子または炭素数１から３の直鎖アルキル基である］か、または－ＯＲ５ｂ［ここで、Ｒ５ｂは水素原子または炭素数１から３の直鎖アルキル基である］かで置換されていてもよい、炭素数２から８のアルケニレン基；であり、そして
　Ｘ２は、酸素原子、硫黄原子、－ＮＨ－、－Ｎ（ＣＨ３）－またはメチレン基である）で表されるヌクレオシド構造を少なくとも１つ含む。
　１つの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドに含まれる式（ＩＩ）のヌクレオシド構造の一例としては以下の式（ＩＩ－１）～（ＩＩ－６）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
　（式中、
　ＢａｓｅおよびＸ２は上記式（ＩＩ）に定義した基と同様であり、そしてＲ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０およびＲ１１はそれぞれ独立して、水素原子、炭素数１から３の直鎖アルキル基、－ＮＨＲ４ｂ［ここで、Ｒ４ｂは水素原子または炭素数１から３の直鎖アルキル基である］、または－ＯＲ５ｂ［ここで、Ｒ５ｂは水素原子または炭素数１から３の直鎖アルキル基である］である）で表されるものが挙げられる。ここで、例えば、上記式（ＩＩ－１）および（ＩＩ－４）におけるＲ６およびＲ７はともに水素原子である。あるいは、例えば、上記式（ＩＩ－２）および（ＩＩ－５）におけるＲ６、Ｒ７、Ｒ８、およびＲ９のすべては水素原子である。あるいは、例えば、上記式（ＩＩ－３）および（ＩＩ－６）におけるＲ６、Ｒ７、Ｒ８、およびＲ９、Ｒ１０、およびＲ１１のすべては水素原子である。
　あるいは、１つの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドに含まれる式（ＩＩ）のヌクレオシド構造の他の例としては以下の式（ＩＩ’）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
　（式中、ＢａｓｅおよびＸ１は上記式（ＩＩ）に定義した基と同様である）で表されるものが挙げられる。
　あるいは、１つの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドに含まれる式（ＩＩ）のヌクレオシド構造の別の例としては以下の式（ＩＩ－１）および（ＩＩ－４）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
　（式中、
　ＢａｓｅおよびＸ２は上記式（ＩＩ）に定義した基と同様であり、そしてＲ６およびＲ７はそれぞれ独立して、水素原子、炭素数１から３の直鎖アルキル基、－ＮＨＲ４ｂ［ここで、Ｒ４ｂは水素原子または炭素数１から３の直鎖アルキル基である］、または－ＯＲ５ｂ［ここで、Ｒ５ｂは水素原子または炭素数１から３の直鎖アルキル基である］である）で表されるものが挙げられる。ここで、例えば、上記式（ＩＩ－１）および（ＩＩ－４）におけるＲ６およびＲ７はともに水素原子である。
　あるいは、１つの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドに含まれる式（ＩＩ）のヌクレオシド構造のさらに別の例としては以下の式（ＩＩ’－１）および（ＩＩ’－４）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
　（式中、
　Ｂａｓｅは上記式（ＩＩ）に定義した基と同様であり、そしてＲ６およびＲ７はそれぞれ独立して、水素原子、炭素数１から３の直鎖アルキル基、－ＮＨＲ４ｂ［ここで、Ｒ４ｂは水素原子または炭素数１から３の直鎖アルキル基である］、または－ＯＲ５ｂ［ここで、Ｒ５ｂは水素原子または炭素数１から３の直鎖アルキル基である］である）で表されるものが挙げられる。ここで、例えば、上記式（ＩＩ’－１）および（ＩＩ’－４）におけるＲ６およびＲ７はともに水素原子である。
　本発明のオリゴヌクレオチドは、上記ヌクレオシド構造を、任意の位置に少なくとも１つ有する。その位置および数は、特に限定されず、目的に応じて適宜設計され得る。
　このようなヌクレオシド構造を含むオリゴヌクレオチド（アンチセンス分子）は、従来の２’，４’－ＢＮＡ／ＬＮＡを用いる場合と比較して、ヌクレアーゼ耐性能が飛躍的に向上する。また、公知の２’，４’－ＢＮＡ／ＬＮＡに匹敵するｓｓＲＮＡ結合親和性を有する。
　これらのことから、本発明の架橋型ヌクレオシドを用いて合成された本発明のオリゴヌクレオチドは、抗腫瘍剤、抗ウイルス剤をはじめとした、特定の遺伝子の働きを阻害して疾病を治療する医薬品（アンチセンス分子）としての有用性が期待される。
　特に、アンチセンス法では、相補センス鎖ＲＮＡに対する結合親和性および生体内ＤＮＡ分解酵素への耐性の両方が必要とされる。一般的に、核酸は、一本鎖状態では、糖部の構造が絶えずＤＮＡ二重鎖に近い形と、ＤＮＡ－ＲＮＡ二重鎖やＲＮＡ二重鎖に近い形との間に「ゆらぎ」が存在する。この「ゆらぎ」を予め二重鎖形成時の配座へと固定化することにより、標的ｓｓＲＮＡに対する結合親和性を向上させることができる。また、核酸分解酵素は、オリゴ核酸のリン酸ジエステル部分を切断するが、糖部等に嵩高い置換基を導入することにより、立体障害を通じてオリゴ核酸の分解を抑制することができる。
　本発明の架橋型ヌクレオシドは、上記の通り６’位に嵩高い環状の置換基を有する。このため、これを用いて得られるオリゴヌクレオチドは、上記ｓｓＲＮＡに対する結合親和性を向上させ、かつ優れた酵素耐性能を有することができる。
　本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、賦形剤、結合剤、防腐剤、酸化安定剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味剤などの医薬の製剤技術分野において通常用いられる補助剤を配合して、非経口投与製剤またはリポソーム製剤とすることができる。また、例えば、当該技術分野で通常用いられる医薬用担体を配合して、液剤、クリーム剤、軟膏剤などの局所用の製剤を調製することができる。
　以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
（実施例１：架橋型ヌクレオシドの合成（１））
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
（１－１）化合物５の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
　アルゴン雰囲気下にて、Yamaguchi, T.ら、Chem. Commun., 2015年, 51号, 9737-9740頁に記載の方法により化合物１からｉ）～ｉｉｉ）の３工程を経て作製した化合物４（３．６９ｇ，８．６１ｍｍｏｌ）および無水塩化セリウム（ＩＩＩ）（７．９９ｇ，３２．４ｍｍｏｌ）の無水テトラヒドロフラン溶液（６０ｍＬ）に、アリルマグネシウムブロミド（３３ｍＬ，３３．０ｍｍｏｌ）を室温で加え、１４時間撹拌した。反応が終了した後に、塩化アンモニウム水溶液を加え、有機層を濃縮した。次いで、セライトでろ過し、濾液を酢酸エチルで抽出した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２，ヘキサン：酢酸エチル＝３２：１から６：１）により精製し、化合物５（４．０６ｇ，９８％）を無色透明の油状物質として得た。
　得られた化合物５の物性データを表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000030
（１－２）化合物６の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
　アルゴン雰囲気下にて、上記で得られた化合物５（１．６０ｇ，３．５４ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン溶液（１１０ｍＬ）に第二世代グラブス触媒（４２５ｍｇ，０．５０１ｍｍｏｌ）を室温で加え、４時間加熱還流した。反応が終了した後に濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２，ヘキサン：酢酸エチル＝３２：１から１０：１）により精製し、化合物６（１．３５ｇ，９０％）を黄淡色の粘性油状物質として得た。
　得られた化合物６の物性データを表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000032
（１－３）化合物７の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
　アルゴン雰囲気下にて、上記で得られた化合物６（１．２１ｇ，２．６７ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン溶液（３１ｍＬ）に２，６－ルチジン（２．２０ｍＬ，１９．０ｍｍｏｌ）とｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリルトリフルオロメタンスルホン酸（３．００ｍＬ，１３．１ｍｍｏｌ）を０℃で加え、室温で２０時間撹拌した。反応が終了した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、有機層を酢酸エチルで抽出した。有機層を水および飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２，ヘキサン：酢酸エチル＝１０：０から９：１）により精製し、化合物７（１．４３ｇ，９４％）を無色透明の粘性油状物質として得た。
　得られた化合物７の物性データを表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000034
（１－４）化合物８の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
　アルゴン雰囲気下にて、上記で得られた化合物７（９１１ｍｇ，１．６１ｍｍｏｌ）の酢酸溶液（１．８５ｍＬ，３２．３ｍｍｏｌ）に無水酢酸（３．０５ｍＬ，３２．３ｍｍｏｌ）とトリフルオロ酢酸（２９５μＬ，３．８６ｍｍｏｌ）とを０℃で加え、室温で２時間撹拌した。反応が終了した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、有機層を酢酸エチルで抽出した。有機層を水および飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２，ヘキサン：酢酸エチル＝９：１から４：１）により精製し、化合物８（８４１ｍｇ，８６％）を無色透明の粘性油状物質として得た。
　得られた化合物８の物性データを表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000036
（１－５）化合物９の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
　アルゴン雰囲気下にて、上記で得られた化合物８（３８９ｍｇ，０．６３７ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリル溶液（５．６ｍＬ）にチミン（２４２ｍｇ，１．９１ｍｍｏｌ），Ｎ，Ｏ－ビス－トリメチルシリルアセトアミド（７８０μＬ，３．１８ｍｍｏｌ）を室温で順次加え、室温で１時間撹拌した。その後、アルゴン雰囲気下にて、トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホン酸（１７５μｌ，０．９６９ｍｍｏｌ）を０℃で加え、５時間加熱還流した。反応が終了した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、有機層を酢酸エチルで抽出した。有機層を水および飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２，ヘキサン：酢酸エチル＝９：１から４：１）により精製し、化合物９（３８５ｍｇ，８９％）を白色固体として得た。
　得られた化合物９の物性データを表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000038
（１－６）化合物１０の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
　アルゴン雰囲気下にて、上記で得られた化合物９（９８６ｍｇ，１．４６ｍｍｏｌ）のメタノール溶液（１４．６ｍＬ）に炭酸カリウム（６０７ｍｇ，４．３９ｍｍｏｌ）を０℃で加え、室温で５時間撹拌した。反応が終了した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、有機層をジエチルエーテルで抽出した。有機層を水および飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２，ヘキサン：酢酸エチル＝４：１から１：１）により精製し、化合物１０（８９５ｍｇ，９７％）を白色固体として得た。
　得られた化合物１０の物性データを表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000040
（１－７）化合物１１の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
　アルゴン雰囲気下にて、上記で得られた化合物１０（８９５ｍｇ，１．４１ｍｍｏｌ）の脱水ピリジン溶液（１４．５ｍＬ）にメタンスルホン酸クロリド（１７０μＬ，２．１９ｍｍｏｌ）を０℃で加え、室温で４時間撹拌した。反応が終了した後、水を加え、有機層を酢酸エチルで抽出した。有機層を水および飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２，ヘキサン：酢酸エチル＝９：１から４：１）により精製し、化合物１１（９９２ｍｇ，定量的）を白色固体として得た。
　得られた化合物１１の物性データを表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000042
（１－８）化合物１２の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000043
　アルゴン雰囲気下にて、上記で得られた化合物１１（９９２ｍｇ，１．３９ｍｍｏｌ）の脱水テトラヒドロフラン溶液（１３．９ｍＬ）にテトラブチルアンモニウムフルオリドのテトラヒドロフラン溶液（４．１８ｍＬ，４．１８ｍｍｏｌ）を０℃で加え、室温で３０時間撹拌した。反応が終了した後、水を加え、有機層を酢酸エチルで抽出した。有機層を水および飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧留去した。得られた残渣を精製することなく、この残渣のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド溶液（１３．９ｍＬ）に炭酸カリウム（５７７ｍｇ，４．１７ｍｍｏｌ）を０℃で加え、９０℃で２０時間撹拌した。反応が終了した後、水を加え、有機層をジエチルエーテルで抽出した。有機層を水および飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２，ヘキサン：酢酸エチル＝４：１から１：２）により精製し、化合物１２（５８３ｍｇ，８３％（２工程））を白色固体として得た。
　得られた化合物１２の物性データを表８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000044
（１－９）化合物１３の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000045
　水素ガス雰囲気下にて、上記で得られた化合物１２（１１０ｍｇ，０．２１９ｍｍｏｌ）の酢酸エチル溶液（２．１５ｍＬ）に２０％水酸化パラジウム／カーボン（４４ｍｇ，４０重量部（化合物１２（１００重量部）に対して））を室温で加え、数回フラスコ内を水素ガスで置換しながら室温で０．５時間撹拌した。反応が終了した後、ろ過し、酢酸エチルで洗浄した。次いで、溶媒を減圧留去し、得られた残渣をＰＬＣプレート（ＳｉＯ２，クロロホルム：メタノール＝７：１）により精製し、化合物１３（５７ｍｇ，８０％）を白色固体として得た。
　得られた化合物１３の物性データを表９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000046
（１－１０）化合物１４の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000047
　アルゴン雰囲気下にて、上記で得られた化合物１３（１７０ｍｇ，０．５２４ｍｍｏｌ）の無水ピリジン溶液（５．３ｍＬ）に４，４’－ジメトキシトリチルクロリド（３２０ｍｇ，０．９４４ｍｍｏｌ）を０℃で加え、室温で８時間撹拌した。反応が終了した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、有機層を酢酸エチルで抽出した。有機層を水および飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下で留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２，１％トリエチルアミン含有、ヘキサン：酢酸エチル＝４：１から１：４）により精製し、化合物１４（３２９ｍｇ，定量的）を白色固体として得た。
　得られた化合物１４の物性データを表１０に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000048
（１－１１）化合物１５の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000049
　アルゴン雰囲気下、上記で得られた化合物１４（３２９ｍｇ，０．５２５ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン溶液（５．３ｍＬ）にＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（２７５μＬ，１．６１ｍｍｏｌ）と２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルホスホロクロリダート（１７５μＬ，０．７８４ｍｍｏｌ）を０℃で順次加え、室温で８時間撹拌した。反応が終了した後に溶媒を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２，１％トリエチルアミン含有、ヘキサン：酢酸エチル＝４：１から２：１）と再沈殿（トルエン／ヘキサン）により精製し、化合物１５（２５２ｍｇ，５８％）を白色固体として得た。
　得られた化合物１５の物性データを表１１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000050
　上記化合物１から化合物１５を得るまでの一連の合成経路を通じて、最終的に得られた化合物１５の総収率は２２％であった。これは、例えば特許文献１および非特許文献５に記載される架橋型ヌクレオシド（ｓｃｐＢＮＡ）の合成経路で得られる最終生成物の総収率（１８％）と比較して、高い値であり、本実施例の架橋型ヌクレオシドが効率良く合成できたことがわかる。
（実施例２：架橋型ヌクレオシドの合成（２））
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000051
（２－１）化合物１６の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000052
　窒素気流下、上記実施例１（１－１０）で得られた化合物１４（６２６ｍｇ，９９９μｍｏｌ）の無水ピリジン溶液（１０ｍＬ）に、クロロトリエチルシラン（０．４５ｍＬ，３．０ｍｍｏｌ）を０℃で加え、室温で４時間撹拌した。反応終了後、飽和重曹水を０℃で加え、酢酸エチルで抽出し、水と飽和食塩水で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、溶媒を減圧留去した。得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｓｉ２，ｎ－ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）で精製し、化合物１６（５３１ｍｇ，７２％）を白色泡状固体として得た。
　得られた化合物１６の物性データを表１２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000053
（２－２）化合物１７の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000054
　窒素気流下、上記で得られた化合物１６（３２９ｍｇ，４４４μｍｏｌ）とトリエチルアミン（１．１ｍＬ，８ｍｍｏｌ）、１，２，４－トリアゾール（５３７ｍｇ，７．８ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリル溶液（４．８ｍＬ）に、塩化ホスホリル（１３６μＬ，１．５ｍｍｏｌ）を０℃で滴下した。室温で１時間撹拌した後、反応溶液に飽和重曹水を加え、酢酸エチルで抽出し、水と飽和食塩水で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣の１，４－ジオキサン溶液（２．０ｍＬ）に、２８重量％アンモニア水溶液（５００μＬ，７．３ｍｍｏｌ）を０℃で加え、室温で１．５時間撹拌した。反応終了後、溶媒を減圧留去した。得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２，クロロホルム：メタノール＝２０：１）で精製し、化合物１７（３２２ｍｇ，９８％，２工程）を白色泡状固体として得た。
　得られた化合物１７の物性データを表１３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000055
（２－３）化合物１８の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000056
　窒素気流下、上記で得られた化合物１７（３２２ｍｇ，０．４３５ｍｍｏｌ）の無水ピリジン溶液（４．５ｍＬ）に塩化ベンゾイル（１００μＬ，０．８６ｍｍｏｌ）を０℃で加え、室温で２．５時間撹拌した。反応終了後、飽和重曹水を加え、酢酸エチルで抽出し、水と飽和食塩水で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、溶媒を減圧留去した。得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２，ｎ－ヘキサン：酢酸エチル＝５：１）で精製し、化合物１８（２２９ｍｇ，６２％）を白色泡状固体として得た。
　得られた化合物１８の物性データを表１４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000057
（２－４）化合物１９の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000058
　上記で得られた化合物１８（１０８ｍｇ，１２１μｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（１．２ｍＬ）に１Ｍのテトラブチルアンモニウムフルオリド／テトラヒドロフラン溶液（１２０μＬ，１２０μｍｏｌ）を０℃加え、室温で２０分間撹拌した。反応終了後、溶媒を減圧留去した。得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２，クロロホルム：メタノール＝２０：１）　により精製し、化合物１９（１０１ｍｇ，定量的）を白色泡状固体として得た。
　得られた化合物１９の物性データを表１５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000059
（２－５）化合物２０の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000060
　窒素気流下、上記で得られた化合物１９（７１ｍｇ，９７．３μｍｏｌ）の無水アセトニトリル溶液（９８０μＬ）に２－シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトライソプロピルホスホジアミダイト（９５μＬ，２９５μｍｏｌ）、４，５－ジシアノイミダゾール（３５ｍｇ，２９０μｍｏｌ）を０℃で加え、室温で２時間撹拌した。反応終了後、溶媒を減圧留去した。得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２，１％トリエチルアミン含有ｎ－ヘキサン：酢酸エチル＝３：１）で精製し、化合物２０（７３ｍｇ，８１％）を白色泡状固体として得た。
　得られた化合物２０の物性データを表１６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000061
（実施例３）オリゴヌクレオチドの合成および精製（１）
　実施例１で作製された化合物１５（ｓｃｐＢＮＡ２ｎｄ－Ｔ）をアミダイトブロックとして用い、以下のようにしてオリゴヌクレオチドを合成した。オリゴヌクレオチドを構成する化合物１５以外の化合物は、特に表記がない限り、Ｐｒｏｌｉｇｏ社から購入した。以下のオリゴヌクレオチドを合成した。
ＯＮ１：５’－ｄ（ＧＣＧＴＴＹＴＴＴＧＣＴ）－３’（配列番号１）
ＯＮ２：５’－ｄ（ＧＣＧＹＴＹＴＹＴＧＣＴ）－３’（配列番号２）
ＯＮ３：５’－ｄ（ＧＣＧＴＹＹＹＹＴＧＣＴ）－３’（配列番号３）
ＯＮ４：５’－ｄ（ＧＣＧＹＹＹＹＹＹＧＣＴ）－３’（配列番号４）
ＯＮ５：５’－ｄ（ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＹ）－３’
ＯＮ６：５’－ｄ（ＴＴＴＴＴＴＴＴＹＴ）－３’
Ｙ＝化合物１５（ｓｃｐＢＮＡ２ｎｄ－Ｔ）
　実施例１で作製された化合物１５から、各々０．１Ｍの無水アセトニトリルまたは無水ジクロロメタン溶液として調製し、ＧｅｎｅＤｅｓｉｇｎ社製ｎＳ－８　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒに仕込んだ。各合成をトリチルオン条件で行った。活性化剤にはＡｃｔｉｖａｔｏｒ－４２（登録商標）（Ｐｒｏｌｉｇｏ社製）（０．２５Ｍアセトニトリル溶液）を用い、縮合時間は化合物１５を１５０秒×５に延長した。その他の操作については通常のホスホロアミダイト法に従って合成を行った。
　合成完了後、生成物を、２８％アンモニア水溶液を用いて室温下で１．５時間処理してカラム担体からの切り出しを行い、次いで５５℃で１０時間静置することで塩基部の脱保護を行った。その後、簡易逆相カラム（Ｗａｔｅｒｓ社製Ｓｅｐ－Ｐａｋ（登録商標）Ｐｌｕｓ　Ｃ１８　Ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ）により精製し、さらに逆相ＨＰＬＣにて精製を行った。
　精製したオリゴヌクレオチドの組成をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳ測定により決定した。当該測定にあたり、まず、３－ヒドロキシピコリン酸水溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）とクエン酸二アンモニウム水溶液（１ｍｇ／ｍＬ）とを１：１の容量比で混合したマトリックス（１μＬ）を乾燥させたアンカーチップ上に、オリゴヌクレオチド水溶液（５０μＭ，１μＬ）を載せて再度乾燥させ、その後ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳ測定を行った。分子量の測定をネガティブモードで行い、オリゴチミジル酸（７ｍｅｒ、９ｍｅｒ、１１ｍｅｒおよび１３ｍｅｒ）を外部標準として用いた。また、合成したオリゴヌクレオチドの定量を、吸光度測定装置（株式会社島津製作所製ＳＨＩＭＡＤＺＵ　ＵＶ－１８００）を用いて２６０ｎｍにおける紫外部吸収を測定することで行った。
　この結果を以下の表１７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000062
（実施例４）二重鎖形成能の評価
　ＯＮ１～ＯＮ４について二重鎖形成能を調べた。対照として、天然ＤＮＡを用いた５’－ｄ（ＧＣＧＴＴＴＴＴＴＧＣＴ）－３’（「ＯＮ９」：配列番号５）もまた用いた。標的鎖として一本鎖オリゴＲＮＡ５’－ｒ（ＡＧＣＡＡＡＡＡＡＣＧＣ）－３’（配列番号６）および一本鎖オリゴＤＮＡ５’－ｄ（ＡＧＣＡＡＡＡＡＡＣＧＣ）－３’（配列番号７）を用いた。
　オリゴヌクレオチドの二重鎖形成能を、各種オリゴヌクレオチドと標的鎖とをアニーリング処理して二重鎖を形成させた後、Ｔｍ値を測定することにより調べた。より詳細には、各オリゴヌクレオチド（終濃度４μＭ）と塩化ナトリウム（終濃度１００ｍＭ）のリン酸緩衝液（１０ｍＭ，ｐＨ７．２，１３０μＬ）の混合液を沸騰水中に浴し、室温までゆっくり冷却した。その後、窒素気流下で５℃まで冷却し、測定を開始した。０．５℃／分で９０℃または１１０℃まで昇温し、０．５℃間隔で２６０ｎｍにおける吸光度をプロットした。Ｔｍ値を中線法により算出し、独立した３回の測定における平均値とした。
　表１８に結果を示す。表１８中、一本鎖オリゴＲＮＡに対する結果を「ｓｓＲＮＡ」、一本鎖オリゴＤＮＡに対する結果を「ｓｓＤＮＡ」に示し、そして各オリゴヌクレオチドの人工修飾核酸１塩基当たりのＴｍ変動温度（「ΔＴｍ／ｍｏｄ．」）とＲＮＡ選択性（ＲＮＡに対する融解温度とＤＮＡに対する融解温度との差）を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000063
　化合物１５を用いた場合、一本鎖オリゴＤＮＡおよび一本鎖オリゴＲＮＡの両方とも、天然のオリゴヌクレオチド（ＯＮ９）と比べて高い融解温度を示した。さらに、化合物１５を用いた場合、特に一本鎖オリゴＲＮＡに対して天然のオリゴヌクレオチド（ＯＮ９）と比べてＴｍ値が上昇し、よって、一本鎖オリゴＲＮＡに対する高い結合親和性を示した。また、化合物１５を用いた場合、ＲＮＡ選択性が見られた。
　（実施例５）ヌクレアーゼ耐性能の評価
　ＯＮ５および以下の１０ｍｅｒの配列のオリゴヌクレオチドを合成および精製し、被験オリゴヌクレオチドとして用いた：
５’－ｄ（ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＸ）－３’
（１）Ｘ＝化合物１５（ＯＮ５：「ｓｃｐＢＮＡ２ｎｄ－Ｔ」）
（２）Ｘ＝ホスホロチオエートチミジン（「ＰＳ－Ｔ」：ホスホロチオエート化に関しては、０．０５Ｍの（（ジメチルアミノ－メチリデン）アミノ）－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾリン－３－チオン（ＤＤＴＴ）（ピリジン／アセトニトリル（３：２）溶液、ＧＬＥＮ　ＲＥＳＥＡＲＣＨ社）を用いた。）
（３）Ｘ＝スピロシクロプロピレンＢＮＡ（特許文献１および非特許文献５：「ｓｃｐＢＮＡ－Ｔ」）
　７．５μＭ被験オリゴヌクレオチドと１０ｍＭ塩化マグネシウムを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、１．５μｇ／ｍＬの３’－エキソヌクレアーゼ（Crotalus adamanteus venom phosphodiesterase，ＣＡＶＰ）を加え、３７℃でインキュベートした。インキュベーションの開始時（０分）、２．５分後、５分後、１０分後、２０分後、４０分後にそれぞれ２０μＬずつ試料を取り出し、逆相ＨＰＬＣで解析し、未切断のオリゴヌクレオチドの割合を算出した。また、評価は独立した３回の測定により導き出した。
　結果を図１に示す。図１中、黒菱形は上記（１）の結果を表し、黒丸は上記（２）の結果を表し、そして黒三角は上記（３）を表す。図１から明らかなように、化合物１５を有するオリゴヌクレオチド（上記（１））は、ヌクレアーゼ処理の４０分後でも約７０％が未切断で残存しており、分解されにくかった。化合物１５を有するオリゴヌクレオチド（上記（１））では、ホスホロチオエート化（ＰＳ）オリゴ（上記（２））およびスピロシクロプロピレンＢＮＡを有するオリゴヌクレオチド（上記（３））と比べて非常に高いヌクレアーゼ耐性がみられた。
（実施例６）オリゴヌクレオチドの合成および精製（２）
　実施例１で作製された化合物１５（ｓｃｐＢＮＡ２ｎｄ－Ｔ）と実施例２で作製された化合物２０（ｓｃｐＢＮＡ２ｎｄ－ＭｅＣ）をアミダイトブロックとして用い、実施例３と同様にして表１９に示すオリゴヌクレオチドを合成した。なお、ホスホロチオエート化に関しては、０．０５Ｍの（（ジメチルアミノ－メチリデン）アミノ）－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾリン－３－チオン（ＤＤＴＴ）（ピリジン／アセトニトリル（３：２）溶液、ＧＬＥＮ　ＲＥＳＥＡＲＣＨ社）を用いた。得られたオリゴヌクレオチドであるＯＮｓ２１、ＯＮｓ２２、ＯＮｓ２３およびＯＮｄ１の配列をそれぞれ配列番号８～１１にも示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000064
（実施例７）毒性低減効果の評価
　６週齢のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、雄）の腹腔内に、表２０に示す被験オリゴヌクレオチド（２０ｍｇ／ｋｇ）を投与した（５匹／群）。９６時間後、吸入麻酔下（イソフルラン）で採血を行い、放血安楽死させた。その後、血清中のアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）およびアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）の活性を自動分析装置（ＦＵＪＩＦＩＬＭ製　富士ドライケム４０００Ｖ）により測定した。
　なお、表２０に示す被験オリゴヌクレオチドについて、ＯＮｄ１（配列番号１１）は、実施例１で作製された化合物１５（ｓｃｐＢＮＡ２ｎｄ－Ｔ）をアミダイトブロックとして用い、実施例６と同様にして作製した。ＯＮｄ０（配列番号１２）は、化合物１５（ｓｃｐＢＮＡ２ｎｄ－Ｔ）をアミダイトブロックに含まない以外はＯＮｄ１と同様にして作製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000065
　表２１は、被験オリゴヌクレオチドを投与した場合ならびに生理食塩水投与の場合の血液中のアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）およびアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）の活性を示す。肝毒性を示すことが知られているＯＮｄ０を投与した群では、マウスが５匹全て死亡した。一方で、ＯＮｄ０の配列の一部を本発明にて置換したＯＮｄ１は、ほとんどＡＬＴとＡＳＴの上昇を示しておらず、毒性の低減効果が確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000066
（実施例８）アンチセンス活性の評価
　実施例１で作製された化合物１５（ｓｃｐＢＮＡ２ｎｄ－Ｔ）と実施例２で作製された化合物２０（ｓｃｐＢＮＡ２ｎｄ－ＭｅＣ）を含むオリゴヌクレオチド（ONs21、ONs22、ONs23：実施例６にて作製）と、化合物１５と化合物２０に代えてＬＮＡを含むオリゴヌクレオチド（ONs01）とについて、各組織におけるアンチセンス活性を調べた。
　これらの４つのオリゴヌクレオチドの塩基配列は、ＭＡＬＡＴ１に対するアンチセンス核酸として設計した。ONs01は、化合物１５と化合物２０に代えてＬＮＡをアミダイトブロックとして用い、実施例３と同様にして合成した。ONs21、ONs22、ONs23およびONs01の配列を以下の表２２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000067
　６週齢のマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｌＣｒｌｊ、雌）の尾静脈に、被験オリゴヌクレオチド（２０ｎｍｏｌ：１００μＭ生理食塩水溶液を２００μＬ）を投与した（５匹／群）。７２時間後、吸入麻酔下（イソフルラン）で採血を行い、放血安楽死させた。その後、各組織を採取し、ＲＮＡ抽出（使用キット：ＲＮｅａｓｙ）を行った。各組織におけるＭＡＬＡＴ１のｍＲＮＡ発現量をリアルタイムＰＣＲ（使用キット：One Step TB Green（登録商標）PrimeScriptTM RT-PCR Kit（Perfect Real Time）、タカラバイオ株式会社製）により測定した。リアルタイムＰＣＲでは、以下のプライマーを使用した：
MALAT1 forward：ａｃａｔｔｃｃｔｔｇａｇｇｔｃｇｇｃａａ（配列番号１４）
MALAT1 reverse：ｃａｃｃｃｇｃａａａｇｇｃｃｔａｃａｔａ（配列番号１５）
GAPDH forward：ｔｃａｃｃａｃｃａｔｇｇａｇａａｇｇｃ（配列番号１６）
GAPDH reverse：ｇｃｔａａｇｃａｇｔｔｇｇｔｇｇｔｇｃａ（配列番号１７）
　結果を図２および図３に示す。図２および図３は、各種オリゴヌクレオチド投与時のマウスの各種組織における相対的ＭＡＬＡＴ１発現レベルを示す（図２：肝臓、心臓、腎臓、膵臓、骨格筋、肺および胃、ならびに図３：脾臓、皮膚、大腸、脳、乳腺、眼球および軟骨）。「相対的ＭＡＬＡＴ１発現レベル」は、生理食塩水のみ投与（オリゴヌクレオチドなし）の場合の発現レベルを１とした場合の相対値として表した。図２および図３中、結果を示す棒の表示を、コントロール（生理食塩水のみ投与）、化合物１５と化合物２０に代えてＬＮＡを含むオリゴヌクレオチド（ONs01）および化合物１５と化合物２０を含むオリゴヌクレオチド（ONs21、ONs22、ONs23）の間で区別した。
　化合物１５と化合物２０を含むオリゴヌクレオチド（ONs21, ONs22, ONs23）は、多くの組織において、化合物１５と化合物２０に代えてＬＮＡを含むオリゴヌクレオチド（ONs01）と比較して同等かそれ以上の高い標的遺伝子抑制効果を示した。
　本発明によれば、ホスホロチオエート修飾核酸の代替とすることが可能な新規架橋型ヌクレオシドおよびそれを用いたヌクレオチドが提供される。本発明の架橋型ヌクレオシドを用いて得られるオリゴヌクレオチドは、例えば、核酸医薬への素材として有用である。

Claims (9)

  1. 　以下の式（Ｉ）で表される化合物またはその塩：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     　（式中、
    　Ｂａｓｅは、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン－９－イル基または２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり、
    　Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して、水素原子、核酸合成の水酸基の保護基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１０のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいシリル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいリン酸基、核酸合成の保護基で保護されたリン酸基、－Ｐ（Ｒ４ａ）Ｒ５ａ［式中、Ｒ４ａおよびＲ５ａは、それぞれ独立して、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１から６のアルコキシ基、炭素数１から６のアルキルチオ基、炭素数１から６のシアノアルコキシ基、または炭素数１から６のアルキル基を有するジアルキルアミノ基を表す］を表し、
    　Ｘ１は、炭素数１から３の直鎖アルキル基か、－ＮＨＲ４ｂ［ここで、Ｒ４ｂは水素原子または炭素数１から３の直鎖アルキル基である］か、または－ＯＲ５ｂ［ここで、Ｒ５ｂは水素原子または炭素数１から３の直鎖アルキル基である］かで置換されていてもよい、炭素数２から８のアルキレン基；あるいは炭素数１から３の直鎖アルキル基か、－ＮＨＲ４ｂ［ここで、Ｒ４ｂは水素原子または炭素数１から３の直鎖アルキル基である］か、または－ＯＲ５ｂ［ここで、Ｒ５ｂは水素原子または炭素数１から３の直鎖アルキル基である］かで置換されていてもよい、炭素数２から８のアルケニレン基；であり、そして
    　Ｘ２は、酸素原子、硫黄原子、－ＮＨ－、－Ｎ（ＣＨ３）－またはメチレン基である）。
  2. 　前記式（Ｉ）が以下の式：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     　（式中、
    　Ｂａｓｅは、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン－９－イル基または２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり、
    　Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して、水素原子、核酸合成の水酸基の保護基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１０のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいシリル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいリン酸基、核酸合成の保護基で保護されたリン酸基、－Ｐ（Ｒ４ａ）Ｒ５ａ［式中、Ｒ４ａおよびＲ５ａは、それぞれ独立して、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１から６のアルコキシ基、炭素数１から６のアルキルチオ基、炭素数１から６のシアノアルコキシ基、または炭素数１から６のアルキル基を有するジアルキルアミノ基を表す］を表し、
    　Ｘ２は、酸素原子、硫黄原子、－ＮＨ－、－Ｎ（ＣＨ３）－またはメチレン基であり、そして
    　Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０およびＲ１１はそれぞれ独立して、水素原子、炭素数１から３の直鎖アルキル基、－ＮＨＲ４ｂ［ここで、Ｒ４ｂは水素原子または炭素数１から３の直鎖アルキル基である］、または－ＯＲ５ｂ［ここで、Ｒ５ｂは水素原子または炭素数１から３の直鎖アルキル基である］である）で表される、請求項１に記載の化合物またはその塩。
  3. 　前記式（Ｉ）が以下の式：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     　（式中、
    　Ｂａｓｅは、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン－９－イル基または２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり、
    　Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して、水素原子、核酸合成の水酸基の保護基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１０のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいシリル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいリン酸基、核酸合成の保護基で保護されたリン酸基、－Ｐ（Ｒ４ａ）Ｒ５ａ［式中、Ｒ４ａおよびＲ５ａは、それぞれ独立して、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１から６のアルコキシ基、炭素数１から６のアルキルチオ基、炭素数１から６のシアノアルコキシ基、または炭素数１から６のアルキル基を有するジアルキルアミノ基を表す］を表し、
    　Ｘ２は、酸素原子、硫黄原子、－ＮＨ－、－Ｎ（ＣＨ３）－またはメチレン基であり、そして
    　Ｒ６およびＲ７はそれぞれ独立して、水素原子、炭素数１から３の直鎖アルキル基、－ＮＨＲ４ｂ［ここで、Ｒ４ｂは水素原子または炭素数１から３の直鎖アルキル基である］、または－ＯＲ５ｂ［ここで、Ｒ５ｂは水素原子または炭素数１から３の直鎖アルキル基である］である）で表される、請求項１に記載の化合物またはその塩。
  4. 　前記式（Ｉ）において、前記Ｂａｓｅが、６－アミノプリン－９－イル基、２，６－ジアミノプリン－９－イル基、２－アミノ－６－クロロプリン－９－イル基、２－アミノ－６－フルオロプリン－９－イル基、２－アミノ－６－ブロモプリン－９－イル基、２－アミノ－６－ヒドロキシプリン－９－イル基、６－アミノ－２－メトキシプリン－９－イル基、６－アミノ－２－クロロプリン－９－イル基、６－アミノ－２－フルオロプリン－９－イル基、２，６－ジメトキシプリン－９－イル基、２，６－ジクロロプリン－９－イル基、６－メルカプトプリン－９－イル基、２－オキソ－４－アミノ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、４－アミノ－２－オキソ－５－フルオロ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、４－アミノ－２－オキソ－５－クロロ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、２－オキソ－４－メトキシ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、２－オキソ－４－メルカプト－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、２－オキソ－４－ヒドロキシ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、２－オキソ－４－ヒドロキシ－５－メチル－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、または４－アミノ－５－メチル－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基である、請求項１から３のいずれかに記載の化合物またはその塩。
  5. 　前記式（Ｉ）において、前記Ｂａｓｅが、以下の式：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     で表される基である、請求項１から４のいずれかに記載の化合物またはその塩。
  6. 　以下の式（ＩＩ）で表されるヌクレオシド構造を少なくとも１つ含有するオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     　（式中、
    　Ｂａｓｅは、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン－９－イル基または２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり、
    　Ｘ１は、炭素数１から３の直鎖アルキル基か、－ＮＨＲ４ｂ［ここで、Ｒ４ｂは水素原子または炭素数１から３の直鎖アルキル基である］か、または－ＯＲ５ｂ［ここで、Ｒ５ｂは水素原子または炭素数１から３の直鎖アルキル基である］かで置換されていてもよい、炭素数２から８のアルキレン基；あるいは炭素数１から３の直鎖アルキル基か、－ＮＨＲ４ｂ［ここで、Ｒ４ｂは水素原子または炭素数１から３の直鎖アルキル基である］か、または－ＯＲ５ｂ［ここで、Ｒ５ｂは水素原子または炭素数１から３の直鎖アルキル基である］かで置換されていてもよい、炭素数２から８のアルケニレン基；であり、そして
    　Ｘ２は、酸素原子、硫黄原子、－ＮＨ－、－Ｎ（ＣＨ３）－またはメチレン基である）。
  7. 　前記式（ＩＩ）が以下の式：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     　（式中、
    　Ｂａｓｅは、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン－９－イル基または２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり、
    　Ｘ２は、酸素原子、硫黄原子、－ＮＨ－、Ｎ（ＣＨ３）－またはメチレン基であり、そして
    　Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０およびＲ１１はそれぞれ独立して、水素原子、炭素数１から３の直鎖アルキル基、－ＮＨＲ４ｂ［ここで、Ｒ４ｂは水素原子または炭素数１から３の直鎖アルキル基である］、または－ＯＲ５ｂ［ここで、Ｒ５ｂは水素原子または炭素数１から３の直鎖アルキル基である］である）で表される、請求項６に記載のオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩。
  8. 　前記式（ＩＩ）が以下の式：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
     　（式中、
    　　Ｂａｓｅは、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン－９－イル基または２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり、
    　　Ｘ２は、酸素原子、硫黄原子、－ＮＨ－、－Ｎ（ＣＨ３）－またはメチレン基であり、そして
    　　Ｒ６およびＲ７はそれぞれ独立して、水素原子、炭素数１から３の直鎖アルキル基、－ＮＨＲ４ｂ［ここで、Ｒ４ｂは水素原子または炭素数１から３の直鎖アルキル基である］、または－ＯＲ５ｂ［ここで、Ｒ５ｂは水素原子または炭素数１から３の直鎖アルキル基である］である）で表される、請求項６に記載のオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩。
  9. 　請求項６に記載のオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩の製造方法であって、
    　以下の式（Ｉ）で表される化合物またはその薬理学上許容される塩：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
     　（式中、
    　Ｂａｓｅは、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン－９－イル基または２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり、
    　Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して、水素原子、核酸合成の水酸基の保護基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１０のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいシリル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいリン酸基、核酸合成の保護基で保護されたリン酸基、－Ｐ（Ｒ４ａ）Ｒ５ａ［式中、Ｒ４ａおよびＲ５ａは、それぞれ独立して、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１から６のアルコキシ基、炭素数１から６のアルキルチオ基、炭素数１から６のシアノアルコキシ基、または炭素数１から６のアルキル基を有するジアルキルアミノ基を表す］を表し、
    　Ｘ１は、炭素数１から３の直鎖アルキル基か、－ＮＨＲ４ｂ［ここで、Ｒ４ｂは水素原子または炭素数１から３の直鎖アルキル基である］か、または－ＯＲ５ｂ［ここで、Ｒ５ｂは水素原子または炭素数１から３の直鎖アルキル基である］かで置換されていてもよい、炭素数２から８のアルキレン基；あるいは炭素数１から３の直鎖アルキル基か、－ＮＨＲ４ｂ［ここで、Ｒ４ｂは水素原子または炭素数１から３の直鎖アルキル基である］か、または－ＯＲ５ｂ［ここで、Ｒ５ｂは水素原子または炭素数１から３の直鎖アルキル基である］かで置換されていてもよい、炭素数２から８のアルケニレン基；であり、そして
    　Ｘ２は、酸素原子、硫黄原子、－ＮＨ－、－Ｎ（ＣＨ３）－またはメチレン基である）
    　を用いてオリゴヌクレオチドを合成する工程を包含する、方法。
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