WO2021172559A1 - ブロック共重合体、及びその製造方法 - Google Patents

ブロック共重合体、及びその製造方法 Download PDF

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WO2021172559A1
WO2021172559A1 PCT/JP2021/007499 JP2021007499W WO2021172559A1 WO 2021172559 A1 WO2021172559 A1 WO 2021172559A1 JP 2021007499 W JP2021007499 W JP 2021007499W WO 2021172559 A1 WO2021172559 A1 WO 2021172559A1
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WO
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acid
hydroxycarboxylic
copolymer
segment
hydroxybutyric
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PCT/JP2021/007499
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French (fr)
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謙一郎 松本
俊昭 福居
静流 石原
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Hokkaido University NUC
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Hokkaido University NUC
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G63/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a carboxylic ester link in the main chain of the macromolecule
    • C08G63/02—Polyesters derived from hydroxycarboxylic acids or from polycarboxylic acids and polyhydroxy compounds
    • C08G63/06—Polyesters derived from hydroxycarboxylic acids or from polycarboxylic acids and polyhydroxy compounds derived from hydroxycarboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters
    • C12P7/625—Polyesters of hydroxy carboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y208/00—Transferases transferring sulfur-containing groups (2.8)
    • C12Y208/03—CoA-transferases (2.8.3)
    • C12Y208/03001—Propionate CoA-transferase (2.8.3.1)

Definitions

  • the present invention relates to a block copolymer and a method for producing the same, and more particularly to a block copolymer having a homopolymerized segment and a copolymerized segment, and a method for producing the same.
  • a copolymer is a polymer compound synthesized by polymerizing two or more types of monomers, and is excellent in physical properties such as elasticity, transparency, processability, and light weight as compared with other materials such as metal. .. Therefore, it is often used in various industrial fields such as medical treatment.
  • a block copolymer composed of a chain in which two or more kinds of polymers (segments) having different properties are connected by a covalent bond is expected to be a material having the characteristics of each constituent segment.
  • PHA polyhydroxyalkanoates
  • 3HB 3-hydroxybutyric acid
  • 3HHx 3-hydroxyhexanoic acid
  • the present invention has been made in view of the problems of the prior art, and an object of the present invention is to provide a block copolymer having a homopolymerized segment and a copolymerized segment.
  • the hydroxycarboxylic acid (A) consists of a group consisting of 2-hydroxybutyric acid, 2-hydroxyacetic acid, 2-hydroxypropionic acid, 2-hydroxypentanoic acid, 2-hydroxyhexanoic acid and medium-chain 2-hydroxyalkanoic acid. At least one hydroxycarboxylic acid of choice,
  • the hydroxycarboxylic acid (B) is 3-hydroxybutyric acid, 3-hydroxyhexanoic acid, 3-hydroxypropionic acid, 3-hydroxypentanoic acid, medium-chain 3-hydrochialkanoic acid, 4-hydroxy-2-methylbutyric acid, 4-.
  • the copolymer according to ⁇ 1> which is at least one hydroxycarboxylic acid selected from the group consisting of hydroxybutyric acid, 2,4-dihydroxybutyric acid, 5-hydroxypentanoic acid and 6-hydroxyhexanoic acid.
  • the hydroxycarboxylic acid (A) is 2-hydroxybutyric acid
  • the hydroxycarboxylic acid (B) is 3-hydroxybutyric acid and 3-hydroxycaproic acid
  • the copolymer according to ⁇ 1> which has a homopolymerized segment composed of 2-hydroxybutyric acid and a copolymerized segment containing 3-hydroxybutyric acid and 3-hydroxyhexanoic acid.
  • ⁇ 4> The copolymerized segment of hydroxycarboxylic acid (A) being 2-hydroxyacetic acid, hydroxycarboxylic acid (B) being 3-hydroxybutyric acid, and 3-hydroxybutyric acid, 2-hydroxyacetic acid and 3-.
  • the copolymer according to ⁇ 1> which has a copolymer segment containing hydroxybutyric acid.
  • the hydroxycarboxylic acid (A) is 2-hydroxyacetic acid
  • the hydroxycarboxylic acid (B) is 3-hydroxybutyric acid and 3-hydroxycaproic acid
  • the copolymer according to ⁇ 1> which has a homopolymerized segment composed of 3-hydroxybutyric acid and a copolymerized segment containing 2-hydroxyacetic acid, 3-hydroxybutyric acid and 3-hydroxyhexanoic acid.
  • ⁇ 6> The method for producing a copolymer according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 5>.
  • a method comprising a step of recovering the copolymer from the culture obtained in the step.
  • a block copolymer (P (2HB-b- (3HB-co-3HHx)) in which a homopolymer composed of 2HB and a random polymer composed of 3HB and 3HHx are bonded is provided.
  • this block copolymer has higher extensibility than the copolymer P (2HB-b-3HB) disclosed in Non-Patent Document 2.
  • P (2HB-b- (3HB-co-3HHx)) has a very high extensibility of over 1200%.
  • a block copolymer (P (3HB-b- (GL-co-3HB))) in which a homopolymer composed of 3HB and a copolymer composed of GL and 3HB are bonded.
  • a block copolymer (P (3HB-b- (GL-co-3HB-co-3HHx)) in which a homopolymer composed of 3HB and a copolymer composed of GL, 3HB and 3HHx are bonded.
  • these block copolymers have improved non-enzymatic hydrolyzability due to the introduction of GL, and thus exhibit high degradability in vivo.
  • the copolymerized segment of P (3HB-b- (GL-co-3HB-co-3HHx)) adopts a gradient structure. Further, the flexibility of the copolymer is greatly improved by introducing 3HHx.
  • 2HB, g of 3HB and 3HHx, of the copolymer obtained by using a polymerization enzyme PhaC AR shows the results of the 1 H NMR spectrum analysis, Chart It is a figure.
  • phacNSDG a modified PHA synthase gene derived from Aeromonas caviae
  • phaCAR chimeric PHA synthase gene derived from Aeromonas caviae
  • the present invention provides a block copolymer having a homopolymerized segment and a copolymerized segment, and more specifically, it provides a block copolymer.
  • a hydroxycarboxylic acid (A) having a hydroxy group only at the 2-position and a hydroxycarboxylic acid (B) having a hydroxy group at a site other than the 2-position, and the hydroxycarboxylic acid (A) and the hydroxycarboxylic acid (B) A homopolymerized segment consisting of 1 hydroxycarboxylic acid selected from the group consisting of Provided is a copolymer having a copolymerization segment containing at least 2 hydroxycarboxylic acids selected from the group consisting of hydroxycarboxylic acid (A) and hydroxycarboxylic acid (B).
  • the copolymer of the present invention is obtained by polymerizing a hydroxycarboxylic acid by an ester bond and has at least two types of segments.
  • the "segment” is a structural unit constituting each block in a block copolymer, and is a unit (homopolymerization segment) composed of one type of monomer (hydroxycarboxylic acid described later) or a plurality of types. It is a unit (copolymerization segment) composed of the monomers of.
  • a plurality of types of monomers are randomly polymerized, a random polymerization segment, a constituent monomer composition is continuously changed, a gradient polymerization segment, and a plurality of types of monomers are alternately used. Examples thereof include alternating polymerization segments that are polymerized.
  • the number of monomers constituting each segment in the copolymer of the present invention is not particularly limited, but when used as a material, it is preferably 100 or more, usually 500 or more, and more preferably 4000. That is all.
  • hydroxycarboxylic acid can be divided into two types: a monohydroxycarboxylic acid having a hydroxy group only at the 2-position and a hydroxycarboxylic acid having a hydroxy group at a site other than the 2-position.
  • a monohydroxycarboxylic acid having a hydroxy group only at the 2-position and a hydroxycarboxylic acid having a hydroxy group at a site other than the 2-position.
  • it may be a hydroxycarboxylic acid having a plurality of hydroxy groups, and in that case, it may be a hydroxy carboxylic acid having a hydroxy group at the 2-position in addition to a site other than the 2-position.
  • hydroxycarboxylic acid (A) examples include 2-hydroxyacetic acid (glycolic acid, GL), 2-hydroxybutyric acid (2HB), and 2 -Hydroxypropionic acid (lactic acid, 2HP), 2-hydroxypentanoic acid (2-hydroxyvaleric acid), 2-hydroxyhexanoic acid, medium-chain 2-hydroxyalkanoic acid can be mentioned. More specifically, the medium-chain 2-hydroxyalkanoic acid includes 2-hydroxyalkanoic acid derived from an amino acid (derived from the side chain structure of the amino acid). (See Sudo M. et al., J Biosci Bioeng. 2019 Oct 18.
  • the hydroxycarboxylic acid (A) according to the present invention means not only one type of monohydroxycarboxylic acid having a hydroxy group only at the 2-position but also a plurality of types of monohydroxycarboxylic acid having a hydroxy group only at the 2-position. .. Among these, 2-hydroxyacetic acid is preferable from the viewpoint that the non-enzymatic hydrolyzability is improved by being introduced into the copolymer, and the high degradability in the living body is easily exhibited.
  • an isotactic polymer having a three-dimensional structure similar to that of poly-D-lactic acid (PDLA), which imparts transparency to the material, can be obtained, and the glass transition temperature of the polymer is higher than that of other 2-hydroxycarboxylic acids.
  • PDLA poly-D-lactic acid
  • 2-Hydroxybutyric acid is preferable from the viewpoint of facilitating biosynthesis due to its low value.
  • hydroxycarboxylic acid (B) examples include 3-hydroxypropionic acid (3HP), 3-hydroxybutyric acid (3HB), and 3. -Hydroxyhexanoic acid (3HHx), 3-hydroxypentanoic acid (3-hydroxyvaleric acid, 3HV), medium-chain 3-hydrochialkanoic acid, 4-hydroxy-2-methylbutyric acid (4H2MB), 4-hydroxybutyric acid, 2, Examples thereof include 4-dihydroxybutyric acid (24DHB), 5-hydroxypentanoic acid (5-hydroxyvaleric acid, 5HV), and 6-hydroxyhexanoic acid (6HHx).
  • the hydroxycarboxylic acid (B) according to the present invention includes not only one type of hydroxycarboxylic acid having a hydroxy group at a site other than the 2-position, but also a plurality of types of hydroxycarboxylic acids having a hydroxy group at a site other than the 2-position. means.
  • 3-hydroxybutyric acid is preferable from the viewpoint of being most efficiently synthesized from various carbon sources and imparting strength to the material, and its flexibility is improved by introducing it into a copolymer.
  • 3-Hydroxyhexanoic acid is preferable from the viewpoint of
  • the combination of the hydroxycarboxylic acid (A) and the hydroxycarboxylic acid (B) is not particularly limited as long as it can form the above-mentioned two types of segments, and is, for example, 2-hydroxybutyric acid and 3-hydroxy.
  • Butyric acid and 3-hydroxyhexanoic acid 2-hydroxyacetic acid and 3-hydroxybutyric acid; 2-hydroxyacetic acid, 3-hydroxybutyric acid and 3-hydroxyhexanoic acid; 2-hydroxybutyric acid, 3-hydroxybutyric acid and 3-hydroxypropionic acid; 2-Hydroxybutyric acid, 3-hydroxybutyric acid and 4-hydroxy-2-methylbutyric acid; 2-hydroxybutyric acid, 3-hydroxybutyric acid and 2,4-dihydroxybutyric acid; 2-hydroxybutyric acid, 3-hydroxybutyric acid and 5-hydroxykichi Grass acid; 2-hydroxybutyric acid, 3-hydroxybutyric acid and 6-hydroxyhexanoic acid; 2-hydroxybutyric acid, 3-hydroxypropionic acid and 4-hydroxy-2-methylbutyric acid; 2-hydroxybutyric acid, 3-hydroxypropionic acid and 2 , 4-Dihydroxybutyric acid; 2-hydroxybutyric acid, 3-hydroxypropionic acid and 5-hydroxyvaleric acid; 2-hydroxybutyric acid, 3-hydroxypropionic acid and
  • the molecular weight of the copolymer of the present invention composed of such a combination is not particularly limited, but it is said that sufficient mechanical strength is obtained and a sufficient molecular weight is maintained even after the molecular weight is reduced by melt molding.
  • the number average molecular weight is preferably 10,000 or more, more preferably 100,000 or more, and further preferably 1 million or more.
  • the upper limit is not particularly limited, but is usually 10 million or less from the viewpoint of difficulty in manufacturing.
  • copolymer of the present invention will be further described below with examples of specific combinations.
  • those containing 2-hydroxybutyric acid, 3-hydroxybutyric acid and 3-hydroxyhexanoic acid include a homopolymerized segment composed of 2-hydroxybutyric acid and 3-hydroxybutyric acid and 3-hydroxyhexanoic acid. It has a copolymerization segment containing.
  • the copolymer segment in the copolymer has a random copolymer structure.
  • the molecular weight (number average molecular weight) of the copolymer is not particularly limited, but is preferably 10 from the viewpoint of obtaining sufficient mechanical strength and maintaining a sufficient molecular weight even after the molecular weight is reduced by melt molding. It is 10,000 or more, more preferably 1 million or more.
  • the random copolymer segment of 3-hydroxybutyric acid and 3-hydroxycaproic acid is 50 mol% or more of the total polymer. It is preferable, and more preferably 70 mol% or more. From the viewpoint of exhibiting sufficient flexibility, the composition of the random segment preferably contains 3-hydroxycaproic acid in an amount of 5 mol% or more, more preferably 20 mol% or more.
  • the composition of 2-hydroxybutyric acid is uniquely determined by determining the amount ratio of the homopolymerized segment and the copolymerized segment.
  • the copolymer of the present invention containing 2-hydroxyacetic acid and 3-hydroxybutyric acid has a homopolymerized segment composed of 3-hydroxybutyric acid and a copolymerized segment containing 2-hydroxyacetic acid and 3-hydroxybutyric acid. ..
  • the copolymer segment in the copolymer has a random copolymer structure.
  • the molecular weight (number average molecular weight) of such a copolymer is not particularly limited, but when it is used as a material, it exhibits mechanical strength and further retains a sufficient molecular weight even after the molecular weight is reduced by melt molding. From this point of view, it is preferably 10,000 or more, and more preferably 1 million or more.
  • the content ratio of 2-hydroxyacetic acid and 3-hydroxybutyric acid is not particularly limited from the viewpoint of controlling the mechanical characteristics of the material, but when used as a hard segment, 2-hydroxyacetic acid is 50 mol%. The above is preferable, and more preferably 70 mol% or more. On the other hand, when used as a soft segment, 2-hydroxyacetic acid is preferably 50 mol% or less, more preferably 10 to 30 mol%.
  • copolymers of the present invention those containing 2-hydroxyacetic acid, 3-hydroxybutyric acid and 3-hydroxyhexanoic acid are homopolymerized segments composed of 3-hydroxybutyric acid, 2-hydroxyacetic acid, 3-hydroxybutyric acid and 3 -Has a copolymerized segment containing hydroxyhexanoic acid.
  • the copolymerized segment of the copolymer has a gradient polymerization structure.
  • the lower limit of the molecular weight (number average molecular weight) of the copolymer is not particularly limited, but when it is used as a material, it exhibits mechanical strength and maintains a sufficient molecular weight even after the molecular weight is reduced by melt molding. From the viewpoint, it is preferably 10,000 or more, and more preferably 1 million or more.
  • the content of 3-hydroxycaproic acid is preferably 10 mol% or more, more preferably 30 mol% or more.
  • the contents of 2-hydroxyacetic acid and 3-hydroxybutyric acid are preferably 70 mol% or less for both, and more preferably 50 mol% or less for both.
  • the amount of the hard homopolymerized segment is preferably 50 mol% or less, more preferably 30 mol% or less.
  • Those containing hydroxyhexanoic acid have a homopolymerized segment composed of 2-hydroxybutyric acid and a copolymerized segment containing 3-hydroxybutyric acid, 3-hydroxypropionic acid and the like.
  • the copolymer segment in the copolymer has a random copolymer structure.
  • the molecular weight of the copolymer is preferably 100,000 or more by weight average in order to develop strength enough to be processed into a material, and more preferably about 1 million (for example, 500,000 to 2 million, 800,000 to 150). Ten thousand).
  • the monomer composition of the random segment can be appropriately adjusted by those skilled in the art in order to obtain the desired physical properties, but 3-hydroxybutyric acid is the main component, and 3-hydroxypropionic acid and 4-hydroxy-2-methyl are used.
  • 3-hydroxybutyric acid is the main component, and 3-hydroxypropionic acid and 4-hydroxy-2-methyl are used.
  • a random segment containing butyric acid, 5-hydroxyvaleric acid or 6-hydroxycaproic acid is synthesized for the purpose of softening the poly-3-hydroxybutyric acid skeleton, 0 to 50 mol% of components other than 3-hydroxybutyric acid are used. In order to develop appropriate flexibility and strength, it is more preferably about 5 to 20 mol% (for example, 1 to 40 mol%, 3 to 30 mol%).
  • the composition of 2,4-dihydroxybutyric acid is about 5 to 20 mol% (for example, 1 to 40 mol%, 3 to 30 mol%). It is preferable to have.
  • the purpose is to make a soft segment with a unit other than 3-hydroxybutyric acid (3-hydroxypropionic acid, 4-hydroxy-2-methylbutyric acid, 5-hydroxyvaleric acid or 6-hydroxycaproic acid) as the main component. In this case, it is preferable to adjust the components other than 3-hydroxybutyric acid to 50 to 100 mol%.
  • the proportion of components other than 3-hydroxybutyric acid is high, but in order to achieve compatibility with the synthesis efficiency of the polymer, it is about 80 to 95 mol% (for example, 60 to 99 mol%, 70 to 97 mol). %) Is preferable.
  • 2-hydroxybutyric acid, 3-hydroxypropionic acid, 4-hydroxy-2-methylbutyric acid, 2,4-dihydroxybutyric acid, 5-hydroxyvaleric acid or 6-hydroxyhexanoic acid are used. It has a homopolymerized segment composed of 2-hydroxybutyric acid and a copolymerized segment containing 3-hydroxypropionic acid, 4-hydroxy-2-methylbutyric acid and the like.
  • the copolymer segment in the copolymer has a random copolymer structure.
  • the fraction of 3-hydroxypropionic acid and other units in the segment can be used in any composition, and examples thereof include 100% or 90 mol% of 3-hydroxypropionic acid.
  • the molecular weight is preferably 100,000 or more in terms of weight average molecular weight.
  • those containing 2-hydroxybutyric acid, 3-hydroxybutyric acid and 3-hydroxyvaleric acid include a homopolymerized segment composed of 2-hydroxybutyric acid and 3-hydroxybutyric acid and 3-hydroxyvaleric acid. It has a copolymerization segment containing.
  • the copolymer segment in the copolymer has a random copolymer structure.
  • the copolymerization segment preferably contains 10 to 30 mol% of 3-hydroxyvaleric acid.
  • the molecular weight is preferably 100,000 or more in terms of weight average molecular weight.
  • Step 1 A step of culturing a microorganism expressing CoA transferase and a polymerization enzyme in a medium containing hydroxycarboxylic acid (A) and hydroxycarboxylic acid (B), and Step 2: The step of recovering the copolymer from the culture obtained in the above step is included. Provide a method.
  • the "CoA transferase” means an enzyme that catalyzes the reaction in which CoA (coenzyme A) is transferred to the above-mentioned hydroxycarboxylic acid.
  • CoA coenzyme A
  • a hydroxycarboxylic acid having 5 or less carbon atoms is targeted, propionic acid CoA transferase can be mentioned.
  • PCT Propionate CoA transferase
  • EC enzyme number
  • the origin of the PCT according to the present invention is not particularly limited as long as it retains its catalytic activity, but from the viewpoint of easy expression of a different host in Escherichia, Pseudomonas genus, Ralstonia ( Those derived from bacteria belonging to the genus Ralstonia, Pseudomonas, or Escherichia are preferable, those derived from bacteria belonging to the genus Megasphera are more preferable, and those derived from Megasphaera elsden are more preferable. (Protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1) is more preferable.
  • nucleotide sequence is mutated in nature.
  • amino acid encoded by it can be changed accordingly. Therefore, in the PCT according to the present invention, as long as it has the catalytic activity, one or more amino acids are substituted or deleted in the wild-type amino acid sequence derived from the bacterium (for example, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1).
  • a protein (modified) consisting of an added and / or inserted amino acid sequence is also included.
  • plural means 100 amino acids or less, preferably 80 amino acids or less, more preferably 50 amino acids or less, still more preferably 30 amino acids or less, more preferably 20 amino acids or less, still more preferably 10 amino acids or less. Particularly preferably, it is within a few amino acids (for example, within 5 amino acids, within 3 amino acids, or within 2 amino acids).
  • homologous gene from the same species or other bacteria by using the gene (nucleotide sequence) information.
  • Methods for identifying homologous genes include, for example, hybridization techniques (Southern, EM, J. Mol. Biol., 98: 503, 1975) and polymerase chain reaction (PCR) techniques (Saiki, R. et al.). K., et al. Science, 230: 1350-1354, 1985, Saiki, RK et al. Science, 239: 487-491, 1988).
  • hybridization reactions are usually performed under stringent conditions.
  • 6M urea, 0.4% SDS, 0.5xSSC conditions or equivalent stringency hybridization conditions can be exemplified. Isolation of genes with higher homology can be expected by using conditions with higher stringency, such as 6M urea, 0.4% SDS, and 0.1xSSC.
  • the PCT according to the present invention also includes a protein encoded by a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA consisting of the wild-type nucleotide acid sequence derived from the bacterium as long as it has the catalytic activity.
  • the protein encoded by the identified homologous gene usually has high homology (high similarity), preferably high identity with that derived from the bacterium.
  • high means at least 50% or more, preferably 60% or more, more preferably 70% or more, still more preferably 80% or more, more preferably 85% or more (for example, 90% or more, 95% or more). 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more).
  • the PCT according to the present invention also includes a protein consisting of an amino acid sequence having at least 50% or more homology (similarity) or identity with the wild-type amino acid sequence derived from the bacterium as long as it has the catalytic activity. ..
  • the sequence homology can be determined by using a BLAST program (Altschul et al. J. Mol. Biol., 215: 403-410, 1990).
  • the program is based on the algorithm BLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 2264-2268, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877, 1993) by Karlin and Altschul.
  • the amino acid sequence is analyzed using the Gapped BLAST program, it can be performed as described in Altschul et al. (Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997).
  • BLAST and Gapped BLAST programs use the default parameters of each program. Specific methods of these analysis methods are known.
  • Whether or not the above-mentioned variant or homologue of PCT has the above-mentioned catalytic activity can be determined by those skilled in the art, for example, A.I. E. The catalytic activity thereof can be measured and determined by using the method described in Hofmeister et al. (Eur. J. Biochem., Vol. 206, pp. 547-552).
  • an acyl-CoA synthetase is used as a preferable example of the CoA transferase according to the present invention. Be done.
  • AlkK Acyl-CoA synthetase
  • EC enzyme number
  • AlkK Acyl-CoA synthetase
  • the origin of AlkK according to the present invention is not particularly limited as long as it retains its catalytic activity, but from the viewpoint of having sufficient activity against medium-chain 3-hydroxycarboxylic acid, Pseudomonas (Pseudomonas) ) Derived from bacteria belonging to the genus, more preferably derived from Pseudomonas putida, more preferably derived from Pseudomonas putida, and even more preferably derived from Pseudomonas putida KT24. (Protein composed of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2) is more preferable (see Wang et al. Appl Environ Microbiol. 2012 Jan; 78 (2): 519-527).
  • AlkK according to the present invention is substituted with one or more amino acids in the wild-type amino acid sequence derived from the bacterium (for example, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2) as long as it has the catalytic activity.
  • proteins (variants) consisting of deleted, added, and / or inserted amino acid sequences.
  • “plurality” means 100 amino acids or less, preferably 80 amino acids or less, more preferably 50 amino acids or less, still more preferably 30 amino acids or less, more preferably 20 amino acids or less, still more preferably 10 amino acids or less. Particularly preferably, it is within a few amino acids (for example, within 5 amino acids, within 3 amino acids, or within 2 amino acids).
  • AlkK includes a protein encoded by a DNA that hybridizes with a DNA consisting of a wild-type nucleotide acid sequence derived from the bacterium under stringent conditions as long as it has the catalytic activity, and a wild-type derived from the bacterium. Also included is a protein consisting of an amino acid sequence having at least 50% or more homology (similarity) or identity with the amino acid sequence.
  • Whether or not the modified or homologous of AlkK has the catalytic activity can be determined by a person skilled in the art, for example, by specifically oxidizing acyl CoA generated by the reaction of the enzyme with acyl CoA oxidase.
  • the hydrogen peroxide produced here was mixed with 4-aminoantipyrine and 3-methyl-N-ethyl-N- (2-hydroxyethyl) aniline, N, N-dimethylaniline, N, N in the presence of peroxidase.
  • -It can be determined by using a method of detecting by developing a color with diethylaniline or phenol.
  • the "polymerizing enzyme” may be an enzyme that catalyzes the reaction of polymerizing the above-mentioned hydroxycarboxylic acid to which CoA is transferred to form the above-mentioned homopolymerized segment and copolymerized segment, and is, for example, (1).
  • a polymerization enzyme capable of recognizing a hydroxycarboxylic acid having a hydroxy group only at the 2-position and (2) a hydroxycarboxylic acid having no hydroxy group at the 2-position and controlling the polymerization reaction can be mentioned.
  • the type 1 polyhydroxyalcan enzyme (PhaC) having the above-mentioned catalytic activity or a variant thereof is mentioned, and more preferably, it is a type 1 PhaC or a variant thereof derived from a bacterium belonging to the genus Aeromonas. More preferably, it is Type 1 PhaC or a variant thereof derived from Aeromonas caviae. More preferably, it is a chimeric polymer enzyme in which the N-terminal portion of type 1 PhaC derived from a bacterium belonging to the genus Aeromonas and the C-terminal portion of type 1 PhaC derived from a bacterium belonging to the genus Aeromonas are fused, and more preferably Aeromonas.
  • -A chimeric type polymerizable enzyme in which the N-terminal portion of type 1 PhaC derived from Aeromonas caviae and the C-terminal portion of type 1 PhaC derived from Aeromonas caviae are fused, and more preferably Aeromonas caviae.
  • a chimeric polymer enzyme (PhaC AR , in SEQ ID NO: 3) in which a 26% N-terminal portion of type 1 PhaC derived from a bacterium and a 74% C-terminal portion of type 1 PhaC derived from Larstonia eutropha are fused. (Protein consisting of the described amino acid sequence)) (see Matsumoto K. et al., Biomacromoleculees. 2009 Apr 13; 10 (4): 682-685).
  • the polymerization enzyme according to the present invention contains one or more amino acids in the amino acid sequence of the enzyme (for example, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3) as long as it has the catalytic activity. Also included are proteins (modifiers) consisting of substituted, deleted, added, and / or inserted amino acid sequences.
  • proteins modifiers
  • "plurality” means 100 amino acids or less, preferably 80 amino acids or less, more preferably 50 amino acids or less, still more preferably 30 amino acids or less, more preferably 20 amino acids or less, still more preferably 10 amino acids. Within, particularly preferably within a few amino acids (eg, within 5 amino acids, within 3 amino acids, within 2 amino acids).
  • Such modifications include, for example, in PhaC AR , at least one amino acid substitution selected from the group consisting of F314X, I320X, G423X, V448X and I505X (“X” means an amino acid different from that before the substitution). do). Since the 3HHx polymerization ability is enhanced by such amino acid substitution, for example, when 3HHx is used as the hydroxycarboxylic acid (B), the 3HHx fraction in the copolymer according to the present invention can be improved.
  • the polymerization enzyme according to the present invention includes a protein encoded by a DNA consisting of a nucleotide acid sequence encoding the enzyme and a DNA encoding under stringent conditions as long as it has the catalytic activity, and an amino acid sequence of the enzyme. Also included is a protein consisting of an amino acid sequence having at least 50% or more homology (similarity) or identity.
  • the copolymer of the present invention can be produced by culturing a microorganism expressing the above-mentioned two kinds of enzymes.
  • a microorganism that naturally expresses these enzymes can be used, but usually, a transformant prepared by introducing a DNA encoding the enzyme into the microorganism is used.
  • the "microorganism” according to the present invention is not particularly limited as long as it is a microorganism capable of functionally expressing the polyhydroxyalkanoate (PHA) synthase group, but for example, Escherichia coli, hydrogen bacteria (cupriavidus necator, etc.). Cupriavidus necator), coryneform bacteria, yeasts, Ralstonia spp., Pseudomonas spp.
  • Escherichia coli and hydrogen bacteria are preferable, and Escherichia coli is more preferable, from the viewpoint of polymer productivity and its production stability.
  • the strain of Escherichia coli is not particularly limited, but from the viewpoint of enabling more stable copolymer production, as an example, E. coli. Colli JM109 strain can be mentioned. Further, as shown in Examples described later, from the viewpoint of being able to biosynthesize the hydroxycarboxylic acid (B) (3HB, 3HV, 3HHx, etc.) according to the present invention, Ralstonia bacteria are preferable, and Ralstonia eutropha is more preferable.
  • Ralstonia eutropha glucose assimilation modified strain (H16 NSDG-GG- ⁇ B1 strain) is more preferable, and H16 CAR-GG- ⁇ B1 and H16 CAR-GG- ⁇ B1-ldhAhadA shown in Examples described later are more preferable. ..
  • the above DNA is usually introduced in a form incorporated in a vector. It may also be introduced into the chromosome by homologous recombination.
  • the DNA is appropriately controlled by a promoter on the chromosome. Must be built in as shown below.
  • the "vector” exists as a self-replicating vector, that is, an extrachromosomal independent entity, and its replication does not depend on chromosomal replication, for example, it can be constructed on the basis of a plasmid.
  • the vector may also be one that, when introduced into a host cell, integrates into the genome of the host cell and replicates with the chromosome into which it has been integrated.
  • Examples of such a vector include plasmid DNA and phage DNA.
  • Examples of the vector to be introduced into Escherichia coli include plasmid DNA such as pBLUescript (pBLUescript KS +, pBLUescript SK +, pBLUescriptII KS +, pBLuescritII KS-, etc.), pBR322, pUC18 and the like, plasmid DNA such as pBR322, pUC18, etc.
  • Examples of vectors for introduction into hydrogen bacteria are pCUP2 (see International Publication No.
  • pLA2917 (ATCC37355) having an RK2 origin of replication that is replicated and retained in a range of hosts, and pJRD215 having an RS F1010 origin of replication. (ATCC37533) and the like can be mentioned.
  • vectors for introduction into coryneform bacteria include pAM330, pHM1519, pAJ655, pAJ611, pAJ1844, pCG1, pCG2, pCG4, pCG11, pHK, pPSPTG1, pVC7, pUC19I and the like.
  • yeast examples include YEp13, YCp50 and the like.
  • the vector for introducing into Ralstonia bacterium, Pseudomonas bacterium and the like the above-mentioned pLA2917 (ATCC37355) and pJRD215 (ATCC37533) can be mentioned.
  • Examples of the vector for homologous recombination include pK18movsacB (Schafer et al., Gene145,69-73 (1994)) and pJQ200 (Quant, J. and Hynes, MP, Gene (1993) 17). 15-21).
  • a known gene recombination technique commonly used in the field of genetic engineering can be used.
  • a method is adopted in which the purified DNA is first cleaved with an appropriate restriction enzyme, inserted into a restriction enzyme site or a multicloning site of an appropriate vector, and ligated to the vector. Will be done.
  • the promoter is not particularly limited as long as it can regulate the transcription of the gene in the host, and can be obtained as a DNA sequence that controls the expression of a gene encoding a protein that is the same as or different from that of the host cell.
  • lac promoter, trp promoter, PL promoter, PR promoter, and T7 promoter can be mentioned.
  • the promoter region of the phb operon of cupriavidus necator can also be used.
  • hydrogen bacteria When hydrogen bacteria are used as a host, examples thereof include a phaC1 gene promoter derived from the bacterium and a phaP1 gene promoter derived from the bacterium.
  • a coryneform bacterium When a coryneform bacterium is used as a host, for example, a cell surface protein gene promoter derived from Corynebacterium glutamicum can be mentioned.
  • yeast When yeast is used as a host, for example, a gal1 promoter and a gal10 promoter can be mentioned.
  • a region containing a promoter upstream of the phaC1Ps gene or upstream of the phbCABRe operon can be used.
  • the vector includes a terminator sequence, an enhancer sequence, a splicing signal sequence, a poly A addition signal sequence, a ribosome binding sequence (SD sequence), etc., which can be used in the microorganism into which the DNA is to be introduced, other than the promoter.
  • Sequences that control expression are also included.
  • a sequence that induces expression may be included. Such sequences include the lactose operon, which can induce the expression of a gene located downstream by the addition of isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside (IPTG).
  • the vector may contain a selectable marker gene, if necessary.
  • the selection marker gene may be appropriately selected depending on the method for selecting the transformed microbial cells, for example, ampicillin resistance gene, tetracycline resistance gene, neomycin resistance gene, canamachine resistance gene, chloramphenicol resistance gene and the like. Examples thereof include drug resistance genes, genes involved in intracellular biosynthesis of nutrients such as amino acids and nucleic acids (genes that complement nutritional requirements), genes related to chemical luminescence such as luciferase, and genes encoding fluorescent proteins such as GFP.
  • One type of DNA encoding the enzyme (CoA transferase, polymerizing enzyme) according to the present invention may be inserted into the vector, or a plurality of types of DNA may be inserted into one vector.
  • these DNAs form an operon when a plurality of types of DNA are inserted into one vector.
  • the "operon” is a nucleic acid sequence unit composed of one or a plurality of genes transcribed under the control of the same promoter.
  • the above DNA or the vector into which the DNA is inserted is introduced into a microorganism using a known method.
  • the method for introducing DNA into a microorganism include a calcium chloride method, a heat shock method, a calcium phosphate method, an electroporation method, a spheroplast method, a lithium acetate method, a junction transfer method, and a method using calcium ions.
  • the copolymer of the present invention can be produced by culturing the above-mentioned microorganism in a medium containing hydroxycarboxylic acid (A) and hydroxycarboxylic acid (B).
  • the medium is not particularly limited as long as a carbon source having a sufficient concentration is supplied, but may contain a nitrogen source, an inorganic salt, and other organic nutrient sources that are nutrient sources other than the carbon source.
  • any carbon source can be used as long as the above-mentioned microorganisms can be assimilated, but saccharides such as glucose, fructose and sucrose; palm oil, palm kernel oil, corn oil and palm oil are preferable. , Olive oil, soybean oil, rapeseed oil, yatrofa oil and other oils and fractionated oils; fatty acids such as lauric acid, oleic acid, stearic acid, palmitic acid and myrinstic acid and derivatives thereof.
  • Examples of the nitrogen source include ammonia; ammonium salts such as ammonium chloride, ammonium sulfate, and ammonium phosphate; peptone, meat extract, yeast extract, and the like.
  • Examples of the inorganic salts include potassium dihydrogen phosphate, disodium hydrogen phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride and the like.
  • Examples of other organic nutrient sources include amino acids such as glycine, alanine, serine, threonine and proline; vitamins such as vitamin B1, vitamin B12 and vitamin C.
  • Examples of the medium according to the present invention include, but are limited to, LB medium (containing 10 g / L tryptone, 5 g / L yeast extract, 5 g / L sodium chloride) when culturing Escherichia coli and the like. is not it.
  • LB medium containing 10 g / L tryptone, 5 g / L yeast extract, 5 g / L sodium chloride
  • a nitrogen source-restricted inorganic salt medium for example, 9 g / L Na 2 HPO 4 , 1.5 g / L KH 2 PO 4 4) is used as a host.
  • phosphorus source restricted inorganic salt medium eg, glucose 1 g / L, KNO 3 0.5 g / L, transferase 4 (7H 2 0) 0.2g / L, CaC1 2 0.1g / L, NaC1 0.1g / L, which in the 8.0 mg K 2 HPO 4 and 2.0 mg KH 2 P0 4 was added, the pH 7 (Adjustment), but is not limited to these.
  • the hydroxycarboxylic acid added to the medium is as described above, but may be R-form or racemic, but is preferably R-form. Further, it may be added after adjusting the pH (neutralization or the like) according to the optimum pH of the medium, or it may be added in the form of a salt. Examples of such salts include sodium salts, potassium salts, ammonium salts and the like.
  • the amount added to the medium may be any concentration suitable for copolymerization synthesis, and may be appropriately adjusted in order to control the monomer composition during copolymerization, which is synthesized depending on the concentration. It is 1 to 10 g / L.
  • any microorganism capable of biosynthesizing such a hydroxycarboxylic acid without including the hydroxycarboxylic acid (A) and the hydroxycarboxylic acid (B) itself in the medium is a metabolic precursor thereof.
  • the copolymer of the present invention can be produced by using (a starting material for metabolism, etc.).
  • Step 2 The step of recovering the copolymer from the culture obtained in the above step is included. It can be rephrased as a method.
  • the metabolic precursor according to the present invention is not particularly limited as long as it is a substance that can be finally converted to the hydroxycarboxylic acid according to the present invention by the metabolic pathway in the microorganism.
  • hydroxycarboxylic acid (A) is 2HB.
  • glucose, threonine, 2-ketobutyric acid and the like can be mentioned.
  • hydroxycarboxylic acid (B) is 3HB, glucose, pyruvic acid, acetyl CoA, acetoacetyl CoA and the like can be mentioned.
  • hydroxycarboxylic acid (B) is 3HV, 2HB, 2-oxobutyric acid, threonine, propionic acid, propionic acid-IP, propionic acid-CoA, 3-ketovaleryl-CoA and the like can be mentioned (FIG. 5A). Etc.).
  • the culture temperature is not particularly limited as long as the microorganisms to be used can grow and each enzyme activity is exhibited, and is usually 25 to 37 ° C.
  • the temperature is preferably 28 to 32 ° C, particularly preferably 30 ° C.
  • aerobic conditions and anaerobic conditions can be appropriately selected depending on the type of microorganism used, but aerobic conditions are preferable from the viewpoint that copolymer synthesis is more easily promoted.
  • the culturing time can be appropriately adjusted according to the amount of copolymer produced and the like, but is usually 12 hours to 1 week, preferably 1 to 3 days.
  • the copolymer of the present invention is recovered from the culture obtained by culturing the above-mentioned microorganisms.
  • the "culture” includes not only the grown microorganisms obtained by culturing the microorganisms in a medium, but also a medium containing secretory products and metabolites of the microorganisms, dilutions thereof, and concentrates thereof. Is done.
  • the method for recovering the copolymer from such a culture is not particularly limited, but for example, it can be carried out by the following method.
  • microorganisms are separated from the medium by centrifugation or the like, and the microorganisms are washed with distilled water, methanol or the like and dried (for example, freeze-dried).
  • the copolymer is extracted by heat-treating the dried cells with an organic solvent such as chloroform.
  • the bacterial cell component is removed from the organic solvent solution containing the copolymer by filtration or the like, and a poor solvent such as methanol or hexane is added to the filtrate to precipitate the copolymer. Further, the supernatant is removed by filtration or centrifugation and dried to recover the copolymer.
  • the copolymer thus obtained is averaged by using known analytical methods such as nuclear magnetic resonance (NMR), gel permeation chromatography, and gas chromatography.
  • NMR nuclear magnetic resonance
  • gel permeation chromatography gel permeation chromatography
  • gas chromatography gas chromatography
  • This transformant was used as (R, S) -2HB-Na 1 to 10 g / mL, (R, S) -3HB-Na 1 to 10 g / mL, and (R, S) -3HHx-Na 1 to 10 g / mL.
  • LB medium containing the mixture was shake-cultured at 30 ° C. for 48 hours.
  • the Escherichia coli recovered from the obtained culture solution was freeze-dried and heat-treated with chloroform to recover the polymer (Taguchi, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. US A. 2008, 105 ( 45), 17323-17327 (see the collection method described in 17323-17327).
  • the polymer obtained above is a block copolymer composed of a P (2HB) homopolymer segment and a P (3HB-ran-3HHx) random segment. ..
  • a solvent cast film was prepared by dissolving about 100 mg of the polymer in chloroform and volatilizing the solvent in a glass petri dish.
  • a test piece was cut out from the obtained circular film and subjected to a tensile test to calculate parameters such as breaking elongation (stretchability) and tensile strength.
  • the ternary copolymer P (2HB-) obtained this time is compared with the binary copolymer P (2HB-b-3HB) disclosed in Non-Patent Document 2.
  • b- (3HB-ran-3HHx)) showed high extensibility.
  • the ternary copolymer showed a very high extensibility of over 1200%.
  • Example 2 ⁇ Preparation method of P (3HB-b- (GL-ran-3HB))>
  • pBSPreCARpctAlkK was introduced into Escherichia coli (JM109 strain) by the calcium chloride method to obtain a transformant.
  • a transformant into which a plasmid DNA encoding PhaC1 Ps STQK was introduced instead of the plasmid DNA encoding PhaC AR was prepared.
  • This plasmid was prepared by substituting the PhaC1 Ps STQK gene in place of the PhaC AR gene in pBSPreCARpctAlkK by a conventional method.
  • FIG. 2C The figure shows the results of analysis of the polymer obtained using an LB medium containing 12 g / L of (R, S) -GL-Na and 5 g / L of (R, S) -3HB-Na. ..
  • the polymer obtained by using PhaC1 Ps STQK is a random copolymer (P (GL-ran-3HB)) (see FIG. 2A).
  • the polymer obtained with PhaC AR is observed strongly signals GL-GL-GL, it can be seen that GL density include high structural. From the relative intensity ratio of the four peaks, the GL fraction is estimated to be about 70 mol%, which is significantly different from the GL fraction of the entire polymer of about 20 mol%. Therefore, this polymer has a random-block structure ( P (3HB-b- (GL-ran-3HB))) was revealed.
  • Such a polymer has two main merits. The first is that it is possible to create a structure in which a plurality of polymers having different physical properties are linked in the same molecule, so that a new material can be created due to the structure. Second, since a large number of GL unit chains are contained, non-enzymatic hydrolyzability is improved (see Matsumoto K. et al., ACS Biomaterials Science & Engineering, 3 (12) 3058, 2017).
  • Example 3 ⁇ Method of preparing P (3HB-b- (GL-co-3HB-co-3HHx))> pBSPreCARpctAlkK was introduced into Escherichia coli (JM109 strain) by the calcium chloride method to obtain a transformant.
  • This transformant was obtained from (R, S) -GL-Na 2.5 to 5 g / L, (R, S) -3HB-Na 0 to 2.5 g / L and (R, S) -3HHx-Na 1 g.
  • the cells were cultured with shaking at 30 ° C. for 48 hours in an LB medium containing / L, and the polymer was recovered from the obtained culture solution by the same method as described in Example 1.
  • DSC ⁇ Differential Scanning Calorimetry (DSC) for P (3HB-b- (GL-co-3HB-co-3HHx))>
  • a solvent cast film was prepared by dissolving the polymer in chloroform and volatilizing the solvent in a glass petri dish.
  • a few milligrams of a test piece was cut out from the obtained film and sealed in an aluminum pan to prepare a sample.
  • This sample was subjected to DSC analysis. In the DSC analysis, the temperature was raised from ⁇ 50 ° C. to 220 ° C., and the presence or absence of an endothermic peak associated with melting of the crystal was determined. The obtained results are shown in FIG. 3B.
  • the obtained polymer had a gradient structure based on the relative intensities of the four observed signals. It became clear. In the gradient structure, both ends and the center of the molecule have different structures, so that the structure is similar to that of a triblock.
  • this polymer contains an internal structure having a high GL fraction, similar to P (3HB-b- (GL-ran-3HB)) shown in Example 2.
  • P 3HB-b- (GL-ran-3HB)
  • this polymer has a special structure (P (3HB-b- (GL-co-3HB-co-3HHx)) in which a GL-rich region is added to a conventional 3HB, 3HHx random copolymer.
  • the tensile test result of P (3HB-b- (GL-co-3HB-co-3HHx)) shown in FIG. 3C shows that it has soft physical properties because the inclination is gentle. It can also be stretched a little. As described above, it has been clarified that the flexibility of this polymer is significantly improved by introducing a soft 3HHx unit.
  • this polymer has increased non-enzymatic hydrolyzability due to the introduction of the GL unit, and is expected to be highly degradable in vivo, so that it is a medical device (for example, suture). It is useful in such cases.
  • Example 4 ⁇ Method of preparing a block copolymer composed of a P (2HB) homopolymer segment and a random copolymer segment mainly composed of 3-hydroxy acid, and analysis of the block copolymer>
  • a P (2HB) homopolymer segment and a P (3HB-ran-3HHx) random segment were cultured.
  • FIG. 4A shows the results of 1 H NMR measurement in the same manner as in the method described in ⁇ Analysis of P (3HB-b- (GL-ran-3HB))>.
  • FIG. 4B shows the results of analysis in the same manner as the above ⁇ P (3HB-b- (GL-co-3HB-co-3HHx)) differential scanning calorimetry (DSC)>.
  • thermogram for measuring the differential calorific value of P (3HB-co-5HV) illustrated in FIG. 4B the peak position representing the melting point is lower than the vicinity of the melting point (178 ° C.) of P (3HB). From this, it can be confirmed that 5HV is randomly copolymerized. Although not shown in the figure, similar thermograms have been obtained with other copolymers.
  • the newly added monomer precursor was incorporated as a random copolymer with the 3HB unit, and the 2HB component was polymerized as a P (2HB) homopolymer segment. .. More specifically, depending on the above culture conditions, a novel ternary block copolymer, P (2HB) -b-P (3HB-ran-3HP), P (2HB) -b-P (3HB-ran-4H2MB) ), P (2HB) -b-P (3HB-ran-24DHB), P (2HB) -b-P (3HB-ran-5HV), P (2HB) -b-P (3HB-ran-6HHx) It was confirmed that it could be obtained.
  • the synthesis of these polymers is due to the properties of the polymerizing enzyme, and if the CoA form of the corresponding monomer can be synthesized, the monomer supplying enzyme is not selected.
  • Example 5 ⁇ Method of preparing block copolymer (P (2HB) -b-P (3HB-co-3HV)) from glucose and 2HB> As shown in FIG. 5A, in the case of a microorganism equipped with the biosynthetic pathway shown below, by culturing in the presence of glucose and 2HB, a P (2HB) homopolymer segment and a segment consisting of 3HB and 3HV are randomly coexisted. The present inventors thought that a block copolymer composed of a polymer (P (2HB) -b-P (3HB-co-3HV)) could be obtained.
  • ⁇ Biosynthetic pathway> 2HB is converted to 2HB-CoA in the presence of HadA (CoA transferase).
  • HadA CoA transferase
  • pyruvic acid is produced from glucose.
  • Acetyl-CoA is further produced from pyruvic acid, converted to acetoacetyl-CoA in the presence of PhaA, and 3HB-CoA is biosynthesized in the presence of PhaB (Journal of Biotechnology, 152 (2011), 144-146).
  • 2HB is converted to 2-oxobutyric acid in the presence of LdhA (lactate dehydrogenase).
  • Propionic acid and 2-hydroxybutyric acid are produced from threonine and 2-oxobutyric acid (Letters in Applied Microbiology, 1997, 25, 371-374).
  • Propionic acid-CoA is converted from propionic acid via propionic acid-IP.
  • Propionic acid-CoA and acetyl-CoA are converted to 3-ketovaleryl-CoA in the presence of PhaA and further to 3HV-CoA in the presence of PhaB (Journal of Biotechnology, 152 (2011), 144-). 146).
  • Ralstonia europha glucose assimilating modified strain R. eutrpha H16 NSDG-GG- ⁇ B1 strain (Zhang et al., Microbial Cell Factories, volume 18, Article number: 147 (2019) refer) in pha operon on the chromosome, phaCNSDG (Aeromonas caviae-derived modified PHA synthase gene) the phaC AR gene was replaced by homologous recombination to construct a PhC AR expression strain H16 CAR-GG- ⁇ B1. Specifically, the plasmid pK18movsacB derivative containing the target fragment was transferred to R.
  • ldhA lactate dehydrogenase gene
  • hadA CoA dehydrogenase gene
  • H16 CAR-GG- ⁇ B1-ldhAhadA was constructed to enable the expression of these enzymes under the control of (PphaP, increased transcriptional activity during PHA synthesis).
  • the composition of the nitrogen sources limited mineral salts medium, water 100ml, Na 2 HPO 4 ⁇ 12H 2 O 0.9g, KH 2 PO 4 0.15g, NH 4 Cl 0.05g, MgSO 4 ⁇ 7H 2 O 0 .02 g and 0.1 ml of trace-element solution.
  • the final concentrations of other components added to the medium were glucose 2% (w / v), 2HB-Na 0.25% (w / v), pyruvic acid 0.8% (w / v), and valine 0. It was set to 0.05%.
  • Culturing was performed on a 100 mL scale using a shaking flask, and the culture was shaken at 118 strokes / min at 30 ° C.
  • the cells were collected by centrifugation from the culture solution after 120 hours and freeze-dried to obtain dried cells.
  • the amount and composition of PHA accumulated in the cells were analyzed by gas chromatography (GC) after the PHA contained in the dried cells was subjected to a methanolysis treatment.
  • GC gas chromatography
  • This method is the most common method used for the analysis of PHA (see PNAS November 11/2008 vol. 105 no. 45 17323-17327) and is a polymer by heating the PHA solution in the presence of acidic methanol. Is completely decomposed into a volatile monomer derivative, and it is possible to perform quantitative and qualitative analysis by GC. Further described in ⁇ Analysis of P (3HB-b- (GL-ran-3HB))> and ⁇ Gel filtration chromatography (GPC) analysis of P (3HB-b- (GL-ran-3HB))>. Purified PHA was obtained by chloroform extraction from dried cells and reprecipitation of methanol in the same manner as in 1), and structural analysis by 1 H-NMR and molecular weight measurement by GPC were performed.
  • a block copolymer having a homopolymerized segment and a copolymerized segment As described above, according to the present invention, it is possible to provide a block copolymer having a homopolymerized segment and a copolymerized segment. Such a block copolymer has the characteristics of each of the constituent polymerization segments and can exhibit various physical properties. Therefore, it is useful in various industrial fields such as medical treatment. Further, according to the present invention, since the block copolymer can be provided by biosynthesis, it can also contribute to solving environmental problems.

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Abstract

２位のみにヒドロキシ基を有するヒドロキシカルボン酸（Ａ）と、２位以外の部位にヒドロキシ基を有するヒドロキシカルボン酸（Ｂ）とを含み、かつヒドロキシカルボン酸（Ａ）及びヒドロキシカルボン酸（Ｂ）からなる群から選択される１のヒドロキシカルボン酸からなるホモ重合セグメントと、ヒドロキシカルボン酸（Ａ）及びヒドロキシカルボン酸（Ｂ）からなる群から選択される少なくとも２のヒドロキシカルボン酸を含む共重合セグメントとを有する、共重合体。

Description

ブロック共重合体、及びその製造方法
　本発明は、ブロック共重合体、及びその製造方法に関し、より詳しくは、ホモ重合セグメント及び共重合セグメントを有するブロック共重合体、及びその製造方法に関する。
　共重合体は、２種類以上のモノマーが重合して合成される高分子化合物であり、金属等の他の材料と比較して、弾性、透明性、加工性、軽量等の物性において優れている。そのため、医療等の様々な産業分野において多々使用されている。中でも、２種類以上の性質の異なる重合体（セグメント）が共有結合でつながった連鎖からなるブロック共重合体は、構成する各セグメントの特長を併せ持つ材料となることが期待される。
　また、かかる高分子化合物は、通常、石油を原料として合成される。しかしながら、昨今問題となっている化石資源の枯渇や地球温暖化への対策のため、再生可能資源（バイオマス由来の原料）を炭素源として生成される高分子化合物（所謂、バイオポリマー）が注目を集めている。
　例えば、微生物によって産生されるポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）は、バイオベース・生分解性材料として着目されている。現在商業生産されるＰＨＡは、３－ヒドロキシ酪酸（３ＨＢ）と３－ヒドロキシヘキサン酸（３ＨＨｘ）の共重合体であり、さらに、２００８年に非天然型の乳酸ユニットの重合が報告されてから、様々な非天然モノマーを含むＰＨＡが報告されている（非特許文献１）。
　また、微生物において通常、２種類以上のモノマーは無秩序に配列され、ＰＨＡは、ランダム共重合体として生合成される。しかしながら、本発明者らによって、２－ヒドロキシ酪酸（２ＨＢ）及び３ＨＢを含む培地にて、ＣｏＡ転移酵素及び重合酵素を発現する微生物を培養することによって、２－ヒドロキシ酪酸（２ＨＢ）からなるホモ重合セグメントと３ＨＢからなるホモ重合セグメントとが結合した、ブロック共重合体（Ｐ（２ＨＢ－ｂ－３ＨＢ））を生合成できたことが報告されている（非特許文献２）。
　このように、バイオポリマーに関しても、ブロック共重合体の生合成が可能になりつつも、物性等の改良のため、更なるブロック共重合体の開発が求められている。
Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ　ｅｔ　ａｌ．，２０１３，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９７，８０１１ Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ　Ｋ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，１９（２），６６２，２０１８
　本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、ホモ重合セグメント及び共重合セグメントを有するブロック共重合体を提供することを目的とする。
　本発明者らは、非特許文献２において報告したブロック共重合体（Ｐ（２ＨＢ－ｂ－３ＨＢ））を更に改良すべく、従前の２ＨＢ及び３ＨＢに加え３ＨＨｘも添加した培地にて、前記微生物を培養した。その結果、２ＨＢからなるホモ重合セグメントと３ＨＢ及び３ＨＨｘからなるランダム重合セグメントとが結合したブロック共重合体（Ｐ（２ＨＢ－ｂ－（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨｘ）））を得ることができた。すなわち、従前のホモ重合セグメントのみを有するものとは異なり、ランダム共重合セグメントをも備えたブロック共重合体を生合成することができた。
　さらに、３ＨＨｘの代わりに、３－ヒドロキシプロピオン酸（３ＨＰ）、４－ヒドロキシ－２－メチル酪酸（４Ｈ２ＭＢ）、２，４－ジヒドロキシ酪酸（２４ＤＨＢ）、５－ヒドロキシ吉草酸（５ＨＶ）又は６－ヒドロキシヘキサン酸（６ＨＨｘ）を、２ＨＢ及び３ＨＢを含む培地に加え、前記微生物を培養しても、３ＨＨｘを用いた場合同様に、ブロック共重合体（Ｐ（２ＨＢ）－ｂ－Ｐ（３ＨＢ－ｒａｎ－３ＨＰ）、Ｐ（２ＨＢ）－ｂ－Ｐ（３ＨＢ－ｒａｎ－４Ｈ２ＭＢ）、Ｐ（２ＨＢ）－ｂ－Ｐ（３ＨＢ－ｒａｎ－２４ＤＨＢ）、Ｐ（２ＨＢ）－ｂ－Ｐ（３ＨＢ－ｒａｎ－５ＨＶ）、Ｐ（２ＨＢ）－ｂ－Ｐ（３ＨＢ－ｒａｎ－６ＨＨｘ））を合成できることを確認した。
　また、２－ヒドロキシ酢酸（グリコール酸、ＧＬ）及び３ＨＢを添加した培地にて、前記微生物を培養した結果、３ＨＢからなるホモ重合セグメントとＧＬ及び３ＨＢからなる共重合セグメントとが結合した、ブロック共重合体（Ｐ（３ＨＢ－ｂ－（ＧＬ－ｃｏ－３ＨＢ）））を得ることができた。
　さらにまた、ＧＬ、３ＨＢ及び３ＨＨｘを添加した培地にて、前記微生物を培養した結果、３ＨＢからなるホモ重合セグメントと、ＧＬ、３ＨＢ及び３ＨＨｘからなるランダム共重合セグメントとが結合した、ブロック共重合体（Ｐ（３ＨＢ－ｂ－（ＧＬ－ｃｏ－３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨｘ）））を得ることができた。
　また、ｌｄｈＡ（乳酸脱水素酵素遺伝子）、ｈａｄＡ（ＣｏＡ転移酵素遺伝子）及びＰｈａＣＡＲ（重合酵素遺伝子）を導入したＲａｌｓｔｏｎｉａ　ｅｕｔｒｏｐｈａグルコース資化性改変株を、グルコース及び２ＨＢを含む培地にて培養した場合、当該微生物は、３ＨＢ及び３ＨＶ（３－ヒドロキシ吉草酸）を生合成し、更にこれらヒドロキシカルボン酸から、ブロック共重合体（Ｐ（２ＨＢ）－ｂ－Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＶ））も生合成し得ることが明らかになった。すなわち、３ＨＢ及び３ＨＶ等の２位以外の部位にヒドロキシ基を有するヒドロキシカルボン酸を、培地に添加せずとも、前記微生物を培養することによって、前記ブロック共重合体を得ることができた。
　本発明は、以上の合成例に基づくものであり、より具体的には以下を提供する。
＜１＞　２位のみにヒドロキシ基を有するヒドロキシカルボン酸（Ａ）と、２位以外の部位にヒドロキシ基を有するヒドロキシカルボン酸（Ｂ）とを含み、かつ
　ヒドロキシカルボン酸（Ａ）及びヒドロキシカルボン酸（Ｂ）からなる群から選択される１のヒドロキシカルボン酸からなるホモ重合セグメントと、
　ヒドロキシカルボン酸（Ａ）及びヒドロキシカルボン酸（Ｂ）からなる群から選択される少なくとも２のヒドロキシカルボン酸を含む共重合セグメントとを有する、共重合体。
＜２＞　ヒドロキシカルボン酸（Ａ）が、２－ヒドロキシ酪酸、２－ヒドロキシ酢酸、２－ヒドロキシプロピオン酸、２－ヒドロキシペンタン酸、２－ヒドロキシヘキサン酸及び中鎖２－ヒドロキシアルカン酸からなる群から選択される少なくとも１のヒドロキシカルボン酸であり、
　ヒドロキシカルボン酸（Ｂ）が、３－ヒドロキシ酪酸、３－ヒドロキシヘキサン酸、３－ヒドロキシプロピオン酸、３－ヒドロキシペンタン酸、中鎖３－ヒドロキアルカン酸、４－ヒドロキシ－２－メチル酪酸、４－ヒドロキシ酪酸、２，４－ジヒドロキシ酪酸、５－ヒドロキシペンタン酸及び６－ヒドロキシへキサン酸からなる群から選択される少なくとも１のヒドロキシカルボン酸である、＜１＞に記載の共重合体。
＜３＞　ヒドロキシカルボン酸（Ａ）が２－ヒドロキシ酪酸であり、ヒドロキシカルボン酸（Ｂ）が３－ヒドロキシ酪酸及び３－ヒドロキシヘキサン酸であり、かつ、
　２－ヒドロキシ酪酸からなるホモ重合セグメントと、３－ヒドロキシ酪酸及び３－ヒドロキシヘキサン酸を含む共重合セグメントとを有する、＜１＞に記載の共重合体。
＜４＞　ヒドロキシカルボン酸（Ａ）が２－ヒドロキシ酢酸であり、ヒドロキシカルボン酸（Ｂ）が３－ヒドロキシ酪酸であり、かつ
　３－ヒドロキシ酪酸からなるホモ重合セグメントと、２－ヒドロキシ酢酸及び３－ヒドロキシ酪酸を含む共重合セグメントとを有する、＜１＞に記載の共重合体。
＜５＞　ヒドロキシカルボン酸（Ａ）が２－ヒドロキシ酢酸であり、ヒドロキシカルボン酸（Ｂ）が３－ヒドロキシ酪酸及び３－ヒドロキシヘキサン酸であり、かつ、
　３－ヒドロキシ酪酸からなるホモ重合セグメントと、２－ヒドロキシ酢酸、３－ヒドロキシ酪酸及び３－ヒドロキシヘキサン酸を含む共重合セグメントとを有する、＜１＞に記載の共重合体。
＜６＞　＜１＞～＜５＞のうちのいずれかに記載の共重合体の製造方法であって、
　ＣｏＡ転移酵素及び重合酵素を発現する微生物を、ヒドロキシカルボン酸（Ａ）及び／又はその代謝前駆体とヒドロキシカルボン酸（Ｂ）及び／又はその代謝前駆体とを含む培地にて培養する工程と、
　前記工程にて得られた培養物から、前記共重合体を回収する工程とを含む、方法。
　本発明によれば、ホモ重合セグメント及び共重合セグメントを有するブロック共重合体、及びその製造方法を提供することが可能となる。
　本発明によれば、例えば、２ＨＢからなるホモ重合体と３ＨＢ及び３ＨＨｘからなるランダム重合体とが結合した、ブロック共重合体（Ｐ（２ＨＢ－ｂ－（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨｘ）））を提供することができる。このブロック共重合体は、後述の実施例に示すとおり、非特許文献２に開示の共重合体　Ｐ（２ＨＢ－ｂ－３ＨＢ）と比較して、高い伸張性を有する。特に、Ｐ（２ＨＢ－ｂ－（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨｘ））は、１２００％を超える非常に高い伸張性を有する。
　また、３ＨＢからなるホモ重合体とＧＬ及び３ＨＢからなる共重合体とが結合した、ブロック共重合体（Ｐ（３ＨＢ－ｂ－（ＧＬ－ｃｏ－３ＨＢ）））を提供することができる。さらにまた、３ＨＢからなるホモ重合体と、ＧＬ、３ＨＢ及び３ＨＨｘからなる共重合体とが結合した、ブロック共重合体（Ｐ（３ＨＢ－ｂ－（ＧＬ－ｃｏ－３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨｘ）））を提供することができる。これらのブロック共重合体は、後述の実施例に示すとおり、ＧＬが導入されていることにより、非酵素的加水分解性が向上し、ひいては生体内での高い分解性を発揮する。また、Ｐ（３ＨＢ－ｂ－（ＧＬ－ｃｏ－３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨｘ））の共重合セグメントは、グラディエント構造を採る。さらに、当該共重合体は、３ＨＨｘが導入されることによって、柔軟性が大幅に向上される。
２ＨＢ、３ＨＢ及び３ＨＨｘを仕込み、重合酵素　ＰｈａＣＡＲを用いて得られた共重合体（Ｐ（２ＨＢ－ｂ－（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨｘ）））の、１Ｈ　ＮＭＲスペクトル分析の結果を示す、チャート図である。 ２ＨＢ、３ＨＢ及び３ＨＨｘを仕込み、重合酵素　ＰｈａＣＡＲを用いて得られた共重合体（Ｐ（２ＨＢ－ｂ－（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨｘ）））の、１３Ｃ　ＮＭＲスペクトル分析の結果を示す、チャート図である。 Ｐ（２ＨＢ－ｂ－（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨｘ））等に関し、応力ひずみ関係を示すプロット図である。 ３ＨＢ及びＧＬを仕込み、重合酵素　ＰｈａＣ１ＰｓＳＴＱＫを用いて得られた共重合体の、１Ｈ　ＮＭＲスペクトル分析の結果を示す、チャート図である。 ３ＨＢ及びＧＬを仕込み、重合酵素　ＰｈａＣＡＲを用いて得られた共重合体（Ｐ（３ＨＢ－ｂ－（ＧＬ－ｃｏ－３ＨＢ）））の、１Ｈ　ＮＭＲスペクトル分析の結果を示す、チャート図である。 Ｐ（３ＨＢ－ｂ－（ＧＬ－ｃｏ－３ＨＢ））を、ゲル濾過クロマトグラフィーにて分析した結果を示す、分子量分布曲線である。 Ｐ（３ＨＢ－ｂ－（ＧＬ－ｃｏ－３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨｘ））の、１Ｈ　ＮＭＲスペクトル分析の結果を示す、チャート図である。なお、図中の番号は、表２の記載に対応する。 Ｐ（３ＨＢ－ｂ－（ＧＬ－ｃｏ－３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨｘ））の、示差走査熱量測定結果を示す、グラフである。 Ｐ（３ＨＢ－ｂ－（ＧＬ－ｃｏ－３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨｘ））に関し、応力ひずみ関係を示すプロット図である。 Ｐ（２ＨＢ）ホモポリマーセグメントと３ＨＢを含むランダム共重合体セグメントとから構成されるブロック共重合体について、１Ｈ　ＮＭＲスペクトル分析をした結果を示す、チャート図である。 Ｐ（２ＨＢ）－ｂ－Ｐ（３ＨＢ－ｒａｎ－５ＨＶ）の、示差走査熱量測定結果を示す、グラフである。 Ｐ（２ＨＢ）－ｂ－Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＶ）を生合成するための代謝経路を示す、概略図である。 Ｒ．ｅｕｔｒｐｈａ　Ｈ１６　ＮＳＤＧ－ＧＧ－ΔＢ１株染色体上のｐｈａオペロンにおいて、ｐｈａＣＮＳＤＧ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ　ｃａｖｉａｅ由来改変型ＰＨＡシンターゼ遺伝子）をｐｈａＣＡＲ（Ａ．ｃａｖｉａｅ及びＲ．ｅｕｔｒｏｐｈａ由来のキメラＰＨＡシンターゼ遺伝子）に相同組換えにより置換したことを示す、概略図である。 ｐｈａＰ１（ＰＨＡ顆粒結合タンパク質遺伝子）下流にＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来のｌｄｈＡ（乳酸脱水素酵素遺伝子）及びｈａｄＡ（ＣｏＡ転移酵素遺伝子）を挿入したことを示す、概略図である。 Ｐ（２ＨＢ）－ｂ－Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＶ）について、１Ｈ　ＮＭＲスペクトル分析をした結果を示す、チャート図である。
　＜ブロック共重合体＞
　後述の実施例に示すとおり、本発明においては、ホモ重合セグメント及び共重合セグメントを有するブロック共重合体を提供するものであり、より具体的には、
　２位のみにヒドロキシ基を有するヒドロキシカルボン酸（Ａ）と、２位以外の部位にヒドロキシ基を有するヒドロキシカルボン酸（Ｂ）とを含み、かつ
　ヒドロキシカルボン酸（Ａ）及びヒドロキシカルボン酸（Ｂ）からなる群から選択される１のヒドロキシカルボン酸からなるホモ重合セグメントと、
　ヒドロキシカルボン酸（Ａ）及びヒドロキシカルボン酸（Ｂ）からなる群から選択される少なくとも２のヒドロキシカルボン酸を含む共重合セグメントとを有する、共重合体を、提供する。
　本発明の共重合体は、エステル結合によってヒドロキシカルボン酸が重合されたものであり、少なくとも２種類のセグメントを有する。
　本発明において、「セグメント」とは、ブロック共重合体において各ブロックを構成する構成単位であって、１種類のモノマー（後述のヒドロキシカルボン酸）から構成される単位（ホモ重合セグメント）又は複数種のモノマーから構成される単位（共重合セグメント）である。「共重合セグメント」としては、例えば、複数種のモノマーがランダムに重合している、ランダム重合セグメント、構成するモノマー組成が連続的に変化している、グラディエント重合セグメント、複数種のモノマーが交互に重合している、交互重合セグメントが挙げられる。また、本発明の共重合体において各セグメントを構成するモノマー数は、特に限定されるものではないが、材料として利用する場合には、１００以上が好ましく、通常５００以上であり、より好ましくは４０００以上である。
　本発明にかかる「ヒドロキシカルボン酸」は、２位のみにヒドロキシ基を有するモノヒドロキシカルボン酸と、２位以外の部位にヒドロキシ基を有するヒドロキシカルボン酸との２種類に分けられる。なお、後者においては、複数のヒドロキシ基を有するヒドロキシカルボン酸であってもよく、その場合、２位以外の部位に加え、２位にヒドロキシ基を有するものであってもよい、
　２位のみにヒドロキシ基を有するヒドロキシカルボン酸（以下、「ヒドロキシカルボン酸（Ａ）」とも称する）としては、例えば、２－ヒドロキシ酢酸（グリコール酸、ＧＬ）、２－ヒドロキシ酪酸（２ＨＢ）、２－ヒドロキシプロピオン酸（乳酸、２ＨＰ）、２－ヒドロキシペンタン酸（２－ヒドロキシ吉草酸）、２－ヒドロキシヘキサン酸、中鎖２－ヒドロキシアルカン酸が挙げられる。なお、中鎖２－ヒドロキシアルカン酸は、より具体的にはアミノ酸から誘導される（アミノ酸の側鎖構造に由来する）２－ヒドロキシアルカン酸が挙げられる。（Ｓｕｄｏ　Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ　Ｂｉｏｓｃｉ　Ｂｉｏｅｎｇ．２０１９　Ｏｃｔ　１８．ｐｉｉ：Ｓ１３８９－１７２３（１９）３０７８５－６ 参照）。また、本発明にかかるヒドロキシカルボン酸（Ａ）は、２位のみにヒドロキシ基を有するモノヒドロキシカルボン酸１種のみならず、複数種の２位のみにヒドロキシ基を有するモノヒドロキシカルボン酸も意味する。これらの中で、共重合体に導入されることにより、非酵素的加水分解性が向上し、ひいては生体内での高い分解性が発揮され易いという観点から、２－ヒドロキシ酢酸が好ましい。また、材料に透明性が付与される、ポリ－Ｄ－乳酸（ＰＤＬＡ）と類似した立体構造を有するイソタクチックポリマーが得られる、重合物のガラス転移温度が他の２－ヒドロキシカルボン酸よりも低いことから生合成が容易となるという観点から、２－ヒドロキシ酪酸が好ましい。
　２位以外の部位にヒドロキシ基を有するヒドロキシカルボン酸（以下、「ヒドロキシカルボン酸（Ｂ）」とも称する）としては、例えば、３－ヒドロキシプロピオン酸（３ＨＰ）、３－ヒドロキシ酪酸（３ＨＢ）、３－ヒドロキシヘキサン酸（３ＨＨｘ）、３－ヒドロキシペンタン酸（３－ヒドロキシ吉草酸、３ＨＶ）、中鎖３－ヒドロキアルカン酸、４－ヒドロキシ－２－メチル酪酸（４Ｈ２ＭＢ）、４－ヒドロキシ酪酸、２，４－ジヒドロキシ酪酸（２４ＤＨＢ）、５－ヒドロキシペンタン酸（５－ヒドロキシ吉草酸、５ＨＶ）、６－ヒドロキシへキサン酸（６ＨＨｘ）が挙げられる。なお、本発明にかかるヒドロキシカルボン酸（Ｂ）は、２位以外の部位にヒドロキシ基を有するヒドロキシカルボン酸１種のみならず、複数種の２位以外の部位にヒドロキシ基を有するヒドロキシカルボン酸も意味する。これらの中で、様々な炭素源から最も効率的に合成可能であり、材料に強度を付与するという観点から、３－ヒドロキシ酪酸が好ましく、共重合体に導入されることにより、柔軟性が向上するという観点から、３－ヒドロキシヘキサン酸が好ましい。
　本発明において、これらヒドロキシカルボン酸（Ａ）及びヒドロキシカルボン酸（Ｂ）の組み合わせとしては、上述の２種類のセグメントを形成し得る限り、特に制限はなく、例えば、２－ヒドロキシ酪酸、３－ヒドロキシ酪酸及び３－ヒドロキシヘキサン酸；２－ヒドロキシ酢酸及び３－ヒドロキシ酪酸；２－ヒドロキシ酢酸、３－ヒドロキシ酪酸及び３－ヒドロキシヘキサン酸；２－ヒドロキシ酪酸、３－ヒドロキシ酪酸及び３－ヒドロキシプロピオン酸；２－ヒドロキシ酪酸、３－ヒドロキシ酪酸及び４－ヒドロキシ－２－メチル酪酸；２－ヒドロキシ酪酸、３－ヒドロキシ酪酸及び２，４－ジヒドロキシ酪酸；２－ヒドロキシ酪酸、３－ヒドロキシ酪酸及び５－ヒドロキシ吉草酸；２－ヒドロキシ酪酸、３－ヒドロキシ酪酸及び６－ヒドロキシヘキサン酸；２－ヒドロキシ酪酸、３－ヒドロキシプロピオン酸及び４－ヒドロキシ－２－メチル酪酸；２－ヒドロキシ酪酸、３－ヒドロキシプロピオン酸及び２，４－ジヒドロキシ酪酸；２－ヒドロキシ酪酸、３－ヒドロキシプロピオン酸及び５－ヒドロキシ吉草酸；２－ヒドロキシ酪酸、３－ヒドロキシプロピオン酸及び６－ヒドロキシヘキサン酸；２－ヒドロキシ酪酸、３－ヒドロキシ酪酸及び３－ヒドロキシ吉草酸が挙げられるが、２－ヒドロキシ酪酸及び３－ヒドロキシ酪酸は除かれる。
　また、このような組み合わせからなる本発明の共重合体の分子量としては、特に限定されるものではないが、十分な機械強度を得る、さらに溶融成型による分子量低下後も十分な分子量を保持するという観点から、数平均分子量で、好ましくは１万以上であり、より好ましくは１０万以上であり、さらに好ましくは１００万以上である。また、上限としても、特に限定されるものではないが、製造が困難であるという観点から、通常１０００万以下となる。
　以下に、本発明の共重合体について、具体的な組み合わせの例をもって更に説明する。
　本発明の共重合体において、２－ヒドロキシ酪酸、３－ヒドロキシ酪酸及び３－ヒドロキシヘキサン酸を含むものは、２－ヒドロキシ酪酸からなるホモ重合セグメントと、３－ヒドロキシ酪酸及び３－ヒドロキシヘキサン酸を含む共重合セグメントとを有する。なお、当該共重合体における、共重合セグメントはランダム共重合構造を採る。
　かかる共重合体の分子量（数平均分子量）は、特に限定されるものではないが、十分な機械強度を得る、さらに溶融成型による分子量低下後も十分な分子量を保持するという観点から、好ましくは１０万以上であり、より好ましくは１００万以上である。
　また、十分な柔軟性を発揮し、かつブロック構造に起因した物性も発揮させるという観点から、３－ヒドロキシ酪酸及び３－ヒドロキシヘキサン酸のランダム共重合体セグメントは、ポリマー全体の５０ｍｏｌ％以上であることが好ましく、より好ましくは、７０ｍｏｌ％以上である。本ランダムセグメントの組成は、十分な柔軟性を発揮するという観点から、３－ヒドロキシヘキサン酸が５ｍｏｌ％以上が好ましく、より好ましくは、２０ｍｏｌ％以上である。２－ヒドロキシ酪酸の組成は、ホモ重合セグメントと共重合セグメントの量比が決定されることにより一意に決定される。
　本発明の共重合体において、２－ヒドロキシ酢酸及び３－ヒドロキシ酪酸を含むものは、３－ヒドロキシ酪酸からなるホモ重合セグメントと、２－ヒドロキシ酢酸及び３－ヒドロキシ酪酸を含む共重合セグメントとを有する。なお、当該共重合体における、共重合セグメントはランダム共重合構造を採る。
　かかる共重合体の分子量（数平均分子量）は、特に限定されるものではないが、材料として用いる場合には、機械的強度を発揮する、さらに溶融成型による分子量低下後も十分な分子量を保持するという観点から、好ましくは１万以上であり、より好ましくは、１００万以上である。
　また、材料の機械的物性制御観点から、２－ヒドロキシ酢酸及び３－ヒドロキシ酪酸の含有比率は、特に限定されるものではないが、硬質セグメントとして利用する場合には、２－ヒドロキシ酢酸が５０ｍｏｌ％以上であることが好ましく、さらに好ましくは７０ｍｏｌ％以上である。一方、軟質セグメントとして利用する場合は、２－ヒドロキシ酢酸が５０ｍｏｌ％以下であることが好ましく、さらに好ましくは１０～３０ｍｏｌ％である。
　本発明の共重合体において、２－ヒドロキシ酢酸、３－ヒドロキシ酪酸及び３－ヒドロキシヘキサン酸を含むものは、３－ヒドロキシ酪酸からなるホモ重合セグメントと、２－ヒドロキシ酢酸、３－ヒドロキシ酪酸及び３－ヒドロキシヘキサン酸を含む共重合セグメントとを有する。なお、当該共重合体における、共重合セグメントはグラディエント重合構造を採る。
　かかる共重合体の分子量（数平均分子量）としては、下限はとくに限定されないが、材料として用いる場合には、機械的強度を発揮する、さらに溶融成型による分子量低下後も十分な分子量を保持するという観点から、好ましくは１万以上であり、より好ましくは、１００万以上である。
　また、材料が柔軟性を発揮するという観点から、３－ヒドロキシヘキサン酸の含有率が全体の１０ｍｏｌ％以上であることが好ましく、より好ましくは３０ｍｏｌ％以上である。この時の、２－ヒドロキシ酢酸、３－ヒドロキシ酪酸の含有率は、双方が７０ｍｏｌ％以下であることが好ましく、さらに好ましくは、双方が５０ｍｏｌ％以下である。
　また同様に、材料に柔軟性を持たせる観点から、硬質のホモ重合セグメントが５０ｍｏｌ％以下であることが好ましく、さらに好ましくは３０ｍｏｌ％以下である。
　本発明の共重合体において、２－ヒドロキシ酪酸と、３－ヒドロキシ酪酸と、３－ヒドロキシプロピオン酸、４－ヒドロキシ－２－メチル酪酸、２，４－ジヒドロキシ酪酸、５－ヒドロキシ吉草酸又は６－ヒドロキシヘキサン酸とを含むものは、２－ヒドロキシ酪酸からなるホモ重合セグメントと、３－ヒドロキシ酪酸及び３－ヒドロキシプロピオン酸等を含む共重合セグメントとを有する。なお、当該共重合体における、共重合セグメントはランダム共重合構造を採る。
　かかる共重合体の分子量は、材料に加工できるだけの強度を発現するために重量平均分子量１０万以上であることが好ましく、より好ましくは１００万程度（例えば、５０万～２００万、８０万～１５０万）である。
　ランダムセグメントのモノマー組成としては、目的とする物性を得るために、当業者であれば適宜調整し得るが、３―ヒドロキシ酪酸を主成分とし、３－ヒドロキシプロピオン酸、４－ヒドロキシ－２－メチル酪酸、５－ヒドロキシ吉草酸又は６－ヒドロキシヘキサン酸を含むランダムセグメントを合成し、ポリ－３－ヒドロキシ酪酸骨格の軟質化を目的とする場合は、３－ヒドロキシ酪酸以外の成分が０～５０ｍｏｌ％であることが好ましく、適度な柔軟性と強度を発現するためには５～２０ｍｏｌ％程度（例えば、１～４０ｍｏｌ％、３～３０ｍｏｌ％）であることがより好ましい。ポリマーの親水化を目的として２，４－ジヒドロキシ酪酸を含むセグメントを合成する場合は、２，４－ジヒドロキシ酪酸の組成が５～２０ｍｏｌ％程度（例えば、１～４０ｍｏｌ％、３～３０ｍｏｌ％）であることが好ましい。３－ヒドロキシ酪酸以外のユニット（３－ヒドロキシプロピオン酸、４－ヒドロキシ－２－メチル酪酸、５－ヒドロキシ吉草酸又は６－ヒドロキシヘキサン酸）を主成分とし、軟質性のセグメントを作ることを目的とする場合は、３－ヒドロキシ酪酸以外の成分を５０～１００ｍｏｌ％に調整することが好ましい。柔軟な物性を発揮するためには３－ヒドロキシ酪酸以外の成分割合が高いことが好ましいが、ポリマーの合成効率と両立させるためには８０～９５ｍｏｌ％程度（例えば、６０～９９ｍｏｌ％、７０～９７ｍｏｌ％）が好ましい。
　本発明の共重合体において、２－ヒドロキシ酪酸と、３－ヒドロキシプロピオン酸と、４－ヒドロキシ－２－メチル酪酸、２，４－ジヒドロキシ酪酸、５－ヒドロキシ吉草酸又は６－ヒドロキシヘキサン酸とを含むものは、２－ヒドロキシ酪酸からなるホモ重合セグメントと、３－ヒドロキシプロピオン酸及び４－ヒドロキシ－２－メチル酪酸等を含む共重合セグメントとを有する。なお、当該共重合体における、共重合セグメントはランダム共重合構造を採る。
　かかる共重合体において、セグメント中の３－ヒドロキシプロピオン酸とその他のユニットの分率は任意組成で利用することができ、例として、３－ヒドロキシプロピオン酸１００％又は９０ｍｏｌ％が挙げられる。また、分子量は、重量平均分子量で１０万以上であることが好ましい。
　本発明の共重合体において、２－ヒドロキシ酪酸、３－ヒドロキシ酪酸及び３－ヒドロキシ吉草酸を含むものは、２－ヒドロキシ酪酸からなるホモ重合セグメントと、３－ヒドロキシ酪酸及び３－ヒドロキシ吉草酸を含む共重合セグメントとを有する。なお、当該共重合体における、共重合セグメントはランダム共重合構造を採る。
　かかる共重合体において、共重合セグメントは３－ヒドロキシ吉草酸を１０～３０ｍｏｌ％含むことが好ましい。分子量は、重量平均分子量で１０万以上であることが好ましい。
　＜ブロック共重合体の製造方法＞
　後述の実施例に示すとおり、大腸菌等の微生物において、ＣｏＡ転移酵素によって、上述のヒドロキシカルボン酸にＣｏＡが付加され、さらにこれらヒドロキシカルボン酸が重合酵素により重合することにより、上述の本発明の共重合体を得ることができる。したがって、本発明は、
工程１：ＣｏＡ転移酵素及び重合酵素を発現する微生物を、ヒドロキシカルボン酸（Ａ）及びヒドロキシカルボン酸（Ｂ）を含む培地にて培養する工程と、
工程２：前記工程にて得られた培養物から、前記共重合体を回収する工程とを含む、
方法を提供する。
　（ＣｏＡ転移酵素）
　本発明において「ＣｏＡ転移酵素」とは、上述のヒドロキシカルボン酸にＣｏＡ（補酵素Ａ）が転移される反応を触媒する酵素を意味する。例えば、炭素数が５以下のヒドロキシカルボン酸を対象とする場合には、プロピオン酸ＣｏＡ転移酵素が挙げられる。
　プロピオン酸ＣｏＡ転移酵素（ＰＣＴ）は、酵素番号（ＥＣ）：２．８．３．１に分類される酵素を意味する。本発明にかかるＰＣＴとしては、その触媒活性を保持している限り、その由来については特に制限はないが、大腸菌での異宿主発現が容易であるという観点から、メガスフェラ（Ｍｅｇａｓｐｈｅｒａ）属、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、又は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する細菌由来のものが好ましく、メガスフェラ（Ｍｅｇａｓｐｈｅｒａ）属に属する細菌由来のものがより好ましく、メガスファエラ・エルスデニ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ　ｅｌｓｄｅｎｉｉ）由来のもの（配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）がさらに好ましい。
　また、自然界においてもヌクレオチド配列が変異することは起こり得ることである。そして、それに伴いコードするアミノ酸も変化し得る。したがって、本発明にかかるＰＣＴには、前記触媒活性を有する限り、前記細菌由来の野生型アミノ酸配列（例えば、配列番号：１に記載のアミノ酸配列）において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質（改変体）も含まれる。
　本発明にかかるＰＣＴにおいて「複数」とは、１００アミノ酸以内、好ましくは８０アミノ酸以内、より好ましくは５０アミノ酸以内、さらに好ましくは３０アミノ酸以内、より好ましくは２０アミノ酸以内、さらに好ましくは１０アミノ酸以内、特に好ましくは数個のアミノ酸以内（例えば、５アミノ酸以内、３アミノ酸以内、２アミノ酸以内）である。
　さらに、現在の技術水準においては、当業者であれば、その遺伝子（ヌクレオチド配列）情報を利用して、同種若しくは他の細菌等から、その相同遺伝子を同定することが可能である。相同遺伝子を同定するための方法としては、例えば、ハイブリダイゼーション技術（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９８：５０３，１９７５）やポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．，ｅｔ　ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０：１３５０－１３５４，１９８５、Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．ｅｔ　ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：４８７－４９１，１９８８）が挙げられる。相同遺伝子を同定するためには、通常、ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行なう。ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件としては、６Ｍ　尿素、０．４％　ＳＤＳ、０．５ｘＳＳＣの条件又はこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を例示できる。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、６Ｍ　尿素、０．４％　ＳＤＳ、０．１ｘＳＳＣの条件を用いれば、より相同性の高い遺伝子の単離を期待することができる。
　したがって、本発明にかかるＰＣＴには、前記触媒活性を有する限り、前記細菌由来の野生型ヌクレオチド酸配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡがコードするタンパク質も含まれる。
　また、同定された相同遺伝子がコードするタンパク質は、通常、前記細菌由来のそれと高い相同性（高い類似性）、好ましくは高い同一性を有する。ここで「高い」とは、少なくとも５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上（例えば、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）のことである。
　したがって、本発明にかかるＰＣＴには、前記触媒活性を有する限り、前記細菌由来の野生型アミノ酸配列と少なくとも５０％以上の相同性（類似性）又は同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質も含まれる。
　なお、配列の相同性は、ＢＬＡＳＴのプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ　ｅｔ　ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３－４１０，１９９０）を利用して決定することができる。該プログラムは、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：２２６４－２２６８，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５８７３－５８７７，１９９３）に基づいている。例えば、ＢＬＡＳＴによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。また、Ｇａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴプログラムを用いて、アミノ酸配列を解析する場合は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２，１９９７）に記載されているように行うことができる。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。
　上述のＰＣＴの改変体又は相同体が、前記触媒活性を有するか否かは、当業者であれば、例えば、Ａ．Ｅ．Ｈｏｆｍｅｉｓｔｅｒら（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第２０６巻、第５４７－５５２頁）に記載の方法を用い、それらの触媒活性を測定して判定することができる。
　また、前述のＰＣＴの他、例えば、３ＨＨｘ等の３位にヒドロキシ基を有するヒドロキシカルボン酸を対象とする場合には、アシル－ＣｏＡシンテターゼが、本発明にかかるＣｏＡ転移酵素の好適な例として用いられる。
　アシル－ＣｏＡシンテターゼ（ＡｌｋＫ）は、酵素番号（ＥＣ）：６．２．１．３に分類される酵素を意味する。本発明にかかるＡｌｋＫとしては、その触媒活性を保持している限り、その由来については特に制限はないが、中鎖３－ヒドロキシカルボン酸に対して十分な活性を有するという観点から、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する細菌由来のものが好ましく、シュードモナス・オレオボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）又はシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ）由来のものがより好ましく、シュードモナス・プチダ由来のものがさらに好ましく、シュードモナス・プチダ　ＫＴ２４４０由来のもの（配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）がより好ましい（Ｗａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．Ａｐｐｌ　Ｅｎｖｉｒｏｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１２　Ｊａｎ；７８（２）：５１９－５２７　参照）。
　またＰＣＴ同様に、本発明にかかるＡｌｋＫには、前記触媒活性を有する限り、前記細菌由来の野生型アミノ酸配列（例えば、配列番号：２に記載のアミノ酸配列）において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質（改変体）も含まれる。本発明にかかるＡｌｋＫにおいて「複数」とは、１００アミノ酸以内、好ましくは８０アミノ酸以内、より好ましくは５０アミノ酸以内、さらに好ましくは３０アミノ酸以内、より好ましくは２０アミノ酸以内、さらに好ましくは１０アミノ酸以内、特に好ましくは数個のアミノ酸以内（例えば、５アミノ酸以内、３アミノ酸以内、２アミノ酸以内）である。
　さらに、本発明にかかるＡｌｋＫには、前記触媒活性を有する限り、前記細菌由来の野生型ヌクレオチド酸配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡがコードするタンパク質、前記細菌由来の野生型アミノ酸配列と少なくとも５０％以上の相同性（類似性）又は同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質も含まれる。
　また、かかるＡｌｋＫの改変体又は相同体が、前記触媒活性を有するか否かは、当業者であれば、例えば、当該酵素の反応によって生じたアシルＣｏＡを、アシルＣｏＡオキシダーゼによって特異的に酸化し、ここで生じた過酸化水素を、ペルオキシダーゼの存在下で、４－アミノアンチピリンと、３－メチル－Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）アニリン、Ｎ，Ｎ－ジメチルアニリン、Ｎ，Ｎ－ジエチルアニリン又はフェノールとにより発色させて検出する方法を用いて判定することができる。
　（重合酵素）
　本発明において「重合酵素」とは、前述のＣｏＡが転移されたヒドロキシカルボン酸を重合し、上述のホモ重合セグメント及び共重合セグメントを形成する反応を触媒する酵素であればよく、例えば、（１）２位のみにヒドロキシ基を有するヒドロキシカルボン酸と、（２）２位にヒドロキシ基を有しないヒドロキシカルボン酸とを認識して重合反応を制御できる重合酵素が挙げられる。好ましくは、前記触媒活性を有する、タイプ１　ポリヒドロキシアルカン酵素（ＰｈａＣ）又はその改変体が挙げられ、さらに好ましくは、エロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属に属する細菌由来のタイプ１　ＰｈａＣ又はその改変体であり、より好ましくは、エロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ　ｃａｖｉａｅ）由来のタイプ１　ＰｈａＣ又はその改変体である。さらに好ましくは、エロモナス属に属する細菌由来のタイプ１　ＰｈａＣのＮ末部分とラルストニア属に属する細菌由来のタイプ１　ＰｈａＣのＣ末部分とを融合させたキメラ型重合酵素であり、より好ましくは、エロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ　ｃａｖｉａｅ）由来のタイプ１　ＰｈａＣのＮ末部分とラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ　ｅｕｔｒｏｐｈａ）由来のタイプ１　ＰｈａＣのＣ末部分とを融合させたキメラ型重合酵素であり、さらに好ましくは、エロモナス・キャビエ由来のタイプ１　ＰｈａＣのＮ末側２６％の部分とラルストニア・ユートロファ由来のタイプ１　ＰｈａＣのＣ末側７４％の部分とを融合させたキメラ型重合酵素（ＰｈａＣＡＲ、（配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質））である（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ　Ｋ．ｅｔ　ａｌ．、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．２００９Ａｐｒ　１３；１０（４）：６８２－６８５　参照）。
　また上述のＣｏＡ転移酵素同様に、本発明にかかる重合酵素には、前記触媒活性を有する限り、前記酵素のアミノ酸配列（例えば、配列番号：３に記載のアミノ酸配列）において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質（改変体）も含まれる。本発明にかかるＣｏＡ転移酵素において「複数」とは、１００アミノ酸以内、好ましくは８０アミノ酸以内、より好ましくは５０アミノ酸以内、さらに好ましくは３０アミノ酸以内、より好ましくは２０アミノ酸以内、さらに好ましくは１０アミノ酸以内、特に好ましくは数個のアミノ酸以内（例えば、５アミノ酸以内、３アミノ酸以内、２アミノ酸以内）である。
　かかる改変としては、例えば、ＰｈａＣＡＲにおいて、Ｆ３１４Ｘ、Ｉ３２０Ｘ、Ｇ４２３Ｘ、Ｖ４４８Ｘ及びＩ５０５Ｘからなる群から選択される、少なくとも１のアミノ酸置換が挙げられる（「Ｘ」は、置換前とは異なるアミノ酸を意味する）。かかるアミノ酸置換によって、３ＨＨｘ重合能は強化されるため、例えば、ヒドロキシカルボン酸（Ｂ）として３ＨＨｘを用いた場合、本発明にかかる共重合体における３ＨＨｘ分率を向上させることが可能となる。
　さらに、本発明にかかる重合酵素には、前記触媒活性を有する限り、前記酵素をコードするヌクレオチド酸配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡがコードするタンパク質、前記酵素のアミノ酸配列と少なくとも５０％以上の相同性（類似性）又は同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質も含まれる。
　また、かかる重合酵素の改変体又は相同体が、前記触媒活性を有するか否かは、当業者であれば、例えば、非特許文献２に記載の方法を用いて判定することができる。
　（微生物）
　本発明においては、上述の２種の酵素を発現する微生物を培養することにより、本発明の共重合体を製造することができる。かかる微生物として、生来的にこれら酵素を発現しているものを用いることができるが、通常、当該酵素をコードするＤＮＡを微生物に導入して調製される形質転換体が用いられる。
　本発明にかかる「微生物」としては、ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）合成酵素群が機能的に発現できる微生物であればとくに限定されないが、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、水素細菌（カプリアビダス・ネカトール、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｎｅｃａｔｏｒ）、コリネ型細菌、酵母、ラルストニア属細菌、シュードモナス属細菌が挙げられる。これら微生物の中で、ポリマー生産性とその生産安定性の観点から、大腸菌、水素細菌が好ましく、大腸菌がより好ましい。大腸菌の菌株はとくに限定されないが、より安定した共重合体生産が可能となるという観点から、一例として、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９株が挙げられる。また、後述の実施例に示すように、本発明にかかるヒドロキシカルボン酸（Ｂ）（３ＨＢ、３ＨＶ、３ＨＨｘ等）を生合成できるという観点からは、ラルストニア属細菌が好ましく、ラルストニア・ユートロファがより好ましく、ラルストニア・ユートロファのグルコース資化性改変株（Ｈ１６　ＮＳＤＧ－ＧＧ－ΔＢ１株）がさらに好ましく、後述の実施例に示す、Ｈ１６　ＣＡＲ－ＧＧ－ΔＢ１、Ｈ１６　ＣＡＲ－ＧＧ－ΔＢ１－ｌｄｈＡｈａｄＡが、より好ましい。
　かかる微生物において、本発明にかかる２種の酵素を発現させるために、上記ＤＮＡは通常、ベクターに組み込まれた形態にて導入される。また、相同組換えによる染色体への導入であってもよい。なお、本発明にかかる微生物の染色体に導入されたＤＮＡ（遺伝子）が適切に転写され、さらには所望の活性を有するタンパク質に翻訳されるために、当該ＤＮＡは染色体上で適切なプロモータ一の制御下にあるように組み込まれる必要がある。
　本発明において「ベクター」は、自己複製ベクター、すなわち、染色体外の独立体として存在し、その複製が染色体の複製に依存しない、例えば、プラスミドを基本に構築することができる。また、ベクターは、宿主細胞に導入されたとき、その宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それが組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであってもよい。
　このようなベクターとしては、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡが挙げられる。大腸菌に導入するためのベクターの例としては、ｐＢＬｕｅｓｃｒｉｐｔ（ｐＢＬｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＫＳ＋、ｐＢＬｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ＋、ｐＢＬｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＫＳ＋、ｐＢＬｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＫＳ－等）、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８等のプラスミドＤＮＡ、ＥＭＢＬ３、Ｍ１３、λｇｔII等のファージＤＮＡが挙げられる。水素細菌に導入するためのベクターの例としては、ｐＣＵＰ２（国際公開２００７／０４９７１６号　参照）、範囲の宿主において複製・保持されるＲＫ２複製起点を有するｐＬＡ２９１７（ＡＴＣＣ３７３５５）やＲＳ　Ｆ１０１０複製起点を有するｐＪＲＤ２１５（ＡＴＣＣ３７５３３）等を挙げることができる。コリネ型細菌に導入するためのベクターの例としては、ｐＡＭ３３０、ｐＨＭ１５１９、ｐＡＪ６５５、ｐＡＪ６１１、ｐＡＪ１８４４、ｐＣＧ１、ｐＣＧ２、ｐＣＧ４、ｐＣＧ１１、ｐＨＫ、ｐＰＳＰＴＧ１、ｐＶＣ７、ｐＵＣ１９Ｉ等が挙げられる。酵母に導入するためのベクターの例としては、ＹＥｐ１３、ＹＣｐ５０等が挙げられる。また、ラルストニア属細菌、シュードモナス細菌等に導入するためのベクターの例としては、前述のｐＬＡ２９１７（ＡＴＣＣ３７３５５）、ｐＪＲＤ２１５（ＡＴＣＣ３７５３３）を挙げることができる。また、相同性組換え用のべクタ一としては、例えば、ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ（Ｓｃｈａｆｅｒら，Ｇｅｎｅ１４５，６９－７３（１９９４））、ｐＪＱ２００（Ｑｕａｎｄｔ，Ｊ．　ａｎｄ　Ｈｙｎｅｓ，Ｍ．Ｐ．，Ｇｅｎｅ（１９９３）１７：１５－２１）が挙げられる。
　上述の各酵素をコードするＤＮＡのベクターへの挿入は、遺伝子工学の分野で慣用されている、公知の遺伝子組み換え技術を用いることができる。例えば、当該ＤＮＡをベクターに挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法等が採用される。
　組み換えに際して、ベクターに挿入されるＤＮＡからの各タンパク質の転写翻訳を調節することのできるプロモーターの下流に、前記ＤＮＡを連結することが好ましい。プロモーターとしては、宿主中で遺伝子の転写を調節できるものであれば特に制限はなく、宿主細胞と同種若しくは異種のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子の発現を制御するＤＮＡ配列として得ることができる。例えば、大腸菌を宿主として用いる場合には、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、Ｔ７プロモーターが挙げられる。また、カプリアビダス・ネカトールのｐｈｂオペロンのプロモーター領域も利用することができる。水素細菌を宿主として用いる場合には、当該細菌由来のｐｈａＣ１遺伝子プロモーター、当該細菌由来のｐｈａＰ１遺伝子プロモーターが挙げられる。コリネ型細菌を宿主として用いる場合には、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム由来の細胞表層タンパク質遺伝子プロモーターが挙げられる。酵母を宿主として用いる場合には、例えば、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーターが挙げられる。シュードモナス属細菌を本発明の微生物として用いる場合には、ｐｈａＣ１Ｐｓ遺伝子上流やｐｈｂＣＡＢＲｅオペロン上流のプロモーターを含む領域を用いることができる。
　ベクターには、必要に応じて、前記ＤＮＡを導入しようとする微生物において利用可能なターミネーター配列、エンハンサー配列、スプライシングシグナル配列、ポリＡ付加シグナル配列、リボゾーム結合配列（ＳＤ配列）等の、プロモーター以外の発現を制御する配列も含まれる。また当該配列以外に発現を誘導する配列を含んでいても良い。かかる配列としては、イソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加により、下流に配置された遺伝子の発現を誘導することのできるラクトースオペロンが挙げられる。
　ベクターには、必要に応じて、選択マーカー遺伝子を含んでいても良い。選択マーカー遺伝子は、形質転換された微生物細胞の選択の方法に応じて適宜選択されてよく、例えば、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子、アミノ酸や核酸等の栄養素の細胞内生合成に関与する遺伝子（栄養要求性を相補する遺伝子）、ルシフェラーゼ等の化学発光に関する遺伝子、ＧＦＰ等の蛍光タンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。
　ベクターには、本発明にかかる酵素（ＣｏＡ転移酵素、重合酵素）をコードするＤＮＡが１種ずつ挿入されていてもよく、また複数種のＤＮＡを１のベクターに挿入してもよい。ベクターに複数種のＤＮＡを挿入する場合において、一つのベクターに複数種のＤＮＡが挿入される場合、これらのＤＮＡはオペロンを形成することが好ましい。ここで「オペロン」とは、同一のプロモーターの制御下に転写される１又は複数の遺伝子から構成される核酸配列単位である。
　上記ＤＮＡ、又は当該ＤＮＡが挿入されているベクターは、公知の手法を用い、微生物に導入される。微生物へのＤＮＡ導入方法としては、例えば、塩化カルシウム法、ヒートショック法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、接合伝達法、カルシウムイオンを用いる方法が挙げられる。
　（培地等の培養条件）
　本発明においては、前述の微生物を、ヒドロキシカルボン酸（Ａ）及びヒドロキシカルボン酸（Ｂ）を含む培地にて培養することにより、本発明の共重合体を製造することができる。
　培地は、十分な濃度の炭素源が供給されていればとくに限定されないが、炭素源以外の栄養源である窒素源、無機塩類、そのほかの有機栄養源を含んでいてもよい。
　炭素源としては、上述の微生物が資化可能であればどんな炭素源でも使用可能であるが、好ましくは、グルコース、フルクトース、スクロース等の糖類；パーム油、パーム核油、コーン油、やし油、オリーブ油、大豆油、菜種油、ヤトロファ油等の油脂やその分画油類；ラウリン酸、オレイン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、ミリンスチン酸等の脂肪酸やそれらの誘導体等が挙げられる。
　窒素源としては、例えば、アンモニア；塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩；ペプトン、肉エキス、酵母エキス等が挙げられる。無機塩類としては、例えば、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２ナトリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。そのほかの有機栄養源としては、例えば、グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリン等のアミノ酸；ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ等のビタミン等が挙げられる。
　本発明にかかる培地の例として、大腸菌等を培養する場合には、ＬＢ培地（１０ｇ／Ｌ　トリプトン、５ｇ／Ｌ　酵母エキス、５ｇ／Ｌ　塩化ナトリウム　含有）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、天然のＰＨＡ生産菌（例えば、水素細菌、シュードモナス・プチダ）を宿主として用いる場合は、窒素源制限無機塩培地（例えば、９ｇ／Ｌ　Ｎａ２ＨＰＯ４，１．５ｇ／Ｌ　ＫＨ２ＰＯ４，０．５ｇ／Ｌ　ＮＨ４Ｃｌ，０．２ｍｇ／Ｌ　ＭｇＳＯ４，微量元素（ｔｒａｃｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ）　含有）、リン源制限無機塩培地（例えば、ｇｌｕｃｏｓｅ　１ｇ／Ｌ，ＫＮＯ３　０．５ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ４（７Ｈ２０）　０．２ｇ／Ｌ，ＣａＣ１２　０．１ｇ／Ｌ，ＮａＣ１　０．１ｇ／Ｌ、これに８．０ｍｇ　Ｋ２ＨＰＯ４及び２．０ｍｇ　ＫＨ２Ｐ０４を加え、ｐＨを７に調整）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
　培地に添加されるヒドロキシカルボン酸は上述のとおりであるが、Ｒ体であってもよく、ラセミであってもよいが、好ましくはＲ体である。また培地の至適ｐＨに合わせて、ｐＨを調整（中和等）してから添加してもよいし、塩の形態にて添加してもよい。かかる塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩等が挙げられる。培地への添加量としては、共重合合成に適した濃度であればよく、また濃度に依存して合成される、共重合中のモノマー組成を制御するために適宜調整することもできるが、例えば、１～１０ｇ／Ｌである。
　また、後述の実施例に示すとおり、ヒドロキシカルボン酸（Ａ）及びヒドロキシカルボン酸（Ｂ）自体を培地に含めずとも、かかるヒドロキシカルボン酸を生合成し得る微生物であれば、それらの代謝前駆体（代謝の出発物質等）を用いることによって、本発明の共重合体を製造することができる。
　したがって、本発明は、
　ＣｏＡ転移酵素及び重合酵素を発現する微生物を、ヒドロキシカルボン酸（Ａ）及び／又はその代謝前駆体と、ヒドロキシカルボン酸（Ｂ）及び／又はその代謝前駆体とを含む培地にて培養する工程と、
工程２：前記工程にて得られた培養物から、前記共重合体を回収する工程とを含む、
方法と言い換えることもできる。
　本発明にかかる代謝前駆体としては、微生物における代謝経路によって、本発明にかかるヒドロキシカルボン酸に最終的に変換され得る物質であれば特に制限はないが、例えば、ヒドロキシカルボン酸（Ａ）が２ＨＢである場合には、グルコース、スレオニン、２－ケト酪酸等が挙げられる。例えば、ヒドロキシカルボン酸（Ｂ）が３ＨＢである場合には、グルコース、ピルビン酸、アセチルＣｏＡ、アセトアセチルＣｏＡ等が挙げられる。例えば、ヒドロキシカルボン酸（Ｂ）が３ＨＶである場合には、２ＨＢ、２－オキソ酪酸、スレオニン、プロピオン酸、プロピオン酸－ＩＰ、プロピオン酸－ＣｏＡ、３－ケトバレリル－ＣｏＡ等が挙げられる（図５Ａ等　参照のほど）。
　上述の微生物を培養する際の条件として、前述の培地の他、培養温度は、用いる微生物が生育可能な範囲で、各酵素活性が発揮される範囲であれば特に制限なく、通常２５～３７℃、好ましくは２８～３２℃、特に好ましくは３０℃である。また用いる微生物の種類によって、好気的条件、嫌気的条件は適宜選択し得るが、共重合体合成がより促進され易いという観点から、好気的条件が好ましい。培養時間としては、共重合体の生産量等に応じて適宜調整され得るが、通常１２時間～１週間、好ましくは１～３日間である。
　（共重合体の回収等）
　本発明においては、上述の微生物を培養して得られる培養物から、本発明の共重合体を回収する。なお「培養物」とは、微生物を培地で培養することによって得られる、増殖した当該微生物のみならず、該微生物の分泌産物及び代謝産物等を含有する培地、それらの希釈物、濃縮物が含まれる。
　このような培養物からの共重合体の回収方法としては、特に限定されないが、例えば、次のような方法により行うことができる。培養終了後、培地から遠心分離処理等で微生物を分離し、その微生物を蒸留水及びメタノール等により洗浄し、乾燥（例えば、凍結乾燥）させる。この乾燥菌体を、クロロホルム等の有機溶剤を用いて加熱処理することによって、共重合体を抽出する。この共重合体を含んだ有機溶剤溶液から、濾過等によって菌体成分を除去し、そのろ液にメタノールやヘキサン等の貧溶媒を加えて共重合体を沈殿させる。さらに、濾過や遠心分離によって上澄み液を除去し、乾燥させて共重合体を回収する。
　また、このようにして得られた共重合体は、後述の実施例に示すように、核磁気共鳴法（ＮＭＲ）、ゲル浸透クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフ法等の公知の分析方法を用い、その平均分子量、モノマー組成、構造等を確認することができる。
　以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。また実施例は、下記方法を用いて行なった。
　（実施例１）
　＜Ｐ（２ＨＢ－ｂ－（３ＨＢ－ｒａｎ－３ＨＨｘ））の調製方法＞
　ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＫＳ＋プラスミドに、Ｃ．ｎｅｃｔｏｒのｐｈｂオペロンのプロモーター領域、ＰｈａＣＡＲ遺伝子、メガスファエラ・エルスデニ由来のｐｃｔ遺伝子、シュードモナス・プチダ　ＫＴ２４４０由来のＡｌｋＫ遺伝子を順に挿入したプラスミド（ｐＢＳＰｒｅＣＡＲｐｃｔＡｌｋＫ）を、調製した。なお、ｐＢＳＰＲｅｐｈａＣ（ＡＲ）ｐｃｔ（非特許文献２　参照）において、前記ｐｃｔ遺伝子の下流に、前記ＡｌｋＫ遺伝子を、常法により挿入することによって作成した。そして、このプラスミドを、大腸菌（ＪＭ１０９株）に、塩化カルシウム法にて導入し、形質転換体を得た。
　この形質転換体を、（Ｒ，Ｓ）－２ＨＢ－Ｎａ　１～１０ｇ／ｍＬ、（Ｒ，Ｓ）－３ＨＢ－Ｎａ　１～１０ｇ／ｍＬ及び（Ｒ，Ｓ）－３ＨＨｘ－Ｎａ　１～１０ｇ／ｍＬを含有するＬＢ培地にて、３０℃、４８時間振とう培養した。
　得られた培養液から回収した大腸菌を、凍結乾燥し、クロロホルム加熱処理することにより、ポリマーを回収した（Ｔａｇｕｃｈｉ，Ｓ.ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ　Ａ．２００８，１０５（４５），１７３２３－１７３２７に記載の回収方法　参照のほど）。
　＜Ｐ（２ＨＢ－ｂ－（３ＨＢ－ｒａｎ－３ＨＨｘ））の構造解析＞
　（Ｒ，Ｓ）－２ＨＢ－Ｎａ、（Ｒ，Ｓ）－３ＨＢ－Ｎａ、及び（Ｒ，Ｓ）－３ＨＨｘ－Ｎａを各々２．５ｇ／ｍＬになるようＬＢ培地に添加し、得られたポリマーを重クロロホルムに溶解させたのち、１Ｈ　ＮＭＲ測定を行うことにより、組成とｍｏｌ分率を算出した。その結果、図１Ａに示すとおり、２ＨＢに由来する５ｐｐｍシグナルが一つしか見えないことから、Ｐ（２ＨＢ）セグメントが存在することが明らかになった。
　また、同一のサンプルをさらに１３Ｃ　ＮＭＲ測定に供した。その結果、図１Ｂに示すとおり、３ＨＨｘ同士の連鎖強度が弱いことから、Ｐ（３ＨＨｘ）ホモ重合セグメントが存在しない、すなわち、３ＨＨｘユニットを含む構造がランダム配列であることが分かった。
　以上のことから、上記にて得られたポリマーは、Ｐ（２ＨＢ）ホモポリマーセグメントと、Ｐ（３ＨＢ－ｒａｎ－３ＨＨｘ）ランダムセグメントとから構成されるブロック共重合体であることが明らかになった。
　＜Ｐ（２ＨＢ－ｂ－（３ＨＢ－ｒａｎ－３ＨＨｘ））の物性解析＞
　ポリマー１００ｍｇ程度をクロロホルムに溶解し、ガラスシャーレ中で溶媒を揮発させることにより、ソルベントキャストフィルムを作成した。得られた円形のフィルムから、試験片を切り出して、引っ張り試験に供することにより、破壊伸び（伸張性）、引っ張り強度等のパラメーターを算出した。
　図１Ｃに示した結果から明らかなように、非特許文献２に開示の二元共重合体　Ｐ（２ＨＢ－ｂ－３ＨＢ）と比較して、今回得られた三元共重合体　Ｐ（２ＨＢ－ｂ－（３ＨＢ－ｒａｎ－３ＨＨｘ））は高い伸張性を示した。特に、三元共重合体は、１２００％を超える非常に高い伸張性を示した。これらの結果から、本発明によれば、このようにモノマーの配列を制御、ひいては高次構造を制御することにより、ひずみと応力が比例するエラストマー物性を示す共重合体が得られることも示唆される。
　（実施例２）
　＜Ｐ（３ＨＢ－ｂ－（ＧＬ－ｒａｎ－３ＨＢ））の調製方法＞
　実施例１同様に、ｐＢＳＰｒｅＣＡＲｐｃｔＡｌｋＫを、大腸菌（ＪＭ１０９株）に、塩化カルシウム法にて導入し、形質転換体を得た。
　また、ＰｈａＣＡＲをコードするプラスミドＤＮＡの代わりに、ＰｈａＣ１ＰｓＳＴＱＫをコードするプラスミドＤＮＡを導入した形質転換体を調製した。なお、このプラスミドは、ｐＢＳＰｒｅＣＡＲｐｃｔＡｌｋＫにおいて、常法により、ＰｈａＣＡＲ遺伝子の代わりに、ＰｈａＣ１ＰｓＳＴＱＫ遺伝子に置換することにより作成した。
　そして、これら形質転換体を、（Ｒ，Ｓ）－ＧＬ－Ｎａ　０～１２ｇ／Ｌ及び（Ｒ，Ｓ）－３ＨＢ－Ｎａ　５ｇ／Ｌを含有するＬＢ培地にて、３０℃、４８時間振とう培養し、得られた培養液から、実施例１に記載の方法同様にポリマーを回収した。
　＜Ｐ（３ＨＢ－ｂ－（ＧＬ－ｒａｎ－３ＨＢ））の分析＞
　培養後の菌体を凍結乾燥し、クロロホルム抽出を行うことで、細胞内のポリマーを抽出した。菌体を濾別したクロロホルム溶液を濃縮した後、過剰なメタノールを加えてポリマーを沈殿させた。回収されたポリマーを重クロロホルムに溶解させ、１Ｈ　ＮＭＲ測定を行った。得られた結果を図２Ａ及び２Ｂに示す。なお、これらの図には、（Ｒ，Ｓ）－ＧＬ－Ｎａ　１２ｇ／Ｌ及び（Ｒ，Ｓ）－３ＨＢ－Ｎａ　５ｇ／Ｌを含有するＬＢ培地を用いて得られたポリマーを解析した結果を示す。また、ピーク強度に基づいてモノマー組成を算出した。得られた結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　＜Ｐ（３ＨＢ－ｂ－（ＧＬ－ｒａｎ－３ＨＢ））についてのゲル濾過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）分析＞
　培養後の菌体を凍結乾燥し、クロロホルム抽出を行うことで、細胞内のポリマーを抽出した。そして、分析の際には、ＰＴＦＥメンブレンを使ってろ過し、クロロホルムを移動相としたＧＰＣ分析に供した。得られた結果を図２Ｃに示す。なお、当該図には、（Ｒ，Ｓ）－ＧＬ－Ｎａ　１２ｇ／Ｌ及び（Ｒ，Ｓ）－３ＨＢ－Ｎａ　５ｇ／Ｌを含有するＬＢ培地を用いて得られたポリマーを解析した結果を示す。
　上記ＮＭＲ解析の結果、図２Ａ及び２Ｂにおいて、４．５～４．９ｐｐｍに見られる４つのピークは、ＧＬユニットに帰属されるシグナルであり、最も低磁場側（左側）のピークが３ＨＢに挟まれたＧＬユニット（３ＨＢ－ＧＬ－３ＨＢ）に対応する。ＧＬ分率が２０ｍｏｌ％程度のランダム共重合体の場合は、３ＨＢ－ＧＬ－３ＨＢのシグナルが強く観測されると予測される。
　以上のことから、ＰｈａＣ１ＰｓＳＴＱＫを用いて得られたポリマーは、ランダム共重合体（Ｐ（ＧＬ－ｒａｎ－３ＨＢ））であると判定される（図２Ａ　参照）。一方、ＰｈａＣＡＲを用いて得られたポリマーは、ＧＬ－ＧＬ－ＧＬのシグナルが強く観測され、ＧＬ密度が高い構造が含まれることが分かる。４つのピークの相対強度比から、ＧＬ分率が約７０ｍｏｌ％と推定され、これがポリマー全体のＧＬ分率　約２０ｍｏｌ％と大きく異なることから、本ポリマーはランダム―ブロック構造を有していること（Ｐ（３ＨＢ－ｂ－（ＧＬ－ｒａｎ－３ＨＢ）））が明らかになった。
　また、上記ゲル濾過クロマトグラフィー分析において、ポリマーが二種類以上の混合物（例えば、Ｐ（３ＨＢ）との共重合体）である場合、分子量分布が複数観測される。しかしながら、ＰｈａＣＡＲを用いて得られたポリマーに関しては、図２Ｃに示すとおり、単峰性のピークが見られたことから、当該ポリマーが同一分子内に配列構造を持つことが支持された。
　このように、ＰｈａＣＡＲを用いて得られたポリマーは、Ｐ（３ＨＢ）ホモポリマーセグメントとＰ（ＧＬ－ｒａｎ－３ＨＢ）ランダム共重合体セグメントとを含み、これまでの生合成ＰＨＡで全く合成例のない、同一分子鎖内で組成が大きく異なる配列構造を有する。
　このようなポリマーには、メリットが主に２つある。一つ目は、同一分子内に物性の異なる複数のポリマーが連結した構造を作れるため、その構造に起因する新規材料の創生が可能となることである。二つ目は、ＧＬユニットの連鎖が多く含まれることから、非酵素的な加水分解性が向上する（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ　Ｋ．ｅｔ　ａｌ．，ＡＣＳ　Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　＆　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，３（１２）３０５８，２０１７　参照）。
　（実施例３）
　＜Ｐ（３ＨＢ－ｂ－（ＧＬ－ｃｏ－３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨｘ））の調製方法＞
　ｐＢＳＰｒｅＣＡＲｐｃｔＡｌｋＫを、大腸菌（ＪＭ１０９株）に、塩化カルシウム法にて導入し、形質転換体を得た。この形質転換体を、（Ｒ，Ｓ）－ＧＬ－Ｎａ　２．５～５ｇ／Ｌ、（Ｒ，Ｓ）－３ＨＢ－Ｎａ　０～２．５ｇ／Ｌ及び（Ｒ，Ｓ）－３ＨＨｘ－Ｎａ　１ｇ／Ｌを含有するＬＢ培地にて、３０℃、４８時間振とう培養し、得られた培養液から、実施例１に記載同様の方法にて、ポリマーを回収した。
　＜Ｐ（３ＨＢ－ｂ－（ＧＬ－ｃｏ－３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨｘ））の分析＞
　上記＜Ｐ（３ＨＢ－ｂ－（ＧＬ－ｒａｎ－３ＨＢ））の分析＞に記載の方法同様に、１Ｈ　ＮＭＲ測定を行った。得られた結果を図３Ａに示す。なお、当該図面は、（Ｒ，Ｓ）－ＧＬ－Ｎａ　５ｇ／Ｌ、（Ｒ，Ｓ）－３ＨＢ－Ｎａ　２．５ｇ／Ｌ及び（Ｒ，Ｓ）－３ＨＨｘ－Ｎａ　１ｇ／Ｌを含有するＬＢ培地を用いて得られたポリマーを解析した結果であり、ＧＬユニットのシグナルを拡大したものである。また、ピークエリア値からモノマー組成を算出した。得られた結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　＜Ｐ（３ＨＢ－ｂ－（ＧＬ－ｃｏ－３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨｘ））についての示差走査熱量測定（ＤＳＣ）＞
　ポリマーをクロロホルムに溶解し、ガラスシャーレ中で溶媒を揮発させることにより、ソルベントキャストフィルムを作製した。得られたフィルムから数ミリグラムの試験片を切り出して、アルミパンに封入することによりサンプルとした。本サンプルをＤＳＣ分析に供した。ＤＳＣ分析は、－５０℃から２２０℃までの昇温を行い、結晶の融解に伴う吸熱ピークの有無を判断した。得られた結果を図３Ｂに示す。
　表２に示すとおり、本発明によれば、ＧＬ、３ＨＢ及び３ＨＨｘを含む３元共重合体の合成が可能であることが明らかになった。また、このようにして得られる３元共重合体において、３ＨＨｘは６０ｍｏｌ％まで上昇させることができる。これは、ポリマー物性に柔軟性を付与する目的に対して十分な割合である。また、ＧＬ分率は３０ｍｏ％程度まで上昇させることが可能であり、材料物性を改変する目的のために十分なＧＬユニット分率が達成可能となる。
　また、図３Ａに示すとおり、上記ＮＭＲ解析結果において、ＧＬユニットのシグナルを拡大したところ、観測されている４つのシグナルの相対強度に基づいて、得られた本ポリマーがグラディエント構造を有していることが明らかになった。グラディエント構造では、分子の両端と中央部分がそれぞれ異なる構造を持つため、トリブロックに近い構造をとる。
　さらに、図３Ｂに示すとおり、ＤＳＣ分析において、全く結晶融解ピークが見られなかった。このことから、本ポリマーは結晶化度が非常に低い構造を取ることが示される。
　以上の結果から、本ポリマーは、実施例２において示した　Ｐ（３ＨＢ－ｂ－（ＧＬ－ｒａｎ－３ＨＢ））と同様に、ＧＬ分率の高い内部構造を含むことが明らかになった。一方で、３ＨＢと３ＨＨｘユニットは互いにランダムに重合していると判断できる。したがって、本ポリマーは、従来型の３ＨＢ，３ＨＨｘランダム共重合体に、ＧＬ－ｒｉｃｈ領域が追加された特殊な構造（Ｐ（３ＨＢ－ｂ－（ＧＬ－ｃｏ－３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨｘ）））を有する。
　＜Ｐ（３ＨＢ－ｂ－（ＧＬ－ｃｏ－３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨｘ））の物性解析＞
　ポリマーをクロロホルムに溶解し、ガラスシャーレ中で溶媒を揮発させることにより、ソルベントキャストフィルムを作成した。得られたフィルムから試験片を切り出して、引っ張り試験に供した。得られた結果を図３Ｃに示す。
　図３Ｃに示す、Ｐ（３ＨＢ－ｂ－（ＧＬ－ｃｏ－３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨｘ））の引っ張り試験結果は、傾きが緩やかであることから、柔らかい物性であることがわかる。また、少し伸長することができる。このように、本ポリマーは、軟質性の３ＨＨｘユニットが導入されることによって、柔軟性が大幅に向上されることが明らかになった。
　また、本ポリマーは、ＧＬユニットが導入されることにより、非酵素的加水分解性が増加しており、例えば、生体内での高い分解性が期待されるため、医療機器（例えば、縫合糸）等において有用である。
　（実施例４）
　＜Ｐ（２ＨＢ）ホモポリマーセグメントと３－ヒドロキシ酸を主体とするランダム共重合体セグメントとから構成されるブロック共重合体の調製方法、及びそのブロック共重合体の解析＞
　実施例１に記載の通り、２ＨＢ、３ＨＢ及び３ＨＨｘを添加した培地で、プラスミドｐＢＳＰｒｅＣＡＲｐｃｔＡｌｋＫを導入した大腸菌ＪＭ１０９株を培養すると、Ｐ（２ＨＢ）ホモポリマーセグメントと、Ｐ（３ＨＢ－ｒａｎ－３ＨＨｘ）ランダムセグメントとから構成されるブロック共重合体が得られる。
　そこで、本実施例においては、実施例１に記載の培養系にて、３ＨＨｘの代わりに、３－ヒドロキシプロピオン酸（３ＨＰ）、４－ヒドロキシ－２－メチル酪酸（４Ｈ２ＭＢ）、２，４－ジヒドロキシ酪酸（２４ＤＨＢ）、５－ヒドロキシ吉草酸（５ＨＶ）又は６－ヒドロキシヘキサン酸（６ＨＨｘ）のナトリウム塩を、それぞれ１．０ｇ／Ｌ添加したＬＢ培地を用いて培養（３０℃、４８時間振とう培養）を行ない、実施例１同様に、それぞれのモノマーユニットが含まれる共重合体が合成されるかにつき、確認した。得られた結果を、図４Ａ及び４Ｂに示す。なお、図４Ａにおいては、上記＜Ｐ（３ＨＢ－ｂ－（ＧＬ－ｒａｎ－３ＨＢ））の分析＞に記載の方法同様に、１Ｈ　ＮＭＲ測定を行った結果を示す。図４Ｂにおいては、上記＜Ｐ（３ＨＢ－ｂ－（ＧＬ－ｃｏ－３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨｘ））についての示差走査熱量測定（ＤＳＣ）＞同様に、解析した結果を示す。
　図４Ａに示すとおり、Ｐ（２ＨＢ）ホモポリマーセグメントの存在は１Ｈ　ＮＭＲ測定により確認された。より具体的に説明すると、いずれのポリマーからも、５．１ｐｐｍ付近に２ＨＢのメチン基に帰属される共鳴が観測されることから、Ｐ（２ＨＢ）セグメントが存在することが示された。
　また、３ＨＢを主体とするセグメントがランダム共重合体であることは、融点測定から確認できた。図４Ｂにて例示する、Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－５ＨＶ）の示差熱量測定のサーモグラムにおいて、融点を表すピーク位置が、Ｐ（３ＨＢ）の融点（１７８℃）付近よりも低くなっている。このことから、５ＨＶがランダム共重合していることが確認できる。なお、図には示さないが、他の共重合体でも同様のサーモグラムが得られている。
　以上の結果から、得られたポリマーは、新たに添加したモノマー前駆体が３ＨＢユニットとのランダム共重合体として取り込まれ、２ＨＢ成分はＰ（２ＨＢ）ホモポリマーセグメントとして重合されることが確認された。より具体的には、上記の培養条件により、新規３元ブロック共重合体、Ｐ（２ＨＢ）－ｂ－Ｐ（３ＨＢ－ｒａｎ－３ＨＰ）、Ｐ（２ＨＢ）－ｂ－Ｐ（３ＨＢ－ｒａｎ－４Ｈ２ＭＢ）、Ｐ（２ＨＢ）－ｂ－Ｐ（３ＨＢ－ｒａｎ－２４ＤＨＢ）、Ｐ（２ＨＢ）－ｂ－Ｐ（３ＨＢ－ｒａｎ－５ＨＶ）、Ｐ（２ＨＢ）－ｂ－Ｐ（３ＨＢ－ｒａｎ－６ＨＨｘ）が得られることが確認された。
　さらに、本発明においては、培地に加える前駆体３ＨＢを３ＨＰに置き換えても前記同様にＰ（２ＨＢ）ホモポリマーセグメントと、３－ヒドロキシ酸を主体とするセグメントがランダム共重合体から構成されるブロック共重合体が得られる。すなわち、本発明によれば、Ｐ（２ＨＢ）－ｂ－Ｐ（３ＨＰ－ｒａｎ－４Ｈ２ＭＢ）、Ｐ（２ＨＢ）－ｂ－Ｐ（３ＨＰ－ｒａｎ－２４ＤＨＢ）、Ｐ（２ＨＢ）－ｂ－Ｐ（３ＨＰ－ｒａｎ－５ＨＶ）、Ｐ（２ＨＢ）－ｂ－Ｐ（３ＨＰ－ｒａｎ－６ＨＨｘ）等を得ることもできる。
　また、本発明において、これらのポリマーの合成は重合酵素の性質によるものであり、対応するモノマーのＣｏＡ体が合成可能であれば、モノマー供給酵素は選ばない。
　（実施例５）
　＜グルコース及び２ＨＢからの、ブロック共重合体（Ｐ（２ＨＢ）－ｂ－Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＶ））の調製方法＞
　図５Ａに示すとおり、以下に示す生合成経路を備えた微生物であれば、グルコース及び２ＨＢの存在下にて培養することにより、Ｐ（２ＨＢ）ホモポリマーセグメントと３ＨＢ及び３ＨＶからなるセグメントがランダム共重合体とから構成されるブロック共重合体（Ｐ（２ＨＢ）－ｂ－Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＶ））を得られるのではないかと、本発明者らは考えた。
　＜生合成経路＞
・２ＨＢが、ＨａｄＡ（ＣｏＡ転移酵素）の存在下、２ＨＢ－ＣｏＡに変換される。
・解糖系において、グルコースからピルビン酸が生成される。ピルビン酸から、さらにアセチルＣｏＡが生成され、ＰｈａＡ存在下、アセトアセチルＣｏＡに変換され、さらにＰｈａＢの存在下、３ＨＢ－ＣｏＡが生合成される（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５２（２０１１），１４４－１４６）。
・２ＨＢが、ＬｄｈＡ（乳酸脱水素酵素）の存在下、２－オキソ酪酸に変換される。スレオニン及び２－オキソ酪酸から、プロピオン酸及び２－ヒドロキシ酪酸が生成される（Ｌｅｔｔｅｒｓ　ｉｎ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９７，２５，３７１－３７４）。プロピオン酸から、プロピオン酸－ＩＰを経て、プロピオン酸－ＣｏＡが変換される。プロピオン酸－ＣｏＡ及びアセチル－ＣｏＡが、ＰｈａＡの存在下、３－ケトバレリル－ＣｏＡに変換され、さらに、ＰｈａＢの存在下、３ＨＶ－ＣｏＡに変換される（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５２（２０１１），１４４－１４６）。
　＜Ｒａｌｓｔｏｎｉａ　ｅｕｔｒｏｐｈａ改変株の構築＞
　図５Ｂに示すとおり、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ　ｅｕｔｒｏｐｈａグルコース資化性改変株であるＲ．ｅｕｔｒｐｈａ　Ｈ１６　ＮＳＤＧ－ＧＧ－ΔＢ１株（Ｚｈａｎｇら、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ、ｖｏｌｕｍｅ　１８、Ａｒｔｉｃｌｅ　ｎｕｍｂｅｒ：１４７（２０１９）　参照）染色体上のｐｈａオペロンにおいて、ｐｈａＣＮＳＤＧ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ　ｃａｖｉａｅ由来改変型ＰＨＡシンターゼ遺伝子）をｐｈａＣＡＲ遺伝子に相同組換えにより置換し、ＰｈａＣＡＲ発現株　Ｈ１６　ＣＡＲ－ＧＧ－ΔＢ１を構築した。具体的には、目的断片を含むプラスミドｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ誘導体を、接合伝達能を有する大腸菌Ｓ１７－１株を介してＲ．ｅｕｔｒｐｈａに導入し、染色体ＤＮＡ上の目的の位置にｐｈａＣＡＲ遺伝子が挿入された株をカナマイシン耐性を指標に選抜し、続いてｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢに含まれるｓａｃＢのショ糖存在下における致死性を利用して、ベクター部分が除去された組換え株を単離した。
　さらに、図５Ｃに示すとおり、この改変株染色体上のｐｈａＰ１（ＰＨＡ顆粒結合タンパク質遺伝子）下流にＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来のｌｄｈＡ（乳酸脱水素酵素遺伝子）及びｈａｄＡ（ＣｏＡ転移酵素遺伝子）を挿入し、ｐｈａＰプロモーター（ＰｐｈａＰ，ＰＨＡ合成期に転写活性増大）の制御下でこれら酵素の発現も可能とするＨ１６　ＣＡＲ－ＧＧ－ΔＢ１－ｌｄｈＡｈａｄＡを構築した。
　＜Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ改変株の培養及び生合成ＰＨＡの分析＞
　上記改変株（Ｒ．ｅｕｔｒｐｈａ　Ｈ１６　ＣＡＲ－ＧＧ－ΔＢ１－ｌｄｈＡｈａｄＡ）を、グルコースを単一炭素源とする窒素源制限無機塩培地に２ＨＢ－Ｎａラセミ体（２ＨＢ）を添加して培養を試みたところ、２ＨＢの添加により強い生育阻害が確認された。この生育阻害の回避について検討を行い、バリン又はピルビン酸の添加が効果的であることを見出した。そこで、２ＨＢを培地に添加する場合は、バリン若しくはピルビン酸、又はその両方を添加して培養を行なった。なお、窒素源制限無機塩培地の組成は、水１００ｍｌ中、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ　０．９ｇ、ＫＨ２ＰＯ４　０．１５ｇ、ＮＨ４Ｃｌ　０．０５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　０．０２ｇ、及びｔｒａｃｅ－ｅｌｅｍｅｎｔ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　０．１ｍｌである。また、当該培地に添加したその他成分の最終濃度は、グルコース２％（ｗ／ｖ）、２ＨＢ－Ｎａ　０．２５％（ｗ／ｖ）、ピルビン酸　０．８％（ｗ／ｖ）、バリン　０．０５％とした。
　培養は振盪フラスコを用いた１００ｍＬスケールで行い、３０℃で１１８ｓｔｒｏｋｅｓ／ｍｉｎで振とう培養した。１２０時間後の培養液から遠心分離によって菌体を回収し、凍結乾燥して乾燥菌体を得た。
　菌体内に蓄積したＰＨＡの量及び組成は、乾燥菌体に含まれるＰＨＡをメタノリシス処理した後、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）により分析した。本方法は、ＰＨＡの分析に用いられる最も一般的な手法であり（ＰＮＡＳ　Ｎｏｖｅｍｂｅｒ　１１，２００８　ｖｏｌ．１０５　ｎｏ．４５　１７３２３～１７３２７　参照）、酸性条件メタノール存在下でＰＨＡ溶液を加熱することにより、ポリマーを揮発性のあるモノマー誘導体に完全分解し、ＧＣにより定量・定性分析を行う事を可能とするものである。また、上記＜Ｐ（３ＨＢ－ｂ－（ＧＬ－ｒａｎ－３ＨＢ））の分析＞及び＜Ｐ（３ＨＢ－ｂ－（ＧＬ－ｒａｎ－３ＨＢ））についてのゲル濾過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）分析＞に記載の方法同様に、乾燥菌体からのクロロホルム抽出とメタノール再沈によって精製ＰＨＡを取得し、１Ｈ－ＮＭＲによる構造解析及びＧＰＣによる分子量測定を行なった。
　グルコース　２％（ｗ／ｖ）、２ＨＢ－Ｎａ　０．２５％（ｗ／ｖ）、ピルビン酸　０．８％（ｗ／ｖ）、バリン　０．０５％を含む窒素源制限無機塩培地にて、Ｈ１６　ＣＡＲ－ＧＧ－ΔＢ１－ｌｄｈＡｈａｄＡ株を培養した結果、２．２４±０．００ｇ／Ｌの乾燥菌体が得られ、ＰＨＡ量　０．４２±０．００ｇ／Ｌ（ＰＨＡ蓄積率　１８．９２±０．２０ｗｔ％）であった。乾燥菌体のＰＨＡ分析では、３ＨＢと２ＨＢ（１０．６０±０．２４ｍｏｌ％）からなる共重合体と推測された。
　また、前記１Ｈ－ＮＭＲ解析の結果、図５Ｄに示すとおり、このポリマーは、３ＨＢ、２ＨＢに加え、少量の３ＨＶユニットを含有していることが明らかになった。さらに、図５Ｄの「４．８～５．４ｐｐｍ」に示すとおり、２ＨＢのホモセグメントを有するブロック共重合体であることが強く示唆された。
　さらに、ＧＰＣによる分析結果を統合し、その詳細な組成は、Ｐ［（３ＨＢ－ｃｏ－０．５ｍｏｌ％　３ＨＶ）－ｂｌｏｃｋ－８．３ｍｏｌ％　２ＨＢ］と決定された。また、数平均分子量（Ｍｎ）＝３．７１×１０５、重量平均分子量（Ｍｗ）＝９．５８×１０５、多分酸度（ＰＤＩ）＝２．５８であった。さらに、平均重合度　４，３１１、うち２ＨＢセグメントの重合度が３５８であると見積もられた。
　以上説明したように、本発明によれば、ホモ重合セグメント及び共重合セグメントを有するブロック共重合体を提供することが可能となる。かかるブロック共重合体は、構成する各重合セグメントの特長を併せ持ち、様々な物性を発揮し得る。そのため、医療等の様々な産業分野において有用である。また、本発明によれば、ブロック共重合体を生合成にて提供することができるため、環境問題解決にも貢献し得るものである。

Claims (6)

  1. 　２位のみにヒドロキシ基を有するヒドロキシカルボン酸（Ａ）と、２位以外の部位にヒドロキシ基を有するヒドロキシカルボン酸（Ｂ）とを含み、かつ
    　ヒドロキシカルボン酸（Ａ）及びヒドロキシカルボン酸（Ｂ）からなる群から選択される１のヒドロキシカルボン酸からなるホモ重合セグメントと、
    　ヒドロキシカルボン酸（Ａ）及びヒドロキシカルボン酸（Ｂ）からなる群から選択される少なくとも２のヒドロキシカルボン酸を含む共重合セグメントとを有する、共重合体。
  2. 　ヒドロキシカルボン酸（Ａ）が、２－ヒドロキシ酪酸、２－ヒドロキシ酢酸、２－ヒドロキシプロピオン酸、２－ヒドロキシペンタン酸、２－ヒドロキシヘキサン酸及び中鎖２－ヒドロキシアルカン酸からなる群から選択される少なくとも１のヒドロキシカルボン酸であり、
    　ヒドロキシカルボン酸（Ｂ）が、３－ヒドロキシ酪酸、３－ヒドロキシヘキサン酸、３－ヒドロキシプロピオン酸、３－ヒドロキシペンタン酸、中鎖３－ヒドロキアルカン酸、４－ヒドロキシ－２－メチル酪酸、４－ヒドロキシ酪酸、２，４－ジヒドロキシ酪酸、５－ヒドロキシペンタン酸及び６－ヒドロキシへキサン酸からなる群から選択される少なくとも１のヒドロキシカルボン酸である、請求項１に記載の共重合体。
  3. 　ヒドロキシカルボン酸（Ａ）が２－ヒドロキシ酪酸であり、ヒドロキシカルボン酸（Ｂ）が３－ヒドロキシ酪酸及び３－ヒドロキシヘキサン酸であり、かつ、
    　２－ヒドロキシ酪酸からなるホモ重合セグメントと、３－ヒドロキシ酪酸及び３－ヒドロキシヘキサン酸を含む共重合セグメントとを有する、請求項１に記載の共重合体。
  4. 　ヒドロキシカルボン酸（Ａ）が２－ヒドロキシ酢酸であり、ヒドロキシカルボン酸（Ｂ）が３－ヒドロキシ酪酸であり、かつ
    　３－ヒドロキシ酪酸からなるホモ重合セグメントと、２－ヒドロキシ酢酸及び３－ヒドロキシ酪酸を含む共重合セグメントとを有する、請求項１に記載の共重合体。
  5. 　ヒドロキシカルボン酸（Ａ）が２－ヒドロキシ酢酸であり、ヒドロキシカルボン酸（Ｂ）が３－ヒドロキシ酪酸及び３－ヒドロキシヘキサン酸であり、かつ、
    　３－ヒドロキシ酪酸からなるホモ重合セグメントと、２－ヒドロキシ酢酸、３－ヒドロキシ酪酸及び３－ヒドロキシヘキサン酸を含む共重合セグメントとを有する、請求項１に記載の共重合体。
  6. 　請求項１～５のうちのいずれかに記載の共重合体の製造方法であって、
    　ＣｏＡ転移酵素及び重合酵素を発現する微生物を、ヒドロキシカルボン酸（Ａ）及び／又はその代謝前駆体とヒドロキシカルボン酸（Ｂ）及び／又はその代謝前駆体とを含む培地にて培養する工程と、
    　前記工程にて得られた培養物から、前記共重合体を回収する工程とを含む、方法。
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007049716A1 (ja) 2005-10-27 2007-05-03 Kaneka Corporation 新規プラスミドベクター及びプラスミドを安定に保持する形質転換体

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5256762A (en) * 1992-07-14 1993-10-26 United States Surgical Corporation Polyesters having predetermined monomeric sequence
US6323010B1 (en) * 1998-05-22 2001-11-27 Metabolix, Inc. Polyhydroxyalkanoate biopolymer compositions
JP5577764B2 (ja) * 2009-07-06 2014-08-27 株式会社リコー 共重合樹脂組成物、成形品、及び共重合樹脂組成物の製造方法
US20160068803A1 (en) * 2014-09-09 2016-03-10 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Production of tailored PHA copolymers with methane and added co-substrates

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007049716A1 (ja) 2005-10-27 2007-05-03 Kaneka Corporation 新規プラスミドベクター及びプラスミドを安定に保持する形質転換体

Non-Patent Citations (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A. E. HOFMEISTER ET AL., EUR. J. BIOCHEM., vol. 206, pages 547 - 552
ALTSCHUL ET AL., J. MOL. BIOL., vol. 215, 1990, pages 403 - 410
ALTSCHUL ET AL., NUCLEIC ACIDS RES., vol. 25, 1997, pages 3389 - 3402
ARAI, S. ET AL.: "Biosynthesis of Random-Homo Block Copolymer Poly [Glycolate-ran-3- Hydroxybutyrate (3HB)]-b-Poly(3HB) Using Sequence- Regulating Chimeric Polyhydroxyalkanoate Synthase in Escherichia coli", FRONTIERS IN BIOENGINEERING AND BIOTECHNOLOGY, vol. 8, no. 612991, 8 December 2020 (2020-12-08), pages 1 - 10, XP055850473 *
JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY, vol. 152, 2011, pages 144 - 146
KARLINALTSCHUL, PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 90, 1993, pages 5873 - 5877
LETTERS IN APPLIED MICROBIOLOGY, vol. 25, 1997, pages 371 - 374
MATSUMOTO ET AL., APPL. MICROBIOL. BIOTECHNOL, vol. 97, 2013, pages 8011
MATSUMOTO K ET AL., BIOMACROMOLECULES, vol. 19, no. 2, 2018, pages 662
MATSUMOTO K. ET AL., ACS BIOMATERIALS SCIENCE & ENGINEERING, vol. 3, no. 12, 2017, pages 3058
MATSUMOTO K. ET AL., BIOMACROMOLECULES, vol. 10, no. 4, 13 April 2009 (2009-04-13), pages 682 - 685
MATSUMOTO KEN’ICHIRO, HORI CHIAKI, FUJII RYUNOSUKE, TAKAYA MASAHIRO, OOBA TAKASHI, OOI TOSHIHIKO, ISONO TAKUYA, SATOH TOSHIFUMI, T: "Dynamic Changes of Intracellular Monomer Levels Regulate Block Sequence of Polyhydroxyalkanoates in Engineered Escherichia coli", BIOMACROMOLECULES, vol. 19, no. 2, 12 February 2018 (2018-02-12), US, pages 662 - 671, XP055850465, ISSN: 1525-7797, DOI: 10.1021/acs.biomac.7b01768 *
MATSUMOTO, KENICHIRO: "Development on Biosynthesis of sequence-regulated polyesters", BAIOSAIENSU TO INDASUTORI - BIOSCIENCE TO INDUSTRY, vol. 77, no. 3, 10 May 2019 (2019-05-10), JP, pages 252 - 253, XP009530593, ISSN: 0914-8981 *
MENG DE-CHUAN, CHEN GUO-QIANG: "Synthetic Biology of Polyhydroxyalkanoates (PHA", ADVANCES IN BIOCHEMICAL ENGINEERING/BIOTECHNOLOGY, vol. 162, 2018, DE, pages 147 - 174, XP009530595, ISSN: 0724-6145, DOI: 10.1007/10_2017_3 *
PNAS, vol. 105, no. 45, 11 November 2008 (2008-11-11), pages 17323 - 17327
PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 87, 1990, pages 2264 - 2268
QUANDT, J.HYNES, M. P., GENE, vol. 17, 1993, pages 15 - 21
SAIKI, R. K. ET AL., SCIENCE, vol. 230, 1985, pages 1350 - 1354
SAIKI, R.K. ET AL., SCIENCE, vol. 239, 1988, pages 487 - 491
SCHAFER ET AL., GENE, vol. 145, 1994, pages 69 - 73
See also references of EP4116428A4
SOUTHERN, E. M, MOL. BIOL., vol. 98, 1975, pages 503
SUDO M. ET AL., J BIOSCI BIOENG, vol. 30785-6, no. 19, 18 October 2019 (2019-10-18), pages 1389 - 1723
SUN, J. ET AL.: "Production of P(3- hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate-co-3- hydroxyoctanoate) terpolymers using a chimeric PHA synthase in recombinant Ralstonia eutropha and Pseudomonas putida", BIOSCIENCE, BIOTECHNOLOGY, AND BIOCHEMISTRY, vol. 74, no. 8, 7 August 2010 (2010-08-07), pages 1716 - 1718, XP055358664, DOI: 10.1271/bbb.100242 *
TAGUCHI,S ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. U.S A., vol. 105, no. 45, 2008, pages 17323 - 17327
WANG ET AL., APPL ENVIRON MICROBIOL., vol. 78, no. 2, January 2012 (2012-01-01), pages 519 - 527
ZHANG ET AL., MICROBIAL CELL FACTORIES, vol. 18, no. 147, 2019

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