WO2021187601A1

WO2021187601A1 - 心筋細胞の精製方法

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Publication number: WO2021187601A1
Application number: PCT/JP2021/011231
Authority: WO
Inventors: 善紀吉田; 幸造渡邉; 礼田中
Original assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd; Kyoto University NUC
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd; Kyoto University NUC
Priority date: 2020-03-19
Filing date: 2021-03-18
Publication date: 2021-09-23
Anticipated expiration: 2022-09-19
Also published as: BR112022018640A2; AU2021239654A1; JPWO2021187601A1; US20230136878A1; EP4123015A1; CN115885035A; JP7758347B2; TW202200783A; CA3175573A1; JP2026004460A; TWI888509B; AU2025202903A1; EP4123015A4; IL296317A; KR102949854B1; KR20220149592A

Abstract

本発明は、心筋細胞を含む細胞集団を製造する方法であって、（１）多能性幹細胞を心筋細胞分化用培地中で培養して得られた、心筋細胞または心筋前駆細胞とその他の細胞とを含む細胞集団に、受容体型チロシンキナーゼ阻害剤（但し、ＥＧＦ受容体阻害剤を除く。）を接触させる工程、および（２）該細胞集団を培養する工程、を含む、方法を提供する。

Description

心筋細胞の精製方法

　本発明は、心筋細胞の製造方法および精製方法に関し、より詳細には、受容体型チロシンキナーゼ阻害剤を用いた心筋細胞の製造方法および精製方法に関する。

（発明の背景）
　近年、心筋梗塞の発生率は減少してきてはいるものの、心筋梗塞を含む心疾患は世界中で依然として主な死亡原因である。重症心不全患者においては、心臓移植が現在唯一の治療法であるが、心臓移植はドナー不足という問題を抱えている。そこで、心筋細胞を用いた細胞治療が、心疾患を改善させる治療法として注目されてきている。また、心筋細胞を用いたインビトロでの薬効評価試験、あるいは薬剤安全性試験の確立にも着目されている。そのため、細胞治療やインビトロでの試験に用いることのできる均一な心筋細胞の安定的な供給が求められている。

　均一な心筋細胞を安定的に提供する方法の１つとして、幹細胞または心筋前駆細胞から、心筋細胞を分化誘導する方法が挙げられ、効率的な心筋細胞への分化誘導法を確立するために、様々な努力がなされている。かかる分化誘導法として、ＥＧＦＲ阻害剤を含む培地中で多能性幹細胞を培養させることで、多能性幹細胞から心筋細胞への分化誘導を促進する方法（特許文献１）、人工多能性幹細胞を心筋細胞へ分化誘導した後、該心筋細胞とＮｅｕｒｅｇｕｌｉｎ　１のアンタゴニストまたはＥｒｂＢのアンタゴニストとを接触させることで、心筋細胞を成熟させる方法（特許文献２）、筋芽細胞などの未分化前駆細胞と脱アセチル化酵素阻害剤とを接触させることで、該未分化前駆細胞の分化誘導を促進する方法（特許文献３）、心筋前駆細胞などの成体の前駆細胞と、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤とを接触させることで、該前駆細胞の分化誘導を促進する方法（特許文献４）などが報告されている。また、幹細胞からの分化誘導過程を経ない方法についても報告されており、例えば、特許文献５には、線維芽細胞などの体細胞から、ダイレクトリプログラミングにより、心筋前駆細胞または心筋細胞を製造する方法が開示されている。

国際公開第２０１４／１３６５１９号米国公開第２０１０／０１８３５６５号国際公開第２００３／０３３６７８号国際公開第２００９／０７３６１８号国際公開第２０１５／０３８７０４号

　本発明は、上記従来の方法とは異なる手段により、純度が高い心筋細胞を含む細胞集団を製造する方法を提供することを課題とする。また、心筋細胞を含む細胞集団から、高純度で心筋細胞を精製する方法を提供することも課題とする。

　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、未分化細胞から心筋細胞への分化誘導を促進するのではなく、既に心筋細胞が含まれている細胞集団内の、心筋細胞以外の細胞で高発現しているタンパク質を標的とした阻害剤により、該心筋細胞以外の細胞の増殖を抑制する、あるいは心筋細胞以外の細胞の数を減らすことで、該細胞集団中の心筋細胞の割合を増加させること、即ち心筋細胞を精製できるのではないかとの着想を得た。そこで、まず、ｉＰＳ細胞から分化誘導させた心筋細胞を含む細胞集団を用いて、シングルセルＲＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ解析を行い、該細胞集団中の細胞をクラスタリングした。クラスタリングの結果、心筋細胞と、それ以外の細胞において、受容体型チロシンキナーゼの発現に差異が認められることを見出した。そこで、受容体型チロシンキナーゼに対する阻害剤を用いて、細胞集団に占める心筋細胞の割合の変化を検証したところ、受容体型チロシンキナーゼ阻害剤により、首尾よく心筋細胞を純化できることを見出した。本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成させるに至った。

　すなわち、本発明は以下を提供する。
［１］心筋細胞を含む細胞集団を製造する方法であって、
　（１）多能性幹細胞を心筋細胞分化用培地中で培養して得られた、心筋細胞または心筋前駆細胞とその他の細胞とを含む細胞集団に、受容体型チロシンキナーゼ阻害剤（但し、ＥＧＦ受容体阻害剤を除く。）を接触させる工程、および
　（２）該細胞集団を培養する工程、
を含む、方法。
［２］前記工程（１）の細胞集団と受容体型チロシンキナーゼ阻害剤との接触が、多能性幹細胞の分化誘導開始から４日目以降に行われる、［１］に記載の方法。
［３］前記工程（１）の細胞集団と受容体型チロシンキナーゼ阻害剤との接触が１日以上行われる、［１］または［２］に記載の方法。
［４］前記阻害剤が、ＶＥＧＦ受容体、ＰＤＧＦ受容体、ＨＧＦ受容体およびＦＧＦ受容体からなる群から選択される少なくとも１つの受容体型チロシンキナーゼに対する阻害剤である、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］前記阻害剤が、Ｎ－［５－（｛２－［（シクロプロパンカルボニル）アミノ］イミダゾ［１，２－ｂ］ピリダジン－６－イル｝オキシ）－２－メチルフェニル］－１，３－ジメチル－１Ｈ－ピラゾール－５－カルボキサミド、Ｎ－｛４－［（６，７－ジメトキシキノリン－４－イル）オキシ］－３－フルオロフェニル｝－Ｎ’－（４－フルオロフェニル）シクロプロパン－１，１－ジカルボキサミド、ＡＭＧ３３７、ＡＳＰ５８７８、ＢＧＪ３９８、Ｆｏｒｅｔｉｎｉｂ、ＺＭ３２３８８１、ＣＰ－６７３４５１、ＣｒｅｎｏｌａｎｉｂおよびＣｒｉｚｏｔｉｎｉｂからなる群から選択される少なくとも１種である、［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
［６］前記多能性幹細胞が人工多能性幹細胞である、［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［７］［１］～［６］のいずれかに記載の方法により得られた、心筋細胞を含む細胞集団。
［８］［７］に記載の細胞集団を含有してなる、細胞移植療法剤。
［９］心筋細胞を精製する方法であって、
　（１）多能性幹細胞を心筋細胞分化用培地中で培養して得られた、心筋細胞または心筋前駆細胞とその他の細胞とを含む細胞集団に、受容体型チロシンキナーゼ阻害剤を接触させる工程、および
　（２）該細胞集団を培養する工程、
を含む、方法。

　本発明によれば、心筋細胞を高純度で含む細胞集団が提供される。かかる細胞集団は、心疾患に対する細胞移植療法に好適に用いることができる。また、心筋細胞および心筋前駆細胞を含む細胞集団から、高純度で心筋細胞を精製する方法も提供される。

図１は、ｉＰＳ細胞から分化誘導した心筋細胞のシングルセルＲＮＡシークエンシングデータによるクラスタリングのｔ－ＳＮＥプロットと各クラスタのｓａｒｃｏｍｅｒｉｃ－α－ａｃｔｉｎｉｎとｃＴｎＴ（Ｃａｒｄｉａｃ　Ｔｒｏｐｏｎｉｎ　Ｔ）の発現量を示す。上のパネルの丸で囲った部分は非心筋細胞集団を示す。中央と下のパネルの縦軸は遺伝子発現量を横軸のｉｄｅｎｔｉｔｙのラベルは図１のクラスタの番号を示す。一つ一つのドットは個々の細胞を示し、枠で囲った部分は非心筋細胞クラスタを示す。図２－１は、シングルＲＮＡシークエンシングデータによるｉＰＳ細胞由来心筋細胞のクラスタリング結果のｔ－ＳＮＥプロットと各細胞のＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２遺伝子の発現を示す。遺伝子発現を示すパネルの濃い灰色のドットは高い発現量を薄い灰色は低い発現量を示す細胞を表す。発現の高い細胞集団は丸で囲み、集団名を図中に示す（ＣＭ：心筋細胞（以下ＣＭ）、ＳＭＣ：平滑筋様細胞（以下ＳＭＣ）、ＥＮＤ：内胚葉系譜細胞（以下ＥＮＤ）、ＥＣ：内皮様細胞）。図２－２は、シングルＲＮＡシークエンシングデータによるｉＰＳ細胞由来心筋細胞のクラスタリング結果のｔ－ＳＮＥプロットと各細胞のＶＥＧＦＲ３、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ遺伝子の発現を示す。遺伝子発現を示すパネルの濃い灰色のドットは高い発現量を薄い灰色は低い発現量を示す細胞を表す。発現の高い細胞集団は丸で囲み、集団名を図中に示す（ＳＭＣ：平滑筋様細胞（以下ＳＭＣ）、ＥＣ：内皮様細胞）。図２－３は、シングルＲＮＡシークエンシングデータによるｉＰＳ細胞由来心筋細胞のクラスタリング結果のｔ－ＳＮＥプロットと各細胞のＦＧＦＲ４、ＨＧＦＲ（ｃ－Ｍｅｔ）、ＥＧＦＲ１遺伝子の発現を示す。遺伝子発現を示すパネルの濃い灰色のドットは高い発現量を薄い灰色は低い発現量を示す細胞を表す。発現の高い細胞集団は丸で囲み、集団名を図中に示す（ＥＮＤ：内胚葉系譜細胞（以下ＥＮＤ））。図２－４は、シングルＲＮＡシークエンシングデータによるｉＰＳ細胞由来心筋細胞のクラスタリング結果のｔ－ＳＮＥプロットと各細胞のＥＧＦＲ３遺伝子の発現を示す。遺伝子発現を示すパネルの濃い灰色のドットは高い発現量を薄い灰色は低い発現量を示す細胞を表す。発現の高い細胞集団は丸で囲み、集団名を図中に示す（ＥＮＤ：内胚葉系譜細胞（以下ＥＮＤ））。図３は、ｉＰＳ細胞由来心筋細胞のＣＤ３２６、ＣＤ３１、ＣＤ４９ａ発現による細胞集団の分離結果を示す。フローサイトメトリーにより、心筋細胞率（ＴＮＮＩ１陽性率）８９．６％（左端のパネル）のＴＮＮＩ１レポーターｉＰＳ細胞由来心筋細胞を、ＣＤ３２６陽性細胞細胞（ＥＮＤ、中央左のパネルの枠で囲んだ細胞）、ＣＤ３２６陰性ＣＤ３１陽性細胞（ＥＣ、中央右のパネルの枠で囲んだ細胞）、ＣＤ３２６陰性ＣＤ３１陰性ＣＤ４９ａ陽性細胞（ＳＭＣ、中央右のパネルの枠で囲んだ細胞）、ＣＤ３２６陰性ＣＤ３１陰性ＣＤ４９ａ陰性細胞細胞（Ｔｒｉｐｌｅ　Ｎｅｇａｔｉｖｅ：ＴＮ、中央右のパネルの左下に位置する細胞）に分離した。ＴＮの９９％以上が心筋マーカーＴＮＮＩ１陽性の細胞（心筋細胞）であった（右端のパネル）。ＥＣとＳＭＣのパーセント表示についてはパネル内の細胞ではなく、ＣＤ３２６陰性細胞も含めた数値を示す。図４は、化合物処理後の心筋細胞率を示す。＊：細胞数が少なかったため測定不実施。縦軸は実験番号を示し、横軸がＡｃｔｉｎｉｎ陽性細胞率（心筋細胞率）を示す。図５は、化合物処理後の非心筋細胞率を示す（ＥＮＤ：内胚葉系譜細胞、ＳＭＣ：平滑筋様細胞、ＥＣ：内皮様細胞）。縦軸は実験番号を示し、横軸が非心筋細胞率を示す。図６は、化合物処理後の心筋細胞率の平均値（標準偏差）（ｎ＝４）を示す。縦軸は実験番号を示し、横軸が心筋細胞率を示す。図７は、化合物処理後の非心筋細胞率を示す（ＥＮＤ：内胚葉系譜細胞、ＳＭＣ：平滑筋様細胞、ＥＣ：内皮様細胞）。縦軸は実験番号を示し、横軸が非心筋細胞率を示す。図８は、化合物処理後の心筋細胞率の平均値（標準偏差）（ｎ＝３）を示す。縦軸は実験番号を示し、横軸が心筋細胞率を示す。図９は、化合物未処理の場合の回収細胞数を１とした場合の、化合物処理後の回収細胞数の相対比の平均値（標準偏差）（ｎ＝３）を示す。縦軸は実験番号を示し、横軸が回収細胞数の相対比を示す。図１０は、化合物処理後の心筋細胞率の平均値（標準偏差）（ｎ＝４）を示す。縦軸は実験番号を示し、横軸が心筋細胞数率を示す。図１１は、化合物未処理の場合の回収細胞数を１とした場合の、化合物処理後の回収細胞数の相対比の平均値（標準偏差）（ｎ＝４）を示す。縦軸は実験番号を示し、横軸が回収細胞数の相対比を示す。図１２は、化合物処理後の心筋細胞率の平均値（標準偏差）（ｎ＝４）を示す。縦軸は実験番号を示し、横軸が心筋細胞率を示す。図１３は、化合物処理後の非心筋細胞率の平均値（標準偏差）（ｎ＝４）を示す（ＥＮＤ：内胚葉系譜細胞、ＳＭＣ：平滑筋様細胞、ＥＣ：内皮様細胞）。縦軸は実験番号を示し、横軸が非心筋細胞率を示す。図１４は、化合物未処理の場合の回収細胞数を１とした場合の、化合物処理後の回収細胞数の相対比の平均値（標準偏差）（ｎ＝４）を示す。縦軸は実験番号を示し、横軸が回収細胞数の相対比を示す。図１５は、化合物処理後の心筋細胞率（実験番号１はｎ＝２の平均値、他はｎ＝１）を示す。縦軸は実験番号を示し、横軸が心筋細胞率を示す。図１６は、化合物処理後の非心筋細胞率（ＥＮＤ：内胚葉系譜細胞、ＳＭＣ：平滑筋様細胞、ＥＣ：内皮様細胞）を示す。縦軸は実験番号を示し、横軸が非心筋細胞率を示す。＊：細胞数が少なかったため測定不実施。図１７は、化合物処理後の心筋細胞率（実験番号１はｎ＝４、実験番号２、３はｎ＝３の平均値（標準偏差）、実験番号４、５はｎ＝１）を示す。縦軸は実験番号を示し、横軸が心筋細胞数率を示す。図１８は、化合物処理後の非心筋細胞率（実験番号１はｎ＝４、実験番号２はｎ＝３の平均値（標準偏差）、実験番号３はｎ＝２の平均値、実験番号４、５はｎ＝１）を示す（ＥＮＤ：内胚葉系譜細胞、ＳＭＣ：平滑筋様細胞、ＥＣ：内皮様細胞）。縦軸は実験番号を示し、横軸が非心筋細胞率を示す。図１９は、化合物処理後の心筋細胞率の平均値（標準偏差）（ｎ＝４、実験番号２はｎ＝３）を示す。縦軸は実験番号を示し、横軸が心筋細胞率を示す。図２０は、化合物処理後の非心筋細胞率の平均値（標準偏差）（ｎ＝４）を示す（ＥＮＤ：内胚葉系譜細胞、ＳＭＣ：平滑筋様細胞、ＥＣ：内皮様細胞）。縦軸は実験番号を示し、横軸が非心筋細胞率を示す。図２１は、化合物未処理の場合の回収細胞数を１とした場合の、化合物処理後の回収細胞数の相対比の平均値（標準偏差）（ｎ＝４）を示す。縦軸は実験番号を示し、横軸が回収細胞数の相対比を示す。

（発明の詳細な説明）
１．心筋細胞を含む細胞集団の製造方法
　本発明は、心筋細胞を含む細胞集団を製造する方法（以下、「本発明の製法」ともいう）を提供する。本発明の製法は、（１）心筋細胞または心筋前駆細胞とその他の細胞とを含む細胞集団に、受容体型チロシンキナーゼ阻害剤を接触させる工程、および（２）該細胞集団を培養する工程、を含む。本発明の製法において、上記（１）における「受容体型チロシンキナーゼ阻害剤」からは、ＥＧＦ受容体阻害剤は除かれる。

　本明細書において、「心筋細胞」とは、サルコメアα－アクチニン（Ｓａｒｃｏｍｅｒｉｃ　α－ａｃｔｉｎｉｎ）、心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）、トロポニンＩタイプ１（ＴＮＮＩ１）の内の少なくとも１つが陽性の細胞を意味し、好ましくは、サルコメアα－アクチニン陽性細胞である。また、典型的には、自己拍動能を有する心筋の細胞である。また、「心筋前駆細胞」とは、前記心筋細胞の前駆細胞であって、Ｎｋｘ２．５、ＧＡＴＡ４、ＭＥＦ２ＣおよびＭＥＳＰ１の内の少なくとも１つが陽性の細胞を意味する。上記「その他の細胞」とは、心筋細胞および心筋前駆細胞のどちらにも該当しない細胞（以下、「非心筋細胞」ともいう。）を意味し、具体的な細胞としては、例えば、平滑筋細胞、内皮細胞、幹細胞（例：多能性幹細胞）などが挙げられる。

　本明細書において、「陽性」とは、タンパク質または遺伝子が当該分野で公知の少なくともいずれかの手法による検出可能量で発現していることを意味する。タンパク質の検出は、抗体を用いた免疫学的アッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡ、免疫染色、フローサイトメトリーを利用して行うことができる。また、細胞内に発現し、細胞表面には現れないタンパク質（例えば転写因子またはそのサブユニットなど）の場合は、当該タンパク質とともにレポータータンパク質を発現させ、当該レポータータンパク質を検出することによって対象とするタンパク質を検出できる。遺伝子の検出は、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ、バイオチップ（例：マイクロアレイ）、ＲＮＡｓｅｑ等の核酸増幅方法および／または核酸検出方法を利用して行うことができる。タンパク質又は遺伝子の発現は、一般的な手法で判断することができ、例えばフローサイトメトリーを利用する場合には、タンパク質の発現が陰性の対照群での発現量と比較して、相対的に発現量が高い場合に、タンパク質が検出可能で発現していると判断できる。

　本明細書において、「陰性」とは、タンパク質または遺伝子の発現量が、上記のような公知手法の全てあるいはいずれかによる検出下限値未満であることを意味する。タンパク質または遺伝子の発現の検出下限値は、各手法により異なり得るが、一般的な手法で判断できる。

　本明細書において、「細胞集団」とは、同じ種類または異なる種類の２以上の細胞からなる集団を意味する。「細胞集団」は、同じ種類または異なる種類の細胞の一塊（ｍａｓｓ）をも意味する。前記工程（１）で用いる心筋細胞または心筋前駆細胞と非心筋細胞とを含む細胞集団は、多能性幹細胞を心筋細胞分化用培地中で培養することにより製造することができる。従って、本発明の製法は、前記工程（１）の前に、工程（０）多能性幹細胞から心筋細胞または心筋前駆細胞を分化誘導する工程、を含んでいてもよい。

　本発明に用いる多能性幹細胞としては、例えば、人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ：ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ：ＥＳ細胞）、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹細胞（ｎｕｃｌｅａｒ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ：ｎｔＥＳ細胞）、多能性生殖幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ　ｇｅｒｍｌｉｎｅ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ：ｍＧＳ細胞）、胚性生殖幹細胞（ＥＧ細胞）、Ｍｕｓｅ細胞（ｍｕｌｔｉ－ｌｉｎｅａｇｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ　ｓｔｒｅｓｓ　ｅｎｄｕｒｉｎｇ　ｃｅｌｌ）が挙げられるが、好ましくはｉＰＳ細胞（より好ましくはヒトｉＰＳ細胞）である。上記多能性幹細胞がＥＳ細胞またはヒト胚に由来する任意の細胞である場合、その細胞は胚を破壊して作製された細胞であっても、胚を破壊することなく作製された細胞であってもよいが、好ましくは、胚を破壊することなく作製された細胞である。上記多能性幹細胞は哺乳動物（例：マウス、ラット、ハムスター、モルモット、イヌ、サル、オランウータン、チンパンジー、ヒト）由来であることが好ましく、ヒト由来であることがより好ましい。従って、本発明で用いる多能性幹細胞として最も好ましくは、ヒトｉＰＳ細胞である。

　「人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）」とは、哺乳動物体細胞または未分化幹細胞に、特定の因子（核初期化因子）を導入して再プログラミングすることにより得られる細胞を指す。現在、「人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）」にはさまざまなものがあり、山中らにより、マウス線維芽細胞にＯｃｔ３／４・Ｓｏｘ２・Ｋｌｆ４・ｃ－Ｍｙｃの４因子を導入することにより、樹立されたｉＰＳ細胞（Ｔａｋａｈａｓｈｉ　Ｋ，Ｙａｍａｎａｋａ　Ｓ．，Ｃｅｌｌ，（２００６）１２６：６６３－６７６）のほか、同様の４因子をヒト線維芽細胞に導入して樹立されたヒト細胞由来のｉＰＳ細胞（Ｔａｋａｈａｓｈｉ　Ｋ，Ｙａｍａｎａｋａ　Ｓ．，ｅｔ　ａｌ．Ｃｅｌｌ，（２００７）１３１：８６１－８７２．）、上記４因子導入後、Ｎａｎｏｇの発現を指標として選別し、樹立したＮａｎｏｇ－ｉＰＳ細胞（Ｏｋｉｔａ，Ｋ．，Ｉｃｈｉｓａｋａ，Ｔ．，ａｎｄ　Ｙａｍａｎａｋａ，Ｓ．（２００７）．Ｎａｔｕｒｅ　４４８，３１３－３１７．）、ｃ－Ｍｙｃを含まない方法で作製されたｉＰＳ細胞（Ｎａｋａｇａｗａ　Ｍ，Ｙａｍａｎａｋａ　Ｓ．，ｅｔ　ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（２００８）２６，１０１－１０６）、ウイルスフリー法で６因子を導入して樹立されたｉＰＳ細胞（Ｏｋｉｔａ　Ｋ　ｅｔ　ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　２０１１　Ｍａｙ；８（５）：４０９－１２，Ｏｋｉｔａ　Ｋ　ｅｔ　ａｌ．Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ．３１（３）：４５８－６６．）も用いることができる。また、Ｔｈｏｍｓｏｎらにより作製されたＯＣＴ３／４・ＳＯＸ２・ＮＡＮＯＧ・ＬＩＮ２８の４因子を導入して樹立された人工多能性幹細胞（Ｙｕ　Ｊ．，Ｔｈｏｍｓｏｎ　ＪＡ．ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００７）３１８：１９１７－１９２０．）、Ｄａｌｅｙらにより作製された人工多能性幹細胞（Ｐａｒｋ　ＩＨ，Ｄａｌｅｙ　ＧＱ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２００７）４５１：１４１－１４６）、桜田らにより作製された人工多能性幹細胞（特開２００８－３０７００７号）等も用いることができる。
　このほか、公開されているすべての論文（例えば、Ｓｈｉ　Ｙ．，ＤｉｎｇＳ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ，（２００８）Ｖｏｌ３，　Ｉｓｓｕｅ　５，５６８－５７４；、Ｋｉｍ　ＪＢ．，Ｓｃｈｏｌｅｒ　ＨＲ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，（２００８）４５４，６４６－６５０；Ｈｕａｎｇｆｕ　Ｄ．，Ｍｅｌｔｏｎ，ＤＡ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（２００８）２６，Ｎｏ　７，７９５－７９７）、あるいは特許（例えば、特開２００８－３０７００７号、特開２００８－２８３９７２号、ＵＳ２００８－２３３６６１０、ＵＳ２００９－０４７２６３、ＷＯ２００７－０６９６６６、ＷＯ２００８－１１８２２０、ＷＯ２００８－１２４１３３、ＷＯ２００８－１５１０５８、ＷＯ２００９－００６９３０、ＷＯ２００９－００６９９７、ＷＯ２００９－００７８５２）に記載されている当該分野で公知の人工多能性幹細胞のいずれも用いることができる。人工多能性幹細胞株としては、ＮＩＨ、理研、京都大学等が樹立した各種ｉＰＳ細胞株が利用可能である。例えば、ヒトｉＰＳ細胞株であれば、理研のＨｉＰＳ－ＲＩＫＥＮ－１Ａ株、ＨｉＰＳ－ＲＩＫＥＮ－２Ａ株、ＨｉＰＳ－ＲＩＫＥＮ－１２Ａ株、Ｎｉｐｓ－Ｂ２株、京都大学の２５３Ｇ１株、２０１Ｂ７株、４０９Ｂ２株、４５４Ｅ２株、６０６Ａ１株、６１０Ｂ１株、６４８Ａ１株、再生医療用ｉＰＳ細胞ストック等が挙げられる。

　本明細書において、「体細胞」とは、卵子、卵母細胞、ＥＳ細胞などの生殖系列細胞または分化全能性細胞を除くあらゆる動物細胞（好ましくは、ヒトを含む哺乳動物細胞）を意味する。体細胞としては、特に限定されないが、胎児（仔）の体細胞、新生児（仔）の体細胞、および成熟した健全な若しくは疾患性の体細胞のいずれも包含されるし、また、初代培養細胞、継代細胞、および株化細胞のいずれも包含される。具体的には、体細胞は、例えば（１）神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）、（２）組織前駆細胞、（３）リンパ球、上皮細胞、内皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞（皮膚細胞等）、毛細胞、肝細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞（膵外分泌細胞等）、脳細胞、肺細胞、腎細胞および脂肪細胞等の分化した細胞などが例示される。

　ＥＳ細胞は、ヒトやマウスなどの哺乳動物の初期胚（例えば胚盤胞）の内部細胞塊から樹立された、多能性と自己複製による増殖能を有する幹細胞である。ＥＳ細胞は、マウスで１９８１年に発見され（Ｍ．Ｊ．Ｅｖａｎｓ　ａｎｄ　Ｍ．Ｈ．Ｋａｕｆｍａｎ（１９８１），Ｎａｔｕｒｅ　２９２：１５４－１５６）、その後、ヒト、サルなどの霊長類でもＥＳ細胞株が樹立された（Ｊ．Ａ．Ｔｈｏｍｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９９８），Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８２：１１４５－１１４７；Ｊ．Ａ．Ｔｈｏｍｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９９５），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２：７８４４－７８４８；Ｊ．Ａ．　Ｔｈｏｍｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９９６），Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，５５：２５４－２５９；Ｊ．Ａ．Ｔｈｏｍｓｏｎ　ａｎｄ　Ｖ．Ｓ．Ｍａｒｓｈａｌｌ（１９９８），Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，３８：１３３－１６５）。ＥＳ細胞は、対象動物の受精卵の胚盤胞から内部細胞塊を取出し、内部細胞塊を線維芽細胞のフィーダー上で培養することによって樹立することができる。ヒトおよびサルのＥＳ細胞の樹立と維持の方法については、例えば、ＵＳＰ５，８４３，７８０；Ｔｈｏｍｓｏｎ　ＪＡ，ｅｔ　ａｌ．（１９９５），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９２：７８４４－７８４８；Ｔｈｏｍｓｏｎ　ＪＡ，ｅｔ　ａｌ．（１９９８），Ｓｃｉｅｎｃｅ．２８２：１１４５－１１４７；Ｓｕｅｍｏｒｉ　Ｈ．ｅｔ　ａｌ．（２００６），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３４５：９２６－９３２；Ｕｅｎｏ　Ｍ．ｅｔ　ａｌ．（２００６），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：９５５４－９５５９；Ｓｕｅｍｏｒｉ　Ｈ．ｅｔ　ａｌ．（２００１），Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．，２２２：２７３－２７９；Ｋａｗａｓａｋｉ　Ｈ．ｅｔ　ａｌ．（２００２），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：１５８０－１５８５；Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ　Ｉ．ｅｔ　ａｌ．（２００６），Ｎａｔｕｒｅ．４４４：４８１－４８５などに記載されている。或いは、ＥＳ細胞は、胚盤胞期以前の卵割期の胚の単一割球のみを用いて樹立することもできるし（Ｃｈｕｎｇ　Ｙ．ｅｔ　ａｌ．（２００８），Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　２：１１３－１１７）、発生停止した胚を用いて樹立することもできる（Ｚｈａｎｇ　Ｘ．ｅｔ　ａｌ．（２００６），Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ　２４：２６６９－２６７６．）。「ＥＳ細胞」としては、マウスＥＳ細胞であれば、ｉｎＧｅｎｉｏｕｓ　ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社、理研（理化学研究所）等が樹立した各種マウスＥＳ細胞株が利用可能であり、ヒトＥＳ細胞であれば、ウィスコンシン大学、ＮＩＨ、理研、京都大学、国立成育医療研究センターおよびＣｅｌｌａｒｔｉｓ社などが樹立した各種ヒトＥＳ細胞株が利用可能である。たとえば、ヒトＥＳ細胞株としては、ＥＳＩ　Ｂｉｏ社が分譲するＣＨＢ－１～ＣＨＢ－１２株、ＲＵＥＳ１株、ＲＵＥＳ２株、ＨＵＥＳ１～ＨＵＥＳ２８株等、ＷｉＣｅｌｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈが分譲するＨ１株、Ｈ９株等、理研が分譲するＫｈＥＳ－１株、ＫｈＥＳ－２株、ＫｈＥＳ－３株、ＫｈＥＳ－４株、ＫｈＥＳ－５株、ＳＳＥＳ１株、ＳＳＥＳ２株、ＳＳＥＳ３株等を利用することができる。

　ｎｔ　ＥＳ細胞（ｎｕｃｌｅａｒ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ＥＳ細胞）は、核移植技術によって作製されたクローン胚由来のＥＳ細胞であり、受精卵由来のＥＳ細胞とほぼ同じ特性を有している（Ｗａｋａｙａｍａ　Ｔ．ｅｔ　ａｌ．（２００１），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９２：７４０－７４３；Ｓ．Ｗａｋａｙａｍａ　ｅｔ　ａｌ．（２００５），Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，７２：９３２－９３６；Ｂｙｒｎｅ　Ｊ．ｅｔ　ａｌ．（２００７），Ｎａｔｕｒｅ，４５０：４９７－５０２）。すなわち、未受精卵の核を体細胞の核と置換することによって得られたクローン胚由来の胚盤胞の内部細胞塊から樹立されたＥＳ細胞がｎｔ　ＥＳ（ｎｕｃｌｅａｒ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ＥＳ）細胞である。ｎｔ　ＥＳ細胞の作製のためには、核移植技術（Ｃｉｂｅｌｌｉ　Ｊ．Ｂ．ｅｔ　ａｌ．（１９９８），Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６：６４２－６４６）とＥＳ細胞作製技術（上記）との組み合わせが利用される（若山清香ら（２００８），実験医学，２６巻，５号（増刊），４７～５２頁）。核移植においては、哺乳動物の除核した未受精卵に、体細胞の核を注入し、数時間培養することで初期化することができる。

　ｍＧＳ細胞は、精巣由来の多能性幹細胞であり、精子形成のための起源となる細胞である。この細胞は、ＥＳ細胞と同様に、種々の系列の細胞に分化誘導可能であり、例えばマウス胚盤胞に移植するとキメラマウスを作出できるなどの性質をもつ（Ｋａｎａｔｓｕ－Ｓｈｉｎｏｈａｒａ　Ｍ．ｅｔ　ａｌ．（２００３）Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，６９：６１２－６１６；Ｓｈｉｎｏｈａｒａ　Ｋ．ｅｔ　ａｌ．（２００４），Ｃｅｌｌ，１１９：１００１－１０１２）。神経膠細胞系由来神経栄養因子（ｇｌｉａｌ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ　ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ　ｆａｃｔｏｒ（ＧＤＮＦ））を含む培養液で自己複製可能であるし、またＥＳ細胞と同様の培養条件下で継代を繰り返すことによって、生殖幹細胞を得ることができる（竹林正則ら（２００８），実験医学，２６巻，５号（増刊），４１～４６頁，羊土社（東京、日本））。

　ＥＧ細胞は、胎生期の始原生殖細胞から樹立される、ＥＳ細胞と同様な多能性をもつ細胞である。ＬＩＦ、ｂＦＧＦ、幹細胞因子（ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｆａｃｔｏｒ）などの物質の存在下で始原生殖細胞を培養することによって樹立し得る（Ｍａｔｓｕｉ　Ｙ．ｅｔ　ａｌ．（１９９２），Ｃｅｌｌ，７０：８４１－８４７；Ｊ．Ｌ．Ｒｅｓｎｉｃｋ　ｅｔ　ａｌ．（１９９２），Ｎａｔｕｒｅ，３５９：５５０－５５１）。

　Ｍｕｓｅ細胞は、生体に内在する非腫瘍性の多能性幹細胞であり、例えば、ＷＯ　２０１１／００７９００に記載された方法にて製造することができる。詳細には、線維芽細胞または骨髄間質細胞を長時間トリプシン処理、好ましくは８時間または１６時間トリプシン処理した後、浮遊培養することで得られる多能性を有した細胞がＭｕｓｅ細胞であり、ＳＳＥＡ－３およびＣＤ１０５が陽性である。

　前記工程（０）は、多能性幹細胞を心筋細胞または心筋前駆細胞へと分化誘導できる限り特に制限されないが、例えば、多能性幹細胞を、心筋細胞分化用培地中で培養することで、心筋細胞または心筋前駆細胞へと分化誘導することができる。本発明の一態様において、前記工程（０）は、（０－１）多能性幹細胞を中胚葉系細胞へと分化誘導する工程、および（０－２）該中胚葉系細胞を心筋細胞または心筋前駆細胞へと分化誘導する工程を含み得る。本明細書において、「心筋細胞分化用培地」とは、サイトカインなどの心筋細胞への分化誘導を促進する因子（以下、「心筋細胞分化誘導因子」と称することがある。）および基礎培地を含む培地を意味する。上記心筋細胞分化誘導促進因子には、多能性幹細胞から心筋細胞または心筋前駆細胞への分化誘導過程における中間細胞（例えば、中胚葉系細胞など）への分化誘導に必要な因子も包含されるものとする。

　本発明で用いる基礎培地としては、例えば、ＳｔｅｍＦｉｔ（例：ＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０３Ｎ、ＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０２Ｎ）（味の素社）、ＳｔｅｍＰｒｏ－３４（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、ＰＥＣＭ（Ｐｒｉｍａｔｅ　ＥＳ　Ｃｅｌｌ　Ｍｅｄｉｕｍ）、ＧＭＥＭ（グラスゴー最小必須培地：Ｇｌａｓｇｏｗ　Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ）、ＩＭＤＭ（イスコフ改変ダルベッコ培地：Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ）、１９９培地、イーグル最小必須培地（Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ）（ＥＭＥＭ）、αＭＥＭ、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ）（ＤＭＥＭ）、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ　１６４０培地、フィッシャー培地（Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ　ｍｅｄｉｕｍ）、およびこれらの混合培地などが包含される。

　基礎培地には、ＲＯＣＫ阻害剤（例：Ｙ－２７６３２、Ｆａｓｕｄｉｌ／ＨＡ１０７７、ＳＲ３６７７、ＧＳＫ２６９９６２、Ｈ－１１５２、Ｗｆ－５３６等）、血清（例：ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ヒト血清、ウマ血清等）若しくは血清代替物、インスリン、各種ビタミン（例：ビタミンＣ類（例：アスコルビン酸））、Ｌ－グルタミン、非必須アミノ酸等の各種アミノ酸、２－メルカプトエタノール、チオグリセロール（例：α－モノチオグリセロール（ＭＴＧ））、各種サイトカイン、幹細胞因子（ＳＣＦ（Ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｆａｃｔｏｒ））、アクチビンなど）、各種ホルモン、各種増殖因子（白血病抑制因子（ＬＩＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、ＴＧＦ－β等）、各種細胞外マトリックス、各種細胞接着分子、ペニシリン／ストレプトマイシン、ピューロマイシン等の抗生物質、フェノールレッド等のｐＨ指示薬などを適宜添加することができる。血清代替物として、アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）、ＩＴＳ－サプリメントおよびこれらの混合物などが包含される。

　本発明においてビタミンＣ類とは、Ｌ－アスコルビン酸およびその誘導体を意味し、Ｌ－アスコルビン酸誘導体とは、生体内で酵素反応によりビタミンＣとなるものを意味する。本発明に用いるアスコルビン酸の誘導体として、リン酸ビタミンＣ（例：アスコルビン酸－２リン酸）、アスコルビン酸グルコシド、アスコルビルエチル、ビタミンＣエステル、テトラヘキシルデカン酸アスコビル、ステアリン酸アスコビルおよびアスコルビン酸－２リン酸－６パルミチン酸が例示される。好ましくは、リン酸ビタミンＣ（例：Ａｓｃｏｒｂｉｃ　ａｃｉｄ　２－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）であり、例えば、リン酸－Ｌ－アスコルビン酸Ｎａまたはリン酸－Ｌ－アスコルビン酸Ｍｇなどのリン酸－Ｌ－アスコルビン酸塩が挙げられる。

　人工多能性幹細胞または胚様体の培養は、接着培養または浮遊培養であってもよい。接着培養の場合、細胞外基質成分でコーティングした培養容器を用いて行ってもよく、またフィーダー細胞と共培養してもよい。フィーダー細胞としては、特に限定されないが、例えば、線維芽細胞（マウス胎仔線維芽細胞（ＭＥＦ）、マウス線維芽細胞（ＳＴＯ）など）が挙げられる。フィーダー細胞は自体公知の方法、例えば放射線（ガンマ線など）照射や抗がん剤（マイトマイシンＣなど）処理などで不活化されていることが好ましい。細胞外基質成分としては、マトリゲル（Ｎｉｗａ　Ａ，ｅｔ　ａｌ．ＰＬｏＳ　Ｏｎｅ．６（７）：ｅ２２２６１，２０１１）、ゼラチン、コラーゲン、エラスチンなどの繊維性タンパク質、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸などのグルコサミノグリカンやプロテオグリカン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニンなどの細胞接着性タンパク質などが挙げられる。

　培養温度の条件は、特に制限されないが、例えば、３７℃～４２℃程度、３７℃～３９℃程度が好ましい。また、低酸素条件で培養してもよく、本発明において低酸素条件とは、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％またはそれら以下の酸素濃度が例示される。

　浮遊培養とは、細胞を培養容器へ非接着の状態で培養することであり、特に限定はされないが、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリックス等によるコーティング処理）されていない培養容器、若しくは、人工的に接着を抑制する処理（例えば、ポリヒドロキシエチルメタクリル酸（ｐｏｌｙ－ＨＥＭＡ）または非イオン性の界面活性ポリオール（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ－１２７等）によるコーティング処理）した培養容器を使用して行うことができる。また、例えば、シングルユースバイオリアクター（株式会社バイオット）、シングルユースバイオリアクター（サーモフィッシャー）、シングルユースバイオリアクター（ザルトリウス・ステディウム）、シングルユースバイオリアクター（ＧＥヘルスケアライフサイエンス）などの撹拌翼を備える培養器を用いて、浮遊培養を行ってもよい。用いる培養器の種類および撹拌速度は、培養される細胞の種類に応じて、当業者であれば適宜選択することができる。撹拌速度の例として、例えば、０～１００ｒｐｍ、２０～８０ｒｐｍ、または４５～６５ｒｐｍが挙げられるが、これらに限定されない。

　また、浮遊培養の際には、胚様体（ＥＢ）を形成させて培養することが好ましい。従って、前記工程（０）には、多能性幹細胞から胚様体を形成させる工程を含んでいてもよい。かかる工程においては、コロニーを形成した多能性幹細胞を解離して単細胞にしたのちに胚様体を形成させることが好ましい。多能性幹細胞を解離させる工程においては、互いに接着して集団を形成している細胞を個々の細胞に解離（分離）させる。多能性幹細胞を解離させる方法としては、例えば、力学的に解離する方法、プロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する解離溶液（例えば、Ａｃｃｕｔａｓｅ^ＴＭおよびＡｃｃｕｍａｘ^ＴＭなど）またはコラゲナーゼ活性のみを有する解離溶液を用いた解離方法が挙げられる。好ましくは、プロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する解離溶液（特に好ましくは、Ａｃｃｕｍａｘ^ＴＭ）を用いて多能性幹細胞を解離する方法が用いられる。上記工程で用いる培地は、チオグリセロール、Ｌ－グルタミンおよび／またはアスコルビン酸を含むことが好ましい。

　上記工程（０－１）で用いる心筋細胞分化誘導因子としては、Ｗｎｔシグナル活性化物質、アクチビンＡ、ＢＭＰ４、ｂＦＧＦが挙げられ、これらは単独で用いてもよく、複数を組み合わせて用いてもよい。本発明の一態様において、アクチビンＡ、ＢＭＰ４およびｂＦＧＦの組み合わせが用いられる。また、上記工程（０－１）で用いる培地は、チオグリセロール、Ｌ－グルタミンおよび／またはアスコルビン酸を含むことが好ましい。

　本明細書において、「Ｗｎｔシグナル活性化剤」とは、Ｗｎｔシグナル経路を活性化する物質を意味する。Ｗｎｔシグナル活性化剤としては、例えば、Ｗｎｔタンパク質、ＧＳＫ３β阻害剤（例：ＢＩＯ、ＣＨＩＲ９９０２１等）などが例挙げられる。これらは単独で用いてもよく、複数を組み合わせて用いてもよい。Ｗｎｔシグナル活性化剤を用いる場合に、培地中でのその濃度は特に限定はされない。Ｗｎｔシグナル活性化剤としてＢＩＯまたはＣＨＩＲ９９０２１を使用する場合、培地中での最終濃度１００ｎＭ～１００μＭ、好ましくは１μＭ～１０μＭで使用することが好ましい。

　アクチビンＡを用いる場合に、培地中でのその濃度としては、１ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌが好ましく、１ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ、４ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、６ｎｇ／ｍｌ、７ｎｇ／ｍｌ、８ｎｇ／ｍｌ、９ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１１ｎｇ／ｍｌ、１２ｎｇ／ｍｌ、１３ｎｇ／ｍｌ、１４ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、１６ｎｇ／ｍｌ、１７ｎｇ／ｍｌ、１８ｎｇ／ｍｌ、１９ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌおよび１００ｎｇ／ｍｌが例示される。

　ＢＭＰ４を用いる場合に、培地中でのその濃度としては、１ｎｇ／ｍｌ～１μｇ／ｍｌが好ましく、１ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ、４ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、６ｎｇ／ｍｌ、７ｎｇ／ｍｌ、８ｎｇ／ｍｌ、９ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１１ｎｇ／ｍｌ、１２ｎｇ／ｍｌ、１３ｎｇ／ｍｌ、１４ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、１６ｎｇ／ｍｌ、１７ｎｇ／ｍｌ、１８ｎｇ／ｍｌ、１９ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、６００ｎｇ／ｍｌ、７００ｎｇ／ｍｌ、８００ｎｇ／ｍｌ、９００ｎｇ／ｍｌおよび１μｇ／ｍｌが例示される。

　ｂＦＧＦを用いる場合に、培地中でのその濃度としては、１ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌが好ましく、１ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ、４ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、６ｎｇ／ｍｌ、７ｎｇ／ｍｌ、８ｎｇ／ｍｌ、９ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１１ｎｇ／ｍｌ、１２ｎｇ／ｍｌ、１３ｎｇ／ｍｌ、１４ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、１６ｎｇ／ｍｌ、１７ｎｇ／ｍｌ、１８ｎｇ／ｍｌ、１９ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌおよび１００ｎｇ／ｍｌが例示される。

　上記工程（０－１）の期間としては、中胚葉系細胞が得られる限り特に限定されないが、１２時間以上（例：１日間、２日間またはそれ以上）が好ましく、６日間以下（例：５日間、４日間、３日間またはそれ以下）が挙げられる。また、中胚葉系細胞が得られたか否かをモニタリングしてもよく、この場合には、中胚葉マーカー遺伝子の発現により決定することができる。中胚葉マーカー遺伝子としては、例えば、Ｔ、ＭＩＸＬ１、ＮＯＤＡＬなどが挙げられる。

　上記工程（０－２）で用いる心筋細胞分化誘導因子としては、例えば、Ｗｎｔ阻害剤、ＶＥＧＦが挙げられ、これらは単独で用いてもよく、複数を組み合わせて用いてもよい。また、上記工程（０－２）で用いる培地は、チオグリセロール、Ｌ－グルタミンおよび／またはアスコルビン酸を含むことが好ましい。

　本明細書において、「Ｗｎｔ阻害剤」とは、Ｗｎｔの受容体への結合からβカテニンの蓄積へと続くシグナル伝達を阻害する物質を意味し、受容体であるＦｒｉｚｚｌｅｄファミリーへの結合を阻害する物質であっても、βカテニンの分解を促進する物質であってもよい。Ｗｎｔ阻害剤としては、例えば、ＤＫＫ１タンパク質（例えば、ヒトの場合、ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＮＭ＿０１２２４２）、スクレロスチン（例えば、ヒトの場合、ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＮＭ＿０２５２３７）、ＩＷＲ－１（Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＩＷＰ－２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＩＷＰ－３（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＩＷＰ－４（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＰＮＵ－７４６５４（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＸＡＶ９３９（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）およびこれらの誘導体などが挙げられる。中でも、ＩＷＰ－３またはＩＷＰ－４が好ましい。Ｗｎｔ阻害剤は、１種類のみを用いてもよく、複数種類を組み合わせて用いてもよい。

　Ｗｎｔ阻害剤を用いる場合に、培地中でのその濃度としては、１ｎＭ～５０μＭが好ましく、例えば、１ｎＭ、１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、５００ｎＭ、７５０ｎＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭであるがこれらに限定されない。より好ましくは、１μＭである。

　ＶＥＧＦを用いる場合に、培地中でのその濃度としては、１～１００ｎｇ／ｍｌが好ましく、１ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ、４ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、６ｎｇ／ｍｌ、７ｎｇ／ｍｌ、８ｎｇ／ｍｌ、９ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１１ｎｇ／ｍｌ、１２ｎｇ／ｍｌ、１３ｎｇ／ｍｌ、１４ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、１６ｎｇ／ｍｌ、１７ｎｇ／ｍｌ、１８ｎｇ／ｍｌ、１９ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌおよび１００ｎｇ／ｍｌが例示される。

　上記工程（０－２）では、さらに、心筋細胞分化誘導因子として、ＢＭＰ阻害剤および／またはＴＧＦβ阻害剤を基本培地に添加しても良い。本明細書において、「ＢＭＰ阻害剤」としては、Ｃｈｏｒｄｉｎ、Ｎｏｇｇｉｎ、Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎなどのタンパク質性阻害剤、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ（６－［４－（２－ｐｉｐｅｒｉｄｉｎ－１－ｙｌ－ｅｔｈｏｘｙ）ｐｈｅｎｙｌ］－３－ｐｙｒｉｄｉｎ－４－ｙｌ－ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５－ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）およびその誘導体（Ｐ．Ｂ．Ｙｕ　ｅｔ　ａｌ．（２００７），Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１１６：ＩＩ＿６０；Ｐ．Ｂ．Ｙｕ　ｅｔ　ａｌ．（２００８），Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：３３－４１；Ｊ．　Ｈａｏ　ｅｔ　ａｌ．（２００８），ＰＬｏＳ　ＯＮＥ，３（８）：ｅ２９０４）、ＬＤＮ－１９３１８９（４－（６－（４－（ｐｉｐｅｒａｚｉｎ－１－ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ）ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５－ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－３－ｙｌ）ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ）などが挙げられる。中でも、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎが好ましい。ＢＭＰ阻害剤およびＴＧＦβ阻害剤は、１種類のみを用いてもよく、複数種類を組み合わせて用いてもよい。

　ＢＭＰ阻害剤を用いる場合に、培地中でのその濃度としては、１ｎＭ～５０μＭが好ましく、例えば、１ｎＭ、１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、５００ｎＭ、６００ｎＭ、７００ｎＭ、８００ｎＭ、９００ｎＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭであるがこれらに限定されない。

　本明細書において、ＴＧＦβ阻害剤とは、ＴＧＦβの受容体への結合からＳＭＡＤへと続くシグナル伝達を阻害する物質を意味し、受容体であるＡＬＫファミリーへの結合を阻害する物質であっても、ＡＬＫファミリーによるＳＭＡＤのリン酸化を阻害する物質であってもよい。ＴＧＦβ阻害剤としては、例えば、Ｌｅｆｔｙ－１（ＮＣＢＩ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．として、マウス：ＮＭ＿０１００９４、ヒト：ＮＭ＿０２０９９７が例示される）、ＳＢ４３１５４２、ＳＢ２０２１９０（以上、Ｒ．Ｋ．Ｌｉｎｄｅｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ，２００３，２：２０）、ＳＢ５０５１２４（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ＮＰＣ３０３４５、ＳＤ０９３、ＳＤ９０８、ＳＤ２０８（Ｓｃｉｏｓ）、ＬＹ２１０９７６１、ＬＹ３６４９４７、ＬＹ５８０２７６（Ｌｉｌｌｙ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、Ａ－８３－０１（ＷＯ　２００９１４６４０８）およびこれらの誘導体などが挙げられる。中でも、ＳＢ４３１５４２が好ましい。

　ＴＧＦβ阻害剤を用いる場合に、培地中でのその濃度としては、１ｎＭ～５０μＭが好ましく、例えば、１ｎＭ、１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、５００ｎＭ、７５０ｎＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、５．２μＭ、５．４μＭ、５．６μＭ、５．８μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭであるがこれらに限定されない。

　上記工程（０－２）の期間としては、心筋細胞または心筋前駆細胞が得られる限り特に限定されないが、１日間以上（例：１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間またはそれ以上）が挙げられる。また、長期間培養することにより心筋細胞または心筋前駆細胞の樹立に影響がでないことから、上限は特に設けられないが、典型的には、４０日間以下である。また、心筋細胞または心筋前駆細胞が得られたか否かをモニタリングしてもよく、この場合には、拍動心筋細胞の数、心筋細胞または心筋前駆細胞のマーカーの発現、イオンチャネルの発現、電気生理学的刺激に対する反応等により確認することができる。

　また、前記工程（０）は、さらに、工程（０－３）ＶＥＧＦおよび／またはｂＦＧＦの存在下、または非存在下で、工程（０－２）で得られた心筋細胞または心筋前駆細胞を培養する工程を含んでいてもよい。本工程で用いる培地は、チオグリセロール、Ｌ－グルタミンおよび／またはアスコルビン酸を含むことが好ましい。また、本工程で用いる培地は、心筋成熟化化合物（例：Ｎ－（１，１－ジオキソ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－１－ベンゾチオフェン－５－イル）－２－（４－｛５－［１－オキソ－５－（ピペリジン－１－イル）－１，３－ジヒドロ－２Ｈ－イソインドール－２－イル］－１Ｈ－ベンゾイミダゾール－２－イル｝フェノキシ）アセトアミド）および／またはマルチキナーゼ阻害剤（例：２－（４－｛３－［３－（２－アミノ－２－フェニルエトキシ）－４－シアノフェニル］ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－６－イル｝－１Ｈ－ピラゾール－１－イル）－Ｎ－（２－メトキシエチル）アセトアミド）を含んでいてもよい。

　工程（０－３）でＶＥＧＦを用いる場合、培地中でのその濃度としては、１～１００ｎｇ／ｍｌが好ましく、１ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ、４ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、６ｎｇ／ｍｌ、７ｎｇ／ｍｌ、８ｎｇ／ｍｌ、９ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１１ｎｇ／ｍｌ、１２ｎｇ／ｍｌ、１３ｎｇ／ｍｌ、１４ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、１６ｎｇ／ｍｌ、１７ｎｇ／ｍｌ、１８ｎｇ／ｍｌ、１９ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌおよび１００ｎｇ／ｍｌが例示される。

　工程（０－３）でｂＦＧＦを用いる場合、培地中でのその濃度としては、１～１００ｎｇ／ｍｌが好ましく、１ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ、４ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、６ｎｇ／ｍｌ、７ｎｇ／ｍｌ、８ｎｇ／ｍｌ、９ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１１ｎｇ／ｍｌ、１２ｎｇ／ｍｌ、１３ｎｇ／ｍｌ、１４ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、１６ｎｇ／ｍｌ、１７ｎｇ／ｍｌ、１８ｎｇ／ｍｌ、１９ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌおよび１００ｎｇ／ｍｌが例示される。より好ましくは、５ｎｇ／ｍｌである。

　上記工程（０－３）の期間としては、特に制限されないが、１日間以上（例：１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、またはそれ以上）が挙げられる。また、長期間培養することにより心筋細胞または心筋前駆細胞の樹立に影響がでないことから、上限は特に設けられないが、典型的には６０日以下である。上記工程（０－３）を行うことで、心筋細胞または心筋前駆細胞への分化効率が向上し得る。

　また、上記工程（０－２）または工程（０－３）を行う前に、上述と同様の方法により、胚様体を解離させてもよい。

　上記で具体的に説明した方法はあくまで例示であり、上記方法に限定されるものではない。例えば、マウス由来の支持細胞であるＥＮＤ２細胞と多能性幹細胞を共培養する方法（Ｍｕｍｍｅｒｙ，Ｃ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｔｏ　ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ：ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｃｏｃｕｌｔｕｒｅ　ｗｉｔｈ　ｖｉｓｃｅｒａｌ　ｅｎｄｏｄｅｒｍ－ｌｉｋｅ　ｃｅｌｌｓ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．１０７（２１），２７３３－４０（２００３））、胚様体を、ＢＭＰ４、ＦＧＦ２、インスリンと血清とを用いて培養することで、心筋細胞を誘導する方法（Ｐａｕｌ，Ｗ　Ｂ．，ｅｔ　ａｌ．，Ａ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　Ｈｉｇｈｌｙ　Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　Ｃａｒｄｉａｃ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｉｎｄｕｃｅｄ　Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ　Ｔｈａｔ　Ｅｌｉｍｉｎａｔｅｓ　Ｉｎｔｅｒｌｉｎｅ　Ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ．ＰＬｏＳｏｎｅ．６（４），ｅ１８２９３（２０１１）．）などが挙げられる。また、接着培養でサイトカインを使わずに心筋細胞を分化誘導する方法（Ｌｉａｎ　Ｘ，ｅｔ　ａｌ．、Ｒｏｂｕｓｔ　ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　ｈｕｍａｎ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｖｉａ　ｔｅｍｐｏｒａｌ　ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃａｎｏｎｉｃａｌ　Ｗｎｔ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ．、２０１２　Ｊｕｌｙ　３；１０９（２７）：Ｅ１８４８－５７）、接着培養と、浮遊培養とを併用し、サイトカインを使わずに心筋細胞を分化誘導する方法（Ｍｉｎａｍｉ　Ｉ，ｅｔ　ａｌ．、Ａ　ｓｍａｌｌ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ　ｔｈａｔ　ｐｒｏｍｏｔｅｓ　ｃａｒｄｉａｃ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｕｎｄｅｒ　ｄｅｆｉｎｅｄ，ｃｙｔｏｋｉｎｅ－ａｎｄ　ｘｅｎｏ－ｆｒｅｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．、Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐ．、２０１２　Ｎｏｖ　２９；２（５）：１４４８－６０）などを用いてもよい。

　上記のようにして得られた心筋細胞または心筋前駆細胞を含む細胞集団に、受容体型チロシンキナーゼ阻害剤を接触させ、次いで該細胞集団を培養することで、受容体型チロシンキナーゼ阻害剤を接触させる前の細胞集団と比較して、心筋細胞の純度が高い細胞集団を製造することができる。即ち、受容体型チロシンキナーゼ阻害剤を用いて、心筋細胞を精製することができる。従って、本発明の別の態様において、（１’）多能性幹細胞を心筋細胞分化用培地中で培養して得られた、心筋細胞または心筋前駆細胞と非心筋細胞とを含む細胞集団に、受容体型チロシンキナーゼ阻害剤を接触させる工程、および（２’）該細胞集団を培養する工程を含む、心筋細胞を精製する方法（以下、「本発明の精製方法」ともいう。）が提供される。

　本明細書において、心筋細胞を精製するとは、受容体型チロシンキナーゼ阻害剤により、非心筋細胞の細胞数（「細胞数」は、生細胞数を意味する。以下同様。）の減少割合が心筋細胞の減少割合を上回ること、あるいは非心筋細胞の増殖が阻害されることで心筋細胞の増殖割合が上回ることで、細胞集団中の心筋細胞の割合（細胞集団中の心筋細胞数／細胞集団中の全細胞数）が増加することを意味する。従って、心筋前駆細胞から心筋細胞への分化誘導促進または心筋前駆細胞から心筋細胞以外の細胞への分化誘導阻害による、心筋細胞の割合の増加とは区別される。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、受容体型チロシンキナーゼ阻害剤による細胞数の減少は、受容体型チロシンキナーゼ阻害剤により細胞のアポトーシスが誘導された結果であると推測される。

　前記工程（１）および（１’）において、心筋細胞または心筋前駆細胞を含む細胞集団と、受容体型チロシンキナーゼ阻害剤とを接触させる期間は特に限定されないが、例えば、１時間以上（例：２時間、３時間、５時間、１２時間、１日間、２日間、３日間またはそれ以上）であることが好ましい。また、長期間培養することにより心筋細胞または心筋前駆細胞の樹立に影響がでないことから、上限は特に設けられないが、典型的には、６０日間以下（例：５０日間、４０日間、３０日間、２０日間、１４日間、１３日間、１２日間、１１日間またはそれ以下）であることが好ましい。心筋細胞または心筋前駆細胞を含む細胞集団と、受容体型チロシンキナーゼ阻害剤との接触は、該細胞集団を含む培地中に受容体型チロシンキナーゼ阻害剤を添加することにより行ってもよく、また、あらかじめ受容体型チロシンキナーゼ阻害剤を添加した培地に、該細胞集団を播種することにより行ってもよい。受容体型チロシンキナーゼ阻害剤を接触させるタイミングも、細胞集団に心筋細胞または心筋前駆細胞が含まれタイミングであれば特に限定されないが、例えば、上記工程（０－２）または（０－３）で接触させることが好ましく、多能性幹細胞の分化誘導開始日を基準にすれば、分化誘導開始から４日目以降（例：５日目、６日目、７日目またはそれ以降）に行うことが好ましい。

　本発明に用いる受容体型チロシンキナーゼ阻害剤により阻害される受容体型チロシンキナーゼとしては、ＥＧＦ受容体（ＥｒｂＢまたはＨＥＲともいう）（例：ＥｒｂＢ１（ＥＧＦＲ）、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ＥｒｂＢ３（ＨＥＲ３）、ＥｒｂＢ４（ＨＥＲ４））、インスリン受容体（例：ＩＲ－Ａ、ＩＲ－Ｂ）、インスリン様成長因子１受容体、ＶＥＧＦ受容体（例：ＶＥＧＦＲ－１（Ｆｌｔ－１）、ＶＥＧＦＲ－２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ－１）、ＶＥＧＦＲ－３（Ｆｌｔ－４））、ＰＤＧＦ受容体（例：ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ）、ＨＧＦ受容体（ｃ－Ｍｅｔともいう）、ＦＧＦ受容体（例：ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４）、ＣＣＫ、ＮＧＦ受容体（Ｔｒｋ受容体ともいう）（例：ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢ、ＴｒｋＣ）、Ｅｐｈ（Ｅｐｈｒｉｎ）受容体（例：ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＡ４、ＥＰＨＡ５、ＥＰＨＡ６、ＥＰＨＡ７、ＥＰＨＡ８、ＥＰＨＡ９、ＥＰＨＡ１０、ＥＰＨＢ１、ＥＰＨＢ２、ＥＰＨＢ３、ＥＰＨＢ４、ＥＰＨＢ５、ＥＰＨＢ６）、ＡＸＬ（ＴＡＭ受容体ともいう）、ＴＩＥ（例：ＴＩＥ－１、ＴＩＥ－２）、ＲＹＫ、ＤＤＲ（例：ＤＤＲ１）、ＲＥＴ、ＲＯＳ、ＬＴＫ、ＲＯＲ（例：ＲＯＲ１、ＲＯＲ２）、ＭｕＳＫ、ＬＭＲが挙げられる。中でも、受容体型チロシンキナーゼ阻害剤の標的として、ＶＥＧＦ受容体、ＰＤＧＦ受容体、ＨＧＦ受容体およびＦＧＦ受容体が好ましい。また、前記工程（１）で用いる受容体型チロシンキナーゼ阻害剤からは、ＥＧＦ受容体阻害剤は除かれるが、前記工程（１’）で用いる受容体型チロシンキナーゼ阻害剤として、ＥＧＦ受容体阻害剤を用いることができる。

　本明細書において、受容体型チロシンキナーゼ阻害剤は、少なくとも上記のいずれかの受容体型チロシンキナーゼに対する阻害活性を有していれば、他の活性、例えば、他の受容体型チロシンキナーゼに対する阻害活性など、を有していてもよく、また１種類の受容体型チロシンキナーゼに特異的な阻害活性を有していてもよい。また、ＥＧＦ受容体阻害剤を除く受容体型チロシンキナーゼ阻害剤は、ＥＧＦ受容体以外の受容体型チロシンキナーゼに対する阻害活性を有し、かつＥＧＦ受容体に対する阻害活性を有しているものを排除するものではなく、本明細書において、「ＥＧＦ受容体阻害剤」とは、ＥＧＦ受容体阻害活性が他の活性と比べて優位な物質であり、具体的には、ＥＧＦ受容体を少なくとも９０％以上阻害する物質またはＥＧＦ受容体の５０％阻害濃度が１０μＭ以下である物質を指す。

　本発明に用いるＥＧＦ受容体に対する阻害剤としては、例えば、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ、Ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ　ＨＣｌ（ＯＳＩ－７４４）、Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ（ＺＤ１８３９）、Ｌａｐａｔｉｎｉｂ（ＧＷ－５７２０１６）Ｄｉｔｏｓｙｌａｔｅ、Ａｆａｔｉｎｉｂ（ＢＩＢＷ２９９２）、Ｃａｎｅｒｔｉｎｉｂ（ＣＩ－１０３３）、ＴＡＳ６４１７、ＰＤ１５３０３５、ＭＴＸ－２１１、ＨＳ－１０２９６、Ｔｈｅｌｉａｔｉｎｉｂ（ＨＭＰＬ－３０９）、Ｌａｐａｔｉｎｉｂ、ＡＧ－４９０（Ｔｙｒｐｈｏｓｔｉｎ　Ｂ４２）、ＣＰ－７２４７１４、Ｄａｃｏｍｉｔｉｎｉｂ（ＰＦ－００２９９８０４）、ＷＺ４００２、Ｓａｐｉｔｉｎｉｂ（ＡＺＤ８９３１）、ＣＵＤＣ－１０１、ＡＧ－１４７８（Ｔｙｒｐｈｏｓｔｉｎ　ＡＧ－１４７８）、ＰＤ１５３０３５　ＨＣｌ、Ｐｅｌｉｔｉｎｉｂ（ＥＫＢ－５６９）、ＡＣ４８０（ＢＭＳ－５９９６２６）、ＡＥＥ７８８（ＮＶＰ－ＡＥＥ７８８）、ＡＰ２６１１３－ａｎａｌｏｇ（ＡＬＫ－ＩＮ－１）、ＯＳＩ－４２０、ＷＺ３１４６、ＨＥＲ２－Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ－１、ＷＺ８０４０、ＡＳＴ－１３０６、Ｒｏｃｉｌｅｔｉｎｉｂ（ＣＯ－１６８６）、Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ、Ｖａｒｌｉｔｉｎｉｂ、Ｉｃｏｔｉｎｉｂ、ＴＡＫ－２８５、ＷＨＩ－Ｐ１５４、Ｄａｐｈｎｅｔｉｎ、ＰＤ１６８３９３、Ｔｙｒｐｈｏｓｔｉｎ　９、ＣＮＸ－２００６、ＡＧ－１８、ＡＺ５１０４、Ｌａｚｅｒｔｉｎｉｂ、ＡＺＤ９２９１、ＣＬ－３８７７８５（ＥＫＩ－７８５）、Ｏｌｍｕｔｉｎｉｂ（ＢＩ　１４８２６９４）、（－）－Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ　Ｇａｌｌａｔｅ、Ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ、Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、Ａｆａｔｉｎｉｂ（ＢＩＢＷ２９９２）Ｄｉｍａｌｅａｔｅ、ＡＺＤ３７５９、Ｐｏｚｉｏｔｉｎｉｂ（ＨＭ７８１－３６Ｂ）、Ｂｒｉｇａｔｉｎｉｂ（ＡＰ２６１１３）、Ｏｓｉｍｅｒｔｉｎｉｂ　ｍｅｓｙｌａｔｅ、Ｎａｑｕｏｔｉｎｉｂ（ＡＳＰ８２７３）、Ｃｈｒｙｓｏｐｈａｎｉｃ　Ａｃｉｄ、Ｎａｚａｒｔｉｎｉｂ（ＥＧＦ８１６）、Ｎｏｒｃａｎｔｈａｒｉｄｉｎ、Ｌｉｆｉｒａｆｅｎｉｂ（ＢＧＢ－２８３）、Ｌｉｄｏｃａｉｎｅ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、Ｂｕｔｅｉｎ、ＥＡＩ０４５、Ｃｙａｓｔｅｒｏｎｅ、Ａｖｉｔｉｎｉｂ（ＡＣ００１０）などが挙げられる。

　インスリン受容体またはインスリン様成長因子１受容体に対する阻害剤としては、例えば、ＨＮＭＰＡ、ＧＳＫ１９０４５２９Ａ、Ｄｏｖｉｔｉｎｉｂ（ＴＫＩ－２５８）Ｄｉｌａｃｔｉｃ　Ａｃｉｄ、Ｄｏｖｉｔｉｎｉｂ（ＴＫＩ２５８）Ｌａｃｔａｔｅ、ＮＶＰ－ＡＥＷ５４１、Ｄｏｖｉｔｉｎｉｂ（ＴＫＩ－２５８）、ＮＶＰ－ＡＤＷ７４２、Ｌｉｎｓｉｔｉｎｉｂ（ＯＳＩ－９０６）、ＧＳＫ１９０４５２９Ａ、ＢＭＳ－７５４８０７、ＴＡＥ２２６（ＮＶＰ－ＴＡＥ２２６）、Ｃｅｒｉｔｉｎｉｂ（ＬＤＫ３７８）などが挙げられる。

　ＰＤＧＦＲαに対する阻害剤としては、Ｎ－［５－（｛２－［（シクロプロパンカルボニル）アミノ］イミダゾ［１，２－ｂ］ピリダジン－６－イル｝オキシ）－２－メチルフェニル］－１，３－ジメチル－１Ｈ－ピラゾール－５－カルボキサミド（式（Ｉ）の化合物）

、Ｐｏｎａｔｉｎｉｂ（ＡＰ２４５３４）、Ｔｅｌａｔｉｎｉｂ、Ａｍｕｖａｔｉｎｉｂ（ＭＰ－４７０）、Ｋｉ８７５１、ＫＲＮ　６３３、Ｃｒｅｎｏｌａｎｉｂ（ＣＰ－８６８５９６）、Ａｘｉｔｉｎｉｂ、ＣＰ－６７３４５１、Ｔｉｖｏｚａｎｉｂ（ＡＶ－９５１）、Ｎｉｎｔｅｄａｎｉｂ（ＢＩＢＦ　１１２０）、Ｄｏｖｉｔｉｎｉｂ（ＴＫＩ－２５８，ＣＨＩＲ－２５８）、Ｄｏｖｉｔｉｎｉｂ（ＴＫＩ２５８）Ｌａｃｔａｔｅ、Ｄｏｖｉｔｉｎｉｂ（ＴＫＩ－２５８）Ｄｉｌａｃｔｉｃ　Ａｃｉｄ、Ｍａｓｉｔｉｎｉｂ（ＡＢ１０１０）などが挙げられる。ＰＤＧＦＲβに対する阻害剤としては、Ｎ－［５－（｛２－［（シクロプロパンカルボニル）アミノ］イミダゾ［１，２－ｂ］ピリダジン－６－イル｝オキシ）－２－メチルフェニル］－１，３－ジメチル－１Ｈ－ピラゾール－５－カルボキサミド、ＣＰ－６７３４５１、Ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ　Ｍａｌａｔｅ、Ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ、ＴＳＵ－６８（ＳＵ６６６８，Ｏｒａｎｔｉｎｉｂ）、ＭＫ－２４６１、Ｓｏｒａｆｅｎｉｂ　Ｔｏｓｙｌａｔｅ、Ｌｉｎｉｆａｎｉｂ（ＡＢＴ－８６９）、Ａｘｉｔｉｎｉｂ、Ｃｒｅｎｏｌａｎｉｂ（ＣＰ－８６８５９６）、Ｄｏｖｉｔｉｎｉｂ（ＴＫＩ－２５８）Ｄｉｌａｃｔｉｃ　Ａｃｉｄ、Ｄｏｖｉｔｉｎｉｂ（ＴＫＩ－２５８，ＣＨＩＲ－２５８）、Ｄｏｖｉｔｉｎｉｂ（ＴＫＩ２５８）Ｌａｃｔａｔｅ、Ｔｉｖｏｚａｎｉｂ（ＡＶ－９５１）、Ｎｉｎｔｅｄａｎｉｂ（ＢＩＢＦ　１１２０）、Ｍａｓｉｔｉｎｉｂ（ＡＢ１０１０）、ＫＲＮ　６３３などが挙げられる。

　ＶＥＧＦＲ－１に対する阻害剤としては、Ｎ－［５－（｛２－［（シクロプロパンカルボニル）アミノ］イミダゾ［１，２－ｂ］ピリダジン－６－イル｝オキシ）－２－メチルフェニル］－１，３－ジメチル－１Ｈ－ピラゾール－５－カルボキサミド、ＺＭ　３０６４１６、Ａｘｉｔｉｎｉｂ、Ｍｏｔｅｓａｎｉｂ　Ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＡＭＧ－７０６）、Ｌｉｎｉｆａｎｉｂ（ＡＢＴ－８６９）、ＭＧＣＤ－２６５、Ｃｅｄｉｒａｎｉｂ（ＡＺＤ２１７１）、Ｆｏｒｅｔｉｎｉｂ（ＧＳＫ１３６３０８９）、ＯＳＩ－９３０、Ｄｏｖｉｔｉｎｉｂ（ＴＫＩ－２５８，ＣＨＩＲ－２５８）、Ｐａｚｏｐａｎｉｂ　ＨＣｌ（ＧＷ７８６０３４　ＨＣｌ）、Ｐａｚｏｐａｎｉｂ、Ｄｏｖｉｔｉｎｉｂ（ＴＫＩ－２５８）Ｄｉｌａｃｔｉｃ　Ａｃｉｄ、Ｄｏｖｉｔｉｎｉｂ（ＴＫＩ２５８）Ｌａｃｔａｔｅ、Ｃａｂｏｚａｎｔｉｎｉｂ（ＸＬ１８４，ＢＭＳ－９０７３５１）、Ｃａｂｏｚａｎｔｉｎｉｂ　ｍａｌａｔｅ（ＸＬ１８４）、Ｒｅｇｏｒａｆｅｎｉｂ（ＢＡＹ　７３－４５０６）、Ｌｅｎｖａｔｉｎｉｂ（Ｅ７０８０）、Ｔｉｖｏｚａｎｉｂ（ＡＶ－９５１）、Ｎｉｎｔｅｄａｎｉｂ（ＢＩＢＦ　１１２０）、ＡＥＥ７８８（ＮＶＰ－ＡＥＥ７８８）、Ｖａｔａｌａｎｉｂ（ＰＴＫ７８７）２ＨＣｌ、ＫＲＮ　６３３、Ｂｒｉｖａｎｉｂ（ＢＭＳ－５４０２１５）、Ｂｒｉｖａｎｉｂ　Ａｌａｎｉｎａｔｅ（ＢＭＳ－５８２６６４）などが挙げられる。ＶＥＧＦＲ－２に対する阻害剤としては、Ｎ－［５－（｛２－［（シクロプロパンカルボニル）アミノ］イミダゾ［１，２－ｂ］ピリダジン－６－イル｝オキシ）－２－メチルフェニル］－１，３－ジメチル－１Ｈ－ピラゾール－５－カルボキサミド、Ｎ－｛４－［（６，７－ジメトキシキノリン－４－イル）オキシ］－３－フルオロフェニル｝－Ｎ’－（４－フルオロフェニル）シクロプロパン－１，１－ジカルボキサミド（式（ＩＩ）の化合物）

、Ｃａｂｏｚａｎｔｉｎｉｂ（ＸＬ１８４，ＢＭＳ－９０７３５１）、Ｃａｂｏｚａｎｔｉｎｉｂ　ｍａｌａｔｅ（ＸＬ１８４）、Ｋｉ８７５１、Ａｐａｔｉｎｉｂ、Ｐｏｎａｔｉｎｉｂ（ＡＰ２４５３４）、ＺＭ３２３８８１、ＬＹ２８７４４５５、Ｓｏｒａｆｅｎｉｂ　Ｔｏｓｙｌａｔｅ、ＢＭＳ－７９４８３３、Ｇｏｌｖａｔｉｎｉｂ（Ｅ７０５０）、ＲＡＦ２６５（ＣＨＩＲ－２６５）、ＳＫＬＢ１００２、Ｖａｎｄｅｔａｎｉｂ（ＺＤ６４７４）、ＣＹＣ１１６、Ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ　Ｍａｌａｔｅ、Ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ、ＰＤ１７３０７４、Ｓｅｍａｘａｎｉｂ（ＳＵ５４１６）、ＴＳＵ－６８（ＳＵ６６６８，Ｏｒａｎｔｉｎｉｂ）、Ａｘｉｔｉｎｉｂ、Ｃｅｄｉｒａｎｉｂ（ＡＺＤ２１７１）、Ｆｏｒｅｔｉｎｉｂ（ＧＳＫ１３６３０８９）、ＭＧＣＤ－２６５、Ｍｏｔｅｓａｎｉｂ　Ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＡＭＧ－７０６）、Ｌｉｎｉｆａｎｉｂ（ＡＢＴ－８６９）、Ｌｅｎｖａｔｉｎｉｂ（Ｅ７０８０）、Ｒｅｇｏｒａｆｅｎｉｂ（ＢＡＹ　７３－４５０６）、Ｔｅｌａｔｉｎｉｂ、Ｔｉｖｏｚａｎｉｂ（ＡＶ－９５１）、ＯＳＩ－９３０、Ｄｏｖｉｔｉｎｉｂ（ＴＫＩ－２５８）Ｄｉｌａｃｔｉｃ　Ａｃｉｄ、Ｎｉｎｔｅｄａｎｉｂ（ＢＩＢＦ　１１２０）、Ｄｏｖｉｔｉｎｉｂ（ＴＫＩ２５８）Ｌａｃｔａｔｅ、Ｄｏｖｉｔｉｎｉｂ（ＴＫＩ－２５８，ＣＨＩＲ－２５８）、Ｂｒｉｖａｎｉｂ　Ａｌａｎｉｎａｔｅ（ＢＭＳ－５８２６６４）、Ｂｒｉｖａｎｉｂ（ＢＭＳ－５４０２１５）、Ｐａｚｏｐａｎｉｂ、Ｐａｚｏｐａｎｉｂ　ＨＣｌ（ＧＷ７８６０３４　ＨＣｌ）、Ｖａｔａｌａｎｉｂ（ＰＴＫ７８７）２ＨＣｌ、ＥＮＭＤ－２０７６　Ｌ－（＋）－Ｔａｒｔａｒｉｃ　ａｃｉｄ、ＥＮＭＤ－２０７６　Ｌ－（＋）－Ｔａｒｔａｒｉｃ　ａｃｉｄ、ＡＥＥ７８８（ＮＶＰ－ＡＥＥ７８８）、ＫＲＮ　６３３などが挙げられる。ＶＥＧＦＲ－３に対する阻害剤としては、Ｎ－［５－（｛２－［（シクロプロパンカルボニル）アミノ］イミダゾ［１，２－ｂ］ピリダジン－６－イル｝オキシ）－２－メチルフェニル］－１，３－ジメチル－１Ｈ－ピラゾール－５－カルボキサミド、ＳＡＲ１３１６７５、Ａｘｉｔｉｎｉｂ、Ｆｏｒｅｔｉｎｉｂ（ＧＳＫ１３６３０８９）、Ｃｅｄｉｒａｎｉｂ（ＡＺＤ２１７１）、Ｔｅｌａｔｉｎｉｂ、ＭＧＣＤ－２６５、Ｌｅｎｖａｔｉｎｉｂ（Ｅ７０８０）、Ｃａｂｏｚａｎｔｉｎｉｂ（ＸＬ１８４，　ＢＭＳ－９０７３５１）、Ｃａｂｏｚａｎｔｉｎｉｂ　ｍａｌａｔｅ（ＸＬ１８４）、Ｍｏｔｅｓａｎｉｂ　Ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＡＭＧ－７０６）、Ｄｏｖｉｔｉｎｉｂ（ＴＫＩ－２５８，ＣＨＩＲ－２５８）、Ｄｏｖｉｔｉｎｉｂ（ＴＫＩ－２５８）Ｄｉｌａｃｔｉｃ　Ａｃｉｄ、Ｄｏｖｉｔｉｎｉｂ（ＴＫＩ２５８）Ｌａｃｔａｔｅ、Ｎｉｎｔｅｄａｎｉｂ（ＢＩＢＦ　１１２０）、Ｔｉｖｏｚａｎｉｂ（ＡＶ－９５１）、ＥＮＭＤ－２０７６　Ｌ－（＋）－Ｔａｒｔａｒｉｃ　ａｃｉｄ、ＥＮＭＤ－２０７６、Ｒｅｇｏｒａｆｅｎｉｂ（ＢＡＹ　７３－４５０６）、Ｐａｚｏｐａｎｉｂ　ＨＣｌ（ＧＷ７８６０３４　ＨＣｌ）、Ｐａｚｏｐａｎｉｂ、ＫＲＮ　６３３、Ｌｉｎｉｆａｎｉｂ（ＡＢＴ－８６９）、ＡＥＥ７８８（ＮＶＰ－ＡＥＥ７８８）、Ｖａｔａｌａｎｉｂ（ＰＴＫ７８７）２ＨＣｌなどが挙げられる。

　ＨＧＦ受容体に対する阻害剤としては、例えば、Ｎ－｛４－［（６，７－ジメトキシキノリン－４－イル）オキシ］－３－フルオロフェニル｝－Ｎ’－（４－フルオロフェニル）シクロプロパン－１，１－ジカルボキサミド、Ｃｒｉｚｏｔｉｎｉｂ（ＰＦ－０２３４１０６６）、Ｃａｂｏｚａｎｔｉｎｉｂ（ＢＭＳ－９０７３５１）、Ｆｏｒｅｔｉｎｉｂ（ＧＳＫ１３６３０８９）、ＰＨＡ－６６５７５２、ＳＵ１１２７４、ＪＮＪ－３８８７７６１８（ＯＭＯ－１）、Ｇｌｕｍｅｔｉｎｉｂ（ＳＣＣ２４４）、Ａｌｔｉｒａｔｉｎｉｂ、ＳＡＲ１２５８４４、ＳＧＸ－５２３、ＢＭＳ－７７７６０７、Ｔｉｖａｎｔｉｎｉｂ（ＡＲＱ　１９７）、ＪＮＪ－３８８７７６０５、ＰＦ－０４２１７９０３、ＭＧＣＤ－２６５　ａｎａｌｏｇ、Ｃａｐｍａｔｉｎｉｂ（ＩＮＣＢ２８０６０）、ＢＭＳ－７５４８０７、ＢＭＳ－７９４８３３、ＡＭＧ－２０８、ＭＫ－２４６１、Ｇｏｌｖａｔｉｎｉｂ（Ｅ７０５０）、ＡＭＧ－４５８、ＮＶＰ－ＢＶＵ９７２、ＡＭＧ　３３７、Ｍｅｒｅｓｔｉｎｉｂ（ＬＹ２８０１６５３）、Ｓ４９０７６、Ｐｕｌｓａｔｉｌｌａ　ｓａｐｏｎｉｎ　Ｄ、Ｎｏｒｃａｎｔｈａｒｉｄｉｎ、ＮＰＳ－１０３４、Ｓａｖｏｌｉｔｉｎｉｂ（ＡＺＤ６０９４）などが挙げられる。

　ＦＧＦＲ１に対する阻害剤としては、例えば、ＡＳＰ５８７８、Ｐｏｎａｔｉｎｉｂ（ＡＰ２４５３４）、ＰＤ１７３０７４、Ｄａｎｕｓｅｒｔｉｂ（ＰＨＡ－７３９３５８）、Ｂｒｉｖａｎｉｂ　Ａｌａｎｉｎａｔｅ（ＢＭＳ－５８２６６４）、Ｂｒｉｖａｎｉｂ（ＢＭＳ－５４０２１５）、ＴＳＵ－６８（ＳＵ６６６８，Ｏｒａｎｔｉｎｉｂ）、ＳＳＲ１２８１２９Ｅ、ＡＺＤ４５４７、ＢＧＪ３９８　（ＮＶＰ－ＢＧＪ３９８）、ＬＹ２８７４４５５、Ｄｏｖｉｔｉｎｉｂ（ＴＫＩ－２５８，ＣＨＩＲ－２５８）、Ｄｏｖｉｔｉｎｉｂ（ＴＫＩ２５８）Ｌａｃｔａｔｅ、Ｄｏｖｉｔｉｎｉｂ（ＴＫＩ－２５８）Ｄｉｌａｃｔｉｃ　Ａｃｉｄ、ＣＨ５１８３２８４（Ｄｅｂｉｏ－１３４７）、ＭＫ－２４６１、Ｎｉｎｔｅｄａｎｉｂ（ＢＩＢＦ　１１２０）などが挙げられる。ＦＧＦＲ２に対する阻害剤としては、例えば、ＡＳＰ５８７８、ＢＧＪ３９８（ＮＶＰ－ＢＧＪ３９８）、ＡＺＤ４５４７、ＬＹ２８７４４５５、ＣＨ５１８３２８４（Ｄｅｂｉｏ－１３４７）、Ｎｉｎｔｅｄａｎｉｂ　（ＢＩＢＦ　１１２０）、ＭＫ－２４６１などが挙げられる。ＦＧＦＲ３に対する阻害剤としては、例えば、ＡＳＰ５８７８、ＢＧＪ３９８（ＮＶＰ－ＢＧＪ３９８）、ＡＺＤ４５４７、ＬＹ２８７４４５５、Ｄｏｖｉｔｉｎｉｂ（ＴＫＩ－２５８）Ｄｉｌａｃｔｉｃ　Ａｃｉｄ、Ｄｏｖｉｔｉｎｉｂ（ＴＫＩ２５８）　Ｌａｃｔａｔｅ、Ｄｏｖｉｔｉｎｉｂ（ＴＫＩ－２５８，ＣＨＩＲ－２５８）、ＣＨ５１８３２８４（Ｄｅｂｉｏ－１３４７）、ＭＫ－２４６１、Ｎｉｎｔｅｄａｎｉｂ（ＢＩＢＦ　１１２０）などが挙げられる。ＦＧＦＲ４に対する阻害剤としては、例えば、ＡＳＰ５８７８、ＬＹ２８７４４５５、ＡＺＤ４５４７、ＣＨ５１８３２８４（Ｄｅｂｉｏ－１３４７）、Ｎｉｎｔｅｄａｎｉｂ（ＢＩＢＦ　１１２０）などが挙げられる。

　ＮＧＦ受容体に対する阻害剤としては、例えば、ＢＭＳ－７５４８０７、ＧＷ４４１７５６、ＤＳ－６０５１ｂ、ＧＮＦ－５８３７、ＣＨ７０５７２８８、Ａｌｔｉｒａｔｉｎｉｂ、Ｓｅｌｉｔｒｅｃｔｉｎｉｂ（ＬＯＸＯ－１９５）、ＢＭＳ－９３５１７７、Ｅｎｔｒｅｃｔｉｎｉｂ（ＲＸＤＸ－１０１）、Ｓｉｔｒａｖａｔｉｎｉｂ（ＭＧＣＤ５１６）、ＰＦ－０６２７３３４０、Ｂｅｌｉｚａｔｉｎｉｂ（ＴＳＲ－０１１）、Ｌａｒｏｔｒｅｃｔｉｎｉｂ（ＬＯＸＯ－１０１）ｓｕｌｆａｔｅなどが挙げられる。

　Ｅｐｈ受容体に対する阻害剤としては、例えば、ＮＶＰ－ＢＨＧ７１２、Ｓｉｔｒａｖａｔｉｎｉｂ（ＭＧＣＤ５１６）などが挙げられる。

　ＡＸＬに対する阻害剤としては、例えば、ＢＭＳ－７７７６０７、Ｂｅｍｃｅｎｔｉｎｉｂ（Ｒ４２８）、Ｃａｂｏｚａｎｔｉｎｉｂ　ｍａｌａｔｅ（ＸＬ１８４）、ＵＮＣ２２５０、Ｄｕｂｅｒｍａｔｉｎｉｂ（ＴＰ－０９０３）、ＵＮＣ－２０２５、ＬＤＣ１２６７、ＵＮＣ２８８１、ＲＸＤＸ－１０６（ＣＥＰ－４０７８３）、Ｓ４９０７６、Ｓｉｔｒａｖａｔｉｎｉｂ（ＭＧＣＤ５１６）、２－Ｄ０８、Ｇｉｌｔｅｒｉｔｉｎｉｂ（ＡＳＰ２２１５）、ＮＰＳ－１０３４などが挙げられる。

　ＴＩＥに対する阻害剤としては、例えば、ＭＧＣＤ－２６５　ａｎａｌｏｇ、Ｔｉｅ２　ｋｉｎａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、Ａｌｔｉｒａｔｉｎｉｂ、Ｐｅｘｍｅｔｉｎｉｂ（ＡＲＲＹ－６１４）などが挙げられる。

　また、その他の受容体型チロシンキナーゼ阻害剤についても、適宜選択することができる。受容体型チロシンキナーゼ阻害剤としては、Ｎ－［５－（｛２－［（シクロプロパンカルボニル）アミノ］イミダゾ［１，２－ｂ］ピリダジン－６－イル｝オキシ）－２－メチルフェニル］－１，３－ジメチル－１Ｈ－ピラゾール－５－カルボキサミド、Ｎ－｛４－［（６，７－ジメトキシキノリン－４－イル）オキシ］－３－フルオロフェニル｝－Ｎ’－（４－フルオロフェニル）シクロプロパン－１，１－ジカルボキサミド、ＡＭＧ３３７、ＡＳＰ５８７８、ＢＧＪ３９８、Ｆｏｒｅｔｉｎｉｂ、ＺＭ３２３８８１、ＣＰ－６７３４５１、ＣｒｅｎｏｌａｎｉｂまたはＣｒｉｚｏｔｉｎｉｂが好ましい。受容体型チロシンキナーゼ阻害剤は、１種類のみを用いてもよく、複数種類を組み合わせて用いてもよい。また、より高い純度の心筋細胞を得るために、受容体型チロシンキナーゼ阻害剤と同時または前後の工程に他薬剤（ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤等）を用いてもよい。

　上記阻害剤は、上記化合物またはその塩を１種含有しても、２種以上を含有してもよい。
　上記化合物またはその塩は、自体公知の方法に従って、それぞれ製造することができる。

　上記化合物が塩である場合、薬理学的に許容される塩が好ましく、このような塩としては、例えば、無機塩基との塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩等が挙げられる。
　無機塩基との塩の好適な例としては、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩；アンモニウム塩等が挙げられる。
　有機塩基との塩の好適な例としては、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン］、ｔｅｒｔ－ブチルアミン、シクロヘキシルアミン、ベンジルアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ－ジベンジルエチレンジアミン等との塩が挙げられる。
　無機酸との塩の好適な例としては、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸等との塩が挙げられる。
　有機酸との塩の好適な例としては、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フタル酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸等との塩が挙げられる。
　塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、アルギニン、リジン、オルニチン等との塩が挙げられる。
　酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、アスパラギン酸、グルタミン酸等との塩が挙げられる。

　上記化合物は、水和物、非水和物、溶媒和物、無溶媒和物のいずれであってもよい。
　また、上記化合物は、同位元素（例、^２Ｈ、^３Ｈ、^１１Ｃ、^１４Ｃ、^１８Ｆ、^３５Ｓ、^１２５Ｉなど）などで標識または置換された化合物であってもよい。
　^１Ｈを^２Ｈ（Ｄ）に変換した重水素変換体も、上記化合物に包含される。
　互変異性体も、上記化合物に包含される。
　上記化合物は、薬学的に許容され得る共結晶または共結晶塩であってもよい。ここで、共結晶または共結晶塩とは、各々が異なる物理的特性（例えば、構造、融点、融解熱、吸湿性、溶解性および安定性等）を持つ、室温で二種またはそれ以上の独特な固体から構成される結晶性物質を意味する。共結晶または共結晶塩は、自体公知の共結晶化法に従い製造することができる。

　受容体型チロシンキナーゼ阻害剤の培地中での濃度としては、当業者であれば適宜選択できるが、例えば、１ｎＭ～１０μＭが好ましく、特に１０ｎＭ～３μＭがより好ましく、具体的には、１ｎＭ、２ｎＭ、３ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、０．１μＭ、０．２μＭ、０．３μＭ、０．４μＭ、０．５μＭ、１．０μＭ、１．５μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭが挙げられる。また、化合物の種類によっても適宜濃度を変更することもでき、例えば、Ｎ－［５－（｛２－［（シクロプロパンカルボニル）アミノ］イミダゾ［１，２－ｂ］ピリダジン－６－イル｝オキシ）－２－メチルフェニル］－１，３－ジメチル－１Ｈ－ピラゾール－５－カルボキサミドを用いる場合には、２０ｎＭ～１０μＭが好ましく、Ｎ－｛４－［（６，７－ジメトキシキノリン－４－イル）オキシ］－３－フルオロフェニル｝－Ｎ’－（４－フルオロフェニル）シクロプロパン－１，１－ジカルボキサミドを用いる場合には、０．２μＭ～１０μＭが好ましく、ＡＭＧ３３７を用いる場合には、０．２μＭ～１０μＭが好ましく、ＡＳＰ５８７８を用いる場合には、１ｎＭ～１μＭが好ましく、ＢＧＪ３９８を用いる場合には、５ｎＭ～５μＭが好ましく、Ｆｏｒｅｔｉｎｉｂを用いる場合には、５ｎＭ～５μＭが好ましく、ＺＭ３２３８８１を用いる場合には、０．１μＭ～１０μＭが好ましく、ＣＰ－６７３４５１を用いる場合には、０．１μＭ～１０μＭが好ましく、Ｃｒｅｎｏｌａｎｉｂを用いる場合には、０．１μＭ～１０μＭが好ましく、Ｃｒｉｚｏｔｉｎｉｂを用いる場合には、０．１μＭ～１０μＭが好ましいが、これらの濃度に限定されない。

　前記工程（２）および（２’）における細胞集団の培養方法は、上記（０－２）または（０－３）と同様である。培養期間も同様であり、少なくとも細胞集団と受容体型チロシンキナーゼ阻害剤とを接触をしている間培養を続ければよい。

２．心筋細胞を含む細胞集団
　本発明はまた、本発明の製法または精製方法により得られた、心筋細胞を含む細胞集団（以下、「本発明の細胞集団」ともいう）を提供する。上述の通り、本発明の細胞集団は、高い純度で心筋細胞を含む。高い純度とは、細胞集団中の心筋細胞の割合（細胞集団中の心筋細胞数／細胞集団中の全細胞数）が、具体的には、８０％以上（例：８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上）の高純度で含むことを意味する。当然のことながら、上記心筋細胞の割合は、上記細胞集団と、間葉系幹細胞などの他の細胞または細胞集団とを混合して用いる場合には、他の細胞または細胞集団を混合する前の割合を指す。好ましい態様において、本発明の細胞集団は、多能性幹細胞から心筋細胞を誘導する従来の方法で得られる細胞集団よりも、高い割合で心筋細胞を含む。かかる細胞集団は、セルソーティングなどによりさらに精製してもよく、このように精製された細胞集団もまた、「本発明の細胞集団」に包含されるものとする。

３．細胞移植療法剤
　本発明はまた、本発明の細胞集団を含有してなる、細胞移植療法剤（以下、「本発明の細胞移植療法剤」ともいう）を提供する。本発明の細胞移植療法剤は、自家移植に用いてもよく、他家移植に用いてもよい。また、他の薬剤、例えば免疫抑制剤、と併用してもよい。上述の通り、本発明の細胞集団は、高純度で心筋細胞を含むため、本発明の細胞集団は、細胞移植療法剤の原料として用いることに適しており、本発明の細胞集団または本発明の細胞移植療法剤は、心疾患の治療または予防に有用である。従って、本発明の細胞集団または細胞移植療法剤の有効量を治療または予防の対象とする哺乳動物（例：ヒト、マウス、ラット、サル、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ等）に投与または移植する、心疾患の治療または予防方法も本発明に包含される。治療または予防の対象とする心疾患としては、心不全、虚血性心疾患、心筋梗塞、心筋症、心筋炎、肥大型心筋症、拡張相肥大型心筋症、拡張型心筋症などの疾患または障害による欠損などが挙げられるが、これらに限定されない。

　本発明の細胞集団を、細胞移植療法剤に用いる場合、拒絶反応が起こらないという観点から、移植先の個体のＨＬＡ遺伝子型が同一若しくは実質的に同一である体細胞から樹立したｉＰＳ細胞に由来する細胞を含む細胞集団を用いることが望ましい。ここで、「実質的に同一」とは、移植した細胞に対して免疫抑制剤により免疫反応が抑制できる程度にＨＬＡ遺伝子型が一致していることであり、例えば、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－ＢおよびＨＬＡ－ＤＲの３遺伝子座或いはＨＬＡ－Ｃを加えた４遺伝子座が一致するＨＬＡ型を有する体細胞である。また、ポリエチレングリコールやシリコンのようなカプセル、多孔性の容器などに包埋して拒絶反応を回避した状態で移植することも可能である。

　本発明の細胞集団は、常套手段にしたがって医薬上許容される担体と混合するなどして、注射剤、懸濁剤、点滴剤等の非経口製剤として製造される。当該非経口製剤に含まれ得る医薬上許容される担体としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ－ソルビトール、Ｄ－マンニトール、塩化ナトリウムなど）などの注射用の水性液を挙げることができる。本発明の細胞移植療法剤は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤、酸化防止剤などと配合してもよい。本発明の移植療法剤を水性懸濁液剤として製剤化する場合、上記水性液に約１×１０^６～約１×１０^８細胞／ｍＬとなるように、心筋細胞を含む細胞集団を懸濁させればよい。また、生着を促すような足場材と共に投与され得る。ここで足場材とは、コラーゲンなどの生体由来の成分やこれに代替するポリ乳酸などの合成ポリマーが例示されるが、これらに限定されない。

　あるいは、心疾患の治療は、得られた心筋細胞をシート化して、患者の心臓に貼付することによって行われてもよい。心筋シートを投与する場合、所望の部分を覆うように配置することによって達成される。ここで、所望の部分を覆うように配置することは、当該分野において周知技術を用いて行うことができる。配置に際し、所望の部分が大きい場合は、組織を取り巻くように配置してもよい。また、投与は、所望の効果を得るため、同部分へ数回の配置を行うこともできる。数回の配置を行う場合、所望の細胞が組織へ生着し、血管新生を行うために十分な時間をおいて行うことが望ましい。このような心疾患の治療の機序は、心筋シートの生着により生じる効果であってもよく、あるいは細胞の生着によらない間接的な作用（例えば、誘引物質を分泌することによるレシピエント由来細胞の損傷部位への動員による効果）であってもよい。心疾患の治療において、心筋シートを用いる場合には、心筋細胞に加えて、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン等の細胞足場材料（スキャホールド）を含んでいてもよい。あるいは、心筋細胞の他に、任意の細胞種（複数も可）を含んでいることも可能である。心疾患の治療に用いられる心筋細胞の細胞数は、投与される心筋シートが心疾患の治療において効果を発揮するような量であれば特に限定されるものではなく、患部の大きさや体躯の大きさに合わせて適宜増減して調製することができる。

　さらに別の実施形態では、本発明の細胞集団は、心疾患の治療のための薬剤スクーニングや薬剤の心毒性評価に利用することもできる。例えば、本発明の細胞集団に試験薬剤を投与し、心筋細胞の応答を調べることにより、試験薬剤の効果や毒性の評価を行うことができる。

　本発明を以下の実施例でさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はそれら実施例に限定されない。

実施例１．ｉＰＳ細胞から心筋細胞に分化誘導した細胞のシングルセルＲＮＡシークエンシング解析
　国立大学法人京都大学ｉＰＳ細胞研究所（ＣｉＲＡ）で作製された臨床用ｉＰＳ細胞株の評価用株を使用した。ｉＰＳ細胞株の維持培養は従来法に準じて行った（Ｏｋｉｔａ　Ｋ，ｅｔ　ａｌ．Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ．２０１２　Ｎｏｖ　２９．ｄｏｉ：１０．１００２／ｓｔｅｍ．１２９３）。心筋細胞への分化誘導は、論文（Ｍｉｋｉ　ｅｔ　ａｌ，Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ．２０１５　Ｊｕｎ　４；１６．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍ．２０１５．０４．００５．）に記載の方法に準じて行った。分化誘導開始後２２日目の心筋細胞について１０ＸＧｅｎｏｍｉｃｓ社のＣｈｒｏｍｉｕｍを用いてシングルセルＲＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ解析を行った。ソフトウェア（Ｃｅｌｌｒａｎｇｅｒ、Ｓｅｕｒａｔ、Ｌｏｕｐｅ　Ｃｅｌｌ　Ｂｒｏｗｓｅｒ）により細胞のクラスタリングと各クラスタの解析を行った。ｉＰＳ細胞から心筋細胞に分化誘導した細胞集団中には、ｓａｒｃｏｍｅｒｉｃ－α－ａｃｔｉｎｉｎとｃａｒｄｉａｃ　Ｔｒｏｐｏｎｉｎ　Ｔを発現する心筋細胞集団の他に、ｓａｒｃｏｍｅｒｉｃ－α－ａｃｔｉｎｉｎとｃａｒｄｉａｃ　Ｔｒｏｐｏｎｉｎ　Ｔを発現しない３つの非心筋細胞集団（遺伝子発現から平滑筋様の細胞（ＳＭＣ）、内皮様の細胞（ＥＣ）、内胚葉系譜の細胞（ＥＮＤ）と考えられる）が、存在していることを見出した（図１）。

実施例２．ｉＰＳ細胞から心筋に分化誘導した細胞集団に存在する非心筋細胞の解析
　シングルセルＲＮＡシークエンシングデータのＬｏｕｐｅ　Ｃｅｌｌ　Ｂｒｏｗｓｅｒによる解析で受容体型チロシンキナーゼの遺伝子発現の解析を行った。その結果、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ｃ－Ｍｅｔ（ＨＧＦＲ）、ＦＧＦＲ４等の受容体型チロシンキナーゼの遺伝子発現が非心筋細胞集団において高く、心筋細胞集団では高くないことを見出した（図２）。

実施例３．細胞表面マーカーによる非心筋細胞の染色
　ＴＮＮＩ１の遺伝子座にＥｍＧＦＰ（配列番号１）、ＴＮＮＩ３の遺伝子座にｍＣｈｅｒｒｙ（配列番号２）のレポータータンパク質の配列を挿入したダブルノックインのヒトｉＰＳ細胞株を作製した。ヒトｉＰＳ細胞株の作製はＣＴＬ社より購入したＰＢＭＣ（ＬＰ＿１６７，Ｓａｍｐｌｅ　ＩＤ：２０１３０３１８）を用いてエピソーマルベクター（搭載遺伝子；ＯＣＴ３／４，ＫＬＦ４，ＳＯＸ２，Ｌ－ＭＹＣ，ＬＩＮ２８，ｍｏｕｓｅ　ｐ５３ＤＤ）により行った（参考文献；Ｏｋｉｔａ　Ｋ，ｅｔ　ａｌ．Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ．２０１２　Ｎｏｖ　２９．ｄｏｉ：１０．１００２／ｓｔｅｍ．１２９３）。

　ｉＰＳ細胞株の維持培養は従来法に準じて行った（Ｏｋｉｔａ　Ｋ，ｅｔ　ａｌ．Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ．２０１２　Ｎｏｖ　２９．ｄｏｉ：１０．１００２／ｓｔｅｍ．１２９３）。
　心筋細胞への分化誘導は論文（Ｍｉｋｉ　ｅｔ　ａｌ，Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ．２０１５　Ｊｕｎ　４；１６．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍ．２０１５．０４．００５．）に記載の方法に準じて６　ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅで行った。簡潔に説明すれば、心筋細胞への分化誘導は、レポーターｉＰＳ細胞株を０．５ｍＭ　ＥＤＴＡ／ＰＢＳで１／２に希釈したＴｒｙｐＬＥ　ｓｅｌｅｃｔ（ライフテクノロジーズ）で４～５分処理後、セルスクレーパー（ＩＷＡＫＩ）で細胞を剥離し、ピペッティングによりシングルセルへと解離した。１，０００ｒｐｍ，５ｍｉｎの遠心分離により培地を除去し、得られた細胞を、６ウェルプレート１ウェルあたり２×１０^６ｃｅｌｌｓ播種して、ＳｔｅｍＰｒｏ３４培地に１％Ｌ－グルタミン、トランスフェリン１５０μｇ／ｍＬ、アスコルビン酸５０μｇ／ｍＬ（ｓｉｇｍａ）、モノチオグリセロール４×１０^－４Ｍ、１０μＭ　Ｙ－２７６３２、２ｎｇ／ｍＬ　ＢＭＰ４（Ｒ＆Ｄ）および０．５％Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｒｅｄｕｃｅｄ　Ｍａｔｒｉｇｅｌを添加した培地１．５ｍＬ／ｗｅｌｌで、３７℃、５％酸素条件下にて培養して、胚様体を形成させた（０日目）。
　翌日（１日目）、ＳｔｅｍＰｒｏ３４培地に１％Ｌ－グルタミン、トランスフェリン１５０μｇ／ｍＬ、アスコルビン酸５０μｇ／ｍＬ（ｓｉｇｍａ）、モノチオグリセロール４×１０^－４Ｍ、２ｎｇ／ｍＬ　ＢＭＰ４（Ｒ＆Ｄ）アクチビンＡ　１２ｎｇ／ｍＬ、ｂＦＧＦ　５ｎｇ／ｍＬ、ＢＭＰ４　１８ｎｇ／ｍＬを加えた培地を各ウェルに１．５ｍＬ添加し、３７℃、５％酸素条件にてさらに２日間培養した。
　続いて（３日目）、６ウェルプレートを傾けて静置して胚様体を沈降させ、培地の８０～９０％除去した後、各ウェルにＩＭＤＭを１．５ｍＬ添加した。再びウェルプレートを傾けて静置して胚様体を沈降させ、培地の８０～９０％除去した後、ＳｔｅｍＰｒｏ３４培地に１％Ｌ－グルタミン、トランスフェリン１５０μｇ／ｍＬ、アスコルビン酸５０μｇ／ｍＬ（ｓｉｇｍａ）、モノチオグリセロール４×１０^－４Ｍ、１０ｎｇ／ｍＬ　ＶＥＧＦ、１μＭ　ＩＷＰ－３、０．６μＭ　Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎおよび５．４μＭ　ＳＢ４３１５４２を添加した培地中で、３７℃、５％酸素条件下で、３日間培養した。
　続いて（６日目）、６ウェルプレートを傾けて静置して胚様体を沈降させ、培地の８０～９０％除去した後、１％Ｌ－グルタミン、トランスフェリン１５０μｇ／ｍＬ、アスコルビン酸５０μｇ／ｍＬ（ｓｉｇｍａ）、モノチオグリセロール４×１０^－４Ｍおよび５ｎｇ／ｍＬ　ＶＥＧＦを添加したＳｔｅｍＰｒｏ３４培地を添加した。８日間、３７℃、５％酸素条件下で培養した。この間、２～３日に１度同じ条件の培地に交換した。

　分化誘導１５日目に胚様体を含む細胞培養液を２００ｇで１分間遠心後、上清をアスピレーターで取り除いた。ＰＢＳを加え、２００ｘｇで１分間遠心後、上清をアスピレーターで取り除いた。ＩＭＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｅｄｉａ）にＤＮａｓｅ　１０μｇ／ｍＬ、Ｌｉｂｅｒａｓｅ　１００μｇ／ｍＬを加えた溶液３ｍＬを各チューブに添加し、３７℃、通常酸素条件下で１時間静置した。１時間後、チューブを４００ｇで５分間遠心し、胚様体を吸わないように上清を除去した。Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ）にＤＮａｓｅ　１０μｇ／ｍＬを添加した溶液２ｍＬを各チューブに添加し、３７℃、通常酸素条件下で１０分間静置した。静置後、ピペッティングにより単一の細胞（ｓｉｎｇｌｅ　ｃｅｌｌ）とし、ＩＭＤＭにＤＮａｓｅ　１０μｇ／ｍＬを添加した培地２ｍＬを各チューブに加えて転倒混和することで、シングルセル懸濁液を調製した。
　上記のシングルセル懸濁液を、２００ｘｇで５分間遠心後、上清を除去し、－８０℃で凍結保存した。
　凍結保存した細胞を、３７℃の温浴につけて融解し、４００ｘｇで５分間遠心後、上清を除去した。
　細胞ペレットをタッピング後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳを１ｍＬ加え、３００ｘｇで３分間遠心し、上清を除去した。１％ＢＳＡを含むＰＢＳでＡＰＣＦｉｒｅ７５０標識抗ＣＤ３２６抗体、ＰＥ標識抗ＣＤ４９ａ抗体、ＢＶ６０５標識抗ＣＤ３１抗体、ＤＡＰＩを用いて染色した。ＤＡＰＩ陽性の死細胞を除去した上で、核細胞の各蛍光色素のシグナル量を測定することで、細胞集団の分離と各細胞集団の割合を測定した。
　上記レポーターｉＰＳ細胞から心筋に分化誘導した心筋細胞は、これらの３つの表面マーカーの発現の違いにより、ＣＤ３２６陽性細胞、ＣＤ３２６陰性ＣＤ３１陽性細胞、ＣＤ３２６陰性ＣＤ３１陰性ＣＤ４９ａ陽性細胞、ＣＤ３２６陰性ＣＤ３１陰性ＣＤ４９ａ陰性細胞の主に４つの細胞集団に分離された。４つの細胞集団は、これら３つの表面マーカーのいずれかまたは複数を発現する、３つの非心筋細胞を主とする集団（心筋レポーター遺伝子を発現しない細胞を多く含む集団）と、３つのマーカー全てが陰性の心筋細胞集団（心筋レポーター遺伝子を発現する細胞集団）であった。３つのマーカー全てが陰性の細胞集団については、その９９％以上が、心筋細胞（心筋レポーター遺伝子を発現する細胞）であった（図３）。

　次に、実施例２により見出した受容体型チロシンキナーゼに着目し、受容体型チロシンキナーゼ阻害剤により、受容体型チロシンキナーゼの発現が相対的に低い心筋細胞を純化できるか否かを、様々な条件で検証した（試験例１～９）。
　以下の試験例１～９において、化合物ＡとはＮ－［５－（｛２－［（シクロプロパンカルボニル）アミノ］イミダゾ［１，２－ｂ］ピリダジン－６－イル｝オキシ）－２－メチルフェニル］－１，３－ジメチル－１Ｈ－ピラゾール－５－カルボキサミドであり、化合物ＢとはＮ－｛４－［（６，７－ジメトキシキノリン－４－イル）オキシ］－３－フルオロフェニル｝－Ｎ’－（４－フルオロフェニル）シクロプロパン－１，１－ジカルボキサミドを表す。

試験例１．受容体型チロシンキナーゼ阻害剤による心筋細胞の純化作用の検証
＜心筋細胞への分化誘導＞
　ヒトｉＰＳ細胞株は、ＣＴＬ社より購入したＰＢＭＣ（ＬＰ＿１６７，Ｓａｍｐｌｅ　ＩＤ：２０１３０３１８）を用いてエピソーマルベクター（搭載遺伝子；ＯＣＴ３／４，ＫＬＦ４，ＳＯＸ２，Ｌ－ＭＹＣ，ＬＩＮ２８，ｍｏｕｓｅ　ｐ５３ＤＤ）により作製された（参考文献；Ｏｋｉｔａ　Ｋ，ｅｔ　ａｌ．Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ．２０１２　Ｎｏｖ２９．ｄｏｉ：１０．１００２／ｓｔｅｍ．１２９３）細胞株（細胞表面マーカーによる非心筋細胞の染色で使用したレポーター細胞の親株）を使用した。
　ｉＰＳ細胞株の維持培養は従来法に準じて行った（Ｏｋｉｔａ　Ｋ，ｅｔ　ａｌ．Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ．２０１２　Ｎｏｖ　２９．ｄｏｉ：１０．１００２／ｓｔｅｍ．１２９３）。心筋細胞への分化誘導は論文（Ｍｉｋｉ　ｅｔ　ａｌ，Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ．２０１５　Ｊｕｎ　４；１６．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍ．２０１５．０４．００５．）に記載の方法に準じて６　ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅで行った。ＶＥＧＦについてはＤａｙ８以降は添加せずに実施した。
　分化誘導８日目に、胚様体を１つの遠心チューブに集め室温で数分間静置して胚様体を沈降させ、上清をアスピレーターで取り除き、培地を添加することで、培地交換を実施した。胚様体懸濁液を６　ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに移し、最終濃度の１００倍濃度の評価化合物（以下の表１に示す実験番号２から８の化合物と濃度）を各ウェルに１００分の１量添加後、プレートを攪拌し、細胞培養を行った。

　分化誘導１０日目に、６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅを傾けて数分間静置することで胚様体を沈降させ、上清をアスピレーターで取り除き、培地を添加することで各ウェルの培地交換を実施し、８日目と同様に最終濃度の１００倍濃度の評価化合物を１００分の１量添加することで、化合物の添加を実施した。分化誘導１３日目に、６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅを傾けて胚様体を沈降させ、広径の１ｍＬピペット用チップを付けたピペットで胚様体を１．５ｍＬチューブに移した。細胞のシングルセル化は細胞表面マーカーによる非心筋細胞の染色に準じて実施し、シングルセル懸濁液を、心筋細胞マーカー陽性細胞率測定、および非心筋細胞マーカー陽性細胞率測定に用いた。

＜心筋マーカー陽性細胞率（心筋細胞率）測定＞
　上記のシングルセル懸濁液を１．５ｍＬチューブに分注後、４００ｇで３分間遠心し、上清を除去した。細胞ペレットをＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ　Ｆｉｘａｔｉｏｎ／Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢＤ）に再懸濁して室温で１５分静置し、固定した。各チューブに１ｘＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ　Ｂｕｆｆｅｒ　１ｍＬを添加し、１５００ｇで３分間遠心後、上清を除去することで細胞を洗浄した。細胞ペレットをタッピング後に、１ｘＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ　Ｂｕｆｆｅｒ　１ｍＬを添加し、同様の操作を行うことで細胞を洗浄した。細胞ペレットはタッピング後、１％ＢＳＡ　を含む１ｘＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ　Ｂｕｆｆｅｒで抗Ｓａｒｃｏｍｅｒｉｃ　α－ａｃｔｉｎｉｎ抗体を用いて、蛍光色素Ａｌｅｘａ６４７で染色後、さらにＤＡＰＩ（４’，６－Ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ　Ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）でＤＮＡ染色を行った。フローサイトメーターによる測定で、死細胞（ＤＮＡ量がＳｕｂ－Ｇ１の細胞）を除いた細胞集団のＡｌｅｘａ６４７の蛍光シグナル量を測定することで、Ｓａｒｃｏｍｅｒｉｃ　α－ａｃｔｉｎｉｎ陽性の細胞率の解析を行った。その結果、化合物Ａ（Ｎ－［５－（｛２－［（シクロプロパンカルボニル）アミノ］イミダゾ［１，２－ｂ］ピリダジン－６－イル｝オキシ）－２－メチルフェニル］－１，３－ジメチル－１Ｈ－ピラゾール－５－カルボキサミド）、ＡＭＧ３３７、ＡＳＰ５８７８、ＢＧＪ３９８処理により、化合物未処理に比べ心筋細胞率（Ａｃｔｉｎｉｎ陽性細胞率）が増加した（図４）。

＜非心筋細胞マーカー陽性細胞率（非心筋細胞率）測定＞
　未凍結のシングルセル懸濁液を用いて、細胞表面マーカーによる非心筋細胞の染色に準じて、染色、測定、解析を実施した。その結果、化合物Ａ、ＡＭＧ３３７、ＡＳＰ５８７８、ＢＧＪ３９８処理により、化合物未処理に比べ、非心筋細胞率（ＣＤ３２６、ＣＤ３１、ＣＤ４９ａいずれかが陽性の細胞率）が減少した（図５）。

試験例２．受容体型チロシンキナーゼ阻害剤による心筋細胞の純化作用の検証
＜心筋細胞への分化誘導＞
　ヒトｉＰＳ細胞は試験例１と同じ細胞株を用い、心筋細胞への分化誘導についても同様の方法で行った。培地交換は分化誘導８日目、１０日目、１３日目に実施し、分化誘導８日目、１０日目は試験例１と同様の方法で、分化誘導１３日目は試験例１の１０日目と同様の方法で行った。分化誘導８日目、１０日目、１３日目は評価化合物（以下の表２に示す実験番号２、３の化合物と濃度）の添加を試験例１と同様の方法で実施した。ただし、実験番号３のＡＳＰ５８７８の添加は分化誘導８日目と１０日目のみで実施した。各実験について４ウェルずつで実施した。

　分化誘導１６日目に、細胞のシングルセル化、固定、心筋細胞率（Ｓａｒｃｏｍｅｒｉｃ　α－ａｃｔｉｎｉｎ陽性細胞率）測定を試験例１と同様の方法で行った。その結果、Ｆｏｒｅｔｉｎｉｂ、ＡＳＰ５８７８処理により、化合物未処理に比べ心筋細胞率が増加した（図６）。

試験例３．受容体型チロシンキナーゼ阻害剤による心筋細胞の純化作用の検証
＜心筋細胞への分化誘導＞
　ヒトｉＰＳ細胞株は、ＣＴＬ社より購入したＰＢＭＣ（ＬＰ＿１４０，Ｓａｍｐｌｅ　ＩＤ：２０１２０８０８）を用いてエピソーマルベクター（搭載遺伝子；ＯＣＴ３／４，ＫＬＦ４，ＳＯＸ２，Ｌ－ＭＹＣ，ＬＩＮ２８，ｍｏｕｓｅ　ｐ５３ＤＤ）により作製された（参考文献；Ｏｋｉｔａ　Ｋ，ｅｔ　ａｌ．Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ．２０１２　Ｎｏｖ　２９．ｄｏｉ：１０．１００２／ｓｔｅｍ．１２９３）細胞株を使用した。
　ｉＰＳ細胞株の維持培養は従来法に準じて行った（Ｏｋｉｔａ　Ｋ，ｅｔ　ａｌ．Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ．２０１２　Ｎｏｖ　２９．ｄｏｉ：１０．１００２／ｓｔｅｍ．１２９３）。心筋細胞への分化誘導は実施例１と同様の方法で行った。ＶＥＧＦについてはＤａｙ１０以降は添加せずに実施した。
　培地交換は分化誘導８日目、１０日目、１３日目に実施し、分化誘導８日目、１０日目は試験例１と同様の方法で、分化誘導１３日目は試験例１の１０日目と同様の方法で行った。分化誘導８日目、１０日目、１３日目は評価化合物（以下の表３に示す実験番号２から６の化合物と濃度）の添加を試験例１と同様の方法で実施した。

　分化誘導１７日目に、細胞のシングルセル化、非心筋細胞率（ＣＤ３２６、ＣＤ３１、ＣＤ４９ａいずれかが陽性の細胞率）測定を試験例１と同様の方法で行った。その結果、化合物Ａ、Ｆｏｒｅｔｉｎｉｂ、ＺＭ３２３８８１、Ｃｒｅｎｏｌａｎｉｂ、Ｃｒｉｚｏｔｉｎｉｂ処理により、化合物未処理に比べ非心筋細胞率が減少した（図７）。

試験例４．受容体型チロシンキナーゼ阻害剤による心筋細胞の純化作用の検証
＜心筋細胞への分化誘導＞
　ヒトｉＰＳ細胞は試験例３と同じ細胞株を用い、心筋細胞への分化誘導についても同様の方法で行った。
　培地交換は分化誘導８日目、１０日目、１３日目に実施し、分化誘導８日目、１０日目は試験例１と同様の方法で、分化誘導１３日目は試験例１の１０日目と同様の方法で行った。分化誘導８日目、１０日目、１３日目は評価化合物（以下の表４に示す実験番号２、３の化合物と濃度）の添加を試験例１と同様の方法で実施した。各実験について４ウェルずつで実施した。

　分化誘導１７日目に、細胞のシングルセル化を行い、細胞数測定と心筋細胞率測定を行った。固定、心筋細胞率（Ｓａｒｃｏｍｅｒｉｃ　α－ａｃｔｉｎｉｎ陽性細胞率）測定を試験例１と同様の方法で行った。その結果、化合物Ａ、Ｆｏｒｅｔｉｎｉｂ処理により、未処理に比べ心筋細胞率が増加した（図８）。

　上記のシングルセル懸濁液を、１．５ｍＬチューブに５倍希釈になるように用意しておいたＩＭＤＭ培地に加えて転倒混和し、細胞計数装置ＮＣ－２００（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ）で細胞数を測定した。その結果、Ｆｏｒｅｔｉｎｉｂ処理では未処理に比べて７０％程度、化合物Ａ処理ではほぼ同じ数の細胞数が回収された（図９）。

試験例５．受容体型チロシンキナーゼ阻害剤による心筋細胞の純化作用の検証
＜心筋細胞への分化誘導＞
　ヒトｉＰＳ細胞は試験例３と同じ細胞株を用い、心筋細胞への分化誘導についても同様の方法で行った。
　培地交換は分化誘導８日目、１０日目、１３日目に実施し、分化誘導８日目、１０日目は試験例１と同様の方法で、分化誘導１３日目は試験例１の１０日目と同様の方法で行った。分化誘導８日目、１０日目、１３日目は評価化合物（以下の表５に示す実験番号２から４の化合物と濃度）の添加を試験例１と同様の方法で実施した。ただし、実験番号４のＡＳＰ５８７８の添加は分化誘導８日目と１０日目のみで実施した。各実験について４ウェルずつで実施した。

　分化誘導１６日目に、細胞のシングルセル化、固定、心筋細胞率（Ｓａｒｃｏｍｅｒｉｃ　α－ａｃｔｉｎｉｎ陽性細胞率）を試験例１と同様の方法で行った。その結果、化合物未処理に比べ、Ｃｒｅｎｏｌａｎｉｂ、化合物Ｂ（Ｎ－｛４－［（６，７－ジメトキシキノリン－４－イル）オキシ］－３－フルオロフェニル｝－Ｎ’－（４－フルオロフェニル）シクロプロパン－１，１－ジカルボキサミド）、ＡＳＰ５８７８処理により、心筋細胞率（Ｓａｒｃｏｍｅｒｉｃ　α－ａｃｔｉｎｉｎ陽性細胞率）が増加した（図１０）。

　上記のシングルセル懸濁液を用いて、細胞数測定方法を試験例４に記載の方法で実施した。その結果、化合物処理の有無で回収できた細胞数には大きな変化は認められなかった（図１１）。

試験例６．受容体型チロシンキナーゼ阻害剤による心筋細胞の純化作用の検証
＜心筋細胞への分化誘導＞
　ＣｉＲＡで作製された臨床用ｉＰＳ細胞株を使用した。ｉＰＳ細胞株の維持培養は従来法に準じて行った（Ｏｋｉｔａ　Ｋ，ｅｔ　ａｌ．Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ．２０１２　Ｎｏｖ　２９．ｄｏｉ：１０．１００２／ｓｔｅｍ．１２９３）。心筋細胞への分化誘導は、論文（Ｍｉｋｉ　ｅｔ　ａｌ，Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ．２０１５　Ｊｕｎ　４；１６．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍ．２０１５．０４．００５．）に記載の方法に準じて行った。
　培地交換は分化誘導８、１０、１４、１７、２１日目に実施し、分化誘導８日目、１０日目は試験例１と同様の方法で、分化誘導１４日目以降は試験例１の１０日目と同様の方法で行った。
　分化誘導１４日目、１７日目、２１日目は評価化合物の１つである化合物Ａの添加を試験例１と同様の方法で実施した。各実験について４ウェルずつで実施した。

　細胞のシングルセル化、固定、心筋細胞率測定、非心筋細胞率測定は試験例１と同様の方法で、細胞数測定は試験例４と同様の方法で行った。その結果、化合物未処理に比べ、化合物Ａ処理により心筋細胞率が増加し（図１２）、非心筋細胞率が減少した（図１３）。化合物処理の有無で回収できた細胞数には大きな変化が認められなかった（図１４）。

試験例７．受容体型チロシンキナーゼ阻害剤による心筋細胞の純化作用の検証
＜心筋細胞への分化誘導＞
　ヒトｉＰＳ細胞は、ＣｉＲＡで作製された臨床用ｉＰＳ細胞株を使用した。試験例６と同じ細胞株を用い、心筋細胞への分化誘導についても同様の方法で行った。
　培地交換は分化誘導８日目、１０日目、１３日目に実施し、分化誘導８日目、１０日目は試験例１と同様の方法で、分化誘導１３日目は試験例１の１０日目と同様の方法で行った。分化誘導８日目、１０日目、１３日目は評価化合物（以下の表７に示す実験番号２から９の化合物と濃度、の添加を試験例１と同様の方法で実施した（実験番号１については２ウェル、他は１ウェルで実施した）。

　分化誘導１７日目に、細胞のシングルセル化、固定、心筋細胞率（Ｓａｒｃｏｍｅｒｉｃ　α－ａｃｔｉｎｉｎ陽性細胞率）測定、非心筋細胞率測定を試験例１と同様の方法で行った。化合物未処理に比べ、化合物Ａ、Ｆｏｒｅｔｉｎｉｂ、ＺＭ３２３８８１、ＣＰ－６７３５１、Ｃｒｉｚｏｔｉｎｉｂ処理により心筋細胞率が増加し（図１５）、非心筋細胞率が減少した（図１６）。

試験例８．受容体型チロシンキナーゼ阻害剤による心筋細胞の純化作用の検証
＜心筋細胞への分化誘導＞
　ヒトｉＰＳ細胞は試験例６と同じ細胞株を用い、心筋細胞への分化誘導についても同様の方法で行った。
　培地交換は分化誘導８、１０、１３、１７、２０日目に実施し、分化誘導８日目は試験例１の８日目と同様の方法で、分化誘導１０日目以降は試験例１の１０日目と同様の方法で行った。分化誘導８、１０、１３、１７、２０日目は評価化合物Ｃｒｅｎｏｌａｎｉｂの添加を表８に記載の条件に従い試験例１と同様の方法で実施した。実験番号４は分化誘導８日目以降、実験番号２、３は分化誘導１０日目以降から、実験番号５は分化誘導１３日目以降から化合物の添加を行った。実験番号１は４ウェル、実験番号２、３は３ウェル、実験番号４、５については１ウェルで実施した。

　分化誘導２３日目に、細胞のシングルセル化、固定、心筋細胞率（Ｓａｒｃｏｍｅｒｉｃ　α－ａｃｔｉｎｉｎ陽性細胞率）測定、非心筋細胞率測定を試験例１と同様の方法で行った。Ｃｒｅｎｏｌａｎｉｂ処理により心筋細胞率が増加し（図１７）、非心筋細胞率が減少した（図１８）。

試験例９．受容体型チロシンキナーゼ阻害剤による心筋細胞の純化作用の検証
＜心筋細胞への分化誘導＞
　ヒトｉＰＳ細胞は試験例６と同じ細胞株を用い、心筋細胞への分化誘導についても同様の方法で行った。
　培地交換は、分化誘導８日目は試験例１の８日目と同様の方法で、分化誘導１０日目、１３日目は試験例１の１０日目と同様の方法で行った。分化誘導８、１０、１３日目は評価化合物（以下の表９に示す実験番号２、３の化合物と濃度）の添加を試験例１と同様の方法で実施した。各実験番号４ウェルで実施した。

　分化誘導１７日目に、細胞のシングルセル化、固定、心筋細胞率（Ｓａｒｃｏｍｅｒｉｃ　α－ａｃｔｉｎｉｎ陽性細胞率）測定、非心筋細胞率測定を試験例１と同様の方法で、細胞数測定を試験例４と同様の方法で実施した。化合物未処理に比べ、Ｆｏｒｅｔｉｎｉｂ、Ｃｒｉｚｏｔｉｎｉｂ処理により、心筋細胞率が増加し（図１９）、非心筋細胞率が減少した（図２０）。化合物未処理に比べＣｒｉｚｏｔｉｎｉｂで８割、Ｆｏｒｅｔｉｎｉｂ処理ではほぼ同数の細胞数が回収された（図２１）。

　以上より、様々な種類の受容体型チロシンキナーゼ阻害剤を培地に添加するだけの簡便な処理によって、様々な細胞株において胚様体中の心筋細胞を純化できることが示された。

　なお、上記試験例１～９で用いた各化合物の標的となる受容体型チロシンキナーゼを、表１０として示す。

　本発明により、心筋細胞を高純度で含む細胞集団が提供される。かかる細胞集団は、心疾患に対する細胞移植療法や心疾患の治療剤のスクリーニングに好適に用いることができるため、有用である。

　本出願は日本で出願された特願２０２０－０５０２６８（出願日：２０２０年３月１９日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims

　心筋細胞を含む細胞集団を製造する方法であって、
　（１）多能性幹細胞を心筋細胞分化用培地中で培養して得られた、心筋細胞または心筋前駆細胞とその他の細胞とを含む細胞集団に、受容体型チロシンキナーゼ阻害剤（但し、ＥＧＦ受容体阻害剤を除く。）を接触させる工程、および
　（２）該細胞集団を培養する工程、
を含む、方法。
　前記工程（１）の細胞集団と受容体型チロシンキナーゼ阻害剤との接触が、多能性幹細胞の分化誘導開始から４日目以降に行われる、請求項１に記載の方法。
　前記工程（１）の細胞集団と受容体型チロシンキナーゼ阻害剤との接触が１日以上行われる、請求項１または２に記載の方法。
　前記阻害剤が、ＶＥＧＦ受容体、ＰＤＧＦ受容体、ＨＧＦ受容体およびＦＧＦ受容体からなる群から選択される少なくとも１つの受容体型チロシンキナーゼに対する阻害剤である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
　前記阻害剤が、Ｎ－［５－（｛２－［（シクロプロパンカルボニル）アミノ］イミダゾ［１，２－ｂ］ピリダジン－６－イル｝オキシ）－２－メチルフェニル］－１，３－ジメチル－１Ｈ－ピラゾール－５－カルボキサミド、Ｎ－｛４－［（６，７－ジメトキシキノリン－４－イル）オキシ］－３－フルオロフェニル｝－Ｎ’－（４－フルオロフェニル）シクロプロパン－１，１－ジカルボキサミド、ＡＭＧ３３７、ＡＳＰ５８７８、ＢＧＪ３９８、Ｆｏｒｅｔｉｎｉｂ、ＺＭ３２３８８１、ＣＰ－６７３４５１、ＣｒｅｎｏｌａｎｉｂおよびＣｒｉｚｏｔｉｎｉｂからなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
　前記多能性幹細胞が人工多能性幹細胞である、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
　請求項１～６のいずれか１項に記載の方法により得られた、心筋細胞を含む細胞集団。
　請求項７に記載の細胞集団を含有してなる、細胞移植療法剤。
　心筋細胞を精製する方法であって、
　（１）多能性幹細胞を心筋細胞分化用培地中で培養して得られた、心筋細胞または心筋前駆細胞とその他の細胞とを含む細胞集団に、受容体型チロシンキナーゼ阻害剤を接触させる工程、および
　（２）該細胞集団を培養する工程、
を含む、方法。