WO2021187883A1 - 인비트로 트랜스크립트 mrna 및 이를 함유하는 약학조성물 - Google Patents

인비트로 트랜스크립트 mrna 및 이를 함유하는 약학조성물 Download PDF

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최준영
김나영
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    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/50—Vector systems having a special element relevant for transcription regulating RNA stability, not being an intron, e.g. poly A signal

Definitions

  • the present invention relates to an in vitro transcript mRNA for intracellular expression of a target gene, and more particularly, to an RNA in vitro transcript mRNA for intracellular expression of a target gene and a pharmaceutical composition for a vaccine containing the same.
  • Gene therapy and gene vaccine are technologies that have already been proven and applied in the medical field, and can be treated not only for genetic diseases, but also for autoimmune diseases, infectious diseases, cancer or tumor-related diseases, and inflammatory diseases.
  • DNA and DNA can be used as nucleic acid molecules for gene administration, and it is known that DNA is relatively stable and tractable compared to RNA.
  • RNA Ribonucleic acid
  • a potential risk may arise if the administered DNA-fragment into the patient's genome is inserted at an unwanted location, resulting in damage to the gene. Additionally, unwanted anti-DNA antibodies may appear, and another problem is that the expression level of peptides or proteins expressed by DNA administration and subsequent transcription/translation is limited.
  • RNA The level of the peptide or protein to be used is also limited.
  • RNA when used as a tool for gene administration, RNA does not require transcription, so proteins can be synthesized directly in the cytoplasm without having to enter the nucleus like DNA, which can interfere with cell chromosomes and cause unwanted gene damage. no worries In addition, it does not induce long-term genetic modification due to its short half-life compared to DNA (Sayour EJ, et al., J Immunother Cancer 2015;3:13, 2015).
  • a general RNA vaccine When delivered into cells, a general RNA vaccine is activated for a short time to express the target protein, and is destroyed by an enzymatic reaction within a few days, and a specific immune response to the expressed target antigen (protein) remains.
  • the target protein in the case of using RNA as a tool for gene administration, can be expressed in the same amount as DNA even with a smaller amount than DNA because it does not need to pass through the nuclear membrane and acts only when it passes through the cell membrane. .
  • RNA itself has immunoreinforcing properties, so that the same immune effect can be seen even when administered in a small amount compared to DNA.
  • RNA in the case of RNA, it can be mass-produced in vitro, so it can be safely produced even in a small GMP production facility.
  • a script (transcript) can be produced.
  • it required a lot of expense and high-level technology to produce a large amount of RNA in this way, but now it is possible to produce a large amount of RNA using a small amount of DNA template through the improvement of related reagents for in vitro transcription reactions, especially DNA-dependent RNA polymerase.
  • RNA could be produced within 1-2 weeks.
  • a gene vaccine is a system that expresses a target antigen by inoculating an animal with a gene (DNA or RNA) of a protein to be expressed by using various vectors.
  • the amount of protein expressed from a gene is not actually directly proportional to immunogenicity. That is, even if there are many antigens to be expressed, it does not necessarily mean that the immunogenicity of the antigen also increases proportionally.
  • the genetic vaccine DNA or RNA
  • the genetic vaccine is transmitted and infected in various ways in the animal muscle cells. Since the transfected muscle cells are lysed by antigen-specific T cells, the actual antigen expression period or amount of antigen is not as predicted in in vitro cell culture experiments.
  • RNA in order to induce an excellent immune response by the target gene, the amount of protein expressed in the animal cells by the administered RNA, the composition of the administered RNA transcript and the appropriate RNA dose required for immunity, and the optimal use of a compound such as protamine
  • the modification of RNA is important (Park, JH et al., J. Bacteriol & Virol. , 46:115, 2016).
  • the present inventors made diligent efforts to develop a method for stably expressing a target gene in animal cells.
  • the target gene and the 5'-UTR, 3'-UTR, and 5'-UTR connected to both ends of the target gene The target gene is transferred to animal cells by using an in vitro transcript mRNA containing a poly-A tail consisting of 20 to 400 adenines linked to the 5' cap and the 3'-UTR linked to the 3'-UTR.
  • a poly-A tail consisting of 20 to 400 adenines linked to the 5' cap and the 3'-UTR linked to the 3'-UTR.
  • An object of the present invention is to provide an in vitro transcript mRNA for stably expressing a target gene in animal cells.
  • Another object of the present invention is to provide a DNA template for preparing the in vitro transcript mRNA.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for a vaccine comprising the in vitro transcript mRNA.
  • the present invention provides (a) an RNA sequence insertion portion encoding a target peptide or target protein; (b) 5'-UTR and 3'-UTR connected to both ends of the RNA sequence encoding the target peptide or target protein; (c) a 5' cap connected to the 5'-UTR; And (d) provides an in vitro transcript (in vitro transcript) mRNA comprising a poly A tail containing 20 to 400 adenines linked to 3'-UTR.
  • the present invention also provides (a) a portion having a DNA sequence corresponding to the RNA in vitro transcript (in vitro transcript) mRNA; and (b) a template DNA for in vitro transcript mRNA production comprising a promoter to which RNA polymerase binds for transcription of a DNA sequence corresponding to the in vitro transcript mRNA. to provide.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for a vaccine comprising the in vitro transcript mRNA.
  • the present invention also provides a method for preventing or treating a disease comprising administering the in vitro transcript mRNA.
  • the present invention also provides the use of the in vitro transcript mRNA for the prevention or treatment of a disease.
  • the present invention also provides the use of the in vitro transcript mRNA for the prevention or treatment of a disease.
  • FIG. 1 shows the composition of the in vitro transcript mRNA and template DNA according to the present invention.
  • Figure 2 shows the process of synthesizing the in vitro transcript mRNA through in vitro transcription from the template plasmid DNA according to the present invention.
  • 3 shows the results of confirming the expression level of the target protein according to the length of the poly A tail of the in vitro transcript mRNA.
  • 5 shows the results of confirming the expression level of the target protein according to the mixing of the non-A residue of the poly A tail of the in vitro transcript mRNA.
  • 7A shows the result of confirming the expression level of the target protein by substituting modified nucleotides for the nucleotides of the in vitro transcript mRNA
  • B is the non-A residue of the non-A residue mixed poly A tail with modified nucleotides. Shows the results of confirming the expression level of the target protein.
  • the present invention provides (a) an RNA sequence insertion portion encoding a target peptide or target protein; (b) 5'-UTR and 3'-UTR connected to both ends of the RNA sequence encoding the target peptide or target protein;
  • the target gene is a therapeutically active protein or peptide, adjuvant protein, antigen, tumor antigen, pathogenic antigen, animal antigen, viral antigen, protozoan antigen, bacterial antigen, allergen, autologous antigen It may be characterized as a gene encoding an immune antigen, allergen, antibody, immunostimulatory protein or peptide or antigen-specific T-cell receptor.
  • the 5' cap is a component located at the 5' start site of mRNA.
  • the Cap structure initiates protein synthesis and serves to protect mRNA from the action of nucleases.
  • 5'Cap also affects translation. During translation initiation, the 5' cap binds to eukaryote translation initiation factor 4 E (elF4E) to bind the 40S ribosomal subunit to mRNA.
  • elF4E eukaryote translation initiation factor 4 E
  • the 5' cap may be a Cap-1 or an anti-reverse cap analog (ARCA).
  • ARCA anti-reverse cap analog
  • transcript when a transcript (transcript) is produced using a co-transcriptional capping method that simultaneously performs capping and transcription, the ARCA-RNA using mMESSAGE mMACHINETM T7 ULTRA Transcription kit (Thermofisher Scientific) was synthesized.
  • uncapped-RNA was synthesized using the MEGAscriptTM T7 transcription kit (Thermofisher Scientific).
  • in vitro transcript mRNA having uncapped, Cap-0, Cap-1, and ARCA was used to determine 5'Cap optimized for the platform of in vitro transcript mRNA for delivery and expression of a target gene to animal cells.
  • the expression level of the target protein in 293T cells was compared, and it was confirmed that the expression efficiency of ACRA and Cap-1 was the best (FIG. 6).
  • ARCA which performs capping simultaneously with in vitro transcription
  • uncapped RNA can be synthesized. Since this can induce innate immunity, it was determined that Cap-1, a capping system after transcription using an enzyme, is more suitable for the platform of in vitro transcript mRNA.
  • a Kozak sequence is preferably added to the upper portion of the start codon of the target gene, and the target gene preferably has a codon-optimized sequence for the host cell.
  • the poly (A) tail is a component located at the 3' end of the in vitro transcript mRNA of the present invention. Together with 5'-Cap, it serves to protect mRNA from enzymatic degradation, and it is known that mRNA stability is deteriorated if the length is insufficient.
  • the poly A tail also affects translation.
  • Poly (A) binding protein (PABP) a protein that binds to the poly A tail, binds to eukaryote translation initiation factor 4 G (elF4G) during the initiation of translation and attaches the 40S ribosomal subunit to mRNA.
  • the poly A tail may be characterized in that it is composed of 20 to 400 adenines, preferably 30 to 200 adenines, more preferably 60 to 150 adenines. It may be composed of, and more preferably, may be composed of 100 to 130 adenines.
  • templates having A0, A30 and A120 tails including 0, 30, and 120 adenines, including the existing A33C18 were prepared.
  • mRNA generated through in vitro transcription was introduced into 293T cells to compare the expression level of the target protein.
  • IgM-D4 expression was not confirmed in the A0 tail, and it was confirmed that the expression was good in the order of A120 tail, A30 tail, and A33C18 tail ( FIG. 3 ).
  • the poly A tail is characterized in that one or more nucleotides other than adenine selected from the group consisting of uracil (U), cytosine (C) and guanine (G) are inserted between a plurality of adenines. , wherein the inserted nucleotides other than adenine are inserted between 2 to 20, preferably 4 to 15, more preferably 6 to 12, most preferably 8 to 10 adenine. may, but is not limited thereto.
  • the original A120 tail, A120-G mixed tail, A120-C mixed tail, and A120-U mixed tail were prepared as template DNA.
  • In vitro transcript mRNA was synthesized based on each template, and the expression level of the target protein in 293T cells was compared in the same manner as in Example 3. As a result, it was confirmed that the mRNA expression efficiency of the U mixed tail was the best.
  • the end of the poly A tail may be characterized in that adenine.
  • the poly A tail end of the mRNA produced by the restriction enzyme used for linearization of the template plasmid DNA may end with an A residue or may include a restriction enzyme recognition site.
  • U uracil
  • modified U modified U
  • pseudo UTP N1-methylpeudo UTP
  • the poly A tail may be characterized in that a modified U (modified U) is inserted between a plurality of adenines.
  • in vitro transcript mRNA including modified CTP and UTP is synthesized, and 293T The expression level of the target protein in the cells was compared.
  • the present invention provides (a) a portion having a DNA sequence corresponding to the RNA in vitro transcript (in vitro transcript) mRNA; And (b) the in vitro transcript (in vitro transcript) to the template DNA for mRNA production comprising a promoter to which RNA polymerase binds for transcription of the DNA sequence corresponding to the mRNA it's about
  • the promoter may be characterized in that it is selected from the group consisting of T7 promoter, T3 promoter and SP6 promoter.
  • the template DNA may be characterized in that it comprises a restriction enzyme recognition site linked to the poly A tail.
  • the restriction enzyme recognition site is preferably a sequence such that the end of the in vitro transcript mRNA poly A tail ends with adenine (A) during restriction enzyme treatment, and the restriction enzyme is preferably Nhe I or SapI. .
  • RNA is synthesized in vitro by T7, SP6, or T3 RNA polymerase using the enzymatically truncated and linearized DNA as a template, live viruses or microorganisms used in the production of general live or dead vaccines can be directly handled. no need. Moreover, yeast, E. coli, and insect cell cultures that must be used for the production of recombinant vaccines (recombinant proteins) are unnecessary.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for a vaccine comprising the in vitro transcript mRNA.
  • the in vitro transcript mRNA of the present invention includes a target gene, therapeutically active protein or peptide, adjuvant protein, antigen, tumor antigen, pathogenic antigen, animal antigen, viral antigen, protozoan antigen, bacteria Sex antigens, allergens, autoimmune antigens, allergens, antibodies, immunostimulatory proteins or peptides, or genes encoding antigen-specific T-cell receptors, etc. may be inserted, and depending on the type of the inserted gene, self It can be used as a genetic vaccine for immune diseases, infectious diseases, cancer or tumor-related diseases, inflammatory diseases, and the like.
  • the present invention relates to a method for preventing or treating a disease comprising administering the in vitro transcript mRNA.
  • the present invention also relates to the use of said in vitro transcript mRNA for the prevention or treatment of a disease.
  • the present invention also relates to the use of said in vitro transcript mRNA for the prevention or treatment of a disease.
  • the in vitro transcript mRNA platform is an innovative vaccine production technology that will completely change the current vaccine production method. Recently, new viruses such as MERS virus and Corona-19 or Zika virus have existed in the past, but there are many cases of sudden outbreaks of viruses that cause problems. However, it is practically impossible to always prepare a vaccine for all these infectious agents.
  • In vitro transcript mRNA is the only production platform that best meets these crisis response vaccine conditions. In the production of mRNA, with only a very small amount of template DNA, 300,000 doses, the national essential amount, can be produced within 1 to 2 weeks. This is because a biological reactor is not required for in vitro production of mRNA, and it is the only vaccine production platform that can produce a vaccine by synthetically processing all relevant genes without the need to directly deal with the infectious agent.
  • a template plasmid DNA (template pDNA) required as a template for in vitro Trinscript mRNA production was prepared.
  • the target protein gene was a tomato fluorescent protein gene.
  • the target protein gene was amplified by PCR using the pTdTomato-N1 vector containing the tomato fluorescent protein gene (SEQ ID NO: 1) as a template.
  • primers 20 bp of both ends of the target protein gene were used as annealing sites, and PCR primers designed to add EcoRI recognition sequence-Kozak sequence and HindIII recognition sequence to both ends were used.
  • reverse primer 5' at aagctt ttacttgtacagctcgtcca 3' (SEQ ID NO: 4)
  • the tomato fluorescent protein gene amplified by electrophoresis was identified, and purified using MEGAquick-spinTM plus Fragment DNA Purification Kit (iNtRON).
  • the in vitro transcription template pDNA (SEQ ID NO: 2) and the corresponding tomato fluorescent protein DNA were digested using the enzymes EcoRI and HindIII (Thermofisher), purified with MEGAquick-spinTM plus Fragment DNA Purification Kit, and then T4 ligase ( Enzynomics) was used for the ligation reaction.
  • the plasmid was transformed into a DH5 ⁇ competent cell, incubated at 37 °C overnight, pDNA was isolated from the cultured colonies, and the template pDNA sequence was confirmed through sequencing service (Cosmogene Tech). .
  • transcript mRNA (transcript mRNA) was synthesized in vitro using T7 RNA polymerase using the template plasmid DNA prepared in Example 1 as a template.
  • the template plasmid DNA was linearized by cutting immediately after the poly (A) tail using NheI or SapI restriction enzyme (Thermofisher Scientific), and purified using MEGAquick-SpinTM plus Fragment DNA Purification Kit (Intron) to obtain template DNA and , In vitro transcription was performed using the obtained template DNA (FIG. 2).
  • ARCA-RNA is prepared using mMESSAGE mMACHINETM T7 ULTRA Transcription kit (Thermofisher Scientific). synthesized.
  • the LiCl purification method is as follows: A mixture of 7.5 M LiCl solution (Thermofisher) and nuclease-free purified water with RNA solution 1:1:1 was reacted at -20°C for 30 minutes, followed by 15 at 13000 rpm. Centrifuged for minutes. The supernatant was removed, and 70% ethanol was added, followed by centrifugation at 13000 rpm for 5 minutes. After removing the supernatant, the RNA pellet was dissolved in nuclease-free purified water to obtain purified RNA.
  • Example 3 mRNA introduction into mammalian cells and confirmation of target protein expression
  • 293T cells (ATCC CRL-3216) were seeded to 70-80% confluent in 6-well plates, and then cultured overnight in DMEM/HIGH GLUCOSE (HyCloneTM) medium.
  • the cell culture medium of 293T cells cultured in the 6-well plate was replaced with DMEM/HIGH GLUCOSE (HyCloneTM) medium without serum and antibiotics, and then the mixed solution was added. After 4 hours, the culture medium was changed to a medium containing 10% Fetal Bovine Serum (HyCloneTM) and 1% antibiotics (HyCloneTM) and cultured for 24 hours. After incubation for 24 hours, the cells were washed with DPBS, and then RIPA buffer (Biosesang, Korea) containing a protase inhibitor (Roche, Basel, Swiss) was added and the cells were lysed at 4°C for 30 minutes.
  • 293T cells (ATCC CRL-3216) were seeded to 70-80% confluent in 6-well plates, and then cultured overnight.
  • the cell culture medium of 293T cells cultured in the 6-well plate was replaced with DMEM/HIGH GLUCOSE (HyCloneTM) medium without serum and antibiotics, and then the mixed solution was added.
  • Cell culture plates were placed in IncuCyteTM (Sartorius, Germany) and red fluorescence was measured every hour. After 4 hours, the culture medium was changed to a medium containing 10% Fetal Bovine Serum (HyCloneTM) and 1% antibiotics (HyCloneTM) and cultured for 48 hours.
  • the poly (A) tail is a component located at the 3' end of the in vitro transcript mRNA of the present invention. Together with 5'-Cap, it serves to protect mRNA from enzymatic degradation, and it is known that mRNA stability is deteriorated if the length is insufficient.
  • the poly A tail also affects translation.
  • Poly (A) binding protein (PABP) a protein that binds to the poly A tail, binds to eukaryote translation initiation factor 4 G (elF4G) during the initiation of translation and attaches the 40S ribosomal subunit to mRNA.
  • template DNAs having A 0 , A 30 and A 120 tails including 0, 30, and 120 adenines, respectively, including A 33 C 18 were prepared.
  • mRNA was synthesized by performing in vitro transcription and Cap-1 capping in the same manner as in Example 2, and in the same manner as in Example 3, the expression level of the target protein in 293T cells was compared. did.
  • IgM-D4 expression was not confirmed in the A 0 tail, and it was confirmed that the expression was well in the order of A 120 tail, A 30 tail, and A 33 C 18 tail. This is considered to be because the longer the tail, the longer the A tail disappears due to deadenylation, resulting in relatively high stability, and as the length increases, the PABP protein binds better, thereby increasing the translation efficiency.
  • the poly A tail end of the mRNA produced by the restriction enzyme used for linearization of the template plasmid DNA may end with an A residue or may contain a restriction enzyme recognition site.
  • non-complete, complete end mRNA was synthesized based on a template linearized with NheI or SapI restriction enzymes, and in the same manner as in Example 3, 293T cells The expression level of the target protein was compared.
  • 5'Cap is a component located at the 5' start site of mRNA. Like the poly A tail, it is known to play a role in preventing mRNA degradation. 5'Cap also affects translation. During translation initiation, 5'Cap binds to eukaryote translation initiation factor 4 E (elF4E) to bind the 40S ribosomal subunit to mRNA.
  • elF4E eukaryote translation initiation factor 4 E
  • Example 6 Modified nucleotide substitution for in vitro transcript mRNA optimization
  • modified nucleotides can evade the innate immune sensor in the host and enhance translational activity.
  • modified CTP ((5-Methylcytidine-5'-Triphosphate (TriLink biotechnologies)
  • modified UTP ( Pseudouridine) Synthesis of in vitro transcript mRNA containing -5'-Triphosphate (TriLink biotechnologies) and N1-Methylpseudouridine-5'-Triphosphate (TriLink biotechnologies)
  • TriLink biotechnologies N1-Methylpseudouridine-5'-Triphosphate
  • the in vitro transcript mRNA containing the target gene according to the present invention When the in vitro transcript mRNA containing the target gene according to the present invention is injected into animal cells, a large amount of the target protein can be expressed in animal cells, so autoimmune diseases, infectious diseases, cancer or tumors It can be used as a genetic vaccine for related diseases and inflammatory diseases.

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Abstract

본 발명은 목적유전자의 세포 내 발현을 위한 RNA 인비트로 트랜스크립트 mRNA 및 이를 함유하는 백신용 약학조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 목적유전자를 포함하는 인비트로 트랜스크립트(in vitro transcript) mRNA를 동물세포에 주입하는 경우, 다량의 목적단백질을 동물세포에서 발현시킬 수 있어, 자가면역질환, 감염성 질환, 암 또는 종양 관련 질환, 염증성 질환 등에 대한 유전자 백신으로 사용할 수 있다.

Description

인비트로 트랜스크립트 MRNA 및 이를 함유하는 약학조성물
본 발명은 목적유전자의 세포 내 발현을 위한 인비트로 트랜스크립트 mRNA에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 목적유전자의 세포 내 발현을 위한 RNA 인비트로 트랜스크립트 mRNA 및 이를 함유하는 백신용 약학조성물에 관한 것이다.
유전자 치료법 및 유전자 백신은 의약 분야에서 이미 증명되고 일반에 적용되는 기술로, 유전적 질환뿐만 아니라 자가면역질환, 감염성 질환, 암 또는 종양 관련 질환, 염증성 질환 등도 치료대상이 될 수 있다.
유전자 백신은 타겟 유전자를 코딩하는 DNA 및 RNA를 직접 동물에 주입하면, 타겟 유전자가 살아있는 동물에서 발현하고, 이 발현에 의해 면역이 가능하다는 것이 보고되면서부터 개발되기 시작하였다(Wolff JA et al. Science, 247:1465-8, 1990).
유전자 치료 또는 유전적 백신 접종에서 DNA와 DNA가 유전자 투여를 위한 핵산 분자로서 사용될 수 있으며, DNA가 RNA에 비해 상대적으로 안정하고 다루기 쉬운 것으로 알려져 있다. 그러나, DNA의 경우, 환자의 유전체 내로 투여된 DNA-절편이 원하지 않은 위치에 삽입되어, 유전자가 손상되는 경우, 잠재적인 위험이 발생할 수 있다. 추가적으로, 원하지 않는 항-DNA 항체가 나타낼 수 있으며, 또 다른 문제점은, DNA 투여 및 이의 이후의 전사/번역에 의해 발현되는 펩타이드 또는 단백질의 발현 수준이 한정적이라는 점이다. DNA 전사를 조절하는 특정 전사 인자의 존재 여부가 투여된 DNA의 발현 수준에 주요한 영향을 미치며, 특정 전사 인자가 없는 경우에는 DNA 전사에 의해 충분한 양의 RNA가 생성되지 않아, 결과적으로, 번역되어 생성되는 펩타이드 또는 단백질의 수준도 한정된다.
반면, RNA를 유전자 투여를 위한 도구로 사용할 경우, RNA는 전사가 필요하지 않아 DNA처럼 핵으로 들어가야 할 필요없이 세포질 내에서 바로 단백질을 합성할 수 있어, 세포 염색체 내로 끼어들어가 원치 않는 유전자 손상을 일으킬 염려가 없다. 또한, DNA에 비해 반감기가 짧아 장기 유전자 변형을 유도하지 않는다(Sayour EJ, et al., J Immunother Cancer 2015;3:13, 2015). 일반적인 RNA 백신은 세포 안에 전달하게 되면 단기간 만 활성화 되어 타켓 단백질을 발현하게 되고, 수일 안에 효소학적 반응으로 인해 파괴되고, 발현한 타켓 항원(단백질)에 대한 특이적인 면역 반응은 남아있게 된다.
또한, 유전자 투여를 위한 도구로 RNA를 사용의 경우, 핵막을 통과할 필요가 없이 세포막만을 통과하면 작용하기 때문에, DNA 보다 적은 양을 사용하여도, DNA 와 같은 양의 타겟 단백질을 발현할 수 있다. 또한, RNA는 자체가 면역 보강원성을 가지고 있어, DNA에 비해 소량만 투여하여도 동일한 면역효과를 볼 수 있다.
아울러, RNA의 경우, 시험관 내에서 대량 생산이 가능하여 소규모 GMP 생산시설에서도 안전하게 생산할 수 있으며, 바이러스나 미생물의 중화항체 유도관련 에피톱의 유전자만을 합성한 후 그 부분만을 시험관 내에서 전사하여 RNA 트랜스크립트(transcript, 전사체)를 생산할 수 있다. 과거에는 이런 방식으로 대량의 RNA를 생산하는데 많은 경비와 고난이도의 기술이 필요하였으나 현재는 시험관내 전사반응의 관련 시약, 특히 DNA-의존 RNA 중합효소의 개선을 통해 소량의 DNA 주형을 이용하여 대량의 RNA를 1~2주 안에 생산할 수 있게 되었다.
유전자 백신은 기본적으로 발현하고자 하는 단백질의 유전자(DNA 혹은 RNA)를 다양한 벡터를 사용하여 동물에 접종하여 타켓 항원을 발현하는 시스템이다. 흥미로운 점은 유전자로부터 발현되는 단백질의 양은 실제로 면역원성과 직접적인 비례 관계에 있지는 않다는 점이다. 즉, 발현되는 항원이 많다고 하여 반드시 그 항원의 면역원성 또한 비례하여 증가한다는 것은 아니다. 일반적으로 유전자 백신을 동물에 주사하게 되면, 유전자 백신(DNA 혹은 RNA)이 동물 근육 세포에 다양한 방식으로 전달 감염된다. 이렇게 전달 감염된 근육 세포는 항원 특이적인 T 세포에 의해서 용해(lysis)되기 때문에 실제로 항원이 발현되는 기간이나 항원의 양은 시험관 외 세포 배양 실험에서 예측한 정도가 아니다. 따라서 어떻게 유전자 백신이 제한된 발현 양과 기간을 통해 면역 반응을 유도하는지를 정확히 이해하기 위한 추가적인 연구가 필요하다. 실제로 시험관 외 세포 배양 연구를 통해 얻어진 결과는 생체 내 동물 실험의 결과와 일치하지 않는 경우가 많다. 그 이유는 유전자 백신이 투여된 후 면역 반응에 수반되는 선천성 면역 수용체의 종 특이적 발현과 항원 인식 패턴 차이, 세포 종류별로 선천성 면역 수용체 발현양의 차이가 있기 때문이다. 알파 바이러스를 기본으로 하여 활용한 self-replicon RNA 백신이 단순히 항원 발현의 양이 많기 때문에 항원에 대한 면역원성이 높다고 설명하기 보다는 또 다른 요인의 영향일 수도 있음을 시사하고 있다(Park,JH et al.,J. Bacteriol & Virol., 46:115, 2016).
따라서, 목적유전자에 의한 우수한 면역반응을 유도하기 위해서는 투여되는 RNA에 의해 동물 세포에서 발현되는 단백질의 양과, 투여되는 RNA 전사체의 구성 및 면역에 필요한 적합한 RNA 투여량, protamine 같은 화합물을 활용한 최적의 RNA의 변형 등이 중요하다(Park,JH et al.,J. Bacteriol & Virol., 46:115, 2016).
이에, 본 발명자들은 목적 유전자를 동물세포에서 안정적으로 발현시키는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 목적유전자와 상기 목적유전자의 양 말단에 연결되는 5'-UTR과 3'-UTR, 5'-UTR에 연결되는 5' 캡(cap) 및 상기 3'-UTR에 연결되는 20~400개의 아데닌으로 구성되어 있는 폴리 A 테일을 포함하는 인비트로 트랜스크립트(in vitro transcript) mRNA를 사용하여 목적 유전자를 동물세포로 전달하는 경우, 상기 동물세포가 우수한 발현효율로 목적 단백질을 생성하는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 목적 유전자를 동물세포에서 안정적으로 발현시키기 위한 인비트로 트랜스크립트 mRNA를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 인비트로 트랜스크립트 mRNA를 제작하기 위한 DNA 주형을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 인비트로 트랜스크립트(in vitro transcript) mRNA를 포함하는 백신용 약학조성물을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 목적 펩타이드 또는 목적 단백질을 암호화하는 RNA 서열 삽입 부분; (b) 상기 목적 펩타이드 또는 목적 단백질을 암호화하는 RNA 서열의 양 말단에 연결되는 5'-UTR과 3'-UTR; (c) 5'-UTR에 연결되는 5' 캡(cap); 및 (d) 3'-UTR에 연결되는 20~400개의 아데닌을 함유하는 폴리 A 테일을 포함하는 인비트로 트랜스크립트(in vitro transcript) mRNA를 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 상기 RNA 인비트로 트랜스크립트(in vitro transcript) mRNA에 대응하는 DNA 서열을 가지는 부분; 및 (b) 상기 인비트로 트랜스크립트(in vitro transcript) mRNA에 대응하는 DNA 서열의 전사를 위하여 RNA 중합효소가 결합하는 프로모터를 포함하는 인비트로 트랜스크립트(in vitro transcript) mRNA 제작을 위한 주형 DNA를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 인비트로 트랜스크립트(in vitro transcript) mRNA를 포함하는 백신용 약학조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 인비트로 트랜스크립트(in vitro transcript) mRNA를 투여하는 단계를 포함하는 질병의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 질병의 예방 또는 치료를 위한, 상기 인비트로 트랜스크립트(in vitro transcript) mRNA의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한, 질병의 예방 또는 치료를 위한, 상기 인비트로 트랜스크립트(in vitro transcript) mRNA의 사용을 제공한다.
도 1은 본 발명에 따른 인비트로 트랜스크립트 mRNA와 주형 DNA의 구성을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 주형 플라스미드 DNA로부터 in vitro transcription을 통해 인비트로 트랜스크립트 mRNA를 합성하는 과정을 나타낸 것이다.
도 3은 인비트로 트랜스크립트 mRNA의 폴리 A 테일의 길이에 따른 목적 단백질의 발현 정도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 인비트로 트랜스크립트 mRNA의 폴리 A 테일의 말단의 모양에 따른 목적 단백질의 발현 정도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 인비트로 트랜스크립트 mRNA의 폴리 A 테일의 non-A residue 혼합에 따른 목적 단백질의 발현 정도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 인비트로 트랜스크립트 mRNA의 캡(cap) 종류에 따른 목적 단백질의 발현 정도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7 A는 인비트로 트랜스크립트 mRNA의 뉴클레오티드를 변형 뉴클레오티드로 치환하여 목적 단백질의 발현 정도를 확인한 결과를 나타낸 것이고, B는 non-A residue 혼합 폴리 A 테일의 non-A residue를 변형 뉴클레오티드로 치환하여 목적 단백질의 발현 정도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
종래 유전자 치료기술 들이 이미 향상된 mRNA 안정화 및 번역활성을 위한 수단 등을 제공하고 있지만, RNA 기반 플랫폼의 낮은 안정성에 대한 문제가 아직 남아있다. 따라서, 생체 내에서 암호화된 단백질의 더 나은 발현율을 제공하게 하는 향상된 mRNA 안정성 및 번역활성을 위한 플랫폼 개발이 필요하며, 본 발명에서는 발명은 (a) 목적 펩타이드 또는 목적 단백질을 암호화하는 RNA 서열 삽입 부분; (b) 상기 목적 펩타이드 또는 목적 단백질을 암호화하는 RNA 서열의 양 말단에 연결되는 5'-UTR과 3'-UTR; (c) 5'-UTR에 연결되는 5' 캡(cap); 및 (d) 3'-UTR에 연결되는 20~400개의 아데닌을 함유하는 폴리 A 테일 을 포함하는 인비트로 트랜스크립트(in vitro transcript) mRNA를 개발하였다(도 1). 본 발명의 방법으로 제작한, 아데닌을 120개 포함하는 폴리 A 테일(A120)을 가지는 인비트로 트랜스크립트 mRNA의 경우, A33C18, A0, A30 테일을 가지는 mRNA에 비하여, 투여된 동물세포 내에서 안정적으로 높은 목적 단백질을 발현율을 나타내었다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 본 발명은 발명은 (a) 목적 펩타이드 또는 목적 단백질을 암호화하는 RNA 서열 삽입 부분; (b) 상기 목적 펩타이드 또는 목적 단백질을 암호화하는 RNA 서열의 양 말단에 연결되는 5'-UTR과 3'-UTR;
(c) 5'-UTR에 연결되는 5' 캡(cap); 및 (d) 3'-UTR에 연결되는 20~400개의 아데닌을 함유하는 폴리 A 테일을 포함하는 인비트로 트랜스크립트(in vitro transcript) mRNA에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 목적유전자는 치료적으로 활성인 단백질 또는 펩타이드, 애쥬반트 단백질, 항원, 종양 항원, 병원성 항원, 동물 항원, 바이러스성 항원, 원생동물성 항원, 박테리아성 항원, 알레르기성 항원, 자가면역 항원, 알레르겐, 항체, 면역자극성 단백질 또는 펩타이드 또는 항원-특이적 T-세포 수용체를 암호화하는 유전자인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 5' 캡(cap)은 mRNA의 5' 시작 부위에 위치한 구성요소이다. 상기 Cap 구조는 단백질 합성을 개시하고 핵산분해효소의 작용으로부터 mRNA를 보호하는 역할을 한다. 또한 5'Cap은 번역에도 영향을 준다. 번역 시작 과정에서 5' 캡(cap)은 elF4E(eukaryote translation initiation factor 4 E)와 결합하여 40S 리보솜 서브유닛을 mRNA에 결합시킨다.
본 발명에 있어서, 상기 5' 캡(cap)은 Cap-1 또는 ARCA(anti-reverse cap analog)인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서는 캡핑(capping)과 전사를 동시에 수행하는 코-트랜스크립셔널 캡핑 방법을 사용하여 트랜스크립트(전사체)를 제작하는 경우, mMESSAGE mMACHINETM T7 ULTRA Transcription kit (Thermofisher Scientific)를 사용하여 ARCA-RNA를 합성하였다.
아울러, 전사 후 캡핑(Post-transcriptional capping) 방법을 사용하는 경우는 MEGAscriptTM T7 transcription kit(Thermofisher Scientific)를 사용하여 uncapped-RNA를 합성하였다.
본 발명에서는 동물세포로의 목적유전자의 전달 및 발현을 위한 인비트로 트랜스크립트 mRNA의 플랫폼에 최적화된 5'Cap을 결정하고자 uncapped, Cap-0, Cap-1, ARCA를 가진 인비트로 트랜스크립트 mRNA를 합성하여, 293T 세포에서의 목적 단백질의 발현 정도를 비교하였으며, ACRA 및 Cap-1의 발현효율이 가장 우수한 것을 확인할 수 있었다(도 6). 그러나, ARCA와 같이 GTP 비율을 낮추고 cap 아날로그 비율을 높여 in vitro transcription과 동시에 캐핑(capping)을 하는 방법의 경우, uncapped RNA가 합성될 수 있다. 이는 선천성 면역(innate immunity)을 유발할 수 있기 때문에, 인비트로 트랜스크립트 mRNA의 플랫폼에는 효소를 이용한 전사 후 캡핑 시스템인 Cap-1이 더 적합한 것으로 판단하였다.
본 발명에 있어서, 상기 목적유전자의 시작코돈의 상부에는 코작(Kozak) 서열이 추가되는 것이 바람직하며, 상기 목적유전자는 숙주세포에 대하여 코돈 최적화(codon optimization)된 서열을 가지는 것이 바람직하다.
상기 폴리 (A) 테일(poly(A) tail)은 본 발명의 인비트로 트랜스크립트 mRNA의 3' 말단에 위치하는 구성요소이다. 5'-Cap과 함께 mRNA를 효소분해로부터 보호하는 역할을 하며, 그 길이가 충분하지 않을 경우 mRNA의 안정성이 떨어진다고 알려져있다. 폴리 A 테일은 번역(translation)에도 영향을 준다. 폴리 A 테일에 결합하는 단백질인 PABP(Poly(A) binding protein)는 번역의 시작과정에서 elF4G(eukaryote translation initiation factor 4 G)와 결합하여 40S 리보좀 서브유닛을 mRNA에 부착시킨다.
본 발명에 있어서, 상기 폴리 A 테일은 20~400개의 아데닌으로 구성되어 있는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 30~200개의 아데닌으로 구성될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 60~150개의 아데닌으로 구성될 수 있으며, 더더욱 바람직하게는 100~130개의 아데닌으로 구성될 수 있다.
본 발명의 일 양태에서는 폴리 A 테일의 다양한 길이에 따른 mRNA의 번역 효율을 비교하기 위해, 기존 A33C18을 포함하여 아데닌을 각각 0개, 30개, 120개 포함하는 A0, A30 및 A120 테일을 갖는 주형 DNA를 제작한 후, 인비트로 트랜스크립션을 통해 생성된 mRNA를 293T 세포에 도입하여 목적 단백질의 발현 정도를 비교하였다. 그 결과, A0 테일에서는 IgM-D4 발현이 확인되지 않았고, A120 테일, A30 테일, A33C18 테일 순으로 발현이 잘 되는 것을 확인할 수 있었다(도 3).
본 발명에 있어서, 상기 폴리 A 테일은 우라실(U), 시토신(C) 및 구아닌(G)으로 구성되는 군에서 선택되는 아데닌 이외의 하나 이상의 뉴클레오티드가 복수개의 아데닌 사이에 삽입되어 있는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 삽입되는 아데닌 이외의 뉴클레오티드는 2 내지 20개, 바람직하게는 4 내지 15개, 더욱 바람직하게는 6 내지 12개, 가장 바람직하게는 8 내지 10개의 아데닌 사이에 삽입되는 것을 특징으로 할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 양태에서는 non-A residue가 섞인 혼합 테일의 번역 효율을 비교하기 위해, 오리지널 A120 테일, A120-G 혼합 테일, A120-C 혼합 테일, A120-U 혼합 테일을 주형 DNA를 제작하였다. 각 주형을 바탕으로 인비트로 트랜스크립트 mRNA를 합성하고, 실시예 3과 동일한 방법으로, 293T 세포에서의 목적 단백질의 발현 정도를 비교하였다. 그 결과, U 혼합 테일의 mRNA의 발현 효율이 가장 우수한 것을 확인할 수 있었다.
본 발명에 있어서, 상기 폴리 A 테일의 말단은 아데닌인 것을 특징으로 할 수 있다.
in vitro transcription시 선형화된 DNA 주형을 사용하기 때문에, 주형 플라스미드 DNA 선형화를 위해 사용되는 제한효소에 따라 만들어진 mRNA의 폴리 A 테일 말단이 A 잔기로 끝날 수도 있고, 제한효소 인식부위를 포함할 수도 있다.
Figure PCTKR2021003281-appb-I000001
폴리(A) 테일의 말단 모양에 따른 번역 정도를 비교하기 위해, NheI 또는 SapI 제한효소로 선형화시킨 주형을 바탕으로 non-complete, complete end mRNA를 합성하여, 목적 단백질의 발현 정도를 비교하였다. 그 결과, 말단이 온전히 A 로 끝나는 테일을 갖는 mRNA의 발현 능력이 더 우수한 것을 확인할 수 있었다(도 4).
본 발명에 있어서, 상기 인비트로 트랜스크립트(in vitro transcript) mRNA 서열의 우라실(U)의 전체 또는 일부가 변형된 U(modified U)로 치환되어 있는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 변형된 UTP는 pseudo UTP 또는 N1-methylpeudo UTP인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 폴리 A 테일은 변형된 U(modified U)가 복수개의 아데닌 사이에 삽입되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서는 동물세포로의 목적유전자의 전달 및 발현을 위한 인비트로 트랜스크립트 mRNA의 플랫폼에 적합한 변형 뉴클레오티드를 정하기 위해, modified CTP, UTP를 포함하는 인비트로 트랜스크립트 mRNA를 합성하여, 293T 세포에서의 목적 단백질의 발현 정도를 비교하였다.
그 결과, modified UTP를 단일로 사용하여 mRNA의 U를 modified U로 100% 치환한 mRNA의 단백질 발현율이 가장 높은 것을 확인할 수 있었다(도 7). 아울러, 단백질 발현률이 우수하였던 U 혼합 테일과 접목시킨다면 시너지 효과를 나타낼 수 있을 것으로 판단되어, 추가적으로 modified UTP를 사용하여 mixed tail을 비교하였고 그 결과, U-mixed tail에서의 단백질 발현이 가장 우수한 것을 확인할 수 있었다.
다른 관점에서, 본 발명은 (a) 상기 RNA 인비트로 트랜스크립트(in vitro transcript) mRNA에 대응하는 DNA 서열을 가지는 부분; 및 (b) 상기 인비트로 트랜스크립트(in vitro transcript) mRNA에 대응하는 DNA 서열의 전사를 위하여 RNA 중합효소가 결합하는 프로모터를 포함하는 인비트로 트랜스크립트(in vitro transcript) mRNA 제작을 위한 주형 DNA에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 프로모터는 T7 프로모터, T3 프로모터 및 SP6 프로모터로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 주형 DNA는 폴리 A 테일과 연결되는 제한효소 인식 부위를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 제한효소 인식부위는 제한효소 처리 시 인비트로 트랜스크립트 mRNA 폴리 A 테일의 말단을 아데닌(A)으로 끝나도록 하는 서열인 것이 바람직하며, 상기 제한효소는 바람직하게는 Nhe I 또는 SapI인 것이 바람직하다.
본 발명의 인비트로 트랜스크립트 mRNA를을 제작하기 위해서는 일반적인 시험관내 전사반응을 통해 mRNA를 생산하기 때문에 모든 제작 공정을 시험관 내(in vitro)에서 수행하게 된다. 즉, 효소적으로 말단이 절단되어 선형화된 DNA를 주형으로 이용하여 T7, SP6, 혹은 T3 RNA polymerase에 의해서 RNA를 시험관에서 합성하기 때문에 일반적인 생백신이나 사백신 제조에 사용 하는 살아 있는 바이러스나 미생물을 직접 다룰 필요가 없다. 더구나 재조합 백신(재조합 단백질) 생산을 위해 반드시 사용해야 하는 효모, 대장균, 곤충 세포 배양 등이 불필요하다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 인비트로 트랜스크립트(in vitro transcript) mRNA를 포함하는 백신용 약학조성물에 관한 것이다.
본 발명의 인비트로 트랜스크립트(in vitro transcript) mRNA에는 목적유전자로 치료적으로 활성인 단백질 또는 펩타이드, 애쥬반트 단백질, 항원, 종양 항원, 병원성 항원, 동물 항원, 바이러스성 항원, 원생동물성 항원, 박테리아성 항원, 알레르기성 항원, 자가면역 항원, 알레르겐, 항체, 면역자극성 단백질 또는 펩타이드 또는 항원-특이적 T-세포 수용체를 암호화하는 유전자 등이 삽입될 수 있으며, 상기 삽입된 유전자의 종류에 따라, 자가면역질환, 감염성 질환, 암 또는 종양 관련 질환, 염증성 질환 등에 대한 유전자 백신으로 사용할 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 인비트로 트랜스크립트(in vitro transcript) mRNA를 투여하는 단계를 포함하는 질병의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 또한, 질병의 예방 또는 치료를 위한, 상기 인비트로 트랜스크립트(in vitro transcript) mRNA의 용도에 관한 것이다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 또한, 질병의 예방 또는 치료를 위한, 상기 인비트로 트랜스크립트(in vitro transcript) mRNA의 사용을 관한 것이다.
인비트로 트랜스크립트(in vitro transcript) mRNA 플랫폼은 현재의 백신 생산 법을 완전히 새롭게 변화시킬 혁신적인 백신 생산 기술이다. 최근 들어 메르스 바이러스, 코로나-19 같은 신변종 바이러스나 지카 바이러스 같이 과거부터 존재하였으나 갑자기 문제를 야기하는 바이러스들이 새롭게 발생하는 경우가 많다. 하지만 이러한 모든 감염원에 대해서 항상 백신을 준비하는 것은 현실적으로 불가능한 일이다. 이러한 위기 대응 백신 조건에 가장 부합하는 생산 플랫폼은 인비트로 트랜스크립트(in vitro transcript) mRNA가 유일하다. mRNA의 생산은 매우 소량의 주형 DNA 만을 가지고 있으면 1~2주 안으로 국가 필수 필요량인 30만 도스를 생산할 수 있다. mRNA의 인비트로 생산에는 생물학적 반응기가 불필요하며, 감염원을 직접 다룰 필요가 없이 모든 관련 유전자를 합성으로 처리하여 백신을 생산할 수 있는 유일한 백신 생산 플랫폼이기 때문이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 주형 DNA의 제작
인비트로 트린스크립트 mRNA제작을 위하여 주형으로 필요한 주형 플라스미드 DNA(주형 pDNA)를 제작하였다. 목적단백질 유전자는 토마토 형광 단백질 유전자를 사용하였다.
주형 pDNA에 목적 단백질 유전자를 삽입하기 위해, 토마토 형광 단백질 유전자(서열번호 1)를 포함하는 pTdTomato-N1 벡터를 주형으로 하여 목적 단백질 유전자를 PCR로 증폭시켰다.
프라이머 디자인 시 목적 단백질 유전자의 양 끝 20 bp를 annealing site로 사용하며, 양 끝에 EcoRI 인식서열-Kozak 서열, HindIII 인식서열이 추가되도록 디자인된 PCR용 프라이머를 사용하였다.
- forward primer : 5' at gaattc gccacc atggtgagcaagggcgagga 3'(서열번호 3)
reverse primer : 5' at aagctt ttacttgtacagctcgtcca 3'(서열번호 4)
PCR 반응을 수행 후, 전기영동으로 증폭된 tomato 형광단백질 유전자를 확인하고, MEGAquick-spinTM plus Fragment DNA Purification Kit(iNtRON)을 사용하여 정제하였다. 그 다음, in vitro transcription template pDNA(서열번호 2)와 해당 tomato 형광단백질 DNA를 재한효소 EcoRI과 HindIII (Thermofisher)을 사용하여 절단 한 후, MEGAquick-spinTM plus Fragment DNA Purification Kit로 정제한 다음 T4 ligase(Enzynomics)를 이용하여 라이게이션 반응을 진행하였다.
라이게이션 후, 플라스미드를 DH5α 컴피던트 셀에 트랜스포메이션 후, 37 ℃에서 하룻밤 배양 후, 배양된 콜로니에서 pDNA 분리하여, 염기서열 분석(sequencing service, 코스모진텍)을 통해 주형 pDNA 서열을 확인하였다.
실시예 2: mRNA의 인비트로(in vitro) 합성
인비트로 트랜스크립트 mRNA(전사체 mRNA)는 실시예 1에서 제작한 주형 플라스미드 DNA를 주형으로 사용하여 T7 RNA 중합효소를 통해서 in vitro에서 합성하였다.
먼저 주형 플라스미드 DNA를 NheI 또는 SapI 제한효소(Thermofisher Scientific)를 사용하여 폴리 (A) 테일 직후를 잘라 선형화하고, MEGAquick-SpinTM plus Fragment DNA Purification Kit(Intron)를 사용하여 정제하여, 주형 DNA를 수득하고, 상기 수득된 주형 DNA를 이용하여 인비트로 트랜스크립션(In vitro transcription)을 수행하였다(도 2).
먼저, 캡핑(capping)과 전사를 동시에 수행하는 코-트랜스크립셔널 캡핑 방법을 사용하여 트랜스크립트(전사체)를 제작하는 경우, mMESSAGE mMACHINETM T7 ULTRA Transcription kit (Thermofisher Scientific)를 사용하여 ARCA-RNA를 합성하였다.
전사 후 캡핑(Post-transcriptional capping) 방법을 사용하는 경우는 MEGAscriptTM T7 transcription kit(Thermofisher Scientific)를 사용하여 uncapped-RNA를 합성하였다. 키트의 프로토콜을 따라 실험을 진행하였으며, 실험 방법은 다음과 같다.
선형화한 주형 DNA 1 μg에 키트별 용액들을 표 1 또는 표 2와 같이 넣고 최종 부피를 20μL의 혼합용액(mixed solution)을 제조하였다. 5-methyl-CTP, pseudo-UTP, and N1-methylpseudo-UTP (TriLink)와 같은 변형 뉴클레오티드를 사용할 경우, 농도를 고려하여 해당 뉴클레오티드를 변형 뉴클레오티드로 100% 치환하여 사용하였다.
Figure PCTKR2021003281-appb-T000001
Figure PCTKR2021003281-appb-T000002
상기 제조된 혼합 용액을 37 ℃에서 하룻밤 반응시킨 후, DNase 1μL를 첨가하여 37 ℃에서 15분 반응시키고, 끝으로, Lithium chloride*를 이용하여 합성된 인비트로 트랜스크립트 RNA(서열번호 5)를 정제하였다.
합성된 uncapped-RNA에 Cap-0, Cap-1를 캡핑(capping)할 경우, 각각 ScriptCapTM M7G Capping System kit(CELLSCRIPT)와 ScriptCapTM Cap-1 Capping System kit (CELLSCRIPT)를 사용하였으며, 제조사의 프로토콜을 따라 실험을 진행하였다. 실험 방법은 다음과 같다.
Uncapped-RNA 55μg을 최종 부피 68.5μL 또는 67μL로 희석하여 65℃ 10 분간 반응시키고, 반응 후 얼음에서 냉각시키고, 표 3 및 표 4와 같이 프리믹스를 제조하였다.
Figure PCTKR2021003281-appb-T000003
Figure PCTKR2021003281-appb-T000004
상기 제조한 프리믹스 용액에 uncapped-RNA를 넣고 37℃에서 30분간 반응을 진행한 후, 리튬클로라이드(LiCl)을 이용하여 Cap-0, Cap-1-RNA를 정제하였다.
LiCl 정제방법은 다음과 같다:7.5 M LiCl 용액 (Thermofisher) 및 뉴클레이즈-프리 정제수를 RNA 용액과 1:1:1로 혼합한 혼합액을 -20℃에서 30분간 반응시킨 후, 13000 rpm에서 15분간 원심분리하였다. 상등액을 제거하고, 70% 에탄올을 첨가한 후 13000 rpm에서 5분간 원심분리하고, 상등액을 제거한 후, RNA 펠렛을 뉴클레이즈-프리 정제수에 녹여, 정제된 RNA를 수득하였다.
실시예 3: 포유동물 세포로의 mRNA 도입 및 목적 단백질 발현 확인
293T 세포(ATCC　CRL-3216)를 6웰 플레이트에 70~80% 컴플루언트하게 시딩한 다음, DMEM/HIGH GLUCOSE (HyCloneTM) 배지에서 하룻밤 배양하였다. 실시예 2에서 수득한 인비트로 트랜스크립트 mRNA 2.5μg과 5μL의 Lipofectamine TM2000 (Thermofisher scientific, USA)을 각각 Opti-MEMTM(Thermofisher scientific, USA) 200μL에 섞고 10분간 실온에서 반응시킨 후, 두 용액을 혼합하여 혼햅용액을 만든 후, 실온에서 5분간 반응시켰다.
상기 6웰 플레이트에 배양된 293T 세포의 세포 배양액을 serum과 항생제가 첨가되지 않은 DMEM/HIGH GLUCOSE (HyCloneTM) 배지로 갈아준 다음, 상기 혼합 용액을 첨가하였다. 4시간 후, 배양액을 10% Fetal Bovine Serum(HyCloneTM)와 1% antibiotics(HyCloneTM)를 첨가한 배지로 갈아준 다음 24시간 배양하였다. 24시간 배양 후, 세포들을 DPBS로 세척한 다음, 프로테이즈 저해제(Roche, Basel, Swiss)를 포함하는 RIPA buffer(Biosesang, 한국)를 첨가하고 4 ℃에서 30분간 세포를 용해시켰다. 세포 용해 후, 13000 rpm에서 30분 원심분리하여 상등액을 분리하고, BCA 어세이를 통해 단백질을 정량하였다. 정량한 각 용해물 샘플에 5X SDS-PAGE 샘플버퍼를 넣고 100 ℃에서 10분간 끓였다. SDS-PAGE를 통해 단백질을 크기별로 분리한 다음 PVDF 막으로 트랜스퍼하고, 5% BSA + 5% skim milk (in phosphate-buffer containing 0.1% Tween-20) 10 mL 첨가하고 4℃에서 하룻밤 반응시켰다. 그 후, anti PA-D4 항체 (ABION, Seoul, South Korea, in dilution buffer, 5% skim milk in phosphate buffer containing 0.1% Tween-20)의 1:5000 희석용액 10 mL를 넣고 실온에서 3시간 반응시켰다. 0.1% Tween-20 인산버퍼로 세척한 다음, 막에 HRP conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)(Thermofisher scientific, MA, USA)을 넣고 실온에서 1시간 반응시켰다. 마지막으로, 세척 후 EZ-Western Lumi Femto(DOGEN, Seoul, South Korea) 용액을 통해 현상하여 인비트로 트랜스크립트 mRNA로부터 발현된 목적 단백질 밴드를 확인하였다.
실시예 4: 리얼타임 형광 분석을 이용한 발현 확인 방법
293T 세포(ATCC　CRL-3216)를 6웰 플레이트에 70~80% 컴플루언트하게 시딩한 다음, 하룻밤 배양하였다. 실시예 2에서 수득한 인비트로 트랜스크립트 mRNA 2.5μg과 5μL의 Lipofectamine TM2000 (Thermofisher scientific, USA)을 각각 Opti-MEMTM(Thermofisher scientific, USA) 200μL에 섞고 10분간 실온에서 반응시킨 후, 두 용액을 혼합하여 혼햅용액을 만든 후, 실온에서 5분간 반응시켰다.
상기 6웰 플레이트에 배양된 293T 세포의 세포 배양액을 serum과 항생제가 첨가되지 않은 DMEM/HIGH GLUCOSE (HyCloneTM) 배지로 갈아준 다음, 상기 혼합 용액을 첨가하였다. 세포 배양 플레이트를 IncuCyteTM(Sartorius, Germany)에 넣고 1시간 마다 적색 형광을 측정하였다. 4시간 후, 배양액을 10% Fetal Bovine Serum(HyCloneTM)와 1% antibiotics(HyCloneTM)를 첨가한 배지로 갈아준 다음 48시간 배양하였다.
실시예 5: 인비트로 트랜스크립트 mRNA의 폴리 A 테일의 최적화
폴리 (A) 테일(poly(A) tail)은 본 발명의 인비트로 트랜스크립트 mRNA의 3' 말단에 위치하는 구성요소이다. 5'-Cap과 함께 mRNA를 효소분해로부터 보호하는 역할을 하며, 그 길이가 충분하지 않을 경우 mRNA의 안정성이 떨어진다고 알려져있다. 폴리 A 테일은 번역(translation)에도 영향을 준다. 폴리 A 테일에 결합하는 단백질인 PABP(Poly(A) binding protein)는 번역의 시작과정에서 elF4G(eukaryote translation initiation factor 4 G)와 결합하여 40S 리보좀 서브유닛을 mRNA에 부착시킨다.
동물세포로의 목적유전자의 전달 및 발현을 위한 인비트로 트랜스크립트 mRNA의 플랫폼에 최적화된 폴리 A 테일을 결정하고자, 1) 폴리 A 테일의 길이, 2) 말단의 모양, 3) A가 아닌 잔기의 혼합 유무에 따른 다양한 mRNA를 in vitro transcription을 통해 생산하여 목적 단백질의 발현 수준을 비교하였다.
1) 폴리 A 테일의 길이
다양한 길이에 따른 mRNA의 번역 효율을 비교하기 위해, 기존 A33C18을 포함하여 아데닌을 각각 0개, 30개, 120개 포함하는 A0, A30 및 A120 테일을 갖는 주형 DNA를 제작하였다. 각 주형 DNA를 바탕으로 실시예 2와 동일한 방법으로 인비트로 트랜스크립션 및 Cap-1 캡핑을 수행하여 mRNA를 합성하고, 실시예 3과 동일한 방법으로, 293T 세포에서의 목적 단백질의 발현 정도를 비교하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, A0 테일에서는 IgM-D4 발현이 확인되지 않았고, A120 테일, A30 테일, A33C18 테일 순으로 발현이 잘 되는 것을 확인할 수 있었다. 이는 테일의 길이가 길수록 디아데닐레이션(deadenylation)으로 인해 A 테일이 사라지는 시간이 오래 걸려 비교적 안정성이 높고, 길이가 길어짐에 따라 PABP 단백질이 더 잘 결합하여, 번역 효율이 증가되기 때문이라고 판단된다.
2) 말단 모양
in vitro transcription시 선형화된 DNA 주형을 사용하기 때문에, 주형 플라스미드 DNA 선형화를 위해 사용되는 제한효소에 따라 만들어진 mRNA의 폴리 A 테일 말단이 A 잔기로 끝날수도, 제한효소 인식부위를 포함할수도 있다.
Figure PCTKR2021003281-appb-I000002
폴리(A) 테일의 말단 모양에 따른 번역 정도를 비교하기 위해, NheI 또는 SapI 제한효소로 선형화시킨 주형을 바탕으로 non-complete, complete end mRNA를 합성하여, 실시예 3과 동일한 방법으로, 293T 세포에서의 목적 단백질의 발현 정도를 비교하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 말단이 온전히 A 로 끝나는 테일을 갖는 mRNA의 발현 능력이 더 우수한 것을 확인할 수 있었다. 제한효소 인식부위의 일부를 포함하는 non-complete 테일은 complete 폴리 A 테일과 달리 3'->5'엑소뉴클레이즈를 제대로 막지 못하기 때문이라고 판단된다.
3) 아데닌이 아닌 NT(non-A residue)의 혼합
TENT4A, 4B에 의해 A 테일에 생긴 non-A residue가 디아데닐레이즈 작용을 방해한다는 논문을 참고하여, non-A residue가 섞인 혼합 테일의 번역 효율을 비교하기 위해, 오리지널 A120 테일, A120-G 혼합 테일, A120-C 혼합 테일, A120-U 혼합 ㅌ테일을 주형 DNA를 제작하였다. 각 주형을 바탕으로 인비트로 트랜스크립트 mRNA를 합성하고, 실시예 3과 동일한 방법으로, 293T 세포에서의 목적 단백질의 발현 정도를 비교하였다.
그 결과, U 혼합 테일 mRNA의 발현 효율이 가장 우수한 것을 확인할 수 있었다. G, C 혼합 테일과 오리지널 테일의 경우는 리얼타임 형광 검출 결과에서는 일관적으로 오리지널 테일의 발현효율이 가장 안좋은 것으로 나타났으나, 웨스턴 블럿 결과에서는 일관적으로 나타나지 않았다. 그러나, 모든 실험에서 A120-U 혼합 테일의 발현 효율이 가장 우수하게 나타나, 폴리 A 테일에 non-A residue가 존재할 경우 디아데닐레이즈 작용이 저해되며 U가 가장 잘 저해하는 것으로 판단된다.
실시예 6: 인비트로 트랜스크립트 mRNA의 5'-Cap의 최적화
5'Cap은 mRNA의 5'시작부위에 위치한 구성요소이다. 폴리 A 테일과 마찬가지로 mRNA 분해를 방지하는 역할을 한다고 알려져 있다. 또한 5'Cap은 번역에도 영향을 준다. 번역 시작 과정에서 5'Cap은 elF4E(eukaryote translation initiation factor 4 E)와 결합하여 40S 리보솜 서브유닛을 mRNA에 결합시킨다.
동물세포로의 목적유전자의 전달 및 발현을 위한 인비트로 트랜스크립트 mRNA의 플랫폼에 최적화된 5'Cap을 결정하고자 uncapped, Cap-0, Cap-1, ARCA를 가진 인비트로 트랜스크립트 mRNA를 합성하여, 실시예 3과 동일한 방법으로, 293T 세포에서의 목적 단백질의 발현 정도를 비교하였다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, ACRA 및 Cap-1의 발현효율이 가장 우수한 것을 확인할 수 있었다. 그러나, ARCA와 같이 GTP 비율을 낮추고 cap 아날로그 비율을 높여 in vitro transcription과 동시에 캐핑(capping)을 하는 방법의 경우, uncapped RNA가 합성될 수 있다. 이는 선천성 면역(innate immunity)을 유발할 수 있기 때문에, 인비트로 트랜스크립트 mRNA의 플랫폼에는 효소를 이용한 전사 후 캡핑 시스템인 Cap-1이 더 적합한 것으로 판단하였다.
실시예 6: 인비트로 트랜스크립트 mRNA 최적화를 위한 변형 뉴클레오티드(modified nucleotide)치환
변형 뉴클레오티드를 사용하는 것은 호스트 내의 선천성 면역 센서(innate immune sensor)를 피할 수 있으며 번역 활성을 향상시킨다고 알려져있다.
동물세포로의 목적유전자의 전달 및 발현을 위한 인비트로 트랜스크립트 mRNA의 플랫폼에 적합한 변형 뉴클레오티드를 정하기 위해, modified CTP((5-Methylcytidine-5'-Triphosphate (TriLink biotechnologies)), modified UTP(( Pseudouridine-5'-Triphosphate (TriLink biotechnologies) 및 N1-Methylpseudouridine-5'-Triphosphate (TriLink biotechnologies))를 포함하는 인비트로 트랜스크립트 mRNA를 합성하여, 실시예 3과 동일한 방법으로, 293T 세포에서의 목적 단백질의 발현 정도를 비교하였다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, modified UTP를 단일로 사용하여 mRNA의 U를 modified U로 100% 치환한 mRNA의 단백질 발현율이 가장 높은 것을 확인할 수 있었다. 아울러, 실시예 4의 혼합 테일(mixed tail)에서, 단백질 발현률이 우수하였던 U 혼합 테일과 접목시킨다면 시너지 효과를 나타낼 수 있을 것으로 판단되어, 추가적으로 modified UTP를 사용하여 mixed tail을 비교하였고 그 결과, 예상대로modified U를 사용한 U-mixed tail에서의 단백질 발현이 가장 우수한 것을 확인할 수 있었다. modified-UTP가 mRNA 구조를 안정화시키는데 우수한 역할을 하는 것으로 추정된다.
본 발명에 따른 목적유전자를 포함하는 인비트로 트랜스크립트(in vitro transcript) mRNA를 동물세포에 주입하는 경우, 다량의 목적단백질을 동물세포에서 발현시킬 수 있어, 자가면역질환, 감염성 질환, 암 또는 종양 관련 질환, 염증성 질환 등에 대한 유전자 백신으로 사용할 수 있다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. 본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 이용될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (15)

  1. 다음을 포함하는 인비트로 트랜스크립트(in vitro transcript) mRNA;
    (a) 목적 펩타이드 또는 목적 단백질을 암호화하는 RNA 서열 삽입 부분;
    (b) 상기 목적 펩타이드 또는 목적 단백질을 암호화하는 RNA 서열의 양 말단에 연결되는 5'-UTR과 3'-UTR;
    (c) 5'-UTR에 연결되는 5' 캡(cap); 및
    (d) 3'-UTR에 연결되는 20~400개의 아데닌을 함유하는 폴리 A 테일.
  2. 제1항에 있어서, 상기 폴리 A 테일은 30~200개의 아데닌을 함유하는 것을 특징으로 하는 인비트로 트랜스크립트(in vitro transcript) mRNA.
  3. 제1항에 있어서, 상기 폴리 A 테일은 우라실(U), 시토신(C) 및 구아닌(G)으로 구성되는 군에서 선택되는 아데닌 이외의 하나 이상의 뉴클레오티드가 복수개의 아데닌 사이에 삽입되어 있는 것을 특징으로 하는 인비트로 트랜스크립트(in vitro transcript) mRNA.
  4. 제3항에 있어서, 상기 삽입되는 아데닌 이외의 뉴클레오티드는 2 내지 20개의 아데닌 사이에 삽입되는 것을 특징으로 하는 인비트로 트랜스크립트(in vitro transcript) mRNA.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리 A 테일의 말단은 아데닌인 것을 특징으로 하는 인비트로 트랜스크립트(in vitro transcript) mRNA.
  6. 제1항에 있어서, 상기 5' 캡(cap)은 Cap-1 또는 ARCA(anti-reverse cap analog)인 것을 특징으로 하는 인비트로 트랜스크립트(in vitro transcript) mRNA.
  7. 제1항에 있어서, 상기 인비트로 트랜스크립트(in vitro transcript) mRNA 서열의 우라실(U)의 전체 또는 일부가 변형된 U(modified U)로 치환되어 있는 것을 특징으로 하는 인비트로 트랜스크립트(in vitro transcript) mRNA.
  8. 제7항에 있어서, 상기 변형된 UTP는 pseudo UTP 또는 N1-methylpeudo UTP인 것을 특징으로 하는 인비트로 트랜스크립트(in vitro transcript) mRNA.
  9. 제3항에 있어서, 상기 폴리 A 테일은 변형된 U(modified U)가 복수개의 아데닌 사이에 삽입되어 있는 것을 특징으로 하는 인비트로 트랜스크립트(in vitro transcript) mRNA.
  10. 제9항에 있어서, 상기 변형된 UTP는 pseudo UTP 또는 N1-methylpeudo UTP인 것을 특징으로 하는 인비트로 트랜스크립트(in vitro transcript) mRNA.
  11. 제1항에 있어서, 상기 목적 펩타이드 또는 목적 단백질은 치료적으로 활성인 단백질 또는 펩타이드, 애쥬반트 단백질, 항원, 종양 항원, 병원성 항원, 동물 항원, 바이러스성 항원, 원생동물성 항원, 박테리아성 항원, 알레르기성 항원, 자가면역 항원, 알레르겐, 항체, 면역자극성 단백질 또는 펩타이드 또는 항원-특이적 T-세포 수용체인 것을 특징으로 하는 인비트로 트랜스크립트(in vitro transcript) mRNA.
  12. 다음을 포함하는 인비트로 트랜스크립트(in vitro transcript) mRNA 제작을 위한 주형 DNA;
    (a) 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 RNA 인비트로 트랜스크립트(in vitro transcript) mRNA에 대응하는 DNA 서열을 가지는 부분; 및
    (b) 상기 인비트로 트랜스크립트(in vitro transcript) mRNA에 대응하는 DNA 서열의 전사를 위하여 RNA 중합효소가 결합하는 프로모터.
  13. 제12항에 있어서, 상기 프로모터는 T7 프로모터, T3 프로모터 및 SP6 프로모터로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 주형 DNA.
  14. 제12항에 있어서, 상기 인비트로 트랜스크립트(in vitro transcript) mRNA에 대응하는 DNA 서열을 가지는 부분에 포함된 폴리 A 테일과 연결되는 제한효소 인식 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 주형 DNA.
  15. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 인비트로 트랜스크립트(in vitro transcript) mRNA를 포함하는 백신용 약학조성물.
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