WO2021193360A1 - 膵臓α細胞への分化誘導方法 - Google Patents

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仁志 大河内
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Kaneka Corp
National Center for Global Health and Medicine
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    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/23—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from cells of the gastro-intestinal tract
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells

Definitions

  • the present invention relates to a method for inducing differentiation into pancreatic ⁇ cells.
  • the present application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2020-52420 filed in Japan on March 24, 2020, the contents of which are incorporated herein by reference.
  • ES cells embryonic stem cells
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • Pancreatic islets are endocrine tissues that exist inside the pancreas, secrete insulin and glucagon, and mainly regulate blood glucose. Pancreatic islets are composed of various cells, and include ⁇ cells, ⁇ cells, ⁇ cells, and the like. Of these, pancreatic ⁇ cells are useful in cell therapy for diabetes, and therefore, a method for efficiently producing pancreatic ⁇ cells from pluripotent stem cells has been studied.
  • Patent Document 1 describes a method for producing pancreatic ⁇ cells from endoderm cells induced to differentiate from pluripotent stem cells.
  • pancreatic ⁇ -cells pancreatic ⁇ -cells that promote gluconeogenesis in response to hypoglycemia are abnormal in the islets of diabetic patients.
  • pancreatic ⁇ -cells are active even in hyperglycemic conditions and continue to secrete glucagon, which raises blood glucose levels.
  • glucagon secreted by pancreatic ⁇ -cells is known to play an important role in the regulation of blood glucose levels in vivo, and there are great expectations for the elucidation of the glucagon secretion mechanism from the viewpoint of developing new therapeutic agents for diabetes. It has been sent.
  • pancreatic ⁇ -cells used for research, and it is necessary to secure a new source of pancreatic ⁇ -cells in order to accelerate these studies.
  • pluripotent stem cells such as iPS cells and ES cells can differentiate into almost all cells constituting the living body, they are expected to be a new cell source for pancreatic ⁇ cells.
  • a technique for efficiently inducing the differentiation of pluripotent stem cells into functional pancreatic ⁇ cells is required.
  • Non-Patent Document 1 reports a method of inducing differentiation of human embryonic stem cells into pancreatic ⁇ cells having a glucagon-secreting function, but it efficiently induces differentiation of pluripotent stem cells into functional pancreatic ⁇ cells. Much technology has not been reported so far, and a fully functional pancreatic ⁇ -cell line has not been established.
  • the present invention has set the problem to be solved to provide a method for efficiently inducing the differentiation of pluripotent stem cells into functional pancreatic ⁇ cells.
  • pancreatic ⁇ -cells have a glucagon secretory function.
  • the present invention has been completed based on these findings.
  • Step of inducing differentiation into (PGT) (B) Step of inducing differentiation into pancreatic endocrine progenitor cells (EP) by culturing the primitive intestinal tract cells (PGT): and (c) Differentiation into pancreatic ⁇ cells by culturing the pancreatic endocrine progenitor cells (EP) Inducing process: Including A method for inducing differentiation into pancreatic ⁇ -cells, wherein the step (b) and the step (c) are performed in the absence of ascorbic acid. [2] The method for inducing differentiation into pancreatic ⁇ -cells according to [1], wherein the step (c) is performed under oxygen supply conditions.
  • the oxygen supply condition is a condition in which the dissolved oxygen concentration in the culture solution is controlled to be 20 to 50% when the saturated dissolved oxygen concentration in the culture solution at 37 ° C. under 1 atm is 100%.
  • the endoderm cells induced to differentiate from the pluripotent stem cells are cultured in a medium containing a TGF ⁇ superfamily signal activator, and then in a medium to which FGF2 and BMP4 are not added.
  • the method for inducing differentiation into pancreatic ⁇ -cells according to any one of [1] to [4], which is an endoderm cell that has been induced to differentiate by culturing.
  • the step (b) described above (B1) A step of inducing differentiation into posterior anterior enterocytes (PFG) by culturing the primitive intestinal cells (PGT) in the presence of a protein kinase C (PKC) activator: (B2) A step of inducing differentiation into pancreatic progenitor cells (PP) by culturing the posterior progenitor cells (PFG) in the presence of retinoic acid or an analog thereof: and (b3) The pancreatic progenitor cells (PP).
  • Step of inducing differentiation into pancreatic endocrine progenitor cells (EP) by culturing in the presence of Notch signal inhibitor and ROCK signal inhibitor The method for inducing differentiation into pancreatic ⁇ -cells according to any one of [1] to [5], which comprises. [7]
  • the step (c) includes a step of inducing differentiation of the pancreatic endocrine progenitor cells (EP) into pancreatic ⁇ cells by culturing the pancreatic endocrine progenitor cells (EP) in the presence of an insulin receptor signal activator, transferase and subselenic acid.
  • the method for inducing differentiation into pancreatic ⁇ -cells according to any one of [1] to [6].
  • pancreatic ⁇ -cells made it possible to efficiently induce the differentiation of pluripotent stem cells into functional pancreatic ⁇ -cells.
  • the pancreatic ⁇ -cell produced by the present invention is useful as a tool for elucidating the glucagon secretion mechanism and developing a novel therapeutic drug for diabetes.
  • the results of analyzing the expression of the INS gene, the GCG gene, the NKX6.1 gene and the PDX1 gene in the cells obtained by the methods of Example 1 and Comparative Example 1 are shown.
  • the measurement result of the glucagon secretion amount of the primordial intestinal cell (PGT) which induced the differentiation from the human iPS cell was induced to differentiate in the presence or absence of ascorbic acid is shown.
  • the measurement result of the amount of glucagon secretion between the cell obtained by the method of Example 2 and the cell obtained by the method of Comparative Example 1 is shown.
  • the result of analyzing the expression of GCG gene, ARX gene, GC gene, INS gene and NKX6.1 gene in the cell obtained by the method of Example 2 and the cell obtained by the method of Comparative Example 1 is shown.
  • the oxygen concentration in the culture medium when cultured under the oxygen concentration control of # 3-1 is shown.
  • Expression of GCG gene in cells induced to differentiate by culturing pancreatic endocrine progenitor cells (EP) under oxygen concentration control (# 3-1 to # 3-3) or oxygen concentration uncontrolled (Comparative Example 1)
  • the result of the analysis is shown.
  • Expression of INS gene in cells induced to differentiate by culturing pancreatic endocrine progenitor cells (EP) under oxygen concentration control (# 3-1 to # 3-3) or oxygen concentration uncontrolled is shown.
  • the term "not added” refers to exogenously not adding factors such as proteins, peptides and compounds identified as not added in the culture or conditioned medium. If factors such as proteins, peptides and compounds identified as not added in the culture or acclimatization medium are brought in by continuous operation of the culture, less than 1% (volume / volume), 0.5. Less than% (volume / volume), less than 0.1% (volume / volume), less than 0.05% (volume / volume), less than 0.01% (volume / volume), 0.001% (volume / volume) Adjust so that it is less than.
  • the term "improved" refers to increased gene expression above a particular gene expression level in the cell population to be compared, relative to the cell population to be compared. 1.1 times or more, 1.2 times or more, 1.3 times or more, 1.4 times or more, 1.5 times or more, 1.6 times or more, 1.7 times or more, 1.8 times or more, 1.9 times or more, 2.0 times or more, 2.1 times or more, 2.2 times or more, 2.3 times or more, 2.4 times or more, 2.5 times or more, 2.6 times or more, 2.
  • the term "decreased” refers to a decrease in gene expression below a specific gene expression level in the cell population to be compared, with respect to the cell population to be compared. 1.1 times or less, 1.2 times or less, 1.3 times or less, 1.4 times or less, 1.5 times or less, 1.6 times or less, 1.7 times or less, 1.8 times or less, 1.9 times or less, 2.0 times or less, 2.1 times or less, 2.2 times or less, 2.3 times or less, 2.4 times or less, 2.5 times or less, 2.6 times or less 2.
  • aggregate can be used with respect to the aggregate of the present invention, and generally refers to an aggregate of a group of cells that has not dissociated into a single cell.
  • the pluripotent stem cell in the present invention is a cell having pluripotency (pluripotency) capable of differentiating into all or a plurality of types of cells constituting a living body, and is in vitro (in) under appropriate conditions.
  • embryonic stem cells ES cells
  • pluripotent stem cells derived from fetal primordial germ cells EG cells: Proc Natl Acad Sci USA 1998, 95: 13726-31
  • pluripotent derived from testis Examples thereof include stem cells (GS cells: Nature.
  • Pluripotent stem cells are preferably iPS cells or ES cells, and more preferably iPS cells.
  • embryonic refers to an embryo derived by somatic cell nuclear transfer in addition to an embryo derived by gamete fusion.
  • ES cells cells derived from any warm-blooded animal, preferably a mammal, can be used. Mammals include, for example, mice, rats, guinea pigs, hamsters, rabbits, cats, dogs, sheep, pigs, cows, horses, goats, monkeys, or humans. Preferably, cells derived from humans can be used.
  • ES cells include ES cells such as mammals established by culturing early embryos before implantation, and early embryos prepared by nuclear transfer of somatic cell nuclei. Examples thereof include ES cells and ES cells in which genes on the chromosomes of these ES cells are modified by using genetic engineering techniques. Each ES cell can be prepared according to a method usually practiced in the art or a known document. Mouse ES cells were found in 1981 by Evans et al. (Evans et al., 1981, Nature 292: 154-6) and Martin et al. (Martin GR. Et al., 1981, Proc Natl Acad Sci 78: 7634-8). Established by. Human ES cells were established in 1998 by Thomson et al.
  • iPS cells are pluripotent cells obtained by reprogramming somatic cells.
  • iPS cells were produced by a group of Professor Shinya Yamanaka of Kyoto University, a group of Rudolf Jaenisch of Massachusetts Institute of Technology, a group of James Thomson of Wisconsin University, and Conrad of Harvard University.
  • groups have been successful, including groups such as Konrad Hochedlinger and others.
  • WO2007 / 069666 discloses somatic cell nuclear reprogramming factors containing the Oct family gene, Klf family gene, and the gene products of the Myc family gene, as well as the Oct family gene, Klf family gene, Sox family gene, and Myc.
  • a somatic cell nuclear reprogramming factor containing a gene product of a family gene is described, and an induced pluripotent stem cell is produced by nuclear reprogramming of the somatic cell, which further comprises a step of contacting the somatic cell with the nuclear reprogramming factor. How to do it is described.
  • the type of somatic cell used for producing iPS cells is not particularly limited, and any somatic cell can be used. That is, the somatic cell includes all cells other than the endogerm cells of the cells constituting the living body, and may be a differentiated somatic cell or an undifferentiated stem cell.
  • the origin of somatic cells may be any of mammals, birds, fish, reptiles, and amphibians, and is not particularly limited, but is preferably mammals (for example, rodents such as mice, or primates such as humans). It is preferably a mouse or a human. When human somatic cells are used, any fetal, neonatal or adult somatic cells may be used.
  • somatic cells include fibroblasts (eg, cutaneous fibroblasts), epithelial cells (eg, gastric epithelial cells, hepatic epithelial cells, alveolar epithelial cells), and endothelial cells (eg, blood vessels, lymph vessels).
  • fibroblasts eg, cutaneous fibroblasts
  • epithelial cells eg, gastric epithelial cells, hepatic epithelial cells, alveolar epithelial cells
  • endothelial cells eg, blood vessels, lymph vessels.
  • Nerve cells eg, neurons, glial cells
  • pancreatic cells leukocyte cells (B cells, T cells, etc.)
  • bone marrow cells muscle cells (eg, skeletal muscle cells, smooth muscle cells, myocardial cells), hepatic parenchymal cells, Non-hepatic parenchymal cells, fat cells, osteoblasts, cells constituting periodontal tissue (for example, root membrane cells, cement blasts, gingival fibroblasts, osteoblasts), cells constituting kidney / eye / ear, etc.
  • muscle cells eg, skeletal muscle cells, smooth muscle cells, myocardial cells
  • hepatic parenchymal cells Non-hepatic parenchymal cells
  • fat cells for example, root membrane cells, cement blasts, gingival fibroblasts, osteoblasts
  • periodontal tissue for example, root membrane cells, cement blasts, gingival fibroblasts, osteoblasts
  • cells constituting kidney / eye / ear etc.
  • iPS cells have long-term self-renewal ability under predetermined culture conditions (for example, conditions for culturing ES cells), and ectoderm cells, mesoderm cells or endoderm under predetermined differentiation-inducing conditions. It is a stem cell that has pluripotency in any of the lineage cells. Further, the iPS cells may be stem cells having an ability to form a teratoma when transplanted into a test animal such as a mouse.
  • the reprogramming gene is a gene encoding a reprogramming factor having an action of reprogramming somatic cells into iPS cells.
  • Specific examples of combinations of reprogramming genes include, but are not limited to, the following combinations.
  • (I) Oct gene, Klf gene, Sox gene, Myc gene ii) Oct gene, Sox gene, NANOG gene, LIN28 gene
  • iv Oct gene, Klf gene, Sox gene
  • the form of introduction of the reprogramming factor into cells is not particularly limited, and examples thereof include gene transfer using a plasmid, introduction of synthetic RNA, and direct introduction as a protein.
  • iPS cells prepared by a method using microRNA, RNA, a small molecule compound or the like may be used.
  • the pluripotent stem cells such as ES cells and iPS cells, commercially available cells or cells that have been sold may be used, or newly prepared cells may be used.
  • iPS cells for example, 253G1 strain, 253G4 strain, 201B6 strain, 201B7 strain, 409B2 strain, 454E2 strain, 606A1 strain, 610B1 strain, 648A1 strain, 1201C1 strain, 1205D1 strain, 1210B2 strain, 1231A3 strain, 1383D2 strain, 1383D6 strain, iPS-TIG120-3f7 strain, iPS-TIG120-4f1 strain, iPS-TIG114-4f1 strain, RPChiPS771-2 strain, 15M63 strain, 15M66 strain, HiPS-RIKEN-1A strain, HiPS-RIKEN-2A strain, HiPS-RIKEN- 12A strain, Nippons-B2 strain, TkDN4-M strain, TkDA3-1 strain, TkDA3-2 strain, TkDA3-4 strain, TkDA3-5 strain, TkDA3-9 strain, TkDA3-20 strain, hiPSC38-2 strain, MSC -IPSC
  • ES cells for example, KhES-1, KhES-2, KhES-3, KhES-4, KhES-5, SEES1, SEES2, SEES3, HUES8, CyT49, H1 and H9. , HS-181 strain and the like can be used. Newly prepared clinical grade iPS cells or ES cells may be used.
  • Endodermal cells are tissues of organs such as the gastrointestinal tract, lungs, thyroid, pancreas, and liver, cells of secretory glands that open into the gastrointestinal tract, peritoneum, thoracic membrane, laryngeal, ear canal, trachea, bronchi, and urinary tract (bladder, bladder). It has the ability to differentiate into most of the urinary tract, part of the urinary tract, etc., and is commonly referred to as endoderm (DE). Differentiation from pluripotent stem cells to endoderm cells can be confirmed by measuring the expression level of genes specific to endoderm cells. Examples of genes specific to endoderm cells include SOX17, FOXA2, CXCR4, AFP, GATA4, EOMES and the like. In the present specification, endoderm cells may be used in other words as germ layer in the embryo.
  • Primitive intestinal cells form the foregut, midgut, and hindgut.
  • the midgut is connected to the yolk sac, and the extraembryonic allantois branches from the hindgut.
  • the foregut also forms the pharynx of the respiratory system.
  • Differentiation from endoderm cells to primordial intestinal cells can be confirmed by measuring the expression level of genes specific to primordial intestinal cells. Examples of genes specific to progenitor tract cells include HNF-1 ⁇ and HNF-4 ⁇ .
  • Pancreatic progenitor cells are cells that have differentiated from posterior anterior intestinal cells and are capable of differentiating into exocrine and endocrine cells of the pancreas. Differentiation of posterior progenitor cells into pancreatic progenitor cells can be confirmed by measuring the expression level of genes specific to pancreatic progenitor cells. Examples of genes specific to pancreatic progenitor cells include PDX1, NKX6.1 and the like.
  • Pancreatic endocrine precursor cells are cells differentiated from pancreatic precursor cells and can differentiate into pancreatic endocrine cells ( ⁇ cells, ⁇ cells, ⁇ cells, ⁇ cells, PP cells, etc.). Differentiation into pancreatic endocrine progenitor cells can be confirmed by measuring the expression level of genes specific to pancreatic endocrine progenitor cells. Examples of genes specific to pancreatic endocrine progenitor cells include PDX1, NKX6.1, NeuroG3, NeuroD1 and the like.
  • Pancreatic ⁇ -cells are cells differentiated from pancreatic endocrine progenitor cells and secrete glucagon. The differentiation of pancreatic endocrine progenitor cells into pancreatic ⁇ -cells can be confirmed by measuring the expression level of genes specific to pancreatic ⁇ -cells. Examples of genes specific to pancreatic ⁇ cells include glucagon (GCG), ARK, IRX2, GC, TM4SF4, TTR, CRYBA2 and the like.
  • GCG glucagon
  • ARK IRX2, GC, TM4SF4, TTR, CRYBA2
  • Pancreatic ⁇ -cells are cells differentiated from pancreatic endocrine progenitor cells and secrete insulin.
  • the differentiation of pancreatic endocrine progenitor cells into pancreatic ⁇ cells can be confirmed by measuring the expression level of genes specific to pancreatic ⁇ cells. Examples of genes specific to pancreatic ⁇ cells include insulin, NKX6.1, MAFA, PDX1 and the like.
  • Bone morphogenetic protein (BMP) signals are signals mediated by bone morphogenetic protein (BMP) ligands and play a variety of roles in vertebrates. During embryogenesis, the dorsoventral axis is established by the gradient of BMP signaling formed by the coordinated expression of ligands, receptors, co-receptors and soluble antagonists. BMP is an important regulator of gastrulation, mesoderm induction, organogenesis and cartilage bone formation and controls the fate of pluripotent stem cell populations.
  • the BMP receptor consists of a complex of type I receptor (active receptor-like kinase; ALK-1, ALK-2, ALK-3 or ALK-6) and type II receptor (ActRII, ActRIIB or BMPRII) and is active.
  • the modified type I receptor kinase phosphorylates two serine residues present at the C-terminal of the R-Smad (receptor-regulated Smad) protein.
  • R-Smads Smad1, Smad5, Smad8 that undergo phosphorylation by binding of a ligand (BMP) to a receptor are called BR-Smads (BMP R-Smads), and are two phosphorylated molecules.
  • R-Smad forms a heterotrimer with Smad4 and regulates transcription of the target gene by translocating into the nucleus.
  • the bone morphogenetic protein (BMP) signal inhibitor is not particularly limited as long as it is a substance that inhibits a BMP signal that begins with binding to a receptor by a ligand (BMP-4, etc.), but is preferably ALK-1 or ALK-2. , ALK-3 and ALK-6, a substance that inhibits at least one of them.
  • a substance such as an antagonist antibody
  • BMP signal inhibitor can be used as a BMP signal inhibitor.
  • the bone morphogenetic protein (BMP) signal inhibitor is not particularly limited, but an inhibitor that acts on a type I receptor (ALK-1, ALK-2, ALK-3 or ALK-6) is effective for BMP signal.
  • a type I receptor ALK-1, ALK-2, ALK-3 or ALK-6
  • Dorsomorphin, LDN193189, LDN-214117, LDN-21284, K02288, ML347 and the like can be mentioned.
  • Retinoic acid is a carboxylic acid derivative of vitamin A, all-trans retinoic acid (also called tretinoin), 9-cis retinoic acid (also called alitretinoin; 9 cis retinoic acid), 13-cis retinoic acid (also called 13-cis retinoic acid). There are several steric isomers, such as (13 cisretinoic acid). Retinoic acid plays a major role in the physiological activity of retinoids and carotenoids in vivo as a natural ligand of the retinoic acid receptor (RAR), which is one of the nuclear receptors.
  • RAR retinoic acid receptor
  • RAR forms a heterodimer with retinoid X receptor (RXR: ligand is 9cis retinoic acid), and as a ligand-inducible transcription factor, it binds to the promoter of a specific target gene group to be a target gene. It is known to control the expression of the group positively and negatively at the transcription level. Even compounds with a chemical structure that is completely dissimilar to vitamin A are called retinoids, including synthetic compounds that show very high binding affinities for these specific receptors.
  • Retinoic acid (Analog of retinoic acid) Retinoic acid (RA) is known to have an action of promoting cell differentiation, arrest of the cell division cycle, or apoptosis, and is also used for inducing differentiation of pluripotent stem cells.
  • the analog of the retinoic acid is not particularly limited as long as it is a substance that activates the nuclear receptor retinoic acid receptor (PAR), retinoid X receptor (RXR), but for example, EC23, EC19, AC 261066, AC 55649, Adamalene, AM 580, AM 80, BMS 753, BMS 961, CD 1530, CD 2314, CD 437, Ch 55, Isotinoin, Tazarotene, TTNPB and the like.
  • EC23 is less affected by deterioration due to light and is a stable compound, so that it can be preferably used.
  • Ascorbic acid is an organic compound having a lactone structure known as vitamin C, which is a water-soluble vitamin. Ascorbic acid is an optically active compound, and there are L-form and D-form, but L-form is preferable. It should be noted that what is known as vitamin C is the L form. Ascorbic acid has a strong reducing power and is involved in various redox reactions in the living body. Ascorbic acid is absorbed from the upper part of the small intestine and partially metabolized in the liver via the portal vein, but most of it is taken up by tissues such as the adrenal gland and the pituitary gland.
  • Ascorbic acid is essential for suppressing the production of peroxides, detoxifying xenobiotic substances, metabolizing tyrosine, and promoting absorption of non-heme iron. In addition, it is involved in hydroxylation in reactions such as collagen, catecholamine, and carnitine biosynthesis and cholesterol metabolism.
  • ROCK Rho-associated coiled-coil forming kinase / Rho-associated kinase transforms the myosin light chain into an active structure via phosphorylation of the myosin light chain and the myosin light chain dephosphorylating enzyme. Furthermore, ROCK inactivates actin depolymerization factor cofilin via phosphorylation of LIM kinase and suppresses actin depolymerization. In addition, ROCK phosphorylates a large number of substrates and is involved in various vital functions such as cell motility, cell polarity, cell adhesion, cell division, apoptosis, and transcriptional regulation.
  • ROCK signal inhibitors include Y27632, Thiazovivin, Fasudil (HA-1077) HCl, GSK492286A, RKI-1447, GSK180736A (GSK180736), Hydroxyfasudil (HA-1100) HCl, Y-39983 HCl, Y-39983 , GSK269962A HCl, Ripasudil (K-115) chloride dihydrate, KD025 (SLx-2119), AT13148 and the like.
  • TGF ⁇ superfamily signal activator The TGF ⁇ superfamily signal plays a very important role in the regulation of cell proliferation, differentiation, and development in a wide range of biological systems.
  • ligand-induced multimeric formation of serine / threonine receptor kinase and phosphorylation of intracellular signaling molecules such as Smad 1/5/8 for the bone morphogenetic protein (BMP) pathway, and TGF ⁇ / For the Actibin and NODAL / Actibin pathways, signaling is initiated by phosphorylation of Smad2 / 3.
  • SMADs Phosphorylation of the carboxyl group ends of SMADs by activating receptors forms a partner with them and Smad4, which is a common signal transducer, and promotes translocation to the nucleus.
  • Smad4 is a common signal transducer, and promotes translocation to the nucleus.
  • Activated SMADs are known to control various biological effects by partnering with transcription factors and to regulate transcription specific to the cell state.
  • Genes involved in the TGF ⁇ superfamily signaling pathway include Activin A gene, BMP2 gene, BMP3 gene, BMP4 gene, BMP5 gene, BMP6 gene, BMP7 gene, BMP8 gene, BMP13 gene, GDF2 (Growth diffusion factor 2) gene, and GDF3.
  • the TGF ⁇ superfamily signal activator is not particularly limited as long as it is a substance that activates signals of the bone morphogenetic protein (BMP) pathway, the TGF ⁇ / activin pathway, and / or the NODAL / activin pathway, and is not particularly limited, and is, for example, activin A. , BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8, BMP13, GDF2, GDF5, GDF6, GDF7, GDF8, GDF11, TGF- ⁇ 1, TGF- ⁇ 2, TGF- ⁇ 3, AMH, PITX2, and / or NODAL, etc. Can be used.
  • BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8, BMP13, GDF2, GDF5, GDF6, GDF7, GDF8, GDF11, TGF- ⁇ 1, TGF- ⁇ 2, TGF- ⁇ 3, AMH, PITX2, and / or NODAL, etc. Can be used.
  • a substance that activates the signal of the TGF ⁇ / activin pathway can be preferably used, and specifically, at least one selected from the group consisting of activin A and BMP4 is preferably used, and activin A is preferable. , And BMP4 are particularly preferred.
  • PKC Protein kinase C activator
  • PKC protein kinase C activator
  • DAG diacylglycerol
  • DAG is produced with inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3) by hydrolyzing phosphatidylinositol 4,5-diphosphate (PIP2) with phosphoripase C (PLC).
  • IP3 inositol 1,4,5-trisphosphate
  • PIP2 phosphatidylinositol 4,5-diphosphate
  • PLC phosphoripase C
  • the new PKC isozymes ( ⁇ , ⁇ , ⁇ , ⁇ ) are activated only by DAG. This is because the new PKC isozyme has an extremely high affinity for DAG in the C1 domain than that of the conventional type.
  • Atypical PKC isozymes ( ⁇ , M ⁇ , ⁇ / ⁇ ) do not require DAG or Ca 2+ for their activation and are activated by a second messenger of various lipid metabolites (Khalil, 2010; Wu-Zhang and). Newton, 2013; Mochly-Rosen et al., 2012).
  • the PKC activator may be any substance that activates at least one or more of the PKC isozymes.
  • the PKC activator is not particularly limited, and is, for example, indolactam V (ILV), Okadaic Acid, Phorbol-12-Myristate-13-Actate (PMA), Bryostatin 1, 1alpha, 25-Dihydroxyvitamin D3, Prostra.
  • ILV indolactam V
  • PMA Phorbol-12-Myristate-13-Actate
  • Bryostatin 1, 1alpha 25-Dihydroxyvitamin D3, Prostra.
  • -Dioctanoyl-sn-glycerol 1-Oleoyl-2-acetyl-sn-glycerol (OAG), Olic Acid, Ingenol 3-angelate, DCP-LA, PIP2, Phorbol-12,13-dibutyrate, 8 , And derivatives thereof and the like can be used.
  • Notch signal inhibitor Notch signal inhibitor
  • ER endoplasmic reticulum
  • S1 cleavage sugar chains are bound and stabilized by calcium ions (Ca 2+).
  • Ca 2+ calcium ions
  • This processed receptor then translocates to the cell membrane, allowing it to bind the ligand.
  • members of the Delta-like (DLL1, DLL3, DLL4) and Jugged (JAG1, JAG2) families present in the signal-sending cells act as ligands for Notch signaling receptors.
  • NECD Upon binding of the ligand, NECD is cleaved from the TM-NICD domain by TACE (ADAM metalloproteinase TNF- ⁇ converting enzyme) (S2 cleavage). The NECD remains bound to the ligand, and the complex undergoes endocytosis and recycling / degradation within the signal-transmitting cell. In the signal-receiving cell, ⁇ -secretase (also involved in Alzheimer's disease) releases NICD from TM (S3 cleavage), which causes NICD to translocate into the nucleus, where CSL (CBF1 / Su (H)). ) / Lag-1) Associates with the family transcription factor complex, which is followed by activation of the reference Notch target genes Myc, p21 and HES family members.
  • TACE ADAM metalloproteinase TNF- ⁇ converting enzyme
  • Notch signal inhibitors examples include IMR-1, FLI-06, Crenigacesstat (LY309478) and the like.
  • DBZ dibenzazepine
  • DAPT N- [N- (3,5-Difluorophenecateyl-L-alanyl)]-(S) -phenylglycine t-butyl ester
  • LY411575 Dibenzazepine2097, Dibenzazepine297 (Dibenzazepine1097)
  • ⁇ -secretase inhibitors such as (PF-0384014, PF-3084014), L-685,458, Semagacestat (LY450139), Avagacestat (BMS-708163), MK-0752 can also be used as Notch signaling inhibitors.
  • Hedgehog (HH) signal inhibitor Hedgehog (HH) signaling is known as a fetal cell growth factor and morphogenetic factor. In addition, it has been shown that it can also function in adult homeostasis, tissue regeneration, and control of tissue stem cells. Abnormalities in HH signals during the fetal period cause congenital diseases such as total preencephalopathy, and persistent activity of HH signals in adults is said to be associated with various cancers including basal cell carcinoma of the skin and medulloblastoma. ing. As a hedgehog signaling ligand, three types of HH ligands (SHH; Sonic hedgehog, IHH; Indian hedgehog, DHH; Desert hedgehog) are known in mammals.
  • the patched receptor for the hedgehog family ligand In the absence of the hedgehog ligand (off state), the patched receptor for the hedgehog family ligand normally binds to the G protein-coupled transmembrane protein, Smoothened (Smo), and inhibits Smoothened association with the membrane. do.
  • SuFu and COS2 Kif7 in vertebrates sequester the population of transcription factor Gli that binds to microtubules in the first cilia.
  • Gli is phosphorylated by PKA, CKI and GSK-3, resulting in ⁇ -TrCP-mediated degradation of Gli activators (Gli1 and Gli2 in mammals) or Gli suppressors in conserved pathways (Gli suppressors).
  • the hedgehog (HH) signal inhibitor is not particularly limited as long as it is a substance that inhibits the hedgehog signal, but for example, there is a substance that acts on Smo to inhibit the signal.
  • an antagonist antibody or the like that inhibits the binding of the hedgehog ligand to a receptor such as Patched can also be used as a hedgehog signal inhibitor.
  • the hedgehog (HH) signal inhibitor is not particularly limited, and examples thereof include SANT1, Cyclopamine, Sonidegib, PF-5274857, Glasdegib, Taradegib, BMS-833923, MK-4101, Vismodegib, GANT61, Jervine, etc. Can be mentioned.
  • SANT1 is an antagonist of a strong cell-permeable HH signal and can be suitably used because it inhibits by directly binding to the Smo receptor.
  • TGF- ⁇ receptor signal inhibitor TGF- ⁇ receptor signal inhibitor
  • TGF ⁇ signaling is signal transduction involving the transforming growth factor ⁇ (TGF ⁇ ) ligand and plays a central role in cellular processes such as cell growth, proliferation, differentiation and apoptosis. To bear.
  • the TGF ⁇ signal involves the binding of a TGF ⁇ ligand to a type II receptor (serine / threonine kinase) that incrementally phosphorylates the type I receptor (ALK5).
  • type II receptor serine / threonine kinase
  • the type I receptor then phosphorylates the receptor-regulated SMAD (R-SMAD; eg, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5, SMAD8, or SMAD9) that binds to SMAD4, and then this SMAD complex is transcribed. Enter the nucleus that plays a role in regulation.
  • R-SMAD receptor-regulated SMAD
  • the TGF ⁇ signal inhibitor is not particularly limited as long as it is a substance that inhibits the TGF ⁇ signal, but is, for example, a substance that acts on ALK5 and inhibits its phosphorylation.
  • an antagonist antibody or the like that inhibits TGF ⁇ from binding to the receptor can also be used as a TGF ⁇ signal inhibitor.
  • the TGF ⁇ signal inhibitor is not particularly limited, but for example, an inhibitor that acts on ALK5 can be preferably used.
  • an inhibitor that acts on ALK5 can be preferably used.
  • SB431542, Galunistertib, LY2109761, SB525334, SB505124, GW788388, LY364497, RepSox, SD-208, Vactosertib, LDN-21284 and the like can be mentioned.
  • Insulin receptors are expressed in liver, skeletal muscle, adipose tissue, nerve cells, etc., and insulin receptor signals are known to be involved in the formation, maintenance, and repair of neural networks. Insulin is an important hormone that regulates important energy functions such as glucose and lipid metabolism, activates the insulin receptor tyrosine kinase (IR), and is a different substrate adapter such as the IRS (insulin receptor substrate) family. recruit and phosphorylate. Tyrosine-phosphorylated IRS presents binding sites to many signal partners.
  • IR insulin receptor tyrosine kinase
  • PI3K phosphoinositide 3-kinase plays an important role in insulin function mainly through activation of Akt (protein kinase B) and PKC (protein kinase C).
  • Akt protein kinase B
  • PKC protein kinase C
  • Activated Akt is glycogen synthesis via inhibition of GSK-3 (glycogen kinase kinase), protein synthesis via mTOR (mammalian target kinase) and downstream factors, proapoptotic factors (Bad, transcription factor: Forkhead family). , GSK-3, etc.) causes cell survival and the like.
  • Insulin receptor signals also have cell growth and cell division effects, which, as well as activation of the Ras / MAPK pathway, primarily involve the Akt cascade.
  • the insulin receptor signal activator is not particularly limited as long as it is a substance that activates the insulin receptor signal, and examples thereof include an insulin receptor and a ligand that binds to an IGF receptor. It may also be a substance that directly or indirectly activates PI3K, PKC or Akt.
  • insulin receptor signal activator insulin, insulin-like growth factor-1 (IGF-1), IGF-2 and the like can be preferably mentioned.
  • IGF-1 insulin-like growth factor-1
  • IGF-2 insulin-like growth factor-2
  • PI3-kinase activator Santa Cruz, product number: sc-3036
  • 740 YP 740 YP, and the like, which are PI3K activators, can also be used as insulin receptor signal activators.
  • the FGF (fibroblast growth factor) receptor signal is signal transduction via the FGF receptor and flows through the RAS-MAPK pathway and the PI3K-AKT pathway, causing cell proliferation, cell death, angiogenesis, and epithelial-mesenchymal transition (EMT). ), And also plays an important role in the regulation of embryonic development and postnatal skeletal system development.
  • the FGF receptor signal activator may be any substance that activates signal transduction as described above, and a ligand (FGF family) that binds to the FGF receptor is a typical example. Further, an activator of the RAS-MAPK pathway or the PI3K-AKT pathway can also be used as the FGF receptor signal activator.
  • FGF receptor signal activator examples include the FGF family, preferably FGF7, FGF3, FGF10, FGF22, FGF1, FGF2, FGF4, FGF5, FGF6, FGF8, FGF17, FGF18, FGF9, FGF16, FGF20. , FGF19, FGF21, FGF23 and the like, and FGF7 is particularly preferable.
  • EGF receptor signal activator Epidermal growth factor (EGF) is a protein of 6045 Da consisting of 53 amino acid residues and three intramolecular disulfide bonds, which binds as a ligand to the epidermal growth factor receptor (EGFR) present on the cell surface and causes cell growth. It plays an important role in the regulation of growth. Examples of the EGF receptor signal activator include EGF.
  • GLP-1 Glucagon-like peptide-1
  • GLP-1 an incretin hormone secreted in the body
  • GLP-1 receptor signal activator examples include GLP-1, Endin4 and the like.
  • the growth factor stabilizer means a substance having a growth factor stabilizing action. Growth factor stabilization is particularly limited as long as it suppresses the decrease in the amount of extracellular growth factors, such as the action of suppressing the decomposition of growth factors and the action of promoting the extracellular secretion of growth factors. Not done.
  • Examples of the growth factor stabilizer include heparin and heparan sulfate.
  • Hepatocyte growth factor Hepatocyte growth factor
  • HGF Hepatocyte growth factor
  • Insulin-like growth factor is a polypeptide having a structure similar to proinsulin, and is known to be involved in cell proliferation and survival, migration and extracellular matrix production including collagen. Insulin-like growth factor exhibits cell division-promoting activity by binding to a common receptor called insulin-like growth factor receptor-1 (IGFR1) for various cell types including tumor cells. Insulin-like growth factors include insulin-like growth factor-I (IGF-I) and insulin-like growth factor-II (IGF-I).
  • Adenylate cyclase activator (substance that improves intracellular cAMP concentration)
  • Adenylate cyclase is an enzyme that catalyzes the conversion of ATP to 3', 5'-cyclic AMP (cAMP) and pyrophosphate.
  • cAMP is a molecule called a second messenger, which is important for eukaryotic signal transduction.
  • Examples of the Adenylate cyclase activator include Forskolin, NKH477 and the like.
  • WNT signal activator The WNT signal refers to a series of actions that promote the nuclear transduction of ⁇ -catenin and exert a function as a transcription factor. WNT signals are caused by cell-cell interactions, for example, a series of flows in which a protein called WNT3A secreted from one cell acts on yet another cell, intracellular ⁇ -catenin translocates to the nucleus, and acts as a transcription factor. Is included. The sequence causes the first phenomenon of organ construction, such as epithelial-mesenchymal interaction.
  • WNT signaling is known by activating three pathways, the ⁇ -catenin pathway, the PCP pathway, and the Ca 2+ pathway, to control various cell functions such as cell proliferation and differentiation, organogenesis, and cell motility during early development. Be done. Examples of genes involved in the WNT signaling pathway include the WNT3A gene.
  • the WNT signal activator is not particularly limited, but may be any WNT signal activator as long as it exhibits an inhibitory activity on glycogen synthase kinase-3 (GSK-3), for example, a bis-indro (indylbin) compound (BIO) (( 2'Z, 3'E) -6-bromoinzylvin-3'-oxime), its acetoxime analog BIO-acetoxime (2'Z, 3'E) -6-bromoinzilbin-3'-acetone), Thiasiazolidine (TDZD) analog (4-benzyl-2-methyl-1,2,4-thiadiazolidin-3,5-dione), oxothiazolidin-3-thioone analog (2,4-dibenzyl) -5-oxothiazolidin-3-thione), thienyl ⁇ -chloromethyl ketone compound (2-chloro-1- (4,4-dibromo-thiophen-2-yl) -etanone),
  • pancreatic ⁇ -cells can be produced from pluripotent stem cells.
  • step (a) of the present invention endometrial cells induced to differentiate from pluripotent stem cells are cultured in the presence of a bone morphogenetic protein (BMP) signal inhibitor and an analog of retinoic acid or retinoic acid. Induces differentiation of primitive intestinal cells (PGT).
  • step (b) of the present invention differentiation is induced into pancreatic endocrine progenitor cells (EP) by culturing the primitive intestinal cells (PGT).
  • step (c) of the present invention the pancreatic endocrine progenitor cells (EP) are cultured to induce differentiation into pancreatic ⁇ cells.
  • the step (b) and the step (c) are performed in the absence of ascorbic acid.
  • each step will be described. The induction of differentiation from pluripotent stem cells to endoderm cells will be described later.
  • ⁇ Culture conditions As the cell culture at the time of inducing the differentiation of endometrial cells into pancreatic ⁇ cells, either adhesive culture or suspension culture may be used, but suspension culture is preferable.
  • the cells may be suspended-cultured by adhering them to a microcarrier or the like, or may be suspended-cultured in the state of a cell aggregate composed only of cells, or a polymer such as collagen is mixed in the cell aggregate. It may be used, and the form is not particularly limited.
  • the culture temperature for inducing differentiation of endometrial cells into pancreatic ⁇ -cells is not particularly limited as long as it is suitable for culturing the cells to be used, but is generally 30 ° C to 40 ° C, preferably 30 ° C to 40 ° C. It is about 37 ° C. It is preferable to culture in a CO 2 concentration atmosphere of about 1 to 10%, preferably 5% using a CO 2 incubator or the like.
  • the culture period for inducing differentiation of endoderm cells into primitive intestinal cells (PGT) in step (a) is generally 24 hours to 120 hours, preferably about 48 hours to 96 hours. For example, 72 hours.
  • the induction of differentiation from primitive intestinal cells (PGT) to pancreatic endocrine progenitor cells (EP) in step (b) is the induction of differentiation from the primitive intestinal cells (PGT) to posterior anterior intestinal cells (PFG), the posterior anterior intestinal cells.
  • PGT primitive intestinal cells
  • PFG posterior anterior intestinal cells
  • PP pancreatic progenitor cells
  • EP pancreatic endocrine progenitor cells
  • the culture period of the differentiation culture from the primitive intestinal cell (PGT) to the posterior anterior enterocyte (PFG) is not particularly limited as long as the cell type exhibits the cellular characteristics of the posterior enterocyte (PFG), but for example. It may be 2 weeks or less, more specifically 1 day or more and 10 days or less, more preferably 2 days or more and 7 days or less, still more preferably 3 days or more and 5 days or less, as an example. 4 days.
  • the culture period of the differentiation culture from the posterior progenitor cells (PFG) to the pancreatic progenitor cells (PP) is not particularly limited as long as the cell type exhibits the cell characteristics of the pancreatic progenitor cells (PP). It may be 2 weeks or less, more specifically 1 day or more and 10 days or less, more preferably 2 days or more and 7 days or less, still more preferably 2 days or more and 4 days or less, for example, 3 It's a day.
  • the culture period of the differentiation culture from pancreatic progenitor cells (PP) to pancreatic endocrine progenitor cells (EP) is not particularly limited as long as the cell type exhibits the cell characteristics of pancreatic endocrine progenitor cells (EP), but for example. It may be 2 weeks or less, more specifically 1 day or more and 10 days or less, more preferably 3 days or more and 10 days or less, still more preferably 5 days or more and 9 days or less, as an example. It's 7 days.
  • the culture period of the differentiation culture into pancreatic ⁇ -cells in step (c) is not particularly limited as long as it has a cell type exhibiting the cell characteristics of pancreatic ⁇ -cells, but may be, for example, within 3 weeks. Specifically, it is 3 days or more and 20 days or less, more preferably 5 days or more and 14 days or less, further preferably 7 days or more and 12 days or less, and an example is 10 days.
  • the medium used in steps (a) to (c) is MEM medium, BME medium, DMEM medium, DMEM / F12 medium, ⁇ MEM medium, IMDM medium, ES medium, DM-160 medium, depending on the type of cells.
  • Fisher medium, F12 medium, WE medium, RPMI1640 medium, Essential6 TM medium (Thermo Fisher Scientific), or a medium obtained by mixing two or more kinds of media arbitrarily selected from these media can be used.
  • the medium may contain glucose, and the glucose concentration is preferably 1 mM or more and 100 mM or less, more preferably 2 mM or more and 50 mM or less, and further preferably 5 mM or more and 30 mM or less.
  • the medium may further contain bovine serum albumin (BSA) or human serum albumin (HSA).
  • BSA bovine serum albumin
  • HSA human serum albumin
  • the lipid contained in BSA or HSA is 2 mg / g or less, and the free fatty acid is 0.2 mg / g or less.
  • the lower limit of the amount of BSA added to the medium is preferably 0.01%, more preferably 0.05%, more preferably 0.10%, more preferably 0.15%, more preferably 0.20%, and more. It is preferably 0.25%.
  • the upper limit of the amount of BSA added to the medium is preferably 1.00%, more preferably 0.90%, more preferably 0.80%, more preferably 0.70%, more preferably 0.60%, and more. It is preferably 0.50%, more preferably 0.40%, more preferably 0.30%, and even more preferably 0.25%.
  • the medium may further contain antibiotics such as penicillin and streptomycin.
  • antibiotics such as penicillin and streptomycin.
  • the medium can contain 0.1-2% (volume / volume) of penicillin and 0.1-2% (volume / volume) of streptomycin.
  • the medium may contain a B27® supplement.
  • the lower limit of the amount of B27® supplement added to the medium is preferably 0.01%, more preferably 0.1%, more preferably 0.2%, more preferably 0.3%, more preferably 0. It is 0.4%, more preferably 0.5%, more preferably 0.6%, more preferably 0.7%, more preferably 0.8%, and even more preferably 0.9%.
  • the upper limit of the amount of B27® supplement added to the medium is preferably 10%, more preferably 9%, more preferably 8%, more preferably 7%, more preferably 6%, more preferably 5%. It is more preferably 4%, more preferably 3%, more preferably 2%, and even more preferably 1%.
  • the medium can contain insulin, transferrin and selenous acid.
  • Insulin, transferrin and selenous acid may be included in the medium in the form of commercially available mixtures such as B27 supplements.
  • the lower limit of the amount of transferrin added to the medium is preferably 0.001 mg / L, more preferably 0.01 mg / L, more preferably 0.1 mg / L, more preferably 1 mg / L, and more preferably 1.1 mg / L. L, more preferably 1.2 mg / L, more preferably 1.3 mg / L, more preferably 1.4 mg / L.
  • the upper limit of the amount of transferrin added to the medium is preferably 1000 mg / L, more preferably 500 mg / L, more preferably 100 mg / L, more preferably 90 mg / L, more preferably 80 mg / L, and more preferably 70 mg / L.
  • the lower limit of the amount of selenous acid added to the medium is preferably 0.001 ⁇ g / L, more preferably 0.01 ⁇ g / L, more preferably 0.1 ⁇ g / L, more preferably 1 ⁇ g / L, and more preferably 1. 1 ⁇ g / L, more preferably 1.2 ⁇ g / L, more preferably 1.3 ⁇ g / L, more preferably 1.4 ⁇ g / L, more preferably 1.5 ⁇ g / L, more preferably 1.6 ⁇ g / L, and more. It is preferably 1.7 ⁇ g / L.
  • the upper limit of the amount of selenous acid added to the medium is preferably 1000 ⁇ g / L, more preferably 500 ⁇ g / L, more preferably 100 ⁇ g / L, more preferably 90 ⁇ g / L, more preferably 80 ⁇ g / L, and more preferably 70 ⁇ g. / L, more preferably 60 ⁇ g / L, more preferably 50 ⁇ g / L, more preferably 40 ⁇ g / L, more preferably 30 ⁇ g / L, more preferably 20 ⁇ g / L, more preferably 10 ⁇ g / L, more preferably 9 ⁇ g / L. L, more preferably 8 ⁇ g / L, more preferably 7 ⁇ g / L, more preferably 6 ⁇ g / L, more preferably 5 ⁇ g / L, more preferably 4 ⁇ g / L.
  • step (a) of the present invention endometrial cells induced to differentiate from pluripotent stem cells are used.
  • Primitive intestinal cells (PGT) by culturing in the presence of a bone-forming protein (BMP) signal inhibitor and an analog of retinoic acid or retinoic acid under culture conditions suitable for inducing differentiation into primitive intestinal cells (PGT).
  • BMP bone-forming protein
  • Induce differentiation Primitive intestinal tract by culturing endometrial cells induced to differentiate from pluripotent stem cells in step (a) in the presence of bone morphogenetic protein (BMP) signal inhibitors and retinoic acid or retinoic acid analogs.
  • BMP bone morphogenetic protein
  • the culture conditions suitable for inducing differentiation into primordial intestinal cells (PGT) are those in which endometrial cells induced to differentiate from pluripotent stem cells can be suitably induced in differentiation into primordial intestinal cells (PGT).
  • the differentiation-inducing medium is not particularly limited as long as it is a medium that induces differentiation of endoderm cells (PGT), but as one embodiment, it can be cultured in a differentiation-inducing medium described later. Can be mentioned.
  • the lower limit of the amount of the bone morphogenetic protein (BMP) signal inhibitor added to the medium used in the step (a) is preferably 0.01 ⁇ moL when the bone morphogenetic protein (BMP) signal inhibitor is Dorsomorphin. / L, more preferably 0.05 ⁇ moL / L, more preferably 0.1 ⁇ moL / L, more preferably 0.3 ⁇ moL / L, more preferably 0.5 ⁇ moL / L, more preferably 0.6 ⁇ moL / L, more preferably.
  • Is 0.7 ⁇ moL / L more preferably 0.8 ⁇ moL / L, more preferably 0.9 ⁇ moL / L, and more preferably 1 ⁇ moL / L.
  • the upper limit of the content of dolsomorphine in the medium is preferably 20 ⁇ moL / L, more preferably 15 ⁇ moL / L, more preferably 10 ⁇ moL / L, more preferably 7 ⁇ moL / L, more preferably 5 ⁇ moL / L, and more preferably 4 ⁇ moL / L.
  • L more preferably 3 ⁇ moL / L, more preferably 2 ⁇ moL / L, more preferably 1 ⁇ moL / L.
  • the lower limit of the content of LDN193189 in the medium is preferably 0.01 ⁇ moL / L, more preferably 0.02 ⁇ moL / L, more preferably 0.05 ⁇ moL / L. , More preferably 0.1 ⁇ moL / L, more preferably 0.2 ⁇ moL / L, more preferably 0.3 ⁇ moL / L, more preferably 0.4 ⁇ moL / L, more preferably 0.5 ⁇ moL / L, more preferably 0. It is 0.6 ⁇ mo L / L.
  • the upper limit of the content of LDN193189 in the medium is preferably 10 ⁇ moL / L, more preferably 5 ⁇ moL / L, more preferably 1 ⁇ moL / L, more preferably 0.9 ⁇ moL / L, more preferably 0.8 ⁇ moL / L, and more preferably. Is 0.7 ⁇ mo L / L.
  • the lower limit of the amount of retinoic acid or analog retinoic acid (EC23, etc.) added to the medium used in the step (a) is preferably 0.01 ⁇ mol / L, more preferably 0.02 ⁇ mol / L, and more preferably 0. 03 ⁇ mol / L, more preferably 0.05 ⁇ mol / L, more preferably 0.1 ⁇ mol / L, more preferably 0.2 ⁇ mol / L, more preferably 0.3 ⁇ mol / L, more preferably 0.4 ⁇ mol / L, and more.
  • 0.5 ⁇ mol / L Preferably 0.5 ⁇ mol / L, more preferably 0.6 ⁇ mol / L, more preferably 0.7 ⁇ mol / L, more preferably 0.8 ⁇ mol / L, more preferably 0.9 ⁇ mol / L, more preferably 1.0 ⁇ mol. / L.
  • the upper limit of the amount of retinoic acid analog (EC23, etc.) added to the medium is preferably 5.0 ⁇ mol / L, more preferably 4.0 ⁇ mol / L, more preferably 3.0 ⁇ mol / L, and more preferably 2.0 ⁇ mol / L. L, more preferably 1.0 ⁇ mol / L.
  • the step (a) may be performed in the presence of a ROCK signal inhibitor (Y27632, etc.).
  • the lower limit of the content of the ROCK signal inhibitor (Y27632, etc.) in the medium is preferably 0.1 ⁇ mo L / L, more preferably 0. It is .5 ⁇ moL / L, more preferably 1 ⁇ moL / L, more preferably 1.5 ⁇ moL / L, more preferably 2.0 ⁇ moL / L, and even more preferably 2.5 ⁇ moL / L.
  • the upper limit of the content of the ROCK signal inhibitor (Y27632, etc.) in the medium is preferably 100 ⁇ moL / L, more preferably 50 ⁇ moL / L, more preferably 40 ⁇ moL / L, more preferably 30 ⁇ moL / L, and more preferably 20 ⁇ moL / L. , More preferably 10 ⁇ moL / L, more preferably 5 ⁇ moL / L, more preferably 4 ⁇ moL / L, more preferably 3 ⁇ moL / L, and more preferably 2.5 ⁇ moL / L.
  • the medium used in the step (a) is preferably a medium containing an insulin receptor signal activator.
  • the lower limit of the amount of insulin receptor signal activator added to the medium is preferably 0.001 mg / L, more preferably 0.01 mg / L, more preferably 0.1 mg / L, more preferably 1 mg / L, and more. It is preferably 2 mg / L, more preferably 3 mg / L, more preferably 4 mg / L, and even more preferably 5 mg / L.
  • the upper limit of the amount of insulin receptor signal activator added to the medium is preferably 1000 mg / L, more preferably 500 mg / L, more preferably 100 mg / L, more preferably 90 mg / L, and more preferably 80 mg / L.
  • the medium used in the step (a) is preferably a medium containing insulin, transferrin and selenous acid.
  • Insulin, transferrin and selenous acid may be included in the medium in the form of commercially available mixtures such as B27 supplements.
  • Ethanolamine may be included in addition to insulin, transferrin and selenous acid.
  • the lower limit of the amount of transferrin added to the medium is preferably 0.001 mg / L, more preferably 0.01 mg / L, more preferably 0.1 mg / L, more preferably 1 mg / L, and more preferably 2 mg / L. More preferably 2.1 mg / L, more preferably 2.2 mg / L, more preferably 2.3 mg / L, more preferably 2.4 mg / L, more preferably 2.5 mg / L, still more preferably 2. It is 6 mg / L, more preferably 2.7 mg / L.
  • the upper limit of the amount of transferrin added to the medium is preferably 1000 mg / L, more preferably 500 mg / L, more preferably 100 mg / L, more preferably 90 mg / L, more preferably 80 mg / L, and more preferably 70 mg / L.
  • the lower limit of the amount of selenous acid added to the medium is preferably 0.001 ⁇ g / L, more preferably 0.01 ⁇ g / L, more preferably 0.1 ⁇ g / L, more preferably 1 ⁇ g / L, and more preferably 2 ⁇ g / L. L, more preferably 2.1 ⁇ g / L, more preferably 2.2 ⁇ g / L, more preferably 2.3 ⁇ g / L, more preferably 2.4 ⁇ g / L, more preferably 2.5 ⁇ g / L, more preferably.
  • the upper limit of the amount of selenous acid added to the medium is preferably 1000 ⁇ g / L, more preferably 500 ⁇ g / L, more preferably 100 ⁇ g / L, more preferably 90 ⁇ g / L, more preferably 80 ⁇ g / L, and more preferably 70 ⁇ g.
  • / L more preferably 60 ⁇ g / L, more preferably 50 ⁇ g / L, more preferably 40 ⁇ g / L, more preferably 30 ⁇ g / L, more preferably 20 ⁇ g / L, more preferably 10 ⁇ g / L, more preferably 9 ⁇ g / L. L, more preferably 8 ⁇ g / L, more preferably 7 ⁇ g / L, more preferably 6 ⁇ g / L, more preferably 5 ⁇ g / L, more preferably 4 ⁇ g / L.
  • the medium used in the step (a) is preferably a medium containing an FGF receptor signal activator.
  • the culture in the step (a) is performed in the absence of FGF2.
  • the lower limit of the amount of FGF receptor signal activator added to the medium is preferably 1 ng / mL, more preferably 5 ng / mL, more preferably 10 ng / mL, more preferably 20 ng / mL, more preferably 30 ng / mL. It is more preferably 40 ng / mL and more preferably 50 ng / mL.
  • the upper limit of the amount of the FGF receptor signal activator added to the medium is preferably 500 ng / mL, more preferably 400 ng / mL, more preferably 300 ng / mL, more preferably 200 ng / mL, and more preferably 100 ng / mL.
  • the medium used in the step (a) is preferably a medium containing a B27 (registered trademark) supplement and / or FGF7.
  • the lower limit of the amount of B27® supplement added to the medium is preferably 0.01%, more preferably 0.1%, more preferably 0.2%, more preferably 0.3%, more preferably 0. It is 0.4%, more preferably 0.5%, more preferably 0.6%, more preferably 0.7%, more preferably 0.8%, and even more preferably 0.9%.
  • the upper limit of the amount of B27® supplement added to the medium is preferably 10%, more preferably 9%, more preferably 8%, more preferably 7%, more preferably 6%, more preferably 5%. It is more preferably 4%, more preferably 3%, more preferably 2%, and even more preferably 1%.
  • the lower limit of the amount of FGF7 added to the medium is preferably 1 ng / mL, more preferably 5 ng / mL, more preferably 10 ng / mL, more preferably 20 ng / mL, more preferably 30 ng / mL, and more preferably 40 ng / mL. , More preferably 50 ng / mL.
  • the upper limit of the amount of FGF7 added to the medium is preferably 500 ng / mL, more preferably 400 ng / mL, more preferably 300 ng / mL, more preferably 200 ng / mL, more preferably 100 ng / mL, and more preferably 90 ng / mL. , More preferably 80 ng / mL, more preferably 70 ng / mL, more preferably 60 ng / mL, more preferably 50 ng / mL.
  • the culture in the step (a) is a culture in the absence of a hedgehog (HH) signal inhibitor, and more preferably a culture in the absence of a TGF ⁇ signal inhibitor.
  • HH hedgehog
  • the medium is MEM medium, BME medium, DMEM medium, DMEM / F12 medium, ⁇ MEM medium, IMDM medium, ES medium, DM-160 medium, Fisher medium, F12 medium, WE medium, RPMI1640 medium, depending on the type of cell. , Essential 6 TM medium (Thermo Fisher Scientific), or a mixed medium thereof or the like can be used.
  • the medium may further contain bovine serum albumin (BSA) or human serum albumin (HSA).
  • BSA bovine serum albumin
  • HSA human serum albumin
  • the lipid contained in BSA or HSA is 2 mg / g or less, and the free fatty acid is 0.2 mg / g or less.
  • the lower limit of the amount of BSA added to the medium is preferably 0.01% (% by weight), more preferably 0.05%, more preferably 0.10%, more preferably 0.15%, and even more preferably 0. It is 20%, more preferably 0.25%.
  • the upper limit of the amount of BSA added to the medium is preferably 1.00%, more preferably 0.90%, more preferably 0.80%, more preferably 0.70%, more preferably 0.60%, and more. It is preferably 0.50%, more preferably 0.40%, more preferably 0.30%, and even more preferably 0.25%.
  • the medium may further contain sodium pyruvate.
  • the lower limit of the amount of sodium pyruvate added to the medium is preferably 0.01 mmol / L, more preferably 0.05 mmol / L, more preferably 0.1 mmol / L, more preferably 0.2 mmol / L, and more preferably 0. It is .5 mmol / L, more preferably 0.6 mmol / L, more preferably 0.7 mmol / L, more preferably 0.8 mmol / L, more preferably 0.9 mmol / L, and even more preferably 1 mmol / L.
  • the upper limit of the amount of sodium pyruvate added to the medium is preferably 20 mmol / L, more preferably 15 mmol / L, more preferably 10 mmol / L, more preferably 5 mmol / L, more preferably 4 mmol / L, and more preferably 3 mmol / L. L, more preferably 2 mmol / L, more preferably 1 mmol / L.
  • the medium may further contain NEAA (eg, 1 ⁇ non-essential amino acids (NEAA; Wako), etc.).
  • the lower limit of the content of NEAA in the medium is preferably 0.05 ⁇ NEAA, more preferably 0.1 ⁇ NEAA, more preferably 0.5 ⁇ NEAA, more preferably 0.6 ⁇ NEAA, and more preferably 0. It is 7 ⁇ NEAA, more preferably 0.8 ⁇ NEAA, more preferably 0.9 ⁇ NEAA, and more preferably 1 ⁇ NEAA.
  • the upper limit of the content of NEAA in the medium is preferably 20 ⁇ NEAA, more preferably 15 ⁇ NEAA, more preferably 10 ⁇ NEAA, more preferably 5 ⁇ NEAA, more preferably 4 ⁇ NEAA, and more preferably 3 ⁇ NEAA. , More preferably 2 ⁇ NEAA, more preferably 1 ⁇ NEAA.
  • the medium may further contain a growth factor stabilizer (such as heparin).
  • a growth factor stabilizer such as heparin
  • the lower limit of the amount of growth factor stabilizer (heparin, etc.) added to the medium is preferably 0.2 ⁇ g / mL, more preferably 0.5 ⁇ g / mL, more preferably 1 ⁇ g / mL, more preferably 2 ⁇ g / mL, and more. It is preferably 3 ⁇ g / mL, more preferably 4 ⁇ g / mL, and more preferably 5 ⁇ g / mL.
  • the upper limit of the amount of growth factor stabilizer (heparin, etc.) added to the medium is preferably 100 ⁇ g / mL, more preferably 90 ⁇ g / mL, more preferably 80 ⁇ g / mL, more preferably 70 ⁇ g / mL, and more preferably 60 ⁇ g / mL. mL, more preferably 50 ⁇ g / mL, more preferably 40 ⁇ g / mL, more preferably 30 ⁇ g / mL, more preferably 20 ⁇ g / mL, more preferably 10 ⁇ g / mL, more preferably 9 ⁇ g / mL, more preferably 8 ⁇ g / mL. , More preferably 7 ⁇ g / mL, more preferably 6 ⁇ g / mL, more preferably 5 ⁇ g / mL.
  • the medium may further contain antibiotics such as penicillin and streptomycin.
  • the culture temperature is not particularly limited as long as it is suitable for culturing the pluripotent stem cells to be used, but is generally 30 ° C to 40 ° C, preferably about 37 ° C. It is preferable to culture in a CO 2 concentration atmosphere of about 1 to 10%, preferably 5% using a CO 2 incubator or the like.
  • Culturing may be carried out with stirring.
  • the stirring speed is not particularly limited, but the upper limit is preferably 200 rpm, more preferably 150 rpm, still more preferably 120 rpm, more preferably 110 rpm, more preferably 100 rpm, more preferably 90 rpm, more preferably 80 rpm, more preferably 70 rpm. It can be particularly preferably 60 rpm and most preferably 55 rpm.
  • the lower limit can be preferably 1 rpm, more preferably 10 rpm, still more preferably 20 rpm, more preferably 30 rpm, more preferably 40 rpm, particularly preferably 50 rpm, and most preferably 55 rpm.
  • step (b) of the present invention the primitive intestinal tract induced to differentiate from endometrial cells. Differentiation is induced into pancreatic endocrine progenitor cells (EP) under culture conditions suitable for inducing differentiation of cells (PGT) into pancreatic endocrine progenitor cells (EP). Culture conditions suitable for inducing differentiation into pancreatic endocrine progenitor cells (EP) are culture conditions in which primitive intestinal cells (PGT) induced to differentiate from endometrial cells can be suitably induced to differentiate into pancreatic endocrine progenitor cells (EP).
  • EP pancreatic endocrine progenitor cells
  • the differentiation-inducing medium is not particularly limited as long as it is a medium that induces differentiation of primitive intestinal cells (PGT) into pancreatic endocrine progenitor cells (EP), but as one embodiment, a differentiation-inducing medium described later is used. Culturing is mentioned.
  • the step (b) in the present invention is carried out in the absence of ascorbic acid from the viewpoint of efficiently inducing the differentiation of pancreatic ⁇ cells from primitive intestinal cells (PGT).
  • the step (b) in the present invention is a step of inducing differentiation of posterior anterior intestinal cells (PFG) from primitive intestinal cells (PGT) induced to differentiate from endometrial cells, and pancreatic progenitor cells from the posterior anterior intestinal cells (PFG). It includes a step of inducing differentiation into (PP) and a step of inducing differentiation from the pancreatic progenitor cell (PP) into a pancreatic endocrine progenitor cell (EP).
  • PTT primitive intestinal cells
  • EP pancreatic progenitor cells
  • the step (b) in the present invention is (B1) A step of inducing differentiation into posterior anterior enterocytes (PFG) by culturing the primitive intestinal cells (PGT) in the presence of a protein kinase C (PKC) activator: (B2) A step of inducing differentiation into pancreatic progenitor cells (PP) by culturing the posterior progenitor cells (PFG) in the presence of retinoic acid or an analog thereof: and (b3) The pancreatic progenitor cells (PP). Step of inducing differentiation into pancreatic endocrine progenitor cells (EP) by culturing in the presence of Notch signal inhibitor and ROCK signal inhibitor: May include.
  • the differentiation-inducing medium is not particularly limited as long as it is a medium that induces differentiation of primitive intestinal cells (PGT) into posterior anterior enterocytes (PFG), but as one embodiment, a differentiation-inducing medium described later is used. Culturing is mentioned.
  • the lower limit of the content of the PKC activator in the medium used in the step (b1) is preferably 0.01 ⁇ moL / L, more preferably 0.02 ⁇ moL / L, more preferably 0.05 ⁇ moL / L, and more preferably 0. .1 ⁇ moL / L, more preferably 0.2 ⁇ moL / L, more preferably 0.3 ⁇ moL / L.
  • the upper limit of the PKC activator content in the medium is preferably 10 ⁇ moL / L, more preferably 5 ⁇ moL / L, more preferably 1 ⁇ moL / L, more preferably 0.8 ⁇ moL / L, more preferably 0.5 ⁇ moL / L, It is more preferably 0.4 moL / L, and more preferably 0.3 ⁇ mo L / L.
  • the medium used in the step (b1) may contain a hedgehog (HH) signal inhibitor (SANT1 or the like).
  • the lower limit of the amount of the HH signal inhibitor (SANT1, etc.) added to the medium is preferably 0.01 ⁇ mol / L, more preferably 0.02 ⁇ mol / L, more preferably 0.03 ⁇ mol / L, and more preferably 0.05 ⁇ mol / L. L, more preferably 0.10 ⁇ mol / L, more preferably 0.15 ⁇ mol / L, more preferably 0.20 ⁇ mol / L, and even more preferably 0.25 ⁇ mol / L.
  • the upper limit of the amount of the HH signal inhibitor (SANT1, etc.) added to the medium is preferably 5.0 ⁇ mol / L, more preferably 4.0 ⁇ mol / L, more preferably 3.0 ⁇ mol / L, and more preferably 2.0 ⁇ mol / L. L, more preferably 1.0 ⁇ mol / L, more preferably 0.80 ⁇ mol / L, more preferably 0.70 ⁇ mol / L, more preferably 0.60 ⁇ mol / L, more preferably 0.50 ⁇ mol / L, more preferably. It is 0.40 ⁇ mol / L, more preferably 0.30 ⁇ mol / L, and more preferably 0.25 ⁇ mol / L.
  • the medium used in the step (b1) may contain a bone morphogenetic protein (BMP) signal inhibitor.
  • BMP bone morphogenetic protein
  • the lower limit of the content of LDN193189 in the medium is preferably 0.01 ⁇ moL / L, more preferably 0.02 ⁇ moL / L, more preferably 0.05 ⁇ moL / L. , More preferably 0.1 ⁇ moL / L, more preferably 0.2 ⁇ moL / L.
  • the upper limit of the content of LDN193189 in the medium is preferably 10 ⁇ moL / L, more preferably 5 ⁇ moL / L, more preferably 1 ⁇ moL / L, more preferably 0.8 ⁇ moL / L, more preferably 0.5 ⁇ moL / L, and more preferably.
  • the medium used in the step (b1) may contain an EGF receptor signal activator.
  • the lower limit of the amount of EGF receptor signal activator added to the medium is preferably 1 ng / mL, more preferably 5 ng / mL, more preferably 10 ng / mL, more preferably 15 ng / mL, more preferably 20 ng / mL. More preferably, it is 25 ng / mL.
  • the upper limit of the amount of the EGF receptor signal activator added to the medium is preferably 500 ng / mL, more preferably 400 ng / mL, more preferably 300 ng / mL, more preferably 200 ng / mL, and more preferably 100 ng / mL. It is more preferably 50 ng / mL, more preferably 40 ng / mL, more preferably 30 ng / mL, and even more preferably 25 ng / mL.
  • the medium used in the step (b1) may contain an analog of retinoic acid (EC23, etc.).
  • the amount of the analog retinoic acid added to the medium is as described in [2] above.
  • the medium used in the step (b1) may contain NEAA (for example, 1 ⁇ non-essential amino acids (NEAA; Wako)).
  • NEAA for example, 1 ⁇ non-essential amino acids (NEAA; Wako)
  • the amount of NEAA added to the medium is as described in [2] above.
  • the medium in step (b1) may contain an FGF receptor signal activator. Particularly preferably, it contains FGF7.
  • the amount of the FGF receptor signal activator added to the medium is as described in [2] above.
  • FIG. 3 Differentiation-inducing factors and other additives used for inducing differentiation of posterior progenitor cells (PFG) into pancreatic progenitor cells (PP)
  • posterior progenitor cells PFG
  • PFG posterior progenitor cells
  • the culture conditions suitable for inducing differentiation into pancreatic progenitor cells (PP) are not particularly limited as long as they are culture conditions capable of inducing differentiation of posterior anterior intestinal cells (PFG) into pancreatic progenitor cells (PP).
  • the differentiation-inducing medium is not particularly limited as long as it is a medium that induces differentiation of posterior anterior intestinal cells (PFG) into pancreatic progenitor cells (PP), but as one embodiment, a differentiation-inducing medium described later is used. Culturing is mentioned.
  • the amount of retinoic acid or retinoic acid analog (EC23, etc.) added to the medium used in the step (b2) is as described in [2] above.
  • the medium used in the step (b2) may contain a hedgehog (HH) signal inhibitor (SANT1 or the like).
  • the amount of the hedgehog (HH) signal inhibitor (SANT1 or the like) added to the medium is as described in [3-1] above.
  • the medium used in the step (b2) may contain NEAA (for example, 1 ⁇ non-essential amino acids (NEAA; Wako), etc.).
  • NEAA for example, 1 ⁇ non-essential amino acids (NEAA; Wako), etc.
  • the amount of NEAA added to the medium is as described in [2] above.
  • the medium in step (b2) may contain a bone morphogenetic protein (BMP) signal inhibitor.
  • BMP bone morphogenetic protein
  • the medium in step (b2) may contain an FGF receptor signal activator. Particularly preferred is FGF10.
  • FGF10 The amount of the FGF receptor signal activator added to the medium is as described in [2] above.
  • the medium in step (b2) may contain a protein kinase C (PKC) activator.
  • PKC protein kinase C
  • the amount of the protein kinase C (PKC) activator added to the medium is as described in [3-1] above.
  • the medium in step (b2) may contain an EGF receptor signal activator.
  • the amount of the EGF receptor signal activator added to the medium is as described in [3-1] above.
  • the medium in step (b2) may contain a TGF- ⁇ receptor signal inhibitor (RepSOX, etc.).
  • the lower limit of the content of the TGF- ⁇ receptor signal inhibitor (RepSOX, etc.) in the medium is preferably 0.01 ⁇ moL / L, more preferably 0.05 ⁇ moL / L, more preferably 0.1 ⁇ moL / L, and more preferably.
  • the upper limit of the content of the TGF- ⁇ receptor signal inhibitor (RepSOX, etc.) in the medium is preferably 10 ⁇ moL / L, more preferably 8 ⁇ moL / L, more preferably 5 ⁇ moL / L, more preferably 4 ⁇ moL / L, and more preferably.
  • the medium in step (b2) may contain ZnSO 4.
  • the lower limit of the content of ZnSO 4 in the medium is preferably 0.1 ⁇ moL / L, more preferably 0.5 ⁇ moL / L, more preferably 1 ⁇ moL / L, more preferably 3 ⁇ moL / L, and more preferably 5 ⁇ moL / L. ..
  • the upper limit of the content of ZnSO 4 in the medium is preferably 100 ⁇ moL / L, more preferably 80 ⁇ moL / L, more preferably 50 ⁇ moL / L, more preferably 40 ⁇ moL / L, more preferably 30 ⁇ moL / L, and more preferably 20 ⁇ moL / L. L, more preferably 15 ⁇ moL / L, more preferably 12 ⁇ moL / L, more preferably 10 ⁇ moL / L, and even more preferably 5 ⁇ moL / L.
  • pancreatic progenitor cells (PP) pancreatic progenitor cells
  • EP pancreatic endocrine progenitor cells
  • the pancreatic progenitor cells (PP) Is induced to differentiate into pancreatic endocrine progenitor cells (EP) by culturing in the presence of Notch signal inhibitor and ROCK signal inhibitor under culture conditions suitable for inducing differentiation into pancreatic endocrine progenitor cells (EP).
  • the culture conditions suitable for inducing differentiation into endocrine progenitor cells are not particularly limited as long as they are culture conditions capable of inducing differentiation of posterior anterior intestinal cells (PP) into pancreatic endocrine progenitor cells (EP).
  • the differentiation-inducing medium is not particularly limited as long as it is a medium that induces differentiation of posterior anterior intestinal cells (PP) into pancreatic endocrine progenitor cells (EP). And cultivate.
  • the lower limit of the amount of Notch signal inhibitor (DBZ, etc.) added to the medium in the step (b3) is preferably 0.01 ⁇ mol / L, more preferably 0.02 ⁇ mol / L, more preferably 0.03 ⁇ mol / L, and more preferably.
  • the upper limit of the amount of Notch signal inhibitor (DBZ, etc.) added to the medium is preferably 5.0 ⁇ mol / L, more preferably 4.0 ⁇ mol / L, more preferably 3.0 ⁇ mol / L, and more preferably 2.0 ⁇ mol / L. L, more preferably 1.0 ⁇ mol / L, more preferably 0.9 ⁇ mol / L, more preferably 0.8 ⁇ mol / L, more preferably 0.7 ⁇ mol / L, more preferably 0.6 ⁇ mol / L, more preferably. It is 0.5 ⁇ mol / L.
  • the medium used in the step (b3) may contain a hedgehog (HH) signal inhibitor (SANT1 or the like).
  • the amount of the hedgehog (HH) signal inhibitor (SANT1 or the like) added to the medium is as described in [3-1] above.
  • the medium used in the step (b3) may contain an analog of retinoic acid (EC23, etc.).
  • the amount of the analog retinoic acid added to the medium is as described in [2] above.
  • the medium used in step (b3) may contain L-glutamine.
  • the lower limit of the content of L-glutamine in the medium is preferably 0.01 mmol / L, more preferably 0.05 mmol / L, more preferably 0.1 mmol / L, more preferably 0.5 mmol / L, and more preferably. It is 0.7 mmol / L, more preferably 1.0 mmol / L, more preferably 1.2 mmol / L, more preferably 1.5 mmol / L, and even more preferably 2.0 mmol / L.
  • the upper limit of the content of L-glutamine in the medium is preferably 100 mmol / L, more preferably 50 mmol / L, more preferably 40 mmol / L, more preferably 30 mmol / L, more preferably 20 mmol / L, and more preferably 10 mmol. / L, more preferably 9 mmol / L, more preferably 8 mmol / L, more preferably 7 mmol / L, more preferably 6 mmol / L, more preferably 5 mmol / L, more preferably 4 mmol / L, more preferably 3 mmol / L. L, more preferably 2 mmol / L.
  • the medium in step (b3) may contain a bone morphogenetic protein (BMP) signal inhibitor.
  • BMP bone morphogenetic protein
  • the medium in step (b3) may contain a TGF- ⁇ receptor signal inhibitor.
  • the amount of the TGF- ⁇ receptor signal inhibitor added to the medium is as described in [3-2] above.
  • the medium in step (b3) may contain ZnSO 4.
  • the amount of ZnSO 4 added to the medium is as described in [3-2] above.
  • the medium in step (b3) may contain a growth factor stabilizer (heparin or the like).
  • the amount of the growth factor stabilizer (heparin, etc.) added to the medium is as described in [2] above.
  • the medium in step (b3) may contain nicotinamide.
  • the lower limit of the content of nicotinamide in the medium is preferably 0.1 mmoL / L, more preferably 0.5 mmoL / L, more preferably 1 mmoL / L, more preferably 3 mmoL / L, and more preferably 5 mmoL / L. ..
  • the upper limit of nicotinamide in the medium is preferably 100 mmoL / L, more preferably 80 mmoL / L, more preferably 50 mmoL / L, more preferably 40 mmoL / L, more preferably 30 mmoL / L, more preferably 20 mmoL / L, and more. It is preferably 15 mmoL / L, more preferably 12 mmoL / L, more preferably 10 mmoL / L, and even more preferably 5 mmoL / L.
  • the medium in step (b3) may contain an EGF receptor signal activator (EGF, etc.).
  • EGF receptor signal activator EGF, etc.
  • the amount of the EGF receptor signal activator (EGF, etc.) added to the medium is as described in [3-1] above.
  • the medium in step (b3) may contain a ROCK signal inhibitor (Y27632, etc.).
  • the lower limit of the content of the ROCK signal inhibitor (Y27632, etc.) in the medium is preferably 0.1 ⁇ mo L / L, more preferably 0.
  • .5 ⁇ moL / L more preferably 1 ⁇ moL / L, more preferably 3 ⁇ moL / L, more preferably 5 ⁇ moL / L, more preferably 6 ⁇ moL / L, more preferably 7 ⁇ moL / L, more preferably 8 ⁇ moL / L, more preferably 9 ⁇ moL / L, more preferably 10 ⁇ mo L / L.
  • the upper limit of the content of the ROCK signal inhibitor (Y27632, etc.) in the medium is preferably 100 ⁇ moL / L, more preferably 80 ⁇ moL / L, more preferably 50 ⁇ moL / L, more preferably 40 ⁇ moL / L, and more preferably 30 ⁇ moL / L. , More preferably 20 ⁇ moL / L, more preferably 10 ⁇ moL / L.
  • pancreatic endocrine progenitor cells are used.
  • Pancreatic ⁇ -cells are produced by culturing under conditions suitable for inducing differentiation into pancreatic ⁇ -cells.
  • the culture conditions suitable for inducing the differentiation into pancreatic ⁇ -cells are not particularly limited as long as the culture conditions can appropriately induce the differentiation of pancreatic endocrine progenitor cells (EP) into pancreatic ⁇ -cells.
  • the differentiation-inducing medium is not particularly limited as long as it is a medium that induces the differentiation of pancreatic endocrine progenitor cells (EP) into pancreatic ⁇ -cells, but as one embodiment, it is cultured in a differentiation-inducing medium described later. Can be mentioned.
  • the step (c) in the present invention is carried out in the absence of ascorbic acid from the viewpoint of efficiently inducing the differentiation of pancreatic ⁇ cells from pancreatic endocrine progenitor cells (EP).
  • the step (c) in the present invention is preferably performed under oxygen supply conditions.
  • pancreatic endocrine progenitor cells EP
  • the dissolved oxygen concentration in the culture solution is 20 when the dissolved oxygen concentration in the culture solution is 100% when the saturated dissolved oxygen concentration in the culture solution at 37 ° C. at 1 atm in the culture solution is 100%. It is preferable that the condition is controlled so as to be ⁇ 50%.
  • the dissolved oxygen concentration in the culture solution can be measured by, for example, a dissolved oxygen meter such as a fluorescent oxygen sensor or a galvanic cell oxygen sensor.
  • the oxygen supply is not particularly limited as long as it can supply oxygen to the medium, but for example, air or oxygen is supplied into the culture solution by using surface aeration or a sparger that aerated air or oxygen on the upper surface of the culture solution. Examples thereof include a sparging method and a method of supplying oxygen into a culture medium using microbubbles or nanobubbles, and surface aeration is preferable. In addition, these oxygen supply methods can be combined with performing step (c) under stirring culture.
  • the stirring conditions in the stirring culture are not particularly limited as long as oxygen is supplied to the culture solution, but the upper limit is preferably 200 rpm, more preferably 150 rpm, still more preferably 120 rpm, more preferably 100 rpm, and more preferably.
  • It can be 90 rpm, more preferably 80 rpm, more preferably 70 rpm, particularly preferably 60 rpm, and most preferably 55 rpm.
  • the lower limit can be preferably 1 rpm, more preferably 10 rpm, still more preferably 20 rpm, more preferably 30 rpm, more preferably 40 rpm, particularly preferably 50 rpm, and most preferably 55 rpm.
  • pancreatic endocrine progenitor cells may be cultured in the presence of insulin receptor signal activator, transferrin and selenite.
  • the amount of insulin receptor signal activator, transferrin and selenous acid added to the medium is as described in the above ⁇ medium>.
  • the medium in step (c) may contain a TGF- ⁇ receptor signal inhibitor.
  • the amount of the TGF- ⁇ receptor signal inhibitor added to the medium is as described in [3-2] above.
  • the medium in step (c) may contain ZnSO 4.
  • the amount of ZnSO 4 added to the medium is as described in [3-2] above.
  • the medium in step (c) may contain a GLP-1 (Glucagon-like peptide-1) receptor signal activator (Exendin 4, etc.).
  • the lower limit of the amount of GLP-1 (Glucagon-like peptide-1) receptor signal activator (Exendin 4, etc.) added to the medium is preferably 1 ng / mL, more preferably 5 ng / mL, and more preferably 10 ng / mL. , More preferably 20 ng / mL, more preferably 30 ng / mL, more preferably 40 ng / mL, more preferably 50 ng / mL.
  • the upper limit of the amount of the GLP-1 receptor signal activator (Exendin 4, etc.) added to the medium is preferably 500 ng / mL, more preferably 400 ng / mL, more preferably 300 ng / mL, more preferably 200 ng / mL, and more. It is preferably 100 ng / mL, more preferably 90 ng / mL, more preferably 80 ng / mL, more preferably 70 ng / mL, more preferably 60 ng / mL, and more preferably 50 ng / mL.
  • the medium in step (c) may contain a growth factor stabilizer (heparin or the like).
  • the amount of the growth factor stabilizer (heparin, etc.) added to the medium is as described in [2] above.
  • the medium in step (c) may contain nicotinamide.
  • the amount of nicotinamide added to the medium is as described in [3-3] above.
  • the medium in step (c) may contain a TGF ⁇ superfamily signal activator (BMP4, etc.).
  • the lower limit of the amount of TGF ⁇ superfamily signal activator (BMP4, etc.) added to the medium is preferably 0.2 ng / mL, more preferably 0.5 ng / mL, more preferably 1 ng / mL, and more preferably 3 ng / mL. , More preferably 5 ng / mL, more preferably 6 ng / mL, more preferably 7 ng / mL, more preferably 8 ng / mL, more preferably 9 ng / mL, more preferably 10 ng / mL.
  • the upper limit of the amount of the TGF ⁇ superfamily signal activator (BMP4, etc.) added to the medium is preferably 100 ng / mL, more preferably 90 ng / mL, more preferably 80 ng / mL, more preferably 70 ng / mL, and more preferably. It is 60 ng / mL, more preferably 50 ng / mL, more preferably 40 ng / mL, more preferably 30 ng / mL, more preferably 20 ng / mL, and more preferably 10 ng / mL.
  • the medium in step (c) may contain hepatocyte growth factor (HGF).
  • HGF hepatocyte growth factor
  • the lower limit of the amount of hepatocyte growth factor (HGF) added to the medium is preferably 1 ng / mL, more preferably 5 ng / mL, more preferably 10 ng / mL, more preferably 20 ng / mL, and more preferably 30 ng / mL. It is more preferably 40 ng / mL and more preferably 50 ng / mL.
  • the upper limit of the amount of hepatocellular growth factor (HGF) added to the medium is preferably 500 ng / mL, more preferably 400 ng / mL, more preferably 300 ng / mL, more preferably 200 ng / mL, and more preferably 100 ng / mL. It is more preferably 90 ng / mL, more preferably 80 ng / mL, more preferably 70 ng / mL, more preferably 60 ng / mL, and even more preferably 50 ng / mL.
  • HGF hepatocellular growth factor
  • the medium in step (c) may contain insulin-like growth factors (IGF1, etc.).
  • the lower limit of the amount of insulin-like growth factor (IGF1, etc.) added to the medium is preferably 1 ng / mL, more preferably 5 ng / mL, more preferably 10 ng / mL, more preferably 20 ng / mL, and more preferably 30 ng / mL. , More preferably 40 ng / mL, more preferably 50 ng / mL.
  • the upper limit of the amount of insulin-like growth factor (IGF1, etc.) added to the medium is preferably 500 ng / mL, more preferably 400 ng / mL, more preferably 300 ng / mL, more preferably 200 ng / mL, and more preferably 100 ng / mL. , More preferably 90 ng / mL, more preferably 80 ng / mL, more preferably 70 ng / mL, more preferably 60 ng / mL, more preferably 50 ng / mL.
  • the medium in step (c) may contain an Adenylate cyclase activator (Forskolin, etc.).
  • the lower limit of the content of the adenylate cyclase activator (Forskolin, etc.) in the medium is preferably 0.1 ⁇ moL / L, more preferably 0.3 ⁇ moL / L, more preferably 0.5 ⁇ moL / L, and more preferably 0.7 ⁇ moL. / L, more preferably 1 ⁇ moL / L, more preferably 2 ⁇ moL / L, more preferably 3 ⁇ moL / L, more preferably 4 ⁇ moL / L, and more preferably 5 ⁇ moL / L.
  • the upper limit of the content of the adenylate cyclase activator (Forskolin, etc.) in the medium is preferably 100 ⁇ moL / L, more preferably 80 ⁇ moL / L, more preferably 50 ⁇ moL / L, more preferably 40 ⁇ moL / L, and more preferably 30 ⁇ moL / L. L, more preferably 20 ⁇ moL / L, more preferably 15 ⁇ moL / L, more preferably 10 ⁇ moL / L, more preferably 7 ⁇ moL / L, more preferably 5 ⁇ moL / L.
  • pluripotent stem cells In the method for inducing differentiation of the present invention, endoderm cells induced to differentiate from pluripotent stem cells are used. It is preferable that the pluripotent stem cells before the induction of differentiation into endoderm cells are maintained undifferentiated by using an undifferentiated maintenance medium. A culture that maintains the undifferentiated state of pluripotent stem cells using an undifferentiated maintenance medium is also referred to as a maintenance culture of pluripotent stem cells.
  • the undifferentiated maintenance medium is not particularly limited as long as it can maintain the undifferentiated state of pluripotent stem cells, but has, for example, the property of maintaining the undifferentiated state of mouse embryonic stem cells and mouse induced pluripotent stem cells.
  • Examples include a medium containing a leukemia inhibity factor, which is known to be used, and a medium containing a basic FGF (Fibroblast growth factor), which is known to have the property of maintaining the undifferentiated state of human iPS. Be done.
  • human iPS cell medium (20% Knockout thermoreplacement (KSR; Gibco)), 1 ⁇ non-essential amino acids (NEAA; Wako), 55 ⁇ mol / L 2-mercaptoethanol (2-ME; Gibco), 7 .5 ng / mL recombinant human fibroblast growth factor2 (FGF2; Peprotech), 0.5xPencillin and Streptomycin (PS; Wako), DMEM / Ham's Fiber (PS; Wako), DMEM / Amino Acid Medium (PS) STEMPRO (registered trademark) hESC SFM (Life Technologies Japan Co., Ltd.), mTeSR1 (Veritas), TeSR2 (Veritas), StemFit (registered trademark) and the like can be used, but are not particularly limited.
  • the maintenance culture of pluripotent stem cells can be performed on suitable feeder cells (for example, SL10 feeder cells, SNL feeder cells, etc.) using the above-mentioned undifferentiated maintenance medium.
  • suitable feeder cells for example, SL10 feeder cells, SNL feeder cells, etc.
  • the above-mentioned undifferentiated maintenance medium can also be used on a cell culture dish coated with a cell adhesion protein such as vitronectin, fibronectin, laminin, collagen or matrigel, or an extracellular matrix.
  • the culture temperature is not particularly limited as long as it is suitable for culturing the pluripotent stem cells to be used, but is generally 30 ° C to 40 ° C, preferably about 37 ° C. It is preferable to culture in a CO 2 concentration atmosphere of about 1 to 10%, preferably 5% using a CO 2 incubator or the like.
  • the maintenance culture of pluripotent stem cells can be carried out for a desired period while subculturing.
  • the number of passages after maintenance culture is 1 to 100, preferably 10 to 50, and more preferably 25 to 40. It is preferable to use pluripotent stem cells to form aggregates and induce differentiation.
  • the suspension culture may be a static culture using a microwell or the like having viscosity or unevenness of the medium, or a culture under the condition that the liquid medium flows using a spinner or the like.
  • the culture is preferably carried out under the condition that the liquid medium flows.
  • the culture under the condition that the liquid medium flows the culture under the condition that the liquid medium flows so as to promote cell aggregation is preferable.
  • the liquid medium is used so that the cells gather at one point due to the stress (centrifugal force, afferent force) caused by the flow such as swirling flow and oscillating flow.
  • Examples thereof include culturing under conditions where the liquid medium flows by linear reciprocating motion, and culturing using a swirling flow and / or a oscillating flow is particularly preferable. Further, it may be suspended-cultured by adhering it to a microcarrier or the like in advance, or it may be suspended-cultured in the state of a cell aggregate composed of only cells, or a polymer such as collagen is contained in the cell aggregate. It may be mixed, and the form is not particularly limited.
  • the culture vessel used for suspension culture is preferably a vessel having low cell adhesion to the inner surface of the vessel.
  • a container having low cell adhesion to the inner surface of the container include a plate having a hydrophilic surface treatment with a biocompatible substance.
  • Nunclon TM Sphera Nunclon TM Sphera (Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.) can be used, but is not particularly limited.
  • the shape of the culture vessel is not particularly limited, and examples thereof include a culture vessel having a dish shape, a flask shape, a well shape, a bag shape, a spinner flask shape, and the like.
  • the period for forming aggregates is not particularly limited as long as it exceeds 6 hours, but specifically, 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, 7 days, or 2 days. It is preferable to form aggregates in a period of week, 3 weeks, 4 weeks, 5 weeks, 6 weeks, 7 weeks and 8 weeks.
  • the suspension culture medium is not particularly limited as long as it contains a component capable of proliferating pluripotent stem cells, but is an mTeSR1 (Veritas) medium containing 1 to 100 ⁇ M Y-27632 (Cayman) or 1 to 100 ⁇ M.
  • Y-27632 (Cayman), Ethential8 TM containing 1 to 100 mg / mL BSA and the like can be used.
  • the conditions for stirring or swirling in the suspension culture are not particularly limited as long as the pluripotent stem cells can form aggregates in the suspension, but the upper limit is preferably 200 rpm, more preferably 150 rpm, still more preferably.
  • the lower limit can be preferably 1 rpm, more preferably 10 rpm, still more preferably 20 rpm, more preferably 30 rpm, more preferably 40 rpm, and particularly preferably 45 rpm.
  • the swirling width during swirling culture is not particularly limited, but the lower limit can be, for example, 1 mm, preferably 10 mm, more preferably 20 mm, and most preferably 25 mm.
  • the upper limit of the turning width can be, for example, 200 mm, preferably 100 mm, preferably 50 mm, more preferably 30 mm, and most preferably 25 mm.
  • the radius of gyration during the swirling culture is also not particularly limited, but the swirling width is preferably set to be within the above range.
  • the lower limit of the radius of gyration can be, for example, 5 mm, preferably 10 mm, and the upper limit can be, for example, 100 mm, preferably 50 mm. It is preferable to set the conditions for swirling culture within this range because it becomes easy to produce cell aggregates having appropriate dimensions.
  • the suspension culture may be a shaking culture performed while flowing the liquid medium by shaking (rocking) stirring.
  • Shaking culture is performed by shaking a culture container containing a liquid medium and cells in a plane substantially perpendicular to a horizontal plane.
  • the swing speed is not particularly limited, but for example, swinging can be performed 2 to 50 times, preferably 4 to 25 times (one round trip is one round trip) per minute.
  • the swing angle is not particularly limited, but can be, for example, 0.1 ° to 20 °, more preferably 2 ° to 10 °. It is preferable to set the shaking culture conditions within this range because it is possible to produce cell aggregates having appropriate dimensions.
  • Suspension culture using a spinner flask-shaped culture container is a culture performed while stirring a liquid medium using a stirring blade in the culture container.
  • the number of revolutions and the amount of medium are not particularly limited. If it is a commercially available spinner flask-shaped culture vessel, the amount of the culture solution recommended by the manufacturer can be preferably used, and for example, a spinner flask manufactured by ABLE can also be preferably used.
  • the seeding density of cells in suspension culture is not particularly limited as long as the seeding density is such that the cells form aggregates, but it is preferably 1 ⁇ 10 5 to 1 ⁇ 10 7 cells / mL.
  • the seeding density of cells is preferably 2 ⁇ 10 5 cells / mL or more, 3 ⁇ 10 5 cells / mL or more, 4 ⁇ 10 5 cells / mL or more, or 5 ⁇ 10 5 cells / mL or more, preferably 9 ⁇ 10 6 cells / mL.
  • Cell aggregates contain hundreds to thousands of cells per aggregate.
  • the size (diameter) of the cell aggregate is not particularly limited, but for example, 50 ⁇ m or more, 55 ⁇ m or more, 60 ⁇ m or more, 65 ⁇ m or more, 70 ⁇ m or more, 80 ⁇ m or more, 90 ⁇ m or more, 100 ⁇ m or more, 110 ⁇ m or more, 120 ⁇ m. These include 130 ⁇ m or more, 140 ⁇ m or more, 150 ⁇ m or more, and 1000 ⁇ m or less, 900 ⁇ m or less, 800 ⁇ m or less, 700 ⁇ m or less, 600 ⁇ m or less, 500 ⁇ m or less, and 400 ⁇ m or less. Cell aggregates having a diameter in the range of 150 ⁇ m to 400 ⁇ m are suitable in the present invention. Cell aggregates having a diameter other than the above range may be mixed.
  • the amount of culture solution during suspension culture can be appropriately adjusted depending on the culture vessel used. For example, when a 12-well plate (the area of the bottom surface of the well in a plan view per well is 3.5 cm 2 ) is used. It can be 0.5 ml / well or more, 1.5 ml / well or less, and more preferably 1 ml / well. For example, when using a 6-well plate (the area of the bottom surface of the well in a plan view per well is 9.6 cm 2 ), 1.5 mL / well or more, preferably 2 mL / well or more, more preferably 3 mL / well or more.
  • It can be 6.0 mL / well or less, preferably 5 mL / well or less, and more preferably 4 mL / well or less.
  • 10 mL / container or more when using a 125 mL Erlenmeyer flask (triangular flask with a capacity of 125 mL), 10 mL / container or more, preferably 15 mL / container or more, more preferably 20 mL / container or more, more preferably 25 mL / container or more, more preferably 30 mL.
  • It can be 50 mL / container or less, more preferably 45 mL / container or less, and more preferably 40 mL / container or less.
  • 100 mL / container or more when using a 500 mL triangular flask (triangular flask having a capacity of 500 mL), 100 mL / container or more, preferably 105 mL / container or more, more preferably 110 mL / container or more, more preferably 115 mL / container or more, more preferably 120 mL. It can be 150 mL / container or less, more preferably 145 mL / container or less, more preferably 140 mL / container or less, more preferably 135 mL / container or less, more preferably 130 mL / container or less, more preferably 125 mL. / Can be less than or equal to the container.
  • 250 mL / container or more 250 mL / container or more, preferably 260 mL / container or more, more preferably 270 mL / container or more, more preferably 280 mL / container or more, more preferably 290 mL. It can be 350 mL / container or less, more preferably 340 mL / container or less, more preferably 330 mL / container or less, more preferably 320 mL / container or less, and more preferably 310 mL / container or less. ..
  • a 2000 mL Erlenmeyer flask (triangular flask having a capacity of 2000 mL)
  • it can be 500 mL / container or more, more preferably 550 mL / container or more, more preferably 600 mL / container or more, and 1000 mL / container or less, more preferably.
  • It can be 900 mL / container or less, more preferably 800 mL / container or less, and more preferably 700 mL / container or less.
  • 1000 mL / container or more preferably 1100 mL / container or more, more preferably 1200 mL / container or more, more preferably 1300 mL / container or more, more preferably 1400 mL / container or more.
  • it can be more preferably 1500 mL / container or more, 2000 mL / container or less, more preferably 1900 mL / container or less, more preferably 1800 mL / container or less, more preferably 1700 mL / container or less, more preferably 1600 mL / container or less. It can be as follows.
  • a 2L culture bag a disposable culture bag having a capacity of 2L
  • 100 mL / bag or more more preferably 200 mL / bag or more, more preferably 300 mL / bag or more, more preferably 400 mL / bag or more, more preferably 500 mL.
  • / Bag or more more preferably 600 mL / bag or more, more preferably 700 mL / bag or more, more preferably 800 mL / bag or more, more preferably 900 mL / bag or more, more preferably 1000 mL / bag or more, 2000 mL / Bag or less, more preferably 1900 mL / bag or less, more preferably 1800 mL / bag or less, more preferably 1700 mL / bag or less, more preferably 1600 mL / bag or less, more preferably 1500 mL / bag or less, more preferably 1400 mL / bag or less.
  • it can be more preferably 1300 mL / bag or less, more preferably 1200 mL / bag or less, and more preferably 1100 mL / bag or less.
  • a 10 L culture bag a disposable culture bag having a capacity of 10 L
  • 500 mL / bag or more more preferably 1 L / bag or more, more preferably 2 L / bag or more, more preferably 3 L / bag or more, more preferably 4 L.
  • / Bag or more more preferably 5L / bag or more, 10L / bag or less, more preferably 9L / bag or less, more preferably 8L / bag or less, more preferably 7L / bag or less, more preferably 6L / Can be less than or equal to a bag.
  • a 20 L culture bag a disposable culture bag having a capacity of 20 L
  • 1 L / bag or more more preferably 2 L / bag or more, more preferably 3 L / bag or more, more preferably 4 L / bag or more, more preferably.
  • It can be 5 L / bag or more, more preferably 6 L / bag or more, more preferably 7 L / bag or more, more preferably 8 L / bag or more, more preferably 9 L / bag or more, more preferably 10 L / bag or more.
  • 20 L / bag or less more preferably 19 L / bag or less, more preferably 18 L / bag or less, more preferably 17 L / bag or less, more preferably 16 L / bag or less, more preferably 15 L / bag or less, more preferably 14 L / bag. It can be less than or equal to a bag, more preferably 13 L / bag or less, more preferably 12 L / bag or less, and more preferably 11 L / bag or less.
  • a 50 L culture bag (a disposable culture bag having a capacity of 50 L), 1 L / bag or more, more preferably 2 L / bag or more, more preferably 5 L / bag or more, more preferably 10 L / bag or more, more preferably 15 L. / Bag or more, more preferably 20 L / bag or more, more preferably 25 L / bag or more, 50 L / bag or less, more preferably 45 L / bag or less, more preferably 40 L / bag or less, more preferably 35 L. It can be less than / bag, more preferably 30 L / bag or less. When the amount of the culture medium is in this range, cell aggregates of an appropriate size are likely to be formed.
  • the capacity of the culture vessel to be used can be appropriately selected and is not particularly limited, but the lower limit of the area when the bottom surface of the portion containing the liquid medium is viewed in a plan view is, for example, 0.32 cm 2 , preferably 0.65 cm 2. , more preferably 0.95 cm 2, more preferably 1.9 cm 2, it is more preferably 3.0 cm 2, 3.5 cm 2, 9.0 cm 2, or can be used culture vessel 9.6 cm 2, the upper limit as, for example 1000 cm 2, preferably 500 cm 2, more preferably 300 cm 2, more preferably 150 cm 2, more preferably 75 cm 2, more preferably 55cm 2, more preferably 25 cm 2, even more preferably 21cm 2, further More preferably, a 9.6 cm 2 or 3.5 cm 2 culture vessel can be used.
  • the culture temperature is not particularly limited as long as it is suitable for culturing the pluripotent stem cells to be used, but is generally 30 ° C to 40 ° C, preferably about 37 ° C. It is preferable to culture in a CO 2 concentration atmosphere of about 1 to 10%, preferably 5% using a CO 2 incubator or the like.
  • Preculture of pluripotent stem cells Before inducing differentiation of pluripotent stem cell aggregates or pluripotent stem cells into endometrial cells, suspension culture is performed using a medium containing 2-mercaptoethanol and stauprimid. , Cell populations can be prepared.
  • the medium used for preculture is MEM medium, BME medium, DMEM medium, DMEM / F12 medium, ⁇ MEM medium, IMDM medium, ES medium, DM-160 medium, Fisher medium, F12 medium, WE medium, depending on the type of cells. , RPMI1640 medium, Essential 6 TM medium (Thermo Fisher Scientific), or the like can be used.
  • Preculture of pluripotent stem cells is performed by suspension culture. It can be carried out under the above-mentioned suspension culture conditions, and further, it may be suspended-cultured by adhering it to a microcarrier or the like in advance, or it may be suspended-cultured in the state of a cell aggregate composed of only cells.
  • a polymer such as collagen may be mixed in the cell aggregate, and the morphology is not particularly limited.
  • the concentration of 2-mercaptoethanol in the medium used for preculture is not particularly limited as long as the efficiency of differentiation induction is improved.
  • the concentration of 2-mercaptoethanol is 1 ⁇ M or more, 2 ⁇ M or more, 5 ⁇ M or more. It is preferably 10 ⁇ M or more, 20 ⁇ M or more, 30 ⁇ M or more, 40 ⁇ M or more, or 50 ⁇ M or more, and preferably 200 ⁇ M or less, 150 ⁇ M or less, 120 ⁇ M or less, 100 ⁇ M or less, 90 ⁇ M or less, 80 ⁇ M or less, 70 ⁇ M or less, or 60 ⁇ M or less.
  • the concentration of stauprimide in the medium used for preculture is not particularly limited as long as the efficiency of induction of differentiation is improved, but for example, the concentration of stauprimide is preferably 0.01 ⁇ moL / L, more preferably 0.02 ⁇ moL. / L, more preferably 0.05 ⁇ moL / L, more preferably 0.1 ⁇ moL / L.
  • the upper limit of the content of stauprimide in the medium is preferably 10 ⁇ moL / L, more preferably 5 ⁇ moL / L, more preferably 1 ⁇ moL / L, more preferably 0.8 ⁇ moL / L, more preferably 0.5 ⁇ moL / L, and more preferably. Is 0.4 ⁇ moL / L, more preferably 0.3 ⁇ moL / L, more preferably 0.2 ⁇ moL / L, and more preferably 0.1 ⁇ moL / L.
  • the medium used for the preculture is a medium to which FGF2 (Fibroblast Growth Factor2) has not been added. By using a medium to which FGF2 is not added, it may be possible to further improve the efficiency of differentiation into endoderm cells. It is also preferable that the medium used for the preculture is a medium to which TGF- ⁇ 1 (Transforming growth factor- ⁇ 1) has not been added. By using a medium to which TGF- ⁇ 1 is not added, it may be possible to further improve the efficiency of differentiation into endoderm cells.
  • FGF2 Fibroblast Growth Factor2
  • TGF- ⁇ 1 Transforming growth factor- ⁇ 1
  • the medium used for the preculture is a medium to which no WNT signal activator has been added. By using a medium to which no WNT signal activator has been added, it may be possible to further improve the efficiency of differentiation into endoderm cells. It is also preferable that the medium used for the preculture is a medium to which Activin A (sometimes referred to as "ACTIVIN A" in the present specification) is not added. By using a medium to which activin A is not added, it may be possible to further improve the efficiency of differentiation into endoderm cells.
  • Activin A sometimes referred to as "ACTIVIN A" in the present specification
  • Amino acids, antibiotics, antioxidants and other additives may be added to the preculture medium.
  • 0.1-2% (volume / volume) NEAA (non-essential amino acid), 0.1-2% (volume / volume) penicillin / streptomycin, 0.1-20 mg / mL BSA or 1-25% (Volume / volume) (preferably 1 to 20% (volume / volume)) of Knockout serum essential (KSR) or the like may be added.
  • the culture temperature is not particularly limited as long as it is suitable for culturing the pluripotent stem cells to be used, but is generally 30 ° C to 40 ° C, preferably about 37 ° C. It is preferable to culture in a CO 2 concentration atmosphere of about 1 to 10%, preferably 5% using a CO 2 incubator or the like.
  • the culture period for pre-culturing pluripotent stem cells is not particularly limited as long as it is the number of days for culturing until pluripotency is improved, but it may be, for example, a period not exceeding one week. More specifically, it is less than 6 days, less than 5 days, less than 4 days, less than 3 days, or 6 hours to 48 hours, about 12 hours to 36 hours, and 18 hours to 24 hours.
  • the cell population obtained by the above preculture is differentiated into endoderm cells by culturing under conditions that can induce differentiation into endoderm cells. Can be induced.
  • Endoderm cells are tissues of organs such as the gastrointestinal tract, lungs, thyroid, pancreas, and liver, cells of secretory glands that open into the gastrointestinal tract, peritoneum, thoracic membrane, laryngeal, ear canal, trachea, bronchi, and urinary tract (bladder, bladder). It has the ability to differentiate into most of the urinary tract, part of the urinary tract, etc., and is commonly referred to as endoderm (DE). Differentiation from pluripotent stem cells to endoderm cells can be confirmed by measuring the expression level of genes specific to endoderm cells. Examples of genes specific to endoderm cells include SOX17, FOXA2, CXCR4, AFP, GATA4, EOMES and the like.
  • the pluripotent stem cells When inducing the differentiation of pluripotent stem cells into endometrial cells, the pluripotent stem cells are cultured using a differentiation-inducing medium.
  • the differentiation-inducing medium is not particularly limited as long as it is a medium that induces differentiation of pluripotent stem cells, and examples thereof include a serum-containing medium and a serum-free medium containing a serum substitute component.
  • primate ES / iPS cell medium (reprocell medium), BME medium, BGJb medium, CMRL 1066 medium, Glasgow MEM medium, Improved MEM Zinc Option medium, IMDM medium, Medium 199 medium, Eagle MEM. Medium, ⁇ MEM medium, DMEM medium, ham medium, RPMI1640 medium, Fisher's medium, and a medium obtained by mixing two or more kinds of media arbitrarily selected from these media can be used.
  • the medium is not particularly limited as long as it can be used for culturing animal cells.
  • the differentiation-inducing medium may contain a serum component or a serum substitute component.
  • Serum components or serum substitute components include, for example, albumin, insulin, transferase, fatty acids, collagen precursors, trace elements (eg zinc, selenium), B-27 supplements (Thermo Fisher Scientific), N2 supplements, N21 supplements (R & D). Systems), NeuroBrew-21 supplement (Milteniotech), Knockout serum replenishment (KSR), 2-mercaptoethanol, 3'thiolglycerol, and equivalents thereof.
  • Various additives, antibiotics, antioxidants, etc. may be further added to the differentiation-inducing medium.
  • / Volume) of streptomycin, 0.1-2% (volume / volume) of amphotericin B, catalase, glutathione, galactose, retinoic acid (vitamin A), superoxide dismutase, ascorbic acid (vitamin C), D- ⁇ -tocopherol (Vitamin E) and the like may be added.
  • differentiation-inducing factor is added to the differentiation-inducing medium. Details of the differentiation-inducing factors will be described later.
  • the culture of pluripotent stem cells at the time of inducing differentiation is preferably suspension culture.
  • the cells may be suspended-cultured by adhering them to a microcarrier or the like, or may be suspended-cultured in the state of a cell aggregate composed only of cells, or a polymer such as collagen is mixed in the cell aggregate. It may be used, and the form is not particularly limited.
  • the culture temperature in the culture for inducing differentiation is not particularly limited as long as it is a culture temperature suitable for culturing the pluripotent stem cells to be used, but is generally 30 ° C to 40 ° C, preferably about 37 ° C. Is. It is preferable to culture in a CO 2 concentration atmosphere of about 1 to 10%, preferably 5% using a CO 2 incubator or the like.
  • the culture period of the differentiation culture from pluripotent stem cells to endoderm cells is not particularly limited as long as it has a cell type exhibiting the cell characteristics of the endoderm lineage, but it may be, for example, within 2 weeks. More specifically, it is 2 days or more and 8 days or less, more preferably 2 days or more and 7 days or less, further preferably 3 days or more and 6 days or less, and an example is 4 days or 5 days.
  • endometrial cells activate pluripotent stem cells into TGF ⁇ (Transforming growth factor- ⁇ ) superfamily signal activation. It is an endodermal cell whose differentiation is induced by culturing in a medium containing an agent and then culturing in a medium to which FGF2 and BMP4 (Bone morphogenetic protein 4) are not added.
  • TGF ⁇ Transforming growth factor- ⁇
  • the initial concentration of Actibin A added is preferably 1 ng / mL or more, 2 ng / mL or more, 3 ng / mL or more, 5 ng / mL or more, 10 ng / mL or more, 20 ng / mL or more, 30 ng / mL or more, 40 ng / mL or more, or 50 ng / mL or more, preferably 1,000 ng / mL or less, 900 ng / mL or less, 800 ng / mL or less, 700 ng / mL or less, 600 ng / mL or less, 500 ng / mL or less, 400 ng / mL or less, 300 ng / mL or less, 200 ng / mL or less, 150 ng / mL or less, or 100 ng / mL or more
  • the initial concentration of FGF2 added is preferably 1 ng / mL or more, 2 ng / mL or more, 3 ng / mL or more, 5 ng / mL or more, 10 ng / mL or more. , 20 ng / mL or more, 30 ng / mL or more, or 40 ng / mL or more, preferably 1,000 ng / mL or less, 900 ng / mL or less, 800 ng / mL or less, 700 ng / mL or less, 600 ng / mL or less, 500 ng / mL.
  • the initial concentration of BMP4 added is preferably 1 ng / mL or more, 2 ng / mL or more, 3 ng / mL or more, 5 ng / mL or more, 6 ng / mL or more.
  • ng / mL or more 7 ng / mL or more, 8 ng / mL or more, 9 ng / mL or more, 10 ng / mL or more, 11 ng / mL or more, 12 ng / mL or more, 13 ng / mL or more, 14 ng / mL or more, or 15 ng / mL or more, preferably Is 1,000 ng / mL or less, 900 ng / mL or less, 800 ng / mL or less, 700 ng / mL or less, 600 ng / mL or less, 500 ng / mL or less, 400 ng / mL or less, 300 ng / mL or less, 200 ng / mL or less, 150 ng / mL, 100 ng / mL or less, 90 ng / mL or less, 80 ng / mL or less
  • the medium to which FGF2 and BMP4 are not added preferably contains activin A.
  • the initial concentration of Actibin A added is preferably 1 ng / mL or more, 2 ng / mL or more, 3 ng / mL or more, 5 ng / mL or more, 10 ng / mL or more.
  • ng / mL or more 20 ng / mL or more, 30 ng / mL or more, 40 ng / mL or more, or 50 ng / mL or more, preferably 1,000 ng / mL or less, 900 ng / mL or less, 800 ng / mL or less, 700 ng / mL or less, 600 ng / mL. It is mL or less, 500 ng / mL or less, 400 ng / mL or less, 300 ng / mL or less, 200 ng / mL or less, 150 ng / mL or less, or 100 ng / mL or less.
  • the medium to which FGF2 and BMP4 are not added preferably contains at least one selected from the group consisting of insulin, transferrin, sodium selenite and ethanolamine.
  • the concentration of insulin added is preferably 0.001 ⁇ g / mL or more, 0.01 ⁇ g / mL or more, 0.05 ⁇ g / mL or more, 0.1 ⁇ g / mL or more, 0.2 ⁇ g / mL or more, and preferably 10,000 ⁇ g.
  • / ML or less 1,000 ⁇ g / mL or less, 100 ⁇ g / mL or less, 10 ⁇ g / mL or less, 9 ⁇ g / mL or less, 8 ⁇ g / mL or less, 7 ⁇ g / mL or less, 6 ⁇ g / mL or less, 5 ⁇ g / mL or less, 4 ⁇ g / mL or less 3, 3 ⁇ g / mL or less, 2 ⁇ g / mL or less.
  • the concentration of transferase added is preferably 0.001 ⁇ g / mL or more, 0.01 ⁇ g / mL or more, 0.05 ⁇ g / mL or more, 0.06 ⁇ g / mL or more, 0.07 ⁇ g / mL or more, 0.08 ⁇ g / mL or more, 0.09 ⁇ g / mL or more, 0.1 ⁇ g / mL or more, 0.11 ⁇ g / mL or more, preferably 10,000 ⁇ g / mL or less, 1,000 ⁇ g / mL or less, 100 ⁇ g / mL or less, 10 ⁇ g / mL or less, 9 ⁇ g / ML or less, 8 ⁇ g / mL or less, 7 ⁇ g / mL or less, 6 ⁇ g / mL or less, 5 ⁇ g / mL or less, 4 ⁇ g / mL or less, 3 ⁇ g
  • the concentration of sodium selenite added is preferably 0.001 ng / mL or more, 0.01 ng / mL or more, 0.1 ng / mL or more, preferably 10,000 ng / mL or less, 1,000 ng / mL or less, It is 100 ng / mL or less, 10 ng / mL or less, and 1 ng / mL or less.
  • the concentration of ethanolamine added is preferably 0.001 ⁇ g / mL or more, 0.01 ⁇ g / mL or more, 0.02 ⁇ g / mL or more, 0.03 ⁇ g / mL or more, 0.04 ⁇ g / mL or more, and preferably 10, 000 ⁇ g / mL or less, 1,000 ⁇ g / mL or less, 100 ⁇ g / mL or less, 10 ⁇ g / mL or less, 1 ⁇ g / mL or less, 0.9 ⁇ g / mL or less, 0.8 ⁇ g / mL or less, 0.7 ⁇ g / mL or less, 0. It is 6 ⁇ g / mL or less, 0.5 ⁇ g / mL or less, and 0.4 ⁇ g / mL or less.
  • the medium containing the TGF ⁇ superfamily signal activator and / or the medium to which FGF2 and BMP4 are not added preferably further contains 2-mercaptoethanol.
  • 2-mercaptoethanol By acting 2-mercaptoethanol, the efficiency of inducing differentiation into endoderm cells can be enhanced.
  • the medium containing the TGF ⁇ superfamily signal activator preferably further contains a WNT signal activator.
  • the initial concentration of addition is preferably 0.01 ⁇ M or higher, 0.02 ⁇ M or higher, 0.03 ⁇ M or higher, 0.04 ⁇ M or higher, 0.05 ⁇ M or higher, 0.
  • ⁇ M or more 0.2 ⁇ M or more, 0.3 ⁇ M or more, 0.4 ⁇ M or more, 0.5 ⁇ M or more, 0.6 ⁇ M or more, 0.7 ⁇ M or more, 0.8 ⁇ M or more, 0.9 ⁇ M or more, 1 ⁇ M or more, or 2 ⁇ M or more It is preferably 100 ⁇ M or less, 90 ⁇ M or less, 80 ⁇ M or less, 70 ⁇ M or less, 60 ⁇ M or less, 50 ⁇ M or less, 45 ⁇ M or less, 40 ⁇ M or less, 35 ⁇ M or less, 30 ⁇ M or less, 25 ⁇ M or less, 20 ⁇ M or less, 15 ⁇ M or less, 10 ⁇ M or less, or 5 ⁇ M or less. Is. More preferably, it is 3 ⁇ M or 4 ⁇ M.
  • the medium containing the TGF ⁇ superfamily signal activator and / or the medium not containing FGF2 and BMP4 contains at least glucose.
  • the lower limit of the glucose concentration contained in the medium is not particularly limited as long as it is a concentration at which cells can proliferate, but is preferably 0.01 g / L or more.
  • the upper limit of the glucose concentration contained in the medium is not particularly limited as long as it does not kill cells, but is preferably 10 g / L or less, for example.
  • a medium containing glucose at less than 2.0 g / L is preferable from the viewpoint of efficiently differentiating into somatic cells of the endoderm lineage.
  • the concentration of glucose in the medium containing the TGF ⁇ superfamily signal activator and / or the medium not added with FGF2 and BMP4 may be 1.0 g / L or less, 0.9 g / L or less, and 0.8 g. It may be / L or less, 0.7 g / L or less, and 0.6 g / L or less.
  • the lower limit of the glucose concentration is not particularly limited, but may be 0.01 g / L or more.
  • It may be 0.02 g / L or more, 0.05 g / L or more, 0.1 g / L or more, 0.2 g / L or more, 0.3 g / L or more, 0.4 g / L or more, 0.5 g / L or more. ..
  • pancreatic ⁇ -cells obtained by the method of the present invention have glucagon secretory ability and are useful as a tool for elucidating the glucagon secretory mechanism in pancreatic islets and developing a new therapeutic drug for diabetes. That is, pancreatic ⁇ -cells produced by using the method of the present invention can be used to screen for substances that suppress the secretion of glucagon from the cells. The substance that suppresses glucagon secretion from pancreatic ⁇ cells obtained as a result of this screening can be used as a novel therapeutic agent for diabetes.
  • FGF2, BMP4, and CHIR99021 were removed from this medium, and on the 4th day, suspension culture was performed in a medium containing 0.5 (volume / volume)% KSR added to the medium on the 3rd day. Differentiation was induced into endometrial cells.
  • the suspension culture was carried out in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C. by mounting a 30 mL single-use bioreactor (ABLE) on a 6-channel magnetic stirrer and stirring at a speed of 45 rpm.
  • PTT primitive intestinal cells
  • ITS-X Insurin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine
  • FGF-7 Human Fibroblast Volume Factor 7
  • pancreatic progenitor cells PP
  • pancreatic endocrine progenitor cells EP
  • pancreatic endocrine progenitor cells Specifically, 0.15 (volume / volume)% BSA, 1 ⁇ NEAA, 0.4 ⁇ PS, 1 (volume / volume)% B-27 supplement, 0.3 (volume / volume)% ITS-X. , 50 ng / mL Exendin, 50 ng / mL human recombinant insulin-like volume factor (IGF), 5 ⁇ M Forskolin, 5 ⁇ M Zinc Sulfate, 10 ⁇ M RepSox, 10 ⁇ M RepSox, 10 ⁇ g / mL Heparin The mixture was suspended and cultured for 10-12 days in a 4: 1 mixed medium.
  • IGF insulin-like volume factor
  • a 30 mL single-use bioreactor is mounted on a 6-channel magnetic stirrer, and a microbial culture device (ABLE) is used in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C. or a 100 mL single-use bioreactor (ABLE) while stirring at a speed of 45 rpm. It was mounted on a BMZ-P (ABLE) and stirred at a speed of 50 rpm in a 37 ° C., 5% CO 2 environment.
  • Example 1 Induction of differentiation Inducing differentiation of endoderm cells in the same manner as in Comparative Example 1 and inducing differentiation of the endoderm cells into primitive intestinal cells (PGT) was carried out in the medium used in Comparative Example 1. The cells were suspension-cultured for 3 days in a medium supplemented with 0.67 ⁇ M LDN193189, 1 ⁇ M EC23, or both. In addition, 2.5 ⁇ M Y-27632 was added to the above medium for the purpose of maintaining the shape of the agglomerates. Suspension culture was performed in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C. with a 30 mL single-use bioreactor mounted on a 6-channel magnetic stirrer with stirring at a rate of 45 rpm. Induction of differentiation into posterior anterior enterocytes (PFG) and thereafter was carried out in the same manner as in Comparative Example 1.
  • PTT primitive intestinal cells
  • the base sequence of the primers used for quantitative PCR is as follows.
  • OAZ1 F GTC AGA GGG ATC ACA ATC TTT CAG (SEQ ID NO: 1)
  • OAZ1 R GTC TTG TCG TTG GAC GTT AGT TC (SEQ ID NO: 2)
  • INS F TTG TGA ACC AAC ACC TGT GC (SEQ ID NO: 3)
  • INS R GTG TGT AGA AGA AGC CTC GTT CC (SEQ ID NO: 4)
  • GCG F ACA TTC ACC AGT GAC TAC AGC AAG (SEQ ID NO: 5)
  • NKX6.1 F ATC TTC GCC CTG GAG AAG AC (SEQ ID NO: 7)
  • the measurement result of the gene expression level is shown in FIG. Comparing the cells obtained under each condition of Example 1 with the cells obtained by the method of Comparative Example 1, the INS gene and the NKX6.1 gene, which are genes specific to pancreatic ⁇ cells under the condition to which LDN193189 was added, were found. A decrease in expression was observed. On the other hand, under the condition of adding EC23, improvement in GCG gene expression, which is a gene specific to pancreatic ⁇ cells, was observed. From this, when inducing differentiation of endoderm cells into primitive intestinal cells (PGT), addition of LDN193189 suppresses the induction of differentiation into pancreatic ⁇ cells, and addition of EC23 induces differentiation into pancreatic ⁇ cells.
  • PTT primitive intestinal cells
  • pancreatic ⁇ cells were produced instead of pancreatic ⁇ cells. It can be seen that (Fig. 1). Therefore, the cells obtained in this example are mainly pancreatic ⁇ cells, and when differentiation is induced from endoderm cells using primitive intestinal tract cells (PGT) by the method of Example 1, pancreatic ⁇ cells are efficiently induced. Can be manufactured.
  • PTT primitive intestinal tract cells
  • Example 2 Differentiation induction Primitive intestinal cells (PGT) were produced from human iPS cells by the same method as in Example 1. The obtained primitive intestinal cells (PGT) were induced to differentiate into cells after posterior anterior enterocytes (PFG) using a medium obtained by removing ascorbic acid from the medium of Comparative Example 1.
  • the GCG concentration contained in the culture supernatant was measured using a Glucagon ELISA 10 ⁇ l Kit (Mercodia).
  • the amount of GCG secreted from the cells obtained in Example 1 and Comparative Example 1 was also measured by the above method.
  • the cells obtained by the method of Example 2 are compared with the cells obtained by the method of Comparative Example 1 (FIG. 3), the cells obtained by the method of Example 2 are obtained by the method of Comparative Example 1. It can be seen that the amount of glucagon secreted is significantly higher than that of the obtained cells. From this, in addition to producing primitive intestinal cells (PGT) by the method of Example 1, the subsequent differentiation induction step was performed in the absence of ascorbic acid to obtain pancreatic ⁇ cells from human iPS cells. It can be manufactured efficiently.
  • PTT primitive intestinal cells
  • FIG. 4 shows the results of measuring the gene expression levels of the cells obtained by the method of Example 2 and the cells obtained by the method of Comparative Example 1.
  • the GCG gene, ARX gene and GC gene which are genes specific to pancreatic ⁇ cells, are highly expressed, while the INS gene, which is a gene specific to pancreatic ⁇ cells.
  • the expression of the NKX6.1 gene was low. From this, it can be seen that pancreatic ⁇ -cells can be efficiently produced by inducing differentiation of pluripotent stem cells by the method of the present invention.
  • Example 3 In Example 3, the effect of oxygen concentration in the culture medium in the step of inducing differentiation of pancreatic endocrine progenitor cells (EP) into pancreatic ⁇ cells was examined.
  • Pantoatic endocrine progenitor cells (EP) were produced by the same method as in Comparative Example 1.
  • the medium of Comparative Example 1 was used, and the oxygen concentration in the culture medium was controlled using a microbial culture device (BMZ-P; Able). It was suspended and cultured for 12 days. The dissolved oxygen concentration was controlled so that the dissolved oxygen concentration in the culture solution became the oxygen concentration shown in Table 1 when the saturated oxygen concentration in the culture solution at 1 atm was 100%.
  • BMZ-P microbial culture device
  • the oxygen concentration during culture in # 3-1 is shown in FIG.
  • the oxygen concentration was not controlled, the amount of dissolved oxygen was about 15% due to oxygen consumption by cells.
  • the oxygen concentration was controlled using the culture device, the dissolved oxygen concentration could be controlled at around ⁇ 10% of the target oxygen concentration.
  • the results of measuring the gene expression level of the obtained cells are shown in FIGS. 6 and 7.
  • the expression of the GCG gene which is a gene specific to pancreatic ⁇ cells, was higher in the oxygen concentration controlled group (Example 3) than in the oxygen concentration controlled group (Comparative Example 1) (Fig. 6), and in pancreatic ⁇ cells.
  • pancreatic ⁇ -cells can be produced more efficiently if the oxygen concentration is appropriately controlled in the step of inducing the differentiation of pancreatic endocrine progenitor cells (EP) into pancreatic ⁇ -cells.

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Abstract

（ａ）多能性幹細胞から分化誘導された内胚葉系細胞を、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤、及びレチノイン酸又はレチノイン酸のアナログの存在下で培養することにより原始腸管細胞（ＰＧＴ）に分化誘導する工程：（ｂ）前記原始腸管細胞（ＰＧＴ）を培養することにより膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）に分化誘導する工程：及び（ｃ）前記膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）を培養することにより膵臓α細胞に分化誘導する工程：を含み、前記（ｂ）工程及び前記（ｃ）工程をアスコルビン酸の非存在下で行う、膵臓α細胞への分化誘導方法。

Description

膵臓α細胞への分化誘導方法
　本発明は、膵臓α細胞への分化誘導方法に関する。
　本願は、２０２０年３月２４日に、日本に出願された特願２０２０－５２４２０号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　再生医療は、ドナー不足を課題とする臓器移植の代替法や難病の新たな治療法開発などにおいて大きな期待が寄せられている。胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）は多能性及び無限増殖性を有しているため、再生医療に必要とされる細胞を調製するための細胞ソースとして期待されている。これらの多能性幹細胞を用いた再生医療の実用化に際しては、多能性幹細胞を効率よく目的の体細胞に分化誘導させる技術の確立が必要であり、多様な分化誘導方法について報告されている。
　膵島（ランゲルハンス島）は、膵臓の内部に存在する内分泌組織であり、インスリンやグルカゴンを分泌し、主に血糖調整を行っている。膵島は種々の細胞で構成されており、α細胞、β細胞、δ細胞等が存在する。このうち、膵臓β細胞は、糖尿病の細胞治療において有用であることから、多能性幹細胞から効率よく膵臓β細胞を作製する方法が検討されている。特許文献１には、多能性幹細胞から分化誘導された内胚葉系細胞から膵臓β細胞を製造する方法が記載されている。
　近年、糖尿病患者の膵島では、膵臓β細胞だけでなく、低血糖に応じて糖新生を促進する膵臓α細胞にも異常が生じていることが報告されている。このような患者では、高血糖状態でも膵臓α細胞は活性化状態にあり、血糖値を上昇させるグルカゴン分泌を行い続ける。このように、膵臓α細胞より分泌されるグルカゴンは生体内の血糖値調整において重要な役割を担うことが知られており、新規糖尿病治療薬の開発の観点からグルカゴン分泌機構の解明に大きな期待が寄せられている。
　しかしながら、研究用に供される膵臓α細胞は慢性的に不足しており、これらの研究を加速するためには新たな膵臓α細胞ソースの確保が必要である。ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞などの多能性幹細胞は、生体を構成するほぼ全ての細胞に分化することが可能であることから、膵臓α細胞の新たな細胞ソースとしても期待が寄せられる。多能性幹細胞由来膵臓α細胞の実用化に際しては、多能性幹細胞を効率よく機能的な膵臓α細胞へと分化誘導する技術が必要となる。非特許文献１には、ヒト胚性幹細胞からグルカゴン分泌機能を有する膵臓α細胞に分化誘導させる方法が報告されているが、多能性幹細胞を効率よく機能的な膵臓α細胞へと分化誘導する技術はこれまでに多く報告されておらず、十分な機能を有する膵臓α細胞株も樹立されていない。
国際公開第２０１９／２０８７８８号
Ａｌｉｒｅｚａ　Ｒｅｚａｎｉａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，２０１１　Ｊａｎ；６０（１）：２３９－２４７
　上記した通り、膵臓α細胞からのグルカゴンの分泌機構の解明や新規糖尿病治療薬の開発ツールの構築等の観点から、効率的に多能性幹細胞を機能的な膵臓α細胞へ分化誘導する技術を提供する必要がある。
　従って、本発明は効率的に多能性幹細胞を機能的な膵臓α細胞へ分化誘導する方法を提供することを解決すべき課題とした。
　本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、多能性幹細胞から分化誘導された内胚葉細胞を、所定の条件下で培養することにより、膵臓α細胞へと分化誘導することができ、得られた膵臓α細胞がグルカゴンの分泌機能を有することを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて完成したものである。
　すなわち、本明細書によれば、以下の発明が提供される。
［１］　（ａ）多能性幹細胞から分化誘導された内胚葉系細胞を、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤、及びレチノイン酸又はレチノイン酸のアナログの存在下で培養することにより原始腸管細胞（ＰＧＴ）に分化誘導する工程：
　（ｂ）前記原始腸管細胞（ＰＧＴ）を培養することにより膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）に分化誘導する工程：及び
　（ｃ）前記膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）を培養することにより膵臓α細胞に分化誘導する工程：
を含み、
　前記（ｂ）工程及び前記（ｃ）工程をアスコルビン酸の非存在下で行う、膵臓α細胞への分化誘導方法。
［２］　前記（ｃ）工程を酸素供給条件下で行う、［１］に記載の膵臓α細胞への分化誘導方法。
［３］　前記酸素供給条件が、１ａｔｍ下における３７℃の培養液の飽和溶存酸素濃度を１００％としたときに、培養液中の溶存酸素濃度が２０～５０％となるように制御する条件である、［２］に記載の膵臓α細胞への分化誘導方法。
［４］　前記（ａ）工程を、ＲＯＣＫシグナル阻害剤存在下で行う、［１］～［３］のいずれか一項に記載の膵臓α細胞への分化誘導方法。
［５］　前記多能性幹細胞から分化誘導された内胚葉系細胞が、多能性幹細胞を、ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル活性化剤を含む培地で培養した後、ＦＧＦ２及びＢＭＰ４を添加していない培地で培養することにより分化誘導された内胚葉系細胞である、［１］～［４］のいずれか一項に記載の膵臓α細胞への分化誘導方法。
［６］　前記（ｂ）工程が、
　（ｂ１）前記原始腸管細胞（ＰＧＴ）をプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）活性化剤の存在下において培養することにより後前腸細胞（ＰＦＧ）に分化誘導する工程：
　（ｂ２）前記後前腸細胞（ＰＦＧ）をレチノイン酸又はそのアナログの存在下において培養することにより膵臓前駆細胞（ＰＰ）に分化誘導する工程：及び
　（ｂ３）前記膵臓前駆細胞（ＰＰ）を、Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤及びＲＯＣＫシグナル阻害剤の存在下において培養することにより膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）に分化誘導する工程：
を含む、［１］～［５］のいずれか一項に記載の膵臓α細胞への分化誘導方法。
［７］　前記（ｃ）工程が、前記膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）をインスリン受容体シグナル活性化剤、トランスフェリン及び亜セレン酸の存在下において培養することにより膵臓α細胞に分化誘導する工程を含む、［１］～［６］のいずれか一項に記載の膵臓α細胞への分化誘導方法。
［８］　前記培養を浮遊培養で行う、［１］～［７］のいずれか一項に記載の膵臓α細胞への分化誘導方法。
［９］　前記酸素供給を撹拌培養下で行う、［２］～［８］のいずれか一項に記載の膵臓α細胞への分化誘導方法。
　本発明による膵臓α細胞の分化誘導方法により、多能性幹細胞を効率的に機能的な膵臓α細胞に分化誘導することが可能になる。また、本発明により製造された膵臓α細胞は、グルカゴン分泌機構の解明や新規糖尿病治療薬の開発ツールとしてとして有用である。
実施例１と比較例１の方法により得られた細胞におけるＩＮＳ遺伝子、ＧＣＧ遺伝子、ＮＫＸ６．１遺伝子及びＰＤＸ１遺伝子の発現を解析した結果を示す。 ヒトｉＰＳ細胞から分化誘導した原始腸管細胞（ＰＧＴ）をアスコルビン酸存在下又は非存在下で分化誘導させた細胞のグルカゴン分泌量の測定結果を示す。 実施例２の方法で得られた細胞と、比較例１の方法で得られた細胞とのグルカゴン分泌量の測定結果を示す。 実施例２の方法で得られた細胞と、比較例１の方法で得られた細胞とにおけるＧＣＧ遺伝子、ＡＲＸ遺伝子、ＧＣ遺伝子、ＩＮＳ遺伝子及びＮＫＸ６．１遺伝子の発現を解析した結果を示す。 膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）を培養することにより膵臓α細胞に分化誘導する工程において、＃３－１の酸素濃度制御下で培養した場合の培養液中の酸素濃度を示す。 膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）を酸素濃度制御下（＃３－１～＃３－３）又は酸素濃度非制御下（比較例１）で培養することにより分化誘導させた細胞におけるＧＣＧ遺伝子の発現を解析した結果を示す。 膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）を酸素濃度制御下（＃３－１～＃３－３）又は酸素濃度非制御下（比較例１）で培養することにより分化誘導させた細胞におけるＩＮＳ遺伝子の発現を解析した結果を示す。
　以下、本発明の実施形態について具体的に説明するが、下記の説明は本発明の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲は、下記の実施形態に限られるものではなく、当業者が下記の実施形態の構成を適宜置換した他の実施形態も本発明の範囲に含まれる。
［用語の説明］
　本発明において、「阻害剤の非存在下において」とは、「当該阻害剤を添加していない培地において」を意味する。
　本発明の培地に関して、「を添加していない」という用語は、培養物又は馴化培地において添加していないと特定されたタンパク質、ペプチド及び化合物等の因子を外因的に加えないことを指す。なお、培養物又は馴化培地において添加していないと特定されたタンパク質、ペプチド及び化合物等の因子が培養の連続的な操作により持ち込んでいる場合は、１％未満（体積／体積）、０．５％（体積／体積）未満、０．１％（体積／体積）未満、０．０５％（体積／体積）未満、０．０１％（体積／体積）未満、０．００１％（体積／体積）未満になるように調整する。
　遺伝子発現量に関して、「が向上している」という用語は、比較対象となる細胞集団における特定の遺伝子発現量よりも遺伝子の発現が増加していることを指し、比較対象となる細胞集団に対して、１．１倍以上、１．２倍以上、１．３倍以上、１．４倍以上、１．５倍以上、１．６倍以上、１．７倍以上、１．８倍以上、１．９倍以上、２．０倍以上、２．１倍以上、２．２倍以上、２．３倍以上、２．４倍以上、２．５倍以上、２．６倍以上、２．７倍以上、２．８倍以上、２．９倍以上、３．０倍以上、３．１倍以上、３．２倍以上、３．３倍以上、３．４倍以上、３．５倍以上、３．６倍以上、３．７倍以上、３．８倍以上、３．９倍以上、４．０倍以上、４．１倍以上、４．２倍以上、４．３倍以上、４．４倍以上、４．５倍以上、４．６倍以上、４．７倍以上、４．８倍以上、４．９倍以上、５．０倍以上、５．１倍以上、５．２倍以上、５．３倍以上、５．４倍以上、５．５倍以上、５．６倍以上、５．７倍以上、５．８倍以上、５．９倍以上、６．０倍以上、６．１倍以上、６．２倍以上、６．３倍以上、６．４倍以上、６．５倍以上、６．６倍以上、６．７倍以上、６．８倍以上、６．９倍以上、７．０倍以上、７．１倍以上、７．２倍以上、７．３倍以上、７．４倍以上、７．５倍以上、７．６倍以上、７．７倍以上、７．８倍以上、７．９倍以上、８．０倍以上、８．１倍以上、８．２倍以上、８．３倍以上、８．４倍以上、８．５倍以上、８．６倍以上、８．７倍以上、８．８倍以上、８．９倍以上、９．０倍以上、９．１倍以上、９．２倍以上、９．３倍以上、９．４倍以上、９．５倍以上、９．６倍以上、９．７倍以上、９．８倍以上、９．９倍以上、１０．０倍以上、２０倍以上、３０倍以上、４０倍以上、５０倍以上、６０倍以上、７０倍以上、８０倍以上、９０倍以上、１００倍以上、２５０倍以上、５００倍以上、７５０倍以上、１０００倍以上、５０００倍以上、１００００倍以上である。
　遺伝子発現量に関して、「が減少している」という用語は、比較対象となる細胞集団における特定の遺伝子発現量よりも遺伝子の発現が減少していることを指し、比較対象となる細胞集団に対して、１．１倍以下、１．２倍以下、１．３倍以下、１．４倍以下、１．５倍以下、１．６倍以下、１．７倍以下、１．８倍以下、１．９倍以下、２．０倍以下、２．１倍以下、２．２倍以下、２．３倍以下、２．４倍以下、２．５倍以下、２．６倍以下、２．７倍以下、２．８倍以下、２．９倍以下、３．０倍以下、３．１倍以下、３．２倍以下、３．３倍以下、３．４倍以下、３．５倍以下、３．６倍以下、３．７倍以下、３．８倍以下、３．９倍以下、４．０倍以下、４．１倍以下、４．２倍以下、４．３倍以下、４．４倍以下、４．５倍以下、４．６倍以下、４．７倍以下、４．８倍以下、４．９倍以下、５．０倍以下、５．１倍以下、５．２倍以下、５．３倍以下、５．４倍以下、５．５倍以下、５．６倍以下、５．７倍以下、５．８倍以下、５．９倍以下、６．０倍以下、６．１倍以下、６．２倍以下、６．３倍以下、６．４倍以下、６．５倍以下、６．６倍以下、６．７倍以下、６．８倍以下、６．９倍以下、７．０倍以下、７．１倍以下、７．２倍以下、７．３倍以下、７．４倍以下、７．５倍以下、７．６倍以下、７．７倍以下、７．８倍以下、７．９倍以下、８．０倍以下、８．１倍以下、８．２倍以下、８．３倍以下、８．４倍以下、８．５倍以下、８．６倍以下、８．７倍以下、８．８倍以下、８．９倍以下、９．０倍以下、９．１倍以下、９．２倍以下、９．３倍以下、９．４倍以下、９．５倍以下、９．６倍以下、９．７倍以下、９．８倍以下、９．９倍以下、１０．０倍以下、２０倍以下、３０倍以下、４０倍以下、５０倍以下、６０倍以下、７０倍以下、８０倍以下、９０倍以下、１００倍以下、２５０倍以下、５００倍以下、７５０倍以下、１０００倍以下、５０００倍以下、１００００倍以下である。
＜凝集体＞
　本発明の凝集体に関して、「凝集塊」、「クラスター」または「スフェロイド」という用語に言い換えて使用することができ、単細胞に解離していない一群の細胞の集合体を一般的に指す。
＜多能性幹細胞＞
　本発明における多能性幹細胞とは、生体を構成する全てまたは複数の種類の細胞に分化することができる多分化能（多能性）を有する細胞であって、適切な条件下のインビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）での培養において多能性を維持したまま無限に増殖を続けることができる細胞をいう。具体的には胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胎児の始原生殖細胞由来の多能性幹細胞（ＥＧ細胞：Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１９９８，９５：１３７２６－３１）、精巣由来の多能性幹細胞（ＧＳ細胞：Ｎａｔｕｒｅ．２００８，４５６：３４４－９）、人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ；ｉＰＳ細胞）、体性幹細胞（組織幹細胞）などが挙げられる。多能性幹細胞は、好ましくは、ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞であり、より好ましくはｉＰＳ細胞である。なお、「胚（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ）」とは、配偶子融合によって導出された胚に加えて、体細胞核移植によって、導出された胚も指す。
　ＥＳ細胞としては、任意の温血動物、好ましくは哺乳動物に由来する細胞を使用できる。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、サル、又はヒトが挙げられる。好ましくはヒトに由来する細胞を使用できる。
　ＥＳ細胞の具体例としては、着床以前の初期胚を培養することによって樹立した哺乳動物等のＥＳ細胞、体細胞の核を核移植することによって作製された初期胚を培養することによって樹立したＥＳ細胞、及びこれらのＥＳ細胞の染色体上の遺伝子を遺伝子工学の手法を用いて改変したＥＳ細胞が挙げられる。各ＥＳ細胞は当分野で通常実施されている方法や、公知文献に従って調製することができる。 マウスのＥＳ細胞は、１９８１年にエバンスら（Ｅｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：１５４－６）や、マーチンら（Ｍａｒｔｉｎ  ＧＲ．ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ７８：７６３４－８）によって樹立されている。 ヒトのＥＳ細胞は、１９９８年にトムソンら（Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８，２８２：１１４５－７）によって樹立されており、ＷｉＣｅｌｌ研究施設（ＷｉＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ウェブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｉｃｅｌｌ．ｏｒｇ／、マジソン、ウイスコンシン州、米国）、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）、京都大学、国立成育医療研究センターなどから入手可能であり、例えばＣｅｌｌａｒｔｉｓ社（ウェブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｅｌｌａｒｔｉｓ．ｃｏｍ／、スウェーデン）から購入可能である。
　人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）は、体細胞を初期化することによって得られる多能性を有する細胞である。ｉＰＳ細胞の作製は、京都大学の山中伸弥教授らのグループ、マサチューセッツ工科大学のルドルフ・ヤニッシュ(Ｒｕｄｏｌｆ Ｊａｅｎｉｓｃｈ)らのグループ、ウイスコンシン大学のジェームス・トムソン（Ｊａｍｅｓ Ｔｈｏｍｓｏｎ）らのグループ、ハーバード大学のコンラッド・ホッケドリンガー（Ｋｏｎｒａｄ Ｈｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒ）らのグループなどを含む複数のグループが成功している。例えば、国際公開ＷＯ２００７／０６９６６６号公報には、Ｏｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子及びＭｙｃファミリー遺伝子の遺伝子産物を含む体細胞の核初期化因子、並びにＯｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子、Ｓｏｘファミリー遺伝子及びＭｙｃファミリー遺伝子の遺伝子産物を含む体細胞の核初期化因子が記載されており、さらに体細胞に上記核初期化因子を接触させる工程を含む、体細胞の核初期化により誘導多能性幹細胞を製造する方法が記載されている。
　ｉＰＳ細胞の製造に用いる体細胞の種類は特に限定されず、任意の体細胞を用いることができる。即ち、体細胞とは、生体を構成する細胞の内生殖細胞以外の全ての細胞を包含し、分化した体細胞でもよいし、未分化の幹細胞でもよい。体細胞の由来は、哺乳動物、鳥類、魚類、爬虫類、両生類の何れでもよく特に限定されないが、好ましくは哺乳動物（例えば、マウスなどのげっ歯類、又はヒトなどの霊長類）であり、特に好ましくはマウス又はヒトである。また、ヒトの体細胞を用いる場合、胎児、新生児又は成人の何れの体細胞を用いてもよい。体細胞の具体例としては、例えば、線維芽細胞（例えば、皮膚線維芽細胞）、上皮細胞（例えば、胃上皮細胞、肝上皮細胞、肺胞上皮細胞）、内皮細胞（例えば血管、リンパ管）、神経細胞（例えば、ニューロン、グリア細胞）、膵臓細胞、白血球細胞（Ｂ細胞、Ｔ細胞等）、骨髄細胞、筋肉細胞（例えば、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞）、肝実質細胞、非肝実質細胞、脂肪細胞、骨芽細胞、歯周組織を構成する細胞（例えば、歯根膜細胞、セメント芽細胞、歯肉線維芽細胞、骨芽細胞）、腎臓・眼・耳を構成する細胞などが挙げられる。
　ｉＰＳ細胞は、所定の培養条件下（例えば、ＥＳ細胞を培養する条件下）において長期にわたって自己複製能を有し、また所定の分化誘導条件下において外胚葉系細胞、中胚葉系細胞又は内胚葉系細胞への何れにも多分化能を有する幹細胞である。また、ｉＰＳ細胞はマウスなどの試験動物に移植した場合にテラトーマを形成する能力を有する幹細胞でもよい。
　体細胞からｉＰＳ細胞を製造するためには、まず、少なくとも１種類以上の初期化遺伝子を体細胞に導入する。初期化遺伝子とは、体細胞を初期化してｉＰＳ細胞とする作用を有する初期化因子をコードする遺伝子である。初期化遺伝子の組み合わせの具体例としては、以下の組み合わせをあげることができるが、これらに限定されるものではない。
（ｉ）Ｏｃｔ遺伝子、Ｋｌｆ遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子、Ｍｙｃ遺伝子
（ｉｉ）Ｏｃｔ遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子、ＮＡＮＯＧ遺伝子、ＬＩＮ２８遺伝子
（ｉｉｉ）Ｏｃｔ遺伝子、Ｋｌｆ遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子、Ｍｙｃ遺伝子、ｈＴＥＲＴ遺伝子、ＳＶ４０  ｌａｒｇｅＴ遺伝子
（ｉｖ）Ｏｃｔ遺伝子、Ｋｌｆ遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子
　上記以外にも、導入遺伝子をさらに減らした方法（Ｎａｔｕｒｅ．２００８  Ｊｕｌ  ３１；４５４（７２０４）：６４６－５０）、低分子化合物を利用した方法（Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．２００９  Ｊａｎ  ９；４（１）：１６－９、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．２００９  Ｎｏｖ  ６；５（５）：４９１－５０３）、遺伝子の代わりに転写因子タンパク質を利用した方法（Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．２００９  Ｍａｙ  ８；４（５）：３８１－４）などが報告されており、いずれの方法で製造されたｉＰＳ細胞でもよい。
　初期化因子の細胞への導入形態は特に限定されないが、例えば、プラスミドを用いた遺伝子導入、合成ＲＮＡの導入、タンパク質として直接導入などが挙げられる。また、ｍｉｃｒｏＲＮＡやＲＮＡ、低分子化合物等を用いた方法で作製されたｉＰＳ細胞を用いてもよい。ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞を始めとする多能性幹細胞は、市販品又は分譲を受けた細胞を用いてもよいし、新たに作製したものを用いてもよい。
　ｉＰＳ細胞として、例えば２５３Ｇ１株、２５３Ｇ４株、２０１Ｂ６株、２０１Ｂ７株、４０９Ｂ２株、４５４Ｅ２株、６０６Ａ１株、６１０Ｂ１株、６４８Ａ１株、１２０１Ｃ１株、１２０５Ｄ１株、１２１０Ｂ２株、１２３１Ａ３株、１３８３Ｄ２株、１３８３Ｄ６株、ｉＰＳ－ＴＩＧ１２０－３ｆ７株、ｉＰＳ－ＴＩＧ１２０－４ｆ１株、ｉＰＳ－ＴＩＧ１１４－４ｆ１株、ＲＰＣｈｉＰＳ７７１－２株、１５Ｍ６３株、１５Ｍ６６株、ＨｉＰＳ－ＲＩＫＥＮ－１Ａ株、ＨｉＰＳ－ＲＩＫＥＮ－２Ａ株、ＨｉＰＳ－ＲＩＫＥＮ－１２Ａ株、Ｎｉｐｓ－Ｂ２株、ＴｋＤＮ４－Ｍ株、ＴｋＤＡ３－１株、ＴｋＤＡ３－２株、ＴｋＤＡ３－４株、ＴｋＤＡ３－５株、ＴｋＤＡ３－９株、ＴｋＤＡ３－２０株、ｈｉＰＳＣ ３８－２株、ＭＳＣ－ｉＰＳＣ１株、ＢＪ－ｉＰＳＣ１株等を使用することができる。
　ＥＳ細胞として、例えばＫｈＥＳ－１株、ＫｈＥＳ－２株、ＫｈＥＳ―３株、ＫｈＥＳ－４株、ＫｈＥＳ－５株、ＳＥＥＳ１株、ＳＥＥＳ２株、ＳＥＥＳ３株、ＨＵＥＳ８株、ＣｙＴ４９株、Ｈ１株、Ｈ９株、ＨＳ－１８１株等を使用することができる。新たに作製された臨床グレードのｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞を用いてもよい。
＜内胚葉系細胞＞
　内胚葉系細胞は、消化管、肺、甲状腺、膵臓、肝臓などの器官の組織、消化管に開口する分泌腺の細胞、腹膜、胸膜、喉頭、耳管、気管、気管支、尿路（膀胱、尿道の大部分、尿管の一部）などへと分化する能力を有し、一般的に、胚体内胚葉（ＤＥ）と言われることがある。多能性幹細胞から内胚葉系細胞への分化は、内胚葉系細胞に特異的な遺伝子の発現量を測定することにより確認することができる。内胚葉系細胞に特異的な遺伝子としては、例えば、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＣＸＣＲ４、ＡＦＰ、ＧＡＴＡ４、ＥＯＭＥＳ等を挙げることができる。なお、本明細書中において、内胚葉系細胞を胚体内胚葉と言い換えて使用することがある。
＜原始腸管細胞＞
　原始腸管細胞は、前腸、中腸、後腸を形成する。中腸は卵黄嚢とつながっており、後腸からは胚体外の尿膜が分岐している。また、前腸からは呼吸器系の咽頭も形成される。胃や腸のように腸管がそのまま分化するものと、肝臓、胆嚢、膵臓、（脾臓（リンパ性器官））などのように腸管から出芽するような形で形成されるものがある。内胚葉系細胞から原始腸管細胞への分化は、原始腸管細胞に特異的な遺伝子の発現量を測定することにより確認することができる。始腸管細胞に特異的な遺伝子としては、例えば、ＨＮＦ－１β、ＨＮＦ－４αなどを挙げることができる。
＜後前腸細胞（ＰＦＧ）＞
　原始腸管細胞から後前腸細胞への分化は、後前腸細胞に特異的な遺伝子の発現量を測定することにより確認することができる。後前腸細胞に特異的な遺伝子としてはＰＤＸ１、ＨＮＦ６などを挙げることができる。
＜膵臓前駆細胞（ＰＰ）＞
　膵臓前駆細胞は後前腸細胞から分化した細胞であり、膵臓の外分泌系細胞および内分泌系細胞へと分化することができる細胞である。後前腸細胞から膵臓前駆細胞への分化は、膵臓前駆細胞に特異的な遺伝子の発現量を測定することにより確認することができる。膵臓前駆細胞に特異的な遺伝子としてはＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１などを挙げることができる。
＜膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）＞
　膵内分泌前駆細胞は、膵臓前駆細胞から分化した細胞であり、膵臓の内分泌系細胞（α細胞、β細胞、δ細胞、ε細胞、ＰＰ細胞等）へと分化することができる細胞である。膵内分泌前駆細胞への分化は、膵内分泌前駆細胞に特異的な遺伝子の発現量を測定することにより確認することができる。膵内分泌前駆細胞に特異的な遺伝子としてはＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＮｅｕｒｏＧ３、ＮｅｕｒｏＤ１などを挙げることができる。
＜膵臓α細胞＞
　膵臓α細胞は、膵内分泌前駆細胞から分化した細胞であり、グルカゴンを分泌する細胞である。膵内分泌前駆細胞から膵臓α細胞への分化は、膵臓α細胞に特異的な遺伝子の発現量を測定することにより確認することができる。膵臓α細胞に特異的な遺伝子としては、グルカゴン（ＧＣＧ）、ＡＲＫ、ＩＲＸ２、ＧＣ、ＴＭ４ＳＦ４、ＴＴＲ、ＣＲＹＢＡ２などを挙げることができる。
＜膵臓β細胞＞
　膵臓β細胞は、膵内分泌前駆細胞から分化した細胞であり、インスリンを分泌する細胞である。膵内分泌前駆細胞から膵臓β細胞への分化は、膵臓β細胞に特異的な遺伝子の発現量を測定することにより確認することができる。膵臓β細胞に特異的な遺伝子としては、インスリン、ＮＫＸ６．１、ＭＡＦＡ、ＰＤＸ１などを挙げることができる。
＜シグナル及び因子＞
（骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤）
　骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナルとは、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）リガンドにより媒介されるシグナルであり、脊椎動物において多様な役割を果たす。胚形成の間に、背腹軸は、リガンド、受容体、補助受容体及び可溶性アンタゴニストの協調発現により形成されるＢＭＰシグナル伝達の勾配によって確立される。ＢＭＰは、原腸形成、中胚葉誘導、器官形成及び軟骨性骨形成の重要なレギューレータであり、多能性幹細胞集団の運命を制御する。
　ＢＭＰ受容体はＩ型受容体（ａｃｔｉｖｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｌｉｋｅ ｋｉｎａｓｅ；ＡＬＫ－１、ＡＬＫ－２、ＡＬＫ－３またはＡＬＫ－６）とＩＩ型受容体（ＡｃｔＲＩＩ、ＡｃｔＲＩＩＢまたはＢＭＰＲＩＩ）の複合体から成り、活性化したＩ型受容体キナーゼはＲ－Ｓｍａｄ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ Ｓｍａｄ）タンパク質のＣ末端に存在する２個のセリン残基をリン酸化する。リガンド（ＢＭＰ）が受容体に結合することによりリン酸化を受けるＲ－Ｓｍａｄ（Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ５、Ｓｍａｄ８）はＢＲ－Ｓｍａｄ（ＢＭＰ Ｒ－Ｓｍａｄ）と呼ばれており、リン酸化を受けた２分子のＲ－ＳｍａｄはＳｍａｄ４とヘテロ三量体を形成し，核内に移行することで標的遺伝子の転写を調節する。
　骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤とは、リガンド（ＢＭＰ－４など）による受容体への結合から始まるＢＭＰシグナルを阻害する物質であれば特に限定しないが、好ましくはＡＬＫ－１、ＡＬＫ－２、ＡＬＫ－３およびＡＬＫ－６の少なくとも１つを阻害する物質である。また、リガンドが受容体へと結合するのを妨げる物質（アンタゴニスト抗体など）をＢＭＰシグナル阻害剤として用いることができる。
　骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤としては、特に限定しないが、Ｉ型受容体（ＡＬＫ－１、ＡＬＫ－２、ＡＬＫ－３またはＡＬＫ－６）に作用する阻害剤などは効果的にＢＭＰシグナルを阻害することができ、例えばドルソモルフィン（Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ）、ＬＤＮ１９３１８９、ＬＤＮ－２１４１１７、ＬＤＮ－２１２８５４、Ｋ０２２８８、ＭＬ３４７などを挙げることができる。
（レチノイン酸）
　レチノイン酸とは、ビタミンＡのカルボン酸誘導体で、ａｌｌ－ｔｒａｎｓ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ（ｔｒｅｔｉｎｏｉｎ；トレチノインとも呼ばれる)、９－ｃｉｓ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ（ａｌｉｔｒｅｔｉｎｏｉｎ とも呼ばれる;９シスレチノイン酸)、１３－ｃｉｓ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ （ｉｓｏｔｒｅｔｉｎｏｉｎとも呼ばれる; １３シスレチノイン酸)などいくつかの立体異性体が存在する。レチノイン酸は核内受容体の一つであるレチノイン酸受容体（ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ； ＲＡＲ）の天然リガンドとして、生体内におけるレチノイド、カロテノイドの生理活性の主役を担っている。ＲＡＲはレチノイドＸ受容体（ｒｅｔｉｎｏｉｄ Ｘ ｒｅｃｅｐｔｏｒ； ＲＸＲ：リガンドは９ｃｉｓレチノイン酸）とヘテロ二量体を形成し、リガンド誘導性転写因子として、特異的な標的遺伝子群のプロモーターに結合することで標的遺伝子群の発現を正負に転写レベルで制御することが知られている。ビタミンＡとは全く類似しない化学構造を持つ化合物でも、これら特異的な受容体と非常に高い結合親和性を示す合成化合物を含めて、レチノイドと称されている。
（レチノイン酸のアナログ）
　レチノイン酸（ＲＡ）は、細胞分化、細胞分裂周期の停止、またはアポトーシスを促進する作用があることが知られており、多能性幹細胞の分化誘導時にも用いられている。そのレチノイン酸のアナログとしては、核内受容体であるレチノイン酸受容体（Ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＰＡＲ）、rｅｔｉｎｏｉｄ　Ｘ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＲＸＲ））を活性化する物質であれば特に限定しないが、例えば、ＥＣ２３、ＥＣ１９、ＡＣ ２６１０６６、ＡＣ ５５６４９、Ａｄａｐａｌｅｎｅ、ＡＭ ５８０、ＡＭ ８０、ＢＭＳ ７５３、ＢＭＳ ９６１、ＣＤ １５３０、ＣＤ ２３１４、ＣＤ ４３７、Ｃｈ ５５、Ｉｓｏｔｒｅｔｉｎｏｉｎ、Ｔａｚａｒｏｔｅｎｅ、ＴＴＮＰＢなどを挙げることができる。ＥＣ２３はレチノイン酸に比べて光による劣化の影響が少なく、安定な化合物であるため好適に用いることができる。
（アスコルビン酸）
　アスコルビン酸とは、水溶性ビタミンであるビタミンＣとして知られている、ラクトン構造を有する有機化合物である。アスコルビン酸は光学活性化合物であり、Ｌ体とＤ体が存在するが、Ｌ体が好ましい。なお、ビタミンＣとして知られているのはＬ体である。アスコルビン酸は、強い還元力を持ち、生体内では様々な酸化還元反応に関与している。アスコルビン酸は小腸上部から吸収され、門脈を経て肝臓で一部は代謝されるが、多くは副腎や脳下垂体などの組織に取り込まれる。アスコルビン酸は過酸化物の生成抑制、生体異物の解毒、チロシンの代謝、非ヘム鉄の吸収促進に不可欠である。また、コラーゲン、カテコールアミン、カルニチンの生合成やコレステロール代謝などの反応では水酸化に関与している。
（ＲＯＣＫシグナル阻害剤）
　ＲＯＣＫ（Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ ｆｏｒｍｉｎｇ ｋｉｎａｓｅ/Ｒｈｏ結合キナーゼ）はミオシン軽鎖とミオシン軽鎖脱リン酸化酵素のリン酸化を介してミオシン軽鎖を活性型構造に変化させる。さらに、ＲＯＣＫは、ＬＩＭキナーゼのリン酸化を介してアクチン脱重合因子であるコフィリンを不活化し、アクチン脱重合を抑制する。その他、ＲＯＣＫは多数の基質をリン酸化して、細胞運動、細胞極性、細胞接着、細胞分裂、アポトーシス、転写制御など多様な生命機能に関わっている。ＲＯＣＫシグナル阻害剤としては、Ｙ２７６３２、Ｔｈｉａｚｏｖｉｖｉｎ、Ｆａｓｕｄｉｌ （ＨＡ－１０７７） ＨＣｌ、ＧＳＫ４２９２８６Ａ、ＲＫＩ－１４４７、ＧＳＫ１８０７３６Ａ （ＧＳＫ１８０７３６）、Ｈｙｄｒｏｘｙｆａｓｕｄｉｌ （ＨＡ－１１００） ＨＣｌ、Ｙ－３９９８３ ＨＣｌ、Ｎｅｔａｒｓｕｄｉｌ （ＡＲ－１３３２４） ２ＨＣｌ、ＧＳＫ２６９９６２Ａ ＨＣｌ、Ｒｉｐａｓｕｄｉｌ （Ｋ－１１５） ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ ｄｉｈｙｄｒａｔｅ、ＫＤ０２５ （ＳＬｘ－２１１９）、ＡＴ１３１４８などを挙げることができる。
（ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル活性化剤）
　ＴＧＦβスーパーファミリーシグナルとは、細胞増殖の調節、分化、広汎な生物学的システムでの発達において大変重要な役割を演じている。一般的に、リガンドにより惹起されるセリン／スレオニン受容体キナーゼの多量体形成と、骨形態発生蛋白（ＢＭＰ）経路についてはＳｍａｄ１／５／８ といった細胞内シグナル分子のリン酸化によって、また、ＴＧＦβ／アクチビン経路ならびにＮＯＤＡＬ／アクチビン経路についてはＳｍａｄ２/３のリン酸化によってシグナルは開始される。活性化受容体によるＳｍａｄｓのカルボキシル基末端のリン酸化は、それらと共通のシグナルトランスデューサーであるＳｍａｄ４とのパートナーを形成し、核への移行を促す。活性化Ｓｍａｄｓは、転写因子とパートナーを組むことで様々な生物学的効果を制御し、細胞の状態に特異的な転写調節を行うが知られている。
　ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル経路に関与する遺伝子としては、Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ遺伝子、ＢＭＰ２遺伝子、ＢＭＰ３遺伝子、ＢＭＰ４遺伝子、ＢＭＰ５遺伝子、ＢＭＰ６遺伝子、ＢＭＰ７遺伝子、ＢＭＰ８遺伝子、ＢＭＰ１３遺伝子、ＧＤＦ２（Ｇｒｏｗｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ２）遺伝子、ＧＤＦ３遺伝子、ＧＤＦ５遺伝子、ＧＤＦ６遺伝子、ＧＤＦ７遺伝子、ＧＤＦ８遺伝子、ＧＤＦ１１遺伝子、ＴＧＦ－β１遺伝子、ＴＧＦ－β２遺伝子、ＴＧＦ－β３遺伝子、ＡＭＨ（ａｎｔｉ－ｍｕｌｌｅｒｉａｎ　ｈｏｒｍｏｎｅ）遺伝子、ｐａｉｒｅｄ　ｌｉｋｅ　ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ　２（ＰＩＴＸ２）遺伝子、及びＮＯＤＡＬ遺伝子などが挙げられる。
　ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル活性化剤としては、骨形態発生タンパク質（ＢＭＰ）経路、ＴＧＦβ／アクチビン経路、及び／又はＮＯＤＡＬ／アクチビン経路のシグナルを活性化する物質であれば特に限定されないが、例えば、アクチビンＡ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８、ＢＭＰ１３、ＧＤＦ２、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、ＡＭＨ、ＰＩＴＸ２、及び／又はＮＯＤＡＬなどを用いることができる。特に、ＴＧＦβ／アクチビン経路のシグナルを活性化する物質を好適に用いることができ、具体的には、アクチビンＡ、及びＢＭＰ４からなる群から選択される少なくとも１種類を使用することが好ましく、アクチビンＡ、及びＢＭＰ４を使用することが特に好ましい。
（プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）活性化剤）
　ＰＫＣは、細胞増殖や細胞死、遺伝子の転写および翻訳、細胞の形態、細胞間接触など、多くの細胞機能の制御に関わるタンパク質である。ＰＫＣは、基質タンパク質のセリン残基およびスレオニン残基のヒドロキシル基をリン酸化するタンパク質キナーゼの一種であり、少なくとも １０種類以上のアイソザイムが存在する。アイソザイムはその構造、活性化の機序、生理活性によって在来型（Ｃｌａｓｓｉｃａｌ）、新型（Ｎｏｖｅｌ）、非典型（Ａｔｙｐｉｃａｌ）の３種類のサブファミリーに分類される。在来型ＰＫＣアイソザイム（α、βI、βII、γ）はその活性化のために、ジアシルグリセロール（Ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ；ＤＡＧ）とＣａ２＋を必要とする。ＤＡＧは、ホスファチジルイノシトール ４，５－二リン酸（ＰＩＰ２）がホスフォリパーゼＣ（ＰＬＣ）により加水分解されることによって、イノシトール １，４，５－三リン酸（ＩＰ３）と共に生じる。ＩＰ３が細胞内で拡散し、小胞体上にあるＩＰ３感受性Ｃａ２＋チャネルに結合すると、Ｃａ２＋イオンが細胞質に放出される。これらのＣａ２＋イオンがＰＫＣと結合することでＰＫＣ は細胞膜へと移動する。そこで ＰＫＣはＣ１ドメインを介しＤＡＧと相互作用する。するとＰＫＣは、その触媒ドメインから調節領域が外れるような構造変化を起こして活性型となる。新型ＰＫＣアイソザイム（δ、ε、θ、η）はＤＡＧのみによって活性化される。これは、新型ＰＫＣアイソザイムが有する Ｃ１ ドメインのＤＡＧに対するアフィニティーが、在来型のものより極めて高いことに起因している。非典型 ＰＫＣ アイソザイム（ζ、Mζ、ι/λ）は、その活性化にＤＡＧもＣａ２＋も必要とせず、様々な脂質代謝産物のセカンドメッセンジャーによって活性化される（Khalil, 2010; Wu-Zhang and Newton, 2013; Mochly-Rosen et al., 2012）。
　ＰＫＣ活性化剤とは、上記ＰＫＣアイソザイムのうち少なくとも１つ以上のＰＫＣアイソザイムを活性化する物質であればよい。
　ＰＫＣ活性化剤としては、特に限定しないが、例えばｉｎｄｏｌａｃｔａｍ　Ｖ（ＩＬＶ）、Ｏｋａｄａｉｃ Ａｃｉｄ、Ｐｈｏｒｂｏｌ－１２－Ｍｙｒｉｓｔａｔｅ－１３－Ａｃｅｔａｔｅ（ＰＭＡ）、Ｂｒｙｏｓｔａｔｉｎ １、１ａｌｐｈａ，２５－Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｖｉｔａｍｉｎ Ｄ３、Ｐｒｏｓｔｒａｔｉｎ、１，２－Ｄｉｏｃｔａｎｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１－Ｏｌｅｏｙｌ－２－ａｃｅｔｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏｌ （ＯＡＧ）、Ｏｌｅｉｃ Ａｃｉｄ、Ｉｎｇｅｎｏｌ ３－ａｎｇｅｌａｔｅ、ＤＣＰ－ＬＡ、ＰＩＰ２、Ｐｈｏｒｂｏｌ－１２,１３－ｄｉｂｕｔｙｒａｔｅ、８（Ｓ）－ＨＥＴＥ、およびこれらの誘導体などを用いることができる。
（Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤）
　Ｎｏｔｃｈシグナルは多くの細胞の生存、増殖、および分化に深く関わっており、サイトカイン／チロシンキナーゼ、Ｗｎｔ、ＴＧＦ－βファミリー／Ｓｍａｄ、ヘッジホッグ、およびインテグリンと共に、個体発生にも関与している。Ｎｏｔｃｈシグナルの異常は、発がん、がん細胞の増殖、およびがん幹細胞の生存にも関わっている。 Ｎｏｔｃｈ受容体は、1回膜貫通型タンパク質で、機能的な細胞外ドメイン（ＮＥＣＤ）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）、及び細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）からなる。シグナルを受容する細胞内における小胞体（ＥＲ）及びゴルジ体におけるＮｏｔｃｈ受容体のプロセッシングの結果、切断が起こり (Ｓ１切断)、さらに、糖鎖が結合し、カルシウムイオン（Ｃａ２＋）によって安定化されたヘテロ二量体を生じるが、これは膜に挿入されたＴＭ－ＮＩＣＤと非共有結合で接着したＮＥＣＤから構成される。このプロセッシングを受けた受容体は、次に細胞膜へ移行し、リガンドを結合できるようになる。哺乳類では、シグナルを送る側の細胞に存在するＤｅｌｔａ様（ＤＬＬ１、ＤＬＬ３、ＤＬＬ４）及びＪａｇｇｅｄ（ＪＡＧ１、ＪＡＧ２）ファミリーのメンバーが、Ｎｏｔｃｈシグナル受容体に対するリガンドとして働く。リガンドが結合すると直ちに、ＮＥＣＤはＴＡＣＥ（ＡＤＡＭ金属プロテアーゼＴＮＦ－α変換酵素）によってＴＭ－ＮＩＣＤドメインから切り離される (Ｓ２切断)。このＮＥＣＤはリガンドに結合した状態を維持し、この複合体はシグナル送信側の細胞内でエンドサイトーシスとリサイクリング／分解を受ける。シグナル受信側の細胞内では、γ-セクレターゼ（アルツハイマー病にも関与する）がＴＭからＮＩＣＤを遊離する (Ｓ３切断)が、これによってＮＩＣＤは核内へ移行し、そこでＣＳＬ（ＣＢＦ１／Ｓｕ(Ｈ)／Ｌａｇ－１）ファミリー転写因子複合体と会合するが、その結果引き続いて、基準的なＮｏｔｃｈの標的遺伝子であるＭｙｃ、ｐ２１及びＨＥＳファミリーメンバーの活性化が起こる。
　Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤としては、ＩＭＲ－１、ＦＬＩ－０６、Ｃｒｅｎｉｇａｃｅｓｔａｔ （ＬＹ３０３９４７８）などが挙げられる。また、ＤＢＺ（ｄｉｂｅｎｚａｚｅｐｉｎｅ）、ＤＡＰＴ（Ｎ－［Ｎ－（３，５－Ｄｉｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎａｃｅｔｙｌ－Ｌ－ａｌａｎｙｌ）］－（Ｓ）－ｐｈｅｎｙｌｇｌｙｃｉｎｅ ｔ－ｂｕｔｙｌ ｅｓｔｅｒ）、ＬＹ４１１５７５、Ｄｉｂｅｎｚａｚｅｐｉｎｅ （ＹＯ－０１０２７）、ＲＯ４９２９０９７、Ｎｉｒｏｇａｃｅｓｔａｔ （ＰＦ－０３０８４０１４, ＰＦ－３０８４０１４）、Ｌ－６８５，４５８ 、Ｓｅｍａｇａｃｅｓｔａｔ （ＬＹ４５０１３９）、Ａｖａｇａｃｅｓｔａｔ （ＢＭＳ－７０８１６３）、ＭＫ－０７５２等のγ―セクレターゼ阻害剤もＮｏｔｃｈシグナル阻害剤として用いることができる。
（ヘッジホッグ（ＨＨ）シグナル阻害剤）
　ヘッジホッグ（ＨＨ；Ｈｅｄｇｅｈｏｇ）シグナルは胎児期の細胞増殖因子，形態形成因子として知られている。加えて，成体でのホメオスタシスや組織再生，組織幹細胞の制御にも機能し得ることが示されている。胎児期のＨＨシグナルの異常は，全前脳症などの先天性疾患の原因となり，成体でのＨＨシグナルの持続的活性は皮膚基底細胞癌や髄芽細胞腫を含む様々な癌に関連すると言われている。ヘッジホッグシグナルのリガンドとしては、哺乳類では３種類のＨＨリガンド（ＳＨＨ；Ｓｏｎｉｃ ｈｅｄｇｅｈｏｇ, ＩＨＨ；Ｉｎｄｉａｎ ｈｅｄｇｅｈｏｇ, ＤＨＨ；Ｄｅｓｅｒｔ ｈｅｄｇｅｈｏｇ）が知られている。ヘッジホッグリガンドが無い状態 (オフ状態) では、ヘッジホッグファミリーリガンドに対する受容体のＰａｔｃｈｅｄは、Ｇタンパク質共役型膜貫通タンパク質であるＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄ（Ｓｍｏ）に正常に結合し、Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄの膜への会合を阻害する。このオフ状態では、ＳｕＦｕ及び (脊椎動物におけるＫｉｆ７である) ＣＯＳ２が、第一繊毛において、微小管に結合している転写因子のＧｌｉの集団を隔離する。ＧｌｉはＰＫＡ、ＣＫＩ及びＧＳＫ－３によってリン酸化され、β－ＴｒＣＰを介したＧｌｉ活性化因子 (哺乳動物におけるＧｌｉ１及びＧｌｉ２) の分解が起こるか、あるいは、保存された経路においてＧｌｉの抑制因子 (ショウジョウバエにおけるＧｌｉ３あるいは短縮されたＣｉ) を産生するが、これがヘッジホッグの標的遺伝子の抑制につながる。活性化状態 (オン状態) では、ヘッジホッグリガンドがＰａｔｃｈｅｄに結合することによってβ－Ａｒｒｅｓｔｉｎを介したＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄの第一繊毛への移動が可能になるが、そこでは、これに会合していたＧタンパク質活性が、Ｇｌｉに作用する抑制性のキナーゼ活性を阻害するため、Ｇｌｉを自由に核に移行させて、サイクリンＤ (Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ)、サイクリンＥ (Ｃｙｃｌｉｎ Ｅ)、Ｍｙｃ及びＰａｔｃｈｅｄなどのヘッジホッグ標的遺伝子を活性化する。
　ヘッジホッグ（ＨＨ）シグナル阻害剤とは、上記ヘッジホッグシグナルを阻害する物質であれば特に限定しないが、例えば、Ｓｍｏに作用してシグナルを阻害する物質などがある。また、ヘッジホッグリガンドがＰａｔｃｈｅｄ等の受容体に結合するのを阻害するアンタゴニスト抗体などもヘッジホッグシグナル阻害剤として使用することができる。
　ヘッジホッグ（ＨＨ）シグナル阻害剤としては、特に限定しないが、例えばＳＡＮＴ１、Ｃｙｃｌｏｐａｍｉｎｅ、Ｓｏｎｉｄｅｇｉｂ、ＰＦ－５２７４８５７、Ｇｌａｓｄｅｇｉｂ、Ｔａｌａｄｅｇｉｂ、ＢＭＳ－８３３９２３、ＭＫ－４１０１、Ｖｉｓｍｏｄｅｇｉｂ、ＧＡＮＴ６１、Ｊｅｒｖｉｎｅ、ＨＰＩ－４などを挙げることができる。例えばＳＡＮＴ１は細胞透過性の強力なＨＨシグナルのアンタゴニストであり、Ｓｍｏレセプターに直接結合することにより阻害するため、好適に用いることができる。
（ＴＧＦ－β受容体シグナル阻害剤）
　ＴＧＦ－β受容体（ＴＧＦβ）シグナルとは、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦβ）のリガンドが関与するシグナル伝達であり、例えば、細胞の成長、増殖、分化及びアポトーシスなどの細胞プロセスにおいて中心的な役割を担う。ＴＧＦβシグナルは、Ｉ型受容体（ＡＬＫ５）を漸増してリン酸化する、ＩＩ型受容体（セリン／トレオニンキナーゼ）へのＴＧＦβリガンドの結合が関与する。次いで、このＩ型受容体が、ＳＭＡＤ４に結合する受容体制御ＳＭＡＤ（Ｒ－ＳＭＡＤ；例えば、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ５、ＳＭＡＤ８、又はＳＭＡＤ９）をリン酸化し、次いで、このＳＭＡＤ複合体が転写調節において役割を果たす核に入る。
　ＴＧＦβシグナル阻害剤とは、上記ＴＧＦβシグナルを阻害する物質であれば特に限定しないが、例えば、ＡＬＫ５に作用してそのリン酸化を阻害するような物質である。また、ＴＧＦβが受容体へと結合するのを阻害するアンタゴニスト抗体などもＴＧＦβシグナル阻害剤として用いることができる。
　ＴＧＦβシグナル阻害剤としては、特に限定しないが、例えばＡＬＫ５に作用するような阻害剤は好適に用いることができる。例えばＳＢ４３１５４２、Ｇａｌｕｎｉｓｅｒｔｉｂ、ＬＹ２１０９７６１、ＳＢ５２５３３４、ＳＢ５０５１２４、ＧＷ７８８３８８、ＬＹ３６４９４７、ＲｅｐＳｏｘ、ＳＤ－２０８、Ｖａｃｔｏｓｅｒｔｉｂ、ＬＤＮ－２１２８５４などを挙げることができる。
（インスリン受容体シグナル活性化剤）
　インスリン受容体は、肝臓、骨格筋、脂肪組織、神経細胞などに発現しており、インスリン受容体シグナルは、神経回路網の形成、維持、修復に関与することが知られている。インスリンはグルコースや脂質代謝のような重要なエネルギー機能を調節する重要なホルモンであり、インスリン受容体チロシンキナーゼ（ｉｎｓｕｌｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＩＲ）を活性化し、ＩＲＳ（ｉｎｓｕｌｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）ファミリーのような異なる基質アダプターのリクルートとリン酸化を行う。チロシンリン酸化されたＩＲＳは多くのシグナルパートナーに結合部位を呈示する。中でも、ＰＩ３Ｋ （ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ　３－ｋｉｎａｓｅ）は、主に Ａｋｔ（ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ　Ｂ）とＰＫＣ（ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ　Ｃ）の活性化を介してインスリン機能において重要な役割を果たす。活性化されたＡｋｔは、ＧＳＫ－３（ｇｌｙｃｏｇｅｎ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ｋｉｎａｓｅ）の阻害を介したｇｌｙｃｏｇｅｎ合成、ｍＴＯＲ（ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｔａｒｇｅｔ　ｏｆ　ｒａｐａ）と下流因子を介したタンパク合成、プロアポトーシス因子（Ｂａｄ、転写因子：Ｆｏｒｋｈｅａｄファミリー、ＧＳＫ－３等）の阻害による細胞生存などを引き起こす。インスリン受容体シグナルはまた、細胞の成長と細胞分裂効果を持ち、それらの効果にはＲａｓ／ＭＡＰＫ経路の活性化と同様に、主にＡｋｔカスケードも関与している。
　インスリン受容体シグナル活性化剤とは、上記インスリン受容体シグナルを活性化する物質であれば特に限定しないが、例えば、インスリン受容体並びにＩＧＦ受容体に結合するリガンドが挙げられる。また、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＣまたはＡｋｔを直接または間接的に活性化するような物質であってもよい。
　インスリン受容体シグナル活性化剤としては、好ましくはインスリン、インスリン様成長因子－１（ＩＧＦ－１）、ＩＧＦ－２などを挙げることができる。また、ＰＩ３Ｋ活性化剤であるＰＩ３－ｋｉｎａｓｅ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ（ＳａｎｔａＣｒｕｚ社、製品番号：ｓｃ－３０３６）、７４０　Ｙ－Ｐなどもインスリン受容体シグナル活性化剤として用いることができる。
（ＦＧＦ受容体シグナル活性化剤）
　ＦＧＦ（線維芽細胞増殖因子）受容体シグナルは、ＦＧＦ受容体を介するシグナル伝達であり、ＲＡＳ－ＭＡＰＫ経路やＰＩ３Ｋ－ＡＫＴ経路に流れ、細胞増殖、細胞死、血管新生、上皮間葉転換（ＥＭＴ）などの様々な細胞機能に関与しており、また、胚発生および生後の骨格系の発生の制御において重要な役割を果たす。
　ＦＧＦ受容体シグナル活性化剤とは、上記のようなシグナル伝達を活性化するような物質であればよく、ＦＧＦ受容体に結合するリガンド（ＦＧＦファミリー）がその代表例である。またＲＡＳ－ＭＡＰＫ経路やＰＩ３Ｋ－ＡＫＴ経路の活性化剤もＦＧＦ受容体シグナル活性化剤として用いることができる。
　ＦＧＦ受容体シグナル活性化剤としては、ＦＧＦファミリーを挙げることができ、好ましくは、ＦＧＦ７、ＦＧＦ３、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ２２、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５，ＦＧＦ６、ＦＧＦ８、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ２０，ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２３などが挙げられ、特に好ましくはＦＧＦ７である。
（ＥＧＦ受容体シグナル活性化剤）
　上皮成長因子（ＥＧＦ）は５３アミノ酸残基及び３つの分子内ジスルフィド結合から成る６０４５　Ｄａのタンパク質であり、細胞表面に存在する上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）にリガンドとして結合し、細胞の成長と増殖の調節に重要な役割をする。ＥＧＦ受容体シグナル活性化剤としては、ＥＧＦなどを挙げることができる。
（ＧＬＰ－１（Ｇｌｕｃａｇｏｎ－ｌｉｋｅ　ｐｅｐｔｉｄｅ－１）受容体シグナル活性化剤）
　生体で分泌されるインクレチンホルモンであるグルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）は、ＧＬＰ－１受容体を介して作用することによりｃＡＭＰを増加させ、グルコース濃度依存的にインスリン分泌を促進させる。ＧＬＰ－１受容体シグナル活性化剤としては、ＧＬＰ－１、Ｅｘｅｎｄｉｎ４などが挙げられる。
（増殖因子安定化剤）
　増殖因子安定化剤とは、増殖因子の安定化作用を有する物質を意味する。増殖因子の安定化とは、増殖因子の分解を抑制する作用、増殖因子の細胞外への分泌を促進する作用など、細胞外の増殖因子の量の減少を抑制する作用である限りにおいて特に限定はされない。増殖因子安定化剤としては、ヘパリン、ヘパラン硫酸などが挙げられる。
（肝細胞増殖因子）
　肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）は、生体内で組織再生や修復に関与するサイトカインの一種である。肝細胞増殖因子は、肝細胞以外にもさまざまな細胞に作用し、上皮細胞や内皮細胞の増殖を促進することや、神経細胞に対し神経栄養因子として働くことが知られている。
（インスリン様増殖因子）
　インスリン様増殖因子は、プロインスリンに似た構造を持つポリペプチドであり、細胞増殖や生存、遊走やコラーゲンを含む細胞外マトリクスの産生に関与することが知られている。インスリン様増殖因子は、腫瘍細胞を含む種々の細胞型に対して、インスリン様増殖因子受容体－１（ＩＧＦＲ１）と称される共通の受容体に結合することにより細胞分裂促進活性を示す。インスリン様増殖因子としては、インスリン様増殖因子－Ｉ（ＩＧＦ－Ｉ）およびインスリン様増殖因子－ＩＩ（ＩＧＦ－ＩＩ）が挙げられる。
（Ａｄｅｎｙｌａｔｅ　ｃｙｃｌａｓｅ活性化剤（細胞内のｃＡＭＰ濃度を向上させる物質））
　アデニレートシクラーゼは、ＡＴＰを３’，５’－環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）とピロリン酸への変換を触媒する酵素である。ｃＡＭＰはセカンドメッセンジャーと呼ばれる、真核生物のシグナル伝達に重要な分子である。Ａｄｅｎｙｌａｔｅ　ｃｙｃｌａｓｅ活性化剤としては、Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ、ＮＫＨ４７７などが挙げられる。
（ＷＮＴシグナル活性化剤）
　ＷＮＴシグナルとは、β－カテニンの核移行を促し、転写因子としての機能を発揮する一連の作用をいう。ＷＮＴシグナルは細胞間相互作用に起因し、例えば、ある細胞から分泌されたＷＮＴ３Ａというタンパクがさらに別の細胞に作用し、細胞内のβ－カテニンが核移行し、転写因子として作用する一連の流れが含まれる。一連の流れは上皮間葉相互作用を例とする器官構築の最初の現象を引き起こす。ＷＮＴシグナルはβ－カテニン経路、ＰＣＰ経路、Ｃａ２＋経路の三つの経路を活性化することにより、細胞の増殖や分化、器官形成や初期発生時の細胞運動など各種細胞機能を制御することで知られる。
　ＷＮＴシグナル経路に関与する遺伝子としては、ＷＮＴ３Ａ遺伝子などがある。
　ＷＮＴシグナル活性化剤としては、特に限定されないが、グリコーゲンシンターゼキナーゼ－３（ＧＳＫ－３）の阻害活性を示すものであればいかなるものでもよく、例えばビス－インドロ（インジルビン）化合物（ＢＩＯ）（（２’Ｚ，３’Ｅ）－６－ブロモインジルビン－３’－オキシム）、そのアセトキシム類似体ＢＩＯ－アセトキシム（２’Ｚ，３’Ｅ）－６－ブロモインジルビン－３’－アセトキシム）、チアジアゾリジン（ＴＤＺＤ）類似体（４－ベンジル－２－メチル－１，２，４－チアジアゾリジン－３，５－ジオン）、オキソチアジアゾリジン－３－チオン類似体（２，４－ジベンジル－５－オキソチアジアゾリジン－３－チオン）、チエニルα－クロロメチルケトン化合物（２－クロロ－１－（４，４－ジブロモ－チオフェン－２－イル）－エタノン）、フェニルαブロモメチルケトン化合物（α－４－ジブロモアセトフェノン）、チアゾール含有尿素化合物（Ｎ－（４－メトキシベンジル）－Ｎ’－（５－ニトロ－１，３－チアゾール－２－イル）ユレア）やＧＳＫ－３βペプチド阻害剤、例えばＨ－ＫＥＡＰＰＡＰＰＱＳｐＰ－ＮＨ２などを使用することができ、特に好ましくは、ＣＨＩＲ９９０２１（ＣＡＳ：２５２９１７－０６－９）を使用することができる。ＷＮＴ３Ａも好適に用いることができる。
［１］膵臓α細胞への分化誘導方法
　本発明による膵臓α細胞への分化誘導方法は、多能性幹細胞から分化誘導された内胚葉系細胞を、原始腸管細胞（Ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ　Ｇｕｔ　Ｔｕｂｅ：ＰＧＴ）に分化誘導する工程、前記原始腸管細胞（ＰＧＴ）から膵内分泌前駆細胞（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ：ＥＰ）を分化誘導する工程、及び前記膵内分泌前駆細胞から膵臓α細胞（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ　αｃｅｌｌ）を分化誘導する工程を含む方法である。本発明の膵臓α細胞への分化誘導方法により、多能性幹細胞から膵臓α細胞を製造することができる。
　多能性幹細胞から分化誘導された内胚葉系細胞から膵臓α細胞を分化誘導する方法について説明する。
　本発明における工程（ａ）においては、多能性幹細胞から分化誘導された内胚葉系細胞を、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤、及びレチノイン酸又はレチノイン酸のアナログの存在下で培養することにより原始腸管細胞（ＰＧＴ）を分化誘導する。
　本発明における工程（ｂ）においては、前記原始腸管細胞（ＰＧＴ）を培養することにより膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）に分化誘導する。
　本発明における工程（ｃ）においては、前記膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）を培養することにより膵臓α細胞に分化誘導する。
　前記（ｂ）工程及び前記（ｃ）工程は、アスコルビン酸の非存在下で行う。以下、それぞれの工程について説明する。なお、多能性幹細胞から内胚葉系細胞への分化誘導については後記する。
＜培養条件＞
　内胚葉系細胞から膵臓α細胞への分化誘導時における細胞の培養は、接着培養、浮遊培養のいずれを用いても良いが、浮遊培養であることが好ましい。細胞はマイクロキャリア等に接着させて浮遊培養しても良いし、細胞のみで構成された細胞凝集塊の状態で浮遊培養しても良いし、細胞凝集塊の中にコラーゲン等の高分子が混在していても良く、形態は特に限定しない。
　内胚葉系細胞から膵臓α細胞への分化誘導における培養温度は、使用する細胞の培養に適した培養温度であれば、特に限定されないが、一般的には３０℃～４０℃であり、好ましくは約３７℃である。
　ＣＯ２インキュベーターなどを利用して、約１～１０％、好ましくは５％のＣＯ２濃度雰囲気下で培養を行うことが好ましい。
＜培養期間＞
　工程（ａ）の内胚葉系細胞から原始腸管細胞（ＰＧＴ）への分化誘導の培養期間は、一般的には２４時間から１２０時間であり、好ましく４８時間から９６時間程度である。例えば、７２時間である。
　工程（ｂ）の原始腸管細胞（ＰＧＴ）から膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）への分化誘導は、前記原始腸管細胞（ＰＧＴ）から後前腸細胞（ＰＦＧ）への分化誘導、前記後前腸細胞（ＰＦＧ）から膵臓前駆細胞（ＰＰ）への分化誘導、前記膵臓前駆細胞（ＰＰ）から膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）への分化誘導を含む。
　原始腸管細胞（ＰＧＴ）から後前腸細胞（ＰＦＧ）への分化培養の培養期間は、後前腸細胞（ＰＦＧ）の細胞特性が呈する細胞型になっているのであれば特に限定されないが、例えば、２週間以内であればよく、より具体的には１日以上１０日以内であり、より好ましくは２日以上７日以内であり、さらに好ましくは３日以上５日以内であり、一例としては４日である。
　後前腸細胞（ＰＦＧ）から膵臓前駆細胞（ＰＰ）への分化培養の培養期間は、膵臓前駆細胞（ＰＰ）の細胞特性が呈する細胞型になっているのであれば特に限定されないが、例えば、２週間以内であればよく、より具体的には１日以上１０日以内であり、より好ましくは２日以上７日以内であり、さらに好ましくは２日以上４日以内であり、一例としては３日である。
　膵臓前駆細胞（ＰＰ）から膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）への分化培養の培養期間は、膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）の細胞特性が呈する細胞型になっているのであれば特に限定されないが、例えば、２週間以内であればよく、より具体的には１日以上１０日以内であり、より好ましくは３日以上１０日以内であり、さらに好ましくは５日以上９日以内であり、一例としては７日である。
　工程（ｃ）の膵臓α細胞への分化培養の培養期間は、膵臓α細胞の細胞特性が呈する細胞型になっているのであれば特に限定されないが、例えば、３週間以内であればよく、より具体的には３日以上２０日以内であり、より好ましくは５日以上１４日以内であり、さらに好ましくは７日以上１２日以内であり、一例としては１０日である。
＜培地＞
　工程（ａ）～工程（ｃ）において使用する培地としては、細胞の種類に応じて、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＤＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ－１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ６ＴＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、又はこれらの培地から任意に選択した２種以上の培地を混合した培地等を用いることができる。上記培地はグルコースを含んでいてもよく、グルコース濃度は好ましくは１ｍＭ以上１００ｍＭ以下であり、より好ましくは２ｍＭ以上５０ｍＭ以下であり、さらに好ましくは５ｍＭ以上３０ｍＭ以下である。
　培地にはさらに、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）が含まれていてもよい。好ましくはＢＳＡまたはＨＳＡに含まれる脂質が２ｍｇ／ｇ以下、遊離脂肪酸が０．２ｍｇ／ｇ以下である。
　培地におけるＢＳＡの添加量の下限は、好ましくは０．０１％、より好ましくは０．０５％、より好ましくは０．１０％、より好ましくは０．１５％、より好ましくは０．２０％、より好ましくは０．２５％である。培地におけるＢＳＡの添加量の上限は、好ましくは１．００％、より好ましくは０．９０％、より好ましくは０．８０％、より好ましくは０．７０％、より好ましくは０．６０％、より好ましくは０．５０％、より好ましくは０．４０％、より好ましくは０．３０％、より好ましくは０．２５％である。
　培地にはさらに、ペニシリンおよびストレプトマイシンなどの抗生物質が含まれていてもよい。例えば、培地には、０．１～２％（体積／体積）のペニシリン、０．１～２％（体積／体積）のストレプトマイシンを含めることができる。
　培地にはＢ２７（登録商標）サプリメントが含まれていてもよい。
　培地におけるＢ２７（登録商標）サプリメントの添加量の下限は、好ましくは０．０１％、より好ましくは０．１％、より好ましくは０．２％、より好ましくは０．３％、より好ましくは０．４％、より好ましくは０．５％、より好ましくは０．６％、より好ましくは０．７％、より好ましくは０．８％、より好ましくは０．９％である。培地におけるＢ２７（登録商標）サプリメントの添加量の上限は、好ましくは１０％、より好ましくは９％、より好ましくは８％、より好ましくは７％、より好ましくは６％、より好ましくは５％、より好ましくは４％、より好ましくは３％、より好ましくは２％、より好ましくは１％である。
　培地には、インスリン、トランスフェリン及び亜セレン酸を含めることができる。インスリン、トランスフェリン及び亜セレン酸は、Ｂ２７サプリメントなど市販の混合物の形態で培地に含まれていてもよい。
　培地におけるトランスフェリンの添加量の下限は、好ましくは０．００１ｍｇ／Ｌ、より好ましくは０．０１ｍｇ／Ｌ、より好ましくは０．１ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１．１ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１．２ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１．３ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１．４ｍｇ／Ｌである。培地におけるトランスフェリンの添加量の上限は、好ましくは１０００ｍｇ／Ｌ、より好ましくは５００ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１００ｍｇ／Ｌ、より好ましくは９０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは８０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは７０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは６０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは５０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは４０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは３０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは２０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは９ｍｇ／Ｌ、より好ましくは８ｍｇ／Ｌ、より好ましくは７ｍｇ／Ｌ、より好ましくは６ｍｇ／Ｌ、より好ましくは５ｍｇ／Ｌ、より好ましくは４ｍｇ／Ｌ、より好ましくは３ｍｇ／Ｌである。
　培地における亜セレン酸の添加量の下限は、好ましくは０．００１μｇ／Ｌ、より好ましくは０．０１μｇ／Ｌ、より好ましくは０．１μｇ／Ｌ、より好ましくは１μｇ／Ｌ、より好ましくは１．１μｇ／Ｌ、より好ましくは１．２μｇ／Ｌ、より好ましくは１．３μｇ／Ｌ、より好ましくは１．４μｇ／Ｌ、より好ましくは１．５μｇ／Ｌ、より好ましくは１．６μｇ／Ｌ、より好ましくは１．７μｇ／Ｌである。培地における亜セレン酸の添加量の上限は、好ましくは１０００μｇ／Ｌ、より好ましくは５００μｇ／Ｌ、より好ましくは１００μｇ／Ｌ、より好ましくは９０μｇ／Ｌ、より好ましくは８０μｇ／Ｌ、より好ましくは７０μｇ／Ｌ、より好ましくは６０μｇ／Ｌ、より好ましくは５０μｇ／Ｌ、より好ましくは４０μｇ／Ｌ、より好ましくは３０μｇ／Ｌ、より好ましくは２０μｇ／Ｌ、より好ましくは１０μｇ／Ｌ、より好ましくは９μｇ／Ｌ、より好ましくは８μｇ／Ｌ、より好ましくは７μｇ／Ｌ、より好ましくは６μｇ／Ｌ、より好ましくは５μｇ／Ｌ、より好ましくは４μｇ／Ｌである。
［２］内胚葉系細胞から原始腸管細胞への分化誘導に用いる分化誘導因子、及びその他の添加物
　本発明における工程（ａ）においては、多能性幹細胞から分化誘導された内胚葉系細胞を原始腸管細胞（ＰＧＴ）への分化誘導条件に適した培養条件下、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤、及びレチノイン酸又はレチノイン酸のアナログの存在下で培養することにより、原始腸管細胞（ＰＧＴ）に分化誘導する。工程（ａ）において、多能性幹細胞から分化誘導された内胚葉系細胞を、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤、及びレチノイン酸又はレチノイン酸のアナログの存在下で培養することにより、原始腸管細胞（ＰＧＴ）に分化誘導することによって、原始腸管細胞（ＰＧＴ）から効率的に膵臓α細胞に分化誘導することができる。
　原始腸管細胞（ＰＧＴ）への分化誘導に適した培養条件とは、多能性幹細胞から分化誘導された内胚葉系細胞を原始腸管細胞（ＰＧＴ）へ好適に分化誘導できる培養条件であれば、特に限定されない。
　分化誘導培地としては、内胚葉系細胞を原始腸管細胞（ＰＧＴ）分化誘導させる培地であれば特に限定されるものではないが、一つの実施態様として、後述する分化誘導培地にて培養することが挙げられる。
　前記工程（ａ）において使用する培地における骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤の添加量の下限は、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤がドルソモルフィン（Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ）である場合、好ましくは０．０１μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．０５μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．１μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．３μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．５μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．６μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．７μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．８μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．９μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは１μｍｏＬ／Ｌである。培地におけるドルソモルフィンの含有量の上限は、好ましくは２０μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは１５μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは１０μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは７μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは５μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは４μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは３μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは２μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは１μｍｏＬ／Ｌである。
　骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤がＬＤＮ１９３１８９である場合、培地におけるＬＤＮ１９３１８９の含有量の下限は、好ましくは０．０１μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．０２μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．０５μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．１μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．２μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．３μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．４μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．５μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．６μｍｏＬ／Ｌである。培地におけるＬＤＮ１９３１８９の含有量の上限は、好ましくは１０μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは５μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは１μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．９μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．８μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．７μｍｏＬ／Ｌである。
　前記工程（ａ）において使用する培地におけるレチノイン酸又はレチノイン酸のアナログ（ＥＣ２３等）の添加量の下限は、好ましくは０．０１μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．０２μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．０３μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．０５μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．１μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．２μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．３μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．４μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．５μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．６μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．７μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．８μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．９μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは１．０μｍｏｌ／Ｌ、である。培地におけるレチノイン酸のアナログ（ＥＣ２３等）の添加量の上限は、好ましくは５．０μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは４．０μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは３．０μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは２．０μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは１．０μｍｏｌ／Ｌである。
　前記工程（ａ）は、ＲＯＣＫシグナル阻害剤（Ｙ２７６３２等）存在下で行ってもよい。
　前記工程（ａ）を、ＲＯＣＫシグナル阻害剤（Ｙ２７６３２等）存在下で行う場合、培地におけるＲＯＣＫシグナル阻害剤（Ｙ２７６３２等）の含有量の下限は、好ましくは０．１μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．５μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは１μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは１．５μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは２．０μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは２．５μｍｏＬ／Ｌ、である。培地におけるＲＯＣＫシグナル阻害剤（Ｙ２７６３２等）の含有量の上限は、好ましくは１００μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは５０μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは４０μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは３０μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは２０μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは１０μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは５μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは４μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは３μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは２．５μｍｏＬ／Ｌである。
　前記工程（ａ）において使用する培地は、インスリン受容体シグナル活性化剤を含む培地であることが好ましい。
　培地におけるインスリン受容体シグナル活性化剤の添加量の下限は、好ましくは０．００１ｍｇ／Ｌ、より好ましくは０．０１ｍｇ／Ｌ、より好ましくは０．１ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１ｍｇ／Ｌ、より好ましくは２ｍｇ／Ｌ、より好ましくは３ｍｇ／Ｌ、より好ましくは４ｍｇ／Ｌ、より好ましくは５ｍｇ／Ｌである。培地におけるインスリン受容体シグナル活性化剤の添加量の上限は、好ましくは１０００ｍｇ／Ｌ、より好ましくは５００ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１００ｍｇ／Ｌ、より好ましくは９０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは８０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは７０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは６０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは５０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは４０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは３０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは２０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１０ｍｇ／Ｌである。
　前記工程（ａ）において使用する培地は、インスリン、トランスフェリン及び亜セレン酸を含む培地であることが好ましい。
　インスリン、トランスフェリン及び亜セレン酸は、Ｂ２７サプリメントなど市販の混合物の形態で培地に含まれていてもよい。インスリン、トランスフェリン及び亜セレン酸に加えてエタノールアミンが含まれていてもよい。
　培地におけるトランスフェリンの添加量の下限は、好ましくは０．００１ｍｇ／Ｌ、より好ましくは０．０１ｍｇ／Ｌ、より好ましくは０．１ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１ｍｇ／Ｌ、より好ましくは２ｍｇ／Ｌ、より好ましくは２．１ｍｇ／Ｌ、より好ましくは２．２ｍｇ／Ｌ、より好ましくは２．３ｍｇ／Ｌ、より好ましくは２．４ｍｇ／Ｌ、より好ましくは２．５ｍｇ／Ｌ、より好ましくは２．６ｍｇ／Ｌ、より好ましくは２．７ｍｇ／Ｌである。培地におけるトランスフェリンの添加量の上限は、好ましくは１０００ｍｇ／Ｌ、より好ましくは５００ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１００ｍｇ／Ｌ、より好ましくは９０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは８０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは７０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは６０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは５０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは４０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは３０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは２０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは９ｍｇ／Ｌ、より好ましくは８ｍｇ／Ｌ、より好ましくは７ｍｇ／Ｌ、より好ましくは６ｍｇ／Ｌ、より好ましくは５ｍｇ／Ｌ、より好ましくは４ｍｇ／Ｌ、より好ましくは３ｍｇ／Ｌ、より好ましくは２．９ｍｇ／Ｌ、より好ましくは２．８ｍｇ／Ｌである。
　培地における亜セレン酸の添加量の下限は、好ましくは０．００１μｇ／Ｌ、より好ましくは０．０１μｇ／Ｌ、より好ましくは０．１μｇ／Ｌ、より好ましくは１μｇ／Ｌ、より好ましくは２μｇ／Ｌ、より好ましくは２．１μｇ／Ｌ、より好ましくは２．２μｇ／Ｌ、より好ましくは２．３μｇ／Ｌ、より好ましくは２．４μｇ／Ｌ、より好ましくは２．５μｇ／Ｌ、より好ましくは２．６μｇ／Ｌ、より好ましくは２．７μｇ／Ｌ、より好ましくは２．８μｇ／Ｌ、より好ましくは２．９μｇ／Ｌ、より好ましくは３μｇ／Ｌ、より好ましくは３．１μｇ／Ｌ、より好ましくは３．２μｇ／Ｌ、より好ましくは３．３μｇ／Ｌである。培地における亜セレン酸の添加量の上限は、好ましくは１０００μｇ／Ｌ、より好ましくは５００μｇ／Ｌ、より好ましくは１００μｇ／Ｌ、より好ましくは９０μｇ／Ｌ、より好ましくは８０μｇ／Ｌ、より好ましくは７０μｇ／Ｌ、より好ましくは６０μｇ／Ｌ、より好ましくは５０μｇ／Ｌ、より好ましくは４０μｇ／Ｌ、より好ましくは３０μｇ／Ｌ、より好ましくは２０μｇ／Ｌ、より好ましくは１０μｇ／Ｌ、より好ましくは９μｇ／Ｌ、より好ましくは８μｇ／Ｌ、より好ましくは７μｇ／Ｌ、より好ましくは６μｇ／Ｌ、より好ましくは５μｇ／Ｌ、より好ましくは４μｇ／Ｌである。
　前記工程（ａ）において使用する培地は、ＦＧＦ受容体シグナル活性化剤を含む培地であることが好ましい。ただし、より効率的な分化誘導の達成という観点からは、前記工程（ａ）における培養はＦＧＦ２非存在下において行うことが好ましい。
　培地におけるＦＧＦ受容体シグナル活性化剤の添加量の下限は、好ましくは１ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは２０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは３０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは４０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５０ｎｇ／ｍＬである。培地におけるＦＧＦ受容体シグナル活性化剤の添加量の上限は、好ましくは５００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは４００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは３００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは２００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは９０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは８０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは７０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは６０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５０ｎｇ／ｍＬである。
　前記工程（ａ）において使用する培地は、Ｂ２７（登録商標）サプリメント及び／またはＦＧＦ７を含む培地であることが好ましい。
　培地におけるＢ２７（登録商標）サプリメントの添加量の下限は、好ましくは０．０１％、より好ましくは０．１％、より好ましくは０．２％、より好ましくは０．３％、より好ましくは０．４％、より好ましくは０．５％、より好ましくは０．６％、より好ましくは０．７％、より好ましくは０．８％、より好ましくは０．９％である。培地におけるＢ２７（登録商標）サプリメントの添加量の上限は、好ましくは１０％、より好ましくは９％、より好ましくは８％、より好ましくは７％、より好ましくは６％、より好ましくは５％、より好ましくは４％、より好ましくは３％、より好ましくは２％、より好ましくは１％である。
　培地におけるＦＧＦ７の添加量の下限は、好ましくは１ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは２０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは３０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは４０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５０ｎｇ／ｍＬである。培地におけるＦＧＦ７の添加量の上限は、好ましくは５００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは４００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは３００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは２００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは９０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは８０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは７０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは６０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５０ｎｇ／ｍＬである。
　前記工程（ａ）における培養は、ヘッジホッグ（ＨＨ）シグナル阻害剤の非存在下における培養であり、ＴＧＦβシグナル阻害剤の非存在下における培養であることがより好ましい。
　培地としては、細胞の種類に応じて、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＤＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ－１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　６ＴＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、又はこれらの混合培地等を用いることができる。
　培地にはさらに、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）が含まれていてもよい。好ましくはＢＳＡまたはＨＳＡに含まれる脂質が２ｍｇ／ｇ以下、遊離脂肪酸が０．２ｍｇ／ｇ以下である。
　培地におけるＢＳＡの添加量の下限は、好ましくは０．０１％（重量％）、より好ましくは０．０５％、より好ましくは０．１０％、より好ましくは０．１５％、より好ましくは０．２０％、より好ましくは０．２５％である。培地におけるＢＳＡの添加量の上限は、好ましくは１．００％、より好ましくは０．９０％、より好ましくは０．８０％、より好ましくは０．７０％、より好ましくは０．６０％、より好ましくは０．５０％、より好ましくは０．４０％、より好ましくは０．３０％、より好ましくは０．２５％である。
　培地にはさらに、ｓｏｄｉｕｍ　ｐｙｒｕｖａｔｅが含まれていてもよい。
　培地におけるｓｏｄｉｕｍ　ｐｙｒｕｖａｔｅの添加量の下限は、好ましくは０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．１ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．２ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．５ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．６ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．７ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．８ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．９ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは１ｍｍｏｌ／Ｌである。培地におけるｓｏｄｉｕｍ　ｐｙｒｕｖａｔｅの添加量の上限は、好ましくは２０ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは１５ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは１０ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは５ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは４ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは３ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは２ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは１ｍｍｏｌ／Ｌである。
　培地にはさらに、ＮＥＡＡ（例えば、１×ｎｏｎ－ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ（ＮＥＡＡ；Ｗａｋｏ社）など）が含まれていてもよい。
　培地におけるＮＥＡＡの含有量の下限は、好ましくは０．０５×ＮＥＡＡ、より好ましくは０．１×ＮＥＡＡ、より好ましくは０．５×ＮＥＡＡ、より好ましくは０．６×ＮＥＡＡ、より好ましくは０．７×ＮＥＡＡ、より好ましくは０．８×ＮＥＡＡ、より好ましくは０．９×ＮＥＡＡ、より好ましくは１×ＮＥＡＡである。培地におけるＮＥＡＡの含有量の上限は、好ましくは２０×ＮＥＡＡ、より好ましくは１５×ＮＥＡＡ、より好ましくは１０×ＮＥＡＡ、より好ましくは５×ＮＥＡＡ、より好ましくは４×ＮＥＡＡ、より好ましくは３×ＮＥＡＡ、より好ましくは２×ＮＥＡＡ、より好ましくは１×ＮＥＡＡである。
　培地にはさらに、増殖因子安定化剤（ヘパリン等）を含んでいてもよい。
　培地における増殖因子安定化剤（ヘパリン等）の添加量の下限は、好ましくは０．２μｇ／ｍＬ、より好ましくは０．５μｇ／ｍＬ、より好ましくは１μｇ／ｍＬ、より好ましくは２μｇ／ｍＬ、より好ましくは３μｇ／ｍＬ、より好ましくは４μｇ／ｍＬ、より好ましくは５μｇ／ｍＬである。培地における増殖因子安定化剤（ヘパリン等）の添加量の上限は、好ましくは１００μｇ／ｍＬ、より好ましくは９０μｇ／ｍＬ、より好ましくは８０μｇ／ｍＬ、より好ましくは７０μｇ／ｍＬ、より好ましくは６０μｇ／ｍＬ、より好ましくは５０μｇ／ｍＬ、より好ましくは４０μｇ／ｍＬ、より好ましくは３０μｇ／ｍＬ、より好ましくは２０μｇ／ｍＬ、より好ましくは１０μｇ／ｍＬ、より好ましくは９μｇ／ｍＬ、より好ましくは８μｇ／ｍＬ、より好ましくは７μｇ／ｍＬ、より好ましくは６μｇ／ｍＬ、より好ましくは５μｇ／ｍＬである。
　培地にはさらに、ペニシリンおよびストレプトマイシンなどの抗生物質が含まれていてもよい。
　培養温度は、使用する多能性幹細胞の培養に適した培養温度であれば、特に限定されないが、一般的には３０℃～４０℃であり、好ましくは約３７℃である。
　ＣＯ２インキュベーターなどを利用して、約１～１０％、好ましくは５％のＣＯ２濃度雰囲気下で培養を行うことが好ましい。
　培養は攪拌しながら行ってもよい。撹拌速度は特に限定されないが、上限は、好ましくは２００ｒｐｍ、より好ましくは１５０ｒｐｍ、さらに好ましくは１２０ｒｐｍ、より好ましくは１１０ｒｐｍ、より好ましくは１００ｒｐｍ、より好ましくは９０ｒｐｍ、より好ましくは８０ｒｐｍ、より好ましくは７０ｒｐｍ、特に好ましくは６０ｒｐｍ、最も好ましくは５５ｒｐｍとすることができる。下限は好ましくは１ｒｐｍ、より好ましくは１０ｒｐｍ、さらに好ましくは２０ｒｐｍ、より好ましくは３０ｒｐｍ、より好ましくは４０ｒｐｍ、特に好ましくは５０ｒｐｍ、最も好ましくは５５ｒｐｍとすることができる。
［３］原始腸管細胞から膵内分泌前駆細胞への分化誘導に用いる分化誘導因子、その他の添加物、及び培養条件
　本発明における工程（ｂ）においては、内胚葉系細胞から分化誘導された原始腸管細胞（ＰＧＴ）を膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）への分化誘導に適した培養条件下、膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）に分化誘導する。
　膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）への分化誘導に適した培養条件とは、内胚葉系細胞から分化誘導された原始腸管細胞（ＰＧＴ）を膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）へ好適に分化誘導できる培養条件であれば、特に限定されない。
　分化誘導培地としては、原始腸管細胞（ＰＧＴ）を膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）へ分化誘導させる培地であれば特に限定されるものではないが、一つの実施態様として、後述する分化誘導培地にて培養することが挙げられる。
　本発明における工程（ｂ）は、原始腸管細胞（ＰＧＴ）から膵臓α細胞を効率的に分化誘導するという観点からアスコルビン酸の非存在下で行う。
　本発明における工程（ｂ）は、内胚葉系細胞から分化誘導された原始腸管細胞（ＰＧＴ）から後前腸細胞（ＰＦＧ）を分化誘導する工程、前記後前腸細胞（ＰＦＧ）から膵臓前駆細胞（ＰＰ）に分化誘導する工程、及び、前記膵臓前駆細胞（ＰＰ）から膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）に分化誘導する工程を含む。
　本発明における工程（ｂ）は、
　（ｂ１）前記原始腸管細胞（ＰＧＴ）をプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）活性化剤の存在下において培養することにより後前腸細胞（ＰＦＧ）に分化誘導する工程：
　（ｂ２）前記後前腸細胞（ＰＦＧ）をレチノイン酸又はそのアナログの存在下において培養することにより膵臓前駆細胞（ＰＰ）に分化誘導する工程：及び
　（ｂ３）前記膵臓前駆細胞（ＰＰ）を、Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤及びＲＯＣＫシグナル阻害剤の存在下において培養することにより膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）に分化誘導する工程：
を含んでいてもよい。
［３－１］原始腸管細胞から後前腸細胞への分化誘導に用いる分化誘導因子、及びその他の添加物
　前記（ｂ１）工程においては、内胚葉系細胞から分化誘導された原始腸管細胞（ＰＧＴ）を後前腸細胞（ＰＦＧ）への分化誘導に適した培養条件下、プロテインキナーゼ（ＰＫＣ）活性化剤の存在下において培養することにより後前腸細胞（ＰＦＧ）に分化誘導する。
　後前腸細胞（ＰＦＧ）への分化誘導に適した培養条件とは、内胚葉系細胞から分化誘導された原始腸管細胞（ＰＧＴ）を後前腸細胞（ＰＦＧ）へ好適に分化誘導できる培養条件であれば、特に限定されない。
　分化誘導培地としては、原始腸管細胞（ＰＧＴ）を後前腸細胞（ＰＦＧ）へ分化誘導させる培地であれば特に限定されるものではないが、一つの実施態様として、後述する分化誘導培地にて培養することが挙げられる。
　前記工程（ｂ１）において使用する培地におけるＰＫＣ活性剤の含有量の下限は、好ましくは０．０１μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．０２μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．０５μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．１μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．２μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．３μｍｏＬ／Ｌである。培地におけるＰＫＣ活性剤の含有量の上限は、好ましくは１０μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは５μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは１μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．８μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．５μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．４ｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．３μｍｏＬ／Ｌである。
　前記工程（ｂ１）において使用する培地は、ヘッジホッグ（ＨＨ）シグナル阻害剤（ＳＡＮＴ１等）を含んでいてもよい。
　培地におけるＨＨシグナル阻害剤（ＳＡＮＴ１等）の添加量の下限は、好ましくは０．０１μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．０２μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．０３μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．０５μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．１０μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．１５μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．２０μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．２５μｍｏｌ／Ｌである。培地におけるＨＨシグナル阻害剤（ＳＡＮＴ１等）の添加量の上限は、好ましくは５．０μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは４．０μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは３．０μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは２．０μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは１．０μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．８０μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．７０μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．６０μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．５０μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．４０μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．３０μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．２５μｍｏｌ／Ｌである。
　前記工程（ｂ１）において使用する培地は、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤を含んでもよい。
　骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤がＬＤＮ１９３１８９である場合、培地におけるＬＤＮ１９３１８９の含有量の下限は、好ましくは０．０１μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．０２μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．０５μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．１μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．２μｍｏＬ／Ｌである。培地におけるＬＤＮ１９３１８９の含有量の上限は、好ましくは１０μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは５μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは１μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．８μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．５μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．４μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．３μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．２μｍｏＬ／Ｌである。
　前記工程（ｂ１）において使用する培地は、ＥＧＦ受容体シグナル活性化剤を含んでもよい。
　培地におけるＥＧＦ受容体シグナル活性化剤の添加量の下限は、好ましくは１ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１５ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは２０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは２５ｎｇ／ｍＬである。培地におけるＥＧＦ受容体シグナル活性化剤の添加量の上限は、好ましくは５００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは４００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは３００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは２００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは４０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは３０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは２５ｎｇ／ｍＬである。
　工程（ｂ１）において使用する培地は、レチノイン酸のアナログ（ＥＣ２３等）を含んでいてもよい。前記培地におけるレチノイン酸のアナログの添加量については上記の［２］に記載したとおりである。
　工程（ｂ１）において使用する培地には、ＮＥＡＡ（例えば、１×ｎｏｎ－ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ（ＮＥＡＡ；Ｗａｋｏ社）など）が含まれていてもよい。前記培地におけるＮＥＡＡの添加量については上記の［２］に記載したとおりである。
　工程（ｂ１）における培地は、ＦＧＦ受容体シグナル活性化剤を含んでいてもよい。特に好ましくは、ＦＧＦ７を含む。前記培地におけるＦＧＦ受容体シグナル活性化剤の添加量については上記の［２］に記載したとおりである。
［３－２］後前腸細胞（ＰＦＧ）から膵臓前駆細胞（ＰＰ）への分化誘導に用いる分化誘導因子、及びその他の添加物
　前記工程（ｂ２）においては、後前腸細胞（ＰＦＧ）を、膵臓前駆細胞（ＰＰ）への分化誘導に適した培養条件下、レチノイン酸又はそのアナログの存在下において培養することにより膵臓前駆細胞（ＰＰ）に分化誘導する。
　膵臓前駆細胞（ＰＰ）への分化誘導に適した培養条件とは、後前腸細胞（ＰＦＧ）を膵臓前駆細胞（ＰＰ）へ好適に分化誘導できる培養条件であれば、特に限定されない。
　分化誘導培地としては、後前腸細胞（ＰＦＧ）を膵臓前駆細胞（ＰＰ）へ分化誘導させる培地であれば特に限定されるものではないが、一つの実施態様として、後述する分化誘導培地にて培養することが挙げられる。
　前記工程（ｂ２）において使用する培地におけるレチノイン酸又はレチノイン酸のアナログ（ＥＣ２３等）の添加量については上記の［２］に記載したとおりである。
　工程（ｂ２）において使用する培地は、ヘッジホッグ（ＨＨ）シグナル阻害剤（ＳＡＮＴ１等）を含んでいてもよい。前記培地におけるヘッジホッグ（ＨＨ）シグナル阻害剤（ＳＡＮＴ１等）の添加量については、上記の［３－１］に記載したとおりである。
　また、工程（ｂ２）において使用する培地には、ＮＥＡＡ（例えば、１×ｎｏｎ－ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ（ＮＥＡＡ；Ｗａｋｏ社）など）が含まれていてもよい。前記培地におけるＮＥＡＡの添加量については上記の［２］に記載したとおりである。
　工程（ｂ２）における培地は、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤を含んでもよい。前記培地における骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤の添加量については上記の［３－１］に記載したとおりである。
　工程（ｂ２）における培地は、ＦＧＦ受容体シグナル活性化剤を含んでいてもよい。特に好ましくは、ＦＧＦ１０である。前記培地におけるＦＧＦ受容体シグナル活性化剤の添加量は上記の［２］に記載したとおりである。
　工程（ｂ２）における培地は、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）活性化剤を含んでいてもよい。前記培地におけるプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）活性化剤の添加量は上記の［３－１］に記載したとおりである。
　工程（ｂ２）における培地は、ＥＧＦ受容体シグナル活性化剤を含んでいてもよい。前記培地におけるＥＧＦ受容体シグナル活性化剤の添加量は上記の［３－１］に記載したとおりである。
　工程（ｂ２）における培地は、ＴＧＦ－β受容体シグナル阻害剤（ＲｅｐＳＯＸ等）を含んでいてもよい。
　前記培地におけるＴＧＦ－β受容体シグナル阻害剤（ＲｅｐＳＯＸ等）の含有量の下限は、好ましくは０．０１μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．０５μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．１μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．３μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．５μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．６μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．７μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．８μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．９μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは１．０μｍｏＬ／Ｌである。培地におけるＴＧＦ－β受容体シグナル阻害剤（ＲｅｐＳＯＸ等）の含有量の上限は、好ましくは１０μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは８μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは５μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは４μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは３μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは２μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは１．５μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは１．２μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは１．０μｍｏＬ／Ｌである。
　工程（ｂ２）における培地は、ＺｎＳＯ４を含んでいてもよい。
　培地におけるＺｎＳＯ４の含有量の下限は、好ましくは０．１μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．５μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは１μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは３μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは５μｍｏＬ／Ｌである。培地におけるＺｎＳＯ４の含有量の上限は、好ましくは１００μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは８０μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは５０μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは４０μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは３０μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは２０μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは１５μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは１２μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは１０μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは５μｍｏＬ／Ｌである。
［３－３］膵臓前駆細胞（ＰＰ）から膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）への分化誘導に用いる分化誘導因子、及びその他の添加物
　本発明における工程（ｂ３）においては、膵臓前駆細胞（ＰＰ）を、膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）への分化誘導に適した培養条件下、Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤及びＲＯＣＫシグナル阻害剤の存在下において培養することにより膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）へ分化誘導する。
　内分泌前駆細胞（ＥＰ）への分化誘導に適した培養条件とは、後前腸細胞（ＰＰ）を膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）へ好適に分化誘導できる培養条件であれば、特に限定されない。
　分化誘導培地としては、後前腸細胞（ＰＰ）を膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）へ分化誘導させる培地であれば特に限定されるものではないが、一つの実施態様として、後述する分化誘導培地にて培養することが挙げられる。
　前記工程（ｂ３）培地におけるＮｏｔｃｈシグナル阻害剤（ＤＢＺ等）の添加量の下限は、好ましくは０．０１μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．０２μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．０３μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．０５μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．１μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．２μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．３μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．４μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．５μｍｏｌ／Ｌである。培地におけるＮｏｔｃｈシグナル阻害剤（ＤＢＺ等）の添加量の上限は、好ましくは５．０μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは４．０μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは３．０μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは２．０μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは１．０μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．９μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．８μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．７μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．６μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．５μｍｏｌ／Ｌである。
　工程（ｂ３）において使用する培地は、ヘッジホッグ（ＨＨ）シグナル阻害剤（ＳＡＮＴ１等）を含んでいてもよい。前記培地におけるヘッジホッグ（ＨＨ）シグナル阻害剤（ＳＡＮＴ１等）の添加量については上記の［３－１］に記載したとおりである。
　工程（ｂ３）において使用する培地は、レチノイン酸のアナログ（ＥＣ２３等）を含んでいてもよい。前記培地におけるレチノイン酸のアナログの添加量については上記の［２］に記載したとおりである。
　工程（ｂ３）において使用する培地には、Ｌ－グルタミンが含まれていてもよい。
　培地におけるＬ－グルタミンの含有量の下限は、好ましくは０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．１ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．５ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．７ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは１．０ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは１．２ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは１．５ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは２．０ｍｍｏｌ／Ｌである。培地におけるＬ－グルタミンの含有量の上限は、好ましくは１００ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは５０ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは４０ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは３０ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは２０ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは１０ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは９ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは８ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは７ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは６ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは５ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは４ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは３ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは２ｍｍｏｌ／Ｌである。
　工程（ｂ３）における培地は、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤を含んでもよい。前記培地における骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤の添加量については上記の［３－１］に記載したとおりである。
　工程（ｂ３）における培地は、ＴＧＦ－β受容体シグナル阻害剤を含んでいてもよい。前記培地におけるＴＧＦ－β受容体シグナル阻害剤の添加量については上記の［３－２］に記載したとおりである。
　工程（ｂ３）における培地は、ＺｎＳＯ４を含んでいてもよい。前記培地におけるＺｎＳＯ４の添加量については上記の［３－２］に記載したとおりである。
　工程（ｂ３）における培地は、増殖因子安定化剤（ヘパリン等）を含んでいてもよい。前記培地における増殖因子安定化剤（ヘパリン等）の添加量については上記の［２］に記載したとおりである。
　工程（ｂ３）における培地は、ニコチンアミドを含んでいてもよい。
　培地におけるニコチンアミドの含有量の下限は、好ましくは０．１ｍｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．５ｍｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは１ｍｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは３ｍｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは５ｍｍｏＬ／Ｌである。培地におけるニコチンアミドの上限は、好ましくは１００ｍｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは８０ｍｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは５０ｍｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは４０ｍｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは３０ｍｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは２０ｍｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは１５ｍｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは１２ｍｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは１０ｍｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは５ｍｍｏＬ／Ｌである。
　工程（ｂ３）における培地は、ＥＧＦ受容体シグナル活性化剤（ＥＧＦ等）を含んでいてもよい。前記培地におけるＥＧＦ受容体シグナル活性化剤（ＥＧＦ等）の添加量については上記の［３－１］に記載したとおりである。
　工程（ｂ３）における培地は、ＲＯＣＫシグナル阻害剤（Ｙ２７６３２等）を含んでいてもよい。
　前記工程（ｂ３）を、ＲＯＣＫシグナル阻害剤（Ｙ２７６３２等）存在下で行う場合、培地におけるＲＯＣＫシグナル阻害剤（Ｙ２７６３２等）の含有量の下限は、好ましくは０．１μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．５μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは１μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは３μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは５μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは６μｍｏＬ／Ｌより好ましくは７μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは８μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは９μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは１０μｍｏＬ／Ｌである。培地におけるＲＯＣＫシグナル阻害剤（Ｙ２７６３２等）の含有量の上限は、好ましくは１００μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは８０μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは５０μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは４０μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは３０μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは２０μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは１０μｍｏＬ／Ｌである。
［４］膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）から膵臓α細胞への分化誘導に用いる分化誘導因子、その他の添加物、及び培養条件
　本発明における工程（ｃ）においては、膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）を、膵臓α細胞への分化誘導に適した条件下、培養することにより膵臓α細胞を製造する。
　膵臓α細胞への分化誘導に適した培養条件とは、膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）を膵臓α細胞へ好適に分化誘導できる培養条件であれば、特に限定されない。
　分化誘導培地としては、膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）を膵臓α細胞へ分化誘導させる培地であれば特に限定されるものではないが、一つの実施態様として、後述する分化誘導培地にて培養することが挙げられる。
　本発明における工程（ｃ）は、膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）から膵臓α細胞を効率的に分化誘導するという観点からアスコルビン酸の非存在下で行う。
　本発明における工程（ｃ）は、酸素供給条件下で行うことが好ましい。工程（ｃ）を、酸素供給条件下で行うことにより、膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）を効率的に膵臓α細胞に分化誘導することができる。
　前記酸素供給条件は、培養液中の溶存酸素濃度が、前記培養液中の1ａｔｍ下における３７℃の培養液の飽和溶存酸素濃度を１００％としたときに、培養液中の溶存酸素濃度が２０～５０％となるように制御する条件であることが好ましい。
　培養液中の溶存酸素濃度は、例えば、蛍光式酸素センサーやガルバニ電池式酸素センサー等の溶存酸素計により測定することができる。
　酸素供給は、培地に酸素が供給できる方法であれば特に限定されないが、例えば、培養液上面に空気あるいは酸素を通気する表面通気やスパージャー等を用いて培養液中へ空気あるいは酸素を供給するスパージング法、マイクロバブルやナノバブルを用いた培養液中への酸素供給する手法が挙げられ、好ましくは表面通気である。また、これらの酸素供給方法は、工程（ｃ）を撹拌培養下で行うことと組み合わせることが可能である。撹拌培養における撹拌条件としては、培養液に酸素が供給される範囲であれば特に限定されないが、上限は、好ましくは２００ｒｐｍ、より好ましくは１５０ｒｐｍ、さらに好ましくは１２０ｒｐｍ、より好ましくは１００ｒｐｍ、より好ましくは９０ｒｐｍ、より好ましくは８０ｒｐｍ、もっと好ましくは７０ｒｐｍ、特に好ましくは６０ｒｐｍ、最も好ましくは５５ｒｐｍとすることができる。下限は好ましくは１ｒｐｍ、より好ましくは１０ｒｐｍ、さらに好ましくは２０ｒｐｍ、より好ましくは３０ｒｐｍ、より好ましくは４０ｒｐｍ、特に好ましくは５０ｒｐｍ、最も好ましくは５５ｒｐｍとすることができる。
　本発明における工程（ｃ）においては、膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）を、インスリン受容体シグナル活性化剤、トランスフェリン及び亜セレン酸の存在下において培養してもよい。
　前記培地におけるインスリン受容体シグナル活性化剤、トランスフェリン及び亜セレン酸の添加量については上記の＜培地＞に記載したとおりである。
　工程（ｃ）における培地は、ＴＧＦ－β受容体シグナル阻害剤を含んでいてもよい。前記培地におけるＴＧＦ－β受容体シグナル阻害剤の添加量については上記の［３－２］に記載したとおりである。
　工程（ｃ）における培地は、ＺｎＳＯ４を含んでいてもよい。前記培地におけるＺｎＳＯ４の添加量については上記の［３－２］に記載したとおりである。
　工程（ｃ）における培地は、ＧＬＰ－１（Ｇｌｕｃａｇｏｎ－ｌｉｋｅ　ｐｅｐｔｉｄｅ－１）受容体シグナル活性化剤（Ｅｘｅｎｄｉｎ４等）を含んでいてもよい。
　前記培地におけるＧＬＰ－１（Ｇｌｕｃａｇｏｎ－ｌｉｋｅ　ｐｅｐｔｉｄｅ－１）受容体シグナル活性化剤（Ｅｘｅｎｄｉｎ４等）の添加量の下限は、好ましくは１ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは２０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは３０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは４０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５０ｎｇ／ｍＬである。培地におけるＧＬＰ－１受容体シグナル活性化剤（Ｅｘｅｎｄｉｎ４等）の添加量の上限は、好ましくは５００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは４００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは３００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは２００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは９０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは８０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは７０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは６０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５０ｎｇ／ｍＬである。
　工程（ｃ）における培地は、増殖因子安定化剤（ヘパリン等）を含んでいてもよい。前記培地における増殖因子安定化剤（ヘパリン等）の添加量については上記の［２］に記載したとおりである。
　工程（ｃ）における培地は、ニコチンアミドを含んでいてもよい。前記培地におけるニコチンアミドの添加量については上記の［３－３］に記載したとおりである。
　工程（ｃ）における培地は、ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル活性化剤（ＢＭＰ４等）を含んでいてもよい。
　培地におけるＴＧＦβスーパーファミリーシグナル活性化剤（ＢＭＰ４等）の添加量の下限は、好ましくは０．２ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは０．５ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは３ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは６ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは７ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは８ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは９ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１０ｎｇ／ｍＬである。培地におけるＴＧＦβスーパーファミリーシグナル活性化剤（ＢＭＰ４等）の添加量の上限は、好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは９０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは８０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは７０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは６０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは４０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは３０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは２０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１０ｎｇ／ｍＬである。
　工程（ｃ）における培地は、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を含んでいてもよい。
　培地における肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の添加量の下限は、好ましくは１ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは２０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは３０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは４０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５０ｎｇ／ｍＬである。培地における肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の添加量の上限は、好ましくは５００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは４００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは３００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは２００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは９０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは８０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは７０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは６０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５０ｎｇ／ｍＬである。
　工程（ｃ）における培地は、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ１等）を含んでいてもよい。
　培地におけるインスリン様増殖因子（ＩＧＦ１等）の添加量の下限は、好ましくは１ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは２０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは３０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは４０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５０ｎｇ／ｍＬである。培地におけるインスリン様増殖因子（ＩＧＦ１等）の添加量の上限は、好ましくは５００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは４００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは３００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは２００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは９０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは８０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは７０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは６０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５０ｎｇ／ｍＬである。
　工程（ｃ）における培地は、Ａｄｅｎｙｌａｔｅ　ｃｙｃｌａｓｅ活性化剤（Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ等）を含んでいてもよい。
　培地におけるＡｄｅｎｙｌａｔｅ　ｃｙｃｌａｓｅ活性化剤（Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ等）の含有量の下限は、好ましくは０．１μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．３μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．５μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．７μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは１μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは２μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは３μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは４μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは５μｍｏＬ／Ｌである。培地におけるＡｄｅｎｙｌａｔｅ　ｃｙｃｌａｓｅ活性化剤（Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ等）の含有量の上限は、好ましくは１００μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは８０μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは５０μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは４０μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは３０μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは２０μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは１５μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは１０μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは７μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは５μｍｏＬ／Ｌである。
［５］多能性幹細胞の維持培養
　本発明の分化誘導方法においては、多能性幹細胞から分化誘導された内胚葉系細胞を使用する。
　内胚葉系細胞への分化誘導を行う前の多能性幹細胞は、未分化維持培地を用いて未分化性を維持したものとすることが好ましい。未分化維持培地を用いて多能性幹細胞の未分化性を維持する培養のことを、多能性幹細胞の維持培養ともいう。
　未分化維持培地は、多能性幹細胞の未分化性を維持できる培地であれば特に限定されないが、例えば、マウス胚性幹細胞及びマウス人工多能性幹細胞の未分化性を維持する性質を有していることが知られているｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒを含む培地や、ヒトｉＰＳの未分化性を維持する性質を有していることが知られているｂａｓｉｃ  ＦＧＦ（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）を含む培地等が挙げられる。例えば、ヒトｉＰＳ細胞培地（２０％Ｋｎｏｃｋｏｕｔ　ｓｅｒｕｍ　ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ；Ｇｉｂｃｏ社）、１×ｎｏｎ－ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ（ＮＥＡＡ；Ｗａｋｏ社）、５５μｍｏｌ／Ｌ　２－メルカプトエタノール（２－ＭＥ；Ｇｉｂｃｏ社）、７．５ｎｇ／ｍＬ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｈｕｍａｎ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ２（ＦＧＦ２；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）、０．５ｘＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎ　ａｎｄ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ＰＳ；Ｗａｋｏ社）を含むＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ　Ｆ１２（Ｗａｋｏ社）、又はＥｓｓｅｎｔａｉｌ８培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、ＳＴＥＭＰＲＯ（登録商標）　ｈＥＳＣ　ＳＦＭ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、ｍＴｅＳＲ１（Ｖｅｒｉｔａｓ社）、ＴｅＳＲ２（Ｖｅｒｉｔａｓ社）、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）等を使用することができるが、特に限定されない。
　多能性幹細胞の維持培養は、好適なフィーダー細胞（例えば、ＳＬ１０フィーダー細胞、ＳＮＬフィーダー細胞等）上において上記の未分化維持培地を用いて行うことができる。また、ビトロネクチン、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン又はマトリゲル等の細胞接着タンパク質や細胞外マトリックスをコートした細胞培養用ディッシュ上においても上記した未分化維持培地を用いて行うことができる。
　培養温度は、使用する多能性幹細胞の培養に適した培養温度であれば、特に限定されないが、一般的には３０℃～４０℃であり、好ましくは約３７℃である。
　ＣＯ２インキュベーターなどを利用して、約１～１０％、好ましくは５％のＣＯ２濃度雰囲気下で培養を行うことが好ましい。
　多能性幹細胞の維持培養は継代しながら所望の期間行うことができ、例えば、維持培養後の継代数１～１００、好ましくは継代数１０～５０、より好ましくは継代数２５～４０の多能性幹細胞を用いて、凝集体の形成や分化誘導を行うことが好ましい。
［６］多能性幹細胞の浮遊培養による凝集体の形成
　多能性幹細胞の凝集体を形成するための実施形態の一つとしては、未分化で維持培養している細胞を、ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ　Ｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）やａｃｃｕｍａｘ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ　Ｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）等によりフィーダー細胞から剥がし、３～４回ヒトｉＰＳ細胞培地でリンスをしてフィーダー細胞を除くことができる。次いで、ピペッティングにより小さな細胞塊又はシングルセルに砕き、それら細胞を培地中に懸濁した後に、懸濁液中の多能性幹細胞が凝集体を形成するまでの期間にわたって攪拌又は旋回させながら浮遊培養する。
　浮遊培養は、培地の粘性等や凹凸を有するマイクロウェル等を用いた静置培養であってもよいし、スピナー等を利用して液体培地が流動する条件での培養であってもよいが、好ましくは液体培地が流動する条件での培養である。液体培地が流動する条件での培養としては、細胞の凝集を促進するように液体培地が流動する条件での培養が好ましい。細胞の凝集を促進するように液体培地が流動する条件での培養としては、例えば、旋回流、揺動流等の流れによる応力（遠心力、求心力）により細胞が一点に集まるように液体培地が流動する条件での培養や、直線的な往復運動により液体培地が流動する条件での培養が挙げられ、旋回流及び／又は揺動流を利用した培養が特に好ましい。さらに、予めマイクロキャリア等に接着させて浮遊培養しても良いし、細胞のみで構成された細胞凝集塊の状態で浮遊培養しても良いし、細胞凝集塊の中にコラーゲン等の高分子が混在していても良く、形態は特に限定しない。
　浮遊培養に用いる培養容器は、好ましくは容器内面への細胞の接着性が低い容器が好ましい。このような容器内面への細胞の接着性が低い容器としては、例えば生体適合性がある物質で親水性表面処理されているようなプレートが挙げられる。例えば、ＮｕｎｃｌｏｎＴＭＳｐｈｅｒａ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を使用できるが特に限定はされない。また、培養容器の形状は特に限定されないが、例えば、ディッシュ状、フラスコ状、ウェル状、バッグ状、スピナーフラスコ状等の形状の培養容器が挙げられる。
　凝集体を形成させる期間としては、６時間を超える期間であれば特に限定されないが、具体的には、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、または２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間の期間において凝集体を形成させることが好ましい。
　浮遊培養培地としては、多能性幹細胞を増殖可能な成分が含まれるのであれば特に限定されないが、１～１００μＭのＹ－２７６３２（Ｃａｙｍａｎ社）を含むｍＴｅＳＲ１（Ｖｅｒｉｔａｓ社）培地、又は１～１００μＭのＹ－２７６３２（Ｃａｙｍａｎ社）、１～１００ｍｇ／ｍＬ　ＢＳＡを含むＥｓｓｅｎｔｉａｌ８ＴＭなどを使用することができる。
　浮遊培養における攪拌又は旋回の条件としては、懸濁液中において多能性幹細胞が凝集体を形成し得る範囲であれば特に限定されないが、上限は、好ましくは２００ｒｐｍ、より好ましくは１５０ｒｐｍ、さらに好ましくは１２０ｒｐｍ、より好ましくは１００ｒｐｍ、より好ましくは９０ｒｐｍ、より好ましくは８０ｒｐｍ、より好ましくは７０ｒｐｍ、より好ましくは６０ｒｐｍ、特に好ましくは５０ｒｐｍ、最も好ましくは４５ｒｐｍとすることができる。下限は好ましくは１ｒｐｍ、より好ましくは１０ｒｐｍ、さらに好ましくは２０ｒｐｍ、より好ましくは３０ｒｐｍ、より好ましくは４０ｒｐｍ、特に好ましくは４５ｒｐｍとすることができる。旋回培養の際の旋回幅は特に限定されないが、下限は、例えば１ｍｍ、好ましくは１０ｍｍ、より好ましくは２０ｍｍ、最も好ましくは２５ｍｍとすることができる。旋回幅の上限は、例えば２００ｍｍ、好ましくは１００ｍｍ、好ましくは５０ｍｍ、より好ましくは３０ｍｍ、最も好ましくは２５ｍｍとすることができる。旋回培養の際の回転半径もまた特に限定されないが、好ましくは旋回幅が前記の範囲となるように設定される。回転半径の下限は例えば５ｍｍ、好ましくは１０ｍｍであり、上限は例えば１００ｍｍ、好ましくは５０ｍｍとすることができる。旋回培養の条件をこの範囲とすることで、適切な寸法の細胞凝集体を製造することが容易となるため好ましい。
　また、浮遊培養は、揺動（ロッキング）撹拌により液体培地を流動させながら行う揺動培養であってもよい。揺動培養は、液体培地と細胞を収容した培養容器を概ね水平面に垂直な平面内で揺動させることにより行う。揺動速度は特に限定されないが、例えば１分間に２～５０回、好ましくは４～２５回（一往復を１回とする）揺動させることができる。揺動角度は特に限定されないが、例えば０．１°～２０°、より好ましくは２°～１０°とすることができる。揺動培養の条件をこの範囲とすることで、適切な寸法の細胞凝集塊を製造することが可能となるため好ましい。
　更に、上記のような旋回と揺動とを組み合わせた運動により撹拌しながら培養することもできる。
　スピナーフラスコ状の培養容器を用いた浮遊培養は、培養容器の中に攪拌翼を使用して、液体培地を攪拌しながら行う培養である。回転数や培地量は特に限定されない。市販のスピナーフラスコ状の培養容器であれば、メーカー推奨の培養液量を好適に使用することができ、例えばＡＢＬＥ社のスピナーフラスコ等も好適に用いることができる。
　本発明において、浮遊培養における細胞の播種密度は、細胞が凝集体を形成する播種密度であれば特に限定されないが、１×１０５～１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬであることが好ましい。細胞の播種密度は、２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、又は５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上が好ましく、９×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下、８×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下、７×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下、６×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下、５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下、４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下、３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下、２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下、１．９×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下、１．８×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下、１．７×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下、１．６×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下、１．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下が好ましい。特に、５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬから１．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの範囲の細胞密度が好適である。
　細胞の凝集体は、凝集体当たり数百から数千の細胞を含む。本発明において、細胞凝集体の大きさ（直径）は、特に限定されないが、例えば、５０μｍ以上、５５μｍ以上、６０μｍ以上、６５μｍ以上、７０μｍ以上、８０μｍ以上、９０μｍ以上、１００μｍ以上、１１０μｍ以上、１２０μｍ以上、１３０μｍ以上、１４０μｍ以上、１５０μｍ以上であり、且つ、１０００μｍ以下、９００μｍ以下、８００μｍ以下、７００μｍ以下、６００μｍ以下、５００μｍ以下、４００μｍ以下が挙げられる。１５０μｍ～４００μｍの範囲の直径を有する細胞凝集体は本発明で好適である。上記範囲以外の直径を有する細胞凝集体が混在していても良い。
　浮遊培養の際の培養液量は使用する培養容器によって適宜調整することができるが、例えば１２ウェルプレート（１ウェルあたりの平面視でのウェル底面の面積が３．５ｃｍ２）を使用する場合は０．５ｍｌ／ウェル以上、１．５ｍｌ／ウェル以下とすることができ、より好ましくは１ｍｌ／ウェルとすることができる。例えば６ウェルプレート（１ウェルあたりの平面視でのウェル底面の面積が９．６ｃｍ２）を使用する場合は、１．５ｍＬ／ウェル以上、好ましくは２ｍＬ／ウェル以上、より好ましくは３ｍＬ／ウェル以上とすることができ、６．０ｍＬ／ウェル以下、好ましくは５ｍＬ／ウェル以下、より好ましくは４ｍＬ／ウェル以下とすることができる。例えば１２５ｍＬ三角フラスコ（容量が１２５ｍＬの三角フラスコ）を使用する場合は、１０ｍＬ／容器以上、好ましくは１５ｍＬ／容器以上、より好ましくは２０ｍＬ／容器以上、より好ましくは２５ｍＬ／容器以上、より好ましくは３０ｍＬ／容器以上とすることができ、５０ｍＬ／容器以下、より好ましくは４５ｍＬ／容器以下、より好ましくは４０ｍＬ／容器以下とすることができる。例えば５００ｍＬ三角フラスコ（容量が５００ｍＬの三角フラスコ）を使用する場合は、１００ｍＬ／容器以上、好ましくは１０５ｍＬ／容器以上、より好ましくは１１０ｍＬ／容器以上、より好ましくは１１５ｍＬ／容器以上、より好ましくは１２０ｍＬ／容器以上とすることができ、１５０ｍＬ／容器以下、より好ましくは１４５ｍＬ／容器以下、より好ましくは１４０ｍＬ／容器以下、より好ましくは１３５ｍＬ／容器以下、より好ましくは１３０ｍＬ／容器以下、より好ましくは１２５ｍＬ／容器以下とすることができる。例えば１０００ｍＬ三角フラスコ（容量が１０００ｍＬの三角フラスコ）を使用する場合は、２５０ｍＬ／容器以上、好ましくは２６０ｍＬ／容器以上、より好ましくは２７０ｍＬ／容器以上、より好ましくは２８０ｍＬ／容器以上、より好ましくは２９０ｍＬ／容器以上とすることができ、３５０ｍＬ／容器以下、より好ましくは３４０ｍＬ／容器以下、より好ましくは３３０ｍＬ／容器以下、より好ましくは３２０ｍＬ／容器以下、より好ましくは３１０ｍＬ／容器以下とすることができる。例えば２０００ｍＬ三角フラスコ（容量が２０００ｍＬの三角フラスコ）の場合は、５００ｍＬ／容器以上、より好ましくは５５０ｍＬ／容器以上、より好ましくは６００ｍＬ／容器以上とすることができ、１０００ｍＬ／容器以下、より好ましくは９００ｍＬ／容器以下、より好ましくは８００ｍＬ／容器以下、より好ましくは７００ｍＬ／容器以下とすることができる。例えば３０００ｍＬ三角フラスコ（容量が３０００ｍＬの三角フラスコ）の場合は、１０００ｍＬ／容器以上、好ましくは１１００ｍＬ／容器以上、より好ましくは１２００ｍＬ／容器以上、より好ましくは１３００ｍＬ／容器以上、より好ましくは１４００ｍＬ／容器以上、より好ましくは１５００ｍＬ／容器以上とすることができ、２０００ｍＬ／容器以下、より好ましくは１９００ｍＬ／容器以下、より好ましくは１８００ｍＬ／容器以下、より好ましくは１７００ｍＬ／容器以下、より好ましくは１６００ｍＬ／容器以下とすることができる。例えば２Ｌ培養バッグ（容量が２Ｌのディスポーザブル培養バッグ）の場合は、１００ｍＬ／バッグ以上、より好ましくは２００ｍＬ／バッグ以上、より好ましくは３００ｍＬ／バッグ以上、より好ましくは４００ｍＬ／バッグ以上、より好ましくは５００ｍＬ／バッグ以上、より好ましくは６００ｍＬ／バッグ以上、より好ましくは７００ｍＬ／バッグ以上、より好ましくは８００ｍＬ／バッグ以上、より好ましくは９００ｍＬ／バッグ以上、より好ましくは１０００ｍＬ／バッグ以上とすることができ、２０００ｍＬ／バッグ以下、より好ましくは１９００ｍＬ／バッグ以下、より好ましくは１８００ｍＬ／バッグ以下、より好ましくは１７００ｍＬ／バッグ以下、より好ましくは１６００ｍＬ／バッグ以下、より好ましくは１５００ｍＬ／バッグ以下、より好ましくは１４００ｍＬ／バッグ以下、より好ましくは１３００ｍＬ／バッグ以下、より好ましくは１２００ｍＬ／バッグ以下、より好ましくは１１００ｍＬ／バッグ以下とすることができる。例えば１０Ｌ培養バッグ（容量が１０Ｌのディスポーザブル培養バッグ）の場合は、５００ｍＬ／バッグ以上、より好ましくは１Ｌ／バッグ以上、より好ましくは２Ｌ／バッグ以上、より好ましくは３Ｌ／バッグ以上、より好ましくは４Ｌ／バッグ以上、より好ましくは５Ｌ／バッグ以上とすることができ、１０Ｌ／バッグ以下、より好ましくは９Ｌ／バッグ以下、より好ましくは８Ｌ／バッグ以下、より好ましくは７Ｌ／バッグ以下、より好ましくは６Ｌ／バッグ以下とすることができる。例えば、２０Ｌ培養バッグ（容量が２０Ｌのディスポーザブル培養バッグ）の場合は、１Ｌ／バッグ以上、より好ましくは２Ｌ／バッグ以上、より好ましくは３Ｌ／バッグ以上、より好ましくは４Ｌ／バッグ以上、より好ましくは５Ｌ／バッグ以上、より好ましくは６Ｌ／バッグ以上、より好ましくは７Ｌ／バッグ以上、より好ましくは８Ｌ／バッグ以上、より好ましくは９Ｌ／バッグ以上、より好ましくは１０Ｌ／バッグ以上とすることができ、２０Ｌ／バッグ以下、より好ましくは１９Ｌ／バッグ以下、より好ましくは１８Ｌ／バッグ以下、より好ましくは１７Ｌ／バッグ以下、より好ましくは１６Ｌ／バッグ以下、より好ましくは１５Ｌ／バッグ以下、より好ましくは１４Ｌ／バッグ以下、より好ましくは１３Ｌ／バッグ以下、より好ましくは１２Ｌ／バッグ以下、より好ましくは１１Ｌ／バッグ以下とすることができる。例えば５０Ｌ培養バッグ（容量が５０Ｌのディスポーザブル培養バッグ）の場合は、１Ｌ／バッグ以上、より好ましくは２Ｌ／バッグ以上、より好ましくは５Ｌ／バッグ以上、より好ましくは１０Ｌ／バッグ以上、より好ましくは１５Ｌ／バッグ以上、より好ましくは２０Ｌ／バッグ以上、より好ましくは２５Ｌ／バッグ以上とすることができ、５０Ｌ／バッグ以下、より好ましくは４５Ｌ／バッグ以下、より好ましくは４０Ｌ／バッグ以下、より好ましくは３５Ｌ／バッグ以下、より好ましくは３０Ｌ／バッグ以下とすることができる。培養液量がこの範囲であるとき、適切な大きさの細胞凝集体が形成され易い。
　使用する培養容器の容量は適宜選択することができ特に限定されないが、液体培地を収容する部分の底面を平面視したときの面積として、下限が、例えば０．３２ｃｍ２、好ましくは０．６５ｃｍ２、より好ましくは０．９５ｃｍ２、さらに好ましくは１．９ｃｍ２、もっと好ましくは３．０ｃｍ２、３．５ｃｍ２、９．０ｃｍ２、又は９．６ｃｍ２の培養容器を用いることができ、上限としては、例えば１０００ｃｍ２、好ましくは５００ｃｍ２、より好ましくは３００ｃｍ２、より好ましくは１５０ｃｍ２、より好ましくは７５ｃｍ２、もっと好ましくは５５ｃｍ２、さらに好ましくは２５ｃｍ２、さらにより好ましくは２１ｃｍ２、さらにもっと好ましくは９．６ｃｍ２、又は３．５ｃｍ２の培養容器を用いることができる。
　培養温度は、使用する多能性幹細胞の培養に適した培養温度であれば、特に限定されないが、一般的には３０℃～４０℃であり、好ましくは約３７℃である。
　ＣＯ２インキュベーターなどを利用して、約１～１０％、好ましくは５％のＣＯ２濃度雰囲気下で培養を行うことが好ましい。
［７］多能性幹細胞の前培養
　上記多能性幹細胞の凝集体又は多能性幹細胞を内胚葉系細胞に分化誘導する前に、２－メルカプトエタノール、スタウプリミドを含む培地を用いて浮遊培養し、細胞集団を調製することができる。
　前培養に用いる培地は、細胞の種類に応じて、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＤＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ－１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、又はＥｓｓｅｎｔｉａｌ　６ＴＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）等を用いることができる。
　多能性幹細胞の前培養は、浮遊培養にて実施する。上述した浮遊培養の条件によって行うことができ、さらに、予めマイクロキャリア等に接着させて浮遊培養しても良いし、細胞のみで構成された細胞凝集塊の状態で浮遊培養しても良いし、細胞凝集塊の中にコラーゲン等の高分子が混在していても良く、形態は特に限定しない。
　前培養に用いる培地中における２－メルカプトエタノールの濃度としては、分化誘導の効率が向上する範囲であれば特に限定されないが、例えば、２－メルカプトエタノールの濃度として、１μＭ以上、２μＭ以上、５μＭ以上、１０μＭ以上、２０μＭ以上、３０μＭ以上、４０μＭ以上、又は５０μＭ以上が好ましく、２００μＭ以下、１５０μＭ以下、１２０μＭ以下、１００μＭ以下、９０μＭ以下、８０μＭ以下、７０μＭ以下、又は６０μＭ以下が好ましい。
　前培養に用いる培地中におけるスタウプリミドの濃度としては、分化誘導の効率が向上する範囲であれば特に限定されないが、例えば、スタウプリミドの濃度として、好ましくは０．０１μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．０２μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．０５μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．１μｍｏＬ／Ｌである。培地におけるスタウプリミドの含有量の上限は、好ましくは１０μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは５μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは１μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．８μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．５μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．４μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．３μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．２μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．１μｍｏＬ／Ｌである。
　前培養に用いる培地は、ＦＧＦ２（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ２）を添加していない培地であることも好ましい。ＦＧＦ２を添加していない培地を使用することにより、内胚葉系細胞への分化効率をより向上することができる場合がある。
　前培養に用いる培地は、ＴＧＦ－β１（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ－β１）を添加していない培地であることも好ましい。ＴＧＦ－β１を添加していない培地を使用することにより、内胚葉系細胞への分化効率をより向上することができる場合がある。
　前培養に用いる培地は、ＷＮＴシグナル活性化剤を添加していない培地であることも好ましい。ＷＮＴシグナル活性化剤を添加していない培地を使用することにより、内胚葉系細胞への分化効率をより向上することができる場合がある。
　前培養に用いる培地は、アクチビンＡ（本明細書中において「ＡＣＴＩＶＩＮ　Ａ」と言い換える場合がある）を添加していない培地であることも好ましい。アクチビンＡを添加していない培地を使用することにより、内胚葉系細胞への分化効率をより向上することができる場合がある。
　前培養用の培地には、アミノ酸、抗生物質、抗酸化剤、その他の添加物を加えてもよい。例えば０．１～２％（体積／体積）のＮＥＡＡ（非必須アミノ酸）、０．１～２％（体積／体積）のペニシリン／ストレプトマイシン、０．１～２０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ又は１～２５％（体積／体積）（好ましくは１～２０％（体積／体積））のＫｎｏｃｋｏｕｔ ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ （ＫＳＲ）などを添加してもよい。
　培養温度は、使用する多能性幹細胞の培養に適した培養温度であれば、特に限定されないが、一般的には３０℃～４０℃であり、好ましくは約３７℃である。
　ＣＯ２インキュベーターなどを利用して、約１～１０％、好ましくは５％のＣＯ２濃度雰囲気下で培養を行うことが好ましい。
　多能性幹細胞の前培養の培養期間は、多分化能が向上するまで培養する日数であれば特に限定されないが、例えば１週間を超えない期間であれば良い。より具体的には、６日未満、５日未満、４日未満、３日未満、または、６時間～４８時間であり、１２時間～３６時間程度であり、１８時間～２４時間である。
［８］内胚葉系細胞への分化誘導
　本発明においては、上記の前培養で得られた細胞集団を、内胚葉系細胞に分化誘導できる条件下で培養することによって、内胚葉系細胞に分化誘導することができる。
　内胚葉系細胞は、消化管、肺、甲状腺、膵臓、肝臓などの器官の組織、消化管に開口する分泌腺の細胞、腹膜、胸膜、喉頭、耳管、気管、気管支、尿路（膀胱、尿道の大部分、尿管の一部）などへと分化する能力を有し、一般的に、胚体内胚葉（ＤＥ）と言われることがある。多能性幹細胞から内胚葉系細胞への分化は、内胚葉系細胞に特異的な遺伝子の発現量を測定することにより確認することができる。内胚葉系細胞に特異的な遺伝子としては、例えば、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＣＸＣＲ４、ＡＦＰ、ＧＡＴＡ４、ＥＯＭＥＳ等を挙げることができる。
　多能性幹細胞を内胚葉系細胞に分化誘導する際には、分化誘導化培地を使用して多能性幹細胞の培養を行う。
　分化誘導化培地としては、多能性幹細胞を分化誘導させる培地であれば特に限定されるものではないが、例えば、血清含有培地や、血清代替成分を含有した無血清培地等が挙げられる。
　用いる細胞の種類に応じて、霊長類ＥＳ／ｉＰＳ細胞用培地（リプロセル培地）、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ　１０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ　ＭＥＭ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ＭＥＭ  Ｚｉｎｃ　Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ　１９９培地、Ｅａｇｌｅ　ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ハム培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、及びこれらの培地から任意に選択した２種以上の培地を混合した培地などが使用できる。なお、動物細胞の培養に用いることのできる培地であれば特に限定されない。
　分化誘導培地は、血清成分又は血清代替成分を含んでいてもよい。血清成分又は血清代替成分としては、例えば、アルブミン、インスリン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素（例えば亜鉛、セレン）、Ｂ－２７サプリメント（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、Ｎ２サプリメント、Ｎ２１サプリメント（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）、ＮｅｕｒｏＢｒｅｗ－２１サプリメント（Ｍｉｌｔｅｎｙｉｂｉｏｔｅｃ社）、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）、２－メルカプトエタノール、３’チオールグリセロール、並びにこれらの均等物が挙げられる。
　分化誘導培地には、さらに各種の添加物、抗生物質、抗酸化剤などを加えてもよい。例えば、０．１ｍＭ～５ｍＭのピルビン酸ナトリウム、０．１～２％（体積／体積）の非必須アミノ酸、０．１～２％（体積／体積）のペニシリン、０．１～２％（体積／体積）のストレプトマイシン、０．１～２％（体積／体積）のアンフォテリシンＢ、カタラーゼ、グルタチオン、ガラクトース、レチノイン酸（ビタミンＡ）、スーパーオキシドディスムターゼ、アスコルビン酸（ビタミンＣ）、Ｄ－α－トコフェロール（ビタミンＥ）などを添加してもよい。
　分化誘導培地にはさらに、分化誘導因子を添加する。分化誘導因子の詳細については後記する。
　分化誘導時における多能性幹細胞の培養は、浮遊培養であることが好ましい。細胞はマイクロキャリア等に接着させて浮遊培養しても良いし、細胞のみで構成された細胞凝集塊の状態で浮遊培養しても良いし、細胞凝集塊の中にコラーゲン等の高分子が混在していても良く、形態は特に限定しない。
　分化誘導のための培養における培養温度は、使用する多能性幹細胞の培養に適した培養温度であれば、特に限定されないが、一般的には３０℃～４０℃であり、好ましくは約３７℃である。
　ＣＯ２インキュベーターなどを利用して、約１～１０％、好ましくは５％のＣＯ２濃度雰囲気下で培養を行うことが好ましい。
　多能性幹細胞から内胚葉系細胞への分化培養の培養期間は、内胚葉系列の細胞特性が呈する細胞型になっているのであれば特に限定されないが、例えば、２週間以内であればよく、より具体的には２日以上８日以内であり、より好ましくは２日以上７日以内であり、さらに好ましくは３日以上６日以内であり、一例としては４日または５日である。
［９］内胚葉系細胞への分化誘導に用いる分化誘導因子、及びその他の添加物
　好ましくは、内胚葉系細胞は、多能性幹細胞を、ＴＧＦβ(Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ－β)スーパーファミリーシグナル活性化剤を含む培地で培養した後、ＦＧＦ２及びＢＭＰ４（Ｂｏｎｅ　ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ　４）を添加していない培地で培養することにより分化誘導された内胚葉系細胞である。
　ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル活性化剤を含む培地においてアクチビンＡを使用する場合、アクチビンＡの添加初期濃度は、好ましくは１ｎｇ／ｍＬ以上、２ｎｇ／ｍＬ以上、３ｎｇ／ｍＬ以上、５ｎｇ／ｍＬ以上、１０ｎｇ／ｍＬ以上、２０ｎｇ／ｍＬ以上、３０ｎｇ／ｍＬ以上、４０ｎｇ／ｍＬ以上、又は５０ｎｇ／ｍＬ以上であり、好ましくは１,０００ｎｇ／ｍＬ以下、９００ｎｇ／ｍＬ以下、８００ｎｇ／ｍＬ以下、７００ｎｇ／ｍＬ以下、６００ｎｇ／ｍＬ以下、５００ｎｇ／ｍＬ以下、４００ｎｇ／ｍＬ以下、３００ｎｇ／ｍＬ以下、２００ｎｇ／ｍＬ以下、１５０ｎｇ／ｍＬ以下、又は１００ｎｇ／ｍＬ以下である。
　ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル活性化剤を含む培地においてＦＧＦ２を使用する場合、ＦＧＦ２の添加初期濃度は、好ましくは１ｎｇ／ｍＬ以上、２ｎｇ／ｍＬ以上、３ｎｇ／ｍＬ以上、５ｎｇ／ｍＬ以上、１０ｎｇ／ｍＬ以上、２０ｎｇ／ｍＬ以上、３０ｎｇ／ｍＬ以上、又は４０ｎｇ／ｍＬ以上であり、好ましくは１,０００ｎｇ／ｍＬ以下、９００ｎｇ／ｍＬ以下、８００ｎｇ／ｍＬ以下、７００ｎｇ／ｍＬ以下、６００ｎｇ／ｍＬ以下、５００ｎｇ／ｍＬ以下、４００ｎｇ／ｍＬ以下、３００ｎｇ／ｍＬ以下、２００ｎｇ／ｍＬ以下、１５０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ以下、９０ｎｇ／ｍＬ以下、８０ｎｇ／ｍＬ以下、又は７０ｎｇ／ｍＬ以下である。
　ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル活性化剤を含む培地においてＢＭＰ４を使用する場合、ＢＭＰ４の添加初期濃度は、好ましくは１ｎｇ／ｍＬ以上、２ｎｇ／ｍＬ以上、３ｎｇ／ｍＬ以上、５ｎｇ／ｍＬ以上、６ｎｇ／ｍＬ以上、７ｎｇ／ｍＬ以上、８ｎｇ／ｍＬ以上、９ｎｇ／ｍＬ以上、１０ｎｇ／ｍＬ以上、１１ｎｇ／ｍＬ以上、１２ｎｇ／ｍＬ以上、１３ｎｇ／ｍＬ以上、１４ｎｇ／ｍＬ以上、又は１５ｎｇ／ｍＬ以上であり、好ましくは１,０００ｎｇ／ｍＬ以下、９００ｎｇ／ｍＬ以下、８００ｎｇ／ｍＬ以下、７００ｎｇ／ｍＬ以下、６００ｎｇ／ｍＬ以下、５００ｎｇ／ｍＬ以下、４００ｎｇ／ｍＬ以下、３００ｎｇ／ｍＬ以下、２００ｎｇ／ｍＬ以下、１５０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ以下、９０ｎｇ／ｍＬ以下、８０ｎｇ／ｍＬ以下、７０ｎｇ／ｍＬ以下、６０ｎｇ／ｍＬ以下、５０ｎｇ／ｍＬ以下、４０ｎｇ／ｍＬ以下、又は３０ｎｇ／ｍＬ以下である。
　ＦＧＦ２及びＢＭＰ４を添加していない培地は、アクチビンＡを含むことが好ましい。
　ＦＧＦ２及びＢＭＰ４を添加していない培地がアクチビンＡを含む場合におけるアクチビンＡの添加初期濃度は、好ましくは１ｎｇ／ｍＬ以上、２ｎｇ／ｍＬ以上、３ｎｇ／ｍＬ以上、５ｎｇ／ｍＬ以上、１０ｎｇ／ｍＬ以上、２０ｎｇ／ｍＬ以上、３０ｎｇ／ｍＬ以上、４０ｎｇ／ｍＬ以上、又は５０ｎｇ／ｍＬ以上であり、好ましくは１,０００ｎｇ／ｍＬ以下、９００ｎｇ／ｍＬ以下、８００ｎｇ／ｍＬ以下、７００ｎｇ／ｍＬ以下、６００ｎｇ／ｍＬ以下、５００ｎｇ／ｍＬ以下、４００ｎｇ／ｍＬ以下、３００ｎｇ／ｍＬ以下、２００ｎｇ／ｍＬ以下、１５０ｎｇ／ｍＬ以下、又は１００ｎｇ／ｍＬ以下である。
　ＦＧＦ２及びＢＭＰ４を添加していない培地は、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム及びエタノールアミンからなる群から選択される少なくとも１種類以上を含むことが好ましい。
　インスリンの添加濃度は、好ましくは０．００１μｇ／ｍＬ以上、０．０１μｇ／ｍＬ以上、０．０５μｇ／ｍＬ以上、０．１μｇ／ｍＬ以上、０．２μｇ／ｍＬ以上であり、好ましくは１０，０００μｇ／ｍＬ以下、１，０００μｇ／ｍＬ以下、１００μｇ／ｍＬ以下、１０μｇ／ｍＬ以下、９μｇ／ｍＬ以下、８μｇ／ｍＬ以下、７μｇ／ｍＬ以下、６μｇ／ｍＬ以下、５μｇ／ｍＬ以下、４μｇ／ｍＬ以下、３μｇ／ｍＬ以下、２μｇ／ｍＬ以下である。トランスフェリンの添加濃度は、好ましくは０．００１μｇ／ｍＬ以上、０．０１μｇ／ｍＬ以上、０．０５μｇ／ｍＬ以上、０．０６μｇ／ｍＬ以上、０．０７μｇ／ｍＬ以上、０．０８μｇ／ｍＬ以上、０．０９μｇ／ｍＬ以上、０．１μｇ／ｍＬ以上、０．１１μｇ／ｍＬ以上であり、好ましくは１０，０００μｇ／ｍＬ以下、１，０００μｇ／ｍＬ以下、１００μｇ／ｍＬ以下、１０μｇ／ｍＬ以下、９μｇ／ｍＬ以下、８μｇ／ｍＬ以下、７μｇ／ｍＬ以下、６μｇ／ｍＬ以下、５μｇ／ｍＬ以下、４μｇ／ｍＬ以下、３μｇ／ｍＬ以下、２μｇ／ｍＬ以下、１．９μｇ／ｍＬ以下、１．８μｇ／ｍＬ以下、１．７μｇ／ｍＬ以下、１．６μｇ／ｍＬ以下、１．５μｇ／ｍＬ以下、１．４μｇ／ｍＬ以下、１．３μｇ／ｍＬ以下、１．２μｇ／ｍＬ以下、１．１μｇ／ｍＬ以下である。亜セレン酸ナトリウムの添加濃度は、好ましくは０．００１ｎｇ／ｍＬ以上、０．０１ｎｇ／ｍＬ以上、０．１ｎｇ／ｍＬ以上であり、好ましくは１０，０００ｎｇ／ｍＬ以下、１，０００ｎｇ／ｍＬ以下、１００ｎｇ／ｍＬ以下、１０ｎｇ／ｍＬ以下、１ｎｇ／ｍＬ以下である。エタノールアミンの添加濃度は、好ましくは０．００１μｇ／ｍＬ以上、０．０１μｇ／ｍＬ以上、０．０２μｇ／ｍＬ以上、０．０３μｇ／ｍＬ以上、０．０４μｇ／ｍＬ以上であり、好ましくは１０，０００μｇ／ｍＬ以下、１，０００μｇ／ｍＬ以下、１００μｇ／ｍＬ以下、１０μｇ／ｍＬ以下、１μｇ／ｍＬ以下、０．９μｇ／ｍＬ以下、０．８μｇ／ｍＬ以下、０．７μｇ／ｍＬ以下、０．６μｇ／ｍＬ以下、０．５μｇ／ｍＬ以下、０．４μｇ／ｍＬ以下である。
　ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル活性化剤を含む培地、及び／又は、ＦＧＦ２及びＢＭＰ４を添加していない培地は、さらに２－メルカプトエタノールを含むことが好ましい。２－メルカプトエタノールを作用することにより、内胚葉系細胞への分化誘導効率を高めることができる。
　ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル活性化剤を含む培地は、さらにＷＮＴシグナル活性化剤を含むことが好ましい。
　ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル活性化剤を含む培地においてＣＨＩＲ９９０２１を使用する場合、添加初期濃度は、好ましくは０．０１μＭ以上、０．０２μＭ以上、０．０３μＭ以上、０．０４μＭ以上、０．０５μＭ以上、０．１μＭ以上、０．２μＭ以上、０．３μＭ以上、０．４μＭ以上、０．５μＭ以上、０．６μＭ以上、０．７μＭ以上、０．８μＭ以上、０．９μＭ以上、１μＭ以上、又は２μＭ以上であり、好ましくは１００μＭ以下、９０μＭ以下、８０μＭ以下、７０μＭ以下、６０μＭ以下、５０μＭ以下、４５μＭ以下、４０μＭ以下、３５μＭ以下、３０μＭ以下、２５μＭ以下、２０μＭ以下、１５μＭ以下、１０μＭ以下、又は５μＭ以下である。より好ましくは３μＭまたは４μＭである。
　ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル活性化剤を含む培地、及び／又はＦＧＦ２及びＢＭＰ４を添加していない培地は、少なくともグルコースを含む。前記培地中に含まれるグルコース濃度の下限は、細胞が増殖できる濃度であれば特に限定されないが、０．０１ｇ／Ｌ以上が好ましい。また、前記培地中に含まれるグルコース濃度の上限は、細胞が死滅しない濃度であれば特に限定されないが、例えば１０ｇ／Ｌ以下が好ましい。他の実施態様として、内胚葉系列の体細胞に効率的に分化させる観点においては、グルコースを２．０ｇ／Ｌ未満で含有する培地が好ましい。ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル活性化剤を含む培地、及び／又はＦＧＦ２及びＢＭＰ４を添加していない培地におけるグルコースの濃度は、１．０ｇ／Ｌ以下でもよく、０．９ｇ／Ｌ以下でもよく、０．８ｇ／Ｌ以下、０．７ｇ／Ｌ以下、０．６ｇ／Ｌ以下でもよい。ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル活性化剤を含む培地、及び／又はＦＧＦ２及びＢＭＰ４を添加していない培地がグルコースを含む場合における、グルコースの濃度の下限は特に限定されないが、０．０１ｇ／Ｌ以上でもよく、０．０２ｇ／Ｌ以上、０．０５ｇ／Ｌ以上、０．１ｇ／Ｌ以上、０．２ｇ／Ｌ以上、０．３ｇ／Ｌ以上、０．４ｇ／Ｌ以上、０．５ｇ／Ｌ以上でもよい。
［１０］膵臓α細胞の利用
　本発明の方法により得られる膵臓α細胞は、グルカゴン分泌能を有し、膵島におけるグルカゴン分泌機構の解明や、新規糖尿病治療薬の開発ツールとしてとして有用である。即ち、本発明の方法を利用して製造した膵臓α細胞を用いて、当該細胞からのグルカゴンの分泌を抑制する物質をスクリーニングすることができる。このスクリーニングの結果得られた膵臓α細胞からのグルカゴン分泌を抑制する物質は、新規糖尿病治療薬として用いることができる。
　以下の実施例にて本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
［比較例１］
　Ｓ．　Ｇ．　Ｙａｂｅ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｉｓｌｅｔ－ｌｉｋｅ　ｃｅｌｌｓ　ｆｒｏｍ　ｈｕｍａｎ　ｉＰＳ　ｃｅｌｌｓ　ｂｙ　ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ　ｃｕｌｔｕｒｅ，　Ｒｅｇｅｎ．　Ｔｈｅｒ．，　１０，　６９－７６，　２０１９を参考にヒトｉＰＳ細胞を膵臓β細胞へ分化誘導した。
（１）ヒトｉＰＳ細胞の維持培養
　ヒトｉＰＳ細胞はＭｉｔｏｍｙｃｉｎ－Ｃで処理したＳＮＬ　Ｆｅｅｄｅｒ細胞上で、２０（体積／体積）％　ＫｎｏｃｋＯｕｔ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）、１×Ｎｏｎ－Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ａｍｉｎｏ　Ａｃｉｄ（ＮＥＡＡ）、５５μＭ　２－Ｍｅｒｃａｐｔｅｔｈａｎｏｌ（２－ＭＥ）、７．５ｎｇ／ｍＬ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ　Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　２（ＦＧＦ２）、０．５×Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ　ａｎｄ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ＰＳ）を含むＤＭＥＭ／ＨＡＭ’Ｓ　Ｆ１２培地で未分化維持培養を行った。または、Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎでコーティングしたプレート上で、０．５×Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ　ａｎｄ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを含むＳｔｅｍＦｉｔ培地で未分化維持培養を行った。なお、播種時のみ最終濃度１０μＭとなるようにＹ－２７６３２を添加して培養した。培養は、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で行った。
（２）ヒトｉＰＳ細胞凝集塊の作製
　ヒトｉＰＳ細胞を１回ＰＢＳ（－）で洗浄した後、Ａｃｃｕｍａｘを添加した。３７℃で５－１５分間インキュベートした後、ピペッティングによりシングルセルまで分散して回収した。４×１０７個の細胞を１０μＭのＹ－２７６３２を含むｍＴｅＳＲ１培地３０ｍＬ中に懸濁し、３０ｍＬのシングルユースバイオリアクター（ＡＢＬＥ社）に播種した。これを６チャネルマグネチックスターラー（ＡＢＬＥ社）に装着して４５ｒｐｍの速度で撹拌しながら、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で浮遊培養を２日間行った。
（３）ヒトｉＰＳ細胞の前培養
　凝集塊の作製にて得られた凝集塊を形成した細胞集団を、２０（体積／体積）％　ＫＳＲ、１×ＮＥＡＡ、０．１μＭ　Ｓｔａｕｐｒｉｍｉｄｅ、５５μＭ　２－ＭＥを含むＤＭＥＭ／ＨＡＭ’Ｓ　Ｆ１２に懸濁し、３０ｍＬのシングルユースバイオリアクターへ移した。これを６チャネルマグネチックスターラーに装着して４５ｒｐｍの速度で撹拌しながら、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で浮遊培養を１日間行った。
（４）膵臓β細胞への分化誘導
　前培養にて得られた細胞集団を、まずは内胚葉系細胞へ分化誘導した。具体的には、最初の２日は０．２５（体積／体積）％　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ　Ａｌｂｕｍｉｎ　（ＢＳＡ）、１ｍＭ　Ｓｏｄｉｕｍ　Ｐｙｒｕｖａｔｅ、１×ＮＥＡＡ、０．４×ＰＳ、８０ｎｇ／ｍＬ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ　Ａｃｔｉｖｉｎ　Ａ、５０ｎｇ／ｍＬ　ＦＧＦ２、２０ｎｇ／ｍＬ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ　Ｂｏｎｅ　Ｍｏｒｈｏｇｅｎｅｔｉｃ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　４（ＢＭＰ４）、３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１、５５μＭ　２－ＭＥを含むＲＰＭＩ１６４０培地で浮遊培養した。３日目はこの培地からＦＧＦ２、ＢＭＰ４、ＣＨＩＲ９９０２１を除いた培地で、４日目は３日目の培地に０．５（体積／体積）％　ＫＳＲを加えた培地で浮遊培養を行うことで、内胚葉系細胞へ分化誘導した。なお、浮遊培養は３０ｍＬシングルユースバイオリアクター（ＡＢＬＥ社）を６チャネルマグネチックスターラーに装着し、４５ｒｐｍの速度で撹拌しながら３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で行った。
　上記で得られた内胚葉系細胞から原始腸管細胞（ＰＧＴ）へ分化誘導した。具体的には、０．２５（体積／体積）％　ＢＳＡ、１　ｍＭ　Ｓｏｄｉｕｍ　Ｐｙｒｕｖａｔｅ、１×ＮＥＡＡ、０．４×ＰＳ、１（体積／体積）％　Ｂ－２７　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、０．３（体積／体積）％　Ｉｎｓｕｌｉｎ－Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ－Ｓｅｌｅｎｉｕｍ－Ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（ＩＴＳ－Ｘ）、５０ｎｇ／ｍＬ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ　Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　７（ＦＧＦ－７）を含むＲＰＭＩ１６４０培地もしくはＤＭＥＭ培地とＨＡＭ’Ｓ　Ｆ１２培地の１：１混合培地で３日間浮遊培養した。浮遊培養は３０ｍＬシングルユースバイオリアクターを６チャネルマグネチックスターラーに装着し、４５ｒｐｍの速度で撹拌しながら３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で行った。
　上記で得られた原始腸管細胞（ＰＧＴ）から後前腸細胞（ＰＦＧ）へ分化誘導した。具体的には、０．１５（体積／体積）％　ＢＳＡ、１×ＮＥＡＡ、０．４×ＰＳ、１（体積／体積）％　Ｂ－２７　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、０．３（体積／体積）％　ＩＴＳ－Ｘ、５０ｎｇ／ｍＬ　ＦＧＦ－７、０．３μＭ　Ｉｎｄｏｌａｃｔａｍ　Ｖ（ＩＬＶ）、０．２μＭ　ＬＤＮ１９３１８９、０．２５μＭ　ＳＡＮＴ１、０．２５ｍＭ　Ａｓｃｏｒｂｉｃ　Ａｃｉｄを含むＲＰＭＩ１６４０培地もしくはＤＭＥＭ培地とＨＡＭ’Ｓ　Ｆ１２培地の３：１混合培地で４日間浮遊培養した。浮遊培養は３０ｍＬシングルユースバイオリアクターを６チャネルマグネチックスターラーに装着し、４５ｒｐｍの速度で撹拌しながら３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で行った。
　次に、上記で得られた後前腸細胞（ＰＧＴ）から膵臓前駆細胞（ＰＰ）へ分化誘導した。具体的には、０．１５（体積／体積）％　ＢＳＡ、１×ＮＥＡＡ、０．４×ＰＳ、１（体積／体積）％　Ｂ－２７　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、０．２５（体積／体積）％　ＩＴＳ－Ｘ、５０ｎｇ／ｍＬ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ　Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　１０（ＦＧＦ１０）、０．０４μＭ　ＥＣ２３、０．２μＭ　ＬＤＮ１９３１８９、０．２５μＭ　ＳＡＮＴ１、５μＭ　Ｚｉｎｃ　Ｓｕｌｆａｔｅ、５５μＭ　２－ＭＥ、０．２５ｍＭ　Ａｓｃｏｒｂｉｃ　Ａｃｉｄを含むＤＭＥＭ培地もしくはＤＭＥＭ培地とＨＡＭ’Ｓ　Ｆ１２培地の４：１混合培地で３日間浮遊培養した。浮遊培養は３０ｍＬシングルユースバイオリアクターを６チャネルマグネチックスターラーに装着し、４５ｒｐｍの速度で撹拌しながら３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で行った。
　次に、膵臓前駆細胞（ＰＰ）から膵臓内分泌前駆細胞（ＥＰ）へ分化誘導した。具体的には、０．１５（体積／体積）％　ＢＳＡ、１×ＮＥＡＡ、０．４×ＰＳ、１（体積／体積）％　Ｂ－２７　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、０．３（体積／体積）％　ＩＴＳ－Ｘ、２０ｎｇ／ｍＬ　ＥＧＦ、５０ｎｇ／ｍＬ　Ｅｘｅｎｄｉｎ４、０．０１μＭ　ＥＣ２３、０．２μＭ　ＬＤＮ１９３１８９、０．２５μＭ　ＳＡＮＴ１、１０μＭ　ＲｅｐＳｏｘ、０．５μＭ　ＤＢＺ、１０μＭ　Ｙ－２７６３２、５μＭ　Ｚｉｎｃ　Ｓｕｌｆａｔｅ、１０μｇ／ｍＬ　Ｈｅｐａｒｉｎ、５ｍＭ　Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅを含むＤＭＥＭ培地もしくはＤＭＥＭ培地とＨＡＭ’Ｓ　Ｆ１２培地の４：１混合培地で７日間浮遊培養した。浮遊培養は３０ｍＬシングルユースバイオリアクターを６チャネルマグネチックスターラーに装着し、４５ｒｐｍの速度で撹拌しながら３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で行った。
　最後に、膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）から膵臓β細胞へ分化誘導した。具体的には、０．１５（体積／体積）％　ＢＳＡ、１×ＮＥＡＡ、０．４×ＰＳ、１（体積／体積）％　Ｂ－２７　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、０．３（体積／体積）％　ＩＴＳ－Ｘ、５０ｎｇ／ｍＬ　Ｅｘｅｎｄｉｎ、５０ｎｇ／ｍＬ　ｈｕｍａｎ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ（ＩＧＦ）、５μＭ　Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ、５μＭ　Ｚｉｎｃ　Ｓｕｌｆａｔｅ、１０μＭ　ＲｅｐＳｏｘ、１０μｇ／ｍＬ　Ｈｅｐａｒｉｎ、５ｍＭ　Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅを含むＤＭＥＭ培地もしくはＤＭＥＭ培地とＨＡＭ’ｓ　Ｆ１２培地の４：１混合培地で１０－１２日間浮遊培養した。浮遊培養は３０ｍＬシングルユースバイオリアクターを６チャネルマグネチックスターラーに装着し、４５ｒｐｍの速度で撹拌しながら３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内、もしくは１００ｍＬシングルユースバイオリアクター（ＡＢＬＥ社）を微生物培養装置（ＢＭＺ－Ｐ；ＡＢＬＥ社）に装着し５０ｒｐｍの速度で撹拌しながら、３７℃、５％ＣＯ２環境下で行った。
［実施例１］
（１）分化誘導
　内胚葉系細胞までは比較例１と同様の方法にて分化誘導し、前記内胚葉系細胞から原始腸管細胞（ＰＧＴ）への分化誘導は比較例１で使用した培地に、０．６７μＭ　ＬＤＮ１９３１８９を添加、１μＭ　ＥＣ２３を添加、もしくはその両方を添加した培地で３日間浮遊培養した。また、上記培地には凝集塊の形状維持を目的とし、２．５μＭ　Ｙ－２７６３２を添加した。浮遊培養は３０ｍＬシングルユースバイオリアクターを６チャネルマグネチックスターラーに装着し、４５ｒｐｍの速度で撹拌しながら３７℃の５％　ＣＯ２インキュベーター内で行った。後前腸細胞（ＰＦＧ）以降への分化誘導は比較例１と同様の方法にて行った。
（２）定量的ＲＴ－ＰＣＲ
　（１）の分化誘導で得られた細胞よりＩｓｏｇｅｎ（Ｎｉｐｐｏｎ　Ｇｅｎｅ社）を用いてｔｏｔａｌ　ＲＮＡを単離・精製し、得られたｔｏｔａｌ　ＲＮＡからＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＩＩ（Ｔａｋａｒａ　Ｂｉｏ社）を用いてｃＤＮＡ合成を行った。得られたｃＤＮＡを鋳型とし、ＧｏＴａｑ　ｑＰＣＲ　ｍａｓｔｅｒ　ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いてＭｙｉＱ　ｑＰＣＲ　ｍａｃｈｉｎｅ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）により定量ＰＣＲを実施した。検出はＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎによるインターカーレーション法を、遺伝子発現量比較はΔＣｔ法もしくはΔΔＣｔ法による相対定量法を用いた。各遺伝子の発現レベルはハウスキーピング遺伝子であるＯＡＺ１により標準化した。
　定量ＰＣＲに使用したプライマーの塩基配列は次の通りである。
OAZ1 F :GTC AGA GGG ATC ACA ATC TTT CAG（配列番号１）
OAZ1 R :GTC TTG TCG TTG GAC GTT AGT TC（配列番号２）
INS F :TTG TGA ACC AAC ACC TGT GC（配列番号３）
INS R :GTG TGT AGA AGA AGC CTC GTT CC（配列番号４）
GCG F :ACA TTC ACC AGT GAC TAC AGC AAG（配列番号５）
GCG R :GGC AAT GTT ATT CCT GTT CCT C（配列番号６）
NKX6.1 F:ATC TTC GCC CTG GAG AAG AC（配列番号７）
NKX6.1 R:CGT GCT TCT TCC TCC ACT TG（配列番号８）
（測定の結果）
　遺伝子発現量の測定結果を図１に示す。
　実施例１の各条件で得られた細胞を比較例１の方法で得られた細胞と比較すると、ＬＤＮ１９３１８９を添加した条件では膵臓β細胞に特異的な遺伝子である、ＩＮＳ遺伝子及びＮＫＸ６．１遺伝子発現の低下が認められた。一方、ＥＣ２３を添加した条件では膵臓α細胞に特異的な遺伝子であるＧＣＧ遺伝子発現の向上が認められた。このことから、内胚葉系細胞から原始腸管細胞（ＰＧＴ）への分化誘導する際に、ＬＤＮ１９３１８９を添加すると膵臓β細胞への分化誘導が抑制され、ＥＣ２３を添加すると膵臓α細胞への分化誘導が促進されることが明らかとなった。
　また、ＬＤＮ１９３１８９及びＥＣ２３の両方を添加した条件では、ＩＮＳ遺伝子及びＮＫＸ６．１遺伝子の発現は低下し、かつＧＣＧ遺伝子の発現は向上していることから、膵臓β細胞ではなく膵臓α細胞が製造されていることが分かる（図１）。従って、本実施例で得られた細胞は主に膵臓α細胞であり、実施例１の方法で内胚葉系細胞から原始腸管細胞（ＰＧＴ）を用いて分化誘導すると、膵臓α細胞を効率的に製造することができる。
［実施例２］
（１）分化誘導
　実施例１と同様の方法でヒトｉＰＳ細胞から原始腸管細胞（ＰＧＴ）を製造した。得られた原始腸管細胞（ＰＧＴ）は比較例１の培地からアスコルビン酸を除いた培地を用いて、後前腸細胞（ＰＦＧ）以降の細胞へと分化誘導した。
（２）ＧＣＧ分泌量測定
　（１）の分化誘導で得られた細胞を２×１０６細胞回収し、１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ及び０．１（体積／体積）％　ＢＳＡを含むＤＭＥＭ培地（２ｍＭ　グルコース含有）中で３０分間培養した。その後、細胞を２回　１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ及び０．１（体積／体積）％　ＢＳＡを含むＤＭＥＭ培地（グルコース不含）で洗浄した後、１ｍＬの２．０ｍＭグルコース、１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ及び０．１（体積／体積）％　ＢＳＡを含むＤＭＥＭ培地中で１時間培養した。その後、培養上清中に含まれるＧＣＧ濃度をＧｌｕｃａｇｏｎ　ＥＬＩＳＡ　１０μｌ　Ｋｉｔ（Ｍｅｒｃｏｄｉａ社）を用いて測定した。
　比較対象として、実施例１及び比較例１で得られた細胞についても上記の方法でＧＣＧ分泌量を測定した。
（３）定量ＲＴ－ＰＣＲ
　（１）の分化誘導で得られた細胞を実施例１に記載の方法と同じ方法を用いて定量ＰＣＲを実施した。なお本実施例では実施例１のプライマーに下記プライマーを追加し、定量ＰＣＲに使用した。
ARX F：AAG GAG GTG TGC TAA AGG CTG（配列番号９）
ARX R：GCT GGT CCT CTG TTT CCA TTT G（配列番号１０）
GC F：CTG AGT GCT GCA CCA AAG AG（配列番号１１）
GC R：ATT TGT GGG TTC CAC GTA GGT AG（配列番号１２）
（測定の結果）
　実施例１の方法で得られた細胞と実施例２の方法で得られた細胞では、グルカゴンの分泌量に顕著な差が認められた。具体的には、実施例２の方法で得られた細胞のグルカゴンは実施例１の方法で得られた細胞と比較してグルカゴンの分泌量が多かった。つまり、原始腸管細胞（ＰＧＴ）以降の分化誘導工程において、分化誘導培地からアスコルビン酸を除去する（または、アスコルビン酸を含まない分化誘導培地で培養する）ことで、原始腸管細胞から効率的に膵臓α細胞へと分化誘導していることが分かる（図２）。
　同様に実施例２の方法で得られた細胞を、比較例１の方法で得られた細胞と比較すると（図３）、実施例２の方法で得られた細胞は、比較例１の方法で得られた細胞と比較して、グルカゴンの分泌量が顕著に多いことが分かる。このことから実施例１の方法で原始腸管細胞（ＰＧＴ）を製造することに加えて、その後の分化誘導工程をアスコルビン酸の非存在下で行うことで、ヒトｉＰＳ細胞から膵臓α細胞を、より効率的に製造することができる。
　従って、本発明に記載の方法でヒトｉＰＳ細胞を分化誘導すると、膵臓β細胞への分化を抑制すると共に、膵臓α細胞への分化を促進し、効率的に膵臓α細胞を製造することができる。
　次に、実施例２の方法で得られた細胞と比較例１の方法で得られた細胞の遺伝子発現量を測定した結果を図４に示す。実施例２の方法で得られた細胞では、膵臓α細胞に特異的な遺伝子である、ＧＣＧ遺伝子、ＡＲＸ遺伝子及びＧＣ遺伝子の発現が高く、一方で膵臓β細胞に特異的な遺伝子であるＩＮＳ遺伝子及びＮＫＸ６．１遺伝子の発現は低かった。このことからも、本発明の方法で多能性幹細胞を分化誘導すれば、効率的に膵臓α細胞を製造できることが分かる。
［実施例３］
　実施例３では、膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）から膵臓α細胞への分化誘導工程における培養液中の酸素濃度が与える影響について検討した。
（１）分化誘導
　膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）までは比較例１と同様の方法にて製造した。膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）から膵臓α細胞への分化誘導では、比較例１の培地を使用し、微生物培養装置（ＢＭＺ－Ｐ；エイブル社）を用いて培養液中の酸素濃度を制御しながら１２日間浮遊培養した。溶存酸素濃度は、１ａｔｍでの前記培養液中の飽和酸素濃度を１００％としたとき、培養液中の溶存酸素濃度が表１に示す酸素濃度となるように制御した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（２）酸素濃度測定
　培養液中の酸素濃度は蛍光式溶存酸素計を用いて経時的に測定した。測定値は１ａｔｍにおける培養液中の飽和溶存酸素濃度を１００％としたときの溶存酸素量（％）を示す。
（３）定量的ＲＴ－ＰＣＲ
　膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）から膵臓α細胞への分化誘導段階において、２日ごとに、得られた細胞を回収し、実施例１に記載の方法で定量的ＲＴ－ＰＣＲを実施した。
（測定の結果）
　＃３－１における培養中の酸素濃度を図５に示す。酸素濃度非制御時には細胞による酸素消費により、溶存酸素量は１５％程度となった。一方、培養装置を用いて酸素濃度制御を行った場合には、目的酸素濃度の±１０％前後で溶存酸素濃度を制御可能であった。
　得られた細胞について遺伝子発現量を測定した結果を図６及び図７に示す。酸素濃度非制御群（比較例１）と比較して、膵臓α細胞に特異的な遺伝子であるＧＣＧ遺伝子の発現は酸素濃度制御群（実施例３）で高く（図６）、膵臓β細胞に特異的な遺伝子であるＩＮＳ遺伝子の発現は酸素濃度制御群では低かった（図７）。
　このことから、膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）から膵臓α細胞への分化誘導工程において、酸素濃度を適切に制御すれば、より効率的に膵臓α細胞を製造することができることが分かった。

Claims (9)

  1. 　（ａ）多能性幹細胞から分化誘導された内胚葉系細胞を、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル阻害剤、及びレチノイン酸又はレチノイン酸のアナログの存在下で培養することにより原始腸管細胞（ＰＧＴ）に分化誘導する工程：
    　（ｂ）前記原始腸管細胞（ＰＧＴ）を培養することにより膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）に分化誘導する工程：及び
    　（ｃ）前記膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）を培養することにより膵臓α細胞に分化誘導する工程：
    を含み、
    　前記（ｂ）工程及び前記（ｃ）工程をアスコルビン酸の非存在下で行う、膵臓α細胞への分化誘導方法。
  2. 　前記（ｃ）工程を酸素供給条件下で行う、請求項１に記載の膵臓α細胞への分化誘導方法。
  3. 　前記酸素供給条件が、１ａｔｍ下における３７℃の培養液の飽和溶存酸素濃度を１００％としたときに、培養液中の溶存酸素濃度が２０～５０％となるように制御する条件である、請求項２に記載の膵臓α細胞への分化誘導方法。
  4. 　前記（ａ）工程を、ＲＯＣＫシグナル阻害剤存在下で行う、請求項１～３のいずれか一項に記載の膵臓α細胞への分化誘導方法。
  5. 　前記多能性幹細胞から分化誘導された内胚葉系細胞が、多能性幹細胞を、ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル活性化剤を含む培地で培養した後、ＦＧＦ２及びＢＭＰ４を添加していない培地で培養することにより分化誘導された内胚葉系細胞である、請求項１～４のいずれか一項に記載の膵臓α細胞への分化誘導方法。
  6. 　前記（ｂ）工程が、
    　（ｂ１）前記原始腸管細胞（ＰＧＴ）をプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）活性化剤の存在下において培養することにより後前腸細胞（ＰＦＧ）に分化誘導する工程：
    　（ｂ２）前記後前腸細胞（ＰＦＧ）をレチノイン酸又はそのアナログの存在下において培養することにより膵臓前駆細胞（ＰＰ）に分化誘導する工程：及び
    　（ｂ３）前記膵臓前駆細胞（ＰＰ）を、Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤及びＲＯＣＫシグナル阻害剤の存在下において培養することにより膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）に分化誘導する工程：
    を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の膵臓α細胞への分化誘導方法。
  7. 　前記（ｃ）工程が、前記膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）をインスリン受容体シグナル活性化剤、トランスフェリン及び亜セレン酸の存在下において培養することにより膵臓α細胞に分化誘導する工程を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の膵臓α細胞への分化誘導方法。
  8. 　前記培養を浮遊培養で行う、請求項１～７のいずれか一項に記載の膵臓α細胞への分化誘導方法。
  9. 　前記酸素供給を撹拌培養下で行う、請求項２～８のいずれか一項に記載の膵臓α細胞への分化誘導方法。
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