WO2021197389A1 - Pi4k抑制剂在细胞内蛋白错误折叠相关疾病和溶酶体贮积病中的应用 - Google Patents

Pi4k抑制剂在细胞内蛋白错误折叠相关疾病和溶酶体贮积病中的应用 Download PDF

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Definitions

  • the primary lysosome contains a variety of hydrolytic enzymes, but they have no activity. Only when the lysosome ruptures or other substances enter, the enzyme activity is available. Its hydrolases include proteases, nucleases, lipases, phosphatases, sulfatases, and phospholipases. More than 60 kinds of enzymes are known. These enzymes are acid hydrolases. The optimal pH value for the reaction is about 5. Lysosomes Although the thickness of the membrane is similar to that of the plasma membrane, the composition is different. The main differences are: (1) The membrane has a proton pump, which pumps H+ into the lysosome to reduce its PH value; (2) The membrane protein is highly glycosylated and may have Conducive to prevent degradation of self-membrane protein.
  • Heterolysosome refers to the macromolecular solution or virus, bacteria, etc. that cannot penetrate the plasma membrane.
  • the former is formed through pinocytosis (including receptor-mediated endocytosis).
  • Drinking vesicles (or endosomes) the latter phagocytic vesicles formed by phagocytosis, respectively fused with primary lysosomes (or endolysosomes) to form secondary lysosomes (or lysosomes).
  • the sphingolipid metabolism disorder is Gaucher disease.
  • the R 1 is located in the ortho and/or para position of the -As(O) group.

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Abstract

提供PI4KIIIα特异性抑制剂在用于预防或治疗细胞内蛋白错误折叠相关疾病中的用途，同时提供了PI4KIIIα特异性抑制剂在预防或治疗溶酶体贮积病中的用途。

Description

PI4K抑制剂在细胞内蛋白错误折叠相关疾病和溶酶体贮积病中的应用 技术领域
本发明涉及PI4KIIIα特异性抑制剂在预防或治疗细胞内蛋白错误折叠相关疾病中的用途，同时，本发明涉及PI4KIIIα特异性抑制剂在用于预防或治疗溶酶体贮积病中的用途。
背景技术
溶酶体(lysosomes)是一种单层膜包被的囊状结构的细胞内器官，其体内含许多能分解各种外源和内源大分子的水解酶，包括蛋白质、糖类、脂类等物质的水解酶，所以溶酶体能分解蛋白质、核酸、多糖等生物大分子，也可消化细胞自身的局部细胞质或细胞器。溶酶体分为初级溶酶体和次级溶酶体。
初级溶酶体直径约0.2～0.5um，膜厚7.5nm，内含物均一，无明显颗粒，是高尔基体分泌形成的。初级溶酶体是在高尔基体的顺式(trans)面以出芽的形式形成的，其形成过程如下：内质网上核糖体合成溶酶体蛋白，进入内质网腔进行N-连接的糖基化修饰，溶酶体酶蛋白先带上3个葡萄糖、9个甘露糖和2个N-乙酰葡萄糖胺，后切除三分子葡萄糖和一分子甘露糖，进入高尔基体反式(Cis)面膜囊；N-乙酰葡糖胺磷酸转移酶识别溶酶体水解酶的信号斑；将N-乙酰葡糖胺磷酸转移在1～2个甘露糖残基上；在中间膜囊由N-乙酰葡萄糖苷酶切去N-乙酰葡糖胺形成M6P配体；与顺式膜囊上的受体结合；选择性地包装成初级溶酶体。初级溶酶体含有多种水解酶，但没有活性，只有当溶酶体破裂，或其它物质进入，才有酶活性。其水解酶包括蛋白酶，核酸酶、脂酶、磷酸酶、硫酸酯酶、磷脂酶类，已知60余种，这些酶均属于酸性水解酶，反应的最适PH值为5左右， 溶酶体膜虽然与质膜厚度相近，但成分不同，主要区别是：(1)膜有质子泵，将H+泵入溶酶体，使其PH值降低；(2)膜蛋白高度糖基化，可能有利于防止自身膜蛋白降解。
次级溶酶体都是消化泡，正在进行或完成消化作用的溶酶体，内含水解酶和相应的底物，可分为异噬溶酶体(phagolysosome)和自噬溶酶体(autophago lysosome)，前者消化的物质来自外源，后者消化的物质来自细胞本身的各种组分。
根据溶酶体作用物的来源，将次级溶酶体分为：
(1)异生性溶酶体(heterolysosome)，系指不能透过质膜的大分子溶液或病毒、细菌等，前者通过胞饮作用(其中也包括受体介导的内吞作用)形成的胞饮泡(或胞内体)，后者通过吞噬作用形成的吞噬泡，分别与初级溶酶体(或内溶酶体)融合后形成次级溶酶体(或溶酶体)。
(2)自生性溶酶体(autolysosome)或自噬溶酶体(autophagolysosome)，系指包围了部分被损伤或衰老细胞器(线粒体、内质网碎片等)的自体吞噬体(autophagosome)与初级溶酶体(或内溶酶体)融合后形成的次级溶酶体。其消化的物质是内源性的。内含不能被消化的残留物质的次级溶酶体被称为残留小体。残留物质有的可排出，有的长期贮留在细胞内不被排出。
残体又称后溶酶体(post-lysosome)已失去酶活性，仅留未消化的残渣故名，残体可通过外排作用排出细胞，也可能留在细胞内逐年增多，如肝细胞中的脂褐质。
因此溶酶体是多条细胞代谢通路如自噬作用(autophagy)、内吞作用(endocytosis)、内质网-高尔基体(ER-Golgi)通路等下游的共同交汇点。自噬或自噬溶酶体介导的信号通路被认为是保持胞内蛋白质水平平衡(homeostasis)的主要控制系统之一(Manecka et al.,2017)。自噬-溶酶体信号通路由巨自噬(Macroautophagy)和分子伴侣介导的自噬(Chaperon Mediated  Autophagy，CMA)两种方式实现。巨自噬主要先从自噬小体的形成开始，它们与溶酶体融合，将蛋白引入到溶酶体里降解(Bento et al.,2016)。CMA则是由Chaperons(如Hsc70)，与靶蛋白结合，通过溶酶体受体LAMP2A，将蛋白运输到溶酶体内进行降解(Cuervo and Wong,2014)。
由于遗传变异等因素导致的溶酶体内水解酶缺失、酶活性不足、激活蛋白、转运蛋白或溶酶体蛋白加工校正酶的缺乏而引起溶酶体功能缺陷，造成次级溶酶体内相应底物不能被消化，底物积蓄，代谢障碍，形成溶酶体贮积性疾病(Lysosome Storage Disorders,LSDs)。LSDs包括戈谢病(Gaucher’s disease)，庞贝氏症(Pompe disease)和Niemann-Pick Type C disease(NPC)在内的60多种疾病。到目前为止，对这一类疾病的治疗方案主要以阻碍溶酶体酶底物合成或替代溶酶体酶为主要策略，但是大部分方案的效果有限(Platt et al.,2018)。因此，通过促进自噬和溶酶体分泌，将溶酶体内积累的物质清除出细胞，是一个新的LSDs治疗方向(Samie and Xu,2014)。
此外，在多种蛋白质包涵体积累病中(细胞内蛋白质因错误折叠而在包涵体内聚集引起的疾病)，多个自噬-溶酶体调节因子，如mTOR(Kahan,2011,Decreassac et al.,2013,Magahaes et al.,2016,Tian et al.,2016)、Beclin-1(Spencer et al.,2009)、Spermidin [14](Buttner et al.,2014)、PLK2(Mbefo et al.,2010)和LAMP2(Xilouri et al.,2013)的表达和活性有不同程度的改变。这些包涵体内聚集的蛋白，如与帕金森氏病(PD)和路易体痴呆(LBD)相关的α-synuclein,在自噬-溶酶体通路中存在或被该通路降解(Dehay et al.,2010.J.Neurosci,30:12535-12544)。因此促进自噬和溶酶体分泌，也可以使细胞促进清除这些蛋白，从而减少包涵体积累。
溶酶体内容物中含有许多重要的酶，以及需要排出细胞外的细胞废弃物质。小胶质细胞溶酶体可通过胞吐作用从细胞中释放其内容物，部分溶酶体分泌功能通过溶酶体胞吐 (Lysosome Exocytosis)实现,胞吐作用是一种能量依赖性活动，在胞吐过程中囊泡与质膜融合然后释放其内容物进入细胞外空间。溶酶体的可以与质膜是通过完全融合来释放其内容物，也可以通过“kiss-and-run”进行胞吐。以“kiss-and-run”胞吐时，溶酶体囊泡与质膜的融合是短暂的并且涉及融合孔的快速打开和闭合以允许囊泡中内容物释放。
通过对溶酶体分泌(胞吐)的调节有望为治疗溶酶体贮积病以及包括帕金森氏病和路易体痴呆在内的细胞包涵体积累病提供有效治疗手段。
细胞包涵体疾病多系统萎缩症(Multiple System Atrophy，MSA)病人的脑组织中，自噬小体形成相关基因GABARAPs/GATE-16的水平显著降低，说明MSA病人中自噬小体蛋白水平受抑制从而导致自噬系统成熟的过程受破坏(Tanji et al.,2013)。另一工作 [22](Miki et al,2016)显示MSA中α-synuclein结合蛋白的降解受与之结合的autophagy/beclin1 regulator 1(AMBRA1)蛋白调控，MSA神经元中AMBRA1过磷酸化水平明显增高。小鼠皮质细胞上的体外试验显示自噬抑制剂可以沉默AMBRA1的活性，从而导致α-synuclein聚集。
细胞内15-18nm微管蛋白等蛋白折叠沉积在包涵体肌炎(inclusion body myositis，IBM)中非常常见。
在一些家族性额颞叶变性可能与progranulin(PGRN)基因突变有关。Progranulin是一种生长因子，基因突变可能导致生长因子减少，妨碍了神经的生长和修复。最近发现TAR-DNA结合蛋白43(TDP-43，一种调节转录的核蛋白)异常磷酸化与额颞叶变性伴运动神经元病密切相关。
多聚谷氨酰胺疾病(PolyQ疾病)共包含9中疾病(亨廷顿氏疾病,Hungtington Disease,HD；X-关联的脊延髓肌萎缩症(SBMA)，dentatorubralpalludoluysian atrophy(DRPLA)，以及6种脊髓小脑萎缩症((SCA 1,2,3,6,7&17)。虽然每种疾病的相关蛋白不一样，但是它们都和自体吞噬的流动性的失活有 关 [26](Cortes et al,2015)，自噬体标记蛋白P62可以缓解SBMA小鼠模型中行为和运动功能的缺陷 [27](Doi et al,2013)。DRPLA果蝇模型呈现出和溶酶体积储病类似的表型，在聚合物中有lipofuscin和P62，预示着由自噬作用损伤引起的溶酶体消化功能失活 [28](Settembre et al,2008)。
亨廷顿氏疾病中，Htt基因的突变导致非正常多聚谷氨酰胺(CAG编码)长度的翻译和积累。
95％的肌萎缩性侧索硬化症(ALS)病人的运动神经元中含有以TDP-43蛋白为主的包涵体。其它蛋白如FUS和SOD1也经常在ALS病人中一起共聚集
朊病毒疾病(Prion Disease)是由错误折叠的阮病毒蛋白(PrP)引起的疾病(Cai et al,2016)。正常PrP(PrP C)存在于细胞膜上，它也可以转化为具有传染性的形态(PrP Sc)。
磷脂酰肌醇(PI)及其代谢酶在溶酶体形成和运输中具有重要作用。已发现PI4KIIIβ可控制溶酶体的释放和溶酶体物质的分选 [38,39](Sridhar S,Patel B,Aphkhazava D,et al.The lipid kinase PI4KIIIβ preserves lysosomal identity[J].The EMBO Journal,2012,32(3):324-339；De Barry J,Janoshazi,Dupont J L,et al.Functional Implication of Neuronal Calcium Sensor-1 and Phosphoinositol 4-Kinase-beta Interaction in Regulated Exocytosis of PC12 Cells[J].Journal of Biological Chemistry,2006,281(26):18098-18111)。高尔基体中的PI4KIIIβ和PI4KIIα都参与调节或促进溶酶体酶和蛋白质向溶酶体的递送。组织学上，PI4KIIα基因缺失小鼠显示脂褐质沉积物，表明下调PI4KIIα会抑制内溶酶体运输，导致脊髓中浦肯野(Purkinje)细胞减少和轴突缺陷。抑制PI4KIIIβ和PI4KIIα导致溶酶体蛋白的积累和戈谢病(一种溶酶体贮积症)(Jovic M,Kean M J,Szentpetery Z,et al.Two phosphatidylinositol 4-kinases control lysosomal delivery of the Gaucher disease enzyme-glucocerebrosidase[J].Molecular Biology of the Cell,2012,23(8):1533-1545)。然而， PI4KIIIα在溶酶体转运中的作用还未被报道。
PI4KIIIα与脚手架蛋白TTC7A或者TTC7B和定位在细胞膜的上的Efr3a或者Efr3b，以及细胞浆蛋白FAM126A或者FAM126B,或者它们的同源蛋白在细胞膜上形成蛋白复合体，直接调控细胞膜上的磷脂酰肌-4磷酸(PI4P)的水平,并且PI4KIIIα的表达或者细胞膜上的定位依赖Efr3a/Efr3b、TTC7A/TTC7B和FAM126A/FAM126B(Baird D,Stefan C,et al.,J Cell Biol,2008,183:1061-1074；Nakatsu F,Baskin JM,et al.,J Cell Biol,2012,199:1003-1016；Baskin JM,Wu X et al.,Nat Cell Biol,2016,18:132-138；Zhang X,Jiang LX,et al.,J Neurosci,2017,37(16):4928-4941；Lees JA,Zhang Y,et al.,PNAS,2017,114:13720-13725)。
发明内容
在一方面中，本发明提供了PI4KIIIα特异性抑制剂在制备用于预防或治疗细胞内蛋白错误折叠相关疾病中的用途。
在另一方面中，本发明提供了PI4KIIIα特异性抑制剂在制备用于预防或治疗溶酶体贮积病中的用途。
在一些实施方案中，所述PI4KIIIα特异性抑制剂是抗体、小分子化合物、RNAi分子或者反义核酸。
在一些实施方案中，所述抗体是单克隆抗体或者多克隆抗体。
在一些实施方案中，所述抗体是嵌合抗体、人源化抗体或者全人源抗体。
在一些实施方案中，所述RNAi分子是小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)或微小RNA(miRNA)。
在一些实施方案中，所述RNAi分子的长度为18-100碱基。
在一些实施方案中，所述RNAi分子被修饰以增强其稳定性。
在一些实施方案中，所述PI4KIIIα特异性抑制剂是小分子 化合物。
在一些实施方案中，所述小分子化合物是氧化苯砷或其衍生物、G1及其类似物、A1及其类似物。
在一些实施方案中，所述氧化苯砷及其衍生物具有式(I)所示的结构或者其药学上可接受的盐，
Figure PCTCN2021084612-appb-000001
其中，R 1各自独立的选自(a)H、卤素、硝基、氰基、羟基、氨基、氨基甲酰基、C 1-6烷基砜基、C 1-6烷基、C 1-6环烷基、C 2-6炔基、C 2-6烯基、C 1-6烷氧基、C 1-6卤代烷基、C 1-6亚烷基-NH 2、C 1-6亚烷基-NH-C(O)H、-As(O)、-N＝NH、N-(C 1-6烷基)氨基、N,N-(C 1-6烷基) 2氨基、-NH-C(O)H、-NH-S(O) 2H、-C(O)OH、-OC(O)H、-SH、-S(O) 2H、-S(O) 2-NH 2或杂环基，并且可选的被R 2或R 3取代，其中R 2和R 3各自独立的选自氨基、C 1-6烷基、C 1-6烷氧基、C 1-6卤代烷基、N-(C 1-6烷基)氨基、N-(6-12元芳香基)氨基、N,N-(C 1-6烷基) 2氨基、C 3-6环烷基、6-12元的芳香基或3-12元的杂环基，并且可选的被一个或多个卤素、硝基、氰基、羟基、氨基、氨基甲酰基、-NH-C(O)-R 5、-C(O)OR 4、6-12元的芳香基、C 1-6烷基、C 2-6炔基、C 2-6烯基、C 1-6烷氧基、C 1-6卤代烷基、3-6元的杂环基、C 3-6环烷基或Bn-O-取代，并且R 4是C 1-6的烷基，并且可选的被一个或多个卤素、硝基、氰基、羟基、氨基、氨基甲酰基、6-12元的芳香基、C 1-6烷基、C 2-6炔基、C 2-6烯基、C 1-6烷氧基、C 1-6卤代烷基、3-6元的杂环基、C 3-6环烷基或Bn-O-取代，R 5选自H、C 1-6烷基、C 2-6炔基、C 2-6烯基、C 1-6烷氧基或C 1-6卤代烷基，和/或
(b)两个相邻碳原子上的R 1形成5-12元的环烷基、芳香基或杂环基，并且可选的被一个或多个卤素、硝基、氰基、羟基、 氨基、氨基甲酰基、6-12元的芳香基、C 1-6烷基、C 2-6炔基、C 2- 6烯基、C 1-6烷氧基、C 1-6卤代烷基、3-6元的杂环基、C 3-6环烷基或Bn-O-取代，
其中，n为0-5的整数。
在一些实施方案中，n为0-2的整数，所述R 1各自独立的选自H、卤素、硝基、氰基、羟基、氨基、氨基甲酰基、C 1-6烷基砜基、C 1-6烷基、C 1-6环烷基、C 1-6烷氧基、C 1-6卤代烷基、-As(O)、N-(C 1-6烷基)氨基、N,N-(C 1-6烷基) 2氨基、-NH-C(O)H或-NH-S(O) 2H，并且可选的被所述R 2或R 3取代。
在一些实施方案中，n为0-2的整数，所述R 1各自独立的选自H、卤素、硝基、氰基、羟基、氨基、C 1-6烷基砜基、C 1-6烷基、C 1-6环烷基、C 1-6烷氧基、C 1-6卤代烷基、-As(O)、-NH-C(O)H或-NH-S(O) 2H，并且可选的被所述R 2或R 3取代。
在一些实施方案中，n为1或2，所述R 1各自独立的选自H、卤素、氨基、C 1-6烷基砜基、C 1-6环烷基、C 1-6烷氧基、C 1-6卤代烷基、-NH-C(O)R 2或-NH-S(O) 2R 3，其中R 2为C 1-6烷基，可选的被一个6-12元芳香基取代，R 3为6-12元芳香基，可选的被一个卤素、C 1-6烷氧基或C 1-6卤代烷基取代。
在一些实施方案中，所述R 1位于-As(O)基团的邻位和/或者对位。
在一些实施方案中，n是0。
在一些实施方案中，所述小分子化合物选自由以下化合物组成的组：
Figure PCTCN2021084612-appb-000002
Figure PCTCN2021084612-appb-000003
Figure PCTCN2021084612-appb-000004
Figure PCTCN2021084612-appb-000005
在一些实施方案中，所述客体是人或者哺乳动物。
在一些实施方案中，所述细胞内蛋白错误折叠相关疾病为帕金森氏病、路易体痴呆症、多系统萎缩症、包涵体肌炎症、额颞痴呆、亨廷顿疾病、多聚谷氨酰胺病、肌萎缩性侧索硬化症、或朊病毒疾病。
在一些实施方案中，所述溶酶体贮积病为鞘脂类代谢障碍、黏多糖病、糖原贮存病、糖蛋白贮积病、脂类储存疾病、翻译后修饰缺陷症、内在膜蛋白缺失失调症、神经元蜡样质脂褐质沉积病、或溶酶体相关细胞器紊乱症。
在一些实施方案中，所述鞘脂类代谢障碍为戈谢病。
在一些实施方案中，其进一步包括向需要其的客体施用第二试剂。
在一些实施方案中，其中所述第二试剂是用于治疗细胞内蛋白错误折叠相关疾病的试剂或者用于治疗溶酶体贮积病的试剂。
在一些实施方案中，所述PI4KIIIα特异性抑制剂在所述第二试剂之前、之后或同时施用。
在又一方面中，本发明提供了一种筛选用于预防或治疗细胞内蛋白错误折叠相关疾病的药物的方法，包括将备选药物与PI4KIIIα蛋白或者核酸或者PI4KIIIα接触，并检测备选药物是否能够抑制PI4KIIIα的形成或者活性。
在再一方面中，本发明提供了一种筛选用于预防或治疗溶酶体贮积病的药物的方法，包括将备选药物与PI4KIIIα蛋白或者核酸或者PI4KIIIα接触，并检测备选药物是否能够抑制PI4KIIIα的形成或者活性。
本发明发现，与PI4KIIα或PI4KIIIβ基因缺失所产生的结果相反，抑制PI4KIIIα促进溶酶体分泌，减少细胞内和溶酶体内多种分子的积累或贮积。PI4KIIIα抑制剂如小分子化合物PAO等，可以穿过血脑屏障，通过抑制PI4KIIIα活性，促进溶酶体分泌，减少细胞内和溶酶体内多种分子的积累或贮积，弥补现存疗法的缺陷。
附图说明
图1示出抑制PI4KIIIα诱导小胶质细胞溶酶体胞吐。(A)对照组，孵育装载溶液，随机选27个点，图中比例尺22μm；(B)100nM PAO处理组，随机取21个点，图中比例尺22μm；(C)PI4KIIIα杂合敲除组，随机取22个荧光点，图中比例尺16μm。
图2示出溴酚蓝(BPB)因“kiss-and-run”胞吐进入小胶质细胞的溶酶体中使得溶酶体的荧光减弱。图片部分分别为0、500秒的荧光图，折线图为溶酶体荧光强度变化图。(A)对照组，WT细胞0秒时孵育BPB溶液，随机取20个点，比例尺16μm；(B)PAO处理组，WT细胞0秒时孵育BPB和PAO溶液，随机取22个点，比例尺22μm；(C)PI4KIIIα杂合敲除细胞组，0秒时孵育BPB溶液，随机取22个点，比例尺22μm。
图3示出因BPB离开溶酶体后使得小胶质细胞溶酶体荧光恢复/增高。图片部分分别为0、200、500秒的荧光图，折线图为溶酶体荧光强度变化图，在用药的前60分钟加入BPB溶液。(A)对照组，WT细胞0秒时孵育装载溶液，随机取22个点；(B)PAO处理组，WT细胞0秒时孵育PAO溶液，随机取28个点；(C)PI4KIIIα杂合敲除细胞组，0秒时孵育BPB溶液，随机取26个点。图中比例尺均为22μm。
图4示出抑制PI4KIIIα酶活性促进小胶质细胞溶酶体胞外分泌ATP。(A)ATP与溶酶体共定位。左图1μM Quinacrine标记的WT小胶质细胞胞内的ATP分子，中图LysoTracker标记的溶酶体，右图合并通道后的共定位荧光图。图中比例尺为16μm。(B)用100nM PAO处理WT细胞组和PI4K+/-的细胞组胞外ATP浓度。
图5示出抑制PI4KIIIα诱导的神经元细胞溶酶体胞吐。拍摄0秒和500秒时海马神经元中溶酶体的荧光图片。(A)对照组；(B)100nM PAO处理组。图中比例尺均为16μm。
图6示出PAO抑制α-synuclein过表达导致的细胞死亡或凋 亡。PAO处理12小时，加入MTT孵育4小时，检测吸光度值。(A)图片显示细胞存活情况；(B)细胞存活率。
图7示出PAO和PI-07促进α-synuclein分泌。
图8示出PAO使细胞内α-synuclein蛋白水平下调。(A)ELISA检测胞内α-synuclein蛋白水平。n＝6，One-way ANOVA，**p<0.001vs.α-syn-OE。(B)Western blot检测胞内α-synuclein蛋白水平。
图9示出PAO促进HTT蛋白和SOD1蛋白分泌。(A)ELISA检测HTT蛋白分泌；(B)ELISA检测SOD1蛋白检测。
图10示出PAO减少CBE诱导的SH-SY5Y细胞损伤作用。MTT实验检测细胞存活率。(A)不同浓度CBE处理SH-SY5Y细胞；(B)100μM CBE处理后，给予不同浓度的PAO处理24小时。n＝5,One-way ANOVA，**p<0.001，***p<0.0001，vs.α-syn-OE。
图11示出PAO缓解CBE诱导的溶酶体聚集和葡萄糖神经酰胺(Glucosylceramide,GlcCer)在细胞内积累。(A)SH-SY5Y细胞与lysosome tracker共孵育30分钟，再吸去上清更换为含有不同浓度的PAO并孵育10分钟，通过免疫荧光方法观察Lyso-tracker；(B)统计分析各组Lyso-tracker荧光强度；标尺:50μm；n＝5；One-way ANOVA分析，与对照组比较##p<0.001，与100μM CBE处理组比较**p<0.001，***p<0.0001；(C)各组细胞裂解液中GlcCer浓度经LC/MS测定值统计分析。
图12示出PI4KIIIa抑制剂A1和G1缓解CBE诱导的溶酶体聚集。100μM CBE处理SH-SY5Y 72小时后加入溶酶体标记(Lysosome tracker,Lyso-tracker)标记溶酶体，并在30分钟后给予50nM或75nM A1或G1处理5分钟10分钟，4％多聚甲醛(PFA)固定后进行观察。Scale bar：50μm。
图13示出敲减PI4Ka促进溶酶体胞吐或减少溶酶体贮积。图13A示出敲减Western blot检测不同shRNA干扰慢病毒载体(sh-ctrl,sh1-PI4Ka,sh2-PI4Ka,sh3-PI4Ka)处理SH-SY5Y细胞48小时PI4KⅢα蛋白水平；图13B对Western blot检测结果统计分析；图 13C示出免疫荧光方法检测shRNA干扰慢病毒载体处理后Lyso-tracker荧光强度，并统计分析(图13D)。标尺:50μm；n＝5；数据以mean±SEM表示，One-way ANOVA分析，***p<0.0001。
图14示出PAO促进LC3B和p62表达，Baf-A1阻断PAO在细胞模型中的保护作用，其中图34A示出蛋白质免疫印迹实验检测LC3B和p62蛋白；图34B，C示出使用Image J软件统计分析LC3B和p62蛋白信号强度统计分析；图34D示出免疫荧光检测LC3B和p62，红色：p62，绿色：LC3B，标尺：50μm；图34E示出MTT检测各组细胞活力，并统计分析。n＝5,数据以mean±SEM表示，One-way ANOVA分析，与对照组比较###p<0.0001,与100μM CBE处理组比较**p<0.001。
图15敲减PI4Ka激活CBE处理和无CBE处理细胞的自噬通路。PAO促进LC3B和p62表达，Baf-A1阻断PAO在细胞模型中的保护作用。(A)蛋白质免疫印迹实验检测LC3B和p62蛋白；(B，C)使用Image J软件统计分析LC3B和p62蛋白信号强度统计分析；(D)免疫荧光检测LC3B和p62，红色：p62，绿色：LC3B，标尺：50μm；(E)MTT检测各组细胞活力，并统计分析。n＝5,数据以mean±SEM表示，One-way ANOVA分析，与对照组比较###p<0.0001,与100μM CBE处理组比较**p<0.001。
图16示出PAO抑制U18666A导致的胆固醇贮积。标尺：50μm。
具体实施方式
以下根据实施例，并且结合附图，详细描述本发明。从下文的详细描述中，本发明的上述方面和本发明的其他方面将是明显的。本发明的范围不局限于下列实施例。
PI4KIIIα特异性抑制剂
本文中所用的术语“PI4KIIIα特异性抑制剂”是指能够特异性降低、减少、消除PI4KIIIα基因的转录或翻译，和/或PI4KIIIα 蛋白活性的各类物质。在一些实施方案中，所述PI4KIIIα特异性抑制剂能够将PI4KIIIα的活性降低至少5％、10％、20％、40％、50％、80％、90％、95％或更多。在本文中，当“活性”与增加或降低一同使用的时候，是指检测到的功能活性，其可以表现为含量变化、或者含量不变但是功能活性变化。
本文中，PI4KIIIα的活性是指PI4KIIIα蛋白将磷酸肌醇(PI)在特定位置磷酸化(例如，转化为4-磷酸磷脂酰肌醇(PI4P))的活性。所述PI4KIIIα特异性抑制剂与PI4KIIIα蛋白的结合常数为其与其他非特异性结合蛋白的结合常数的至少2倍以上。在一些实施方案中，PI4KIIIα特异性抑制剂能够在复杂混合物中优选识别PI4KIIIα蛋白，包括与其他PI4K亚型蛋白的混合物。
在一些实施方案中，相比于其他PI4K蛋白的亚型(例如，PI4K蛋白，包括PI4KIIα或PI4KIIβ)，所述PI4KIIIα特异性抑制剂对PI4KIII的抑制强至少1倍、2倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、50倍、100倍、200倍、500倍或10000倍。例如，在一些实施方案中，PI4KIIIα特异性抑制剂基本上不抑制PI4KII(例如，PI4KIIα或PI4KIIβ)，例如，其IC 50大于或等于10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、80μM、100μM、150μM、200μM或500μM。
在一些实施方案中，相比于对PI4KIII的其他亚型(例如PI4KIIIβ)，PI4KIIIα特异性抑制剂对PI4KIIIα的抑制强至少1倍、2倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、50倍、100倍、200倍、500倍或10000倍。
在一些实施方案中，PI4KIIIα特异性抑制剂对PI4KIIIα的IC 50小于或等于100μM、80μM、50μM、30μM、20μM、10μM、5μM、3μM、2μM、1μM、0.5μM、0.2μM、0.1μM、0.05μM、0.02μM、0.01μM、0.005μM、0.002μM或0.001μM。在一些实施方案中，所述PI4KIIIα特异性抑制剂是抗体、小分子化合物、RNAi分子或者反义核酸。
在一些实施方案中，所述PI4KIIIα特异性抑制剂是抗体。
本文所用的术语“抗体”包含可结合某特定抗原的任意免疫球蛋白、单克隆抗体、多克隆抗体、多价抗体、双价抗体、单价抗体或抗体。本文中的“抗体”一词旨在广泛地涵盖常规的四链抗体以及不具有四条链的较不常规的抗体(例如，天然缺乏轻链的抗体)。
一个常规的完整抗体是异四聚体，其包含两条重(H)链和两条轻(L)链。哺乳动物的重链可分为α、δ、ε、γ和μ，每条重链由一可变区(VH)和第一、第二、第三恒定区(分别为CH1、CH2、CH3)组成；哺乳动物的轻链可分为λ或κ，每条轻链由一可变区(VL)和一恒定区组成。常规抗体呈“Y”型，“Y”型结构的颈部由两条重链的第二和第三恒定区组成，其通过二硫键结合。“Y”型结构的每条臂包含其中一条重链的可变区和第一恒定区，其与一条轻链的可变区和恒定区结合。轻链和重链的可变区决定抗原的结合。每条链的可变区均含有三个高变区，称互补决定区(CDR)(轻链的CDR包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，重链的CDR包含HCDR1、HCDR2、HCDR3)。其中，三个CDR由被称为框架区(FR)的侧面连续部分间隔开，框架区比CDR更加高度保守并形成一个支架支撑超变环。重链和轻链的恒定区与抗原结合无关，但具有多种效应功能。
在本发明的一些实施方案中，所述抗体是全长抗体或抗原结合片段。
本文中使用的术语“抗原结合片段”指由含有一个或多个CDR的抗体部分但不具有完整抗体结构的抗体片段所形成的一种抗体片段。抗原结合片段的例子包括但不限于Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、单链抗体分子(scFv)、scFv二聚体、骆驼化单域抗体(camelized single domain antibody)和纳米抗体。抗原结合片段可以与母体抗体结合相同的抗原。
抗体的“Fab”片段是指由一条轻链(包括可变区和恒定区)和一条重链的可变区和第一恒定区经二硫键结合起来的那部分抗体。
“Fab'”片段是指包含了部分铰链区的Fab片段。
“F(ab')2”片段是指Fab'的二聚体。
抗体的“Fv”片段由一条轻链的可变区和一条重链的可变区组成。
“单链抗体分子”或“scFv”是指由轻链可变区与重链可变区直接相连或通过一个肽链连接而成的工程抗体。详细介绍可以参见例如Huston JS等，Proc Natl Acad Sci USA、85:5879(1988)。
“scFv二聚体”是指由两个scFv形成的聚合体。
“骆驼化单域抗体(Camelized single domain antibody)”(又称为“重链抗体”或“HCAb(Heavy-chain-only antibodies，HCAb)”)是指含有两个重链可变区而不含有轻链的抗体。重链抗体最初从驼科(骆驼、单峰驼和美洲驼)衍生得到。虽然缺失轻链，但是骆驼化抗体具有抗原结合的全部功能。
“纳米抗体”是由一个来自重链抗体的重链可变区和两个恒定区CH2和CH3组成。
在一些实施方案中，所述抗体是单克隆抗体或者多克隆抗体。
在一些实施方案中，所述抗体是鼠源抗体、兔源抗体、嵌合抗体、人源化抗体或者全人源抗体。
本文中使用的术语“全人源”当用于抗体或抗原结合片段时，是指所述抗体或抗原结合片段的氨基酸序列对应于由人或人免疫细胞生产的、或从例如利用人源抗体库的转基因非人动物等非人来源衍生的抗体的氨基酸序列，或者其他编码人源抗体的序列。
本文中使用的术语“人源化”当用于抗体或抗原结合片段时，是指包括来源于非人动物的CDR、来源于人的FR区，以及来源于人的恒定区(当适用时)的抗体或抗原结合片段。由于人源化的抗体或抗原结合片段具有更低的免疫原性，其在某些实施方式中可用作人的治疗剂。在某些实施方式中，所述非人动物 是哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、豚鼠或仓鼠)。在某些实施方式中，所述人源化抗体或抗原结合片段除了CDR序列是非人源的以外，基本上全部由人源序列组成。
本文中使用的术语“嵌合”当用于抗体或抗原结合片段时，是指具有来源于一种物种的重链和/或轻链的一部分，而所述重链和/或轻链其余部分来源于不同物种的抗体或抗原结合片段。在一些实施方式中，嵌合抗体可以包括来源于人的恒定区和来源于非人动物(例如小鼠或兔)的可变区。
在一些实施方式中，本文所述抗体是单特异性抗体、双特异性抗体或多特异抗体。
在一些实施方式中，本文所述抗体可以进一步地被标记。
在一些实施方案中，所述PI4KIIIα特异性抑制剂是RNAi分子。
本文所用的术语“RNAi分子”是指RNA或其类似物，其具有与靶RNA充分的序列互补性，以指导RNA干扰。在一些实施方式中，还包括可用于生成RNA的DNA。RNA干扰(RNAi)是指序列特异或选择的过程，通过该过程下调了靶分子(例如，靶基因、蛋白或RNA)。
在一些实施方案中，所述RNAi分子能够降低PI4KIIIα的表达，例如，敲减PI4KA基因。
在一些实施方案中，所述RNAi分子具有[5’-GCTGATCTCTACTACACTTCC-3’](SEQ ID NO：1)。
在一些实施方案中，所述RNAi分子具有[5’-GGTTATCACCGGAAATCAATA-3’](SEQ ID NO：2)。
在一些实施方案中，所述RNAi分子具有[5’-GCAACATTATGCTGGACAAGA-3’](SEQ ID NO：3)。
在一些实施方案中，所述RNAi分子的长度为18-100碱基。
在一些实施方案中，所述RNAi分子被修饰以增强其稳定性。
在一些实施方案中，所述RNAi分子是小干扰RNA (siRNA)、短发夹RNA(shRNA)或微小RNA(miRNA)。
本文所用的术语“小干扰RNA(siRNA)”是指一种RNA分子，优选双链分子，具有约10～50个核苷酸的长度，优选约15～25个核苷酸的长度，更优选约17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸的长度，所述链任选地具有包括例如1、2或3个突出的核苷酸(或核苷酸类似物)的突出末端，其能够指导或介导RNA的降解。
本文所用的术语“短发夹RNA(shRNA)”是指具有茎环结构的RNA分子，其包括互补序列的第一区域和第二区域，互补的程度以及区域的方向足以使碱基对出现在区域之间，第一区域和第二区域被环区域连接，环由环区域中的核苷酸(或核苷酸类似物)之间缺少碱基配对而产生。
本文所用的术语“微小RNA(microRNA或miRNA)”是一种短的、天然存在的非编码的单链RNA分子，长度约为16-26个核苷酸(nt)(例如约16-29nt，19-22nt，20-25nt，或21-23nt)，通常在体内参与调控基因表达。在真核细胞中，miRNA基因通过DNA转录酶II(DNA transcriptase II)转录为“初产物”(pri-miRNA)，pri-miRNA很快被一种核糖核酸酶III(Drosha)加工为miRNA“前体”(pre-miRNA)，pre-miRNA从细胞核转运到细胞质中，然后经另一种核糖核酸酶III(Dicer)识别剪切为成熟的miRNA。成熟的miRNA分子与一种或多种mRNA部分互补，并且调控蛋白的表达。已知的miRNA的序列可以通过公开的数据库获得，例如miRBase数据库(www.mirbase.org)，其中提供了包括miRNA序列信息、功能注释、以及预测的基因靶标等信息。在本发明中，miRNA还包括由人工合成的质粒在细胞中表达的具有类似天然miRNA的结构和功能的RNA分子，能像天然miRNA靶向对应的mRNA，阻碍其翻译成蛋白质。
在一些实施方案中，所述PI4KIIIα特异性抑制剂是反义核酸。
本文所用的术语“反义核酸”包括与靶序列完全互补的核 苷酸以及具有一个或多个核苷酸错配的那些核苷酸，只要该反义核酸能与所述靶序列特异性杂交即可。例如，本文的反义核酸包括在至少15个连续核苷酸的长度上具有至少70％或更高，优选80％或更高，更优选90％或更高，甚至更优选95％或更高同源性的多核苷酸。由于形成杂交体，靶基因转录和/或靶mRNA翻译减少或被阻断。。
在一些实施方案中，所述PI4KIIIα抑制剂是小分子化合物。
本文所用的术语“小分子化合物”是指一种分子量小于3000、2500、2000、1500、1000或500道尔顿的有机化合物，该有机化合物可以是天然的或者是化学合成的。
在一些实施方案中，所述氧化苯砷及其衍生物具有式(I)所示的结构或者其药学上可接受的盐，
Figure PCTCN2021084612-appb-000006
其中，R 1各自独立的选自(a)H、卤素、硝基、氰基、羟基、氨基、氨基甲酰基、C 1-6烷基砜基、C 1-6烷基、C 1-6环烷基、C 2-6炔基、C 2-6烯基、C 1-6烷氧基、C 1-6卤代烷基、C 1-6亚烷基-NH 2、C 1-6亚烷基-NH-C(O)H、-As(O)、-N＝NH、N-(C 1-6烷基)氨基、N,N-(C 1-6烷基) 2氨基、-NH-C(O)H、-NH-S(O) 2H、-C(O)OH、-OC(O)H、-SH、-S(O) 2H、-S(O) 2-NH 2或杂环基，并且可选的被R 2或R 3取代，其中R 2和R 3各自独立的选自氨基、C 1-6烷基、C 1-6烷氧基、C 1-6卤代烷基、N-(C 1-6烷基)氨基、N-(6-12元芳香基)氨基、N,N-(C 1-6烷基) 2氨基、C 3-6环烷基、6-12元的芳香基或3-12元的杂环基，并且可选的被一个或多个卤素、硝基、氰基、羟基、氨基、氨基甲酰基、-NH-C(O)-R 5、-C(O)OR 4、6-12元的芳香基、C 1-6烷基、C 2-6炔基、C 2-6烯基、C 1-6烷氧基、C 1-6卤代烷基、3-6元的杂环基、C 3-6环烷基或Bn-O-取代，并且R 4 是C 1-6的烷基，并且可选的被一个或多个卤素、硝基、氰基、羟基、氨基、氨基甲酰基、6-12元的芳香基、C 1-6烷基、C 2-6炔基、C 2-6烯基、C 1-6烷氧基、C 1-6卤代烷基、3-6元的杂环基、C 3-6环烷基或Bn-O-取代，R 5选自H、C 1-6烷基、C 2-6炔基、C 2-6烯基、C 1-6烷氧基或C 1-6卤代烷基，和/或
(b)两个相邻碳原子上的R 1形成5-12元的环烷基、芳香基或杂环基，并且可选的被一个或多个卤素、硝基、氰基、羟基、氨基、氨基甲酰基、6-12元的芳香基、C 1-6烷基、C 2-6炔基、C 2- 6烯基、C 1-6烷氧基、C 1-6卤代烷基、3-6元的杂环基、C 3-6环烷基或Bn-O-取代，
其中，n为0-5的整数。
在一些实施方案中，n为0-2的整数，所述R 1各自独立的选自H、卤素、硝基、氰基、羟基、氨基、氨基甲酰基、C 1-6烷基砜基、C 1-6烷基、C 1-6环烷基、C 1-6烷氧基、C 1-6卤代烷基、-As(O)、N-(C 1-6烷基)氨基、N,N-(C 1-6烷基) 2氨基、-NH-C(O)H或-NH-S(O) 2H，并且可选的被所述R 2或R 3取代。
在一些实施方案中，n为0-2的整数，所述R 1各自独立的选自H、卤素、硝基、氰基、羟基、氨基、C 1-6烷基砜基、C 1-6烷基、C 1-6环烷基、C 1-6烷氧基、C 1-6卤代烷基、-As(O)、-NH-C(O)H或-NH-S(O) 2H，并且可选的被所述R 2或R 3取代。
在一些实施方案中，n为1或2，所述R 1各自独立的选自H、卤素、氨基、C 1-6烷基砜基、C 1-6环烷基、C 1-6烷氧基、C 1-6卤代烷基、-NH-C(O)R 2或-NH-S(O) 2R 3，其中R 2为C 1-6烷基，可选的被一个6-12元芳香基取代，R 3为6-12元芳香基，可选的被一个卤素、C 1-6烷氧基或C 1-6卤代烷基取代。
在一些实施方案中，所述R 1位于-As(O)基团的邻位和/或者对位。
在一些实施方案中，n是0。
本文中所用的术语“取代”，当指化学基团时，指所述化学基团的一个或多个氢原子被去除并且被取代基取代。
本文中所用的术语“取代基”具有本领域公知的通常含义，指共价连接至或者在适合的情况下稠合至母体基团的化学部分。
本文中使用的术语“C n-C m”表示碳原子数的范围，其中n和m是整数并且碳原子数的范围包括端点(即n和m)和其间的各整数点。例如，C 1-C 6表示1至6个碳原子的范围，包括1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子、4个碳原子、5个碳原子和6个碳原子。
本文中使用的术语“烷基”，无论是作为其他术语的一部分还是单独使用，指饱和的烃基基团，其可以是直链的或支链的。术语“C n-C m烷基”指具有n至m个碳原子的烷基。在某些实施方案中，烷基基团含有1至12、1至8、1至6、1至4、1至3或1至2个碳原子。烷基基团的示例包括但不限于化学基团如甲基、乙基、n-丙基、异丙基、n-丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、2-甲基-1-丁基、n-戊基、3-戊基、n-己基、1,2,2-三甲基丙基等。
本文中使用的术语“烯基”，无论是作为其他术语的一部分还是单独使用，指不饱和的烃基基团，其可以是直链的或支链的，具有至少一个碳-碳双键。在某些实施方案中，烯基基团含有2至12、2至10、2至8、2至6、2至5、2至4或2至3个碳原子。在某些实施方案中，烯基基团还能有1至6、1至5、1至4、1至3、1至2或1个碳碳双键。烯基基团的示例包括但不限于化学基团如乙烯基、n-丙烯基、异丙烯基、n-丁烯基、仲丁烯基等。
本文中使用的术语“炔基”，无论是作为其他术语的一部分还是单独使用，指不饱和的炔基基团，其可以是直链的或支链的，具有至少一个碳-碳三键。在某些实施方案中，炔基基团含有2至12、2至10、2至8、2至6、2至5、2至4或2至3个碳原子。在某些实施方案中，炔基基团还能有1至6、1至5、1至4、1至3、1至2或1个碳碳三键。炔基基团的示例包括但不限于化学基团如乙炔基、丙炔基、丁炔基等。
本文中使用的术语“环烷基”指至少由3个原子组成的环系 烷基。术语“n-m元环烷基”指具有n至m个形成环的成员的环烷基。此外，该环还可以具有一个或多个双键，但不具有完全共轭的系统。在某些实施方案中，环烷基具有3至8、3至6或4至6个形成环的碳原子。环烷基的示例包括但不限于环丙烷、环丁烷、环戊基等。
本文中使用的术语“杂环基”指在环系中的至少一个原子是杂原子而其余环原子是碳原子的环基。术语“n-m元杂环基”指具有n至m个形成环的成员的杂环基。本文中使用的术语“杂环基”包括杂芳基和杂环烷基。此外，该环还可以具有一个或多个双键。在某些实施方案中，杂环基是饱和的杂环烷基。杂原子的示例包括但不限于氧、硫、氮、磷等。
本文中使用的术语“杂环烷基”指在环系中的至少一个原子是杂原子而其余环原子是碳原子的环烷基。术语“n-m元杂环烷基”指具有n至m个形成环的成员的杂环烷基。此外，该环还可以具有一个或多个双键，但不具有完全共轭的系统。在某些实施方案中，杂环烷基是饱和的杂环烷基。杂原子的示例包括但不限于氧、硫、氮、磷等。在某些实施方案中，杂环烷基具有3至8、3至6或4至6个形成环的碳原子。杂环烷基的示例包括但不限于氮杂环丁烷、氮丙啶、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉、高哌嗪等。
本文中使用的术语“芳基”或“芳香基”，无论是作为其他术语的一部分还是单独使用，指在形成环的碳原子之间具有交替的双键和单键的单-或多-碳环环系基团。术语“C n-C m芳基”指具有n至m个形成环的碳原子的芳基。在某些实施方案中，芳基环系在一个或多个环中具有6至12、6至10或6至8个碳原子。在某些实施方案中，芳基环系具有稠合在一起的2个或多个环。芳基基团的示例包括但不限于化学基团如苯基、萘基、四氢萘基、茚满基、茚基等。
本文中使用的术语“杂芳基”指其中在芳环中的至少一个环原子是杂原子并且其余的环原子是碳原子的芳基基团。术语 “n-m元杂芳基”指具有n至m个形成环的成员的杂芳基。杂原子的示例包括但不限于氧、硫、氮、磷等。在某些实施方案中，杂芳基可以具有5至10、5至8或5至6个形成环的成员。在某些实施方案中，杂芳基是5元或6元杂芳基。杂芳基的示例包括但不限于呋喃基、噻吩基、吡啶基、喹啉基、吡咯基、N-低级烷基吡咯基、吡啶基-N-氧化物、嘧啶基、吡嗪基、咪唑基、吲哚基等。
本文中使用的术语“烷氧基”，无论是作为其他术语的一部分还是单独使用，指式“-O-烷基”所示的基团。术语“C n-C m烷氧基”指烷氧基的烷基部分具有n至m个碳原子。在某些实施方案中，烷基部分具有1至6、1至4或1至3个碳原子。烷氧基基团的示例包括但不限于化学基团如甲氧基、乙氧基、丙氧基(例如n-丙氧基和异丙氧基)、t-丁氧基等。
本文中使用的术语“卤代烷基”，无论是作为其他术语的一部分还是单独使用，指式“-烷基-X”所示的基团，其中X为卤素，选自氟、氯、溴和碘的原子。术语“C n-C m卤代烷基”指卤代烷基的烷基部分具有n至m个碳原子。在某些实施方案中，烷基部分具有1至6、1至4或1至3个碳原子。卤代烷基基团的示例包括但不限于化学基团如卤代甲基、卤代乙基、卤代丙基(例如n-卤代丙基和异卤代丙基)、t-卤代丁基等。
本文中使用的术语“n元”，其中n是整数，其通常与环系一起使用以描述环系中形成环的原子数。例如，哌啶基为6元杂环烷基环的一个示例，吡唑基为5元杂芳基环的一个示例，吡啶基为6元杂芳基环的一个示例而1,2,3,4-四氢-萘为10元芳基的一个示例。本文中使用的术语“n-m元”通常与环系一起使用以描述环系中形成环的成员的数量，其中n和m是整数并且形成环的成员的范围包括端点(即n和m)和其间的各整数点。例如，3-8元表示3至8个形成环的成员的范围，包括3个成员、4个成员、5个成员、6个成员、7个成员和8个成员。
本文中使用的术语“卤素”指选自氟、氯、溴和碘的原子。
本文中使用的术语“氰基”指式“-CN”所示的基团。
本文中使用的术语“羟基”指式“-OH”所示的基团。
本文中使用的术语“硝基”指式“-NO 2”所示的基团。
本文中使用的术语“氨基””指式“-NH 2”所示的基团。
本文中使用的术语“氨基甲酰基”指式“-HNCONH 2”所示的基团。
本文中使用的术语“化合物”旨在包括所示结构的所有立体异构体(例如对映体和非对映体)、几何异构体和互变异构体。
本文所述的化合物可以是不对称的(例如具有一个或多个立体中心)。除非另外指明，所有的立体异构体，例如对映体和非对映体，都旨在包含在内。在本文所述的化合物中还可以存在烯烃、碳-碳双键等多种几何异构体，并且在本文中已经考虑了所有的这些稳定异构体。本文描述了化合物的顺式和反式几何异构体并且其可以以异构体的混合物或单独的异构体形式分离。
本文的化合物还包括互变异构形式。互变异构形式是由同时伴有质子的迁移的单键与相邻双键的对换导致的。互变异构形式包括具有相同化学式和总电荷的异构质子化状态的质子的互变异构体。质子互变异构体的示例包括酮-烯醇对、酰胺-亚胺酸对、内酰胺-内酰亚胺对、烯胺-亚胺对和环状的形式，其中质子能够占据杂环系统的两个或多个位置，例如1H-和3H-咪唑、1H-，2H-和4H-1,2,4-三唑、1H-和2H-异吲哚以及1H-和2H-吡唑。互变异构形式通过适宜的取代能够平衡或空间锁定成一种形式。
在某些实施方案中，本文的小分子化合物可以通过有机合成获得。可以使用任意公知的有机合成技术制备并且可以根据多种可能的合成途径合成本文的化合物，包括其盐、酯、水合物或溶剂化物。
在一些实施方案中，本文所述小分子化合物为具有下列结构式的化合物，包括其中的一种或多种：
Figure PCTCN2021084612-appb-000007
Figure PCTCN2021084612-appb-000008
Figure PCTCN2021084612-appb-000009
Figure PCTCN2021084612-appb-000010
本文中使用的术语“氧化苯砷”(PAO)是指具体化学结构如下的小分子化合物：
Figure PCTCN2021084612-appb-000011
本文中使用的术语“A1”和“G1”均为PI4KIIIα蛋白的小分子化合物抑制剂，具有较类似的结构。其中，A1的化合结构式为：
Figure PCTCN2021084612-appb-000012
5-(2-氨基-1-(4-(4-吗啉基)苯基)-1H-苯并咪唑-6-基)-N-(2-氟代苯基)-2-甲氧基-3-吡啶磺酰胺
G1的化学结构式为：
Figure PCTCN2021084612-appb-000013
(aS)-5-(2-氨基-4-氧代-3-(2-(三氟甲基)苯基)-3,4-二氢喹唑啉-6- 基)-N-(2,4-二氟代苯基)-2-甲氧基吡啶-3-磺酰胺。
本文还涉及氧化苯砷的衍生物、A1、或G1的类似物，只要它们具备抑制PI4KIIIα蛋白的磷酸激酶活性的功能，也同样可以用于治疗细胞内蛋白错误折叠相关疾病和溶酶体贮积病，并且该类结构类似物的制备方法也均已公开。在一些实施例中，所述的氧化苯砷、A1、或G1的衍生物为与氧化苯砷、A1、或G1结构类似的类似物。
细胞内蛋白错误折叠相关疾病
本文所用的术语“细胞内蛋白错误折叠相关疾病”是指由胞浆内非正常折叠的蛋白聚集所成为标志性特征的疾病，也被诊断为蛋白聚集(aggregation，accumulation)或蛋白错误折叠(misfolding)疾病。此外，术语“细胞内蛋白错误折叠相关疾病”也包括一些细胞内包涵体病变，比如蛋白质包涵体积累病，这一类包涵体主要由一种因折叠错误而聚集的核心蛋白，外附各种参与响应非折叠蛋白的应激蛋白。
细胞内蛋白错误折叠相关疾病包括但不限于帕金森氏病(PD)、路易体痴呆症(LBD)、多系统萎缩症(MSA)、包涵体肌炎症(IBM)、额颞痴呆(FTD)、亨廷顿疾病(HD)、多聚谷氨酰胺病(PolyQ)、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、朊病毒疾病。
溶酶体贮积病
本文所用的术语“溶酶体贮积病”是指因各种原因导致一些内源或外源的物质在溶酶体内积累引起的疾病，包括但不局限于因溶酶体内的酶活性不足、激活蛋白、转运蛋白或溶酶体蛋白加工校正酶的缺乏而引起溶酶体功能缺陷，造成次级溶酶体内相应底物不能被消化，底物积蓄，代谢障碍，形成贮积性疾病等。
溶酶体贮积病包括但不限于鞘脂类代谢障碍、黏多糖病、 糖原贮存病、糖蛋白贮积病、脂类储存疾病、翻译后修饰缺陷症、内在膜蛋白缺失失调症、神经元蜡样质脂褐质沉积病、或溶酶体相关细胞器紊乱症。其中，鞘脂类代谢障碍包括但不限于法布雷病，代谢障碍皮肤病(Farbe病)，戈谢病I、II、III型及产前死亡型，GM1神经节苷脂沉积症I、II、III型，GM2神经节苷脂沉积症(家族性黑蒙性白痴)，GM2神经节苷脂沉积症，类球状脑白质营养不良(克拉伯病)，异染性脑白质营养不良，尼曼匹克症A和B型；黏多糖病包括但不限于贺勒-施艾氏症候群和施艾氏症(ML I)、亨特综合症(MPS II)、圣菲利柏氏症A(MPS IIIA)、圣菲利柏氏症B(MPS IIIB)、圣菲利柏氏症C(MPS IIIC)、圣菲利柏氏症D(MPS IIID)、离心性骨软骨发育不良综合症(MPS IVA)、离心性骨软骨发育不良综合症(MPS IVB)、粘多糖病第六型(拉米氏症，MPS VI)、Sly病(MPS VII)、MPS IX；糖原贮存病包括但不限于罕见病庞贝氏症(GSD II)；糖蛋白贮积病包括但不限于α-苷露糖苷贮积病、β-苷露糖苷贮积病、岩藻糖苷贮积症、门冬酰葡糖胺尿症、辛德勒疾病I型(婴儿期发病神经轴索营养不良症)、辛德勒疾病II型(Kanzaki疾病)、辛德勒疾病III型(中等严重度)、唾液酸贮积症I型(樱桃红点状肌阵挛综合征)、唾液酸贮积症II型(粘多糖症I)、半乳糖涎酸贮积症；脂类储存疾病包括但不限于酸脂酶缺乏诸如Wolman病和胆固醇酯沉积病；翻译后修饰缺陷症包括但不限于多发性硫酸脂酶缺乏症、粘脂累积病IIα/β(I-细胞症)、粘脂累积病IIα/β(假赫勒氏综合症)、粘脂累积病IIIγ型(假赫勒氏综合症变体)；内在膜蛋白缺失失调症包括但不限于胱氨酸过多症、Danon病、肌阵挛肾衰竭综合症、唾液酸贮积症诸如ISSD、Salla症和中度严重Salla症、尼曼-皮克症C1和C2型、粘脂累积病IV型；神经元蜡样质脂褐质沉积病包括但不限于蜡样脂质褐质沉积病1型(Haltia-Santavuori症和INCL)、神经元蜡样质脂褐质沉积病2型(Jansky-Bielschowsky症)、蜡样脂质褐质沉积病3型(Batten-Spielmeyer-Sjogren症)、蜡样脂质褐质沉积病4型(Parry 病和Kufs A和B类)、蜡样脂质褐质沉积病5型(晚期婴儿芬兰异型)、蜡样脂质褐质沉积病6型(Lake-Cavanagh或印第安异型)、蜡样脂质褐质沉积病7型(土耳其异型)、蜡样脂质褐质沉积病8(北方癫痫、癫痫智能障碍)、蜡样脂质褐质沉积病9、蜡样脂质褐质沉积病10、蜡样脂质褐质沉积病11、蜡样脂质褐质沉积病12、蜡样脂质褐质沉积病13、蜡样脂质褐质沉积病14；溶酶体相关细胞器紊乱症包括但不限于Hermansky-Pudlak病1型、Hermansky-Pudlak病2型、Hermansky-Pudlak病3型、Hermansky-Pudlak病4型、Hermansky-Pudlak病5型、Hermansky-Pudlak病6型、Hermansky-Pudlak病7型、Hermansky-Pudlak病8型、Hermansky-Pudlak病9型、Griscelli综合症1(Elejalde综合症)、Griscelli综合症2、Chédiak–Higashi病。
药物施用和医药用途
本文中使用的术语“药学上可接受的”指在合理的医学判断范围内适宜用于与人和动物的组织接触而无过度的毒性、刺激、过敏反应或者其他问题或并发症，具有合理的收益/风险比的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。在某些实施方案中，药学上可接受的化合物、材料、组合物和/或剂型指由管理机构批准(如美国食品药品管理局、中国食品药品管理局或欧洲药品局)或者列于普遍认可的药典中(如美国药典、中国药典或欧洲药典)的用于动物(更特别地用于人)的那些。
本文中所用的术语“客体”可以包括人类和非人动物。非人动物包括所有的脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物。“客体”也可以是家畜动物(例如，牛、猪、羊、鸡、兔或马)，或啮齿类动物(例如，大鼠或小鼠)，或灵长类动物(例如，大猩猩或猴子)，或家养动物(例如，狗或猫)。“客体”可以是雄性或者雌性，也可以是不同年龄阶段。人类“客体”可以是高加索人、非洲人、亚洲人、闪族人，或其他种族，或不同种族的杂合体。人类“客体”可以是老年、成年、青少年、儿童或者婴儿。
在一些实施方案中，本文所述的客体是人或者非人灵长类动物。
本文中公开的PI4KIIIα特异性抑制剂可通过本领域公知的给药途径进行施用，例如注射给药(如，皮下注射、腹腔注射、静脉注射(包括静脉滴注或静脉输注)、肌肉注射或皮内注射)或非注射给药(如，口服给药、鼻腔给药、舌下给药、直肠给药或外用给药)。在一些实施方案中，本文所述的PI4KIIIα特异性抑制剂通过口服、皮下、肌内或静脉施用。在一些实施方案中，本文所述的PI4KIIIα特异性抑制剂通过口服施用。
本文中使用的术语“治疗有效量”是指，可以缓解或者消除客体的疾病或症状，或者可以预防性地抑制或防止疾病或症状发生的药物的量。治疗有效量可以是将客体的一种或多种疾病或症状缓解到一定程度的药物的量；可以将那些跟疾病或症状成因相关的一种或多种生理或生物化学参数部分或完全恢复到正常的药物的量；和/或可以降低疾病或症状发生的可能性的药物的量。在一些实施方案中，本文中使用的术语“治疗有效量”是指，可以缓解或者消除客体的细胞内蛋白错误折叠相关疾病或溶酶体贮积病的药物的量。
本文中提供的PI4KIIIα特异性抑制剂的治疗有效剂量依赖于本领域公知的多种因素，例如体重、年龄、过往病史、目前正在接受的治疗、对象的健康状况和药物相互作用的强度、过敏、超敏和副作用，以及给药途径和疾病发展的程度。本领域熟练人员(例如医生或兽医)可根据这些或其它条件或要求相应降低或升高剂量。
在一些实施方案中，治疗进一步包括向需要其的客体施用第二试剂。
在一些实施方案中，所述第二试剂是用于治疗细胞内蛋白错误折叠相关疾病的试剂，包括但不限于左旋多巴、力鲁唑。
在一些实施方案中，所述PI4KIIIα特异性抑制剂在所述第二试剂之前、之后或同时施用。
本申请的还涉及用于预防或治疗细胞内蛋白错误折叠相关疾病的方法，包括向需要其的客体施用有效量的PI4KIIIα特异性抑制剂。
本申请的还涉及用于预防或治疗溶酶体贮积病的方法，包括向需要其的客体施用有效量的PI4KIIIα特异性抑制剂。
药物筛选
本发明提供了一种筛选用于预防或治疗细胞内蛋白错误折叠相关疾病的药物的方法，包括将备选药物与PI4KIIIα蛋白或者核酸或者PI4KIIIα接触，并检测备选药物是否能够抑制PI4KIIIα的形成或者活性。
本发明还提供了一种筛选用于预防或治疗溶酶体贮积病的药物的方法，包括将备选药物与PI4KIIIα蛋白或者核酸或者PI4KIIIα接触，并检测备选药物是否能够抑制PI4KIIIα的形成或者活性。
实施例1.PI4KIIIα抑制剂促进小胶质细胞溶酶体的胞吐作用
1.1实验动物
使用的小鼠为野生型(WT)C57BL/6J小鼠和具有PI4KA的杂合敲除(KO)的C57BL/6J小鼠。雄性PI4KA -/+突变小鼠[Pi4kaGt(RRO073)Byg/+，MMRRC，Cat.#016351，UC Davis Mouse Resource Center(USA)]与野生型C57BL/6小鼠回交5代以上。然后将得到的Pi4kaGt(RRO073)Byg/+小鼠用于该研究。WT小鼠购自集萃药康，所有小鼠均在复旦大学药学院动物研究中心(中国上海)繁殖。将所有小鼠保持在不超过5只小鼠/盒的标准笼盒中，在12小时光照/黑暗循环中不限制进食和饮水。需要进行繁育的小鼠保持在每盒不超过一雄两雌进行饲养。
1.2原代小胶质细胞分离与培养(完全培养基：MEM+10％FBS)
a、混合胶质细胞的分离与培养
用麻醉剂麻醉18-20天孕鼠(1.2％阿佛丁腹腔注射0.3mL/10g)，取胚胎，置于灭菌烧杯中，以薄膜手套封住烧杯的口部，送至细胞房。剪头，取脑及之前的步骤与取原代神经元细胞一致。将取下的脑组织置于盛有Hank’s平衡盐溶液(HBSS)的细胞培养皿中，然后在解剖镜下分离出大脑皮质，置于HBSS中，剥去附着在大脑皮质上的脑膜和血管，用镊子撕碎，吸至15mL EP管中。加HBSS冲洗干净后，弃HBSS加胰酶(胰酶体积视细胞量而定，一般10×胰酶比例为1：10)，置37℃CO 2培养箱消化10分钟，然后弃胰酶，加入FBS(约为总体积的20％)终止消化反应1.5-2分钟。用一次性吸管小心吸去FBS，加入MEM培养液，反复吹打直至培养液为含细胞的混悬液，此时细胞在MEM培养液中分散均匀无明显团块及组织碎块，过70微米细胞筛后加入完全培养基吹打均匀后细胞计数，加入含10％FBS的MEM完全培养基种于T25细胞培养瓶，每个培养瓶培养从一只胎鼠的大脑分离出的小胶质细胞。置于CO 2培养箱孵育，过夜后弃旧培养基换新鲜的培养基，此后每隔48小时换液，约10天后观察到细胞分层生长，上层折光性较好的为小胶质细胞，下层支撑生长的为星形胶质细胞。
b、温和胰酶消化法分离纯化小胶质细胞
弃旧培养基后用PBS洗三次，加入低浓度的0.125％胰蛋白酶5mL消化，在倒置显微镜下边观察边晃动培养瓶，待上层细胞大部分脱落后将含有小胶质细胞的悬液转入15mL离心管中，在4℃低温下以1000g的转速离心5分钟，吸除上清后加入2mL完全培养基重悬细胞沉淀，然后将细胞悬液与0.4％的台盼蓝溶液以9:1的比例混合均匀后滴到血球计数板上计数。计数后以1×10 6的细胞数接种于多聚赖氨酸包被的35mm玻璃底培养皿中，30分钟后换新鲜的完全培养基，除去未完全贴壁的杂细胞，放入CO 2培养箱中培养。纯化后24小时更换新鲜的完全培养液，此后每隔2天全换或半换液。原代小胶质细胞至少培养4小时后 再换无血清培养基，进行后续实验。
1.3小胶质细胞Iba1抗体免疫染色
Iba1(Ionized calcium-binding adapter molecule 1)抗体是小胶质细胞和巨噬细胞的特异性抗体，可以特异性结合小胶质细胞特异性表达的钙结合蛋白，是中枢神经系统中小胶质细胞的标记物。
配置4％(w/v)的PFA：首先将700mL水磁力搅拌加速升温，升温后滴几滴1M氢氧化钠溶液助溶，然后加入40g多聚甲醛(PFA)搅拌使其完全溶解，向溶液中加入100mL加热后的10×PBS并用水定容至1L，调pH为8.0后过滤，分装于50mL离心管中，待冷却后放入4℃冰箱保存。
将分离纯化后的小胶质细胞种入铺有PDL包被的盖玻片的12孔板中，待细胞融合度达到70％左右弃培养基用PBS洗三次每次5分钟，弃PBS用4％(w/v)的PFA在4℃固定20分钟，PBS洗三次每次5分钟，然后在室温下用0.2％(w/v)的Triton X-100-PBS通透5分钟，PBS洗三次每次5分钟。用10％BSA(PBS)在室温下孵育1小时以封闭固定后的细胞，PBS洗两次。将细胞爬片放入暗盒中加入anti-Iba1抗体4℃孵育过夜，PBS洗三次每次5分钟。加入荧光标记的二抗室温黑暗孵育1小时，PBS洗四次每次5分钟。加入含DAPI染料的抗荧光淬灭封片液后将盖玻片倒扣在载玻片上用透明指甲油封边后放入暗盒中待测。其中一抗以1:500稀释，二抗以1:1000稀释。
随机选取3张荧光图片，用Image-pro-plus软件对整张图进行分析。红色点为阳性细胞数，蓝色点为细胞核总数，计算阳性细胞率。计算公式：阳性细胞率(％)＝阳性染色细胞数/细胞核总数×100％。计算阳性细胞率后得出本实验纯化后的小胶质细胞纯度>95％，可以用于后续实验。
1.4荧光染色及活细胞成像
需要进行活细胞成像的原代小胶质细胞接种于玻璃底培养皿中，实验前弃旧培养基换无血清培养基培养过夜。用含10％FBS的MEM完全培养基将1mM LysoTracker Red DND-99稀释至50nM，用含有荧光探针的装载溶液替换旧的培养基后将培养皿放在CO 2培养箱里孵育30分钟对活细胞溶酶体进行染色，用完全培养基将奎纳克林(Quinacrine)稀释至100nM对细胞内的ATP进行染色。荧光图片由Nikon倒置显微镜(Nikon Eclipse Ti-E,Japan)拍摄，所用的物镜为Plan Apo 60×1.40倍油镜，通过连续激光扫描获得实时活细胞成像，其中LysoTracker的发射光为561nm，Quinacrine的发射光为488nm。以点样的方式向细胞培养基中加入高浓度PAO母液使其在培养基中的终浓度为100nM，从点样加入PAO的第0s开始计时，延时拍摄每10秒收集一张荧光图像，总拍摄时间为500秒，使用Volocity软件(PerkinElmer)进行荧光图像分析。延时拍摄时使用的激光功率尽量降低(<1％)以避免可能发生的荧光漂白现象。
1.5 PI4KIIIα抑制剂处理细胞
原代小胶质细胞用氧化苯砷(PAO)处理，PAO在低浓度下是PI4KIIIα的特异性抑制剂。将原代小胶质细胞培养物分别与用完全培养基稀释的0,25或100nM浓度的PAO孵育1小时，然后收集细胞样品用于溶酶体胞吐成像或收集培养液用于测定细胞外液的ATP浓度。用不含PAO的含10％FBS的MEM培养液处理小胶质细胞作为对照实验。
1.6细胞培养液中ATP浓度测定
使用荧光素酶报告实验通过生物发光法测定细胞外液中ATP的含量。将小胶质细胞用不含血清的MEM培养基饥饿培养过夜。在整个实验过程中，为防止ATP水解，在培养基中加入ATP水解酶抑制剂双嘧达莫(10μM)。分别将0、25、100nM的PI4KIIIα抑制剂PAO加入培养基中，并分别在孵育0、4、6、8、15、30和 60分钟后收集培养基。向不透明白色96孔板中加入50μL含有荧光素酶-荧光素缓冲液的ATP测定混合物，静置两分钟以消耗孔内的ATP，然后将50μL样品加入到孔中。用Varioskan Flash(Thermo Fisher Scientific)多功能酶标仪测量溶液的发光值。从标准ATP样品的发光值获得标准曲线，对照标准方程得出样品中ATP的含量。数据表示为每组至少3次实验的平均值±SEM。使用单因素方差分析法(one-way ANOVA)进行数据统计分析。
1.7细胞内总蛋白含量的测定
将旧的细胞培养基吸出，加入PBS缓冲液洗3遍，弃PBS加入含1％蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液(12孔板加入100μL/孔)，将孔板置于冰上裂解30分钟后用细胞刮刀刮净孔底的细胞置于1.5mL离心管中，然后在4℃下15000rpm离心30分钟，收集上清液并测其中的总蛋白含量。按照说明书要求配置工作液和标准品溶液，将样品与工作液按1：8的比例加入96孔板，即在每孔中加入25μL样品和BSA标准溶液及200μL工作液，在平板振荡器上混匀30秒后用铝箔覆盖孔板在37℃下孵育30分钟，待孔板冷却至室温测其562nm处的吸光度。细胞内总的蛋白浓度可以根据标准曲线计算出。
1.8统计分析
数据处理采用GraphPad Prism 5软件进行分析。使用单因素分析(One-way ANOVA)处理，mean±SEM,p<0.03有统计学差异。
1.9抑制PI4KIIIα促进小胶质细胞溶酶体荧光强度减弱
计算阳性细胞率后得出本实验纯化后的小胶质细胞纯度>95％，可以用于后续实验。
在培养的小胶质细胞(分别来自于C57B6或者是PI4KA -/+突变小鼠)，将1mM LysoTracker Red DND-99稀释至50nM，用 含有荧光探针的装载溶液替换旧的培养基后将培养皿孵育30分钟对活细胞溶酶体进行染色。将原代小胶质细胞培养物用100nM浓度的PAO或培养液继续孵育1小时后，进行荧光成像(图1)。
图1显示荧光强度随着时间而减弱(从0秒到500秒)，表明溶酶体膜与细胞质膜融合而引起溶酶体内荧光染料解离。图1(A)对照组中(野生型WT小鼠细胞，无PAO)，500秒内各荧光点的荧光强度变化不大，与0秒时的荧光强度相比，在250秒时荧光强度减少13.5％(p<0.001)，经历500秒常规溶酶体胞吐后荧光强度只有15.1％(p<0.001)的减少。图1(B)PAO(100nM)组中，100秒时显示出5.2％的脱色(p<0.001)，200秒脱色达到47.4％(p<0.001)，400秒时为68.5％(p<0.001)，500秒时为70.1％(p<0.001)。图1(C)PI4K+/-组中，部分点的荧光强度减弱不甚明显，平均荧光强度的减少为45.1％(p<0.001)，并且在200s后荧光强度变化的幅度减少。
1.10 BPB使得小胶质细胞内溶酶体荧光减弱
为了进一步验证这种“kiss-and-run”的融合形式，引入一个不透膜的荧光淬灭剂——溴酚蓝(BPB)，工作浓度为1mM。BPB可快速扩散通过“kiss-and-run”过程中形成的融合孔，以淬灭溶酶体膜内部小叶上的残留荧光。不做任何处理的原代小胶质细胞可以经历常规胞吐，使少量BPB进入到细胞内，而当抑制PI4KIIIα酶活性的时候，大量BPB就会通过“kiss-and-run”过程中产生的融合孔进入溶酶体内叶，使得细胞内溶酶体的荧光短暂淬灭(图2)。
图2(A)为对照组，与0秒时的荧光强度相比，在250秒显示出17.7％(p<0.001)的脱色，在500秒时显示20.2％(p<0.001)。图2(B)与0秒时的荧光强度相比，PAO处理后在10秒时显示出22.3％(p<0.001)脱色，50秒时脱色达到55.1％(p<0.001)，在100秒时为62.8％(p<0.001)，200秒时69.1％(p<0.001)， 400秒时75.5％(p<0.001)，500秒时为78％(p<0.001)。图2(C)500秒22个荧光点的平均荧光强度相对于0秒时平均降低62.5％。
1.11 BPB因从溶酶体分散出去使得小胶质细胞溶酶体荧光恢复/增高
此外，当孵育BPB溶液的时间达1小时后，BPB通过常规胞吐进入细胞内达到有限的浓度，使溶酶体荧光淬灭，此时下调PI4KIIIα使溶酶体与质膜“kiss-and-run”融合，BPB就会在溶酶体染料解离之前从溶酶体中扩散出来的，这时原本被暂时淬灭的溶酶体荧光又重新发光(图3)。
图3(A)为对照组实验，与0秒时的荧光强度相比溶酶体的荧光强度在500秒几乎不变，只微幅增加了1.4％。图3(B)WT细胞前200秒由于融合孔的出现，胞外的BPB进入胞内将溶酶体的荧光暂时淬灭了，与0秒相比荧光强度平均减少41.8％。后300秒由于融合孔的存在，胞内的BPB又在染料从溶酶体中解离之前透过融合孔排出胞外，使得短暂淬灭的荧光恢复，与0秒相比增加26.4％。图3(C)PI4K -/+杂合敲除细胞在BPB孵育1小时后由于溶酶体在这个过程中一直处于“kiss-and-run”状态中，细胞内外的BPB浓度达到平衡，最终在500秒时与0秒相比荧光强度平均增加11.7％。
1.12 PI4KIIIα抑制剂促进小胶质细胞溶酶体胞外分泌ATP
有文献报道，细胞外ATP对促进溶酶体与质膜的融合起着重要的作用，并且ATP在小胶质细胞中大量积累也得到了验证(Dou Y,Wu H J,Li H Q,et al.Microglial migration mediated by ATP-induced ATP release from lysosomes[J].Cell Research,2012,22(6):1022-1033；Imura Y,Moriza WA Y,Komatus R,et al.Microglia release ATP by exocytosis[J].Glia,2013,61(8):1320-1330；Zhang Z,Chen G,Zhou W,et al.Regulated ATP release from  astrocytes through lysosome exocytosis[J].Nature Cell Biology,2007,9(8):945-953)。抑制PI4KIIIα促进小胶质细胞溶酶体与细胞膜进行“kiss-and-run”融合，释放出溶酶体中的ATP。ATP释放到胞外后又进一步促进溶酶体和细胞膜融合从而将溶酶体中的细胞降解产物和有细胞毒性的物质释放出去，比如β淀粉样蛋白。为了验证ATP在溶酶体中的积累和释放，本发明使用了100nM奎纳克林(Quinacrine)标记细胞内的ATP(图4)。
图4中，由合并后的图可以看出细胞内的ATP与溶酶体共定位，验证了小胶质细胞溶酶体内积累了大量的ATP。此时孵育PAO，ATP释放到细胞外，胞内ATP减少。图4(B)数据分析可知，PAO处理的WT细胞和PI4K +/-的细胞在8、15、30、60分钟时测出的胞外ATP浓度与对照组相比有显著增加(p<0.05)。
实施例2.PI4KIIIα抑制剂促进神经元溶酶体的胞吐作用
2.1原代海马神经元细胞分离与培养
用麻醉剂麻醉18-20天孕鼠(1.2％阿佛丁腹腔注射0.3mL/10g)，取胚胎，置于灭菌烧杯中，以薄膜手套封住烧杯的口部，送至细胞房。剪头，取脑，将取下的脑组织置于盛有DMEM高糖培养基的细胞培养皿中，然后在解剖镜下仔细分离出海马部位，置于DMEM高糖培养基中，剥去附着在海马上的脑膜和血管，用镊子撕碎，吸至12孔板中。加入DMEM高糖培养基冲洗干净后，用微量移液器仔细吸出DMEM高糖培养基后加1mL0.125％胰酶，置于37℃二氧化碳培养箱温和消化8分钟，每隔4分钟拿出来晃动一下使消化均匀，然后小心吸除胰酶，加入胎牛血清(FBS)(约为总体积的20％)终止消化反应1.5-2分钟。小心吸去FBS，加接种液(DMEM-HG)，吹打10次之后静置2分钟，游离的单细胞在上清液中，团块沉积在下面，将上清液移入冰浴的培养皿中，重复三次后弃沉积的团块。吹打均匀后细胞计数，血球计数板的每个孔都需要计数，若发现细胞分布不均匀，需重新计数。计数后加接种液将细胞吹散均匀，种于细胞培养板 (一般6孔板种1*10 5/孔，依此类推，若需转染则适当加大细胞量)。置于CO 2培养箱孵育4小时后换neurobasal培养基，换液时轻晃板内液体并用37℃接种液洗一遍，使贴壁不牢的血管细胞脱落。此后每隔两天半量换液，在体外培养10天(DIV10)用于后续实验。
2.2抑制PI4KIIIα促进神经元细胞溶酶体荧光强度减弱
从WT胚胎小鼠的海马中分离原代海马神经元，对该原代神经元细胞进行PI4KIIIα药物抑制，分别对比用药处理与不用药处理的野生型神经元细胞中溶酶体的变化(图5)。
图5(A)为在WT原代神经元细胞中不用PAO抑制PI4KIIIα活性时溶酶体的荧光点数量几乎不变。图5(B)为在野生型原代神经元细胞中用PAO溶液孵育后，与对照组相比溶酶体荧光强度明显降低。
实施例3.PI4KIIIα抑制剂抑制细胞内α-synuclein蛋白水平下降
3.1 PC12、SH-SY5Y细胞系培养
PC12的完全培养体系为10％HS和5％FBS加入高糖DMEM；SH-SY5Y的完全培养体系为15％FBS加入高糖DMEM。
3.2 PC12和SH-SY5Y细胞免疫荧光染色
细胞培养体系在被药物处理后，先固定：4％PFA处理30分钟；通透：0.1％Triton-X处理15分钟；封闭：10％驴血清封闭1小时；一抗：Mouse anti-α-synuclein；二抗：anti-Mouse Alex 555。
3.3 α-synuclein ELISA检测
加50ul Hu α-synuclein Detection Antibody solution到各孔(chromogen blanks empty除外，即空白比色孔)，再加50ul样品及标曲(标曲配制见下图)到各孔(chromogen blanks empty除 外)，轻震荡混匀，盖膜4℃孵育过夜；用1X Wash buffer 100ul充分洗孔四次后，除空白比色孔外每孔加100ul Anti-Rabbit IgG HRP盖膜室温孵育30分钟，再用1X Wash buffer充分清洗四次；加100μL Stabilized Chromogen到每孔，溶液变蓝，避光室温孵育30分钟；加100μL Stop Solution到每孔。轻震荡混匀，溶液变黄，使用酶标仪(波长450nm)读数。
3.4 PI4KIIIα抑制剂处理细胞
PC12或SY细胞培养体系：10％HS+5％FBS+高糖DMEM，培养至培养皿40-60％，使用Fugene HD转染试剂转染α-synuclein过表达质粒。培养24小时后饥饿培养24小时(去除血清)，更换为正常培养体系，加入Lyso-tracker处理30分钟后更换新鲜培养液，同时PAO处理。PAO处理组：25nM、50nM、100nM处理时间10分钟后进行免疫细胞化学染色。
3.5噻唑蓝(MTT)法检测细胞活力
给药处理12小时，加入终浓度为05.mg/mL的MTT，孵育4小时后吸去培养液，加入100μL DMSO溶解吸附的MTT，振荡15分钟后读取吸光度值。
3.6质粒转染
α-synuclein过表达质粒信息如下：
Figure PCTCN2021084612-appb-000014
Figure PCTCN2021084612-appb-000015
α-synuclein ELISA Kit试剂盒购自Thermo Fisher Scientific(Catalog No.KHB0061)。Fugene HD转染试剂购自Promega(Beijing)Biotech Co.,Ltd.(Catalog No.E2311)；α-synuclein单克隆抗体(Mouse monoclonal)购自Sigma-Aldrich(上海，Catatlog No.S5566)。
3.7 PAO抑制SH-SY5Y细胞中α-synuclein过表达导致的细胞死亡或凋亡
帕金森氏病病人的标志性细胞病理特征，是出现以错误折叠的α-synuclein蛋白为主的蛋白聚集(aggregation)。这些聚集的蛋白因无法及时被清理，因而被认为导致细胞毒性。本发明在SH-SY5Y细胞系里转染α-synuclein过表达(α-syn-OE)质粒，24小时后再给予PAO处理12小时。然后通过MTT实验检测各组细胞存活率，并与α-syn-OE组比较(图6)。
经One-way ANOVA分析，结果显示：图6(A)α-syn-OE组细胞存活率显著低于对照(Vehicle)组。(B)α-syn-OE+PAO处理组(PAO浓度分别为6.25、12.5、25、50、75、100nM)的细胞存活率显著高于α-syn-OE组(n＝5,mean±SEM，One-way ANOVA,**p<0.01，***p<0.0001vs.α-syn-OE)。这个实验说明PAO能够起到缓解α-synuclein过表达引起的细胞毒性。
3.8 PAO系列化合物促进α-synuclein分泌
本发明进一步检测了PAO的促α-synuclein分泌或外排的特性。培养的PC12和SH-SY5Y细胞系分别使用Fugene HD转染试剂转染α-synuclein过表达质粒，饥饿处理24小时后更换为完全培养体系，同时用化合物PAO或PAO衍生物对甲基苯氧化砷处理4小时，通过ELISA检测细胞培液上清中α-synuclein水平。
PAO衍生物对甲基苯氧化砷的化学式如下：
Figure PCTCN2021084612-appb-000016
图7(A)中显示在P12细胞系中，50nM、75nM和100nM PAO处理组中胞外α-synuclein蛋白水平与未加PAO的对照α-synOE组比较显著增高，提示PAO能够促使细胞内α-synuclein蛋白的外排。图7(B)中显示在SH-SY5Y细胞系中，PAO有同样的提升胞外α-synuclein水平的能力。图7(C)中显示在P12细胞系中，50nM、75nM PI-70处理也能促使细胞内α-synuclein蛋白的外排。
3.9 PAO促使细胞内α-synuclein蛋白水平下降
本发明先将细胞进行PAO处理，然后通过ELISA检测方法和Western blot检测胞内α-synuclein蛋白水平。细胞培养及给药处理方式与上相同。图8中，ELISA检测结果显示，75nM和100nM PAO处理组α-synuclein蛋白水平与α-syn OE组比较显著降低，提示PAO能够降低了细胞内α-synuclein蛋白水平。图8(B)中Western blot检测到75nM和100nM PAO处理组中的α-synuclein低于对照组。
实施例4.PI4KIIIα抑制剂促进HTT蛋白和SOD1蛋白分泌
4.1 SOD1 ELISA检测
于检测孔板对应孔中加入稀释标曲、空白对照和样本各100ul。盖膜于37℃孵育2小时；弃去各孔中液体，加100ul Detection Reagent A Working Solution于各孔，盖膜于37℃孵育1小时；弃上清，用1X Wash buffer清洗各孔3次，每次2分钟且尽量无液体残留；加100ul Detection Reagent B Working Solution于各孔，盖膜于37℃孵育1小时；重复清洗操作5次；加90μL Substrate Solution到各孔，盖膜于37℃避光孵育20分钟。溶液变蓝；加50μL Stop Solution到每孔，轻震荡混匀，溶液变黄，尽 快用酶标仪(吸收波长450nm)读数。
4.2 Human Huntingtin ELISA检测
于检测孔板对应孔中加入稀释标曲、空白对照和样本各50ul；立即加50ul Detection A Working Solution于各孔。轻柔震荡混匀后，盖膜于37℃孵育1小时；移去各孔中液体，用1X Wash buffer清洗各孔3次，每次2分钟且尽量无液体残留；加100ul Detection Reagent B Working Solution于各孔。盖膜于37℃孵育45分钟，重复清洗操作5次；加90μl Substrate Solution到各孔。盖新膜于37℃避光孵育10-20分钟；加50μl Stop Solution到每孔，轻柔震荡混匀，溶液变黄，立即用酶标仪(吸收波长450nm)读数。
4.3转染试剂
转PC12细胞系使用Fugene HD转染试剂转染HTT(1-586aa)(HTT(1-586aa)过表达质粒能够表达HTT蛋白的N端，是HTT蛋白穿梭的重要部位)或SOD1过表达质粒。
4.4质粒转染
以下质粒购自Obio Technology(Shanghai)Corp.,Ltd：
1)基因名称：HTT(1-586aa)；GenBank ID:NM_002111；
2)基因名称：SOD1，基因ID：6647。
Human Superoxide Dismutase 1,Soluble(SOD1)ELISA Kit试剂盒购自Signalway Antibody LLC.(SAB，Catalog No.EK16688)；Human Huntingtin(HTT)ELISA Kit试剂盒购自Signalway Antibody LLC.(SAB，Catalog No.EK2869)。
4.5 PI4KIIIα抑制剂促进HTT蛋白和SOD1蛋白分泌
在神经系统疾病中，HTT和SOD1蛋白也与多种神经系统疾病的发生发展密切相关，其中亨廷顿疾病与HTT蛋白相关而肌 萎缩性侧索硬化症与SOD1蛋白相关。PC12细胞系使用Fugene HD转染试剂转染HTT(1-586aa)(HTT(1-586aa)过表达质粒能够表达HTT蛋白的N端，是HTT蛋白穿梭的重要部位)或SOD1过表达质粒，培养24小时后饥饿处理24小时，更换为正常培养体系，同时化合物PAO处理4小时，通过ELISA检测细胞培液上清中HTT蛋白和SOD1蛋白水平。结果显示，在PC12细胞系中25nM、50nM、75nM以及100nM PAO处理组较HTT OE组显著促进HTT蛋白分泌(图9A)。同时，在SOD1过表达实验中，75nM和100nM PAO处理组分泌的SOD1较HTT OE组有显著意义(图9B)。
实施例5.抑制PI4KIIIα缓解CBE诱导的溶酶体聚集
5.1 PAO通过促进溶酶体缓解CBE引起的细胞毒性
戈谢病(Gaucher disease)是溶酶体贮积病(lysosome storage disease，LSD)中较为常见的一类疾病。该病由于葡萄糖脑苷脂酶基因突变导致机体酸性β-葡萄糖苷酶(acidβ-glucosidase或glucocerebrosidase，GCase)活性缺乏，造成其底物葡萄糖脑苷脂(glucocerebroside)在多种脏器，包括肝、脾、骨骼、肺，甚至脑的巨噬细胞溶酶体中贮积，导致受累组织器官出现病变，临床表现多脏器受累并呈进行性加重。Conduritol B Epoxide(CBE)是常用的β-葡糖苷酶(β-glucosidase)抑制剂，本发明中CBE被用考察PAO对戈谢病的调控。
在培养的SH-SY5Y细胞系中分别加入以下浓度CBE：1.5μM、3μM、6.25μM、12.5μM、25μM、50μM和100μM，处理72小时后检测细胞活力。结果显示，50μM和100μM CBE处理72小时造成的细胞死亡或凋亡与对照组(ctrl)比较有显著差异(图10A)。100μM CBE选择被选择处理SH-SY5Y细胞进行后续实验。100μM CBE处理24小时后进行饥饿处理，并在饥饿24小时后重新孵育100μM CBE并给予不同浓度的PAO处理24小时，进行MTT实验检测细胞存活率。n＝5,One-way ANOVA,**p<0.001,***p<0.0001,vs.α-syn-OE。通过MTT检测 PAO对100μM CBE处理造成的细胞死亡或凋亡的影响。实验结果显示，6.25nM,12.5Nm,25Nm,50Nm,75nM以及100nM PAO处理组细胞的存活率均显著高于100μM CBE处理组(图10B)。
5.2 PAO促进溶酶体释放和减少细胞内多种GlcCer的积累
因为PAO可以诱导溶酶体释放，因此本发明结合PAO和CBE，测试PAO是否可以影响溶酶体释放。在100μM CBE处理SH-SY5Y细胞72小时后加入溶酶体标记Lysosome tracker(LysoTracker)标记溶酶体。结果显示，100μM CBE处理组LysoTracker标记的阳性细胞数量较阴性对照组显著增多(图11)，说明CBE诱导了溶酶体的聚集，可以用来模拟Gaucher病。100μM CBE处理SH-SY5Y72小时后加入LysoTracker，并在30分钟后给予50nM或75nM PAO处理5分钟(A)或10分钟(B)，4％多聚甲醛(PFA)固定后进行观察。Scale bar＝100μm。5分钟(图11A)或10分钟(图11B)后，Lyso-tracker标记的阳性细胞都较对照组减少，说明PAO可以缓解CBE诱导的溶酶体聚集。
PAO降低葡萄糖神经酰胺(Glucosylceramide,GlcCer)在CBE处理细胞内积累。GD的根本缺陷在于缺乏葡萄糖脑苷脂酶的活性，而该酶主要介导把葡萄糖脑苷脂分解成葡萄糖和GlcCer过程，因此GD患者或CBE处理的细胞中均出现GlcCer等底物的贮积。为了进一步探究PAO是否对SH-SY5Y细胞模型中的GlcCer贮积有所影响，我们通过LC-MS实验测量细胞内不同侧链的GlcCer含量。结果表明，细胞内100μM CBE处理组多种不同侧链GlcCer浓度远高于对照组(ctrl)，100μM CBE和50nM PAO共同处理组GlcCer浓度与100μM CBE处理组比较降低(图11C)。
化合物A1和G1也是特异性的PI4KIIIα的抑制剂。在100μM CBE处理SH-SY5Y 72小时后加入溶酶体标记(Lysosome tracker,Lyso-tracker)标记溶酶体，并在30分钟后给予50nM或75nM A1或G1处理10分钟。结果显示，100μM CBE处理组Lyso-tracker标记的阳性细胞数量较阴性对照组显著增多，50nM和75nM A1 或G1处理10分钟能够促使Lyso-tracker标记的阳性细胞较100μM CBE处理组减少(图12A,B)。因此，A1和G1都能促进溶酶体酶的胞吐，减轻CBE处理导致的溶酶体蓄积。
5.3敲减PI4Kα促进溶酶体胞吐或减少溶酶体贮积
前期研究显示，PAO在低浓度(<5μM)时主要作用于磷脂酰肌醇4激酶PI4KⅢα，为了进一步探究PAO作用靶点PI4KⅢα在溶酶体贮积病以及蛋白质错误折叠相关疾病中的作用，我们设计了针对编码PI4KⅢα蛋白的基因序列PI4Kα的shRNA干扰慢病毒载体(带有绿色荧光蛋白GFP表达序列)。蛋白质免疫印迹实验结果显示，三个针对PI4Kα的shRNA干扰慢病毒载体在转染SH-SY5Y细胞48小时后，干扰序列sh1、sh2、sh3均使处理组PI4KⅢα表达水平显著降低(图13A和13B)。shRNA干扰慢病毒载体处理48小时后通过免疫荧光观察Lyso-tracker的荧光强度。与sh-ctrl比较，sh-ctrl和100μM CBE共同处理组Lyso-tracker免疫荧光强度显著升高。与sh-ctrl和100μM CBE共同处理组比较，sh1-PI4Kα和100μM CBE共同处理组Lyso-tracker免疫荧光强度的下降有显著意义。以上结果说明敲减PI4Kα能减少溶酶体贮积或促进溶酶体胞吐。
实施案例6.抑制PI4KIIIα促进或激活自噬和活化自噬流
前期研究显示，GD等溶酶体贮积病发展过程中ALP被阻断。SH-SY5Y细胞经CBE处理48小时后根据分组分别加入不同浓度PAO或mTOR抑制剂雷帕霉素(Rapamycin，RAPA)作为阳性对照，共孵育24小时，进行蛋白质免疫印迹实验或免疫荧光实验，通过观察ALP常见标志物研究PAO等化合物对自噬溶酶体通路的影响。对ALP常见的标志物LC3B和p62进行检测，蛋白质免疫印迹实验显示：在CBE构建的SH-SY5Y细胞模型中，PAO剂量依赖性地促进LC3B蛋白表达，抑制p62蛋白水平，说明PAO激活ALP通路并使自噬流活化(图14A-C)，与阳性对照500nM RAPA结果相近(图14A-C)。免疫荧光结果与蛋白免疫印迹实验结果相 一致(图14D)。此外，H+-ATPase抑制剂Bafilomycin A1(Baf-A1)是一种常用的ALP抑制剂，通过利用Baf-A1阻断ALP信号可以进一步验证PAO等化合物对CBE构建的SH-SY5Y细胞的保护作用是否与ALP有关。SH-SY5Y细胞经CBE处理48小时后根据分组分别加入不同浓度PAO或50nM Baf-A1共孵育24小时，通过MTT实验检测细胞活力。实验结果表明，与对照组(ctrl)比较，100μM CBE显著抑制SH-SY5Y细胞活力。与100μM CBE处理组比较，100μM CBE与25nM，50nM以及75nM PAO共同处理组细胞活力显著升高，50nM Baf-A1处理则使PAO在相应组别中的保护作用下降，使50nM Baf-A1和100μM CBE分别与25nM，50nM以及75nM PAO共同处理组的细胞活力与100μM CBE处理组没有明显差异(图14E)，说明Baf-A1通过抑制ALP信号阻断PAO对CBE处理的SH-SY5Y细胞的保护作用。以上结果证实PAO激活ALP使自噬流活化，并通过ALP发挥对GD细胞模型的保护作用。
对进行shRNA干扰慢病毒载体处理的SH-SY5Y细胞检测ALP通路标志物LC3B进行检测，结果显示：与sh-ctrl组比较，敲减PI4Kα后LC3B蛋白水平显著升高(图15)，在CBE处理的SH-SY5Y细胞中敲减PI4Kα同样促进LC3B蛋白表达，说明与PI4Kα抑制剂PAO结果相同，敲减PI4Kα同样激活了ALP通路。
实施例7.抑制PI4KIIIα减少C型尼曼氏病(NPC)的细胞内胆固醇的积累(图16)
U18666A，是一种细胞内胆固醇转运(cholesterol transport)抑制剂，常被用于构建C型尼曼氏病(NPC)的细胞模型。
1细胞培养与化合物处理
SH-SY5Y细胞使用高糖DMEM加15％FBS的完全培养基放置37℃，5％CO 2培养箱培养。当细胞70％融合时，加入含10μM U18666A(购自爱必信(上海)生物科技有限公司，货号：abs819512)同时根据分组加入不同深度d5PAO和PAO，培养 24小时。
2 Filipin染色
1)将24孔板中的培养基弃去，加入1mL PBS缓冲液静置1分钟，弃去24孔板中的液体，重复此步骤2次；
2)每孔加入1mL 4％多聚甲醛，室温下固定30分钟；
3)将24孔板中的4％多聚甲醛弃去，加入1mL PBS缓冲液，轻轻晃动24孔板1分钟，弃去24孔板中的液体，重复此步骤2次；
4)每孔加入1mL 1.5mg/mL甘氨酸溶液，室温下孵育10分钟；
5)将24孔板中的液体弃去，加入终浓度为50μg/mL Filipin染色液(购自Sigma-Aldrich，货号：SAE0087)1mL，室温下孵育1小时，避免光照；
6)将24孔板中的液体弃去，加入1mL PBS缓冲液，轻轻晃动24孔板1分钟，弃去24孔板中的液体，重复此步骤2次；
7)取载玻片，在载玻片中央滴加5微升封片剂(含DAPI),将细胞爬片取出晾干，将有细胞的一面向下，盖在载玻片上，使之与封片剂充分接触，室温避光孵育30分钟。
8)激光共聚焦显微镜观察。
实验结果
10μM U18666A处理SH-SY5Y细胞，同时根据分组加入不同浓度PAO，共孵育24小时，进行Filipin染色后观察。免疫荧光染色结果表明，10μM U18666A单独处理组Filipin染色荧光强度比对照组(ctrl)增强，提示10μM U18666A处理导致与Filipin结合的胆固醇量上升，即导致胆固醇贮积。10μM U18666A与35nM PAO，70nM PAO共同处理组Filipin染色荧光强度与10μM U18666A单独处理组比较出现下降(图16)。以上结果说明一定浓度PAO能够抑制U18666A导致的胆固醇贮积。
本领域的技术人员应当明了，尽管为了举例说明的目的，本文描述了本发明的具体实施方式，但可以对其进行各种修改而不偏离本发明的精神和范围。因此，本发明的具体实施方式和实施例不应当视为限制本发明的范围。本发明仅受所附权利要求的限制。本文中引用的所有文献均完整地并入本文作为参考。

Claims (27)

  1. PI4KIIIα特异性抑制剂在制备用于预防或治疗细胞内蛋白错误折叠相关疾病中的用途。
  2. PI4KIIIα特异性抑制剂在制备用于预防或治疗溶酶体贮积病中的用途。
  3. 根据权利要求1或2所述的用途，其中所述PI4KIIIα特异性抑制剂是抗体、小分子化合物、RNAi分子或者反义核酸。
  4. 根据权利要求3所述的用途，其中所述抗体是单克隆抗体或者多克隆抗体。
  5. 根据权利要求3所述的用途，其中所述抗体是嵌合抗体、人源化抗体或者全人源抗体。
  6. 根据权利要求3所述的用途，其中所述RNAi分子是小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)或微小RNA(miRNA)。
  7. 根据权利要求3所述的用途，其中所述RNAi分子的长度为18-100碱基。
  8. 根据权利要求3和6-7中任一项所述的用途，其中所述RNAi分子被修饰以增强其稳定性。
  9. 根据权利要求1或2所述的用途，其中所述PI4KIIIα特异性抑制剂是小分子化合物。
  10. 根据权利要求9所述的用途，其中所述小分子化合物是氧化苯砷或其衍生物、G1及其类似物、A1及其类似物。
  11. 根据权利要求10所述的用途，其中所述氧化苯砷及其衍生物具有式(I)所示的结构或者其药学上可接受的盐，
    Figure PCTCN2021084612-appb-100001
    其中，R 1各自独立的选自(a)H、卤素、硝基、氰基、羟基、氨 基、氨基甲酰基、C 1-6烷基砜基、C 1-6烷基、C 1-6环烷基、C 2-6炔基、C 2- 6烯基、C 1-6烷氧基、C 1-6卤代烷基、C 1-6亚烷基-NH 2、C 1-6亚烷基-NH-C(O)H、-As(O)、-N＝NH、N-(C 1-6烷基)氨基、N,N-(C 1-6烷基) 2氨基、-NH-C(O)H、-NH-S(O) 2H、-C(O)OH、-OC(O)H、-SH、-S(O) 2H、-S(O) 2-NH 2或杂环基，并且可选的被R 2或R 3取代，其中R 2和R 3各自独立的选自氨基、C 1-6烷基、C 1-6烷氧基、C 1-6卤代烷基、N-(C 1-6烷基)氨基、N-(6-12元芳香基)氨基、N,N-(C 1-6烷基) 2氨基、C 3-6环烷基、6-12元的芳香基或3-12元的杂环基，并且可选的被一个或多个卤素、硝基、氰基、羟基、氨基、氨基甲酰基、-NH-C(O)-R 5、-C(O)OR 4、6-12元的芳香基、C 1-6烷基、C 2-6炔基、C 2-6烯基、C 1-6烷氧基、C 1-6卤代烷基、3-6元的杂环基、C 3-6环烷基或Bn-O-取代，并且R 4是C 1-6的烷基，并且可选的被一个或多个卤素、硝基、氰基、羟基、氨基、氨基甲酰基、6-12元的芳香基、C 1-6烷基、C 2-6炔基、C 2-6烯基、C 1-6烷氧基、C 1-6卤代烷基、3-6元的杂环基、C 3-6环烷基或Bn-O-取代，R 5选自H、C 1-6烷基、C 2-6炔基、C 2-6烯基、C 1-6烷氧基或C 1-6卤代烷基，和/或
    (b)两个相邻碳原子上的R 1形成5-12元的环烷基、芳香基或杂环基，并且可选的被一个或多个卤素、硝基、氰基、羟基、氨基、氨基甲酰基、6-12元的芳香基、C 1-6烷基、C 2-6炔基、C 2-6烯基、C 1-6烷氧基、C 1-6卤代烷基、3-6元的杂环基、C 3-6环烷基或Bn-O-取代，
    其中，n为0-5的整数。
  12. 根据权利要求11所述的用途，其中n为0-2的整数，所述R 1各自独立的选自H、卤素、硝基、氰基、羟基、氨基、氨基甲酰基、C 1- 6烷基砜基、C 1-6烷基、C 1-6环烷基、C 1-6烷氧基、C 1-6卤代烷基、-As(O)、N-(C 1-6烷基)氨基、N,N-(C 1-6烷基) 2氨基、-NH-C(O)H或-NH-S(O) 2H，并且可选的被所述R 2或R 3取代。
  13. 根据权利要求11所述的用途，其中n为0-2的整数，所述R 1各自独立的选自H、卤素、硝基、氰基、羟基、氨基、C 1-6烷基砜基、C 1-6烷基、C 1-6环烷基、C 1-6烷氧基、C 1-6卤代烷基、-As(O)、-NH-C(O)H或-NH-S(O) 2H，并且可选的被所述R 2或R 3取代。
  14. 根据权利要求11所述的用途，其中n为1或2，所述R 1各自 独立的选自H、卤素、氨基、C 1-6烷基砜基、C 1-6环烷基、C 1-6烷氧基、C 1-6卤代烷基、-NH-C(O)R 2或-NH-S(O) 2R 3，其中R 2为C 1-6烷基，可选的被一个6-12元芳香基取代，R 3为6-12元芳香基，可选的被一个卤素、C 1-6烷氧基或C 1-6卤代烷基取代。
  15. 根据权利要求14所述的用途，其中所述R 1位于-As(O)基团的邻位和/或者对位。
  16. 根据权利要求11所述的用途，其中n是0。
  17. 根据权利要求10所述的用途，其中所述小分子化合物选自由以下化合物组成的组：
    Figure PCTCN2021084612-appb-100002
    Figure PCTCN2021084612-appb-100003
    Figure PCTCN2021084612-appb-100004
    Figure PCTCN2021084612-appb-100005
  18. 根据权利要求1或2所述的用途，其中所述客体是人或者哺乳动物。
  19. 根据权利要求1所述的用途，其中所述细胞内蛋白错误折叠相关疾病为帕金森氏病、路易体痴呆症、多系统萎缩症、包涵体肌炎症、额颞痴呆、亨廷顿疾病、多聚谷氨酰胺病、肌萎缩性侧索硬化症、或朊病毒疾病。
  20. 根据权利要求2所述的用途，其中所述溶酶体贮积病为鞘脂类代谢障碍、C型尼曼氏病、黏多糖病、糖原贮存病、糖蛋白贮积病、脂类储存疾病、翻译后修饰缺陷症、内在膜蛋白缺失失调症、神经元蜡样质脂褐质沉积病、或溶酶体相关细胞器紊乱症。
  21. 根据权利要求20所述的用途，其中所述鞘脂类代谢障碍为戈谢病。
  22. 根据权利要求1或2所述的用途，其进一步包括向需要其的客体施用第二试剂。
  23. 根据权利要求22所述的用途，其中所述第二试剂是用于治疗细胞内蛋白错误折叠相关疾病的试剂或者用于治疗溶酶体贮积病的试剂。
  24. 根据权利要求23所述的用途，其中所述PI4KIIIα特异性抑制剂在所述第二试剂之前、之后或同时施用。
  25. 一种筛选用于预防或治疗细胞内蛋白错误折叠相关疾病的药物的方法，包括将备选药物与PI4KIIIα蛋白或者核酸或者PI4KIIIα或者PI4KIIIα蛋白复合体接触，并检测备选药物是否能够抑制PI4KIIIα的形成或者活性，或者PI4KIIIα蛋白复合体的形成、稳定性、活性、或者其在细胞膜上的定位。
  26. 一种筛选用于预防或治疗溶酶体贮积病的药物的方法，包括将备选药物与PI4KIIIα蛋白或者核酸或者PI4KIIIα或者PI4KIIIα蛋白复合体接触，并检测备选药物是否能够抑制PI4KIIIα的形成或者活性、或者PI4KIIIα蛋白复合体的形成、稳定性、活性或者其在细胞膜上的定位。
  27. 根据权利要求25和26中所述的方法，其中所述PI4KIIIα蛋白复合体是指由PI4KIIIα与Efr3a/Efr3b、TTC7A/TTC7B、FAM126A/FAM126B或者它们的同源蛋白所组成的蛋白复合体。
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