WO2021201277A1 - 蛋白質の脱アミド方法 - Google Patents

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deamidation
enzyme
reaction
salts
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啓太 奥田
杏匠 酒井
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Amano Enzyme USA Co Ltd
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Amano Enzyme Inc
Amano Enzyme USA Co Ltd
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/01—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in linear amides (3.5.1)
    • C12Y305/01044—Protein-glutamine glutaminase (3.5.1.44)

Definitions

  • the present invention relates to deamidation of proteins. More specifically, the present invention relates to a protein deamidation method and its use, a protein improver used in a protein deamidation method, and the like.
  • the deamidation reaction by protein deamidation enzyme is an enzymatic reaction, the reaction may be insufficient due to the influence of conditions such as substrate and reaction temperature. In other words, because it is an enzymatic reaction, the desired effect (improvement of protein functionality by deamidation, etc.) may not be obtained. Therefore, it is an object of the present invention to provide a method for promoting a deamidation reaction by a protein deamidating enzyme.
  • a method for deamidating a protein which comprises allowing a protein deamidating enzyme to act on a protein in the presence of salts and / or polysaccharides.
  • the protein improver according to [6] wherein the salts are phosphates, polyphosphates or citrates.
  • a method for producing a deamidated protein which comprises the following steps: (1) A step of preparing a solution containing a protein and salts and / or polysaccharides, (2) A step of treating the prepared solution with a protein deamidating enzyme.
  • a method for producing a food or pharmaceutical product which comprises the following steps: (1) A step of preparing a food raw material or a pharmaceutical raw material containing a protein, and a solution containing a salt and / or a polysaccharide. (2) A step of treating the prepared solution with a protein deamidating enzyme. [12] The production method according to [10] or [11], wherein the salts are at least one selected from the group consisting of carbonates, phosphates, hydrogen phosphates, polyphosphates, and citrates. .. [13] The production method according to any one of [10] to [12], wherein the polysaccharide is gellan gum.
  • Results of measuring the reaction efficiency of deamidation by reacting Z-Gln-Gly with protein glutaminase using a solution containing disodium hydrogen phosphate supplemented with sodium dihydrogen phosphate or sodium carbonate It is a figure which shows. It is a figure which shows the result of having measured the reaction effect of deamidation by reacting various substrate proteins with protein glutaminase using the solvent which added sodium carbonate supplement to the solution containing disodium hydrogen phosphate. It is a figure which shows the result of having measured the thermal stability of protein glutaminase in the solvent which supplemented and added sodium carbonate to the solution containing disodium hydrogen phosphate.
  • the first aspect of the present invention relates to a method for deamidating a protein (protein deamidation method).
  • the protein deamidation reaction is promoted by treating the protein raw material with a protein deamidating enzyme in the presence of salts and / or polysaccharides.
  • the protein (substrate protein) subjected to the enzyme treatment in the present invention is not particularly limited as long as it is affected by the above-mentioned enzyme, and there are no particular restrictions on its origin, properties, etc., and it is a vegetable protein or an animal protein. , A protein derived from fungi, a protein derived from algae, or the like.
  • Vegetable proteins are derived from beans such as soy beans, green peas, Lentils, chickpeas, black beans, and fava beans. Proteins, wheat, barley, swallow (Oat), rye, rice and other grain-derived proteins; almonds, peanuts and other nut-derived proteins; cannabis seeds (Hemp), chia seeds (Chia), Quinoa, amaranthus ( Examples include seed-derived proteins such as Amaranthus).
  • the animal protein may be derived from either a mammal or an insect.
  • protein derived from mammals include milk proteins such as casein and ⁇ -lactoglobulin; egg proteins such as ovalbumin; meat proteins such as myosin and actin; blood proteins such as serum albumin; tendon proteins such as gelatin and collagen. And so on.
  • Insect-derived proteins include, for example, cricket-derived proteins.
  • fungal-derived protein examples include yeast-derived protein, filamentous fungal-derived protein, fungal-derived protein (mushroom-derived mycoprotein, etc.) and the like.
  • the target of deamidation is preferably a plant protein and an animal protein, and more preferably a plant protein.
  • the substrate protein may be a chemically partially decomposed protein by an acid, an alkali or the like, an enzymatic partially decomposed protein by a protease or the like, a chemically modified protein by various reagents, a synthetic peptide or the like.
  • the substrate protein may be used alone or in combination of two or more.
  • the above-mentioned substrate proteins are subjected to the reaction in a solution, slurry or paste state, but the concentration thereof is not particularly limited, and the concentration is determined according to the desired properties and states of the target deamidated protein. do it. Moreover, not only an aqueous solution but also a solution, a slurry or a paste which became an emulsion with an oil and fat may be subjected to a reaction. Further, salts, sugars, proteins, fragrances, moisturizers, colorants and the like may be added to the substrate protein solution, slurry or paste, if necessary.
  • the salts used in the present invention are preferably water-soluble salts.
  • the type of water-soluble salts is not particularly limited, and for example, sulfates, hydrochlorides, nitrates, dioxides, phosphates, hydrogen phosphates, polyphosphates, thiosocyanates, thiosulfates, etc.
  • Inorganic salts such as carbonates and hydrogen carbonates; organic acid salts such as acetates, tartrates, citrates and sorbates.
  • the types of metal atoms constituting water-soluble salts are not particularly limited. For example, alkali metals such as sodium and potassium; alkaline earth metals such as magnesium and calcium; manganese, copper, zinc and the like. Other metals such as. Among these, alkali metals are preferable.
  • the polyphosphate may be linear, branched, or cyclic, but is preferably cyclic.
  • the degree of polymerization of the phosphoric acid of the polyphosphate is not particularly limited, and examples thereof include 2 to 1,000, preferably 3 to 100, more preferably 4 to 10, and even more preferably 5 to 7.
  • the polyphosphates hexametaphosphates are preferable.
  • the salts used in the present invention are preferably phosphates, hydrogen phosphates, polyphosphates, citrates, sorbates, and carbonates; more preferably potassium phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, Examples thereof include disodium hydrogen phosphate, sodium dihydrogen phosphate, trisodium phosphate, sodium polyphosphate, trisodium citrate, and sodium carbonate.
  • carbonate when carbonate is used as a salt, deamination of the substrate protein can be performed remarkably efficiently, and further, the thermal stability of the protein deamidating enzyme can be improved.
  • salts may be used alone or in combination of two or more.
  • An example of a combination of the two salts is a combination of a hydrogen phosphate salt and a carbonate.
  • the ratio thereof is not particularly limited, but for example, the amount of the carbonate is 4 to 46 parts by weight, preferably 15 to 1 part by weight of the hydrogen phosphate. 43 parts by weight, more preferably 20 to 41 parts by weight.
  • the polysaccharide used in the present invention is preferably a water-soluble polysaccharide.
  • the type of water-soluble polysaccharide is not particularly limited, and for example, starch, dextrin, dextran, cellulose, xylan, tamarind seed gum, guar gum, tara gum, locust bean gum, arabic gum, caraginan, gellan gum (gellan gum). , Xanthan gum, Karaya gum, pectin, polygalacturonic acid, alginic acid and the like.
  • These polysaccharides may be in the form of salts. Examples of the salt of the polysaccharide include alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt.
  • polysaccharides preferably acidic polysaccharides (polysaccharides having a carboxyl group in at least one of the constituent monosaccharides); more preferably caraginan, gellan gum, xanthan gum, karaya gum, pectin, polygalacturonic acid, alginic acid; Preferred is gellan gum.
  • the protein deamidating enzyme referred to in the present invention is an enzyme that deamids the amide groups of glutamine residues and asparagine residues in proteins, and examples thereof include the following. (1) An enzyme that deamidates glutamine residues in a protein and converts it into glutamic acid (for example, protein glutaminase). (2) An enzyme that deamidates asparagine residues in a protein and converts it into aspartic acid (for example, protein asparaginase). (3) An enzyme that deimidates an arginine residue in a protein and converts it into citrulline (for example, arginine deiminase, protein arginine deiminase, peptidyl arginine deiminase).
  • the deamidated protein has amphipathic properties and becomes an ideal surfactant, and the emulsifying power, emulsifying stability, foaming property, and foam stability of the protein are greatly improved.
  • deamidation of a protein brings about improvement of various functional properties of the protein, and the use of the protein is dramatically increased.
  • the hydrophobicity of the protein is increased and the higher-order structure of the protein is changed.
  • protein deamidases examples include Chryseobacterium, Flavobacterium, Empedobacter, Sphingobacterium, Aureobacterium or Miloides.
  • protein deamidating enzymes from the genus Myroides. These protein deamidating enzymes are disclosed in JP-A-2000-50887, JP-A-2001-218590, WO2006 / 075772 and the like.
  • enzyme that deamidates the side chain of glutamine residues in a protein include protein glutaminase derived from the genus Chryseobacterium.
  • enzymes that deamidates asparagine residues in proteins include the genus Luteimicrobium, the genus Agromyces, the genus Microbacterium, and the genus Leifsonia. Derived protein deamidating enzymes can be mentioned. These protein deamidating enzymes are disclosed, for example, in WO2015 / 133590.
  • arginine deiminase derived from the genus Fusarium.
  • the protein deamidating enzyme is disclosed in, for example, WO2008 / 00714.
  • protein deamidating enzymes examples include protein glutaminase, more preferably protein glutaminase derived from the genus Chryseobacterium, and further preferably protein glutaminase derived from Chryseobacterium proteolyticum.
  • the protein glutaminase derived from Chryseobacterium proteolyticum is commercially available as, for example, protein glutaminase "Amano" 500 (manufactured by Amano Enzyme Co., Ltd.), and the commercially available product can be used.
  • the protein deamidating enzyme may be an enzyme modified by a protein engineering method.
  • the protein deamidating enzyme one prepared from a culture solution of a microorganism producing the protein deamidating enzyme can be used.
  • the microorganism used for the preparation of the protein deamidating enzyme is not particularly limited, but is a microorganism producing the enzyme, for example, Chryseobacterium, Flavobacterium, Empedobacter, Sphingobacterium, Aureo. Microorganisms belonging to the genus Bacterium or the genus Chryseobacterium can be used. Further, a microorganism into which a protein deamidating enzyme gene has been introduced by genetic engineering may be used. As a specific example of a microorganism suitable for preparing a protein deamidating enzyme, Chryseobacterium sp. No. 9670 belonging to the genus Chryseobacterium can be mentioned.
  • a protein deamidating enzyme can be obtained from the culture solution or cells of the above microorganisms. That is, if it is a secretory protein, it can be recovered from the culture solution, and if it is not, it can be recovered from the cells.
  • known protein separation and purification methods centrifugation, UF concentration, salting out, various chromatographys using ion exchange resins, etc.
  • the culture solution can be centrifuged to remove bacterial cells, and then salting out, chromatography and the like can be combined to obtain the desired enzyme.
  • the target enzyme When the enzyme is recovered from the cells, the target enzyme can be obtained by, for example, crushing the cells by pressure treatment, ultrasonic treatment, or the like, and then separating and purifying in the same manner as described above. In addition, after collecting the bacterial cells from the culture solution in advance by filtration, centrifugation or the like, the above series of steps (crushing, separation, purification of the bacterial cells) may be performed.
  • the enzyme may be pulverized by a drying method such as freeze-drying or vacuum-drying, and at that time, an appropriate excipient or drying aid may be used.
  • the protein deamidating enzyme used in the present invention is preferably purified and has high purity, but it may have any purity as long as it catalyzes a desired reaction. Further, those enzyme preparations may be those to which various salts, sugars, proteins, lipids and surfactants are added as enzyme stabilizers.
  • the enzyme activity of protein glutaminase is measured by the method described below using Z-Gln-Gly (Benzyloxycarbonyl-L-glutaminylglycine) as a substrate.
  • Z-Gln-Gly Benzyloxycarbonyl-L-glutaminylglycine
  • ⁇ Activity measurement method Add 10 ⁇ l of enzyme solution to 100 ⁇ l of 176 mmol / l phosphate buffer (pH 6.5) containing 10 mmol / l Z-Gln-Gly, incubate at 37 ° C for 60 minutes, and then add 100 ⁇ l of 12% trichloroacetic acid solution. Stop the reaction.
  • the supernatant is measured using the Ammonia Assay Kit (manufactured by Sigma-Aldrich) as follows (A1). Separately, use water instead of the enzyme solution and measure in the same manner (A2). Add 10 ⁇ l of supernatant and 190 ⁇ l of water to 100 ⁇ l of F-kit ammonia reagent 2, leave at room temperature for 5 minutes, and then measure the absorbance (E1) at 340 nm using 100 ⁇ l.
  • Deamidation of proteins is performed by incubating a reaction solution containing proteins, salts and / or polysaccharides, and protein deamidating enzymes.
  • the conditions for treatment with the protein deamidating enzyme are not particularly limited, and the protein concentration, reaction temperature, reaction pH, reaction time, and salt addition amount are not particularly limited throughout the preliminary experiment.
  • the optimum reaction conditions may be set according to the enzyme to be used by adjusting (when adding salts), the amount of polysaccharide added (when adding polysaccharide), the amount of enzyme added (enzyme concentration), and the like.
  • the protein mass is 0.1 to 30% by weight, preferably 0.5 to 20% by weight, and more preferably 0.9 to 11% by weight in the reaction solution.
  • the amount of the enzyme is 0.01 to 1000 U, preferably 0.1 to 100 U, more preferably 0.5 to 20 U, still more preferably 1 to 10 U for the deamidating enzyme with respect to 1 g of the protein.
  • the amount of salts in the reaction solution is 0.01 to 20% (W / V%), preferably 0.05 to 15% (W / V%), and more preferably 0.1 to 11% (W / V%).
  • the amount of polysaccharide is 0.001 to 10% (W / V%), preferably 0.005 to 5% (W / V%), and more preferably 0.01 to 1% (W / V%) in the reaction solution.
  • the reaction temperature is 5 to 80 ° C., preferably 20 to 70 ° C., more preferably 30 to 60 ° C.
  • the pH of the reaction solution is 2-10, preferably 4-8.
  • the reaction time is 10 seconds to 48 hours, preferably 10 minutes to 24 hours, more preferably 30 minutes to 12 hours, still more preferably 30 minutes to 4 hours. Under the above reaction conditions, a deamidated protein can be obtained.
  • the conditions for these reactions are appropriately selected according to the physical characteristics of the protein, the salts to be used, the polysaccharide, and the protein deamidating enzyme. The optimum reaction conditions may be determined through preliminary experiments.
  • the present invention also provides a method for producing a deamidated protein and a method for producing a food or pharmaceutical product containing the deamidated protein.
  • a typical aspect of the method for producing a deamidated protein includes the following steps (1) and (2).
  • a step of inactivating the protein deamidating enzyme may be added after the step (2).
  • the specific conditions of the following steps (1) and (2) are as described in the column of "1.1. Protein deamidation method" above. (1) A step of preparing a solution containing a protein and salts and / or polysaccharides, (2) A step of treating the prepared solution with a protein deamidating enzyme.
  • a typical aspect of a method for producing a food or a pharmaceutical product includes the following steps (1) and (2).
  • a step of inactivating the protein deamidating enzyme may be added after the step (2).
  • the specific conditions of the following steps (1) and (2) are as described in the column of "1.1. Protein deamidation method" above.
  • a step of treating the prepared solution with a protein deamidating enzyme is described in the column of "1.1. Protein deamidation method" above.
  • a solution prepared by adding salts and / or polysaccharides to vegetable milk prepared using vegetable protein can be mentioned.
  • the deamidated protein produced by the method of the present invention has commercial value by itself. On the other hand, it is also useful as a material or material for various foods and beverages. Therefore, the present application also provides a food or beverage containing the deamidated protein obtained by the production method of the present invention.
  • the foods and beverages here are not particularly limited.
  • Examples of foods and beverages include processed marine products (chikuwa, kamaboko, hampen, sakiika, dried food, salted fish, fish sausage, boiled fish, canned food, etc.), processed meat products (ham, bacon, sausage, jerky, conbeef, molded meat, etc.) Etc.), processed vegetable products (canned vegetables / bottled products, processed tomato products, processed mushroom products, pickled vegetables, dried vegetables, boiled vegetables, etc.), noodles / breads (various noodles, bread, sweet bread, etc.), processed grain products (etc.) Cereals, oatmeal, museley, processed rice products, fu, barley tea, etc.), dairy products (milk, processed milk, milk drinks, concentrated milk, powdered milk, condensed milk, fermented milk, lactic acid bacteria drinks, yogurt, butter, cheese, ice cream, etc.
  • processed marine products chikuwa, kamaboko, hampen, sakiika, dried food, salted fish, fish sausage, boiled fish, canned food, etc
  • Processed fruit products (canned fruit / bottled, jam, marmalade, dried fruits, etc.), confectionery / desserts (biscuits, baked confectionery, rice confectionery, oil confectionery, Japanese confectionery, Western confectionery, semi-raw confectionery, Japanese dried confectionery, candy , Chocolates, chewing gum, snacks, jelly, cold drinks, etc.), beverages (soft drinks, carbonated beverages, fruit juice beverages, coffee beverages, vegetable juice beverages, tea beverages, non-alcoholic beverages, alcoholic beverages, etc.), seasonings (Dare, soup, dressing, sauce, etc.), soups, tofu, noodles, breads, alternative meat / dairy products (alternative cheese, alternative milk fermented foods), ruu (curry roux, stew ruu, etc.), nutritional supplements Foods and beverages (protein powders, protein beverages, supplements, nutritional drinks, etc.), pet animal foods, and pet animal nutritional supplements. Furthermore, it is used in a wide range of industries including cosmetics, medical products, materials for microcapsules, carriers such as
  • the present invention also provides a protein improver that can be used for deamidation of proteins.
  • the protein improver of the present invention is typically used in the protein deamidation method, the deamidation protein production method, or the food or pharmaceutical production method of the present invention.
  • the protein improver of the present invention contains salts and / or polysaccharides as active ingredients in addition to the protein deamidating enzyme. Since the details of the protein deamidating enzyme, salts and polysaccharides are as described above, the description thereof will be omitted.
  • the content of the protein deamidating enzyme is 1 to 2000 U, preferably 10 to 1500 U, and more preferably 50 to 1000 U per 1 g of the pharmaceutical product.
  • the content of salts is 0.1 to 10 g, preferably 0.2 to 9 g, and more preferably 0.5 to 8 g per 1 U of protein deamidating enzyme.
  • the amount of polysaccharide is 0.01 to 10 mg, preferably 0.05 to 5 mg, and more preferably 0.1 to 1 mg per 1 U of protein deamidating enzyme.
  • the final form of the protein improver may be liquid or solid (including powder). In addition to the active ingredient, the protein improver may contain excipients, buffers, suspensions, stabilizers, preservatives, preservatives, physiological saline and the like.
  • the ammonia liberated by protein glutaminase was quantified as follows.
  • the reaction was stopped by treating the reaction solution at 85 ° C. for 10 minutes, 1 mL of the reaction solution was centrifuged (13,000 rpm, 10 min), and the obtained supernatant was diluted 100-fold with ultrapure water.
  • Ammonia was quantified using Kit (Sigma-Aldrich). The amount of enzyme was 7.5 U of protein glutaminase (final concentration) per 1 g of substrate protein.
  • the deamidation rate is calculated by dividing the amount of ammonia per 1 g of pea protein released by protein glutaminase by the amount of ammonia released by acid decomposition of 1 g of pea protein (reaction at 110 ° C for 24 hours in 6N hydrochloric acid (final concentration)). bottom.
  • the deamidation rate was measured by performing an enzymatic reaction under the same conditions as described above, except that sodium citrate was not added.
  • Example 2 It was investigated whether the deamidation reaction of protein glutaminase was promoted by the presence of inorganic salts. Same as Example 1 except that dipotassium hydrogen phosphate (DKP) 1.0% (W / V%) (final concentration) was used instead of sodium citrate 0.5% (W / V%) (final concentration). The reaction and evaluation were carried out by the method of. For comparison, the deamidation rate was measured by performing an enzymatic reaction under the same conditions as described above, except that dipotassium hydrogen phosphate was not added.
  • DKP dipotassium hydrogen phosphate
  • Example 3 The effects of the treated pH and the concentration of the inorganic salts were investigated with respect to the effect of promoting the deamidation reaction by the inorganic salts. Performed except that the pea protein was changed (in this example, the product name: PURIS Pea Protein 870, manufactured by PURIS Foods) was changed, and the treated pH and the concentration of dipotassium hydrogen phosphate (DKP) were changed. The reaction and evaluation were carried out in the same manner as in Example 2. The pH was adjusted using hydrochloric acid or sodium hydroxide.
  • Example 4 We investigated whether the deamidation reaction of protein glutaminase was promoted by the presence of polysaccharides.
  • the pea protein was changed (in this example, product name: PURIS Pea Protein 870, manufactured by PURIS Foods), and gellan gum 0.02% instead of sodium citrate 0.5% (W / V%) (final concentration).
  • the reaction and evaluation were carried out in the same manner as in Example 1 except that (W / V%) (final concentration) was used.
  • the deamidation rate was measured by performing an enzymatic reaction under the same conditions as described above, except that gellan gum was not added.
  • Example 5 It was investigated whether the deamidation reaction of protein glutaminase is promoted by the coexistence of polysaccharides and inorganic salts.
  • the deamidation rate was measured by performing an enzymatic reaction under the same conditions as described above, except that neither gellan gum nor DKP was added.
  • DKP dipotassium hydrogen phosphate
  • Example 7 A reaction of Z-Gln-Gly (Benzyloxycarbonyl-L-glutaminylglycine) with protein glutaminase was carried out using a solvent supplemented with sodium dihydrogen phosphate or sodium carbonate to a solution containing disodium hydrogen phosphate. The effect of supplemental addition of sodium hydrogen hydrogen or sodium carbonate on the reaction efficiency of deamidation was evaluated. Specifically, Z-Gln-Gly (final concentration 60 mM) was added to McKilvine buffer (pH 7.0, containing 16.5 mM disodium hydrogen phosphate and 1.8 mM citric acid), and then dihydrogen phosphate.
  • McKilvine buffer pH 7.0, containing 16.5 mM disodium hydrogen phosphate and 1.8 mM citric acid
  • a solution was prepared by supplementing with sodium or sodium carbonate (additional final concentration 0 to 1.0 M) and adjusting the pH to 7.0.
  • To this solution was added 0.1 ml of an enzyme solution containing 0.13 U / ml of protein glutaminase (product name: protein glutaminase "Amano" 500, manufactured by Amano Enzyme Co., Ltd.), and the mixture was reacted at 37 ° C. for 20 minutes. Then, 1.0 ml of 0.4 M trichloroacetic acid solution was added to stop the reaction.
  • the amount of ammonia liberated by protein glutaminase was measured using an ammonia measurement kit (product name: Ammonia Test Wako, manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • Ammonia Test Wako manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • Sodium dihydrogen phosphate or sodium carbonate supplementation Sodium dihydrogen phosphate or sodium carbonate, with 100% free ammonia under conditions without addition (ie, containing only 16.5 mM disodium hydrogen phosphate as salts)
  • the relative value of the amount of free ammonia when sodium was supplemented and added was determined.
  • Example 8 The reaction efficiency of deamidation was evaluated by reacting various substrate proteins with protein glutaminase using a solvent supplemented with sodium carbonate to a solution containing disodium hydrogen phosphate.
  • a solvent supplemented with sodium carbonate to a solution containing disodium hydrogen phosphate.
  • McKilvine buffer pH 7.0, containing 16.5 mM disodium hydrogen phosphate and 1.8 mM citric acid
  • egg albumin egg albumin, milk casein, chick bean protein, pea protein, soy protein, or wheat gluten.
  • sodium carbonate final concentration 0.5 M
  • Example 9 The thermal stability of protein glutaminase was evaluated using a solvent supplemented with sodium carbonate to a solution containing disodium hydrogen phosphate. Specifically, sodium carbonate (final concentration 1.0 M) was supplementarily added to McKilvine buffer (pH 7.0, containing 41.2 mM disodium hydrogen phosphate and 4.4 mM citric acid) to adjust the pH to 7.0. Add protein glutaminase (product name: protein glutaminase "Amano" 500, manufactured by Amano Enzyme Co., Ltd.) to the solution at 0.13 U / ml, and incubate at 50 ° C for 120 minutes or 60 ° C for 60 minutes to obtain protein.
  • product name: protein glutaminase "Amano" 500 manufactured by Amano Enzyme Co., Ltd.
  • the activity of glutaminase was measured over time.
  • the activity of protein glutaminase was carried out by the method described above.
  • the residual activity value of protein glutaminase was determined by setting the activity value of protein glutaminase before incubation as 100%. For comparison, the test was conducted under the same conditions as above, except that 1.0 M sodium carbonate was not added, and the activity of protein glutaminase was measured over time.
  • the deamidation reaction can be promoted and the reaction efficiency can be expected to be improved.
  • the deamidated protein obtained by the present invention has commercial value by itself, and can also be used as a material or material for various foods, beverages or pharmaceuticals. That is, the present invention is expected to be used and applied particularly in the fields of food / beverage and pharmaceuticals.

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Abstract

蛋白質脱アミド酵素による脱アミド反応の促進を図ることを課題とする。　本発明は、塩類又は多糖類存在下で蛋白質脱アミド酵素を蛋白質に作用させることで脱アミド反応の促進を図る。本発明によれば反応効率の向上が望める。特にエンドウ蛋白質等の植物性蛋白質の脱アミド化に本発明は有用である。本発明を適用して得られた脱アミド蛋白質（特に脱アミド植物性蛋白質）は、様々な食品または飲料に使用することができる。

Description

蛋白質の脱アミド方法
　本発明は蛋白質の脱アミド化に関する。詳しくは、蛋白質の脱アミド方法及びその用途、蛋白質の脱アミド方法に利用される蛋白質改良剤等に関する。
　近年の健康志向の高まりを背景として、植物蛋白質等の需要は大幅に増加している。一方、蛋白質脱アミド酵素による蛋白質の脱アミド化は、蛋白質の溶解性を向上させ、乳化剤、起泡剤としての機能性を付与するため、食品や飲料を含む様々な用途での利用が期待されている（例えば特許文献１を参照）。
特開２０００－５０８８７号公報
　蛋白質脱アミド酵素による脱アミド反応は酵素反応であることから、基質や反応温度等の条件に影響を受け、反応が不十分になることがある。言い換えれば、酵素反応であるが故に、望んだ効果（脱アミド化による蛋白質の機能性向上等）が得られない場合がある。そこで、本発明は、蛋白質脱アミド酵素による脱アミド反応を促進する方法を提供することを課題とする。
　本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、塩類及び／又は多糖類の存在下で蛋白質脱アミド酵素を作用させると蛋白質の架橋反応が促進されることを見出し、以下に示す本発明を完成するに至った。
　［１］塩類及び／又は多糖類存在下で蛋白質脱アミド酵素を蛋白質に作用させることを特徴とする、蛋白質脱アミド方法。
　［２］塩塩類が炭酸塩、リン酸塩、リン酸水素塩、ポリリン酸塩、及びクエン酸塩よりなる群から選択される少なくとも１種である、［１］に記載の蛋白質脱アミド方法。
　［３］多糖類がゲランガムである、［１］又は［２］に記載の蛋白質脱アミド方法。
　［４］蛋白質脱アミド酵素がプロテイングルタミナーゼである、［１］～［３］のいずれか一項に記載の蛋白質脱アミド方法。
　［５］蛋白質が植物性蛋白質及び／又は動物性蛋白質である、［１］～［４］のいずれか一項に記載の蛋白質脱アミド方法。
　［６］塩類及び／又は多糖類、並びに蛋白質脱アミド酵素を含有する蛋白質改良剤。
　［７］塩類がリン酸塩、ポリリン酸塩又はクエン酸塩である、［６］に記載の蛋白質改良剤。
　［８］多糖類がゲランガムである、［６］又は［７］に記載の蛋白質改良剤。
　［９］蛋白質脱アミド酵素がプロテイングルタミナーゼである、［６］～［８］のいずれか一項に記載の蛋白質改良剤。
　［１０］以下の工程を含む、脱アミド蛋白質の製造方法：
　（１）蛋白質、並びに塩類及び／又は多糖類を含む溶液を用意する工程、
　（２）用意した溶液を蛋白質脱アミド酵素で処理する工程。
　［１１］以下の工程を含む、食品又は医薬の製造方法：
　（１）蛋白質を含む食品原料又は医薬原料、並びに塩類及び／又は多糖類を含む溶液を用意する工程、
　（２）用意した溶液を蛋白質脱アミド酵素で処理する工程。
　［１２］塩類が炭酸塩、リン酸塩、リン酸水素塩、ポリリン酸塩、及びクエン酸塩よりなる群から選択される少なくとも１種である、［１０］又は［１１］に記載の製造方法。
　［１３］多糖類がゲランガムである、［１０］～［１２］のいずれか一項に記載の製造方法。
　［１４］蛋白質脱アミド酵素がプロテイングルタミナーゼである、［１０］～［１３］のいずれか一項に記載の製造方法。
　［１５］蛋白質が植物性蛋白質及び／又は動物性蛋白質である、［１０］～［１４］のいずれか一項に記載の製造方法。
リン酸水素二ナトリウムを含む溶液に、リン酸二水素ナトリウム又は炭酸ナトリウムを補充添加した溶媒を用いて、Z-Gln-Glyとプロテイングルタミナーゼの反応を行い、脱アミド化の反応効率を測定した結果を示す図である。 リン酸水素二ナトリウムを含む溶液に、炭酸ナトリウムを補充添加した溶媒を用いて、各種基質蛋白質とプロテイングルタミナーゼの反応を行い、脱アミド化の反応効を測定した結果を示す図である。 リン酸水素二ナトリウムを含む溶液に、炭酸ナトリウムを補充添加した溶媒中で、プロテイングルタミナーゼの熱安定性を測定した結果を示す図である。
１．蛋白質の脱アミド方法
　本発明の第１の局面は蛋白質を脱アミド化する方法（蛋白質脱アミド方法）に関する。本発明では蛋白質原料を塩類及び／又は多糖類の存在下、蛋白質脱アミド酵素で処理することによって蛋白質脱アミド反応の促進を図る。
　本発明において酵素処理に供される蛋白質（基質蛋白質）は、上記酵素の作用を受けるものであれば特に限定されず、その起源、性状等に特段の制約はなく、植物性蛋白質、動物性蛋白質、菌類由来の蛋白質、藻類由来の蛋白質などのいずれであってもよい。
　植物性蛋白質としては、たとえば、大豆（Soy beans）、えんどう豆（Green peas）、レンズ豆（Lentils）、ひよこ豆（Chickpeas）、黒豆（Black beans）、そら豆（Fava bean）等の豆類由来の蛋白質、小麦、大麦、燕麦（Oat）、ライ麦、米などの穀類由来の蛋白質；アーモンド、ピーナッツ等のナッツ由来の蛋白質；大麻種子（Hemp）、チア種子（Chia）、キア（Quinoa）、アマランサス（Amaranthus）などの種子類由来の蛋白質などがその例として挙げられる。
　動物性蛋白質としては、哺乳動物由来または昆虫由来のいずれであってもよい。哺乳動物由来の蛋白質としては、たとえば、カゼイン、β－ラクトグロブリンなどの乳蛋白；オボアルブミンなどの卵蛋白；ミオシン、アクチンなどの肉蛋白；血清アルブミンなどの血液蛋白；ゼラチン、コラーゲンなどの腱蛋白質などが挙げられる。また、昆虫由来の蛋白質としては、たとえば、コオロギ由来蛋白質などが挙げられる。
　菌類由来の蛋白質としては、例えば、酵母由来蛋白質、糸状菌由来蛋白質、真菌類由来蛋白質（キノコ由来のマイコプロテインなど）などが挙げられる。
　これらの基質蛋白質の中でも、脱アミド化の対象として、好ましくは、植物性蛋白質及び動物性蛋白質、より好ましくは植物性蛋白質が挙げられる。
　また、基質蛋白質は、酸、アルカリなどによる化学的部分分解蛋白質、プロテアーゼなどによる酵素的部分分解蛋白質、各種試薬による化学修飾蛋白質、或いは合成ペプチド等であってもよい。
　基質蛋白質は、１種単独で使用してもよく、２種以上を組み合わせて使用してもよい。
　以上のような基質蛋白質は、溶液またはスラリーあるいはペースト状態で反応に供されるが、その濃度は特に限定されるものではなく、目的の脱アミド蛋白質の望まれる性状、状態に応じて濃度を決定すればよい。また、水溶液に限らず、油脂とのエマルジョンになった、溶液、スラリー又はペーストを反応に供してもよい。更に、基質蛋白質の溶液、スラリー又はペーストに、必要に応じて塩類、糖類、蛋白質、香料、保湿剤、着色料などが添加されていてもよい。
　本発明で用いられる塩類は、水溶性の塩類であることが好ましい。水溶性の塩類の種類については特に限定されるものではなく、たとえば、硫酸塩、塩酸塩、硝酸塩、二酸化塩、リン酸塩、リン酸水素塩、ポリリン酸塩、チオシアン酸塩、チオ硫酸塩、炭酸塩、炭酸水素塩などの無機塩；酢酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、ソルビン酸塩などの有機酸塩が挙げられる。また、水溶性の塩類を構成する金属原子の種類については、特に限定されるものではなく、たとえば、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属；マグネシウム、カルシウムなどのアルカリ土類金属；マンガン、銅、亜鉛などのその他の金属などが挙げられる。これらの中でも、アルカリ金属が好ましい。
　また、塩類の内、ポリリン酸塩については、直鎖状、分岐状、又は環状のいずれであってもよいが、好ましくは環状である。また、ポリリン酸塩のリン酸の重合度については、特に限定されないが、例えば2～1,000、好ましくは3～100、より好ましくは4～10、さらに好ましくは5～7が挙げられる。ポリリン酸塩の中でも、好ましくはヘキサメタリン酸塩が挙げられる。
　本発明で用いられる塩類として、好ましくは、リン酸塩、リン酸水素塩、ポリリン酸塩、クエン酸塩、ソルビン酸塩、及び炭酸塩；更に好ましくは、リン酸カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸三ナトリウム、ポリリン酸ナトリウム、クエン酸三ナトリウム、炭酸ナトリウムが挙げられる。とりわけ、塩類として炭酸塩を使用した場合には、基質蛋白質の脱アミノ化を格段効率的に行うことができ、更に、蛋白質脱アミド酵素の熱安定性を向上させることもできる。
　これらの塩類は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。2種の塩類の組み合わせの一例として、リン酸水素塩と炭酸塩との組み合わせが挙げられる。リン酸水素塩と炭酸塩とを組み合わせて使用する場合、これらの比率については、特に限定されないが、例えば、リン酸水素塩１重量部当たり、炭酸塩が4～46重量部、好ましくは15～43重量部、より好ましくは20～41重量部が挙げられる。
　本発明で用いられる多糖類は、水溶性の多糖類であることが好ましい。水溶性の多糖類の種類については特に限定されるものではなく、例えば、澱粉、デキストリン、デキストラン、セルロース、キシラン、タマリンドシードガム、グァーガム、タラガム、ローカストビーンガム、アラビアガム、カラギナン、ゲランガム（ジェランガム）、キサンタンガム、カラヤガム、ペクチン、ポリガラクツロン酸、アルギン酸などが挙げられる。これらの多糖類は塩の形態であってもよい。多糖類の塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩などが挙げられる。
　これらの多糖類の中でも、好ましくは、酸性多糖類（構成単糖の少なくとも１つにカルボキシル基を有する多糖）；より好ましくは、カラギナン、ゲランガム、キサンタンガム、カラヤガム、ペクチン、ポリガラクツロン酸、アルギン酸；より好ましくは、ゲランガムが挙げられる。
　本発明でいう蛋白質脱アミド酵素は、蛋白質中のグルタミン残基及びアスパラギン残基のアミド基を脱アミドする酵素であり、例えば以下のものが挙げられる。
　（１）蛋白質中のグルタミン残基を脱アミド化し、グルタミン酸に変換する酵素（例えばプロテイングルタミナーゼ）。
　（２）蛋白質中のアスパラギン残基を脱アミド化し、アスパラギン酸に変換する酵素（例えばプロテインアスパラギナーゼ）。
　（３）蛋白質中のアルギニン残基を脱イミド化し、シトルリンに変換する酵素（例えば、アルギニンデイミナーゼ、プロテインアルギニンデイミナーゼ、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ）。
　一般に蛋白質中のグルタミン及びアスパラギン残基を脱アミド化し、カルボキシル基を生じさせると、その蛋白質の負電荷が増加し、その結果等電点が低下、水和力が増加する。さらに静電反撥力の上昇による蛋白質間の相互作用の低下すなわち会合性の低下がもたらされる。これらの変化により蛋白質の可溶性、水分散性は大きく増大する。また蛋白質の負電荷の増加は、その蛋白質の折りたたみをほぐし、高次構造を変化させ、分子内部に埋もれていた疎水性領域を分子表面に露出させる。したがって脱アミド化蛋白質は、両親媒性を有し理想的な界面活性剤となり、蛋白質の乳化力、乳化安定性、起泡性、泡沫安定性が大きく向上する。このように、蛋白質の脱アミド化は、蛋白質の様々な機能特性の向上をもたらし、その蛋白質の用途は飛躍的に増大する。また、蛋白質中のアルギニン残基を脱イミノ化した場合も、蛋白質の疎水性を増大させて、蛋白質の高次構造を変化させる。
　蛋白質脱アミド酵素の例として、クリセオバクテリウム（Chryseobacterium）属、フラボバクテリウム（Flavobacterium）属、エンペドバクター（Empedobacter）属、スフィンゴバクテリウム（Sphingobacterium）属、アウレオバクテリウム（Aureobacterium）属又はミロイデス（Myroides）属由来の蛋白質脱アミド酵素が挙げられる。これらの蛋白質脱アミド酵素は、特開２０００－５０８８７号公報、特開２００１－２１８５９０号公報、ＷＯ２００６／０７５７７２等に開示されている。
　また、蛋白質中のグルタミン残基の側鎖を脱アミドする酵素としては、具体的には、クリセオバクテリウム属由来のプロテイングルタミナーゼが挙げられる。
　また、蛋白質中のアスパラギン残基を脱アミドする酵素としては、具体的には、ルテイミクロビウム（Luteimicrobium）属、アグロマイセス（Agromyces）属、ミクロバクテリウム（Microbacterium）属、又はレイフソニア（Leifsonia）属由来の蛋白質脱アミド酵素を挙げることができる。これらの蛋白質脱アミド酵素は、例えばＷＯ２０１５／１３３５９０に開示されている。
　また、蛋白質中のアルギニン残基を脱イミノ化する酵素としては、具体的には、フザリウム（Fusarium）属由来のアルギニンデイミナーゼが挙げられる。当該蛋白質脱アミド酵素は、例えばＷＯ２００８／０００７１４に開示されている。
　これらの蛋白質脱アミド酵素として、好ましくはプロテイングルタミナーゼ、より好ましくはクリセオバクテリウム属由来のプロテイングルタミナーゼ、更に好ましくはクリセオバクテリウム・プロテオリティカム由来のプロテイングルタミナーゼが挙げられる。クリセオバクテリウム・プロテオリティカム由来のプロテイングルタミナーゼは、たとえば、プロテイングルタミナーゼ「アマノ」500（天野エンザイム株式会社製）として市販されており、当該市販品を使用することができる。
　また、蛋白質脱アミド酵素は、蛋白質工学的手法により修飾された酵素であってもよい。
　蛋白質脱アミド酵素は、蛋白質脱アミド酵素を産生する微生物の培養液より調製したものを用いることができる。蛋白質脱アミド酵素の調製に用いられる微生物は特に限定されないが、当該酵素を産生する微生物であって、例えば、クリセオバクテリウム属、フラボバクテリウム属、エンペドバクター属、スフィンゴバクテリウム属、アウレオバクテリウム属、又はミロイデス属に属する微生物を用いることができる。また、遺伝子工学によって蛋白質脱アミド酵素遺伝子を導入した微生物を用いても良い。蛋白質脱アミド酵素の調製に好適な微生物の具体例として、クリセオバクテリウム属に属するクリセオバクテリウム・エスピー（Chryseobacterium sp.）No.9670を挙げることができる。
　例えば、上記の微生物の培養液又は菌体より蛋白質脱アミド酵素を得ることができる。即ち、分泌型蛋白質であれば培養液より、それ以外であれば菌体内より回収することができる。培養液から蛋白質脱アミド酵素を調製する方法は、公知の蛋白質分離、精製方法（遠心分離、UF濃縮、塩析、イオン交換樹脂等を用いた各種クロマトグラフィー等）を用いることができる。例えば、培養液を遠心分離して菌体を除去し、その後塩析、クロマトグラフィー等を組み合わせて目的の酵素を得ることができる。菌体内から酵素を回収する場合には、例えば菌体を加圧処理、超音波処理などによって破砕した後、上記と同様に分離、精製を行うことにより目的の酵素を取得することができる。尚、ろ過、遠心処理などによって予め培養液から菌体を回収した後、上記一連の工程（菌体の破砕、分離、精製）を行ってもよい。酵素は凍結乾燥、減圧乾燥等の乾燥法により粉末化してもよいし、その際に適当な賦形剤、乾燥助剤を用いてもよい。
　本発明に用いる蛋白質脱アミド酵素は、精製された純度の高いものを利用することが望ましいが、所望の反応を触媒するのであればいかなる純度であっても良い。また、それらの酵素製剤は、酵素の安定化剤として各種の塩類、糖類、蛋白質、脂質、界面活性剤が添加されているものであってもよい。
　蛋白質脱アミド酵素の一つであるプロテイングルタミナーゼの酵素活性測定は、特に断りのない限りZ-Gln-Gly（Benzyloxycarbonyl-L-glutaminylglycine）を基質として以下に記載する方法で行われる。
＜活性測定法＞
　10mmol/l Z-Gln-Glyを含む176mmol/lリン酸緩衝液（pH6.5）100μlに酵素溶液10μlを添加して、37℃、60分間インキュベートした後、12％トリクロロ酢酸溶液100μlを加えて反応を停止する。遠心分離（15000rpm、４℃、５分間）した後、上清について以下のようにAmmonia Assay Kit（Sigma-Aldrich社製）を用いて測定する(A1)。別に酵素溶液の代わりに水を用いて同様にして測定する(A2)。F-kit ammonia 100μl試薬２に上清10μlと水190μlを加え室温で５分間放置後100μlを用いての340nmの吸光度(E1)を測定する。残りの200μlに、1.0μlの試薬３（グルタメートデヒドロゲナーゼ）を加えた後、更に20分間室温に放置した後に残りの200μlの340nmの吸光度(E2)を測定する。上記条件下で１分間あたり１μmolのアンモニアを遊離する酵素量を１単位とし、以下の式に従って求める。
　U/ml＝1.76×［A1(E1-E2)-A2(E1-E2)］
　蛋白質の脱アミドは、蛋白質、塩類及び／又は多糖類、並びに蛋白質脱アミド酵素を含む反応液をインキュベートすることにより行われる。
　本発明による効果、即ち、蛋白質の脱アミド反応が促進される限り、蛋白質脱アミド酵素による処理の条件は特に限定されず、予備実験を通して蛋白質濃度、反応温度、反応pH、反応時間、塩類添加量（塩類を添加する場合）、多糖類添加量（多糖類を添加する場合）及び酵素添加量（酵素濃度）等を調整し、使用する酵素に応じた最適な反応条件を設定すればよい。
　この例に限定されるわけではないが、蛋白質量は、反応溶液中に0.1～30重量％、好ましくは0.5～20％重量％、より好ましくは0.9～11重量％である。酵素量は蛋白質1gに対し脱アミド酵素が、0.01～1000U、好ましくは0.1～100U、より好ましくは0.5～20U、更に好ましくは1～10Uである。塩類量は、反応溶液中に0.01～20％（W/V％）、好ましくは0.05～15％（W/V％）、より好ましくは0.1～11％（W/V％）である。多糖類量は、反応溶液中に0.001～10％（W/V％）、好ましくは0.005～5％（W/V％）、より好ましくは0.01～1％（W/V％）である。反応温度は5～80℃、好ましくは20～70℃、より好ましくは30～60℃である。反応溶液のpHは2～10、好ましくは4～8である。反応時間は10秒～48時間、好ましくは10分～24時間、より好ましくは30分～12時間、更に好ましくは30分～4時間である。以上の反応条件によって、脱アミド化した蛋白質を得ることができる。これらの反応の条件は、蛋白質の物性や用いる塩類、多糖類、蛋白質脱アミド酵素に応じて適宜選択される。尚、最適な反応条件は予備実験を通して決定すればよい。
２．脱アミド蛋白質、又は脱アミド蛋白質を含む食品や医薬品の製造方法
　本発明の蛋白質脱アミド方法を用いれば脱アミド蛋白質、又はそれを含む食品や医薬品を製造することができる。そこで本発明は、脱アミド蛋白質の製造方法と、脱アミド蛋白質を含む食品又は医薬品の製造方法も提供する。脱アミド蛋白質の製造方法の典型的な一態様は、以下の工程（１）及び（２）を含む。尚、工程（２）の後に、蛋白質脱アミド酵素の失活工程を追加しても良い。以下の工程（１）及び（２）の具体的条件については、前記「１．１．蛋白質の脱アミド方法」の欄に記載の通りである。
　（１）蛋白質、並びに塩類及び／又は多糖類を含む溶液を用意する工程、
　（２）用意した溶液を蛋白質脱アミド酵素で処理する工程。
　一方、食品又は医薬の製造方法の典型的な一態様は、以下の工程（１）及び（２）を含む。尚、工程（２）の後に、蛋白質脱アミド酵素の失活工程を追加しても良い。以下の工程（１）及び（２）の具体的条件については、前記「１．１．蛋白質の脱アミド方法」の欄に記載の通りである。
　（１）蛋白質を含む食品原料又は医薬原料、並びに塩類及び／又は多糖類を含む溶液を用意する工程、
　（２）用意した溶液を蛋白質脱アミド酵素で処理する工程。
　前記（１）の工程で用意する溶液の一例として、植物性蛋白質を用いて調製された植物性ミルクに塩類及び／又は多糖類を添加したものが挙げられる。
　本発明の方法で製造される脱アミド蛋白質は、それ自体で商品的価値を有する。その一方で、様々な食品や飲料等の素材ないし材料としても有用である。そこで本願は、本発明の製造方法で得られた脱アミド蛋白質が配合された食品又は飲料も提供する。ここでの食品及び飲料は特に限定されない。食品及び飲料の例を挙げると、水産加工品（ちくわ、かまぼこ、はんぺん、さきいか、干物、塩辛、魚肉ソーセージ、佃煮、缶詰等）、食肉加工品（ハム、ベーコン、ソーセージ、ジャーキー、コンビーフ、成形肉等）、野菜加工品（野菜缶・瓶詰、トマト加工品、きのこ類加工品、野菜漬物、乾燥野菜、野菜つくだ煮等）、めん・パン類（各種めん、食パン、菓子パン等）、穀類加工品（シリアル、オートミール、ミューズリー、米加工品、麩、麦茶等）、酪農製品（牛乳、加工乳、乳飲料、濃縮乳、粉乳、練乳、はっ酵乳、乳酸菌飲料、ヨーグルト、バター、チーズ、アイスクリーム等）、果実加工品（果実缶・瓶詰、ジャム、マーマレード、ドライフルーツ等）、菓子・デザート類（ビスケット類、焼き菓子、米菓、油菓子、和生菓子、洋生菓子、半生菓子、和干菓子、キャンデー類、チョコレート類、チューインガム、スナック菓子、ゼリー、冷菓等）、飲料等（清涼飲料水、炭酸飲料、果汁飲料、珈琲飲料、野菜汁飲料、茶系飲料、ノンアルコール飲料、アルコール飲料等）、調味料（たれ、つゆ、ドレッシング、ソースなど）、スープ類、豆腐、麺類、パン類、植物原料の代替肉・代替乳製品（代替チーズ、代替乳発酵食品）、ルウ（カレールウ、シチュールウ等）、栄養補助食品・飲料（プロテインパウダー、プロテイン飲料、サプリメント、栄養ドリンク等）、愛玩動物用食品、愛玩動物用栄養補助食品である。更に、新規な蛋白質由来素材として化粧品、医療用品、マイクロカプセルの素材、固定化酵素等の坦体などを含む広範な産業に用いられる。
３．蛋白質改良剤
　本発明は更に、蛋白質の脱アミド化に使用できる蛋白質改良剤も提供する。本発明の蛋白質改良剤は、典型的には、本発明の蛋白質脱アミド方法、脱アミド蛋白質の製造方法、或いは食品又は医薬の製造方法に利用される。本発明の蛋白質改良剤は、蛋白質脱アミド酵素に加え、塩類及び／又は多糖類を有効成分として含む。蛋白質脱アミド酵素、塩類及び多糖類の詳細は上記の通りであるため、その説明を省略する。この例に限定されるわけではないが、蛋白質脱アミド酵素の含有量としては、製剤1g当たりに1～2000U、好ましくは10～1500U、より好ましくは50～1000Uである。塩類の含有量としては、蛋白質脱アミド酵素1U当たりに0.1～10g、好ましくは0.2～9g、より好ましくは0.5～8gである。多糖類量は、蛋白質脱アミド酵素1U当たりに0.01～10mg、好ましくは0.05～5mg、より好ましくは0.1～1mgである。また、蛋白質改良剤の最終的な形態は液体状であっても固体状（粉体状を含む）であってもよい。蛋白質改良剤は、有効成分の他、賦形剤、緩衝剤、懸濁剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水などを含有していてもよい。
　以下に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
＜実施例１＞
　プロテイングルタミナーゼの脱アミド化反応が塩類の存在によって促進されるか否かを検討するため、エンドウ蛋白質（製品名：NOW（登録商標） Sports Organic Pea Protein社製）を基質とした実験を用いた。精製水中に、エンドウ蛋白質10重量%（終濃度）、プロテイングルタミナーゼ（製品名：プロテイングルタミナーゼ「アマノ」500、天野エンザイム株式会社製）、クエン酸ナトリウム0.5%(W/V％)（終濃度）を混合し、塩酸又は水酸化ナトリウムを用いてpH7.5に調整後、52.5℃で1.5時間インキュベートし、反応させた。反応終了後、プロテイングルタミナーゼによって遊離したアンモニアを以下のように定量した。反応溶液を85℃、10分処理することで反応を停止させ、反応液1mLを遠心分離(13,000rpm, 10min)し、得られた上清を超純水にて100倍希釈したものについてAmmonia Assay Kit (Sigma-Aldrich)を用いてアンモニアを定量した。酵素量については、基質蛋白質1g当たり7.5Uのプロテイングルタミナーゼ（終濃度）とした。脱アミド化率はプロテイングルタミナーゼによって遊離したエンドウ蛋白質1gあたりのアンモニア量をエンドウ蛋白質1gの酸分解（6N塩酸（終濃度）中、110℃、24時間反応）によって遊離したアンモニア量で除算して算出した。また、比較のため、クエン酸ナトリウムを添加しなかったこと以外は、前記と同条件で酵素反応を行って脱アミド化率を測定した。
　結果を表１に示す。クエン酸ナトリウム存在下でプロテイングルタミナーゼを反応させることで、塩類非存在下に比べ、エンドウ蛋白質の脱アミド化率が有意に向上した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
＜実施例２＞
　プロテイングルタミナーゼの脱アミド化反応が無機塩類の存在によって促進されるか否かを検討した。クエン酸ナトリウム0.5%(W/V％)（終濃度）の代わりにリン酸水素二カリウム(DKP)1.0%(W/V％)（終濃度）を用いたこと以外は、実施例１と同様の方法にて反応及び評価を行った。また、比較のため、リン酸水素二カリウムを添加しなかったこと以外は、前記と同条件で酵素反応を行って脱アミド化率を測定した。
　結果を表２に示す。DKP存在下でプロテイングルタミナーゼを反応させることで、無機塩非存在下に比べ、エンドウ蛋白質の脱アミド化率が大きく向上した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
＜実施例３＞
　無機塩類による脱アミド化反応の促進効果に関して、処理pHと無機塩類濃度の影響を検討した。エンドウ蛋白質を変更したことと（本実施例では、製品名：PURIS Pea Protein 870、PURIS Foods社製を使用）、処理pH及びリン酸水素二カリウム(DKP)の濃度を変更したこと以外は、実施例２と同様の方法にて反応及び評価を行った。なお、pHの調整は、塩酸又は水酸化ナトリウムを用いて行った。
　結果を表３に示す。全てのpH条件（pH6.5～8.5）において、DKP濃度に関わらず、DKP非存在下に比べて、DKP存在下でプロテイングルタミナーゼによるエンドウ蛋白質の脱アミド化率が向上した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
＜実施例４＞
　プロテイングルタミナーゼの脱アミド化反応が多糖類の存在によって促進されるか否かを検討した。エンドウ蛋白質を変更したことと（本実施例では、製品名：PURIS Pea Protein 870、PURIS Foods社製を使用）、クエン酸ナトリウム0.5%(W/V％)（終濃度）の代わりにゲランガム0.02%(W/V％)（終濃度）を用いたこと以外、実施例１と同様の方法にて反応及び評価を行った。また、比較のため、ゲランガムを添加しなかったこと以外は、前記と同条件で酵素反応を行って脱アミド化率を測定した。
　結果を表４に示す。ゲランガム存在下でプロテイングルタミナーゼを反応させることで、ゲランガム非存在下に比べ、エンドウ蛋白質の脱アミド化率が大きく向上した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
＜実施例５＞
　プロテイングルタミナーゼの脱アミド化反応が多糖類及び無機塩類の共存によって促進されるか否かを検討した。ゲランガム0.02%(W/V％)（終濃度）に加えてリン酸水素二カリウム(DKP)1.0%(W/V％)（終濃度）も用いたこと以外、実施例４と同様の方法にて反応及び評価を行った。また、比較のため、ゲランガム及びDKPの双方を添加しなかったこと以外は、前記と同条件で酵素反応を行って脱アミド化率を測定した。
　結果を表５に示す。ゲランガム及びDKP存在下でプロテイングルタミナーゼを反応させることで、多糖類及びDKP非存在下に比べ、エンドウ蛋白質の脱アミド化率が大きく向上した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
＜実施例６＞
　プロテイングルタミナーゼの脱アミド化反応が多糖類及びポリリン酸の共存によって促進されるか否かを検討した。リン酸水素二カリウム(DKP)1.0%(W/V％)（終濃度）の代わりにポリリン酸ナトリウム（ヘキサメタリン酸ナトリウム）(SPP)0.5%(W/V％)（終濃度）を用いたこと以外、実施例５と同様の方法にて反応及び評価を行った。また、比較のため、ゲランガム及びSPPの双方を添加しなかったこと以外は、前記と同条件で酵素反応を行って脱アミド化率を測定した。
　結果を表６に示す。ゲランガム及びSPP存在下でプロテイングルタミナーゼを反応させることで、多糖類及びSPP非存在下に比べ、エンドウ蛋白質の脱アミド化率が大きく向上した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
＜実施例７＞
　リン酸水素二ナトリウムを含む溶液に、リン酸二水素ナトリウム又は炭酸ナトリウムを補充添加した溶媒を用いて、Z-Gln-Gly（Benzyloxycarbonyl-L-glutaminylglycine）とプロテイングルタミナーゼの反応を行い、リン酸二水素ナトリウム又は炭酸ナトリウムの補充添加が脱アミド化の反応効率に及ぼす影響を評価した。具体的には、マッキルバイン緩衝液（pH7.0、16.5mMのリン酸水素二ナトリウム及び1.8mMのクエン酸含有）に、Z-Gln-Gly（終濃度60 mM）を加え、更にリン酸二水素ナトリウム又は炭酸ナトリウム（追加分の終濃度0～1.0M）を補充し、pHを7.0に調整した溶液を準備した。この溶液に、プロテイングルタミナーゼ（製品名：プロテイングルタミナーゼ「アマノ」500、天野エンザイム株式会社製）を0.13U/ml含む酵素液0.1mlを添加し、37℃で20分間反応させた。その後、0.4 Mトリクロロ酢酸溶液1.0mlを添加し、反応を停止させた。次いで、プロテイングルタミナーゼによって遊離したアンモニア量をアンモニア測定キット（製品名：アンモニアテストワコー、富士フイルム和光純薬株式会社製）を用いて測定した。リン酸二水素ナトリウム又は炭酸ナトリウムの補充添加していない条件（即ち、塩類として16.5mMのリン酸水素二ナトリウムのみを含む場合）において遊離したアンモニア量を１００％として、リン酸二水素ナトリウム又は炭酸ナトリウムを補充添加した際の遊離したアンモニア量の相対値を求めた。
　結果を図１に示す。この結果、リン酸水素二ナトリウムを含む溶液に、リン酸二水素ナトリウム又は炭酸ナトリウムを補充添加した場合、リン酸二水素ナトリウム又は炭酸ナトリウムの濃度依存的に、脱アミノ化の反応効率が向上することが分かった。特に、リン酸水素ナトリウムを含む溶液に炭酸ナトリウムを補充添加した場合には、脱アミノ化の反応効率が格段に向上していことから、塩類として炭酸ナトリウムを単独で使用しても脱アミノ化の反応効率を向上させ得ることが明らかとなった。
＜実施例８＞
　リン酸水素二ナトリウムを含む溶液に、炭酸ナトリウムを補充添加した溶媒を用いて、各種基質蛋白質とプロテイングルタミナーゼの反応を行い、脱アミド化の反応効率を評価した。具体的には、マッキルバイン緩衝液（pH7.0、16.5mMのリン酸水素二ナトリウム及び1.8mMのクエン酸含有）に、卵アルブミン、ミルクカゼイン、ひよこ豆蛋白、エンドウ蛋白、大豆蛋白、又は小麦グルテン（終濃度1.0 W/V%）を加え、更に炭酸ナトリウム（終濃度0.5 M）を補充添加し、pHを7.0に調整した溶液を準備した。この溶液に、プロテイングルタミナーゼ（製品名：プロテイングルタミナーゼ「アマノ」500、天野エンザイム株式会社製）を0.13U/ml含む酵素液0.1mlを添加し、37℃で20分間反応させた。その後、0.4 Mトリクロロ酢酸溶液1.0mlを添加し、反応を停止させた。次いで、プロテイングルタミナーゼによって遊離したアンモニア量をアンモニア測定キット（製品名：アンモニアテストワコー、富士フイルム和光純薬株式会社製）を用いて測定した。炭酸ナトリウムの補充添加していない条件（即ち、塩類として16.5mMのリン酸水素二ナトリウムのみを含む場合）でも同様の測定を行い、当該条件で遊離したアンモニア量を１００として、炭酸ナトリウムを補充添加した際の遊離したアンモニア量の相対値を求めた。
　結果を図２に示す。この結果、リン酸水素二ナトリウムを含む溶液に0.5 Mの炭酸ナトリウムを補充添加すると、プロテイングルタミナーゼによる基質蛋白質の脱アミノ化が促進されることが分かった。また、塩類を添加した反応系において、植物性蛋白質及び動物性蛋白質のいずれに対しても、プロテイングルタミナーゼによる脱アミノ化反応は促進され、特に、植物性蛋白質に対しては脱アミノ化反応の促進効果が格段に高いことも明らかとなった。
＜実施例９＞
　リン酸水素二ナトリウムを含む溶液に、炭酸ナトリウムを補充添加した溶媒を用いて、プロテイングルタミナーゼの熱安定性を評価した。具体的には、マッキルバイン緩衝液（pH7.0、41.2mMのリン酸水素二ナトリウム及び4.4mMのクエン酸含有）に、炭酸ナトリウム（終濃度1.0 M）を補充添加し、pHを7.0に調整した溶液に、プロテイングルタミナーゼ（製品名：プロテイングルタミナーゼ「アマノ」500、天野エンザイム株式会社製）を0.13U/mlとなるように添加し、50℃で120分間、又は60℃で60分間インキュベートし、プロテイングルタミナーゼの活性を経時的に測定した。プロテイングルタミナーゼの活性は、前述する方法で行った。インキュベート前のプロテイングルタミナーゼの活性値を１００％として、プロテイングルタミナーゼの残存活性値を求めた。また、比較のために、1.0 Mの炭酸ナトリウムを添加しなかったこと以外は、前記と同条件で試験を行い、プロテイングルタミナーゼの活性を経時的に測定した。
　結果を図３に示す。この結果、炭酸ナトリウムの存在下でプロテイングルタミナーゼの熱安定性が向上することが確認された。
　本発明の蛋白質脱アミド方法によれば、脱アミド反応の促進が図られ、反応効率の向上が望める。本発明によって得られる脱アミド蛋白質は、それ自体で商品的価値を有し、また、様々な食品や飲料或いは医薬の素材ないし材料としても利用され得る。即ち、本発明には特に食品・飲料分野及び医薬分野での利用・応用が期待される。
　この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。

Claims (15)

  1. 　塩類及び／又は多糖類存在下で蛋白質脱アミド酵素を蛋白質に作用させる、蛋白質脱アミド方法。
  2. 　塩類が炭酸塩、リン酸塩、リン酸水素塩、ポリリン酸塩、及びクエン酸塩よりなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１に記載の蛋白質脱アミド方法。
  3. 　多糖類がゲランガムである、請求項１又は２に記載の蛋白質脱アミド方法。
  4. 　蛋白質脱アミド酵素がプロテイングルタミナーゼである、請求項１～３のいずれか一項に記載の蛋白質脱アミド方法。
  5. 　蛋白質が植物性蛋白質及び／又は動物性蛋白質である、請求項１～４のいずれか一項に記載の蛋白質脱アミド方法。
  6. 　塩類及び／又は多糖類、並びに蛋白質脱アミド酵素を含有する蛋白質改良剤。
  7. 　塩類がリン酸塩、ポリリン酸塩又はクエン酸塩である、請求項６に記載の蛋白質改良剤。
  8. 　多糖類がゲランガムである、請求項６又は７に記載の蛋白質改良剤。
  9. 　蛋白質脱アミド酵素がプロテイングルタミナーゼである、請求項６～８のいずれか一項に記載の蛋白質改良剤。
  10. 　以下の工程を含む、脱アミド蛋白質の製造方法：
    　（１）蛋白質、並びに塩類及び／又は多糖類を含む溶液を用意する工程、
    　（２）用意した溶液を蛋白質脱アミド酵素で処理する工程。
  11. 　以下の工程を含む、食品又は医薬の製造方法：
    　（１）蛋白質を含む食品原料又は医薬原料、並びに塩類及び／又は多糖類を含む溶液を用意する工程、
    　（２）用意した溶液を蛋白質脱アミド酵素で処理する工程。
  12. 　塩類が炭酸塩、リン酸塩、リン酸水素塩、ポリリン酸塩、及びクエン酸塩よりなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１０又は１１に記載の製造方法。
  13. 　多糖類がゲランガムである、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の製造方法。
  14. 　蛋白質脱アミド酵素がプロテイングルタミナーゼである、請求項１０～１３のいずれか一項に記載の製造方法。
  15. 　蛋白質が植物性蛋白質及び／又は動物性蛋白質である、請求項１０～１４のいずれか一項に記載の製造方法。
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