WO2021201637A1 - 제대혈 줄기세포에 의해 고효능의 엑소좀이 고함량으로 분비된 배양액의 제조 방법 및 이의 용도 - Google Patents

제대혈 줄기세포에 의해 고효능의 엑소좀이 고함량으로 분비된 배양액의 제조 방법 및 이의 용도 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a culture medium in which high-potency exosomes are secreted in a high content by umbilical cord blood stem cells, and to a use thereof.
  • the umbilical cord blood stem cell culture medium prepared according to the present invention contains a high content of highly effective exosomes, and can be applied and/or permeated to a biological membrane such as skin, so that it is useful as a cosmetic composition and a pharmaceutical composition such as a wound treatment. can be used
  • Mesenchymal stem cells secrete various growth factors and cytokines such as epidermal growth factor and fibroblast growth factor to produce collagen from fibroblasts. is known to play an important role in skin regeneration by promoting There is a lot of interest in the development of cosmetics using stem cells with these characteristics, and in particular, research related to the development of technologies that can increase the penetration of stem cells into the skin for effective factors is being conducted, and one of them is exosomes. is to use
  • Exosomes are small vesicles with a membrane structure secreted from various types of cells. The diameter of the exosomes is reported to be approximately 30 ⁇ 150 nm. It was observed that exosomes originate in specific compartments within cells called multivesicular bodies (MVBs), rather than directly detach from the plasma membrane, and are released and secreted out of the cells in studies through electron microscopy. That is, when polycystic body and plasma membrane fusion occurs, vesicles are released into the extracellular environment, which is called exosomes.
  • MVBs multivesicular bodies
  • exosomes secreted from almost all living cells contain various components such as receptors, proteins, and miRNAs and play an important role in cell-to-cell signaling. have.
  • the exosomes contain relatively little animal serum compared to stem cells, so the risk of symptoms (zoonosis) caused by animal serum infection can also be excluded.
  • treatment using exosomes is expected to be a new paradigm that can overcome the limitations of existing stem cell therapies.
  • the skin is composed of an epidermal layer and a dermis layer.
  • keratinocytes Cells that fill the epidermis include keratinocytes, melanocytes, dendritic cells and tactile cells. Most epidermal cells are keratinocytes ( FIG. 8 ).
  • the main function of keratinocytes is to form a barrier against environmental damage by heat, ultraviolet light, water loss, and pathogenic bacteria, fungi, parasites and viruses.
  • a number of structural proteins filamentaggrin, keratin), enzymes (proteases), lipids and antimicrobial peptides (defensins) contribute to maintaining the important barrier function of the skin.
  • Keratinogenesis is part of the physical barrier formation (keratinization), where keratinocytes produce more and more keratin and undergo terminal differentiation. The fully keratinized keratinocytes that form the outermost layer are continuously removed and replaced by new cells.
  • the dermis layer is 15 to 40 times thicker than the epidermis layer (0.04 mm to 1.6 mm), occupies most of the skin, and maintains the elasticity of the skin, and acts as a connective tissue between the epidermis and subcutaneous tissue.
  • the papillary dermis occupies only a small portion of the total thickness of the dermis and is composed of collagen, blood vessels, and fibrocytes. Provides nutrients to the basal layer of the avascular epidermis.
  • the reticular dermis is the layer that occupies most of the dermis, and elastin and collagen fibers are arranged in thick bundles to give strength and flexibility to the skin and consist of elastic fibers and various matrix proteins. Collagen accounts for about 25% of the total protein in the connective tissue and plays an important role in the tensile strength of the dermal layer.
  • MMP matrix metalloprotease
  • ECM extracellular matrix
  • MMP decomposes ECM to increase cell mobility and circulates skin tissue, but promotes skin aging by forming wrinkles, promotes cancer cell metastasis, and promotes formation by UV rays, stress, and antibiotics.
  • Fibronectin is a glycoprotein present on the cell surface, connective tissue, and blood. Cells are not directly connected to collagen, but via fibronectin.
  • fibroblasts produce and secrete both growth factors and cytokines required by keratinocytes.
  • Keratinocytes are epidermal cells that are most easily exposed to the environment. Fibroblasts can be activated through keratinocytes, and through activation, the extracellular matrix is reformed to even out the skin layer.
  • Biomembrane coversing and lining membranes
  • covers and lining membranes are continuous multicellular sheets composed of epithelial tissue bound to an underlying layer of connective tissue.
  • Biomembrane coversing and lining membranes
  • Biopharmaceutical raw materials are medicines developed using cells, tissues, hormones, etc. derived from humans or other living organisms, a step forward from existing pharmaceuticals based on chemical components, and are called biologics.
  • Existing chemical medicines have the disadvantage of having severe side effects and showing temporary improvement, but biologics have the advantage of fundamentally solving the cause of the disease without side effects, and are currently being actively studied around the world. Accordingly, the present invention intends to utilize umbilical cord blood stem cell-derived exosomes as a main raw material in the next-generation biopharmaceutical field.
  • the present invention relates to biomembrane (covering and lining membranes) such as skin.
  • An object of the present invention is to provide a culture medium in which exosomes with high efficacy are secreted in a high content by cord blood stem cells in order to increase the regenerative ability.
  • Cord blood stem cells are grown in a serum-free medium containing a specific growth factor cocktail containing two or more growth factors.
  • a specific growth factor cocktail containing two or more growth factors.
  • one or two or more growth factors selected from the group consisting of GDF-11, EGF, FGF2, TGF- ⁇ 1, and VEGF are used in umbilical cord blood-derived stem cells at a concentration of 1-20 ng/ml, respectively.
  • the concentration of exosomes secreted during culturing of cord blood-derived stem cells is 0.5-5x10 9 /ml, preferably 1-3x10 9 /ml, characterized by comprising the step of producing a high culture medium
  • a method for preparing a culture medium containing exosomes secreted by phosphorus and cord blood stem cells are used in umbilical cord blood-derived stem cells at a concentration of 1-20 ng/ml, respectively.
  • Cord blood stem cells can be cultured in the added serum-free medium.
  • GDF-11 Preferably, all of GDF-11, EGF, FGF2, TGF- ⁇ 1, and VEGF at a concentration of 1-20 ng/ml, respectively.
  • Cord blood stem cells can be cultured in the added serum-free medium.
  • a second aspect of the present invention is a composition for applying a skin or biological membrane (covering and lining membranes) containing a culture medium containing umbilical cord blood stem cell exosomes obtained by the method of the first aspect or a high-potency exosome isolated therefrom as an active ingredient
  • the composition for application include a cosmetic composition, a quasi-drug composition, or a pharmaceutical composition.
  • the composition for application is a formulation that is mixed with a polymer and gelled, and may be solized under body temperature conditions.
  • a third aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for the treatment of wounds or wounds containing the exosome-containing culture medium of umbilical cord blood stem cells obtained by the method of the first aspect or high-potency exosomes isolated therefrom as an active ingredient.
  • Adult stem cells are cells in an undifferentiated state that differentiate into cells of a specific tissue when necessary.
  • Adult stem cells may be mesenchymal stem cells, mesenchymal stromal cells, or pluripotent stem cells, but are not limited thereto.
  • embryonic stem cells extracted from human embryos adult stem cells have the advantage of avoiding ethical disputes because they are extracted from already grown body tissues such as bone marrow or brain cells.
  • adult stem cells may be derived from umbilical cord, umbilical cord blood, bone marrow, fat, muscle, nerve, skin, amniotic membrane or placenta, but is not limited thereto.
  • cord blood-derived stem cells use cord blood formed during the donor's gestational cycle (40 weeks), so there is no difference in efficacy depending on the donor's condition.
  • the medium refers to a composition containing essential components necessary for the growth and proliferation of cells in vitro, and includes all of the stem cell culture medium commonly used in the art, for example, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI 1640, DMEM/F-10 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-10), DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) : Nutrient Mixture F-12), ⁇ -MEM ( ⁇ -Minimal essential Medium), G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM (Isocove's Modified Dulbecco's Medium), KnockOut DMEM, etc.
  • One medium may be used, but not limited thereto.
  • the medium of the present invention generally includes a carbon source, a nitrogen source, and a trace element component, and may further include various growth factors other
  • growth factors such as GDF-11, EGF, FGF2, TGF- ⁇ 1, and VEGF may be added to the culture medium and/or produced by cord blood stem cells.
  • Growth factor refers to a proteinaceous physiologically active substance that promotes cell division, growth, and differentiation, for example, GDF-11 (Growth and differentiation factor 11), brain-derived neurotropic factor (BDNF). ), fibroblast growth factor (FGF), hepatocyte growth factor (HGF), nerve growth factor (NGF), vascular epithelial growth factor (vascular endothelial growth factor, VEGF), similar Insulin-like growth factor (IGF), transforming growth factor (TGF), platelet-derived growth factor (PDGF), bone-derived growth factor (bone-derived growth factor, BDF), colony stimulation factor (CSF), epidermal growth factor (EGF), keratinocyte growth factor (KGF), and the like.
  • GDF-11 Crowth and differentiation factor 11
  • BDNF brain-derived neurotropic factor
  • FGF fibroblast growth factor
  • HGF hepatocyte growth factor
  • NGF nerve growth factor
  • VEGF vascular epithelial growth factor
  • IGF Insulin-like growth factor
  • TGF transforming growth
  • GDF-11, EGF, FGF2, TGF- ⁇ 1, and VEGF added to the serum-free medium stimulate the receptor signaling pathway of each growth factor of umbilical cord blood stem cells. It is interpreted to increase the synthesis of collagen and fibronectin protein by promoting the SMAD signaling pathway, and the content of growth factors, collagen, and fibronectin in the exosomes. It is interpreted that the increased collagen, fibronectin, and growth factor-containing exosomes affect the proliferation and migration ability of human fibroblasts and keratinocytes.
  • the culture medium may refer to a cell culture supernatant cultured with cord blood stem cells.
  • the umbilical cord blood stem cell culture medium contains various physiologically active substances secreted from the cells during the culturing of the cord blood stem cells.
  • the physiologically active substance is a generic term for cytokines, cell growth factors, immunomodulatory factors, etc. that can affect the functions of cells or the body, and examples of the physiologically active substances include VEGF (vascular endothelial growth factor), EGF ( epidermal growth factor), hepatocyte growth factor (HGF), tumor growth factor-beta (TGF-beta), and insulin growth factor (IGF), but are not limited thereto.
  • Exosomes are evaluated as ideal vesicles for drug delivery because they can deliver substances across cell membranes. Since this lipid bilayer vesicle system can overcome the skin penetration problem, it is one of the most effective strategies for delivering drugs to the dermal layer of the skin. It is being evaluated (Saahil Arora et al., Asian Journal of Pharmaceutics, 6, 4, 237-244, 2012).
  • exosomes contain RNA, proteins, lipids and metabolites that reflect the cell type from which the exosomes are derived.
  • Exosomes contain various molecular components (eg, proteins and RNA) of the cell from which the exosomes are derived.
  • Exosome protein composition varies depending on the cell and tissue from which the exosome is derived, but most exosomes contain a common set of evolutionarily conserved protein molecules.
  • Exosomes can be obtained by separating from the culture medium obtained after culturing cells, and the size and content of exosomes can be affected by molecular signals received by cells producing exosomes.
  • the culture medium itself can be used as a raw material without separating the exosomes, but the exosomes can be separated and used.
  • the exosomes can be isolated to confirm the size and physical properties of the exosomes in the culture medium for quality assurance and the like.
  • centrifugation method As a method for isolating the exosomes from the culture medium, centrifugation method, immunobinding method, filtration method, etc. can be used.
  • Ultracentrifugation the most commonly used exosome separation method, cannot separate a large amount of exosomes at once, requires expensive equipment, takes a lot of time to separate, and is Physical damage may occur, and in particular, there are disadvantages such as a decrease in the purity of the isolated exosomes.
  • a PS affinity method that increases the purity of the separated exosome by using a substance that specifically binds to phosphatidylserine (PS), a protein present in the membrane of the exosome. (PS affinity method) is available. This can separate exosomes of high purity compared to the ultracentrifugation method, but has a disadvantage in that the yield is low.
  • the exosomes in the umbilical cord blood mesenchymal stem cell (UCB-MSC) culture medium contain EGF, VEGF, TGF, HGF, FGF, IGF and It contains various growth factors such as PDGF. Growth factors such as EGF promote the proliferation of fibroblasts, which are constituent cells of the skin, and promote cell migration and collagen synthesis. It can exhibit excellent skin condition improvement effects such as prevention or improvement of skin aging, hair growth or restoration of reduced hair follicles, and wound healing effects.
  • the stem cell culture medium prepared according to the present invention not only contains a large amount of exosomes, but also nano-sized exosomes that can penetrate to the dermal layer of the skin by a unique lipid bilayer structure to enhance the regeneration effect can be provided in large amounts. Because it contains a large amount of various growth factors in exosomes, It can exhibit skin regeneration and anti-aging effects, increase collagen synthesis, hair growth, restoration of reduced hair follicles, and wound healing effects through proliferation and activation of fibroblasts.
  • the exosomes of the present invention may be produced or used as a culture medium containing them, or may be produced or used in a state in which cells are removed from the culture medium. Since the cell-free culture medium containing exosomes is a cell-free preparation, there is little risk of carcinogenesis and no problem of transplant rejection, and there is no risk of occlusion of microvessels when administered systemically, and is off as a separation material rather than cells. It is possible to develop drugs into the shelf products, so the manufacturing cost can be reduced.
  • the present invention relates to cord blood-derived stem cells EGF, FGF2, TGF in order to produce a high culture medium in which the concentration of exosomes secreted during culturing of cord blood-derived stem cells is 0.5 to 5x10 9 /ml, preferably 1 to 3x10 9 /ml.
  • - ⁇ 1, VEGF, and / or GDF-11 is characterized by culturing in a serum-free medium added at a concentration of 1 to 20 ng/ml, respectively.
  • the present inventors culturing the umbilical cord blood mesenchymal stem cells under specific culture conditions in which EGF, FGF2, TGF- ⁇ 1, VEGF, and GDF-11, which are growth factors, respectively, were added at a concentration of 1 to 20 ng/ml, Compared to the case of culturing cord blood stem cells in a serum-free medium to which no growth factor is added, the concentration of exosomes present in the culture medium is high (1 to 3x10 9 /ml), and the exosomes contain human fibroblasts and human keratinocytes. It was found that it improves the migration and proliferation of cells.
  • the culture medium produced by culturing umbilical cord blood stem cells in a serum-free medium supplemented with EGF, FGF2, TGF- ⁇ 1, VEGF, and GDF-11 at a concentration of 1 to 20 ng/ml is an extracellular matrix fibronectin protein and/or collagen found to contain a large amount of protein. Furthermore, it was found that a large amount of exosomes with a small particle size diameter of 100 nm ⁇ 20 nm and easily permeable through the skin were produced. The present invention is based on this.
  • a stem cell culture medium containing a large amount of exosomes containing a high concentration of growth factors contained at a high concentration and uniform the size of exosomes secreted during culturing of cord blood stem cells, or exosomes separated therefrom is applied to the skin and It may be an active ingredient of the composition for applying the same biomembrane (covering and lining membranes).
  • the present invention not only can mass-produce exosomes with a size of about 100 nm that permeates the skin through cell culture of cord blood stem cells, but also the cord blood-derived stem cell culture medium prepared according to the present invention has the ability to move human fibroblasts.
  • the permeability of biological membranes such as the skin of the culture medium is high, and it contains a large amount of fibronectin protein and / or collagen protein, such as skin
  • biomembrane covering and lining membranes
  • a therapeutic agent such as a wound healing agent or a wound healing agent
  • the exosome-containing culture medium secreted by the cord blood-derived stem cells and/or the exosomes isolated from the culture medium can be formulated in various ways depending on the purpose of use.
  • gelation of the exosomes isolated from the exosome-containing culture medium and/or the culture medium can be powdered by freezing and/or drying.
  • compositions for applying to skin or biomembrane that can control gelation and solation due to the difference in viscosity according to the content ratio of components by mixing with components such as hydrogel, gelatin, etc. , poloxamer, etc., and gelled at 4°C conditions, and the formulation can be designed so that it dissolves at body temperature conditions.
  • Cosmetic compositions include solutions, external ointments, creams, foams, nutritional lotions, softened lotions, perfumes, packs, soft water, emulsions, makeup bases, essences, soaps, liquid detergents, bath agents, sunscreen creams, sun oils, suspensions, emulsions , paste, gel, lotion, powder, soap, surfactant-containing cleansing, oil, powder foundation, emulsion foundation, wax foundation, patch and spray, but is not limited thereto.
  • the cosmetic composition may further include one or more cosmetically acceptable carriers to be formulated in general skin cosmetics, and conventional ingredients include, for example, oil, water, surfactant, humectant, lower alcohol, thickener, chelating agent, Colors, preservatives, fragrances, etc. may be appropriately blended, but the present invention is not limited thereto.
  • the cosmetically acceptable carrier included in the cosmetic composition varies depending on the formulation of the cosmetic composition.
  • the formulation is an ointment
  • paste, cream or gel animal oil, vegetable oil, wax, paraffin, starch, tracanth, cellulose derivative, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silica, talc, zinc oxide, etc.
  • animal oil vegetable oil, wax, paraffin, starch, tracanth, cellulose derivative, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silica, talc, zinc oxide, etc.
  • silicone can, but is not limited thereto. These may be used alone or in combination of two or more.
  • lactose When the formulation is a powder or a spray, lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate, polyamide powder, etc. may be used as a carrier component, and in particular, in the case of a spray, additional chlorofluorohydrocarbon, propane/ propellants such as butane or dimethyl ether, but are not limited thereto. These may be used alone or in combination of two or more.
  • a solvent, solubilizer or emulsifier may be used as a carrier component, for example, water, glycerin, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, propylene Glycol, 1,3-butylglycol oil and the like can be used, and in particular, cottonseed oil, peanut oil, corn germ oil, olive oil, castor oil and sesame oil, glycerol aliphatic esters, fatty acid esters of polyethylene glycol or sorbitan may be used. can be used, but is not limited thereto. These may be used alone or in combination of two or more.
  • the carrier component water
  • a liquid diluent such as glycerin, ethanol or propylene glycol
  • a suspending agent such as ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitol esters and polyoxyethylene sorbitan esters, microcrystals Sex cellulose, aluminum metahydroxide, bentonite, agar or tracanth may be used, but is not limited thereto. These may be used alone or in combination of two or more.
  • alkali metal salts of fatty acids When the formulation is soap, alkali metal salts of fatty acids, fatty acid hemiester salts, fatty acid protein hydrolysates, isethionate, lanolin derivatives, aliphatic alcohols, vegetable oils, glycerol, sugar, etc. may be used as carrier components. , but not limited thereto. These may be used alone or in combination of two or more.
  • the exosome may be included in an amount of 0.0001 to 50% by weight of the total weight of the cosmetic composition, and more specifically, it may be included in an amount of 0.0005 to 10% by weight.
  • the exosome is included within the above range, there is an advantage of exhibiting excellent skin condition improvement efficacy, and there is an advantage in that the formulation of the composition is stabilized.
  • quasi-drugs refer to those used for the purpose of diagnosing, treating, ameliorating, alleviating, treating or preventing diseases of humans or animals, excluding those that have a milder action than pharmaceuticals or are used for pharmaceutical purposes. It includes products used for the treatment or prevention of diseases in humans or animals, and products with minor or no direct action on the human body.
  • the quasi-drug composition may be prepared in a formulation selected from the group consisting of body cleanser, foam, soap, mask, ointment, cream, lotion, essence and spray, but is not limited thereto.
  • a pharmaceutically acceptable carrier is further added may include
  • “Pharmaceutically acceptable” means that it can be used routinely in the field of pharmaceuticals, which does not stimulate the organism upon administration and does not impair the biological activity and properties of the administered compound.
  • the dosage may be a pharmaceutically effective amount for improving skin condition.
  • pharmaceutically effective amount refers to an amount sufficient to treat a disease with a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level includes the subject type and severity, age, sex, type of disease, drug activity, sensitivity to drugs, administration time, administration route and excretion rate, duration of treatment, factors including concomitant drugs, and other factors well known in the medical field.
  • effective amounts may vary depending on the route of treatment, the use of excipients, and the potential for use with other agents, as will be appreciated by those skilled in the art.
  • the type of carrier is not particularly limited, and any carrier commonly used in the art may be used. Although not limited thereto, specific examples include saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, albumin injection solution, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, maltodextrin, glycerol, ethanol, and the like. . These may be used alone or in mixture of two or more.
  • additives such as excipients, diluents, antioxidants, buffers or bacteriostats may be added and used, and fillers, extenders, wetting agents, disintegrants, dispersants, surfactants, binders or lubricants may be added. It can be used by adding it.
  • the umbilical cord blood mesenchymal stem cell culture medium prepared according to the present invention contains a high content of high-potency exosomes having a uniform size distribution, and can be usefully used as a cosmetic composition requiring skin penetration and a pharmaceutical composition for wound/wound treatment.
  • FIG. 1 is a result of comparative analysis of the total protein concentration and extracellular matrix protein content present in the umbilical cord blood stem cell culture solution prepared for each condition according to Example 1.
  • FIG. 1 is a result of comparative analysis of the total protein concentration and extracellular matrix protein content present in the umbilical cord blood stem cell culture solution prepared for each condition according to Example 1.
  • Example 2 is a result of comparative analysis of the distribution, size and concentration of exosomes present in the umbilical cord blood-derived stem cell culture solution prepared for each condition according to Example 1.
  • Example 4 is a result of comparative analysis of the effect of exosomes of umbilical cord blood-derived stem cell culture medium prepared for each condition according to Example 1 on the proliferative capacity of human fibroblasts and keratinocytes.
  • Example 5 is a result of comparative analysis of the effect on skin cell regeneration by treating the exosomes of the umbilical cord blood-derived stem cell culture medium prepared for each condition according to Example 1 to an animal wound model.
  • FIG. 6 is a conceptual diagram illustrating a biological membrane (covering and lining membranes), which is an upper concept of the skin.
  • FIG. 7 is a conceptual diagram showing various active ingredients produced by fibroblasts.
  • FIG. 8 is a conceptual diagram showing the main structural features of the skin epidermis.
  • FIG. 9 is a conceptual diagram illustrating the interaction between fibroblasts and keratinocytes.
  • KSB-3 Basal Culture Medium
  • 10% fetal bovine serum in a 37°C 5% CO 2 incubator for 1 to 4 days, then After removing the culture medium, it was washed with PBS.
  • GDF-11 (1-20 ng/ml), EGF (1-20 ng/ml), FGF2 (1-20 ng/ml), TGF- ⁇ 1 (1-20 ng/ml), and VEGF (1-20 ng) in the washed cells /ml) added DMEM medium and DMEM medium not containing growth factors, incubated for 1 to 4 days at 37°C 5% CO 2 in an incubator, centrifuged at 500 g for 5 minutes, and then the supernatant was separated and then 0.2 Filtration with a ⁇ m-0.8 ⁇ m filter.
  • Exosomes were extracted from the culture medium produced under each condition and filtered through a 0.2 ⁇ m ⁇ 0.8 ⁇ m filter using CapturemTM Exosome Isolation Kit (Takara Bio). It was used for each test after buffer exchange with
  • the extracellular matrix in the connective tissue which is responsible for structural support of cells, and the like, typically contains components such as fibronectin, collagen, and elastin, and plays a role in regenerating damaged tissues.
  • BCA Assay was performed to analyze the total amount of protein in the umbilical cord blood stem cell culture, and an enzyme-linked immunoprecipitation assay (ELISA assay) was performed to analyze the extracellular matrix protein content in the umbilical cord blood stem cell culture.
  • the culture medium of each condition prepared in Example 1 was comparatively analyzed with Human Fibronectin Quantikine ELISA Kit (R&D System, MN, USC) and Procollagen Type I C-peptide (PIP) EIA Kit (Takara bio inc, Japan).
  • a culture medium using a growth factor-free medium
  • GDF-11, EGF, FGF2, TGF- ⁇ 1, and VEGF were compared and analyzed for total protein content and extracellular matrix protein component content of a culture medium using a medium to which 1 to 20 ng/ml concentration was added, respectively.
  • PIP collagen protein
  • Nanosight can analyze the distribution and concentration of nanoparticle size by observing and analyzing individual particles that are diffusing in size from 10nm to 2000nm in solution.
  • the migration ability of epidermal cells is a major mechanism in wound healing.
  • HDF human dermal fibroblasts
  • HKC keratinocytes
  • Human fibroblasts and keratinocytes were each aliquoted into the trans-well insert at 2x10 4 cells/well, and cultured for one day at 37°C under 5% CO 2 conditions, and then the culture medium was removed and washed with PBS. 100ul/well of serum-free DMEM containing exosomes prepared and extracted in Example 1 for each condition was treated, and 2 hours later, 400ul of DMEM containing 10% serum was added to the bottom plate at 37°C 5% CO 2 condition. cultured for one day. After staining with Cristal Violet Solution to stain the migrated cells, comparative analysis was performed with an optical microscope.
  • DMEM growth factor-free medium
  • GDF-11, EGF, FGF2, TGF- ⁇ 1, and VEGF added at a concentration of 1 to 20 ng/ml, respectively.
  • 2x10 8 cells were treated with human fibroblasts, and a basal medium (Basal DMEM) without culturing cord blood stem cells was used as a non-treat.
  • Basal DMEM basal medium without culturing cord blood stem cells was used as a non-treat.
  • GDF-11 As a result, as can be seen in Figure 3, GDF-11, EGF, FGF2, TGF- ⁇ 1, and a human treated with exosomes isolated from umbilical cord blood stem cell culture medium using a medium to which VEGF was added at a concentration of 1 to 20 ng/ml, respectively. It was confirmed that the mobility of fibroblasts and keratinocytes was increased compared to the control group.
  • fibroblasts and keratinocytes are also an important part of the regeneration process. Therefore, in order to confirm the effect of the culture on the proliferation of human fibroblasts and keratinocytes, a Proliferation Assay was performed. Human fibroblasts and keratinocytes were each dispensed at 1x10 5 cells/well in a 6- well plate, and cultured at 37° C. 5% CO 2 condition. The number of cells was measured at 24 hour intervals.
  • DMEM growth factor-free medium
  • GDF-11 growth factor-free medium
  • EGF EGF
  • FGF2 FGF2, TGF- ⁇ 1, and VEGF
  • VEGF vascular endothelial growth factor-free medium
  • 2x10 8 small cells were treated with human fibroblasts and keratinocytes, and a basal medium (Basal DMEM) without culturing cord blood stem cells was used as a non-treat.
  • the growth factors GDF-11, EGF, FGF2, TGF- ⁇ 1, and VEGF were treated with exosomes isolated from the umbilical cord blood stem cell culture medium using a medium added at a concentration of 1 to 20 ng/ml, respectively. It was confirmed that the proliferative capacity of human fibroblasts and keratinocytes was increased compared to the control group.
  • Example 1 GDF-11, EGF, FGF2, TGF- ⁇ 1, and each exosome 2x10 8 extracted from a culture medium using a medium to which VEGF was added at a concentration of 1 to 20 ng/ml were treated in an animal wound model.
  • An animal wound model without any treatment was used as a negative control group (NC).

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Abstract

본 발명은 제대혈 줄기세포가 분비하는 엑소좀 함유 배양액 제조 방법에 관한 것이다. 상기 제조방법은 제대혈 줄기세포를 GDF-11, EGF, FGF2, TFG-β1, 및/또는 VEGF이 첨가된 무혈청 배지에서 배양하는 것을 기본으로 한다. 제대혈 줄기세포에 5종의 성장인자를 첨가한 무혈청 배지를 처리하여 생산한 배양액과 해당 배양액에서 분리한 엑소좀을 성장인자 없이 무혈청 배지만 처리한 경우와 비교했을 때 성장인자가 포함된 배양액 내의 총단백질 함량과 세포외기질 단백질 함량이 높은 배양액을 생산한다. 또한, 5종의 성장인자 포함 무혈청 배지에서 배양된 제대혈 줄기세포가 분비한 엑소좀은 개수가 많아 농도가 높고 크기가 작고 고른 분포도를 보인다. 본 발명에 따라 제조되는 제대혈 줄기세포 배양액은 고효능 엑소좀을 고함량으로 함유하여 피부재생 효능이 높아, 피부 투과가 필요한 피부 도포용 화장료 조성물 및 상처치료용 약학 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

제대혈 줄기세포에 의해 고효능의 엑소좀이 고함량으로 분비된 배양액의 제조 방법 및 이의 용도
본 발명은 제대혈 줄기세포에 의해 고효능의 엑소좀이 고함량으로 분비된 배양액의 제조 방법 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따라 제조되는 제대혈 줄기세포 배양액은 고효능의 엑소좀을 고함량으로 함유하며, 피부와 같은 생체 멤브레인에 도포 및/또는 투과 유도가 가능하여 화장료 조성물과 상처치료와 같은 약학 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
중간엽 줄기세포(Mesenchymal stem cell)는 표피세포성장인자(Epithelial growth factor), 섬유아세포성장인자(Fibroblast growth factor)와 같은 다양한 성장인자(growth factor)와 사이토카인을 분비하여 섬유아세포로부터 콜라겐의 생성을 촉진시켜 피부의 재생에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다(도 7). 이러한 특성을 가진 줄기세포를 이용한 화장품의 개발에 많은 관심이 고조되고 있으며, 특히 줄기세포의 유효 인자들에 대한 피부 내 침투력을 높일 수 있는 기술 개발과 관련된 연구가 이루어지고 있으며 그 중 하나가 엑소좀을 활용하는 것이다.
엑소좀(exosome)은 여러 종류의 세포들로부터 분비되는 막 구조의 작은 소낭이다. 엑소좀의 직경은 대략 30 ~ 150 nm인 것으로 보고되어 있다. 엑소좀은 전자 현미경을 통한 연구에서 원형질막으로부터 직접 떨어져 나가는 것이 아니라 다낭체(multivesicular bodies, MVBs)라고 불리는 세포 내 특정 구획에서 기원하며 세포 밖으로 방출, 분비되는 것으로 관찰되었다. 즉, 다낭체와 원형질막의 융합이 일어나면, 소낭들은 세포 밖 환경으로 방출되는데, 이것을 엑소좀이라고 부른다. 이러한 엑소좀이 어떤 분자적 기작에 의해 만들어지는지 확실히 밝혀진 바가 없으나, 살아있는 거의 모든 세포에서 분비되는 엑소좀은 수용체, 단백질 및 miRNA 등 다양한 성분을 함유하고 있어 세포 간 신호전달에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 또한, 엑소좀은 줄기세포에 비해 동물 혈청을 상대적으로 적게 함유하고 있어 동물 혈청 감염에 의한 증상(zoonosis)의 위험성 역시 배재할 수 있다. 이러한 엑소좀의 특성을 고려할 때 엑소좀을 이용한 치료법은 기존의 줄기세포 치료법의 한계를 극복할 수 있는 새로운 패러다임이 될 것으로 기대된다.
피부는 표피층과 진피층으로 구성되어 있다.
표피(epidermis)를 채우는 세포는 각질 세포(keratinocytes), 멜라닌 세포(melanocytes), 수지상 세포(dendritic cells) 및 촉각 세포(tactile cells)를 포함한다. 대부분의 표피 세포는 각질 세포이다(도 8). 각질 세포의 주요 기능은 열, 자외선, 수분 손실, 병원성 박테리아, 곰팡이, 기생충 및 바이러스에 의한 환경 피해에 대한 장벽 형성이다. 다수의 구조 단백질 (filaggrin, keratin), 효소 (프로테아제), 지질 및 항균성 펩타이드 (defensins)는 피부의 중요한 장벽 기능을 유지하는 데 기여한다. 각질 형성은 각질 세포가 점점 더 많은 각질을 생성하고 말단 분화를 겪는 물리적 장벽 형성 (각질화)의 일부이다. 최외각층을 형성하는 완전히 각질화 된 각질 세포는 지속적으로 제거되어 새로운 세포로 대체된다.
진피층은 표피층(0.04mm~1.6mm)의 15~40배의 두께를 보이며 피부의 대부분을 차지하고 피부의 탄력을 유지하는 층으로, 표피와 피하조직 사이의 결합조직(connective tissue)으로서 작용한다. 피부부속기, 혈관, 임파관, 근육, 신경 등이 있으며, 크게 유두 진피(papillary dermis)와 망상 진피(reticular dermis) 두 층으로 나뉜다.
유두 진피는 진피 전체의 두께에서 극히 일부분만 차지 하고 있으며 콜라겐, 혈관, 섬유세포(fibrocyte)로 구성되어 있다. 혈관이 없는(avascular) 표피의 기저층에 영양분을 공급해준다. 망상 진피는 진피의 대부분을 차지하는 층으로 엘라스틴과 콜라겐 섬유가 굵은 다발을 이루어 배열되어 있어 피부에 강도와 유연성을 부여하며 탄력섬유 및 다양한 기질 단백질로 이루어져 있다. 콜라겐은 결합조직 총 단백질의 25% 정도를 차지하며 진피층의 인장강도에 중요한 역할을 한다. 한편, matrix metalloprotease(MMP)는 세포외기질(extracellular matrix, ECM)을 가수분해하는 zinc-dependent endopeptidase이다. MMP는 ECM을 분해시켜 세포의 이동능을 증가시켜 피부조직을 순환시키지만 주름을 형성하여 피부노화를 촉진시키고 암세포의 전이를 촉진하며 자외선, 스트레스, 항생제 등에 의해 형성이 촉진된다. 피브로넥틴(Fibronectin)은 세포표면, 결합조직, 혈액 중에 존재하는 당 단백질이다. 세포는 직접적으로 콜라겐(collagen)과 연결되어 있지 않고 피브로넥틴 (fibronectin)을 통해 연결되어 있다.
도 9에 도시된 바와 같이, 섬유아세포(fibroblast)는 각질 세포(keratinocyte)가 필요로 하는 성장인자 및 사이토카인을 모두 생산 및 분비한다. 각질 세포(keratinocyte)는 표피세포로 환경에 가장 쉽게 노출되는 세포이다. 섬유아세포는 각질 세포(keratinocyte)를 통해 활성화할 수 있으며, 활성화를 통해 세포외 기질을 재형성하여 피부층을 고르게 한다.
한편, 피부의 상위개념으로 생체 멤브레인(covering and lining membranes)가 있다. 생체 멤브레인(covering and lining membranes)은 결합 조직(connective tissue)의 하부층(underlying layer)에 결합된 상피조직(epithelium)으로 구성된 연속적인 다세포 시트(continuous multicellular sheets)이다. 생체 멤브레인(covering and lining membranes)에는 피부막(Cutaneous Membrane), 점막(Mucous Membranes), 장액막(Serous Membranes)이 있다(도 6).
현대인들의 생활수준 향상과 더불어 노령인구가 증가함에 따라 노화방지, 주름개선, 미백, 자외선차단 등과 관련된 기능성 화장품에 대한 관심과 수요가 증가하고 있는 추세이다. 그러나, 기초 화장품 또는 기능성 화장품은 대부분 화학물질로 제조되기 때문에 인체에 대한 안전성 문제가 꾸준히 제기되었다. 이에 따라, 천연, 유기농 원료를 함유한 제품에 대한 관심이 증가하고 있으며, 관련 제품의 시장 규모 또한 증가하고 있다.
이러한 천연 원료를 활용한 제품 개발은 의약품 영역에서도 활발히 진행되면서 바이오의약품 시장을 형성하고 있다. 바이오의약품 원료는 기존의 화학 성분을 기반으로 한 의약품에서 진일보하여 사람이나 다른 생물체에서 유래된 세포, 조직, 호르몬 등을 이용해 개발된 의약품으로 생물의약품이라고 한다. 기존 화학성분 의약품의 경우 부작용이 심하며 일시적인 개선 효능을 보이는 단점을 가지고 있으나 바이오의약품의 경우 부작용 없이 질환의 원인을 근본적으로 해결한다는 장점을 가지고 있어 현재 전 세계적으로 활발히 연구가 되고 있다. 이에 본 발명은 제대혈 줄기세포 유래 엑소좀 또한 차세대 바이오의약품 영역에서 하나의 주원료로 활용하고자 한다.
본 발명은 피부와 같은 생체 멤브레인(covering and lining membranes)의 재생력을 높이기 위해, 제대혈 줄기세포에 의해 고효능의 엑소좀이 고함량으로 분비되는 배양액을 제공하고자 한다.
본 발명에서는 제대혈 줄기세포를 2종 이상의 성장인자를 함유한 특정 성장인자 칵테일을 첨가한 무혈청 배지에서 키워 얻은 배양액을 분석한 결과, 세포외기질 단백질의 함량이 높은 것을 확인하였고, 이 배양액으로부터 엑소좀을 분리하여 분석한 결과, 엑소좀 내 유효성분의 농도가 높으며 그 효능이 향상된 것을 발견하였다. 또한, 본 발명의 고효능 엑소좀을 인간 섬유아세포 및 각질세포에 처리하였을 때 세포의 증식능과 이동능, 창상치유능이 향상되는 것을 확인하였다. 본 발명은 이에 기초한 것이다.
본 발명의 제1양태는 제대혈 유래 줄기세포를 GDF-11, EGF, FGF2, TGF-β1, 및 VEGF로 구성된 군에서 하나 또는 둘 이상 선택된 성장인자를 각각 1~20 ng/ml 농도로 첨가된 무혈청 배지에서 배양하여, 제대혈 유래 줄기세포 배양 시 분비되는 엑소좀의 농도가 0.5~5x109/ml, 바람직하게는 1~3x109/ml 로 높은 배양액을 생산하는 단계를 포함하는 것이 특징인, 제대혈 줄기세포가 분비한 엑소좀 함유 배양액 제조방법을 제공한다.
예컨대, GDF-11; 및 EGF, FGF2, TGF-β1, 및 VEGF로 구성된 군에서 하나 이상 선택된 성장인자를 각각 1~20 ng/ml 농도로 첨가된 무혈청 배지에서 제대혈 줄기세포를 배양할 수 있다.
바람직하게는 GDF-11, EGF, FGF2, TGF-β1, 및 VEGF를 모두 각각 1~20 ng/ml 농도로 첨가된 무혈청 배지에서 제대혈 줄기세포를 배양할 수 있다.
본 발명의 제2양태는 제1양태의 방법으로 수득 된 제대혈 줄기세포 엑소좀 함유 배양액 또는 이로부터 분리된 고효능 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 피부 또는 생체 멤브레인(covering and lining membranes) 도포용 조성물을 제공한다. 상기 도포용 조성물의 예로, 화장료 조성물, 의약외품 조성물, 또는 약학 조성물이 있다. 예컨대, 상기 도포용 조성물은 고분자와 혼합하여 겔화된 제형으로, 체온 조건에서는 졸화 되는 것일 수 있다.
본 발명의 제3양태는 제1양태의 방법으로 수득 된 제대혈 줄기세포의 엑소좀 함유 배양액 또는 이로부터 분리된 고효능 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 상처 또는 창상 치료용 약학 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명을 설명한다.
1. 줄기세포 배양액
성체줄기세포는 필요한 때에 특정한 조직의 세포로 분화하게 되는 미분화상태의 세포이다. 성체줄기세포는 중간엽 줄기세포, 중간엽 기질세포(mesenchymal stromal cell) 또는 다분화능 줄기세포일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 성체줄기세포는 인간 배아에서 추출한 배아 줄기세포와 달리 골수나 뇌세포 등 이미 성장한 신체조직에서 추출하기 때문에 윤리논쟁을 피할 수 있는 장점이 있다. 본 발명에서 성체줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 또는 태반으로부터 유래된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
제대혈 유래 줄기세포는 지방 또는 골수 유래 성체줄기세포와는 달리 공여자의 임신주기(40주) 동안 형성된 제대혈을 사용하기 때문에 공여자의 상태에 따른 효능차이가 발생하지 않는다는 장점이 있다.
배지는 생체 외(in vitro)에서 세포의 성장과 증식에 필요한 필수성분을 포함하는 조성물을 의미하는 것으로, 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 줄기세포 배양용 배지를 모두 포함하며, 예를 들어 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI 1640, DMEM/F-10 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-10), DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-12), α-MEM(α-Minimal essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM(Isocove's Modified Dulbecco's Medium), KnockOut DMEM 등의 상업적으로 제조된 배지 또는 인위적으로 합성한 배지를 이용할 수 있고, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 배지는 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함하며, 아미노산, 항생제 외 다양한 성장인자 등을 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 GDF-11, EGF, FGF2, TGF-β1, VEGF와 같은 성장인자는 제대혈 줄기세포 배양 시 배지에 첨가 및/또는 제대혈 줄기세포가 생산할 수 있다.
성장인자는 세포 분열이나 생장, 분화를 촉진하는 단백질성의 생리활성물질을 의미하는 것으로, 예를 들어, GDF-11 (Growth and differentiation factor 11), 뇌 유래 신경 성장인자(brain-derived neurotropic factor, BDNF), 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor, FGF), 간세포 성장인자(hepatocyte growth factor, HGF), 신경 성장인자(nerve growth factor, NGF), 혈관상피 성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF), 유사 인슐린 성장 인자(insulin-like growth factor, IGF), 형질전환 성장 인자(transforming growth factor, TGF), 혈소판 유래성장인자(platelet-derived growth factor, PDGF), 뼈 유래 성장인자(bone-derived growth factor, BDF), 콜로니 자극 인자(colony stimulation factor, CSF), 표피 성장 인자(epidermal growth factor, EGF), 각질세포 성장인자(Keratinocyte growth factor, KGF) 등이 있다.
실험예 1 내지 5에서 확인된 바와 같이, 본 발명에 따라, 무혈청 배지에 첨가된 GDF-11, EGF, FGF2, TGF-β1, VEGF은 제대혈 줄기세포의 각 성장인자의 수용체 신호경로를 자극하게 되고, SMAD 신호경로 등을 촉진하여 콜라겐과 피브로넥틴 단백질의 합성을 증가시키며, 엑소좀 내 성장인자, 콜라겐, 피브로넥틴의 함량이 증가된 것으로 해석된다. 증가된 콜라겐, 피브로넥틴, 및 성장인자 함유 엑소좀은 인간섬유아세포 및 각질세포의 증식과 이동능에 영향을 미치게 된 것으로 해석된다. 또한 Autocrine Effect와 Paracrine Effect로 인하여 EGF, FGF2, TGF-β1, VEGF, GDF-11의 재분비가 증가되고 기타 다른 성장인자의 재분비를 촉진시켜 주변세포의 증식능과 이동능에도 영향을 미치게 된 것으로 해석된다.
따라서, 본 발명에서 배양액은 제대혈 줄기세포를 배양한 세포배양 상등액을 지칭할 수 있다. 제대혈 줄기세포 배양액은 제대혈 줄기세포의 배양 과정에서 세포로부터 분비되는 여러가지 생리활성 물질을 함유하고 있다. 또한, 상기 생리활성 물질은 세포나 신체의 기능에 영향을 미칠 수 있는 사이토카인, 세포성장인자, 면역조절인자 등을 통칭하는 것으로, 생리활성 물질의 예로는 VEGF(vascular endothelial growth factor), EGF(epidermal growth factor), HGF(hepatocyte growth factor), TGF-beta(Tumor growth factor-beta), IGF(Insulin growth factor) 등이 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
2. 줄기세포 분비 엑소좀
엑소좀은 세포막을 가로질러 물질을 전달할 수 있어 약물 전달을 위한 이상적인 소낭으로 평가되고 있는데, 이러한 지질 이중층 소낭 시스템은 피부 침투 문제점을 극복할 수 있으므로 약물을 피부 진피층까지 전달하기 위한 가장 효과적인 전략 중 하나로 평가되고 있다(Saahil Arora et al., Asian Journal of Pharmaceutics, 6, 4, 237-244, 2012).
또한, 엑소좀은 해당 엑소좀이 유래된 세포 타입을 반영하는 RNA, 단백질, 지질 및 대사물질들을 함유한다. 엑소좀은 해당 엑소좀이 유래된 세포의 다양한 분자 구성성분들(예, 단백질들 및 RNA)을 함유한다. 엑소좀 단백질 조성은 해당 엑소좀이 유래된 세포 및 조직(tissue)에 따라 다양하나, 대부분의 엑소좀은 진화적으로 보존된 공통의 단백질 분자들 세트를 함유한다.
엑소좀은 세포를 배양한 후 수득된 배양액에서 분리하여 수득 할 수 있으며, 엑소좀 크기 및 함량은 엑소좀을 생산하는 세포가 받은 분자 신호에 의해 영향을 받을 수 있다.
본 발명은 엑소좀 분리없이 배양액 자체를 원료로 사용할 수 있으나, 엑소좀을 분리하여 사용할 수도 있다. 또한, 품질 보증 등을 위해 배양액 내 엑소좀의 크기 물성을 확인하기 위해 엑소좀을 분리할 수 있다.
배양액으로부터 엑소좀을 분리하기 위한 방법으로 원심분리법, 면역결합법, 여과법 등을 활용할 수 있다.
엑소좀 분리방법 중 가장 보편적으로 쓰이는 초원심분리 (Ultracetrifugation)는 한 번에 다량의 엑소좀을 분리할 수 없으며, 고가의 장비가 필요하고 분리하는데 많은 시간이 소요되며 강한 원심분리로 인해 엑소좀에 물리적으로 손상이 발생할 수 있고, 특히 분리된 엑소좀의 순도가 떨어지는 등의 단점이 있다. 이러한 단점을 개선하기 위한 방법 중, 엑소좀의 막 (membrane)에 존재하는 단백질인 포스파티딜세린(phosphatidylserine, PS)에 특이적으로 결합하는 물질을 이용함으로써 분리되는 엑소좀의 순도를 높인 PS 친화성 방법 (PS affinity method)이 있다. 이는 초원심분리 방법에 비해 높은 순도의 엑소좀을 분리할 수 있지만 수율이 낮다는 단점이 있다.
제대혈 중간엽 줄기세포(UCB-MSC) 배양액 내 엑소좀은 지방조직 유래 중간엽 줄기세포 또는 골수 유래 중간엽 줄기세포의 배양액 내 엑소좀보다 높은 수준으로 EGF, VEGF, TGF, HGF, FGF, IGF 및 PDGF 등의 다양한 성장 인자들을 함유하고 있다. EGF 등의 성장 인자는 피부 구성세포인 섬유아세포의 증식을 촉진하며, 세포의 이동 및 콜라겐 합성 등을 촉진하므로, 상기 UCB-MSC 유래 엑소좀은 피부 재생, 피부 탄력 개선, 피부 주름 방지 또는 개선, 피부 노화 방지 또는 개선, 모발 성장 또는 축소된 모낭 복원 등의 우수한 피부 상태 개선 효과 및 상처치유 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명에 따라 제조된 줄기세포 배양액 내에는 엑소좀을 다량 함유할 뿐만 아니라 이로인해 특유의 지질 이중층 구조에 의하여 피부 진피층까지 침투하여 재생 효과를 높일 수 있는 나노사이즈의 엑소좀도 다량으로 제공할 수 있으며, 엑소좀 내에 다양한 성장인자를 다량 함유하고 있기 때문에 피부 구성세포인 섬유아세포의 증식과 활성화를 통한 피부 재생 및 항노화 효과, 콜라겐합성 증가, 모발 성장, 축소된 모낭 복원 및 상처치유 효과를 발휘할 수 있다.
본 발명의 엑소좀은 이를 함유한 배양액으로 생산 또는 사용될 수도 있으며, 상기 배양액으로부터 세포를 제거한 상태로 생산 또는 사용될 수도 있다. 세포를 제거한, 엑소좀 함유 배양액은 cell-free 제제이기 때문에 발암의 위험성이 적고 이식거부 반응의 문제가 없을 뿐만 아니라, 전신 투여 시 미세혈관에 폐색을 일으킬 우려가 없으며, 세포가 아닌 분리물질로써 off the shelf 제품으로의 약제 개발이 가능하므로 제조단가를 줄일 수 있다.
본 발명은 제대혈 유래 줄기세포 배양 시 분비되는 엑소좀의 농도가 0.5~5x109/ml, 바람직하게는 1~3x109/ml 로 높은 배양액을 생산하기 위해, 제대혈 유래 줄기세포를 EGF, FGF2, TGF-β1, VEGF, 및/또는 GDF-11이 각각 1~20 ng/ml 농도로 첨가된 무혈청 배지에서 배양하는 것이 특징이다.
본 발명자들은 제대혈 중간엽 줄기세포를 성장인자(Growth Factors)인 EGF, FGF2, TGF-β1, VEGF, GDF-11이 각각 1~20 ng/ml 농도로 첨가된 특정 배양 조건으로 배양한 결과, 상기 성장인자가 첨가되지 않은 무혈청 배지에서 제대혈 줄기세포를 배양한 경우와 대비, 배양액 내 존재하는 엑소좀의 농도가 높으며(1~3x109/ml), 상기 엑소좀은 인간 섬유아세포와 인간 각질형성세포의 이동능 및 증식능을 향상시킨다는 것을 발견하였다. 또한, 제대혈 줄기세포를 EGF, FGF2, TGF-β1, VEGF, GDF-11이 1~20 ng/ml 농도로 첨가된 무혈청 배지에서 배양하여 생산하는 배양액은 세포외기질인 피브로넥틴 단백질 및/또는 콜라겐 단백질을 다량 함유한다는 것을 발견하였다. 나아가, 경피 투과가 용이한 작은 입자 크기 직경 100 nm ± 20 nm의 엑소좀을 다량 생산하는 것을 발견하였다. 본 발명은 이에 기초한 것이다.
본 발명에 따라 제대혈 줄기세포 배양시 분비되는 엑소좀의 크기를 균일하게 하고 고농도로 함유된 고농도의 성장인자 함유 엑소좀을 다량 함유하는 줄기세포 배양액 또는 이로부터 분리된 엑소좀은 피부(skin)와 같은 생체 멤브레인(covering and lining membranes) 도포용 조성물의 유효성분일 수 있다.
따라서, 본 발명은 제대혈 줄기세포의 세포배양을 통해 경피를 투과하는 100 nm 내외 크기의 엑소좀을 대량생산할 수 있을 뿐만 아니라, 본 발명에 따라 제조된 제대혈 유래 줄기세포 배양액은 인간 섬유아세포의 이동능 및 증식능을 향상시킬 수 있는 엑소좀의 함유량이 높아서 배양액의 피부와 같은 생체 멤브레인(covering and lining membranes)의 투과도가 높고, 피브로넥틴 단백질 및/또는 콜라겐 단백질을 다량 함유하고 있으므로, 피부(skin)와 같은 생체 멤브레인(covering and lining membranes) 도포용 제형(예, 약학조성물, 화장료, 의약외품) 및/또는 상처치료제 또는 창상치료제와 같은 치료제에 바람직할 뿐만 아니라, 사용시 우수한 효능을 발휘할 수 있다.
3. 다양한 제형화
본 발명에 따라 제대혈 유래 줄기세포가 분비한 엑소좀 함유 배양액 및/또는 배양액에서 분리한 엑소좀은 사용 목적에 따라 다양하게 제형화 할 수 있다.
예컨대, 엑소좀 함유 배양액 및/또는 배양액에서 분리한 엑소좀을 겔화(gelation)하거나; 동결 및/또는 건조하여 분말화 할 수 있다.
하이드로겔, 젤라틴 등의 성분과 혼합하여 성분의 함량비에 따른 점성 차이로 인한 젤화(gelation)과 졸화(solation)의 조절이 가능한 피부 또는 생체 멤브레인(covering and lining membranes) 도포용 조성물로 사용될 수 있으며, poloxamer 등의 성분과 혼합하여 4℃ 조건에서 겔화 되며 체온 조건에서 졸화 되게 제형을 설계할 수 있다.
화장료 조성물은 용액, 외용 연고, 크림, 폼, 영양 화장수, 유연 화장수, 향수, 팩, 유연수, 유액, 메이크업 베이스, 에센스, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 선 스크린 크림, 선 오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 계면 활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패치 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
화장료 조성물은 일반 피부 화장료에 배합되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 성분으로 예를 들면 유분, 물, 계면 활성제, 보습제, 저급 알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
화장료 조성물에 포함되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체는 상기 화장료 조성물의 제형에 따라 다양하다.
제형이 연고, 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는, 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화 아연 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실리케이트, 폴리아미드 파우더 등이 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로하이드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제 등이 이용될 수 있으며, 예컨대 물, 글리세린, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일 등이 이용될 수 있고, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브 오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 물, 글리세린, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타하이드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
제형이 비누인 경우에는, 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속 염, 지방산 헤미에스테르 염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알코올, 식물성 유, 글리세롤, 당 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
화장료 조성물에서, 상기 엑소좀은 상기 화장료 조성물 총 중량의 0.0001 내지 50 중량%로 포함될 수 있으며, 더욱 구체적으로 0.0005 내지 10 중량%로 포함될 수 있다. 엑소좀이 상기 범위 내로 포함될 때, 우수한 피부 상태 개선 효능을 나타내는 이점이 있으며, 조성물의 제형이 안정화되는 이점이 있다.
통상 의약외품은 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 개선, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 물품들 중에서 의약품보다 작용이 경미하거나 의약품의 용도로 사용되는 물품을 제외한 것을 의미한다. 사람이나 동물의 질병 치료나 예방에 쓰이는 제품, 인체에 대한 작용이 경미하거나 직접 작용하지 않는 제품 등이 포함된다.
의약외품 조성물은 바디 클렌저, 폼, 비누, 마스크, 연고제, 크림, 로션, 에센스 및 스프레이로 이루어진 군에서 선택되는 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명이 피부(skin)와 같은 생체 멤브레인(covering and lining membranes) 도포용 또는 상처/창상 치료용 약학 조성물인 경우, 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 것에 더하여, 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.
"약학적으로 허용 가능"하다는 것은, 투여 시 생물체를 자극하지 않으면서, 투여되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는, 약학 분야에서 통상적으로 사용될 수 있는 것을 의미한다.
투여량은 피부 상태 개선을 위해 약학적으로 유효한 양일 수 있다. 상기 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 질환의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 또한, 유효량은 당업자에게 인식되어 있듯이 처리의 경로, 부형제의 사용 및 다른 약제와 함께 사용할 수 있는 가능성에 따라 변할 수 있다.
담체의 종류는 특별히 제한되지 않으며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 이에 제한되지 않으나 구체적인 예로, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 말토 덱스트린, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
또한, 필요한 경우, 부형제, 희석제, 항산화제, 완충액 또는 정균제 등 기타 약학적으로 허용 가능한 첨가제들을 첨가하여 사용할 수 있으며, 충진제, 증량제, 습윤제, 붕해제, 분산제, 계면 활성제, 결합제 또는 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 사용할 수 있다.
본 발명을 따라 제조되는 제대혈 중간엽 줄기세포 배양액은 균일한 크기 분포의 고효능 엑소좀을 고함량으로 함유하며, 피부 투과가 필요한 화장료 조성물과 상처/창상치료용 약학 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 실시예 1에 따라 각 조건별로 준비된 제대혈 줄기세포 배양액 내 존재하는 전체 단백질의 농도와 세포외기질 단백질 함유량을 비교 분석한 결과이다.
도 2는 실시예 1에 따라 각 조건별로 준비된 제대혈 유래 줄기세포 배양액 내 존재하는 엑소좀의 분포, 크기와 농도를 비교 분석한 결과이다.
도 3은 실시예 1에 따라 각 조건별로 준비된 제대혈 유래 줄기세포 배양액의 엑소좀이 인간 섬유아세포와 각질세포의 이동능에 미치는 영향을 비교 분석한 결과이다.
도 4는 실시예 1에 따라 각 조건별로 준비된 제대혈 유래 줄기세포 배양액의 엑소좀이 인간 섬유아세포와 각질세포의 증식능에 미치는 영향을 비교 분석한 결과이다.
도 5는 실시예 1에 따라 각 조건별로 준비된 제대혈 유래 줄기세포 배양액의 엑소좀을 동물 창상모델에 처리하여 피부세포재생에 미치는 영향을 비교 분석한 결과이다.
도 6은 피부의 상위개념인 생체 멤브레인(covering and lining membranes)을 설명하는 개념도이다.
도 7 은 섬유아세포(fibroblast)가 생산하는 다양한 유효성분들을 보여주는 개념도이다.
도 8은 피부 표피(skin epidermis)의 주요 구조적 특징을 보여주는 개념도이다.
도 9는 섬유아세포(fibroblast)와 각질 세포(keratinocyte)의 상호작용을 도시한 개념도이다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 기술적 특징을 명확하게 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 보호범위를 한정하는 것은 아니다.
실시예 1. 제대혈 줄기세포 배양액 제조 및 제대혈 줄기세포가 분비한 엑소좀 추출
*제대혈 줄기세포(Humam umbilical cord blood stem cell)를 10% 우태혈청(Fetal bovine serum)을 함유하는 KSB-3(Basal Culture Medium)로 37℃ 5% CO2 배양기에서 1~4일간 배양한 다음, 배양배지를 제거 후 PBS로 세척하였다.
세척한 세포에 GDF-11(1~20ng/ml), EGF(1~20ng/ml), FGF2(1~20ng/ml), TGF-β1(1~20ng/ml), 및 VEGF(1~20ng/ml)이 첨가된 DMEM 배지와 성장인자를 포함하지 않은 DMEM 배지를 각각 넣어 37℃ 5% CO2 배양기에서 1~4일간 배양한 다음 500 g에서 5분간 원심분리후 상층액을 분리한 다음 0.2 μm~0.8 μm 필터로 여과하였다.
각 조건에서 생산하여 0.2 μm ~ 0.8 μm 필터로 여과한 배양액을 Capturem™ Exosome Isolation Kit (Takara Bio)를 사용하여 엑소좀을 추출하였다, 추출한 엑소좀을 Amicon Ultra Centrifugal Filter(Merck Millipore)를 활용하여 PBS로 버퍼교환을 시행한 후 각 시험에 사용하였다.
실험예 1. 제대혈 줄기세포 배양액 내 세포외기질 단백질 함유량 분석
세포의 구조적 지지 등을 담당하는 결합조직 내 세포외기질(Extracellular Molecule)은 대표적으로 피브로넥틴(Fibronectin), 콜라겐(Collagen), 엘라스틴(Elastin)과 같은 성분이 있으며 손상된 조직을 재생시키는 역할을 한다.
제대혈 줄기세포 배양액 내 총 단백질량을 분석하기 위하여 BCA Assay를 진행하였으며, 제대혈 줄기세포 배양액 내 세포외기질 단백질 함유량을 분석하기 위하여 효소결합 면역 침강 분석법(ELISA assay)을 실시하였다. 실시예 1에서 준비된 각 조건의 배양액을 Human Fibronectin Quantikine ELISA Kit(R&D System, MN, USC)와 Procollagen Type I C-peptide (PIP) EIA Kit(Takara bio inc, Japan)로 비교분석 하였다.
구체적으로, 성장인자가 포함되지 않은 배지를 사용한 배양액(DMEM); 및 GDF-11, EGF, FGF2, TGF-β1, 및 VEGF이 각각 1~20ng/ml 농도로 첨가된 배지를 사용한 배양액의 총 단백질량과 세포외기질 단백질 성분 함량을 비교 분석하였다.
그 결과 도 1의 A에서 볼 수 있듯이 GDF-11, EGF, FGF2, TGF-β1, 및 VEGF이 각각 1~20ng/ml 농도로 첨가된 배지를 사용한 배양액 내 존재하는 총 단백질량과 피브로넥틴(Fibronectin) 단백질 함유량이 대조군(DMEM) 대비 높은 것을 확인하였다. 또한, 도 1의 B에서 볼 수 있듯이 콜라겐 단백질(PIP) 함유량이 대조군(DMEM) 대비 높은 수준으로 함유하고 있는 것을 확인하였다.
실험예 2. 제대혈 줄기세포 배양액 내 존재하는 엑소좀의 크기와 농도 분석
실시예 1에서 각 조건별로 배양하여 준비한 제대혈 줄기세포 배양액에서 엑소좀 분리 후 배양액 내 존재하는 엑소좀 크기와 농도를 Nanosight를 활용하여 비교 분석하였다. Nanosight는 용액에서 10nm~2000nm 사이즈의 나노 입자 확산 운동을 하고 있는 개별입자를 관찰하고 분석하여 나노 입자크기의 분포와 농도를 분석할 수 있다.
그 결과, 도 2에서 볼 수 있듯이 성장인자가 포함되지 않은 배지를 사용한 대조군(DMEM)에 비하여 GDF-11, EGF, FGF2, TGF-β1, 및 VEGF이 각각 1~20ng/ml 농도로 첨가된 배지를 사용한 경우 엑소좀의 개수가 많으며 100 nm 내외로 크기 분포가 고르게 나타나는 것을 확인하였다.
실험예 3. 제대혈 줄기세포 배양액 내 엑소좀이 인간 섬유아세포와 각질세포의 이동능에 미치는 영향
상처치료에 있어 표피세포의 이동능은 주요한 기전으로, 제대혈 줄기세포의 배양액 내 엑소좀이 인간 섬유아세포(human dermal fibroblast, HDF)와 각질세포(human keratinocyte, HKC)의 이동능에 미치는 영향을 확인하기 위하여 Trans-well migration Assay를 실시하였다.
Trans-well Insert에 인간 섬유아세포와 각질세포를 각각 2x104cells/well로 분주하고 37℃ 5% CO2 조건에서 하루 배양한 다음 배양 배지를 제거 후 PBS로 세척하였다. 실시예 1에서 준비 및 추출된 각 조건별 엑소좀이 포함된 Serum-free DMEM을 100ul/well 처리하고 2시간 후 Bottom plate에 10% Serum이 포함된 DMEM을 400ul 넣고 37℃ 5% CO2 조건에서 하루 배양하였다. 이동된 세포를 염색하기 위하여 Cristal Violet Solution으로 염색한 후 광학 현미경으로 비교 분석하였다.
구체적으로, 성장인자가 포함되지 않은 배지(DMEM)을 사용한 배양액과 GDF-11, EGF, FGF2, TGF-β1, 및 VEGF이 각각 1~20ng/ml 농도로 첨가된 배지를 사용한 배양액에서 추출한 엑소좀 2x108개를 인간 섬유아세포에 처리하였으며 제대혈 줄기세포를 배양하지 않은 기본 배지(Basal DMEM)를 음성대조군(non treat)로 사용하였다.
그 결과, 도 3에서 볼 수 있듯이 GDF-11, EGF, FGF2, TGF-β1, 및 VEGF이 각각 1~20ng/ml 농도로 첨가된 배지를 사용한 제대혈 줄기세포 배양액에서 분리한 엑소좀을 처리한 인간 섬유아세포와 각질세포의 이동능이 대조군과 비교하여 증가하는 것을 확인하였다.
실험예 4. 제대혈 줄기세포 배양액 내 엑소좀이 인간 섬유아세포와 각질세포의 증식능에 미치는 영향
창상치료에 있어 섬유아세포와 각질세포의 증식 또한 재생 과정에 있어 중요한 부분이다. 따라서, 배양액의 인간 섬유아세포와 각질세포의 증식에 미치는 영향을 확인하기 위하여 Proliferation Assay를 진행하였다. 6well Plate에 인간 섬유아세포와 각질세포를 각각 1x105 cells/well로 분주하고 37℃ 5% CO2 조건에서 배양하였다. 24시간 간격으로 세포의 수를 측정하였다.
구체적으로, 성장인자가 포함되지 않은 배지(DMEM)를 사용한 배양액과 GDF-11, EGF, FGF2, TGF-β1, 및 VEGF이 각각 1~20ng/ml 농도로 첨가된 배지를 사용한 배양액에서 추출한 각 엑소좀 2x108개를 인간 섬유아세포와 각질세포에 처리하였으며 제대혈 줄기세포를 배양하지 않은 기본 배지(Basal DMEM)를 음성대조군(non treat)로 사용하였다.
그 결과, 도 4에서 볼 수 있듯이 성장인자 GDF-11, EGF, FGF2, TGF-β1, 및 VEGF이 각각 1~20ng/ml 농도로 첨가된 배지를 사용한 제대혈 줄기세포 배양액에서 분리한 엑소좀을 처리한 인간 섬유아세포와 각질세포의 증식능이 대조군과 비교하여 증가하는 것을 확인하였다.
실험예 5. 제대혈 줄기세포 배양액 내 엑소좀이 동물창상모델의 피부 조직 재생에 미치는 영향
체외(In-vitro)에서 확인한 제대혈 줄기세포 분비 엑소좀이 인간피부세포의 증식능과 이동능을 향상시키는 것과 동일하게 체내(In-vivo) 에서도 동일하게 향상시키는지 확인하기 위하여 동물창상모델 시험을 진행하였다. 6주령의 SD Rat의 등 부분에 15mm size 창상을 형성한 다음 2x108개 엑소좀을 처리하였다. 14일 후 피부조직재생효과를 확인하였다.
구체적으로, 실시예 1에서 GDF-11, EGF, FGF2, TGF-β1, 및 VEGF이 각각 1~20ng/ml 농도로 첨가된 배지를 사용한 배양액에서 추출한 각 엑소좀 2x108개를 동물창상모델에 처리하였으며 아무 처리를 하지 않은 동물창상모델을 음성대조군(NC)로 사용하였다.
그 결과, 도 4에서 볼 수 있듯이 GDF-11, EGF, FGF2, TGF-β1, 및 VEGF이 각각 1~20ng/ml 농도로 첨가된 배지를 사용한 제대혈 줄기세포 배양액에서 분리한 엑소좀을 처리한 동물창상모델의 피부조직재생능이 대조군과 비교하여 월등히 뛰어난 것을 확인하였다.

Claims (15)

  1. 제대혈 줄기세포를 GDF-11, EGF, FGF2, TGF-β1, 및 VEGF로 구성된 군에서 하나 또는 둘 이상 선택된 성장인자를 각각 1~20 ng/ml 농도로 첨가된 무혈청 배지에서 배양하여, 제대혈 줄기세포 배양 시 분비되는 엑소좀의 농도가 0.5~5x109/ml로 높은 배양액을 생산하는 단계를 포함하는 것이 특징인, 제대혈 줄기세포가 분비한 엑소좀 함유 배양액 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 제대혈 줄기세포를 GDF-11; 및 EGF, FGF2, TGF-β1, 및 VEGF로 구성된 군에서 하나 이상 선택된 성장인자를 각각 1~20 ng/ml 농도로 첨가된 무혈청 배지에서 배양하는 것이 특징인, 제대혈 줄기세포가 분비한 엑소좀 함유 배양액 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 제대혈 줄기세포를 GDF-11, EGF, FGF2, TGF-β1, 및 VEGF를 모두 각각 1~20 ng/ml 농도로 첨가된 무혈청 배지에서 배양하는 것이 특징인, 제대혈 줄기세포가 분비한 엑소좀 함유 배양액 제조방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 성장인자가 첨가된 무혈청 배지에서 제대혈 줄기세포가 분비한 엑소좀 함유 배양액은 상기 성장인자가 첨가되지 않은 무혈청 배지에서 제대혈 줄기세포를 배양하여 생산한 배양액 대비, 세포외기질 단백질인 피브로넥틴(Fibronectin) 및/또는 콜라겐(Collagen, PIP) 함유량이 더 높은 수준인 것이 특징인, 제대혈 줄기세포가 분비한 엑소좀 함유 배양액 제조방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 성장인자가 첨가된 무혈청 배지에서 제대혈 줄기세포가 분비한 엑소좀 함유 배양액은 성장인자가 첨가되지 않은 무혈청 배지에서 제대혈 줄기세포를 배양하여 생산한 배양액 대비, 분비된 엑소좀의 개수가 더 많고, 엑소좀 내 더 높은 고농도의 유효성분을 함유하고 있어 피부재생능력이 더 높은 것이 특징인. 제대혈 줄기세포가 분비한 엑소좀 함유 배양액 제조방법.
  6. 제 1항에 있어서, 경피 투과가 용이한 작은 입자 크기 직경 100 nm ± 20 nm의 엑소좀을 대량생산하는 것이 특징인 제대혈 줄기세포가 분비한 엑소좀 함유 배양액 제조방법.
  7. 제1항에 있어서, 배지는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI 1640, DMEM/F-10 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-10), DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-12), α-MEM(α-Minimal essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM(Isocove's Modified Dulbecco's Medium), 및 KnockOut DMEM으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 배지인 것이 특징인, 제대혈 줄기세포가 분비한 엑소좀 함유 배양액 제조방법.
  8. 제1항에 있어서, 제대혈 줄기세포가 분비한 엑소좀 함유 배양액 또는 배양액에서 분리한 엑소좀을 사용 목적에 따라 제형화하는 단계를 더 포함하는 것이 특징인, 제대혈 줄기세포가 분비한 엑소좀 함유 배양액 제조방법.
  9. 제8항에 있어서, 엑소좀 함유 배양액 또는 배양액에서 분리한 엑소좀을 겔화(gelation)하거나; 동결 또는 건조하여 분말화하는 것이 특징인, 제대혈 줄기세포가 분비한 엑소좀 함유 배양액 제조방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 성장인자가 첨가된 무혈청 배지에서 제대혈 줄기세포 배양 시 분비되는 엑소좀은, 상기 성장인자가 첨가되지 않은 무혈청 배지에서 제대혈 줄기세포를 배양시 분비되는 엑소좀 대비, 인간 섬유아세포 및/또는 인간 각질형성세포의 이동능 및/또는 증식능을 향상시키는 것이 특징인, 제대혈 줄기세포가 분비한 엑소좀 함유 배양액 제조방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 수득 된 제대혈 줄기세포 엑소좀 함유 배양액 또는 이로부터 분리된 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 피부 또는 생체 멤브레인(covering and lining membranes) 도포용 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 화장료 조성물, 의약외품 조성물, 또는 약학 조성물인 것이 특징인 피부 또는 생체 멤브레인(covering and lining membranes) 도포용 조성물.
  13. 제11항에 있어서, 제대혈 줄기세포의 소형 엑소좀은 경피투과형 운반체로 사용되는 것이 특징인 피부 또는 생체 멤브레인(covering and lining membranes) 도포용 조성물.
  14. 제11항에 있어서, 고분자와 혼합하여 겔화된 제형으로, 체온 조건에서는 졸화 되는 것이 특징인 피부 또는 생체 멤브레인(covering and lining membranes) 도포용 조성물.
  15. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 수득 된 제대혈 줄기세포의 엑소좀 함유 배양액 또는 이로부터 분리된 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 상처 또는 창상 치료용 약학 조성물.
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