WO2021243921A1 - 检测SARS-CoV-2的组合物、试剂盒、方法及其用途 - Google Patents

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    • C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes

Definitions

  • coronavirus 2019-nCoV, SARS-CoV-2
  • SARS-CoV-2 The new type of coronavirus (2019-nCoV, SARS-CoV-2) was named SARS-CoV-2 on February 11 by the International Committee for Classification of Viruses.
  • Coronavirus is a large virus family. Before this, there are 6 known species that can infect humans, such as causing colds, Middle East Respiratory Syndrome (MERS) and Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS).
  • SARS-CoV-2 is a new strain of coronavirus that has never been found in the human body before. The virus belongs to the ⁇ -type coronavirus in the Coronavirus family (Coronaviridae) and belongs to the genus Coronavirus.
  • the third probe is used to detect the amplified product of the third primer pair.
  • the primers and probes used are all used for qPCR.
  • N gene forward primer 1 5'-GGTATTTCTACTACCTAGGAACT-3' (SEQ ID NO: 5);
  • ORF1ab negative primer 1-1 5'-ACATCTGTCGTAGTGCAACAGGAC-3' (SEQ ID NO: 9);
  • ORF1ab probe 1-2 5'-CCAATTCTGCTGTCAAATTACAGAATA-3' (SEQ ID NO: 13).
  • ORF1ab probe 2-2 5'-ATGTGCTCATGGATGGCTCTATTATTCAATT-3' (SEQ ID NO: 19).
  • N gene negative primer 1 5'-TGCAGCATTGTTAGCAGGATTG-3' (SEQ ID NO: 6);
  • ORF1ab probe 2-2 5'-ATGTGCTCATGGATGGCTCTATTATTCAATT-3' (SEQ ID NO: 19).
  • the present invention provides a third composition including:
  • the first probe is a first probe
  • probes such as those shown in SEQ ID NO: 7, 10, 13, 16, 19, 22, and 45 can be designed, for example.

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Abstract

提供了一种用于检测SARS-CoV-2的组合物；同时，还提供了包括该组合物的试剂盒，所述试剂盒的用途，以及用于检测SARS-CoV-2的方法。

Description

检测SARS-CoV-2的组合物、试剂盒、方法及其用途 技术领域
本发明属于分子生物学检测领域；具体地，涉及SARS-CoV-2的检测。
背景技术
新型冠状病毒(2019-nCoV，SARS-CoV-2)，在2月11日国际病毒分类委员会将该病毒命名为SARS-CoV-2。冠状病毒是一个大型病毒家族，在此之前已知有6种可以感染到人类，如可引起感冒以及中东呼吸综合征(MERS)和严重急性呼吸综合征(SARS)等。SARS-CoV-2是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株，该病毒在分类学上属于冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)中的β类型冠状病毒，具有囊膜和刺突细胞学特征基因组为线性单股正链的RNA((+)ssRNA)病毒。SARS-CoV-2从2019年末发现至今，短短的4个月，几乎在全世界爆发，在全球累积造成超过140万人感染，累积造成超过7万人死亡，引起了国际社会高度重视。
在目前《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)》中，SARS-CoV-2的核酸的检出仍是唯一确诊依据，在诊疗方案中了明确核酸检测的方式有两种：(1)实时荧光定量PCR(qPCR)检测核酸阳性；(2)病毒基因测序，测序结果与已知SARS-CoV-2高度同源。
病毒基因测序法虽然结果更为准确，但是其耗时长，成本高，很难大规模运用临床。
由于基因测序法存在上述限制，所以临床上，大部分的高疑待排患者都采取qPCR来进行检测。因为相对基因测序而言，qPCR方式具有速度快、可批量化、价格低等优势。
据报道，自从qPCR检测试剂大面积用于临床诊断以来，初次核酸阳性检 出率只有30-50％；此外，更有医疗机构报道，个别病例在不同时间5次以上结果由阴性转为阳性；且在国内外网上爆出多个报道，WHO提供的引物探针存在特异性问题，美国CDC提供的检测试剂存在检测效果差的问题，还有康复出院后，再次发现SARS-CoV-2核酸检测转阳。以上这些情况的发生为临床诊断和疾病控制带来极大困扰。
因此，本领域需求一种更为灵敏和准确检测SARS-CoV-2的qPCR相关产品。
发明内容
为解决以上问题，本发明人进行了大量分析和实验研究，发现针对SARS-CoV-2的基因组中ORF1ab基因(Genbank登陆号：NC_045512.2(266..21555))上的两个特定区域，来设计qPCR检测的扩增引物以及探针，能够有效地提高核酸阳性检出率，据此完成本发明。
上述所提及的两个特定区域分别为：
ACAATTCACCTAATTTAGCATGGCCTCTTATTGTAACAGCTTTAAGGGCCAATTCTGCTGTCAAATTACAGAATAATGAGCTTAGTCCTGTTGCACTACGACAGATGTCTTGTGCTGCCGGTACTACACAAACTGCTTGCACTGATGACAATGCGTTAGCTTACTACAAC(SEQ ID NO:1)；以及
Figure PCTCN2020121026-appb-000001
因此，在第一方面，本发明提供了一种用于检测SARS-CoV-2的组合物，包括：
第一引物对，用于特异性地扩增SARS-CoV-2的N基因；
第一探针，用于检测所述第一引物对的扩增产物；
第二引物对，用于特异性地扩增ORF1ab基因中如SEQ ID NO:1所示的区 域；
第二探针，用于检测所述第二引物对的扩增产物；
第三引物对，用于特异性地扩增ORF1ab基因中如SEQ ID NO:2所示的区域；和
第三探针，用于检测所述第三引物对的扩增产物。
在本发明中，所使用的引物和探针均用于qPCR。
通过对上述ORF1ab基因的两个特定区域，以及N基因同时进行检测，本发明的组合物提高了对SARS-CoV-2的核酸阳性检出率，使得检测结果更为准确，对于疫情防控和确诊病患的治疗有积极的意义。
在优选的实施方案中，本发明的第一引物对特异性地扩增N基因(Genbank登陆号：NC_045512.2(28274..29533))的以下区域：
Figure PCTCN2020121026-appb-000002
在一个具体的实施方案中，本发明的第一引物对和第一探针为：
N基因正向引物1：5’-GGTATTTCTACTACCTAGGAACT-3’(SEQ ID NO:5)；
N基因负向引物1：5’-TGCAGCATTGTTAGCAGGATTG-3’(SEQ ID NO:6)；和
N基因探针1：5’-GCCAGAAGCTGGACTTCCCTATGGTGC-3’(SEQ ID NO:7)。
在一个具体的实施方案中，本发明的第一引物对和第一探针为：
N基因正向引物2：5’-ACTACCTAGGAACTGGGCCAG-3’(SEQ ID NO:43)；
N基因负向引物2：5’-AGCAGGATTGCGGGTGCCAAT-3’(SEQ ID NO:44)；和
N基因探针2：5’-ACTTCCCTATGGTGCTAACAAAGACGGCAT-3’(SEQ ID NO:45)。
使用本发明的N基因引物以及探针，使得N基因的Ct值显著前移，也就意味着，N基因的检测下限降低，能够检测更低浓度的N基因，也就有助于检测更低浓度的SARS-CoV-2，使得检测更为灵敏、准确。
在一个具体的实施方案中，本发明的第二引物对和第二探针为：
ORF1ab正向引物1-1：5’-ATTCACCTAATTTAGCATGGCCTC-3’(SEQ ID NO:8)；
ORF1ab负向引物1-1：5’-ACATCTGTCGTAGTGCAACAGGAC-3’(SEQ ID NO:9)；和
ORF1ab探针1-1：5’-TTGTAACAGCTTTAAGGGCCAATTCTGCTGT-3’(SEQ ID NO:10)。
在一个具体的实施方案中，本发明的第二引物对和第二探针为：
ORF1ab正向引物1-2：5’-ATGGCCTCTTATTGTAACAGCT-3’(SEQ ID NO:11)；
ORF1ab负向引物1-2：5’-AGCAGTTTGTGTAGTACCGGCAGC-3’(SEQ ID NO:12)；和
ORF1ab探针1-2：5’-CCAATTCTGCTGTCAAATTACAGAATA-3’(SEQ ID NO:13)。
在一个具体的实施方案中，本发明的第三引物对和第三探针为：
ORF1ab正向引物2-1：5’-GAAGGTTCTGTTGCTTATGAAAGTT-3’(SEQ ID NO:14)；
ORF1ab负向引物2-1：5’-TACCACTCTAACAGAACCTTC-3’(SEQ ID NO:15)；
ORF1ab探针2-1：5’-GCCCTGACACACGTTATGTGCTCATGGA-3’(SEQ ID NO:16)。
在一个具体的实施方案中，本发明的第三引物对和第三探针为：
ORF1ab正向引物2-2：5’-ATGAAAGTTTACGCCCTGAC-3’(SEQ ID NO:17)；
ORF1ab负向引物2-2：5’-CCGTGCCTACAGTACTCAGAATC-3’(SEQ ID NO:18)；和
ORF1ab探针2-2：5’-ATGTGCTCATGGATGGCTCTATTATTCAATT-3’(SEQ ID NO:19)。
上述的第一引物对和第一探针、第二引物对和第二探针，以及第三引物对和第三探针分别的具体引物对和探针序列可以相互组合，只要满足每种组合物包括第一引物对和第一探针、第二引物对和第二探针，以及第三引物对和第三探针即可。
在一个示例性的实施方案中，本发明提供了第一组合物，包括：
第一引物对：
N基因正向引物1：5’-GGTATTTCTACTACCTAGGAACT-3’(SEQ ID NO:5)；
N基因负向引物1：5’-TGCAGCATTGTTAGCAGGATTG-3’(SEQ ID NO:6)；
第一探针：
N基因探针1：5’-GCCAGAAGCTGGACTTCCCTATGGTGC-3’(SEQ ID NO:7)；
第二引物对：
ORF1ab正向引物1-1：5’-ATTCACCTAATTTAGCATGGCCTC-3’(SEQ ID NO:8)；
ORF1ab负向引物1-1：5’-ACATCTGTCGTAGTGCAACAGGAC-3’(SEQ ID NO:9)；
第二探针：
ORF1ab探针1-1：5’-TTGTAACAGCTTTAAGGGCCAATTCTGCTGT-3’(SEQ ID NO:10)；以及
第三引物对：
ORF1ab正向引物2-1：5’-GAAGGTTCTGTTGCTTATGAAAGTT-3’(SEQ ID NO:14)；
ORF1ab负向引物2-1：5’-TACCACTCTAACAGAACCTTC-3’(SEQ ID NO:15)；
第三探针：
ORF1ab探针2-1：5’-GCCCTGACACACGTTATGTGCTCATGGA-3’(SEQ ID NO:16)。
在另一个示例性的实施方案中，本发明提供了第二组合物，包括：
第一引物对：
N基因正向引物1：5’-GGTATTTCTACTACCTAGGAACT-3’(SEQ ID NO:5)；
N基因负向引物1：5’-TGCAGCATTGTTAGCAGGATTG-3’(SEQ ID NO:6)；
第一探针：
N基因探针1：5’-GCCAGAAGCTGGACTTCCCTATGGTGC-3’(SEQ ID NO:7)；
第二引物对：
ORF1ab正向引物1-2：5’-ATGGCCTCTTATTGTAACAGCT-3’(SEQ ID NO:11)；
ORF1ab负向引物1-2：5’-AGCAGTTTGTGTAGTACCGGCAGC-3’(SEQ ID NO:12)；
第二探针：
ORF1ab探针1-2：5’-CCAATTCTGCTGTCAAATTACAGAATA-3’(SEQ ID NO:13)；以及
第三引物对：
ORF1ab正向引物2-2：5’-ATGAAAGTTTACGCCCTGAC-3’(SEQ ID  NO:17)；
ORF1ab负向引物2-2：5’-CCGTGCCTACAGTACTCAGAATC-3’(SEQ ID NO:18)；
第三探针：
ORF1ab探针2-2：5’-ATGTGCTCATGGATGGCTCTATTATTCAATT-3’(SEQ ID NO:19)。
在又一个示例性的实施方案中，本发明提供了第三组合物，包括：
第一引物对：
N基因正向引物1：5’-GGTATTTCTACTACCTAGGAACT-3’(SEQ ID NO:5)；
N基因负向引物1：5’-TGCAGCATTGTTAGCAGGATTG-3’(SEQ ID NO:6)；
第一探针：
N基因探针1：5’-GCCAGAAGCTGGACTTCCCTATGGTGC-3’(SEQ ID NO:7)；
第二引物对：
ORF1ab正向引物1-1：5’-ATTCACCTAATTTAGCATGGCCTC-3’(SEQ ID NO:8)；
ORF1ab负向引物1-1：5’-ACATCTGTCGTAGTGCAACAGGAC-3’(SEQ ID NO:9)；
第二探针：
ORF1ab探针1-1：5’-TTGTAACAGCTTTAAGGGCCAATTCTGCTGT-3’(SEQ ID NO:10)；以及
第三引物对：
ORF1ab正向引物2-2：5’-ATGAAAGTTTACGCCCTGAC-3’(SEQ ID NO:17)；
ORF1ab负向引物2-2：5’-CCGTGCCTACAGTACTCAGAATC-3’(SEQ ID  NO:18)；
第三探针：
ORF1ab探针2-2：5’-ATGTGCTCATGGATGGCTCTATTATTCAATT-3’(SEQ ID NO:19)。
在再一个示例性的实施方案中，本发明提供了第四组合物，包括：
第一引物对：
N基因正向引物1：5’-GGTATTTCTACTACCTAGGAACT-3’(SEQ ID NO:5)；
N基因负向引物1：5’-TGCAGCATTGTTAGCAGGATTG-3’(SEQ ID NO:6)；
第一探针：
N基因探针1：5’-GCCAGAAGCTGGACTTCCCTATGGTGC-3’(SEQ ID NO:7)；
第二引物对：
ORF1ab正向引物1-2：5’-ATGGCCTCTTATTGTAACAGCT-3’(SEQ ID NO:11)；
ORF1ab负向引物1-2：5’-AGCAGTTTGTGTAGTACCGGCAGC-3’(SEQ ID NO:12)；
第二探针：
ORF1ab探针1-2：5’-CCAATTCTGCTGTCAAATTACAGAATA-3’(SEQ ID NO:13)；以及
第三引物对：
ORF1ab正向引物2-1：5’-GAAGGTTCTGTTGCTTATGAAAGTT-3’(SEQ ID NO:14)；
ORF1ab负向引物2-1：5’-TACCACTCTAACAGAACCTTC-3’(SEQ ID NO:15)；
第三探针：
ORF1ab探针2-1：5’-GCCCTGACACACGTTATGTGCTCATGGA-3’(SEQ ID NO:16)。
通过采用如上所示的组合物，本发明使得SARS-CoV-2的核酸检测的阳性率更高，同时能够以更高的灵敏度检测SARS-CoV-2，对于疫情防控和确诊病患的治疗有积极的意义。
在一个具体的实施方案中，本发明组合物还包括可以进一步实施巢式PCR的引物对。
进一步地，所述组合物中，第二探针与第三探针的荧光报告基团可以相同也可以不同。
进一步地，所述组合物中，第一探针与第二和第三探针带有彼此不互相干扰的荧光报告基团。
在本文中，“彼此不互相干扰”是指组合物中每个探针所用的荧光报告基团是不一样的，并且不会影响彼此的检测，即可以利用不同的通道进行检测。例如可以使用FAM、HEX、ROX和CY5，这些基团吸光值不接近，能选择不同的通道，因而不会互相干扰。
在本发明中，荧光报告基团可以选自FAM、HEX、ROX、VIC、CY5、5-TAMRA、TET、CY3和JOE，但不限于此。
在一个具体的实施方案中，第一探针的荧光报告基团为ROX；第二探针和第三探针的荧光报告基团为FAM。
进一步地，探针的3’末端还具有猝灭基团，例如BHQ1或BHQ2。
进一步地，所述组合物包括：用于监控的内标上游引物、内标下游引物和内标探针。
其中，内标基因为RNaseP基因(Genbank登陆号：U77665.1)。优选地，内标上下游引物特异性扩增以下序列：
Figure PCTCN2020121026-appb-000003
Figure PCTCN2020121026-appb-000004
在一个具体的实施方案中，所述组合物包括：
内标引物对，用于特异性扩增如SEQ ID NO:4所示RNaseP基因的区域；
内标探针，用于检测所述内标引物对的扩增产物。
在一个具体的实施方案中，所述组合物还包括：
内标上游引物：5’-GAGGTGGGACTTCAGCATGGC-3’(SEQ ID NO:20)；
内标下游引物：5’-TGTTTCTTTTCCTTAAAGTCAAC-3’(SEQ ID NO:21)；
内标探针：5’-AGATTTGGACCTGCGAGCGGGTTCTGA-3’(SEQ ID NO:22)。
进一步地，所述第一探针、第二和第三探针，与内标探针带有彼此不互相干扰的荧光报告基团。
进一步地，所述内标探针的荧光报告基团为HEX。
进一步地，所述组合物中引物的用量为25～200nM；所述组合物中探针的用量为10～80nM。
在一些的实施方案中，本发明的组合物存在于同一包装中。
在另一些的实施方案中，本发明的第一引物对和第一探针、第二引物对和第二探针，及第三引物对和第三探针，分别存在于单独的包装中。
在又一些实施方案中，本发明的第一引物对和第一探针存在于一个包装中；而第二引物对和第二探针及第三引物对和第三探针存在于另一个包装中。
在另一些的实施方案中，本发明的第一引物对和第一探针、第二引物对和第二探针，第三引物对和第三探针，和内标引物对和内标探针，分别存在于单独的包装中。
第二方面，本发明提供了上述本发明的组合物在制备检测SARS-CoV-2的试剂盒中的用途。
第三方面，本发明提供了一种检测SARS-CoV-2的试剂盒，所述试剂盒包 括如上所述本发明的组合物。
进一步地，所述试剂盒还包括dNTP、PCR缓冲液以及Mg 2+中的至少一种。
更进一步地，所述试剂盒还包括：核酸释放剂、核酸提取试剂、逆转录酶以及DNA聚合酶中的至少一种。
更进一步地，所述试剂盒还包括核酸释放试剂、核酸提取试剂、dNTP、逆转录酶、DNA聚合酶、PCR缓冲液以及Mg 2+中的至少一种。
进一步地，所述逆转录酶的浓度为5U/μL～15U/μL，例如逆转录酶可以是鼠白血病逆转录酶(MMLV)或者Tth酶；所述DNA聚合酶的浓度为3U/μL～15U/μL，例如DNA聚合酶可以是Taq酶。
在一个具体的实施方案中，本发明试剂盒包括：反/逆转录酶、Taq酶、Mg 2+、Mn 2+、Rnasin、dNTP、引物、探针和PCR缓冲液。
常见的PCR缓冲液由Tris-HCl、MgCl 2、KCl、Triton X-100等缓冲体系构成。一般单个PCR反应管中总体积为20-200μl。
在一个具体的实施方案中，本发明试剂盒可以兼容数字PCR扩增体系，即可以直接用于数字PCR仪上进行扩增。
第四方面，提供了一种用于检测SARS-CoV-2的方法，所述方法包括以下步骤：
1)提取或释放待测样本的核酸；
2)使用如上所述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量PCR；
3)获得并分析结果。
在本发明中，用于检测的样本可以是咽拭子、痰液、肺泡灌洗液、血液等，但不限于此。
进一步地，所述荧光定量PCR的反应条件为：
逆转录，温度为50℃～60℃，时间15～35分钟，1次循环；cDNA预变性，温度为95℃，时间1～10分钟，1次循环；变性，温度为95℃，时间为10～20秒，退火，温度为60℃，时间为20～60秒，40～50次循环。
在一个具体的实施方案中，提供了一种用于以非诊断目的检测SARS-CoV-2的方法，所述方法包括以下步骤：
1)提取或释放待测样本的核酸；
2)使用如上述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量PCR；
3)获得并分析结果。
进一步地，所述荧光定量PCR的反应条件为：
逆转录，温度为50℃～60℃，时间15～35分钟，1次循环；cDNA预变性，温度为95℃，时间1～10分钟，1次循环；变性，温度为95℃，时间为10～20秒，退火，温度为60℃，时间为20～60秒，40～50次循环。
在本文中，术语“非诊断目的”指并非旨在获得个体是否感染SARS-CoV-2并罹患肺炎的信息。例如，该方法可以在以科研为目的的实验中的检测培养物中检测是否有SARS-CoV-2。
附图说明
图1为本发明组合物的第一组合物检测SARS-CoV-2的检测结果图；
图2为本发明组合物的第一组合物与ORF1ab一个单引物探针组合物的检测效果对比图；
图3为本发明组合物的第一组合物与ORF1ab另一个单引物探针组合物的检测效果对比图；
图4为本发明组合物的N基因引物探针与中国CDC、美国CDC的引物探针的检测效果对比图；
图5为本发明组合物的N基因引物探针与香港大学的引物探针的检测效果对比图；
图6为ORF1ab基因的本发明组合物与一个对比例组合物(第五组合物)的检测效果对比图；
图7为ORF1ab基因的本发明组合物与另一个对比例组合物(第六组合物) 的检测效果对比图；
图8为本发明组合物(第一组合物、第三组合物、第四组合物)检测SARS-CoV-2的FAM通道的检测结果图；
图9为本发明的第七组合物检测SARS-CoV-2的ROX通道的检测结果图；
图10为本发明的第八组合物检测SARS-CoV-2的ROX通道的检测结果图；
图11为针对ORF1ab基因三个特异性区域设计的引物和探针体系分别检测的结果图；
图12为N基因两个特异性区域设计的引物和探针体系分别检测的结果图
具体实施方式
在本发明中，表述“第一”、“第二”、“第三”和“第四”等仅用于描述目的，用以区分所限定的物质，而不以任何方式限定次序或主次。
针对本发明提供的目标区域(例如，SEQ ID NO:1所示的区域、SEQ ID NO:2所示的区域、SEQ ID NO:3所示的区域，和/或SEQ ID NO:4所示的区域)，可以设计特异性扩增引物和相应的检测探针。例如，可采用以下方式来进行。
对于荧光定量PCR引物，通常遵从以下原则：1、引物应在区域内设计并具有特异性；2、扩增产物长度在80～150bp，最长不要超过300bp；3、产物不能形成二级结构(自由能小于58.61KJ/mol)；4、引物长度：一般在17～25碱基之间，上下游引物不宜相差太大；5、引物自身不能有连续4个碱基的互补，避免形成发卡结构；6、引物之间不能有连续4个碱基的互补，避免形成引物二聚体；7、引物G+C含量在40％～60％之间，45～55％最好；引物中碱基要随机分布，尽量均匀；8、引物Tm值在58～62度之间。
根据上述原则，针对本发明提供的目标区域，可以设计出例如包括但不限于如SEQ ID NO:5～6、8～9、11～12、14～15、17～18、20～21和43～44所示的引物。
对于荧光定量PCR探针，通常遵从以下原则：1、先设计探针，然后设计引物使其尽可能的靠近于探针；2、探针的Tm值应在68～70之间，如果是目测 探针，则要仔细审查GC富含区；3、选择C多于G的链作探针，G的含量多于C会降低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针；4、探针应尽可能的短，一般不要超过30个bp；5、检测探针的DNA折叠和二级结构。
根据上述原则，针对本发明提供的目标区域，可以设计出例如包括但不限于如SEQ ID NO:7、10、13、16、19、22和45所示的探针。
可以使用常见的引物和探针设计软件，如Primer Express、Primer Premier、Oligo、Omiga等，来辅助进行设计。根据本发明所提供的特定扩增区域，本领域技术人员可以在上述原则的引导下并使用这些软件进行辅助完成探针和引物的设计。
下文将结合具体实施方案和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方案和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
实施例1、本发明所使用的引物及探针
本发明所使用的引物及探针如下所示：
第一组合物：
第一引物对：N基因正向引物1(SEQ ID NO:5)；N基因负向引物1(SEQ ID NO:6)；
第一探针：N基因探针1(SEQ ID NO:7)；
第二引物对：ORF1ab正向引物1-1(SEQ ID NO:8)；ORF1ab负向引物1-1(SEQ ID NO:9)；
第二探针：ORF1ab探针1-1(SEQ ID NO:10)；以及
第三引物对：ORF1ab正向引物2-1(SEQ ID NO:14)；ORF1ab负向引物2-1(SEQ ID NO:15)；
第三探针：ORF1ab探针2-1(SEQ ID NO:16)。
第三组合物：
第一引物对：N基因正向引物1(SEQ ID NO:5)；N基因负向引物1(SEQ ID NO:6)；
第一探针：N基因探针1(SEQ ID NO:7)；
第二引物对：ORF1ab正向引物1-1(SEQ ID NO:8)；ORF1ab负向引物1-1(SEQ ID NO:9)；
第二探针：ORF1ab探针1-1(SEQ ID NO:10)；以及
第三引物对：ORF1ab正向引物2-2(SEQ ID NO:17)；ORF1ab负向引物2-2(SEQ ID NO:18)；
第三探针：ORF1ab探针2-2(SEQ ID NO:19)。
第四组合物：
第一引物对：N基因正向引物1(SEQ ID NO:5)；N基因负向引物1(SEQ ID NO:6)；
第一探针：N基因探针1(SEQ ID NO:7)；
第二引物对：ORF1ab正向引物1-2(SEQ ID NO:11)；ORF1ab负向引物1-2(SEQ ID NO:12)；
第二探针：ORF1ab探针1-2(SEQ ID NO:13)；以及
第三引物对：ORF1ab正向引物2-1(SEQ ID NO:14)；ORF1ab负向引物2-1(SEQ ID NO:15)；
第三探针：ORF1ab探针2-1(SEQ ID NO:16)。
其中，每一个组合物还具有内标上游引物、内标下游引物，和内标探针(SEQ ID NO:20～22)；
并且其中，第一探针的荧光报告基团为ROX；第二探针和第三探针的荧光报告基团为FAM，内标探针的荧光报告基团为HEX。探针的3’末端还具有猝灭基团，例如BHQ1或BHQ2。
实施例2、检测SARS-CoV-2的方法
本发明检测样本为咽拭子、痰液、肺泡灌洗液、血液。进行如下操作：
(1)使用圣湘生物核酸释放剂S1014，与阳性对照1：1混合，常温裂解10分钟。
(2)按每种反应液26μL和混合酶4μL的比例，取相应量的反应液和混合酶混匀，以每反应30μL的体积分装至各反应管。分别向各反应管中加入待检测的裂解后样本20μL，然后盖上PCR管盖，瞬时离心后放置于实时荧光PCR仪器中。
(3)按以下循环条件进行反应和检测(荧光采集选取FAM通道、ROX通道以及HEX通道)：
Figure PCTCN2020121026-appb-000005
反应结束后自动保存结果，对检测靶标以及内标的扩增曲线分别进行分析。根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值以及Threshold值(用户可根据实际情况自行调整，Start值可以在3～15、End值可设在5～20，调整阴性对照的扩增曲线使其平直或低于阈值线)，点击Analyze进行分析，使各项参数符合下述“质量控制”中的要求，然后到Plate窗口下记录定性结果。
(4)质量控制
SARS-CoV-2-PCR-阴性对照：FAM、ROX通道及内标(HEX)通道均无Ct值或Ct＞40；
SARS-CoV-2-PCR-阳性对照：FAM、ROX及内标(HEX)通道均Ct≤35；
以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。
实施例3、本发明组合物用于检测SARS-CoV-2
将本发明实施例1中的第一组合物按照实施例2所述的方法对来自中国CDC的新型冠状病毒保存样品进行检测，实验重复两次，结果如图1所示。
将本发明实施例1中的第一组合物，第二组合物，以及第三组合物按照实施例2所述的方法对来自中国CDC的新型冠状病毒保存样品进行检测，图8示出了FAM通道的检测结果。
从图1和图8可以看出，各扩增曲线挺拔，Ct值符合条件，表明本发明的各种组合物能够检测SARS-CoV-2。
实施例4、本发明组合物与ORF1ab单引物探针组合物的检测效果对比
使用本发明实施例1中所述第一组合物，以及ORF1ab单引物探针组合物1(不含SEQ ID NO:14～16，其余组成与第一组合物一致)、ORF1ab单引物探针组合物2(不含SEQ ID NO:8～10，其余组成与第一组合物一致)，按照实施例2所述的方法对8例保存液中存放一周以上阴性棉质咽拭子样本加入阳性核酸作为模拟干扰样本的新型冠状病毒样本进行检测。检测结果如图2和3所示。
从图2和3中可以看出，含有ORF1ab双引物的本发明第一组合物比单引物探针组合物的Ct值明显前移，表明其灵敏度高于单引物探针组合物。
实施例5、本发明组合物与中国CDC、美国CDC以及香港大学引物探针的检测效果对比
使用本发明实施例1中所述的组合物中的第一引物对和第一探针(SEQ ID NO:5～7)，与中国CDC和美国CDC引物探针(三组)(由于美国CDC仅给出了N基因的引物和探针，因此，本实施例仅能比较N基因的区别)，按照实施例2所述的方法对新型冠状病毒样本(病毒培养液)5～10拷贝/ml进行联合检测，重复检测10次，检测结果如图4所示，从图中可以看出，对于同样浓度的新型冠状病毒，本发明的第一引物对和第一探针检测N基因比中国CDC、美国CDC的引物探针Ct值显著前移。
使用本发明实施例1中所述的组合物中的第一引物对和第一探针，与香港 大学引物和探针，按照实施例2所述的方法对新型冠状病毒样本(肺泡灌洗液样本类型、病毒培养液、血浆样本)5～10拷贝/ml进行联合检测，重复检测10次，检测结果如图5所示，从图中可以看出，对于同样浓度的新型冠状病毒，本发明的第一引物对和第一探针检测N基因比香港大学的引物探针Ct值显著前移。
使用本发明的组合物能更加准确地检测SARS-CoV-2。
下面给出本实施例中所使用的作为对比的各种引物和探针的具体序列：
中国CDC SARS-CoV-2 N上游引物：5’-GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT-3’(SEQ ID NO:23)；
中国CDC SARS-CoV-2 N下游引物：5’-CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG-3’(SEQ ID NO:24)；
中国CDC SARS-CoV-2 N探针：5’-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-3’(SEQ ID NO:25)；
US CDC SARS-CoV-2_N1上游引物：5’-GACCCCAAAATCAGCGAAAT-3’(SEQ ID NO:26)；
US CDC SARS-CoV-2_N1下游引物：
5’-TCTGGTTACTGCCAGTTGAATCTG-3’(SEQ ID NO:27)；
US CDC SARS-CoV-2_N1探针：5’-ACCCCGCATTACGTTTGGTGGACC-3’(SEQ ID NO:28)；
US CDC SARS-CoV-2_N2上游引物：5’-TTACAAACATTGGCCGCAAA-3’(SEQ ID NO:29)；
US CDC SARS-CoV-2_N2下游引物：5’-GCGCGACATTCCGAAGAA-3’(SEQ ID NO:30)；
US CDC SARS-CoV-2_N2探针：5’-ACAATTTGCCCCCAGCGCTTCAG-3’(SEQ ID NO:31)；
US CDC SARS-CoV-2_N3上游引物：5’-GGGAGCCTTGAATACACCAAAA-3’(SEQ ID NO:32)；
US CDC SARS-CoV-2_N3下游引物：5’-TGTAGCACGATTGCAGCATTG-3’(SEQ ID NO:33)；
US CDC SARS-CoV-2_N3探针：5’-AYCACATTGGCACCCGCAATCCTG-3’(SEQ ID NO:34)；
HKU-N上游引物:5’-TAATCAGACAAGGAACTGATTA-3’(SEQ ID NO:35)；
HKU-N下游引物:5’-CGAAGGTGTGACTTCCATG-3’(SEQ ID NO:36)；
HKU-N探针:5’-FAM-GCAAATTGTGCAATTTGCGG-TAMRA-3’(SEQ ID NO:37)。
实施例6、本发明组合物的抗干扰测试
使用本发明实施例1中所述的第一组合物(SEQ ID NO:5～10，14～16以及20～22)，按照实施例2所述的方法对具有干扰物质的新型冠状病毒样本进行验证。
经过测试验证，干扰物质对试剂盒的检测结果无明显干扰。实验结果如表1所示，3次重复试验均未出现干扰。
表1
Figure PCTCN2020121026-appb-000006
Figure PCTCN2020121026-appb-000007
实施例7、本发明组合物的特异性验证
本发明的第一组合物(SEQ ID NO:5～10，14～16以及20～22)与冠状病毒(NL63，HKU1，229E，OC43)、SARS冠状病毒、MERS冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒Yamagata型、Victoria型、甲型H1N1流感病毒、甲型H3N2流感病毒、甲型H5N1流感病毒、甲型H7N9流感病毒、呼吸道合胞病毒A、B型、鼻病毒A、B、C型、腺病毒1、2、3、4、5、7、55型、副流感病毒1、2、3型、肠病毒A、B型、肠病毒C型(EV-C95)、肠病毒D型(EV-D70)、偏肺病毒、人间质肺病毒、新生隐球菌、化脓性链球菌、鲍曼不动杆菌、肺孢子虫、肺炎克雷伯杆菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、铜绿假单胞菌、嗜肺军团菌、百日咳杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎支原体、肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌、肺炎衣原体、EB病毒、人巨细胞病毒、烟曲霉、白色念球菌、光滑念珠菌、结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌、诺如病毒、轮状病毒、水痘-带状疱疹病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、人类基因组DNA等阳性样本无交叉反应。
下表2中列出了一些具体的例子的检测结果。
表2
Figure PCTCN2020121026-appb-000008
Figure PCTCN2020121026-appb-000009
实施例8、本发明组合物的精密度验证
本实验将SARS-CoV-2阳性样本稀释至中浓度阳性、临界浓度阳性，加上SARS-CoV-2阴性样本作为待测样本进行批内不精密度的测定。
每个精密度样品，每天分析1个实验批，每个精密度样品重复5次，连续测试5天。用质检合格的新型冠状病毒检测试剂盒(其包含本发明的第一组合物(SEQ ID NO:5～10，14～16以及20～22))在同一台SLAN 96P仪器上检测，分析阳性检出率、阴性检出率，考察试剂盒的精密度性能，其结果如下表3所示，结果表明本发明的组合物的检测结果在每批间的结果是一致的，反映了良好的精密度。
表3、试剂批内不精密度检测结果Ct值统计
Figure PCTCN2020121026-appb-000010
Figure PCTCN2020121026-appb-000011
实施例9、本发明的ORF1ab基因的对比例组合物的检测
为了进一步证明本发明所提及的特定区域的优势，发明人使用了ORF1ab基因上的另一个特定区域：
ATAAAGAAATGTATCTAAAGTTGCGTAGTGATGTGCTATTACCTCTTACGCAATATAATAGATACTTAGCTCTTTATAATAAGTACAAGTATTTTAGTGGAGCAATGGATACAACTAGCTACAGAGAAGCTGCTTGTTGTCATCTCGCAAAGGCTCTCAATGACTTCAGTAACTCAGGTTCTGATGTTCTTTA(SEQ ID NO:38)，并据此设计了引物和探针，其具体序列如下所示：
ORF1ab正向引物3：5’-ATGTATCTAAAGTTGCGTAG-3’(SEQ ID NO:39)；
ORF1ab负向引物3：5’-GTTACTGAAGTCATTGAGAGCCT-3’(SEQ ID NO:40)；
ORF1ab探针3：5’-ATGTGCTATTACCTCTTACGCAATATAAT-3’(SEQ ID NO:41)。
首先，发明人验证了单独使用一个ORF1ab基因检测的引物和探针的检测效率：
分别使用1、ORF1ab正向引物1-1，ORF1ab负向引物1-1，ORF1ab探针1-1；2、ORF1ab正向引物2-1，ORF1ab负向引物2-1，ORF1ab探针2-1；3、ORF1ab正向引物3，ORF1ab负向引物3，ORF1ab探针3的三种引物和探针组合对ORF1ab基因进行检测，结果如图11所示。结果表明，三种引物和探针对ORF1ab基因的检测效率是相当的。也就是说，单独针对SEQ ID NO:38所设计的体系，与单独针对SEQ ID NO:1和2所设计的体系，检测效果相当。
将SEQ ID NO:39～41(ORF1ab正向引物3，ORF1ab负向引物3，ORF1ab探针3)与本发明实施例1所提及的SEQ ID NO:8～10组合形成第五组合物；SEQ ID NO:39～41(ORF1ab正向引物3，ORF1ab负向引物3，ORF1ab探针3)与本发明实施例所提及的SEQ ID NO:14～16组合形成第六组合物。
将第五组合物和第六组合物分别按照实施例2所述的方法进行检测，FAM通道的检测结果分别如图6和图7所示。虽然在上述单独体系验证中，发现单独的引物探针的检测效果相当(如图11所示)，但是组合之后发现，第五组合物和第六组合物明显比本发明的第一组合物的ORF1ab的Ct值后移，因此，证明本发明所寻找到的ORF1ab特定区域的组合，在检测方面有着更高的灵敏度优势。
实施例10、本发明的N基因的对比例组合物的检测
为了进一步证明本发明所提及的特定区域的优势，首先，发明人针对上述提及的N基因特定区域(SEQ ID NO:3)设计了N基因引物探针组合2，其具体序列如下所示：
N基因正向引物2：5’-ACTACCTAGGAACTGGGCCAG-3’(SEQ ID NO:43)；
N基因负向引物2：5’-AGCAGGATTGCGGGTGCCAAT-3’(SEQ ID NO:44)；和
N基因探针2：5’-ACTTCCCTATGGTGCTAACAAAGACGGCAT-3’(SEQ ID NO:45)。
其次，发明人在N基因上另外寻找到了一个特定区域：
TGAGAGCAAAATGTCTGGTAAAGGCCAACAACAACAAGGCCAAACTGTCACTAAGAAATCTGCTGCTGAGGCTTCTAAGAAGCCTCGGCAAAAACGTACTGCCACTAAAGCATACAATGTAACACAAGCTTTCGGCAGACGTGGTCCAGAACAAACCCAAGGAAATTTTGGGGACCAGGAACTAATCAGACAAGGAACTGATTACAAACATTGGCCGCA(SEQ ID NO:42)，并据此设计了N基因引物探针组合3，其具体序列如下所示：
N基因正向引物3：5’-ATGTCTGGTAAAGGCCAACAAC-3’(SEQ ID NO:46)；
N基因负向引物3：5’-AGTTCCTTGTCTGATTAGTTC-3’(SEQ ID NO:47)；和
N基因探针3：5’-ACTGTCACTAAGAAATCTGCTGCTGAGGC-3’(SEQ ID NO:48)。
首先，发明人验证了单独使用一个N基因检测的引物探针组合的检测效率：
分别使用1、N基因正向引物1，N基因负向引物1，N基因探针1；2、N基因正向引物2，N基因负向引物2，N基因探针2；3、N基因正向引物3，N基因负向引物3，N基因探针3的三种引物探针组合分别对N基因进行了检测，结果如图12所示。结果表明，三种引物探针组合对N基因的检测效率是相当的。也就是说，单独针对SEQ ID NO:42所设计的体系，与单独针对SEQ ID NO:3所设计的体系，检测效果相当。
将N基因引物探针组合2与本申请实施例1中所提及的SEQ ID NO:8～10和SEQ ID NO:14～16组合形成第七组合物；N基因引物探针组合3与本申请实施例中所提及的SEQ ID NO:8～10和SEQ ID NO:14～16组合形成第八组合物。
将第七组合物和第八组合物分别按照实施例2所述的方法进行检测，ROX通道的检测结果分别如图9和图10所示。虽然在上述单独体系验证中，发现单 独的引物探针的检测效果相当(如图12所示)，但是组合之后发现，第七组合物和第一组合物的检测效率相当，而第八组合物的Ct值明显比本发明第一组合物的N基因的Ct值后移，因此，证明本发明所寻找到的N基因特定区域，在组合检测方面有着更高的灵敏度优势。

Claims (10)

  1. 一种用于检测SARS-CoV-2的组合物，包括：
    第一引物对，用于特异性地扩增SARS-CoV-2的N基因；
    第一探针，用于检测所述第一引物对的扩增产物；
    第二引物对，用于特异性地扩增ORF1ab基因中如SEQ ID NO:1所示的区域；
    第二探针，用于检测所述第二引物对的扩增产物；
    第三引物对，用于特异性地扩增ORF1ab基因中如SEQ ID NO:2所示的区域；和
    第三探针，用于检测所述第三引物对的扩增产物。
  2. 根据权利要求1所述的组合物，其中，所述第二引物对和第二探针为：
    ORF1ab正向引物1-1：5’-ATTCACCTAATTTAGCATGGCCTC-3’(SEQ ID NO:8)；
    ORF1ab负向引物1-1：5’-ACATCTGTCGTAGTGCAACAGGAC-3’(SEQ ID NO:9)；和
    ORF1ab探针1-1：5’-TTGTAACAGCTTTAAGGGCCAATTCTGCTGT-3’(SEQ ID NO:10)；或者
    ORF1ab正向引物1-2：5’-ATGGCCTCTTATTGTAACAGCT-3’(SEQ ID NO:11)；
    ORF1ab负向引物1-2：5’-AGCAGTTTGTGTAGTACCGGCAGC-3’(SEQ ID NO:12)；和
    ORF1ab探针1-2：5’-CCAATTCTGCTGTCAAATTACAGAATA-3’(SEQ ID NO:13)。
  3. 根据权利要求1所述的组合物，其中，所述第三引物对和第三探针为：
    ORF1ab正向引物2-1：5’-GAAGGTTCTGTTGCTTATGAAAGTT-3’(SEQ ID NO:14)；
    ORF1ab负向引物2-1：5’-TACCACTCTAACAGAACCTTC-3’(SEQ ID NO:15)；
    ORF1ab探针2-1：5’-GCCCTGACACACGTTATGTGCTCATGGA-3’(SEQ ID NO:16)；或者
    ORF1ab正向引物2-2：5’-ATGAAAGTTTACGCCCTGAC-3’(SEQ IDNO:17)；
    ORF1ab负向引物2-2：5’-CCGTGCCTACAGTACTCAGAATC-3’(SEQ ID NO:18)；和
    ORF1ab探针2-2：5’-ATGTGCTCATGGATGGCTCTATTATTCAATT-3’(SEQ ID NO:19)。
  4. 根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中，所述第一引物对用于特异性地扩增N基因中如SEQ ID NO:3所示的区域。
  5. 根据权利要求4所述的组合物，其中，所述第一引物对和第一探针为：
    N基因正向引物1：5’-GGTATTTCTACTACCTAGGAACT-3’(SEQ ID NO:5)；
    N基因负向引物1：5’-TGCAGCATTGTTAGCAGGATTG-3’(SEQ ID NO:6)；和
    N基因探针1：5’-GCCAGAAGCTGGACTTCCCTATGGTGC-3’(SEQ ID NO:7)；或者
    N基因正向引物2：5’-ACTACCTAGGAACTGGGCCAG-3’(SEQ ID NO:43)；
    N基因负向引物2：5’-AGCAGGATTGCGGGTGCCAAT-3’(SEQ ID NO:44)；和
    N基因探针2：5’-ACTTCCCTATGGTGCTAACAAAGACGGCAT-3’(SEQ ID NO:45)。
  6. 根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物还包括用于监控的内标上游引物、内标下游引物和内标探针，例如，内标上游引物： 5’-GAGGTGGGACTTCAGCATGGC-3’(SEQ ID NO:20)；内标下游引物：5’-TGTTTCTTTTCCTTAAAGTCAAC-3’(SEQ ID NO:21)；内标探针：5’-AGATTTGGACCTGCGAGCGGGTTCTGA-3’(SEQ ID NO:22)。
  7. 根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物中，第一探针，与第二和第三探针带有彼此不互相干扰的荧光报告基团。
  8. 如权利要求1～7中任一项所述的组合物在制备检测SARS-CoV-2的试剂盒中的用途。
  9. 一种检测SARS-CoV-2的试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求1～7中任一项所述的组合物。
  10. 一种用于检测SARS-CoV-2的方法，所述方法包括以下步骤：
    1)提取或释放待测样本的核酸；
    2)使用如权利要求1～7中任一项所述的组合物对步骤1)获得的核酸进行荧光定量PCR；
    3)获得并分析结果。
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