WO2022013659A1 - Procedimiento para obtención de ácido carmínico - Google Patents

Procedimiento para obtención de ácido carmínico Download PDF

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    • C12N5/0601—Invertebrate cells or tissues, e.g. insect cells; Culture media therefor

Definitions

  • the present invention is related to a novel, alternative, low-cost process for the production of carminic acid (CA) in vitro, for use in the dye industry that has wide application in the food, cosmetic, pharmaceutical and industrial industries. textile, among others.
  • CA carminic acid
  • the content of carminic acid present in each sample was determined by high performance liquid chromatography.
  • the extraction of the pigment from the samples was carried out with a 2M HCl solution.
  • the detection limits of the pigment were from 1 .0 mg L-1 to 120.0 mg L-1 .
  • No significant effect of pH on carminic acid content or number of cell lines was observed, although the intermediate pH (5.5) tended to give better results.
  • the conclusions of said document indicate that “culture media with 4.5 to 6.5 are suitable for the in vitro culture of cochineal cells, although intermediate pHs tended to be better in terms of carmine content and the number of cell lines. Centrifugation times of 2 and 5 min were the most suitable for establishing D. coccus embryo cell lines. Carmine production in secondary cultures was low, so it was suggested to evaluate other variables of the culture medium, such as osmotic pressure and constituents of the nutrient medium, mainly.
  • a method for culturing insects of the genus Dactylopius comprising: heating a mixture comprising (a) a cactus additive obtained from a cactus of the genus Opuntia, (b) a polysaccharide, and (c) glucose; combining the heated mixture with a three-dimensional matrix; cooling the combined mixture and matrix to form a hardened medium; and inoculating the hardened medium with a species selected from the group consisting of the genus Dactylopius.
  • a cancer-associated cell proliferation/activation method that can be performed at such low costs that the methods may be applicable to non-human animals;
  • a cell proliferation/activation method of the present application comprises the steps of, during cell culture, supplementing with at least 5-15pg/ml concanavalin A and a growth factor having interleukin-2-like activity to the medium culture, therefore, the present method can proliferate/activate, on a preferential basis, aB cells.
  • the present invention is particularly related to a process for the production of acid in vitro carmine, where the procedure is based on the isolation, purification and permanence of a hemocyte cell line obtained from oviplen adult females of the insect Dactylopius coccus Costa (cochineal insects) that are cultivated to generate a primary culture (phase I ) and subsequently stimulate the hemocytes with a mixture of mitogens.
  • the production of carminic acid through the novel process of the present invention provides a reduction both in the number of insects to be used and in production and harvest times, which are now estimated between approximately 12-14 days, as well as a reduction in operating expenses and human resources, large quantities are produced in a reduced space and the handling is with cells in laboratory conditions without the need to handle large volumes of inputs, reduction of raw material (elimination of host plant), harvest in the form direct soluble without the need for drying processes (times and materials), cryo-preservation of a production cell line for perpetuity in case insect populations are scarce in the future, production free of pests and natural predators, use of fewer insects in an amount of about 10-15 individuals to produce the same amount compared to traditional methods that require the sacrifice of approximately 350,000 to approximately 400,000 insects Dactylopius coccus Costa (cochineal) to produce approximately one kilogram of carminic acid, the production cost is approximately 50% less than the costs by traditional method, in addition to being a low scalable process. the reproduction scheme of production units.
  • a methodology is provided to isolate, extract and maintain a pure AC-producing cell line to obtain reproducible and constant AC production harvests under laboratory conditions and in 1000 ml container production, as well as to maintain lines cells free of contaminants in a constant way that were reproducible and replicable before the stimulus that is administered to the cultures.
  • Figure 1 shows Phase I of the extraction of hemocytes from the hemolymph of the insect Dactylopius coccus Costa, where:
  • a and B are chromatocytes (separated and concentrated in a 70% Percoll gradient), cultured for 96 hours in Schneider medium.
  • a and B are the same type of cells with different image contrast under microscope. In B, the presence of carminic acid granules in the cytoplasm becomes more evident.
  • C are younger, undifferentiated chromatocytes that, once mature, will begin to increase their production of carminic acid.
  • Figure 2 shows the results of the Percoll gradient (separation phases) and carbamate formation (cell product) on the surface of the last two tubes as a colored supernatant. black.
  • Figure 3 shows a phase contrast microscopy of mitogen-stimulated hemocytes post-72 hours grown in Schneider culture medium.
  • Figure 4 shows a microscopy of cell viability bioproduction in culture in Schneider medium 72 hours post inoculation, MTT 2 Mm plate culture assay.
  • Figure 5 shows a microscopy of the granulocytes 96 hours post inoculation.
  • Figure 6 shows a representation of the production and maintenance process in flat-bottomed containers according to one embodiment of the invention.
  • Figure 7 shows the results of the inspection in containers at day 25 post inoculation.
  • Figure 8 shows a graph of results describing the absorption spectrum (Absorbance vs. wavelength in nanometers) for the identification of AC in bioculture from the table of example 1 detailed in the examples section below.
  • Figure 9 shows a graph of results describing the absorption spectrum for the identification of AC in bioculture purified from the table of example 2 detailed in the examples section below.
  • FIG. 10 complementary to Table 2 described below, said figure shows preliminary results of the different cell types that are obtained by Percoll gradient (microscopy of the cells obtained in Percoll gradient) of the method detailed below.
  • Figure 11 shows a micrograph of a granulocyte in culture on day 8.
  • Figure 12 shows a micrograph of a granulocyte in culture at day 10.
  • Figure 13 shows an anticoagulant effect in obtaining hemolymph by perfusion.
  • Figure 14 shows integrity of proteins obtained during perfusion.
  • the use of the term "approximately/approximately” provides a certain additional range.
  • the term is defined as follows.
  • the additional range provided by the term is approximately ⁇ 10%. By way of example, but not limitation, if it says “approximately 40 grams", the range is between ⁇ 10% standard deviation and so on for the other measurements.
  • the in vitro production of carminic acid comprises: extracting, isolating, purifying and maintaining a hemocyte cell line obtained from oviplen adult females (full of eggs) of the insect Dactylopius coccus Costa (cochineal insects) of the following general way:
  • hemolymph is obtained by perfusion of the strain hemocoel with an anticoagulant buffer solution comprising a base, an ionic salt, a chelating agent and an organic acid, until obtaining a red pigmented solution containing carminic acid (CA)-producing cells among others.
  • an anticoagulant buffer solution comprising a base, an ionic salt, a chelating agent and an organic acid
  • the anticoagulant buffer comprises NaOH, NaCl, EDTA and citric acid.
  • the pigmented solution obtained is deposited in sterile containers and centrifuged.
  • the supernatant is recovered.
  • the discontinuous Percoll gradient is pre-run by centrifugation.
  • the hemolymph cells that will be used to generate a culture are obtained.
  • the cells are recovered and plated with culture medium for cultivation of insect cell lines for adaptation.
  • Granulocytes and hemocytes are selected.
  • the selected cells are seeded in plates with culture medium for cultivation of insect cell lines for adaptation.
  • a combination of mitogens in phosphate-buffered saline is added to each cell in culture to promote mitosis.
  • Cultures are incubated until they gradually turn red and cells are observed undergoing cell division due to mitogens.
  • the crops that show an increase in their population density are selected and propagated in a container where it is recommended to prepare a cryogenic preserve.
  • the plated cells are cultured in containers with culture medium for growth of insect cell lines.
  • the containers are incubated for a time interval of approximately 10-14 days (primary line). During this period of time the cells form a confluent monolayer of cells adhered to the container, and the culture medium turns red as a positive signal of color production.
  • the containers are checked each day to evaluate and check for the presence of mitoses.
  • the crops are harvested and the color of each of the culture containers is milked or harvested.
  • the "milking” or “harvest” is done in a disinfected environment and each harvest is centrifuged in containers with the purpose of eliminating cellular debris and only recovering the supernatant which is in this case: "The pigment” (carminic acid).
  • hemolymph is obtained by perfusing the hemocoel of the strain with an anticoagulant buffer reported in the literature by Graham et al., 1986 comprised of a range of about 0.25 mM to about 0.75 mM NaOH, preferably about 0.61 mM; a range of from about 0.15 M to about 0.50 M NaCl, preferably about 0.56 M; a range from about 0.10 mM to about 0.25 mM EDTA, preferably about 0.16 mM; a range of from about 100 mM to about 250 mM citric acid, preferably about 100 mM; at an approximate pH in a range of 4.5-6.5 as can be seen in Table 1 below.
  • the solution obtained is a red pigmented solution in which the cells that produce carminic acid (AC) are suspended
  • the obtained pigmented solution is deposited in sterile containers, preferably for the purposes of the present invention in sterile polypropylene conical tubes and is centrifuged at a range of approximately 500-1200 revolutions per minute (rpm), preferably approximately 600-1000 rpm, for about a range of 8-17 minutes, preferably about 10-15 minutes at a temperature in the approximate range of 2-5°C, preferably about 4°C.
  • rpm revolutions per minute
  • the supernatant is recovered in sterile containers, preferably for the purposes of the present invention in sterile polypropylene conical tubes and kept at room temperature.
  • a discontinuous Percoll gradient (approximately at a range of approximately 10-90%, preferably at a range between approximately 20-80%) is prepared with phosphate saline (1X PBS at a pH range of approximately 4.5). to 5.2, preferably at a pH of about 5.5) as can be seen in the subsequent Table 2 and in Figure 10 in the Figures section. TABLE 2: Percoll gradients used
  • the gradient is pre-run by centrifuging at a range of at least about 4,000-5,500 rpm, preferably at a range of about 4,500-5,000 rpm, over a time interval of about 12-22 minutes, preferably at a range of about 15-20 minutes. minutes.
  • an amount in a range of approximately 95-550 m I is added, preferably at a range of about 100-500 ⁇ l of the obtained pigmented solution.
  • phase I the interface between Percoll and the dye (pigment) contains the purified cells of the hemolymph that will be used to generate a primary culture
  • the cells are recovered and plated in, preferably but not limited to, 16-well multiwell plates with about 100 to about 500 ⁇ l, preferably about 250 ⁇ l, of culture medium for culture of insect cell lines, of preferably commercial Schneider medium for a time interval of approximately 20-30 hours, preferably at a range of approximately 24-26 hours at a temperature approximately in a range of approximately 20-28°C, preferably at a range of approximately 22-22°C. 26° C for adaptation.
  • the cell variant “Young granulocytes” and the variant “Young undifferentiated hemocytes” are selected (CANDIDATE SELECTION).
  • These two variants are selected and reseeded in, preferably but not limited to, 16-well multiwell plates with about 100 to about 500 ⁇ l, preferably about 250 ⁇ l, of culture medium for culturing cell lines of insects, preferably commercial Schneider medium for a time in the range of about 20-30 hours, preferably in a range of about 22-26 hours at a temperature in the range of about 20-28°C, preferably in a range of approximately 22-26° C for adaptation.
  • a combination of mitogens is added to each of the wells with the cells in culture (Concanavalin A at a range of approximately 0.20-0.30 micromoles, preferably approximately 0.25 micromoles + Phytohemagglutinin at a range of approximately 0.40-0.60 micromoles, of preferably about 0.50 micromoles) in phosphate saline (1X PBS at a pH between about 4.8-5.2, preferably at a pH of about 5.0), to promote mitosis in young granulocytes.
  • Cultures are incubated at a temperature range of approximately 20-28°C, preferably at a range of approximately 22-26°C for a time interval of approximately 20-50 hours, preferably at a range of approximately 24-48 hours. , where they gradually turn red and cells are seen in the cell division due to mitogens.
  • Crops that show an increase in their population density are selected and taken to the stage of propagation and container production.
  • cryogenic preserve In the container propagation stage, it is recommended to prepare a cryogenic preserve to store in liquid nitrogen tanks (in an interval between approximately -160 to -180°C, preferably at approximately -170°C) for an approximate time of two to three months.
  • the plated cells are cultured in containers with culture medium for growth of insect cell lines, flat-bottomed containers with a surface area in the range of approximately 200-300 cm 2 are preferred for the purposes of the present invention. more preferably containers with a surface area of approximately 225 cm 2 ; for this, by way of example, approximately 200 m I of the plate culture are used and inoculated in a range of approximately 200-350 m I, more preferably in a range of approximately 250-300 m I of culture medium for culture of insect cell lines, preferably Schneider culture medium.
  • the containers are incubated at a range of about 20-28°C, preferably at a range of about 22-26°C for a time range of about 10-14 days, preferably for a time range of about 12-13 days. (primary line). During this period of time, the cells form a confluent monolayer of cells adherent to the container, and the culture medium turns red as a positive signal of color production.
  • the vessels are checked approximately every 24 hours to evaluate and check the cell lines for the presence of mitoses.
  • the crops are harvested and the color of each of the culture containers is milked or harvested.
  • the "milking" or “harvest” is done in a sanitized environment and each harvest is centrifuged in containers, for purposes of the present invention, conical tubes with a capacity of approximately 40-60 ml of volume are preferred, more preferably a capacity of approximately 50 ml, at a speed range of approximately 3500-5500 rpm, preferably 4000-5000 rpm for an approximate time interval of between 18-22 minutes, preferably approximately 20 minutes, with the purpose of removing cellular debris and only recover the supernatant which is in this case: "The pigment” (carminic acid).
  • container propagation and production of carminic acid can be performed in containers such as, but not limited to, flat-bottomed culture bottles, Roux flasks, benchtop bioreactors, specialized bioreactors, bioreactors industrial containers, containers in which a chemical process is carried out involving organisms, microorganisms or biochemically active substances derived from said organisms and/or microorganisms and/or any other suitable container or device where a propagation reaction can be carried out such as the one described in the present invention.
  • containers such as, but not limited to, flat-bottomed culture bottles, Roux flasks, benchtop bioreactors, specialized bioreactors, bioreactors industrial containers, containers in which a chemical process is carried out involving organisms, microorganisms or biochemically active substances derived from said organisms and/or microorganisms and/or any other suitable container or device where a propagation reaction can be carried out such as the one described in the present invention.

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Abstract

Un proceso novedoso, alternativo de bajo costo de síntesis para la producción de ácido carmínico in vitro mediante el uso de células de la hemolinfa del insecto Dactylopius coccus Costa (insectos cochinilla o grana cochinilla) para su empleo en la industria de los colorantes que se emplean para alimentos, cosméticos, farmacéuticos y textiles.

Description

PROCEDIMIENTO PARA OBTENCIÓN DE ÁCIDO CARMÍNICO
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se relaciona con un proceso novedoso, alternativo, de bajo costo, para la producción de ácido carmínico (AC) in vitro, para su empleo en la industria de los colorantes que tienen amplia aplicación en la Industria alimentaria, cosmética, farmacéutica y textil, entre otras.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Existen en el arte previo, desde hace muchos años, métodos tradicionales de producción que implican la siembra, crecimiento y cosecha del insecto Dactylopius coccus Costa (insectos cochinilla o grana cochinilla) en ciclos de aproximadamente 80-90 días que utilizan sistemas de invernadero, cobertizo y/o cielo abierto. En esos casos se requiere el binomio de producción planta-insecto. Se sabe que el ácido carmínico extraído de la cochinilla se utiliza como colorante rojo y/o carmín en cosméticos (labiales, entre otros) y como E-120 en la industria alimenticia para dar un color rojo a los alimentos, aunque se sustituye cada vez más por colorantes sintéticos más económicos. Un sustituto ampliamente utilizado es el rojo cochinilla A, un colorante diazoico con el número E-124. En Europa se utiliza el ácido carmínico obtenido a partir de insectos autóctonos al menos desde la Edad de Hierro, y se han descubierto restos, por ejemplo, en tumbas de la cultura de Hallstad.
En el arte, se conocen los siguientes métodos, todos ellos tienen la misma fase primaria de preparación de la cochinilla para extraer el ácido carmínico: secado de materia prima, separación mecánica, molienda, extracción de grasas y ceras; diferenciándose en la extracción de grasas y ceras; y en la extracción del ácido carmínico que es la siguiente etapa y luego su continuación con la precipitación del carmín, reposo, filtración y secado del carmín.
Algunas soluciones del estado de la técnica para la producción de ácido carmínico en grandes cantidades se divulgan en los siguientes documentos:
Miguel González González et al, Nota Científica Rev. Fitotec. Mex. Vol. 25 (2): 209-212, 2002, “CULTIVO in vi tro DE CÉLULAS EMBRIONARIAS DE COCHINILLA (Dactylopius coccus Costa) A DIFERENTES pH”, ha evaluado la determinación de un pH óptimo al que cultivos celulares de cochinilla ( Dactylopius coccus Costa) registran la máxima producción de ácido carmínico in vitro, en donde se evaluaron varios niveles de pH (4.5, 5.0, 5.5, 6.0 y 6.5) y de fracciones de centrifugado (0, 2, 5 y 10 min) de células maceradas de embriones de cochinilla establecidos en medio de cultivo para cultivo de líneas celulares de insectos el cual es medio nutritivo de Schneider. El contenido de ácido carmínico presente en cada muestra se determinó mediante cromatografía líquida de alta resolución. La extracción del pigmento de las muestras se realizó con una solución de HCI 2M. Los límites de detección del pigmento fueron de 1 .0 mg L-1 a 120.0 mg L-1 . No se observó un efecto significativo del pH en el contenido de ácido carmínico ni en el número de líneas celulares, aunque el pH intermedio (5.5) tendió a dar mejores resultados. Sin embargo, las conclusiones de dicho documento señalan que “los medios de cultivo con 4.5 a 6.5 son adecuados para el cultivo in vitro de células de la cochinilla, aunque tendieron a ser mejores los pH intermedios en el contenido de carmín y el número de líneas celulares. Los tiempos de centrifugado de 2 y 5 min fueron los más adecuados para establecer líneas celulares de embriones de D. coccus. La producción de carmín en cultivos secundarios fue baja, por lo que se sugirió evaluar otras variables del medio de cultivo, como presión osmótica y constituyentes del medio nutritivo, principalmente.
US 8,919,281 (B2), 2013, Means to culture cochineal insects in an artificial médium, Hendrickson, Constance M.
Merkle, Denise Lynn, menciona un método para cultivar insectos del género Dactylopius, que comprende: calentar una mezcla que comprende (a) un aditivo para cactus obtenido de un cactus del género Opuntia, (b) un polisacárido y (c) glucosa; combinando la mezcla calentada con una matriz tridimensional; enfriar la mezcla combinada y la matriz para formar un medio endurecido; e inocular el medio endurecido con una especie seleccionada del grupo que consiste en el género Dactylopius.
Por su parte, MX 295682, ARIGEN PHARMACEUTICALS, INC, METODO DE PROLIFERACION DE CELULAS ASESINAS ACTIVADAS POR LINFOCINA, Watarai, Shinobu; Nishikawa, Shigeru, menciona un método de proliferación/activación de células asociadas con cánceres que se puede realizar a costos tan bajos que los métodos pueden ser aplicables a animales no humanos; un método de proliferación/activación de células de la presente solicitud comprende los pasos de, durante el cultivo de células, suplementar con al menos 5-15pg/ml de concanavalina A y un factor de crecimiento que tiene actividad de tipo interleucina-2 al medio de cultivo, por consiguiente, el presente método puede proliferar/activar, en una base preferencial, células aB.
No obstante, en las soluciones proporcionadas aún existe una necesidad en la técnica por aquellas que sean eficaces y que permitan una reducción en los tiempos de producción y cosechas inmediatas de ácido carmínico, así como en los gastos de operación y de recursos humanos. La presente invención resuelve este problema proporcionando un proceso novedoso e inventivo para la producción in vitro de ácido carmínico de la siguiente estructura:
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BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se relaciona de manera particular con un procedimiento para la producción de ácido carmínico in vitro, en donde el procedimiento se basa en el aislamiento, la purificación y la permanencia de una línea celular de hemocitos obtenida de hembras adulto oviplenas del insecto Dactylopius coccus Costa (insectos cochinilla) que se cultivan para generar un cultivo primario (fase I) y, posteriormente, estimular los hemocitos con una mezcla de mitógenos.
Ventajosamente, la producción de ácido carmínico a través del proceso novedoso de la presente invención proporciona reducción tanto en el número de insectos a utilizar como en los tiempos de producción y cosecha que ahora se estiman entre aproximadamente 12-14 días, así como también reducción en los gastos de operación y de recursos humanos, en espacio reducido se producen grandes cantidades y el manejo es con células en condiciones de laboratorio sin la necesidad de manejar volúmenes grandes de insumos, reducción de materia prima (eliminación de planta hospedera), cosecha en forma soluble directa sin necesidad de procesos de secado (tiempos y materiales), crio-preservación de una estirpe celular de producción para la perpetuidad en caso de que en un futuro las poblaciones de insecto sean escasas, producción libre de plagas y depredadores naturales, empleo de menos insectos en una cantidad de aproximadamente 10-15 individuos para producir la misma cantidad comparado con los métodos tradicionales que requieren el sacrificio de aproximadamente 350,000 a aproximadamente 400,000 insectos Dactylopius coccus Costa (cochinilla) para producir aproximadamente un kilogramo de ácido carmínico, el costo de producción es aproximadamente 50% menos que los costos por método tradicional, además de ser un proceso escalable bajo el esquema de reproducción de unidades de producción.
De acuerdo con la presente invención se provee una metodología para aislar, extraer y mantener una línea celular productora de AC pura para obtener cosechas de producción de AC reproducibles y constantes en condiciones de laboratorio y en producción de recipiente de 1000 mi, así como mantener líneas celulares libres de contaminantes de forma constante que fueran reproducibles y replicables ante el estímulo que se les administra a los cultivos.
DESCRIPCIÓN DE LA FIGURAS
Las características particulares y ventajas de la invención, así como otros objetos de la misma, serán aparentes de la siguiente descripción, tomada en conexión con las figuras acompañantes, las cuales:
La Figura 1 muestra la Fase I de extracción de hemocitos de la hemolinfa del insecto Dactylopius coccus Costa, en donde:
A y B son cromatocitos (separados y concentrados en gradiente de Percoll 70%), cultivados por 96 horas en medio Schneider. A y B son el mismo tipo de células con diferente contraste de imagen en microscopio. En B se hace más evidente la presencia en citoplasma de los gránulos de ácido carmínico.
C son cromatocitos de menor edad indiferenciados que una vez maduros empezarán a incrementar su producción de ácido carmínico.
La Figura 2 muestra los resultados de gradiente de Percoll (fases de separación) y formación de carbamato (producto celular) en la superficie de los dos últimos tubos como un sobrenadante que se aprecia de color negro.
La Figura 3 muestra una microscopía de contraste de fases de hemocitos estimulados por los mitógenos post-72 horas cultivados en medio de cultivo Schneider.
La Figura 4 muestra una microscopía de bioproducción viabilidad celular en cultivo en medio Schneider 72 horas post inoculación, ensayo MTT 2 Mm cultivo en placa.
La Figura 5 muestra una microscopía de los granulocitos 96 horas post inoculación.
La Figura 6 muestra una representación del proceso de producción y mantenimiento en recipientes de fondo plano de acuerdo a una modalidad de la invención.
La Figura 7 muestra los resultados de la revisión en recipientes al día 25 post inoculación.
La Figura 8 muestra una gráfica de resultados que describe el espectro de absorción (Absorbancia vs longitud de onda en nanómetros) para la identificación del AC en biocultivo de la tabla del ejemplo 1 detallado en la sección de ejemplos de más abajo.
La Figura 9 muestra una gráfica de resultados que describe el espectro de absorción para la identificación del AC en biocultivo purificado de la tabla del ejemplo 2 detallado en la sección de ejemplos de más abajo.
La Figura 10 complementaria a la Tabla 2 descrita abajo, dicha figura muestra resultados preliminares de los diferentes tipos celulares que se obtienen por gradiente de Percoll (microscopías de las células obtenidas en gradiente de Percoll) del método detallado más abajo.
La Figura 11 muestra una micrografía de un granulocito en cultivo en día 8.
La Figura 12 muestra una micrografía de un granulocito en cultivo en día 10.
La Figura 13 muestra un efecto anticoagulante en la obtención de la hemolinfa por perfusión.
La Figura 14 muestra integridad de las proteínas obtenidas durante la perfusión.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Las siguientes definiciones se proveen para permitir una mejor comprensión de la invención:
El uso del término “aproximado/aproximadamente” provee un determinado rango adicional. El término es definido de la siguiente manera. El rango adicional provisto por el término es de aproximadamente ± 10%. De manera ejemplar, pero no limitativa, si se dice “aproximadamente 40 gramos”, el rango se encuentra entre ± 10% de desviación estándar y así sucesivamente para las demás mediciones.
De acuerdo con la presente invención, la producción de ácido carmínico in vitro, comprende: extraer, aislar, purificar y permanecer una línea celular de hemocitos obtenida de hembras adulto oviplenas (llenas de huevecillos) del insecto Dactylopius coccus Costa (insectos cochinilla) de la siguiente manera generalizada:
Extracción de Hemocitos de la hemolinfa:
A partir de cepas grávidas oviplenas de Dactylopius coccus se obtiene hemolinfa por perfusión del hemocele de la cepa con una solución amortiguadora anticoagulante que comprende una base, una sal iónica, un agente quelante y un ácido orgánico, hasta obtener una solución pigmentada roja que contiene células productoras de ácido carmínico (AC) entre otras.
En una modalidad de la invención la solución amortiguadora anticoagulante comprende NaOH, NaCI, EDTA y ácido cítrico.
La solución pigmentada obtenida se deposita en recipientes estériles y se centrifuga.
El sobrenadante es recuperado.
Por otro lado, se prepara un gradiente discontinuo de Percoll con solución salina de fosfatos.
El gradiente discontinuo de Percoll se precorre por centrifugación.
Una vez finalizada la precorrida se adiciona la solución pigmentada obtenida.
Se corre por centrifugación para obtener células identificadas (Tabla 2).
Al final de la corrida, se obtienen las células de la hemolinfa que se destinará para generar un cultivo.
Las células son recuperadas y colocadas en placas con medio de cultivo para cultivo de líneas celulares de insectos para su adaptación.
Selección de la línea Celular y obtención de Cultivos primarios:
Se revisan, evalúan y seleccionan los cultivos que muestran al microscopio células diferenciadas.
Se seleccionan granulocitos y hemocitos.
Se siembran las células seleccionadas en placas con medio de cultivo para cultivo de líneas celulares de insectos para su adaptación.
Finalmente, se revisan y evalúan de acuerdo con su integridad celular fenotipo.
Estimulación y Activación de las líneas celulares:
A cada célula en cultivo se les adiciona una combinación de mitógenos en solución salina de fosfatos para promover la mitosis.
Los cultivos son incubados hasta volverse gradualmente rojos y se observan células en la división celular debido a los mitógenos.
Los cultivos que muestran aumento en su densidad poblacional son seleccionados y se propagan en recipiente en donde se recomienda elaborar un preservado criogénico.
Propagación y producción en recipiente:
Las células en placa se cultivan en recipientes con medio de cultivo para crecimiento de líneas celulares de insectos.
Los recipientes se incuban durante un intervalo de tiempo de aproximadamente 10-14 días (línea primaria). Durante este período de tiempo las células forman una monocapa confluente de células adheridas al recipiente, y el medio de cultivo se vuelve rojo como una señal positiva de producción de color.
Los recipientes se revisan cada día para evaluar y comprobar la presencia de mitosis.
Al finalizar el ciclo, los cultivos se recolectan y se ordeña o cosecha el color de cada uno de los recipientes de cultivo.
La “ordeña” o “cosecha” se hace en un ambiente desinfectado y cada cosecha es centrifugada en recipientes con el propósito de eliminar los detritus celulares y solamente recuperar el sobrenadante que es en este caso: “El pigmento” (ácido carmínico).
Para fines de la presente invención, se presentan detalladamente los pasos del método arriba mencionado:
Extracción de Hemocitos de la hemolinfa:
En primer lugar, a partir de por lo menos aproximadamente 20 a aproximadamente 95 mg de cepas grávidas oviplenas de Dactylopius coccus, preferiblemente de aproximadamente 30 a aproximadamente 85 mg de cepas grávidas oviplenas del insecto, se obtiene hemolinfa por perfusión del hemocele de la cepa con una solución amortiguadora anticoagulante reportada en la literatura por Graham et al., 1986 compuesta por un intervalo de aproximadamente 0.25 mM a aproximadamente 0.75 mM de NaOH, preferiblemente aproximadamente 0.61 mM; un intervalo de aproximadamente 0.15 M a aproximadamente 0.50 M de NaCI, preferiblemente aproximadamente 0.56 M; un intervalo de aproximadamente 0.10 mM a aproximadamente 0.25 mM de EDTA, preferiblemente aproximadamente 0.16 mM; un intervalo de aproximadamente 100 mM a aproximadamente 250 mM de ácido cítrico, preferiblemente aproximadamente 100 mM; a un pH aproximado en un intervalo de 4.5-6.5 como puede observarse en la Tabla 1 más abajo. La solución que se obtiene es una solución pigmentada roja en donde van suspendidas las células productoras de ácido carmínico (AC) así como otras variantes celulares (hemocitos) de la hemolinfa.
La solución pigmentada obtenida se deposita en recipientes estériles, de manera preferida para los efectos de la presente invención en tubos cónicos estériles de polipropileno y se centrifuga a un intervalo de aproximadamente 500-1200 revoluciones por minuto (rpm), preferiblemente de aproximadamente 600-1000 rpm, por aproximadamente un intervalo de 8-17 minutos, preferiblemente aproximadamente 10-15 minutos a una temperatura aproximada en un intervalo de 2-5°C, de manera preferida aproximadamente 4°C.
El sobrenadante es recuperado en recipientes estériles, de manera preferida para los efectos de la presente invención en tubos cónicos estériles de polipropileno y se mantienen a temperatura ambiente.
Adicionalmente, se prepara un gradiente discontinuo de Percoll (aproximadamente a un intervalo de aproximadamente 10-90%, de manera preferida a un intervalo entre aproximadamente 20-80%) con solución salina de fosfatos (PBS 1X a un rango de pH de aproximadamente 4.5 a 5.2, de manera preferida a un pH de aproximadamente 5.5) como puede observarse en la subsecuente Tabla 2 y en la Figura 10 en la sección de Figuras. TABLA 2: Gradientes de Percoll empleados
Figure imgf000008_0001
El gradiente se precorre centrifugando a un intervalo de por lo menos aproximadamente 4000-5500 rpm, preferiblemente a un intervalo de aproximadamente 4500-5000 rpm, en un intervalo de tiempo de aproximadamente 12-22 minutos, preferiblemente a un intervalo de aproximadamente 15 a 20 minutos.
Una vez finalizada la precorrida se adiciona una cantidad en un intervalo de aproximadamente 95-550 m I, preferiblemente a un intervalo de aproximadamente 100-500 m I de la solución pigmentada obtenida.
Se centrifuga a aproximadamente a 1000 revoluciones por minuto (rpm) durante un período de tiempo en un intervalo de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 minutos, de manera preferida aproximadamente 15 minutos, a temperatura ambiente, para obtener los siguientes resultados como pueden apreciarse en la Tabla 2 que se reproduce nuevamente abajo y en la Figura 10 en la sección de Figuras.
TABLA 2: Gradientes de Percoll empleados
Figure imgf000009_0001
Figure imgf000010_0001
Al final de la corrida por centrifugación, se obtienen varias fases, la interfase entre el Percoll y el colorante (pigmento) contiene las células purificadas de la hemolinfa que se destinará para generar un cultivo primario (fase I).
Las células son recuperadas y colocadas en placas, preferiblemente pero no de manera limitada, placas multipocillos de 16 pocilios con aproximadamente 100 a aproximadamente 500 m I, de manera preferida aproximadamente 250 mI, de medio de cultivo para cultivo de líneas celulares de insectos, de manera preferida medio comercial Schneider por un intervalo de tiempo de aproximadamente 20-30 horas, preferiblemente a un intervalo de aproximadamente 24-26 horas a una temperatura aproximada en un intervalo de aproximadamente 20-28° C, preferiblemente a un intervalo de aproximadamente 22-26° C para su adaptación.
Selección de la línea Celular y obtención de Cultivos primarios:
Aproximadamente 24 horas después del cultivo, se revisan, evalúan y seleccionan los cultivos que muestran al microscopio mejor integridad celular y fenotipo.
Se seleccionan la variante celular: “Granulocitos jóvenes” y la variante “hemocitos indiferenciados jóvenes” (SELECCIÓN DE CANDIDATOS).
Estas dos variantes son seleccionadas y sembradas nuevamente en placas, preferiblemente pero no de manera limitada, placas multipocillos de 16 pocilios con aproximadamente 100 a aproximadamente 500 m I, de manera preferida aproximadamente 250 m I, de medio de cultivo para cultivo de líneas celulares de insectos, de manera preferida medio comercial Schneider por un tiempo en un intervalo de aproximadamente 20-30 horas, preferiblemente en un intervalo de aproximadamente 22-26 horas a una temperatura en un intervalo de aproximadamente 20-28°C, preferiblemente a un intervalo de aproximadamente 22-26° C para su adaptación.
Finalmente, aproximadamente 24 horas después se revisan y evalúan de acuerdo con su integridad celular y mantenimiento del fenotipo.
Estimulación y Activación de las líneas celulares:
A cada uno de los pocilios con las células en cultivo se les adiciona una combinación de mitógenos (Concanavalina A a un intervalo de aproximadamente 0.20-0.30 micromoles, de manera preferida aproximadamente 0.25 micromoles + Fitohemaglutinina a un intervalo de aproximadamente 0.40-0.60 micromoles, de manera preferida aproximadamente 0.50 micromoles) en solución salina de fosfatos (PBS 1X a un pH de entre aproximadamente 4.8- 5.2, de manera preferida a un pH de aproximadamente 5.0), para promover la mitosis en granulocitos jóvenes.
Los cultivos son incubados a un intervalo de temperatura aproximada de 20-28° C, preferiblemente a un intervalo de aproximadamente 22-26° C por un intervalo de tiempo de aproximadamente 20-50 horas, preferiblemente a un intervalo de aproximadamente 24-48 horas, en donde se vuelven gradualmente rojos y se observan células en la división celular debido a los mitógenos.
Los cultivos que muestran aumento en su densidad poblacional son seleccionados y llevados a la etapa de propagación y producción en recipiente.
En la etapa de propagación en recipiente se recomienda elaborar un preservado criogénico para guardar en tanques de nitrógeno líquido (en un intervalo de entre aproximadamente -160 a -180°C, preferiblemente a aproximadamente -170°C) por un tiempo aproximado de dos a tres meses.
Propagación y producción en recipiente:
Las células en placa son llevadas a cultivo en recipientes con medio de cultivo para crecimiento de líneas celulares de insectos, para los propósitos de la presente invención se prefieren recipientes de fondo plano con un área superficial en un intervalo de aproximadamente 200-300 cm2, más preferiblemente recipientes de aproximadamente 225 cm2 de superficie; para esto, a manera de ejemplo se utilizan aproximadamente 200 m I del cultivo de placa y se inocula en un intervalo de aproximadamente 200-350 m I, más preferiblemente a un intervalo de aproximadamente 250- 300 m I de medio de cultivo para cultivo de líneas celulares de insectos, de manera preferida medio de cultivo Schneider.
Los recipientes se incuban a un intervalo de aproximadamente 20-28° C, preferiblemente a un intervalo de aproximadamente 22-26°C durante un intervalo de tiempo de aproximadamente 10-14 días, preferiblemente durante un intervalo de tiempo de aproximadamente 12-13 días (línea primaria). Durante este período de tiempo, las células forman una monocapa confluente de células adheridas al recipiente, y el medio de cultivo se vuelve rojo como una señal positiva de producción de color.
Los recipientes se revisan aproximadamente cada 24 horas para evaluar y comprobar la presencia de mitosis en las líneas celulares.
Al finalizar el ciclo, los cultivos se recolectan y se ordeña o cosecha el color de cada uno de los recipientes de cultivo.
La “ordeña” o “cosecha” se hace en un ambiente sanitizado y cada cosecha es centrifugada en recipientes, para efectos de la presente invención se prefieren tubos cónicos de una capacidad de aproximadamente 40-60 mi de volumen, de manera más preferida a una capacidad de aproximadamente 50 mi, a un intervalo de velocidad de aproximadamente 3500-5500 rpm, preferentemente 4000-5000 rpm por un intervalo de tiempo aproximado de entre 18-22 minutos, preferiblemente aproximadamente 20 minutos, con el propósito de eliminar los detritus celulares y solamente recuperar el sobrenadante que es en este caso: “El pigmento” (ácido carmínico).
Es importante mencionar que el arte previo divulga que con los métodos convencionales de producción de ácido carmínico se requieren miles de insectos para producir aproximadamente 1 kg de ácido carmínico (AC), además se requiere una planta hospedera de alta calidad que en estos casos es la planta del nopal Opuntia ficus- indica, que debe ser reemplazada o cultivada de forma constante (costos) al igual que un control fitosanitario preventivo y profiláctico de la penca que implica empleo de recursos humanos para el cuidado constante del cultivo; para las cosechas se requieren cumplir ciclos de crecimiento de 80-90 días para que el insecto crezca, alcance la edad adulta y se coseche; además, para la producción de AC se requiere de un proceso de secado después de la cosecha en la cual hay mermas de producción naturales. Aproximadamente en una proporción 3:1 (insecto vivo: insecto seco), existe presencia de plagas y depredadores que merman producción en algunos momentos, hay costos de producción elevados por todo lo anteriormente expuesto, el precio internacional es monopolizado por los países que producen altas cantidades de AC, se fija el precio arbitrariamente por ser la única forma de producción y porque en los países altamente productores las condiciones biogeográficas permiten producir al año grandes cantidades por lo que se requieren de áreas de producción grandes para producir cantidades atractivas de AC.
En algunas modalidades de la presente invención, la propagación y producción en recipiente del ácido carmínico se puede realizar en recipientes tales como, pero sin ser limitativos a, botellas de cultivo de fondo plano, Matraces de Roux, biorreactores de mesa, biorreactores especializados, biorreactores industriales, recipientes en los que se lleve a cabo un proceso químico que involucra organismos, microorganismos o sustancias bioquímicamente activas derivadas de dichos organismos y/o microorganismos y/o cualquier otro recipiente o dispositivo adecuado donde se pueda llevar a cabo una reacción de propagación como la que se describe en la presente invención.
EJEMPLOS
Ejemplo 1.- ESPECTRO DE ABSORCIÓN PARA LA IDENTIFICACIÓN DEL AC EN BIOCULTIVO
Tabla de resultados:
Figure imgf000012_0001
La filtración se realizó con membrana PVOF (0.2 mm)/ calentamiento 30 minutos (55°C). Ejemplo obtención del % AC con el resultado 3:
Fórmula: %AC = 0.5208/0.139 x 0.1 g = 37.46%
Ejemplo 2.- ESPECTRO DE ABSORCIÓN PARA LA IDENTIFICACIÓN DEL AC EN BIOCULTIVO PURIFICADO
Tabla de resultados:
Figure imgf000013_0001
Ejemplo obtención del % AC:
Fórmula: %AC = 0.5562/0.139 x 0.05 g = 80.02%
Aunque se han descrito las modalidades de la invención precedente en cierto detalle a modo de ilustración y ejemplo con el propósito de mejorar su comprensión, las descripciones y ejemplos no deben interpretarse como limitantes del alcance de la invención, sólo ¡lustran algunas de las variaciones que se encuentran comprendidas dentro del espíritu y alcance de la misma. Como será evidente para una persona con conocimientos medios en la materia, las variaciones o modificaciones que no se alejen del espíritu de la invención se encuentran dentro del alcance de la misma. Las descripciones de la literatura científica aquí citadas se incorporan de forma expresa como referencia.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Un método para la producción de ácido carmínico proveniente de insectos del género Dactylopius coccus (grana cochinilla), el método comprendiendo: extraer hemocitos de hemolinfa de los insectos hasta obtener una solución que comprende células productoras de ácido carmínico; precorrer una solución de gradiente de Percoll; agregar la solución que comprende las células productoras de ácido carmínico a la solución precorrida de gradiente de Percoll para obtener una mezcla que comprende hemocitos; purificar los hemocitos de la mezcla; recuperar los hemocitos purificados; cultivar los hemocitos purificados con medio de cultivo para cultivo de líneas celulares de insectos; estimular y activar las líneas celulares de insectos; y propagar las líneas celulares de insectos produciendo el ácido carmínico.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde extraer hemocitos de hemolinfa se realiza por perfusión del hemocele con una solución amortiguadora anticoagulante que comprende una base, una sal iónica, un agente quelante y un ácido orgánico; en donde la solución de gradiente de Percoll se prepara con una solución salina de fosfatos; en donde la etapa de precorrer el gradiente de Percoll se realiza mediante centrifugación; y, en donde la etapa de purificar los hemocitos de la mezcla se realiza por centrifugación.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde antes de estimular y activar las líneas celulares, el método comprende seleccionar granulocitos y hemocitos jóvenes y cultivar las células seleccionadas con medio de cultivo para cultivo de líneas celulares de insectos.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde estimular y activar las líneas celulares comprende: agregar una combinación de mitógenos en solución salina de fosfatos; incubar las líneas celulares con la combinación de mitógenos agregada para generar cultivos; y después de la incubación, seleccionar los cultivos que muestren aumento en su densidad poblacional.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en donde propagar las líneas celulares de insectos y producir el ácido carmínico comprende: cultivar las células seleccionadas de los cultivos que muestren aumento en su densidad poblacional en recipientes con medio de cultivo para crecimiento de líneas celulares de insectos; y recolectar los cultivos y cosechar el ácido carmínico (color) producido.
6. El método de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde el gradiente de Percoll se encuentra a aproximadamente 10-90%.
7. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en donde los cultivos se realizan durante un intervalo de tiempo de aproximadamente 20-50 horas a una temperatura en un intervalo de aproximadamente 20-28°C.
8. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en donde los cultivos que muestren aumento en densidad poblacional se preservan en fase criogénica con nitrógeno líquido.
9. El método de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la fase criogénica se lleva a cabo a una temperatura en un intervalo aproximado de entre -160°C a -180°C por un tiempo de aproximadamente 2-3 meses.
10. El método de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde la etapa de extraer hemocitos de la hemolinfa comprende aproximadamente de 20 mg a aproximadamente 95 mg de cepas grávidas oviplenas del insecto Dactylopius coccus (cochinilla).
11. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la solución amortiguadora anticoagulante comprende de 0.25 mM a aproximadamente 0.75 mM de NaOH; un intervalo de aproximadamente 0.15 M a aproximadamente 0.50 M de NaCI; un intervalo de aproximadamente 0.10 mM a aproximadamente 0.25 mM de EDTA; un intervalo de aproximadamente 100 mM a aproximadamente 250 mM de ácido cítrico; a un pH aproximado en un intervalo de 4.5-6.5.
12. El método de acuerdo con la reivindicación 11 , en donde la solución amortiguadora anticoagulante comprende preferiblemente 0.61 mM de NaOH; 0.56 M de NaCI; 0.16 mM de EDTA; 100 mM de ácido cítrico; a un pH aproximado en un intervalo de 4.5-6.5.
13. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el medio de cultivo de líneas celulares de insectos es medio de cultivo Schneider.
14. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en donde los mitógenos son Concanavalina A a un intervalo de aproximadamente 0.20-0.30 micromoles con Fitohemaglutinina a un intervalo de aproximadamente 0.40- 0.60 micromoles.
15. Ácido carmínico caracterizado porque comprende la estructura:
Figure imgf000015_0001
producido de acuerdo con el método de la reivindicación 1 .
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