WO2022055192A1 - 신규 o-포스포세린 배출 단백질 및 이를 이용한 o-포스포세린, 시스테인 및 이의 유도체의 생산 방법 - Google Patents

신규 o-포스포세린 배출 단백질 및 이를 이용한 o-포스포세린, 시스테인 및 이의 유도체의 생산 방법 Download PDF

Info

Publication number
WO2022055192A1
WO2022055192A1 PCT/KR2021/011994 KR2021011994W WO2022055192A1 WO 2022055192 A1 WO2022055192 A1 WO 2022055192A1 KR 2021011994 W KR2021011994 W KR 2021011994W WO 2022055192 A1 WO2022055192 A1 WO 2022055192A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
phosphoserine
activity
mdth
cysteine
producing
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/KR2021/011994
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
박혜민
김소연
심희진
유혜련
이진남
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
CJ CheilJedang Corp
Original Assignee
CJ CheilJedang Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to AU2021340470A priority Critical patent/AU2021340470B2/en
Priority to CN202180061926.XA priority patent/CN116568701A/zh
Priority to BR112023004005-1A priority patent/BR112023004005B1/pt
Priority to MX2023002722A priority patent/MX2023002722A/es
Priority to EP21867058.6A priority patent/EP4198130A4/en
Priority to US18/023,462 priority patent/US20230313243A1/en
Application filed by CJ CheilJedang Corp filed Critical CJ CheilJedang Corp
Priority to CA3191495A priority patent/CA3191495A1/en
Priority to JP2023515631A priority patent/JP7646816B2/ja
Publication of WO2022055192A1 publication Critical patent/WO2022055192A1/ko
Priority to ZA2023/03414A priority patent/ZA202303414B/en
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/245—Escherichia (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1096—Transferases (2.) transferring nitrogenous groups (2.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/12—Methionine; Cysteine; Cystine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01095—Phosphoglycerate dehydrogenase (1.1.1.95)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y205/00—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5)
    • C12Y205/01—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5) transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5.1)
    • C12Y205/01065—O-Phosphoserine sulfhydrylase (2.5.1.65)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y206/00—Transferases transferring nitrogenous groups (2.6)
    • C12Y206/01—Transaminases (2.6.1)
    • C12Y206/01052—Phosphoserine transaminase (2.6.1.52)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/03—Phosphoric monoester hydrolases (3.1.3)
    • C12Y301/03003—Phosphoserine phosphatase (3.1.3.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli

Definitions

  • the present application relates to a novel O-phosphoserine excreting protein and a method for producing O-phosphoserine, cysteine and derivatives of cysteine using the same.
  • L-cysteine is an important amino acid for sulfur metabolism in all living things. It is used not only for the synthesis of in vivo proteins such as hair keratin, glutathione, biotin, methionine and other sulfur-containing metabolites, but also as a precursor for coenzyme A biosynthesis. do.
  • a method of producing L-cysteine using a microorganism 1) A method of biologically converting D,L-ATC (D,L-2-amino-2-thiazoline-4-carboxylate) using a microorganism, 2) Direct fermentation method for producing L-cysteine using E. coli (European Patent Registration EP0885962B; Wada M and Takagi H, Appl. Microbiol.
  • O-phosphoserine using microorganisms
  • O-phosphoserine hereinafter “OPS”
  • OPSS O-phosphoserine sulfhydrylase
  • the present inventors identified an appropriate excretion factor that allows O-phosphoserine produced in the OPS-producing strain to be smoothly discharged out of the cell, and as a result of earnest efforts to increase the production of OPS, the present application by discovering a novel OPS excreting protein was completed.
  • One object of the present application is to provide a recombinant microorganism producing O-phosphoserine, in which the activity of the mdtH protein is enhanced compared to the intrinsic activity.
  • Another object of the present application is to provide a method for producing O-phosphoserine using the O-phosphoserine-producing recombinant microorganism of the present application.
  • Another object of the present application is to provide a method for producing cysteine or a derivative thereof using the O-phosphoserine-producing recombinant microorganism of the present application.
  • the present application provides an O-phosphoserine-producing recombinant microorganism in which the activity of the mdtH protein is enhanced compared to the intrinsic activity.
  • OPS O-phosphoserine
  • OPSS OPS sulfhydrylase
  • the recombinant microorganism of the present application may have enhanced O-phosphoserine excretion activity compared to its intrinsic activity.
  • the mdtH protein of the present application may have an activity of releasing O-phosphoserine out of cells, and this activity was first identified in the present application.
  • the mdtH protein of the present application may be a membrane protein, and the mdtH protein of the present application may be derived from Escherichia coli .
  • mdtH protein of the present application may be a transporter belonging to a major facilitator superfamily (MFS).
  • MFS major facilitator superfamily
  • the mdtH protein of the present application may be a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence exhibiting 95% or more identity with SEQ ID NO: 1 while having O-phosphoserine excretion activity.
  • the protein comprising the amino acid sequence showing 95% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is the same as or equivalent to the mdtH protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 If it is a protein that exhibits OPS excretion activity, including without limitation do.
  • amino acid sequence showing 95% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, 99.5% or more, or 99.75 to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 % or more, and less than 100% identity.
  • the mdtH protein of the present application is a protein variant in which some sequences are deleted, modified, substituted, conservatively substituted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or the amino acid sequence showing 95% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 Also may be included within the scope of the present application as long as it has substantially O-phosphoserine excretion activity.
  • the mdtH protein of the present application has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or O-phosphoserine excretion activity while adding meaningless sequences before and after the amino acid sequence having 95% or more identity with SEQ ID NO: 1 or naturally occurring mutations , or a latent mutation thereof may be apparent to those skilled in the art.
  • the term 'homology' or 'identity' refers to the degree of similarity between two given amino acid sequences or nucleotide sequences and may be expressed as a percentage.
  • the terms homology and identity can often be used interchangeably.
  • Sequence homology or identity of a conserved polynucleotide or polypeptide is determined by standard alignment algorithms, with default gap penalties established by the program used may be used. Substantially homologous or identical sequences are generally capable of hybridizing with all or part of a sequence under moderate or high stringent conditions. It is apparent that hybridization also includes hybridization with a polynucleotide containing a common codon in a polynucleotide or a codon in consideration of codon degeneracy.
  • a GAP program can be defined as the total number of symbols in the shorter of two sequences divided by the number of similarly aligned symbols (ie, nucleotides or amino acids).
  • Default parameters for the GAP program are: (1) a binary comparison matrix (containing values of 1 for identity and 0 for non-identity) and Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation , pp. 353-358 (1979), Gribskov et al (1986) Nucl. Acids Res. 14: weighted comparison matrix of 6745 (or EDNAFULL (EMBOSS version of NCBI NUC4.4) substitution matrix); (2) a penalty of 3.0 for each gap and an additional 0.10 penalty for each symbol in each gap (or a gap opening penalty of 10, a gap extension penalty of 0.5); and (3) no penalty for end gaps.
  • OPS orthophosphoserine
  • OPS-producing recombinant microorganism refers to a microorganism having a naturally weak OPS-producing ability or a parent strain without OPS-producing ability naturally or artificially genetically modified to give OPS-producing ability. It may mean microorganisms.
  • OPS-producing recombinant microorganism may be used interchangeably with "a microorganism having an OPS-producing ability”.
  • the production of OPS may be increased compared to the wild-type or pre-modified microorganism. This is because the wild-type or pre-modified microorganism cannot produce OPS or can produce a trace amount even if it produces OPS, whereas the microorganism of the present application can increase the OPS-producing ability by enhancing the activity of the mdtH protein.
  • the term “enhancement” of a polypeptide activity means that the activity of the polypeptide is increased compared to the intrinsic activity.
  • the reinforcement may be used interchangeably with terms such as activation, up-regulation, overexpression, and increase.
  • activation, enhancement, upregulation, overexpression, and increase may include all of those exhibiting an activity that was not originally possessed, or exhibiting an improved activity compared to intrinsic activity or activity before modification.
  • intrinsic activity refers to the activity of a specific polypeptide originally possessed by the parent strain or unmodified microorganism before transformation when the trait is changed due to genetic mutation caused by natural or artificial factors. It can be used interchangeably.
  • Enhancement, “upregulation”, “overexpression” or “increase” of the activity of a polypeptide compared to the intrinsic activity means that the activity of a specific polypeptide originally possessed by the parent strain or unmodified microorganism before transformation. And / or concentration (expression amount) means improved compared to.
  • the enrichment can be achieved by introducing an exogenous polypeptide, or by enhancing the activity and/or concentration (expression amount) of an endogenous polypeptide. Whether or not the activity of the polypeptide is enhanced can be confirmed from the increase in the level of activity, expression level, or the amount of product excreted from the polypeptide.
  • the enhancement of the activity of the polypeptide can be applied by various methods well known in the art, and is not limited as long as it can enhance the activity of the target polypeptide compared to the microorganism before modification. Specifically, it may be one using genetic engineering and/or protein engineering well known to those skilled in the art, which is a routine method of molecular biology, but is not limited thereto (eg, Sitnicka et al. Functional Analysis of Genes. Advances in Cell). Biology 2010, Vol. 2. 1-16, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012, etc.).
  • modification of the polynucleotide sequence encoding the polypeptide to enhance the activity of the polypeptide eg, modification of the polynucleotide sequence of the polypeptide gene to encode a polypeptide that has been modified to enhance the activity of the polypeptide;
  • the increase in the intracellular copy number of the polynucleotide encoding the polypeptide is achieved by introduction of a vector, to which the polynucleotide encoding the polypeptide is operably linked, which can replicate and function independently of the host, into a host cell.
  • the polynucleotide encoding the polypeptide may be achieved by introducing one copy or two or more copies into a chromosome in a host cell.
  • the introduction into the chromosome may be performed by introducing a vector capable of inserting the polynucleotide into the chromosome in the host cell into the host cell, but is not limited thereto.
  • the vector is the same as described above.
  • Replacing the gene expression control region (or expression control sequence) on the chromosome encoding the polypeptide with a sequence with strong activity is, for example, deletion, insertion, non-conservative or Conservative substitution or a combination thereof may result in a mutation in the sequence, or replacement with a sequence having a stronger activity.
  • the expression control region is not particularly limited thereto, but may include a promoter, an operator sequence, a sequence encoding a ribosome binding site, and a sequence for regulating the termination of transcription and translation. As an example, it may be to replace the original promoter with a strong promoter, but is not limited thereto.
  • Examples of known strong promoters include cj1 to cj7 promoter (US Patent US 7662943 B2), lac promoter, trp promoter, trc promoter, tac promoter, lambda phage PR promoter, PL promoter, tet promoter, gapA promoter, SPL7 promoter, SPL13 (sm3) promoter (US Patent US 10584338 B2), O2 promoter (US Patent US 10273491 B2), tkt promoter, yccA promoter, etc., but is not limited thereto.
  • the modification of the nucleotide sequence encoding the start codon or 5'-UTR region of the gene transcript encoding the polypeptide is, for example, a nucleotide sequence encoding another start codon having a higher expression rate of the polypeptide compared to the intrinsic start codon. It may be a substitution, but is not limited thereto.
  • the modification of the amino acid sequence or polynucleotide sequence of 4) and 5) above may include deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution of the amino acid sequence of the polypeptide or the polynucleotide sequence encoding the polypeptide to enhance activity of the polypeptide; A combination thereof may result in sequence mutation, or replacement with an amino acid sequence or polynucleotide sequence improved to have stronger activity or an amino acid sequence or polynucleotide sequence improved to increase activity, but is not limited thereto.
  • the replacement may be specifically performed by inserting a polynucleotide into a chromosome by homologous recombination, but is not limited thereto.
  • the vector used may further include a selection marker for confirming whether or not the chromosome is inserted. The selection marker is the same as described above.
  • the introduction of the foreign polynucleotide exhibiting the activity of the polypeptide may be introduction of the foreign polynucleotide encoding the polypeptide exhibiting the same/similar activity as the polypeptide into a host cell.
  • the foreign polynucleotide is not limited in origin or sequence as long as it exhibits the same/similar activity as the polypeptide.
  • the method used for the introduction can be performed by appropriately selecting a known transformation method by those skilled in the art, and the introduced polynucleotide is expressed in a host cell to generate a polypeptide and increase its activity.
  • Codon optimization of the polynucleotide encoding the polypeptide is codon-optimized so that the transcription or translation of the endogenous polynucleotide is increased in the host cell, or the transcription and translation of the foreign polynucleotide is optimized in the host cell. It may be that its codons are optimized so that the
  • Selecting an exposed site by analyzing the tertiary structure of the polypeptide and modifying or chemically modifying it for example, compares the sequence information of the polypeptide to be analyzed with a database in which sequence information of known proteins is stored to determine the degree of sequence similarity. Accordingly, it may be to determine a template protein candidate, check the structure based on this, and select an exposed site to be modified or chemically modified and modified or modified.
  • Such enhancement of polypeptide activity is to increase the activity or concentration of the corresponding polypeptide relative to the activity or concentration of the polypeptide expressed in the wild-type or pre-modified microbial strain, or increase the amount of product produced from the polypeptide.
  • the present invention is not limited thereto.
  • the term "vector” refers to a DNA comprising a nucleotide sequence of a polynucleotide encoding the target polypeptide operably linked to a suitable expression control region (or expression control sequence) so that the target polypeptide can be expressed in a suitable host. preparations may be included.
  • the expression control region may include a promoter capable of initiating transcription, an optional operator sequence for regulating such transcription, a sequence encoding a suitable mRNA ribosome binding site, and a sequence regulating the termination of transcription and translation. After transformation into an appropriate host cell, the vector can replicate or function independently of the host genome, and can be integrated into the genome itself.
  • the vector used in the present application is not particularly limited, and any vector known in the art may be used.
  • Examples of commonly used vectors include natural or recombinant plasmids, cosmids, viruses and bacteriophages.
  • pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, and Charon21A may be used as phage vectors or cosmid vectors, and pDZ-based, pBR-based, and pUC-based plasmid vectors may be used.
  • pBluescript II-based, pGEM-based, pTZ-based, pCL-based, pET-based and the like can be used.
  • pDZ, pDC, pDCM2, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC vectors and the like can be used.
  • a polynucleotide encoding a target polypeptide may be inserted into a chromosome through a vector for intracellular chromosome insertion.
  • the insertion of the polynucleotide into the chromosome may be performed by any method known in the art, for example, homologous recombination, but is not limited thereto.
  • It may further include a selection marker (selection marker) for confirming whether the chromosome is inserted.
  • the selection marker is used to select cells transformed with the vector, that is, to determine whether a target nucleic acid molecule is inserted, and selectable phenotypes such as drug resistance, auxotrophy, resistance to cytotoxic agents, or surface polypeptide expression. Markers to be given can be used. In an environment treated with a selective agent, only the cells expressing the selectable marker survive or exhibit other expression traits, so that the transformed cells can be selected.
  • the term “transformation” refers to introducing a vector including a polynucleotide encoding a target polypeptide into a host cell or microorganism so that the polypeptide encoded by the polynucleotide can be expressed in the host cell.
  • the transformed polynucleotide may include all of them regardless of whether they are inserted into the chromosome of the host cell or located extrachromosomally, as long as they can be expressed in the host cell.
  • the polynucleotide includes DNA and/or RNA encoding a target polypeptide.
  • the polynucleotide may be introduced in any form as long as it can be introduced and expressed into a host cell.
  • the polynucleotide may be introduced into a host cell in the form of an expression cassette, which is a gene construct including all elements necessary for self-expression.
  • the expression cassette may include a promoter operably linked to the polynucleotide, a transcription termination signal, a ribosome binding site, and a translation termination signal.
  • the expression cassette may be in the form of an expression vector capable of self-replication.
  • the polynucleotide may be introduced into a host cell in its own form and operably linked to a sequence required for expression in the host cell, but is not limited thereto.
  • operably linked means that a promoter sequence that initiates and mediates transcription of a polynucleotide encoding the target variant of the present application and the polynucleotide sequence are functionally linked.
  • the recombinant microorganism of the present application includes a microorganism into which the gene/polynucleotide encoding the mdtH protein is introduced, a microorganism in which the intracellular copy number of the polynucleotide encoding the mdtH protein is increased, and a polynucleotide encoding the mdtH protein It may be a microorganism transformed with a vector that is there is.
  • the gene encoding the mdtH protein may be an mdtH gene.
  • the polynucleotide encoding the mdtH protein may be a polynucleotide including the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 can be obtained from GenBank of NCBI, which is a known database.
  • the protein/polypeptide comprising the amino acid sequence of the specific SEQ ID NO: or the amino acid sequence described in the specific SEQ ID NO: of the present application is a protein/polypeptide having the amino acid sequence of the specific SEQ ID NO: or the amino acid sequence described in the specific SEQ ID NO: It may be a protein/polypeptide consisting essentially of an amino acid sequence or an amino acid sequence set forth in a specific SEQ ID NO:
  • the polynucleotide comprising the nucleotide sequence of the specific SEQ ID NO: or the nucleotide sequence described in the specific SEQ ID NO: of the present application is a polynucleotide having the nucleotide sequence of the specific SEQ ID NO: or the nucleotide sequence described in the specific SEQ ID NO: It may be a polynucleotide consisting of/consisting essentially of a base sequence or a base sequence described in a specific SEQ ID NO.
  • the type of the microorganism of the present application is not particularly limited as long as it can produce OPS, and both prokaryotic and eukaryotic cells are possible, but specifically prokaryotic cells.
  • Escherichia genus Erwinia genus, Serratia genus, Providencia genus, Corynebacterium genus, and Brevibacterium belonging to the genus It may include a microbial strain, specifically, a microorganism of the genus Escherichia, more specifically Escherichia coli , but may be, but is not limited thereto.
  • the recombinant microorganism of the present application may additionally have a weakened activity of phosphoserine phosphatase (SerB) compared to its intrinsic activity.
  • SerB phosphoserine phosphatase
  • the SerB Since the SerB has an activity of converting OPS to L-serine (L-serine), the microorganism mutated to weaken the SerB activity has the characteristic of accumulating OPS and can be usefully used in the production of OPS.
  • the SerB may be a protein including the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, but is not limited thereto.
  • the SerB includes an amino acid sequence that is 80% or more, specifically 90% or more, more specifically 95% or more, more specifically 99% or more identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 as long as it exhibits SerB activity can, but is not limited to.
  • the polynucleotide encoding the SerB may have a nucleotide sequence encoding the amino acid set forth in SEQ ID NO: 3.
  • various modifications are made to the coding region within the range that does not change the amino acid sequence of the variant of the present application. can be done
  • the polynucleotide encoding the SerB may include, for example, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4, and the identity thereof is 80% or more, specifically 90% or more, more specifically 95% or more, more specifically 99% or more. It may include more than one nucleotide sequence, but is not limited thereto.
  • the term "weakening" of a polypeptide is a concept that includes both reduced or no activity compared to intrinsic activity.
  • the attenuation may be used interchangeably with terms such as inactivation, deficiency, down-regulation, decrease, reduce, attenuation, and the like.
  • the attenuation is when the activity of the polypeptide itself is reduced or eliminated compared to the activity of the polypeptide possessed by the original microorganism due to mutation of the polynucleotide encoding the polypeptide, etc.
  • the overall polypeptide activity level and/or concentration (expression amount) in the cell is lower than that of the native strain due to (translation) inhibition, etc., when the expression of the polynucleotide is not made at all, and/or when the expression of the polynucleotide is Even if there is no activity of the polypeptide, it may also be included.
  • the "intrinsic activity” refers to the activity of a specific polypeptide originally possessed by the parent strain, wild-type or unmodified microorganism before transformation when the trait is changed due to genetic mutation caused by natural or artificial factors. This may be used interchangeably with “activity before modification”. "Inactivation, deficiency, reduction, downregulation, reduction, attenuation” of the activity of a polypeptide compared to the intrinsic activity means that the activity of the specific polypeptide originally possessed by the parent strain or unmodified microorganism before transformation is lowered.
  • Attenuation of the activity of the polypeptide may be performed by any method known in the art, but is not limited thereto, and may be achieved by application of various methods well known in the art (eg, Nakashima N et al., Bacterial cellular engineering by genome editing and gene silencing. Int J Mol Sci. 2014;15(2):2773-2793, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012, etc.).
  • the attenuation of the polypeptide of the present application is
  • an antisense oligonucleotide eg, antisense RNA
  • an antisense oligonucleotide that complementarily binds to the transcript of said gene encoding the polypeptide
  • deletion of a part or all of the gene encoding the polypeptide may be the removal of the entire polynucleotide encoding the endogenous target polypeptide in the chromosome, replacement with a polynucleotide in which some nucleotides are deleted, or replacement with a marker gene.
  • the above 2) modification of the expression control region is deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution or a combination thereof, resulting in mutation in the expression control region (or expression control sequence), or weaker replacement with an active sequence.
  • the expression control region includes, but is not limited to, a promoter, an operator sequence, a sequence encoding a ribosome binding site, and a sequence regulating the termination of transcription and translation.
  • the base sequence modification encoding the start codon or 5'-UTR region of the gene transcript encoding the polypeptide is, for example, a base encoding another start codon having a lower polypeptide expression rate than the intrinsic start codon It may be substituted with a sequence, but is not limited thereto.
  • the modification of the amino acid sequence or polynucleotide sequence of 4) and 5) above deletes, inserts, non-conservative or conservative substitution of the amino acid sequence of the polypeptide or the polynucleotide sequence encoding the polypeptide to weaken the activity of the polypeptide. Or a combination thereof may result in sequence mutation, or replacement with an amino acid sequence or polynucleotide sequence improved to have weaker activity, or an amino acid sequence or polynucleotide sequence improved to have no activity, but is not limited thereto.
  • the expression of a gene may be inhibited or attenuated, but is not limited thereto.
  • antisense oligonucleotide eg, antisense RNA
  • antisense RNA an antisense oligonucleotide that complementarily binds to the transcript of the gene encoding the polypeptide
  • Weintraub, H. et al. Antisense-RNA as a molecular tool. for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986].
  • RTE reverse transcription engineering
  • Modification of part or all of the polynucleotide in the microorganism of the present application is (a) homologous recombination using a vector for chromosome insertion in the microorganism or genome correction using engineered nuclease (eg, CRISPR-Cas9) and/or (b) It may be induced by light and/or chemical treatments such as, but not limited to, ultraviolet and radiation.
  • the method for modifying part or all of the gene may include a method by DNA recombination technology.
  • a part or all of the gene may be deleted.
  • the injected nucleotide sequence or vector may include a dominant selection marker, but is not limited thereto.
  • the recombinant microorganism of the present application is additionally phosphoglycerate dehydrogenase (phosphoglycerate dehydrogenase, SerA), phosphoserine aminotransferase (phosphoserine aminotransferase, SerC), or any one of a combination of the activity is enhanced compared to the intrinsic activity it may have been
  • the SerA is a protein having an activity of converting 3-phosphoglycerate to 3-phospho-hydroxypymvate, and the SerC is 3-phosphohydroxypymvate. It is a protein having the activity of converting rubate into OPS. Therefore, the microorganisms with enhanced SerA or/and SerC activity can be usefully used as OPS-producing strains.
  • the SerA is not limited thereto, but may be a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or 6.
  • SEQ ID NO: 5 is a sequence of wild-type SerA
  • SEQ ID NO: 6 is a sequence of a SerA mutant in which feedback to serine is canceled.
  • the SerA is 80% or more, specifically 90% or more, more specifically 95% of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5 or 6 Above, more specifically, it may include an amino acid sequence that is 99% or more identical, but is not limited thereto.
  • the SerA mutant in which the feedback to serine is released refers to a case in which the activity is maintained or enhanced from feedback inhibition by serine or glycine by introducing a mutation such as insertion or substitution into the SerA-encoding gene, SerA variants with abolished feedback to the serine are already well known (Grant GA et al., J. Biol. Chem., 39: 5357-5361, 1999; Grant GA et al., Biochem., 39: 7316- 7319, 2000; Grant GA et al., J. Biol. Chem., 276:17844-17850, 2001; Peters-Wendisch P et al., Appl. Microbiol. BiotechnoL, 60:37-441, 2002; European Patent EP 0943687 B).
  • the polynucleotide encoding the wild-type SerA or the SerA variant in which feedback for serine is canceled may include a nucleotide sequence encoding any one of the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 5 to 6, but is not limited thereto.
  • various modifications may be made to the coding region within the range that does not change the amino acid sequence of the polypeptide due to codon degeneracy or in consideration of codons preferred by the organism in which the polypeptide is to be expressed.
  • the polynucleotide encoding the wild-type SerA or the SerA variant in which feedback to serine is canceled may be, for example, a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 or 8, and the homology thereof is 80% or more, specifically It may be a polynucleotide comprising a nucleotide sequence of 90% or more, more specifically 95% or more, and more specifically 99% or more, but is not limited thereto.
  • the SerC may be, for example, a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 9, but is not limited thereto.
  • it may include an amino acid sequence that is 80% or more, specifically 90% or more, more specifically 95% or more, even more specifically 99% or more identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 9. However, it is not limited thereto.
  • the polynucleotide encoding the SerC may include a nucleotide sequence encoding the amino acid set forth in SEQ ID NO: 9.
  • various modifications can be made in the coding region within the range that does not change the amino acid sequence of the polypeptide due to codon degeneracy or in consideration of codons preferred by the organism in which the polypeptide is to be expressed.
  • the SerC-encoding polynucleotide may include, for example, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10, and the homology thereof is 80% or more, specifically 90% or more, more specifically 95% or more, more specifically 99% or more. It may include a nucleotide sequence, but is not limited thereto.
  • the recombinant microorganism of the present application may be a microorganism in which the ability to further reduce the influx or degradation of OPS into cells.
  • the present application provides a method for producing O-phosphoserine, comprising the step of culturing a recombinant microorganism producing O-phosphoserine in which the activity of the mdtH protein is enhanced compared to the intrinsic activity. .
  • the mdtH protein, intrinsic activity, enrichment, O-phosphoserine and microorganisms are the same as described above.
  • the term "cultivation” means growing the microorganism in an appropriately controlled environmental condition.
  • the culture process of the present application may be made according to a suitable medium and culture conditions known in the art. Such a culture process can be easily adjusted and used by those skilled in the art according to the selected strain.
  • the culture may be a batch type, a continuous type, and a fed-batch type, but is not limited thereto.
  • Glycine may be provided in the form of purified glycine, yeast extract containing glycine, tryptone, and the concentration contained in the culture medium may be usually 0.1 to 10 g/L, specifically 0.5 to 3 g/L.
  • serine may be provided in the form of purified serine, yeast extract containing serine, tryptone, etc., and the concentration contained in the culture medium may be usually 0.1 to 5 g/L, specifically 0.1 to 1 g/L.
  • Carbon sources included in the medium include glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, starch, sugars and carbohydrates such as cellulose, oils and fats such as soybean oil, sunflower oil, castor oil, coconut oil, palmitic acid, fatty acids such as stearic acid and linoleic acid, alcohols such as glycerol and ethanol, and organic acids such as acetic acid, and these substances may be used individually or as a mixture, but are not limited thereto.
  • sugars and carbohydrates such as cellulose, oils and fats such as soybean oil, sunflower oil, castor oil, coconut oil, palmitic acid, fatty acids such as stearic acid and linoleic acid, alcohols such as glycerol and ethanol, and organic acids such as acetic acid, and these substances may be used individually or as a mixture, but are not limited thereto.
  • organic nitrogen sources such as peptone, yeast extract, broth, malt extract, corn steep liquor and soybean wheat and inorganic nitrogen sources such as urea, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, anmonium carbonate and ammonium nitrate are included. and these nitrogen sources may be used alone or in combination, but are not limited thereto.
  • potassium hydrogen phosphate dipotassium hydrogen phosphate and the corresponding sodium-containing salt may be included, but the present invention is not limited thereto.
  • the medium may contain a metal salt such as magnesium sulfate or iron sulfate, and in addition, amino acids, vitamins and appropriate precursors may be included. These media or precursors may be added to the culture in a batch or continuous manner, but is not limited thereto.
  • chemicals such as ammonium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia, phosphoric acid and sulfuric acid can be added to the culture in an appropriate manner to adjust the pH of the culture.
  • an antifoaming agent such as fatty acid polyglycol ester can be used to suppress foaming.
  • oxygen or oxygen-containing gas may be injected into the culture, or nitrogen, hydrogen or carbon dioxide gas may be injected with or without gas to maintain anaerobic and microaerobic conditions.
  • the temperature of the culture may be usually 25°C to 40°C, specifically 30°C to 35°C.
  • the incubation period of the culture may be continued until the desired production of useful substances is obtained, and specifically may be 10 to 100 hours. However, it is not limited to these examples.
  • the production method of O-phosphoserine of the present application includes the steps of preparing the microorganism of the present application, preparing a medium for culturing the microorganism, or a combination thereof (regardless of order, in any order), for example , prior to the culturing step, may be further included.
  • the method for producing O-phosphoserine of the present application may further include recovering O-phosphoserine from the medium according to the culture (the culture medium) or the microorganism of the present application. The recovering step may be further included after the culturing step.
  • the method for recovering the O-phosphoserine is a method of culturing the microorganism of the present application, for example, a desired O-phosphoserine using a suitable method known in the art according to a batch, continuous or fed-batch culture method, etc. It may be to collect.
  • centrifugation, filtration, treatment with a crystallized protein precipitant salting out method
  • extraction ultrasonic disruption, ultrafiltration, dialysis, molecular sieve chromatography (gel filtration), adsorption chromatography, ion exchange chromatography, affinity
  • chromatography such as island chromatography, HPLC, or a combination thereof
  • a desired O-phosphoserine may be recovered from a medium or a microorganism using a suitable method known in the art.
  • the O-phosphoserine production method of the present application may additionally include a purification step.
  • the purification may be performed using a suitable method known in the art.
  • the recovery step and the purification step are performed continuously or discontinuously, regardless of the order, or simultaneously or in one step It may be integrated and performed, but is not limited thereto.
  • variants, polynucleotides, vectors, strains, etc. are as described in the other aspects above.
  • the present application relates to: a) O-phosphoserine-producing recombinant microorganisms in which the activity of mdtH protein is enhanced compared to the intrinsic activity is cultured in a medium, and a medium containing O-phosphoserine or O-phosphoserine producing; And b) in the presence of O-phosphoserine sulfliydrylase (O-phosphoserine sulfliydrylase, OPSS) or a microorganism comprising the same, reacting the O-phosphoserine produced in step a) or a medium containing the same with sulfide It provides a method for producing cysteine or a derivative thereof, comprising a.
  • O-phosphoserine sulfliydrylase O-phosphoserine sulfliydrylase
  • the term “comprising” a specific protein means a state in which a specific protein of interest is introduced into the microorganism or expressed in the microorganism.
  • the mdtH protein, intrinsic activity, enrichment, and O-phosphoserine microorganisms are as described above.
  • derivative refers to a similar compound obtained by chemically changing a part of a certain compound, and usually refers to a compound in which a hydrogen atom or a specific atomic group is substituted with another atom or atomic group.
  • cyste derivative refers to a compound in which a hydrogen atom or a specific atomic group of cysteine is substituted with another atom or atomic group.
  • it may be a form in which another atom or group is attached to the nitrogen atom of the amine group (-NH2) of cysteine or the sulfur atom of the thiol group (-SH), for example, NAC (N-acetylcysteine), SCMC (S- Carboxymetylcysteine), BOC-CYS(ME)-OH,(R)-S-(2-Amino-2-carboxyethyl)-L-homocysteine, (R)-2-Amino-3-sulfopropionic acid, D-2-Amino -4-(ethylthio)butyric acid, 3-sulfino-L-alanine, Fmoc-Cys(Boc-methyl)-OH, Seleno-L-
  • cysteine As long as cysteine is produced according to the method of the present application, the conversion to a cysteine derivative may be easily converted into various cysteine derivatives by a method well known in the art.
  • the method for producing the cysteine derivative may further include the step of converting the cysteine produced in step b) into a cysteine derivative, for example, by reacting cysteine with an acetylation agent to form NAC ( N-acetylcysteine) or by reacting cysteine with haloacetic acid under basic conditions to synthesize S-Carboxymetylcysteine (SCMC), but is not limited thereto.
  • NAC N-acetylcysteine
  • SCMC S-Carboxymetylcysteine
  • the cysteine derivative is mainly used as a pharmaceutical raw material as an antitussive, a cough reliever, bronchitis, bronchial asthma and sore throat, but is not limited thereto.
  • OPS O-phosphoserine sulfhydrylase
  • the OPSS includes not only the wild-type OPSS protein, but also a mutant protein in which some of the polynucleotide sequences encoding the OPSS are deleted, substituted, or added, and exhibiting an activity equal to or higher than that of the wild-type OPSS protein. and OPSS protein disclosed in European Patent Application Publication No. EP 2444481 and US Patent No. 9127324 and variant proteins thereof may also be included.
  • the sulfide is provided in the form of a liquid or gas due to differences in pH, pressure, and solubility, as well as a solid commonly used in the art, so that sulfide (S 2- ), thiosulfate (thiosulfate, S 2 0 3 ) If it is a sulfide that can be converted to a thiol group (SH group) in the form of 2- ), etc., it can be used without limitation. Specifically, Na 2 S, NaSH, H 2 S, (NH 4 ) 2 S, or Na 2 S 2 0 3 that provides a thiol group to the OPS may be used, but is not limited thereto.
  • the reaction is a reaction for preparing one cysteine or cysteine derivative by providing one thiol group to one OPS reactor, and the amount of sulfide added in the reaction may be 0.1 to 3 times the molar concentration of OPS, specifically, 1 to 2 It may be a ship, but is not limited thereto.
  • the present application may further include the step of recovering the cysteine produced through the reaction step.
  • the desired cysteine may be isolated and purified from the reaction solution and collected using a suitable reaction known in the art.
  • the present application provides a use for producing a derivative of O-phosphoserine, cysteine or cysteine of a recombinant microorganism producing O-phosphoserine in which the activity of the mdtH protein is enhanced compared to the intrinsic activity.
  • the present application provides a use for excreting O-phosphoserine of mdtH protein from a microorganism.
  • the mdtH protein, intrinsic activity, enrichment, O-phosphoserine, cysteine, cysteine derivatives and microorganisms are the same as described above.
  • the screening-based strain is an OPS-producing strain mutated to weaken the activity of endogenous phosphoserine phosphatase (serB) in W3110, CA07-0012 (KCCM11212P, European Patent Publication EP 2444481; US Patent Publication No. 2012-0190081) ) is a strain named
  • CA07-0012 was cultured in a medium containing OPS to establish optimal screening conditions showing growth inhibition.
  • the W3110 genome library plasmid was transformed into CA07-0012 by electroporation (van der Rest et al. 1999), and colonies in which growth degradation was released in the medium condition with an excess of OPS were selected. Plasmids were obtained from the selected colonies and nucleotide sequences were analyzed through sequencing techniques. From this, two types of E. coli membrane proteins involved in canceling growth degradation under the condition of adding excess OPS were identified.
  • the gene encoding the E. coli membrane protein was identified as an mdtH transporter belonging to the major facilitator superfamily (MFS).
  • pCL_Ptrc-yhhS To prepare pCL_Ptrc-yhhS, pCL_Ptrc-gfp (WO 2016/024771 A1) was used as a template, and PCR was performed using SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12 to obtain a Ptrc DNA fragment.
  • the yhhS DNA fragment was obtained by PCR with SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14 using W3110 as a template.
  • the amplified fragment was subjected to IST with the pCL1920 vector treated with restriction enzymes XbaI and HindIII to obtain pCL_Ptrc-yhhS.
  • IST DG Gibson et al., NATURE METHODS, VOL.6 NO.5, MAY 2009, NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix
  • pCL_Ptrc-mdtH also used pCL_Ptrc-gfp as a template, but Ptrc DNA fragments were obtained using SEQ ID NOs: 15 and 16.
  • An mdtH DNA fragment was obtained using SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18 using W3110 as a template, and pCL_Ptrc-mdtH was prepared through IST in the same manner as pCL_Ptrc-yhhS.
  • pCL_Ptrc-yfaV was also cloned in the same manner as in the production of the two plasmids, and the Ptrc DNA fragment was obtained using pCL_Ptrc-gfp and the yfaV DNA fragment using W3110 as a template.
  • SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20 were used for Ptrc, and PCR was performed using SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22 for yfaV.
  • Example 3 mdtH MFS transporter-enhanced strain production and OPS production capacity evaluation
  • Example 2 The three types of plasmid prepared in Example 2 were each introduced into the OPS-producing strain CA07-0012 to prepare a strain, and the production ability of OPS was evaluated.
  • OPS production ability is increased by enhancing the activities of serA (3-phosphoglycerate dehydrogenase) and serC (3-phosphoserine aminotransferase), which are OPS biosynthetic pathways.
  • serA 3-phosphoglycerate dehydrogenase
  • serC 3-phosphoserine aminotransferase
  • pCL_Ptrc-serA*C was prepared to construct a negative control plasmid into which serA and serC were introduced.
  • a Ptrc DNA fragment was obtained by using SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24 and using the template as pCL_Ptrc-gfp.
  • pC_Prmf-serA*C (WO 2016/024771 A1) as a template, PCR was performed using SEQ ID NOs: 25 and 26 to obtain a serA*C DNA fragment.
  • the amplified fragment was subjected to IST with a pCL1920 vector treated with XbaI and HindIII to obtain pCL_Ptrc-serA*C.
  • SEQ ID NOs: 27 and 28 were used to construct pCL_Ptrc-serA*C_Ptrc-yhhS, and a template PCR was performed using the pCL_Ptrc-yhhS prepared above. From this, a Ptrc-yhhS DNA fragment was obtained. The amplified fragment was subjected to IST with pCL_Ptrc-serA*C vector treated with HindIII restriction enzymes to obtain pCL_Ptrc-serA*C_Ptrc-yhhS.
  • pCL_Ptrc-serA*C_Ptrc-mdtH and pCL_Ptrc-serA*C_Ptrc-yfaV were also constructed in the same manner as pCL_Ptrc-serA*C_Ptrc-yhhS.
  • SEQ ID NO: 29 and SEQ ID NO: 30 a Ptrc-mdtH DNA fragment was obtained using pCL_Ptrc-mdtH as a template, and a Ptrc-yfaV DNA fragment was obtained using pCL_Ptrc-yfaV as a template using SEQ ID NO: 31 and SEQ ID NO: 32 did.
  • the OPS-producing ability was confirmed by introducing the prepared plasmid into CA07-0022, an OPS-producing strain, and the results are shown in Table 5 below.
  • a strain in which the autologous promoter is substituted with the trc promoter was prepared and the production ability of O-phosphoserine was evaluated in order to check whether the excretion ability is improved.
  • the method of introducing the trc promoter into the E. coli chromosome was prepared by the following method commonly used.
  • a pSKH130 vector having an R6K replicon that is dependent on PI protein (pir gene) and into which a sacB (Levansucrase) gene is introduced was used.
  • the vector contains a kanamycin resistance gene, which was used as a selection marker for strain construction.
  • the antibiotic was removed from the medium with sucrose to prepare a strain.
  • a pSKH130_Ptrc-mdtH vector was constructed, and the primer sequences used are shown in Table 6 below.
  • sequence name primer gene vector 33 mdtHUP_F CAGGAATTCGATATCTAATCTCTTTTTCGTCCGGG mdtH pSKH130_mdtHUP_Ptrc-mdtH 34 mdtHUP_R GAGTTGCAGCAAGCGTTCCCCTCCCGGGAAATAAA 35 Ptrc-mdtH_F TTCCCGGGAGGGGAACGCTTGCTGCAACTCTCTCTCA 36 Ptrc-mdtH_R GACTAGCGTGATATCCAGACCAGGCGAAAGTCGTA 37 Ptrc-mdtH_conf_F CACCGCTGCGTTTATTGT 38 Ptrc-mdtH_conf_R AAACGCTTGTCACGCATCA
  • pSKH130_Ptrc-mdtH W3110 was used as a template, and PCR was performed with SEQ ID NO: 33 and SEQ ID NO: 34 to obtain an mdtHUP DNA fragment.
  • SEQ ID NO: 35 and SEQ ID NO: 36 PCR was performed with the pCL_Ptrc-mdtH prepared above as a template to obtain a DNA fragment of Ptrc-mdtH.
  • the amplified fragments were subjected to IST with the pSKH130 vector treated with EcoRV restriction enzymes to obtain pSKH_mdtHUP_Ptrc-mdtH.
  • the obtained plasmid was transformed into strain CA7-0022 by electroporation.
  • OPS is a substance containing phosphate and has a chemically and structurally similar form to 3-phosphoglycerate (hereinafter referred to as 3PG), so it is assumed that the OPS emitter may emit 3PG, 3PG production capacity was also measured in the strain fortified OPS emitter. 3PG was measured using a high performance liquid chromatography (HPLC) instrument, and the 3PG production capacity is shown in Table 8.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • strain name OD562nm OPS (g/L) 3PG (g/L) CA07-0022/pCL_Ptrc-serA*C 45.0 3.5 0.2 CA07-0022/pCL_Ptrc-serA*C_Ptrc-yhhS 35.1 7.6 2.6 CA07-0022/pCL_Ptrc-serA*C_Ptrc-mdtH 30.0 7.8 0.3 CA07-0022/pCL_Ptrc-serA*C_Ptrc-yfaV 25.9 3.2 0.3
  • 3PG was accumulated in the yhhS-enhanced strain, but 3PG was not increased in the mdtH membrane protein-enhanced strain. That is, the strain into which mdtH was introduced had an increased OPS excretion ability, and it was also found that the OPS-specific excretion ability was increased.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

본 출원은 신규 O-포스포세린 배출 단백질 및 이를 이용한 O-포스포세린, 시스테인 및 시스테인의 유도체의 생산 방법에 관한 것이다.

Description

신규 O-포스포세린 배출 단백질 및 이를 이용한 O-포스포세린, 시스테인 및 이의 유도체의 생산 방법
본 출원은 신규 O-포스포세린 배출 단백질 및 이를 이용한 O-포스포세린, 시스테인 및 시스테인의 유도체의 생산 방법에 관한 것이다.
L-시스테인은 모든 생물체의 황 대사에 있어서 중요한 아미노산으로, 모발의 케라틴 등 생체 내 단백질, 글루타치온, 바이오틴, 메치오닌 및 기타 황을 함유한 대사산물의 합성에 사용될 뿐만 아니라 코엔자임 A 생합성의 전구 물질로 사용된다.
미생물을 이용하여 L-시스테인을 생산하는 방법으로, 1) 미생물을 이용하여 D,L-ATC(D,L-2-amino-2-thiazoline- 4-carboxylate)를 생물학적으로 전환하는 방법 , 2) 대장균을 이용하여 L-시스테인을 생산하는 직접 발효 방법(유럽 등록특허 EP0885962B; Wada M andTakagi H , Appl. Microbiol. Biochem., 73:48-54, 2006), 3) 미생물을 이용하여 O -포스포세린(O-phosphoserine, 이하 "OPS")을 발효 생산한 후, O-포스포세린 설피드릴라아제(O-phosphoserine sulfhydrylase, 이하 "OPSS")의 촉매작용 하에 황화물과 반응하여 L-시스테인으로 전환시키는 방법(유럽공개특허 EP 2444481) 등이 알려져 있다.
이 때, 상기 3) 방법으로 고수율의 시스테인을 생산하기 위해서 전구체인 OPS를 과량 생산하여야 할 필요가 존재하였다.
본 발명자들은 OPS 생산 균주에서 생산된 O-포스포세린이 세포 밖으로 원활하게 배출시킬 수 있는 적절한 배출 인자를 규명하고, OPS의 생산을 증가시키기 위해 예의 노력한 결과, 신규한 OPS 배출 단백질을 발굴함으로써 본 출원을 완성하였다.
본 출원의 하나의 목적은 mdtH 단백질의 활성이 내재적 활성에 비하여 강화된, O-포스포세린 생산 재조합 미생물을 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 하나의 목적은 본 출원의 O-포스포세린 생산 재조합 미생물을 이용한 O-포스포세린의 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 본 출원의 O-포스포세린 생산 재조합 미생물을 이용한 시스테인 또는 이의 유도체의 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 mdtH 단백질의 활성이 내재적 활성에 비하여 강화된 O-포스포세린 생산 재조합 미생물을 이용하여, O-포스포세린을 생산하는 경우, 기존 비변형 균주를 이용하는 경우에 비해 고수율의 O-포스포세린 생산이 가능하다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다. 또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 출원에 기재된 본 출원의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 출원에 포함되는 것으로 의도된다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 출원의 하나의 양태로, 본 출원은 mdtH 단백질의 활성이 내재적 활성에 비하여 강화된, O-포스포세린 생산 재조합 미생물을 제공한다.
본 출원에서 용어, "O-포스포세린(O-phosphoserine, OPS)"은 세린의 인산(phosphoric acid) 에스테르로서, 여러 단백질의 구성요소이다. 상기 OPS는 L-시스테인의 전구체로서, OPS 설피드릴라아제(OPS sulfhydrylase, OPSS)의 촉매 작용 하에 황화물과 반응하여 시스테인으로 전환될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다(유럽공개특허 EP 2444481).
구체적으로, 본 출원의 재조합 미생물은 O-포스포세린 배출 활성이 내재적 활성에 비하여 강화될 수 있다. 본 출원의 mdtH 단백질은 O-포스포세린을 세포 밖으로 배출할 수 있는 활성을 가질 수 있으며, 이러한 활성은 본 출원에서 최초로 규명하였다.
일 예로, 본 출원의 mdtH 단백질은 막 단백질일 수 있으며, 본 출원의 mdtH 단백질은 대장균(Escherichia coli) 유래일 수 있다.
또한, 본 출원의 mdtH 단백질은 MFS(major facilitator superfamily)에 속하는 트랜스포터일 수 있다.
구체적으로, 본 출원의 mdtH 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 O-포스포세린 배출 활성을 가지면서 상기 서열번호 1과 95% 이상의 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있다. 예컨대, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열과 95% 이상의 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 단백질은 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 mdtH 단백질과 동일하거나 상응하는 OPS 배출 활성을 나타내는 단백질이라면 제한없이 포함된다.
보다 구체적으로, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열과 95% 이상의 동일성을 나타내는 아미노산 서열은 상기 서열번호 1의 아미노산 서열과 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상 또는 99.75% 이상, 및 100% 미만의 동일성을 가지는 서열일 수 있다.
또한, 본 출원의 mdtH 단백질은 상기 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열과 95% 이상의 동일성을 나타내는 아미노산 서열에서 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 단백질 변이체도 실질적으로 O-포스포세린 배출 활성을 가지는 한 본 출원의 범위 내에 포함될 수 있다.
또한, 본 출원의 mdtH 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 O-포스포세린 배출 활성을 가지면서 상기 서열번호 1과 95% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열의 앞뒤로의 무의미한 서열 추가 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 또는 이의 잠재성 돌연변이(silent mutation)를 포함할 수 있음은 당업자에게 자명할 수 있다.
본 출원에서 용어, '상동성(homology)' 또는 '동일성(identity)'은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열 상호간 유사한 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.
보존된(conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나(homologous) 또는 동일한(identical) 서열은 일반적으로 서열 전체 또는 일부분과 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 일반 코돈 또는 코돈 축퇴성을 고려한 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드와의 하이브리드화 역시 포함됨이 자명하다.
임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는, 예를 들어, Pearson et al (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다(GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 상동성, 유사성 또는 동일성은, 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482 에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48:443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의할 수 있다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 이진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL (NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티 (또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다.
본 출원에서 용어 "O-포스포세린(OPS) 생산 재조합 미생물"은, 자연적으로 약한 OPS 생산능을 가지고 있는 미생물 혹은 OPS 생산능이 없는 모균주에 자연적 또는 인위적으로 유전적 변형이 일어나 OPS 생산능이 부여된 미생물을 의미할 수 있다. 본 출원에서 상기 "OPS 생산 재조합 미생물"은 "OPS 생산능을 갖는 미생물"과 혼용되어 사용될 수 있다.
본 출원의 목적상, 상기 OPS 생산 미생물의 경우, mdtH 단백질의 활성이 강화됨에 따라, OPS의 생산량이 야생형 또는 변형 전 미생물에 비해 증가한 것일 수 있다. 이는 야생형 또는 변형 전 미생물이 OPS를 생산하지 못하거나, OPS를 생산하더라도 극미량을 생산할 수 있는 것에 반해, 본 출원의 미생물은 mdtH 단백질의 활성을 강화함으로써 OPS 생산능을 증가시킬 수 있다는 것에 의의가 있을 수 있다.
본 출원에서 용어, 폴리펩티드 활성의 "강화"는, 폴리펩티드의 활성이 내재적 활성에 비하여 증가되는 것을 의미한다. 상기 강화는 활성화(activation), 상향조절(up-regulation), 과발현(overexpression), 증가(increase) 등의 용어와 혼용될 수 있다. 여기서 활성화, 강화, 상향조절, 과발현, 증가는 본래 가지고 있지 않았던 활성을 나타내게 되는 것, 또는 내재적 활성 또는 변형 전 활성에 비하여 향상된 활성을 나타내게 되는 것을 모두 포함할 수 있다. 상기 “내재적 활성"은 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드의 활성을 의미한다. 이는 "변형 전 활성"과 혼용되어 사용될 수 있다. 폴리펩티드의 활성이 내재적 활성에 비하여 "강화", "상향조절", "과발현" 또는 "증가"한다는 것은, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드의 활성 및/또는 농도(발현량)에 비하여 향상된 것을 의미한다.
상기 강화는 외래의 폴리펩티드를 도입하거나, 내재적인 폴리펩티드의 활성 강화 및/또는 농도(발현량)를 통해 달성할 수 있다. 상기 폴리펩티드의 활성의 강화 여부는 해당 폴리펩티드의 활성 정도, 발현량 또는 해당 폴리펩티드로부터 배출되는 산물의 양의 증가로부터 확인할 수 있다.
상기 폴리펩티드의 활성의 강화는 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용이 가능하며, 목적 폴리펩티드의 활성을 변형전 미생물보다 강화시킬 수 있는 한, 제한되지 않는다. 구체적으로, 분자생물학의 일상적 방법인 당업계의 통상의 기술자에게 잘 알려진 유전자 공학 및/또는 단백질 공학을 이용한 것일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다(예컨대, Sitnicka et al. Functional Analysis of Genes. Advances in Cell Biology. 2010, Vol. 2. 1-16, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012 등).
구체적으로, 본 출원의 폴리펩티드의 강화는
1) 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 세포 내 카피수 증가;
2) 폴리펩티드를 코딩하는 염색체상의 유전자 발현조절영역을 활성이 강력한 서열로 교체;
3) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 염기서열의 변형;
4) 폴리펩티드 활성이 강화되도록 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열의 변형;
5) 폴리펩티드 활성이 강화도록 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형 (예를 들어, 폴리펩티드의 활성이 강화되도록 변형된 폴리펩티드를 코딩하도록 상기 폴리펩티드 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열의 변형);
6) 폴리펩티드의 활성을 나타내는 외래 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 외래 폴리뉴클레오티드의 도입;
7) 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화;
8) 폴리펩티드의 삼차구조를 분석하여 노출 부위를 선택하여 변형하거나 화학적으로 수식; 또는
9) 상기 1) 내지 8) 중 선택된 2 이상의 조합일 수 있으나, 이에, 특별히 제한되는 것은 아니다.
보다 구체적으로,
상기 1) 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 세포 내 카피수 증가는, 해당 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된, 숙주와 무관하게 복제되고 기능할 수 있는 벡터의 숙주세포 내로의 도입에 의해 달성되는 것일 수 있다. 또는, 해당 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내의 염색체 내에 1 카피 또는 2 카피 이상 도입에 의해 달성되는 것일 수 있다. 상기 염색체 내에 도입은 숙주세포 내의 염색체 내로 상기 폴리뉴클레오티드를 삽입시킬 수 있는 벡터가 숙주세포 내에 도입됨으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 벡터는 전술한 바와 같다.
상기 2) 폴리펩티드를 코딩하는 염색체상의 유전자 발현조절영역(또는 발현조절서열)을 활성이 강력한 서열로 교체는, 예를 들면, 상기 발현조절영역의 활성을 더욱 강화하도록 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이 발생, 또는 더욱 강한 활성을 가지는 서열로의 교체일 수 있다. 상기 발현조절영역은, 특별히 이에 제한되지 않으나 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 그리고 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등을 포함할 수 있다. 일 예로, 본래의 프로모터를 강력한 프로모터로 교체시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
공지된 강력한 프로모터의 예에는 cj1 내지 cj7 프로모터(미국등록특허 US 7662943 B2), lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터, 람다 파아지 PR 프로모터, PL 프로모터, tet 프로모터, gapA 프로모터, SPL7 프로모터, SPL13(sm3) 프로모터(미국등록특허 US 10584338 B2), O2 프로모터(미국등록특허 US 10273491 B2), tkt 프로모터, yccA 프로모터 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 3) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 염기서열 변형은, 예를 들면, 내재적 개시코돈에 비해 폴리펩티드 발현율이 더 높은 다른 개시코돈을 코딩하는 염기 서열로 치환하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 4) 및 5)의 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은, 폴리펩티드의 활성을 강화하도록 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이 발생, 또는 더욱 강한 활성을 갖도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 활성이 증가하도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열로의 교체일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 교체는 구체적으로 상동재조합에 의하여 폴리뉴클레오티드를 염색체내로 삽입함으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이때 사용되는 벡터는 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커 (selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 선별 마커는 전술한 바와 같다.
상기 6) 폴리펩티드의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드의 도입은, 상기 폴리펩티드와 동일/유사한 활성을 나타내는 폴리펩티드를 코딩하는 외래 폴리뉴클레오티드의 숙주세포 내 도입일 수 있다. 상기 외래 폴리뉴클레오티드는 상기 폴리펩티드와 동일/유사한 활성을 나타내는 한 그 유래나 서열에 제한이 없다. 상기 도입에 이용되는 방법은 공지된 형질전환 방법을 당업자가 적절히 선택하여 수행될 수 있으며, 숙주 세포 내에서 상기 도입된 폴리뉴클레오티드가 발현됨으로써 폴리펩티드가 생성되어 그 활성이 증가될 수 있다.
상기 7) 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화는, 내재 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 전사 또는 번역이 증가하도록 코돈 최적화한 것이거나, 또는 외래 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 최적화된 전사, 번역이 이루어지도록 이의 코돈을 최적화한 것일 수 있다.
상기 8) 폴리펩티드의 삼차구조를 분석하여 노출 부위를 선택하여 변형하거나 화학적으로 수식하는 것은, 예를 들어 분석하고자 하는 폴리펩티드의 서열정보를 기지 단백질들의 서열정보가 저장된 데이터베이스와 비교함으로써 서열의 유사성 정도에 따라 주형 단백질 후보를 결정하고 이를 토대로 구조를 확인하여, 변형하거나 화학적으로 수식할 노출 부위를 선택하여 변형 또는 수식하는 것일 수 있다.
이와 같은 폴리펩티드 활성의 강화는, 상응하는 폴리펩티드의 활성 또는 농도 발현량이 야생형이나 변형 전 미생물 균주에서 발현된 폴리펩티드의 활성 또는 농도를 기준으로 하여 증가되거나, 해당 폴리펩티드로부터 생산되는 산물의 양의 증가되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 용어, "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 폴리펩티드를 발현시킬 수 있도록 적합한 발현조절영역(또는 발현조절서열)에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 포함하는 DNA 제조물을 포함할 수 있다. 상기 발현조절영역은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 벡터는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pDZ계, pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 pDZ, pDC, pDCM2, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다.
일례로 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 염색체 내로 삽입할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합(homologous recombination)에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 목적 핵산 분자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 폴리펩티드의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
본 출원에서 용어 "형질전환"은 표적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 혹은 미생물 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 폴리펩티드가 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 목적 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 및/또는 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로도 도입될 수 있다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 목적 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.
구체적으로, 본 출원의 재조합 미생물은 상기 mdtH 단백질을 코딩하는 유전자/폴리뉴클레오티드가 도입된 미생물, 상기 mdtH 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 세포 내 카피수가 증가된 미생물, 상기 mdtH 단백질 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질전환된 미생물, 상기 mdtH 단백질을 코딩하는 염색체상의 유전자 발현 조절 서열이 활성이 강력한 서열로 교체된 미생물 또는 상기 mdtH 단백질을 코딩하는 염색체상의 프로모터가 활성이 강력한 프로모터로 교체된 미생물일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 mdtH 단백질을 코딩하는 유전자는 mdtH 유전자일 수 있다. 또한, 상기 mdtH 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 상기 서열번호 1 및 서열번호 2는 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank에서 그 서열을 얻을 수 있다.
본 출원의 특정 서열번호의 아미노산 서열 또는 특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질/폴리펩티드는 상기 특정 서열번호의 아미노산 서열 또는 특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 가지는 단백질/폴리펩티드 또는 상기 특정 서열번호의 아미노산 서열 또는 특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열로 이루어진/필수적으로 이루어진(consisting essentially of) 단백질/폴리펩티드일 수 있다. 또한, 본 출원의 특정 서열번호의 염기 서열 또는 특정 서열번호로 기재된 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 상기 특정 서열번호의 염기 서열 또는 특정 서열번호로 기재된 염기 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 특정 서열번호의 염기 서열 또는 특정 서열번호로 기재된 염기 서열로 이루어진/필수적으로 이루어진(consisting essentially of) 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
본 출원의 미생물은 OPS를 생산할 수 있다면 그 종류가 특별히 제한되지 않으며, 원핵세포 또는 진핵세포 모두 가능하나, 구체적으로 원핵세포일 수 있다. 일예로 에스케리키아(Escherichia) 속, 어위니아(Erwinia) 속, 세라티아(Seratia) 속, 프로비덴시아(Providencia)속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 및 브레비박테리움(Brevibacterium) 속에 속하는 미생물 균주를 포함할 수 있으며, 구체적으로 에스케리키아 속 미생물, 보다 구체적으로 대장균(Escherichia coli)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 에스케리키아 속 또는 코리네박테리움 속 미생물의 경우, OPS 및 L-세린을 생산할 수 있음이 알려져 있다(Ahmed Zahoor, Computational and structural biotechnology journal, vol 3, 2012 October; Wendisch V F et al., Curr Opin Microbiol. 2006 Jun;9(3):268-74; Peters-Wendisch P et al., Appl Environ Microbiol. 2005 Nov;7 1( l l):7 139-44.).
본 출원의 재조합 미생물은 추가적으로 포스포세린 포스파타아제(phosphoserine phosphatase, SerB)의 활성이 내재적 활성에 비해 약화된 것일 수 있다.
상기 SerB는 OPS를 L-세린(L-serine)으로 전환시키는 활성을 지니므로, 상기 SerB 활성이 약화되도록 변이된 미생물은 OPS를 축적하는 특징을 지녀 OPS의 생산에 유용하게 사용될 수 있다. 상기 SerB는 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 SerB는 SerB의 활성을 나타내는 한, 상기 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열과 80% 이상, 구체적으로 90% 이상, 보다 구체적으로 95% 이상, 더욱 구체적으로 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한 되지 않는다. 또한, 상기 SerB를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 상기 서열번호 3에 기재된 아미노산을 암호화하는 염기서열을 가질 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy) 또는 본 출원의 변이체를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 본 출원의 변이체의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 상기 SerB를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는, 예를 들면, 서열번호 4의 염기서열을 포함할 수 있으며, 이와 동일성이 80% 이상, 구체적으로 90% 이상, 보다 구체적으로 95% 이상, 더욱 구체적으로 99% 이상인 염기서열을 포함할 수 있나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, 폴리펩티드의 "약화"는 내재적 활성에 비하여 활성이 감소되거나 또는 활성이 없는 것을 모두 포함하는 개념이다. 상기 약화는 불활성화(inactivation), 결핍(deficiency), 하향조절(down-regulation), 감소(decrease), 저하(reduce), 감쇠(attenuation) 등의 용어와 혼용될 수 있다.
상기 약화는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 변이 등으로 폴리펩티드 자체의 활성이 본래 미생물이 가지고 있는 폴리펩티드의 활성에 비해 감소 또는 제거된 경우, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 유전자의 발현 저해 또는 폴리펩티드로의 번역(translation) 저해 등으로 세포 내에서 전체적인 폴리펩티드 활성 정도 및/또는 농도(발현량)가 천연형 균주에 비하여 낮은 경우, 상기 폴리뉴클레오티드의 발현이 전혀 이루어지지 않은 경우, 및/또는 폴리뉴클레오티드의 발현이 되더라도 폴리펩티드의 활성이 없는 경우 역시 포함할 수 있다. 상기 "내재적 활성"은 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주, 야생형 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드의 활성을 의미한다. 이는 "변형 전 활성"과 혼용되어 사용될 수 있다. 폴리펩티드의 활성이 내재적 활성에 비하여 "불활성화, 결핍, 감소, 하향조절, 저하, 감쇠"한다는 것은, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드의 활성에 비하여 낮아진 것을 의미한다.
이러한 폴리펩티드의 활성의 약화는, 당업계에 알려진 임의의 방법에 의하여 수행될 수 있으나 이로 제한되는 것은 아니며, 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용으로 달성될 수 있다(예컨대, Nakashima N et al., Bacterial cellular engineering by genome editing and gene silencing. Int J Mol Sci. 2014;15(2):2773-2793, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012 등).
구체적으로, 본 출원의 폴리펩티드의 약화는
1) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전체 또는 일부의 결손;
2) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현이 감소하도록 발현조절영역(또는 발현조절서열)의 변형;
3) 폴리펩티드의 활성이 제거 또는 약화되도록 상기 폴리펩티드를 구성하는 아미노산 서열의 변형(예컨대, 아미노산 서열 상의 1 이상의 아미노산의 삭제/치환/부가);
4) 폴리펩티드의 활성이 제거 또는 약화되도록 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 서열의 변형 (예를 들어, 폴리펩티드의 활성이 제거 또는 약화되도록 변형된 폴리펩티드를 코딩하도록 상기 폴리펩티드 유전자의 핵산염기 서열 상의 1 이상의 핵산염기의 삭제/치환/부가);
5) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 염기서열의 변형;
6) 폴리펩티드를 코딩하는 상기 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(예컨대, 안티센스 RNA)의 도입;
7) 리보솜(ribosome)의 부착이 불가능한 2차 구조물을 형성시키기 위하여 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 사인-달가르노(Shine-Dalgarno) 서열 앞단에 사인-달가르노 서열과 상보적인 서열의 부가;
8) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 서열의 ORF(open reading frame)의 3' 말단에 반대 방향으로 전사되는 프로모터의 부가(Reverse transcription engineering, RTE); 또는
9) 상기 1) 내지 8) 중 선택된 2 이상의 조합일 수 있으나, 이에, 특별히 제한되는 것은 아니다.
예컨대,
상기 1) 폴리펩티드를 코딩하는 상기 유전자 일부 또는 전체의 결손은, 염색체 내 내재적 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 전체의 제거, 일부 뉴클레오티드가 결실된 폴리뉴클레오티드로의 교체 또는 마커 유전자로 교체일 수 있다.
또한, 상기 2) 발현조절영역(또는 발현조절서열)의 변형은, 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 발현조절영역(또는 발현조절서열) 상의 변이 발생, 또는 더욱 약한 활성을 갖는 서열로의 교체일 수 있다. 상기 발현조절영역에는 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 3) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 염기서열 변형은, 예를 들면, 내재적 개시코돈에 비해 폴리펩티드 발현율이 더 낮은 다른 개시코돈을 코딩하는 염기서열로 치환하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 4) 및 5)의 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은 폴리펩티드의 활성을 약화하도록 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이 발생, 또는 더욱 약한 활성을 갖도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 활성이 없도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열로의 교체일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 폴리뉴클레오티드 서열 내 변이를 도입하여 종결 코돈을 형성시킴으로써, 유전자의 발현을 저해하거나 약화시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 6) 폴리펩티드를 코딩하는 상기 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(예컨대, 안티센스 RNA)의 도입은 예를 들어 문헌 [Weintraub, H. et al., Antisense-RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986]을 참고할 수 있다.
상기 7) 리보솜(ribosome)의 부착이 불가능한 2차 구조물을 형성시키기 위하여 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 사인-달가르노(Shine-Dalgarno) 서열 앞단에 사인-달가르노 서열과 상보적인 서열의 부가는 mRNA 번역을 불가능하게 하거나 속도를 저하시키는 것일 수 있다.
상기 8) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자서열의 ORF(open reading frame)의 3' 말단에 반대 방향으로 전사되는 프로모터의 부가(Reverse transcription engineering, RTE)는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 전사체에 상보적인 안티센스 뉴클레오티드를 만들어 활성을 약화하는 것일 수 있다.
본 출원의 미생물에서 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전체의 변형은 (a) 미생물 내 염색체 삽입용 벡터를 이용한 상동 재조합 또는 유전자가위 (engineered nuclease, e.g., CRISPR-Cas9)을 이용한 유전체 교정 및/또는 (b) 자외선 및 방사선 등과 같은 빛 및/또는 화학물질 처리에 의해 유도될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 유전자 일부 또는 전체의 변형 방법에는 DNA 재조합 기술에 의한 방법이 포함될 수 있다. 예를 들면, 목적 유전자와 상동성이 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열 또는 벡터를 상기 미생물에 주입하여 상동 재조합(homologous recombination)이 일어나게 함으로써 유전자 일부 또는 전체의 결손이 이루어질 수 있다. 상기 주입되는 뉴클레오티드 서열 또는 벡터는 우성 선별 마커를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 출원의 재조합 미생물은 추가적으로 포스포글리세라이트디하이드로게나제(phosphoglycerate dehydrogenase, SerA), 포스포세린 아미노트랜스퍼라제(phosphoserine aminotransferase, SerC) 또는 이들의 조합 중 어느 하나의 활성이 내재적 활성에 비해 강화된 것 일 수 있다.
상기 SerA는 3-포스포글리세라이트(3-phosphoglycerate)를 3-포스포하이드록시피루베이트(3-phospho-hydroxypymvate)로 전환하는 활성을 가지는 단백질이며, 상기 SerC는 3-포스포하이드록시피루베이트를 OPS로 전환하는 활성을 가지는 단백질이다. 따라서, 상기 SerA 또는/및 SerC의 활성이 강화된 미생물은 OPS 생산 균주로서 유용하게 사용될 수 있다.
상기 SerA는 이에 제한되지는 않으나, 서열번호 5 또는 6의 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있다. 상기 서열번호 5는 야생형 SerA의 서열이며, 서열번호 6은 세린에 대한 피드백이 해제된 SerA 변이체의 서열이다. 또한, 야생형 SerA의 활성 또는 세린에 대한 피드백이 해제된 SerA 변이체의 활성을 나타내는 한, 상기 SerA는 서열번호 5 또는 6으로 기재된 아미노산 서열과 80% 이상, 구체적으로 90% 이상, 보다 구체적으로 95% 이상, 더욱 구체적으로 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 세린에 대한 피드백이 해제된 SerA 변이체는 상기 SerA를 코딩하는 유전자에 삽입, 치환 등의 방법으로 변이를 도입하여 세린 혹은 글리신에 의한 피드백 저해로부터 그 활성을 유지하거나, 강화된 경우를 의미하며, 상기 세린에 대한 피드백이 해제된 SerA 변이체는 이미 잘 알려져 있다(Grant GA et al., J. Biol. Chem., 39: 5357-5361, 1999; Grant GA et al., Biochem., 39: 7316-7319, 2000; Grant GA et al., J. Biol. Chem., 276:17844-17850, 2001;Peters-Wendisch P et al., Appl. Microbiol. BiotechnoL, 60:37-441, 2002; 유럽등록특허 EP 0943687 B).
또한, 상기 SerA의 야생형 또는 세린에 대한 피드백이 해제된 SerA 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 서열번호 5 내지 6에 기재된 어느 하나의 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성으로 인하여 또는 상기 폴리펩티드를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어 질 수 있다. 상기 SerA의 야생형 또는 세린에 대한 피드백이 해제된 SerA 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 예를 들면 서열번호 7 또는 8의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드일 수 있으며, 이와 상동성이 80% 이상, 구체적으로 90% 이상, 보다 구체적으로 95% 이상, 더욱 구체적으로 99% 이상인 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 SerC는 예를 들어서 서열번호 9로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, SerC의 활성을 나타내는 한, 상기 서열번호 9로 기재되는 아미노산 서열과 80% 이상, 구체적으로 90% 이상, 더 구체적으로 95% 이상, 보다 더 구체적으로 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 SerC를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 서열번호 9에 기재된 아미노산을 코딩하는 염기서열을 포함할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성으로 인하여 또는 상기 폴리펩티드를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 상기 SerC를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 예를 들면 서열번호 10의 염기서열을 포함할 수 있으며, 이와 상동성이 80% 이상, 구체적으로 90% 이상, 보다 구체적으로 95% 이상, 더욱 구체적으로 99% 이상인 염기서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 출원에서 용어, "내재적 활성에 비해 강화" 및 강화 방법은 전술한 바와 같다.
또한, 본 출원의 재조합 미생물은 추가로 OPS의 세포 안으로의 유입 또는 분해 능력을 감소시킨 미생물일 수 있다.
상기와 같은 OPS 생산 미생물에 대한 내용은 상기에서 기술된 내용 외에도 유럽공개특허 EP 2444481 또는 미국공개공보 제2012-0190081호 등에 개시된 내용이 본 출원의 참고자료로서 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 다른 하나의 양태로, 본 출원은 mdtH 단백질의 활성이 내재적 활성에 비하여 강화된 O-포스포세린 생산 재조합 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, O-포스포세린의 생산 방법을 제공한다.
상기 mdtH 단백질, 내재적 활성, 강화, O-포스포세린 및 미생물에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 출원에서 용어, "배양"은 상기 미생물을 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 출원의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양 조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 회분식, 연속식 및 유가식 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 SerB 활성이 내재적 활성에 비해 약화된 재조합 미생물의 배양은, 상기 미생물의 세린 요구성이 유도되어 배지에 글리신 또는 세린이 추가로 포함될 수 있다. 글리신은 정제된 글리신, 글리신을 포함하는 이스트 추출물, 트립톤의 형태로 제공될 수 있으며 배양액에 포함되는 농도는 보통 0.1 내지 10g/L, 구체적으로 0.5 내지 3g/L일 수 있다. 또한 세린은 정제된 세린, 세린을 함유하는 이스트 추출물, 트립톤 등의 형태로 제공될 수 있으며 배양액에 포함되는 농도는 보통 0.1 내지 5g/L, 구체적으로 0.1 내지 1g/L 일 수 있다.
상기 배지에 포함되는 탄소원은 글루코즈, 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산을 포함할 수 있으며, 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 배지에 포함되는 질소원으로서 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄 및 질산암모늄과 같은 무기 질소원이 포함될 수 있으며, 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 배지에 포함되는 인원으로서 인사이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 대응되는 소듐 함유염이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 배지는 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있고, 그 외에 아미노산, 비타민 및 적절한 전구체등이 포함될 수 있다. 이들 배지 또는 전구체는 배양물에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화학물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리클리콜에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포생성을 억제할 수 있다. 또한 배양물의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있다. 배양물의 온도는 보통 25℃ 내지 40℃, 구체적으로 30℃ 내지 35℃일 수 있다. 배양물의 배양기간은 원하는 유용물질의 생산량이 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 구체적으로 10 내지 100 시간일 수 있다. 그러나 이들 예시에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 O-포스포세린의 생산 방법은 본 출원의 미생물을 준비하는 단계, 상기 미생물을 배양하기 위한 배지를 준비하는 단계, 또는 이들의 조합(순서에 무관, in any order)을, 예를 들어, 상기 배양하는 단계 이전에, 추가로 포함할 수 있다. 본 출원의 O-포스포세린의 생산 방법은 상기 배양에 따른 배지(배양이 수행된 배지) 또는 본 출원의 미생물로부터 O-포스포세린을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 회수하는 단계는 상기 배양하는 단계 이후에 추가로 포함될 수 있다.
상기 O-포스포세린을 회수하는 방법은 본 출원의 미생물의 배양 방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 기술 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 목적하는 O-포스포세린을 수집(collect)하는 것일 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 결정화 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 추출, 초음파 파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피, HPLC 또는 이들의 방법을 조합하여 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지 또는 미생물로부터 목적하는 O-포스포세린을 회수할 수 있다.
또한, 본 출원의 O-포스포세린 생산 방법은, 추가적으로 정제 단계를 포함할 수 있다. 상기 정제는 당해 기술분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여, 수행할 수 있다. 일 예에서, 본 출원의 O-포스포세린 생산 방법이 회수 단계와 정제 단계를 모두 포함하는 경우, 상기 회수 단계와 정제 단계는 순서에 상관없이 연속적 또는 비연속적으로 수행되거나, 동시에 또는 하나의 단계로 통합되어 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 방법에서, 변이체, 폴리뉴클레오티드, 벡터 및 균주 등은 상기 다른 양태에서 기재한 바와 같다.
본 출원의 다른 하나의 양태로, 본 출원은 a) mdtH 단백질의 활성이 내재적 활성에 비하여 강화된 O-포스포세린 생산 재조합 미생물을 배지에서 배양하여 O-포스포세린 또는 O-포스포세린을 포함하는 배지를 생산하는 단계; 및 b) O-포스포세린 설프하이드릴라아제(O-phosphoserine sulfliydrylase, OPSS) 또는 이를 포함하는 미생물의 존재 하에, 상기 a) 단계에서 생산된 O-포스포세린 또는 이를 포함하는 배지를 황화물과 반응시키는 단계를 포함하는, 시스테인 또는 이의 유도체의 생산 방법을 제공한다.
본 출원에서 미생물에 사용되는 용어, 특정 단백질을 "포함하는"은 목적하는 특정 단백질이 미생물 내에 도입되거나, 미생물 내에서 발현되는 상태를 의미한다.
상기 mdtH 단백질, 내재적 활성, 강화, O-포스포세린 미생물에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 출원에서 용어, "유도체"는 어떤 화합물의 일부를 화학적으로 변화시켜서 얻어지는 유사한 화합물로서, 대개 화합물 중 수소원자 또는 특정 원자단이 다른 원자 또는 원자단에 의하여 치환된 화합물을 의미한다.
본 출원에서 용어, "시스테인 유도체"는 시스테인의 수소 원자 또는 특정 원자단이 다른 원자 또는 원자단에 의하여 치환된 화합물을 의미한다. 그 예로, 시스테인의 아민기(-NH2)의 질소 원자 또는 티올 기(-SH)의 황 원자에 다른 원자 또는 원자단이 부착된 형태일 수 있으며, 그 예로 NAC(N-acetylcysteine), SCMC(S-Carboxymetylcysteine), BOC-CYS(ME)-OH,(R)-S-(2-Amino-2-carboxyethyl)-L-homocysteine, (R)-2-Amino-3-sulfopropionic acid, D-2-Amino-4-(ethylthio)butyric acid, 3-sulfino-L-alanine, Fmoc-Cys(Boc-methyl)-OH, Seleno-L-cystine, S-(2-Thiazolyl)-L-cysteine, S-(2-Thienyl)-L-cysteine, S-(4-Tolyl)-L-cysteine 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 방법에 따라 시스테인을 생산하기만 한다면, 시스테인 유도체로의 전환은 당업계에 널리 알려진 방법으로 용이하게 다양한 시스테인 유도체로의 전환이 가능할 수 있다.
구체적으로, 상기 시스테인 유도체의 생산 방법은 상기 b) 단계에서 생성된 시스테인을 시스테인 유도체로 전환시키는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있으며, 그 예로 시스테인을 아세틸레이션에이젼트(acetylation agent)와 반응시켜 NAC(N-acetylcysteine)를 합성하거나, 시스테인을 염기성 조건에서 할로아세틱에시드(haloacetic acid)와 반응시킴으로써 SCMC(S-Carboxymetylcysteine)를 합성할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 시스테인 유도체는 주로 제약원료로서 진해제, 기침 완화제, 기관지염, 기관지 천식과 인후염 등의 치료제로 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, "O-포스포세린설피드릴라제(O-phosphoserine sulfhydrylase, OPSS)"는 OPS에 티올그룹(thiol, group, SH 기)을 제공하여 상기 OPS를 시스테인으로 전환하는 반응을 촉매하는 효소를 의미한다. 상기 효소는 애로피룸 페닉스(Aeropymm pernix), 마이코박테리움 투베쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 마이코박테리움 스메그마틱스(Mycobacterium smegmatics), 트리코모나스배기날리스(Trichomonas vaginalis)(Mino K and Ishikawa K, FEBSletters, 551:133-138, 2003; Bums K E et al., J. Am. Chem. Soc, 127: 11602-11603, 2005)에서 처음으로 밝혀진 것일 수 있다. 또한, 상기 OPSS는 야생형 OPSS 단백질뿐만 아니라, 상기 OPSS를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 중 일부 서열이 결실, 치환 또는 부가된 서열로서, 야생형 OPSS 단백질의 생물학적 활성과 동등 또는 그 이상의 활성을 나타내는 변이체 단백질도 포함하며, 유럽공개특허 EP 2444481 및 미국등록특허 US 9127324에 개시된 OPSS 단백질 및 이의 변이체 단백질도 모두 포함할 수 있다.
상기 황화물은 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 고형뿐 아니라, pH, 압력, 용해도의 차이로 인해 액체 또는 기체의 형태로 제공되어 설파이드(sulfide, S2-), 티올설페이트(thiosulfate, S203 2-)등의 형태로 티올그룹(thiol group, SH 기)으로 전환될 수 있는 황화물이라면 제한 없이 사용할 수 있다. 구체적으로, 티올 그룹을 OPS에 제공하는 Na2S, NaSH, H2S, (NH4)2S 또는 Na2S203를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 반응은 하나의 OPS 반응기에 하나의 티올기를 제공하여 하나의 시스테인 또는 시스테인 유도체를 제조하는 반응으로, 상기 반응 시 황화물의 첨가량은 OPS 몰농도의 0.1 내지 3배일 수 있으며, 구체적으로, 1 내지 2배일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 출원에서는 추가로 상기 반응 단계를 통하여 생산된 시스테인을 회수하는 단계를 포함할 수 있다. 이 때, 당해 분야에 공지된 적합한 반응을 이용하여 반응액으로부터 목적하는 시스테인을 분리 및 정제하여 수집할 수 있다.
본 출원의 다른 하나의 양태로, 본 출원은 mdtH 단백질의 활성이 내재적 활성에 비하여 강화된 O-포스포세린 생산 재조합 미생물의 O-포스포세린, 시스테인 또는 시스테인의 유도체 생산 용도를 제공한다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태로, 본 출원은 mdtH 단백질의 O-포스포세린을 미생물로부터 배출하는 용도를 제공한다.
상기 mdtH 단백질, 내재적 활성, 강화, O-포스포세린, 시스테인, 시스테인의 유도체 및 미생물에 대해서는 전술한 바와 같다.
이하 본 출원을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 출원을 예시하기 위한 바람직한 실시양태에 불과한 것이며 따라서, 본 출원의 권리범위를 이에 한정하는 것으로 의도되지는 않는다. 한편, 본 명세서에 기재되지 않은 기술적인 사항들은 본 출원의 기술 분야 또는 유사 기술 분야에서 숙련된 통상의 기술자이면 충분히 이해하고 용이하게 실시할 수 있다.
실시예 1: mdtH 막 단백질 동정
OPS의 배출에 관여하는 대장균의 막 단백질을 동정하기 위해 대장균 야생형 균주인 Escherichia coli W3110(ATCC27325)의 게놈 DNA 라이브러리를 이용하여 스크리닝을 수행하였다.
OPS에 의해 대장균의 생육이 저하되는 조건을 셋업(set-up)하기 위해 OPS를 생산하는 기반 균주를 제작하였다. 스크리닝 기반 균주는 W3110에서 내재적 포스포세린 포스파타아제(phosphoserine phosphatase, serB)의 활성이 약화되도록 변이시킨 OPS 생산 균주로, CA07-0012(KCCM11212P, 유럽공개특허 EP 2444481; 미국공개특허 제2012-0190081호)라고 명명한 균주이다.
CA07-0012를 OPS를 포함하는 배지에서 배양시켜 생육 저하(growth inhibition)를 보이는 최적 스크리닝 조건을 수립하였다. W3110 게놈 라이브러리 플라스미드를 CA07-0012에 전기천공법으로 형질전환 시키고(van der Rest et al. 1999), 과량의 OPS가 첨가된 배지 조건에서 생육 저하가 해제되는 콜로니들을 선별하였다. 선별된 콜로니로부터 플라스미드를 획득하여 시퀀싱 기법을 통해 염기서열을 분석하였다. 이로부터 과량의 OPS 첨가 조건에서 생육 저하를 해제시키는데 관여하는 대장균 막단백질 2종을 동정하였다.
그 결과, 상기 대장균 막단백질(서열번호 1)을 코딩하는 유전자는 MFS(major facilitator superfamily)에 속하는 mdtH 트랜스포터로 확인되었다.
실시예 2: mdtH 과발현 벡터 제작
OPS에 의한 생육 저하를 해제시키는데 관여하는 mdtH를 OPS 생산 균주에서 각각 강화시켜주었을 경우, OPS 배출능이 향상되는지 확인하기 위하여 각각 유전자의 과발현 벡터를 제작하였다. 또한, 포스포세린 배출자 yhhS를 OPS 생산 균주에 강화시켜 주었을 경우, OPS 농도가 상승하는 것을 확인하였기 때문에(WO 2016/024771 A1), 이를 양성 대조군(positive control)으로 이용하였다. 그리고 mdtH와 동일하게, MFS(major facilitator superfamily)에 속하는 대장균 막단백질 yfaV MFS 트랜스포터 또한 함께 평가하였다. mdtH를 코딩하는 DNA 단편은 W3110 게노믹 DNA을 주형으로 PCR을 통하여 획득하였다(서열번호 2). 각각의 막 단백질 유전자에 대한 과발현 벡터를 제작하기 위해 사용한 프라이머 서열은 하기 표 1에서 표기한 바와 같다.
서열번호 서열명 프라이머 유전자 벡터
11 yhhS_ Ptrc_F CGGGGATCCTCTAGACGCTTGCTGCAACTCTCTCA yhhS pCL_Ptrc-yhhS
12 yhhS_ Ptrc_R TACGGGTTCGGGcatGATATCTTTCCTGTGTGAAA
13 yhhS_F CACAGGAAAGATATCatgCCCGAACCCGTAGCCGA
14 yhhS_R GATTACGCCAAGCTTttaAGATGATGAGGCGGCCT
15 mdtH_ Ptrc_F CGGGGATCCTCTAGACGCTTGCTGCAACTCTCTCA mdtH pCL_Ptrc-mdtH
16 mdtH_ Ptrc_R CGACACGCGGGAcatGATATCTTTCCTGTGTGAAA
17 mdtH_F CACAGGAAAGATATCatgTCCCGCGTGTCGCAGGC
18 mdtH_R GATTACGCCAAGCTTtcaGGCGTCGCGTTCAAGCA
19 yfaV_ Ptrc_F CGGGGATCCTCTAGACGCTTGCTGCAACTCTCTCA yfaV pCL_Ptrc-yfaV
20 yfaV_ Ptrc_R CAAAGCGGTGCTcatGATATCTTTCCTGTGTGAAA
21 yfaV_F CACAGGAAAGATATCatgAGCACCGCTTTGCTTGA
22 yfaV_R GATTACGCCAAGCTTttaATGATGTGCCACGTCGG
pCL_Ptrc-yhhS를 제작하기 위해 주형으로 pCL_Ptrc-gfp(WO 2016/024771 A1)을 사용하고 서열번호 11 및 서열번호 12를 이용하여 PCR을 진행하여 Ptrc DNA 단편을 수득하였다. yhhS DNA 단편은 W3110를 주형으로 사용하여 서열번호 13 및 서열번호 14로 PCR을 진행하여 수득하였다. 증폭된 단편은 XbaI과 HindIII로 제한효소 처리된 pCL1920 벡터와 IST를 진행하여 pCL_Ptrc-yhhS를 확보하였다. IST(DG Gibson et al., NATURE METHODS, VOL.6 NO.5, MAY 2009, NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix)는 깁슨 어셈블리 방법을 이용하여 클로닝하는 방법을 의미하며, 이하에서 계속적으로 IST로 표기하였다. pCL_Ptrc-mdtH도 pCL_Ptrc-gfp를 주형으로 사용하되, 서열번호 15 및 서열번호 16을 이용하여 Ptrc DNA 단편을 확보하였다. W3110를 주형으로 서열번호 17 및 서열번호 18를 이용하여 mdtH DNA 단편을 확보하였고, pCL_Ptrc-yhhS와 동일하게 IST를 통해서 pCL_Ptrc-mdtH를 제작하였다.
pCL_Ptrc-yfaV도 상기 두 가지 플라즈미드를 제작했던 방법과 동일하게 클로닝하였으며, Ptrc DNA 단편은 pCL_Ptrc-gfp를, yfaV DNA 단편은 W3110를 주형으로 하여 확보하였다. 프라이머는 Ptrc는 서열번호 19 및 서열번호 20을 사용하였고, yfaV는 서열번호 21 및 서열번호 22를 이용하여 PCR을 진행하였다.
실시예 3: mdtH MFS 트랜스포터 강화 균주 제작 및 OPS 생산능 평가
3-1. CA07-0012를 이용한 mdtH MFS 트랜트포터 강화 균주 제작 및 OPS 생산능 평가
실시예 2에서 제작된 3종의 플라스미를 각각 OPS 생산주인 CA07-0012에 도입한 균주를 제작하여 OPS의 생산능을 평가하였다.
각각의 균주를 LB 고체 배지에 도말한 후, 33도 배양기에서 밤새 배양하였다. LB 고체 배지에서 밤새 배양한 균주를 하기 표 2의 25ml 역가 배지에 접종한 다음, 이를 33도, 200rpm의 배양기에서 48시간 배양하였으며, 이의 OPS 생산능을 표 3에 나타내었다.
배지성분 조제량
포도당 40g
KH2PO4(KP1) 6g
(NH4)2SO4 17g
MgSO4.7H2O 1g
MnSO4.4H2O 5mg
FeSO4.7H2O 10mg
L-글리신 2.5g/L
호모액기스 3g/L
CaCO3 30g/L
pH 6.8
균주명 OD562nm 소모당(g/L) O-포스포세린(g/L)
CA07-0012/pCL1920 50.6 40 1.3
CA07-0012/pCL_Ptrc-yhhS 45.1 40 2.3
CA07-0012/pCL_Ptrc-mdtH 38.2 40 2.4
CA07-0012/pCL_Ptrc-yfaV 39.5 40 1.3
상기 표 3에서 볼 수 있는 바와 같이, 대장균 유래의 CA07-0012 균주에 대장균 막 단백질 유전자를 추가로 도입한 경우 중, yhhS와 mdtH 강화주의 경우 OPS의 생산량이 CA07-0012에 비하여 증가한 결과를 나타내었고, 특히 본 출원의 mdtH 강화주의 경우 OPS 농도가 2배값에 가깝게 상승하는 것을 확인하였다. 반면, 비교군인 yfaV 강화주의 경우에는 OPS의 생산량을 증가시키지 못하는 결과를 나타내었다.상기 CA07-0012/pCL_Ptrc-mdtH는 CA07-0354로 명명하였다. CA07-0354균주는 부다페스트 조약 하에 한국미생물센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 2020년 8월 28일자로 기탁하여 기탁번호 KCCM 12781P를 부여받았다.
3-2. serA 및 serC 강화 균주를 이용한 mdtH MFS 트랜스포터 강화 균주 제작 및 OPS 생산능 평가
OPS 생합성 경로인 serA(3-포스포글리세레이트 디하드로제네이즈, D-3-phosphoglycerate dehydrogenase)와 serC(3-포스포세린 아미노트랜스퍼 레이즈, 3-phosphoserine aminotransferase)의 활성을 강화시켜 OPS 생산능이 증가된 OPS 생산 균주인 CA07-0022(KCCM11103P, 미국 등록특허 US 9689009 B2)를 이용하여 상기의 대장균 막 단백질 유전자의 효과를 파악하기 위해, serA, serC와 함께 막단백질 유전자에 대한 과발현 벡터를 제작하였다. 사용한 프라이머 서열은 하기 표 4에서 표기한 바와 같다.
서열번호 서열명 프라이머 유전자 벡터
23 serA*,serC_ Ptrc_F CGGGGATCCTCTAGAGGTACCCGCTTGCTGCAACT serA*,serC pCL_Ptrc-
serA*C
24 serA*,serC_ Ptrc_R CGATACCTTTGCCATGATATCTTTCCTGTGTGAAA
25 serA*,serC_F CACAGGAAAGATATCATGGCAAAGGTATCGCTGGA
26 serA*,serC_R GATTACGCCAAGCTTTTAACCGTGACGGCGTTCGA
27 serA*,serC,yhhS_ Ptrc-yhhS_F CACGGTTAAAAGCTTCGCTTGCTGCAACTCTCTCA serA*,serC,yhhS pCL_Ptrc-serA*C_
Ptrc-yhhS
28 serA*,serC,yhhS_ Ptrc-yhhS_R GATTACGCCAAGCTTttaAGATGATGAGGCGGCCT
29 serA*,serC,mdtH_ Ptrc-mdtH_F CACGGTTAAAAGCTTCGCTTGCTGCAACTCTCTCA serA*,serC,mdtH pCL_Ptrc-serA*C_
Ptrc-mdtH
30 serA*,serC,mdtH_ Ptrc-mdtH_R GATTACGCCAAGCTTtcaGGCGTCGCGTTCAAGCA
31 serA*,serC,mdtH_ Ptrc-yfaV_F CACGGTTAAAAGCTTCGCTTGCTGCAACTCTCTCA serA*,serC,yfaV pCL_Ptrc-serA*C_
Ptrc-yfaV
32 serA*,serC,mdtH_ Ptrc-yfaV_R GATTACGCCAAGCTTttaATGATGTGCCACGTCGG
우선, serA와 serC가 도입된 음성 대조군 플라즈미드를 제작하기 위해서 pCL_Ptrc-serA*C를 제작하였다. 서열번호 23 및 서열번호 24를 이용하고 주형을 pCL_Ptrc-gfp로 하여 Ptrc DNA 단편을 확보하였다. pC_Prmf-serA*C(WO 2016/024771 A1)을 주형으로 하고 서열번호 25 및 서열번호 26을 이용하여 PCR을 진행하여 serA*C DNA 단편을 확보하였다. 증폭된 단편은 XbaI과 HindIII로 제한효소 처리된 pCL1920 벡터와 IST를 진행하여 pCL_Ptrc-serA*C를 확보하였다.pCL_Ptrc-serA*C_Ptrc-yhhS 제작을 위해서 서열번호 27 및 서열번호 28를 사용하고, 주형으로 상위에 제작된pCL_Ptrc-yhhS 사용하여 PCR를 진행하였다. 이로부터 Ptrc-yhhS DNA 단편을 확보하였다. 증폭된 단편은 HindIII로 제한효소 처리된 pCL_Ptrc-serA*C 벡터와 IST를 진행하여 pCL_Ptrc-serA*C_Ptrc-yhhS를 확보하였다.
pCL_Ptrc-serA*C_Ptrc-mdtH와 pCL_Ptrc-serA*C_Ptrc-yfaV도 pCL_Ptrc-serA*C_Ptrc-yhhS와 동일한 방법으로 벡터를 제작하였다. 서열번호 29 및 서열번호 30를 이용하여 pCL_Ptrc-mdtH를 주형으로 하여 Ptrc-mdtH DNA 단편을 확보하였고, 서열번호 31 및 서열번호 32를 이용하여 pCL_Ptrc-yfaV를 주형으로 하여 Ptrc-yfaV DNA 단편을 확보하였다.
OPS 생산 균주인 CA07-0022에 상기 제작된 플라즈미드를 도입하여 OPS 생산능을 확인하였고 그 결과는 하기 표 5에 나타내었다.
균주명 OD562nm 소모당(g/L) O-포스포세린(g/L)
CA07-0022/pCL_Ptrc-serA*C(serA*(G336V)-(RBS)serC 45.0 40 3.5
CA07-0022/pCL_Ptrc-serA*C_Ptrc-yhhS 35.1 40 7.6
CA07-0022/pCL_Ptrc-serA*C_Ptrc-mdtH 30.0 40 7.8
CA07-0022/pCL_Ptrc-serA*C_Ptrc-yfaV 25.9 40 3.2
상기 표 5에서 볼 수 있는 바와 같이, 대장균 유래의 CA07-0012 균주보다 OPS 생산능이 향상된 CA07-0022/pCL_Ptrc-serA*C에 대장균 막 단백질 유전자를 추가로 도입한 균주 중, 양성 대조군인 yhhS 강화주의 경우 OPS의 생산량이 대조군 대비 증가하는 것을 다시 한번 확인할 수 있었다. 특히, 본 출원에 따른 mdtH 강화주의 경우 상기 표 3의 결과와 유사하게 OPS 농도가 상승하는 결과를 나타내었다. 반면, 비교군인 yfaV 강화군의 경우에는 대조군 대비 OPS 생산량이 감소한 결과를 나타내었다.
3-3. 염색체상 프로모터 세기에 따른 mdtH 트랜트포터 강화 균주 제작 및 OPS 생산능 평가
염색체상에서 mdtH의 프로모터를 더 강한 프로모터로 바꿔주었을 경우, 배출능이 향상되는지 확인해보기 위해 자가 프로모터가 trc 프로모터로 치환된 균주를 제작하여 O-포스포세린의 생산능을 평가하였다. trc 프로모터를 대장균의 염색체에 도입하는 방법은 통상적으로 이용되는 하기의 방법으로 제작하였다. 염색체상 삽입을 위해서 PI 단백질(pir 유전자)에 의존성을 가지는 R6K 리플리콘(replicon)을 가지고 있으며, sacB(레반수크라아제, Levansucrase) 유전자가 도입되어 있는 pSKH130 벡터를 이용하였다. 또한 상기 벡터는 카나마이신(kanamycin) 내성 유전자를 포함하고 있으며, 이는 균주 제작의 선택 마커로 사용되었다. 상기 벡터를 이용한 1차 교차에서 R6K 및 카나마이신을 이용하여 원하는 균주를 확보한 후, 수크로스(sucrose)가 있는 배지에서 항생제를 제거하는 작업을 진행하여 균주를 제작하였다. CA07-0022에서 mdtH의 프로모터를 trc로 교체하기 위해서 pSKH130_Ptrc-mdtH 벡터를 제작하였고, 사용한 프라이머 염기서열은 하기 표 6에 나타내었다.
서열번호 서열명 프라이머 유전자 벡터
33 mdtHUP_F CAGGAATTCGATATCTAATCTCTTTTTCGTCCGGG mdtH pSKH130_mdtHUP_Ptrc-mdtH
34 mdtHUP_R GAGTTGCAGCAAGCGTTCCCCTCCCGGGAAATAAA
35 Ptrc-mdtH_F TTCCCGGGAGGGGAACGCTTGCTGCAACTCTCTCA
36 Ptrc-mdtH_R GACTAGCGTGATATCCAGACCAGGCGAAAGTCGTA
37 Ptrc-mdtH_conf_F CACCGCTGCGTTTATTGT
38 Ptrc-mdtH_conf_R AAACGCTTGTCACGCATCA
pSKH130_Ptrc-mdtH를 제작하기 위해 주형으로 W3110를 사용하되, 서열번호 33 및 서열번호 34로 PCR를 진행하여 mdtHUP DNA 단편을 확보하였다. 서열번호 35 및 서열번호 36를 이용하고, 주형으로는 상기에 제작된 pCL_Ptrc-mdtH로 PCR을 진행하여 Ptrc-mdtH의 DNA 단편을 확보하였다. 증폭된 단편들은 EcoRV로 제한효소 처리된 pSKH130 벡터와 IST를 진행하여 pSKH_mdtHUP_Ptrc-mdtH를 확보하였다. 확보된 플라즈미드는 CA7-0022 균주에 전기천공법으로 형질전환시켰다. 재조합(교차)에 의해 카나마이신이 있는 LB 고체배지에서 염색체에 도입된 균주가 선택된 후, 수크로스가 있는 배지에서 2차 재조합(교체)을 통해 염색체로부터 플라스미드 부위의 절제가 일어났다. 상기 2차 재조합이 완료된 균주는 서열번호 37 및 서열번호 38의 프라이머를 이용하여 확보되었다(CA07-0022::Ptrc-mdtH). 제작된 OPS 생산 균주의 효과를 파악하고자 하였고, OPS 생산능을 하기 표 7에 나타내었다.
균주명 OD562nm 소모당(g/L) O-포스포세린(g/L)
CA07-0022/pCL_Ptrc-serA*C 42.4 40 3.5
CA07-0022::Ptrc-mdtH/pCL_Ptrc-serA*C 38.2 40 4.0
그 결과, 상기 표 7에서 볼 수 있는 바와 같이, 프로모터를 강화하여 대장균 막 단백질의 발현을 증가시켰을 경우, 대조군 대비 OPS 농도가 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4: 3-포스포글리세라이트(3-phosphoglycerate) 배출 비교
OPS는 포스페이트(phosphate)를 포함하고 있는 물질로 화학 구조적으로 3-포스포글리세라이트(3-phosphoglycerate, 이하 3PG로 표기)와 유사한 형태를 가지고 있으므로, OPS 배출자가 3PG를 배출할 수도 있다고 가정하고, OPS 배출자가 강화된 균주에서 3PG 생산능을 함께 측정하였다. 3PG는 HPLC(high performance liquid chromatography) 기기를 이용하여 측정하였으며, 3PG 생산능을 표 8에 나타내었다.
균주명 OD562nm OPS(g/L) 3PG(g/L)
CA07-0022/pCL_Ptrc-serA*C 45.0 3.5 0.2
CA07-0022/pCL_Ptrc-serA*C_Ptrc-yhhS 35.1 7.6 2.6
CA07-0022/pCL_Ptrc-serA*C_Ptrc-mdtH 30.0 7.8 0.3
CA07-0022/pCL_Ptrc-serA*C_Ptrc-yfaV 25.9 3.2 0.3
상기 표 8에서 볼 수 있는 바와 같이, yhhS 강화 균주에서는 3PG가 축적되는 결과를 보였으나, mdtH 막단백질이 강화된 균주에서는 3PG가 증가하지 않는 결과를 확인할 수 있었다. 즉, mdtH가 도입된 균주는 OPS 배출능이 증가되었으며, 또한 OPS 특이적 배출능이 증가된 것으로 나타났다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 제한적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Figure PCTKR2021011994-appb-img-000001

Claims (13)

  1. mdtH 단백질의 활성이 내재적 활성에 비하여 강화된, O-포스포세린 생산 재조합 미생물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 재조합 미생물은 O-포스포세린 배출 활성이 내재적 활성에 비하여 강화된, 미생물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 mdtH 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 O-포스포세린 배출 활성을 가지면서 상기 서열번호 1과 95% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 미생물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 재조합 미생물은 추가로 포스포세린 포스파타아제(phosphoserine phosphatase, SerB)의 활성이 내재적 활성에 비해 약화된, 미생물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 재조합 미생물은 추가로 포스포글리세라이트 디하이드로게나제(phosphoglycerate dehydrogenase, SerA), 포스포세린 아미노트랜스퍼라제(phosphoserine aminotransferase, SerC) 또는 이의 조합 중 어느 하나의 활성이 내재적 활성에 비해 강화된, 미생물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 재조합 미생물은 에스케리키아 속(the genus of Escherichia)인, 미생물.
  7. mdtH 단백질의 활성이 내재적 활성에 비하여 강화된 O-포스포세린 생산 재조합 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, O-포스포세린의 생산 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 방법은 배양된 배지 또는 미생물에서 O-포스포세린을 회수하는 단계를 추가로 포함하는, O-포스포세린의 생산 방법.
  9. a) mdtH 단백질의 활성이 내재적 활성에 비하여 강화된 O-포스포세린 생산 재조합 미생물을 배지에서 배양하여 O-포스포세린 또는 O-포스포세린을 포함하는 배지를 생산하는 단계; 및
    b) O-포스포세린 설프하이드릴라아제(O-phosphoserine sulfliydrylase, OPSS) 또는 이를 포함하는 미생물의 존재 하에, 상기 a) 단계에서 생산된 O-포스포세린 또는 이를 포함하는 배지를 황화물과 반응시키는 단계를 포함하는, 시스테인 또는 이의 유도체의 생산 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 시스테인 유도체의 생산 방법은 상기 b) 단계에서 생성된 시스테인을 시스테인 유도체로 전환시키는 단계를 추가로 포함하는, 시스테인 또는 이의 유도체의 생산 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 황화물은 Na2S, NaSH, (NH4)2S, H2S 및 Na2S2O3로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 시스테인 또는 이의 유도체의 생산 방법.
  12. mdtH 단백질의 활성이 내재적 활성에 비하여 강화된 O-포스포세린 생산 재조합 미생물의 O-포스포세린, 시스테인 또는 시스테인의 유도체 생산 용도.
  13. mdtH 단백질의 O-포스포세린을 미생물로부터 배출하는 용도.
PCT/KR2021/011994 2020-09-09 2021-09-06 신규 o-포스포세린 배출 단백질 및 이를 이용한 o-포스포세린, 시스테인 및 이의 유도체의 생산 방법 Ceased WO2022055192A1 (ko)

Priority Applications (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202180061926.XA CN116568701A (zh) 2020-09-09 2021-09-06 新型o-磷酸丝氨酸输出蛋白和使用其生产o-磷酸丝氨酸、半胱氨酸和半胱氨酸衍生物的方法
BR112023004005-1A BR112023004005B1 (pt) 2020-09-09 2021-09-06 Micro-organismo recombinante para produzir o-fosfoserina e seu uso, método para produzir o-fosfoserina e para produzir cisteína ou derivados da mesma, e uso de uma proteína mdth
MX2023002722A MX2023002722A (es) 2020-09-09 2021-09-06 Proteina de exportacion de o-fosfoserina novedosa y procedimientos para producir o-fosfoserina, cisteina, y derivado de cisteina usando la misma.
EP21867058.6A EP4198130A4 (en) 2020-09-09 2021-09-06 NOVEL O-PHOSPHOSERINE EXPORT PROTEIN AND METHODS FOR PRODUCING O-PHOSPHOSERINE, CYSTEINE AND CYSTEINE DERIVATIVE USING SAME
US18/023,462 US20230313243A1 (en) 2020-09-09 2021-09-06 Novel O-Phosphoserine Export Protein and Methods for Producing O-Phosphoserine, Cysteine, and Cysteine Derivative Using Same
AU2021340470A AU2021340470B2 (en) 2020-09-09 2021-09-06 Novel O-phosphoserine export protein and methods for producing o-phosphoserine, cysteine, and cysteine derivative using same
CA3191495A CA3191495A1 (en) 2020-09-09 2021-09-06 Novel o-phosphoserine export protein and methods for producing o-phosphoserine, cysteine, and cysteine derivative using same
JP2023515631A JP7646816B2 (ja) 2020-09-09 2021-09-06 新規なｏ－ホスホセリン排出タンパク質及びそれを用いたｏ－ホスホセリン、システイン及びその誘導体の生産方法
ZA2023/03414A ZA202303414B (en) 2020-09-09 2023-03-08 Novel o-phosphoserine export protein and methods for producing o-phosphoserine, cysteine, and cysteine derivative using same

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200115569A KR102414743B1 (ko) 2020-09-09 2020-09-09 신규 o-포스포세린 배출 단백질 및 이를 이용한 o-포스포세린, 시스테인 및 이의 유도체의 생산 방법
KR10-2020-0115569 2020-09-09

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2022055192A1 true WO2022055192A1 (ko) 2022-03-17

Family

ID=80632270

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2021/011994 Ceased WO2022055192A1 (ko) 2020-09-09 2021-09-06 신규 o-포스포세린 배출 단백질 및 이를 이용한 o-포스포세린, 시스테인 및 이의 유도체의 생산 방법

Country Status (12)

Country Link
US (1) US20230313243A1 (ko)
EP (1) EP4198130A4 (ko)
JP (1) JP7646816B2 (ko)
KR (1) KR102414743B1 (ko)
CN (1) CN116568701A (ko)
AR (1) AR123451A1 (ko)
AU (1) AU2021340470B2 (ko)
CA (1) CA3191495A1 (ko)
MX (1) MX2023002722A (ko)
TW (1) TWI817193B (ko)
WO (1) WO2022055192A1 (ko)
ZA (1) ZA202303414B (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2851144C2 (ru) * 2021-06-03 2025-11-19 СиДжей ЧеилДжеданг Корпорейшн Новый вариант YhhS и способ получения O-фосфосерина, цистеина и производного цистеина с его использованием

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20240147868A (ko) * 2023-03-31 2024-10-10 씨제이제일제당 (주) 알킬하이드로퍼옥사이드 환원효소의 발현이 조절된 재조합 미생물 및 이를 이용한 o-포스포세린, 시스테인 및 이의 유도체의 생산방법
KR20240147887A (ko) * 2023-03-31 2024-10-10 씨제이제일제당 (주) 망간 유입 단백질의 활성이 조절된 재조합 미생물 및 이를 이용한 o-포스포세린, 시스테인 및 이의 유도체의 생산방법

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0943687A2 (en) 1998-01-12 1999-09-22 Ajinomoto Co., Inc. Method of producing L-serine by fermentation
EP0885962B1 (de) 1997-06-19 2005-04-13 Consortium für elektrochemische Industrie GmbH Mikroorganismen und Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Cystein, L-Cystin, N-Acetyl-Serin oder Thiazolindinderivaten
US7662943B2 (en) 2004-12-16 2010-02-16 Cj Cheiljedang Corporation Promoter sequences from Corynebacterium ammoniagenes
EP2444481A1 (en) 2010-10-20 2012-04-25 CJ CheilJedang Corporation Microorganism producing O-phosphoserine and method of producing L-cysteine or derivatives thereof from O-phosphoserine using the same
US20120190081A1 (en) 2010-10-20 2012-07-26 Cj Cheiljedang Corporation Microorganism producing o-phosphoserine and method of producing l-cysteine or derivatives thereof from o-phosphoserine using the same
US9127324B2 (en) 2010-10-20 2015-09-08 CJ Cheildjedang Corporation O-phosphoserine sulfhydrylase mutants and method for production of cysteine using the same
WO2016024771A1 (ko) 2014-08-12 2016-02-18 씨제이제일제당 주식회사 O-포스포세린 생산 미생물 및 이를 이용한 o-포스포세린 또는 l-시스테인 생산 방법
KR101694632B1 (ko) * 2015-09-11 2017-01-10 씨제이제일제당 (주) 신규 ｏ-포스포세린 배출 단백질 변이체 및 이를 이용한 ｏ-포스포세린, 시스테인 및 이의 유도체의 생산방법
US10273491B2 (en) 2015-01-29 2019-04-30 Cj Cheiljedang Corporation Promoter and uses thereof
US10584338B2 (en) 2016-08-31 2020-03-10 Cj Cheiljedang Corporation Promoter and use thereof

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101525663B1 (ko) * 2013-05-10 2015-06-04 씨제이제일제당 (주) 신규 ｏ-포스포세린 배출 단백질 및 이를 이용한 ｏ-포스포세린의 생산방법
KR101825310B1 (ko) * 2016-12-29 2018-03-15 씨제이제일제당 (주) O-포스포세린을 생산하는 에스케리키아 속 미생물 및 이를 이용한 o-포스포세린 또는 l-시스테인을 생산하는 방법

Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0885962B1 (de) 1997-06-19 2005-04-13 Consortium für elektrochemische Industrie GmbH Mikroorganismen und Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Cystein, L-Cystin, N-Acetyl-Serin oder Thiazolindinderivaten
EP0943687A2 (en) 1998-01-12 1999-09-22 Ajinomoto Co., Inc. Method of producing L-serine by fermentation
US7662943B2 (en) 2004-12-16 2010-02-16 Cj Cheiljedang Corporation Promoter sequences from Corynebacterium ammoniagenes
EP2444481A1 (en) 2010-10-20 2012-04-25 CJ CheilJedang Corporation Microorganism producing O-phosphoserine and method of producing L-cysteine or derivatives thereof from O-phosphoserine using the same
US20120190081A1 (en) 2010-10-20 2012-07-26 Cj Cheiljedang Corporation Microorganism producing o-phosphoserine and method of producing l-cysteine or derivatives thereof from o-phosphoserine using the same
US9127324B2 (en) 2010-10-20 2015-09-08 CJ Cheildjedang Corporation O-phosphoserine sulfhydrylase mutants and method for production of cysteine using the same
US9689009B2 (en) 2010-10-20 2017-06-27 Cj Cheiljedang Corporation Microorganism producing o-phosphoserine and method of producing L-cysteine or derivatives thereof from O-phosphoserine using the same
WO2016024771A1 (ko) 2014-08-12 2016-02-18 씨제이제일제당 주식회사 O-포스포세린 생산 미생물 및 이를 이용한 o-포스포세린 또는 l-시스테인 생산 방법
KR20160020050A (ko) * 2014-08-12 2016-02-23 씨제이제일제당 (주) O-포스포세린 생산 미생물 및 이를 이용한 o-포스포세린 또는 l-시스테인 생산 방법
US10273491B2 (en) 2015-01-29 2019-04-30 Cj Cheiljedang Corporation Promoter and uses thereof
KR101694632B1 (ko) * 2015-09-11 2017-01-10 씨제이제일제당 (주) 신규 ｏ-포스포세린 배출 단백질 변이체 및 이를 이용한 ｏ-포스포세린, 시스테인 및 이의 유도체의 생산방법
US10584338B2 (en) 2016-08-31 2020-03-10 Cj Cheiljedang Corporation Promoter and use thereof

Non-Patent Citations (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Guide to Huge Computers", 1994, ACADEMIC PRESS
"NCBI", Database accession no. NUC4.4
"Sequence and Structure", 1979, NATIONAL BIOMEDICAL RESEARCH FOUNDATION, pages: 353 - 358
AHMED ZAHOOR, COMPUTATIONAL AND STRUCTURAL BIOTECHNOLOGY JOURNAL, vol. 3, October 2012 (2012-10-01)
ATSCHUL, S. F. ET AL., J MOLEC BIOL, vol. 215, 1990, pages 403
BURNS, K. E. ET AL., J. AM. CHEM. SOC., vol. 127, 2005, pages 11602 - 11603
CARILLO ET AL., SIAM J APPLIED MATH, vol. 48, 1988, pages 1073
DATABASE Protein GenBank ; ANONYMOUS : "multidrug efflux MFS transporter MdtH [Escherichia coli O11] -", XP055910413, retrieved from NCBI *
DATABASE Protein GenBank; ANONYMOUS : "MULTISPECIES: multidrug efflux MFS transporter MdtH [Enterobacteriacea ]", XP055910411, retrieved from NCBI *
DEVEREUX, J. ET AL., NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 12, 1984, pages 387
GIBSON, D. G. ET AL., NATURE METHODS, vol. 6, no. 5, May 2009 (2009-05-01)
GRANT, G. A. ET AL., BIOCHEM., vol. 39, 2000, pages 7316 - 7319
GRANT, G. A. ET AL., J. BIOL. CHEM., vol. 276, 2001, pages 17844 - 17850
GRANT, G. A. ET AL., J. BIOL. CHEM., vol. 39, 1999, pages 5357 - 5361
GRIBSKOV ET AL., NUCL. ACIDS RES., vol. 14, 1986, pages 6745
MINO, K.ISHIKAWA, K.: "Aeropyrum pernix, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium smegmatis, and Trichomonas vaginalis", FEBS LETTERS, vol. 551, 2003, pages 133 - 138
NAKASHIMA N ET AL.: "Bacterial cellular engineering by genome editing and gene silencing", INT J MOL SCI., vol. 15, no. 2, 2014, pages 2773 - 2793, XP055376889, DOI: 10.3390/ijms15022773
NEEDLEMAN ET AL., J MOL BIOL., vol. 48, 1970, pages 443
NEEDLEMANWUNSCH, J. MOL. BIOL., vol. 48, 1970, pages 443 - 453
PEARSON ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 85, 1988, pages 2444
PETERS-WENDISCH, P. ET AL., APPL ENVIRON MICROBIOL., vol. 7 1, no. II, November 2005 (2005-11-01), pages 139 - 44
PETERS-WENDISCH, P. ET AL., APPL. MICROBIOL. BIOTECHNOL, vol. 60, 2002, pages 37 - 441
RICE ET AL.: "EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite", TRENDS GENET., vol. 16, 2000, pages 276 - 277, XP004200114, DOI: 10.1016/S0168-9525(00)02024-2
SAMBROOK ET AL., MOLECULAR CLONING, 2012
See also references of EP4198130A4
SITNICKA ET AL.: "Functional Analysis of Genes", ADVANCES IN CELL BIOLOGY., vol. 2, 2010, pages 1 - 16
SMITHWATERMAN, ADV. APPL. MATH, vol. 2, 1981, pages 482
WADA MTAKAGI H, APPL. MICROBIOL. BIOCHEM., vol. 73, 2006, pages 48 - 54
WEINTRAUB, H. ET AL., ANTISENSE-RNA AS A GENETICS, vol. 1, no. 1, 1986
WENDISCH, V. F. ET AL., CURR OPIN MICROBIOL., vol. 9, no. 3, June 2006 (2006-06-01), pages 268 - 74
ZHANG YANG; DONG RUNAN; ZHANG MINGJING; GAO HAIJUN: "Native efflux pumps ofEscherichia coliresponsible for short and medium chain alcohol", BIOCHEMICAL ENGINEERING JOURNAL, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 133, 13 February 2018 (2018-02-13), NL , pages 149 - 156, XP085372912, ISSN: 1369-703X, DOI: 10.1016/j.bej.2018.02.009 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2851144C2 (ru) * 2021-06-03 2025-11-19 СиДжей ЧеилДжеданг Корпорейшн Новый вариант YhhS и способ получения O-фосфосерина, цистеина и производного цистеина с его использованием

Also Published As

Publication number Publication date
TWI817193B (zh) 2023-10-01
KR102414743B1 (ko) 2022-06-29
EP4198130A1 (en) 2023-06-21
ZA202303414B (en) 2024-07-31
AR123451A1 (es) 2022-11-30
US20230313243A1 (en) 2023-10-05
KR20220033316A (ko) 2022-03-16
CN116568701A (zh) 2023-08-08
EP4198130A4 (en) 2024-01-17
MX2023002722A (es) 2023-03-28
TW202216741A (zh) 2022-05-01
JP7646816B2 (ja) 2025-03-17
JP2023540374A (ja) 2023-09-22
CA3191495A1 (en) 2022-03-17
AU2021340470A1 (en) 2023-04-06
AU2021340470B2 (en) 2025-04-17
BR112023004005A2 (pt) 2023-04-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2016024771A1 (ko) O-포스포세린 생산 미생물 및 이를 이용한 o-포스포세린 또는 l-시스테인 생산 방법
WO2022163934A1 (ko) 신규한 d-알라닌-d-알라닌 리가아제 a 변이체 및 이를 이용한 l-글루탐산 생산 방법
WO2022163933A1 (ko) 신규한 abc 트랜스포터 atp-결합 단백질 변이체 및 이를 이용한 l-글루탐산 생산 방법
WO2022215796A1 (ko) 신규한 전사 조절자 변이체 및 이를 이용한 l-발린 생산 방법
WO2022163939A1 (ko) 신규한 mfs 트랜스포터 변이체 및 이를 이용한 l-글루탐산 생산 방법
WO2017043915A1 (ko) 신규 ｏ-포스포세린 배출 단백질 변이체 및 이를 이용한 ｏ-포스포세린, 시스테인 및 이의 유도체의 생산방법
WO2022255839A1 (ko) 신규한 yhhs 변이체 및 이를 이용한 o-포스포세린, 시스테인 및 이의 유도체의 생산방법
WO2022055192A1 (ko) 신규 o-포스포세린 배출 단백질 및 이를 이용한 o-포스포세린, 시스테인 및 이의 유도체의 생산 방법
WO2022163935A1 (ko) 신규한 글루코사민-6-포스페이트 디아미나제 변이체 및 이를 이용한 l-글루탐산 생산 방법
WO2022270857A1 (ko) Nadh:quinone 산화환원효소의 발현이 조절된 재조합 미생물 및 이를 이용한 o-포스포세린, 시스테인 및 이의 유도체의 생산방법
WO2022163917A1 (ko) 신규한 단백질 변이체 및 이를 이용한 l-발린 생산 방법
WO2022163923A1 (ko) 신규한 atp 포스포리보실트랜스퍼라제 변이체 및 이를 이용한 l-발린 생산 방법
WO2022163922A1 (ko) 신규한 아스파라긴 신타제 변이체 및 이를 이용한 l-발린 생산 방법
WO2022163936A1 (ko) 신규한 엑시뉴클레아제 abc 서브유닛 a 변이체 및 이를 이용한 l-글루탐산 생산 방법
WO2021251734A1 (ko) O-포스포세린 배출 단백질 변이체 및 이를 이용한 o-포스포세린, 시스테인 및 이의 유도체의 생산방법
WO2022225319A1 (ko) 신규한 l-세린 암모니아 분해 효소 변이체 및 이를 이용한 xmp 또는 gmp 생산 방법
WO2022163920A1 (ko) 신규한 시스테인 설피네이트 디설피나제 변이체 및 이를 이용한 l-발린 생산 방법
WO2022231371A1 (ko) 신규한 5-(카르복시아미노)이미다졸리보뉴클레오티드합성효소 변이체 및 이를 이용한 imp 생산 방법
WO2022154191A1 (ko) 신규한 2,5-다이케토-d-글루콘산 리덕타제 변이체 및 이를 이용한 xmp 또는 gmp 생산 방법
WO2022163909A1 (ko) 신규한 단백질 변이체 및 이를 이용한 l-라이신 생산 방법
WO2022154190A1 (ko) 신규한 포스포노아세테이트 하이드롤라제 변이체 및 이를 이용한 xmp 또는 gmp 생산 방법
WO2022215800A1 (ko) 신규한 분지쇄아미노산 투과효소 변이체 및 이를 이용한 l-발린 생산 방법
WO2022260215A1 (ko) 신규한 mdth 변이체 및 이를 이용한 o-포스포세린, 시스테인 및 이의 유도체의 생산방법
WO2024205186A1 (ko) 알킬하이드로퍼옥사이드 환원효소의 발현이 조절된 재조합 미생물 및 이를 이용한 o-포스포세린, 시스테인 및 이의 유도체의 생산방법
WO2024248498A1 (ko) O-포스포세린 설프하이드릴라아제 변이체 및 이를 이용한 시스테인 생산 방법

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 21867058

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 3191495

Country of ref document: CA

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2023515631

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 202180061926.X

Country of ref document: CN

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 202317016406

Country of ref document: IN

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01A

Ref document number: 112023004005

Country of ref document: BR

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2021867058

Country of ref document: EP

Effective date: 20230315

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 112023004005

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20230302

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2021340470

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20210906

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE