WO2022075419A1 - Ｃｒｉｓｐｒタイプｉ－ｄシステムを利用した標的ヌクレオチド配列改変技術 - Google Patents

Ｃｒｉｓｐｒタイプｉ－ｄシステムを利用した標的ヌクレオチド配列改変技術 Download PDF

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cas10d
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敬史 刑部
祐里子 刑部
直樹 和田
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University of Tokushima NUC
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    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
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    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/89—Algae ; Processes using algae

Definitions

  • the present invention uses a CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) type ID system to target a target nucleotide sequence, specifically modify a target nucleotide sequence, and suppress expression of a target gene.
  • CRISPR Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats
  • complexes and kits containing Cas (CRISPR-associated) protein and crRNA (CRISPRRNA) used in the method used in the method.
  • the CRISPR-Cas system is an acquired immune system found in bacteria and archaea that protects bacteria and archaea from viruses, plasmids and other foreign genetic elements.
  • CRISPR-Cas systems are classified into two classes, six different types (I-VI), and at least 34 subtypes, depending on the Cas proteins and molecular mechanisms that make up the system.
  • the complex of crRNA and Cas effector protein recognizes short (typically 3-5 base length) sequence elements called protospacer flanking motifs (PAMs) in foreign DNA. do.
  • PAMs protospacer flanking motifs
  • the complex of type I or II crRNA and Cas effector protein locally disrupts the DNA pair to form an R-loop structure, and the crRNA guide element base pairs with the complementary target strand. It forms and replaces non-target DNA strands. Binding and unwinding of double-stranded DNA targets by the crRNA-Cas complex is required for DNA cleavage and degradation by type-specific Cas effector nucleases such as Cas3, Cas9 and Cas12 nucleases.
  • CRISPR type I there are various subtypes of CRISPR type I.
  • target recognition modules such as Cas5, Cas6, Cas7 and Cas8 called Cascade (CRISPR-assisted-complex for experimental defense) and DNA cleavage modules such as Cas3
  • Patent Document 2 In genome editing technology, the Class 1 CRISPR system is less common than Class 2, but as a genome editing tool, with Cas9 and Cpf1, for example, long region genomic deletions and diverse mutation profiles involving long gRNA sequences. It was suggested that it may have some advantages in comparison (Non-Patent Document 1, Patent Document 1).
  • the class 1 CRISPR type IE system studied so far it has been reported that a base deletion of 2-300b to 100kb occurs mainly on the 5'upstream side of the PAM sequence (Non-Patent Document 3).
  • the class 1 CRISPR type IE system studied so far consists of six Cas proteins (Cas3e, Cas5e, Cas6e, Cas7e, Cas8e and Cas11e) and a targeting crRNA.
  • Cas8e and Cas11e are called a large subunit and a small subunit, respectively, and have the function of a support protein that stably maintains the binding between the Cas protein complex and the target DNA. It is considered (Non-Patent Document 1).
  • CRISPR type ID (hereinafter referred to as "TiD") system, which is Cas3d, Cas5d. It has been found that genome editing can be realized by the five Cas proteins Cas6d, Cas7d, and Cas10d and the targeting crRNA (Patent Documents 1 and 2). Here, no gene corresponding to Cas11e, which is a small subunit of the CRISPR type IE system, was found at the TiD locus.
  • An object of the present invention is to improve the target sequence targeting and modification efficiency by TiD.
  • the inventors surprisingly found that, in addition to the previously reported expression of the five Cas proteins constituting the TiD system, a polypeptide containing a partial amino acid sequence containing the C-terminal region of Cas10d. It was found that the target nucleotide sequence can be modified with high efficiency by separately expressing. Thus, the present invention was completed.
  • a method for targeting a target nucleotide sequence in a cell comprising: (I) CRISPR type I-D Cas proteins Cas5d, Cas6d, and Cas7d, and polypeptides containing the N-terminal HD domain of Cas10d, or nucleic acids encoding these proteins and polypeptides. (Ii) A polypeptide that does not contain the N-terminal HD domain of Cas10d and contains a C-terminal partial sequence of Cas10d, or a nucleic acid encoding the polypeptide, and (iii) a sequence that forms a base pair with the target nucleotide sequence.
  • [6] The method according to any one of [2] to [5] above, wherein the modification is a deletion, insertion, or substitution of a base.
  • [7] (i) CRISPR type I-D Cas proteins Cas5d, Cas6d, and Cas7d, and a polypeptide containing the N-terminal HD domain of Cas10d, (Ii) A polypeptide that does not contain the N-terminal HD domain of Cas10d and contains a C-terminal partial sequence of Cas10d, and (iii) a crRNA that contains a sequence that forms a base pair with the target nucleotide sequence.
  • Complex containing [8] The complex according to the above [7], further comprising Cas3d.
  • DNA encoding Vector containing. [11] The vector according to the above [10], further comprising a nucleic acid encoding Cas3d. [12] The above [10] or [11], wherein the nucleic acids (i) to (iii), or the nucleic acids (i) to (iii) and the nucleic acid encoding Cas3d are contained in one or more vectors. ] The expression vector described. [13] The vector according to the above [11] or [12], wherein the C-terminal partial sequence of Cas10d is a sequence consisting of 100 to 400 amino acids. [14] A DNA molecule encoding the complex according to any one of the above [7] to [9].
  • a kit for targeting a target nucleotide sequence (I) CRISPR type I-D Cas proteins Cas5d, Cas6d, and Cas7d, and polypeptides containing the N-terminal HD domain of Cas10d, or nucleic acids encoding these proteins and polypeptides. (Ii) A polypeptide that does not contain the N-terminal HD domain of Cas10d and contains a C-terminal partial sequence of Cas10d, or a nucleic acid encoding the polypeptide, and (iii) a sequence that forms a base pair with the target nucleotide sequence. CrRNA containing, or DNA encoding the crRNA Kit including.
  • a kit for modifying a target nucleotide sequence (I) CRISPR Type I-D Cas Proteins Cas3d, Cas5d, Cas6d, and Cas7d, and polypeptides containing the N-terminal HD domain of Cas10d, or nucleic acids encoding these proteins and polypeptides. (Ii) A polypeptide that does not contain the N-terminal HD domain of Cas10d and contains a C-terminal partial sequence of Cas10d, or a nucleic acid encoding the polypeptide, and (iii) a sequence that forms a base pair with the target nucleotide sequence. CrRNA containing, or DNA encoding the crRNA The kit.
  • kits according to the above [15] or [16], wherein the C-terminal partial sequence of Cas10d is a sequence consisting of 100 to 400 amino acids.
  • a method for improving targeting efficiency in targeting a target nucleotide sequence using a CRISPR type ID system which is a poly that does not contain the HD domain on the N-terminal side of Cas10d and contains the C-terminal partial sequence of Cas10d.
  • a method for improving the modification efficiency in modifying a target nucleotide sequence using a CRISPR type ID system which is a polypeptide that does not contain the HD domain on the N-terminal side of Cas10d and contains the C-terminal partial sequence of Cas10d.
  • a method comprising using a nucleic acid encoding the polypeptide Alternatively, a method comprising using a nucleic acid encoding the polypeptide.
  • a composition for improving the modification efficiency in modifying a target nucleotide sequence using a CRISPR type ID system which does not contain the HD domain on the N-terminal side of Cas10d and contains the C-terminal partial sequence of Cas10d.
  • a composition comprising a polypeptide or a nucleic acid encoding the polypeptide.
  • CrRNA contained, or DNA encoding the crRNA A method for producing a cell having a modified target nucleotide sequence, which comprises introducing a cell.
  • a method for producing a plant having a modified target nucleotide sequence which comprises producing a plant cell having a modified target nucleotide sequence by the method according to the above [22].
  • a method for producing a non-human animal having a modified target nucleotide sequence which comprises producing a non-human animal cell having a modified target nucleotide sequence by the method according to the above [22].
  • a method for targeting a target nucleotide sequence wherein the isolated nucleic acid containing the target nucleotide sequence is used.
  • the present invention it is possible to efficiently induce site-specific mutations in cells, preferably animal and plant cells, by using a TiD system containing TiD crRNA engineered to target a particular DNA.
  • a TiD system containing TiD crRNA engineered to target a particular DNA can.
  • the C-terminal partial sequence of Cas10d (hereinafter, also referred to as "Cas10d C-ter"). ) Can increase the efficiency of targeting and modifying the target sequence by the TiD system several times.
  • the techniques of the invention result in longer deletions as a mutation mode near the target sequence.
  • Various types ID Cas10d C-ter were compared with Cas11e by alignment analysis.
  • Various types I-D Cas10d C-ter were compared with Cas11e by alignment analysis (continued from FIG. 1-1).
  • Various types I-D Cas10d C-ter were compared with Cas11e by alignment analysis (continued in FIG. 1-2).
  • the effect on genome editing activity by overexpression of Cas10d C-ter protein in animal cells is shown. Detection of long-chain region deletion mutations in the AAVS gene induced by CRISPR TiD.
  • A) Human AAVS gene structure, gRNA positions (white triangles), and various primer sets for amplifying mutations (black arrows) are shown.
  • a TiD-induced long-chain region deletion pattern containing a Cas11d expression vector indicates the deletion in the 5'upstream region from the target sequence, and the gray bar indicates the deletion in the 3'downstream region from the target sequence. The number on the left side of the bar indicates the total base deletion length.
  • the TiD system includes Cas3d, Cas5d, Cas6d, Cas7d and Cas10d, and TiD crRNA as Cas effector proteins among TiD Cas proteins.
  • Cas5d, Cas6d and Cas7d are known to constitute a target recognition module (Cascade)
  • Cas3d and Cas10d are known to constitute a polynucleotide cleavage module (Patent Document 1).
  • previous studies by the inventors have revealed that Cas10d among the components of the cleavage module has a polynucleotide-degrading action (nuclease activity) and Cas3d has no nuclease activity.
  • the TiD crRNA and the target recognition module target the target nucleotide sequence and guide the polynucleotide cleavage module to the vicinity of the target nucleotide sequence, and the target nucleotide sequence is cleaved by the action of Cas10d.
  • the TiD crRNA comprises a sequence that base pairs with the target nucleotide sequence (eg, a sequence complementary to the target nucleotide sequence).
  • the present invention is a method for targeting a target nucleotide sequence using a TiD system (hereinafter, also referred to as “target sequence targeting method of the present invention”), a method for modifying a target nucleotide sequence (hereinafter, “target sequence modification of the present invention”).
  • a method also referred to as “method”
  • a method for controlling the expression of the target gene hereinafter, also referred to as “the method for controlling the expression of the target gene of the present invention”
  • the present invention is a complex containing a CRISPR type ID-related Cas protein and crRNA used in these methods (hereinafter, also referred to as “complex of the present invention”), and a nucleic acid encoding the complex.
  • a vector containing a molecule hereinafter, also referred to as “vector of the present invention”
  • kit of the present invention hereinafter, also referred to as “kit of the present invention”.
  • the present invention is characterized in that a polypeptide containing the C-terminal partial sequence of Cas10d is used in addition to the Cas protein in the TiD system.
  • a polypeptide containing the C-terminal partial sequence of Cas10d conserved the ⁇ -helix region common to Cas11e (Example 1). It was considered that the C-terminus of Cas10d fulfilled the function of Cas11e, and therefore TiD did not require the expression of Cas11e as in CRISPR type IE.
  • expressing a polypeptide containing the C-terminal partial sequence of Cas10d improves the effectiveness of the TiD system.
  • the present invention further provides a method for improving the efficiency of targeting and modification of a target nucleotide sequence utilizing the TiD system by using a polypeptide containing the C-terminal partial sequence of Cas10d, and a C-terminal partial sequence of Cas10d.
  • a composition comprising a polypeptide comprising, improving the efficiency of targeting and modifying a target nucleotide sequence utilizing the TiD system.
  • the cell may be either a prokaryotic cell or a eukaryotic cell, and is not particularly limited.
  • eukaryotic cells are used.
  • a "cell” is a cell isolated from an organism, a cell present in an organism (eg, in an animal or plant), an organism (eg, an animal, or). Includes either plants) or cultured cells.
  • the method of the present invention may be applied to cells isolated from a living body, cells existing in the living body, or cells derived from any organ and tissue of the living body.
  • it may be applied to cells existing in the body of a non-human animal or a non-human animal body.
  • animal cells include, but are not limited to, germ cells, fertilized eggs, embryonic cells, stem cells (including, for example, iPS cells, embryonic stem cells, somatic stem cells, etc.), somatic cells, and the like.
  • plant cells include, but are not limited to, germ cells, fertilized eggs, embryonic cells, somatic cells, and the like, and protoplasts may be used.
  • the Cas effector protein used in the present invention is Cas3d, Cas5d, Cas6d, Cas7d, and Cas10d among the Cas proteins of TiD.
  • Cas3d, Cas5d, Cas6d, Cas7d, and Cas10d may be derived from any bacteria or archaea, for example, Microcystis aeruginosa, Acetohalobium arabaticum, Ammonifex degensii, Anabaena cylindrica, Anabaena variabilis, Caldicellulosiruptor lactoaceticus, Caldilinea aerophila, Bacteria epipsimmum, Cyanothece Sp.
  • Cas3d, Cas5d, Cas6d, Cas7d, and Cas10d may be derived from two or more bacterial species, or may be derived from the same bacterial species. Preferably, those derived from the same bacterial species are used.
  • the amino acid sequence and nucleotide sequence information of the Cas protein is available from a public database such as, for example, NCBI GenBank.
  • NCBI GenBank a public database
  • BLAST program from microbial genome data obtained by metagenomic analysis or the like, it is possible to acquire sequences from new microbial species.
  • the Cas protein can be obtained by a known method, for example, chemically synthesized based on amino acid sequence information, or a nucleic acid encoding the Cas protein is introduced into a cell via an appropriate vector or the like, and the cell is used. It may be produced in.
  • the nucleic acid encoding the Cas protein can be obtained by a known method. For example, based on the amino acid sequence information, a codon optimized for translation in the host cell into which the nucleic acid is introduced is selected, and by chemical synthesis or the like. You may build it. By using codons that are frequently used in host cells, the expression level of the protein can be increased. Examples of the nucleic acid include RNA such as mRNA or DNA.
  • Cas10d has an HD (histidine-aspartic acid) domain in the N-terminal region, and it is known that the domain functions in DNA cleavage (Patent Document 2). Further, in the present invention, it was found that a plurality of ⁇ -helix regions exist on the C-terminal side of Cas10d (Example 1). Therefore, in the present invention, Cas10d may be a polypeptide containing at least the N-terminal HD domain.
  • Cas10d is a full-length Cas10d protein, a polypeptide containing one or more ⁇ -helix regions on the C-terminal side from the N-terminal HD domain of Cas10d, or the N-terminal HD domain of Cas10d.
  • Cas10d may be a polypeptide containing, and lacking one or more ⁇ -helix regions on the C-terminal side.
  • Cas10d may lack all ⁇ -helix regions on the C-terminal side.
  • the term "Cas10d" includes both the full-length Cas10d polypeptide and the Cas10d fragment containing the N-terminal HD domain as described above.
  • the Cas proteins of Cas3d, Cas5d, Cas6d, Cas7d, and Cas10d or the nucleic acids encoding them are one or more, eg, 1 to, as long as the complex of Cas protein and crRNA targets or modifies the target sequence. It may have several amino acid mutations, or one or more, eg, one to several nucleotide mutations.
  • "several pieces” means about 2 to 10 pieces, for example, 3, 4, 5, 6, 7, 8 or 9 pieces.
  • “mutation” includes deletions, substitutions, insertions or additions of amino acids or nucleotides as compared to the native sequence.
  • Cas3d SEQ ID NO: 1
  • Cas5d SEQ ID NO: 2
  • Cas6d SEQ ID NO: 3
  • Cas7d derived from Microcystis aeruginosa hereinafter referred to as M. aeruginosa
  • SEQ ID NO: 4 Cas10d
  • Cas3d a protein containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1
  • Cas5d a protein containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2
  • Cas6d SEQ ID NO: 3
  • Cas7d derived from Microcystis aeruginosa hereinafter referred to as M. aeruginosa
  • Cas10d SEQ ID NO: 5
  • Examples of the protein comprising the amino acid sequence shown, Cas7d include the protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4, and examples of Cas10d include the protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5.
  • a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 as an example of Cas5d, a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and as an example of Cas6d, SEQ ID NO: 3
  • Cas7d includes a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4
  • an example of Cas10d includes a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5.
  • Cas protein used in the present invention 30% or more, 40% or more, and 60%, respectively, with respect to SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, and SEQ ID NO: 5, respectively. 50% or more, 70% or more, or 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 96% or more, still more preferably 97% or more, still more preferably 98% or more, or More preferably, a protein containing an amino acid sequence having 99% or more sequence identity can be mentioned.
  • the Cas protein used in the present invention 30% or more, 40% or more, and 60 with respect to SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, and SEQ ID NO: 5, respectively.
  • % Or more 50% or more, 70% or more, or 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 96% or more, still more preferably 97% or more, still more preferably 98% or more,
  • a protein consisting of an amino acid sequence having 99% or more sequence identity can be mentioned more preferably. Any of the above Cas proteins is capable of targeting or modifying the target sequence when complexed with the other Cas proteins and crRNA described above.
  • a nuclear localization signal may be preferably added to the end of the Cas protein.
  • the nuclear localization signal is known in the art and can be appropriately selected depending on the species from which the cell to be introduced is derived.
  • two or more nuclear localization signals may be arranged in tandem and added to the Cas protein. Further, the nuclear localization signal may be added to either or both of the N-terminal side and the C-terminal side of the Cas protein.
  • nucleic acid encoding Cas3d used in the present invention, a nucleic acid containing a nucleotide sequence encoding a protein containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and as an example of a nucleic acid encoding Cas5d, the nucleic acid represented by SEQ ID NO: 2.
  • a nucleic acid encoding Cas6d a nucleic acid containing a nucleotide sequence encoding a protein containing a sequence, as an example of a nucleic acid containing a nucleotide sequence encoding a protein containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3, a nucleic acid encoding Cas7d.
  • a nucleic acid comprising a nucleotide sequence encoding a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 and a nucleic acid comprising a nucleotide sequence encoding a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5, as an example of a nucleic acid encoding Cas10d.
  • a nucleic acid encoding Cas3d used in the present invention a nucleic acid containing a nucleotide sequence encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and as an example of a nucleic acid encoding Cas5d, in SEQ ID NO: 2.
  • nucleic acid encoding Cas6d a nucleic acid containing a nucleotide sequence encoding a protein consisting of the indicated amino acid sequence, a nucleic acid containing a nucleotide sequence encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, a nucleic acid encoding Cas7d.
  • nucleic acid containing the nucleotide sequence encoding the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 and as an example of the nucleic acid encoding Cas10d, the nucleotide sequence encoding the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5.
  • nucleic acid encoding Cas3d used in the present invention, a nucleic acid consisting of a nucleotide sequence encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and an example of a nucleic acid encoding Cas5d, SEQ ID NO: 2
  • a nucleic acid encoding Cas6d a nucleic acid consisting of a nucleotide sequence encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in, Cas7d, a nucleic acid consisting of a nucleotide sequence encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 3, is encoded.
  • nucleic acid a nucleic acid consisting of a nucleotide sequence encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, and as an example of a nucleic acid encoding Cas10d, a nucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5. Nucleic acid consisting of sequences can be mentioned.
  • nucleic acid encoding the Cas protein used in the present invention 30% or more and 40%, respectively, with respect to SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, and SEQ ID NO: 5, respectively. 60% or more, 50% or more, 70% or more, or 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 96% or more, still more preferably 97% or more, still more preferably 98. Included are nucleic acids comprising a nucleotide sequence encoding a protein comprising an amino acid sequence having greater than or equal to, or even more preferably greater than or equal to 99% sequence identity.
  • nucleic acid encoding the Cas protein used in the present invention 30% or more and 40, respectively, with respect to SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, and SEQ ID NO: 5, respectively.
  • % Or more 60% or more, 50% or more, 70% or more, or 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 96% or more, still more preferably 97% or more, still more preferably.
  • nucleic acid encoding the Cas protein used in the present invention 30% or more of each of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, and SEQ ID NO: 5 are used. 40% or more, 60% or more, 50% or more, 70% or more, or 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 96% or more, still more preferably 97% or more, still more preferable.
  • the Cas protein expressed from any of the above nucleic acids has the ability to target or modify the target sequence when complexed with the Cas protein and crRNA expressed from the other nucleic acids described above.
  • a nucleotide sequence encoding a nuclear translocation signal may be added to the end of the nucleic acid encoding the Cas protein.
  • the nuclear localization signal sequence is known in the art and can be appropriately selected depending on the species from which the cell to be introduced is derived.
  • two or more nuclear localization signal sequences may be arranged in tandem and added to the nucleic acid encoding the Cas protein.
  • the nuclear localization signal sequence may be added to either or both of the 5'-terminal side and the 3'-terminal side of the nucleic acid encoding the Cas protein.
  • the C-terminal partial sequence of Cas10d (Cas10d C-ter) is on the N-terminal side of Cas10d. It is a sequence that does not contain the HD domain of the above and contains one or more ⁇ -helix regions on the C-terminal side.
  • the polypeptide containing Cas10d C-ter (hereinafter, also referred to as “Cas11d”) does not contain the HD domain on the N-terminal side of Cas10d.
  • the sequence length of Cas10d C-ter is not particularly limited as long as the effects of the present invention are achieved, that is, as long as efficient targeting and modification of the target nucleotide sequence by the TiD system is achieved, but for example, about. Even if it is 100 amino acids long to about 400 amino acids long, preferably about 120 amino acids long to about 270 amino acids long, more preferably about 130 amino acids long to about 180 amino acids long, and even more preferably about 135 amino acids long to about 170 amino acids long. good.
  • Cas10d C-ter about 100 amino acid length to about 400 amino acid length, preferably about 120 amino acid length to about 270 amino acid length, more preferably about 130 amino acid length to about 180 amino acid length from the C end of the full length amino acid sequence of Cas10d.
  • a length, more preferably about 135 amino acids to about 170 amino acids, can be used, and for example, as a nucleic acid encoding Cas10d C-ter, a sequence length of about 0.3 kb upstream from the stop codon of the Cas10d gene is about 0.3 kb.
  • Cas11d is, for example, about 100 amino acids to about 400 amino acids, preferably about 120 amino acids to about 270 amino acids, more preferably about 130 amino acids to about 180 amino acids, and even more preferably about 135 amino acids from the C-terminus of the full-length amino acid sequence of Cas10d. Contains amino acids to about 170 amino acids.
  • Cas11d about 100 amino acids to about 400 amino acids, preferably about 120 amino acids to about 270 amino acids, more preferably about 130 amino acids to about 180 amino acids, still more preferably about 135 amino acids from the C-terminus of the full-length amino acid sequence of Cas10d. Examples thereof include polypeptides consisting of up to about 170 amino acids.
  • the nucleic acid encoding Cas11d is, for example, about 0.3 kb to about 1.2 kb upstream of the stop codon of the Cas10d gene, preferably about 0.36 kb to about 0.81 kb, and more preferably about 0.39 kb to about.
  • Cas11d contains 0.54 kb, more preferably about 0.41 kb to about 0.51 kb.
  • a preferred example of a nucleic acid encoding Cas11d is from about 0.3 kb to about 1.2 kb upstream of the stop codon of the Cas10d gene, preferably from about 0.36 kb to about 0.81 kb, more preferably from about 0.39 kb.
  • Nucleic acids consisting of about 0.54 kb, more preferably about 0.41 kb to about 0.51 kb can be mentioned.
  • Cas11d is not the full length Cas10d.
  • Nucleic acids encoding Cas11d and Cas11d can be obtained by known methods.
  • Cas11d may be chemically synthesized based on amino acid sequence information, or a nucleic acid encoding Cas11d may be introduced into cells via an appropriate vector or the like and produced in the cells.
  • a nucleic acid encoding Cas11d for example, a codon optimized for translation in the host cell into which the nucleic acid is introduced may be selected based on the amino acid sequence information and constructed by chemical synthesis or the like. By using codons that are frequently used in host cells, the expression level of the protein can be increased.
  • the nucleic acid include RNA such as mRNA or DNA.
  • the nucleic acid encoding Cas11d or Cas11d is 1 as long as the effects of the present invention are achieved, i.e., as long as the complex of Cas11d with the Cas protein and crRNA results in efficient targeting and modification of the target sequence. It may have the above, for example, one to several amino acid mutations, or one or more, for example, one to several nucleotide mutations.
  • Cas11d although not limited to, M.D.
  • examples thereof include a polypeptide containing Cas10d C-ter derived from Cas10d (SEQ ID NO: 5) of aeruginosa. Therefore, as an example of Cas11d used in the present invention, about 100 amino acids to about 400 amino acids, preferably about 120 amino acids to about 270 amino acids, and more preferably about 130 amino acids to about 130 amino acids to about 400 amino acids from the C-terminal of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5.
  • Polypeptides comprising 180 amino acids, more preferably from about 135 amino acids to about 170 amino acids.
  • Cas11d used in the present invention, about 100 amino acids to about 400 amino acids, preferably about 120 amino acids to about 270 amino acids, and more preferably about 130 amino acids to the C-terminal of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5.
  • Examples thereof include polypeptides consisting of about 180 amino acids, more preferably about 135 amino acids to about 170 amino acids.
  • M As an example of Cas11d derived from aeruginosa, a polypeptide containing a sequence consisting of the amino acids at positions 997 to 1156 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 (SEQ ID NO: 6) can be mentioned, and more preferably, it is shown by SEQ ID NO: 6.
  • Examples include a polypeptide consisting of an amino acid sequence.
  • Cas11d derived from PCC6803 include polypeptides containing the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 8 to 19, respectively.
  • Cas11d may contain Cas10d C-ter having a bacterial species different from or derived from the same bacterial species as the Cas protein (Cas3d, Cas5d, Cas6d, Cas7d, and / or Cas10d).
  • Cas11d a polypeptide containing Cas10d C-ter derived from the same strain as any of the above Cas proteins is used as Cas11d.
  • Cas11d used in the present invention, about 100 amino acids to about 400 amino acids, preferably about 120 amino acids to about 270 amino acids, and more preferably about 130 amino acids to the C-terminal of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5. 30% or more, 40% or more, 60% or more, 50% or more, 70% or more, or 80% or more, preferably 90% with respect to a sequence consisting of about 180 amino acids, more preferably about 135 amino acids to about 170 amino acids.
  • a polypeptide containing an amino acid sequence having a sequence identity of 95% or more, more preferably 96% or more, still more preferably 97% or more, still more preferably 98% or more, or even more preferably 99% or more Can be mentioned.
  • Cas11d used in the present invention, about 100 amino acids to about 400 amino acids, preferably about 120 amino acids to about 270 amino acids, more preferably about 130 amino acids from the C-terminal of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5. 30% or more, 40% or more, 60% or more, 50% or more, 70% or more, or 80% or more, preferably 90% or more, preferably 90% or more, with respect to a sequence consisting of about 180 amino acids, more preferably about 135 amino acids to about 170 amino acids.
  • Cas11d 30% or more, 40% or more, 60% or more, 50% or more, 70% or more, or 80 with respect to the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 6 and SEQ ID NOs: 8 to 19.
  • Examples include polypeptides containing an amino acid sequence.
  • Cas11d 30% or more, 40% or more, 60% or more, 50% or more, 70% or more, or 80% with respect to the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NOs: 8 to 19.
  • Examples include a polypeptide consisting of a sequence. Any of the above Cas11d is capable of resulting in efficient targeting and modification of the target sequence when complexed with the above Cas protein and crRNA.
  • a nuclear localization signal may be preferably added to the end of Cas11d.
  • the nuclear localization signal is known in the art and can be appropriately selected depending on the species from which the cell to be introduced is derived. Further, two or more nuclear localization signals may be added to Cas11d side by side in tandem. Further, the nuclear localization signal may be added to either or both of the N-terminal side and the C-terminal side of Cas11d.
  • nucleic acid encoding Cas11d used in the present invention, about 0.3 kb to about 1.2 kb upstream of the stop codon of the nucleotide sequence encoding the protein containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, preferably about 1.2 kb.
  • Nucleic acids comprising from about 0.36 kb to about 0.81 kb, more preferably from about 0.39 kb to about 0.54 kb, even more preferably from about 0.41 kb to about 0.51 kb.
  • nucleic acid encoding Cas11d used in the present invention, about 0.3 kb to about 1.2 kb upstream of the stop codon of the nucleotide sequence encoding the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5.
  • Nucleic acids comprising, preferably from about 0.36 kb to about 0.81 kb, more preferably from about 0.39 kb to about 0.54 kb, and even more preferably from about 0.41 kb to about 0.51 kb.
  • nucleic acid encoding Cas11d used in the present invention, about 0.3 kb to about 0.3 kb upstream of the stop codon of the nucleotide sequence encoding the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5.
  • nucleic acids consisting of 2 kb, preferably about 0.36 kb to about 0.81 kb, more preferably about 0.39 kb to about 0.54 kb, and even more preferably about 0.41 kb to about 0.51 kb.
  • nucleic acid encoding Cas11d a nucleic acid containing a nucleotide sequence encoding a polypeptide containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 can be mentioned, and more preferably, a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 can be used.
  • examples thereof include nucleic acids containing the encoding nucleotide sequence, and more preferably, nucleic acid consisting of the nucleotide sequence encoding the polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6.
  • nucleic acids encoding Cas11d include nucleic acids comprising a nucleotide sequence encoding a polypeptide comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 8-19, more preferably the amino acids set forth in SEQ ID NOs: 8-19.
  • nucleic acids comprising a nucleotide sequence encoding a polypeptide consisting of a sequence and more preferably nucleic acid comprising a nucleotide sequence encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 8-19.
  • nucleic acid encoding Cas11d used in the present invention about 0.3 kb to about 1.2 kb upstream of the stop codon of the nucleotide sequence encoding the protein containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5. 30% or more, 40, with respect to a sequence consisting of preferably from about 0.36 kb to about 0.81 kb, more preferably from about 0.39 kb to about 0.54 kb, and even more preferably from about 0.41 kb to about 0.51 kb.
  • nucleic acids containing a nucleotide sequence having 98% or more, or more preferably 99% or more, sequence identity Preferably, as an example of the nucleic acid encoding Cas11d used in the present invention, about 0.3 kb to about 1.2 kb upstream of the stop codon of the nucleotide sequence encoding the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5.
  • nucleic acid encoding Cas11d used in the present invention, about 0.3 kb to about 0.3 kb upstream of the stop codon of the nucleotide sequence encoding the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5. 30% or more of a sequence consisting of 2 kb, preferably about 0.36 kb to about 0.81 kb, more preferably about 0.39 kb to about 0.54 kb, and even more preferably about 0.41 kb to about 0.51 kb.
  • nucleic acids consisting of nucleotide sequences having 98% or more, or even more preferably 99% or more sequence identity.
  • nucleic acid encoding Cas11d 30% or more, 40% or more, 60 with respect to the nucleotide sequence encoding the polypeptide containing the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 6 and SEQ ID NOs: 8-19.
  • nucleic acid containing a nucleotide sequence having 99% or more sequence identity can be mentioned more preferably.
  • nucleic acid encoding Cas11d 30% or more, 40% or more, with respect to the nucleotide sequence encoding the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 6 and SEQ ID NOs: 8-19.
  • nucleic acids containing a nucleotide sequence having 99% or more sequence identity As another example of the nucleic acid encoding Cas11d, 30% or more, 40% or more, with respect to the nucleotide sequence encoding the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 6 and SEQ ID NOs: 8-19.
  • nucleic acid consisting of a nucleotide sequence having 99% or more sequence identity.
  • the Cas11d polypeptide expressed from any of the above nucleic acids is capable of resulting in efficient targeting and modification of the target sequence when complexed with the above Cas protein and crRNA.
  • a nucleotide sequence encoding a nuclear translocation signal may be added to the end of the nucleic acid encoding Cas11d.
  • the nuclear localization signal sequence is known in the art and can be appropriately selected depending on the species from which the cell to be introduced is derived.
  • two or more nuclear localization signal sequences may be arranged in tandem and added to the nucleic acid encoding Cas11d.
  • the nuclear localization signal sequence may be added to either or both of the 5'-terminal side and the 3'-terminal side of the nucleic acid encoding Cas11d.
  • the crRNA comprises one or more structural units (“repeat-spacer-repeat”) consisting of a repeat sequence derived from the CRISPR locus and a spacer sequence sandwiched between the repeat sequences.
  • the repeat sequence preferably comprises a palindrome-like sequence.
  • the crRNA contributes to target recognition of the CRISPR-Cas system by including an RNA sequence (ie, a protospacer sequence) that binds to the target nucleotide sequence as a spacer sequence.
  • An RNA molecule containing a structure consisting of a repeat sequence of crRNA and a protospacer sequence sandwiched between the repeat sequences is also referred to as a guide RNA (gRNA).
  • gRNA guide RNA
  • the crRNA is processed by the action of the Cas effector protein to cleave the repeat sequence, resulting in a mature crRNA consisting of a partial sequence of the repeat sequence and a protospacer sequence sandwiched between the partial sequences of the repeat sequence.
  • the pre-processed crRNA is called a pre-mature crRNA.
  • the crRNA used in the present invention contains a repeat sequence derived from the CRISPR type ID locus and a sequence forming a base pair with the target nucleotide sequence as a protospacer sequence sandwiched between the repeat sequences.
  • the crRNA used in the present invention is preferably a premature crRNA.
  • the pre-mature crRNA is processed by Cas6d before being incorporated into Cascade (complex of Cas5d, Cas6d, and Cas7d) to become a mature crRNA. If the premature crRNA contains more than one "repeat-spacer-repeat" structural unit, the premature crRNA may contain more than one protospacer sequence. Premature crRNAs containing two or more protospacer sequences yield two or more mature crRNAs, which are then individually incorporated into Cascade.
  • the protospacer sequence contained in crRNA is a sequence that forms a base pair with the target nucleotide sequence.
  • the "sequence forming a base pair with the target nucleotide sequence” is, for example, a sequence complementary to the target nucleotide sequence or a sequence substantially complementary to the target nucleotide sequence.
  • substantially complementary includes sequences that are not completely complementary to the target sequence but can bind to the target sequence (form a base pair with the target sequence).
  • a sequence that is substantially complementary to the target nucleotide sequence may contain a mismatch with the target sequence as long as it base pairs with the target sequence.
  • the repeat sequence portion of crRNA may have at least one hairpin structure.
  • the repeat sequence portion on the 5'end side of the protospacer sequence may have a hairpin structure, and the repeat sequence portion on the 3'end side of the protospacer sequence may be single-stranded.
  • crRNA preferably has one hairpin structure.
  • the repeat sequence derived from the CRISPR type ID locus can be found from the crRNA gene sequence region adjacent to the type I-D gene cluster using a tandem repeat search program.
  • the repeat sequence from the Type I-D locus may be from any bacterium or archaea, for example from the bacteria and archaea exemplified for the Cas effector protein described above. ..
  • the base length of the repeat sequence contained in crRNA is not particularly limited as long as the purpose of interacting with Cascade to target the target nucleotide sequence is achieved.
  • the repeat sequences before and after the protospacer sequence may each be about 10 to 70 bases long, for example, about 30 to 50 bases long, preferably about 35 to 45 bases long. May be good.
  • the crRNA used in the present invention can contain a protospacer sequence having a length of about 10 to 70 bases.
  • the protospacer sequence contained in the crRNA is preferably a sequence consisting of 20 to 50 bases, more preferably a sequence consisting of 25 bases to 45 bases, and further preferably a sequence consisting of 30 bases to 40 bases, for example, 31 bases and 32 bases. It is a sequence consisting of 33 bases, 34 bases, 35 bases, 36 bases, 37 bases, 38 bases, or 39 bases.
  • the longer the targetable sequence the greater the sequence specificity of target recognition by crRNA.
  • the longer the targetable sequence the higher the Tm value of the base pair formed between the crRNA and the target sequence, and the more stable the target recognition.
  • the length of the sequence that crRNA can target is about 20 to 24 bases, so in the present invention, the sequence is more specific than the conventional method. Excellent in sex and stability.
  • crRNA used in the present invention examples thereof include those containing a repeat sequence of crRNA derived from aeruginosa.
  • a premature crRNA comprising a sequence represented by GUUCCAAUUAAUCUUAAGCCCUAUUAGGGAUUGAAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUCCAAUUAAUCUUAAGCCCUAUUAGGGAUUGAAAC (SEQ ID NO: 7; N is any nucleotide constituting the sequence forming a base pair with the target nucleotide sequence).
  • the number of N may be changed in the range of 10 to 70, preferably 20 to 50, more preferably 25 to 45, and further preferably 30 to 40.
  • the crRNA may be introduced into cells as RNA or as DNA encoding crRNA.
  • the DNA encoding the crRNA may be contained, for example, in a vector or expression cassette, the DNA sequence being operably linked to regulatory sequences such as promoters and terminators.
  • the vector and the regulatory sequence can be appropriately selected by those skilled in the art based on, for example, a host cell or the like.
  • a pol III promoter eg, SNR6, SNR52, SCR1, RPR1, U6, H1 promoter, etc.
  • a pol II promoter eg, T6 sequence
  • T6 sequence eg, T6 sequence
  • human U6 snRNA promoter can be used.
  • the DNA encoding the crRNA may be contained in the same vector or in the same expression cassette as any of the nucleic acids encoding the Cas protein and the Cas11d polypeptide, or the nucleic acid encoding the Cas protein and the Cas11d polypeptide. Any of these may be contained in another vector or in another expression cassette.
  • the target nucleotide sequence (also simply referred to as “target sequence” in the present specification) is a sequence of an arbitrary nucleic acid and is located in the vicinity of the protospacer proximity motif (PAM) of the TiD system. It is not particularly limited except that the located sequence is selected as the target sequence.
  • the nucleic acid may be a nucleic acid in a living body or a cell, or a nucleic acid isolated from a living body or a cell.
  • the target nucleotide sequence may be either a double-stranded DNA sequence, a single-stranded DNA sequence, or an RNA sequence.
  • the target nucleotide sequence is preferably a sequence on genomic DNA. Therefore, in the sense strand of the target nucleic acid, a sequence located near the PAM sequence, preferably a sequence located near the 3'side downstream of the PAM sequence, and more preferably a sequence adjacent to the 3'side downstream of the PAM sequence. Is selected as the target nucleotide sequence.
  • the target nucleotide sequence is a sequence located near the PAM sequence, preferably a sequence located near the 5'side of the PAM sequence, and more preferably adjacent to the 5'side of the PAM sequence. It is selected from the array to be used.
  • “located in the vicinity” includes both being adjacent and being close to each other.
  • the term “neighborhood” includes both adjacent or near positions. In this specification, unless otherwise specified, it is described based on the sense strand of nucleic acid.
  • the PAM sequence used for target recognition of the CRISPR system differs depending on the type of the CRISPR system. For example, M.
  • the target nucleotide sequence may be a sequence located in the vicinity of the PAM sequence and existing in the intron, coding region, non-coding region, or control region of the target gene.
  • the target gene is an arbitrary gene and may be arbitrarily selected.
  • the length of the target nucleotide sequence is, for example, in the range of 10 to 70 bases, preferably 20 to 50 bases, more preferably 25 to 45 bases, and even more preferably 30 to 40 bases.
  • Targeting sequence targeting method of the present invention comprises a polypeptide containing Cas5d, Cas6d, Cas7d, and Cas10d, Cas10d C-ter, and crRNA among the Cas effector proteins of TiD. It is characterized by introducing and into cells. That is, the target sequence targeting method of the present invention comprises (i) Cas5d, Cas6d, Cas7d, and Cas10d, or a nucleic acid encoding these proteins, (ii) a Cas11d polypeptide, or a nucleic acid encoding the polypeptide, and (i).
  • a crRNA containing a sequence forming a base pair with a target nucleotide sequence or a DNA encoding the crRNA is introduced into the above cells.
  • the target sequence targeting method of the present invention may be performed in vitro, in vivo, or ex vivo.
  • the target sequence targeting method of the present invention can also be applied to the target nucleotide sequence of the isolated nucleic acid, in which case the method is the Cas protein of (i) above, the Cas11d polypeptide of (ii) above.
  • the above-mentioned crRNA of (iii) is contacted with an isolated nucleic acid containing a target nucleotide sequence.
  • the Cas protein is contained in cells as an isolated complex containing two or more of Cas5d, Cas6d, Cas7d, and Cas10d, for example, an isolated complex containing four.
  • An isolated nucleic acid containing an isolated nucleic acid containing an introduced or target nucleotide sequence may be contacted, or each of Cas5d, Cas6d, Cas7d, and Cas10d is introduced into a cell alone as an isolated protein or containing an isolated nucleic acid containing a target nucleotide sequence. May be in contact with.
  • the Cas protein may be introduced into cells as a nucleic acid encoding the Cas proteins Cas5d, Cas6d, Cas7d, and Cas10d.
  • the nucleic acid include RNA such as mRNA or DNA.
  • Cas11d may be introduced into cells as a complex with the Cas protein or contacted with an isolated nucleic acid containing the target nucleotide sequence, or Cas11d may be as an isolated polypeptide. It may be introduced into cells alone or contacted with an isolated nucleic acid containing a target nucleotide sequence. Further, in the target sequence targeting method of the present invention, Cas11d may be introduced into cells as a nucleic acid encoding Cas11d. Examples of the nucleic acid include RNA such as mRNA or DNA.
  • the Cas protein and the nucleic acid encoding Cas11d may be contained, for example, in a vector, and the nucleic acid sequence is preferably operably linked to a regulatory sequence such as a promoter and a terminator.
  • a nuclear translocation signal sequence is preferably added to the nucleic acid sequence encoding the Cas protein and Cas11d.
  • Two or more or all of the nucleic acids encoding the Cas proteins Cas5d, Cas6dCas7d and Cas10d, and Cas11d may be contained in a single vector or expression cassette, or may be contained in separate vectors or expression cassettes. May be good. There are no restrictions on the number of vectors or expression cassettes, and the types and combinations of nucleic acids incorporated into each vector or expression cassette.
  • these nucleic acid sequences may be expressed polycistronically, for example, a sequence encoding a self-cleaving peptide, or the like. They may be connected to each other via.
  • the order in which the Cas protein and two or more nucleic acids encoding Cas11d are linked may be any order.
  • the crRNA may be introduced into cells as RNA or as DNA encoding crRNA.
  • the crRNA may also be introduced into cells as a complex with the Cas protein and / or Cas11d or contacted with an isolated nucleic acid containing a target nucleotide sequence.
  • the crRNA or DNA encoding the crRNA may be contained, for example, in a vector, the RNA or DNA sequence being operably linked to regulatory sequences such as promoters and terminators.
  • the crRNA or the DNA encoding the crRNA may be contained in the same vector or expression cassette as the nucleic acid encoding the Cas protein and / or the nucleic acid encoding Cas11d, or may be contained in a separate vector or expression cassette. May be.
  • the vector is an expression vector for carrying a nucleic acid encoding a target protein into a target cell and expressing the target protein in the cell.
  • the expression cassette means a nucleic acid molecule that directs transcription and / or translation of the nucleic acid encoding the protein of interest to allow expression of the protein of interest.
  • the expression cassette may be included in the vector.
  • various vectors generally used in the art can be used, and the vector is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the cell to be introduced or the method of introduction. For example, but not limited to, plasmid vectors, viral vectors, retroviral vectors, phages, phagemids, cosmids, artificial / minichromosomes, transposons and the like can be mentioned.
  • Examples of the regulatory sequence include promoters, enhancers, terminators, internal ribosome entry sites (IRES), polyadenylation signals, poly U sequences, translation enhancers and the like.
  • the regulatory sequence is not particularly limited and can be appropriately selected by those skilled in the art based on the host cell and the like.
  • examples of the promoter include CaMV35S promoter, 2xCaMV35S promoter, CaMV19S promoter, NOS promoter, etc. when the host is a plant cell, and SR ⁇ promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV promoter, etc. when the host is an animal cell. Examples thereof include RSV promoter, MoMuLV LTR promoter, HSV-TS promoter, human translation elongation factor gene promoter, CAG chimera synthesis promoter and the like.
  • the nuclear localization signal sequence is known in the art and can be appropriately selected depending on the species from which the cells into which the Cas protein, Cas11d and crRNA are introduced are derived. For example, a monopartite nuclear localization signal or a vipartite nuclear localization signal may be used.
  • the introduction of the Cas protein, Cas11d, and crRNA into cells can be performed by various means known in the art.
  • transfection for example, calcium phosphate mediated transfection, electroporation, liposome transfection, etc., virus transduction, lipofection, gene gun, microinjection, agrobacterium method, agroinfiltration method, PEG-calcium method, etc.
  • transfection for example, calcium phosphate mediated transfection, electroporation, liposome transfection, etc.
  • the Cas protein, Cas11d, and crRNA, or nucleic acids encoding these may be introduced into cells simultaneously or continuously.
  • the Cas proteins Cas5d, Cas6d, Cas7d and Cas10d, or nucleic acids encoding each of these Cas proteins may be introduced into cells simultaneously or continuously.
  • the above Cas proteins Cas5d, Cas6d, Cas7d and Cas10d, and Cas11d synthesized in in vitro or in vivo, respectively, and crRNA synthesized in in vitro or in vivo are incubated in in vitro to form a complex. Can be introduced into the cell.
  • the cells Upon introduction of the Cas protein, Cas11d, and crRNA, the cells are cultured under conditions suitable for targeting the target nucleotide sequence. The cells are then cultured under conditions suitable for cell proliferation and maintenance.
  • the culture conditions may be any culture conditions suitable for the species from which the cells to be introduced are derived, and can be appropriately determined by those skilled in the art based on, for example, known cell culture techniques.
  • a fusion protein containing the Cas protein and a functional polypeptide may be used.
  • the action of the Cas protein and crRNA induces the functional polypeptide into the target nucleotide sequence in the cell, and the action of the functional polypeptide modifies or modifies the target nucleotide sequence.
  • the invention further provides a method of modifying or modifying a target nucleotide sequence, comprising introducing the fusion proteins, Cas11d and crRNA into a cell or contacting an isolated nucleic acid comprising the target nucleotide sequence.
  • a functional polypeptide is a polypeptide that exhibits some function with respect to a target sequence.
  • Functional polypeptides include, for example, but not limited to, restriction enzymes, transcription factors, DNA methylases, histone acetylases, fluorescent proteins, and restriction enzyme nucleotide cleavage modules, genes as polynucleotide cleavage modules.
  • restriction enzymes transcription factors, DNA methylases, histone acetylases, fluorescent proteins
  • restriction enzyme nucleotide cleavage modules genes as polynucleotide cleavage modules.
  • transcriptional activation and transcriptional repression modules of transcription factors as epigenome modification modules, DNA methylation enzyme methylation module and histone acetylase acetylation module, and nucleotide substitution-inducing modules
  • cytosine deaminase and Examples include adenine deaminase.
  • the fluorescent protein include GFP.
  • the target sequence targeting method of the present invention the target sequence can be efficiently targeted due to the presence of Cas11d.
  • Target sequence modification method of the present invention cells containing Cas effector proteins Cas5d, Cas6d, Cas7d, Cas3d and Cas10d, a polypeptide containing Cas10d C-ter (Cas11d), and crRNA are used. It is characterized by being introduced inside. That is, the target sequence modification method of the present invention comprises (i) Cas3d, Cas5d, Cas6d, Cas7d, and Cas10d, or a nucleic acid encoding these proteins, (ii) Cas11d polypeptide, or the polypeptide thereof, in a cell.
  • the target sequence modification method of the present invention comprises cleaving the nucleotide sequence targeted by the target sequence targeting method of the present invention by the action of Cas3d and Cas10d.
  • the target sequence modification method of the present invention may be performed in vitro, in vivo, or ex vivo.
  • modifications include deletion, insertion, or substitution of at least one nucleotide, or a combination thereof.
  • the target sequence modification method of the present invention can also be applied to the target nucleotide sequence of an isolated nucleic acid, in which case the method is the Cas protein of (i) above and the Cas11d polypeptide of (ii) above. And the above-mentioned crRNA of (iii) is contacted with an isolated nucleic acid containing a target nucleotide sequence.
  • a method for cleaving the target nucleotide sequence is preferably provided.
  • Cas5d, Cas6d, Cas7d, Cas3d, and Cas10d are isolated complexes containing two or more of these five Cas proteins, for example, an isolated complex containing five. Even if the body or an isolated complex containing Cas5d, Cas6d, and Cas7d and / or an isolated complex containing Cas3d and Cas10d is introduced into cells or contacted with an isolated nucleic acid containing a target nucleotide sequence.
  • each of Cas5d, Cas6d, Cas7d, Cas3d, and Cas10d may be introduced into cells alone as an isolated protein or contacted with an isolated nucleic acid containing a target nucleotide sequence. Alternatively, it may be introduced into cells as a nucleic acid encoding the Cas proteins Cas5d, Cas6d, Cas7d, Cas3d, and Cas10d. Examples of the nucleic acid include RNA such as mRNA or DNA.
  • Cas11d may be introduced into cells as a complex with the Cas protein or contacted with an isolated nucleic acid containing a target nucleotide sequence, or Cas11d may be used as an isolated polypeptide. It may be introduced into cells alone or contacted with an isolated nucleic acid containing a target nucleotide sequence. Further, in the target sequence modification method of the present invention, Cas11d may be introduced into cells as a nucleic acid encoding Cas11d. Examples of the nucleic acid include RNA such as mRNA or DNA.
  • the Cas protein and the nucleic acid encoding Cas11d may be contained, for example, in a vector, and the nucleic acid sequence is preferably operably linked to a regulatory sequence such as a promoter and a terminator.
  • a nuclear localization signal sequence is preferably added to the Cas protein and the nucleic acid encoding Cas11d.
  • Two or more or all of the nucleic acids encoding the Cas proteins Cas5d, Cas6d, Cas7d, Cas3d and Cas10d, and Cas11d may be contained in a single vector or expression cassette, or in separate vectors or expression cassettes. It may be included.
  • nucleic acids incorporated into each vector or expression cassette there are no restrictions on the number of vectors or expression cassettes, and the types and combinations of nucleic acids incorporated into each vector or expression cassette.
  • these nucleic acid sequences may be expressed polycistronically, for example, a sequence encoding a self-cleaving peptide, or the like. They may be connected to each other via.
  • the order in which the Cas protein and two or more nucleic acids encoding Cas11d are linked may be any order.
  • the crRNA may be introduced into cells as RNA or as DNA encoding crRNA.
  • the crRNA may also be introduced into cells as a complex with the Cas protein and / or Cas11d or contacted with an isolated nucleic acid containing a target nucleotide sequence.
  • the crRNA or DNA encoding the crRNA may be contained, for example, in a vector, the RNA or DNA sequence being operably linked to regulatory sequences such as promoters and terminators.
  • the crRNA or the DNA encoding the crRNA may be contained in the same vector or expression cassette as the nucleic acid encoding the Cas protein and / or the nucleic acid encoding Cas11d, or may be contained in a separate vector or expression cassette. May be.
  • vector various vectors generally used in the art can be used, and the vector is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the cell to be introduced or the method of introduction.
  • plasmid vectors viral vectors, retroviral vectors, phages, phagemids, cosmids, artificial / minichromosomes, transposons and the like can be mentioned.
  • Examples of the regulatory sequence include promoters, enhancers, terminators, internal ribosome entry sites (IRES), polyadenylation signals, poly U sequences, translation enhancers and the like.
  • the regulatory sequence is not particularly limited and can be appropriately selected by those skilled in the art based on the host cell and the like.
  • examples of the promoter include CaMV35S promoter, 2xCaMV35S promoter, CaMV19S promoter, NOS promoter, etc. when the host is a plant cell, and SR ⁇ promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV promoter, etc. when the host is an animal cell. Examples thereof include RSV promoter, MoMuLV LTR promoter, HSV-TS promoter, human translation elongation factor gene promoter, CAG chimera synthesis promoter and the like.
  • the nuclear localization signal sequence is known in the art and can be appropriately selected depending on the species from which the cells into which the Cas protein, Cas11d and crRNA are introduced are derived. For example, a monopartite nuclear localization signal or a vipartite nuclear localization signal may be used.
  • a donor polynucleotide in addition to the Cas protein, Cas11d, and crRNA described above, a donor polynucleotide may be introduced into cells or contacted with an isolated nucleic acid containing the target nucleotide sequence.
  • the donor polynucleotide comprises at least one donor sequence containing the modification desired to be introduced at the target site.
  • the donor polynucleotide is a sequence that is highly homologous to the sequences upstream and downstream of the target sequence at both ends of the donor sequence (preferably, substantially the same sequence as the sequences upstream and downstream of the target sequence. ) May be included.
  • the donor polynucleotide may be single-stranded or double-stranded DNA. Donor polynucleotides can be appropriately designed by those skilled in the art based on techniques known in the art.
  • cleavage in the target nucleotide sequence can be repaired by non-homologous end binding (NHEJ).
  • NHEJ non-homologous end binding
  • deletions, insertions, or substitutions of at least one nucleotide, or combinations thereof, can occur during repair of the cleavage.
  • the sequence is modified at the target sequence site, thereby inducing frameshifts and immature stop codons, which can inactivate or knock out the expression of the gene encoded by the target sequence region.
  • the donor sequence of the donor polynucleotide is inserted into or inserted into the target sequence site by homologous recombinant repair (HDR) of the cleaved target nucleotide sequence.
  • HDR homologous recombinant repair
  • the introduction of the Cas protein, Cas11d, and crRNA into cells can be performed by various means known in the art.
  • the donor polynucleotide may also be introduced into the cell by various means known in the art.
  • transfection for example, calcium phosphate mediated transfection, electroporation, liposome transfection, etc., virus transduction, lipofection, gene gun, microinjection, agrobacterium method, agroinfiltration method, PEG-calcium method, etc. Can be mentioned.
  • the Cas protein, Cas11d, and crRNA, or a nucleic acid encoding these, or a complex such as the Cas protein may be introduced into the cell simultaneously or continuously.
  • the donor polynucleotide is also introduced into the cell simultaneously or continuously with the Cas protein, Cas11d, and crRNA, or a nucleic acid encoding them, or a complex such as the Cas protein. Just do it.
  • the cells Upon introduction of the Cas protein, Cas11d and crRNA, the cells are cultured under conditions suitable for cleavage at the target sequence site. The cells are then cultured under conditions suitable for cell proliferation and maintenance. The same applies when introducing a donor polynucleotide.
  • the culture conditions may be any culture conditions suitable for the species from which the cells to be introduced are derived, and can be appropriately determined by those skilled in the art based on, for example, known cell culture techniques.
  • the site on the target nucleotide sequence is cleaved by the TiD system introduced into the cell, and the target sequence is modified when the cleaved sequence is repaired.
  • the method for modifying a target sequence of the present invention can be used for modifying a target nucleotide sequence on the genome, in which the double-stranded DNA on the genome is cleaved and the target site is modified.
  • cells in which the target sequence has been modified are produced.
  • the cell having the modified target sequence is a plant cell, a plant having the modified target sequence can be produced from the cell.
  • the plants include plant bodies, tissues, organs (eg, roots, stems, leaves, etc.), reproductive materials (eg, seeds, tubers, etc.), progeny plants, cloned plants and the like.
  • a plant in which the target sequence has been modified can be produced.
  • Regeneration of plants from plant cells can be carried out by methods known in the art.
  • tissues, organs, reproductive materials, progeny plants, clones and the like having a modified target sequence can be obtained from the plant. It is also possible to produce an animal cell having a modified target sequence using the method for modifying a target sequence of the present invention, and to produce an animal having a modified target sequence using the animal cell.
  • the animals also include individual animals, tissues, organs, offspring, cloned animals and the like.
  • the animal is preferably a non-human animal.
  • a method for producing an animal from animal cells a method known in the art can be used.
  • animal cells for example, germ cells, fertilized eggs, or pluripotent stem cells are used.
  • the TiD system of the present invention may be introduced into a fertilized egg, and the fertilized egg may be transplanted into the uterus of a non-human animal to obtain pups to produce an individual animal having a modified target sequence.
  • tissues, organs, offspring, clones and the like having a modified target sequence can be obtained from the individual animal.
  • the target sequence modification method of the present invention not only the insertion and / or deletion of a short chain region of several bases to several tens of bases is introduced into the target sequence, but also a long chain of several kilobases to several tens of kilobases is introduced. Base deletions in the region can also be introduced.
  • the base of several kilos to several tens of kilos is not limited, but is, for example, 1000 to 90,000 bases long, preferably 2000 to 80,000 bases long, more preferably 2000 to 70,000 bases long, and even more preferably 2000 to 60,000 bases long. , 2000 to 50,000 base lengths, 2000 to 40,000 base lengths, 2000 to 30,000 base lengths, or 2000 to 20000 base lengths.
  • the target sequence modification method of the present invention it is possible to delete an entire locus by designing one guide RNA.
  • the target sequence modification method of the present invention it is possible to completely eliminate a specific exon even in the presence of a long intron such as an animal gene.
  • the target sequence modification method of the present invention it is possible to result in a base deletion in the upstream or downstream direction of the PAM sequence, or both upstream and downstream (that is, bidirectional) of the PAM sequence.
  • the target gene sequence or the transcriptional regulatory sequence of the target gene (for example, a transcription factor binding sequence) is used as the target nucleotide sequence.
  • a transcriptional regulatory sequence of the target gene is used as the target nucleotide sequence.
  • a sequence of at least a part of the transcriptional regulatory sequence of the target gene is selected as the target nucleotide sequence, and a Cas protein and a gene expression regulatory module (for example, a transcriptional activation module or transcription of a transcription factor) are selected.
  • the transcription of the target gene can be regulated (activated or inactivated), whereby the expression of the target gene can be regulated (amplified or suppressed).
  • the present invention provides a method for controlling target gene expression.
  • the target gene expression control method of the present invention as the target nucleotide sequence, at least a part of the sequence of the target gene or the transcriptional regulatory sequence is selected, and crRNA containing a sequence forming a base pair with the sequence is used.
  • the complex of Cas protein and crRNA binds to the target sequence to cause transcription of the target gene. Including being suppressed.
  • the target gene sequence is not cleaved, but the binding of the complex of Cas protein and crRNA to the target nucleotide sequence inhibits the function of the target gene region or the transcription or expression of the gene.
  • the method for controlling the expression of a target gene of the present invention comprises targeting and cleaving a nucleotide sequence in the method for modifying a target sequence of the present invention, thereby suppressing transcription of the target gene.
  • the target gene expression control method of the present invention may be performed in vitro, in vivo or ex vivo.
  • Target sequence targeting method of the present invention and “(7) The present invention. It is the same as described in "Method for modifying the target sequence of”.
  • the complex of the present invention contains the Cas protein, Cas11d, and crRNA described above.
  • the present invention specifically provides a complex comprising Cas5d, Cas6d, Cas7d, Cas10d, Cas11d, and crRNA, and a complex comprising Cas5d, Cas6d, Cas7d, Cas3d, Cas10d, Cas11d, and crRNA.
  • the present invention also provides a complex comprising a fusion protein comprising Cas5d, Cas6d, Cas7d, Cas10d and a functional polypeptide, and Cas11d, and crRNA.
  • a DNA molecule encoding the complex is also provided.
  • the complex of the present invention can be used in the target sequence targeting method, the target sequence modification method, and the target gene expression control method of the present invention.
  • a complex containing Cas5d, Cas6d, Cas7d, Cas3d and Cas10d, a complex containing Cas11d, and crRNA into a cell and allowing the complex to function within the cell, the complex is placed on the genome of the cell.
  • the target sequence can be modified.
  • a complex containing Cas5d, Cas6d, Cas7d and Cas10d, a complex containing Cas11d and crRNA is introduced into a cell, and the complex is made to function in the cell to target a target sequence in the cell. And can control the expression of the target gene.
  • the complex of the present invention can be produced in vitro, in vivo or ex vivo by a conventional method.
  • the nucleic acid encoding the Cas protein, the nucleic acid encoding Cas11d, and the crRNA or the DNA encoding the crRNA may be introduced into the cell to form a complex in the cell.
  • Examples of the complex of the present invention are, but are not limited to, Cas5d (SEQ ID NO: 2), Cas6d (SEQ ID NO: 3), Cas7d (SEQ ID NO: 4), Cas10d (SEQ ID NO: 5), and Cas11d (SEQ ID NO: 2) of Microcystis aeruginosa.
  • SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 6 and arc sisCr (SEQ ID NO: 2), Cas6d (SEQ ID NO: 3), Cas7d (SEQ ID NO: 4), Cas3d (SEQ ID NO: 1) and Cas10d (SEQ ID NO: 5), Cas11d (SEQ ID NO: 6), and GUUCCAAUUAAUCUUAAGCCCUAUUGGAUUGAAACNNNNNNNNNNNNNNAUC Is any nucleotide that constitutes a sequence complementary to the target nucleotide sequence), and examples thereof include a complex containing crRNA consisting of the sequence represented by.
  • the number of N may be changed in the range of 10 to 70, preferably 20 to 50, more preferably 25 to 45, still more preferably 30 to 40, and even more preferably 32 to 37. It may be changed within the range.
  • the present invention further comprises an expression vector comprising the above-mentioned Cas proteins Cas5d, Cas6d, Cas7d and the above-mentioned nucleic acid encoding Cas10d, the above-mentioned nucleic acid encoding the Cas11d, and the above-mentioned crRNA or the above-mentioned DNA encoding the crRNA. Also provided are an expression vector comprising the nucleic acids encoding the Cas proteins Cas3d, Cas5d, Cas6d, Cas7d and Cas10d, the nucleic acids encoding Cas11d, and the crRNA or DNA encoding the crRNA.
  • the vector of the present invention is described in the above-mentioned "(6) Targeting sequence targeting method of the present invention", “(7) Target sequence modification method of the present invention", and “(8) Target gene expression control method of the present invention”. It is a vector for introducing the above-mentioned Cas protein, Cas11d and crRNA into cells as described above. After introduction of the vector, the Cas protein, Cas11d and crRNA are expressed in the cells.
  • the vector of the present invention may also be a vector in which the target sequence contained in the above crRNA is replaced with an arbitrary sequence containing a restriction site. Such a vector is used by incorporating the desired target nucleotide sequence into the arbitrary sequence site.
  • the arbitrary sequence may be, for example, a spacer sequence at a CRISPR type ID locus or a part thereof.
  • each Cas protein, the nucleic acid encoding Cas11d, and the crRNA or the DNA encoding crRNA may be contained in the same vector, or may be separately contained in two or more vectors.
  • Kit of the present invention is a kit for use in the above-mentioned target sequence targeting method, target sequence modification method, and target gene expression control method of the present invention, and the Cas proteins Cas5d, Cas6d, and the above-mentioned Cas proteins Cas5d and Cas6d.
  • the nucleic acid encoding the protein of, Cas11d or the nucleic acid encoding Cas11d, and the above-mentioned crRNA or DNA encoding crRNA may be contained in a vector system or an expression cassette system.
  • the components of the kit of the present invention are as described in (2) to (7) above.
  • a method for improving the efficiency of targeting and modifying a target nucleotide sequence using a TiD system which comprises using Cas11d, and targeting and modifying a target nucleotide sequence using a TiD system, including Cas11d.
  • Compositions that improve efficiency are provided.
  • Cas11d is introduced into cells containing the target sequence.
  • the implementation and constituent components of the above method and composition are as described in (1) to (7) above.
  • M.I Gene clusters (Cas3d, Cas5d, Cas6d, Cas7d, Cas10d) derived from the TiD locus derived from aeruginosa were cloned and used.
  • M. Based on the amino acid sequence information (SEQ ID NOs: 1 to 5) of Cas3d, Cas5d, Cas6d, Cas7d, and Cas10d derived from aeruginosa, a DNA sequence encoding each Cas protein was artificially synthesized.
  • any one of artificial gene chemical synthesis, PCR method, restriction enzyme treatment, ligation, and Gibson Assembly method was used.
  • the Sanger method or the next-generation sequencing method was used to determine the base sequence.
  • the region of 483 bases 5'upstream from the stop codon of Cas10d was cloned and used.
  • PAM is GTC. AAVS1_GTC_70-107 (+): cctagtggcccccactgtggggtggggggagacat (SEQ ID NO: 20)
  • a DNA fragment containing a repeat-spacer-repeat sequence (SEQ ID NO: 22) was artificially synthesized and cloned under the human U6 promoter in pEX-A2J1 (Eurofins Genomics) to obtain pAEX-hU6 crRNA. Obtained.
  • pEX-A2J1 Eurofins Genomics
  • pAEX-hU6 crRNA Obtained.
  • two oligonucleotides containing the target sequence were annealed and cloned into a crRNA expression vector using Golden Gate cloning with the restriction enzyme BsaI (NEB).
  • NLUxxUC_Block1 contains the first 351 bp and multi-cloning site of the NanoLUC TM® gene (Promega) sequence. The XbaI site was added to the 5'end of the NanoLUC gene.
  • NLUxxUC_Block2 contains 465 bp at the 3'end of the NanoLUC gene. The XhoI site was added to the 3'end of the NanoLUC gene.
  • Each split-type NLUxxUC reporter was constructed by removing NLUxxUC_Block1 from the pCAG-NLUxxUC vector by XbaI and BamHI digestion and NLUxxUC_Block2 by XbaI and EcoRI digestion, respectively. Each digestion vector was assembled with a multicloning site to give pCAG-NLUxxUC_Block1 and pCAG-NLUxxUC_Block2.
  • HEK293T cells were seeded on 96-well plates (Corning) at a density of 2.0x10 4 cells / well. Cells were transfected using TurboFect Transfection Reagent (Thermo Fisher Scientific) according to the protocol recommended by the manufacturer. For each well of the 96-well plate, (1) the pGL4.53 vector (Promega, USA) encoding the Fluc gene, (2) the pCAG-nLUxxUC vector interrupted by the insertion of the target DNA fragment, and (3) the TiD component. A total of 200 ng of plasmid DNA containing the encoding plasmid DNA was used.
  • NanoLuc and Flucluciferase activities were measured 3 days after transfection using the Nano-Glo® Dual-Luciferase® Reporter Assay System (Promega). Firefly (Fluc) activity was used as an internal control. The NanoLuc / Fluc ratio was calculated for each sample and compared to the NanoLuc / Fluc ratio of the control sample transfected with untargeted gRNA. Relative NanoLuc / Fluc activity was used to assess gRNA activity. The experiment was independently repeated 3 times with similar results.
  • the first PCR reaction was performed using KOD ONE Master Mix (TOYOBO, Osaka, Japan) under the following conditions. 35 cycles of 10 seconds 98 ° C, 5 seconds 60 ° C and 50 seconds (amplicon: 15-20 kb) or 150 seconds (amplicon: 10-15 kb) or 200 seconds (amplicon: ⁇ 10 kb) 68 ° C.
  • the PCR product was then diluted 100-10,000 times and used as a template for nested PCR. Nested PCR was also performed under the same conditions as above. PCR products were separated by electrophoresis on a 1% agarose gel and visualized by staining with GelRed® Nucleic Acid Gel Stein (Biotium).
  • Nested PCR products were pooled and purified using Monofas® DNA purification Kit I (GL Sciences, Japan). A purified mixture of PCR products was cloned into a pMD20-T vector using a Mighty TA-cloning Kit (Takara Bio, Japan). Clones were picked up and sequenced by Sanger using M13 Uni and M13 RV primers. The results of the Sanger sequencing were analyzed using the BLATN search and the ClustalW program to identify DNA deletions.
  • Example 1 Identification of the Cas11e-like sequence (Cas11d) in the Cas10d sequence M.
  • Cas11e sequence of CRISPR type I-E Escherichia coli, Acetobacter pasteurianus, Acidimicrobium ferrooxidans, Amycolatopsis mediterranei, Bifidobacterium animalis, Cellulomonas fimi, Coriobacterium glomerans, Cyanothece (Gloeothece proteiniformis) PCC7424, Desulfococcus oleovorans, Erwinia amylovora, Francia alni, Geobacter sulfurreducens, Kitasatospora cate was found to be preserved in several places (Fig.
  • Example 2 Analysis of the effect of Cas10d C-ter (Cas11d) expression on the genome editing activity in cells
  • Cas10d C-ter (Cas11d) expression was cloned to construct an animal cell expression vector, which was used as a Cas11d expression vector.
  • the Cas11d expression vector was simultaneously introduced into HEK293 cells together with the Cas3d, Cas5d, Cas6d, Cas7d, Cas10d and gRNA expression vectors, and the genome editing activity was analyzed by the Luc reporter assay.
  • NanoLuc luciferase containing a human AAVS1 gene fragment containing a 300 bp homology arm separated by a stop codon and a TiD target site was used as a recombinant reporter.
  • Each single Cas expression vector, TiD crRNA expression vector, and LUC reporter vector into which the target sequence was introduced were co-transfected into HEK293T cells, and endonuclease cleavage was detected by luminescence 72 hours after transfection.
  • Example 3 Analysis of Human Genome Editing by Expression of Cas10d C-ter (Cas11d) It was analyzed what kind of mutation is induced in the target on the human genome as the expression effect of Cas11d.
  • the Cas11d expression vector was transfected into HEK293T cells with a gRNA expression vector incorporating the targeted gRNA AAVS GTC_70-107 (35b) of the human AAVS gene used in the Luc reporter assay and each single Cas expression vector.
  • a DNA fragment was PCR amplified from the total DNA of TiD vector-introduced HEK293T cells using a primer set that amplifies 10-19 kb including the vicinity of the AAVS target site, and the obtained PCR product was cloned and sequenced by the Sanger method. ..
  • F1 SEQ ID NO: 24: 5'-CTTAGCATATGTCCTCAAGATACATCTAC-3'
  • R1 SEQ ID NO: 25: 5'-GAATATGTAACCATTATTATTCATAGGCATTG-3'
  • primers F2 SEQ ID NO: 26: 5'-GGGTCCAAGGGAAAGGAGT
  • R2 SEQ ID NO: 27: 5'-ATAAACACAAACTCATAAACAACATACATC-3'
  • Lane 1 is a PCR product using DNA derived from wild-type HEK293 cells that does not express TiD.
  • Lanes 2 and 3 are the result of an experiment in which a TiD containing no Cas11d expression vector was introduced, and lane 2 corresponds to a non-specific sequence (SEQ ID NO: 28: 5'-AAATAAAATAGCGGGTCGGGTGCCCCGAATTTCACT-3') instead of the target sequence.
  • Lane 3 is the result of using a gRNA containing a sequence and using a gRNA containing a sequence corresponding to the target sequence AAVS GTC_70-107 (35b).
  • Lanes 4 and 5 are the results of an experiment in which a TiD containing a Cas11d expression vector was introduced, lane 4 uses a gRNA containing a sequence corresponding to a non-specific sequence instead of the target sequence, and lane 5 uses AAVS GTC_70-. It is a result using a gRNA containing a sequence corresponding to 107 (35b).
  • SEQ ID NO: 1 Microcystis aeruginosa Cas3d amino acid sequence SEQ ID NO: 2; Microcystis aeruginosa Cas5d amino acid sequence SEQ ID NO: 3; Microcystis aeruginosa Cas6d amino acid sequence SEQ ID NO: 4; Microcystis aeruginosa Cas7d amino acid sequence SEQ ID NO: 5; Microcystis aeruginosa Cas10d amino acid sequence SEQ ID NO: 6; Microcystis aeruginosa Cas11d amino acid sequence SEQ ID NO: 7; TiDcrRNA containing repeat (37b) and spacer (35b of N).
  • N is any nucleotides a sequence that forms base pairs with a target nucleotide sequence SEQ ID NO: 8; Anabaena cylindrica Cas11d amino acid sequence SEQ ID NO: 9; Calothrix PCC6303 (Calothrix parietina) Cas11d amino acid sequence SEQ ID NO: 10; Crinalium epipsammum Cas11d amino acid sequence SEQ ID NO: 11; Cyanothece PCC7424 (Gloeothece citriformis) Cas11d amino acid sequence SEQ ID NO: 12; Gloeobacter kilaueensis Cas11d amino acid sequence SEQ ID NO: 13; Gloeocapsa sp.
  • PCC6803 Cas11d amino acid sequence SEQ ID NO: 20; Target sequence (35b) SEQ ID NO: 21; Monopartite nuclear localizing signal (NLS) amino acid sequence SEQ ID NO: 22; DNA fragment for pre-mature crRNA SEQ ID NO: 23; Target sequence (30b) SEQ ID NO: 24; Primer F1 SEQ ID NO: 25; Primer R1 SEQ ID NO: 26; Primer F2 SEQ ID NO: 27; Primer R2 SEQ ID NO: 28; Non-specific sequence SEQ ID NO: 29; Escherichia coli Cas11e amino acid sequence SEQ ID NO: 30; Acetobacter pasteurianus Cas11e amino acid sequence SEQ ID NO: 31; Acidimicrobium ferrooxidans Cas11e amino acid sequence SEQ ID NO: 32; Amycolatopsis mediterranei Cas11e amino acid sequence SEQ ID NO: 33; Bifidobacterium animalis Cas11e amino acid sequence SEQ ID NO: 34; Cellulomona

Landscapes

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Abstract

標的ヌクレオチド配列を標的化する方法であって、細胞中に、（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤのＣａｓタンパク質　Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含むポリペプチド、またはこれらのタンパク質およびポリペプチドをコードする核酸、（ｉｉ）Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まず、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列を含むポリペプチド、または該ポリペプチドをコードする核酸、および（ｉｉｉ）前記標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡ、または該ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡを導入することを含む方法等が提供される。

Description

ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ｄシステムを利用した標的ヌクレオチド配列改変技術
　本発明は、ＣＲＩＳＰＲ（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）タイプＩ－Ｄシステムを利用した、標的ヌクレオチド配列を標的化する方法、標的ヌクレオチド配列を特異的に改変する方法、標的遺伝子の発現を抑制する方法、および該方法に用いられるＣａｓ（CRISPR-associated（CRISPR関連））タンパク質およびｃｒＲＮＡ（CRISPR RNA）を含む複合体ならびにキット等に関する。
　ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、ウイルス、プラスミドおよびその他の外来遺伝子エレメントから細菌および古細菌を保護する、細菌および古細菌に見られる獲得免疫システムである。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、該システムを構成しているＣａｓタンパク質および分子メカニズムの違いによって、２つのクラス、６つの異なるタイプ（Ｉ～ＶＩ）、および少なくとも３４種類のサブタイプに分類される。
　タイプＩおよびＩＩシステムのメカニズムでは、ｃｒＲＮＡとＣａｓエフェクタータンパク質との複合体が、外来ＤＮＡ中のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる短い（典型的には３～５塩基長の）配列エレメントを認識する。タイプＩまたはＩＩ　ｃｒＲＮＡとＣａｓエフェクタータンパク質との複合体は、ＰＡＭ認識後、局所的にＤＮＡ対合を崩壊してＲ－ループ構造を形成し、ｃｒＲＮＡガイドエレメントが相補的な標的鎖と塩基対を形成して非標的ＤＮＡ鎖と置き換わる。該ｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ複合体による二本鎖ＤＮＡ標的の結合および巻き戻しが、Ｃａｓ３、Ｃａｓ９およびＣａｓ１２ヌクレアーゼなどのタイプ特異的ＣａｓエフェクターヌクレアーゼによるＤＮＡ切断および分解に必要とされる。
　ＣＲＩＳＰＲタイプＩには、種々のサブタイプが存在する。クラス１システムには、Ｃａｓｃａｄｅ（ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ－ｃｏｍｐｌｅｘ　ｆｏｒ　ａｎｔｉｖｉｒａｌ　ｄｅｆｅｎｓｅ）と呼ばれる、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７およびＣａｓ８などの標的認識モジュールと、Ｃａｓ３などのＤＮＡ切断モジュールが存在する（非特許文献１、非特許文献２）。ゲノム編集技術において、クラス１　ＣＲＩＳＰＲシステムは、クラス２よりも一般的ではないが、ゲノム編集ツールとして、例えば長い領域のゲノム欠失および長いｇＲＮＡ配列を包含する多様な変異プロフィールなど、Ｃａｓ９およびＣｐｆ１と比べていくつかの利点を有する可能性が示唆された（非特許文献１、特許文献１）。今までに研究されたクラス１　ＣＲＩＳＰＲ　ｔｙｐｅ　Ｉ－Ｅシステムでは、２－３００ｂから１００ｋｂの塩基欠失が主にＰＡＭ配列の５’上流側に生じることが報告された（非特許文献３）。
　今までに研究されたクラス１　ＣＲＩＳＰＲ　ｔｙｐｅ　Ｉ－Ｅシステムは、６つのＣａｓタンパク質（Ｃａｓ３ｅ、Ｃａｓ５ｅ、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ７ｅ、Ｃａｓ８ｅおよびＣａｓ１１ｅ）と標的化を行うｃｒＲＮＡから構成される。ここでＣａｓ８ｅおよびＣａｓ１１ｅはそれぞれラージサブユニット（large subunit）およびスモールサブユニット（small subunit）と呼ばれ、Ｃａｓタンパク質複合体と標的ＤＮＡとの結合を安定に保持するサポートタンパク質の機能を持っていると考えられている（非特許文献１）。
　一方、発明者らは以前に、ＣＲＩＳＰＲクラス１タイプＩのサブタイプ：ＣＲＩＳＰＲ　ｔｙｐｅ　Ｉ－Ｄ（以下、「ＴｉＤ」という）システムをコードするＣＲＩＳＰＲゲノム遺伝子座を同定し、該システムがＣａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄの５つのＣａｓタンパク質および標的化を行うｃｒＲＮＡによってゲノム編集が実現できることを見出した（特許文献１、特許文献２）。ここで、ＴｉＤ遺伝子座には、ＣＲＩＳＰＲ　ｔｙｐｅ　Ｉ－ＥシステムのスモールサブユニットであるＣａｓ１１ｅに相当する遺伝子は見出されなかった。
　近年、ＭｃＢｒｉｄｅらは、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ　ｓｐ．　ＰＣＣ６８０３株のＴｉＤ遺伝子座の解析を行い、Ｃａｓ１０ｄ遺伝子座の遺伝子内部にリボソーム結合部位（ＲＢＳ）および翻訳開始コドンが存在し、一つのストップコドンを共通にして、Ｃａｓ１０ｄ遺伝子座から２つのタンパク質、Ｃａｓ１０ｄおよびＣａｓ１１ｄが翻訳されていること示した（非特許文献４）。しかしながら、現在に至るまで、Ｃａｓ１１ｄが標的配列改変技術に果たす機能は見出されていない。
国際公開第２０１９／０３９４１７ 国際公開第２０２０／１８４７２３
Ｍａｋａｒｏｖａ　Ｋ．Ｓ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔ．　Ｒｅｖ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，　１３，　７２２－７３６（２０１５）図 Ｍａｋａｒｏｖａ，　Ｋ．Ｓ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｅｌｌ，１６８，９４６-９４６（２０１７） Ｄｏｌａｎ，　Ａ．Ｅ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ　７４，　９３６－９５０　（２０１９） ＭｃＢｒｉｄｅ，　Ｔ．Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　　ｂｉｏＲｘｉｖ，　ｄｏｉ：　ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２０．０４．１８．０４５６８２（２０２０）
　本発明は、ＴｉＤによる標的配列標的化および改変効率を向上させることを目的とした。
　発明者らは、鋭意研究の結果、驚くべきことに、これまで報告されていたＴｉＤシステムを構成する５種のＣａｓタンパク質の発現に加え、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端領域を含む部分アミノ酸配列を含むポリペプチドを別途発現させることによって、標的ヌクレオチド配列を高効率で改変できることを見出した。かくして本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は以下の態様を提供する。
［１］標的ヌクレオチド配列を標的化する方法であって、細胞中に、
　（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤのＣａｓタンパク質　Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含むポリペプチド、またはこれらのタンパク質およびポリペプチドをコードする核酸、
　（ｉｉ）Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まず、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列を含むポリペプチド、または該ポリペプチドをコードする核酸、および
　（ｉｉｉ）前記標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡ、または該ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ
を導入することを含む方法。
［２］標的ヌクレオチド配列を改変する方法であって、細胞中に、
　（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤのＣａｓタンパク質　Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含むポリペプチド、またはこれらのタンパク質およびポリペプチドをコードする核酸、
　（ｉｉ）Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まず、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列を含むポリペプチド、または該ポリペプチドをコードする核酸、および
　（ｉｉｉ）前記標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡ、または該ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ
を導入することを含む方法。
［３］標的遺伝子の転写を制御する方法であって、前記標的ヌクレオチド配列が標的遺伝子の少なくとも一部のヌクレオチド配列である、上記［１］または［２］記載の方法。
［４］前記Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列が１００～４００アミノ酸からなる配列である、上記［１］～［３］のいずれか１項記載の方法。
［５］前記細胞が真核細胞である、上記［１］～［４］のいずれか１項記載の方法。
［６］改変が塩基の欠失、挿入、又は置換である、上記［２］～［５］のいずれか１項記載の方法。
［７］（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤのＣａｓタンパク質　Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含むポリペプチド、
　（ｉｉ）Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まず、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列を含むポリペプチド、および
　（ｉｉｉ）標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡ
を含む複合体。
［８］Ｃａｓ３ｄをさらに含む、上記［７］記載の複合体。
［９］前記Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列が１００～４００アミノ酸からなる配列である、上記［７］または［８］記載の複合体。
［１０］（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤのＣａｓタンパク質　Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含むポリペプチドをコードする核酸、
　（ｉｉ）Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まず、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列を含むポリペプチドをコードする核酸、および
　（ｉｉｉ）標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡまたは該ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ
を含むベクター。
［１１］Ｃａｓ３ｄをコードする核酸をさらに含む、上記［１０］記載のベクター。
［１２］前記（ｉ）～（ｉｉｉ）の核酸、または前記（ｉ）～（ｉｉｉ）の核酸およびＣａｓ３ｄをコードする核酸が１つまたは２以上のベクターに含まれる、上記［１０］または［１１］記載の発現ベクター。
［１３］前記Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列が１００～４００アミノ酸からなる配列である、上記［１１］または［１２］記載のベクター。
［１４］上記［７］～［９］のいずれか１項記載の複合体をコードするＤＮＡ分子。
［１５］標的ヌクレオチド配列を標的化するためのキットであって、
　（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤのＣａｓタンパク質　Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含むポリペプチド、またはこれらのタンパク質およびポリペプチドをコードする核酸、
　（ｉｉ）Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まず、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列を含むポリペプチド、または該ポリペプチドをコードする核酸、および
　（ｉｉｉ）前記標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡ、または該ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ
を含むキット。
［１６］標的ヌクレオチド配列を改変するためのキットであって、
　（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤのＣａｓタンパク質　Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含むポリペプチド、またはこれらのタンパク質およびポリペプチドをコードする核酸、
　（ｉｉ）Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まず、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列を含むポリペプチド、または該ポリペプチドをコードする核酸、および
　（ｉｉｉ）前記標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡ、または該ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ
をキット。
［１７］前記Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列が１００～４００アミノ酸からなる配列である、上記［１５］または［１６］記載のキット。
［１８］ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ｄシステムを用いる標的ヌクレオチド配列の標的化において標的化効率を改善する方法であって、Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まず、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列を含むポリペプチド、または該ポリペプチドをコードする核酸を用いることを含む方法。
［１９］ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ｄシステムを用いる標的ヌクレオチド配列の改変において改変効率を改善する方法であって、Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まず、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列を含むポリペプチド、または該ポリペプチドをコードする核酸を用いることを含む方法。
［２０］ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ｄシステムを用いる標的ヌクレオチド配列の標的化において標的化効率を改善するための組成物であって、Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まず、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列を含むポリペプチド、または該ポリペプチドをコードする核酸を含む組成物。
［２１］ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ｄシステムを用いる標的ヌクレオチド配列の改変において改変効率を改善するための組成物であって、Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まず、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列を含むポリペプチド、または該ポリペプチドをコードする核酸を含む組成物。
［２２］細胞中に、
　（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤのＣａｓタンパク質　Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含むポリペプチド、またはこれらのタンパク質およびポリペプチドをコードする核酸、
　（ｉｉ）Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まず、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列を含むポリペプチド、または該ポリペプチドをコードする核酸、および
　（ｉｉｉ）標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡ、または該ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ
を導入することを含む、標的ヌクレオチド配列が改変された細胞の製造方法。
［２３］上記［２２］に記載の方法によって標的ヌクレオチド配列が改変された植物細胞を製造することを含む、標的ヌクレオチド配列が改変された植物の製造方法。
［２４］上記［２２］に記載の方法によって標的ヌクレオチド配列が改変された非ヒト動物細胞を製造することを含む、標的ヌクレオチド配列が改変された非ヒト動物の製造方法。
［２５］標的ヌクレオチド配列を標的化する方法であって、標的ヌクレオチド配列を含む単離核酸に、
　（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤのＣａｓタンパク質　Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含むポリペプチド、
　（ｉｉ）Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まず、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列を含むポリペプチド、および
　（ｉｉｉ）前記標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡ、または該ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ
を接触させることを含む方法。
［２６］標的ヌクレオチド配列を改変する方法であって、標的ヌクレオチド配列を含む単離核酸に、
　（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤのＣａｓタンパク質　Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含むポリペプチド、
　（ｉｉ）Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まず、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列を含むポリペプチド、および
　（ｉｉｉ）前記標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡ、または該ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ
を接触させことを含む方法。
　本発明によれば、特定のＤＮＡを標的化するように操作されたＴｉＤ　ｃｒＲＮＡを含むＴｉＤシステムを用いることにより、細胞、好ましくは動物および植物細胞において効率的に部位特異的変異を誘導することができる。驚くべきことに、本発明によれば、ＴｉＤシステムのＣａｓエフェクタータンパク質であるＣａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄに加えて、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列（以下、「Ｃａｓ１０ｄ　Ｃ－ｔｅｒ」ともいう）を発現させることで、ＴｉＤシステムによる標的配列の標的化および改変の効率を数倍上昇させることができる。さらに、本発明の技術を用いれば、標的配列近傍の変異様式として、より長い欠失を生じさせる。
各種ｔｙｐｅ　Ｉ－Ｄ　Ｃａｓ１０ｄ　Ｃ－ｔｅｒをＣａｓ１１ｅとアラインメント解析により比較した。 各種ｔｙｐｅ　Ｉ－Ｄ　Ｃａｓ１０ｄ　Ｃ－ｔｅｒをＣａｓ１１ｅとアラインメント解析により比較した（図１－１のつづき）。 各種ｔｙｐｅ　Ｉ－Ｄ　Ｃａｓ１０ｄ　Ｃ－ｔｅｒをＣａｓ１１ｅとアラインメント解析により比較した（図１－２のつづき）。 動物細胞内におけるＣａｓ１０ｄ　Ｃ－ｔｅｒタンパク質過剰発現によるゲノム編集活性に及ぼす効果を示す。 ＣＲＩＳＰＲ　ＴｉＤによって誘導されるＡＡＶＳ遺伝子における長鎖領域欠失変異の検出。Ａ）ヒトＡＡＶＳ遺伝子構造、ｇＲＮＡ位置（白抜き三角）、および変異を増幅するための種々のプライマーセット（黒矢印）を示した。Ｂ）アガロースゲル上で分離したＰＣＲ増幅フラグメントを示した。黒三角は長鎖欠失由来のＰＣＲ産物を示す。Ｃ）Ｃａｓ１１ｄ発現ベクターを含むＴｉＤによって誘導された長鎖領域欠失パターン。図中の黒バーは、標的配列から５’上流領域の欠失を、灰色バーは標的配列から３’下流領域の欠失をそれぞれ示す。バーの左側の数値は総塩基欠失長を示す。Ｄ）Ｃａｓ１１ｄ発現ベクターを含まないＴｉＤによって誘導された長鎖領域欠失パターン。図中の黒バーは、標的配列から５’上流領域の欠失を、灰色バーは標的配列から３’下流領域の欠失をそれぞれ示す。バーの左側の数値は総塩基欠失長を示す。
　ＴｉＤシステムは、具体的には、ＴｉＤ　Ｃａｓタンパク質のうち、Ｃａｓエフェクタータンパク質として、Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄおよびＣａｓ１０ｄと、ＴｉＤ　ｃｒＲＮＡとを含む。ＴｉＤシステムにおいて、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄおよびＣａｓ７ｄは標的認識モジュール（Ｃａｓｃａｄｅ）を構成し、Ｃａｓ３ｄおよびＣａｓ１０ｄはポリヌクレオチド切断モジュールを構成することが知られていた（特許文献１）。さらに、発明者らの以前の研究により、切断モジュールの構成要素のうちＣａｓ１０ｄがポリヌクレオチド分解作用（ヌクレアーゼ活性）を有し、Ｃａｓ３ｄはヌクレアーゼ活性を有しないことが明らかにされた。すなわち、ＴｉＤシステムでは、ＴｉＤ　ｃｒＲＮＡと標的認識モジュールとが標的ヌクレオチド配列を標的化してポリヌクレオチド切断モジュールを該標的ヌクレオチド配列付近に導き、Ｃａｓ１０ｄの作用により該標的ヌクレオチド配列が切断される。ＴｉＤシステムにおいて、ＴｉＤ　ｃｒＲＮＡは、標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列（例えば、標的ヌクレオチド配列に相補的な配列）を含む。
　本発明は、ＴｉＤシステムを利用した標的ヌクレオチド配列を標的化する方法（以下、「本発明の標的配列ターゲティング方法」ともいう）、標的ヌクレオチド配列を改変する方法（以下、「本発明の標的配列改変方法」ともいう）、および標的遺伝子の発現を制御する方法（以下、「本発明の標的遺伝子発現制御方法」ともいう）を提供する。さらに、本発明は、これらの方法に使用される、ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ｄ関連Ｃａｓタンパク質およびｃｒＲＮＡを含む複合体（以下、「本発明の複合体」ともいう）、および該複合体をコードする核酸分子を含むベクター（以下、「本発明のベクター」ともいう）およびキット（以下、「本発明のキット」ともいう）を提供する。
　とりわけ本発明は、ＴｉＤシステムにおける上記Ｃａｓタンパク質の他に、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列を含むポリペプチドを用いることを特徴とする。興味深いことに、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端側配列にはＣａｓ１１ｅと共通のα－ヘリックス領域が保存されていることが分かった（実施例１）。Ｃａｓ１０ｄのＣ末端がＣａｓ１１ｅの機能を果たしていると考えられ、それ故、ＴｉＤでは、ＣＲＩＳＰＲ　ｔｙｐｅ　Ｉ－ＥのようにＣａｓ１１ｅの発現は必要とされないと考えられた。しかしながら、驚くべきことに、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列を含むポリペプチドを発現させることにより、ＴｉＤシステムの効果が改善されることが分かった。したがって、本発明はさらに、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列を含むポリペプチドを用いることにより、ＴｉＤシステムを利用した標的ヌクレオチド配列の標的化および改変の効率を改善する方法、ならびにＣａｓ１０ｄのＣ末端部分配列を含むポリペプチドを含む、ＴｉＤシステムを利用した標的ヌクレオチド配列の標的化および改変の効率を改善する組成物を提供する。
（１）細胞
　本発明において、細胞は、原核細胞または真核細胞のいずれの細胞であってもよく、特に限定されない。例えば、細菌、古細菌、真菌類（例えば、糸状菌、酵母等）、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞（例えば、ヒト細胞、非ヒト動物細胞、哺乳類動物細胞、非哺乳動物脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞等）が挙げられる。好ましくは、真核細胞が使用される。本明細書において使用される場合、「細胞」とは、生体から単離された細胞、生体内（例えば、動物体または植物の体内）に存在している細胞、生体（例えば、動物体、または植物体）、または培養細胞のいずれも包含する。本発明の方法は、生体から単離された細胞、生体内に存在する細胞、または生体のいずれの器官および組織に由来する細胞に適用してもよい。例えば、ヒト以外の動物の体内に存在する細胞またはヒト以外動物体に適用してもよい。例えば、動物細胞には、限定するものではないが、生殖細胞、受精卵、胚細胞、幹細胞（例えば、ｉＰＳ細胞、胚性幹細胞、体性幹細胞等も含む）、体細胞などが包含される。例えば、植物細胞には、限定するものではないが、生殖細胞、受精卵、胚細胞、体細胞などが包含され、プロトプラストを用いてもよい。
（２）Ｃａｓエフェクタータンパク質および該タンパク質をコードする核酸
　本発明で使用されるＣａｓエフェクタータンパク質は、ＴｉＤのＣａｓタンパク質のうち、Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄである。Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄは、いずれの細菌または古細菌由来のものであってもよく、例えば、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ　ａｒａｂａｔｉｃｕｍ、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ　ｄｅｇｅｎｓｉｉ、Ａｎａｂａｅｎａ　ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａ、Ａｎａｂａｅｎａ　ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ　ｌａｃｔｏａｃｅｔｉｃｕｓ、Ｃａｌｄｉｌｉｎｅａ　ａｅｒｏｐｈｉｌａ、Ｃｒｉｎａｌｉｕｍ　ｅｐｉｐｓａｍｍｕｍ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ　Ｓｐ．、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｅｒｍｕｍ　ｓｔａｇｎａｌｅ、Ｈａｌｏｑｕａｄｒａｔｕｍ　ｗａｌｓｂｙｉ、Ｈａｌｏｒｕｂｒｕｍ　ｌａｃｕｓｐｒｏｆｕｎｄｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｖｕｌｃａｎｉｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ　ｈｕｎｇａｔｅｉ、Ｎａｔｒｉａｌｂａ　ａｓｉａｔｉｃａ、Ｎａｔｒｏｎｏｍｏｎａｓ　ｐｈａｒａｏｎｉｓ、Ｎｏｓｔｏｃ　ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ、Ｐｈｏｒｍｉｄｅｓｍｉｓ　ｐｒｉｅｓｔｌｅｙｉ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ　ａｃｕｍｉｎａｔａ、Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ　ｔｏｒｒｉｄｕｓ、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ、Ｓｔａｎｉｅｒｉａ　ｃｙａｎｏｓｐｈａｅｒａ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ　ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ　ｉｓｌａｎｄｉｃｕｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ　Ｓｐ．、Ｔｈｅｒｍａｃｅｔｏｇｅｎｉｕｍ　ｐｈａｅｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｌｕｍ　ｐｅｎｄｅｎｓ、Ｃａｌｏｔｈｒｉｘ　ｐａｒｉｅｔｉｎａ、Ｇｌｏｅｏｔｈｅｃｅ　ｃｉｔｒｉｆｏｒｍｉｓ、Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ　ｋｉｌａｕｅｅｎｓｉｓ、Ｇｌｏｅｏｃａｐｓａ　ｓｐ．、Ｈａｌｏｔｈｅｃｅ　ｓｐ．、Ｎｏｓｔｏｃ　ｓｐ．、Ｒｉｖｕｌａｒｉａ　ｓｐ．などの菌株由来のものであってもよい。本発明において、Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄは、２種以上の菌種由来のものであってもよく、または同じ菌種由来のものであってもよい。好ましくは同じ菌種由来のものが用いられる。上記Ｃａｓタンパク質のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列情報は、例えば、ＮＣＢＩ　ＧｅｎＢａｎｋ等の公開されたデータベースから入手可能である。また、メタゲノム解析などにより得られた微生物ゲノムデータからＢＬＡＳＴプログラムを利用することで、新規の微生物種からの配列取得も可能である。
　上記Ｃａｓタンパク質は、既知の方法によって得ることができ、例えば、アミノ酸配列情報を基に化学合成するか、またはＣａｓタンパク質をコードする核酸を適当なベクター等を介して細胞中に導入し、該細胞中で産生させてもよい。上記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、既知の方法によって得ることができ、例えば、アミノ酸配列情報を基に、該核酸を導入する宿主細胞における翻訳に最適化されたコドンを選択し、化学合成等により構築してもよい。宿主細胞において使用頻度の高いコドンを使用することにより、タンパク質の発現量の増加させることができる。該核酸としては、例えば、ｍＲＮＡ等のＲＮＡ、またはＤＮＡが挙げられる。
　Ｃａｓ１０ｄは、Ｎ末端領域にＨＤ（ヒスチジン－アスパラギン酸）ドメインを有し、該ドメインがＤＮＡ切断において機能することが知られている（特許文献２）。また、本発明において、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端側には複数のα－ヘリックス領域が存在することが見出された（実施例１）。したがって、本発明においてＣａｓ１０ｄは、少なくともＮ末端側のＨＤドメインを含むポリペプチドであればよい。例えば、限定するものではないが、Ｃａｓ１０ｄは、全長Ｃａｓ１０ｄタンパク質、Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインからＣ末端側の１以上のα－ヘリックス領域を含むポリペプチド、またはＣａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含み、かつＣ末端側の１以上のα－ヘリックス領域を欠くポリペプチドであってもよい。Ｃａｓ１０ｄは、Ｃ末端側の全てのα－ヘリックス領域を欠いていてもよい。本明細書において、「Ｃａｓ１０ｄ」なる語は、全長Ｃａｓ１０ｄポリペプチド、および上記のようなＮ末端側のＨＤドメインを含むＣａｓ１０ｄフラグメントのいずれも包含する。
　Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄの各Ｃａｓタンパク質またはそれらをコードする核酸は、上記Ｃａｓタンパク質とｃｒＲＮＡとの複合体が標的配列を標的化または改変するかぎりにおいて、１以上の、例えば１～数個のアミノ酸変異、または１以上の、例えば１～数個のヌクレオチド変異を有していてもよい。本明細書において「数個」とは、２～１０個程度をいい、例えば３、４、５、６、７、８または９個をいう。本明細書において、「変異」とは、天然配列と比べたアミノ酸またはヌクレオチドの欠失、置換、挿入または付加を包含する。
　例えば、上記Ｃａｓタンパク質の例として、限定するものではないが、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（以下、Ｍ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａという）由来のＣａｓ３ｄ（配列番号１）、Ｃａｓ５ｄ（配列番号２）、Ｃａｓ６ｄ（配列番号３）、Ｃａｓ７ｄ（配列番号４）、およびＣａｓ１０ｄ（配列番号５）が挙げられる。したがって、本発明に用いられるＣａｓ３ｄの例として、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質、Ｃａｓ５ｄの例として、配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質、Ｃａｓ６ｄの例として、配列番号３で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質、Ｃａｓ７ｄの例として、配列番号４で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質、およびＣａｓ１０ｄの例として、配列番号５で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質が挙げられる。好ましくは、本発明に用いられるＣａｓ３ｄの例として、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、Ｃａｓ５ｄの例として、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、Ｃａｓ６ｄの例として、配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、Ｃａｓ７ｄの例として、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、およびＣａｓ１０ｄの例として、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。
　また、本発明に用いられる上記Ｃａｓタンパク質のさらなる例として、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５に対してそれぞれ、３０％以上、４０％以上、６０％以上、５０％以上、７０％以上、または８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、またはさらに好ましくは９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質が挙げられる。好ましくは、本発明に用いられる上記Ｃａｓタンパク質のさらなる例として、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５に対してそれぞれ、３０％以上、４０％以上、６０％以上、５０％以上、７０％以上、または８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、またはさらに好ましくは９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。上記のいずれかのＣａｓタンパク質は、上記の他のＣａｓタンパク質およびｃｒＲＮＡと複合体を形成した場合に標的配列を標的化または改変する能力を有するものである。
　ＴｉＤシステムを導入する細胞が真核細胞である場合、好ましくは、Ｃａｓタンパク質の末端に核移行シグナルを付加してもよい。核移行シグナルは、当該分野で公知であり、導入対象の細胞が由来する生物種に応じて適宜選択することができる。また、核移行シグナルは、２個以上をタンデムに並べてＣａｓタンパク質に付加してもよい。また、核移行シグナルは、Ｃａｓタンパク質のＮ末端側またはＣ末端側のいずれか、あるいは両方に付加されていてもよい。
　本発明に用いられるＣａｓ３ｄをコードする核酸の例として、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、Ｃａｓ５ｄをコードする核酸の例として、配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、Ｃａｓ６ｄをコードする核酸の例として、配列番号３で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、Ｃａｓ７ｄをコードする核酸の例として、配列番号４で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、およびＣａｓ１０ｄをコードする核酸の例として、配列番号５で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸が挙げられる。好ましくは、本発明に用いられるＣａｓ３ｄをコードする核酸の例として、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、Ｃａｓ５ｄをコードする核酸の例として、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、Ｃａｓ６ｄをコードする核酸の例として、配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、Ｃａｓ７ｄをコードする核酸の例として、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、およびＣａｓ１０ｄをコードする核酸の例として、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸が挙げられる。さらに好ましくは、本発明に用いられるＣａｓ３ｄをコードする核酸の例として、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列からなる核酸、Ｃａｓ５ｄをコードする核酸の例として、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列からなる核酸、Ｃａｓ６ｄをコードする核酸の例として、配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列からなる核酸、Ｃａｓ７ｄをコードする核酸の例として、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列からなる核酸、およびＣａｓ１０ｄをコードする核酸の例として、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列からなる核酸が挙げられる。
　また、本発明に用いられる上記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸のさらなる例として、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５に対してそれぞれ、３０％以上、４０％以上、６０％以上、５０％以上、７０％以上、または８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、またはさらに好ましくは９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸が挙げられる。好ましくは、本発明に用いられる上記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸のさらなる例として、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５に対してそれぞれ、３０％以上、４０％以上、６０％以上、５０％以上、７０％以上、または８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、またはさらに好ましくは９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸が挙げられる。さらに好ましくは、本発明に用いられる上記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸のさらなる例として、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５に対してそれぞれ、３０％以上、４０％以上、６０％以上、５０％以上、７０％以上、または８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、またはさらに好ましくは９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列からなる核酸が挙げられる。上記のいずれかの核酸から発現するＣａｓタンパク質は、上記の他の核酸から発現するＣａｓタンパク質およびｃｒＲＮＡと複合体を形成した場合に標的配列を標的化または改変する能力を有するものである。
　ＴｉＤシステムを導入する細胞が真核細胞である場合、好ましくは、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸の末端に核移行シグナルをコードするヌクレオチド配列が付加してもよい。核移行シグナル配列は、当該分野で公知であり、導入対象の細胞が由来する生物種に応じて適宜選択することができる。また、核移行シグナル配列は、２個以上をタンデムに並べてＣａｓタンパク質をコードする核酸に付加してもよい。また、核移行シグナル配列は、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸の５’末端側または３’末端側のいずれか、あるいは両方に付加されていてもよい。
（３）Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列（Ｃａｓ１０ｄ　Ｃ－ｔｅｒ）を含むポリペプチドおよび該ポリペプチドをコードする核酸
　本発明において、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列（Ｃａｓ１０ｄ　Ｃ－ｔｅｒ）は、Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まず、かつ、Ｃ末端側の１以上のα－ヘリックス領域を含む配列である。また、本発明において、Ｃａｓ１０ｄ　Ｃ－ｔｅｒを含むポリペプチド（以下、「Ｃａｓ１１ｄ」ともいう）は、Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まない。
　Ｃａｓ１０ｄ　Ｃ－ｔｅｒの配列長は、本発明の効果が達成されるかぎりにおいて、すなわち、ＴｉＤシステムによる標的ヌクレオチド配列の効率的な標的化および改変が達成されるかぎりにおいて特に限定されないが、例えば、約１００アミノ酸長～約４００アミノ酸長、好ましくは約１２０アミノ酸長～約２７０アミノ酸長、より好ましくは約１３０アミノ酸長～約１８０アミノ酸長、さらに好ましくは約１３５アミノ酸長～約１７０アミノ酸長であってもよい。例えば、Ｃａｓ１０ｄ　Ｃ－ｔｅｒとして、Ｃａｓ１０ｄの全長アミノ酸配列のＣ末端から約１００アミノ酸長～約４００アミノ酸長、好ましくは約１２０アミノ酸長～約２７０アミノ酸長、より好ましくは約１３０アミノ酸長～約１８０アミノ酸長、さらに好ましくは約１３５アミノ酸長～約１７０アミノ酸長を用いることができ、また例えば、Ｃａｓ１０ｄ　Ｃ－ｔｅｒをコードする核酸として、Ｃａｓ１０ｄ遺伝子のストップコドンから５’側上流の約０．３ｋｂ配列長～約１．２ｋｂ配列長、好ましくは約０．３６ｋｂ配列長～約０．８１ｋｂ配列長、より好ましくは約０．３９ｋｂ配列長～約０．５４ｋｂ配列長、さらに好ましくは約０．４１ｋｂ配列長～約０．５１ｋｂ配列長を用いることができる。したがって、Ｃａｓ１１ｄは、例えば、Ｃａｓ１０ｄの全長アミノ酸配列のＣ末端から約１００アミノ酸～約４００アミノ酸、好ましくは約１２０アミノ酸～約２７０アミノ酸、より好ましくは約１３０アミノ酸～約１８０アミノ酸、さらに好ましくは約１３５アミノ酸～約１７０アミノ酸を含む。Ｃａｓ１１ｄの好ましい例として、Ｃａｓ１０ｄの全長アミノ酸配列のＣ末端から約１００アミノ酸～約４００アミノ酸、好ましくは約１２０アミノ酸～約２７０アミノ酸、より好ましくは約１３０アミノ酸～約１８０アミノ酸、さらに好ましくは約１３５アミノ酸～約１７０アミノ酸からなるポリペプチドが挙げられる。Ｃａｓ１１ｄをコードする核酸は、例えば、Ｃａｓ１０ｄ遺伝子のストップコドンの５’側上流約０．３ｋｂ～約１．２ｋｂ、好ましくは約０．３６ｋｂ～約０．８１ｋｂ、より好ましくは約０．３９ｋｂ～約０．５４ｋｂ、さらに好ましくは約０．４１ｋｂ～約０．５１ｋｂを含む。Ｃａｓ１１ｄをコードする核酸の好ましい例として、Ｃａｓ１０ｄ遺伝子のストップコドンの５’側上流約０．３ｋｂ～約１．２ｋｂ、好ましくは約０．３６ｋｂ～約０．８１ｋｂ、より好ましくは約０．３９ｋｂ～約０．５４ｋｂ、さらに好ましくは約０．４１ｋｂ～約０．５１ｋｂからなる核酸が挙げられる。但し、Ｃａｓ１１ｄは、全長Ｃａｓ１０ｄではない。
　Ｃａｓ１１ｄおよびＣａｓ１１ｄをコードする核酸は、既知の方法によって得ることができる。例えば、Ｃａｓ１１ｄは、アミノ酸配列情報を基に化学合成するか、またはＣａｓ１１ｄをコードする核酸を適当なベクター等を介して細胞中に導入し、該細胞中で産生させてもよい。Ｃａｓ１１ｄをコードする核酸は、例えば、アミノ酸配列情報を基に、該核酸を導入する宿主細胞における翻訳に最適化されたコドンを選択し、化学合成等により構築してもよい。宿主細胞において使用頻度の高いコドンを使用することにより、タンパク質の発現量の増加させることができる。該核酸としては、例えば、ｍＲＮＡ等のＲＮＡ、またはＤＮＡが挙げられる。
　Ｃａｓ１１ｄまたはＣａｓ１１ｄをコードする核酸は、本発明の効果が達成されるかぎりにおいて、すなわち、Ｃａｓ１１ｄと上記Ｃａｓタンパク質およびｃｒＲＮＡとの複合体が標的配列の効率的な標的化および改変をもたらすかぎりにおいて、１以上の、例えば１～数個のアミノ酸変異、または１以上の、例えば１～数個のヌクレオチド変異を有していてもよい。
　例えば、Ｃａｓ１１ｄの例として、限定するものではないが、Ｍ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのＣａｓ１０ｄ（配列番号５）由来のＣａｓ１０ｄ　Ｃ－ｔｅｒを含むポリペプチドが挙げられる。したがって、本発明に用いられるＣａｓ１１ｄの例として、配列番号５で示されるアミノ酸配列のＣ末端から約１００アミノ酸～約４００アミノ酸、好ましくは約１２０アミノ酸～約２７０アミノ酸、より好ましくは約１３０アミノ酸～約１８０アミノ酸、さらに好ましくは約１３５アミノ酸～約１７０アミノ酸を含むポリペプチドが挙げられる。好ましくは、本発明に用いられるＣａｓ１１ｄの例として、配列番号５で示されるアミノ酸配列のＣ末端から約１００アミノ酸～約４００アミノ酸、好ましくは約１２０アミノ酸～約２７０アミノ酸、より好ましくは約１３０アミノ酸～約１８０アミノ酸、さらに好ましくは約１３５アミノ酸～約１７０アミノ酸からなるポリペプチドが挙げられる。Ｍ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来のＣａｓ１１ｄの一例として、配列番号５で示されるアミノ酸配列の９９７位～１１５６位のアミノ酸からなる配列（配列番号６）を含むポリペプチドが挙げられ、さらに好ましくは、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。
　さらに、Ａｎａｂａｅｎａ　ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａ、Ｃａｌｏｔｈｒｉｘ　ＰＣＣ６３０３　（Ｃａｌｏｔｈｒｉｘ　ｐａｒｉｅｔｉｎａ）、Ｃｒｉｎａｌｉｕｍ　ｅｐｉｐｓａｍｍｕｍ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ　ＰＣＣ７４２４　（Ｇｌｏｅｏｔｈｅｃｅ　ｃｉｔｒｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ　ｋｉｌａｕｅｅｎｓｉｓ、Ｇｌｏｅｏｃａｐｓａ　ｓｐ．　ＰＣＣ７４２８、Ｈａｌｏｔｈｅｃｅ　ＰＣＣ７４１８、Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ　ｈｕｎｇａｔｅｉ、Ｎｏｓｔｏｃ　ｓｐ．　ＮＩＥＳ－２１１１、Ｒｉｖｕｌａｒｉａ　ｓｐ．　ＰＣＣ７１１６、Ｓｔａｎｉｅｒｉａ　ｃｙａｎｏｓｐｈａｅｒａ、およびＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ　ｓｐ．　ＰＣＣ６８０３由来のＣａｓ１１ｄの例として、それぞれ配列番号８～１９に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる。さらに好ましくは、配列番号８～１９で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。本発明において、Ｃａｓ１１ｄは、上記Ｃａｓタンパク質（Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、および／またはＣａｓ１０ｄ）と異なる菌種または同じ菌種由来のＣａｓ１０ｄ　Ｃ－ｔｅｒを含んでいてもよい。好ましくは、上記Ｃａｓタンパク質のいずれかと同じ菌株由来のＣａｓ１０ｄ　Ｃ－ｔｅｒを含むポリペプチドがＣａｓ１１ｄとして用いられる。
　また、本発明に用いられるＣａｓ１１ｄのさらなる例として、配列番号５で示されるアミノ酸配列のＣ末端から約１００アミノ酸～約４００アミノ酸、好ましくは約１２０アミノ酸～約２７０アミノ酸、より好ましくは約１３０アミノ酸～約１８０アミノ酸、さらに好ましくは約１３５アミノ酸～約１７０アミノ酸からなる配列に対して、３０％以上、４０％以上、６０％以上、５０％以上、７０％以上、または８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、またはさらに好ましくは９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる。好ましくは、本発明に用いられるＣａｓ１１ｄのさらなる例として、配列番号５で示されるアミノ酸配列のＣ末端から約１００アミノ酸～約４００アミノ酸、好ましくは約１２０アミノ酸～約２７０アミノ酸、より好ましくは約１３０アミノ酸～約１８０アミノ酸、さらに好ましくは約１３５アミノ酸～約１７０アミノ酸からなる配列に対して、３０％以上、４０％以上、６０％以上、５０％以上、７０％以上、または８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、またはさらに好ましくは９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。Ｃａｓ１１ｄのまたさらなる例として、配列番号６、配列番号８～１９のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して、３０％以上、４０％以上、６０％以上、５０％以上、７０％以上、または８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、またはさらに好ましくは９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる。Ｃａｓ１１ｄの好ましい例として、配列番号６、配列番号８～１９のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して、３０％以上、４０％以上、６０％以上、５０％以上、７０％以上、または８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、またはさらに好ましくは９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。上記のいずれのＣａｓ１１ｄも、上記のＣａｓタンパク質およびｃｒＲＮＡと複合体を形成した場合に標的配列の効率的な標的化および改変をもたらす能力を有するものである。
　ＴｉＤシステムを導入する細胞が真核細胞である場合、好ましくは、Ｃａｓ１１ｄの末端に核移行シグナルを付加してもよい。核移行シグナルは、当該分野で公知であり、導入対象の細胞が由来する生物種に応じて適宜選択することができる。また、核移行シグナルは、２個以上をタンデムに並べてＣａｓ１１ｄに付加してもよい。また、核移行シグナルは、Ｃａｓ１１ｄのＮ末端側またはＣ末端側のいずれか、あるいは両方に付加されていてもよい。
　本発明に用いられるＣａｓ１１ｄをコードする核酸の例として、配列番号５で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列のストップコドンの５’側上流約０．３ｋｂ～約１．２ｋｂ、好ましくは約０．３６ｋｂ～約０．８１ｋｂ、より好ましくは約０．３９ｋｂ～約０．５４ｋｂ、さらに好ましくは約０．４１ｋｂ～約０．５１ｋｂを含む核酸が挙げられる。好ましくは、本発明に用いられるＣａｓ１１ｄをコードする核酸の例として、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列のストップコドンの５’側上流約０．３ｋｂ～約１．２ｋｂ、好ましくは約０．３６ｋｂ～約０．８１ｋｂ、より好ましくは約０．３９ｋｂ～約０．５４ｋｂ、さらに好ましくは約０．４１ｋｂ～約０．５１ｋｂを含む核酸が挙げられる。さらに好ましくは、本発明に用いられるＣａｓ１１ｄをコードする核酸の例として、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列のストップコドンの５’側上流約０．３ｋｂ～約１．２ｋｂ、好ましくは約０．３６ｋｂ～約０．８１ｋｂ、より好ましくは約０．３９ｋｂ～約０．５４ｋｂ、さらに好ましくは約０．４１ｋｂ～約０．５１ｋｂからなる核酸が挙げられる。Ｃａｓ１１ｄをコードする核酸の一例として、配列番号６で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸が挙げられ、さらに好ましくは、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸が挙げられ、またさらに好ましくは、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる核酸が挙げられる。Ｃａｓ１１ｄをコードする核酸の他の例として、配列番号８～１９で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸が挙げられ、さらに好ましくは、配列番号８～１９で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸が挙げられ、またさらに好ましくは、配列番号８～１９で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる核酸が挙げられる。
　また、本発明に用いられるＣａｓ１１ｄをコードする核酸のさらなる例として、配列番号５で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列のストップコドンの５’側上流約０．３ｋｂ～約１．２ｋｂ、好ましくは約０．３６ｋｂ～約０．８１ｋｂ、より好ましくは約０．３９ｋｂ～約０．５４ｋｂ、さらに好ましくは約０．４１ｋｂ～約０．５１ｋｂからなる配列に対して、３０％以上、４０％以上、６０％以上、５０％以上、７０％以上、または８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、またはさらに好ましくは９９％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸が挙げられる。好ましくは、本発明に用いられるＣａｓ１１ｄをコードする核酸の例として、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列のストップコドンの５’側上流約０．３ｋｂ～約１．２ｋｂ、好ましくは約０．３６ｋｂ～約０．８１ｋｂ、より好ましくは約０．３９ｋｂ～約０．５４ｋｂ、さらに好ましくは約０．４１ｋｂ～約０．５１ｋｂからなる配列に対して、３０％以上、４０％以上、６０％以上、５０％以上、７０％以上、または８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、またはさらに好ましくは９９％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸が挙げられる。さらに好ましくは、本発明に用いられるＣａｓ１１ｄをコードする核酸の例として、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列のストップコドンの５’側上流約０．３ｋｂ～約１．２ｋｂ、好ましくは約０．３６ｋｂ～約０．８１ｋｂ、より好ましくは約０．３９ｋｂ～約０．５４ｋｂ、さらに好ましくは約０．４１ｋｂ～約０．５１ｋｂからなる配列に対して、３０％以上、４０％以上、６０％以上、５０％以上、７０％以上、または８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、またはさらに好ましくは９９％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列からなる核酸が挙げられる。Ｃａｓ１１ｄをコードする核酸の他の例として、配列番号６、配列番号８～１９のいずれかで示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対して、３０％以上、４０％以上、６０％以上、５０％以上、７０％以上、または８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、またはさらに好ましくは９９％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸が挙げられる。Ｃａｓ１１ｄをコードする核酸のまた別の例として、配列番号６、配列番号８～１９のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対して、３０％以上、４０％以上、６０％以上、５０％以上、７０％以上、または８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、またはさらに好ましくは９９％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸が挙げられる。Ｃａｓ１１ｄをコードする核酸のまた別の例として、配列番号６、配列番号８～１９のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対して、３０％以上、４０％以上、６０％以上、５０％以上、７０％以上、または８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、またはさらに好ましくは９９％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列からなる核酸が挙げられる。上記のいずれの核酸から発現するＣａｓ１１ｄポリペプチドも、上記のＣａｓタンパク質およびｃｒＲＮＡと複合体を形成した場合に標的配列の効率的な標的化および改変をもたらす能力を有するものである。
　ＴｉＤシステムを導入する細胞が真核細胞である場合、好ましくは、Ｃａｓ１１ｄをコードする核酸の末端に核移行シグナルをコードするヌクレオチド配列が付加してもよい。核移行シグナル配列は、当該分野で公知であり、導入対象の細胞が由来する生物種に応じて適宜選択することができる。また、核移行シグナル配列は、２個以上をタンデムに並べてＣａｓ１１ｄをコードする核酸に付加してもよい。また、核移行シグナル配列は、Ｃａｓ１１ｄをコードする核酸の５’末端側または３’末端側のいずれか、あるいは両方に付加されていてもよい。
（４）ｃｒＲＮＡ
　ｃｒＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に由来するリピート配列および該リピート配列に挟まれたスペーサー配列からなる１以上の構造単位（「リピート－スペーサー－リピート」）を含む。リピート配列は、好ましくは、パリンドローム様配列を含む。ｃｒＲＮＡは、スペーサー配列として標的ヌクレオチド配列に結合するＲＮＡ配列（すなわち、プロトスペーサー配列）を含むことによって、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの標的認識に寄与する。ｃｒＲＮＡのリピート配列および該リピート配列に挟まれたプロトスペーサー配列からなる構造を含むＲＮＡ分子は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とも呼ばれる。ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓエフェクタータンパク質の作用によりプロセッシングされてそのリピート配列が切断され、リピート配列の部分配列と該リピート配列の部分配列に挟まれたプロトスペーサー配列からなる成熟型（ｍａｔｕｒｅ）ｃｒＲＮＡになる。プロセッシングされる前のｃｒＲＮＡはプレ成熟型（ｐｒｅ－ｍａｔｕｒｅ）ｃｒＲＮＡと呼ばれる。
　本発明で使用されるｃｒＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ｄ遺伝子座に由来するリピート配列と、該リピート配列に挟まれたプロトスペーサー配列として、標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含む。本発明で使用されるｃｒＲＮＡは、好ましくは、プレ成熟型ｃｒＲＮＡである。
　プレ成熟型ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓｃａｄｅ（Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄの複合体）に取り込まれる前にＣａｓ６ｄによるプロセッシングを受けて、成熟型ｃｒＲＮＡとなる。プレ成熟型ｃｒＲＮＡが２以上の「リピート－スペーサー－リピート」構造単位を含む場合、該プレ成熟型ｃｒＲＮＡは、２種以上のプロトスペーサー配列を含んでいてもよい。２種以上のプロトスペーサー配列を含むプレ成熟型ｃｒＲＮＡからは、２種以上の成熟型ｃｒＲＮＡが生じ、次いで、これらの成熟型ｃｒＲＮＡは個別にＣａｓｃａｄｅに取り込まれる。
　ｃｒＲＮＡに含まれるプロトスペーサー配列は、標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列である。「標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列」は、例えば、標的ヌクレオチド配列に相補的な配列、または標的ヌクレオチド配列に対し実質的に相補的な配列である。ここで、「実質的に相補的」とは、標的配列に対して完全に相補的ではないが、標的配列に結合できる（標的配列と塩基対を形成する）配列を包含する。標的ヌクレオチド配列に対し実質的に相補的な配列は、標的配列と塩基対を形成するかぎりにおいて、標的配列に対しミスマッチを含んでいてもよい。
　ｃｒＲＮＡのリピート配列部分は、少なくとも１つのヘアピン構造を有していてもよい。例えば、プロトスペーサー配列の５’末端側にあるリピート配列部分がヘアピン構造を有し、プロトスペーサー配列の３’末端側にあるリピート配列部分は一本鎖であってもよい。本発明において、ｃｒＲＮＡは、好ましくは１つのヘアピン構造を有する。
　ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ｄ遺伝子座に由来するリピート配列は、タイプＩ－Ｄ遺伝子群に隣接するｃｒＲＮＡ遺伝子配列領域から、タンデムリピート検索プログラムを利用して見出すことができる。タイプＩ－Ｄ遺伝子座に由来するリピート配列は、いずれの細菌または古細菌由来のものであってもよく、例えば、上記のＣａｓエフェクタータンパク質に関して例示した細菌および古細菌由来のものであってもよい。
　ｃｒＲＮＡに含まれるリピート配列の塩基長は、Ｃａｓｃａｄｅと相互作用して標的ヌクレオチド配列を標的化するという目的が達成されるかぎり、特に限定されない。例えば、プロトスペーサー配列の前後のリピート配列は各々、約１０～７０塩基長であってもよく、例えば、約３０～５０塩基長であってもよく、好ましくは約３５～４５塩基長であってもよい。
　本発明で使用されるｃｒＲＮＡは、約１０塩基～７０塩基長のプロトスペーサー配列を含むことができる。該ｃｒＲＮＡに含まれるプロトスペーサー配列は、好ましくは２０塩基～５０塩基、より好ましくは２５塩基～４５塩基からなる配列、さらに好ましくは３０塩基～４０塩基からなる配列、例えば、３１塩基、３２塩基、３３塩基、３４塩基、３５塩基、３６塩基、３７塩基、３８塩基、または３９塩基からなる配列である。標的化可能な配列が長いほど、ｃｒＲＮＡによる標的認識の配列特異性が増す。また、標的化可能な配列が長いほど、ｃｒＲＮＡと標的配列との間に形成される塩基対のＴｍ値が高くなり、標的認識の安定性が増す。従来のゲノム編集技術に用いられるＲＮＡ誘導性エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９およびＣｐｆ１）ではｃｒＲＮＡが標的化できる配列の長さは約２０～２４塩基であるので、本発明では、従来法よりも配列特異性および安定性が優れている。
　本発明で使用されるｃｒＲＮＡの例として、限定するものではないが、Ｍ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来のｃｒＲＮＡのリピート配列を含むものが挙げられる。例えば、GUUCCAAUUAAUCUUAAGCCCUAUUAGGGAUUGAAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUCCAAUUAAUCUUAAGCCCUAUUAGGGAUUGAAAC（配列番号７；Ｎは標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を構成する任意のヌクレオチドである）で示される配列を含むプレ成熟型ｃｒＲＮＡが挙げられる。上記ｃｒＲＮＡの配列中、Ｎの数は１０～７０の範囲で変更してもよく、好ましくは２０～５０、より好ましくは２５～４５、さらに好ましくは３０～４０の範囲で変更してもよい。
　上記ｃｒＲＮＡは、ＲＮＡとして、またはｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡとして細胞中に導入されてもよい。ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡは、例えば、ベクターまたは発現カセットに含まれていてもよく、該ＤＮＡ配列は、好ましくは、プロモーターおよびターミネーター等の調節配列に作動可能に連結される。ベクターおよび調節配列は、例えば宿主細胞等に基づいて、当業者が適宜選択することができる。例えば、限定するものではないが、ｐｏｌ　ＩＩＩ系のプロモーター（例えば、ＳＮＲ６、ＳＮＲ５２、ＳＣＲ１、ＲＰＲ１、Ｕ６、Ｈ１プロモーター等）、ｐｏｌ　ＩＩ系のプロモーター、ターミネーター（例えばＴ６配列）、またはヒトＵ６　ｓｎＲＮＡプロモーターを用いることができる。
　上記ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡは、上記Ｃａｓタンパク質およびＣａｓ１１ｄポリペプチドをコードする核酸のいずれかと同じベクター中または同じ発現カセット中に含まれていてもよく、または上記Ｃａｓタンパク質およびＣａｓ１１ｄポリペプチドをコードする核酸のいずれとも別のベクター中または別の発現カセット中に含まれていてもよい。
（５）標的ヌクレオチド配列
　本発明において、標的ヌクレオチド配列（本明細書において、単に「標的配列」ともいう）は、任意の核酸の配列であり、ＴｉＤシステムのプロトスペーサー近接モチーフ（ＰＡＭ）の近傍に位置する配列を標的配列として選択することを除き、特に限定されない。該核酸は、生体内または細胞内における核酸、または生体または細胞から単離された核酸であってもよい。標的ヌクレオチド配列は、二本鎖ＤＮＡ配列、一本鎖ＤＮＡ配列、またはＲＮＡ配列のいずれであってもよい。ＤＮＡとしては、例えば、真核生物核ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、原核生物ゲノムＤＮＡ、ファージＤＮＡ、あるいはプラスミドＤＮＡ等が挙げられる。本発明において、標的ヌクレオチド配列は、好ましくは、ゲノムＤＮＡ上の配列である。したがって、標的とする核酸のセンス鎖において、ＰＡＭ配列の近傍に位置する配列、好ましくはＰＡＭ配列の３’側下流の近傍に位置する配列、さらに好ましくはＰＡＭ配列の３’側下流に隣接する配列を標的ヌクレオチド配列として選択する。また、標的核酸のアンチセンス鎖において、標的ヌクレオチド配列は、ＰＡＭ配列の近傍に位置する配列、好ましくはＰＡＭ配列の５’側の近傍に位置する配列、さらに好ましくはＰＡＭ配列の５’側に隣接する配列から選択される。なお、本明細書において、「近傍に位置する」とは、隣接すること、および近くにあることの両方を包含する。また、本明細書において、「近傍」とは、隣接する位置または近くの位置の両方を包含する。なお、本明細書においては、特記しないかぎり、核酸のセンス鎖に基づいて記載される。
　ＣＲＩＳＰＲシステムの標的認識に利用されるＰＡＭ配列は、ＣＲＩＳＰＲシステムの種類によって異なる。例えば、Ｍ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａを含むいくつかの菌株由来のＴｉＤシステムのＰＡＭ配列は、標的とする核酸のセンス鎖において、５’－ＧＴＨ－３’（Ｈ＝Ａ、ＣまたはＴ）であり、標的核酸のアンチセンス鎖において、５’－ＨＴＧ－３’（Ｈ＝Ａ、ＣまたはＴ）である（特許文献１）。
　例えば、標的ヌクレオチド配列は、上記ＰＡＭ配列の近傍に位置し、かつ、標的遺伝子のイントロン内、コーディング領域内、非コーディング領域内、または制御領域内に存在する配列であってもよい。標的遺伝子は、任意の遺伝子であり、随意に選択すればよい。
　標的ヌクレオチド配列の長さは、例えば、１０～７０塩基長、好ましくは２０～５０塩基長、より好ましくは２５～４５塩基長、さらに好ましくは３０～４０塩基長の範囲である。
（６）本発明の標的配列ターゲティング方法
　本発明の標的配列ターゲティング方法は、ＴｉＤのＣａｓエフェクタータンパク質のうちＣａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄと、Ｃａｓ１０ｄ　Ｃ－ｔｅｒを含むポリペプチド（Ｃａｓ１１ｄ）と、ｃｒＲＮＡとを細胞中に導入することを特徴とする。すなわち、本発明の標的配列ターゲティング方法は、（ｉ）Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄ、またはこれらのタンパク質をコードする核酸、（ｉｉ）Ｃａｓ１１ｄポリペプチド、または該ポリペプチドをコードする核酸、および（ｉｉｉ）標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡ、または該ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡを上記細胞中に導入することを特徴とする。本発明の標的配列ターゲティング方法は、イン・ビトロ、イン・ビボ、またはエクス・ビボのいずれで行ってもよい。また、本発明の標的配列ターゲティング方法は、単離された核酸の標的ヌクレオチド配列に適用することもでき、この場合、該方法は、上記（ｉ）のＣａｓタンパク質、上記（ｉｉ）のＣａｓ１１ｄポリペプチドおよび上記（ｉｉｉ）のｃｒＲＮＡを、標的ヌクレオチド配列を含む単離核酸に接触させることを含む。
　本発明の標的配列ターゲティング方法において、上記Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄのうち２以上を含む単離された複合体、例えば４つを含む単離された複合体として細胞中に導入または標的ヌクレオチド配列を含む単離核酸に接触してもよく、またはＣａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄの各々が単離されたタンパク質として単独で細胞中に導入または標的ヌクレオチド配列を含む単離核酸に接触してもよい。また、本発明の標的配列ターゲティング方法において、上記Ｃａｓタンパク質は、上記Ｃａｓタンパク質Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄをコードする核酸として細胞中に導入してもよい。該核酸としては、例えば、ｍＲＮＡ等のＲＮＡ、またはＤＮＡが挙げられる。
　本発明の標的配列ターゲティング方法において、Ｃａｓ１１ｄは、上記Ｃａｓタンパク質との複合体として細胞中に導入または標的ヌクレオチド配列を含む単離核酸に接触されてもよく、またはＣａｓ１１ｄは単離されたポリペプチドとして単独で細胞中に導入または標的ヌクレオチド配列を含む単離核酸に接触してもよい。また、本発明の標的配列ターゲティング方法において、Ｃａｓ１１ｄは、Ｃａｓ１１ｄをコードする核酸として細胞中に導入してもよい。該核酸としては、例えば、ｍＲＮＡ等のＲＮＡ、またはＤＮＡが挙げられる。
　上記Ｃａｓタンパク質およびＣａｓ１１ｄをコードする核酸は、例えば、ベクターに含まれていてもよく、該核酸配列は、好ましくは、プロモーターおよびターミネーター等の調節配列に作動可能に連結されている。上記Ｃａｓタンパク質Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄおよびＣａｓ１０ｄ、およびＣａｓ１１ｄを導入する細胞が真核細胞である場合、好ましくは、上記Ｃａｓタンパク質およびＣａｓ１１ｄをコードする核酸配列に核移行シグナル配列が付加される。上記Ｃａｓタンパク質Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄＣａｓ７ｄおよびＣａｓ１０ｄ、およびＣａｓ１１ｄをコードする核酸の２以上または全てが単一のベクターまたは発現カセット中に含まれていてもよく、または別々のベクターまたは発現カセット中に含まれていてもよい。ベクターまたは発現カセットの数、ならびに各ベクターまたは発現カセットに組み込む核酸の種類および組み合わせに制限はない。上記Ｃａｓタンパク質およびＣａｓ１１ｄをコードする２以上の核酸が一つのベクターまたは発現カセット中に含まれる場合、これらの核酸配列は、ポリシストロニックに発現するように、例えば自己開裂型ペプチドをコードする配列等を介して、相互に連結されていてもよい。なお、上記Ｃａｓタンパク質およびＣａｓ１１ｄをコードする２以上の核酸を連結する順番は、いずれであってもよい。
　上記ｃｒＲＮＡは、ＲＮＡとして、またはｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡとして細胞中に導入されてもよい。上記ｃｒＲＮＡはまた、上記Ｃａｓタンパク質および／またはＣａｓ１１ｄとの複合体として細胞中に導入または標的ヌクレオチド配列を含む単離核酸に接触してもよい。ｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡは、例えば、ベクターに含まれていてもよく、該ＲＮＡまたはＤＮＡ配列は、好ましくは、プロモーターおよびターミネーター等の調節配列に作動可能に連結される。ｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡは、上記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸および／またはＣａｓ１１ｄをコードする核酸と同じベクターまたは発現カセット中に含まれていてもよく、または別々のベクターまたは発現カセット中に含まれていてもよい。
　ベクターは、対象細胞中に目的タンパク質をコードする核酸を運び、該細胞中で該目的タンパク質を発現させるための発現ベクターである。発現カセットとは、目的タンパク質をコードする核酸の転写および／または翻訳を指示して該目的タンパク質の発現を可能にする核酸分子を意味する。発現カセットは、ベクターに含まれていてもよい。ベクターとしては、当該分野において一般的に使用される種々のベクターを使用することができ、特に限定されず、導入される細胞又は導入方法に応じて適宜選択することができる。例えば、限定するものではないが、プラスミドベクター、ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ファージ、ファージミド、コスミド、人工／ミニ染色体、トランスポゾン等が挙げられる。
　上記調節配列としては、例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、ポリアデニル化シグナル、ポリＵ配列、翻訳エンハンサー等が挙げられる。調節配列は、特に限定されず、宿主細胞等に基づき当業者が適宜選択することができる。例えば、プロモーターとしては、宿主が植物細胞である場合、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、２ｘＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ＣａＭＶ１９Ｓプロモーター、ＮＯＳプロモーター等が挙げられ、宿主が動物細胞である場合、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＭｏＭｕＬＶ　ＬＴＲプロモーター、ＨＳＶ－ＴＳプロモーター、ヒト翻訳伸長因子遺伝子プロモーター、ＣＡＧキメラ合成プロモーター等が挙げられる。
　上記核移行シグナル配列は、当該分野で公知であり、上記Ｃａｓタンパク質、Ｃａｓ１１ｄおよびｃｒＲＮＡを導入する細胞が由来する生物種に応じて適宜選択することができる。例えば、モノパータイト型核移行シグナルまたはバイパータイト型核移行シグナルを使用してもよい。
　上記Ｃａｓタンパク質、Ｃａｓ１１ｄ、およびｃｒＲＮＡの細胞中への導入は、当該分野で知られた種々の手段によって行うことができる。例えば、トランスフェクション、例えば、リン酸カルシウム仲介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソームトランスフェクション等、ウイルス形質導入、リポフェクション、遺伝子銃、マイクロインジェクション、アグロバクテリウム法、アグロインフィルトレーション法、ＰＥＧ－カルシウム法等が挙げられる。
　上記Ｃａｓタンパク質、Ｃａｓ１１ｄ、およびｃｒＲＮＡ、またはこれらをコードする核酸は、同時にまたは連続的に細胞中に導入すればよい。また、上記Ｃａｓタンパク質Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄおよびＣａｓ１０ｄ、またはこれらの各Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、同時にまたは連続的に細胞中に導入すればよい。例えば、イン・ビトロまたはイン・ビボにおいてそれぞれ合成した上記Ｃａｓタンパク質Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄおよびＣａｓ１０ｄ、およびＣａｓ１１ｄと、イン・ビトロまたはイン・ビボにおいて合成したｃｒＲＮＡを、イン・ビトロにおいてインキュベートして複合体を形成させ、該複合体を細胞中に導入することができる。
　上記Ｃａｓタンパク質、Ｃａｓ１１ｄ、およびｃｒＲＮＡの導入の際、細胞は、標的ヌクレオチド配列のターゲティングに適当な条件下で培養される。次いで、該細胞は、細胞増殖および維持に適当な条件下で培養される。培養条件は、導入される細胞が由来する生物種に適切な培養条件であればよく、例えば、既知の細胞培養技術に基づいて当業者により適宜決定可能である。
　本発明の標的配列ターゲティング方法において、上記Ｃａｓタンパク質と機能性ポリペプチドとを含む融合タンパク質を用いてもよい。この場合、上記Ｃａｓタンパク質およびｃｒＲＮＡの作用により機能性ポリペプチドが細胞中の標的ヌクレオチド配列に誘導され、該機能性ポリペプチドの作用により該標的ヌクレオチド配列が改変または修飾される。したがって、本発明はさらに、上記融合タンパク質、Ｃａｓ１１ｄおよびｃｒＲＮＡを細胞中に導入または標的ヌクレオチド配列を含む単離核酸に接触することを含む、標的ヌクレオチド配列の改変または修飾方法を提供する。機能性ポリペプチドは、標的配列に対して何らかの機能を示すポリペプチドである。機能性ポリペプチドとしては、例えば、限定するものではないが、制限酵素、転写因子、ＤＮＡメチル化酵素、ヒストンアセチル化酵素、蛍光タンパク質、ならびに、ポリヌクレオチド切断モジュールとして制限酵素のヌクレオチド切断モジュール、遺伝子発現調節モジュールとして、転写因子の転写活性化モジュールおよび転写抑制モジュール、エピゲノム修飾モジュールとして、ＤＮＡメチル化酵素のメチル化モジュールおよびヒストンアセチル化酵素のアセチル化モジュール、塩基置換を誘発させるモジュールとしてシトシンデアミナーゼおよびアデニンデアミナーゼなどが挙げられる。蛍光タンパク質としては、例えば、ＧＦＰが挙げられる。
　本発明の標的配列ターゲティング方法によれば、Ｃａｓ１１ｄの存在により、効率よく標的配列を標的化することができる。
（７）本発明の標的配列改変方法
　本発明の標的配列改変方法は、Ｃａｓエフェクタータンパク質Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、Ｃａｓ３ｄおよびＣａｓ１０ｄと、Ｃａｓ１０ｄ　Ｃ－ｔｅｒを含むポリペプチド（Ｃａｓ１１ｄ）と、ｃｒＲＮＡとを細胞中に導入することを特徴とする。すなわち、本発明の標的配列改変方法は、細胞中に、（ｉ）Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄ、またはこれらのタンパク質をコードする核酸、（ｉｉ）Ｃａｓ１１ｄポリペプチド、または該ポリペプチドをコードする核酸、および（ｉｉｉ）標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡ、または該ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡを上記細胞中に導入することを特徴とする。本発明の標的配列改変方法は、本発明の標的配列ターゲティング方法により標的化したヌクレオチド配列を、Ｃａｓ３ｄおよびＣａｓ１０ｄの作用により切断することを含む。本発明の標的配列改変方法は、イン・ビトロ、イン・ビボ、またはエクス・ビボのいずれで行ってもよい。本発明において、改変には、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、挿入、または置換、あるいはそれらの組み合わせが含まれる。また、本発明の標的配列改変方法は、単離された核酸の標的ヌクレオチド配列に適用することもでき、この場合、該方法は、上記（ｉ）のＣａｓタンパク質、上記（ｉｉ）のＣａｓ１１ｄポリペプチドおよび上記（ｉｉｉ）のｃｒＲＮＡを、標的ヌクレオチド配列を含む単離核酸に接触させることを含む。本発明の標的配列改変方法は、単離された核酸の標的ヌクレオチド配列に適用する場合、好ましくは、標的ヌクレオチド配列の切断方法が提供される。
　本発明の標的配列改変方法において、上記Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、Ｃａｓ３ｄ、およびＣａｓ１０ｄは、これら５つのＣａｓタンパク質のうち２以上を含む単離された複合体、例えば５つを含む単離された複合体、またはＣａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄを含む単離された複合体および／またはＣａｓ３ｄおよびＣａｓ１０ｄを含む単離された複合体として細胞中に導入または標的ヌクレオチド配列を含む単離核酸に接触してもよく、あるいはＣａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、Ｃａｓ３ｄ、およびＣａｓ１０ｄの各々が単離されたタンパク質として単独で細胞中に導入または標的ヌクレオチド配列を含む単離核酸に接触してもよい。あるいは、上記Ｃａｓタンパク質Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、Ｃａｓ３ｄ、およびＣａｓ１０ｄをコードする核酸として細胞中に導入されてもよい。該核酸としては、例えば、ｍＲＮＡ等のＲＮＡ、またはＤＮＡが挙げられる。
　本発明の標的配列改変方法において、Ｃａｓ１１ｄは、上記Ｃａｓタンパク質との複合体として細胞中に導入または標的ヌクレオチド配列を含む単離核酸に接触してもよく、またはＣａｓ１１ｄは単離されたポリペプチドとして単独で細胞中に導入または標的ヌクレオチド配列を含む単離核酸に接触してもよい。また、本発明の標的配列改変方法において、Ｃａｓ１１ｄは、Ｃａｓ１１ｄをコードする核酸として細胞中に導入されてもよい。該核酸としては、例えば、ｍＲＮＡ等のＲＮＡ、またはＤＮＡが挙げられる。
　上記Ｃａｓタンパク質およびＣａｓ１１ｄをコードする核酸は、例えば、ベクターに含まれていてもよく、該核酸配列は、好ましくは、プロモーターおよびターミネーター等の調節配列に作動可能に連結されている。導入する細胞が真核細胞である場合、好ましくは、上記Ｃａｓタンパク質およびＣａｓ１１ｄをコードする核酸に核移行シグナル配列が付加される。上記Ｃａｓタンパク質Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、Ｃａｓ３ｄおよびＣａｓ１０ｄ、ならびにＣａｓ１１ｄをコードする核酸の２以上または全てが単一のベクターまたは発現カセット中に含まれていてもよく、または別々のベクターまたは発現カセット中に含まれていてもよい。ベクターまたは発現カセットの数、ならびに各ベクターまたは発現カセットに組み込む核酸の種類および組み合わせに制限はない。上記Ｃａｓタンパク質およびＣａｓ１１ｄをコードする２以上の核酸が一つのベクターまたは発現カセット中に含まれる場合、これらの核酸配列は、ポリシストロニックに発現するように、例えば自己開裂型ペプチドをコードする配列等を介して、相互に連結されていてもよい。なお、上記Ｃａｓタンパク質およびＣａｓ１１ｄをコードする２以上の核酸を連結する順番は、いずれであってもよい。
　上記ｃｒＲＮＡは、ＲＮＡとして、またはｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡとして細胞中に導入されてもよい。上記ｃｒＲＮＡはまた、上記Ｃａｓタンパク質および／またはＣａｓ１１ｄとの複合体として細胞中に導入または標的ヌクレオチド配列を含む単離核酸に接触してもよい。ｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡは、例えば、ベクターに含まれていてもよく、該ＲＮＡまたはＤＮＡ配列は、好ましくは、プロモーターおよびターミネーター等の調節配列に作動可能に連結される。ｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡは、上記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸および／またはＣａｓ１１ｄをコードする核酸と同じベクターまたは発現カセット中に含まれていてもよく、または別々のベクターまたは発現カセット中に含まれていてもよい。
　ベクターとしては、当該分野において一般的に使用される種々のベクターを使用することができ、特に限定されず、導入される細胞又は導入方法に応じて適宜選択することができる。例えば、限定するものではないが、プラスミドベクター、ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ファージ、ファージミド、コスミド、人工／ミニ染色体、トランスポゾン等が挙げられる。
　上記調節配列としては、例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、ポリアデニル化シグナル、ポリＵ配列、翻訳エンハンサー等が挙げられる。調節配列は、特に限定されず、宿主細胞等に基づき当業者が適宜選択することができる。例えば、プロモーターとしては、宿主が植物細胞である場合、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、２ｘＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ＣａＭＶ１９Ｓプロモーター、ＮＯＳプロモーター等が挙げられ、宿主が動物細胞である場合、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＭｏＭｕＬＶ　ＬＴＲプロモーター、ＨＳＶ－ＴＳプロモーター、ヒト翻訳伸長因子遺伝子プロモーター、ＣＡＧキメラ合成プロモーター等が挙げられる。
　上記核移行シグナル配列は、当該分野で公知であり、上記Ｃａｓタンパク質、Ｃａｓ１１ｄおよびｃｒＲＮＡを導入する細胞が由来する生物種に応じて適宜選択することができる。例えば、モノパータイト型核移行シグナルまたはバイパータイト型核移行シグナルを使用してもよい。
　本発明の標的配列改変方法においては、上記Ｃａｓタンパク質、Ｃａｓ１１ｄ、およびｃｒＲＮＡに加えて、ドナーポリヌクレオチドを細胞中に導入または標的ヌクレオチド配列を含む単離核酸に接触してもよい。ドナーポリヌクレオチドは、標的部位に導入したい改変を含む少なくとも１つのドナー配列を含む。ドナーポリヌクレオチドは、ドナー配列に加えて、該ドナー配列の両端に標的配列の上流および下流の配列と相同性の高い配列（好ましくは、標的配列の上流および下流の配列と実質的に同一の配列）を含んでいてもよい。ドナーポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖のＤＮＡであってもよい。ドナーポリヌクレオチドは、当該分野で既知の技術に基づいて当業者が適宜設計することができる。
　本発明の標的配列改変方法においてドナーポリヌクレオチドが存在しない場合、標的ヌクレオチド配列における切断は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により修復されうる。ＮＨＥＪはエラーが発生しやすいことが知られており、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、挿入、または置換、あるいはそれらの組み合わせが該切断の修復中に起こりうる。かくして、該配列は、標的配列部位において改変され、それにより、フレームシフトや未成熟終止コドンを誘発し、標的配列領域がコードしている遺伝子の発現が不活性化またはノックアウトされうる。
　本発明の標的配列改変方法においてドナーポリヌクレオチドが存在する場合、ドナーポリヌクレオチドのドナー配列は、切断された標的ヌクレオチド配列の相同組換え修復（ＨＤＲ）により、標的配列部位に挿入されるか、または標的配列部位がドナー配列に置換される。その結果、標的配列部位に所望の改変が導入される。
　上記Ｃａｓタンパク質、Ｃａｓ１１ｄ、およびｃｒＲＮＡの細胞中への導入は、当該分野で知られた種々の手段によって行うことができる。ドナーポリヌクレオチドを用いる場合、ドナーポリヌクレオチドもまた、当該分野で知られた種々の手段によって細胞中に導入すればよい。例えば、トランスフェクション、例えば、リン酸カルシウム仲介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソームトランスフェクション等、ウイルス形質導入、リポフェクション、遺伝子銃、マイクロインジェクション、アグロバクテリウム法、アグロインフィルトレーション法、ＰＥＧ－カルシウム法等が挙げられる。
　上記Ｃａｓタンパク質、Ｃａｓ１１ｄ、およびｃｒＲＮＡ、またはこれらをコードする核酸、あるいは上記Ｃａｓタンパク質等の複合体は、同時にまたは連続的に細胞中に導入すればよい。ドナーポリヌクレオチドを用いる場合は、該ドナーポリヌクレオチドもまた、上記Ｃａｓタンパク質、Ｃａｓ１１ｄ、およびｃｒＲＮＡ、またはこれらをコードする核酸、あるいは上記Ｃａｓタンパク質等の複合体と同時にまたは連続的に細胞中に導入すればよい。
　上記Ｃａｓタンパク質、Ｃａｓ１１ｄおよびｃｒＲＮＡの導入の際、細胞は、標的配列部位での切断に適当な条件下で培養される。次いで、該細胞は、細胞増殖および維持に適当な条件下で培養される。ドナーポリヌクレオチドを導入する際も同様である。培養条件は、導入される細胞が由来する生物種に適切な培養条件であればよく、例えば、既知の細胞培養技術に基づいて当業者により適宜決定可能である。
　本発明の標的配列改変方法によれば、細胞中に導入されたＴｉＤシステムにより標的ヌクレオチド配列上の部位が切断され、該切断配列の修復時に、標的配列が改変される。例えば、本発明の標的配列改変方法は、ゲノム上の標的ヌクレオチド配列の改変のために用いることができ、該方法によりゲノム上の二本鎖ＤＮＡが切断され、標的部位が改変される。かくして、本発明の標的配列改変方法によれば、標的配列が改変された細胞が製造される。さらに、標的配列が改変された細胞が植物細胞である場合、該細胞から標的配列が改変された植物を製造することもできる。該植物には、植物体、組織、器官（例えば、根、茎、葉など）、繁殖材料（例えば、種子、塊茎など）、子孫植物、クローン植物等が包含される。例えば、該標的配列が改変された植物細胞から植物体を再生することにより、標的配列が改変された植物体を製造することができる。植物細胞からの植物体の再生は、当該分野で既知の方法によって実施することができる。該植物体からさらに、標的配列が改変された組織、器官、繁殖材料、子孫植物、クローン等を得ることもできる。また、本発明の標的配列改変方法を用いて標的配列が改変された動物細胞を製造し、該動物細胞を用いて標的配列が改変された動物を製造することもできる。該動物には、動物個体、組織、器官、子孫、クローン動物等も包含される。動物は、好ましくは非ヒト動物である。動物細胞から動物を製造する方法として、当該分野で既知の方法を用いることができる。動物細胞としては、例えば、生殖細胞、受精卵、または多能性幹細胞が用いられる。例えば、本発明のＴｉＤシステムを受精卵に導入し、該受精卵を非ヒト動物の子宮に移植し、仔を得ることによって、標的配列が改変された動物個体を製造してもよい。該動物個体からはさらに、標的配列が改変された組織、器官、子孫、クローン等を得ることもできる。
　本発明の標的配列改変方法によれば、標的配列に、数塩基から数十塩基の短鎖領域の挿入および／または欠失を導入するだけでなく、数キロベースないし数十キロベースの長鎖領域の塩基欠失も導入することができる。数キロベースないし数十キロベースとしては、限定するものではないが、例えば１０００～９００００塩基長、好ましくは２０００～８００００塩基長、より好ましくは２０００～７００００塩基長、さらに好ましくは２０００～６００００塩基長、２０００～５００００塩基長、２０００～４００００塩基長、２０００～３００００塩基長、または２０００～２００００塩基長が挙げられる。したがって、本発明の標的配列改変方法を用いれば、１つのガイドＲＮＡを設計するだけで、１遺伝子座全体を欠失させることが可能となる。また、本発明の標的配列改変方法を用いれば、動物の遺伝子のように長いイントロンが存在する場合でも、特定のエキソンを完全に欠落させることも可能である。さらに、本発明の標的配列改変方法を用いれば、隣接して存在する遺伝子群をまとめて欠落させることも可能である。
　本発明の標的配列改変方法によれば、ＰＡＭ配列の上流方向または下流方向、あるいはＰＡＭ配列の上流および下流の両方（すなわち、二方向性）の塩基欠失をもたらすことができる。
（８）本発明の標的遺伝子発現制御方法
　さらに、本発明の標的配列ターゲティング方法または標的配列改変方法において、標的ヌクレオチド配列として、標的遺伝子の配列または標的遺伝子の転写調節配列（例えば、転写因子結合配列、プロモーター配列、エンハンサー配列など）の少なくとも一部の配列を選択することにより、標的遺伝子の転写を抑制し、それにより当該標的遺伝子の発現を抑制することができる。また、本発明の標的配列ターゲティング方法において、標的ヌクレオチド配列として標的遺伝子の転写調節配列の少なくとも一部の配列を選択し、Ｃａｓタンパク質と遺伝子発現調節モジュール（例えば、転写因子の転写活性化モジュールまたは転写抑制モジュール）とを含む融合タンパク質を用いることにより、当該標的遺伝子の転写を制御（活性化または不活性化）し、それにより標的遺伝子の発現を制御（増幅または抑制）することができる。かくして、本発明は、標的遺伝子発現制御方法を提供する。
　本発明の標的遺伝子発現制御方法では、標的ヌクレオチド配列として、標的遺伝子の配列または転写調節配列の少なくとも一部の配列が選択され、該配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡを使用する。本発明の標的遺伝子発現制御方法は、本発明の標的配列ターゲティング方法においてヌクレオチド配列を標的化する際に、Ｃａｓタンパク質とｃｒＲＮＡとの複合体が標的配列に結合することにより、該標的遺伝子の転写が抑制されることを含む。この場合、標的遺伝子配列は切断されないが、上記Ｃａｓタンパク質とｃｒＲＮＡとの複合体が標的ヌクレオチド配列に結合することにより、該標的遺伝子領域の機能または該遺伝子の転写もしくは発現が阻害される。あるいは、本発明の標的遺伝子発現制御方法は、本発明の標的配列改変方法においてヌクレオチド配列を標的化および切断することにより、該標的遺伝子の転写が抑制されることを含む。本発明の標的遺伝子発現制御方法は、イン・ビトロ、イン・ビボまたはエクス・ビボのいずれで行ってもよい。
　上記Ｃａｓタンパク質、Ｃａｓ１１ｄおよびｃｒＲＮＡ、それらの細胞中への導入方法、および導入時および導入後の細胞培養等については、上記「（６）本発明の標的配列ターゲティング方法」および「（７）本発明の標的配列改変方法」において記載したのと同様である。
（９）本発明の複合体
　本発明の複合体は、上記Ｃａｓタンパク質、Ｃａｓ１１ｄ、およびｃｒＲＮＡを含む。本発明は、特に、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、Ｃａｓ１０ｄ、Ｃａｓ１１ｄ、およびｃｒＲＮＡを含む複合体、およびＣａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ１０ｄ、Ｃａｓ１１ｄ、およびｃｒＲＮＡを含む複合体を提供する。さらに、本発明では、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、Ｃａｓ１０ｄおよび機能性ポリペプチドを含む融合タンパク質と、Ｃａｓ１１ｄ、およびｃｒＲＮＡを含む複合体も提供される。さらに、上記複合体をコードするＤＮＡ分子も提供される。本発明の複合体は、本発明の標的配列ターゲティング方法、標的配列改変方法、および標的遺伝子発現制御方法に使用することができる。例えば、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、Ｃａｓ３ｄおよびＣａｓ１０ｄを含む複合体、Ｃａｓ１１ｄ、およびｃｒＲＮＡを含む複合体を細胞に導入して、該細胞内で該複合体を機能させることにより、該細胞のゲノム上の標的配列を改変することができる。また、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄおよびＣａｓ１０ｄを含む複合体、Ｃａｓ１１ｄおよびｃｒＲＮＡを含む複合体を細胞に導入して、該細胞内で該複合体を機能させることにより、該細胞中の標的配列を標的化することができ、また、標的遺伝子の発現を制御することができる。
　本発明の複合体は、常法により、イン・ビトロ、イン・ビボまたはエクス・ビボで製造することができる。例えば、上記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸、Ｃａｓ１１ｄをコードする核酸、およびｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡを細胞中に導入し、該細胞内で複合体を形成させてもよい。
　本発明の複合体の例として、限定するものではないが、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのＣａｓ５ｄ（配列番号２）、Ｃａｓ６ｄ（配列番号３）、Ｃａｓ７ｄ（配列番号４）およびＣａｓ１０ｄ（配列番号５）と、Ｃａｓ１１ｄ（配列番号６）と、GUUCCAAUUAAUCUUAAGCCCUAUUAGGGAUUGAAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUCCAAUUAAUCUUAAGCCCUAUUAGGGAUUGAAAC（配列番号７；Ｎは、標的ヌクレオチド配列に相補的な配列を構成する任意のヌクレオチドである）で示される配列からなるｃｒＲＮＡとを含む複合体、およびＭｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのＣａｓ５ｄ（配列番号２）、Ｃａｓ６ｄ（配列番号３）、Ｃａｓ７ｄ（配列番号４）、Ｃａｓ３ｄ（配列番号１）およびＣａｓ１０ｄ（配列番号５）と、Ｃａｓ１１ｄ（配列番号６）と、GUUCCAAUUAAUCUUAAGCCCUAUUAGGGAUUGAAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUCCAAUUAAUCUUAAGCCCUAUUAGGGAUUGAAAC（配列番号７；Ｎは、標的ヌクレオチド配列に相補的な配列を構成する任意のヌクレオチドである）で示される配列からなるｃｒＲＮＡとを含む複合体が挙げられる。上記ｃｒＲＮＡの配列中、Ｎの数は１０～７０の範囲で変更してもよく、好ましくは２０～５０、より好ましくは２５～４５、さらに好ましくは３０～４０、またさらに好ましくは３２～３７の範囲で変更してもよい。
（１０）本発明の発現ベクター
　本発明はさらに、上記Ｃａｓタンパク質Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄおよびＣａｓ１０ｄをコードする核酸、上記Ｃａｓ１１ｄをコードする核酸、および上記ｃｒＲＮＡまたは上記ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡを含む発現ベクター、ならびに上記Ｃａｓタンパク質Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄおよびＣａｓ１０ｄをコードする核酸、上記Ｃａｓ１１ｄをコードする核酸、および上記ｃｒＲＮＡまたは上記ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡを含む発現ベクターを提供する。
　本発明のベクターは、上記「（６）本発明の標的配列ターゲティング方法」、「（７）本発明の標的配列改変方法」、および「（８）本発明の標的遺伝子発現制御方法」に記載したような、上記Ｃａｓタンパク質、Ｃａｓ１１ｄおよびｃｒＲＮＡを細胞中に導入するためのベクターである。該ベクターの導入後、該細胞中で上記Ｃａｓタンパク質、Ｃａｓ１１ｄおよびｃｒＲＮＡを発現する。本発明のベクターは、また、上記ｃｒＲＮＡに含まれる標的配列を、制限部位を含む任意の配列に替えたベクターであってもよい。このようなベクターは、該任意の配列部位に所望の標的ヌクレオチド配列を組み込んで使用される。該任意の配列としては、例えば、ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ｄの遺伝子座にあるスペーサー配列またはその一部であってもよい。
　各Ｃａｓタンパク質をコードする核酸、Ｃａｓ１１ｄをコードする核酸、およびｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡは同じベクター中に含まれていてもよく、または２以上のベクターに別れて含まれていてもよい。
（１１）本発明のキット
　本発明のキットは、上記した本発明の標的配列ターゲティング方法、標的配列改変方法、および標的遺伝子発現制御方法に使用するためのキットであり、上記Ｃａｓタンパク質Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄおよびＣａｓ１０ｄ、またはこれらのタンパク質をコードする核酸、Ｃａｓ１１ｄまたはＣａｓ１１ｄをコードする核酸、および上記ｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡを含むか、あるいは上記Ｃａｓタンパク質Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄまたはこれらのタンパク質をコードする核酸、Ｃａｓ１１ｄまたはＣａｓ１１ｄをコードする核酸、および上記ｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡを含む。上記Ｃａｓタンパク質およびＣａｓ１１ｄをコードする核酸、および／またはｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡはベクター系または発現カセット系に含まれていてもよい。本発明のキットの構成成分については、上記（２）～（７）に記載のとおりである。
　さらに、Ｃａｓ１１ｄを用いることを特徴とする、ＴｉＤシステムを利用した標的ヌクレオチド配列の標的化および改変の効率を改善する方法、ならびにＣａｓ１１ｄを含む、ＴｉＤシステムを利用した標的ヌクレオチド配列の標的化および改変の効率を改善する組成物が提供される。上記方法において、Ｃａｓ１１ｄは標的配列を含む細胞中に導入される。上記方法および組成物の実施および構成成分等については、上記（１）～（７）に記載のとおりである。
　以下に、本発明の実施例を示した。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されない。
　実施の一形態として、Ｍ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来のＴｉＤ遺伝子座由来の遺伝子群（Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、Ｃａｓ１０ｄ）を、クローン化して用いた。Ｍ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来のＣａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄのアミノ酸配列情報（配列番号１～５）を基に、各Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡ配列を人工合成した。実施例中のＤＮＡ配列の加工および構築操作には、人工遺伝子化学合成、ＰＣＲ法、制限酵素処理、ライゲーション、Ｇｉｂｓｏｎ　Ａｓｓｅｍｂｌｙ法のいずれかを用いた。また、塩基配列の決定にはサンガー法あるいは次世代シーケンス法を用いた。
　Ｃａｓ１０ｄ　Ｃ－ｔｅｒ配列については、Ｃａｓ１０ｄのストップコドンより５’上流の４８３塩基の領域をクローン化して用いた。
　標的配列については、以下を用いた。ＰＡＭはＧＴＣである。
ＡＡＶＳ１＿ＧＴＣ＿７０－１０７（＋）：　ｃｃｔａｇｔｇｇｃｃｃｃａｃｔｇｔｇｇｇｇｔｇｇａｇｇｇｇａｃａｇａｔ（配列番号２０）
＜方法＞
（１）ベクターの構築
　遺伝子フラグメントのクローニングのためのＰＣＲ増幅は、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　Ｍａｘ（ＴａＫａＲａ）を用いて行た。アセンブリングのためのクローニングは、Ｑｕｉｃｋ　ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｋｉｔ（ＮＥＢ）、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ　ＨｉＦｉ　ＤＮＡ　Ａｓｓｅｍｂｌｙ（ＮＥＢ）、およびＭｕｌｔｉｓｉｔｅ　ｇａｔｅｗａｙ　Ｐｒｏ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて行った。
（１－１）哺乳動物ベクター
　ヒトコドンに最適化したＣａｓエフェクター遺伝子（Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄ）、およびＣａｓ１１ｄをＮ末端のＳＶ４０核移行シグナル（ＮＬＳ）（配列番号２１：ＫＫＫＫＲＫ）と共に合成し（ｇＢｌｏｃｋｓ（登録商標））（ＩＤＴ）、アセンブルし、ｐＥＦｓベクター（Lopez-Perrote et al,(2016), Nucleic Acids Res, 44:1909-1923. doi:10.1093/nar/gkv1527）中に別々にクローン化して、単一Ｃａｓ発現ベクター　ｐＥＦｓ－ｍｙｃ－ＳＶ４０ＮＬＳ－Ｃａｓ３ｄ、ｐＥＦｓ－ｍｙｃ－ＳＶ４０ＮＬＳ－Ｃａｓ５ｄ、ｐＥＦｓ－ｍｙｃ－ＳＶ４０ＮＬＳ－Ｃａｓ６ｄ、ｐＥＦｓ－ｍｙｃ－ＳＶ４０ＮＬＳ－Ｃａｓ７ｄ、ｐＥＦｓ－ｍｙｃ－ＳＶ４０ＮＬＳ－Ｃａｓ１０ｄ、およびｐＥＦｓ－ｍｙｃ－ＳＶ４０ＮＬＳ－Ｃａｓ１１ｄを得た。各Ｃａｓタンパク質にはｍｙｃタグを融合した。
　ｃｒＲＮＡ発現ベクターのために、リピート－スペーサー－リピート配列（配列番号２２）を含有するＤＮＡフラグメントを人工合成し、ｐＥＸ－Ａ２Ｊ１（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）中、ヒトＵ６プロモーター下でクローン化して、ｐＡＥＸ－ｈＵ６ｃｒＲＮＡを得た。ｇＲＮＡ配列の挿入のために、標的配列を含有する２つのオリゴヌクレオチドをアニールし、制限酵素ＢｓａＩ（ＮＥＢ）を用いるＧｏｌｄｅｎ　Ｇａｔｅクローニングを用いて、ｃｒＲＮＡ発現ベクター中にクローン化した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（１－２）ルシフェラーゼレポーターアッセイプラスミド
　ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）レポーターアッセイのために、ＮａｎｏＬＵｘｘＵＣ発現ベクターを構築した。まず、ＮＬＵｘｘＵＣ＿Ｂｌｏｃｋ１およびＮＬＵｘｘＵＣ＿Ｂｌｏｃｋ２　ＤＮＡフラグメントを合成した（ＩＤＴ社製）。ＮＬＵｘｘＵＣ＿Ｂｌｏｃｋ１は、ＮａｎｏＬＵＣＴＭ（登録商標）遺伝子（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）配列の最初の３５１ｂｐおよびマルチクローニングサイトを含む。ＸｂａＩ部位をＮａｎｏＬＵＣ遺伝子の５’末端に付加した。ＮＬＵｘｘＵＣ＿Ｂｌｏｃｋ２は、ＮａｎｏＬＵＣ遺伝子の３’末端の４６５ｂｐを含む。ＸｈｏＩ部位をＮａｎｏＬＵＣ遺伝子の３’末端に付加した。これらのフラグメントをアセンブルし、ｐＣＡＧ－ＥＧｘｘＦＰベクター（ａｄｄｇｅｎｅ、＃５０７１６）中にクローン化した。ＮＬＵｘｘＵＣ＿Ｂｌｏｃｋ１をＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ消化によって、ＮＬＵｘｘＵＣ＿Ｂｌｏｃｋ２をＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩ消化によって、ｐＣＡＧ－ＮＬＵｘｘＵＣベクターからそれぞれ除去することによって、各スプリットタイプＮＬＵｘｘＵＣレポーターを構築した。各消化ベクターをマルチクローニングサイトと共にアセンブルし、ｐＣＡＧ－ＮＬＵｘｘＵＣ＿Ｂｌｏｃｋ１およびｐＣＡＧ－ＮＬＵｘｘＵＣ＿Ｂｌｏｃｋ２を得た。
（２）細胞培養およびトランスフェクション
　ヒト胚性腎細胞株２９３Ｔ（ＨＥＫ２９３Ｔ，ＲＩＫＥＮ　ＢＲＣ）を、１０％胎仔ウシ血清（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＧｌｕｔａｌＭＡＸ（登録商標）サプリメント（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１００単位／ｍＬペニシリン、および１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補足したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、３７℃で６０分、５％ＣＯ２インキュベーションで培養した。トランスフェクションの前日にＨＥＫ２９３Ｔ細胞を６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，　ＵＳＡ）に播種した。ＴｕｒｂｏＦｅｃｔ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造者の推奨プロトコルに従って用いて、細胞をトランスフェクトした。６ウェルプレートの各ウェルについて、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ－ｇｒａｄｅキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ，　Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて抽出された全４μｇのプラスミドを用いた。変異分析のために、４８時間後にトランスフェクト細胞を回収した。
（３）ルシフェラーゼレポーターアッセイ
　トランスフェクションの前日に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に、密度２．０ｘ１０４細胞／ウェルで播種した。ＴｕｒｂｏＦｅｃｔ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造者の推奨するプロトコルに従って用いて、細胞をトランスフェクトした。９６ウェルプレートの各ウェルについて、（１）Ｆｌｕｃ遺伝子をコードするｐＧＬ４．５３ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）、（２）標的ＤＮＡフラグメントの挿入により中断されたｐＣＡＧ－ｎＬＵｘｘＵＣベクター、および（３）ＴｉＤ成分をコードしているプラスミドＤＮＡを含む全２００ｎｇのプラスミドＤＮＡを用いた。ＮａｎｏＬｕｃおよびＦｌｕｃルシフェラーゼ活性は、トランスフェクションの３日後に、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｄｕａｌ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（登録商標）Ｒｅｐｏｒｔｅｒ　Ａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。ホタル（Ｆｌｕｃ）活性を内部対照として用いた。ＮａｎｏＬｕｃ／Ｆｌｕｃ比を各サンプルについて計算し、非標的化ｇＲＮＡでトランスフェクトした対照サンプルのＮａｎｏＬｕｃ／Ｆｌｕｃ比と比較した。相対的ＮａｎｏＬｕｃ／Ｆｌｕｃ活性を用いて、ｇＲＮＡ活性を評価した。実験は独立して３回繰り返し、同様の結果を得た。
（４）長鎖ＤＮＡ領域（ｌｏｎｇ　ｒａｎｇｅ）ＰＣＲによるＤＮＡ欠失分析
　ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中のＤＮＡ欠失を検出するために、長鎖ＤＮＡ領域ＰＣＲおよび長鎖ＤＮＡ領域ＰＣＲ産物のプールのクローニングを行った。最初に、Ｇｅｎｏ　Ｐｌｕｓ（登録商標）Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｓｙｓｔｅｍ　（Ｖｉｏｇｅｎｅ－ＢｉｏＴｅｋ，　Ｔａｉｗａｎ）を用いて、ゲノムＤＮＡをＨＥＫ２９３Ｔ細胞から抽出した。次に、ネステッドＰＣＲを行って、長鎖ＤＮＡ領域を特異的に増幅した。まず、抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として用い、種々の長さ（１０ｋｂ～１９ｋｂ）の標的ＤＮＡ領域を増幅するように設計された、長鎖ＤＮＡ領域ＰＣＲ用の特異的プライマーセットを用いて、標的ＤＮＡ領域を増幅した。最初のＰＣＲ反応は、ＫＯＤ　ＯＮＥ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ，　Ｏｓａｋａ，　Ｊａｐａｎ）を用いて、下記の条件下で行った。１０秒９８℃、５秒６０℃および５０秒（アンプリコン：１５－２０ｋｂ）または１５０秒（アンプリコン：１０－１５ｋｂ）または２００秒（アンプリコン：＜１０ｋｂ）６８℃を３５サイクル。次いで、ＰＣＲ産物を１００～１０，０００倍に希釈し、ネステッドＰＣＲの鋳型として用いた。ネステッドＰＣＲは、また、上記と同じ条件下で行った。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル上の電気泳動によって分離し、ＧｅｌＲｅｄ（登録商標）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｇｅｌ　Ｓｔａｉｎ（Ｂｉｏｔｉｕｍ）での染色によって視覚化した。ネステッドＰＣＲ産物をプールし、Ｍｏｎｏｆａｓ（登録商標）ＤＮＡ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　Ｉ（ＧＬ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，　Ｊａｐａｎ）を用いて精製した。ＰＣＲ産物の精製混合物を、Ｍｉｇｈｔｙ　ＴＡ－ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ　Ｂｉｏ，　Ｊａｐａｎ）を用いてｐＭＤ２０－Ｔベクター中にクローン化した。クローンをピックアップし、Ｍ１３　ＵｎｉおよびＭ１３　ＲＶプライマーを用いてサンガー配列決定した。サンガー配列決定の結果をＢＬＡＴＮサーチおよびＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを用いて分析して、ＤＮＡ欠失を同定した。
実施例１：Ｃａｓ１０ｄ配列中のＣａｓ１１ｅ様配列（Ｃａｓ１１ｄ）の同定
　Ｍ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来のＣａｓエフェクタータンパク質のうち、Ｃａｓ１０ｄ配列についてＣＬＡＳＴＡＬ　Ｗプログラムを用いて、ＣＲＩＳＰＲ　ｔｙｐｅ　Ｉ－ＥのＣａｓ１１ｅ配列（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ、Ａｃｉｄｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ　ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ　ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｎｉｍａｌｉｓ、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ　ｆｉｍｉ、Ｃｏｒｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｏｍｅｒａｎｓ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ　（Ｇｌｏｅｏｔｈｅｃｅ　ｃｉｔｒｉｆｏｒｍｉｓ）　ＰＣＣ７４２４、Ｄｅｓｕｌｆｏｃｏｃｃｕｓ　ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ、Ｅｒｗｉｎｉａ　ａｍｙｌｏｖｏｒａ、Ｆｒａｎｋｉａ　ａｌｎｉ、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ　ｓｕｌｆｕｒｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｋｉｔａｓａｔｏｓｐｏｒａ　ｓｅｔａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ由来）とのアラインメント解析を行ったところ、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端領域にはＣａｓ１１ｅに特徴的なα－ヘリックス領域が数カ所保存されていることが見出された（図１）。さらに、各種ｔｙｐｅ　Ｉ－Ｄ　Ｃａｓ１０ｄ　Ｃ－ｔｅｒ（Ａｎａｂａｅｎａ　ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａ、Ｃａｌｏｔｈｒｉｘ　ＰＣＣ６３０３　（Ｃａｌｏｔｈｒｉｘ　ｐａｒｉｅｔｉｎａ）、Ｃｒｉｎａｌｉｕｍ　ｅｐｉｐｓａｍｍｕｍ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ　ＰＣＣ７４２４　（Ｇｌｏｅｏｔｈｅｃｅ　ｃｉｔｒｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ　ｋｉｌａｕｅｅｎｓｉｓ、Ｇｌｏｅｏｃａｐｓａ　ｓｐ．　ＰＣＣ７４２８、Ｈａｌｏｔｈｅｃｅ　ＰＣＣ７４１８、Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ　ｈｕｎｇａｔｅｉ、Ｎｏｓｔｏｃ　ｓｐ．　ＮＩＥＳ－２１１１、Ｒｉｖｕｌａｒｉａ　ｓｐ．　ＰＣＣ７１１６、Ｓｔａｎｉｅｒｉａ　ｃｙａｎｏｓｐｈａｅｒａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ　ｓｐ．　ＰＣＣ６８０３由来）をＣａｓ１１ｅとアラインメント解析により比較した。
実施例２：Ｃａｓ１０ｄ　Ｃ－ｔｅｒ（Ｃａｓ１１ｄ）の発現が細胞中でのゲノム編集活性に及ぼす影響の解析
　Ｃａｓ１１ｄの発現が真核生物におけるＴｉＤのゲノム編集活性に及ぼす影響を解析するため、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　ＰＣ９８０８株のＣａｓ１０ｄ遺伝子から、Ｃａｓ１１ｄ配列に相当すると考えられる遺伝子配列領域（Ｃａｓ１０ｄ遺伝子のストップコドンより４８３ｂ上流まで）をクローン化し動物細胞発現ベクターを構築し、Ｃａｓ１１ｄ発現ベクターとした。Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、Ｃａｓ１０ｄ及びｇＲＮＡの各発現ベクターと共に、Ｃａｓ１１ｄ発現ベクターを同時にＨＥＫ２９３細胞に導入し、Ｌｕｃレポーターアッセイによりゲノム編集活性を解析した。終止コドンによって分離される３００ｂｐ相同性アームならびにＴｉＤ標的部位を含有するヒトＡＡＶＳ１遺伝子フラグメントを含有するＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼを組換えレポーターとして用いた。各単一Ｃａｓ発現ベクター、ＴｉＤ　ｃｒＲＮＡ発現ベクター、および標的配列が導入されたＬＵＣレポーターベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞中に同時トランスフェクトし、トランスフェクション後７２時間、ルミネッセンスによりエンドヌクレアーゼ切断を検出した。
　その結果、Ｃａｓ１１ｄを別途発現させる事によって、Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、Ｃａｓ１０ｄ及びｃｒＲＮＡの各発現ベクターによるゲノム編集活性と比較し、２．５倍の活性上昇が示された（図２）。また、標的化に用いるｃｒＲＮＡ長について、短縮形である３０塩基長の標的配列（配列番号２３：５’－ＣＣＴＡＧＴＧＧＣＣＣＣＡＣＴＧＴＧＧＧＧＴＧＧＡＧＧＧＧＡ－３’）を標的とするｃｒＲＮＡの場合でもＣａｓ１１ｄの発現効果が認められた（図２）。
実施例３：Ｃａｓ１０ｄ　Ｃ－ｔｅｒ（Ｃａｓ１１ｄ）の発現による、ヒトゲノム編集の解析
　Ｃａｓ１１ｄの発現効果として、ヒトゲノム上の標的にどのような変異が誘導されるか解析した。Ｌｕｃレポーターアッセイに用いたヒトＡＡＶＳ遺伝子の標的化ｇＲＮＡ　ＡＡＶＳ　ＧＴＣ＿７０－１０７（３５ｂ）を組み込んだｇＲＮＡ発現ベクターおよび各単一Ｃａｓ発現ベクターと共に、Ｃａｓ１１ｄ発現ベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞中にトランスフェクトした。ＡＡＶＳ標的部位付近を含む１０－１９ｋｂを増幅するプライマーセットを用いて、ＴｉＤベクター導入ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の全ＤＮＡから、ＤＮＡフラグメントをＰＣＲ増幅し、得られたＰＣＲ産物をクローン化し、サンガー法によって配列決定した。
　プライマーとして、Ｆ１（配列番号２４：５’－ＣＴＴＡＧＣＡＴＡＡＴＧＴＣＣＴＣＡＡＧＡＴＡＣＡＴＣＴＡＣ－３’）およびＲ１（配列番号２５：５’－ＧＡＴＡＴＧＴＡＡＣＣＡＴＴＡＴＴＣＴＡＧＡＴＧＧＣＴＡＴＧ－３’）、ならびにプライマーＦ２（配列番号２６：５’－ＧＧＧＴＣＣＡＡＧＧＧＡＡＡＡＧＧＡＧＧＡＣＴＧＡＴＣＣ－３’）およびＲ２（配列番号２７：５’－ＡＴＡＡＡＣＡＣＡＡＡＣＴＣＡＴＡＡＡＣＡＡＣＡＴＡＣＡＴＣ－３’）を用いた。
　まず図３Ａに示すプライマーＦ１およびＲ１を用いてＰＣＲを行い得られた増幅ＤＮＡを、これを１ｓｔ－ＰＣＲ産物とした。次に１ｓｔ－ＰＣＲ産物を２０倍～５０倍希釈し、図３Ａに示すプライマーＦ２およびＲ２を用いてＰＣＲを行い、電気泳動解析を行った。結果を図３Ｂに示す。レーン１はＴｉＤを発現させない野生型ＨＥＫ２９３細胞由来ＤＮＡを用いたＰＣＲ産物である。レーン２および３はＣａｓ１１ｄ発現ベクターを含まないＴｉＤを導入した実験の結果であり、レーン２は標的配列の代わりに非特異的な配列（配列番号２８：５’－ＡＡＡＴＡＡＡＴＡＧＣＧＧＴＣＧＧＧＴＧＣＣＣＣＧＡＡＴＴＴＣＡＣＡＴ－３’）に対応する配列を含むｇＲＮＡ用い、レーン３は標的配列ＡＡＶＳ　ＧＴＣ＿７０－１０７（３５ｂ）に対応する配列を含むｇＲＮＡを用いた結果である。レーン４および５はＣａｓ１１ｄ発現ベクターを含むＴｉＤを導入した実験の結果であり、レーン４は、標的配列の代わりに非特異的な配列に対応する配列を含むｇＲＮＡを用い、レーン５はＡＡＶＳ　ＧＴＣ＿７０－１０７（３５ｂ）に対応する配列を含むｇＲＮＡを用いた結果である。
　その結果、ＴｉＤの導入により、標的部位で６ｋｂを超える長鎖領域欠失が生じた。興味深いことに、Ｃａｓ１１ｄ発現ベクターを導入した実験区では、Ｃａｓ１１ｄ発現ベクターを含まない実験区に比べ、より長い欠失が生じることがシーケンス解析の結果から明らかとなった（図３Ｃ，Ｄ）。
SEQ ID NO:1; Microcystis aeruginosa Cas3d amino acid sequence
SEQ ID NO:2; Microcystis aeruginosa Cas5d amino acid sequence
SEQ ID NO:3; Microcystis aeruginosa Cas6d amino acid sequence
SEQ ID NO:4; Microcystis aeruginosa Cas7d amino acid sequence
SEQ ID NO:5; Microcystis aeruginosa Cas10d amino acid sequence
SEQ ID NO:6; Microcystis aeruginosa Cas11d amino acid sequence
SEQ ID NO:7; TiDcrRNA containing repeat (37b) and spacer (35b of N).  N is any nucleotide constituting a sequence that forms base pairs with a target nucleotide sequence
SEQ ID NO:8; Anabaena cylindrica Cas11d amino acid sequence
SEQ ID NO:9; Calothrix PCC6303 (Calothrix parietina) Cas11d amino acid sequence
SEQ ID NO:10; Crinalium epipsammum Cas11d amino acid sequence
SEQ ID NO:11; Cyanothece PCC7424 (Gloeothece citriformis) Cas11d amino acid sequence
SEQ ID NO:12; Gloeobacter kilaueensis Cas11d amino acid sequence
SEQ ID NO:13; Gloeocapsa sp. PCC7428 Cas11d amino acid sequence
SEQ ID NO:14; Halothece PCC7418 Cas11d amino acid sequence
SEQ ID NO:15; Methanospirillum hungatei Cas11d amino acid sequence
SEQ ID NO:16; Nostoc sp. NIES-2111 Cas11d amino acid sequence
SEQ ID NO:17; Rivularia sp. PCC7116 Cas11d amino acid sequence
SEQ ID NO:18; Stanieria cyanosphaera Cas11d amino acid sequence
SEQ ID NO:19; Synechocystis sp. PCC6803 Cas11d amino acid sequence
SEQ ID NO:20; Target sequence (35b)
SEQ ID NO:21; Monopartite nuclear localizing signal (NLS) amino acid sequence
SEQ ID NO:22; DNA fragment for pre-mature crRNA
SEQ ID NO:23; Target sequence (30b)
SEQ ID NO:24; Primer F1
SEQ ID NO:25; Primer R1
SEQ ID NO:26; Primer F2
SEQ ID NO:27; Primer R2
SEQ ID NO:28; Non-specific sequence
SEQ ID NO:29; Escherichia coli Cas11e amino acid sequence
SEQ ID NO:30; Acetobacter pasteurianus Cas11e amino acid sequence
SEQ ID NO:31; Acidimicrobium ferrooxidans Cas11e amino acid sequence
SEQ ID NO:32; Amycolatopsis mediterranei Cas11e amino acid sequence
SEQ ID NO:33; Bifidobacterium animalis Cas11e amino acid sequence
SEQ ID NO:34; Cellulomonas fimi Cas11e amino acid sequence
SEQ ID NO:35; Coriobacterium glomerans Cas11e amino acid sequence
SEQ ID NO:36; Cyanothece (Gloeothece citriformis) PCC7424 Cas11e amino acid sequence
SEQ ID NO:37; Desulfococcus oleovorans Cas11e amino acid sequence
SEQ ID NO:38; Erwinia amylovora Cas11e amino acid sequence
SEQ ID NO:39; Frankia alni Cas11e amino acid sequence
SEQ ID NO:40; Geobacter sulfurreducens Cas11e amino acid sequence
SEQ ID NO:41; Kitasatospora setae Cas11e amino acid sequence
SEQ ID NO:42; Lactobacillus fermentum Cas11e amino acid sequence

Claims (26)

  1. 　標的ヌクレオチド配列を標的化する方法であって、細胞中に、
    　（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤのＣａｓタンパク質　Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含むポリペプチド、またはこれらのタンパク質およびポリペプチドをコードする核酸、
    　（ｉｉ）Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まず、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列を含むポリペプチド、または該ポリペプチドをコードする核酸、および
    　（ｉｉｉ）前記標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡ、または該ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ
    を導入することを含む方法。
  2. 　標的ヌクレオチド配列を改変する方法であって、細胞中に、
    　（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤのＣａｓタンパク質　Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含むポリペプチド、またはこれらのタンパク質およびポリペプチドをコードする核酸、
    　（ｉｉ）Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まず、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列を含むポリペプチド、または該ポリペプチドをコードする核酸、および
    　（ｉｉｉ）前記標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡ、または該ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ
    を導入することを含む方法。
  3. 　標的遺伝子の転写を制御する方法であって、前記標的ヌクレオチド配列が標的遺伝子の少なくとも一部のヌクレオチド配列である、請求項１または２記載の方法。
  4. 　前記Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列が１００～４００アミノ酸からなる配列である、請求項１～３のいずれか１項記載の方法。
  5. 　前記細胞が真核細胞である、請求項１～４のいずれか１項記載の方法。
  6. 　改変が塩基の欠失、挿入、又は置換である、請求項２～５のいずれか１項記載の方法。
  7. 　（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤのＣａｓタンパク質　Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含むポリペプチド、
    　（ｉｉ）Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まず、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列を含むポリペプチド、および
    　（ｉｉｉ）標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡ
    を含む複合体。
  8. 　Ｃａｓ３ｄをさらに含む、請求項７記載の複合体。
  9. 　前記Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列が１００～４００アミノ酸からなる配列である、請求項７または８記載の複合体。
  10. 　（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤのＣａｓタンパク質　Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含むポリペプチドをコードする核酸、
    　（ｉｉ）Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まず、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列を含むポリペプチドをコードする核酸、および
    　（ｉｉｉ）標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡまたは該ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ
    を含むベクター。
  11. 　Ｃａｓ３ｄをコードする核酸をさらに含む、請求項１０記載のベクター。
  12. 　前記（ｉ）～（ｉｉｉ）の核酸、または前記（ｉ）～（ｉｉｉ）の核酸およびＣａｓ３ｄをコードする核酸が１つまたは２以上のベクターに含まれる、請求項１０または１１記載の発現ベクター。
  13. 　前記Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列が１００～４００アミノ酸からなる配列である、請求項１１または１２記載のベクター。
  14. 　請求項７～９のいずれか１項記載の複合体をコードするＤＮＡ分子。
  15. 　標的ヌクレオチド配列を標的化するためのキットであって、
    　（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤのＣａｓタンパク質　Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含むポリペプチド、またはこれらのタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸、
    　（ｉｉ）Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まず、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列を含むポリペプチド、または該ポリペプチドをコードする核酸、および
    　（ｉｉｉ）前記標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡ、または該ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ
    を含むキット。
  16. 　標的ヌクレオチド配列を改変するためのキットであって、
    　（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤのＣａｓタンパク質　Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含むポリペプチド、またはこれらのタンパク質およびポリペプチドをコードする核酸、
    　（ｉｉ）Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まず、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列を含むポリペプチド、または該ポリペプチドをコードする核酸、および
    　（ｉｉｉ）前記標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡ、または該ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ
    をキット。
  17. 　前記Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列が１００～４００アミノ酸からなる配列である、請求項１５または１６記載のキット。
  18. 　ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ｄシステムを用いる標的ヌクレオチド配列の標的化において標的化効率を改善する方法であって、Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まず、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列を含むポリペプチド、または該ポリペプチドをコードする核酸を用いることを含む方法。
  19. 　ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ｄシステムを用いる標的ヌクレオチド配列の改変において改変効率を改善する方法であって、Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まず、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列を含むポリペプチド、または該ポリペプチドをコードする核酸を用いることを含む方法。
  20. 　ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ｄシステムを用いる標的ヌクレオチド配列の標的化において標的化効率を改善するための組成物であって、Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まず、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列を含むポリペプチド、または該ポリペプチドをコードする核酸を含む組成物。
  21. 　ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ｄシステムを用いる標的ヌクレオチド配列の改変において改変効率を改善するための組成物であって、Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まず、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列を含むポリペプチド、または該ポリペプチドをコードする核酸を含む組成物。
  22. 　細胞中に、
    　（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤのＣａｓタンパク質　Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含むポリペプチド、またはこれらのタンパク質およびポリペプチドをコードする核酸、
    　（ｉｉ）Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まず、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列を含むポリペプチド、または該ポリペプチドをコードする核酸、および
    　（ｉｉｉ）標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡ、または該ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ
    を導入することを含む、標的ヌクレオチド配列が改変された細胞の製造方法。
  23. 　請求項２２に記載の方法によって標的ヌクレオチド配列が改変された植物細胞を製造することを含む、標的ヌクレオチド配列が改変された植物の製造方法。
  24. 　請求項２２に記載の方法によって標的ヌクレオチド配列が改変された非ヒト動物細胞を製造することを含む、標的ヌクレオチド配列が改変された非ヒト動物の製造方法。
  25. 　標的ヌクレオチド配列を標的化する方法であって、標的ヌクレオチド配列を含む単離核酸に、
    　（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤのＣａｓタンパク質　Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含むポリペプチド、
    　（ｉｉ）Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まず、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列を含むポリペプチド、および
    　（ｉｉｉ）前記標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡ、または該ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ
    を接触させることを含む方法。
  26. 　標的ヌクレオチド配列を改変する方法であって、標的ヌクレオチド配列を含む単離核酸に、
    　（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤのＣａｓタンパク質　Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含むポリペプチド、
    　（ｉｉ）Ｃａｓ１０ｄのＮ末端側のＨＤドメインを含まず、Ｃａｓ１０ｄのＣ末端部分配列を含むポリペプチド、および
    　（ｉｉｉ）前記標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡ、または該ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ
    を接触させことを含む方法。
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