WO2022080486A1 - ポリペプチド、多量体、固相、被検物質の測定方法および試薬キット - Google Patents

ポリペプチド、多量体、固相、被検物質の測定方法および試薬キット Download PDF

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政俊 菅沼
洋一 西川
卓也 久保
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    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring a polypeptide, a multimer, a solid phase, a test substance, and a reagent kit.
  • biotin and a polypeptide belonging to the avidin-streptavidin family are used in various fields.
  • a trap is immobilized on a solid phase such as a plate or particles via streptavidin and biotin, and the target substance is measured using the trap.
  • pretargeting therapy in which an antibody to which avidin is added and a drug to which a biotin group is added is administered to a patient is known (for example, Non-Patent Document 1).
  • this D-biotin (endogenous D-biotin) can bind to avidin or streptavidin. Blood levels of D-biotin may be high, especially if the subject is taking supplements such as vitamins. In such a case, in the immunological measurement method using a blood sample, the biotinylated capture body and the endogenous D-biotin in the blood compete with each other, and some capture bodies cannot be fixed to the solid phase. , Measurement accuracy may decrease. Further, in pretargeting therapy, when an antibody to which avidin is bound is administered to a patient, endogenous D-biotin in the blood may bind to avidin.
  • Patent Document 1 discloses a streptavidin mutant having a reduced affinity for D-biotin and a biotin variant capable of binding to the mutant.
  • An object of the present invention is to provide a polypeptide that does not substantially bind to D-biotin but binds strongly to L-biotin.
  • the present invention also includes a multimer of the polypeptide, a solid phase in which the polypeptide is immobilized, a method for measuring a test substance using the solid phase, and a trap in which the solid phase is bound to L-biotin. It is an object of the present invention to provide a reagent kit.
  • Avidin-Strept A polypeptide belonging to the avidin family, 90% or more of the amino acid residues other than glycine of the polypeptide contains a D-amino acid residue and has a binding ability to L-biotin. , A polypeptide, which has substantially no binding ability to D-biotin.
  • the present invention provides the polypeptide and a multimer of the polypeptide.
  • the present invention provides a reagent kit containing a solid phase on which the polypeptide and the multimer are immobilized, a measurement method using the solid phase, and a trap in which the solid phase and L-biotin are bound.
  • a polypeptide that does not substantially bind to D-biotin and has a binding ability to L-biotin.
  • a reagent kit including a multimer of the polypeptide, a solid phase to which the polypeptide is bound, a measurement method using the solid phase, and a trap in which the solid phase is bound to L-biotin is provided. Will be done.
  • Example 4 It is a graph which shows the result of Example 4. It is a structural model before substituting the 21st amino acid involved in the structural maintenance of Example 5 with the L-form. It is a structural model after the 21st amino acid related to the structural maintenance of Example 5 is replaced with the L form. This is a structural model in which the 21st amino acid involved in the structural maintenance of Example 5 was replaced with an L-form, and then the structural optimization was performed by Clean Geometry. 6 is a sensorgram of surface plasmon resonance (SPR) between D-tamavidin TM 2 of Example 7 and L-biotin-labeled albumin.
  • SPR surface plasmon resonance
  • Example 3 is a sensorgram of surface plasmon resonance (SPR) between D-tamavidin TM 2 of Example 7 and D-biotin-labeled albumin. It is a graph which shows the result of Example 8. It is a graph which shows the result of Example 9. It is the structure of L-biotin. It is the structure of D-biotin.
  • SPR surface plasmon resonance
  • polypeptide of this embodiment belongs to the avidin-streptavidin family. In this polypeptide, 90% or more of amino acid residues other than glycine are D-amino acid residues.
  • This polypeptide is a polypeptide having a binding ability to L-biotin and substantially no binding ability to D-biotin.
  • Avidin-streptavidin family polypeptides are naturally composed of L-amino acid residues, except for glycine, which does not have optical isomers.
  • the polypeptide of the present embodiment may contain L-amino acid residues, but it is preferable that 90% or more of the amino acid residues other than glycine are D-amino acid residues. In a more preferred embodiment, 95% or more of amino acid residues other than glycine are D-amino acid residues, and in a more preferred embodiment, all amino acid residues other than glycine are present. It is a D-amino acid residue.
  • the polypeptide of the present embodiment does not substantially bind to D-biotin, and therefore, the influence of endogenous D-biotin in the immunological measurement method is affected. Can be reduced. In addition, in pretargeting therapy, the effect of endogenous D-biotin is reduced and the drug can be delivered to the affected area more appropriately.
  • polypeptide includes proteins and fragments thereof.
  • the length of the amino acid of the polypeptide of this embodiment is not particularly limited as long as it has the ability to bind to L-biotin, and is, for example, tens to hundreds of residues.
  • the polypeptide of this embodiment preferably has at least a core sequence.
  • the "core sequence” refers to an amino acid sequence required for binding to biotin among the amino acid sequences of the polypeptide of the present embodiment.
  • Avidin-polypeptide belonging to the streptavidin family includes avidin, streptavidin, avidin-like protein derived from Pleurotus cornucopiae (hereinafter, tamavidin TM), bradavidin, chimera of lizavidin (Rhizavid). Includes variants and the like.
  • a D-type polypeptide eg, D-type avidin (hereinafter referred to as “D-avidin” or “avidin of the present embodiment”), a D-type streptavidin (hereinafter, “D-streptavidin”).
  • streptavidin of the present embodiment D-type tamavidin (trademark) (hereinafter referred to as “D-tamavidin TM” or “tamavidin of the present embodiment”), D-type bradavidin (hereinafter referred to as “bradavidin”).
  • D-Bradavidin D-type bradavidin
  • D-type rezavidin are also included in "avidins-polypeptides belonging to the streptavidin family”.
  • polypeptide variant examples include a polypeptide having a modified amino acid sequence and a polypeptide obtained by chemically treating the polypeptide.
  • modification of the amino acid sequence examples include substitution, deletion, addition and the like of amino acid residues.
  • chemical treatments include deglycosylation.
  • Streptavidin is a biotin-binding protein derived from Streptomyces avidini.
  • D-streptavidin comprises the 19th to 133rd amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the 19th to 133rd amino acid sequences are known as the core sequence of D-streptavidin.
  • D-streptavidin comprises the 13th to 133rd amino acid sequence or the 19th to 133rd amino acid sequence.
  • D-streptavidin comprises the 13th-139th amino acid sequence.
  • D-streptavidin comprises the entire amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the binding property with D-biotin is low, and the binding property with L-biotin is low. Highly binding.
  • Avidin is a biotin-binding protein produced in birds and the like.
  • D-avidin which is an embodiment of the present invention, may contain the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • D-avidin comprises the 2nd to 128th amino acid sequences of SEQ ID NO: 2.
  • the second to 128th amino acid sequences are considered to be the core sequence of D-avidin.
  • D-avidin comprises the entire amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. Since 90% or more of the amino acid residues other than glycine of the amino acid residues other than glycine are composed of D-amino acid residues, the avidin of the present embodiment has low binding property to D-biotin and is compatible with L-biotin. Highly binding.
  • Tamavidin is a protein discovered in Pleurotus cornucopiae. It has a high affinity for biotin and is superior in thermal stability to avidin (International Publication No. 2002/072817).
  • Examples of the amino acid sequence of tamavidin (trademark) include the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 (tamavidin TM 1) and SEQ ID NO: 4 (tamavidin TM 2).
  • D-tamavidin TM 1 comprises the 4th to 129th amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • the 4th to 129th amino acid sequences are considered to be the core sequence of Tamavidin TM 1.
  • D-tamavidin TM 2 contains the amino acid sequences 4 to 127 of SEQ ID NO: 4.
  • the 4th to 127th amino acid sequences are considered to be the core sequence of Tamavidin TM 2.
  • D-tamavidin TM 1 and D-tamavidin TM 2 are different from D-biotin because 90% or more of the amino acid residues other than glycine are composed of D-amino acid residues. The binding property is low and the binding property to L-biotin is high.
  • the core sequence of the polypeptide of the present embodiment may contain L-amino acid residues, but it is preferable that 90% or more of the amino acid residues other than glycine are D-amino acid residues. .. In a more preferred embodiment, 95% or more of the amino acid residues other than glycine in the core sequence are D-amino acid residues, and in a more preferred embodiment, all amino acid residues other than glycine are D-. It is an amino acid residue.
  • the polypeptide of the present embodiment may be a polypeptide containing amino acid modification such as substitution, deletion or addition as compared with the above-mentioned amino acid sequence.
  • a preferred embodiment is a polypeptide having 90% or more homology with the above amino acid sequence, and a more preferred embodiment is a polypeptide having 95% or more homology with the above amino acid sequence.
  • streptavidin variant 1 As a specific example of a polypeptide having a modified amino acid sequence, Qureshi et al. , THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, Vol. 276, No. 49, Issue of December 7, pp.
  • streptavidin variant 1 The streptavidin variant described in 46422-46428, 2001 (hereinafter referred to as "streptavidin variant 1") can be mentioned.
  • Streptavidin variant 1 has a substitution mutation of S45A, T90A and D128A as compared to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 5).
  • the homology between the core sequence of streptavidin and the core sequence of streptavidin variant 1 is 97.4%.
  • the streptavidin of one embodiment is a D-form streptavidin variant 1 (hereinafter referred to as “D-streptavidin variant 1”) and contains the amino acid sequences 19 to 133 of SEQ ID NO: 5.
  • the 19th to 133rd amino acid sequences are known as the core sequence of streptavidin variant 1.
  • the D-streptavidin variant 1 comprises the 13th to 133rd amino acid sequence or the 19th to 139th amino acid sequence.
  • the D-streptavidin variant 1 comprises the 13th to 139th amino acid sequences.
  • the D-streptavidin variant 1 comprises the entire amino acid sequence of SEQ ID NO: 5.
  • streptavidin variant 2 has a substitution mutation of T76R, V125R, V55T and L109T as compared to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 6).
  • the homology between the core sequence of streptavidin and the core sequence of streptavidin variant 2 is 96.5%.
  • the streptavidin of one embodiment is a D-form streptavidin variant 2 (hereinafter referred to as “D-streptavidin variant 2”) and contains the 19th to 133rd amino acid sequences of SEQ ID NO: 6.
  • the 19th to 133rd amino acid sequences are known as the core sequence of streptavidin variant 2.
  • the D-streptavidin variant 2 comprises the 13th to 133rd amino acid sequence or the 19th to 139th amino acid sequence.
  • the D-streptavidin variant 2 comprises the 13th to 139th amino acid sequences.
  • the D-streptavidin variant 2 comprises the entire amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.
  • streptavidin variant 3 The streptavidin variant according to 57-67 (hereinafter referred to as “streptavidin variant 3”) can be mentioned.
  • This protein has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7.
  • the streptavidin of one embodiment is preferably D-form streptavidin variant 3 (hereinafter referred to as “D-streptavidin variant 3”) and preferably contains the entire amino acid sequence of SEQ ID NO: 7.
  • streptavidin variant 4 As another example of the streptavidin variant, Sano et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 94, pp. Examples thereof include the streptavidin variant described in 6153-6158, June 1997 (hereinafter referred to as "streptavidin variant 4"). Streptavidin variant 4 has a substitution mutation of H127D and a deletion mutation of G113-W120 as compared to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 8). The homology between the core sequence of streptavidin and the core sequence of streptavidin variant 2 is 92.2%.
  • the streptavidin of one embodiment is a D-form streptavidin variant 4 (hereinafter referred to as “D-streptavidin variant 4”) and contains the 19th to 125th amino acid sequences of SEQ ID NO: 8.
  • the 19th to 125th amino acid sequences are known as the core sequence of streptavidin variant 4.
  • the D-streptavidin variant 4 comprises the 13th to 125th amino acid sequence or the 19th to 131st amino acid sequence.
  • the D-streptavidin variant 4 comprises the 13th to 131st amino acid sequences.
  • the D-streptavidin variant 4 comprises the entire amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.
  • streptavidin variant 5 As another example of the streptavidin variant, the streptavidin variant described in International Publication No. 2006/088222 (hereinafter referred to as "streptavidin variant 5”) can be mentioned.
  • Streptavidin variant 5 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9.
  • the streptavidin of one embodiment is a D-form streptavidin variant 5 (hereinafter referred to as "D-streptavidin variant 5"), and the first to 20th, 35th to 196th and sequences of SEQ ID NO: 9 and streptavidin. Includes the 213rd to 261st amino acid sequences.
  • the 1st to 20th, 35th to 196th and 213rd to 261st amino acid sequences are known as sequences corresponding to the core sequence of streptavidin variant 5.
  • the D-streptavidin variant 5 comprises the 1st to 24th, 29th to 202nd and 207th to 261st.
  • the D-streptavidin variant 5 comprises the entire amino acid sequence of SEQ ID NO: 9.
  • the notation of D- or L- in the present specification is a notation indicating the configuration of a compound based on the IUPAC nomenclature, and a compound that can be produced without breaking this configuration using d-glyceraldehyde as a reference for configuration. It is based on the notation notation that the D-form is used and the enantiomer is called the L-form.
  • L-biotin which is a binding partner of the polypeptide of this embodiment, is an enantiomer of D-biotin.
  • L-biotin is a concept comprising free L-biotin and L-biotin groups added to other substances such as traps.
  • L-biotin can be synthesized by a known method such as, for example, a method in a non-patent document (Journal of the American Chemical Society 1978, 100, 1558-1563), and can be obtained by optical resolution using chiral column chromatography or the like. can.
  • the production method is not particularly limited, and a commercially available product may be used.
  • the binding property of the polypeptide of this embodiment to L-biotin and D-biotin is, for example, a signal in a plate assay using a biotinylated enzyme and a polypeptide-immobilized plate, a change in sensorgram in surface plasmon resonance (SPR), and the like.
  • the dissociation constant (Kd value) can be confirmed as an index.
  • a method for measuring the dissociation constant for example, a known method using SPR analysis, isothermal titration calorimetry analysis, or the like can be used.
  • Biacore T200 (Cytiva) is exemplified.
  • the dissociation constant between the polypeptide of this embodiment and L-biotin is preferably 10-7 M or less, more preferably 10-10 M or less, and most preferably 10-13 M or less.
  • “Substantially having no binding ability to D-biotin” means that, for example, the dissociation constant between the polypeptide of the present embodiment and D-biotin is preferably 10-6 M or more, more preferably 10. It is -4 M or more, more preferably 10-2 M or more.
  • the binding ability between the polypeptide of the present embodiment and L-biotin is measured using Biacore T200 (Cytiva)
  • Biacore T200 Cytiva
  • substantially having no binding ability to D-biotin is synonymous with “substantially not binding to D-biotin”.
  • the method for determining the binding property using the Biacore T200 system is, for example, as follows.
  • Bovine serum albumin is immobilized on flow cells 1 and 3 of the CM5 sensor chip (manufactured by Cytiva) of the Biacore T200 system at a target level of 400 RU by an amine coupling method using an amine coupling kit (Cytiva).
  • L-biotin-labeled albumin and D-biotin-labeled albumin are immobilized on flow cells 2 and 4 at a target level of 400 RU, respectively, by an amine coupling method.
  • Each flow cell is blocked with 1M ethanolamine solution, pH 8.5 (manufactured by Cytiva).
  • the D-biotin-labeled albumin As the D-biotin-labeled albumin, the one whose D-biotin-labeled number per albumin is estimated to be 0.4 by the HABA method is used, and the L-biotin-labeled albumin is prepared under the same conditions as the D-biotin-labeled albumin. Therefore, the one estimated to have the same number of D-biotin labels is used.
  • HBS-EP + (manufactured by Cytiva) is used as a running buffer, and a polypeptide belonging to the avidin-streptavidin family is flowed into each flow cell in the range of 100 pM to 100 nM at a flow rate of 30 ⁇ L / min by a single cycle method, and Biacore T200 Evolution Software ( Data showing changes in the sensorgram in SPR with respect to D-biotin-labeled albumin or L-biotin-labeled albumin (manufactured by Cytiva) are acquired.
  • the data obtained from the flow cell immobilized with bovine serum albumin indicates the background value, and therefore the background value is used to indicate the change in the sensorgram in SPR with respect to D-biotin-labeled albumin or L-biotin-labeled albumin.
  • the data may be normalized.
  • the binding property of the polypeptide belonging to the avidin-streptavidin family is, for example, [data showing the binding property between the L-biotin-labeled albumin and the polypeptide belonging to the avidin-streptavidin family] (hereinafter referred to as "data L1"). And [data showing the binding property between D-biotin-labeled albumin and avidin-streptavidin family of polypeptides] (hereinafter referred to as "data D1").
  • the polypeptide belonging to the avidin-streptavidin family is "D-biotin and parenchyma". It can be determined that it does not bind to each other.
  • the polypeptide belonging to the avidin-streptavidin family "substantially does not bind to D-biotin". Can be determined.
  • the absolute value of the value obtained by subtracting the value of data D1 from the value of data L1 or the value obtained by subtracting the value of data L1 from the value of data D1 is 1/10 or less, 1/100 or less of the value of data L1. Or when it is 1/1000, it can be determined that a polypeptide belonging to the avidin-streptavidin family "substantially does not bind to D-biotin".
  • a biotin measurement system using an ELISA method is constructed based on Example 3 described later, and L.
  • data L2 The value of the enzyme activity when biotin is used
  • data D2 the value of the enzyme activity when D-biotin is used
  • the embodiment according to the multimer is a multimer having the above-mentioned polypeptide as a monomer unit.
  • This multimer can be formed by associating a plurality of the above-mentioned polypeptides.
  • the number of monomer units is not particularly limited.
  • this multimer is a dimer, tetramer or octamer.
  • the polypeptide of the present embodiment can be produced by a known peptide synthesis method.
  • the method for synthesizing the peptide is not particularly limited as long as a desired polypeptide can be obtained.
  • liquid phase synthesis, solid phase synthesis, cell-free synthesis using artificial tRNA, and the like can be mentioned.
  • the number of amino acid residues in the product polypeptide is a certain number or more (generally 30 to 50 residues or more)
  • the polypeptide is ligated by using a known ligation reaction after synthesizing two or more peptide fragments. By doing so, it can be manufactured.
  • the polypeptide of this embodiment can be synthesized, for example, by the following solid-phase synthesis method.
  • the carboxyl group of the amino acid at the first residue, which protects the nitrogen atom of the amino group is bonded to the resin.
  • the protecting group of the reactant obtained by the binding reaction of (1) or (3) is desorbed with a deprotecting agent, and then washed with a solvent to form a free amino acid.
  • the free amino acid obtained in (2) above and an arbitrary amino acid whose amino group is protected by a protecting group are condensed using a condensing agent.
  • the protecting group of the product of (3) above is desorbed with a deprotecting agent to form a free amino acid.
  • a polypeptide in which an arbitrary amino acid having a resin bonded to the C-terminal is linked can be obtained.
  • Any polypeptide to which the protecting group is bound is obtained by protecting the N-terminal amino group of the polypeptide to which the resin washed in (6) is bound with a protecting group and then cleaving the resin with an acid. Can be obtained.
  • Each process may be hand-synthesized or an automatic synthesizer or the like may be used.
  • a part may be manually synthesized and an automatic synthesizer may be used as appropriate.
  • Examples of the automatic synthesizer include Liberty Blue (manufactured by CEM), Multipep2 (manufactured by CEM), Initiator + Alstra (manufactured by Biotage), AMD II (manufactured by Biotage), and the like, but are not particularly limited.
  • the resin used in (1) may be a known resin used in the solid phase synthesis method.
  • the resin for supplying the C-terminal as an amide group include a Rink-Amide-resin (manufactured by Merck KGaA) functionalized with an amino group, a Rink-Amide-PEGA-resin (manufactured by Merck KGaA), and Fmoc-NH-. It is preferable to use SAL-resin (manufactured by Watanabe Chemical Industry Co., Ltd.).
  • Fmoc-NH-SAL-resin-linker manufactured by Watanabe Chemical Industry Co., Ltd.
  • Amino-PEGA-resin manufactured by Merck KGaA
  • Examples of the resin for converting the C-terminal to a carboxylic acid include 2-chlorotrityl chloride resin functionalized with chlorine (manufactured by Merck KGaA) and Amino-PEGA-resin (Merck) functionalized with an amino group.
  • 2-chlorotrityl chloride resin functionalized with chlorine manufactured by Merck KGaA
  • Amino-PEGA-resin Merck
  • a linker may be present between the Amino-PEGA-resin and the amino acid, and examples of such a linker include 4-hydroxymethylphenoxyacetic acid (HMPA) and 4- (4-hydroxymethyl-3-methoxy). Phenoxy) -butylacetic acid (HMPB) and the like can be mentioned. H-Cys (Trt) -Trityl NovaPEG resin (manufactured by Merck KGaA) in which the amino acid at the C-terminal is preliminarily bonded to the resin can be used.
  • the bond between the resin and the amino acid in which the nitrogen atom of the amino group is protected by a protecting group causes the carboxyl group of the amino acid to be bonded to the resin by an ester bond.
  • a resin functionalized with an amino group is used, the carboxyl group of the amino acid is bound to the resin by an amide bond.
  • the protecting group may be any known protecting group, for example, 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) group, t-butyloxylcarbonyl (Boc) group, benzyl group, allyloxycarbonyl group, acetyl group and the like. Carbonyl or amide protecting groups can be used.
  • a protecting group into an amino acid for example, when introducing an Fmoc group, it can be introduced by adding 9-fluorenylmethoxycarbonyl-N-succinimidyl carbonate and sodium carbonate to carry out a reaction. ..
  • the reaction temperature is 0 to 50 ° C., preferably room temperature, and the reaction time is 1 to 5 hours, preferably 3 hours.
  • amino acid in which the nitrogen atom of the amino group is protected by using a protecting group a commercially available amino acid may be used.
  • an amino acid protected with a protecting group and having a protecting group introduced in the side chain may be used.
  • an HMPB resin When a resin having a hydroxyl group is used, for example, an HMPB resin can be used as an esterification catalyst.
  • known dehydration condensing agents such as 1-mesitylenesulfonyl-3-nitro-1,2,4-triazole (MSNT), dicyclohexylcarbodiimide (DCC), and diisopropylcarbodiimide (DIC) may be used.
  • MSNT 1-mesitylenesulfonyl-3-nitro-1,2,4-triazole
  • DCC dicyclohexylcarbodiimide
  • DIC diisopropylcarbodiimide
  • the ratio of the amino acid to the dehydration condensing agent is usually 1 to 10 equivalents, preferably 1 to 5 equivalents, with respect to 1 equivalent of the former.
  • the esterification reaction is preferably carried out, for example, by providing a resin on a solid-phase column, washing with a solvent, and adding an amino acid solution.
  • the cleaning solvent include dimethylformamide (DMF), 2-propanol, dichloromethane (DCM) and the like.
  • the solvent for dissolving the amino acid include dimethyl sulfoxide (DMSO), DMF, DCM and the like.
  • the reaction temperature of the esterification reaction is 0 to 50 ° C., preferably room temperature, and the reaction time is about 10 minutes to 30 hours, preferably about 15 minutes to 24 hours.
  • Desorption of the fat-soluble protecting group can be performed, for example, by treating with a base.
  • a base include piperidine, morpholine and the like.
  • a solvent examples include DMF, DMSO, methanol and the like.
  • amidation reaction between the free amino group and the carboxy group of any amino acid whose amino group nitrogen is protected by a protecting group is preferably carried out in the presence of an activator, a base and a solvent.
  • activator examples include DIC, DCC, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (WSC / HCl), diphenylphosphoryl azide (DPPA), carbonyldiimidazole (CDI), diethyl.
  • Cyanophosphonate (DEPC), benzotriazole-1-yloxy-trispyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOP), 1-hydroxybenzotriazole (HOBt), hydroxysuccinimide (HOSu), dimethylaminopyridine (DMAP), 1-hydroxy- 7-azabenzotriazole (HOAt), hydroxyphthalimide (HOPht), pentafluorophenol (Pfp-OH), O- (1H-6-chlorobenzotriazole-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyl Uronium hexafluorophosphate (HCTU), O- (7-azabenzotriazole-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphonate (HATU), 2- (1H-benzotriazole-) 1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborate (TBTU), 3,4
  • the amount of the activator to be used is preferably 1 to 20 equivalents, preferably 1 to 10 equivalents, more preferably 1 to 5 equivalents, relative to any amino acid protected with an amino group nitrogen by a protecting group. ..
  • a base that can coexist with the alkylation reaction is preferable.
  • DIPEA N-ethyldiisopropylamine
  • DBU 1,8-diazabicyclo [5.4.0] undec-7-ene
  • DMAP 1,4-diazabicyclo [2.2.2] octane
  • DBN 2,6-Dimethylpyridine
  • TAA triethylamine
  • DBN 1,5-diazabicyclo [4.3.0] nona-5-ene
  • DBN 1,5-diazabicyclo [4.3.0] nona-5-ene
  • the solvent examples include DMF, DMSO, and DCM.
  • the reaction temperature is 0 to 50 ° C., preferably room temperature, and the reaction time is preferably about 10 minutes to 30 hours, preferably about 15 minutes to 24 hours. Desorption of the protecting group can be performed in the same manner as described above. It is preferable to treat with an acid to cleave the peptide chain from the resin.
  • the acid include trifluoroacetic acid (TFA).
  • NCL method Native chemical ligation
  • NCL method can be used as a known ligation reaction in which two or more peptide fragments are ligated (Dawson et al., Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation. Science, 266: 767-779). 1994)).
  • the NCL method is a chemical selection reaction between a first peptide having an ⁇ -carboxythioester moiety at the C-terminal and a second peptide having a cysteine residue at the N-terminal, and is a thiol group (SH group) in the side chain of cysteine.
  • SH group thiol group
  • sulfhydryl group selectively react with the carbonyl carbon of the thioester group, and a thiol exchange reaction produces an initial thioester-bonded intermediate. This intermediate spontaneously undergoes intramolecular rearrangement to give the linking site a natural amide bond, while regenerating the cysteine side chain thiol.
  • the cysteine binding site of the second peptide having a cysteine residue at the N-terminal is converted to alanine by a desulfurization reaction (Yanet al., J. Am. Chem. Soc. 123, 526 (2001)) after the ligation reaction. It can also be replaced. That is, a site that is originally alanine can be replaced with cysteine for synthesis, and the site can be used as a binding site for a ligation reaction.
  • Separation and / or purification steps may be included in the steps before and after the peptide synthesis reaction or ligation reaction.
  • the purification method a known method may be used, and examples thereof include column chromatography. Examples of column chromatography include, but are not limited to, normal phase chromatography, reverse phase chromatography, gel filtration chromatography, affinity chromatography and the like.
  • the solvent, the filler of the column, the detection method of the separation target and the purification target, the temperature condition, the pressure condition and the like can be appropriately selected depending on the object for which separation and purification are desired.
  • a known washing, drying, diluting, and concentrating steps may be appropriately included before and after the peptide synthesis reaction, ligation reaction or separation and / or purification step.
  • the polypeptide is not folded correctly, it is preferable to refold it.
  • refolding for example, the purified polypeptide is dissolved in a denaturing buffer containing urea, guanidine hydrochloride, etc., or a denaturing agent such as urea, guanidine hydrochloride is added to the crude purified solution of the fusion polypeptide, and the fusion poly After dissolving the aggregate of the peptide, for example, the diluted refolding method, the dialysis refolding method, the solid phase refolding method, and the size exclusion chromatograph described in the non-patent document (Arakawa et al., Antibodies 232 (2014)). It can be performed by a chromatographic refolding method, a surfactant refolding method, or the like. A dialysis refolding method is preferred.
  • the measurement method of the present embodiment is a method of measuring a test substance in a sample in vitro using a solid phase on which the above-mentioned polypeptide or a multimer thereof is immobilized and a capture body immobilized on the solid phase. Is.
  • the trap a substance that specifically binds to the test substance can be used.
  • L-biotin and its variants are added directly or indirectly to the trap.
  • the trap include antibodies, antigens, aptamers, lectins, nucleic acids, enzymes and the like, but are not particularly limited.
  • the "antibody” used as a trap or a detector described below can be a full-length antibody or a fragment thereof.
  • the class of antibody may be any of IgG, IgA, IgM, IgD and IgE, but IgG is preferable.
  • the subclass of IgG is not particularly limited and may be any of IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4.
  • Examples of antibody fragments include reduced IgG (rIgG), Fab, Fab', F (ab'), F (ab') 2, Fv, single-chain antibody (scFv), diabodies, triabodies and the like. Be done. The methods for preparing these antibody fragments are known.
  • the antibody may be either a monoclonal antibody or a polyclonal antibody, but is preferably a monoclonal antibody.
  • the monoclonal antibody may be a chimeric antibody, a humanized antibody, a fully humanized antibody, or the like. Further, the antibody may be an antibody derived from any animal such as mouse, rat, hamster, rabbit, goat, horse, camel, alpaca, and chicken.
  • the test substance may be a substance to be detected by the measurement method of the present embodiment and may be a substance that can be captured by the trap.
  • Examples of the test substance include, but are not limited to, cells, extracellular vesicles, proteins, nucleic acids, polysaccharides, glycoproteins, phospholipids and the like.
  • the sample is a sample containing a test substance or a sample suspected of containing a test substance.
  • samples include biological samples, environmental samples, and pretreated samples.
  • biological samples include body fluids and excrement.
  • body fluids are not particularly limited as long as they are samples collected from a living body, but are serum, plasma, blood, spinal fluid, semen, tissue, tissue fluid, lymph, saliva, nasopharyngeal swab, sputum, and bronchoalveolar lavage fluid. And so on.
  • Examples of excrement include, but are not limited to, urine, feces and the like.
  • environmental samples include sewage, river water, seawater, and soil.
  • the above-mentioned polypeptide or its multimer is immobilized on a solid phase.
  • the embodiment of the fixation is not particularly limited.
  • the above-mentioned polypeptide or its multimer may be directly bound to the solid phase, or may be indirectly bound.
  • Examples of the direct bond include physical adsorption.
  • Indirect binding is an embodiment in which another substance intervenes between the above-mentioned polypeptide or its multimer and the solid phase.
  • a blocking agent such as bovine serum albumin or polyethylene glycol
  • the above-mentioned polypeptide or its multimer is bound to the solid phase and the blocking agent to form the above-mentioned polypeptide or its multimer.
  • the multimer can be immobilized on the solid phase.
  • the capture body and the solid phase may be separately provided to the user, or the capture body and the solid phase may be provided to the user in a state of being fixed to the solid phase in advance. ..
  • the measurement method of the present embodiment may include a step of contacting the sample, the solid phase, and the capture body. In this step, the order of contact between the sample, the solid phase, and the trap is not particularly limited. Preferably, the sample and the trap are brought into contact with each other to form a complex of the test substance in the sample and the trap, and then the complex and the solid phase are brought into contact with each other to form a complex on the solid phase. ..
  • the above-mentioned polypeptide or multimer immobilized on the solid phase does not substantially bind to D-biotin and captures the L-biotin group. Can bind to the body.
  • the capture body and the solid phase are separately provided to the user in that the solid phase can be shared with a plurality of types of test substances.
  • the measuring method of the present embodiment is a step of forming a complex (hereinafter, also referred to as “sandwich complex”) containing a trap, a test substance, and a detector on a solid phase (hereinafter, “complex forming step”). ”) And a step of measuring a signal based on the detector contained in this complex (hereinafter, also referred to as a“ measurement step ”).
  • a sandwich complex can be formed on the solid phase by contacting the solid phase, the capture body, the sample containing the test substance, and the detector.
  • the order of contact between the solid phase, the trap, the sample, and the detector is not particularly limited.
  • the sample and the trap are brought into contact with each other to form a complex of the test substance in the sample and the trap, and then the complex and the solid phase are brought into contact with each other to form a complex on the solid phase.
  • the complex and the detector are brought into contact with each other to form a sandwich complex on the solid phase.
  • the above-mentioned polypeptide or multimer immobilized on the solid phase does not substantially bind to D-biotin and contains an L-biotin group. Can bind to the captive.
  • B / F separation After forming a complex of the test substance and the trapped substance on the solid phase, it is preferable to perform B / F separation to remove unreacted components before contacting the detector.
  • the reaction conditions for example, solvent, temperature, pressure, reaction time, etc.
  • each component in the complex forming step can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the detector preferably contains a substance that binds to the test substance and a labeling substance.
  • the substance that binds to the test substance include antibodies, antigens, aptamers, lectins, nucleic acids and the like.
  • the detector may include a primary substance that binds to the test substance and a secondary substance that includes a labeling substance and binds to the primary substance.
  • Primary and secondary substances include, for example, antibodies, antigens, aptamers, lectins, nucleic acids and the like. When both the primary substance and the secondary substance are antibodies, they are called primary antibody and secondary antibody, respectively, and are widely used in the art.
  • a sandwich complex containing a labeling substance can be formed by binding the primary antibody to the test substance and binding the secondary antibody to the primary antibody.
  • the primary substance is a primary antibody that is derived from an animal such as a mouse or a rabbit and specifically binds to the test substance
  • the secondary substance contains a labeling substance and is specific to the antibody of the animal. It is a secondary antibody that binds to the target.
  • the labeling substance is not particularly limited, and examples thereof include a substance that generates a signal by itself (hereinafter, also referred to as a “signal generating substance”) and a substance that catalyzes the reaction of another substance to generate a signal. ..
  • the signal generating substance include a fluorescent substance, a radioisotope, and a coloring substance.
  • substances that catalyze the reaction of other substances to generate a detectable signal include enzymes.
  • the fluorescent substance include fluorescent dyes such as fluorescein isothiocyanate (FITC), rhodamine, Alexa Fluor (registered trademark), and fluorescent proteins such as GFP. Radioisotopes include 125 I, 14 C, 32 P and the like.
  • Examples of the color-developing substance include metal colloids such as gold nanocolloids.
  • Examples of the enzyme include alkaline phosphatase, peroxidase, ⁇ -galactosidase, glucosidase, polyphenol oxidase, tyrosinase, acid phosphatase, luciferase and the like.
  • the preferred labeling material is an enzyme, with alkaline phosphatase being particularly preferred.
  • the test substance can be measured by measuring the signal based on the detector. Based on the values obtained by the measurement step, quantitative, qualitative or semi-quantitative detection of the test substance can be performed.
  • the semi-quantitative detection means that the intensity of the signal is shown stepwise, such as "no signal generated”, “weak”, “medium”, “strong” and the like.
  • the method itself for detecting a signal is known in the art.
  • a method according to the type of the signal derived from the above-mentioned labeling substance may be appropriately selected.
  • the signal detection device for example, an absorbance meter, a spectrophotometer, a fluorescence photometer, an infrared photometer, a Raman spectrophotometer, an SPR measuring device, a chemiluminescent enzyme immunoassay device, and the like can be used, but are particularly limited. Not done.
  • the test substance in the sample is immunologically measured.
  • the immunological measurement method include an ELISA method, an immunochromatographic method, and an immune complex transfer method described in JP-A No. 1-254868.
  • the target nucleic acid in the sample is measured as a test substance.
  • a solid phase in which the above-mentioned polypeptide or multimer is immobilized and a nucleic acid probe that hybridizes to a target nucleic acid can be used as a trap.
  • the nucleic acid probe is labeled with L-biotin and binds to the polypeptide or multimer of the present embodiment on a solid phase.
  • a DNA elongation reaction is carried out on the solid phase using a target nucleic acid as a template and a nucleic acid probe as a primer by DNA polymerase and dNPTs.
  • DNA can be detected by a known method.
  • the synthesized amplicon can be labeled with an intercalator (eg, SYBR TM Green I dye, ethidium bromide, etc.) as a detector and the fluorescence can be measured.
  • an intercalator eg, SYBR TM Green I dye, ethidium bromide, etc.
  • a fluorescent probe capable of binding to an extended chain can be bound as a detector to measure fluorescence.
  • the TaqMan TM method may be used. An example of the measurement method of the present embodiment will be described with reference to FIG.
  • the sample containing the test substance 81 and the R1 reagent are dispensed into the container 90.
  • the first reagent dispensing unit 551 dispenses the R1 reagent into the container 90
  • the sample dispensing section 530 dispenses the sample into the container 90.
  • the R1 reagent contains the capture body 84 to which L-biotin is added, and reacts with and binds to the test substance 81.
  • the sample in the container 90 is heated to a predetermined temperature in the reaction unit 580, so that the capture body 84 and the test substance 81 are bound to each other.
  • the R2 reagent is dispensed into the container 90 by the second reagent dispensing section 552.
  • the R2 reagent contains a solid phase 82.
  • the solid phase 82 is immobilized on the polypeptide of the present embodiment or a multimer thereof.
  • the sample in the container 90 is heated to a predetermined temperature in the reaction unit 580.
  • the test substance 81 and the trap 84 are fixed to the solid phase 82 by binding the L-biotin to the polypeptide of the present embodiment or a multimer thereof on the solid phase.
  • test substance 81 and the capture body 84 formed on the solid phase 82 and the unreacted capture body 84 may be separated by a primary BF separation treatment by the BF separation device 100.
  • the primary BF separation treatment unnecessary components such as the unreacted trap 84 are removed from the container 90.
  • the R3 reagent is dispensed into the container 90 by the third reagent dispensing section 553.
  • the R3 reagent contains the detector 83 and reacts with and binds to the test substance 81.
  • the sample in the container 90 is heated to a predetermined temperature in the reaction unit 580.
  • a sandwich complex 85 containing the test substance 81, the detector 83, and the trap 84 is formed on the solid phase 82.
  • the detector 83 is an enzyme-labeled antibody.
  • the sandwich complex 85 formed on the solid phase 82 and the unreacted labeling substance 83 are separated by a secondary BF separation treatment by the BF separation device 100.
  • the secondary BF separation treatment unnecessary components such as the unreacted detector 83 are removed from the container 90.
  • the R4 reagent and the R5 reagent are dispensed into the container 90 by each of the 4th reagent dispensing section 554 and the 5th reagent dispensing section 555.
  • the R4 reagent contains a buffer solution.
  • the sandwich complex 85 bound to the solid phase 82 is dispersed in the buffer solution.
  • the R5 reagent contains a chemiluminescent substrate.
  • the buffer solution contained in the R4 reagent has a composition that promotes the reaction between the enzyme labeled on the detector 83 contained in the sandwich complex 85 and the chemiluminescent substrate contained in the R5 reagent.
  • the sample in the container 90 is heated to a predetermined temperature in the reaction unit 580.
  • Light is generated by reacting the substrate with the detector 83, and the generated light is detected by the photodetector 521 of the detection unit 520.
  • the test substance 81 is measured based on the detected light intensity.
  • the R1 reagent and the R2 reagent are separately dispensed into the container 90, but the R1 reagent and the R2 reagent are mixed in advance, and the container is in a state where the capture body 84 is fixed to the solid phase 82. It may be dispensed into 90.
  • the solid phase of this embodiment is a solid phase in which the above-mentioned polypeptide or a multimer thereof is immobilized.
  • the solid phase of the present embodiment is an insoluble carrier for fixing the trap.
  • the mode of immobilization of the above-mentioned polypeptide or its multimer to the solid phase is as described above.
  • the solid phase can be selected from known solid phases according to the purpose.
  • As the material of the solid phase for example, a polymer compound, an inorganic substance, or the like can be selected.
  • As the solid phase material a plurality of materials may be appropriately combined.
  • Polymer compounds include organic polymer compounds, inorganic polymer compounds, and semi-organic compounds.
  • Polymer compounds include, for example, latex, rubber, polystyrene, polyethylene, polypropylene, styrene-butadiene copolymer, polyvinyl chloride, polyvinyl chloride, polyacrylamide, polymethacrylate, styrene-methacrylate copolymer, polyglycidylmethacrylate, achlorin-.
  • Examples thereof include ethylene glycol dimethacrylate copolymer, polyvinylidene difluoride (PVDF), silicone, insoluble agarose, and insoluble dextran.
  • PVDF polyvinylidene difluoride
  • Inorganic substances include inorganic compounds and metals.
  • the inorganic compound include magnetic substances (iron oxide, chromium oxide, cobalt, nickel, ferrite, magnetite, etc.), glass, silica, alumina and the like.
  • the metal include gold, silver and substances containing them.
  • the reagent kit of the present embodiment includes a solid phase to which the above-mentioned polypeptide or a multimer thereof is bound, and a trap to which L-biotin is added.
  • FIG. 2 An example of the reagent kit of this embodiment is shown in FIG.
  • 11 shows a reagent kit
  • 12 shows a first container containing a reagent containing the above-mentioned polypeptide or particles bound to a multimer thereof
  • 13 shows a capture with L-biotin added.
  • a second container containing a reagent containing a body is shown
  • 14 is a packing box
  • 15 is a package insert.
  • the package insert may describe the composition, usage, storage method, etc. of each reagent.
  • Reagent kits may include other reagents, such as buffer solutions, calibrators, detectors, and the like.
  • Example 1 Preparation of D-streptavidin 1-1. Method
  • a polypeptide consisting of the 13th to 139th amino acids of the polypeptide shown in SEQ ID NO: 1 D-coastreptavidin
  • a peptide thioester consisting of the 13th to 71st amino acids of SEQ ID NO: 1 and 72 A polypeptide consisting of the 139th amino acid was synthesized from the polypeptide in which the alanine residue was replaced with cysteine.
  • Fmoc-D-Ser (tBu) -OH 500 ⁇ mol
  • Fmoc-D-Asp (OtBu)-(Hmb) -Gly-OH 1st time: 150 ⁇ mol,) amino acids whose side chains were protected with a protecting group by the same procedure.
  • Fmoc-D-Asp (OtBu)-(Hmb) -Gly-OH was condensed by double coupling.
  • acetic anhydride 1.5 mL, 15 mmol
  • pyridine 1.2 mL, 15 mmol
  • a polypeptide having a total length of 127 residues was dissolved in a denaturing buffer (50 mM Tris-HCl, 6M guanidine-HCl, 1 mM EDTA, 200 mM NaCl, pH 8.0 (4 ° C.)) at 1 mg / mL at 85 ° C. for 45 minutes. Heated. 5 mL of the heated solution was dialyzed against buffer 1 (50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 200 mM NaCl, pH 8.0) containing 3 M guanidine HCl at 4 ° C. for 12 hours.
  • a denaturing buffer 50 mM Tris-HCl, 6M guanidine-HCl, 1 mM EDTA, 200 mM NaCl, pH 8.0 (4 ° C.)
  • Fraction 8 is the peak of aggregates. Since the fractions 14 to 18 are the fractions in which the same peak was observed in the commercially available tetrameric core streptavidin, it is presumed to be the peak of the tetrameric polypeptide. Fractions 14 to 18 were recovered, concentrated using an Amicon Ultra-15 10K centrifugal filter device (manufactured by Merck KGaA), and a tetramer of D-streptavidin composed of D-amino acid residues. Avidin (hereinafter, simply referred to as "D-streptavidin" in the examples for convenience) was prepared.
  • Example 2 Evaluation of biotin binding property of D-streptavidin by SPR analysis 2-1.
  • L-biotin a mixture of D-biotin and L-biotin is synthesized by the method described in the non-patent document (Journal of the American Chemical Society 1978, 100, 1558-1563), and then optical resolution by liquid chromatography is performed by Daicel. Prepared by outsourcing to the company.
  • CHIRALPAK IG manufactured by Daicel, ⁇ 46 ⁇ 50 mm
  • the mobile phase was a methanol: acetic acid mixed solvent (100: 0.1 (v / v)) with a flow rate of 1.0 mL / min, a column temperature of 40 ° C., and a detection wavelength.
  • Optical resolution was performed under the condition of 205 nm.
  • Bovine serum albumin was added to flow cells 1 and 3 of the CM5 sensor chip (manufactured by Cytiva) of the Biacore T200 system at a target level of 400 RU by an amine coupling method using an amine coupling kit (Cytiva). Immobilized. Further, L-biotin-labeled albumin and D-biotin-labeled albumin were immobilized on flow cells 2 and 4 at a target level of 400 RU, respectively, by an amine coupling method. All flow cells were blocked with 1M ethanolamine solution, pH 8.5 (manufactured by Cytiva).
  • HBS-EP + manufactured by Cytiva
  • D-streptavidin prepared in Example 1 was flowed into each flow cell in the range of 10 pM to 100 nM at a flow rate of 30 ⁇ L / min by a single cycle method.
  • FIG. 4A A sensorgram of the intermolecular interaction between D-streptavidin and L-biotin-labeled albumin is shown in FIG. 4A, and a sensorgram of the intermolecular interaction of D-streptavidin and D-biotin-labeled albumin is shown in FIG. 4B.
  • FIG. 4A A sensorgram of the intramolecular interaction between natural core streptavidin and D-biotin-labeled albumin is shown in FIG.
  • Example 3 Evaluation of the effect of D-biotin on the measurement system in the ELISA method 3-1.
  • Method Preparation of streptavidin-bound solid phase
  • PBS buffer 200 ⁇ L
  • bovine serum albumin 2% bovine serum albumin
  • 6-Aminohexanoic acid (24.2 mg) was dissolved in a 0.25 M aqueous sodium carbonate solution (0.4 mL). This solution was added to a solution of compound 2 in DMF (1 mL) and stirred at room temperature for 23 hours. After distilling off the solvent, the residue was washed with water. Acidify with 4M hydrochloric acid, and the resulting solid is collected by filtration and 6-(5-((3aR, 4R, 6aS) -2-oxohexahydro-1H-thieno [3,4-d] imidazole-4-yl). ) Pentanamide) Caproic acid (Compound 3) (68.5 mg) was obtained.
  • L-Biotin-labeled TSH antibody was prepared. The same treatment was performed for D-biotin-AC5-OSu (manufactured by Dojin Kagaku) to prepare a D-biotin-labeled TSH antibody.
  • FIG. 6 shows the results of TSH detection by the ELISA method in the presence of D-biotin.
  • FIG. 6 shows the percentage of the signal measurement value of each sample when the signal measurement value when the sample having a D-biotin concentration of 0 ng / mL is measured in each measurement system is 100%.
  • the signal decreased in the D-biotin / L-streptavidin measurement system depending on the concentration of D-biotin added.
  • L-biotin / D-streptavidin almost no influence by the addition of D-biotin was observed.
  • the D-streptavidin / L-biotin measurement system was substantially unaffected by the endogenous D-biotin present in the specimen.
  • Example 4 Confirmation of quantitativeness of the measurement system 4-1.
  • Method (1) Add HISC L TM TSH calibration C0 to C5 (manufactured by Sysmex) to 0 ⁇ IU / mL, 2 ⁇ IU / mL, 10 ⁇ IU / mL, 50 ⁇ IU / mL, 120 ⁇ IU / mL or 200 ⁇ IU / mL as a sample in 1.5 mL tube. It was added so as to be.
  • HISC L TM TSH R1 reagent manufactured by Sysmex
  • HISC L TM TSH Calibrator C0 to C5 manufactured by Sysmex
  • FIG. 7 is a graph showing a count value of TSH concentration of 0 to 120 ⁇ IU / mL.
  • TSH concentration 50 ⁇ IU / mL samples were prepared, and the TSH concentration was measured for each sample.
  • the results are shown in Table 2. The coefficient of variation was about 5%. It was found that the measurement system of this example has no problem in terms of reproducibility.
  • Example 5 L-amino acid residue substitution of amino acid residues involved in structure maintenance 5-1.
  • the crystal structure (PDBID: 3RY2) of the natural core streptavidin tetramer was obtained from the protein data bank (PDB), and one monomer structure was extracted from the tetramer.
  • a monomer structure of D-streptavidin was constructed by converting all amino acid residues into D-amino acid residues on Discovery Studio based on the extracted structure. Then, the degree of solvent contact of the amino acid residues constituting the D-streptavidin monomer structure was confirmed.
  • amino acid residues in the core sequence of D-streptavidin amino acid residues other than glycine with a solvent contact degree of 25% or less were identified.
  • amino acid residues are arranged in ascending order of solvent contact degree, 21, 29, 77, 104, 130, 54, 56, 39, 43, 27, 75, 31, 92, 90, 128, 102 of SEQ ID NO: 1. , 33, 79, 71, 73, 106, 23, 60, 96, 81, 122, 28, 86, 88, 50, 45, 108, 38, 110, 132 and 42nd, for a total of 36 amino acid residues. there were. These amino acid residues are thought to be particularly involved in maintaining the structure inside the monomer of D-streptavidin.
  • Example 5 for any of the 36 amino acid residues, the collision between atoms that occurs when the D-amino acid residue is replaced with the L-amino acid residue utilizes the Clean Geometri function. It was solved by performing structural optimization. As an example thereof, FIGS. 8A to 8C show how the atomic collisions that occur when the D-tryptophan residue, which is the 21st amino acid residue, is replaced with the L-tryptophan residue are eliminated. The structure before replacing the 21st D-tryptophan residue with the L-form is shown in FIG. 8A. FIG.
  • FIG. 8B shows how an atomic collision occurs in D-streptavidin when the 21st D-tryptophan residue is replaced with an L-tryptophan residue (the cylinder highlighted by an ellipse indicates the atomic collision). show).
  • FIG. 8C shows how the collision between atoms in D-streptavidin is eliminated by performing structural optimization using the Clean Geometry function.
  • Example 6 Synthesis of Avidin-like Protein from Pleurotus cornucopiae consisting of D amino acid
  • An avidin-like protein derived from Pleurotus cornucopiae consisting of D amino acid (hereinafter, D-tamavidin TM 2) was synthesized.
  • the polypeptide having the 2nd to 141st amino acid sequences of SEQ ID NO: 4 was divided into 5 peptide segments, each of which was synthesized by an automatic peptide synthesizer (Prelude, Protein Technologies, Inc.).
  • the five segments include segment 1 containing the 2nd to 23rd sequences of SEQ ID NO: 4, segment 2 containing the 24th to 49th sequences, segment 3 containing the 50th to 76th sequences, and the 77th to 105th sequences. It was segment 4 containing, and segment 5 containing the 106th to 141st sequences.
  • segments 1 and 2 are connected by chemical ligation to prepare segment 1-2
  • segments 3 and 4 are connected by chemical ligation to prepare segment 3-4
  • segment 5 is chemically combined with segment 3-4.
  • Segments 3-4-5 are ligated to prepare segments 3-4-5
  • segments 1-2 and 3-4-5 are ligated by chemical ligation to have the second to 141st amino acid sequences of SEQ ID NO: 4.
  • D-tamavidin TM 2 was produced. (Preparation of tetramer)
  • D-tamavidin TM 2 was dissolved in denaturing buffer (80 mM Tris-HCl, 6M guanidine-HCl, 1 mM DTT, pH 8.0) at 20 mg / mL and heated at 85 ° C. for 45 minutes. A 5-fold amount of buffer (80 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, pH 8.0) was added to the heated solution, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 30 minutes. Next, the solution was diluted 50-fold with a buffer (80 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, pH 8.0) and then allowed to stand at 4 ° C. O / N. Then, the solution was concentrated with Amicon Ultra-4 (30k) (Merck Millipore) and then recovered as a D-tamavidin TM 2 protein solution.
  • denaturing buffer 80 mM Tris-HCl, 6M guanidine-HCl, 1 mM DTT, pH 8.0
  • Example 7 Evaluation of biotin binding property of D-tamavidin TM 2 by SPR analysis 7-1.
  • Method (1) Preparation of biotin-labeled albumin 50 mg / mL bovine serum albumin / 0.1 M phosphate buffer (pH 7.5) 2.8 mL to 10 mg / mL D-biotin-AC5-OSu (manufactured by Dojin Kagaku Co., Ltd.) ) was added to an N, N-dimethylformamide solution (16.3 ⁇ L), and the mixture was stirred and then allowed to stand at 35 ° C. for 1 hour.
  • Bovine serum albumin was added to flow cells 1 and 3 of the CM5 sensor chip (manufactured by Cytiva) of the Biacore T200 system at a target level of 400 RU by an amine coupling method using an amine coupling kit (Cytiva). Immobilized. Further, L-biotin-labeled albumin and D-biotin-labeled albumin were immobilized on flow cells 2 and 4 at a target level of 400 RU, respectively, by an amine coupling method. All flow cells were blocked with 1M ethanolamine solution, pH 8.5 (manufactured by Cytiva).
  • Example 8 Evaluation of the effect of D-biotin on the measurement system in the ELISA method using D-tamavidin TM 2 immobilized plate 8-1.
  • Method (1) Add 200 ⁇ L of HISCL (trademark) TSH calibrationr C3 (manufactured by Sysmex) and 200 ⁇ L of HISCL (trademark) TSH R1 reagent (manufactured by Sysmex) as samples to 1.5 mL tube, and react at 37 ° C. and 600 rpm for 30 minutes. I let you.
  • D-tamavidin TM 2 (1 ⁇ g / mL, PBS, 50 ⁇ L) was allowed to stand at 4 ° C. overnight on a 96-well ELISA plate (Thermo Fisher) to solidify it, and blocking was performed with 2% BSA / PBS. ..
  • Results Figure 10 shows the results of TSH detection by the ELISA method in the presence of D-biotin.
  • FIG. 10 shows the percentage of the signal measurement value of each sample when the signal measurement value when the sample having a D-biotin concentration of 0 ng / mL is measured in each measurement system is 100%.
  • the effect of adding D-biotin was hardly observed.
  • Example 9 Quantitative confirmation of the measurement system using D-tamavidin TM 2 immobilized plate 9-1.
  • Method (1) Add HISC L TM TSH calibration C0 to C5 (manufactured by Sysmex) to 0 ⁇ IU / mL, 2 ⁇ IU / mL, 10 ⁇ IU / mL, 50 ⁇ IU / mL, 120 ⁇ IU / mL or 200 ⁇ IU / mL as a sample in 1.5 mL tube. 200 ⁇ L was added so as to be.
  • HISC L TM TSH R1 reagent manufactured by Sysmex
  • HISC L TM TSH calibration C0 to C5 manufactured by Sysmex
  • Example 8 The blocked D-tamavidin (trademark) 2 immobilized plate prepared in Example 8 (1) was washed 3 times with HISCL (trademark) wash solution (manufactured by Sysmex), and 1.5 mL was added to each well. 60 ⁇ L of the solution reacted with tube was added. The reaction was carried out at 37 ° C. and 600 rpm for 20 minutes. The L-biotin-labeled TSH antibody prepared above was added and reacted at 37 ° C. and 600 rpm for 30 minutes.
  • HISCL trademark
  • Example 10 In silico analysis For each of D-bradavidin and D-avidin, the binding property to L-biotin or D-biotin was examined by in silico analysis. 10-1. Method
  • L-biotin used in the analysis is shown in FIG. 12A
  • D-biotin is shown in FIG. 12B
  • Discovery Studio 2018 was used for the preparation and calculation of the structure of L-biotin or D-biotin.
  • natural streptavidin-D-biotin complex crystal structure data (PDB ID: 3RY2 Biological Assembury 1)
  • natural bradavidin-D-biotin complex crystal structure data (PDB ID: 4BBO Biological Assembury 1)
  • natural body for the avidin-D-biotin complex crystal structure data (PDB ID: 2AVI Biological Assessment 1)
  • ligands other than D-biotin were removed in a tetramer state.
  • the L / D Convesion command is used to generate the structure of the optical isomer protein composed of D-amino acids, and set the binding site with a radius of 12 ⁇ at the coordinates corresponding to the biotin binding site in the natural form. It was used for predicting ligand docking of D-biotin and L-biotin.
  • the ligand docking structure was predicted by the CDOCKER function on the Discovery Studio, and the value of the interaction score (CDOCKER ENERGY) was obtained.
  • the interaction score between the natural streptavidin and the optical isomers of each biotin is a measure of binding.

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Abstract

Ｄ－ビオチンに対する結合性をさらに低減し、Ｌ－ビオチンに対して強固に結合するポリペプチドを提供することを課題とする。 アビジン－ストレプトアビジンファミリーに属するポリペプチドであって、前記ポリペプチドのグリシン以外のアミノ酸残基のうち、９０％以上のアミノ酸残基にＤ－アミノ酸残基を含み、Ｌ－ビオチンに対する結合能を有し、Ｄ－ビオチンに対する結合能を実質的に有さないポリペプチドを提供する。

Description

ポリペプチド、多量体、固相、被検物質の測定方法および試薬キット
本発明は、ポリペプチド、多量体、固相、被検物質の測定方法および試薬キットに関する。
　アビジン－ストレプトアビジンファミリーに属するポリペプチドと、ビオチンとの間の親和性は非常に強く、該ポリペプチドとビオチンは様々な分野で利用されている。たとえば、診断分野では、免疫学的測定方法において、プレートや粒子などの固相にストレプトアビジンおよびビオチンを介して捕捉体を固定し、これを用いて標的物質を測定することが行われる。また、治療分野では、アビジンを付加した抗体と、ビオチン基を付加した薬剤とを患者に投与するプレターゲティング療法が知られている（たとえば、非特許文献１）。
　しかし、被検者の血液が天然型のＤ－ビオチンを含む場合、このＤ－ビオチン（内在性Ｄ－ビオチン）がアビジンやストレプトアビジンに結合し得る。特に被検者がビタミン剤などのサプリメントを摂取している場合は、Ｄ－ビオチンの血中濃度が高いことがある。このような場合、血液検体を用いる免疫学的測定方法においてはビオチン化した捕捉体と血中の内在性Ｄ－ビオチンとが競合し、一部の捕捉体を固相に固定することができず、測定精度が低下することがある。また、プレターゲティング療法においては、アビジンを結合した抗体を患者に投与すると、アビジンに血中の内在性Ｄ－ビオチンが結合することがある。この場合、該抗体にビオチン基を付加した薬剤が結合できず、患部に届く薬剤の量が低減するという問題が生じ得る。このような問題を解決するための手段として、たとえば特許文献１の技術が知られている。特許文献１には、Ｄ－ビオチンに対する親和性を低減させたストレプトアビジン変異体と、該変異体に結合可能なビオチン改変体が開示されている。
米国特許出願公開第２０１６／０１３７７０４号明細書
Ｈｎａｔｏｗｉｃｈ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２８．８（１９８７）：１２９４－１３０２
　特許文献１に記載のストレプトアビジン変異体は、依然としてＤ－ビオチンとの結合性を維持しており、また該変異体とビオチン改変体との親和性は十分ではない。本発明は、Ｄ－ビオチンと実質的に結合せず、Ｌ－ビオチンに対して強固に結合するポリペプチドを提供することを目的とする。また、本発明は、該ポリペプチドの多量体、該ポリペプチドが固定された固相、該固相を用いた被検物質の測定方法および該固相とＬ－ビオチンが結合した捕捉体を含む試薬キットを提供することを目的とする。
　アビジン－ストレプトアビジンファミリーに属するポリペプチドであって、前記ポリペプチドのグリシン以外のアミノ酸残基のうち９０％以上のアミノ酸残基にＤ－アミノ酸残基を含み、Ｌ－ビオチンに対する結合能を有し、Ｄ－ビオチンに対する結合能を実質的に有さないポリペプチド、を提供する。
　本発明は、前記ポリペプチドおよび前記ポリペプチドの多量体を提供する。本発明は、前記ポリペプチドおよび前記多量体が固定化された固相と、前記固相を用いた測定方法と、前記固相とＬ－ビオチンが結合した捕捉体を含む試薬キットを提供する。
　本発明によれば、Ｄ－ビオチンと実質的に結合せず、Ｌ－ビオチンに対して結合能を有するポリペプチドが提供される。また本発明によれば、前記ポリペプチドの多量体、前記ポリペプチドが結合した固相、前記固相を用いた測定方法および前記固相とＬ－ビオチンが結合した捕捉体を含む試薬キットが提供される。
本実施形態の測定方法の一例を示す概略図である。 本実施形態の試薬キットの一例を示す概略図である。 ゲルろ過クロマトグラフィーにおける波長２８０ｎｍの吸光度推移を示すグラフである。 実施例２のポリペプチドとＬ－ビオチンとの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）のセンサグラムである。 実施例２のポリペプチドとＤ－ビオチンとの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）のセンサグラムである。 実施例２の天然体コアストレプトアビジンと、Ｄ－ビオチン標識アルブミンとの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）のセンサグラムである。 実施例３の結果を示すグラフである。 実施例４の結果を示すグラフである。 実施例５の構造維持に関わる２１番目のアミノ酸をＬ体に置換する前の構造モデルである。 実施例５の構造維持に関わる２１番目のアミノ酸をＬ体に置換した後の構造モデルである。 実施例５の構造維持に関わる２１番目のアミノ酸をＬ体に置換した後にＣｌｅａｎ　Ｇｅｏｍｅｔｒｙによる構造最適化を行った構造モデルである。 実施例７のD-タマビジン（商標）２と、Ｌ－ビオチン標識アルブミンとの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）のセンサグラムである。 実施例７のD-タマビジン（商標）２と、Ｄ－ビオチン標識アルブミンとの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）のセンサグラムである。 実施例８の結果を示すグラフである。 実施例９の結果を示すグラフである。 Ｌ－ビオチンの構造である。 Ｄ－ビオチンの構造である。
　1.　ポリペプチド
　本実施形態のポリペプチドは、アビジン－ストレプトアビジンファミリーに属する。このポリペプチドにおいてグリシン以外のアミノ酸残基のうち９０％以上のアミノ酸残基が、Ｄ－アミノ酸残基である。このポリペプチドは、Ｌ－ビオチンに対する結合能を有し、Ｄ－ビオチンに対する結合能を実質的に有さないポリペプチドである。
　アビジン－ストレプトアビジンファミリーのポリペプチドは、光学異性体が存在しないグリシンを除き、天然ではＬ－アミノ酸残基で構成されている。本実施形態のポリペプチドは、Ｌ－アミノ酸残基を含んでいてもよいが、グリシン以外のアミノ酸残基のうち９０％以上のアミノ酸残基がＤ－アミノ酸残基であることが好ましい。より好ましい実施形態のポリペプチドはグリシン以外のアミノ酸残基のうち９５％以上のアミノ酸残基がＤ－アミノ酸残基であり、さらに好ましい実施形態のポリペプチドは、グリシン以外のすべてのアミノ酸残基がＤ－アミノ酸残基である。これにより少なくともＤ－ビオチンと結合する部位の立体構造が、鏡像異性体となると考えられる。その結果として天然型のＤ－ビオチンとの結合性が低下し、Ｄ－ビオチンの鏡像異性体であるＬ－ビオチンと結合可能となる。
　本実施形態のポリペプチドは、被検者の血中にＤ－ビオチンが存在したとしても、Ｄ－ビオチンとは実質的に結合しないため、免疫学的測定方法において内在性Ｄ－ビオチンの影響を低減することができる。また、プレターゲティング療法において、内在性Ｄ－ビオチンの影響が低減され、より適切に薬剤を患部に送達することができる。
　本明細書において、「ポリペプチド」は、タンパク質およびその断片を含む。本実施形態のポリペプチドのアミノ酸の長さは、Ｌ－ビオチンとの結合能を有していれば特に限定されず、たとえば、数十～数百残基である。本実施形態のポリペプチドは、少なくともコア配列を有することが好ましい。ここで、「コア配列」とは、本実施形態のポリペプチドのアミノ酸配列のうち、ビオチンに結合するために必要なアミノ酸配列をいう。
　「アビジン－ストレプトアビジンファミリーに属するポリペプチド」は、アビジン、ストレプトアビジン、タモギタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｃｏｒｎｕｃｏｐｉａｅ）由来アビジン様タンパク質（以下、タマビジン（商標））、ブラダビジン（Ｂｒａｄａｖｉｄｉｎ）、リザビジン（Ｒｈｉｚａｖｉｄｉｎ）、それらのキメラ、改変体などを含む。本明細書では、Ｄ型のポリペプチド（たとえば、Ｄ型のアビジン（以下、「Ｄ－アビジン」または「本実施形態のアビジン」という）、Ｄ型のストレプトアビジン（以下、「Ｄ－ストレプトアビジン」または「本実施形態のストレプトアビジン」という）、Ｄ型のタマビジン（商標）（以下、「Ｄ－タマビジン（商標）」または「本実施形態のタマビジン（商標）」という）、Ｄ型のブラダビジン（以下、「Ｄ－ブラダビジン」という）、およびＤ型のリザビジンも「アビジン－ストレプトアビジンファミリーに属するポリペプチド」に含まれる。
　ポリペプチドの改変体は、たとえば、アミノ酸配列を改変したポリペプチドや、ポリペプチドを化学的処理したポリペプチドが挙げられる。アミノ酸配列の改変の例としては、アミノ酸残基の置換、欠損、付加などが挙げられる。化学的処理の例としては脱グリコシル化などが挙げられる。
　ストレプトアビジンはストレプトマイセスアビジニ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｉｄｉｎｉｉ）由来のビオチン結合性タンパク質である。
　好ましい実施形態では、Ｄ－ストレプトアビジンは、配列番号１の１９番目～１３３番目のアミノ酸配列を含む。１９番目～１３３番目のアミノ酸配列はＤ－ストレプトアビジンのコア配列として知られている。より好ましい実施形態では、Ｄ－ストレプトアビジンは１３番目～１３３番目のアミノ酸配列または１９番目～１３３番目のアミノ酸配列を含む。さらに好ましい実施形態では、Ｄ－ストレプトアビジンは１３番目～１３９番目のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、Ｄ－ストレプトアビジンは配列番号１のアミノ酸配列全体を含む。本実施形態のストレプトアビジンは、グリシン以外のアミノ酸残基のうち９０％以上のアミノ酸残基がＤ－アミノ酸残基により構成されているため、Ｄ－ビオチンとの結合性は低く、Ｌ－ビオチンとの結合性が高い。
　アビジンは鳥類などで産生されるビオチン結合性タンパク質である。本発明の一実施形態であるＤ－アビジンは、配列番号２のアミノ酸配列を含み得る。好ましい実施形態では、Ｄ－アビジンは、配列番号２の２番目～１２８番目のアミノ酸配列を含む。２番目～１２８番目のアミノ酸配列はＤ－アビジンのコア配列と考えられる。別の実施形態では、Ｄ－アビジンは配列番号２のアミノ酸配列全体を含む。本実施形態のアビジンは、グリシン以外のアミノ酸残基のうち９０％以上のアミノ酸残基がＤ－アミノ酸残基により構成されているため、Ｄ－ビオチンとの結合性は低く、Ｌ－ビオチンとの結合性が高い。
　タマビジン（商標）はタモギタケから発見されたタンパク質である。ビオチンに対して高い親和性をもち、アビジンに比べて熱安定性に優れるなどの特徴をもつ（国際公開第２００２／０７２８１７号）。タマビジン（商標）のアミノ酸配列は、たとえば配列番号３（タマビジン（商標）１）や配列番号４（タマビジン（商標）２）に示されるアミノ酸配列が挙げられる。
　好ましい実施形態では、Ｄ－タマビジン（商標）１は、配列番号３の４番目～１２９番目のアミノ酸配列を含む。４番目～１２９番目のアミノ酸配列はタマビジン（商標）１のコア配列と考えられる。Ｄ－タマビジン（商標）２は、配列番号４の４番目～１２７番目のアミノ酸配列を含む。４番目～１２７番目のアミノ酸配列はタマビジン（商標）２のコア配列と考えられる。Ｄ－タマビジン（商標）１およびＤ－タマビジン（商標）２は、グリシン以外のアミノ酸残基のうち９０％以上のアミノ酸残基がＤ－アミノ酸残基により構成されているため、Ｄ－ビオチンとの結合性は低く、Ｌ－ビオチンとの結合性が高い。
　本実施形態のポリペプチドのコア配列は、Ｌ－アミノ酸残基を含んでいてもよいが、グリシン以外のアミノ酸残基のうち９０％以上のアミノ酸残基がＤ－アミノ酸残基であることが好ましい。より好ましい実施形態では、コア配列のグリシン以外のアミノ酸残基のうち９５％以上のアミノ酸残基がＤ－アミノ酸残基であり、さらに好ましい実施形態では、グリシン以外のすべてのアミノ酸残基がＤ－アミノ酸残基である。
　本実施形態のポリペプチドは、上述のアミノ酸配列と比較して、置換、欠失または付加などのアミノ酸の改変を含むポリペプチドであってもよい。好ましい実施形態は上述のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するポリペプチドであり、より好ましい実施形態は上述のアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するポリペプチドである。
　アミノ酸配列を改変したポリペプチドの具体例として、Ｑｕｒｅｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，ＴＨＥ　ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ　ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，Ｖｏｌ．２７６，Ｎｏ．４９，Ｉｓｓｕｅ　ｏｆ　Ｄｅｃｅｍｂｅｒ　７，　ｐｐ．４６４２２-４６４２８，２００１　に記載のストレプトアビジン改変体（以下、「ストレプトアビジン改変体１」という）が挙げられる。ストレプトアビジン改変体１は、配列番号１のアミノ酸配列と比較してＳ４５Ａ、Ｔ９０ＡおよびＤ１２８Ａの置換変異を有する（配列番号５）。ストレプトアビジンのコア配列とストレプトアビジン改変体１のコア配列の相同性は、９７．４％である。一実施形態のストレプトアビジンは、Ｄ体のストレプトアビジン改変体１（以下、「Ｄ－ストレプトアビジン改変体１」という）であって、配列番号５の１９番目～１３３番目のアミノ酸配列を含む。１９番目～１３３番目のアミノ酸配列はストレプトアビジン改変体１のコア配列として知られている。より好ましい実施形態では、Ｄ－ストレプトアビジン改変体１は、１３番目～１３３番目のアミノ酸配列または１９番目～１３９番目のアミノ酸配列を含む。さらに好ましい実施形態では、Ｄ－ストレプトアビジン改変体１は１３番目～１３９番目のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、Ｄ－ストレプトアビジン改変体１は配列番号５のアミノ酸配列全体を含む。
　ストレプトアビジン改変体の他の例として、Ｗｕ　ｅｔ　ａｌ．，ＴＨＥ　ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ　ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，Ｖｏｌ．２８０，Ｎｏ．２４，Ｉｓｓｕｅ　ｏｆ　Ｊｕｎｅ　１７，ｐｐ．２３２２５-２３２３１，２００５に記載のストレプトアビジン改変体（以下、「ストレプトアビジン改変体２」という）が挙げられる。ストレプトアビジン改変体２は、配列番号１のアミノ酸配列と比較してＴ７６Ｒ、Ｖ１２５Ｒ、Ｖ５５ＴおよびＬ１０９Ｔの置換変異を有する（配列番号６）。ストレプトアビジンのコア配列とストレプトアビジン改変体２のコア配列の相同性は、９６．５％である。一実施形態のストレプトアビジンは、Ｄ体のストレプトアビジン改変体２（以下、「Ｄ－ストレプトアビジン改変体２」という）であって、配列番号６の１９番目～１３３番目のアミノ酸配列を含む。１９番目～１３３番目のアミノ酸配列はストレプトアビジン改変体２のコア配列として知られている。より好ましい実施形態では、Ｄ－ストレプトアビジン改変体２は、１３番目～１３３番目のアミノ酸配列または１９番目～１３９番目のアミノ酸配列を含む。さらに好ましい実施形態では、Ｄ－ストレプトアビジン改変体２は１３番目～１３９番目のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、Ｄ－ストレプトアビジン改変体２は配列番号６のアミノ酸配列全体を含む。
　ストレプトアビジン改変体の他の例として、Ｌｉｍ　ｅｔ　ａｌ．，ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ　ＡＮＤ　ＢＩＯＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ，２０１３　Ｊａｎ；１１０（１）：５７－６７に記載のストレプトアビジン改変体（以下、「ストレプトアビジン改変体３」という）が挙げられる。このタンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列を有する。一実施形態のストレプトアビジンは、Ｄ体のストレプトアビジン改変体３（以下、「Ｄ－ストレプトアビジン改変体３」という）であって、配列番号７のアミノ酸配列全体を含むことが好ましい。
　ストレプトアビジン改変体の他の例として、Ｓａｎｏ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　Ｖｏｌ．９４，ｐｐ．６１５３-６１５８，Ｊｕｎｅ　１９９７に記載のストレプトアビジン改変体（以下、「ストレプトアビジン改変体４」という）が挙げられる。ストレプトアビジン改変体４は、配列番号１のアミノ酸配列と比較してＨ１２７Ｄの置換変異と、Ｇ１１３－Ｗ１２０の欠失変異を有する（配列番号８）。ストレプトアビジンのコア配列とストレプトアビジン改変体２のコア配列の相同性は、９２．２％である。一実施形態のストレプトアビジンは、Ｄ体のストレプトアビジン改変体４（以下、「Ｄ－ストレプトアビジン改変体４」という）であって、配列番号８の１９番目～１２５番目のアミノ酸配列を含む。１９番目～１２５番目のアミノ酸配列はストレプトアビジン改変体４のコア配列として知られている。より好ましい実施形態では、Ｄ－ストレプトアビジン改変体４は、１３番目～１２５番目のアミノ酸配列または１９番目～１３１番目のアミノ酸配列を含む。さらに好ましい実施形態では、Ｄ－ストレプトアビジン改変体４は１３番目～１３１番目のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、Ｄ－ストレプトアビジン改変体４は配列番号８のアミノ酸配列全体を含む。
　ストレプトアビジン改変体の他の例として、国際公開第２００６／０５８２２６号に記載のストレプトアビジン改変体（以下、「ストレプトアビジン改変体５」という）が挙げられる。ストレプトアビジン改変体５は、配列番号９のアミノ酸配列を有する。一実施形態のストレプトアビジンは、Ｄ体のストレプトアビジン改変体５（以下、「Ｄ－ストレプトアビジン改変体５」という）であって、配列番号９の１番目～２０番目、３５番目～１９６番目および２１３番目～２６１番目のアミノ酸配列を含む。１番目～２０番目、３５番目～１９６番目および２１３番目～２６１番目のアミノ酸配列はストレプトアビジン改変体５のコア配列に相当する配列として知られている。より好ましい実施形態では、Ｄ－ストレプトアビジン改変体５は、１番目～２４番目、２９番目～２０２番目および２０７番目～２６１番目を含む。別の実施形態では、Ｄ－ストレプトアビジン改変体５は配列番号９のアミノ酸配列全体を含む。
　本明細書におけるＤ－またはＬ－の表記はＩＵＰＡＣ命名法に基づいて化合物の立体配置を示す表記であり、ｄ－グリセルアルデヒドを立体配置の基準として、この立体配置を崩さずにできる化合物をＤ体とし、その鏡像異性体をＬ体と表記する表記法に基づく。
　本実施形態のポリペプチドの結合パートナーであるＬ－ビオチンはＤ－ビオチンの鏡像異性体である。本明細書では、「Ｌ－ビオチン」は、遊離のＬ－ビオチンと、捕捉体など他の物質に付加されたＬ－ビオチン基とを含む概念である。Ｌ－ビオチンは、たとえば非特許文献（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １９７８、 １００、１５５８－１５６３）の方法などの公知の方法により合成され、キラルカラムクロマトグラフィーなどを用いて光学分割することで得ることができる。Ｌ－ビオチンは、Ｄ－ビオチンの鏡像異性体である限り、製造方法は特に限定されず、市販品を用いてもよい。
　本実施形態のポリペプチドのＬ－ビオチンやＤ－ビオチンに対する結合性は、たとえばビオチン化酵素とポリペプチド固定化プレートを用いたプレートアッセイにおけるシグナルや、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）におけるセンサグラムの変化、および解離定数（Ｋｄ値）を指標として確認することができる。解離定数の測定方法は、たとえば、ＳＰＲ解析や等温滴定型カロリメトリ解析などを用いた公知の方法を用いることができる。測定装置としては、たとえばＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（Ｃｙｔｉｖａ社）が例示される。
　本実施形態のポリペプチドとＬ－ビオチンとの解離定数は、好ましくは１０－７Ｍ以下であり、より好ましくは１０－１０Ｍ以下であり、最も好ましくは１０－１３Ｍ以下である。
　「Ｄ－ビオチンに対する結合能を実質的に有さない」とは、たとえば、本実施形態のポリペプチドとＤ－ビオチンとの解離定数が、好ましくは１０－６Ｍ以上であり、より好ましくは１０－４Ｍ以上であり、さらに好ましくは１０－２Ｍ以上となることである。最も好ましい実施形態では、本実施形態のポリペプチドと、Ｌ－ビオチンとの結合能をＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（Ｃｙｔｉｖａ社）を用いて測定した際に、アナライトの結合による特異的なセンサグラムの変化が確認されないことである。なお、「Ｄ－ビオチンに対する結合能を実質的に有さない」は、「Ｄ－ビオチンに実質的に結合しない」と同義である。
　Ｂｉａｃｏｒｅ　Ｔ２００システムを用いた結合性の決定方法は、たとえば、以下のとおりである。Ｂｉａｃｏｒｅ　Ｔ２００システムのＣＭ５センサーチップ（Ｃｙｔｉｖａ製）のフローセル１および３に対して、ウシ血清アルブミンをアミンカップリングキット（Ｃｙｔｉｖａ社）を用いたアミンカップリング法によりターゲットレベル４００ＲＵで固定化する。さらにフローセル２、４に対して同様にアミンカップリング法によって、それぞれＬ－ビオチン標識アルブミン、Ｄ－ビオチン標識アルブミンをターゲットレベル４００ＲＵで固定化する。各フローセルを１Ｍ エタノールアミン溶液、ｐＨ８．５（Ｃｙｔｉｖａ製）でブロッキングする。Ｄ－ビオチン標識アルブミンとしてはＨＡＢＡ法にてアルブミンあたりのＤ－ビオチン標識数が０．４と推定されたものを用い、Ｌ－ビオチン標識アルブミンとしては前記Ｄ－ビオチン標識アルブミンと同条件で調製することで同様のＤ－ビオチン標識数と推定されるものを用いる。
　ランニングバッファーとしてＨＢＳ－ＥＰ＋（Ｃｙｔｉｖａ製）を使用し、アビジン－ストレプトアビジンファミリーに属するポリペプチドをシングルサイクル法により、１００ｐＭから１００ｎＭの範囲で流速３０μＬ／ｍｉｎで各フローセルに流し、Ｂｉａｃｏｒｅ　Ｔ２００　Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｃｙｔｉｖａ製）によってＤ－ビオチン標識アルブミンまたはＬ－ビオチン標識アルブミンに対するＳＰＲにおけるセンサグラムの変化を示すデータを取得する。ウシ血清アルブミンを固定化したフローセルから取得したデータは、バックグラウンドの値を示すため、バックグラウンドの値を用いて、Ｄ－ビオチン標識アルブミンまたはＬ－ビオチン標識アルブミンに対するＳＰＲにおけるセンサグラムの変化を示すデータを正規化しもよい。アビジン－ストレプトアビジンファミリーに属するポリペプチドの結合性は、たとえば、［Ｌ－ビオチン標識アルブミンとアビジン－ストレプトアビジンファミリーに属するポリペプチドとの結合性を示すデータ］（以下、「データＬ１」とする）と、［Ｄ－ビオチン標識アルブミンとアビジン－ストレプトアビジンファミリーに属するポリペプチドとの結合性を示すデータ］（以下、「データＤ１」とする）とに基づいて決定することができる。
　たとえば、データＤ１の値をデータＬ１の値で除した値が１／１０以下、１／１００以下、または１／１０００であるとき、アビジン－ストレプトアビジンファミリーに属するポリペプチドは「Ｄ－ビオチンと実質的に結合しない」と決定することができる。
　たとえば、データＬ１の値をデータＤ１の値で除した値が１０以上、１００以上、または１０００以上であるとき、アビジン－ストレプトアビジンファミリーに属するポリペプチドは「Ｄ－ビオチンと実質的に結合しない」と決定することができる。
　たとえば、データＬ１の値からデータＤ１の値をひいた値、若しくはデータＤ１の値からデータＬ１の値をひいた値の絶対値が、データＬ１の値の１／１０以下、１／１００以下、または１／１０００であるとき、アビジン－ストレプトアビジンファミリーに属するポリペプチドは「Ｄ－ビオチンと実質的に結合しない」と決定することができる。
　ビオチン化酵素とポリペプチド固定化プレートを用いたプレートアッセイにおけるシグナルに基づく結合性の決定方法は、たとえば、後述する実施例３に基づいて、ＥＬＩＳＡ法を利用したビオチンの測定系を構築し、Ｌ－ビオチンを使用したときの酵素活性の値（データＬ２）と、Ｄ－ビオチンを使用したときの酵素活性の値（データＤ２）を取得する。上記Ｂｉａｃｏｒｅ　Ｔ２００システムを使用した場合と同様に、データＬ２およびデータＤ２に基づいて、アビジン－ストレプトアビジンファミリーに属するポリペプチドが、Ｄ－ビオチンと実質的に結合するかいなかを決定する。
２．多量体
　別の実施形態は、上述のポリペプチドをモノマー単位とする多量体である。この多量体は、複数個の上述のポリペプチドが会合して形成され得る。この多量体において、モノマー単位の数は特に限定されない。たとえば、この多量体は、２量体、４量体または８量体である。
３．ポリペプチドの合成方法
　本実施形態のポリペプチドは公知のペプチドの合成方法により製造することができる。ペプチドの合成方法としては所望のポリペプチドが得られる限り、特に制限されない。たとえば、液相合成、固相合成、人工ｔＲＮＡを用いた無細胞系による合成などが挙げられる。また生産物のポリペプチドのアミノ酸残基数が一定数以上（一般に３０残基～５０残基以上）の場合、２以上のペプチド断片を合成した後に公知のライゲーション反応を用いて、ポリペプチドを連結することで、製造することができる。
　本実施形態のポリペプチドは、たとえば以下の固相合成法によって合成することができる。
（１）保護基を用いて、アミノ基の窒素原子を保護した１残基目のアミノ酸のカルボキシル基を樹脂へ結合させる。
（２）前記（１）または（３）の結合反応により得られた反応物の保護基を脱保護剤を用いて脱離した後、溶媒にて洗浄し遊離アミノ酸を形成させる。
（３）前記（２）で得られた遊離アミノ酸と、保護基によりアミノ基を保護した任意のアミノ酸とを、縮合剤を用いて縮合させる。
（４）前記（３）の生成物の保護基を脱保護剤を用いて脱離し、遊離アミノ酸を形成させる。
（５）（２）から（４）の工程を繰り返すことにより、Ｃ末端に樹脂が結合した任意のアミノ酸が連結したポリペプチドを得ることができる。
（６）（５）の工程後の任意の時点、および所望のポリペプチドが結合した樹脂を製造した時点で溶媒を用いて洗浄する。
（７）（６）で洗浄した前記樹脂が結合したポリペプチドを保護基によって、Ｎ末端アミノ基を保護した後、酸を用いて樹脂を切断することで、保護基が結合した任意のポリペプチドを得ることができる。
　各工程は手合成でもよく、自動合成機などを用いてもよい。一部を手合成で行い、適宜自動合成機を用いてもよい。自動合成機の例としては、Ｌｉｂｅｒｔｙ　Ｂｌｕｅ（ＣＥＭ製）、Ｍｕｌｔｉｐｅｐ２（ＣＥＭ製）、Ｉｎｉｔｉａｔｏｒ＋Ａｌｓｔｒａ（Ｂｉｏｔａｇｅ製）、ＳｙｒＩＩ（Ｂｉｏｔａｇｅ製）などが挙げられるが、特に限定されない。
　（１）において使用する樹脂としては、固相合成法で使用される公知の樹脂であればよい。Ｃ末端をアミド基として供給する樹脂としては、たとえば、アミノ基で官能化されたＲｉｎｋ－Ａｍｉｄｅ－レジン（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ製）、Ｒｉｎｋ－Ａｍｉｄｅ－ＰＥＧＡ－レジン（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ製）および、Ｆｍｏｃ－ＮＨ－ＳＡＬ－レジン（渡辺化学工業製）を用いることが好ましい。また、アミノ基で官能化されたＡｍｉｎｏ－ＰＥＧＡ－レジン（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ製）などにＦｍｏｃ－ＮＨ－ＳＡＬ－レジン－リンカー（渡辺化学工業製）などを結合させてもよい。
　また、Ｃ末端をカルボン酸にする場合の樹脂としては、たとえば、塩素で官能化された２－クロロトリチルクロリド樹脂（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ製）や、アミノ基で官能化されたＡｍｉｎｏ－ＰＥＧＡ－レジン（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ製）、水酸基を有するＮｏｖａＳｙｎ  ＴＧＴアルコール樹脂（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ製）、Ｗａｎｇ－レジン（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ製）、ＨＭＰＡ－ＰＥＧＡ－レジン（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ製）などを用いることができる。また、Ａｍｉｎｏ－ＰＥＧＡ－レジンとアミノ酸との間にリンカーを存在させてもよく、このようなリンカーとして、たとえば、４－ヒドロキシメチルフェノキシ酢酸（ＨＭＰＡ）、４－(４－ヒドロキシメチル－３－メトキシフェノキシ)－ブチル酢酸（ＨＭＰＢ）などを挙げることができる。Ｃ末端のアミノ酸が樹脂にあらかじめ結合したＨ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｔｒｉｔｙｌ  ＮｏｖａＰＥＧ樹脂（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ製）などを用いることができる。
　水酸基を有する樹脂または塩素で官能化された樹脂を使用する場合、樹脂とアミノ基の窒素原子が保護基により保護されたアミノ酸との結合はアミノ酸のカルボキシル基を樹脂へとエステル結合により結合させる。また、アミノ基で官能化された樹脂を使用する場合、該アミノ酸のカルボキシル基を樹脂へとアミド結合により結合させる。
　保護基としては公知の保護基であればよく、たとえば、９－フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基、ｔ－ブチルオキシルカルボニル（Ｂｏｃ）基、ベンジル基、アリルオキシカルボニル基、アセチル基などの、カーボネート系またはアミド系の保護基を用いることができる。アミノ酸に保護基を導入する場合、たとえばＦｍｏｃ基を導入する際には、９－フルオレニルメトキシカルボニル－Ｎ－スクシニミジルカーボネートと炭酸ナトリウムを加えて反応を行うことにより導入することができる。反応温度は０～５０℃、好ましくは室温であり、反応時間は１～５時間、好ましくは３時間である。
　保護基を用いてアミノ基の窒素原子を保護したアミノ酸としては、市販のアミノ酸を用いてもよい。たとえば、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｎ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－ＡＩａ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｒｐ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－ＳｅＭｅｔ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－３－(Ｍｅｔｈｙｌｓｅｌｅｎｏ)－Ａｌａ－ＯＨが挙げられる。
　また、保護基で保護したアミノ酸であって、側鎖に保護基を導入したアミノ酸を用いてもよい。たとえば、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｎ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ａｃｍ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｃ(Ｔｒｔ)－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｃ(ｐＭｅＯＢｚｌ)－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｃ(ｐＭｅＢｚｌ)－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－ＨｏｍｏＳｅｃ(ｐＭｅＢｚｌ)－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－ＨｏｍｏＳｅｃ(Ｍｏｂ)－ＯＨを挙げられる。
　水酸基を有する樹脂を用いる場合、たとえば、ＨＭＰＢ樹脂であれば、エステル化触媒として用いることができる。その際、脱水縮合剤は、１－メシチレンスルホニル－３－ニトロ－１，２，４－トリアゾール（ＭＳＮＴ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）などの公知の脱水縮合剤を用いることができる。アミノ酸と脱水縮合剤との使用割合は、前者１当量に対して、後者が、通常１～１０当量、好ましくは１～５当量である。
　エステル化反応は、たとえば、固相カラムに樹脂を供し、溶媒で洗浄し、アミノ酸溶液を加えることで行うことが好ましい。洗浄用溶媒としては、たとえばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、２－プロパノール、ジクロロメタン（ＤＣＭ）等を挙げることができる。アミノ酸を溶解する溶媒としては、たとえばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ＤＭＦ、ＤＣＭ等を挙げることができる。エステル化反応の反応温度は０～５０℃、好ましくは室温であり、反応時間は１０分間～３０時間程度、好ましくは１５分間～２４時間程度行う。
　この時、固相上の未反応の官能基を、無水酢酸等を用いてアセチル化してキャッピングすることが好ましい。
　脂溶性保護基の脱離は、たとえば塩基で処理することにより行うことができる。塩基としては、たとえばピペリジン、モルホリン等を挙げることができる。その際、溶媒の存在下で行うことが好ましい。溶媒としては、たとえばＤＭＦ、ＤＭＳＯ、メタノールなどが挙げられる。
　遊離アミノ基と、保護基でアミノ基窒素が保護された任意のアミノ酸のカルボキシ基とのアミド化反応は、活性化剤、塩基および溶媒の存在下で行うことが好ましい。
　活性化剤としては、たとえば、ＤＩＣ、ＤＣＣ、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩（ＷＳＣ・ＨＣｌ）、ジフェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ）、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、ジエチルシアノホスホネート（ＤＥＰＣ）、ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ－トリスピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、ヒドロキシフタルイミド（ＨＯＰｈｔ）、ペンタフルオロフェノール（Ｐｆｐ－ＯＨ）、Ｏ－（１H-６－クロロベンゾトリアゾール－１－イル)－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＣＴＵ）、Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスホネート（ＨＡＴＵ）、２－（１H－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）、３，４－ジヒドロ－３－ヒドロキシ－４－オキソ－１，２，３－ベンゾトリアジン（ＤＨＢＴ）、４－(４,６－ジメトキシ－１,３,５－トリアジン－２－イル)－４－メチルモルホリニウム クロライド（ＤＭＴ－ＭＭ）などが挙げられる。
　活性化剤の使用量は、保護基でアミノ基窒素が保護された任意のアミノ酸に対して、１～２０当量、好ましくは１～１０当量、さらに好ましくは、１～５当量とすることが好ましい。
　塩基としては、アルキル化反応と共存させることができる塩基が好ましい。たとえば、Ｎ－エチルジイソプロピルアミン（ＤＩＰＥＡ）、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ－７－エン（ＤＢＵ）、ＤＭＡＰ,１，４－ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン（ＤＡＢＣＯ）、２，６－ジメチルピリジン、トリエチルアミン（ＴＥＡ）、１，５－ジアザビシクロ［４．３．０］ノナ－５－エン（ＤＢＮ）などが挙げることができるが、特に限定されない。
　溶媒としては、たとえばＤＭＦ、ＤＭＳＯ、ＤＣＭなどを挙げることができる。反応温度は０～５０℃、好ましくは室温であり、反応時間は１０分～３０時間程度、好ましくは１５分～２４時間程度行うことがよい。保護基の脱離は、上記と同様に行うことができる。
　樹脂からペプチド鎖を切断するには酸で処理することが好ましい。酸としては、たとえば、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を挙げることができる。
　２以上のペプチド断片を連結させる公知のライゲーション反応としては、ネイティブケミカルライゲーション（ＮＣＬ法）を利用することができる（Ｄａｗｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ Ｎａｔｉｖｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌｉｇａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６６：７７６－７７９（１９９４））。
　ＮＣＬ法はＣ末端にαカルボキシチオエステル部分を有するようにした第１のペプチドとＮ末端にシステイン残基を有する第２のペプチドとの化学選択反応であり、システインの側鎖のチオール基（ＳＨ基、スルフヒドリル基ともいう）がチオエステル基のカルボニル炭素に選択的に反応し、チオール交換反応により、チオエステル結合初期中間体が生成する。この中間体は、自発的に分子内転位して、連結部位に天然アミド結合を与え、一方、システイン側鎖チオールを再生させる。
　ＮＣＬ法において、Ｎ末端にシステイン残基を有する第２のペプチドのシステイン結合部位はライゲーション反応後に脱硫反応（Ｙａｎｅｔ　ａｌ．， Ｊ. Ａｍ. Ｃｈｅｍ. Ｓｏｃ.  １２３, ５２６（２００１））により、アラニンに置換することもできる。すなわち本来アラニンである部位をシステインに置換して合成を行い、ライゲーション反応の結合部位とすることができる。
　ペプチドの合成反応またはライゲーション反応の前後の工程に分離および/または精製工程を含んでいてもよい。精製方法は公知の方法を用いればよく、カラムクロマトグラフィーなどが挙げられる。カラムクロマトグラフィーの例としては、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどが挙げられるが特に限定されない。分離精製を所望する対象物に応じて、溶媒、カラムの充填剤、分離対象物および精製対象物の検出方法、温度条件、圧力条件などは適宜選択することができる。
　ペプチドの合成反応、ライゲーション反応または分離および／または精製工程の前後に適宜、公知の洗浄、乾燥、希釈、および濃縮工程などを含んでいてもよい。
　ポリペプチドが正しくフォールディングされない場合、リフォールディングすることが好ましい。リフォールディングは、たとえば精製したポリペプチドを尿素、グアニジン塩酸塩などを含む変性バッファーなどに溶解させるか、融合ポリペプチドの粗精製液に尿素、グアニジン塩酸塩などの変性剤を添加して、融合ポリペプチドの凝集を溶解してから、たとえば、非特許文献（Ａｒａｋａｗａ ｅｔ　ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ２３２（２０１４））に記載される、希釈リフォールディング法、透析リフォールディング法、固相リフォールディング法、サイズ排除クロマトグラフィーリフォールディング法、界面活性剤リフォールディング法などにより行うことができる。好ましくは、透析リフォールディング法である。
４．測定方法
　本実施形態の測定方法は、上述のポリペプチドまたはその多量体を固定した固相と、前記固相に固定した捕捉体とを用いて、検体中の被検物質をインビトロで測定する方法である。
　捕捉体としては、被検物質に特異的に結合する物質を用いることができる。捕捉体はＬ－ビオチンやその改変体が直接的または間接的に付加されている。捕捉体の例としては、抗体、抗原、アプタマー、レクチン、核酸、酵素などを挙げることができるが特に限定されない。
　捕捉体または後述の検出体として用いられる「抗体」は、全長の抗体またはそのフラグメントであり得る。抗体のクラスは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、IｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥのいずれであってもよいが、好ましくはＩｇＧである。ＩｇＧのサブクラスは特に限定されず、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４のいずれであってもよい。抗体のフラグメントとしては、たとえば還元型ＩｇＧ（ｒＩｇＧ)、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、トリアボディなどが挙げられる。これらの抗体フラグメントを調製する方法自体は公知である。抗体は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体のいずれであってもよいが、好ましくはモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト化抗体などであってもよい。また、抗体は、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ウマ、ラクダ、アルパカ、ニワトリなどのいずれの動物に由来する抗体であってもよい。
　被検物質は、本実施形態の測定方法の検出対象の物質であり、捕捉体によって捕捉可能な物質であればよい。被検物質の例としては、細胞、細胞外小胞、タンパク質、核酸、多糖類、糖タンパク質、リン脂質などを挙げることができるが特に限定されない。
　検体は、被検物質を含む試料または被検物質が含まれることが疑われる試料である。検体の例としては、生物由来の試料や環境サンプル、これらに前処理を施した試料などが挙げられる。生物由来の試料としては体液、排泄物が挙げられる。体液の例としては、生体から採取した試料であれば、特に限定されないが、血清、血漿、血液、髄液、精液、組織、組織液、リンパ液、唾液、鼻咽頭拭い液、喀痰、気管支肺胞洗浄液などが挙げられる。排泄物の例としては、特に限定されないが、尿、糞便などが挙げられる。環境サンプルの例としては下水、河川水、海水、土壌などが挙げられる。
　上述のポリペプチドまたはその多量体は、固相に固定されている。該固定の態様は特に限定されない。たとえば、上述のポリペプチドまたはその多量体と固相とを直接結合してもよいし、間接的に結合してもよい。直接の結合としては、たとえば、物理的吸着などが挙げられる。間接的な結合とは、上述のポリペプチドまたはその多量体と固相との間に別の物質が介在する態様である。たとえば、固相表面がウシ血清アルブミンやポリエチレングリコールなどのブロッキング剤で被覆されている場合、上述のポリペプチドまたはその多量体と固相と該ブロッキング剤とを結合することによって上述のポリペプチドまたはその多量体を固相上に固定することができる。
　本実施形態の測定方法においては、捕捉体と固相とが別々にユーザに提供されてもよいし、捕捉体と固相とがあらかじめ固相に固定された状態でユーザに提供されてもよい。捕捉体と固相とが別々にユーザに提供される場合、本実施形態の測定方法は、検体と固相と捕捉体とを接触する工程を含んでいてもよい。該工程においては、検体と固相と捕捉体との接触の順序は特に限定されない。好ましくは、検体と捕捉体とを接触させて検体中の被検物質と捕捉体との複合体を形成し、その後該複合体と固相とを接触させて複合体を固相上に形成する。この場合、検体にＤ－ビオチンが含まれていても、固相上に固定されている上述ポリペプチドまたは多量体は、Ｄ－ビオチンとは実質的に結合せず、Ｌ－ビオチン基を含む捕捉体と結合することができる。
　本実施形態の測定方法は捕捉体と固相とが別々にユーザに提供されることは、複数種の被検物質に対して固相を共通化できる点で好ましい。
　本実施形態の測定方法は、固相上に、捕捉体と被検物質と検出体とを含む複合体（以下、「サンドイッチ複合体」ともいう）を形成する工程（以下、「複合体形成工程」ともいう）と、この複合体に含まれる検出体に基づくシグナルを測定する工程（以下、「測定工程」ともいう）と、を含んでもよい。
　複合体形成工程では、固相と捕捉体と被検物質を含む検体と検出体とを接触することにより、固相上にサンドイッチ複合体を形成することができる。固相と捕捉体と検体と検出体との接触順序は特に限定されない。好ましくは、検体と捕捉体とを接触させて検体中の被検物質と捕捉体との複合体を形成し、その後該複合体と固相とを接触させて複合体を固相上に形成し、その後該複合体と検出体とを接触させてサンドイッチ複合体を固相上に形成する。この場合、検体にＤ－ビオチンが含まれていても、固相上に固定されている上述のポリペプチドまたは多量体は、Ｄ－ビオチンとは実質的に結合せず、Ｌ－ビオチン基を含む捕捉体と結合することができる。被検物質と捕捉体との複合体を固相上に形成した後、検出体を接触させる前に未反応の成分を除去するＢ／Ｆ分離を行うことが好ましい。複合体形成工程における各成分の反応条件（たとえば、溶媒、温度、圧力、反応時間など）は当業者が適宜選択しうる。
　検出体は、被検物質に結合する物質と、標識物質とを含むことが好ましい。被検物質に結合する物質は、たとえば抗体、抗原、アプタマー、レクチン、核酸などが挙げられる。また、検出体は、被検物質に結合する一次物質と、標識物質を含み一次物質に結合する二次物質とを含んでいてもよい。一次物質および二次物質は、たとえば抗体、抗原、アプタマー、レクチン、核酸などが挙げられる。一次物質および二次物質がいずれも抗体の場合、それぞれ一次抗体および二次抗体と呼ばれ、当業界において広く使用されている。一次抗体および二次抗体を用いる場合は、被検物質に一次抗体を結合し、該一次抗体に二次抗体を結合することにより、標識物質を含むサンドイッチ複合体を形成することができる。具体例としては、一次物質は、マウス、ウサギなどの動物由来であって、被検物質に特異的に結合する一次抗体であり、二次物質は、標識物質を含み、該動物の抗体に特異的に結合する二次抗体である。
　標識物質は、特に限定されないが、たとえば、それ自体がシグナルを発生する物質(以下、「シグナル発生物質」ともいう)、および、他の物質の反応を触媒してシグナルを発生させる物質が挙げられる。シグナル発生物質としては、蛍光物質、放射性同位元素、発色物質などが挙げられる。他の物質の反応を触媒して検出可能なシグナルを発生させる物質としては、たとえば酵素が挙げられる。蛍光物質としては、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標)などの蛍光色素、ＧＦＰなどの蛍光タンパク質などが挙げられる。放射性同位元素としては、125Ｉ、14Ｃ、32Ｐなどが挙げられる。発色物質としては、金ナノコロイドなどの金属コロイドが挙げられる。酵素としては、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、グルコシダーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、チロシナーゼ、酸性ホスファターゼ、ルシフェラーゼなどが挙げられる。好ましい標識物質は酵素であり、アルカリホスファターゼが特に好ましい。
　測定工程において、検出体に基づくシグナルを測定することによって、被検物質を測定することができる。測定工程によって得られた値に基づき、被検物質の定量、定性的検出または半定量的検出を行うことができる。ここで、半定量的検出とは、シグナルの強度を、「シグナル発生せず」、「弱」、「中」、「強」などのように段階的に示すことをいう。
　シグナルを検出する方法自体は、該技術において公知である。本実施形態では、上記の標識物質に由来するシグナルの種類に応じた方法を適宜選択すればよい。シグナルの検出装置は、たとえば、吸光度計、分光光度計、蛍光光度計、赤外光光度計、ラマン分光光度計、ＳＰＲ測定装置、化学発光酵素免疫測定装置などを用いることができるが、特に限定されない。
　一実施形態では、検体中の被検物質を免疫学的に測定する。免疫学的測定法としてＥＬＩＳＡ法、免疫クロマトグラフ法、特開平１－２５４８６８号公報に記載の免疫複合体転移法などが挙げられる。
　別の実施形態では、被検物質として検体中の標的核酸を測定する。たとえば、上述のポリペプチドまたは多量体を固定した固相と、捕捉体として標的核酸にハイブリダイズする核酸プローブとを用いることができる。該核酸プローブは、Ｌ－ビオチンにより標識されており、固相上の本実施形態のポリペプチドまたは多量体と結合する。固相と標的核酸と検体とを接触させることによって、検体中の標的核酸が固相上に固定される。固相上で標的核酸を鋳型とし、核酸プローブをプライマーとして、ＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＰＴｓによりＤＮＡの伸長反応を行う。ＤＮＡの検出は、公知の方法により行うことができる。たとえば、合成されたアンプリコンに検出体としてインターカレーター（たとえばＳＹＢＲ（商標）　ＧｒｅｅｎＩ色素、エチジウムブロマイドなど）で標識し、蛍光を測定することができる。あるいは、検出体として伸長鎖に結合可能な蛍光プローブを結合し、蛍光を測定することができる。また、ＴａｑＭａｎ（商標）法を用いてもよい。
　図１を参照して、本実施形態の測定方法の一例を説明する。
　まず、容器９０に被検物質８１を含む検体とＲ１試薬とが分注される。第１試薬分注部５５１により、Ｒ１試薬が容器９０中に分注され、検体分注部５３０により、容器９０中に検体が分注される。Ｒ１試薬は、Ｌ－ビオチンが付加された捕捉体８４を含有し、被検物質８１と反応して結合する。検体とＲ１試薬とを分注後、反応部５８０において容器９０内の試料が所定温度に加温されることにより、捕捉体８４と被検物質８１とが結合する
　次に、第２試薬分注部５５２により、容器９０にＲ２試薬が分注される。Ｒ２試薬は、固相８２を含有する。固相８２は、本実施形態のポリペプチドまたはその多量体が固定されている。Ｒ２試薬の分注後、反応部５８０において容器９０内の試料が所定温度に加温される。この結果、前記Ｌ－ビオチンと、前記固相上の本実施形態のポリペプチドまたはその多量体とが結合することにより、被検物質８１と捕捉体８４とが固相８２に固定される。
　固相８２上に形成された被検物質８１および捕捉体８４と、未反応の捕捉体８４と、をＢＦ分離装置１００による１次ＢＦ分離処理によって分離してもよい。１次ＢＦ分離処理によって、未反応の捕捉体８４などの不要成分が、容器９０中から除去される。
　次に、第３試薬分注部５５３により、容器９０にＲ３試薬が分注される。Ｒ３試薬は、検出体８３を含有し、被検物質８１と反応して結合する。Ｒ３試薬の分注後、反応部５８０において容器９０内の試料が所定温度に加温される。この結果、固相８２上に、被検物質８１と、検出体８３と、捕捉体８４とを含むサンドイッチ複合体８５が形成される。図１の例では、検出体８３は、酵素標識抗体である。
　固相８２上に形成されたサンドイッチ複合体８５と、未反応の標識物質８３とは、ＢＦ分離装置１００による２次ＢＦ分離処理によって分離される。２次ＢＦ分離処理によって、未反応の検出体８３などの不要成分が、容器９０中から除去される。
　その後、第４試薬分注部５５４および第５試薬分注部５５５の各々により、容器９０にＲ４試薬およびＲ５試薬が分注される。Ｒ４試薬は、緩衝液を含有する。固相８２と結合したサンドイッチ複合体８５が緩衝液中に分散される。図１の例ではＲ５試薬は、化学発光基質を含有する。Ｒ４試薬に含有される緩衝液は、サンドイッチ複合体８５に含まれる検出体８３に標識されている酵素と、Ｒ５試薬に含まれる化学発光基質との反応を促進する組成を有する。Ｒ４、Ｒ５試薬の分注後、反応部５８０において容器９０内の試料が所定温度に加温される。検出体８３に対して基質を反応させることによって光が発生し、発生する光を検出部５２０の光検出器５２１により検出する。検出された光の強度に基づき被検物質８１を測定する。
　なお、本測定方法ではＲ１試薬とＲ２試薬とが容器９０に別々に分注されているが、Ｒ１試薬とＲ２試薬とをあらかじめ混合し、捕捉体８４が固相８２に固定された状態で容器９０に分注してもよい。
５．固相および固相を含む試薬キット
　本実施形態の固相は、上述のポリペプチドまたはその多量体を固定した固相である。
　本実施形態の固相とは、捕捉体を固定するための不溶性の担体である。上述のポリペプチドまたはその多量体の、固相への固定の態様は上で述べた通りである。固相は公知の固相から目的に応じて選択することができる。固相の素材としては、たとえば高分子化合物、無機物などから選択することができる。固相の素材は複数の素材を適宜組み合わせてもよい。
　高分子化合物は、有機高分子化合物、無機高分子化合物、半有機化合物を含む。高分子化合物は、たとえばラテックス、ゴム、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、スチレン－ブタジエン共重合体、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニル、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート、スチレン－メタクリレート共重合体、ポリグリシジルメタクリレート、アクロレイン－エチレングリコールジメタクリレート共重合体、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）、シリコーン、不溶性アガロース、不溶性デキストランなどが挙げられる。
　無機物は無機化合物および金属を含む。無機化合物としては、たとえば磁性体(酸化鉄、酸化クロム、コバルト、ニッケル、フェライト、マグネタイトなど)、ガラス、シリカ、アルミナなどが挙げられる。金属はたとえば金、銀およびそれらを含む物質などが挙げられる。
　本実施形態の試薬キットは上述のポリペプチドまたはその多量体が結合した固相と、Ｌ－ビオチンが付加された捕捉体と、を含む。
　本実施形態の試薬キットの一例を、図２に示す。図２において、１１は、試薬キットを示し、１２は、上述のポリペプチドまたはその多量体を結合した粒子を含む試薬を収容した第１容器を示し、１３は、Ｌ－ビオチンが付加された捕捉体を含む試薬を収容した第２容器を示し、１４は、梱包箱を示し、１５は、添付文書を示す。添付文書には、各試薬の組成、使用方法、保存方法などが記載されてもよい。試薬キットにはその他の試薬が含まれていてもよく、たとえば緩衝溶液、キャリブレータ―、検出体などが挙げられる。
　以下に実施例を示して本発明についてより詳細に説明する。しかし、本発明は実施例に限定して解釈されるものではない。
１．実施例１：Ｄ－ストレプトアビジンの調製
１－１．方法
　配列番号１に示されるポリペプチドの１３番目から１３９番目のアミノ酸からなるポリペプチド（Ｄ－コアストレプトアビジン）を合成すべく、配列番号１の１３番目から７１番目のアミノ酸からなるペプチドチオエステル、および７２番目アラニン残基をシステインに置換したポリペプチドから１３９番目のアミノ酸からなるポリペプチドを合成した。
（１）ＨＭＰＢ－ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ樹脂（０．４９ｍｍｏｌ／ｇ、Ｂｉｏｔａｇｅ製）（８２０ｍｇ、４００μｍｏｌ）にＤＣＭを加え１時間以上室温で膨潤させた。次にＤＣＭ（１２ｍＬ）に保護基で側鎖を保護したアミノ酸であるＦｍｏｃ－Ｄ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ（７９５ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）、縮合剤としてＭＳＮＴ（５９３ｍｇ、 ２．０ｍｍｏｌ）、５’末端ヒドロキシ基のキャッピング剤として１－メチルイミダゾール（１６０μＬ, ２．０ｍｍｏｌ）を加え、混合した。この混合溶液を膨潤させた樹脂に加え、室温で３時間撹拌した。
（２）反応溶液を除いた後、ＤＣＭ、ＤＭＦで樹脂を十分に洗浄した。次にＤＭＦ (１２ｍＬ)に無水酢酸 (２．０ｍＬ、２０ｍｍｏｌ)とピリジン (１．６ｍＬ、２０ｍｍｏｌ)を加え、よく混合し、これを樹脂と混ぜて室温で撹拌した。３０分後、溶液を除き樹脂をＤＭＦで十分に洗浄した。
（３）Ｆｍｏｃ－Ｄ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－ＯＨを縮合させた樹脂（１００μｍｏｌ）に対して、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ　（５００μｍｏｌ）、活性化剤のＤＩＣ（５００μｍｏｌ）、エピ化防止剤の　Ｏｘｙｍａ　Ｐｕｒｅ（商標）（５００μｍｏｌ）（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ製）、溶媒のＮ－メチルピロリドン（ＮＭＰ）（４ｍＬ）を加えて縮合させた。同様の手順で保護基で側鎖を保護したアミノ酸をＦｍｏｃ－Ｄ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ（５００μｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ－Ｄ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－（Ｈｍｂ）－Ｇｌｙ－ＯＨ（１回目：１５０μｍｏｌ、２回目：１００μｍｏｌ）に変更して、手合成により縮合した。Ｆｍｏｃ－Ｄ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－（Ｈｍｂ）－Ｇｌｙ－ＯＨはダブルカップリングにより縮合した。
（４）マイクロ波支援自動ペプチド合成機（ＬｉｂｅｒｔｙＢｌｕｅ、ＣＥＭ製）を用いて３９Ｌ－６６Ｔまでの２８残基を伸長した。マイクロ波支援自動ペプチド合成機ではＦｍｏｃ－Ｄ－アミノ酸（５００μｍｏｌ）、ＤＩＣ（５００μｍｏｌ）、Ｏｘｙｍａ　Ｐｕｒｅ（商標)（５００μｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（５０μｍｏｌ）が用いられ、縮合反応および樹脂の洗浄にはＤＭＦ、Ｆｍｏｃ基の除去には２０％ピペリジン／ＤＭＦを使用した。縮合反応とＦｍｏｃ基の除去反応時にはマイクロ波を照射することで反応を促進させた。
（５）樹脂を回収し、再び手合成によりＦｍｏｃ－Ｄ－Ａｌａ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｄ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－（Ｈｍｂ）－Ｇｌｙ－ＯＨを（３）と同様の反応条件で、ペプチドを伸長した。ここではＦｍｏｃ－Ｄ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－（Ｈｍｂ）－Ｇｌｙ－ＯＨのダブルカップリングを１００μｍｏｌで２回行った。樹脂の結合したポリペプチドにＮＭＰ（７ｍＬ）に無水酢酸（１６７μＬ、１．８ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（７８．８μＬ、０．４５ｍｍｏｌ）およびＯｘｙｍａ　Ｐｕｒｅ（商標）（５．３ｍｇ、３７μｍｏｌ）を加え、混合し、室温で１５分間撹拌した後にＮＭＰで十分に洗浄した。
（６）マイクロ波支援自動ペプチド合成機を用いて１３Ａ－３５Ａまでの２３残基を伸長し、最終的に樹脂が結合した１３Ａ－７１Ｔの５９残基のポリペプチドを調製した。
（７）樹脂が結合した５９残基のポリペプチドをＮ末端のＦｍｏｃ基が除去された状態で合成機から回収した。回収した樹脂（１００μｍｏｌ）にＢｏｃ２Ｏ（１１５μＬ、５００μｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（８７μＬ、５００μｍｏｌ）、ＮＭＰ（３ｍＬ）を加え、室温で撹拌した。１時間後、溶液を除きＮＭＰで樹脂を十分に洗浄した。このＢｏｃ化の操作を２度繰り返した。
（８）樹脂が結合した５９残基のポリペプチド（１００μｍｏｌ）に１％ＴＦＡ／ＤＣＭ溶液（３ｍＬ）を加え、５分間撹拌した後、ピリジン（５８５μＬ）を入れたナスフラスコに濾液を回収した。この操作を１３回繰り返した後、トリフルオロエタノール／ＤＣＭ（３：５）溶液（３ｍＬ）で樹脂を３回洗浄し、洗液を同じナスフラスコに回収した。溶媒を減圧留去した後、得られた固体にＨ２Ｏ（４０ｍＬ）を加え撹拌した。１０分間遠心（１００００ｒｐｍ）し、上澄みを除去。この操作を３回繰り返し、個体を洗浄した後、得られた固体を凍結乾燥することにより保護ペプチド（１７１ｍｇ、２０μｍｏｌ）を得た。
（９）得られた保護ペプチド（１１６ｍｇ、１３．５μｍｏｌ）をＮＭＰ（５ｍＬ）に溶かし、撹拌しながら－１５℃に冷却した。これにチオフェノール（４２μＬ、４０５μｍｏｌ）、ＰｙＢＯＰ（３６．７ｍｇ、６７．５μｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（１２μＬ、６７．５μｍｏｌ）を加え、一晩撹拌した。反応完結後、反応溶液を氷冷したジエチルエーテル（４０ｍＬ）に注ぎ撹拌した。１０分間遠心（１００００ｒｐｍ）し、上澄みを除去した。この操作を３回繰り返した後、生じた沈殿を風乾することにより保護粗生成ペプチドチオエステル（チオフェニルエステル体）（１１３ｍｇ）を得た。得られた粗生成物にＴＦＡ：Ｈ２Ｏ：トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）：エタンジチオール（ＥＤＴ）（９２．５：２．５：２．５：２．５、ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）混合液（３ｍＬ）を加え、室温で撹拌した。３時間後、反応液を氷冷したジエチルエーテル（４０ｍＬ）に加え、生じた沈殿を風乾させて脱保護粗生成ペプチド（８５．６ｍｇ）を得た。得られた脱保護粗生成ペプチドに８Ｍのグアニジン塩酸塩、０．２Ｍの２－メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム（ＭＥＳＮＡ）を含む０．２Ｍのリン酸バッファー（ｐＨ７．０）（３ｍＬ）を加え室温で撹拌した。１時間以上撹拌の後、ＲＰ－ＨＰＬＣ（Ｐｒｏｔｅｏｎａｖｉ　Ｃ１、４．６×２５０ｍｍ、Ｌｉｎｅａｒ　ｇｒａｄｉｅｎｔ　ｏｆ　Ｂ：１７．５－２１．５、１．０ｍＬ／ｍｉｎ、１２ｍｉｎ、６０℃、２２０ｎｍ、Ａ：ａｑｕｅｏｕｓ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　０．１％ＴＦＡ、Ｂ：９０％ＭｅＣＮ、１０％Ｈ２Ｏ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　０．０９％ＴＦＡ、資生堂製）により精製し、５９残基のペプチドチオエステル（１３Ａ－７１Ｔ、ＭＥＳＮＡチオエステル体）（６．６ｍｇ、１．０９μｍｏｌ）を得た。
（システインを含むポリペプチドの合成）
（１）ＨＭＰＢ－ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ樹脂（０．４９ｍｍｏｌ／ｇ）（６１２ｍｇ、３００μｍｏｌ）にＤＣＭを加え１時間以上室温で膨潤させた。次にＤＣＭ（９ ｍＬ）にＦｍｏｃ－Ｄ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ （５７５ ｍｇ、１．５ ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（４４４ ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）および１－メチルイミダゾール（１２０μＬ、１．５ｍｍｏｌ）を加え、よく混合した。この混合溶液を膨潤させた樹脂に加え、室温で一晩撹拌した。反応溶液を除き、ＤＣＭおよびＤＭＦで樹脂を十分に洗浄した。次にＤＭＦ（９ｍＬ）に無水酢酸（１．５ｍＬ、１５ｍｍｏｌ）とピリジン（１．２ｍＬ、１５ｍｍｏｌ）を加え、樹脂と混合し、室温で３０分間撹拌した。その後、樹脂をＤＭＦで十分に洗浄した。
（２）マイクロ波支援自動ペプチド合成機を用いて、Ｆｍｏｃ－Ｄ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－ＯＨを縮合させた樹脂（１００μｍｏｌ）を、７２Ｃ－１３９Ｓでの６８残基を伸長した。縮合反応で使用した各試薬の量はＦｍｏｃ－Ｄ－アミノ酸（５００μｍｏｌ）、ＤＩＣ（５００μｍｏｌ）、Ｏｘｙｍａ Ｐｕｒｅ（商標）（５００μｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（５０μｍｏｌ）であった。縮合反応および樹脂の洗浄にはＤＭＦ、Ｆｍｏｃ基の除去には２０％ピペリジン／ＤＭＦを使用し、縮合およびＦｍｏｃ基の除去反応の際にはマイクロ波を照射することで反応を促進させた。
（３）樹脂が結合した６８残基のポリペプチドを（１００μｍｏｌ）にＴＦＡ：Ｈ２Ｏ：ＴＩＰＳ：ＥＤＴ（９２．５：２．５：２．５：２．５、ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）混合液（１０ｍＬ）を加え、室温で撹拌した。３時間後、反応液を氷冷したジエチルエーテル（８０ｍＬ）に加え、生じた沈殿を風乾させて脱保護粗生成ペプチド（３９６ｍｇ）を得た。
（４）ＲＰ－ＨＰＬＣ（Ｔｒｉａｒｔ－Ｃ１８、２０×２５０ｍｍ、Ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｏｆ Ｂ：３０－４５、９．９ｍＬ／ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、６０℃、２２０ｎｍ、Ａ：ａｑｕｅｏｕｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ０．１％ＴＦＡ、Ｂ：９０％ ＭｅＣＮ、１０％ Ｈ２Ｏ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ０．０９％ ＴＦＡ、ＹＭＣ製）により精製し、６８残基のペプチドセグメント（７２Ｃ－１３９Ｓ）（３７．２ｍｇ、５．０３μｍｏｌ）を得た。
（ポリペプチドのライゲーション）
　０．２Ｍのリン酸バッファー（８Ｍのグアニジン塩酸塩、４０ｍＭの４－メルカプト酢酸、４０ｍＭのアスコルビン酸ナトリウム、４０ｍＭのトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を含む、ｐＨ ７．１）（５４６μＬ）にペプチドチオエステル（１３Ａ－７１Ｔ）（６．０ｍｇ、０．９３３μｍｏｌ）、ペプチドセグメント（７２Ｃ－１３９Ｓ）（９．３ｍｇ、１．２６μｍｏｌ）を加え、室温で終夜撹拌した。反応完結後、０．２Ｍのリン酸バッファー（８Ｍのグアニジン塩酸塩、０．２Ｍの２－メルカプトエタンスルホン酸ナトリウムを含む、ｐＨ７．０）で２倍に希釈し、室温で撹拌した。１時間以上の撹拌の後、ＲＰ－ＨＰＬＣ（Ｐｒｏｔｅｏｎａｖｉ Ｃ１、４．６×２５０ｍｍ、Ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｏｆ Ｂ：１５－３５、１．０ ｍＬ／ｍｉｎ、３０ ｍｉｎ、６０℃、２２０ｎｍ、Ａ：ａｑｕｅｏｕｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ０．１％ ＴＦＡ、Ｂ：９０％ ＭｅＣＮ、１０％Ｈ２Ｏ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ０．０９％ＴＦＡ、資生堂製）により精製し、全長１２７残基の［Ｃｙｓ６０］－（１－１２７）ペプチド（６．７ｍｇ、０．５０４μｍｏｌ）を得た。
（脱硫反応）
　［Ｃｙｓ６０］－（１－１２７）ペプチド（４．７ｍｇ、０．３５４μｍｏｌ）を８Ｍのグアニジン塩酸塩、０．２５ＭのＴＣＥＰを含む０．２Ｍのリン酸バッファー（ｐＨ ７．１）７０７μＬに溶解し、ｔｅｒｔ－ブタンチオール（４０μＬ）、ＶＡ－０４４／Ｈ２Ｏ（２５０ｍｇ／ｍＬ、２７μＬ）を順次加えた後、容器を遮光し室温で撹拌した。４時間後、１．４ ｍＬの８Ｍのグアニジン塩酸塩、０．２５ＭのＴＣＥＰを含む０．２Ｍのリン酸バッファー（ｐＨ ７．１）を加えてよく混ぜた。この混合液にジエチルエーテル（１．７ｍＬ）を加え、よく撹拌した後に静置し、水相を回収した。これを３回繰り返して回収した水相からジエチルエーテルを十分に飛ばした後、ＲＰ－ＨＰＬＣ（Ｐｒｏｔｅｏｎａｖｉ Ｃ１、４．６×２５０ ｍｍ、Ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｏｆ Ｂ：１５－４５、１．０ ｍＬ／ｍｉｎ、３０ ｍｉｎ、６０℃、２２０ｎｍ、Ａ：ａｑｕｅｏｕｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ０．１％ＴＦＡ、Ｂ：９０％ ＭｅＣＮ、１０％Ｈ２Ｏ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ０．０９％ＴＦＡ、資生堂製）により精製し、全長１２７残基のポリペプチド（２．６ ｍｇ、０．１９６ μｍｏｌ）を得た。
（４量体の調製）
　全長１２７残基のポリペプチドを変性バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、６Ｍ グアニジン－ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０（４ ℃））に１ｍｇ／ｍＬとなるよう溶解し、８５℃で４５分間加熱した。加熱した溶液５ｍＬを３ＭのグアニジンＨＣｌを含むバッファー１（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、２００ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）にて４℃で１２時間透析した。次に２ＭのグアニジンＨＣｌを含むバッファー１にて４℃で３６時間透析した。０．４ＭのＬ－アルギニンＨＣｌと１ＭのグアニジンＨＣｌを含むバッファー１にて４℃で１２時間透析した。０．４ＭのＬ－アルギニンＨＣｌと０．５ＭのグアニジンＨＣｌを含むバッファー１にて４℃で３６時間透析した。最後にバッファー１にて４℃で４時間の透析を２回繰り返し、バッファー１にて室温で一晩透析を行った。
（ゲルろ過クロマトグラフィー解析）
　透析後のポリペプチドをアミコンウルトラ－１５ １０Ｋ 遠心式フィルターデバイス（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ製）で濃縮後、ＡＫＴＡ　Ｐｒｉｍｅシステム（Ｃｙｔｉｖａ製）を用いてＳｕｐｅｒｄｅｘ２００　１０／３００ＧＬ（Ｃｙｔｉｖａ製）に５００μＬずつ供し、バッファー１を流速０．４ｍＬ／分で流し、波長２８０ｎｍの吸光度の経時変化を溶出性の指標とするゲルろ過クロマトグラフィーを行った。さらに分子量の推定のために市販の４量体の天然体コアストレプトアビジン（ロシュ製）についても同様にゲルろ過クロマトグラフィーを行った。
１－２．結果
　上記で調製したポリペプチドのゲルろ過クロマトグラフィーの、波長２８０ｎｍの吸光度の経時変化を図３に示す。画分８は凝集体のピークである。画分１４から画分１８は市販の４量体コアストレプトアビジンにおいても、同様のピークが見られた画分であることから、４量体ポリペプチドのピークであると推定される。この画分１４から画分１８までを回収し、アミコンウルトラ－１５ １０Ｋ 遠心式フィルターデバイス（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ製）を用いて濃縮を行い、Ｄ－アミノ酸残基で構成される４量体のＤ－ストレプトアビジン（以下、便宜上実施例では単に「Ｄ－ストレプトアビジン」と称する）を調製した。
２．実施例２：ＳＰＲ解析によるＤ－ストレプトアビジンのビオチン結合性評価
２－１．方法
　実施例１で得たＤ－ストレプトアビジンについて、天然型であるＤ－ビオチンおよびＤ－ビオチンの光学異性体であるＬ－ビオチンに対する結合能を、ＳＰＲを測定原理とした分子間相互作用解析装置（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００）により評価した。
　Ｌ－ビオチンは非特許文献（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １９７８、１００、１５５８－１５６３）に記載の方法によりＤ－ビオチンとＬ－ビオチンの混和物を合成したのち、液体クロマトグラフィーによる光学分割をダイセル社に委託して調製した。カラムはＣＨＩＲＡＬＰＡＫ　ＩＧ（ダイセル製、Φ４６×５０ｍｍ）を用い、移動相にメタノール：酢酸混合溶媒（１００：０．１（ｖ／ｖ））として流速１．０ｍＬ／分、カラム温度４０℃、検出波長２０５ｎｍの条件下で光学分割を行った。
（１）ビオチン標識アルブミンの調製
　５０ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン／０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ　７．５）２．８ｍＬに１０ｍｇ／ｍＬのＤ－ビオチン－ＡＣ５－ＯＳｕ（同仁化学社製）を含むＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド溶液（１６．３μＬ）を加え、攪拌後、３５℃、１時間静置した。その後、０．１Ｍのリン酸バッファー（ｐＨ７．５）で平衡化したＰＤ－１０（Ｃｙｔｉｖａ製、１７０８５１０１）により脱塩を実施し、Ｄ－ビオチン標識アルブミンを回収した。ＨＡＢＡ法によるアルブミン１分子あたりのＤ－ビオチン標識数は０．４であった。
同様にＬ－ビオチン－ＡＣ５－ＯＳｕ［前記実施例３に記載の（Ｌ－ビオチンのアミド化）を参照］を用いてＬ－ビオチン標識アルブミンを調製した。
（２）センサーチップへの固定
　Ｂｉａｃｏｒｅ　Ｔ２００システムのＣＭ５センサーチップ（Ｃｙｔｉｖａ製）のフローセル１および３に対して、ウシ血清アルブミンをアミンカップリングキット（Ｃｙｔｉｖａ社）によるアミンカップリング法によりターゲットレベル４００ＲＵで固定化した。さらにフローセル２、４に対して同様にアミンカップリング法によって、それぞれＬ－ビオチン標識アルブミン、Ｄ－ビオチン標識アルブミンをターゲットレベル４００ＲＵで固定化した。いずれのフローセルも１Ｍ エタノールアミン溶液、ｐＨ８．５（Ｃｙｔｉｖａ製）でブロッキングを実施した。
（ビオチンとの相互作用測定）
ランニングバッファーとしてＨＢＳ－ＥＰ＋（Ｃｙｔｉｖａ製）を使用し、アナライトとして実施例１で調製したＤ－ストレプトアビジンをシングルサイクル法により、１０ｐＭから１００ｎＭの範囲で流速３０μＬ／ｍｉｎで各フローセルに流した。
２－２．結果
　Ｄ－ストレプトアビジンとＬ－ビオチン標識アルブミンとの分子間相互作用のセンサグラムを図４Ａに、Ｄ－ストレプトアビジンとＤ－ビオチン標識アルブミンとの分子間相互作用のセンサグラムを図４Ｂ示す。天然体コアストレプトアビジンとＤ－ビオチン標識アルブミンとの分子間相互作用のセンサグラムを図５に示した。
　天然体コアストレプトアビジンとＤ－ビオチン標識アルブミンとのセンサグラムと、Ｄ－ストレプトアビジンとＬ－ビオチン標識アルブミンとのセンサグラムの比較から本実施例のＤ－ストレプトアビジンとＬ－ビオチン標識アルブミンとが、天然体コアストレプトアビジンとＤ－ビオチン標識アルブミンの組み合わせと同様に非常に強固に結合していることがわかった。
　図４において、Ｄ－ストレプトアビジンとＤ－ビオチン標識アルブミンとはアナライトであるＤ－ストレプトアビジンの結合による特異的なセンサグラムの変化が確認されなかった。特許文献１に示されるストレプトアビジン変異体と天然型のＤ－ビオチン標識アルブミンとの解離定数Ｋｄ＝３．４８×１０－７を考慮すると、本実施例のＤ－ストレプトアビジンとＤ－ビオチンとの結合性が極めて低く、実質的に結合しないということができる。
３．実施例３：ＥＬＩＳＡ法におけるＤ－ビオチンの測定系に対する影響の評価
３－１．方法
（ストレプトアビジン結合固相の作製）
　９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）をＰＢＳで３回洗浄したのち、実施例１で調製したＤ－ストレプトアビジン（１μｇ／ｍＬ、ＰＢＳ、１００μＬ）を加え、４℃で一晩静置した。ＰＢＳで３回洗浄した後、２％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳバッファー（２００μＬ）を添加し２５℃、回転速度６００ｒｐｍで２時間振とう攪拌を行い、Ｄ－ストレプトアビジン固定化プレートを作製した。Ｌ－ストレプトアビジン（ロシュ製）についても同様の処理を行いＬ－ストレプトアビジン固定化プレートを作製した。
（Ｌ－ビオチンのアミド化）
　ビオチン（４３ｍｇ）とＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）（２４．３ｍｇ）をＤＭＦ（１．２ｍＬ）に溶解し、エチル（ジメチルアミノプロピル）カルボキシジイミド（ＥＤＣ）（４０．５ｍｇ）を加え室温にて２３時間攪拌した。溶媒を留去して得られる残留物をエタノール：酢酸：水（９５：５：１）から再結晶し、６－（５－（（３ａＲ，４Ｒ，６ａＳ）－２－オキソヘキサヒドロ－１Ｈ－チエノ［３，４－ｄ］イミダゾル－４－イル）ペンタンアミド）ヘキサン酸６－アミノヘキサン酸（化合物２）（６３．９ｍｇ）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　６－アミノヘキサン酸（２４．２ｍｇ））を０．２５Ｍの炭酸ナトリウム水溶液（０．４ｍＬ）に溶解した。この溶液を、化合物２のＤＭＦ（１ｍＬ）溶液に加え、室温にて２３時間攪拌した。溶媒を留去後、残留物を水洗した。４Ｍ塩酸にて酸性にし、生成した固体を濾取して６－（５－（（３ａＲ，４Ｒ，６ａＳ）－２－オキソヘキサヒドロ－１Ｈ－チエノ［３，４－ｄ］イミダゾル－４－イル）ペンタンアミド）ヘキサン酸（化合物３）（６８．５ｍｇ）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　化合物３（６８．５ｍｇ）とＮＨＳ（４０．５ｍｇ）をＤＭＦ（３．３ｍＬ）に溶解し、ＥＤＣ（６７．５ｍｇ）を室温にて加え、３５℃にて２１時間攪拌した。溶媒を留去して得られる残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、ＤＣＭ－メタノール溶出部より２．５－ジオキソピロリジン－１－イル５－（（３ａＲ, ４Ｒ, ６ａＳ）－２－オキソヘキサヒドロ－１Ｈ－チエノ［３，４－ｄ］イミダゾル－４－イル）ペンタノアート（化合物４）（４７．６ｍｇ）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
（ビオチン標識抗体の調製）
　５．１ｍｇ／ｍＬの甲状腺刺激ホルモン抗体（ＴＳＨ抗体）（Ｔ２－１９４）（北山ラベス製）（２５μＬ）に１６．７ｍｇ／ｍＬのＬ－ビオチン－ＡＣ５－ＯＳｕを含むＤＭＳＯ溶液（１．３μＬ）加え、攪拌後、３５℃、１時間静置した。その後、０．１Ｍのリン酸バッファー（ｐＨ７．５）で平衡化したＰＤ－１０（Ｃｙｔｉｖａ製、１７０８５１０１）に供し、５００μＬずつの画分を分取し、２８０ｎｍ波長の吸収ピーク画分を回収し、Ｌ－ビオチン標識ＴＳＨ抗体を作製した。Ｄ－ビオチン－ＡＣ５－ＯＳｕ（同仁化学製）についても同様の処理を行い、Ｄ－ビオチン標識ＴＳＨ抗体を作製した。
（Ｄ－ビオチン存在下における、測定系への影響の評価）
（１）１．５ｍＬｔｕｂｅに検体としてＨＩＳＣＬ（商標）　ＴＳＨ　ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ　Ｃ３（シスメックス製）４００μＬおよび、ＨＩＳＣＬ（商標）　ＴＳＨ　Ｒ１試薬（シスメックス製）を４００μＬ添加し、３７℃、６００ｒｐｍの条件で３０分反応させた。なお、検体についてはＤ－ビオチン影響度を評価するため、０ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬまたは１００ｎｇ／ｍＬのＤ－ビオチンを添加してＲ１試薬と反応させた。
（２）ブロッキング後のＤ－ストレプトアビジン固定化プレートについて、ＨＩＳＣＬ（商標）　ｗａｓｈ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（シスメックス製）で３回洗浄し、各ｗｅｌｌに１．５ｍＬ　ｔｕｂｅで反応済みの溶液を６０μＬずつ添加した。３７℃、６００ｒｐｍの条件で２０分反応させた。上記で作製したＬ－ビオチン標識ＴＳＨ抗体を添加し、３７℃、６００ｒｐｍの条件で３０分反応させた。
（３）反応後はプレートをＨＩＳＣＬ（商標）　ｗａｓｈ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（シスメックス製）で５回洗浄し、ＨＩＳＣＬ（商標）　Ｒ４試薬（シスメックス製）を５０μＬずつ添加し、続けてＨＩＳＣＬ（商標）　Ｒ５試薬（シスメックス製）を１００ｕＬずつ添加し、３７℃、６００ｒｐｍの条件下で３０分反応させた。反応後はマイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ製、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ　２００　ＰＲＯ）にて発光検出を行った。また、ブロッキング後のＬ-ストレプトアビジン固定化プレートとＤ－ビオチン標識ＴＳＨ抗体についても同様に測定を行った。
３－２．結果
　Ｄ－ビオチン存在下におけるＥＬＩＳＡ法によるＴＳＨの検出結果を図６に示す。図６には、各測定系においてＤ－ビオチン濃度が０ｎｇ/ｍＬの検体を測定したときのシグナル測定値を１００％としたときの、各検体のシグナル測定値の百分率を示す。検体中にＤ－ビオチンが存在する場合、Ｄ－ビオチン／Ｌ－ストレプトアビジンの測定系ではＤ－ビオチンの添加濃度に依存してシグナルが減少した。一方、Ｌ－ビオチン／Ｄ－ストレプトアビジンの測定系ではＤ－ビオチン添加による影響がほとんど見られなかった。
　Ｄ－ストレプトアビジン／Ｌ－ビオチンの測定系は、実質的に検体に存在する内在性のＤ－ビオチンの影響を受けなかった。
４．実施例４：測定系の定量性の確認
４－１．方法
（１）１．５ｍＬのｔｕｂｅに検体としてＨＩＳＣＬ（商標）　ＴＳＨ　ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ　Ｃ０～Ｃ５（シスメックス製）を０μＩＵ／ｍＬ、２μＩＵ／ｍＬ、１０μＩＵ／ｍＬ、５０μＩＵ／ｍＬ、１２０μＩＵ／ｍＬまたは２００μＩＵ／ｍＬになるよう添加した。その後、ＨＩＳＣＬ（商標）　ＴＳＨ　ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ　Ｃ０～Ｃ５（シスメックス製）を添加したＨＩＳＣＬ（商標）　ＴＳＨ　Ｒ１試薬（シスメックス製）を４００μＬ添加し、３７℃、６００ｒｐｍの条件で３０分反応させた。
（２）実施例３と同様に作成したブロッキング後のＤ－ストレプトアビジン固定化プレートについて、ＨＩＳＣＬ（商標）　ｗａｓｈ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（シスメックス製）で３回洗浄し、各ｗｅｌｌに１．５ｍＬ　ｔｕｂｅで反応済みの溶液を６０μＬずつ添加した。３７℃、６００ｒｐｍの条件で２０分反応させた。上記で作製したＬ－ビオチン標識ＴＳＨ抗体を添加し、３７℃、６００ｒｐｍの条件で３０分反応させた。
（３）反応後はプレートをＨＩＳＣＬ（商標）　ｗａｓｈ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（シスメックス製）で５回洗浄し、ＨＩＳＣＬ（商標）　Ｒ４試薬（シスメックス製）を５０μＬずつ添加し、続けてＨＩＳＣＬ（商標）　Ｒ５試薬（シスメックス製）を１００ｕＬずつ添加し、３７℃、６００ｒｐｍの条件下で３０分反応させた。反応後はマイクロプレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ　２００　ＰＲＯ）にて発光検出を行った。
４－２．結果
　実施例４で測定した結果を表１および図７に示す。図７は、ＴＳＨ濃度０～１２０μＩＵ／ｍＬのカウント値を示すグラフである。図７に示される通り、Ｌ－ビオチン／Ｄ－ストレプトアビジンの系はＲ２＝０．９９８と良好な相関性を示した。ＴＳＨの参考基準範囲が０．３４～４．２２μＩＵ／ｍＬであることから、測定範囲において良好な直線性を有する系であることがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　また、ＴＳＨ濃度５０μＩＵ／ｍＬ試料を５つ用意し、それぞれについてＴＳＨ濃度の測定を行った。その結果を表２に示す。変動係数が約５％であった。本実施例の測定系は、再現性の観点でも問題ないことが分かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
５．実施例５：構造維持に関わるアミノ酸残基のＬ－アミノ酸残基置換
５－１．方法
　配列番号１に示すＤ－ストレプトアビジンのアミノ酸配列のうち、一部のアミノ酸残基をＬ体に変更することによる立体構造への影響を検討した。検討の際には、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ（ダッソー社製）によるインシリコ解析を行った。
まず天然型コアストレプトアビジン四量体の結晶構造（ＰＤＢ ＩＤ：３ＲＹ２）をプロテインデータバンク（ＰＤＢ）より取得し、四量体から一つの単量体構造を抽出した。抽出した構造を元にＤｉｓｃｏｖｅｒｙ　Ｓｔｕｄｉｏ上において全アミノ酸残基をＤ－アミノ酸残基に変換することで、Ｄ－ストレプトアビジンの単量体構造を構築した。その後、Ｄ－ストレプトアビジン単量体構造を構成するアミノ酸残基の溶媒接触度を確認した。Ｄ－ストレプトアビジンのコア配列のアミノ酸残基のうち、グリシン以外のアミノ酸残基であって、溶媒接触度２５％以下のアミノ酸残基を特定した。その結果、該アミノ酸残基は溶媒接触度が低い順に、配列番号１の２１、２９、７７、１０４、１３０、５４、５６、３９、４３、２７、７５、３１、９２、９０、１２８、１０２、３３、７９、７１、７３、１０６、２３、６０、９６、８１、１２２、２８、８６、８８、５０、４５、１０８、３８、１１０、１３２および４２番目の計３６個のアミノ酸残基であった。これらのアミノ酸残基は、Ｄ－ストレプトアビジンの単量体内部にある構造維持に特に関わっていると考えられる。上記のアミノ酸残基のうちの１つをＬ－アミノ酸残基に置換した場合、置換したアミノ酸残基と、置換したアミノ酸残基のＮ側に隣接するアミノ酸残基と、Ｃ側に隣接するアミノ酸残基と、に関して、Ｃｌｅａｎ　Ｇｅｏｍｅｔｒｙ機能を利用して化合物の構造最適化を行った。その後、Ｄ－ストレプトアビジンの内部における原子間の衝突の有無を立体構造から確認した。
５－２．結果
　実施例５の結果、３６個のアミノ酸残基のいずれのアミノ酸残基についても、Ｄ－アミノ酸残基からＬ－アミノ酸残基に置換した際に生じる原子間の衝突が、Ｃｌｅａｎ　Ｇｅｏｍｅｔｒｙ機能を利用して構造最適化を行うことで解消した。その１例として、２１番目のアミノ酸残基であるＤ－トリプトファン残基をＬ－トリプトファン残基に置換したときに生じる原子の衝突が解消される様子を図８Ａ～Ｃに示す。２１番目のＤ－トリプトファン残基をＬ体に置換する前の構造を図８Ａで示す。２１番目のＤ－トリプトファン残基をＬ－トリプトファン残基に置換した際に、Ｄ－ストレプトアビジン内で原子間の衝突が生じる様子を図８Ｂに示す（楕円で強調した円柱が原子間の衝突を表す）。Ｃｌｅａｎ　Ｇｅｏｍｅｔｒｙ機能を利用して構造最適化を行うことで、Ｄ－ストレプトアビジン内の原子間の衝突が解消される様子を図８Ｃに示す。
　インシリコ解析において、構造維持に関わるアミノ酸残基のいずれのアミノ酸残基についても、Ｄ－アミノ酸残基からＬ－アミノ酸残基に置換した際に生じる原子間の衝突が解消されることがわかった。インビトロの状態においても、構造維持に関わるアミノ酸残基の一部をＬ－アミノ酸残基に置換した際に、Ｄ－ストレプトアビジン内の原子が移動して原子間の衝突が解消した構造が存在すると考えられる。
　したがって、単量体の構造維持に関わるアミノ酸残基の一部がＬ－アミノ酸残基に変わったとしても、ビオチンに結合可能な構造が維持されると考えられる。
６．実施例６：Ｄアミノ酸からなるタモギタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ　ｃｏｒｎｕｃｏｐｉａｅ）由来アビジン様タンパク質の合成
　Ｄアミノ酸からなるタモギタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ　ｃｏｒｎｕｃｏｐｉａｅ）由来アビジン様タンパク質（以下、Ｄ－タマビジン（商標）２）を合成した。配列番号４の２番目～１４１番目のアミノ酸配列を有するポリペプチドを、５つのペプチドセグメントに分け、それぞれをペプチド自動合成機（Ｐｒｅｌｕｄｅ　、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，　Ｉｎｃ．）により合成した。当該５つのセグメントは、配列番号４の２～２３番目の配列を含むセグメント１、２４～４９番目の配列を含むセグメント２、５０～７６番目の配列を含むセグメント３、７７～１０５番目の配列を含むセグメント４、および１０６～１４１番目の配列を含むセグメント５であった。次に、セグメント１と２を化学ライゲーションにより連結してセグメント１－２を調製し、セグメント３と４を化学ライゲーションにより連結してセグメント３－４を調製し、セグメント３－４にセグメント５を化学ライゲーションにより連結してセグメント３－４－５を調製し、セグメント１－２とセグメント３－４－５とを化学ライゲーションにより連結することにより、配列番号４の２番目～１４１番目のアミノ酸配列を有するＤ－タマビジン（商標）２を生成した。
（４量体の調製）
　Ｄ－タマビジン（商標）２を変性バッファー（８０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、６Ｍ　グアニジン－ＨＣｌ、１ｍＭ　ＤＴＴ、ｐＨ８．０）に２０ｍｇ／ｍＬとなるよう溶解し、８５℃で４５分間加熱した。加熱した溶液に対してバッファー（８０ｍＭ　Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ、１ｍＭ　ＤＴＴ、ｐＨ８．０）を５倍量添加し、室温３０分静置した。次にその溶液をバッファー（８０ｍＭ　Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ、１ｍＭ　ＤＴＴ、ｐＨ８．０）で５０倍希釈した後、４℃　Ｏ／Ｎ静置した。その後、溶液をアミコンウルトラ－４（３０ｋ）（メルクミリポア社）で濃縮を行った後、Ｄ－タマビジン（商標）２タンパク質溶液として回収した。
７．実施例７：ＳＰＲ解析によるＤ－タマビジン（商標）２のビオチン結合性評価
７－１．方法
（１）ビオチン標識アルブミンの調製
　５０ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン／０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ　７．５）２．８ｍＬに１０ｍｇ／ｍＬのＤ－ビオチン－ＡＣ５－ＯＳｕ（同仁化学社製）を含むＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド溶液（１６．３μＬ）を加え、攪拌後、３５℃、１時間静置した。その後、０．１Ｍのリン酸バッファー（ｐＨ７．５）で平衡化したＰＤ－１０（Ｃｙｔｉｖａ製、１７０８５１０１）により脱塩を実施し、Ｄ－ビオチン標識アルブミンを回収した。ＨＡＢＡ法によるアルブミン１分子あたりのＤ－ビオチン標識数は０．４であった。
同様にＬ－ビオチン－ＡＣ５－ＯＳｕ［前記実施例３に記載の（Ｌ－ビオチンのアミド化）を参照］を用いてＬ－ビオチン標識アルブミンを調製した。
（２）センサーチップへの固定
　Ｂｉａｃｏｒｅ　Ｔ２００システムのＣＭ５センサーチップ（Ｃｙｔｉｖａ製）のフローセル１および３に対して、ウシ血清アルブミンをアミンカップリングキット（Ｃｙｔｉｖａ社）によるアミンカップリング法によりターゲットレベル４００ＲＵで固定化した。さらにフローセル２、４に対して同様にアミンカップリング法によって、それぞれＬ－ビオチン標識アルブミン、Ｄ－ビオチン標識アルブミンをターゲットレベル４００ＲＵで固定化した。いずれのフローセルも１Ｍ　エタノールアミン溶液、ｐＨ８．５（Ｃｙｔｉｖａ製）でブロッキングを実施した。
（３）ビオチンとの相互作用測定
　ランニングバッファーとしてＨＢＳ－ＥＰ＋（Ｃｙｔｉｖａ製）を使用し、調製した　Ｄ－タマビジン（商標）２をシングルサイクル法により、１００ｐＭから１００ｎＭの範囲で流速３０μＬ／ｍｉｎで各フローセルに流し、Ｂｉａｃｏｒｅ　Ｔ２００　Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｃｙｔｉｖａ製）によってＤ－ビオチンまたはＬ－ビオチンに対する結合および解離を評価した。
７－２．結果
　Ｄ－タマビジン（商標）２と、Ｌ－ビオチン標識アルブミンとの分子間相互作用のＳＰＲシグナルの変化を図９Ａに示す。Ｄ－タマビジン（商標）２の添加量に応じて、ＳＰＲシグナルの上昇が認められた。
　Ｄ－タマビジン（商標）２と、Ｄ－ビオチン標識アルブミンとの分子間相互作用のＳＰＲシグナル変化を図９Ｂに示す。Ｄ－タマビジン（商標）２の添加に依存するＳＰＲシグナルの上昇は認められなかった。
　これらの結果からＤ－タマビジン（商標）２はＤ－ビオチン標識アルブミンとは実質的に結合せず、Ｌ－ビオチン標識アルブミンと結合することが示された。
８．実施例８：Ｄ－タマビジン（商標）２固定化プレートを用いたＥＬＩＳＡ法におけるＤ－ビオチンの測定系に対する影響の評価
８－１．方法
（１）１．５ｍＬｔｕｂｅに検体としてＨＩＳＣＬ（商標）　ＴＳＨ　ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ　Ｃ３（シスメックス製）２００μＬおよび、ＨＩＳＣＬ（商標）　ＴＳＨ　Ｒ１試薬（シスメックス製）を２００μＬ添加し、３７℃、６００ｒｐｍの条件で３０分反応させた。なお、検体についてはＤ－ビオチン影響度を評価するため、０ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬまたは１００ｎｇ／ｍＬのＤ－ビオチンを添加してＲ１試薬と反応させた。
　９６　ｗｅｌｌ　ＥＬＩＳＡプレート（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ社）にＤ－タマビジン（商標）２（１μｇ／ｍＬ、ＰＢＳ、５０μＬ）を４℃一晩で静置して固相化し、２％　ＢＳＡ／ＰＢＳでブロッキングを実施した。
（２）（１）で作成した、ブロッキング後のＤ－タマビジン（商標）２固定化プレートについて、ＨＩＳＣＬ（商標）　ｗａｓｈ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（シスメックス製）で３回洗浄し、各ｗｅｌｌに１．５ｍＬ　ｔｕｂｅで反応済みの溶液を６０μＬずつ添加した。３７℃、６００ｒｐｍの条件で２０分反応させた。前記実施例３に記載の（ビオチン標識抗体の調製）を参照］で作製したＬ－ビオチン標識ＴＳＨ抗体を添加し、３７℃、６００ｒｐｍの条件で３０分反応させた。
（３）反応後はプレートをＨＩＳＣＬ（商標）　ｗａｓｈ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（シスメックス製）で５回洗浄し、ＨＩＳＣＬ（商標）　Ｒ４試薬（シスメックス製）を５０μＬずつ添加し、続けてＨＩＳＣＬ（商標）　Ｒ５試薬（シスメックス製）を１００ｕＬずつ添加し、３７℃、６００ｒｐｍの条件下で３０分反応させた。反応後はマイクロプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭＡＸｉＤ３　モレキュラーデバイス社）にて発光検出を行った。
８－２．結果
　Ｄ－ビオチン存在下におけるＥＬＩＳＡ法によるＴＳＨの検出結果を図１０に示す。図１０には、各測定系においてＤ－ビオチン濃度が０ｎｇ／ｍＬの検体を測定したときのシグナル測定値を１００％としたときの、各検体のシグナル測定値の百分率を示す。Ｌ－ビオチン／Ｄ－タマビジン（商標）２の測定系ではＤ－ビオチン添加による影響がほとんど見られなかった。
　Ｄ－タマビジン（商標）２／Ｌ－ビオチンの測定系は、実質的に検体に存在する内在性のＤ－ビオチンの影響を受けないことが示唆された。
９．実施例９：Ｄ－タマビジン（商標）２固定化プレートを用いた測定系の定量性確認
９－１．方法
（１）１．５ｍＬのｔｕｂｅに検体としてＨＩＳＣＬ（商標）　ＴＳＨ　ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ　Ｃ０～Ｃ５（シスメックス製）を０μＩＵ／ｍＬ、２μＩＵ／ｍＬ、１０μＩＵ／ｍＬ、５０μＩＵ／ｍＬ、１２０μＩＵ／ｍＬまたは２００μＩＵ／ｍＬになるよう２００μＬ添加した。その後、ＨＩＳＣＬ（商標）　ＴＳＨ　ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ　Ｃ０～Ｃ５（シスメックス製）を添加したＨＩＳＣＬ（商標）　ＴＳＨ　Ｒ１試薬（シスメックス製）を２００μＬ添加し、３７℃、６００ｒｐｍの条件で３０分反応させた。
（２）実施例８（１）で作成した、ブロッキング後のＤ－タマビジン（商標）２固定化プレートについて、ＨＩＳＣＬ（商標）　ｗａｓｈ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（シスメックス製）で３回洗浄し、各ｗｅｌｌに１．５ｍＬ　ｔｕｂｅで反応済みの溶液を６０μＬずつ添加した。３７℃、６００ｒｐｍの条件で２０分反応させた。上記で作製したＬ－ビオチン標識ＴＳＨ抗体を添加し、３７℃、６００ｒｐｍの条件で３０分反応させた。
（３）反応後はプレートをＨＩＳＣＬ（商標）　ｗａｓｈ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（シスメックス製）で５回洗浄し、ＨＩＳＣＬ（商標）　Ｒ４試薬（シスメックス製）を５０μＬずつ添加し、続けてＨＩＳＣＬ（商標）　Ｒ５試薬（シスメックス製）を１００ｕＬずつ添加し、３７℃、６００ｒｐｍの条件下で３０分反応させた。反応後はマイクロプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭＡＸｉＤ３　モレキュラーデバイス社）にて発光検出を行った。
９－２．結果
　測定した結果を表３および図１１に示す。濃度依存的なシグナル変化が見られた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　また、ＴＳＨ濃度５０μＩＵ／ｍＬ試料を５つ用意し、それぞれについてＴＳＨ濃度の測定を行った。その結果を表４に示す。変動係数が約５％であった。本実施例の測定系は、再現性の観点でも問題ないことが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
１０．実施例１０：インシリコ解析
　Ｄ－ブラダビジン、およびＤ－アビジンのそれぞれについて、Ｌ－ビオチンまたはＤ－ビオチンに対する結合性を、インシリコ解析によって検討した。
１０－１．方法
　解析に使用したＬ－ビオチンの構造を図１２Ａに、Ｄ－ビオチンの構造を図１２Ｂに示す。Ｌ－ビオチンまたはＤ－ビオチンの構造の準備、および計算にはＤｉｓｃｏｖｅｒｙ　Ｓｔｕｄｉｏ２０１８を使用した。解析においては、天然体ストレプトアビジン－Ｄ－ビオチン複合体結晶構造データ（ＰＤＢ　ＩＤ：３ＲＹ２　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｓｓｅｍｂｌｙ１）、天然体ブラダビジン－Ｄ－ビオチン複合体結晶構造データ（ＰＤＢ　ＩＤ：４ＢＢＯ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｓｓｅｍｂｌｙ１）、または天然体アビジン－Ｄ－ビオチン複合体結晶構造データ（ＰＤＢ　ＩＤ：２ＡＶＩ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｓｓｅｍｂｌｙ１）に対して、４量体の状態で、Ｄ－ビオチン以外のリガンドを除去した。その後、Ｐｒｅｐａｒｅ　ｐｒｏｔｅｉｎコマンドを使用して水素原子を付与し、Ｄ－ビオチンを構造より除いた。それぞれの構造について、Ｌ／Ｄ　Ｃｏｎｖｅｓｉｏｎコマンドによって、Ｄ－アミノ酸によって構成された光学異性体タンパク質の構造をそれぞれ生成し、天然体におけるビオチン結合サイトに相当とする座標に半径１２Åの結合サイトを設定して、Ｄ－ビオチン、Ｌ－ビオチンのリガンドドッキング予測に用いた。
　Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ　Ｓｔｕｄｉｏ上でＣＤＯＣＫＥＲ機能によってリガンドドッキング構造の予測を行うとともに、相互作用スコア（ＣＤＯＣＫＥＲ　ＥＮＥＲＧＹ）の数値を得た。天然体ストレプトアビジンと各ビオチンの光学異性体との間の相互作用スコアは、結合性の基準となる。
１０－２．結果
　結果は下記の通りであった。いずれも単位はｋｃａｌ／ｍｏｌである。
　　ａ．Ｄ－ストレプトアビジン
　　　　Ｌ－ビオチン　－３３．５８６７
　　　　Ｄ－ビオチン　－２９．２７１７
　　ｂ．Ｄ－ブラダビジン
　　　　Ｌ－ビオチン　－３０．６４２３
　　　　Ｄ－ビオチン　－２５．９５０８
　　ｃ．Ｄ－アビジン
　　　　Ｌ－ビオチン　－３１．５８４８
　　　　Ｄ－ビオチン　－２７．６１８５
　いずれの光学異性体も、Ｄ－ビオチンとの結合性を示すスコアと比較してＬ－ビオチンとの結合性を示すスコアが３．９～４．７ｋｃａｌ／ｍｏｌ程度低かった。この結果から、Ｄ－ブラダビジンおよびＤ－アビジンは、Ｄ－ストレプトアビジンと同様に、Ｄ－ビオチンには実質的に結合せず、Ｌ－ビオチンに対して強力に結合することが示唆された。

Claims (15)

  1. アビジン－ストレプトアビジンファミリーに属するポリペプチドであって、前記ポリペプチドのグリシン以外のアミノ酸残基のうち９０％以上のアミノ酸残基にＤ－アミノ酸残基を含み、
    Ｌ－ビオチンに対する結合能を有し、
    Ｄ－ビオチンに対する結合能を実質的に有さない
    ポリペプチド。
  2. 配列番号１に示されたアミノ酸配列の１９番目から１３３番目の配列、
    配列番号２に示されたアミノ酸配列の２番目から１２８番目の配列、
    配列番号３に示されたアミノ酸配列の４番目から１２９番目の配列および
    配列番号４に示されたアミノ酸配列の４番目から１２７番目の配列
    のいずれかのアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む、
    請求項１に記載のポリペプチド。
  3. アビジン－ストレプトアビジンファミリーに属するポリペプチドであって、前記ポリペプチドのグリシン以外のアミノ酸残基がＤ－アミノ酸残基のみで構成されるポリペプチド。
  4. 配列番号１に示されたアミノ酸配列の１９番目から１３３番目の配列、
    配列番号２に示されたアミノ酸配列の２番目から１２８番目の配列、
    配列番号３に示されたアミノ酸配列の４番目から１２９番目の配列および
    配列番号４に示されたアミノ酸配列の４番目から１２７番目の配列
    のいずれかのアミノ酸配列を含む、
    請求項３に記載のポリペプチド。
  5. 配列番号１に示されたアミノ酸配列の１９番目から１３３番目のアミノ酸残基を含む、
    請求項１～４いずれかに記載のポリペプチド。
  6. 配列番号１に示されたアミノ酸配列の１３番目から１３９番目のアミノ酸残基を含む、
    請求項１～５いずれかに記載のポリペプチド。
  7. 請求項１～６のいずれかに記載のポリペプチドをモノマー単位とする多量体。
  8. 前記多量体が四量体である請求項７に記載の多量体。
  9. 請求項１～６のいずれかに記載のポリペプチドおよび／または請求項７または８に記載の多量体が固定された固相。
  10. ポリペプチドおよび/または多量体が固定された固相と、検体中の被検物質と結合する捕捉体とを用いて被検物質を測定する方法であって、
    前記ポリペプチドは、
    アビジン－ストレプトアビジンファミリーに属し、
    グリシン以外のアミノ酸残基のうち９０％以上のアミノ酸残基にＤ－アミノ酸残基を含み、
    Ｌ－ビオチンに対する結合能を有し、
    Ｄ－ビオチンに対する結合能を実質的に有さないポリペプチドであり、
    前記多量体は前記ポリペプチドをモノマー単位とする多量体であり、
    前記捕捉体は、Ｌ－ビオチンが付加されており、
    前記Ｌ－ビオチンと前記固相上の前記ポリペプチドまたは前記多量体が結合することにより、前記被検物質の検出時において、前記捕捉体が前記固相に固定されている、被検物質の測定方法。
  11. 前記捕捉体が、抗体、抗原、レクチン、核酸、酵素、または基質を含む、請求項１０に記載の測定方法。
  12. 前記固相と、前記捕捉体と、前記被検物質に結合する検出体と、前記被検物質と、を接触させ、前記固相と前記捕捉体と前記検出体と前記被検物質とを含む複合体を形成する工程、および
    前記複合体に含まれる前記検出体に基づき、前記被検物質を測定する工程を含む、
    請求項１０または１１に記載の測定方法。
  13. 　前記検出体が、蛍光物質または酵素を含む、請求項１２に記載の測定方法。
  14. 　ポリペプチドおよび/または多量体が固定された固相、およびＬ－ビオチンが付加された捕捉体を含む、被検物質測定用の試薬キットであって、
    前記ポリペプチドは、
    アビジン－ストレプトアビジンファミリーに属し、
    グリシン以外のアミノ酸残基のうち９０％以上のアミノ酸残基にＤ－アミノ酸残基を含み、
    Ｌ－ビオチンに対する結合能を有し、
    Ｄ－ビオチンに対する結合能を実質的に有さない、
    ポリペプチドであり、
    前記多量体は前記ポリペプチドをモノマー単位とする多量体である、被検物質測定用の試薬キット。
  15. 請求項１０～１３のいずれかに記載の測定方法に用いられる、請求項１４に記載の試薬キット。
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