WO2022093065A1 - Рекомбинантный полипептид на основе аллергена пыльцы березы и аллергена яблока - Google Patents

Рекомбинантный полипептид на основе аллергена пыльцы березы и аллергена яблока Download PDF

Info

Publication number
WO2022093065A1
WO2022093065A1 PCT/RU2021/000437 RU2021000437W WO2022093065A1 WO 2022093065 A1 WO2022093065 A1 WO 2022093065A1 RU 2021000437 W RU2021000437 W RU 2021000437W WO 2022093065 A1 WO2022093065 A1 WO 2022093065A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
allergen
pres
bet
recombinant
apple
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/RU2021/000437
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2022093065A8 (ru
Inventor
Муса Рахимович ХАИТОВ
Рудольф Валента
Милена ВЕБЕР
Раффаэлла КАМПАНА
Игорь Петрович ШИЛОВСКИЙ
Валерий Валерьевич СМИРНОВ
Юрий Владимирович ЖЕРНОВ
Сергей Михайлович АНДРЕЕВ
Артем Андреевич ШАТИЛОВ
Анастасия Витальевна ТИМОФЕЕВА
Наталья Ивановна ИЛЬИНА
Елена Сергеевна ФЕДЕНКО
Ольга Гурьевна ЕЛИСЮТИНА
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
National Research Center Institute Of Immunology Federal Medical Biological Agency Of Russia
Original Assignee
National Research Center Institute Of Immunology Federal Medical Biological Agency Of Russia
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by National Research Center Institute Of Immunology Federal Medical Biological Agency Of Russia filed Critical National Research Center Institute Of Immunology Federal Medical Biological Agency Of Russia
Priority to EP21887017.8A priority Critical patent/EP4233900A4/en
Priority to CN202180072320.6A priority patent/CN116490207A/zh
Publication of WO2022093065A1 publication Critical patent/WO2022093065A1/ru
Anticipated expiration legal-status Critical
Publication of WO2022093065A8 publication Critical patent/WO2022093065A8/ru
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/29—Hepatitis virus
    • A61K39/292—Serum hepatitis virus, hepatitis B virus, e.g. Australia antigen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/35—Allergens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/35—Allergens
    • A61K39/36—Allergens from pollen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/01—DNA viruses
    • C07K14/02—Hepadnaviridae, e.g. hepatitis B virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the invention relates to medicine, namely to biotechnology, immunology and allergology, and concerns the production of a recombinant polypeptide for allergen-specific immunotherapy capable of inducing blocking IgG antibodies to birch pollen allergen and to cross food allergens.
  • allergen-specific immunotherapy is the induction of allergen-specific IgG antibodies that block the binding of IgE antibodies to the sensitizing agent in patients [1]. Allergen-specific blocking IgG antibodies induced during AIT reduce allergy symptoms by blocking IgE antibody cross-linking on mast cells and basophils [2]. In addition, allergen-specific IgG antibodies induced during AIT can inhibit IgE-mediated allergen presentation by T cells and thus reduce the late stage of the allergic reaction [3]. Finally, allergen-specific IgG antibodies are able to bind the allergen, preventing an increase in the allergen-specific IgE response in allergic patients when exposed to the allergen. Presumably, this mechanism leads to a long-term decrease in the level of allergen-specific IgE antibodies in patients undergoing a long-term course of AIT [4].
  • AIT aimed at the treatment of birch pollen allergy partially protects against the appearance of O AS, but this protection is not stable [7]. Therefore, there is a need to develop AIT vaccines capable of inducing blocking IgG antibodies not only to the birch pollen allergen Bet v 1 but also to cross-food allergens.
  • a pharmaceutical composition has been developed for specific immunotherapy of allergies, the initiation of which involves the main allergen of birch pollen Bet v 1, including the hypoallergenic main allergen of birch pollen Bet v 1 and/or its pharmaceutically acceptable derivatives.
  • the hypoallergenic major birch pollen allergens are distinguished by the absence or reduction of immunoglobulin E binding while maintaining therapeutically relevant stimulation of T cells (WO 03/072601 (MERK PATENT GMBH), 09/04/2003).
  • WO 2013/017591 (LOFARMA SPA), February 7, 2013, a hybrid protein was obtained for use in immunotherapy of patients allergic to pollen of Malus domectica and / or Betula verrucosa, containing a protein that is a hypoallergenic mutant of the main allergen Malus domectica, and a protein, which is a hypoallergenic mutant of the main allergen Bet v 1 from Betula verrucosa pollen separated by a linker.
  • This technology for creating hypoallergenic vaccines is notable for the fact that site-directed mutations are introduced into the DNA sequence of allergens. As a result, the polypeptide sequence of the allergen also changes, leading to a decrease in allergenicity.
  • IgG antibody binding to IgE antibody sites on allergens is achieved by fusing non-allergenic peptides derived from allergen IgE-binding sites to the Hepatitis B virus PreS protein acting as a carrier.
  • This new type of molecular allergy vaccines has many advantages over traditional vaccines based on allergen extracts, both in terms of production method, safety and ease of clinical use [9].
  • Technology based on the PreS carrier protein is also used to create hypoallergenic vaccines for the treatment of patients with birch pollen allergy [10].
  • 2PAPB-PreS also referred to as B-Pres, induces protective IgG antibodies better when immunizing rabbits than the native recombinant allergen rBet v 1 [10].
  • hypoallergenic protein which consists of one hypoallergenic molecule derived from an allergen fused to a second non-allergenic protein derived from a pathogen.
  • the allergen is selected from the group consisting of the main allergens of birch pollen, in particular Bet v 1 and Bet v 4, the main allergens of timothy grass pollen, the main allergens of house dust mite, the main allergens of cats Fel d 1 and Fel d 2, the main allergens of bees, the main wasp allergens, ragweed allergens (WO 2007/140505 (BIOMAY AG), 12/13/2007).
  • this vaccine composition does not have the ability to induce blocking IgG antibodies to cross-food allergens.
  • the aim underlying the present invention is to provide a vaccine for allergen-specific immunotherapy capable of inducing blocking IgG- antibodies to the birch pollen allergen and to cross food allergens, in particular, to the apple allergen Mai d 1.
  • the solution to this problem is provided by obtaining a recombinant polypeptide for the treatment or prevention of allergy to birch pollen allergen and apple allergen, containing peptide fragments of the wild-type birch pollen and apple allergen, connected to the surface polypeptide PreS of the hepatitis B virus, and having the amino acid sequence SEQ ID NO 2.
  • the recombinant polypeptide contains at least four peptide fragments of the wild-type birch pollen allergen Bet v 1 and at least two peptide fragments of the wild-type apple allergen Mai d 1.
  • the wild-type allergen is selected from the group consisting of the main birch pollen allergens, in particular Bet v 1, where two peptide fragments have the amino acid sequence of SEQ ID NO 5 and the other two peptide fragments have the amino acid sequence of SEQ ID NO 6.
  • AB-PreS contains apple and birch allergen peptides that mimic B-, but not T-cell epitopes of these allergens. Elimination of T-cell epitopes from the composition AB-PreS allows you to achieve more significant construct security, because. the possibility of activation of T-cells producing pro-inflammatory factors is excluded.
  • the A-PreS construct consists of two copies of each of two Mai d 1 derived peptides (A-Pl and A-P2) combined with a PreS protein.
  • the B-PreS construct consists of two copies of each of the two Bet v 1 derived peptides (B-Pl and B-P2) combined with a PreS protein.
  • the AB-PreS construct is similar in overall construction to B-PreS, with each of the two peptides from the Mai d 1 derivatives placed between the sequences of the PreS protein and the peptides from the birch allergen.
  • FIG. 9 Inhibition of the binding of IgE antibodies of patients to the allergen Bet vic using the serum of rabbits immunized with various doses of recombinant vaccines based on the PreS protein. The percentage inhibition of IgE binding to rBet v 1 was determined for sera from 10 birch pollen allergic patients.
  • the percentage inhibition of IgE binding to rBet v 1 was determined for sera from 10 birch pollen allergic patients. Pre-incubation with Bet v i c PBS is taken as 0% inhibition. The data is displayed as charts, for which 50% of the values are inside a rectangular shape; horizontal lines denote median values. Significant differences in inhibition are shown, calculated using Student's t-test. x - statistically significant compared with the serum of non-immunized "Normal" rabbits.
  • FIG. 11 Inhibition of IgE antibody binding in Bet v i c patients using rabbit sera immunized with recombinant PreS protein-based vaccines compared to Allergovit.
  • the percentage inhibition of IgE binding to rMal d 1 was determined for sera from 10 birch pollen allergic patients. Pre-incubation with Bet v i c PBS is taken as 0% inhibition. The data is displayed as charts, for which 50% of the values are inside a rectangular shape; horizontal lines denote median values. Significant differences in inhibition are shown, calculated using Student's t-test. x - statistically significant compared with the serum of rabbits immunized with "Allergovit" rabbits.
  • the B-PreS ( Figure 2) was identical to the previously described 2PAPB-PreS construct, which was found to activate IgG antibodies capable of blocking the IgE of patients with birch pollen allergy more effectively than wild-type recombinant Bet v 1 [10]. Also, two additional designs were prepared, one of which resembles the B-PreS construct, but instead of peptide derivatives from Bet v 1, peptides from Mai d 1 were added ( Figure 2).
  • the third AB-PreS construct in addition to the peptide derivatives from Bet v 1, contains a copy of two peptide derivatives from Mai d 1, A-Pl and A-P2, inserted into B-PreS, which are located between the birch allergen peptides and the PreS sequence ( Figure 2).
  • AB-PreS contains apple and birch allergen peptides that mimic B-, but not T-cell epitopes of these allergens.
  • EXAMPLE 2 Expression, purification and biochemical characterization of recombinant polypeptides.
  • the resulting bacterial pellets were resuspended in 8 M urea, 10 M MangROd and 10 M Tris (8 Rn) containing a mixture of protease inhibitors (Sigma, Aldrich) and 5 ⁇ g/ml DNase I (Sigma, Aldrich), after which they were homogenized in an Ultra Turrax 3 x 5 minutes (IKA, Stauffen, Germany).
  • the pellet of homogenized cells was lysed by stirring for 2 hours at 4C. Cell lysates were purified by centrifugation at 14,000 rpm for 15 minutes at 4°C, after which recombinant proteins were purified by nickel affinity chromatography (Qiagen, Hilden, Germany).
  • Purified fusion proteins were eluted with 8 M urea, 10 Mm MangroPO and 10 Mm Tris (Ph 4.5), dialyzed with 10 Mm MacgrPOd, for A-PreS Ph 4.8 Ph 7.8, AB-PreS Ph and for B-PreS Ph 7.4, after which concentrated by ultrafiltration (Amicon Ultra 15; Merck KgaA, Darmstadt, Germany) to 0.75-10 mg/mL. The value was determined using the BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific, IL).
  • Figure 6 shows a Coomassie blue stained SDS-PAGE that contains purified recombinant proteins B-PreS, A-PreS and AB-PreS. Proteins are well purified by about 95%, contained in a significant amount for detection, about 10 mg/l of culture, without any signs of decay. Purification was carried out according to the protocol described in the Methods section. The observed molecular weight for the three proteins in SDS-PAGE was consistent with the predicted one, which was calculated in according to their amino acid sequence and observed masses, which we determined using mass spectrometry ( Figure 6). Circular dichroism (CD) analysis showed that the proteins were not folded.
  • CD Circular dichroism
  • Each of the recombinant purified proteins was dissolved in isotonic buffer containing 0.9% sodium chloride and 10 mM sodium phosphate, and an appropriate amount of aluminum hydroxide was added to each protein solution.
  • a mixture containing equal parts of the four resulting suspensions was prepared and aliquoted under sterile conditions in sealed vials.
  • the injectable composition obtained by this method contained 0.16 mg/ml each of A-PreS, B-PreS and AB-PreS.
  • composition of vaccines with adsorbed aluminum hydroxide containing A-PreS, B-PreS and AB-PreS was performed as described in [11].
  • This formulation is required to achieve a maximum dose of 80 ⁇ g AB-PreS per animal in a volume of 0.5 ml/individual.
  • the remaining doses were prepared by diluting the original maximum dose with the appropriate volume of buffer (10 mM NagrPO + 0.9% NaCl).
  • the percentage of active basophils in whole blood samples was assessed using an allergenicity test (BAT-test) (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA) according to the manufacturer's instructions.
  • the BAT test was performed using two purified recombinant allergens Bet v 1 and Mai d i e at three concentrations for each allergen: 1 ng/ml, 10 ng/ml, 100 ng/ml and with equimolar concentrations of protein constructs B-PreS and A-PreS ( 2.1 ng/ml, 21 ng/ml, 210 ng/ml) and AB-PreS (2.7 ng/ml, 26.6 ng/ml, 266 ng/ml), which corresponds to a molar concentration of 0.05, 0.5 and 5 Nm.
  • the positive control was anti-IgE antibodies (0.01 mg/ml) and the negative control (solvent PBS). Controls were prepared for each patient.
  • Flow cytometry was performed on a BD FACS Canto II instrument (BD Biosciences, USA). Compensation was set in BD FACSDiva Software (BD Biosciences). The results were analyzed using FlowJoTM software version 10.6.2 (Tree Star). The results are presented as the percentage of activated basophils. Activated basophils were identified as CRTH2 pos CD203c pos CD3 neg. Isotype controls (rat IgG2a, kappa isotype control (Ebr2a), FITC, eBioscienceTM, mouse IgGl, (PE-Cy7), MG112, Thermofisher) negative (PBS) and positive control (anti-IgE antibodies) were used to gate activated basophils.
  • Isotype controls rat IgG2a, kappa isotype control (Ebr2a), FITC, eBioscienceTM, mouse IgGl, (PE-Cy7), MG112, Thermofisher)
  • EXAMPLE 5 Inhibition of binding of IgE antibodies of patients with recombinant allergens rBet v 1 and rMal d i e using rabbit antibodies.
  • Vaccination Protocol Thirty rabbits with low levels of IgG antibodies to Bet v 1 and Mai d 1 were included in the study after being randomized into 15 groups of 2 rabbits each. Each group of rabbits was individually immunized with 3 recombinant vaccines (A-PreS, B-PreS, AB-PreS) at three doses each and 6 other commercial vaccines based on allergen extracts:
  • Immunization with commercial vaccines based on allergen extracts was carried out in accordance with the manufacturer's recommendations for patients with allergies.
  • the order of injections and timing of blood sampling are shown in Figure 5 and Table 1, and provide additional information on the doses administered and the amount of blood drawn.
  • Serum sampling was performed (approximately 2 ml from each rabbit) on the day of the first immunization and at 4-week intervals as indicated in Table 1. Sera were stored at -20°C until analysis.
  • Inhibition of IgE binding in birch pollen allergic patients rBet v 1 and apple rMal d 1 was determined by competitive inhibition ELISA.
  • the plates were adsorbed with rBet v 1 or rMal d 1 at a concentration of 1 ⁇ g/ml and incubated overnight at 4°C. After washing and blocking overnight with 2% BSA, the plates were incubated for 2 hours at 37°C followed by 1 hour at 4°C with sera from rabbits treated with AIT courses at a 1:10 dilution. Serum from non-immunized rabbits was used as a control and compared with serum obtained from rabbits 1 month after the end of the AIT course.
  • Rabbit sera were preincubated for 1 h at 56°C to inactivate IgE but retain other antibody isotypes, in particular IgG antibodies.
  • An additional negative control using phosphate buffered saline (PBS) was also used, which was added to the wells of the tablet instead of rabbit serum.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the serum of patients allergic to birch pollen was added at a dilution of 1:5 and incubated overnight at 4°C, then bound human IgE antibodies were detected using labeled goat anti-human IgE antibodies conjugated with HRP (Invitrogen, USA) in dilution 1:2000.
  • Student's t-test (STATISTICA 8.0 StatSoft Inc) was used to compare the degree of inhibition after different immunization courses. A p value ⁇ 0.05 was considered statistically significant.
  • Example 6.1 Comparative analysis of inhibition of IgE binding to Bet v 1 upon immunization with AB-PreS, B-Pres and A-PreS.
  • Example 6.2 Comparative analysis of IgE binding to Bet v 1 during immunization with AB-PreS, B-Pres and commercial vaccines based on birch allergen extracts.
  • Figure 10 presents data demonstrating that antibodies induced in rabbits by all vaccines (except Purethal) significantly inhibited the binding of IgE antibodies of patients to the allergen Bet v 1. The highest degree of inhibition of IgE binding was obtained with rabbit antibodies induced by the vaccine on based on Allergovit allergen extracts.
  • SLIT sublingual immunotherapy
  • the regimen for recombinant PreS protein-based vaccines will be a pre-season course of 3-5 injections followed by 1 or 2 pre-season injections the following year.
  • the maximum course will be 7 injections for two years of treatment.
  • the suggestion that only 1 or 2 additional injections are needed to increase the level of allergen-specific IgG antibodies after the base course of immunization is supported by the results obtained in clinical trials of the PreS protein-based grass pollen allergy vaccine BM32.
  • it was found that one injection is enough to restore allergen-specific IgG antibodies to the levels obtained one month after the main course of immunization [12,13].
  • treatment with vaccines based on recombinant PreS proteins will be much more convenient than any currently existing form of AIT.
  • Immunization with B-Pres and AB-PreS induces protective antibodies that inhibit IgE binding to the Bet v 1 allergen significantly more strongly than antibodies induced by commercial vaccines based on allergen extracts.
  • Example 6.3 Comparative analysis of IgE binding to apple allergen Mai d 1 during immunization with AB-PreS and B-Pres.
  • Figure 12 shows that after immunization with three doses (20 ⁇ g, 40 ⁇ g, 80 ⁇ g) of AB-PreS, inhibition of IgE binding to Mai d 1 was significantly more pronounced than the inhibition of the same doses of B-PreS.
  • the recombinant birch pollen allergy vaccine AB-PreS based on the PreS protein, induces a higher level of projective antibodies that block IgE binding to Bet v 1 and Mai d 1 compared to other tested vaccines.
  • Antibodies induced by immunization with AB-Pres are significantly better at inhibiting IgE binding to the apple allergen Mai d 1 than with B-Pres.
  • AB-PreS contains peptides from the allergen of apple and birch, fused with the PreS protein, completely lacks IgE reactivity, which indicates a greater safety of this protein.
  • AB-PreS contains apple and birch allergen peptides that mimic B-, but not T-cell epitopes of these allergens. Elimination of T-cell epitopes from the AB-PreS composition makes it possible to achieve a more significant safety of the construct, since the possibility of activation of T-cells producing pro-inflammatory factors is excluded.
  • This design of the AB-PreS polypeptide evokes an increased immune response against allergenic molecules, and induces blocking IgG antibodies to the birch pollen allergen Bet v 1 and to the apple allergen Mai d 1. At the same time, it inhibits IgE binding to Mai d 1 much stronger than inhibition the same doses of B-PreS polypeptide.
  • the birch pollen allergy vaccine based on the AB-PreS polypeptide induces a higher level of projective antibodies that block IgE binding to Bet v 1 and Mai d 1 compared to other commercial vaccines. List of sources

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Изобретение относится к медицине, а именно к биотехнологии, иммунологии и аллергологии, и касается получения рекомбинантного полипептида для аллерген-специфической иммунотерапии, способного индуцировать блокирующие IgG-антитела к аллергену пыльцы березы и к перекрестным пищевым аллергенам. Рекомбинантный полипептид для лечения или профилактики аллергии на аллерген пыльцы березы и яблока содержит пептидные фрагменты аллергена дикого типа пыльцы березы, и яблока, соединенные с поверхностным полипептидом PreS вируса гепатита В, и имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO 2. Получен рекомбинантный полипептид, содержащий эпитопы, необходимые для активации защитных антител против Bet v 1 и Mal d 1 в одном белке, что позволяет получить однокомпонентную вакцину, вместо того, чтобы использовать вакцины, содержащие два или более производных аллергенов.

Description

РЕКОМБИНАНТНЫЙ ПОЛИПЕПТИД НА ОСНОВЕ АЛЛЕРГЕНА ПЫЛЬЦЫ БЕРЕЗЫ И АЛЛЕРГЕНА ЯБЛОКА
Область техники
Изобретение относится к медицине, а именно к биотехнологии, иммунологии и аллергологии, и касается получения рекомбинантного полипептида для аллерген- специфической иммунотерапии, способного индуцировать блокирующие IgG-антитела к аллергену пыльцы березы и к перекрестным пищевым аллергенам.
Предшествующий уровень техники
Основной механизм в аллерген-специфической иммунотерапии (AIT) — индукция аллерген-специфических антител класса IgG, которые блокируют связывание антител класса IgE с сенсибилизирующим агентом у пациентов [1]. Аллерген-специфические блокирующие IgG-антитела, индуцированные в ходе AIT, уменьшают симптомы аллергии, блокируя перекрестное связывание IgE-антител на тучных клетках и базофилах [2]. К тому же, индуцированные в ходе AIT аллерген-специфические IgG-антитела способны ингибировать IgE-обусловленную презентацию аллергена Т-клетками и, таким образом, уменьшать позднюю стадию аллергической реакции [3]. Наконец, аллерген- специфические IgG-антитела способны связывать аллерген, предотвращая усиление аллерген-специфического IgE-ответа, у пациентов с аллергией при контакте с аллергеном. Предположительно этот механизм, приводит к долгосрочному снижению уровня аллерген-специфических IgE-антител у пациентов, проходящих долговременный курс AIT [4].
Аллергия на пыльцу березы часто встречается у людей на территории России и других северных стран. Она зачастую ассоциирована с оральным аллергическим синдромом (OAS) и возникает при употреблении пищи растительного происхождения, поскольку IgE-антитела, направленные против основного аллергена березы - Bet v 1 , так же перекрестно реагируют со структурно родственными аллергенами других растений [5]. В частности, такая кросс-реактивность Bet v 1 имеет место с аллергеном яблока - Mai d 1, что приводит к появлению OAS у пациентов с аллергией на березу при употреблении в пищу яблок. В ходе аллерген-специфичной иммунотерапии с применением экстрактов, содержащих Bet v 1 или рекомбинантных производных аллергена Bet v 1 происходит индукция не только протективных IgG-антител к Bet v 1, но также блокирующих IgG- антител к аллергену яблока Mai d 1 [6]. Поэтому AIT, направленная на терапию аллергии на пыльцу березы, частично защищает от появления О AS, но эта защита не стойкая [7]. Следовательно, существует потребность в разработке вакцин для AIT, способных индуцировать блокирующие IgG-антитела не только к аллергену пыльцы березы Bet v 1 , но и к перекрестным пищевым аллергенам.
Разработана фармацевтическая композиция для специфической иммунотерапии аллергий, в инициацию которых вовлечен основной аллерген пыльцы березы Bet v 1, включающая гипоаллергенный основной аллерген пыльцы березы Bet v 1 и/или его фармацевтически приемлемые производные. Гипоаллергенные основные аллергены пыльцы березы отличаются отсутствием или снижением связывания иммуноглобулина Е с одновременным сохранением терапевтически релевантной стимуляции Т-клеток (WO 03/072601 (МЕРК ПАТЕНТ ГМБХ), 04.09.2003).
Известны рекомбинантные аллергены Bet v 1, использование которых позволяет снизить специфическую IgE-связывающую способность по сравнению с IgE-связывающей способностью аллергена природного происхождения. Рекомбинантный аллерген Bet v 1 является мутантом аллергена Bet v 1 природного происхождения, где мутантный аллерген Bet v 1 имеет по меньшей мере четыре мутации, где каждая мутация является заменой одного экспонированного на поверхности аминокислотного остатка другим остатком, который не встречается в том же положении в аминокислотной последовательности любого известного гомологичного белка в пределах таксономического вида (WO 02/40676 (АЛЬК-АБЕЛЛО), 23.05.2002).
Согласно WO 2013/017591 (LOFARMA SPA), 07.02.2013 получен гибридный белок для применения в иммунотерапии пациентов, подверженных аллергии к пыльце Malus domectica и/или Betula verrucosa, содержащий белок, который представляет собой гипоаллергенный мутант главного аллергена Malus domectica, и белок, который представляет собой гипоаллергенный мутант главного аллергена Bet v 1 из пыльцы Betula verrucosa, разделенные линкером. Данная технология создания гипоаллергенных вакцин примечательна тем, что в последовательность ДНК аллергенов вводиться сайт- направленные мутации. В результате чего полипептидная последовательность аллергена также меняется, приводя к снижению аллергенности. Такой подход позволил авторам изобретения снизить IgE-реактивность химерного мутантного белка. Недостатком полученного химерного мутантного белка является его остаточная IgE-реактивность. Кроме того, он содержит в своем составе Т-клеточные эпитопы, т.е. имеется возможность активации Т-клеток, продуцирующих провоспалительные факторы, что в свою очередь снижает безопасность данного белка. В настоящее время создано новое поколение молекулярных вакцин для AIT, способных связать IgG-антитела с сайтами IgE-антител на аллергенах [8].
Показано, что связывание IgG-антитела с сайтами IgE-антител на аллергенах достигается путем слияния не аллергенных пептидов, полученных из участков IgE- связывания аллергенов с PreS-белком вируса гепатита В, выступающего в качестве носителя. Этот новый тип молекулярных аллерговакцин обладает множеством преимуществ перед традиционными вакцинами на основе экстрактов аллергенов, как по способу производства, безопасности и удобству клинического применения [9]. Технология на основе белка-носителя PreS, так же используется для создания гипоаллергенных вакцин для лечения пациентов с аллергией на пыльцу березы [10]. В частности, один из кандидатов, названный 2PAPB-PreS, обозначаемый также так же В- Pres, при иммунизации кроликов лучше индуцирует протективные IgG-антитела, чем нативный рекомбинантный аллерген rBet v 1 [10].
Известно получение гипоаллергенного белка, который состоит из одной гипоаллергенной молекулы, происходящей из аллергена, слитой со вторым не аллергенным белком, происходящим из патогена. Аллерген выбран из группы, состоящий из основных аллергенов пыльцы березы, в частности Bet v 1 и Bet v 4, основные аллергенов пыльцы тимофеевки луговой, основных аллергенов клеща домашней пыли, основных аллергенов кошек Fel d 1 и Fel d 2, основных аллергенов пчел, основных аллергенов ос, аллергенов амброзии (WO 2007/140505 (BIOMAY AG), 13.12.2007).
Наиболее близким аналогом изобретения является вакцинная композиция, предназначенная для лечения или предотвращении аллергии на аллерген пыльцы березы Bet v 1, содержащая эффективное количество аллергена, в частности, аллерген пыльцы березы Bet v 1 , и белок-носитель, который является полипептидом PreS вируса гепатита В (WO 2012/168487 (BIOMAY AG), 13.12.2012). Оказалось, что аллерген-специфические IgG антитела, индуцированные иммунизацией подобранными, происходящими от аллергена пептидными фрагментами, соединенными с полипептидом PreS вируса гепатита В, лучше нацеливаются на IgE эпитопы аллергена, в то время как иммунизация аллергеном дикого типа дает в результате IgG, направленный на все части аллергена - также и те, которые не являются IgE-реактивными.
Однако, данная вакцинная композиция не обладает индуцированием блокирующих IgG-антител перекрестным пищевым аллергенам.
Целью, лежащей в основе данного изобретения, является получение вакцины для аллерген-специфической иммунотерапии, способной индуцировать блокирующие IgG- антитела к аллергену пыльцы березы и к перекрестным пищевым аллергенам, в частности, к аллергену яблока Mai d 1.
Решение этой проблемы обеспечено получением рекомбинантного полипептида для лечения или профилактики аллергии на аллерген пыльцы березы и аллерген яблока, содержащего пептидные фрагменты аллергена дикого типа пыльцы березы, и яблока, соединенные с поверхностным полипептидом PreS вируса гепатита В, и имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO 2.
Рекомбинантный полипептид содержит, по меньшей мере, четыре пептидных фрагмента аллергена дикого типа пыльцы березы Bet v 1, и, по меньшей мере, два пептидных фрагмента аллергена дикого типа яблока Mai d 1.
Аллерген дикого типа выбирают из группы, состоящей из основных аллергенов пыльцы березы, в частности Bet v 1 , где два пептидных фрагмента имеют аминокислотную последовательность SEQ ID NO 5 и другие два пептидных фрагмента имеют аминокислотную последовательность SEQ ID NO 6.
Также аллерген дикого типа выбирают из группы, состоящей из основных аллергенов яблока, в частности Mai d 1 , имеющих один пептидный фрагмент с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 3 и другой пептидный фрагмент с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 4.
Композиция вакцины для лечения или профилактики аллергии на аллерген пыльцы березы и яблока содержит эффективное количество рекомбинантного полипептида, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO 2 и фармацевтически приемлемый наполнитель. Композиция дополнительно содержит по меньшей мере один адъювант и / или консервант. Адъювант представляет собой гидроксид алюминия.
Техническими результатами заявленного изобретения является получение рекомбинантного полипептида АВ-PreS (SEQ ID NO 2), содержащего эпитопы, необходимые для активации защитных антител против Bet v 1 и Mai d i e одном белке, что позволяет получить однокомпонентную вакцину, вместо того, чтобы использовать вакцины, содержащие два или более производных аллергенов.
У полученного рекомбинантного полипептида AB-PreS, который содержит пептиды из аллергена яблока и березы, слитые с белком PreS, полностью отсутствует IgE- реактивность, что свидетельствует о большей безопасности данного белка. Кроме того, в состав AB-PreS входят пептиды аллергена яблока и березы, имитирующие В-, но не Т- клеточные эпитопы указанных аллергенов. Элиминация Т-клеточных эпитопов из состава AB-PreS позволяет добиться более существенной безопасности конструкта, т.к. исключена возможность активации Т-клеток, продуцирующих провоспалительные факторы.
Согласно настоящему изобретению, полученный рекомбинантный полипептид АВ- PreS (SEQ ID NO 2), кроме пептидных производных от аллергена дикого типа березы Bet v 1 (SEQ ID NO 5 и SEQ ID NO 6) содержит пептидные производные от аллергена яблока Mai d 1 (SEQ ID NO 3 и SEQ ID NO 4), которые находятся между пептидами аллергена березы и поверхностным полипептидом PreS гепатита В (SEQ ID NO 7), что позволяет данной рекомбинантной конструкции вызвать повышенный иммунный ответ против аллергенных молекул, и индуцировать блокирующие IgG-антитела к аллергену пыльцы березы Bet v 1 и к аллергену яблока Mai d 1.
Таким образом, полученный рекомбинантный белок, представленный SEQ ID NO 2, ингибирует IgE-связывание с Mai d 1 значительно более выраженное, чем ингибирование такими же дозами B-PreS полипептида. В итоге вакцина от аллергии на пыльцу березы на основе AB-PreS полипептида индуцирует более высокий уровень проективных антител, блокирующих IgE-связывание с Bet v 1 и Mai d 1 по сравнению с другими протестированными вакцинами.
Краткое описание графических материалов/фигур.
ФИГ. 1. Множественное выравнивание последовательностей аллергена Bet v 1 и сходных аллергенов.
Аминокислотную последовательность Bet v 1 выравнивали совместно с родственными аллергенами из фруктов, овощей и пыльцы. Идентичные аминокислоты обозначены точками, пробелы обозначены как тире, количество аминокислот указано в правой части поля.
ФИГ. 2. Схематичное изображение полипептидов на основе PreS-белка.
Конструкция A-PreS состоит из двух копий каждого из двух пептидов, производных от Mai d 1 (А-Pl и А-Р2), объединенных с PreS-белком. Конструкции B-PreS состоит из двух копий каждого из двух пептидов, производных от Bet v 1 (В-Pl и В-Р2), объединенных с PreS-белком. Конструкция AB-PreS сходна по общей конструкции В- PreS, с каждым из двух пептидов от производных Mai d 1, помещённых между последовательностями PreS-белка и пептидов из аллергена березы.
ФИГ. 3. Последовательность ДНК, кодирующая полипептид AB-PreS и схематическое изображение регионов, кодирующих основные элементы полипептида. ФИГ. 4. Последовательность аминокислот полипептида AB-PreS и схематическое изображение основных элементов.
ФИГ. 5. Протокол иммунизации кроликов рекомбинантными вакцинами на основе PreS-белка и коммерческими вакцинами на основе экстрактов аллергенов.
Заключительный отбор образцов сыворотки крови отмечен красным квадратом.
ФИГ. 6. Характеристика рекомбинантных белков.
SDS-PAGE, окрашенные раствором кумасси, на котором видны очищенные PreS- белки (B-PreS, A-PreS и AB-PreS) и маркер молекулярной массы (М).
ФИГ. 7. IgE-связывающая способность PreS-белков.
Рекомбинантный Bet v 1 (А) и PreS-белки A-PreS (В), B-Pres (С) и AB-PreS (D) абсорбировались на ИФА-плейте с дальнейшей инкубацией с сыворотками пациентов с аллергией на пыльцу березы (ВРА), без аллергии на пыльцу березы (non-ВРА) и здоровых добровольцев (НС) в качестве контроля.
Данные представлены как среднее значение оптической плотности (OD) при длине волны 405 нм ± стандартная ошибка. Статистический анализ проводился с использованием программы Statistica 8.0 в соответствии с U-критерием Манна-Уитни.
* - статистически значимо отличается от «НС».
* - статистически значимо по сравнению с «поп-ВРА».
ФИГ. 8. Сравнение A-PreS, B-PreS и AB-PreS с rBet v 1 и rMal d 1 по способности активировать базофилы крови.
Показаны процентные содержания активированных базофилов в крови у четырех пациентов с аллергией на пыльцу березы (В1-В4) после стимуляции различными концентрациями (0,05-5 Нм) Bet v 1 и Mai d 1, эквимолярными концентрациями B-PreS, А- PreS и AB-PreS (А), антитела против IgE использованы в качестве положительного контроля (Pos С), буферный раствор в качестве отрицательного контроля (Neg С) (В).
Данные представлены в виде среднего значения процента активированных базофилов ± стандартная ошибка (N = 4).
Статистический анализ проводился с использованием программы Statistica 8.0 в соответствии с U-критерием Манна-Уитни.
* - статистически значимо отличается от «Neg С» х - статистически значимо отличается от «Bet v 1» и «Mai d 1».
ФИГ. 9. Ингибирование связывания IgE-антител пациентов с аллергеном Bet v i c использованием сыворотки кроликов, иммунизированных различными дозами рекомбинантных вакцин на основе PreS-белка. Процент ингибирования IgE-связывания с rBet v 1 определяли для сывороток от 10 пациентов с аллергией на пыльцу березы.
Предварительная инкубация Bet v 1 с PBS была принята за 0% ингибирования. Данные отображены в виде диаграмм, для которых 50% значений находятся внутри прямоугольной фигуры; горизонтальные линии обозначают медианные значения. Показаны существенные различия в ингибировании, рассчитанные с использованием t- критерия Стьюдента. х - статистически значимо по сравнению с сывороткой не иммунизированных кроликов «Normal».
* - статистически значимо по сравнению с сывороткой от кроликов, иммунизированных A-PreS.
ФИГ. 10. Ингибирование IgE-связывания с Bet v 1 сыворотками кроликов, иммунизированных коммерческими вакцинами на основе экстрактов аллергенов, через один месяц после последней иммунизации.
Процент ингибирования IgE-связывания с rBet v 1 определяли для сывороток от 10 пациентов с аллергией на пыльцу березы. Предварительная инкубация Bet v i c PBS принята за 0% ингибирования. Данные отображены в виде диаграмм, для которых 50% значений находятся внутри прямоугольной фигуры; горизонтальные линии обозначают медианные значения. Показаны существенные различия в ингибировании, рассчитанные с использованием t-критерия Стьюдента. х - статистически значимо по сравнению с сывороткой не иммунизированных кроликов «Normal».
ФИГ. 11. Ингибирование связывания IgE-антител пациентов с Bet v i c использованием сывороток кроли кроликов, иммунизированных рекомбинантными вакцинами на основе PreS-белка, по сравнению с Allergovit.
Процент ингибирования IgE-связывания с rBet v 1 определяли для сывороток от 10 пациентов с аллергией на пыльцу березы. Предварительная инкубация Bet v i c PBS принята за 0% ингибирования. Данные отображены в виде диаграмм, для которых 50% значений находятся внутри прямоугольной фигуры; горизонтальные линии обозначают медианные значения. Показаны существенные различия в ингибировании, рассчитанные с использованием t-критерия Стьюдента. х - статистически значимо по сравнению с сывороткой кроликов, иммунизированных кроликов «Allergovit». ФИГ. 12. Ингибирование IgE-связывания с аллергеном Mai d i e использованием сывороток кроликов, получавших курс AIT различными дозами PreS-белков.
Процент ингибирования IgE-связывания с rMal d 1 определяли для сывороток от 10 пациентов с аллергией на пыльцу березы. Предварительная инкубация Bet v i c PBS принята за 0% ингибирования. Данные отображены в виде диаграмм, для которых 50% значений находятся внутри прямоугольной фигуры; горизонтальные линии обозначают медианные значения. Показаны существенные различия в ингибировании, рассчитанные с использованием t-критерия Стьюдента. х - статистически значимо по сравнению с сывороткой кроликов, иммунизированных кроликов «Allergovit».
Подробное описание изобретения
Чтобы исследовать, может ли включение в вакцину B-PreS пептидов из аллергена Mai d 1 иметь преимуществе в части индукции протективных IgG-антител к аллергену яблока дополнительно разработано две вакцины на основе PreS -белка. Вакцина, содержащая пептиды, производные от Mai d 1, (A-PreS) и пептиды производные от Bet v 1 и Mai d 1 (AB-PreS), и сравнили их действие с B-PreS и несколькими другими коммерческими вакцинами на основе экстрактов аллергена пыльцы березы. При этом оценивали способность вакцин индуцировать антитела классе IgG, ингибирующих связывание IgE-антител пациентов с аллергенами Bet v 1 и Mai d 1.
ПРИМЕР 1. Проектирование вакцинных конструкций.
На рисунке 1 изображено множественное выравнивание последовательности Bet v 1 с родственными PR 10-аллергенами из пыльцы, фруктов, овощей, в которых можно выделить два пептида размером 45 аминокислотных остатков (Pl, Р2). Эти два пептида представляют собой производные от Bet v 1 из ранее описанной рекомбинантной вакцины, созданной на основе PreS-белка, которая способна индуцировать IgG-антитела, блокирующие IgE пациентов с аллергией на пыльцу березы эффективнее в сравнении с рекомбинантным аллергеном Bet v 1 дикого типа [10].
Были спроектированы три рекомбинантных конструкции на основе PreS-белка. В- PreS (Рисунок 2) был идентичен ранее описанной конструкции 2PAPB-PreS, которая, как было обнаружено, активирует антитела IgG, способные блокировать IgE пациентов с аллергией на пыльцу березы, эффективнее чем рекомбинантный Bet v 1 дикого типа [10]. Так же, были подготовлены две дополнительные конструкции, одна из которых напоминает конструкцию B-PreS, но вместо пептидных производных от Bet v 1, в нее были добавлены пептиды из Mai d 1 (Рисунок 2). Третья конструкция AB-PreS кроме пептидных производных от Bet v 1 содержит вставленный в B-PreS копию двух пептидных производных от Mai d 1, А-Pl и А-Р2, которые находятся между пептидами аллергена березы и PreS последовательностью (Рисунок 2).
Конструкции для экспрессии рекомбинантных антигенов были сделаны следующим образом: ДНК, кодирующие His-меченые фьюжн-белки (рисунок 3) состоящие из PreS- белка, (SEQ ID NO 7) объединенного с пептидами, производными Bet v 1 или Mai d 1, или объединенные с пептидами производных Bet v 1 или Mai d 1 (Mai d 1: A-P 1(30-74): LIPKIAPQAIKQAEILEGNGGPGTIKKITFGEGSQYGYVKHRIDS (SEQ ID NO 3), A-P2 (60-104): GEGSQYGYVKHRIDSIDEASYSYSYTLIEGDALTDTIEKISYETK (SEQ ID NO 4) Bet v 1: В-Pl (aa 30-74): LFPKVAPQAISSVENIEGNGGPGTIKKISFPEGFPFKYVKDRVDE (SEQ ID NO 5), B-P2 (aa 60-104):
PEGFPFKYVKDRVDEVDHTNFKYNYSVIEGGPIGDTLEKISNEIK (SEQ ID NO 6)) были оптимизированы для экспрессии в Escherichia coli, синтезированы (конструкция Mai d 1 - PreS / A-P2-PreS; конструкция Bet v 1 / конструкция Mai d 1-PreS: 2B-P1 / B-P2+1A-P1 1 A- P2-PreS - PreS) (ATG:biosynthetics GmBH, Merzhausen, Германия) (Рисунок 2) и вставлены по сайтам рестрикции Ndel / Xhol плазмиды pET-27b (Novagen, Darmstadt, Германия). Правильность последовательности ДНК подтверждали секвенированием обеих цепей рекомбинантной плазмиды (ATG:biosynthetics GmBH, Merzhausen, Германия).
Разработан дизайн рекомбинантных слитых PreS-белков, содержащих не аллергенные пептиды из участков связывания IgE основного аллергена пыльцы березы Bet v 1 и основного аллергена яблока Mai d 1.
На рисунке 1 было показано выравнивание пептидных последовательностей Bet v 1 , использованных для создания вакцин, с гомологичными PR 10-аллергенами из растительной пищи и пыльцы. Пептиды Р1 и Р2, производные от Bet v 1, были идентичны ранее описанной конструкции 2PAPB-PreS, которая, как было установлено, активирует антитела IgG, блокирующие IgE пациентов с аллергией на пыльцу березы эффективнее, чем рекомбинантный Bet v 1 дикого типа [10]. Однако, эта вакцина не сравнивалась с вакцинами на основе экстрактов аллергенов в отношении способности индуцировать IgG- антитела, блокирующих связывание IgE пациентов с аллергией к аллергену Bet v 1 и Mai d 1, последний из который является одним из наиболее важных перекрестно-реактивных пищевых аллергенов для пациентов с аллергией на пыльцу березы. Таким образом, A-PreS был разработан аналогично B-PreS на основе гомологичных пептидов А-Pl и А-Р2 (рисунок 2). В химерную конструкцию AB-PreS были включены пептиды из аллергена березы и яблока А-Pl и А-Р2 (конечный белковый продукт имел прогнозируемый размер около 50 кДа). Белковая последовательность AB-PreS представлена на рисунке 4.
Таким образом, в состав AB-PreS входят пептиды аллергена яблока и березы, имитирующие В-, но не Т-клеточные эпитопы указанных аллергенов.
ПРИМЕР 2. Экспрессия, очистка и биохимическая характеристика рекомбинантных полипептидов.
Рекомбинантные PreS-фьюжн-белки, A-PreS, B-PreS и AB-PreS экспрессировали в штамме Е. Coli BL21 (DE3) (Strategene, La Jolla, С А). Трансформированные клетки наращивали в жидкой среде Луция-Бертани (Luria-Bertani), в состав которой входило 25 мг/мл канамицина до оптической плотности OD = 0.6-0.8. Индукцию экспрессии белка осуществляли путем добавления изопропил-В-Э-тиогалактопирозид до конечной концентрации 1 ммоль/л, клетки культивировали в течении 3 часов при температуре 37 С, после центрифугировали при 4000 об/мин в течении 20 минут.
Получившиеся бактериальные осадки были ресуспендированны в 8 М мочевине, 10 Мм МаНгРОд и 10 Мм Трис (8 Рн), содержащей в себе смесь ингибиторов протеаз (Sigma, Aldrich) и 5 мкг/мл ДНКазы I (Sigma, Aldrich), после гомогенизированы в Ultra Turrax 3 раза по 5 минут (IKA, Stauffen, Германия). Осадок гомогенизированных клеток лизировали путем перемешивания в течение 2 часов при 4С. Лизаты клеток очищали центрифугированием при 14000 об/мин в течение 15 минут при 4С, после чего рекомбинантные белки очищали с помощью аффинной хроматографии с никелем (Qiagen, Hilden, Германия). Очищенные фьюжн-белки элюировали с помощью 8 М мочевины, ЮОМм МаНгРО и 10 Мм Трис (Рн 4.5), диализовали 10 Мм МаЦгРОд, для A-PreS Ph 4.8 Ph 7.8, AB-PreS Ph и для B-PreS Ph 7.4, после чего концентрировали ультрафильтрацией (Amicon Ultra 15; Merck KgaA, Darmstadt, Германия) до значений 0.75-10 мг/мл. Значение определяли с помощью набора ВСА Protein Assay Kit (Thermo Scientific, IL).
На рисунке 6, показан окрашенный красителем Кумасси синим SDS-PAGE, который содержит очищенные рекомбинантные белки B-PreS, A-PreS и AB-PreS. Белки хорошо очищены примерно на 95%, содержатся в значительном для детекции количестве, примерно 10 мг/л культуры, без каких-либо признаков распада. Очистка проводилась по протоколу, описанному в разделе методы. Наблюдаемая молекулярная масса для трех белков в SDS-PAGE соответствовала прогнозируемой, которая была рассчитана в соответствии с их аминокислотной последовательностью и наблюдаемыми массами, которые мы определяли с помощью масс-спектрометрии (Рисунок 6). Анализ методом кругового дихроизма (КД) показал, что белки не были свернуты.
ПРИМЕР 3. Получение вакцинной композиции.
Каждый из рекомбинантных очищенных белков был растворен в изотоническом буфере, содержащем 0,9% хлорид натрия и 10 мМ фосфат натрия, и к каждому раствору белка было добавлено соответствующее количество гидроксида алюминия. Была приготовлена смесь, содержащая равные части четырех полученных суспензий, и поделена на аликвоты в стерильных условиях в запаянные флаконы. Инъекционная композиция, полученная с помощью этого метода, содержала 0,16 мг/мл каждого A-PreS, B-PreS и AB-PreS.
Состав вакцин с адсорбированным гидроксидом алюминия, содержащих A-PreS, В- PreS и AB-PreS, выполняли, как описано в публикации [11].
Состав вакцинной композиции на 1 мл стерильной воды:
1. AB-PreS - 0, 16 мг.
2. А1(ОН)3 - 1,25 мг.
3. NaF^PC - 1,2 мг (конечная концентрация 10 мМ).
4. NaCl - 9 мг (конечная концентрация 0,9%).
Данный состав необходим для достижения максимальной дозы 80 мкг AB-PreS на особь в объеме 0,5 мл/особь. Остальные дозы готовились путем разбавления исходной максимальной дозы соответствующим объемом буфера (10 мМ МаНгРО + 0,9% NaCl).
ПРИМЕР 4. Иммунологическая характеристика рекомбинантных белковых вакцин in vitro.
Для оценки способности белков слитых с PreS взаимодействовать с аллерген- специфическими IgE использовали тест ИФА. Планшеты покрывали рекомбинантными аллергенами rBet vl и rMal dl или PreS-гибридными белками (А-PreS, B-PreS или АВ- PreS) в концентрации 2 мкг/мл при 4С в течение ночи. Затем промывали и блокировали в течение ночи с помощью 2% раствора BSA. После чего планшет инкубировали в течение ночи при 4С с разведёнными 1:10 сыворотками пациентов с аллергией на пыльцу березы (группа «ВРА»), пациентов, не страдающих аллергией на пыльцу березы (группа «без ВРА»), или здоровых добровольцев (группа «НС»), Связавшиеся IgE-антитела человека детектировали с помощью АР-меченных козьих антител против человеческого IgE (Invitrogen, USA) в разведении 1 :2500. После стадии промывки вносили раствор субстрат ABTS (10 мг/мл). Оптическую плотность измеряли при 405 нм.
4.1. Оценка гипоаллергенных свойств рекомбинантных белков B-PreS, A-PreS и AB-PreS.
Возможная аллергенная активность трех рекомбинантных PreS-белков была исследована в экспериментах по связыванию IgE и в экспериментах по активации базофилов. В первую серию экспериментов было включено 84 добровольца (таблица 2). IgE-связывающая способность B-PreS, A-PreS и AB-PreS сравнивалась с таковой для rBet v i c помощью теста ИФА с использованием сывороток от 70 пациентов с аллергией на пыльцу березы (рисунок 7). Мы обнаружили, что ни один из трех рекомбинантных белков не продемонстрировал какой-либо реактивности с IgE-антителами из сывороток пациентов с аллергией на пыльцу березы. В то же время сыворотки этих пациентов значительно реагировали с нативным аллергеном rBet v 1. Также для B-PreS, A-PreS и АВ- PreS не выявлено IgE-реактивности с сыворотками пациентов с аллергией на другие аллергены (не пыльцу березы) (п = 7) и здоровых добровольцев (п = 7) (рисунок 7).
4.2. Тест на активацию базофилов крови (ВАТ-тест).
Процентное содержание активных базофилов в образцах цельной крови оценивали с помощью набора для определения аллергенности (ВАТ-тест) (Beckman Coulter, Fullerton, СА, USA) в соответствии с инструкцией производителя. ВАТ-тест выполняли с использованием двух очищенных рекомбинантных аллергенов Bet v 1 и Mai d i e трех концентрациях для каждого аллергена: 1 нг / мл, 10 нг/мл, 100 нг/мл и с эквимолярными концентрациями белковых конструкций B-PreS и A-PreS (2,1 нг/мл, 21 нг/мл, 210 нг/мл) и AB-PreS (2,7 нг/мл, 26,6 нг/мл, 266 нг/мл), что соответствует молярной концентрации 0,05, 0,5 и 5 Нм. Положительным контролем были анти-^Е-антитела (0,01 мг / мл), а отрицательным контролем (растворитель PBS). Контроли готовили для каждого пациента.
Образцы крови собирали в полипропиленовые пробирки, содержащие КЗ EDTA (S- Monovette, Sarstedt, Германия), и использовали для ВАТ-теста сразу после сбора. Использовали 100 мкл цельной крови, 20 мкл тестируемого аллергена / контроля и 20 мкл трехцветных антител (CRTH2-FITC, CD203c-PE, CD3-PC7) и 100 мкл раствора для активации. Смешивали указанные компоненты в пластиковых пробирках и инкубировали в течение 15 минут при 37 0 С на водяной бане. После инкубации, реакцию останавливали добавлением 100 мкл стоп-раствора и 2 мл раствора для фиксации и лизиса. После остановки реакции образцы инкубировали при комнатной температуре, в темном месте, в течение 10 минут и центрифугировали 5 минут при 200 g. После удаления супернатанта добавляли по 3 мл PBS в каждую пробирку и центрифугировали образцы в течение 5 мин при 200 g. Эритроциты лизировали, а лейкоциты фиксировали добавлением 0,5 мл 0,1% раствора формальдегида в PBS.
Проточную цитометрию проводили на приборе BD FACS Canto II (BD Biosciences, США). Компенсация была установлена в BD FACSDiva Software (BD Biosciences). Результаты анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo ™ версии 10.6.2 (Tree Star). Результаты представлены в виде процентного содержания активированных базофилов. Активированные базофилы были идентифицированы как CRTH2 pos CD203c pos CD3 neg. Изотипические контроли (крысиный IgG2a, изотипический контроль каппа (Ebr2a), FITC, eBioscience ™, мышиный IgGl, (РЕ-Су7), MG112, Thermofisher) отрицательный (PBS) и положительный контроль (антитела анти-IgE) использовали для гейтирования активированных базофилов.
Затем, мы провели эксперименты с участием четырех пациентов с аллергией на пыльцу березы в тесте активации базофилов крови. Полученные данные показали, что активация базофилов с помощью rBet v 1 в концентрации 5 Мм была выраженной, тогда как ни один из трех рекомбинантных PreS-белков не индуцировал активацию этих клеток (Рисунок 8А). rMal d 1 также индуцировал активацию базофилов в концентрации 5 Мм у двух пациентов с аллергией на пыльцу березы (Bl, В4) (Рисунок 8А). Так же были проведены эксперименты по активации базофилов положительным контролем (антителами против IgE), при этом не было обнаружено активации базофилов при использовании только буферного раствора (отрицательный контроль) (Рисунок 8 В).
ПРИМЕР 5. Ингибирование связывания IgE-антител пациентов с рекомбинантными аллергенами rBet v 1 и rMal d i e использованием антител кроликов.
Животные
Сорок кроликов (линия Новозеландские белые кролики, самки) массой 2, 2-2, 5 кг, приобретены в компании «КролИнфо» (Россия). Перед первой иммунизацией у каждого кролика собирали образцы сыворотки объемом 0,5- 1,0 мл и анализировали с помощью метода ИФА, для определения фонового уровня IgG-антител против Bet v 1 и Mai d 1. В исследование включали кроликов с низким естественным фоновым уровнем этих антител.
Протокол вакцинации Тридцать кроликов с низким уровнем IgG-антител к Bet v 1 и Mai d 1 были включены в исследование после рандомизированы на 15 групп по 2 кролика в каждой. Каждую группу кроликов индивидуально иммунизировали 3 рекомбинантными вакцинами (A-PreS, B-PreS, AB-PreS) в трех дозах каждая и 6 другими коммерческими вакцинами на основе экстрактов аллергенов:
1. Pollinex Quattro - Bencard
2. Clustoid - Roxall
3. Alutard SQ - ALK
4. Purethal - HAL Allergy
5. Allergovit- Allergopharma
6. Экстракт аллергена из пыльцы березы - Birch Pollen Allergen Extract (Микроген), Россия.
Иммунизация коммерческими вакцинами на основе экстрактов аллергенов проводилась в соответствии рекомендациями производителей для пациентов с аллергией. Порядок инъекций и время отбора образцов крови показаны на Рисунке 5 и в Таблице 1, также в них предоставлена дополнительная информация о введенных дозах и количестве взятой крови.
Рекомбинантные вакцины получали путем адсорбции трех доз (20, 40, 80 мкг каждого из рекомбинантных белков (Apple-Pres: А-Pres; Birch-Pres: В-Pres; Birch I Apple- Pres: AB-Pres) на гидроксиде алюминия, как описано для рекомбинантной вакцины против аллергии на пыльцу трав ВМ32, созданной также на основе PreS-белка [11]. Каждому кролику делали 5 подкожных инъекций, общим объемом введения 0.5 мл, с 4-недельными интервалами времени (Таблица 1, Рисунок 5).
Выполняли отбор образцов сыворотки крови (примерно 2 мл от каждого кролика) в день первой иммунизации и с 4-недельными интервалами, как указано в таблице 1. Сыворотки хранили при -20 ° С до анализа.
Ингибирование связывания IgE пациентов с аллергией на аллерген пыльцы березы rBet v 1 и яблока rMal d 1 определяли с помощью конкурентного ингибирования ИФА. Планшеты сорбировали rBet v 1 или rMal d 1 в концентрации 1 мкг/мл и инкубировали ночь при 4 °C. После промывки и блокирования в течение ночи 2% BSA, планшеты инкубировали в течение 2 часов при 37 °C после чего в течение 1 часа при 4 °C с сывороткой кроликов, получавших курсы AIT, в разведении 1 :10. Для контроля использовали сыворотку от не иммунизированных кроликов и сравнивали ее с сывороткой, полученной от кроликов через 1 месяц после окончания курса AIT. Сыворотку кроликов предварительно инкубировали в течение 1 ч при 56 °C, чтобы инактивировать IgE, но сохранить другие изотипы антител, в частности IgG-антитела. Так же использовали дополнительный отрицательный контроль с помощью фосфатносолевого буфера (PBS), который вносили в лунки планшета вместо сыворотки кроликов. После стадии отмывки, добавляли сыворотку пациентов с аллергией на пыльцу березы в разведении 1 :5 и инкубировали ночь при 4 °C, затем детектировали связавшиеся IgE- антитела человека с помощью меченых козьих антител против человеческого IgE, конъюгированных с HRP (Invitrogen, США) в разведении 1 :2000. Ингибирование связывания IgE с аллергенами rBet v 1 или rMal d 1 после предварительной инкубации с сывороткой иммунизированных кроликов в процентном отношении рассчитывали для каждой сыворотки пациента следующим образом: процент ингибирования = 100 - (Odi/ODpBsxlOO), где Odi - оптическая плотность после предварительной инкубации с сывороткой от иммунизированных кроликов, ODPBS - оптическая плотность после предварительной инкубации с PBS.
Т-критерий Стьюдента (STATISTICA 8.0 StatSoft Inc) использовался для сравнения степени ингибирования после различных курсов иммунизации. Значение р < 0,05 считалось статистически значимым.
ПРИМЕР 6. Определение ингибирования связывания IgE с Bet v 1 при иммунизации B-Pres и AB-PreS.
Пример 6.1. Сравнительный анализ ингибирования связывания IgE с Bet v 1 при иммунизации AB-PreS, B-Pres и A-PreS.
Степень ингибирования связывания IgE-антител пациентов с аллергеном Bet v 1 сыворотками кроликов, получивших курсы AIT рекомбинантными вакцинами B-PreS, А- PreS и AB-PreS (в трех дозах 20 мкг, 40 мкг или 80 мкг) по сравнению с сывороткой не иммунизированных кроликов и кроликов показаны на рисунке 10. Среднее ингибирование IgE-связывания с Bet v 1 с помощью антител кроликов, получавших A-Pres, всегда было менее 50%, тогда как сыворотка кроликов, иммунизированных B-PreS- и AB-PreS приводила к ингибированию приблизительно на 75%, более того, все три дозы значительно лучше ингибировали IgE-связывание, чем A-PreS (Рисунок 9). Не было выявлено значимых отличий в степени ингибирования IgE-связывания сыворотками кроликов, получавших курсы AIT вакцинами B-PreS- и AB-PreS (Рисунок 9). Таким образом, иммунизация B-Pres и AB-PreS индуцирует антитела, которые, ингибируют связывание IgE с Bet v 1 значительно сильнее, чем антитела, индуцированные A-PreS.
Пример 6.2. Сравнительный анализ связывания IgE с Bet v 1 при иммунизации AB-PreS, B-Pres и коммерческих вакцин на основе экстрактов аллергенов березы.
На рисунке 10 представлены данные, демонстрирующие, что антитела, индуцированные у кроликов всеми вакцинами (кроме Purethal), значительно ингибировали связывание IgE-антител пациентов с аллергеном Bet v 1. Самая высокая степень ингибирования IgE-связывания была получена с антителами кроликов, индуцированными вакциной на основе экстрактов аллергенов Allergovit.
Стоит отметить, что рекомбинантные вакцины B-PreS и AB-PreS индуцируют более значимый протективный эффект в сравнении с коммерческой Allergovit (рисунок 10). Таким образом, иммунотерапевтические вакцины на основе B-PreS и AB-PreS превосходят все существующие коммерческие вакцины на основе экстрактов аллергенов в отношении активации антител, блокирующих связывание IgE-антител пациентов с аллергеном Bet v 1.
Для большинства коммерческих вакцин, на основе экстрактов аллергенов было проведено большее количество инъекций, чем для рекомбинантных вакцин на основе PreS-белка (Allergovit: 7 инъекций; Alutard: 15 инъекций; экстракт аллергена из пыльцы березы (Микроген): 30 инъекций; Purethal: 7 инъекций) (Рисунок 5, Таблица 1). Только для вакцин Pollinex и Clustoid, было сделано сопоставимое количество инъекций, четыре и пять, соответственно (рисунок 5, таблица 1). Однако, антитела активируемые двумя последними вакцинами, только в незначительной степени ингибировали связывание IgE- антител пациентов с аллергенов пыльцы березы Bet v 1 (рисунок 10).
Что касается режима введения тестируемых коммерческих вакцин, необходимо иметь в виду, что вакцины Pollinex, Clustoid, Purethal и экстракт аллергена из пыльцы березы компании Микроген должны рассматриваться, как способ предсезонного лечения, что означает необходимость каждый год делать одинаковое количество инъекций перед сезоном цветения березы. В итоге, для полного курса лечения вакциной Allergovit потребуется ввести 14 инъекций в течение 2 лет. Вакцину Alutard также можно вводить каждый год, в качестве предсезонного лечения, которое сводится к 30 инъекциям в течение двухлетнего периода лечения. Кроме того, существует возможность осуществлять ежемесячные инъекции, для которых также потребуется 15 инъекций, из которых 9 инъекций осуществляются в первый год с момента начала лечения и 12 инъекций в дополнительный год лечения.
Еще большим затруднением является лечение с помощью сублингвальной иммунотерапии (SLIT), требующей ежедневного введения экстракта аллергена, что является одной из причин низкого спроса такой терапии. Кроме того, SLIT индуцирует очень низкие уровни аллерген-специфических IgG-антител, и пока неясно, достаточно ли активируется IgG-антител после такой терапии, чтобы блокировать связывание IgE у пациентов с аллергией.
В отличие от приведенных выше особенностей применения вакцин на основе экстрактов аллергенов, схема лечения рекомбинантными вакцинами на основе PreS-белка, будет представлять собой предсезонный курс из 3-5 инъекций с последующими 1 или 2 предсезонными инъекциями в следующем году. Таким образом максимальный курс будет составлять 7 инъекций на два года лечения. Предположение о том, что для повышения уровня аллерген-специфических IgG-антител после базового курса иммунизации необходимы только 1 или 2 дополнительные инъекции, подтверждается результатами, полученными в клинических испытаниях вакцины против аллергии на пыльцу трав ВМ32, созданной на основе PreS-белка. В проведенном клиническом исследовании было обнаружено, что одной инъекции достаточно, для восстановления аллерген- специфических антител IgG до уровней, полученных через месяц после основного курса иммунизации [12,13]. Таким образом, лечение вакцинами на основе рекомбинантных PreS-белков будет намного удобнее, чем любая существующая в настоящее время форма AIT.
Иммунизация B-Pres и AB-PreS индуцирует протективные антитела, которые ингибируют связывание IgE с аллергеном Bet v 1 значительно сильнее, чем антитела, инду цированные коммерческими вакцинами на основе экстрактов аллергенов.
Пример 6.3. Сравнительный анализ связывания IgE с аллергеном яблока Mai d 1 при иммунизации AB-PreS и B-Pres.
Иммунизации двумя рекомбинантными вакцинами на основе PreS, B-Pres и AB-Pres, индуцировали сходный уровень протективных антител, которые ингибировали IgE- связывание с аллергеном Bet v 1 (рисунок И). Обе эти вакцины, в отношении активации антител, блокирующих связывание IgE с Bet v 1, оказались эффективнее остальных вакцин, что мы протестировали (Рисунок 9 и И). Поэтому B-PreS и AB-PreS сравнивали по их способности индуцировать протективные антитела, блокирующие IgE-связывание с одним из наиболее важных перекрестно-реактивных пищевых аллергенов - аллергеном яблока Mai d 1. На рисунке 12 показано, что после иммунизации тремя дозами (20 мкг, 40 мкг, 80 мкг) AB-PreS, ингибирование IgE-связывания с Mai d 1 было значительно выраженнее, чем ингибирование такими же дозами B-PreS. В итоге рекомбинантная вакцина AB-PreS от аллергии на пыльцу березы на основе PreS-белка, индуцирует более высокий уровень проективных антител, блокирующих IgE-связывание с Bet v 1 и Mai d 1 по сравнению с другими протестированными вакцинами.
Антитела, индуцированные иммунизацией AB-Pres, значительно лучше ингибируют IgE-связывание с аллергеном яблока Mai d 1, в сравнении с B-Pres.
Таким образом, получение рекомбинантного полипептида AB-PreS (SEQ ID NO 2), содержащего эпитопы, необходимые для активации защитных антител против Bet v 1 и Mai d 1 в одном белке, позволяет получить однокомпонентную вакцину, вместо того, чтобы использовать вакцины, содержащие два или более производных аллергенов.
У полученного рекомбинантного полипептида AB-PreS, который содержит пептиды из аллергена яблока и березы, слитые с белком PreS, полностью отсутствует IgE- реактивность, что свидетельствует о большей безопасности данного белка. Кроме того, в состав AB-PreS входят пептиды аллергена яблока и березы, имитирующие В-, но не Т- клеточные эпитопы указанных аллергенов. Элиминация Т-клеточных эпитопов из состава AB-PreS позволяет добиться более существенной безопасности конструкта, т.к. исключена возможность активации Т-клеток, продуцирующих провоспалительные факторы.
Данная конструкция полипептида AB-PreS взывает повышенный иммунный ответ против аллергенных молекул, и индуцирует блокирующие IgG-антитела к аллергену пыльцы березы Bet v 1 и к аллергену яблока Mai d 1. При этом ингибирует IgE-связывание с Mai d 1 значительно сильнее, чем ингибирование такими же дозами B-PreS полипептида. В итоге вакцина от аллергии на пыльцу березы на основе AB-PreS полипептида индуцирует более высокий уровень проективных антител, блокирующих IgE-связывание с Bet v 1 и Mai d 1 по сравнению с другими коммерческими вакцинами. Список источников
1. Dorofeeva Y. et al. Past, presence, and future of allergen immunotherapy vaccines // Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 2020.
2. Eckl-Doma J. et al. Allergen-specific antibodies regulate secondary allergenspecific immune responses // Frontiers in Immunology. Frontiers Media S.A., 2019. Vol. 9, № 3131. P. 1-15.
3. van Neerven R.J. et al. Blocking antibodies induced by specific allergy vaccination prevent the activation of CD4+ T cells by inhibiting serum-IgE-facilitated allergen presentation. // J. Immunol. 1999.
4. Niederberger V. et al. Vaccination with genetically engineered allergens prevents progression of allergic disease // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2004. Vol. 101, № 2. P. 14677- 14682.
5. Elisyutina O. et al. Bet v 1-specific IgE levels and PR-10 reactivity discriminate silent sensitization from phenotypes of birch allergy // Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 2019.
6. Gadermaier E. et al. Analysis of the antibody responses induced by subcutaneous injection immunotherapy with birch and Fagales pollen extracts adsorbed onto aluminum hydroxide // Int. Arch. Allergy Immunol. 2010. Vol. 151, № 1. P. 17-27.
7. Bucher X. et al. Effect of tree pollen specific, subcutaneous immunotherapy on the oral allergy syndrome to apple and hazelnut // Allergy Eur. J. Allergy Clin. Immunol. 2004.
8. Valenta R., Campana R., Niederberger V. Recombinant allergy vaccines based on allergen-derived В cell epitopes // Immunology Letters. Elsevier B.V., 2017. Vol. 189. P. 19-26.
9. Valenta R. et al. Vaccine development for allergen-specific immunotherapy based on recombinant allergens and synthetic allergen peptides: Lessons from the past and novel mechanisms of action for the future // J. Allergy Clin. Immunol. Mosby Inc., 2016. Vol. 137, № 2. P. 351-357.
10. Marth K. et al. A nonallergenic birch pollen allergy vaccine consisting of hepatitis PreS-fused Bet v 1 peptides focuses blocking IgG toward IgE epitopes and shifts immune responses to a tolerogenic and Thl phenotype П J. Immunol. The American Association of Immunologists, 2013. Vol. 190, № 7. P. 3068-3078.
11. Zieglmayer P. et al. Mechanisms, safety and efficacy of a В cell epitope-based vaccine for immunotherapy of grass pollen allergy // EBioMedicine. Elsevier B.V., 2016. Vol. 11. P. 43-57. 12. Niederberger V. et al. Safety and efficacy of immunotherapy with the recombinant В-cell epitope-based grass pollen vaccine BM32 // J. Allergy Clin. Immunol. Mosby Inc., 2018. Vol. 142, № 2. P. 497-509.
13. Eckl-Doma J. et al. Two years of treatment with the recombinant grass pollen allergy vaccine BM32 induces a continuously increasing allergen-specific IgG4 response // EBioMedicine. 2019. Vol. 50. P. 421-432.
Таблица 1.
График иммунизаций и дозы.
Figure imgf000023_0001
Figure imgf000024_0001
Figure imgf000025_0001
Figure imgf000026_0001
Figure imgf000027_0001
Figure imgf000028_0001
Figure imgf000029_0001
Figure imgf000030_0001
Таблица 2.
Группы добровольцев, включенные в исследование по оценке способности B-PreS, A-PreS и AB-PreS связываться с IgE-антителами.
Figure imgf000030_0002
Были собраны образцы сыворотки от пациентов с аллергией на пыльцу березы (ВРА), пациентов с аллергией, но без аллергии на пыльцу березы (non-ВРА) или сыворотки от пациентов, не страдающих аллергией - здоровые добровольцы (НС).

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Рекомбинантный полипептид для лечения и профилактики аллергии на пыльцу березы и яблоко, содержащий пептидные фрагменты аллергенов Bet vl и Mai d 1, слитые с полипептидом PreS вируса гепатита В, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2.
2. Рекомбинантный полипептид по п.1, содержащий, по меньшей мере, четыре пептидных фрагмента аллергена дикого типа пыльцы березы Bet v 1 , и, по меньшей мере, два пептидных фрагмента аллергена дикого типа яблока Mai d 1.
3. Рекомбинантный полипептид по п.2, где аллерген дикого типа выбирают из группы, состоящей из основных аллергенов пыльцы березы, в частности Bet v 1, где два пептидных фрагмента имеют аминокислотную последовательность SEQ ID NO 5 и другие два пептидных фрагмента имеют аминокислотную последовательность SEQ ID NO 6.
4. Рекомбинантный полипептид по п.2, где аллерген дикого типа выбирают из группы, состоящей из основных аллергенов яблока, в частности Mai d 1, имеющих один пептидный фрагмент с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 3 и другой пептидный фрагмент с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 4.
5. Композиция вакцины для лечения или профилактики аллергии на пыльцу березы и яблоко, содержащая эффективное количество рекомбинантного полипептида по п.1 и фармацевтически приемлемый наполнитель.
6. Композиция по п.5, отличающаяся тем, что дополнительно содержит, по меньшей мере, один адъювант и / или консервант.
29
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
PCT/RU2021/000437 2020-10-26 2021-10-14 Рекомбинантный полипептид на основе аллергена пыльцы березы и аллергена яблока Ceased WO2022093065A1 (ru)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP21887017.8A EP4233900A4 (en) 2020-10-26 2021-10-14 RECOMBINANT POLYPEPTIDE BASED ON BIRCH POLLEN ALLERGENS AND APPLE ALLERGEN
CN202180072320.6A CN116490207A (zh) 2020-10-26 2021-10-14 基于桦树花粉变应原和苹果变应原的重组多肽

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2020135032 2020-10-26
RU2020135032A RU2761431C9 (ru) 2020-10-26 2020-10-26 Рекомбинантный полипептид на основе аллергена пыльцы березы и аллергена яблока в качестве вакцины от аллергии

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2022093065A1 true WO2022093065A1 (ru) 2022-05-05
WO2022093065A8 WO2022093065A8 (ru) 2023-06-01

Family

ID=79174527

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2021/000437 Ceased WO2022093065A1 (ru) 2020-10-26 2021-10-14 Рекомбинантный полипептид на основе аллергена пыльцы березы и аллергена яблока

Country Status (4)

Country Link
EP (1) EP4233900A4 (ru)
CN (1) CN116490207A (ru)
RU (1) RU2761431C9 (ru)
WO (1) WO2022093065A1 (ru)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002040676A2 (en) 2000-11-16 2002-05-23 Alk-Abelló A/S Mutant allergens
RU2193413C2 (ru) * 1996-03-01 2002-11-27 Новартис Аг Пептидные иммуногены для вакцинации и лечения аллергии
WO2003072601A1 (de) 2002-02-27 2003-09-04 Merck Patent Gmbh VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON HYPOALLERGENEM BIRKENPOLLENHAUPTALLERGEN rBet v 1
WO2007140505A2 (en) 2006-06-09 2007-12-13 Biomay Ag Vaccine carrier
WO2012168487A1 (en) 2011-06-09 2012-12-13 Biomay Ag Peptide carrier fusion proteins as allergy vaccines
WO2013017591A1 (en) 2011-08-03 2013-02-07 Lofarma S.P.A. Hypoallergenic variants of mal d 1, the major allergen from malus domestica

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2193413C2 (ru) * 1996-03-01 2002-11-27 Новартис Аг Пептидные иммуногены для вакцинации и лечения аллергии
WO2002040676A2 (en) 2000-11-16 2002-05-23 Alk-Abelló A/S Mutant allergens
WO2003072601A1 (de) 2002-02-27 2003-09-04 Merck Patent Gmbh VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON HYPOALLERGENEM BIRKENPOLLENHAUPTALLERGEN rBet v 1
WO2007140505A2 (en) 2006-06-09 2007-12-13 Biomay Ag Vaccine carrier
WO2012168487A1 (en) 2011-06-09 2012-12-13 Biomay Ag Peptide carrier fusion proteins as allergy vaccines
RU2013157115A (ru) * 2011-06-09 2015-07-20 Биомей Аг Гибридные белки-носители пептидов в качестве вакцин от аллергии
WO2013017591A1 (en) 2011-08-03 2013-02-07 Lofarma S.P.A. Hypoallergenic variants of mal d 1, the major allergen from malus domestica
RU2624030C2 (ru) * 2011-08-03 2017-06-30 Лофарма С.П.А. ГИПОАЛЛЕРГИЧЕСКИЕ ВАРИАНТЫ Mal d 1, ГЛАВНОГО АЛЛЕРГЕНА Malus domectica

Non-Patent Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BUCHER X. ET AL.: "Effect of tree pollen specific, subcutaneous immunotherapy on the oral allergy syndrome to apple and hazelnut", ALLERGY EUR. J. ALLERGY CLIN. IMMUNOL., 2004
DOROFEEVA Y. ET AL.: "Past, presence, and future of allergen immunotherapy vaccines", ALLERGY: EUROPEAN JOURNAL OF ALLERGYAND CLINICAL IMMUNOLOGY, 2020
ECKL-DORNA J. ET AL.: "Allergen-specific antibodies regulate secondary allergen-specific immune responses", FRONTIERS IN IMMUNOLOGY. FRONTIERS MEDIA S.A., vol. 9, no. 3131, 2019, pages 1 - 15
ECKL-DORNA J. ET AL.: "Two years of treatment with the recombinant grass pollen allergy vaccine BM32 induces a continuously increasing allergen-specific IgG4 response I", BIOMEDICINE, vol. 50, 2019, pages 421 - 432
ELISYUTINA O. ET AL.: "Bet v 1-specific IgE levels and PR-10 reactivity discriminate silent sensitization from phenotypes of birch allergy", ALLERGY: EUROPEAN JOURNAL OF ALLERGY AND CLINICAL IMMUNOLOGY, 2019
GADERMAIER E. ET AL.: "Analysis of the antibody responses induced by subcutaneous injection immunotherapy with birch and Fagales pollen extracts adsorbed onto aluminum hydroxide", INT. ARCH. ALLERGY IMMUNOL, vol. 151, no. 1, 2010, pages 17 - 27, XP008173467, DOI: 10.1159/000232567
MARTH K. ET AL.: "A nonallergenic birch pollen allergy vaccine consisting of hepatitis PreS-fused Bet v 1 peptides focuses blocking IgG toward IgE epitopes and shifts immune responses to a tolerogenic and ThI phenotype", J. IMMUNOL. THE AMERICAN ASSOCIATION OF IMMUNOLOGISTS, vol. 190, no. 7, 2013, pages 3068 - 3078
NIEDERBERGER V. ET AL.: "Safety and efficacy of immunotherapy with the recombinant B-cell epitope-based grass pollen vaccine BM32", I.J. ALLERGY CLIN. IMMUNOL. MOSBY INC., vol. 142, no. 2, 2018, pages 497 - 509, XP085435564, DOI: 10.1016/j.jaci.2017.09.052
NIEDERBERGER V. ET AL.: "Vaccination with genetically engineered allergens prevents progression of allergic disease", PROC. NATL. ACAD. SCI. U. S. A., vol. 101, no. 2, 2004, pages 14677 - 14682, XP002379301, DOI: 10.1073/pnas.0404735101
See also references of EP4233900A4
VALENTA R. ET AL.: "J. Allergy Clin. Immunol", vol. 137, 2016, MOSBY INC., article "Vaccine development for allergen-specific immunotherapy based on recombinant allergens and synthetic allergen peptides: Lessons from the past and novel mechanisms of action for the future", pages: 351 - 357
VALENTA R.CAMPANA R.NIEDERBERGER V.: "Immunology Letters", vol. 189, 2017, ELSEVIER B.V., article "Recombinant allergy vaccines based on allergen-derived B cell epitopes", pages: 19 - 26
VAN NEERVEN R.J. ET AL.: "Blocking antibodies induced by specific allergy vaccination prevent the activation of CD4+ T cells by inhibiting serum-IgE-facilitated allergen presentation", J. IMMUNOL., 1999
ZIEGLMAYER P. ET AL.: "BioMedicine", vol. 1, 2016, ELSEVIER B.V., article "Mechanisms, safety, and efficacy of a B cell epitope-based vaccine for immunotherapy of grass pollen allergy", pages: 43 - 57

Also Published As

Publication number Publication date
EP4233900A1 (en) 2023-08-30
RU2761431C1 (ru) 2021-12-08
CN116490207A (zh) 2023-07-25
RU2761431C9 (ru) 2022-04-18
WO2022093065A8 (ru) 2023-06-01
EP4233900A4 (en) 2024-11-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Worm et al. Development and preliminary clinical evaluation of a peptide immunotherapy vaccine for cat allergy
Niespodziana et al. A hypoallergenic cat vaccine based on Fel d 1–derived peptides fused to hepatitis B PreS
JP5807994B2 (ja) アレルギー治療のための核酸
JP5399895B2 (ja) ワクチン担体
KR100263359B1 (ko) IgE 관련 알레르기 반응의 치료용 IgE의 입실론 사슬의 정상부로 구성된 백신
JP2014518635A (ja) アレルギーワクチンとしてのペプチド担体融合タンパク質
JP5926198B2 (ja) カバノキアレルギーに対するワクチン用ペプチド
KR20180099912A (ko) 나이세리아 메닌지티디스 조성물 및 그의 방법
US9856296B2 (en) Hypoallergen
EA020792B1 (ru) Пептиды трав для вакцины
Khaitov et al. Recombinant PreS‐fusion protein vaccine for birch pollen and apple allergy
EP1792627A1 (en) Modulation of the immune response by administration of intralymphatic transduction allergen (ITAG-)-molecules
Oscherwitz et al. Synthetic peptide vaccine targeting a cryptic neutralizing epitope in domain 2 of Bacillus anthracis protective antigen
JP2014037438A (ja) カバノキ花粉アレルギーの処置のための連続重複ペプチド
EA029009B1 (ru) Применение полипептида профилина растений в неспецифической иммунотерапии аллергии
RU2761431C9 (ru) Рекомбинантный полипептид на основе аллергена пыльцы березы и аллергена яблока в качестве вакцины от аллергии
US20090098167A1 (en) PHL P 1 Allergen Derivative
EA045191B1 (ru) Рекомбинантный полипептид на основе аллергена пыльцы березы и аллергена яблока
US20030007973A1 (en) Methods and compositions for manipulation of the immune response using anti-metallothionein antibody
JP6353510B2 (ja) アレルギー治療のための核酸
BR112020001586A2 (pt) vacina contra malária
WO2007065633A1 (en) Modulation of the immune response by administration of intralymphatic transduction allergen (itag) -molecules
EP4070814A1 (en) Sars-cov-2 polypeptides and uses thereof
WO2015054217A2 (en) Methods and uses for reducing an allergic response in a subject
JP6088584B2 (ja) アレルギー治療のための核酸

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 21887017

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 202180072320.6

Country of ref document: CN

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 202317035707

Country of ref document: IN

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2021887017

Country of ref document: EP

Effective date: 20230526