WO2022098162A1 - 3-하이드록시프로피온산의 생산 방법 - Google Patents

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이경묵
김재형
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LG Chem Ltd
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Definitions

  • the present application relates to a method for producing 3-hydroxypropionic acid (3-HP) and/or a method for improving the productivity of 3-HP, and more particularly, to a method for producing 3-HP It relates to a method for producing 3-HP and/or improving the productivity of 3-HP by regulating energy and/or coenzyme balance in a culture to produce 3-HP using a cell as a catalyst.
  • 3-hydroxypropionic acid is a platform compound that can be converted into various chemicals such as acrylic acid, methyl acrylate, and acrylamide. Since it was selected as Top 12 value-added bio-chemical by the US Department of Energy (DOE) in 2004, it has been actively studied in academia and industry.
  • DOE US Department of Energy
  • Glucose and glycerol are mainly used as substrates for 3-HP biosynthesis using microorganisms, but despite the potential of 3-HP due to low yield and productivity, commercialization has not yet been reached.
  • the present inventors developed a fermentation technology capable of increasing the 3-HP production concentration while maintaining high yield and productivity for commercialization of 3-HP.
  • An example of the present application is to inoculate cells having 3-hydroxypropionic acid (3-HP) producing ability in a medium containing glycerol as a carbon source, and under the conditions of activating the electron transport system, 3- It provides a method for producing 3-hydroxypropionic acid (3-HP) and/or a method for improving productivity of 3-HP, comprising the step of producing HP.
  • cells having 3-hydroxypropionic acid (3-HP) producing ability are inoculated into a medium containing glycerol as a carbon source, and 3-HP is administered under conditions of activating the electron transport system. It provides a method for producing 3-hydroxypropionic acid (3-HP) and/or a method for improving productivity of 3-HP, comprising the step of producing.
  • the method comprises:
  • 3-hydroxypropionic acid (3-hydroxypropionic acid, 3-HP) comprising the steps of inoculating the production medium with cells;
  • the production medium may include glycerol as a carbon source, and the production medium at the time of inoculation of the cells may not include glucose as a carbon source.
  • the culture is (i) a condition of maintaining the amount of dissolved oxygen (DO) in the production medium or culture at a level of 50% or less, (ii) glucose when the amount of dissolved oxygen (DO) in the production medium or culture is 0.1% or more It may be carried out under the conditions of addition, or (iii) both.
  • step (2) of producing 3-HP cell proliferation may not occur.
  • the method further includes a 'growth/proliferation step' of separating the cells from the medium after culturing at a high concentration before the 'production step' of producing 3-HP by inoculating and culturing the cells described above in a production medium. It may be a two-step process comprising
  • the cells isolated from the growth medium may be inoculated into the production medium of step (1).
  • the growth medium may not include glycerol as a carbon source.
  • the production method of 3-HP and/or the productivity improvement method of 3-HP provided herein is a medium containing glycerol (Glycerol) as a carbon source (3-hydroxypropionic acid production medium) in 3-hydroxypropionic acid (3- Inoculate cells having hydroxypropionic acid, 3-HP) producing ability, and 3-HP under conditions that activate the electron transport system (eg, conditions that maintain dissolved oxygen at a constant level and/or conditions that add glucose) comprising the steps of producing
  • the 3-hydroxypropionic acid production medium may be used without limitation within the range of purposes for allowing the cells to produce 3-HP without proliferation (cell division, growth, or growth) of 3-HP-producing cells.
  • the carbon source of the production medium may be glycerol, but is not limited thereto.
  • the production medium may further include vitamin B12.
  • the production medium may not contain glucose (glucose) at the time of cell inoculation.
  • the medium may be a synthetic medium or a semisynthetic medium, but is not limited thereto.
  • the cells for inoculation may be prepared by performing a step of isolating the cells having the 3-hydroxypropionic acid (3-HP) producing ability after culturing at a high concentration, but is not limited thereto.
  • the inoculation concentration (cell concentration at the time of inoculation) of the high-concentration cultured cells may be appropriately adjusted or determined by those skilled in the art within the 3-HP production objective range.
  • the inoculation concentration (based on dry cell weight (DCW)/medium volume (L)) is 1 to 20 g/L, 1 to 16 g/L, 1 to 12 g/L, 1 to 9 g/L, 2-20 g/L, 2-16 g/L, 2-12 g/L, 2-9 g/L, 4-20 g/L, 4-16 g/L, 4-12 g/L L, or 4 to 9 g/L, but is not limited thereto.
  • a culture method known in the art can be selected without limitation within the range of purposes for producing 3-HP, and in one example, the culturing step is fermentation culture (fermentation) may be performed with
  • the number of cells at the end of the production phase is 150% or less, 130% or less, 100% or less, 90% or less, or 80% or less, such as 50 to 150%, 50 to 130% of the number of inoculated cells. , 50 to 100%, 50 to 90%, 50 to 80%, 70 to 150%, 70 to 130%, 70 to 100%, 70 to 90%, or 70 to 80%, but is not limited thereto.
  • Conditions for activating the electron transport system are, for example, activating the reproduction of NAD + coenzyme and / or activating ATP production may be, but is not limited thereto.
  • the conditions for activating the electron transport system are:
  • the conditions for activating the electron transport system may be performed by adding glucose to a medium (eg, a medium for 3-HP production and/or a culture medium).
  • the glucose addition may be performed when the amount of dissolved oxygen (DO) in the medium is above a certain level, or may be performed regardless of the amount of dissolved oxygen in the medium (eg, before the amount of dissolved oxygen in the medium after culturing becomes above a certain level).
  • DO dissolved oxygen
  • the glucose may be added for the purpose of supplying energy, not for the purpose of cell growth.
  • the amount of dissolved oxygen which is the basis for the addition of glucose, may be appropriately selected as needed within the target range for 3-HP production, and in one example, the time point for adding glucose may be a time point at which the amount of dissolved oxygen in the medium starts to rise from that at the start of the culture. and the amount of dissolved oxygen in the medium as a criterion for glucose addition is, for example, 0.1% or more, 0.5% or more, 1% or more, 3% or more, 5% or more, 10% or more, 15% or more, 20% or more, 25% or more or more, or 30% or more, but is not limited thereto (the upper limit may be, but is not limited to, 100%, 75%, or 50%).
  • the amount of added glucose is 0.01 to 3 g/L, 0.05 to 3 g/L, 0.1 to 3 g/L, 0.3 to 3 g/L L, 0.01-2 g/L, 0.05-2 g/L, 0.1-2 g/L, 0.3-2 g/L, 0.01-1 g/L, 0.05-1 g/L, 0.1-1 g/L, 0.3 to 1 g/L, 0.01 to 0.7 g/L, 0.05 to 0.7 g/L, 0.1 to 0.7 g/L, 0.3 to 0.7 g/L, 0.01 to 0.3 g/L, 0.05 to 0.3 g/L, or It may be 0.1 to 0.3 g/L, but is not limited thereto.
  • 3-HP production is 30% or more, 40% or more, compared to the control without adding glucose. , or 50% or more, such as 30 to 1000%, 30 to 500%, 30 to 300%, 30 to 100%, 40 to 1000%, 40 to 500%, 40 to 300%, 40 to 100%, 50 to It may be increased by 1000%, 50 to 500%, 50 to 300%, or 50 to 100%, but is not limited thereto.
  • condition for activating the electron transport system may be performed by maintaining (adjusting) the dissolved oxygen amount (DO) at a certain level.
  • the “constant level” of the DO may be determined without limitation within the 3-HP production purpose range, for example, 50% or less, 30% or less, 20% or less, 10% or less, 1 to 50%, 1 to 30% , 1-20%, 1-10%, 3-50%, 3-30%, 3-20%, 3-10%, 5-50%, 5-30%, 5-20%, or 5-10% % level, but is not limited thereto.
  • the maintenance of the dissolved oxygen amount may be performed by one or more selected from the group consisting of agitation speed control, air supply amount control, and pressure control during culture, but is not limited thereto.
  • agitation speed control air supply amount control
  • pressure control during culture, but is not limited thereto.
  • the amount of dissolved oxygen in the medium or culture is lower than the above range, (1) one or more of agitation speed, air supply amount, and pressure is increased, and (2) when it becomes higher than the above range, agitation speed, air supply amount, pressure
  • the amount of dissolved oxygen in the medium or culture may be maintained in a predetermined range, but is not limited thereto.
  • 3-HP production is 30% or more, 50% or more, compared to the control that does not include the dissolved oxygen amount maintenance condition or more, 70% or more, 30 to 1000%, 30 to 500%, 30 to 300%, 30 to 100%, 50 to 1000%, 50 to 500%, 50 to 300%, 50 to 100%, 70 to 1000% , 70 to 500%, 70 to 300%, or 70 to 100% may be increased, but is not limited thereto.
  • the cells having 3-hydroxypropionic acid-producing ability inoculated into the production medium of step (1) are cultured at a high concentration in a growth medium Then, it may be a cell isolated from the growth medium.
  • the method may further include, before the 3-HP production step, isolating the 3-hydroxypropionic acid-producing cells for inoculation into the production medium after culturing at a high concentration.
  • the cells isolated from the growth medium may be used as cells having 3-hydroxypropionic acid-producing ability inoculated into the production medium of step (1).
  • the growth medium may be one that does not contain glycerol as a carbon source.
  • the 3-hydroxypropionic acid-producing cells (can be used interchangeably with 'cells having 3-hydroxypropionic acid-producing ability') are capable of producing 3-HP from a carbon source (eg, glycerol) in the production medium.
  • a carbon source eg, glycerol
  • Microorganisms such as Escherichia genus ( E.
  • Pseudomonas genus Enterobacteria genus, Brevibacterium genus, Corynebacterium genus, Klebsiella ) genus, Citrobacter genus, Clostridium genus, Streptomyces genus, Bacillus genus, Lactobacillus genus, Pseudomonas genus, Saccharomyces (Saccharomyces) and Aspergillus (Aspergillus) may be selected from microorganisms consisting of the genus, but is not limited thereto.
  • the 3-hydroxypropionic acid producing strain may be E. coli.
  • the 3-hydroxypropionic acid-producing cell is one or more (eg, one or both) selected from the group consisting of glycerol dehydratase and aldehyde dehydrogenase encoding a protein It may contain a gene.
  • the 3-HP-producing cells may further include a gene (gdrAB) encoding a glycerol dehydratase reactivating enzyme (GdrAB).
  • the 3-HP-producing cell may be a cell capable of further biosynthesizing vitamin B12.
  • the glycerol dehydratase may be encoded by a dhaB (GenBank accession no. U30903.1) gene, but is not limited thereto.
  • the dhaB gene may be an enzyme derived from Klebsiella pneumonia, but is not limited thereto.
  • the gene encoding the glycerol dehydratase may include a gene encoding dhaB1, dhaB2 and/or dhaB3.
  • the glycerol dehydratase protein and the gene encoding it have a gene and/or amino acid sequence within the range of maintaining the enzyme activity for decomposing glycerol into 3-hydroxypropanal (3-HPA) and water (HO). may contain mutations.
  • aldehyde dehydrogenase is, for example, Escherichia coli or aldH (GenBank Accession no. U00096.3; EaldH) derived from the E. coli K12 MG1655 cell line. gene, a puuC gene derived from K. pneumoniae, and/or a KGSADH gene derived from Azospirillum brasilense, but is not limited thereto.
  • the aldehyde dehydrogenase protein and the gene encoding the same may include mutations in the gene and/or amino acid sequence within a range that maintains the activity for producing 3-HP from 3-HPA.
  • the 3-HP-producing cell is a gene encoding one or more, two or more, or all three types of proteins selected from the group consisting of glycerol dehydratase, aldehyde dehydrogenase, and glycerol dehydrogenase reactivase, or a recombinant containing the gene It can contain vectors.
  • the recombinant vector is one or more selected from the group consisting of glycerol dehydratase, aldehyde dehydrogenase, and glycerol dehydrogenase reactivating enzyme, in the target range for expressing in cells a gene encoding two or more or all three types of proteins. Promoters and regulatory regions may be substituted by methods known in the art.
  • the high-concentration culture may be performed using any method known in the art without limitation within the range of purposes for securing a large amount of 3-HP-producing cells, and in one example, the culture is performed as a fed-batch culture it may be
  • the fed-batch culture may be performed in a pH-stat method, a continuous feeding culture method, or a combination thereof.
  • glucose when fed-batch culture of the pH-stat method is performed, glucose may be added at a concentration of 1 to 5 g/L.
  • glucose when fed-batch culture of a constant rate culture method is performed, glucose may be injected at a rate of 10 to 20 g/L/h.
  • the pH during the high concentration culture may be maintained at 5 to 7.5, 5 to 7, 5.5 to 7.5, 5.5 to 7, 6 to 7.5, or 6.5 to 6, but is not limited thereto.
  • the carbon source included in the growth medium during high concentration culture may be used by selecting monosaccharides, disaccharides and/or polysaccharides without limitation within the target range for high concentration culture.
  • the carbon source is glucose (glucose), fructose (fructose), galactose (galactose), mannose (mannose), arabinose (arabinose), xylose (xylose), ribose (riboase), sucrose (sucrose), maltose (maltose), lactose (lactose), and cellobiose (cellobiose) may be one or more, two or more, three or more, four or more, five or more, ten or more, or a combination of all 11 types selected from the group consisting of.
  • the growth medium may not include glycerol as a carbon source.
  • the cell concentration after the high concentration culture is OD600 (absorbance (O.D.) measured at 600 nm) 10 or more, 50 or more, 100 or more, 150 or more, 200 or more, 10-500, 10-400, 10-300, 10- 250, 50 to 500, 50 to 400, 50 to 300, 50 to 250, 100 to 500, 100 to 400, 100 to 300, 100 to 250, 150 to 500, 150 to 400, 150 to 300, 150 to 250, 200 to 500, 200 to 400, 200 to 300, or 200 to 250, but is not limited thereto.
  • O.D. absorbance
  • Separation of the high-concentration cultured cells is at least one selected from the group consisting of centrifuging the cells, removing the supernatant, and resuspending the pellet with a buffer, two or more or all of the above steps may include
  • the buffer may be phosphate buffered saline (PBS), but is not limited thereto.
  • the 3-HP yield of the production method of 3-HP and/or the productivity improvement method of 3-HP provided herein is, for example, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 93% or more, or 95%. or more, but is not limited thereto.
  • the 3-HP yield may be calculated as the 3-HP production amount in the medium (culture) compared to the amount of glycerol used (number of moles) in the medium (production medium) in the step of producing the 3-HP, and in one example, the following Equation 1 can be calculated as
  • Yield (yield, %) [(final 3-HP (g))/ ⁇ (Glycerol (g) before culture) - (Glycerol (g) remaining after culture ⁇ ] * 100
  • 3-HP production capacity of the 3-HP production method and/or the productivity improvement method of 3-HP provided by the present invention is 2.0 g/L/h or more, 2.5 g/L/h or more, 2.0 to 60 g/L/ h, 2.0 to 40 g/L/h, 2.0 to 20 g/L/h, 2.0 to 10 g/L/h, 2.5 to 60 g/L/h, 2.5 to 40 g/L/h, 2.5 to 20 g/L/h, or 2.5 to 10 g/L/h, but is not limited thereto.
  • glycerol After glycerol is converted to 3-HPA, it can be reduced to 1,3-propanediol (1,3-PDO) or oxidized to 3-HP.
  • the method for manufacturing 3-HP and/or the method for improving productivity of 3-HP provided herein may not produce 1,3-PDO. Therefore, it is possible to improve the yield of 3-HP by not producing 1,3-PDO.
  • the 3-HP production method and/or the 3-HP productivity improvement method provided herein may significantly reduce residual glycerol content such as acetate, lactate, and the like, which are by-products generated during 3-HP production.
  • Another example provides a culture of 3-hydroxypropionic acid-producing strain with a high content of 3-hydroxypropionic acid and a low content of by-products.
  • the culture contains 3-hydroxypropionic acid, based on the total culture, 60 g / L or more, 62 g / L or more, 65 g / L or more, 67 g / L or more, 70 g / L or more, 72 g / L or more, 75 g / L 77 g/L or more, 78 g/L or more, 79 g/L or more, 80 g/L or more, 81 g/L or more, 82 g/L or more, 83 g/L or more, 84 g/L or more, 85 g/L or more, 86 g/L or more , 87 g / L or more, 88 g / L or more, 89 g / L or more, or 90 g / L or more (the upper limit may be selected from 85 to 1000 g / L without particular limitation, for example, 1000 g / L, 500 g / L , 200 g/L, 100 g
  • the culture may have one or more characteristics selected from the following, based on the entire culture:
  • an acetate concentration of 0.25% (w/v) or less, 0.2% (w/v) or less, 0.15 (w/v) or less, or 0.1% (w/v) or less;
  • Lactate concentration of 0.15% (w/v) or less, 0.1% (w/v) or less, 0.05% (w/v) or less, 0.03% (w/v) or less, 0.01% (w/v) or less, or it does not exist;
  • PDO (1,3-propanediol) concentration of 0.25% (w/v) or less, 0.2% (w/v) or less, 0.15 (w/v) or less, 0.1% (w/v) or less, 0.07% (w/v) v) or less, or 0.05% (w/v) or less;
  • Glycerol concentration of 0.45% (w/v) or less, 0.4% (w/v) or less, 0.35% (w/v) or less, 0.3% (w/v) or less, 0.25% (w/v) or less, 0.2% (w/v) or less, 0.15 (w/v) or less, or 0.1% (w/v) or less.
  • the lower limit of each range is inclusive of 0 (if not present), 0.000001%(w/v), 0.00001%(w/v), 0.0001%(w/v), 0.001%(w/v) , or may be 0.005% (w/v), but is not limited thereto.
  • the culture is the above-described 3-HP production method and / or 3-HP productivity improvement method, that is,
  • 3-hydroxypropionic acid (3-hydroxypropionic acid, 3-HP) comprising the steps of inoculating the production medium with cells;
  • the cells having 3-hydroxypropionic acid-producing ability inoculated into the production medium in step (1) may be separated from the growth medium after high-concentration culture in the growth medium.
  • the culture in one embodiment, the culture,
  • the culture may be used for production of 3-hydroxypropionic acid.
  • Another example provides a composition for producing 3-hydroxypropionic acid comprising the culture.
  • Another example provides a method for producing 3-hydroxypropionic acid comprising the steps of isolating, recovering, and/or purifying 3-hydroxypropionic acid from the composition for producing 3-hydroxypropionic acid.
  • the 3-HP production method and/or the productivity improvement method provided by the present invention can significantly improve 3-HP productivity and yield, and thus can be usefully used for commercialization of 3-HP.
  • FIG. 1 is a schematic schematic view of a biosynthetic pathway for biosynthesis of 3-HP from glycerol.
  • glycerol dehydratase (dhaB), the gene encoding aldehyde dehydrogenase (aldH), and the gene encoding glycerol dehydratase reactivase (gdrAB) were cloned into plasmid pCDF, A recombinant vector for 3HP production (pCDF_J23101_dhaB_gdrAB_J23100_aldH) was constructed.
  • the pCDFDuetJ23 vector used to construct the recombinant vector is a vector in which the promoter portion of the pCDFDuet-1 vector (Novagen, USA) is substituted with promoters J23101 and J23100.
  • the dhaB (U30903.1; about 2.7 kb; including dhaB1, dhaB2 and dhaB3) and gdrAB genes (about 2.2 kb; gdrA, gdrB) inserted into the vector are Krebsiella pneumoniae (ATCC 25955) chromosomes from the table below. 1 was used for amplification.
  • dhaB123 and gdrA genes were located side by side on the chromosome of Krebsiella pneumoniae, they were amplified together, and only gdrB was amplified separately because gdrB was located in the opposite direction to dhaB123 and gdrA.
  • the aldH gene was amplified and isolated from the genome of the E. coli K12 MG1655 strain using a promoter pair consisting of the nucleic acid sequences of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 of Table 1 below.
  • the nucleic acid sequences of the primers used for each gene amplification are shown in Table 1 below.
  • '-F' means a forward promoter
  • '-R' means a reverse promoter.
  • the dhaB123 and gdrA genes were cloned downstream of the J23101 promoter of the pCDFDuetaJ23 vector using restriction enzymes EcoRI and HindIII, and the gdrB gene using restriction enzymes HindIII and AflII. aldH was cloned under the J23108 promoter using restriction enzymes KpnI and NdeI.
  • the cloning method of each gene was performed by a method known in the art.
  • the plasmid was introduced into E. coli W3110 (KCCM 40219) by electroporation to prepare a 3HP-producing strain.
  • the prepared 3-HP production strain was subjected to high-concentration cell culture in a 5L fermenter (working volume 2L) by a fed-batch culture method.
  • MR medium KH 2 PO 4 6.67 g per 1 L, (NH 4 ) 2 HPO 4 4 g, MgSO 4 7H 2 O 0.8 g, citric acid 0.8 g, and trace metal solution 5 mL; here, Trace metal solution Silver per 1L of 5M HCl 5mL , FeSO4 ⁇ 7H2O10g , CaCl22g , ZnSO4 ⁇ 7H2O2.2g , MnSO4 ⁇ 4H2O0.5g , CuSO4 ⁇ 5H2O1g , ( NH4 ) 6 Cell culture by adding 20 g/L of glucose and 25 mg/L of antibiotic (streptomycin) for selection to Mo 7 O 2 ⁇ 4H 2 O 0.1g, and Na 2 B 4 O 2 ⁇ 10H 2 O 0.02g) It was used as a medium and maintained at a temperature of 35 degrees Celsius. The pH was maintained at 6.95 using ammonia water, the dissolved oxygen amount (DO) was maintained at 20% while increasing the
  • pH-stat feeding was used, and glucose was added at 3 g/L.
  • OD600 was about 120 (dry cell weight 30 g/L).
  • the cell culture medium was centrifuged at 6,000 rpm at 4° C. for 10 minutes to recover cells.
  • the recovered cells were suspended in PBS (phosphate-buffered saline) and used in the next step.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • the medium for 3-HP production was prepared by adding 70 g/L of glycerol and 50 uM of vitamin B12 to M9 medium that does not contain glucose.
  • the cell suspension prepared in Preparation Example 1-1 was inoculated into the medium for 3-HP production so that the cell inoculum amount was 5 g/L (based on dry cell weight), and the 3-HP production step was performed in a 5L fermenter (working volume 2L). .
  • Culture conditions for 3-HP production were maintained at a temperature of 35 °C, agitation speed of 300rpm, aeration of 1 vvm, and pH was maintained at 7.0 using Ca(OH) 2 .
  • ATP is consumed to transport 3-HP synthesized in the cell out of the cell.
  • Such ATP synthesis is mainly performed in the electron transport chain, and ATP synthesis is also possible through phosphorylation at the substrate level of glucose. Accordingly, the productivity improvement effect of 3-HP was confirmed when ATP was continuously supplied by adding a small amount of glucose.
  • the strain for 3-HP production (the strain prepared in Preparation Example 1) isolated after the first-step high-concentration culture by the method of Preparation Example 1-1 was inoculated under the same conditions as the second-step culture of Preparation Example 1-2. and cultured. However, the culture conditions were set to measure the dissolved oxygen amount (DO) during the second-stage culture (in the medium) and add a glucose solution with a concentration of 700 g/L to 0.3 g/L when the DO exceeds 20%.
  • DO dissolved oxygen amount
  • the biosynthesis of 3-HP using glycerol is accomplished by converting glycerol to 3-HPA by glycerol dehydratase, and then converting 3-HPA to 3-HP by aldehyde dehydrogenase (FIG. 1) .
  • NAD+ a coenzyme with oxidative power
  • This reproduction process of NAD+ mainly takes place in the electron transport chain. Therefore, the productivity improvement effect of 3-HP was confirmed when the electron transport system was activated by sufficiently supplying oxygen.
  • the strain for 3-HP production (the strain prepared in Preparation Example 1) isolated after the first-step culture by the method of Preparation Example 1-1 was inoculated under the same conditions as the second-step culture of Preparation Example 1-2. Incubation was performed. However, the culture conditions were set by adjusting the stirring speed (rpm) so that the dissolved oxygen amount (DO) was maintained at 5% from 2 hours after inoculation in the second-stage culture. In this example, the initial stirring speed was started at 300 rpm, and the DO was adjusted by gradually increasing the stirring speed so that the DO was 5% after 2 hours. That is, when DO was 5% or less, the stirring speed was increased by 1-2 RPM, and when it was more than 5%, the stirring speed was lowered by 1-2 RPM while maintaining DO 5%.
  • the stirring speed rpm
  • DO dissolved oxygen amount
  • Example 2 3-HP production was compared with the case in which glucose was added when the DO reached 20% or more during the second-step culture and the second-step culture, and the first-step culture and the case where glucose was added (Comparative Example 2).
  • Comparative Example 2 was prepared as follows: First, glucose and glycerol, a substrate, were simultaneously added to the medium for cell growth and 3HP production. The recombinant strain prepared in Example 1 was used, and the same procedure as in Preparation Example 1-1 was performed except that glucose and glycerol were added at the same time (glucose was added in a Fed-batch method, glycerol was added at one time during culture) . Glucose was additionally added by 1 g/L each time the pH reached 7.0 or higher when all of the initially added glucose was consumed, and glycerol was added twice at a time of 70 g/L each at 20 and 48 hours of incubation.
  • results of Table 2 are the results measured at 38 hours in Example 2 in the second stage (production stage), and in Comparative Example 2 at 48 hours in the first stage incubation)
  • Example 2 two-step culture + glucose addition
  • Example 3 three-step culture + DO control
  • Example 3 Acetate 3 g/L 1 g/L or less 1 g/L or less Lactate 2 g/L doesn't exist doesn't exist PDO 3 g/L 0.5 g/L or less 0.5 g/L or less Residual Glycerol 5 g/L or more 1 g/L or less 1 g/L or less
  • results in Table 3 are the results measured at 38 hours in Example 2 and Example 3 in the second stage (production stage) culture, and in the first stage production at 48 hours in the first stage culture)

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Abstract

본 발명은 세포를 고농도로 배양하는 제1단계 및 상기 고농도 배양된 세포를 촉매로 이용하여 3-HP를 생산하는 제2단계를 포함하는 3-HP의 2단계 제조 방법에 있어서 2단계 배양시 에너지 및/또는 조효소 균형을 조절하여 3-HP를 제조 및/또는 3-HP의 생산성을 향상하는 방법에 관한 것으로, 3-HP의 생산성과 수율을 향상시킬 수 있다.

Description

3-하이드록시프로피온산의 생산 방법
관련 출원들과의 상호 인용
본 출원은 2020년 11월 05일자 대한민국 특허출원 제10-2020-0147146호 및 제10-2020-0147147호에 기초한 우선권의 이익을 주장하며, 해당 한국 특허 출원의 문헌에 개시된 모든 내용은 본 명세서의 일부로서 포함된다.
본 출원은 3-하이드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid; 3-HP)을 제조하는 방법 및/또는 3-HP의 생산성을 향상하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 3-HP 생산능을 가지는 세포를 촉매로 이용하여 3-HP를 생산하는 배양시 에너지 및/또는 조효소 균형을 조절하여 3-HP를 제조 및/또는 3-HP의 생산성을 향상하는 방법에 관한 것이다.
3-하이드록시프로피온산은 아크릴산(acrylic acid), 아크릴산메틸(methyl acrylate), 아크릴아마이드(acrylamide) 등의 다양한 화학 물질로 전환 가능한 플랫폼 화합물이다. 2004년 미국 Department of Energy(DOE)로부터 Top 12 value-added bio-chemical로 선정된 이후 학계와 산업계에서 활발히 연구되고 있다.
3-HP의 생산은 크게 화학적 방법과 생물학적 방법의 두 가지 방법으로 이루어지나, 화학적 방법의 경우 초기 물질이 고가인 점, 생산 과정 중 독성 물질이 생성되는 점 등에 의해 비친환경적이라는 지적이 있어, 친환경적인 바이오 공정이 각광받고 있다.
미생물을 이용한 3-HP 생합성을 위한 기질로는 포도당(glucose)과 글리세롤(glycerol)이 주로 이용되고 있으나, 낮은 수율 및 생산성으로 인해 3-HP의 가능성에도 불구하고 아직 상업화에는 이르지 못한 실정이다.
이에 본 발명자들은 3-HP의 상업화를 위해 높은 수율 및 생산성을 유지하면서 3-HP 생산 농도를 높일 수 있는 발효 기술을 개발하였다.
본 출원의 일 예는 글리세롤(Glycerol)을 탄소원으로 포함하는 배지에 3-하이드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid, 3-HP) 생산능을 가지는 세포를 접종하고, 전자전달계를 활성화하는 조건에서 3-HP를 생산하는 단계를 포함하는, 3-하이드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid; 3-HP)의 제조 방법 및/또는 3-HP의 생산성 향상 방법을 제공한다.
본 출원은, 글리세롤(Glycerol)을 탄소원으로 포함하는 배지에 3-하이드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid, 3-HP) 생산능을 가지는 세포를 접종하고, 전자전달계를 활성화하는 조건에서 3-HP를 생산하는 단계를 포함하는, 3-하이드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid; 3-HP)의 제조 방법 및/또는 3-HP의 생산성 향상 방법을 제공한다.
보다 구체적으로, 상기 방법은,
(1) 3-하이드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid, 3-HP) 생산능을 가지는 세포를 생산 배지에 접종하는 단계; 및
(2) 상기 접종된 세포를 배양하여 3-HP를 생산하는 단계
를 포함하는 것일 수 있다.
상기 생산 배지는 탄소원으로 글리세롤을 포함하는 것일 수 있고, 상기 세포 접종시의 생산 배지는 탄소원으로 포도당을 포함하지 않는 것일 수 있다.
상기 배양은 (i) 상기 생산 배지 또는 배양물 내 용존산소량(DO)을 50% 이하 수준으로 유지하는 조건, (ii) 상기 생산 배지 또는 배양물 내 용존산소량(DO)이 0.1% 이상일 때 포도당을 첨가하는 조건, 또는 (iii) 이들 모두에서 수행되는 것일 수 있다.
상기 3-HP를 생산하는 단계 (2)는 세포 증식이 일어나지 않는 것일 수 있다.
다른 예에서, 상기 방법은 앞서 설명한 세포를 생산 배지에 접종하고 배양하여 3-HP를 생산하는 ‘생산 단계’ 이전에, 상기 세포를 고농도 배양 후 배지에서 분리하는 ‘성장/증식 단계’를 추가로 포함하는 2-단계 방법일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 방법은, 상기 접종하는 단계 (1) 이전에,
(a) 3-하이드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid, 3-HP) 생산능을 가지는 세포를 성장 배지에서 고농도 배양하는 단계; 및
(b) 상기 배양된 세포를 상기 성장 배지로부터 분리하는 단계
를 추가로 포함할 수 있다.
상기 성장 배지로부터 분리된 세포를 상기 단계 (1)의 생산 배지에 접종할 수 있다. 상기 성장 배지는 탄소원으로 글리세롤을 포함하지 않는 것일 수 있다.
이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 명세서에서 제공되는 3-HP의 제조 방법 및/또는 3-HP의 생산성 향상 방법은 글리세롤(Glycerol)을 탄소원으로 포함하는 배지 (3-하이드록시프로피온산 생산 배지)에 3-하이드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid, 3-HP) 생산능을 가지는 세포를 접종하고, 전자전달계를 활성화하는 조건, (예를 들어, 용존 산소량을 일정한 수준으로 유지하는 조건 및/또는 포도당을 첨가하는 조건)에서 3-HP를 생산하는 단계를 포함한다.
상기 3-하이드록시프로피온산 생산 배지는 3-HP 생산 세포의 증식(세포 분열, 성장, 또는 생장)이 일어나지 않으면서 상기 세포가 3-HP를 생산할 수 있도록 하기 위한 목적 범위에서 제한 없이 사용될 수 있다.
일 예에서, 상기 생산 배지의 탄소원은 글리세롤일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일 예에서, 상기 생산용 배지는 비타민 B12를 추가로 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 상기 생산 배지는 세포 접종시에 포도당(glucose)을 포함하지 않는 것일 수 있다.
일 예에서 상기 배지는 합성 배지(synthetic media) 또는 반합성배지(semisynthetic media)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 접종용 세포는 상기 3-하이드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid, 3-HP) 생산능을 가지는 세포를 고농도 배양 후 분리하는 단계를 수행하여 준비된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 고농도 배양된 세포의 접종 농도(접종시 세포 농도)는 3-HP 생산 목적 범위에서 통상의 기술자가 적절히 조절 또는 결정할 수 있다. 일 예에서, 상기 접종 농도(건조 세포 중량(Dry cell weight, DCW)/배지 부피(L) 기준)는 1 내지 20 g/L, 1 내지 16 g/L, 1 내지 12 g/L, 1 내지 9 g/L, 2 내지 20g/L, 2 내지 16 g/L, 2 내지 12g/L, 2 내지 9 g/L, 4 내지 20 g/L, 4 내지 16 g/L, 4 내지 12 g/L, 또는 4 내지 9 g/L 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 3-하이드록시프로피온산을 생산하는 단계는, 3-HP를 생산하기 위한 목적 범위에서 당업계에 알려진 배양 방법을 제한 없이 선택하여 사용될 수 있으며, 일 예에서, 상기 배양 단계는 발효 배양(fermentation)으로 수행되는 것일 수 있다.
상기 3-HP 생산 단계에서는 접종된 세포의 증식이 일어나지 않는 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 생산 단계 종료시 세포의 수는 접종된 세포의 수의 150% 이하, 130% 이하, 100% 이하, 90% 이하, 또는 80% 이하, 예컨대, 50 내지 150%, 50 내지 130%, 50 내지 100%, 50 내지 90%, 50 내지 80%, 70 내지 150%, 70 내지 130%, 70 내지 100%, 70 내지 90%, 또는 70 내지 80%일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 전자전달계를 활성화하는 조건(예를 들어, 용존 산소량을 일정한 수준으로 유지하는 조건 및/또는 포도당을 첨가하는 조건)은, 예를 들어, NAD+ 조효소의 재생산을 활성화 및/또는 ATP 생산을 활성화하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 전자전달계를 활성화하는 조건은,
(i) 배지(예를 들어, 3-HP 생산용 배지 및/또는 배양액)에 포도당을 첨가;
(ii) 배지(예를 들어, 3-HP 생산용 배지 및/또는 배양액) 내 용존산소량(DO)을 일정 수준으로 유지(조절); 또는
(iii) (i) 및 (ii)의 조합
일 수 있다.
일 예에서, 상기 전자전달계를 활성화하는 조건은, 배지(예를 들어, 3-HP 생산용 배지 및/또는 배양액)에 포도당을 첨가하여 수행되는 것일 수 있다. 상기 포도당 첨가는 상기 배지 내 용존산소량(DO)이 일정 수준 이상일 때 수행하거나, 배지 내 용존산소량과 무관하게 (예컨대, 배양 후 배지 내 용존산소량이 일정 수준 이상이 되기 전) 수행할 수 있다. 상기 포도당은 세포 성장 목적이 아닌 에너지 공급 목적으로 첨가되는 것일 수 있다.
글리세롤을 이용해 3-HP를 생합성을 수행할 때 일정 시점이 되면 NAD+와 에너지가 부족해지며 반응 속도가 감소하며 3-HP의 생합성이 중단될 수 있다. 이 때 배양(발효) 시작시 0%였던 DO가 상승한다. DO 상승 시점에 포도당을 에너지원으로 첨가함으로써 세포 NAD+ 및 ATP를 재공급함으로써 3-HP 생산을 지속시킬 수 있다. 상기 포도당은 배지 내 DO가 일정 수준 이상으로 상승하기 전 및/또는 후에 배지에 첨가할 수 있다.
상기 포도당 첨가의 기준이 되는 용존산소량은 3-HP 생산 목적 범위에서 필요에 따라 적절히 선택될 수 있으며, 일 예에서, 포도당 첨가 시점은 배지 내 용존산소량이 배양 개시시보다 상승하기 시작하는 시점일 수 있고, 포도당 첨가의 기준이 되는 배지내 용존산소량은, 예컨대, 0.1% 이상, 0.5% 이상, 1% 이상, 3% 이상, 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 또는 30% 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다 (상한값은 100%, 75%, 또는 50%일 수 있으나 이에 제한되지 않음).
일 예에서 상기 첨가되는 포도당의 양(농도; 첨가되는 포도당 중량(g)/배지 부피(L))은 0.01 내지 3g/L, 0.05 내지 3g/L, 0.1 내지 3g/L, 0.3 내지 3 g/L, 0.01 내지 2g/L, 0.05 내지 2 g/L, 0.1 내지 2 g/L, 0.3 내지 2 g/L, 0.01 내지 1 g/L, 0.05 내지 1 g/L, 0.1 내지 1 g/L, 0.3 내지 1 g/L, 0.01 내지 0.7 g/L, 0.05 내지 0.7 g/L, 0.1 내지 0.7 g/L, 0.3 내지 0.7 g/L, 0.01 내지 0.3 g/L, 0.05 내지 0.3 g/L, 또는 0.1 내지 0.3 g/L일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 예에서, 상기와 같이 생산용 배지에 포도당을 첨가하여 전자전달계를 활성화시키는 조건에서 3-HP를 생산하는 방법은 포도당을 첨가하지 않는 대조군에 비해 3-HP 생산량이 30% 이상, 40% 이상, 또는 50% 이상, 예컨대, 30 내지 1000%, 30 내지 500%, 30 내지 300%, 30 내지 100%, 40 내지 1000%, 40 내지 500%, 40 내지 300%, 40 내지 100%, 50 내지 1000%, 50 내지 500%, 50 내지 300%, 또는 50 내지 100% 증가하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
다른 예에서, 상기 전자전달계를 활성화하는 조건은, 용존산소량(DO)을 일정 수준으로 유지(조절)하여 수행되는 것일 수 있다.
상기 DO의 “일정 수준”은 3-HP 생산 목적 범위에서 제한 없이 결정될 수 있으며, 예를 들어, 50% 이하, 30% 이하, 20% 이하, 10% 이하, 1 내지 50%, 1 내지 30%, 1 내지 20%, 1 내지 10%, 3 내지 50%, 3 내지 30%, 3 내지 20%, 3 내지 10%, 5 내지 50%, 5 내지 30%, 5 내지 20%, 또는 5 내지 10% 수준일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현예에서 상기 용존산소량의 유지는 배양시 교반 속도 조절, 공기 공급량 조절, 및 압력 조절 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상에 의하여 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 배지 또는 배양물 내 용존산소량이, (1) 상기 범위보다 낮아지면 교반속도, 공기 공급량, 압력 중 하나 이상을 증가시키고, (2) 상기 범위보다 높아지면 교반속도, 공기 공급량, 압력 중 하나 이상을 감소시킴으로써, 배지 또는 배양물 내 용존산소량을 소정의 범위로 유지할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 예에서, 상기 용존산소량을 유지(조절)하여 전자전달계를 활성화시키는 조건에서 3-HP를 생산하는 방법은 용존산소량 유지 조건을 포함하지 않는 대조군에 비해 3-HP 생산량이 30% 이상, 50% 이상, 70% 이상, 30 내지 1000%, 30 내지 500%, 30 내지 300%, 30 내지 100%, 50 내지 1000%, 50 내지 500%, 50 내지 300%, 50 내지 100%, 70 내지 1000%, 70 내지 500%, 70 내지 300%, 또는 70 내지 100% 증가하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 제공되는 3-HP의 제조 방법 및/또는 3-HP의 생산성 향상 방법에서, 상기 단계 (1)의 생산 배지에 접종되는 3-하이드록시프로피온산 생산능을 가지는 세포는 성장 배지에서 고농도 배양 후 상기 성장 배지로부터 분리된 세포일 수 있다.
이를 위하여, 상기 방법은, 상기 3-HP 생산 단계 이전에, 상기 생산 배지에 접종하기 위한 3-하이드록시프로피온산 생산 세포를 고농도 배양 후 분리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 방법은, 상기 접종하는 단계(1) 이전에,
(a) 3-하이드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid, 3-HP) 생산능을 가지는 세포를 성장 배지에서 고농도 배양하는 단계; 및
(b) 상기 배양된 세포를 상기 성장배지로부터 분리하는 단계
를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
이 때, 상기 성장배지로부터 분리된 세포는 상기 단계 (1)의 생산 배지에 접종되는 3-하이드록시프로피온산 생산능을 가지는 세포로 사용될 수 있다. 상기 성장배지는 탄소원으로 글리세롤을 포함하지 않는 것일 수 있다.
본 명세서에서, 상기 3-하이드록시프로피온산 생산 세포 (‘3-하이드록시프로피온산 생산능을 가지는 세포’와 동등한 의미로 혼용 가능)는 생산 배지 내의 탄소원 (예컨대, 글리세롤)으로부터 3-HP를 생산할 수 있는 미생물, 예컨대, Escherichia 속 균주 (E. coli 등), 슈도모나스 (Pseudomonas) 속, 엔테로박테리아 (Enterobacteria) 속, 브레비박테리움 (Brevibacterium) 속, 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속, 크렙시엘라 (Klebsiella) 속, 시트로박터 (Citrobacter) 속, 클로스트리디움 (Clostridium) 속, 스트렙토마이세스 (Streptomyces) 속, 바실러스 (Bacillus) 속, 락토바실러스 (Lactobacillus) 속, 슈도모나스 (Pseudomonas) 속, 사카로마이세스 (Saccharomyces) 속 및 아스퍼질러스 (Aspergillus) 속으로 이루어진 미생물에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일 구체예에서, 상기 3-하이드록시프로피온산 생산 균주는 대장균일 수 있다.
일 예에서, 상기 3-하이드록시프로피온산 생산 세포는 글리세롤 탈수효소(glycerol dehydratase) 및 알데하이드 탈수소효소(aldehyde dehydrogenase)로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상 (예컨대, 1개 또는 2개 모두)의 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 3-HP 생산 세포는 추가로 글리세롤 탈수효소 재활성효소(GdrAB)를 암호화하는 유전자(gdrAB)를 추가로 포함할 수 있다. 일 예에서, 상기 3-HP 생산 세포는 추가로 비타민 B12를 생합성할 수 있는 세포일 수 있다.
상기 글리세롤 탈수효소(glycerol dehydratase)는 dhaB(GenBank accession no. U30903.1) 유전자에 의해 암호화되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 dhaB 유전자는 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumonia)에서 유래한 효소일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 글리세롤 탈수효소를 암호화하는 유전자는 dhaB1, dhaB2 및/또는 dhaB3를 암호화하는 유전자를 포함할 수 있다. 상기 글리세롤 탈수효소 단백질 및 이를 암호화하는 유전자는 글리세롤을 3-하이드록시프로판알(3-hydroxypropanal, 3-HPA)과 물(H2O)로 분해하는 효소 활성을 유지하는 범위 내에서 유전자 및/또는 아미노산 서열의 변이를 포함할 수 있다.
상기 알데하이드 탈수소효소(aldehyde dehydrogenase; ALDH)를 암호화하는 유전자(aldH)는, 예를 들어, 대장균(Escherichia coli) 또는 E. coli K12 MG1655 세포주에서 유래한 aldH(GenBank Accession no. U00096.3; EaldH) 유전자, 클렙시엘라 뉴모니아(K. pneumonia)에서 유래한 puuC 유전자, 및/또는 아조스피릴룸 브라실렌스(Azospirillum brasilense) 유래의 KGSADH 유전자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 알데하이드 탈수소효소 단백질 및 이를 암호화하는 유전자는 3-HPA로부터 3-HP를 생산하기 위한 활성을 유지하는 범위 내에서 유전자 및/또는 아미노산 서열의 변이를 포함할 수 있다.
상기 3-HP 생산 세포는 글리세롤 탈수효소, 알데하이드 탈수소효소, 및 글리세롤 탈수효소 재활성효소로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상, 둘 이상 또는 3종 모두의 단백질을 암호화하는 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 포함할 수 있다.
상기 재조합 벡터는 글리세롤 탈수효소, 알데하이드 탈수소효소, 및 글리세롤 탈수효소 재활성효소로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상, 둘 이상 또는 3종 모두의 단백질을 암호화하는 유전자를 세포 내에서 발현하기 위한 목적 범위에서 프로모터, 조절 부위를 당업계에 알려진 방법으로 치환하여 사용할 수 있다.
상기 고농도 배양은 3-HP 생산 세포를 대량으로 확보하기 위한 목적 범위에서 당업계에 알려진 방법을 제한 없이 사용하여 수행될 수 있으며, 일 예에서, 상기 배양은 유가 배양(fed-batch culture)으로 수행되는 것일 수 있다.
일 예에서 상기 유가 배양은 pH-stat 방식, 정속(continuous feeding) 배양 방식, 또는 이들의 조합으로 수행될 수 있다. 일 구현예에서 pH-stat 방식의 유가 배양이 수행되는 경우, 포도당이 1 내지 5g/L 농도로 첨가될 수 있다. 일 구현예에서 정속 배양 방식의 유가 배양이 수행되는 경우 포도당이 10 내지 20g/L/h 속도로 주입될 수 있다.
일 예에서, 상기 고농도 배양시 pH는 5 내지 7.5, 5 내지 7, 5.5 내지 7.5, 5.5 내지 7, 6 내지 7.5 또는 6.5 내지 6으로 유지될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 예에서 상기 고농도 배양시 성장 배지에 포함되는 탄소원은 고농도 배양을 위한 목적 범위에서 단당류, 이당류 및/또는 다당류를 제한 없이 선택하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 탄소원은 포도당(glucose), 과당(fructose), 갈락토스(galactose), 만노스(mannose), 아라비노스(arabinose), 자일로스(xylose), 리보스(riboase), 자당(sucrose), 엿당(maltose), 젖당(lactose), 및 셀로비오스(cellobiose)로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상, 둘 이상, 셋 이상, 넷 이상, 다섯 이상, 열 이상, 또는 상기 11종 모두의 조합일 수 있다. 상기 성장 배지는 탄소원으로 글리세롤을 포함하지 않는 것일 수 있다.
일 예에서 상기 고농도 배양후 세포 농도는 OD600 (600nm에서 측정된 흡광도(O.D.)) 10 이상, 50 이상, 100 이상, 150 이상, 200 이상, 10 내지 500, 10 내지 400, 10 내지 300, 10 내지 250, 50 내지 500, 50 내지 400, 50 내지 300, 50 내지 250, 100 내지 500, 100 내지 400, 100 내지 300, 100 내지 250, 150 내지 500, 150 내지 400, 150 내지 300, 150 내지 250, 200 내지 500, 200 내지 400, 200 내지 300, 또는 200 내지 250일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 고농도 배양된 세포의 분리는, 세포를 원심분리하는 단계, 상층액을 제거하는 단계, 및 펠렛(pellet)을 버퍼로 재현탁하는 단계로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상, 둘 이상 또는 상기 단계 모두를 포함할 수 있다. 일 예에서 상기 버퍼는 PBS(Phosphate buffered saline)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 제공되는 3-HP의 제조 방법 및/또는 3-HP의 생산성 향상 방법의 3-HP 수율은 예를 들어, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 또는 95% 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 3-HP 수율은 상기 3-HP를 생산하는 단계에서 배지(생산 배지) 내 글리세롤 사용량(몰수) 대비 배지(배양물) 내 3-HP 생산량으로 계산될 수 있으며, 일 예에서 하기 수학식 1과 같이 계산될 수 있다.
[수학식 1]
수율 (yield, %) = [(최종 3-HP(g))/{(배양 전 Glycerol(g)) - (배양 후 남은 Glycerol(g))}] * 100
본 발명이 제공하는 3-HP 제조 방법 및/또는 3-HP의 생산성 향상 방법의 3-HP 생산능은 2.0 g/L/h 이상, 2.5 g/L/h 이상, 2.0 내지 60 g/L/h, 2.0 내지 40 g/L/h, 2.0 내지 20 g/L/h, 2.0 내지 10 g/L/h, 2.5 내지 60 g/L/h, 2.5 내지 40 g/L/h, 2.5 내지 20 g/L/h, 또는 2.5 내지 10 g/L/h일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
글리세롤은 3-HPA로 전환된 후, 1,3-프로판디올(1,3-propanediol; 1,3-PDO) 로 환원되거나 3-HP로 산화될 수 있다. 본 명세서에서 제공하는 3-HP 제조 방법 및/또는 3-HP의 생산성 향상 방법은 1,3-PDO을 생산하지 않는 것일 수 있다. 따라서 1,3-PDO를 생산하지 않음으로써 3-HP의 수율을 향상시킬 수 있다.
또한, 본 명세서에서 제공하는 제공하는 3-HP 제조 방법 및/또는 3-HP의 생산성 향상 방법은 3-HP 생산 중 발생하는 부산물인 아세테이트, 락테이트 등과 잔류 글리세롤 함량이 현저히 감소된 것일 수 있다.
다른 예는 3-하이드록시프로피온산 함량이 높고 부산물 함량이 낮은 3-하이드록시프로피온산 생산 균주의 배양물을 제공한다.
상기 배양물은 3-하이드록시프로피온산을, 전체 배양물 기준으로, 60g/L 이상, 62g/L 이상, 65g/L 이상, 67g/L 이상, 70g/L 이상, 72g/L 이상, 75g/L 이상, 77g/L 이상, 78g/L, 79g/L 이상, 80g/L 이상, 81g/L 이상, 82g/L 이상, 83g/L 이상, 84g/L 이상, 85g/L 이상, 86g/L 이상, 87g/L 이상, 88g/L 이상, 89g/L 이상, 또는 90g/L 이상일 수 있다 (상한값은 85 내지 1000g/L 중에서 특별한 제한은 없이 선택될 수 있으며, 예컨대, 1000g/L, 500g/L, 200g/L, 100g/L, 또는 95g/L일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다).
또한, 상기 배양물은, 전체 배양물 기준으로, 다음 중 선택된 하나 이상의 특징을 가지는 것일 수 있다:
아세테이트 농도가 0.25%(w/v) 이하, 0.2%(w/v) 이하, 0.15(w/v) 이하, 또는 0.1%(w/v) 이하;
락테이트 농도가 0.15%(w/v) 이하, 0.1%(w/v) 이하, 0.05%(w/v) 이하, 0.03%(w/v) 이하, 0.01%(w/v) 이하, 또는 존재하지 않음;
PDO (1,3-propanediol) 농도가 0.25%(w/v) 이하, 0.2%(w/v) 이하, 0.15(w/v) 이하, 0.1%(w/v) 이하, 0.07%(w/v)이하, 또는 0.05%(w/v)이하; 및
글리세롤 농도가 0.45%(w/v) 이하, 0.4%(w/v) 이하, 0.35%(w/v) 이하, 0.3%(w/v) 이하, 0.25%(w/v) 이하, 0.2%(w/v) 이하, 0.15(w/v) 이하, 또는 0.1%(w/v)이하. 이 때, 각 범위의 하한값은 0을 포함하거나 (존재하지 않는 경우), 0.000001%(w/v), 0.00001%(w/v), 0.0001%(w/v), 0.001%(w/v), 또는 0.005%(w/v)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구체예에서, 상기 배양물은 앞서 설명한 3-HP 제조 방법 및/또는 3-HP의 생산성 향상 방법, 즉,
(1) 3-하이드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid, 3-HP) 생산능을 가지는 세포를 생산 배지에 접종하는 단계; 및
(2) 상기 접종된 세포를 배양하여 3-HP를 생산하는 단계
에 의하여 얻어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이 때, 상기 단계 (1)에서 생산 배지에 접종되는 3-하이드록시프로피온산 생산능을 가지는 세포는 성장 배지에서 고농도 배양 후 성장 배지로부터 분리된 것일 수 있다. 따라서, 일 구체예에서, 상기 배양물은,
(1’) 성장 배지에서 고농도 배양 후 성장 배지로부터 분리된 3-하이드록시프로피온산 생산능을 가지는 세포를 생산 배지에 접종하는 단계; 및
(2’) 상기 접종된 세포를 배양하여 3-HP를 생산하는 단계
에 의하여 얻어진 분리된 3-하이드록시프로피온산 생산 균주의 배양에 의하여 얻어진 것일 수 있다.
상기 배양물은 3-하이드록시프로피온산 생산 용도로 사용될 수 있다.
이에, 다른 예는 상기 배양물을 포함하는 3-하이드록시프로피온산 생산용 조성물을 제공한다.
다른 예는 상기 3-하이드록시프로피온산 생산용 조성물로부터 3-하이드록시프로피온산을 분리, 회수, 및/또는 정제하는 단계를 포함하는 3-하이드록시프로피온산 생산 방법을 제공한다.
본 발명이 제공하는 3-HP 생산방법 및/또는 생산성 향상 방법은 3-HP 생산성과 수율을 현저히 향상시킬 수 있어 3-HP의 상업화에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 글리세롤로부터 3-HP를 생합성하기 위한 생합성 경로를 간략히 도식화한 것이다.
도 2는 대조군(비교예)과 실시예 1 및 실시예 2의 조건에서 2단계 배양시 3-HP의 생산량을 측정한 결과 그래프이다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에 의해 제한되지 아니한다.
본 명세서에서 특별한 언급이 없는 한 온도는 모두 섭씨 온도를 기준으로 하며, 핵산 서열은 특별한 사정이 없는 한 5' 말단에서 3' 말단 방향으로 기재되었다.
실시예 1. 3-HP 생산 균주의 제조
글리세롤을 기질로 사용하여 3-하이드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid, 3-HP)을 생산하는 것으로 알려져 있는 글리세롤 탈수효소(Glycerol dehydratase) 및 알데하이드 탈수소효소(Aldehyde dehydrogenase)를 암호화하는 유전자를 도입한 재조합 벡터를 제조하였다. 상기 제조된 재조합벡터를 대장균(E. coli) W3110 균주에 도입하여 3-HP 생산균주를 제작하였다.
구체적으로, 글리세롤 디하이드라타제를 코딩하는 유전자(dhaB), 알데히드 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자(aldH) 및 글리세롤 디하이드라타제 리액티바제를 코딩하는 유전자(gdrAB)를 플라스미드 pCDF 에 클로닝하여 3HP 생산용 재조합 벡터(pCDF_J23101_dhaB_gdrAB_J23100_aldH)를 제작 하였다.
상기 재조합 벡터 제작에 사용된 pCDFDuetJ23 벡터는 pCDFDuet-1 벡터(Novagen, USA)의 프로모터 부분을 J23101과 J23100 프로모터로 치환한 벡터이다. 상기 벡터에 삽입되는 dhaB (U30903.1; 약 2.7 kb; dhaB1, dhaB2 및 dhaB3 포함)와 gdrAB 유전자 (약 2.2 kb; gdrA, gdrB)는 크렙시엘라 뉴모니아 (ATCC 25955)의 염색체에서 하기 표 1의 프라이머를 사용하여 증폭하였다. 크렙시엘라 뉴모니아의 염색체 상에 dhaB123와 gdrA 유전자가 나란히 위치해 있어 같이 증폭하였고, gdrB는 dhaB123, gdrA와 반대 방향으로 위치해 있기 때문에 gdrB만 따로 증폭하였다.
aldH 유전자는 하기 표 1의 서열번호 5 및 서열번호 6의 핵산 서열로 이루어지는 프로모터쌍을 이용하여 E. coli K12 MG1655 균주의 유전체로부터 증폭하여 분리하였다. 하기 표 1에 각 유전자 증폭에 사용된 프라이머의 핵산 서열을 나타내었으며, 명칭 중 '-F'는 정방향 프로모터를, '-R'은 역방향 프로모터를 의미한다.
서열번호 이름 핵산 서열(5'>3')
1 dhaB-gdrA-F GAATTCATGAAAAGATCAAAACGATTTGCAGTCCT
2 dhaB-gdrA-R AAGCTTGATCTCCCACTGACCAAAGCTGG
3 gdrB-F AAGCTTAGAGGGGGCCGTCATGTCGCTTTCACCGCCAG
4 gdrB-R CTTAAGTCAGTTTCTCTCACTTAACGGC
5 aldH-F ggtaccatgaattttcatcatctggc
6 aldH-R catatgtcaggcctccaggcttat
각 유전자의 증폭 후 dhaB123, gdrA 유전자는 제한 효소 EcoRI과 HindIII을, gdrB 유전자는 제한 효소 HindIII와 AflII을 이용하여 상기 pCDFDuetaJ23 벡터의 J23101 프로모터 하류에 클로닝하였다. aldH는 제한효소 KpnI과 NdeI을 이용하여 J23108 프로모터 아래에 클로닝하였다. 각 유전자의 클로닝 방법은 당업계에 알려진 방법으로 수행되었다.상기 플라스미드를 E. coli W3110 (KCCM 40219)에 전기천공법으로 도입하여, 3HP 생산 균주를 제조하였다.
준비예 1. 3-HP 생산을 위한 2단계 세포 배양
1-1. 세포의 고농도 배양 (1단계 배양)
상기 제조된 3-HP 생산 균주는 유가 배양(fed-batch culture) 방법으로 5L 발효기(Working volume 2L)로 고농도 세포배양을 수행하였다.
구체적으로, MR 배지 (1L 당 KH2PO4 6.67g, (NH4)2HPO4 4g, MgSO4·7H2O 0.8g, citric acid 0.8g, 및 trace metal solution 5mL; 여기에서, Trace metal solution은 1L 당 5M HCl 5mL, FeSO4·7H2O 10g, CaCl2 2g, ZnSO4·7H2O 2.2g, MnSO4·4H2O 0.5g, CuSO4·5H2O 1g, (NH4)6Mo7O2·4H2O 0.1g, 및 Na2B4O2·10H2O 0.02g)에 포도당(Glucose) 20g/L, 선별을 위한 항생제(스트렙토마이신) 25mg/L를 첨가하여 세포 배양 배지로 사용하였으며, 섭씨 35도의 온도를 유지하였다. pH는 암모니아수를 이용하여 6.95로 유지하였고, 용존산소량(DO)은 교반 속도를 단계적으로 900rpm까지 높이면서 20%를 유지하였으며, aeration은 1vvm을 유지하였다.
유가 배양은 pH-stat feeding 방식을 이용하였으며, 포도당을 3g/L로 첨가하였다.
배양 시간의 경과에 따라 UV-Spectrometer를 이용하여 흡광도(Optical Density, OD)를 측정하여 세포 농도를 측정하였다. 배양 시작 후 20시간째에 OD600은 약 120(건조세포중량 30g/L)을 나타내었다.
상기 고농도 세포배양을 마친 후 세포 배양액을 6,000rpm으로 섭씨 4도에서 10분간 원심분리하여 세포를 회수하였다. 회수된 세포는 PBS(phosphate-buffered saline)으로 현탁하여 이후 단계에 사용하였다.
1-2. 고농도 배양된 세포를 이용한 3-HP 생산 (2단계 배양)
3-HP 생산용 배지는 포도당(Glucose)을 포함하지 않는 M9 배지에 글리세롤(Glycerol) 70g/L, 비타민 B12 50uM를 첨가하여 준비하였다. 3-HP 생산용 배지에 상기 준비예 1-1에서 준비한 세포 현탁액을 세포 접종량 5g/L(건조세포중량 기준)가 되도록 접종하고, 5L 발효기 (Working volume 2L)에서 3-HP 생산 단계를 수행하였다.
3-HP 생산을 위한 배양 조건은, 온도 섭씨 35℃, 교반 속도 300rpm, aeration은 1 vvm을 유지하였으며, pH는 Ca(OH)2를 이용해 7.0으로 유지하였다.
실시예 2. 전자전달계 활성화를 위한 포도당 공급 조건 (2단계 배양 + 포도당 첨가)
세포 내에서 합성된 3-HP를 세포 밖으로 수송하기 위해서는 ATP가 소모되는 것으로 알려져 있다. 이러한 ATP 합성은 전자전달계에서 주로 이루어지며, 포도당(glucose)의 기질 수준의 인산화를 통해서도 ATP의 합성이 가능하다. 이에 포도당을 소량 첨가하여 ATP를 지속적으로 공급하는 경우 3-HP의 생산성 향상 효과를 확인하였다.
구체적으로 상기 준비예 1-1의 방법으로 1단계 고농도 배양 후 분리된 3-HP 생산용 균주(준비예 1에서 제조된 균주)를, 상기 준비예 1-2의 2단계 배양과 동일한 조건에 접종하여 배양을 수행하였다. 다만 2단계 배양시(배지내) 용존 산소량(DO)을 측정하여 DO 20% 이상이 되면 700g/L 농도의 포도당 용액을 0.3g/L로 첨가하도록 배양 조건을 설정하였다.
대조군(비교예)으로는 상기 준비예 1-1 내지 1-2의 단계만을 수행하여 세포 배양 및 3-HP 생산을 수행하였다.
실시예 3. 전자전달계 활성화를 위한 공기 공급 조절 조건 (2단계 배양 + DO 조절)
글리세롤을 이용한 3-HP의 생합성은 글리세롤 탈수효소(glycerol dehydratase)이 글리세롤을 3-HPA로 변환하고, 다시 3-HPA를 알데하이드 탈수소효소(aldehyde dehydrogenase)가 3-HP로 전환하여 이루어진다 (도 1). 3-HPA를 3-HP로 전환하기 위해서는 산화력을 가지는 조효소인 NAD+가 필요하며, 3-HP를 지속적으로 생산하기 위해서는 NADH로 전환된 NAD+의 재생산이 이루어져야 한다. 이러한 NAD+의 재생산 과정은 전자전달계에서 주로 이루어진다. 따라서 산소를 충분히 공급하여 전자전달계를 활성화하는 경우 3-HP의 생산성 향상 효과를 확인하였다.
구체적으로 상기 준비예 1-1의 방법으로 1단계 배양 후 분리된 3-HP 생산용 균주(준비예 1에서 제조된 균주)를, 상기 준비예 1-2의 2단계 배양과 동일한 조건에 접종하여 배양을 수행하였다. 다만 2단계 배양에서의 접종 2시간 후부터 용존산소량(DO)이 5%로 유지되도록 교반 속도(rpm)를 조정하여 배양 조건을 설정하였다. 본 실시예에서, 초기 교반속도를 300 rpm으로 시작하여 2시간 이후부터 DO 5%가 되도록 교반속도를 조금씩 높여서 DO를 조절하였다. 즉 DO가 5% 이하면 교반속도를 1~2 RPM씩 높여주고, 5% 이상이 되면 1~2 RPM씩 낮춰주면서 DO 5%를 유지하였다.
대조군(비교예 1)으로는 상기 준비예 1-1 내지 1-2의 단계만을 수행하여 세포 배양 및 3-HP 생산을 수행하였다. 대조군의 경우 접종 직후 초기 DO는 0%이고 2단계 배양 종료시(40시간) 산소 소모가 중단되면서 DO가 100%로 상승하였다.
실시예 4. 각 배양 조건별 3-HP 생산량의 비교
상기 실시예 2 내지 3의 방법과 준비예 1-1 내지 1-2의 방법(비교예 1)으로 3-HP를 생산하면서 2단계 배양 시간의 경과에 따른 3-HP의 생산량 (g/L)을 측정하여 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 2단계 배양(3-HP생산)을 위한 접종 후 50시간 경과시 비교예의 배양 방법에서는 약 56g/L의 3-HP가 생산됨에 그쳤다. 실시예 2와 같이 포도당을 소량 첨가하여 ATP 균형을 유지한 결과 85g/L의 3-HP가 생산되어 비교예에 비해 약 1.5배 이상의 3-HP 생산량 증가가 확인되었다 (3-HP 생산량 약 52% 상승). 실시예 3과 같이 용존 산소량을 일정 수준으로 유지하여 전자전달계를 활성화시킨 경우에는 배양 방법으로는 95g/L의 3-HP가 생산되었다(3-HP 생산량 약 70% 상승). 따라서 본 발명이 제공하는 3-HP의 생산 방법을 적용함으로써 3-HP 생산성을 향상시킬 수 있음이 실험적으로 확인되었다.
실시예 5. 1단계 배양 및 2단계 배양에서의 포도당 첨가에 따른 3-HP 생산량의 비교
상기 실시예 2와 같이 2단계 배양 및 2단계 배양시 DO 20% 이상이 되면 포도당을 추가하도록 설정한 경우와 1단계 배양 및 포도당 첨가한 경우(비교예 2)의 3-HP 생산을 비교하였다.
상기 비교예 2는 다음과 같이 준비하였다: 우선, 배지에 세포 성장에 필요한 포도당과 기질인 글리세롤을 동시에 첨가하여 세포 성장과 3HP 생산을 동시에 진행 하였다. 실시예 1에서 준비된 재조합 균주를 사용하였으며, 포도당과 글리세롤을 동시에 첨가한 것을 제외하고 준비예 1-1과 동일하게 진행되었다 (포도당은 Fed-batch 방식으로 첨가하고, 글리세롤은 배양 중 한번에 첨가함). 포도당은 초기 첨가된 포도당이 모두 소모되면 pH가 7.0 이상 될 때마다 1 g/L씩 추가로 첨가하고, 글리세롤은 배양 20, 48시간에 각각 70g/L씩 2번 첨가하였다.
비교예 2의 배양조건: 온도 35℃, pH는 암모니아수를 이용하여 6.95로 유지, 교반속도 500 rpm, Air 1 vvm 투입
실시예 2 및 비교예 2에서의 2단계 배양(실시예 2) 또는 1단계 배양(비교예 2)의 3-HP 생산량(g/L) 및 생산성(g/L/h)을 측정하여 아래의 표 2에 나타내었다:
발효 방식 3-HP 생산량 (g/L) 생산성 (g/L/h)
1단계 + 포도당 첨가 56 1.5
2단계 + 포도당 첨가 80 2.1
(상기 표 2의 결과는, 실시예 2는 2단계(생산단계) 배양 38시간 시점, 비교예 2는 1단계 배양 48시간 시점에서 각각 측정한 결과임)
표 2에서 보여지는 바와 같이, 실시예 2의 경우, 비교예 2와 비교하여, 3-HP 생산량 및 생산성이 증가하였다. 이러한 결과는 2단계 배양에서 포도당 첨가에 따른 3-HP 생산 증가 효과가 보다 높게 나타남을 보여준다.
실시예 6. 배양물 내 불순물 생성 비교
상기 실시예 2 (2단계 배양 + 포도당 첨가) 및 실시예 3 (3단계 배양 + DO 조절)에서 얻어진 배양물 내의 불순물 (아세테이트, 락테이트, PDO (1,3-propanediol), 및 잔류 글리세롤) 함량을 측정하여, 준비예 1-1만 수행하여 3-HP를 생산한 경우 (1단계 생산)와 비교하였다.
상기 얻어진 결과를 하기의 표 3에 나타내었다:
불순물 1단계 생산 실시예 2 실시예 3
Acetate 3 g/L 1 g/L 이하 1 g/L 이하
Lactate 2 g/L 없음 없음
PDO 3 g/L 0.5 g/L 이하 0.5 g/L 이하
잔류 Glycerol 5 g/L 이상 1 g/L 이하 1 g/L 이하
(상기 표 3의 결과는, 실시예 2 및 실시예 3은 2단계(생산단계) 배양 38시간 시점, 1단계 생산은 1단계 배양 48시간 시점에서 각각 측정한 결과임)
표 3에 나타난 바와 같이, 실시예 2 및 3의 경우, 1단계 생산한 경우와 비교하여, 불순물인 아세테이트, 락테이트, PDO, 잔류 글리세롤 함량이 현저히 낮거나 존재하지 않음을 확인할 수 있다.

Claims (12)

  1. (1) 3-하이드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid, 3-HP) 생산능을 가지는 세포를 생산 배지에 접종하는 단계; 및
    (2) 상기 접종된 세포를 배양하여 3-HP를 생산하는 단계
    를 포함하고,
    상기 생산 배지는 탄소원으로 글리세롤을 포함하고,
    상기 배양은 (i) 상기 생산 배지 내 용존산소량(DO)을 50% 이하 수준으로 유지하는 조건, (ii) 상기 배지 내 용존산소량이 0.1% 이상일 때 포도당을 첨가하는 조건, 또는 (iii) 이들 모두에서 수행되는 것인,
    3-하이드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid, 3-HP)의 생산 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 3-HP를 생산하는 단계 (2)는 세포의 증식이 일어나지 않는 것인, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 단계 (1)에서 세포가 접종되는 생산 배지는 탄소원으로 포도당을 포함하지 않는 것인, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 조건 (i)의 용존산소량 유지는 교반 속도를 조절함으로써 수행되는 것인, 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 조건 (ii)의 첨가되는 포도당의 농도는 0.01 내지 3g/L 인, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (1)에서 생산 배지에 접종되는 3-하이드록시프로피온산 생산능을 가지는 세포는 성장 배지에서 고농도 배양 후 성장 배지로부터 분리된 것인, 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 3-HP 생산능을 가지는 세포는 글리세롤 탈수효소(glycerol dehydratase) 및 알데하이드 탈수소효소(aldehyde dehydrogenase)로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 것인, 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 성장 배지는 탄소원으로 글리세롤을 포함하지 않는 것인, 방법.
  9. 제6항에 있어서, 상기 고농도 배양 후의 OD600 값으로 측정된 세포 농도가 50 이상인, 방법.
  10. 3-하이드록시프로피온산을 60g/L 이상의 농도로 포함하는, 3-하이드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid, 3-HP) 생산 균주의 배양물.
  11. 제11항에 있어서, 다음 중 선택된 하나 이상의 특징을 가지는, 배양물:
    아세테이트 농도가 0.2%(w/v) 이하,
    락테이트 농도가 0.1%(w/v) 이하,
    PDO (1,3-propanediol) 농도가 0.2%(w/v) 이하, 및
    글리세롤 농도가 0.3%(w/v) 이하.
  12. 제10항 또는 제11항의 배양물을 포함하는 3-하이드록시프로피온산 제조용 조성물.
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