WO2022113965A1 - 被験物質のヒト肝細胞様細胞による排出を評価する方法 - Google Patents

被験物質のヒト肝細胞様細胞による排出を評価する方法 Download PDF

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範生 増田
琢男 荻原
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    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry

Definitions

  • the present invention relates to a method for evaluating the excretion of a test substance by human hepatocyte-like cells and a method for producing a sac having a membrane of human hepatocyte-like cells.
  • the liver is composed of hepatic parenchymal cells, which are responsible for the essence of liver function, and hepatic nonparenchymal cells, which support the proliferation and survival of hepatic parenchymal cells.
  • Hepatic parenchymal cells are also called hepatocytes.
  • the hepatic nonparenchymal cell group is composed of hepatic stellate cells, vas sinusoide endothelial cells, Kupffer cells, bile duct epithelial cells and the like.
  • Hepatocytes convert exogenous drugs and substances generated during metabolism into less toxic substances and excrete them from the following two excretion routes.
  • the first is a route in which the converted, less toxic substance is excreted into the bile canaliculus together with bile, and then excreted as stool via the gallbladder and intestine.
  • the second is a route in which the converted low-toxic substance is excreted into the blood vessels of the vas sinusoide, reaches the kidney, and then is excreted as urine. It is known that in these two excretion pathways, both the transporter that takes in exogenous drugs and substances generated during metabolism into hepatocytes and the transporter that excretes the converted low-toxic substance are different. There is.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and is a method for evaluating excretion of a test substance by human hepatocyte-like cells using an evaluation model for evaluating excretion by human hepatocyte-like cells, and a method for evaluating excretion by human hepatocyte-like cells.
  • a method for manufacturing the evaluation model is provided.
  • the present invention includes the following aspects.
  • (1) A method for evaluating the excretion of a test substance by human hepatocyte-like cells. Preparing a sac-containing solution containing a membrane of human hepatocyte-like cells prepared in vitro and a suspended extracellular matrix of 0-10% by volume. Putting the test substance in the sac-containing liquid and bringing the test substance into contact with the sac, and Taking out the sac from the sac-containing liquid and measuring the concentration of the test substance or its metabolite discharged into the lumen of the sac. The method.
  • (2) The method according to (1), wherein the human hepatocyte-like cell is a cell capable of organoid culture.
  • a method for producing a sac having a membrane of human hepatocyte-like cells Embedding human liver progenitor cells or human liver cells in an extracellular matrix and culturing them to form a culture, Dispersing the culture to form a dispersion, as well as The dispersion is suspended and cultured in a medium in which 0 to 10% by volume of extracellular matrix is suspended with respect to the total volume of the medium to form the sac.
  • the manufacturing method is a method for producing a sac having a membrane of human hepatocyte-like cells. Embedding human liver progenitor cells or human liver cells in an extracellular matrix and culturing them to form a culture, Dispersing the culture to form a dispersion, as well as The dispersion is suspended and cultured in a medium in which 0 to 10% by volume of extracellular matrix is suspended with respect to the total volume of the medium to form the sac.
  • the method of the above aspect it is possible to provide a method for evaluating the excretion of a test substance by human hepatocyte-like cells using an evaluation model for evaluating the excretion by human hepatocyte-like cells.
  • an evaluation model for evaluating excretion by human hepatocyte-like cells it is possible to provide an evaluation model for evaluating excretion by human hepatocyte-like cells.
  • FIG. 1 is a bright field image of the evaluation model in Experimental Example 1.
  • FIG. 2 is an image of an evaluation model in which Rho123 is incorporated into a sac-like substance in Experimental Example 1.
  • (A) is a bright field image, and (b) is a fluorescence image.
  • FIG. 3 is an image of the culture in which Rho123 is incorporated into the lumen of the culture in Experimental Example 5.
  • (A) is a bright field image, and (b) is a fluorescence image.
  • FIG. 4 is an optical microscope image of a sac.
  • FIG. 5 is an image of the culture in which Rho123 is incorporated into the lumen of the culture in Experimental Example 6.
  • each component exemplified in the present specification for example, a component contained in a medium or a component used in each step, may be used alone or in combination of two or more. Can be used.
  • the notation representing a numerical range such as “A to B” is synonymous with “A or more and B or less”. Further, in the present specification, the notation representing the numerical range such as “A to B, preferably a to b" is "A or more, B or less", “A or more, b or less", “a or more, B or less”. , And "a or more, b or less”.
  • medium containing substance X and "in the presence of substance X” mean a medium to which an exogenous substance X is added, a medium containing an exogenous substance X, or an exogenous substance X. It means the presence of substance X. That is, when a cell or tissue present in the medium expresses, secretes or produces the substance X endogenously, the endogenous substance X is distinguished from the exogenous substance X and is an exogenous substance. A medium that does not contain X does not fall under the category of "medium containing substance X" even if it contains an intrinsic substance X.
  • the method of this embodiment is a method for evaluating the excretion of a test substance (hereinafter, also referred to as “substrate”) by human hepatocyte-like cells (hereinafter, also referred to as “evaluation method of this embodiment”), and is described below. It has steps 1 to 3.
  • a sac-like substance having a membrane of human hepatocyte-like cells prepared in vitro hereinafter, also referred to as "this evaluation model”
  • a sac-like substance containing 0 to 10% by volume of suspended extracellular matrix hereinafter, also referred to as "this evaluation model”
  • step 1 Preparing the containing liquid (hereinafter, also referred to as “step 1");
  • step 2 The test substance is put into the sac-containing liquid, and the test substance and the sac-like substance are brought into contact with each other (hereinafter, also referred to as “step 2”); Taking out the sac from the sac-containing liquid and measuring the concentration of the test substance or its metabolite discharged into the sac (hereinafter, also referred to as "step 3").
  • This evaluation model is suitably used as a biomimetic model (Micro Physiological System, MPS) for evaluating the excretion of a test substance by cells for human hepatocytes.
  • MPS Micro Physiological System
  • In the bioimitation model in order to mimic the structure of human liver tissue in the living body, it is necessary to orient the human hepatocytes and arrange them in a membranous manner.
  • human hepatocytes and human liver cells have been cultured in a state of being embedded in an extracellular matrix. The sac-like substance thus obtained is in a state of being embedded in the extracellular matrix.
  • the extracellular matrix In order to quantify the concentration of the test substance taken into the sac by excretion, when taking out the test substance taken into the sac, the extracellular matrix is physically or chemically used with an enzyme or the like. Need to get rid of. However, when removing the extracellular matrix, the human hepatocyte-like cell membrane of the sac may be broken and the test substance in the sac may leak out. On the other hand, when the test substance is taken out from the sac and the concentration of the test substance is quantified by LC-MS or the like without removing the extracellular matrix, the extracellular matrix becomes noise and the amount of the test substance is accurately measured. Can not do it. For the above reasons, it has been difficult to quantify the test substance discharged into the sac in the conventional sac embedded in the extracellular matrix.
  • the sac-like substance-containing liquid although 0 to 10% by volume of extracellular matrix is present in the sac-like substance-containing liquid, the sac-like substance is not embedded in the extracellular matrix. Therefore, the sac-like substance can be taken out from the sac-like substance-containing liquid without breaking, and the concentration of the test substance incorporated in the sac-like substance can be easily quantified.
  • metabolism, drug interaction, hepatotoxicity, transporter activity, etc. of a test substance by human hepatocyte-like cells are conventionally performed by fluorescence intensity using a substrate or bile having a fluorescence label. From the low-precision evaluation that has been conducted, it is possible to perform a high-precision quantitative evaluation by the liquid chromatography mass analysis method.
  • step 1 a sac-containing solution containing the present evaluation model prepared in vitro and 0 to 10% by volume of suspended extracellular matrix is prepared.
  • the cyst of this evaluation model is also called cyst, and as shown in FIG. 4, it has a sac-like structure formed by the membrane of human hepatocyte-like cells.
  • a bile canaliculus-like structure is constructed between human hepatocyte-like cells.
  • a bile canaliculus-like structure between human hepatocyte-like cells, it is possible to have tight junctions.
  • the lumen of this evaluation model contains bile as a content.
  • the human hepatocyte-like cells of this evaluation model are BSEP (Bile salt export pump), MRP2 (Multidrug RESISTANCE-associated protein 2), P-gp (P-glycoprotein), MATE (Multidrug), and MATE (Multidrug). It is preferable to have at least one transporter selected from the group consisting of (Breast cancer response protein). These transporters are known as bile excretion transporters for different substances.
  • this evaluation model has a bile canaliculus-like structure and the human hepatocyte-like cells of this evaluation model have the above-mentioned transporter, the test substance or its metabolite incorporated into human hepatocyte-like cells can be obtained.
  • the above-mentioned transporter it can be discharged from the inside of human hepatocytes through a bile canaliculus-like structure to the outside of human hepatocytes, and accumulated in the lumen of a sac together with bile.
  • the human hepatocyte-like cells of this evaluation model include NTCP (Na + -taurocholate cotransporting peptide), OATP (organic anion transporting polypeptide) family transporter, OCT1 (orgation) family transporter, etc. You can have more porters.
  • the human hepatocyte-like cells of this evaluation model can further express genes of metabolic enzymes such as CYP1A2, CYP2A6, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1 and CYP3A4.
  • the membrane of human hepatocyte-like cells in this evaluation model is preferably a monolayer membrane. Since the membrane of human hepatocyte-like cells is a monolayer membrane, the effect of the test substance per cell can be evaluated by this evaluation model.
  • the volume of this evaluation model is 4e -6 to 3e -2 mm 3 , preferably 3e -5 to 1e -2 mm 3 , and more preferably 1e -4 to 4e -3 mm 3 .
  • the human hepatocyte-like cells of this evaluation model are preferably cells that can be cultured with organoids from the viewpoint of functional and property stability.
  • the organoid culture is a three-dimensional self-organizing culture of stem cells, and the cells obtained by the organoid culture are also referred to as organoids.
  • the content ratio of the sac-like substance contained in the sac-like substance-containing liquid is 10 to 2,000 pieces / mL, preferably 50 to 1,000 pieces / mL, and more preferably 100 to 500 pieces / mL. ..
  • Examples of the extracellular matrix include components contained in the basement membrane, glycoproteins existing in the intercellular spaces, and the like.
  • the components contained in the basement membrane include type IV collagen, laminin, heparan sulfate proteoglycan, and entactin.
  • the content ratio of the extracellular matrix in the sac-containing liquid is 0 to 10% by volume, preferably 0.001 to 5% by volume, preferably 0.1, based on the total volume of the sac-containing liquid. It is more preferably to 4% by volume, further preferably 1 to 3% by volume.
  • the sac-containing solution has a medium used for suspension culture, an extracellular matrix, and a membrane of human hepatocyte-like cells in the "method for producing a sac having a membrane of human hepatocyte-like cells" described later. It is preferably a liquid containing sac-like substances.
  • step 2 the test substance is put into the sac-like substance-containing liquid prepared in step 1, and the test substance is brought into contact with the present evaluation model.
  • test substance examples include a natural compound library, a synthetic compound library, an existing drug library, a metabolite library, and the like.
  • Organic compounds or inorganic compounds of various molecular sizes can be used as the test substance.
  • organic compounds include nucleic acids, peptides, proteins, lipids (simple lipids, complex lipids (phosphoglycerides, sphingolipids, glycosylglycides, and celebrosides, etc.), prostaglandins, isoprenoids, terpenes, steroids, polyphenols, catechins, and Examples include vitamins (B1, B2, B3, B5, B6, B7, B9, B12, C, A, D, E, etc.) and the like.
  • test substance examples include ingredients contained in pharmaceuticals, nutritional foods, and the like.
  • examples of the test substance include a plant extract, a cell extract, a culture supernatant and the like. By adding two or more kinds of test substances at the same time, it is possible to investigate the interaction, synergistic action, etc. between the test substances.
  • the test substance may be derived from a natural product or may be artificially synthesized.
  • the period of contact between the test substance and this evaluation model is usually 10 minutes or more and 3 days or less, preferably 30 minutes or more and 1 day.
  • the contact between the test substance and this evaluation model can be performed in a plurality of times.
  • test substance is taken up by human hepatocyte-like cells of this evaluation model, and then the taken-in test substance is excreted in the lumen of this evaluation model, or the taken-in test substance is a human of this evaluation model. It is metabolized by hepatocyte-like cell metabolizing enzymes and excreted in the lumen of this evaluation model.
  • step 3 the evaluation model is taken out from the sac-like liquid after step 2, and the concentration of the test substance or its metabolite discharged into the lumen of the evaluation model is measured.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the extracted test substance in the lumen of the evaluation model is extracted by degrading the membrane of the human hepatocyte-like cells.
  • the method for decomposing the membrane of human hepatocyte-like cells include a chemical method using methanol and the like, and a physical method such as homogenization.
  • the concentration of the test substance or its metabolite can be measured by the liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) method because of its excellent quantitativeness.
  • FIA method fluorescence immunoassay
  • EIA method enzyme immunoassay
  • LC-MS liquid chromatography-mass spectrometry
  • the toxicity of the test substance can be evaluated.
  • the state of human hepatocyte-like cells after contact with the test substance is examined to evaluate the toxicity of the test substance.
  • a method for evaluating human hepatocyte-like cells it can be carried out based on the viability, cell morphology, and the abundance of liver damage markers (for example, GOT, GPT) in the culture medium.
  • the method for producing a sac-like substance having a membrane of human hepatocyte-like cells of the present embodiment has the following steps A to C.
  • step A Human liver progenitor cells or human liver cells are embedded in an extracellular matrix and cultured to form a culture
  • step A Dispersing the culture to form a dispersion
  • step B Dispersing the culture to form a dispersion
  • the dispersion is suspended and cultured in a medium in which 0 to 10% by volume of extracellular matrix is suspended with respect to the total volume of the medium to form a sac-like substance having a membrane of human hepatocyte-like cells (hereinafter referred to as “sac”).
  • sac-like substance having a membrane of human hepatocyte-like cells hereinafter referred to as “sac”.
  • process C Also referred to as "process C”).
  • the sac-like substance having a membrane of human hepatocyte-like cells produced by the production method of the present embodiment can be used as the present evaluation model of the evaluation method of the present embodiment.
  • the details of each step of the manufacturing method of the present embodiment will be described below.
  • step A human liver progenitor cells or human liver cells are embedded in an extracellular matrix and cultured to form a culture.
  • the formed culture contains human hepatocyte-like cells.
  • Human hepatic progenitor cells are embryos by culturing from human pluripotent stem cells in a medium containing factors such as, for example, TGF ⁇ signaling promoters such as Wnt, Nodal, Activin A, and any combination thereof. Induces differentiation into the germ layer in the body. Human hepatic progenitor cells can then be obtained by culturing in a medium containing factors such as FGF, BMP, and any combination thereof.
  • human pluripotent stem cells include human embryonic stem cells (hESC) and human induced pluripotent stem cells (hiPSC).
  • Human liver cells usually include hepatic parenchymal cells as well as non-hepatic parenchymal cells such as bile duct cells, sinus endothelial cells, Kupffer cells, mesocalar cells, and hepatic stellate cells. Among these, it is preferable that hepatic nonparenchymal cells are contained. Since human hepatocyte-like cells having a gene phenotype similar to that of wild type human hepatocytes can be obtained, it is preferable to use human hepatocytes in step A.
  • Human hepatocyte precursor cells or human liver cells are embedded in an extracellular matrix and cultured to proliferate and mature to form human hepatocyte-like cells.
  • Examples of the extracellular matrix include the same as those exemplified in step 1.
  • human liver precursor cells or human liver cells are mixed with extracellular matrix precursors, and the extracellular matrix precursors are polymerized. Then, the extracellular matrix is formed, and then the medium is layered and cultured.
  • the culture conditions in step A are usually 30 ° C. or higher and 40 ° C. or lower, preferably 37 ° C. or higher.
  • Other culture conditions are usually carried out under a CO 2 concentration condition atmosphere of about 5% by volume.
  • the culture time can be appropriately adjusted according to the number of cells, the state of cells, and the like.
  • the medium can be changed every 1 to 3 days. Further, in the step A, by performing the subculture over a plurality of times, a culture having stable functions and properties can be obtained.
  • the culture in step A is preferably organoid culture.
  • Organoids obtained by organoid culture have high expression levels of transporters and genes of metabolic enzymes, and the membranes of human hepatocyte-like cells in sac form have high transepithelial electrical resistance and tight junctions. Can be formed.
  • Growth factors such as mitotic growth factor, Wnt signaling promoter, Rho kinase (ROCK) signaling inhibitor, IL-6 family cytokines, and nicotine amide; transforming growth factor ⁇ Factors that suppress the differentiation of (TGF- ⁇ ) signal transduction inhibitors, etc .; Factors related to maturation such as retinoic acid, DAPT ( ⁇ -sectokine), dimethylsulfoxide (DMSO), and dexamethasone (Dex); and forskolin. It is preferable to contain at least one selected from the group consisting of factors related to the activation of cell receptors such as.
  • the medium When culturing human liver progenitor cells, the medium preferably contains a factor related to maturation, and preferably contains at least one factor selected from DAPT, DMSO and Dex.
  • the medium When culturing human liver cells, the medium preferably contains factors related to maturation, factors related to proliferation, factors that suppress differentiation, and factors related to activation of cell receptors, and DAPT is used as a factor related to maturation.
  • factors related to maturation factors related to proliferation, factors that suppress differentiation, and factors related to activation of cell receptors, and DAPT is used as a factor related to maturation.
  • An IL-6 family cytokine, a mitotic growth factor, a Wnt signaling promoter, and a ROCK signaling inhibitor are preferably contained as factors relating to proliferation.
  • division-promoting growth factor is a factor that induces the initiation of cell division.
  • the mitotic growth factor include epidermal growth factor (EGF), fibroblast growth factor (FGF), hepatocyte growth factor (HGF) and the like.
  • EGF epidermal growth factor
  • FGF fibroblast growth factor
  • HGF hepatocyte growth factor
  • FGF those capable of binding to FGF receptor 2 (FGFR2) or FGF receptor 4 (FGFR4) are preferable, FGF2, FGF4, FGF7 or FGF10 is preferable, and FGF10 is particularly preferable.
  • EGF, FGF10 or HGF is preferable, and it is more preferable to include all of EGF, FGF10 and HGF.
  • the concentrations of EGF and HGF contained in the medium are usually 10 ng / mL to 500 ng / mL, preferably 15 ng / mL to 100 ng / mL, and more preferably 20 ng / mL to 80 ng / mL. It is preferably 25 ng / mL to 50 ng / mL, more preferably 25 ng / mL.
  • the concentration of FGF contained in the medium is usually 20 ng / mL to 500 ng / mL, preferably 50 ng / mL to 300 ng / mL, more preferably 80 ng / mL to 150 ng / mL, and 90 ng. It is more preferably / mL to 110 ng / mL.
  • Wnt signal is a signal related to the proliferation and maintenance of undifferentiated state of stem cells.
  • the Wnt signal transduction promoter can upward control the Wnt signal.
  • Examples of the Wnt signaling promoter include Wnt agonists, Lgr5 agonists, glycogen synthase (GSK) inhibitors and the like.
  • Wnt agonists include Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt9a, Wnt9b, Wnt10a, Wnt10b, Wnt11, and Wnt16. Be done. Among these, Wnt3a is preferable.
  • Afamin contributes to the stabilization and solubilization of Wnt family members.
  • Wnt agonist it can be used as a complex of Wnt family members and afamin.
  • the content of the Wnt agonist contained in the medium is usually 1% by volume to 50% by volume, preferably 10% by volume to 30% by volume, and 15% by volume to 25% by volume, based on the total volume of the medium. More preferably, it is by volume.
  • Lgr5 agonist examples include R-spondin 1, R-spondin 2, R-spondin 3, R-spondin 4, and the like. Among these, R-spondin 1 is preferable.
  • the content ratio of the Lgr5 agonist contained in the medium is usually 1% by volume to 50% by volume, preferably 5% by volume to 30% by volume, and 5% by volume to 15% by volume, based on the total volume of the medium. Volume% is more preferred.
  • GSK inhibitors examples include CHIR99021 (CAS number: 252917-06-9), SB216763 (CAS number: 280744-09-4), SB415286 (CAS number: 264218-23-7), and CHIR98014 (CAS number: 252935-94). -7), AZD1080 (CAS number: 61247-72-6), LY2090314 (CAS number: 603288-22-8) and the like. Among these, CHIR99021 is preferable.
  • the concentration of the GSK inhibitor contained in the medium is usually 0.1 ⁇ M to 10 ⁇ M.
  • M means mol / L, and the same applies hereinafter.
  • the Wnt signaling promoter it is preferable to use a Wnt agonist and an Lgt5 agonist in combination.
  • ROCK signal transduction inhibitor By downward control of ROCK signal, hepatocytes can acquire proliferative ability.
  • ROCK signal transduction inhibitor examples include Y-27632 (CAS number: 146986-50-7), Fasudil (CAS number: 105628-07-7), Y39983 (CAS number: 203911-26-6), Wf.
  • -536 (CAS number: 539857-64-2), SLx-2119 (CAS number: 91417-87-3), azabenzoimidazole-aminofurazans (CAS number: 850664-21-0), DE- 104, H-1152P (CAS Number: 872543-07-6), Rho-kinase ⁇ inhibitor (ROK ⁇ inhibitor), XD-4000, HMN-1152, 4- (1-aminoalkyl) -N- (4-pyridyl) Cyclohexane-carboxyamide (4- (1-aminoalkyl) -N- (4-pyridyl) cyclohexane-carboxamides), Rhostan (Rhostein), BA-210, BA-207, Ki-23095, VAS-012 and the like. Be done. Among these, Y-27632 is preferable.
  • the concentration of the ROCK signal transduction inhibitor contained in the medium is usually 1 ⁇ M to 20 ⁇ M, preferably 5 ⁇ M to 15 ⁇ M.
  • TGF- ⁇ signal transduction inhibitor By downward control of TGF- ⁇ signal, differentiation can be suppressed.
  • TGF- ⁇ signal transduction inhibitor examples include a TGF- ⁇ inhibitor with phosphorylation of Smad2 / 3, a BMP inhibitor with phosphorylation of Smad1 / 5/9, and the like.
  • TGF- ⁇ inhibitor examples include A83-01 (CAS number: 909910-43-6), SB-431542 (CAS number: 301836-41-9), SB-505124 (CAS number: 694433-59-5), and the like.
  • SB-525334 CAS number: 356559-20-1
  • LY364947 CAS number: 396129-53-6
  • SD-208 CAS number: 627536-09-8
  • SJN2511 CAS number: 446859-33-2
  • A83-01 is preferable.
  • the concentration of the TGF- ⁇ inhibitor contained in the medium is usually 0.05 ⁇ M to 50 ⁇ M, preferably 0.5 ⁇ M to 30 ⁇ M, more preferably 1 ⁇ M to 15 ⁇ M, and 4 ⁇ M or more and 6 ⁇ M or less. More preferred.
  • BMP inhibitor examples include Noggin, Differential screening-selected gene Aberrative in Neuroblastoma (DAN), and DAN-like protein. Among these, nogin is preferable.
  • the concentration of the BMP inhibitor contained in the medium is usually 10 ng / mL to 100 ng / mL, preferably 15 ng / mL to 50 ng / mL, and more preferably 20 ng / mL to 30 ng / mL. ..
  • IL-6 family cytokines can enhance the proliferation of human hepatic progenitor cells.
  • the IL-6 family cytokines include interleukin-6 (IL-6), interleukin-11 (IL-11), oncostatin M (OSM), leukemia inhibitory factor (LIF), and cardiotropin-1 (CT-). 1), hair-like neurotrophic factor (CNTF) and the like. Among these, IL-6 is preferable.
  • the concentration of IL-6 family cytokines contained in the medium is usually 10 ng / mL to 1.0 ⁇ g / mL, preferably 50 ng / mL to 500 ng / mL, preferably 80 ng / mL to 200 ng / mL. More preferably, it is more preferably 90 ng / mL to 110 ng / mL.
  • Retinoic acid By containing retinoic acid in the medium, the bile canaliculus can be increased and the orientation of cells can be increased.
  • concentration of retinoic acid contained in the medium is usually 1 ⁇ M to 30 ⁇ M.
  • Nicotinamide By containing nicotinamide in the medium, cell proliferation ability can be improved.
  • the concentration of nicotinamide contained in the medium is usually 5 mM or less.
  • the intracellular concentration of AMP can be increased, and as a result, the cell receptor can be reactivated.
  • concentration of forskolin contained in the medium is usually 0.1 ⁇ M to 100 ⁇ M, preferably 1 ⁇ M to 50 ⁇ M, and more preferably 5 ⁇ M to 15 ⁇ M.
  • the medium may further contain gastrin, a neurobiological supplement, N-acetylcysteine and the like.
  • a neurobiological supplement examples include insulin-containing supplements such as B27 supplement (Thermo Fisher Scientific) and N2 supplement (Thermo Fisher Scientific).
  • the medium can be prepared by adding each of the above-mentioned components to the basic medium.
  • the basal medium Dalbeco's modified Eagle's medium (DMEM), basal medium (MEM), knockout-DMEM (KO-DMEM), Grasgo's basal medium (G-MEM), Eagle's basal medium (BME), DMEM / ham F12
  • DMEM Dalbeco's modified Eagle's medium
  • MEM basal medium
  • KO-DMEM knockout-DMEM
  • G-MEM Grasgo's basal medium
  • BME Eagle's basal medium
  • DMEM / ham F12 Examples include Advanced DMEM / Ham F12 (Advanced DMEM / F12), Iskov-modified Dalveco medium, Ham F-10, Ham F-12, 199 medium, RPMI1640 medium, and human plasma mimicry medium.
  • step B the culture formed in step A is dispersed to form a dispersion.
  • step A The culture formed in step A was embedded in the extracellular matrix.
  • step B the extracellular matrix is disrupted and the culture is removed.
  • the method for disrupting the extracellular matrix include a method for physically disrupting the extracellular matrix and a method for chemically disrupting the extracellular matrix using an enzyme. Among these, the method of physically disrupting the extracellular matrix is preferable because the damage to the cells is small.
  • Dispersion means that cells are separated into a cell population of 100 or less, preferably a cell population of 50 or less, and more preferably a single cell by a dispersion treatment such as enzyme treatment or physical treatment.
  • a dispersion treatment such as enzyme treatment or physical treatment.
  • the dispersion treatment include mechanical dispersion treatment, cell dispersion liquid treatment, and cell protective agent addition treatment. These processes can be combined as appropriate. Among these, cell dispersion treatment is preferable.
  • Examples of the cell dispersion used for the cell dispersion treatment include a solution containing any of enzymes such as trypsin, collagenase, hyaluronidase, elastase, pronase, DNase, and papain; a chelating agent such as ethylenediamine tetraacetic acid. ..
  • Examples of commercially available cell dispersions include TrypLE Select and TrypLE Express manufactured by Thermo Fisher Scientific.
  • Examples of the mechanical dispersion treatment include a pipetting treatment or a scraping operation with a scraper.
  • the cell protective agent Before the dispersion treatment, it can be treated with a cell protective agent to prevent cell death.
  • the cell protective agent include fibroblast growth factor (hereinafter, also referred to as “FGF”), heparin, ROCK inhibitor, insulin-like growth factor (Insulin-like growth factor, hereinafter also referred to as “IGF”), and the like.
  • FGF fibroblast growth factor
  • IGF insulin-like growth factor
  • serum and serum substitutes include serum and serum substitutes.
  • step C the dispersion formed in step B is suspended and cultured in a medium in which 0 to 10% by volume of extracellular matrix is suspended with respect to the total volume of the medium, and a sac-like substance having human hepatocyte-like cells is obtained. To form.
  • Examples of the extracellular matrix in step C include the same extracellular matrix as those exemplified in step 1.
  • the content ratio of the extracellular matrix contained in the medium in step C is 0 to 10% by volume, preferably 0.001 to 5% by volume, and 0.1 to 4% with respect to the total volume of the medium. It is more preferably by volume%, and even more preferably 1 to 3% by volume.
  • Examples of the method for suspending the extracellular matrix include a method in which the medium and the extracellular matrix precursor are mixed, and then the extracellular matrix precursor is gelled to form an extracellular matrix.
  • Examples of the method for mixing the extracellular matrix precursor include a pipetting method on an ice bath. Mixing means a state in which extracellular matrix is not visually observed in the medium.
  • Examples of the medium in step C include the medium exemplified in step A above.
  • the culture conditions in step C can be the conditions generally adopted in the culture of animal cells. For example, at a temperature of 30 ° C. or higher and 40 ° C. or lower, preferably 37 ° C., a CO2 concentration atmosphere condition of 5% by volume can be mentioned.
  • the culture time can be appropriately adjusted according to the number of cells, the state of cells, and the like. Usually, it is 1 day or more and 1 week or less from the start of culture.
  • the medium after culturing in step C is the present. Since the evaluation model and 0 to 10% by volume of suspended extracellular matrix are contained, this medium can be used as the sac-containing solution of step 1 in the evaluation method of the present embodiment.
  • Example 1 Preparation of culture of human liver cells 50 mL of human primary frozen floating hepatocytes (HEP187-S, manufactured by BIOPRRIDIC) was thawed in a water bath at 37 ° C. and serum-free medium (advanced DMEM / F12 plus HEPES, GLUTAMAX, PENICILIN / PENEPTOMYCIN) was added. Suspended in a tube and centrifuged. After centrifugation, the supernatant was removed and then suspended in serum-free medium to prepare a human liver cell suspension.
  • serum-free medium as DMEM / F12 plus HEPES, GLUTAMAX, PENICILIN / PENEPTOMYCIN
  • 20,000 human liver cells were mixed with 50 ⁇ L Matrigel (BD Bioscience), seeded on a 24-well tissue culture plate and incubated at 37 ° C. for 10 minutes until Matrigel was fully polymerized. .. After the polymerization, 500 ⁇ L of the medium shown in Table 1 below was layered and cultured at 37 ° C. in the presence of 5% by volume CO 2 to obtain a culture of human liver cells. The resulting culture formed a lumen with a membrane of human hepatocyte-like cells. The obtained culture was subcultured by repeating the same operation.
  • Matrigel BD Bioscience
  • Example 2 Manufacturing of sac-like material (this evaluation model)
  • MS-8006R manufactured by Sumitomo Bakelite
  • the culture of human liver cells after subculture of Experimental Example 1 the medium shown in Table 1, and 2% by volume of Matrigel were added to the medium.
  • the cells were suspended and cultured at 37 ° C. for 3 days in the presence of 5% by volume CO 2 to form sac-like substances.
  • FIG. 1 shows a bright field image of this evaluation model obtained by imaging a sac with an optical microscope (magnification: 400 times (manufactured by KEYENCE, BZ-X700)).
  • Rho123 was discharged into the lumen of this evaluation model with an optical microscope (magnification: 400 times (manufactured by KEYENCE, BZ-X700)). ..
  • a bright-field image (FIG. 2 (a)) and a fluorescence image (FIG. 2 (b)) are shown in FIG. As shown in FIG. 2, it was confirmed that Rho123 was discharged into the lumen of this evaluation model.
  • Rho123 (10 ⁇ M) was added to the culture broth containing the culture embedded in Matrigel after culturing prepared in Experimental Example 1, and in the presence of 5% by volume CO2, in the culture at 37 ° C. for 30 minutes. Rho123 was taken up into the cavity. It was confirmed by an optical microscope (magnification: 400 times (manufactured by KEYENCE, BZ-X700)) that Rho123 was incorporated into the lumen of the culture. A bright-field image (FIG. 3 (a)) and a fluorescence image (FIG. 3 (b)) are shown in FIG.
  • Rho123 taken up When the polymerized Matrigel was decomposed by pipetting and enzymatic treatment (Corning® cell recovery solution) to measure the amount of Rho123 taken up, Rho123 taken up from the liver organoid leaked along with the decomposition of Matrigel. , The amount of Rho123 taken up could not be measured.
  • the method of the present embodiment it is possible to provide a method for evaluating metabolism or excretion of a test substance by human hepatocyte-like cells using an evaluation model for evaluating excretion by human hepatocyte-like cells.

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Abstract

被験物質のヒト肝細胞様細胞による排出を評価する方法は、インビトロで作製されたヒト肝細胞様細胞の膜を有する嚢状物、及び０～１０体積％の懸濁された細胞外マトリックス、を含有する嚢状物含有液を準備すること、前記嚢状物含有液に被験物質を入れ、前記被験物質と前記嚢状物とを接触させること、並びに、前記嚢状物含有液から前記嚢状物を取り出し、前記嚢状物の内腔に排出される被験物質又はその代謝物の濃度を測定すること、を有する。

Description

被験物質のヒト肝細胞様細胞による排出を評価する方法
　本発明は、被験物質のヒト肝細胞様細胞による排出を評価する方法、及びヒト肝細胞様細胞の膜を有する嚢状物の製造方法に関する。
　本願は、２０２０年１１月２５日に、日本に出願された特願２０２０－１９５４７６号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　肝臓は、肝機能の本質を担う肝実質細胞と肝実質細胞の増殖や生存を支える肝非実質細胞群により構成されている。肝実質細胞は、肝細胞とも呼ばれている。肝非実質細胞群は、肝星細胞、類洞内皮細胞、クッパー細胞、及び胆管上皮細胞等から構成されている。
　肝細胞は、外因性の薬物や代謝の際に生じた物質を、毒性の低い物質に変換し、次に示す２つ排出経路から排出する。一つ目は、変換された毒性の低い物質を胆汁と共に毛細胆管内に排出し、胆のう、腸を経て便として体外に排出する経路である。２つ目は、変換された毒性の低い物質を類洞血管内に排出し、腎臓に到達した後、尿として体外に排出する経路である。これら２つの排出経路において、外因性の薬物や代謝の際に生じた物質を肝細胞内に取り込むトランスポーター、及び変換された毒性の低い物質を排出するトランスポーターのいずれも異なることが知られている。
　創薬において、初期スクリーニングで同定された候補薬の多くは前臨床試験の段階で振るい落とされる。そして、振るい落とされた候補薬が多いことは、患者の治療機会の喪失につながる。ところで、前臨床試験では、候補薬の有効性のスクリーニングと、候補薬の安全性試験で構成されるが、これらのスクリーニングには、インビトロでの前臨床モデルを用いることが有用であることが知られている（例えば、非特許文献１～非特許文献３等参照）。
Oshikata MA et al., "Development of an oxygenation culture method for activating the liver-specific functions of HepG2 cells utilizing a collagen vitrigel membrane chamber.", Cytotechnology, Vol. 68, pp. 1801-1811, 2016. Jang KJ et al., "Reproducing human and cross-species drug toxicities using a Liver-Chip", Sci. Transl. Med., Vol. 11, Issue 517, eaax5516, 2019, doi: 10.1126/scitranslmed.aax5516. Swift B et al., "Sandwich-Cultured Hepatocytes: An In Vitro Model to Evaluate Hepatobiliary Transporter-Based Drug Interactions and Hepatotoxicity", Vol. 42, Issue 3, pp. 446-471, 2010.
　本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、ヒト肝細胞様細胞による排出を評価するための評価モデルを用いた、被験物質のヒト肝細胞様細胞による排出を評価する方法、及び前記評価モデルの製造方法を提供する。
　すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
（１）　被験物質のヒト肝細胞様細胞による排出を評価する方法であって、
　インビトロで作製されたヒト肝細胞様細胞の膜を有する嚢状物、及び０～１０体積％の懸濁された細胞外マトリックス、を含有する嚢状物含有液を準備すること、
　前記嚢状物含有液に被験物質を入れ、前記被験物質と前記嚢状物とを接触させること、並びに、
　前記嚢状物含有液から前記嚢状物を取り出し、前記嚢状物の内腔に排出される被験物質又はその代謝物の濃度を測定すること、
を有する、方法。
（２）　前記ヒト肝細胞様細胞が、オルガノイド培養が可能な細胞である、（１）に記載の方法。
（３）　前記ヒト肝細胞様細胞が、ＢＳＥＰ、ＭＲＰ２、Ｐ－ｇｐ、ＭＡＴＥ、及びＢＣＲＰからなる群より選ばれる少なくとも１種のトランスポーターを有する、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）　前記工程３において、前記嚢状物の内腔に排出がされる被験物質又はその代謝物の濃度の測定を、前記嚢状物を分解して行う、（１）～（３）のいずれか一つに記載の方法。
（５）　前記工程３において、前記嚢状物の内腔に排出がされる前記被験物質又はその代謝物の濃度の測定を、液体クロマトグラフィー質量分析法により行う、（１）～（４）のいずれか一つに記載の方法。
（６）　前記嚢状物の内腔に胆汁を内容物として含む、（１）～（５）のいずれか一つに記載の方法。
（７）　前記ヒト肝細胞様細胞の膜が単層膜である、（１）～（６）のいずれか一つに記載の方法。
（８）　ヒト肝細胞様細胞の膜を有する嚢状物の製造方法であって、
　ヒト肝前駆細胞又はヒト肝臓細胞を細胞外マトリックスに包埋して培養し、培養物を形成すること、
　前記培養物を分散させて、分散物を形成すること、並びに、
　前記分散物を、培地の総体積に対して０～１０体積％の細胞外マトリックスが懸濁した培地で浮遊培養し、前記嚢状物を形成すること、
を有する、製造方法。
　上記態様の方法によれば、ヒト肝細胞様細胞による排出を評価するための評価モデルを用いた、被験物質のヒト肝細胞様細胞による排出を評価する方法を提供することができる。上記態様の製造方法によれば、ヒト肝細胞様細胞による排出を評価するための評価モデルを提供することができる。
図１は、実験例１における評価モデルの明視野画像である。 図２は、実験例１における嚢状物内にＲｈｏ１２３が取り込まれた評価モデルの画像である。（ａ）は明視野画像であり、（ｂ）は蛍光画像である。 図３は、実験例５における培養物の内腔にＲｈｏ１２３が取り込まれた培養物の画像である。（ａ）は明視野画像であり、（ｂ）は蛍光画像である。 図４は、嚢状物の光学顕微鏡画像である。 図５は、実験例６における培養物の内腔にＲｈｏ１２３が取り込まれた培養物の画像である。
　以下、実施形態を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施形態に何ら限定されるものではない。
　本明細書で例示する各成分、例えば、培地中に含まれる成分や各工程で用いられる成分は、特に言及しない限り、それぞれ１種を単独で用いることができ、又は２種以上を併用して用いることができる。
　本明細書で、「Ａ～Ｂ」等の数値範囲を表す表記は、「Ａ以上、Ｂ以下」と同義である。また、本明細書で、「Ａ～Ｂ、好ましくはａ～ｂ」等との数値範囲を表す表記は、「Ａ以上、Ｂ以下」、「Ａ以上、ｂ以下」、「ａ以上、Ｂ以下」、及び「ａ以上、ｂ以下」と同義である。
　本明細書において、「物質Ｘを含む培地」、「物質Ｘの存在下」とは、外来性（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）の物質Ｘが添加された培地、外来性の物質Ｘを含む培地、又は外来性の物質Ｘの存在下を意味する。すなわち、当該培地中に存在する細胞又は組織が当該物質Ｘを内在的（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）に発現、分泌又は産生する場合、内在的な物質Ｘは外来性の物質Ｘとは区別され、外来性の物質Ｘを含んでいない培地は内在的な物質Ｘを含んでいても「物質Ｘを含む培地」の範疇には該当しないものとする。
［被験物質のヒト肝細胞様細胞による排出を評価する方法］
　本実施形態の方法は、被験物質（以下、「基質」ともいう）のヒト肝細胞様細胞による排出を評価する方法（以下、「本実施形態の評価方法」ともいう）であって、以下の工程１～工程３を有する。
　インビトロで作製されたヒト肝細胞様細胞の膜を有する嚢状物（以下、「本評価モデル」ともいう）、及び０～１０体積％の懸濁された細胞外マトリックス、を含有する嚢状物含有液を準備すること（以下、「工程１」ともいう）；
　前記嚢状物含有液に被験物質を入れ、前記被験物質と前記嚢状物とを接触させること（以下、「工程２」ともいう）；
　前記嚢状物含有液から前記嚢状物を取り出し、前記嚢状物内に排出される被験物質又はその代謝物の濃度を測定すること（以下、「工程３」ともいう）。
　本評価モデルは、被験物質のヒト肝細胞用細胞による排出を評価する生体模倣モデル（Ｍｉｃｒｏ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｓｙｓｔｅｍ、ＭＰＳ）として好適に用いられる。生体模倣モデルは、生体内のヒト肝組織の構造を模倣するために、ヒト肝細胞に配向性を持たせて膜状に配置する必要がある。ヒト肝細胞に配向性を持たせて膜状に配置するためには、従来、細胞外マトリックスに包埋させた状態でヒト肝前駆細胞やヒト肝臓細胞を培養してきた。このようにして得られた嚢状物は、細胞外マトリックスに包埋された状態にある。
　排出により嚢状物内に取り込まれた被験物質の濃度を定量するために、嚢状物内に取り込まれた被験物質を取り出すとき、細胞外マトリックスを物理的に或いは酵素等を用いて化学的に取り除く必要がある。しかしながら、細胞外マトリックスを取り除く際に、嚢状物のヒト肝細胞様細胞膜が壊れて嚢状物内の被験物質が漏れ出る虞がある。一方で、細胞外マトリックスを取り除かずに、嚢状物から被験物質を取り出して、被験物質の濃度をＬＣ－ＭＳ等で定量する場合、細胞外マトリックスがノイズとなり、被験物質の量を正確に測定することができない。以上の理由から、従来の細胞外マトリックスで包埋された状態の嚢状物では、嚢状物内に排出された被験物質を定量することが困難であった。
　これに対して、本実施形態の評価方法では、嚢状物含有液中に０～１０体積％の細胞外マトリックスが存在するものの、嚢状物は細胞外マトリックスに包埋されていない。そのため、嚢状物含有液中から当該嚢状物を壊すことなく取り出して、当該嚢状物内に取り込まれた被験物質の濃度を容易に定量することができる。
　本実施形態の評価方法により、ヒト肝細胞様細胞による、被験物質の代謝、薬物相互作用、肝毒性、及びトランスポーター活性等を、従来、蛍光標識を有する基質や胆汁を用いて蛍光強度により行われてきた精度の低い評価から、液体クロマトグラフィー質量分析法による精度の高い定量的な評価を行うことができる。
〈工程１〉
　工程１では、インビトロで作製された本評価モデル、及び０～１０体積％の懸濁された細胞外マトリックス、を含有する嚢状物含有液を準備する。
　本評価モデルの嚢状物は、シスト（ｃｙｓｔ）ともいわれるものであり、図４に示すように、ヒト肝細胞様細胞の膜により形成される袋のような構造を有している。
　本評価モデルは、ヒト肝細胞様細胞の間に毛細胆管様構造が構築されていることが好ましい。ヒト肝細胞様細胞の間に毛細胆管様構造を有することで、タイトジャンクションを有することができる。
　本評価モデルの内腔は胆汁を内容物として含むことが好ましい。さらに、本評価モデルのヒト肝細胞様細胞は、ＢＳＥＰ（Ｂｉｌｅ　ｓａｌｔ　ｅｘｐｏｒｔ　ｐｕｍｐ）、ＭＲＰ２（Ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ　ＲＥＳＩＳＴＡＮＣＥ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　２）、Ｐ－ｇｐ（Ｐ－ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）、ＭＡＴＥ（Ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ　ａｎｄ　ｔｏｘｉｎ　ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ）、及びＢＣＲＰ（Ｂｒｅａｓｔ　ｃａｎｃｅｒ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ）からなる群より選ばれる少なくとも１種のトランスポーターを有することが好ましい。これらトランスポーターはそれぞれ異なる物質についての胆汁排出トランスポーターとして知られている。
　本評価モデルが毛細胆管様構造を有し、且つ、本評価モデルのヒト肝細胞様細胞が上述したトランスポーターを有することで、ヒト肝細胞様細胞内に取り込まれた被験物質又はその代謝物を上述したトランスポーターによりヒト肝細胞様細胞内から毛細胆管様構造を経て、ヒト肝細胞様細胞外へ排出し、胆汁と共に嚢状物の内腔に蓄積させることができる。
　本評価モデルのヒト肝細胞様細胞は、上述したトランスポーターに加えて、ＮＴＣＰ（Ｎａ＋－ｔａｕｒｏｃｈｏｌａｔｅ　ｃｏｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ　ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）、ＯＡＴＰ（ｏｒｇａｎｉｃ　ａｎｉｏｎ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ　ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）ファミリートランスポーター、ＯＣＴ１（ｏｒｇａｎｉｃ　ｃａｔｉｏｎ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ　１）等の取り込みトランスポーターを更に有することができる。
　本評価モデルのヒト肝細胞様細胞は、さらに、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、及びＣＹＰ３Ａ４等の代謝酵素の遺伝子を発現することができる。
　本評価モデルのヒト肝細胞様細胞の膜は単層膜であることが好ましい。ヒト肝細胞様細胞の膜が単層膜であることで、本評価モデルにより、一細胞あたりの被験物質の影響を評価することができる。
　本評価モデルの体積は、４ｅ－６～３ｅ－２ｍｍ３、好ましくは３ｅ－５～１ｅ－２ｍｍ３、より好ましくは１ｅ－４～４ｅ－３ｍｍ３である。
　本評価モデルのヒト肝細胞様細胞は、機能及び性状の安定性の観点から、オルガノイド培養することができる細胞であることが好ましい。オルガノイド培養とは、幹細胞の３次元自己組織化培養であり、オルガノイド培養によって得られた細胞は、オルガノイドともいう。
　嚢状物含有液中に含まれる、嚢状物の含有割合は、１０～２，０００個／ｍＬ、好ましくは、５０～１，０００個／ｍＬ、より好ましくは１００～５００個／ｍＬである。
　細胞外マトリックスとしては、基底膜に含まれる成分、細胞間隙に存在する糖タンパク質等が挙げられる。基底膜に含まれる成分としては、ＩＶ型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、及びエンタクチン等が挙げられる。
　嚢状物含有液中の細胞外マトリックスの含有割合は、嚢状物含有液の総体積に対して０～１０体積％であり、０．００１～５体積％であることが好ましく、０．１～４体積％であることがより好ましく、１～３体積％であることがさらに好ましい。
　嚢状物含有液は、後述する、「ヒト肝細胞様細胞の膜を有する嚢状物の製造方法」における、浮遊培養に用いられる培地、細胞外マトリックス、及びヒト肝細胞様細胞の膜を有する嚢状物を含む液であることが好ましい。
〈工程２〉
　工程２では、工程１で準備した嚢状物含有液に被験物質を入れ、被験物質と本評価モデルとを接触させる。
　被験物質としては、天然化合物ライブラリ、合成化合物ライブラリ、既存薬ライブラリ、及び代謝物ライブラリ等が挙げられる。被験物質には様々な分子サイズの有機化合物又は無機化合物を用いることができる。有機化合物の例としては、核酸、ペプチド、タンパク質、脂質（単純脂質、複合脂質（ホスホグリセリド、スフィンゴ脂質、グリコシルグリセリド、及びセレブロシド等）、プロスタグランジン、イソプレノイド、テルペン、ステロイド、ポリフェノール、カテキン、並びにビタミン（Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、Ｂ９、Ｂ１２、Ｃ、Ａ、Ｄ、及びＥ等）等が挙げられる。
　被験物質としては、医薬品や栄養食品等に含まれる成分が挙げられる。被験物質としては、植物抽出液、細胞抽出液、及び培養上清等が挙げられる。２種類以上の被験物質を同時に添加することにより、被験物質間の相互作用、相乗作用等を調べることもできる。被験物質としては天然物由来であってもよく、人工的に合成されたものであってもよい。
　被験物質と本評価モデルとを接触させる期間は、通常、１０分間以上３日間以下であり、３０分間以上１日間であることが好ましい。被験物質と本評価モデルとの接触は複数回に分けて行うことができる。
　被験物質は、本評価モデルのヒト肝細胞様細胞に取り込まれ、次いで、取り込まれた被験物質は、本評価モデルの内腔に排出されるか、取り込まれた被験物質は、本評価モデルのヒト肝細胞様細胞の代謝酵素により代謝されて、本評価モデルの内腔に排出される。
〈工程３〉
　工程３では、工程２後の嚢状含有液から本評価モデルを取り出し、本評価モデルの内腔に排出される被験物質又はその代謝物の濃度を測定する。
　濃度を測定する前に、嚢状含有液から取り出した本評価モデルを、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）等を用いて洗浄することが好ましい。これにより、濃度測定環境への細胞外マトリックスの持ち込みを低減することができる。
　取り出した本評価モデルはそのヒト肝細胞様細胞の膜を分解することで本評価モデルの内腔の被験物質を取り出すことが好ましい。ヒト肝細胞様細胞の膜を分解する方法としては、例えば、メタノール等を用いた化学的手法、及びホモジナイズ等の物理的手法が挙げられる。
　被験物質又はその代謝物の濃度の測定は、被験物質又はその代謝物の種類に応じて、質量分析、液体クロマトグラフィー、免疫学的手法等を採用することができる。免疫学的手法としては、例えば、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）等が挙げられる。中でも、被験物質又はその代謝物の濃度の測定は、定量性に優れることから、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）法により行うことが好ましい。
　工程３により、被験物質の毒性を評価するができる。例えば、被験物質を接触させた後のヒト肝細胞様細胞の状態を調べ、被験物質の毒性を評価する。ヒト肝細胞様細胞の評価方法としては、生存率、細胞形態、培養液中の肝障害マーカー（例えば、ＧＯＴ、ＧＰＴ）の存在量により行うことができる。
［ヒト肝細胞様細胞の膜を有する嚢状物の製造方法］
　本実施形態のヒト肝細胞様細胞の膜を有する嚢状物の製造方法（以下、「本実施形態の製造方法」ともいう）は、以下の工程Ａ～工程Ｃを有する。
　ヒト肝前駆細胞、又はヒト肝臓細胞を細胞外マトリックスに包埋して培養し、培養物を形成すること（以下、「工程Ａ」ともいう）；
　前記培養物を分散させて、分散物を形成すること（以下、「工程Ｂ」ともいう）；
　前記分散物を、培地の総体積に対して０～１０体積％の細胞外マトリックスが懸濁した培地で浮遊培養し、ヒト肝細胞様細胞の膜を有する嚢状物を形成すること（以下、「工程Ｃ」ともいう）。
　本実施形態の製造方法により製造されるヒト肝細胞様細胞の膜を有する嚢状物は、本実施形態の評価方法の本評価モデルとして使用することができる。
　本実施形態の製造方法の各工程について以下に詳細を説明する。
〈工程Ａ〉
　工程Ａでは、ヒト肝前駆細胞、又はヒト肝臓細胞を細胞外マトリックスに包埋して培養し、培養物を形成する。形成した培養物は、ヒト肝細胞様細胞を含有する。
　ヒト肝前駆細胞は、ヒト多能性幹細胞から、例えば、Ｗｎｔ、Ｎｏｄａｌ、アクチビンＡ等のTGFβシグナル伝達促進剤、及びこれらの任意の組み合わせ、から挙げられる因子を含む培地で培養することで、胚体内胚葉に分化誘導する。次いで、ＦＧＦ、ＢＭＰ、及びこれらの任意の組み合わせから挙げられる因子を含む培地で培養することで、ヒト肝前駆細胞を得ることができる。ヒト多能性幹細胞としては、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）及びヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）が挙げられる。
　ヒト肝臓細胞には、通常、肝実質細胞、並びに胆管細胞、類洞内皮細胞、クッパー細胞、中皮細胞、及び肝星細胞等の肝非実質細胞が含まれている。これらの中でも、肝非実質細胞が含まれていることが好ましい。
　遺伝子の表現型がワイルドタイプのヒト肝細胞に近いヒト肝細胞様細胞を得ることができることから、工程Ａとしては、ヒト肝臓細胞を用いることが好ましい。
　ヒト肝前駆細胞又はヒト肝臓細胞は、細胞外マトリックスに包埋させて培養することで、増殖及び成熟化させて、ヒト肝細胞様細胞を形成する。細胞外マトリックスとしては、工程１において例示されたものと同様のものが挙げられる。
　ヒト肝前駆細胞又はヒト肝臓細胞を細胞外マトリックスに包埋させて培養する方法としては、ヒト肝前駆細胞又はヒト肝臓細胞と細胞外マトリックス前駆体とを混合し、細胞外マトリックス前駆体を重合させて細胞外マトリックスを形成し、次いで、培地を重層して培養する方法が挙げられる。
　工程Ａにおける培養条件としては、通常、３０℃以上４０℃以下、好ましくは３７℃の温度である。その他培養条件としては、通常、５体積％程度のＣＯ２濃度条件雰囲気下で行う。
　培養時間は細胞数や細胞の状態等に応じて、適宜調整することができる。培地は、１日～３日おきに交換することができる。また、工程Ａにおいて、複数回に亘って継代培養を行うことで、機能及び性状が安定した培養物が得られる。
　工程Ａの培養はオルガノイド培養であることが好ましい。オルガノイド培養によって得られたオルガノイドは、トランスポーターの発現量や、代謝酵素の遺伝子の発現量が多く、また、嚢状物のヒト肝細胞様細胞の膜は、経上皮電気抵抗が高く、タイトジャンクションを形成することができる。
（培地）
　工程Ａに用いる培地としては、分裂促進的増殖因子、Ｗｎｔシグナル伝達促進剤、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）シグナル伝達阻害剤、ＩＬ－６ファミリーサイトカイン、及びニコチンアミド等の増殖に関する因子；トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ－β）シグナル伝達阻害剤等の分化を抑制する因子；レチノイン酸、ＤＡＰＴ（γ－ｓｅｃｒｅｔａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、及びデキサメタゾン（Ｄｅｘ）等の成熟化に関する因子；、並びにフォルスコリン等の細胞受容体の活性化に関する因子；からなる群より選ばれる少なくとも１種以上を含むことが好ましい。
　ヒト肝前駆細胞を培養する場合、培地には、成熟化に関する因子を含有することが好ましく、ＤＡＰＴ、ＤＭＳＯ及びＤｅｘから選ばれる少なくとも１種の因子を含有することが好ましい。
　ヒト肝臓細胞を培養する場合、培地には、成熟化に関する因子、増殖に関する因子、分化を抑制する因子、及び細胞受容体の活性化に関する因子を含有することが好ましく、成熟化に関する因子として、ＤＡＰＴを、増殖に関する因子として、ＩＬ－６ファミリーサイトカイン、分裂促進的増殖因子、Ｗｎｔシグナル伝達促進剤、及びＲＯＣＫシグナル伝達阻害剤を、含有することが好ましい。
（１）分裂促進的増殖因子
　分裂促進的増殖因子は、細胞分裂の開始を誘導する因子である。分裂促進的増殖因子としては、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）等が挙げられる。ＦＧＦとしては、ＦＧＦ受容体２（ＦＧＦＲ２）又はＦＧＦ受容体４（ＦＧＦＲ４）に結合することができるものが好ましく、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４、ＦＧＦ７又はＦＧＦ１０であることが好ましく、ＦＧＦ１０であることが特に好ましい。これらの中でも、ＥＧＦ、ＦＧＦ１０又はＨＧＦが好ましく、ＥＧＦ、ＦＧＦ１０及びＨＧＦを全て含むことがより好ましい。
　培地中に含まれるＥＧＦ及びＨＧＦそれぞれの濃度は、通常、１０ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬであり、１５ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬであることが好ましく、２０ｎｇ／ｍＬ～８０ｎｇ／ｍＬであることがより好ましく、２５ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬであることがさらに好ましい。
　培地中に含まれるＦＧＦの濃度は、通常、２０ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬであり、５０ｎｇ／ｍＬ～３００ｎｇ／ｍＬであることが好ましく、８０ｎｇ／ｍＬ～１５０ｎｇ／ｍＬであることがより好ましく、９０ｎｇ／ｍＬ～１１０ｎｇ／ｍＬであることがさらに好ましい。
（２）Ｗｎｔシグナル伝達促進剤
　Ｗｎｔシグナルは、幹細胞の増殖や未分化性の維持に関するシグナルである。Ｗｎｔシグナル伝達促進剤により、ｗｎｔシグナルを上方制御することができる。Ｗｎｔシグナル伝達促進剤としては、例えば、Ｗｎｔアゴニスト、Ｌｇｒ５アゴニスト、グリコーゲン合成酵素（ＧＳＫ）阻害剤等が挙げられる。
　Ｗｎｔアゴニストとしては、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、及びＷｎｔ１６等のＷｎｔファミリーメンバーが挙げられる。これらの中でも、Ｗｎｔ３ａが好ましい。
　Ｗｎｔファミリーメンバーの安定化及び可溶化には、アファミン（Ａｆａｍｉｎ）が寄与していることが知られている。Ｗｎｔアゴニストとしては、Ｗｎｔファミリーメンバーとアファミンとの複合体として用いることができる。
　培地中に含まれるＷｎｔアゴニストの含有割合は、培地の総体積に対して、通常、１体積％～５０体積％であり、１０体積％～３０体積％であることが好ましく、１５体積％～２５体積％であることがより好ましい。
　Ｌｇｒ５アゴニストとしては、Ｒ－スポンジン１、Ｒ－スポンジン２、Ｒ－スポンジン３、及びＲ－スポンジン４等が挙げられる。これらの中でも、Ｒ－スポンジン１が好ましい。
　培地中に含まれるＬｇｒ５アゴニストの含有割合は、培地の総体積に対して、通常、１体積％～５０体積％であり、５体積％～３０体積％であることが好ましく、５体積％～１５体積％がさらに好ましい。
　ＧＳＫ阻害剤としては、ＣＨＩＲ９９０２１（ＣＡＳ番号：２５２９１７－０６－９）、ＳＢ２１６７６３（ＣＡＳ番号：２８０７４４－０９－４）、ＳＢ４１５２８６（ＣＡＳ番号：２６４２１８－２３－７）、ＣＨＩＲ９８０１４（ＣＡＳ番号：２５２９３５－９４－７）、ＡＺＤ１０８０（ＣＡＳ番号：６１２４８７－７２－６）、及びＬＹ２０９０３１４（ＣＡＳ番号：６０３２８８－２２－８）等が挙げられる。これらの中でも、ＣＨＩＲ９９０２１が好ましい。
　培地中に含まれるＧＳＫ阻害剤の濃度は、通常、０．１μＭ～１０μＭである。なお、ここで「Ｍ」はｍｏｌ／Ｌを意味し、以降同様である。
　Ｗｎｔシグナル伝達促進剤としては、Ｗｎｔアゴニスト及びＬｇｔ５アゴニストを組み合わせて用いることが好ましい。
（３）ＲＯＣＫシグナル伝達阻害剤
　ＲＯＣＫシグナルの下方制御により、肝細胞は増殖能を獲得することができる。ＲＯＣＫシグナル伝達阻害剤としては、Ｙ－２７６３２（ＣＡＳ番号：１４６９８６－５０－７）、ファスジル（Ｆａｓｕｄｉｌ）（ＣＡＳ番号：１０５６２８－０７－７）、Ｙ３９９８３（ＣＡＳ番号：２０３９１１－２６－６）、Ｗｆ－５３６（ＣＡＳ番号：５３９８５７－６４－２）、ＳＬｘ－２１１９（ＣＡＳ番号：９１１４１７－８７－３）、アザベンゾイミダゾール－アミノフラザン（Ａｚａｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｅ－ａｍｉｎｏｆｕｒａｚａｎｓ）（ＣＡＳ番号：８５０６６４－２１－０）、ＤＥ－１０４、Ｈ－１１５２Ｐ（ＣＡＳ番号：８７２５４３－０７－６）、Ｒｈｏキナーゼα阻害剤（ＲＯＫα　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、ＸＤ－４０００、ＨＭＮ－１１５２、４－（１－アミノアルキル）－Ｎ－（４－ピリジル）シクロヘキサンーカルボキシアミド（４－（１－ａｍｉｎｏａｌｋｙｌ）－Ｎ－（４－ｐｙｒｉｄｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅｓ）、Ｒｈｏスタチン（Ｒｈｏｓｔａｉｎ）、ＢＡ－２１０、ＢＡ－２０７、Ｋｉ－２３０９５、及びＶＡＳ－０１２等が挙げられる。これらの中でも、Ｙ－２７６３２が好ましい。
　培地中に含まれるＲＯＣＫシグナル伝達阻害剤の濃度は、通常、１μＭ～２０μＭであり、５μＭ～１５μＭであることが好ましい。
（４）ＴＧＦ－βシグナル伝達阻害剤
　ＴＧＦ－βシグナルの下方制御により、分化を抑制することができる。ＴＧＦ－βシグナル伝達阻害剤としては、Ｓｍａｄ２／３のリン酸化を伴うＴＧＦ－β阻害剤、及びＳｍａｄ１／５／９のリン酸化を伴うＢＭＰ阻害剤等が挙げられる。
　ＴＧＦ－β阻害剤としては、Ａ８３－０１（ＣＡＳ番号：９０９９１０－４３－６）、ＳＢ－４３１５４２（ＣＡＳ番号：３０１８３６－４１－９）、ＳＢ－５０５１２４（ＣＡＳ番号：６９４４３３－５９－５）、ＳＢ－５２５３３４（ＣＡＳ番号：３５６５５９－２０－１）、ＬＹ３６４９４７（ＣＡＳ番号：３９６１２９－５３－６）、ＳＤ－２０８（ＣＡＳ番号：６２７５３６－０９－８）、ＳＪＮ２５１１（ＣＡＳ番号：４４６８５９－３３－２）等が挙げられる。これらの中でも、Ａ８３－０１が好ましい。
　培地中に含まれるＴＧＦ－β阻害剤の濃度は、通常、０．０５μＭ～５０μＭであり、０．５μＭ～３０μＭであることが好ましく、１μＭ～１５μＭであることがより好ましく、４μＭ以上６μＭ以下がより好ましい。
　ＢＭＰ阻害剤としては、ノギン（Ｎｏｇｇｉｎ）、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ－ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ｇｅｎｅ　Ａｂｅｒｒａｔｉｖｅ　ｉｎ　Ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ（ＤＡＮ）、及びＤＡＮ様タンパク質等が挙げられる。これらの中でも、ノギンが好ましい。
　培地中に含まれるＢＭＰ阻害剤の濃度は、通常、１０ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬであり、１５ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬであることが好ましく、２０ｎｇ／ｍＬ～３０ｎｇ／ｍＬであることがより好ましい。
（５）ＩＬ－６ファミリーサイトカイン
　ＩＬ－６ファミリーサイトカインにより、ヒト肝前駆細胞の増殖を亢進させることができる。ＩＬ－６ファミリーサイトカインとしては、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、インターロイキン－１１（ＩＬ－１１）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、カルジオトロピン－１（ＣＴ－１)、及び毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）等が挙げられる。これらの中でも、ＩＬ－６が好ましい。
　培地中に含まれるＩＬ－６ファミリーサイトカインの濃度は、通常、１０ｎｇ／ｍＬ～１．０μｇ／ｍＬであり、５０ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬであることが好ましく、８０ｎｇ／ｍＬ～２００ｎｇ／ｍＬであることがより好ましく、９０ｎｇ／ｍＬ～１１０ｎｇ／ｍＬであることがさらに好ましい。
（６）レチノイン酸
　培地中にレチノイン酸を含有することにより、毛細胆管を増大させ細胞の配向性を増大させることができる。
　培地中に含まれるレチノイン酸の濃度は、通常、１μＭ～３０μＭである。
（７）ニコチンアミド
　培地中にニコチンアミドを含有することで、細胞増殖能を向上させることができる。
　培地中に含まれるニコチンアミドの濃度は、通常、５ｍＭ以下である。
（８）フォルスコリン
　培地中にフォルスコリン（Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）を更に含むことで、ＡＭＰの細胞内濃度を高めることができ、その結果、細胞受容体を再活性化することができる。
　培地中に含まれるフォルスコリンの濃度は、通常、０．１μＭ～１００μＭであり、１μＭ～５０μＭであることが好ましく、５μＭ～１５μＭであることがより好ましい。
（９）ＤＡＰＴ、ＤＭＳＯ及びＤｅｘ
　培地中にＤＡＰＴ、ＤＭＳＯやＤｅｘを含有することで、ヒト肝細胞様細胞への成熟化を亢進させることができる。
（１０）その他成分
　培地は、上記成分の他に、ガストリン、神経生物系サプリメント、及びＮ－アセチルシステイン等を更に含むことができる。
　神経生物系サプリメントとしては、Ｂ２７サプリメント（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、及びＮ２サプリメント（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）等のインシュリンを含むサプリメントが挙げられる。
　培地は、基本培地に上述の各成分を添加して調製することができる。基本培地としては、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、基礎培地（ＭＥＭ）、ノックアウト－ＤＭＥＭ（ＫＯ－ＤＭＥＭ）、グラスゴー基本培地（Ｇ－ＭＥＭ）、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）、ＤＭＥＭ／ハムＦ１２、Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＤＭＥＭ／ハムＦ１２（Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＤＭＥＭ／Ｆ１２）、イスコフ改変ダルベッコ培地、ハムＦ－１０、ハムＦ－１２、１９９培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、及びヒト血漿模倣培地等が挙げられる。
〈工程Ｂ〉
　工程Ｂでは、工程Ａで形成された培養物を分散させて、分散物を形成する。
　工程Ａで形成された培養物は、細胞外マトリックスで包埋されたものである。工程Ｂでは、細胞外マトリックスを破砕して培養物を取り出す。細胞外マトリックスを破砕する方法としては、細胞外マトリックスを物理的に破砕する方法、及び酵素を用いて化学的に破砕する方法が挙げられる。これらの中でも細胞へのダメージが少ないことから、細胞外マトリックスを物理的に破砕する方法が好ましい。
　次いで、細胞外マトリックスから取り出された培養物を分散させて、分散物を形成する。分散とは、細胞を酵素処理や物理処理等の分散処理により、１００個以下の細胞集団、好ましくは５０個以下の細胞集団、より好ましくは単一細胞に分離させることをいう。分散処理としては、機械的分散処理、細胞分散液処理、及び細胞保護剤添加処理等が挙げられる。これらの処理は、適宜、組み合わせることができる。これらの中でも、細胞分散液処理が好ましい。
　細胞分散液処理に用いる細胞分散液としては、例えば、トリプシン、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼ、プロナーゼ、ＤＮａｓｅ、及びパパイン等の酵素類；エチレンジアミン四酢酸等のキレート剤；のいずれかを含む溶液が挙げられる。市販の細胞分散液としては、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製のＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ、ＴｒｙｐＬＥ　Ｅｘｐｒｅｓｓ等が挙げられる。機械的分散処理としては、ピペッティング処理又はスクレーパーでの掻き取り操作が挙げられる。
　分散処理する前に、細胞死を防ぐために、細胞保護剤で処理することができる。細胞保護剤としては、線維芽細胞増殖因子（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ、以下、「ＦＧＦ」ともいう）、ヘパリン、ＲＯＣＫ阻害剤、インスリン様成長因子（Ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ、以下「ＩＧＦ」ともいう）、血清、及び血清代替物等が挙げられる。
〈工程Ｃ〉
　工程Ｃでは、工程Ｂで形成された分散物を、培地の総体積に対して０～１０体積％の細胞外マトリックスが懸濁した培地で浮遊培養し、ヒト肝細胞様細胞を有する嚢状物を形成する。
　工程Ｃにおける細胞外マトリックスとしては、上記工程１において例示された細胞外マトリックスと同様のものが挙げられる。
　工程Ｃにおける培地中に含まれる細胞外マトリックスの含有割合としては、培地の総体積に対して０～１０体積％であり、０．００１～５体積％であることが好ましく、０．１～４体積％であることがより好ましく、１～３体積％であることがさらに好ましい。
　細胞外マトリックスの懸濁方法としては、培地と、細胞外マトリックス前駆体を混和し、次いで、細胞外マトリックス前駆体をゲル化させて細胞外マトリックスとする方法が挙げられる。細胞外マトリックス前駆体を混和させる方法としては、氷浴上でピペッティング方法が挙げられる。混和とは、目視で培地中に細胞外マトリックスが観察されない状態を意味する。
　工程Ｃにおける培地としては、上記工程Ａで例示された培地が挙げられる。
　工程Ｃにおける培養条件としては、動物細胞の培養において一般に採用されている条件とすることができる。例えば、３０℃以上４０℃以下、好ましくは３７℃の温度で、５体積％のＣＯ２濃度雰囲気条件下が挙げられる。
　培養時間は細胞数や細胞の状態等に応じて、適宜調整することができる。培養開始から通常、１日間以上１週間以下である。
　本実施形態の製造方法により製造されるヒト肝細胞様細胞の膜を有する嚢状物を、本実施形態の評価方法の本評価モデルとして使用する場合、工程Ｃの培養後の培地には、本評価モデル及び０～１０体積％の懸濁された細胞外マトリックスが含まれていることから、この培地を本実施形態の評価方法における工程１の嚢状物含有液として用いることができる。
　以下、実験例により本発明を説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。
［実験例１］
（ヒト肝臓細胞の培養物の作製）
　ヒト初代凍結浮遊肝細胞（ＢＩＯＰＲＲＩＤＩＣ社製、ＨＥＰ１８７－Ｓ）を３７℃のウォーターバスで融解し、無血清培地（Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＤＭＥＭ／Ｆ１２にＨＥＰＥＳ、ＧＬＵＴＡＭＡＸ、ＰＥＮＩＣＩＬＩＮ／ＳＴＥＲＥＰＴＯＭＹＣＩＮを加えた培地）を加えた５０ｍＬチューブに懸濁して遠心した。遠心後、上清を除き、その後、無血清培地で懸濁し、ヒト肝臓細胞懸濁液を調製した。この懸濁液から２０，０００個のヒト肝臓細胞を５０μＬのマトリゲル（ＢＤバイオサイエンス社）と混合し、２４ウェル組織培養プレートに播種し、マトリゲルが完全に重合するまで３７℃で１０分間インキュベートした。重合した後に、下記表１に示す５００μＬの培地を重層して３７℃、５体積％ＣＯ２存在下で培養し、ヒト肝臓細胞の培養物を得た。得られた培養物はヒト肝細胞様細胞からなる膜による内腔を形成していた。得られた培養物は、同様の操作を繰り返して行い、継代培養した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
［実験例２］
（嚢状物（本評価モデル）の製造）
　６ウェル培養プレート（住友ベークライト社製、ＭＳ―８００６Ｒ）に、実験例１の継代培養後のヒト肝臓細胞の培養物と、表１の培地と、培地に対して２体積％のマトリゲルを添加し、５体積％ＣＯ２存在下、３７℃で３日間浮遊培養し、嚢状物を形成した。嚢状物を光学顕微鏡（倍率：４００倍（ＫＥＹＥＮＣＥ社製、ＢＺ－Ｘ７００））で撮像した本評価モデルの明視野画像を図１に示す。
［実験例３］
（本評価モデルのＲｈｏ１２３の排出）
　実験例２において、浮遊培養後の培養液にＰ糖タンパク質（Ｐ－ｇｐ）の基質であるＲｈｏ１２３（１０μＭ）を加えた。５体積％ＣＯ２存在下、３７℃で３０分間、本評価モデルの内腔へのＲｈｏ１２３の取り込みを行った。ピペッティングにて低吸着１５ｍＬチューブに本評価モデルを含む培養液を入れ、遠心した。遠心後、上清を除き、ＰＢＳで洗浄した後、光学顕微鏡（倍率：４００倍（ＫＥＹＥＮＣＥ社製、ＢＺ－Ｘ７００））にて本評価モデルの内腔にＲｈｏ１２３が排出されていることを確認した。明視野画像（図２（ａ））及び蛍光画像（図２（ｂ））を図２に示す。
　図２に示すように、本評価モデルの内腔にＲｈｏ１２３が排出されていることが確認された。
［実験例４］
（本評価モデルの内腔に取り込まれたＲｈｏ１２３の定量）
　実験例３のＲｈｏ１２３が取り込まれた本評価モデルとメタノールとを混和してヒト肝細胞様細胞を死滅させた。混和後、遠心し、上澄みを抽出した。上澄みについて液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ／ＭＳ）計（ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製、ＬＣＭＳＴＭ－８０４０）による分析を行い、内腔に取り込まれたＲｈｏ１２３の濃度及び量、並びに培養液中のＲｈｏ１２３の濃度から、本評価モデルの内腔に輸送された割合を算出した。ＬＣ／ＭＳ分析条件を以下に、結果を表３に示す。
（ＬＣ条件）
　カラム：Ｘｂｒｉｄｇｅ　Ｃ１８　３．５μｍ、２．１ｍｍ×５０ｍｍ
　カラム温度：４０℃
　内部標準物質：トルブタミン
　溶出溶媒：Ａ液（０．１質量％のギ酸溶液）、Ｂ液（アセトニトリル）
　グラジエント条件：表２参照
　ランタイム：７分間
　流速：０．４ｍＬ／分
　インジェクション量：３μＬ
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（ＭＳ条件）
　モード：ポジティブ（※標準物質はネガティブ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３に示すように、本評価モデルの内腔に取り込まれたＲｈｏ１２３の量を定量することができ、また、培養液中のＲｈｏ１２３のうち、本評価モデルの内腔に輸送された割合を算出することができた。
［実験例５］
　実験例１で作製された、培養後のマトリゲルで包埋された培養物を含む培養液にＲｈｏ１２３（１０μＭ）を添加して、５体積％ＣＯ２存在下、３７℃で３０分間、培養物の内腔内へのＲｈｏ１２３の取り込みを行った。培養物の内腔にＲｈｏ１２３が取り込まれたことを光学顕微鏡（倍率：４００倍（ＫＥＹＥＮＣＥ社製、ＢＺ－Ｘ７００））で確認した。明視野画像（図３（ａ））及び蛍光画像（図３（ｂ））を図３に示す。
　取り込まれたＲｈｏ１２３の量を測定するために、重合したマトリゲルをピペッティング及び酵素処理（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）　セルリカバリーソリューション）により分解したところ、マトリゲルの分解と共に肝臓オルガノイドから取り込まれたＲｈｏ１２３が漏洩し、取り込まれたＲｈｏ１２３の量を測定することができなかった。
［実験例６］
（本評価モデルのＣＤＦＤＡの排出）
　実験例２において、浮遊培養後の培養液にＭＲＰ２の基質であるＣＤＦＤＡ（Ｃａｒｂｏｘｙｄｉｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　Ｄｉａｃｅｔａｔｅ）を、２μＭ、５μＭ、又は１０μＭ加えた。５体積％ＣＯ２存在下、３７℃で３０分間、本評価モデルの内腔へのＣＤＦＤＡの取り込みを行った。ピペッティングにて低吸着１５ｍＬチューブに本評価モデルを含む培養液を入れ、遠心した。遠心後、上清を除き、ＰＢＳで洗浄した後、光学顕微鏡（倍率：４００倍（ＫＥＹＥＮＣＥ社製、ＢＺ－Ｘ７００））にて本評価モデルの内腔にＣＤＦＤＡが排出されていることを確認した。結果を図５に示す。
　本実施形態の方法によれば、ヒト肝細胞様細胞による排出を評価するための評価モデルを用いた、被験物質のヒト肝細胞様細胞による代謝又は排出を評価する方法を提供することができる。

Claims (8)

  1. 　被験物質のヒト肝細胞様細胞による排出を評価する方法であって、
    　インビトロで作製されたヒト肝細胞様細胞の膜を有する嚢状物、及び０～１０体積％の懸濁された細胞外マトリックス、を含有する嚢状物含有液を準備すること、
    　前記嚢状物含有液に被験物質を入れ、前記被験物質と前記嚢状物とを接触させること、並びに、
    　前記嚢状物含有液から前記嚢状物を取り出し、前記嚢状物の内腔に排出される被験物質又はその代謝物の濃度を測定すること、
    を有する、方法。
  2. 　前記ヒト肝細胞様細胞が、オルガノイド培養が可能な細胞である、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記ヒト肝細胞様細胞が、ＢＳＥＰ、ＭＲＰ２、Ｐ－ｇｐ、ＭＡＴＥ、及びＢＣＲＰからなる群より選ばれる少なくとも１種のトランスポーターを有する、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　前記工程３において、前記嚢状物の内腔に排出がされる被験物質又はその代謝物の濃度の測定を、前記嚢状物を分解して行う、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 　前記工程３において、前記嚢状物の内腔に排出がされる前記被験物質又はその代謝物の濃度の測定を、液体クロマトグラフィー質量分析法により行う、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 　前記嚢状物の内腔に胆汁を内容物として含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 　前記ヒト肝細胞様細胞の膜が単層膜である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 　ヒト肝細胞様細胞の膜を有する嚢状物の製造方法であって、
    　ヒト肝前駆細胞又はヒト肝臓細胞を細胞外マトリックスに包埋して培養し、培養物を形成すること、
    　前記培養物を分散させて、分散物を形成すること、並びに、
    　前記分散物を、培地の総体積に対して０～１０体積％の細胞外マトリックスが懸濁した培地で浮遊培養し、前記嚢状物を形成すること、
    を有する、製造方法。
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