WO2022114128A1 - 立体的細胞組織の製造方法及び立体的細胞組織 - Google Patents

立体的細胞組織の製造方法及び立体的細胞組織 Download PDF

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    • C12N2533/56—Fibrin; Thrombin

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a three-dimensional cell tissue and a three-dimensional cell tissue.
  • the present application claims priority with respect to Japanese Patent Application No. 2020-196310 filed in Japan on November 26, 2020, the contents of which are incorporated herein by reference.
  • the inventors of the present application have previously obtained a mixture in which cells are suspended in a solution containing at least a cationic buffer, an extracellular matrix component and a polymer electrolyte, and the cells are obtained from the obtained mixture.
  • a technique for producing a three-dimensional cell tissue which includes a step of collecting cells to form a cell aggregate on a substrate and a step of culturing the cells to obtain a three-dimensional cell tissue (for example, Patent Document 1). reference).
  • the three-dimensional cell tissue can be used for various assays such as drug screening by using it for, for example, a biological tissue model and a solid cancer model.
  • an object of the present invention is to provide a technique for suppressing a decrease in the thickness of a three-dimensional cell tissue over time.
  • the present invention includes the following aspects.
  • a step of obtaining a mixture containing cells, a cationic substance, an extracellular matrix component, and a polymer electrolyte a step of gelling the mixture to obtain a gel-like composition, and an incubation of the gel-like composition.
  • a method for producing a steric cell tissue which comprises a step of obtaining a steric cell tissue.
  • the gel-like composition contains a gel-like component in which at least one selected from the group consisting of the extracellular matrix component, agarose, pectin and fibrin monomer is gelled.
  • the steps for obtaining the gel-like composition include a step of adding the thrombin to the mixture and a step of adding the fibrinogen to the mixture to which the thrombin is added, and as a result, the fibrin gel is formed and the mixture is formed.
  • the polyelectrolyte is selected from the group consisting of glycosaminoglycan, dextran sulfate, ramnan sulfate, fucoidan, caraginan, polystyrene sulfonic acid, polyacrylamide-2-methylpropane sulfonic acid, polyacrylic acid and combinations thereof.
  • the production method according to any one of [1] to [6].
  • [8] The production method according to any one of [1] to [7], wherein the content of the polyelectrolyte in the mixture is 0.005 mg / mL or more.
  • a step of applying an external force to the mixture to obtain a cell aggregate containing the cells, the cationic substance, the extracellular matrix component and the polymer electrolyte Prior to the step of obtaining the gel-like composition, a step of applying an external force to the mixture to obtain a cell aggregate containing the cells, the cationic substance, the extracellular matrix component and the polymer electrolyte.
  • Method [10] A steric cell tissue containing cells, a cationic substance, an extracellular matrix component, a polyelectrolyte and a gel-like component.
  • the gel-like component is a gel-like component in which at least one selected from the group consisting of a first extracellular matrix component, agarose, pectin and a fibrin monomer is gelled.
  • Cellular tissue [13] Further, a second extracellular matrix component is contained, and the gel-like component is a gel-like component in which at least one selected from the group consisting of agarose, pectin and fibrin monomer is gelled [11].
  • the maximum value of the thickness of the section obtained along the line passing through the center of gravity when viewed from the upper surface of the three-dimensional cell tissue on the 8th day after production is from the upper surface of the three-dimensional cell tissue immediately after production.
  • the present invention comprises a step of obtaining a mixture containing cells, a cationic substance, an extracellular matrix component and a polymer electrolyte, a step of gelling the mixture to obtain a gel-like composition, and the above-mentioned gel state.
  • a method for producing a steric cell tissue comprising a step of incubating the composition to obtain a steric cell tissue.
  • the production method of the present embodiment it is possible to suppress a decrease in the thickness of the three-dimensional cell tissue over time.
  • the maximum value of the thickness of the section obtained along the line passing through the center of gravity when viewed from the upper surface of the three-dimensional cell tissue on the 8th day after production is immediately after production. It is possible to maintain 80% or more of the maximum value of the thickness of the section obtained along the line passing through the center of gravity when viewed from the upper surface of the three-dimensional cell tissue.
  • the maximum value of the three-dimensional cell tissue on the eighth day after production is a line passing through the center of gravity when the three-dimensional cell tissue 8 days after the start of incubation of the gel-like composition is viewed from above.
  • the maximum value of the thickness of the three-dimensional cell tissue measured in the section obtained by cutting the three-dimensional cell tissue is obtained by cutting the three-dimensional cell tissue along a line passing through the center of gravity when the three-dimensional cell tissue immediately after the start of incubation of the gel-like composition is viewed from above. It can also be said to be the maximum value of the thickness of the three-dimensional cell tissue measured in the obtained section.
  • immediately after the production of the three-dimensional cell tissue may be 5 minutes to 72 hours after the start of incubation of the gel-like composition, and 1 day (preferably 24 hours) after the start of incubation. May be good.
  • the 8th day from the production may be the 8th day (preferably 192 hours) after the incubation of the gelled composition is started.
  • the thickness of the section obtained along the line passing through the center of gravity when viewed from the upper surface of the three-dimensional cell tissue is the thickness of the section in the substantially central part of the three-dimensional cell tissue.
  • the shape of the three-dimensional cell tissue varies depending on the container used for producing the three-dimensional cell tissue. For example, when the three-dimensional cell tissue is produced using a cylindrical cell culture insert, the shape becomes a columnar shape. In this case, the shape of the three-dimensional cell tissue when viewed from above is a circle, and the center of gravity when viewed from above is the center of the circle.
  • the shape of the three-dimensional cell tissue is not limited to the cylindrical shape, and can be any shape depending on the purpose. Specifically, for example, a polygonal prism shape such as a triangular prism shape and a quadrangular prism shape can be exemplified.
  • the thickness of the section obtained along the line passing through the center of gravity when viewed from the upper surface of the three-dimensional cell tissue is measured as follows.
  • Each steric cell tissue is fixed to the cultured cell aggregate using formarin buffer (for example, model number "062-01661", Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • the center of gravity when viewed from the upper surface of the three-dimensional cell tissue (in the case of producing the three-dimensional cell tissue using the cell culture insert, the upper surface of the cell culture insert).
  • the sliced sections are stained with hematoxylin and eosin (also referred to as HE) and observed under a microscope to measure the maximum thickness of the three-dimensional cell tissue.
  • HE hematoxylin and eosin
  • three-dimensional cell tissue means a collection of three-dimensional cells.
  • Applications of the three-dimensional cell tissue include, but are not limited to, a biological tissue model and a solid cancer model.
  • biological tissue models include models of skin, hair, bone, cartilage, teeth, cornea, blood vessels, lymph vessels, heart, liver, pancreas, nerves, and esophagus.
  • solid cancer model include models of gastric cancer, esophageal cancer, colon cancer, colon cancer, rectal cancer, pancreatic cancer, breast cancer, ovarian cancer, prostate cancer, renal cell cancer, and liver cancer.
  • the morphology of the three-dimensional cell tissue is not particularly limited, and may be, for example, a three-dimensional cell tissue formed by culturing cells inside a container such as a cell culture insert, or a natural biopolymer such as collagen. It may be a three-dimensional cell tissue formed by culturing cells in a scaffold composed of a synthetic polymer or a cell aggregate (also referred to as a spheroid), or a sheet-like cell structure. It may be a body.
  • the method for producing a three-dimensional cell tissue of the present embodiment is a step (a) of obtaining a mixture containing cells, a cationic substance, an extracellular matrix component and a polymer electrolyte, and gelling the mixture to obtain a gel-like composition.
  • the step (b) of obtaining and the step (c) of incubating the gel-like composition to obtain a steric cell tissue are included.
  • each step will be described.
  • step (a) a mixture containing cells, a cationic substance, an extracellular matrix component and a polyelectrolyte is obtained.
  • Mixing of cells, cationic substances, extracellular matrix components and polyelectrolytes may be carried out in an aqueous solvent.
  • aqueous solvents include, but are not limited to, water, buffers and media.
  • the cells are not particularly limited, and cells derived from mammals such as humans, monkeys, dogs, cats, rabbits, pigs, cows, mice and rats can be used.
  • the origin of the cell is not particularly limited, and may be a somatic cell derived from bone, muscle, internal organs, nerve, brain, skin, blood, etc., a germ cell, or a cancer cell. ..
  • somatic cells derived from blood include immune cells such as lymphocytes, neutrophils, macrophages and dendritic cells.
  • cancer cells include gastric cancer, esophageal cancer, colon cancer, colon cancer, rectal cancer, pancreatic cancer, breast cancer, ovarian cancer, prostate cancer, renal cell cancer, liver cancer and the like.
  • the cells may be pluripotent stem cells such as induced pluripotent stem cells (iPS cells) and embryonic stem cells (ES cells), or may be tissue stem cells.
  • pluripotent stem cells such as induced pluripotent stem cells (iPS cells) and embryonic stem cells (ES cells)
  • ES cells embryonic stem cells
  • the cell may be a primary cell, or may be a cultured cell such as a subcultured cell or a cell line cell.
  • one type of cell may be used alone, or a plurality of types may be mixed and used.
  • Cationic substance As the cationic substance, a substance having an arbitrary positive charge can be used as long as it does not adversely affect the growth of cells and the formation of cell aggregates described later.
  • Cationic substances include cationic buffers such as tris-hydrochloride, tris-maleic acid, bis-tris, and HEPES, ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, polyvinylamine, polyallylamine, polylysine, polyhistidine, polyarginine, and the like. However, it is not limited to these. Of these, a cationic buffer is preferable, and Tris-hydrochloric acid is more preferable.
  • the concentration of the cationic substance in the mixture in the step (a) is not particularly limited as long as it does not adversely affect the growth of cells and the formation of cell aggregates.
  • the concentration of the cationic substance used in this embodiment is preferably 10 to 100 mM with respect to the total volume of the mixture, for example, 20 to 90 mM, for example, 30 to 80 mM, for example, 40. It may be ⁇ 70 mM, for example 45-60 mM.
  • the pH of the cationic buffer is not particularly limited as long as it does not adversely affect the growth of cells and the formation of cell aggregates.
  • the pH of the cationic buffer used in this embodiment is preferably 6.0 to 8.0.
  • the pH of the cationic buffer used in this embodiment is 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7. It may be 8, 7.9 or 8.0.
  • the pH of the cationic buffer used in this embodiment is more preferably 7.2 to 7.6, and even more preferably about 7.4.
  • Extracellular matrix component any component constituting the extracellular matrix (also referred to as ECM) can be used as long as it does not adversely affect the growth of cells and the formation of cell aggregates described later.
  • the extracellular matrix component include, but are not limited to, collagen, laminin, fibronectin, vitronectin, elastin, tenascin, entactin, fibrin, proteoglycan, and combinations thereof.
  • the extracellular matrix component may be a variant or variant of the above-mentioned one.
  • one type may be used alone, or two or more types may be used in combination.
  • proteoglycans examples include chondroitin sulfate proteoglycan, heparan sulfate proteoglycan, keratan sulfate proteoglycan, and dermatan sulfate proteoglycan.
  • extracellular matrix component collagen, laminin and fibronectin are preferable, and collagen is particularly preferable.
  • the total content of extracellular matrix components in the mixture in step (a) is not particularly limited as long as it does not adversely affect the growth of cells and the formation of cell aggregates.
  • the total content of extracellular matrix components relative to the total volume of the mixture may be 0.005 mg / mL or more and 1.5 mg / mL or less, or 0.005 mg / mL or more and 1.0 mg / mL or less. It may be 0.01 mg / mL or more and 1.0 mg / mL or less, 0.025 mg / mL or more and 1.0 mg / mL or less, and 0.025 mg / mL or more and 0.1 mg / mL or less. May be.
  • the extracellular matrix component can be used by dissolving it in a suitable solvent. Examples of the solvent include, but are not limited to, water, a buffer solution, acetic acid and the like. Of these, a buffer solution or acetic acid is preferable.
  • polymer electrolyte means a polymer having a dissociable functional group in the polymer chain.
  • any polyelectrolyte can be used as long as it does not adversely affect the growth of cells and the formation of cell aggregates.
  • polymer electrolyte examples include glycosaminoglycans such as heparin, chondroitin sulfate (for example, chondroitin 4-sulfate and chondroitin 6-sulfate), heparan sulfate, dermatane sulfate, keratane sulfate and hyaluronic acid, dextran sulfate, ramnan sulfate, and fucoidan. Examples thereof include, but are not limited to, caraginan, polystyrene sulfonic acid, polyacrylamide-2-methylpropanesulfonic acid, polyacrylic acid and combinations thereof.
  • the polyelectrolyte may be a derivative of the above-mentioned one. These polymer electrolytes may be used alone or in combination of two or more.
  • the polymer electrolyte is preferably glycosaminoglycan.
  • glycosaminoglycan preferably glycosaminoglycan.
  • heparin, chondroitin sulfate and dermatan sulfate are preferable, and heparin is particularly preferable.
  • the concentration of the polyelectrolyte in the mixture in the step (a) is not particularly limited as long as it does not adversely affect the growth of cells and the formation of cell aggregates. Unlike the extracellular matrix component, the polyelectrolyte is effective at any concentration as long as it is below the lysis limit, and does not inhibit the effect of the extracellular matrix component.
  • the concentration of the polymer electrolyte is preferably 0.005 mg / mL or more, preferably 0.005 mg / mL or more and 1.0 mg / mL or less, and 0.01 mg / mL or more 1 with respect to the total volume of the mixture. It may be 0.0 mg / mL or less, 0.025 mg / mL or more and 1.0 mg / mL or less, or 0.025 mg / mL or more and 0.1 mg / mL or less.
  • the polyelectrolyte can be used by dissolving it in an appropriate solvent.
  • solvents include, but are not limited to, water and buffers.
  • a cationic buffer solution is used as the above-mentioned cationic substance, the polyelectrolyte may be dissolved in the cationic buffer solution and used.
  • the compounding ratio (final concentration ratio) of the polyelectrolyte in the mixture in the step (a) and the extracellular matrix component is preferably 1: 2 to 2: 1, preferably 1: 1.5 to 1.5: 1. It may be 1: 1 or 1.
  • step (a) the mixing of cells, cationic substances, extracellular matrix components and polyelectrolytes can be carried out in a suitable container such as a dish, tube, flask, bottle, well plate or cell culture insert. These mixings may be carried out in the container used in the step (b).
  • the mixture in the step (a) may contain other components other than cells, cationic substances, extracellular matrix components and polyelectrolytes.
  • other components include a gelling agent necessary for obtaining a gel-like composition in step (b), a cell culture medium, and the like.
  • gelling agent examples include extracellular matrix components; agarose; pectin; a combination of fibrinogen and thrombin.
  • the gelling agent may be contained in the mixture in the step (a) in advance, or may be added to the mixture in the step (a) in the step (b) described below.
  • the mixture obtained in the step (a) is gelled to obtain a gel-like composition.
  • the method of gelation depends on the gelling agent used, and may be, for example, placing the mixture obtained in step (a) under gelling conditions. Alternatively, after adding a gelling agent to the mixture obtained in step (a), it may be placed under gelling conditions.
  • the gelation conditions include, for example, the condition that the mixture obtained in the step (a) is allowed to stand at about 37 ° C.
  • an additive such as a calcium salt may be added to the mixture obtained in the step (a).
  • the extracellular matrix component contained in the mixture in step (a) gels, and a gel-like composition is obtained.
  • the extracellular matrix component may be further added to the mixture obtained in step (a) and then allowed to stand at about 37 ° C. for gelation.
  • agarose When agarose is used as the gelling agent, agarose is added to the mixture obtained in step (a) to dissolve the agarose under a temperature condition equal to or higher than the melting point of the agarose to be used, and then the freezing point of the agarose to be used or less. It may be left to stand under the above temperature conditions to gel.
  • the temperature at which agarose is melted is 50 ° C to 90 ° C.
  • the temperature at which the dissolved agarose is gelled is 37 ° C to 40 ° C.
  • the addition ratio of agarose to the mixture may be 0.5% to 4% with respect to the total volume of the mixture.
  • pectin When pectin is used as the gelling agent, pectin may be added to the mixture obtained in step (a). As a result, pectin is gelled by divalent ions such as calcium ions contained in the mixture, and a gel-like composition is obtained.
  • the addition ratio of pectin to the mixture may be 0.3 to 1.0% with respect to the total volume of the mixture.
  • fibrinogen and thrombin may be used as the gelling agent.
  • Thrombin a type of serine protease, cleaves fibrinogen to form fibrin monomers.
  • the fibrin monomers polymerize with each other by the action of calcium ions to form a sparingly soluble fibrin polymer.
  • factor XIII fibrin stabilizing factor
  • a gel-like composition gelled by forming a fibrin polymer may be referred to as a fibrin gel.
  • the fibrin monomer polymerizes to form a fibrin polymer, which means that the fibrin monomer gels.
  • the step (b) for obtaining the gel-like composition may include a step of mixing thrombin and fibrinogen with the mixture obtained in the step (a).
  • the gel-like composition in the step (b) may contain fibrin gel as a gel-like component.
  • the step (b) for obtaining the gel-like composition is a step (b1) of adding thrombin to the mixture obtained in step (a) and fibrinogen is added to the mixture to which thrombin is added, and as a result, fibrin gel is added. It is preferable to include a step (b2) in which the mixture is formed and the mixture is gelled.
  • the fibrinogen concentration in the mixture may be 0.5 mg / mL or more and 70 mg / mL or less, and 0.5 mg / mL or more and 45 mg in step (b). It is preferably / mL or less, and more preferably 0.5 mg / mL or more and 25 mg / mL or less.
  • the fibrin monomer is easily gelled by being mixed with thrombin.
  • it is 25 mg / mL or less, it becomes easy to dissolve in the mixture.
  • thrombin is preferably dissolved or dispersed in the mixture in the step (b).
  • the thrombin concentration in the mixture is preferably 1.0 mg / mL or more, and more preferably 5.0 mg / mL or more.
  • the fibrin monomer tends to gel.
  • the upper limit of the thrombin concentration in the mixture is not particularly limited, and examples thereof include 60 mg / mL.
  • the upper and lower limits of the thrombin concentration in the mixture can be arbitrarily combined.
  • the thrombin concentration in the mixture may be 1.0 mg / mL or more and 60 mg / mL or less, or 5.0 mg / mL or more and 60 mg / mL or less.
  • the thrombin concentration and the fibrinogen concentration in the mixture in the step (b) are determined according to the mutual concentration.
  • the fibrinogen concentration in the mixture is 0.5 mg / mL or more and 5.0 mg / mL or less
  • the thrombin concentration is preferably 1.0 mg / mL or more and 60 mg / mL or less.
  • the fibrinogen concentration in the mixture is 10 mg / mL or more and 70 mg / mL or less
  • the thrombin concentration is preferably 5 mg / mL or more and 60 mg / mL or less.
  • the mixture contains a substance having an anticoagulant effect (typically, when heparin is selected as the polyelectrolyte), it is considered that fibrin does not polymerize. Therefore, normally, a substance having an anticoagulant effect and fibrin are not used at the same time. On the other hand, in the present embodiment, the reason is unknown whether it is due to the combination of materials or the low concentration, but the polymerization of fibrin is not inhibited.
  • a substance having an anticoagulant effect typically, when heparin is selected as the polyelectrolyte
  • step (a) if fibrinogen is first added to the mixture obtained in the step (a), gelation may occur by itself depending on the conditions. It is presumed that this is because fibrinogen is cleaved by some protease contained in the mixture obtained in step (a) to form a fibrin monomer. Therefore, when thrombin and fibrinogen are mixed with the mixture obtained in step (a), it is preferable to mix thrombin first and then fibrinogen.
  • step (b) a gel-like composition can be obtained by adding only fibrinogen as a gelling agent.
  • the gel-like composition formed in the step (b) may contain a gel-like component in which at least one of the extracellular matrix component, agarose, pectin, and fibrin monomer is gelled.
  • step (c) the gel-like composition obtained in step (b) is incubated to obtain a three-dimensional cell tissue.
  • the time for culturing the gel-like composition to obtain a three-dimensional cell tissue may be 5 minutes to 192 hours, 12 hours to 144 hours, or 24 hours to 72 hours. ..
  • the step (c) has the effect that the cells contained in the gel-like composition are promoted to adhere to each other and become stable as a three-dimensional cell tissue.
  • the cells in the step (c) can be cultured under culture conditions suitable for the cells to be cultured.
  • One of ordinary skill in the art can select an appropriate medium according to the cell type and desired function.
  • the medium is not particularly limited, and for example, a medium such as DMEM, EMEM, MEM ⁇ , RPMI-1640, McCoy's 5A, Ham's F-12, and a medium obtained by adding about 1 to 20% by volume of serum to these are used.
  • serum include fetal bovine serum (CS), fetal bovine serum (FBS), and fetal bovine serum (HBS).
  • CS fetal bovine serum
  • FBS fetal bovine serum
  • HBS fetal bovine serum
  • Various conditions such as the temperature of the culture environment and the atmospheric composition may be adjusted to conditions suitable for the cells to be cultured.
  • Examples of the container used in the step (c) include the same containers as those used in the step (b). In the step (c), the container used in the step (b) may be used as it is, or may be transferred to another container.
  • a substance for suppressing deformation of the obtained three-dimensional cell tissue for example, tissue contraction, tissue terminal detachment, etc.
  • a substance for suppressing deformation of the obtained three-dimensional cell tissue for example, tissue contraction, tissue terminal detachment, etc.
  • a substance for suppressing deformation of the obtained three-dimensional cell tissue include, but are not limited to, Y-27632, which is a Rho-associated coiled-coil forming kinase / Rho-binding kinase (ROCK) inhibitor.
  • Y-27632 which is a Rho-associated coiled-coil forming kinase / Rho-binding kinase (ROCK) inhibitor.
  • the step (c) may be performed after the steps (a) and (b) are performed twice or more.
  • a three-dimensional cell tissue having a plurality of layers can be produced. That is, it is possible to produce a three-dimensional cell tissue having a large thickness.
  • the steps (a) and (b) may be repeated, and each time the steps (b) are repeated, a different cell population may be used to stack three-dimensional cell tissues composed of different types of cells.
  • the second step (a) is performed using a cell population different from that of the first step (a).
  • a layer containing the cell population used in the second step (a) is formed on the layer containing the cell population used in the first step (a). can do.
  • step (b) of obtaining the gel-like composition an external force is applied to the mixture obtained in the step (a) to apply an external force to cells, a cationic substance, an extracellular matrix component and a polymer electrolyte.
  • step (b) for obtaining a gel-like composition further comprising the step (a') for obtaining a cell aggregate containing the above, the cell aggregate obtained in the step (a') is replaced with the mixture obtained in the step (a). May be gelled to obtain a gelled composition.
  • the method for producing a three-dimensional cell tissue of the present embodiment is a step (a) of obtaining a mixture containing cells, a cationic substance, an extracellular matrix component and a polymer electrolyte, and applying an external force to the mixture to obtain cells.
  • the "cell aggregate” means a structure in which cells are aggregated and integrated.
  • the cell aggregate also includes a cell precipitate obtained by centrifugation, filtration, or the like.
  • the cell aggregate is a slurry-like viscous body.
  • “Slurry-like viscous body” means Akihiro Nishiguchi et al., Cell-cell crosslinking by bio-molecular recognition of heparin-based layer-by-layer nanofilms, Macromol Biosci., 15 (3), 312-317, Refers to a gel-like cell aggregate as described in 2015.
  • Cell aggregates can also be formed by placing the mixture obtained in step (a) in a suitable container and allowing it to stand, or by placing the mixture obtained in step (a) in a suitable container, for example.
  • Cells may be aggregated to form cell aggregates by centrifugation, magnetic separation, filtration, or the like. That is, in the step (a'), applying an external force may mean allowing gravity to act on the subject, centrifuging, magnetic separation, filtration, or the like. When cells are collected by standing, centrifugation, magnetic separation, filtration, etc., the liquid portion may or may not be removed.
  • Examples of the container used in the step (a') include a culture container for use in culturing cells.
  • the culture container may be a container having a material and a shape usually used for culturing cells and microorganisms.
  • Examples of the material of the culture container include, but are not limited to, glass, stainless steel, plastic and the like.
  • Examples of the culture vessel include, but are not limited to, dishes, tubes, flasks, bottles, well plates, cell culture inserts and the like. It is preferable that at least a part of the container is made of a material that does not allow cells in the liquid to pass through and allows the liquid to pass through.
  • Examples of such containers include cell culture inserts such as Transwell® inserts, Netwell® inserts, Falcon® cell culture inserts and Millicell® cell culture inserts. Not limited.
  • the conditions for centrifugation are not particularly limited as long as they do not adversely affect the growth of cells.
  • cells can be collected and cell aggregates obtained by placing the mixture in a cell culture insert and subjecting it to centrifugation at 10 ° C., 400 xg for 1 minute.
  • the step (b') of gelling the cell aggregate to obtain a gel-like composition is the same as the above-mentioned step (b) of gelling the mixture obtained in the step (a) to obtain a gel-like composition. Can be done.
  • the cell aggregate obtained in the step (a') may be allowed to stand at about 37 ° C., or the cell aggregate obtained in the step (a') may be used. After further adding the extracellular matrix component, the cells may be allowed to stand at about 37 ° C. for gelation. Further, an additive such as a calcium salt may be added to the mixture obtained in the step (a').
  • agarose When agarose is used as the gelling agent, agarose is added to the cell aggregate obtained in step (a') to dissolve the agarose under temperature conditions equal to or higher than the melting point of the agarose to be used, and then the agarose to be used. It may be gelled by allowing it to stand still under the temperature condition below the freezing point of.
  • the temperature at which agarose is melted is 50 ° C to 90 ° C.
  • the temperature at which the dissolved agarose is gelled is 37 ° C to 40 ° C.
  • pectin When pectin is used as the gelling agent, pectin may be added to the cell aggregate obtained in step (a'). As a result, pectin is gelled by divalent ions such as calcium ions contained in the mixture, and a gel-like composition is obtained.
  • the step (b') for obtaining the gel-like composition may include a step of mixing thrombin and fibrinogen with the cell aggregate obtained in the step (a').
  • the gel-like composition in the step (b') may contain fibrin gel as a gel-like component.
  • the step (b') for obtaining the gel-like composition is the step (b1') of adding thrombin to the cell aggregate obtained in the step (a'), and the step of adding fibrinogen to the cell aggregate to which thrombin is added.
  • step (c) the gel-like composition obtained in step (b') is incubated to obtain a three-dimensional cell tissue.
  • step (c) is the same as that described above.
  • the invention provides a steric cell tissue comprising cells, cationic material, extracellular matrix components, polyelectrolytes and gel-like components.
  • the invention provides a steric cell tissue comprising cells, cationic substances, polyelectrolytes and gel-like components. The three-dimensional cell tissue of the present embodiment is suppressed from decreasing in thickness over time.
  • the maximum value of the thickness of the section obtained along the line passing through the center of gravity when viewed from the upper surface of the three-dimensional cell tissue on the 8th day after production is the above-mentioned immediately after production. It is preferably 80% or more, preferably 90% or more, and 95% or more of the maximum value of the thickness of the section obtained along the line passing through the center of gravity when viewed from the upper surface of the three-dimensional cell tissue. It is preferably 100% or more.
  • “8th day after production” and “immediately after production” are the same as those described above.
  • the cells, cationic substances, extracellular matrix components, polyelectrolytes and gel-like components are the same as those described above.
  • the gel-like component is a gel-like component in which at least one of the extracellular matrix component, agarose, pectin and fibrin monomer is gelled.
  • the steric cell tissue is a cell, a cationic substance, a polymer electrolyte and a gel. It may contain a state component. Further, when the gel-like component is a gel-like component in which at least one of agarose, pectin and fibrin monomer is gelled, the steric cell tissue is a cell, an extracellular matrix component, a cationic substance, and a polymer electrolyte. And may contain a gel-like component.
  • the content of the gel-like component contained in the steric cell tissue is 0.5% to 4% with respect to the total volume of the steric cell tissue. You may.
  • the content of the gel-like component contained in the steric cell tissue is 0.3 to 1.0% with respect to the total volume of the steric cell tissue. There may be.
  • the content of the gel-like component contained in the steric cell tissue is 0.5 mg / mL or more with respect to the total volume of the steric cell tissue. It may be 70 mg / mL or less, preferably 0.5 mg / mL or more and 45 mg / mL or less, and more preferably 0.5 mg / mL or more and 25 mg / mL or less.
  • the present invention includes the following aspects.
  • a method for producing a three-dimensional cell tissue which comprises a step of incubating an object to obtain a three-dimensional cell tissue.
  • step of obtaining the gel-like composition includes a step of adding the thrombin to the mixture and a step of adding the fibrinogen to the mixture to which the thrombin is added.
  • Method. [4] The production method according to any one of [1] to [3], wherein the content of the fibrinogen in the mixture is 0.5 mg / mL or more and 60 mg / mL or less.
  • the maximum value of the thickness of the section obtained along the line passing through the center of gravity when viewed from the upper surface of the three-dimensional cell tissue on the 8th day after production is from the upper surface of the three-dimensional cell tissue immediately after production.
  • Example 1 Manufacturing of three-dimensional cell tissue
  • a three-dimensional cell tissue containing no fibrin gel and a three-dimensional cell tissue containing fibrin gel were produced.
  • human neonatal-derived skin fibroblasts NHDF (model number "CC-2509", Lonza) were used.
  • DMEM medium model number "043-30085", Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • FBS fetal bovine serum
  • antibiotic solution penicillin, streptomycin
  • a medium was prepared by mixing a general-purpose medium and a medium for vascular cells (product name "EGM-2MV", model number "CC-3202", Lonza) in a ratio of 1: 1 (volume ratio) (hereinafter, "" It may be called “dedicated medium”).
  • each cell suspension was centrifuged at room temperature at 1,000 ⁇ g (gravitational acceleration) for 1 minute, the supernatant was removed, and each cell suspension was resuspended in an appropriate amount of a special medium. Subsequently, each cell suspension was seeded in a 24-well cell culture insert (model number "3470", Corning).
  • the cell culture insert was centrifuged at 400 ⁇ g for 1 minute at room temperature to obtain a cell aggregate. Subsequently, an appropriate amount of a special medium was added to the cell culture insert, and the cells were cultured in a CO 2 incubator (37 ° C., 5% CO 2 ) for 8 days. During that time, the medium was changed as appropriate.
  • a thrombin solution was prepared by dissolving thrombin (model number "T4648-10KU", Sigma Co., Ltd.) in the above-mentioned general-purpose medium so as to have a final concentration of 10 Unit / mL.
  • fibrinogen (model number "F8630-5G", Sigma Co., Ltd.) was dissolved in DMEM medium so as to have a final concentration of 10 mg / mL to prepare a fibrinogen solution. Further, a medium was prepared by mixing a fibrinogen solution and a general-purpose medium in a ratio of 1: 1 (volume ratio) (hereinafter, may be referred to as “fibrinogen-added medium”).
  • each cell suspension was centrifuged at 1,000 ⁇ g at room temperature for 1 minute to remove the supernatant, and then resuspended in a thrombin solution.
  • the thrombin solution in which the cells were lysed and the fibrinogen-added medium were mixed in a ratio of 1: 2 (volume ratio), and 100 ⁇ L of this mixed solution was placed in a 24-well cell culture insert (model number “3470”, Corning). Sown.
  • the cell culture inserts were allowed to stand in a CO 2 incubator (37 ° C., 5% CO 2 ) until gelling. Subsequently, an appropriate amount of a special medium was added to the cell culture insert, and the cells were cultured in a CO 2 incubator (37 ° C., 5% CO 2 ) for 8 days. During that time, the medium was changed as appropriate.
  • each steric cell tissue was fixed using a formalin buffer (model number "062-01661", Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Subsequently, each three-dimensional cell tissue is taken out from the cell culture insert, embedded in paraffin, and then thinned along a line passing through the center of gravity when viewed from the upper surface of the three-dimensional cell tissue (in other words, the upper surface of the cell culture insert). Cut sections were prepared. Subsequently, the sliced sections were stained with hematoxylin and eosin (also referred to as HE) and observed under a microscope to measure the maximum thickness of the three-dimensional cell tissue.
  • HE hematoxylin and eosin
  • FIG. 1A-1D are representative micrographs of sliced sections of each three-dimensional cell tissue.
  • FIG. 1A is a micrograph of a tissue section one day after the start of culture of a three-dimensional cell tissue (manufactured with 2 ⁇ 10 6 cells) containing no fibrin gel.
  • FIG. 1B is a micrograph of a tissue section 8 days after the start of culturing of a three-dimensional cell tissue (manufactured with 2 ⁇ 10 6 cells) containing no fibrin gel.
  • FIG. 1C is a micrograph of a tissue section one day after the start of culturing of a three-dimensional cell tissue containing fibrin gel (manufactured with 2 ⁇ 10 6 cells).
  • FIG. 1D is a photomicrograph of a tissue section 8 days after the start of culture of a three-dimensional cell tissue containing fibrin gel (manufactured with 2 ⁇ 10 6 cells).
  • Table 1 below shows the results of measuring the maximum thickness of each three-dimensional cell tissue that does not contain fibrin gel.
  • Table 2 shows the results of measuring the maximum thickness of each three-dimensional cell tissue containing fibrin gel.
  • “thickness after 1 day” is the maximum value ( ⁇ m) of the thickness of the section obtained along the line passing through the center of gravity when viewed from the upper surface of the three-dimensional cell tissue 1 day after the start of culture.
  • “thickness after 8 days” means the maximum value ( ⁇ m) of the thickness of the section obtained along the line passing through the center of gravity when viewed from the upper surface of the three-dimensional cell tissue 8 days after the start of culture.
  • unmeasurable means that the cells were detached from the cell culture insert and the three-dimensional cell tissue could not be produced, and “unmeasurable” means that the measurement could not be performed.
  • Thickness maintenance rate is a value calculated based on the following formula (1).
  • Thickness maintenance rate (%) Three-dimensional cell tissue 8 days after the start of culture Maximum value of the thickness of the section obtained along the line passing through the center of gravity when viewed from the upper surface / Three-dimensional one day after the start of culture Maximum value of the thickness of the section obtained along the line passing through the center of gravity when viewed from the upper surface of the cell tissue ⁇ 100... (1)
  • Thickness maintenance rate calculated based on the above formula (1) is 80% or more ⁇ ... Thickness maintenance rate calculated based on the above formula (1) is less than 80%
  • the three-dimensional cell tissue containing fibrin gel was able to achieve a thickness maintenance rate of 80% or more under any cell number condition, and was able to suppress a decrease in the thickness of the three-dimensional cell tissue over time. It was confirmed that.
  • the three-dimensional cell tissue containing no fibrin gel could not be prepared under the condition of using 8 ⁇ 10 6 cells. Further, even under other cell number conditions, the thickness maintenance rate was less than 80%, and it was confirmed that the thickness of the three-dimensional cell tissue decreased with time.
  • the steric cell tissue containing fibrin gel can form a thicker tissue than the steric cell tissue not containing fibrin gel.
  • Example 2 Manufacturing of three-dimensional cell tissue 1
  • Human neonatal-derived skin fibroblasts NHDF model number "CC-2509", manufactured by Ronza
  • human umbilical vein endothelial cells model number: cAP-0001GFP, manufactured by Funakoshi
  • a thrombin solution is prepared by dissolving thrombin (model number "T4648-10KU", Sigma Co., Ltd.) in the above-mentioned general-purpose medium so that the final concentrations are 0.5, 1, 5, 10, 20, and 40 Unit / mL, respectively. did.
  • fibrinogen (model number "F8630-5G", Sigma) was dissolved in DMEM medium so that the final concentrations were 0.5, 1, 5.10, 30, and 60 mg / mL, respectively, to prepare a fibrinogen solution. Further, a medium was prepared by mixing a fibrinogen solution and a general-purpose medium in a ratio of 1: 1 (volume ratio) (hereinafter, may be referred to as “fibrinogen-added medium”).
  • each cell suspension was centrifuged at 1,000 ⁇ g at room temperature for 1 minute to remove the supernatant, and then resuspended in a thrombin solution.
  • the thrombin solution in which the cells were lysed and the fibrinogen-added medium were mixed in a ratio of 1: 2 (volume ratio), and 100 ⁇ L of this mixed solution was placed in a 24-well cell culture insert (model number “3470”, Corning). Sown.
  • the cell culture inserts were allowed to stand in a CO 2 incubator (37 ° C., 5% CO 2 ) until gelling. Subsequently, an appropriate amount of the above-mentioned special medium was added to the cell culture insert, and the cells were cultured in a CO 2 incubator (37 ° C., 5% CO 2 ) for 8 days. During that time, the medium was changed as appropriate.
  • each steric cell tissue was fixed using a formalin buffer (model number "062-1661", Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Subsequently, each three-dimensional cell tissue is taken out from the cell culture insert, embedded in paraffin, and then thinned along a line passing through the center of gravity when viewed from the upper surface of the three-dimensional cell tissue (in other words, the upper surface of the cell culture insert). Cut sections were prepared. Subsequently, the sliced sections were stained with hematoxylin and eosin (HE) and observed under a microscope to measure the maximum thickness of the three-dimensional cell tissue.
  • HE hematoxylin and eosin
  • Table 3 below shows the "maintenability" evaluation results of each three-dimensional cell tissue evaluated using the same evaluation criteria as in Experimental Example 1.
  • the thickness maintenance rate of the three-dimensional cell tissue is high in the three-dimensional cell tissue produced under any condition where the final concentration of fibrinogen is 0.5 mg / mL or more. It was confirmed that it was possible to achieve 80% or more and suppress the decrease in the thickness of the steric cell tissue over time.
  • the final thrombin concentration is 1 mg / mL
  • Example 3 Manufacturing of three-dimensional cell tissue 2
  • Human neonatal-derived skin fibroblasts NHDF model number "CC-2509", manufactured by Ronza
  • human umbilical vein endothelial cells model number: cAP-0001GFP, manufactured by Funakoshi
  • each cell suspension was centrifuged at room temperature at 1,000 ⁇ g (gravitational acceleration) for 1 minute, the supernatant was removed, and each cell suspension was resuspended in an appropriate amount of the above-mentioned special medium. Subsequently, each cell suspension was seeded in a 24-well cell culture insert (model number "3470", Corning).
  • the cell culture insert was centrifuged at 400 ⁇ g for 1 minute at room temperature to obtain a cell aggregate.
  • an appropriate amount of the above-mentioned special medium was added to the cell culture insert, and the cells were cultured in a CO 2 incubator (37 ° C., 5% CO 2 ) for 8 days. During that time, the medium was changed as appropriate.
  • each cell suspension is centrifuged at 1,000 ⁇ g at room temperature for 1 minute, the supernatant is removed, and then collagen (CeIlamtrix Type IA, Nitta Gelatin Co., Ltd.) is prepared according to the procedure prescribed by the manufacturer. After mixing, 100 ⁇ L of this mixed solution was seeded in a 24-well cell culture insert (model number “3470”, Corning).
  • the cell culture insert was allowed to stand in a CO 2 incubator (37 ° C., 5% CO 2 ) until the mixed solution gelled. Subsequently, an appropriate amount of the above-mentioned special medium was added to the cell culture insert, and the cells were cultured in a CO 2 incubator (37 ° C., 5% CO 2 ) for 8 days. During that time, the medium was changed as appropriate.
  • each steric cell tissue was fixed using a formalin buffer (model number "062-1661", Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Subsequently, each three-dimensional cell tissue is taken out from the cell culture insert, embedded in paraffin, and then thinned along a line passing through the center of gravity when viewed from the upper surface of the three-dimensional cell tissue (in other words, the upper surface of the cell culture insert). Cut sections were prepared. Subsequently, the sliced sections were stained with hematoxylin and eosin (HE) and observed under a microscope to measure the maximum thickness of the three-dimensional cell tissue.
  • HE hematoxylin and eosin
  • Table 4 shows the results of measuring the maximum thickness of each three-dimensional cell tissue containing the gelled extracellular matrix and the three-dimensional cell tissue containing the gelled extracellular matrix. The "maintenability" evaluation result of each three-dimensional cell tissue evaluated by the same evaluation criteria as above is shown.
  • the three-dimensional cell tissue containing the gelled extracellular matrix can achieve a thickness maintenance rate of 80% or more under any cell number condition, and the thickness of the three-dimensional cell tissue decreases with time. It was confirmed that it was possible to suppress.
  • the thickness maintenance rate is less than 80% under any cell number condition, and the thickness of the three-dimensional cell tissue decreases with time. Was confirmed.
  • the steric cell tissue containing the gelled extracellular matrix can form a thicker tissue than the steric cell tissue not containing the gelled extracellular matrix.

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Abstract

この立体的細胞組織は、細胞、カチオン性物質、細胞外マトリックス成分及び高分子電解質を含む混合物を得る工程と、前記混合物をゲル化させてゲル状組成物を得る工程と、前記ゲル状組成物をインキュベートして立体的細胞組織を得る工程と、を含む、立体的細胞組織の製造方法、並びに、細胞、カチオン性物質、細胞外マトリックス成分、高分子電解質及びゲル状成分を含む。

Description

立体的細胞組織の製造方法及び立体的細胞組織
　本発明は、立体的細胞組織の製造方法及び立体的細胞組織に関する。
　本願は、２０２０年１１月２６日に日本に出願された特願２０２０－１９６３１０号について優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　近年、再生医療及び生体に近い環境が求められる薬剤のアッセイ系等の分野において、平板上で成育させた細胞よりも立体的に組織化させた立体的細胞組織を使用することの優位性が示されている。このため、生体外で立体的細胞組織を構築するための様々な技術が開発されている。
　本願発明者らは、以前に、細胞が、カチオン性緩衝液、細胞外マトリックス成分及び高分子電解質を少なくとも含む溶液に懸濁されている混合物を得る工程と、得られた前記混合物から前記細胞を集め、基材上に細胞集合体を形成する工程と、前記細胞を培養し、立体的細胞組織を得る工程と、を含む、立体的細胞組織の製造技術を開発した（例えば、特許文献１を参照）。立体的細胞組織は、例えば、生体組織モデル及び固形癌モデル等に使用して、薬物スクリーニング等の様々なアッセイに利用することができる。
特許第６６３９６３４号公報
　しかしながら、時間が経過しても製造時の立体的細胞組織の厚さを維持するためには、更なる改善の余地がある。
　そこで、本発明は、立体的細胞組織の経時的な厚さの減少を抑制する技術を提供することを目的とする。
　本発明は以下の態様を含む。
［１］細胞、カチオン性物質、細胞外マトリックス成分及び高分子電解質を含む混合物を得る工程と、前記混合物をゲル化させてゲル状組成物を得る工程と、前記ゲル状組成物をインキュベートして立体的細胞組織を得る工程と、を含む、立体的細胞組織の製造方法。
［２］前記ゲル状組成物が、前記細胞外マトリックス成分、アガロース、ペクチン及びフィブリン・モノマーからなる群より選択される少なくとも１種がゲル化したゲル状成分を含む、［１］に記載の製造方法。
［３］前記ゲル状成分が、フィブリン・モノマーがゲル化したフィブリンゲルであり、前記ゲル状組成物を得る工程が、前記混合物に、トロンビン及びフィブリノゲンを混合する工程を含む、［２］に記載の製造方法。
［４］前記ゲル状組成物を得る工程が、前記混合物に前記トロンビンを添加する工程と、前記トロンビンを添加した前記混合物に前記フィブリノゲンを添加し、その結果、前記フィブリンゲルが形成されて前記混合物がゲル化する工程と、を含む、［３］に記載の製造方法。
［５］前記細胞外マトリックス成分が、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、エラスチン、テネイシン、エンタクチン、フィブリン、プロテオグリカン及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、［１］～［４］のいずれか１つに記載の製造方法。
［６］前記混合物における、前記細胞外マトリックス成分の含有量の合計が、０．００５ｍｇ／ｍＬ以上１．５ｍｇ／ｍＬ以下である、［１］～［５］のいずれか１つに記載の製造方法。
［７］前記高分子電解質が、グリコサミノグリカン、デキストラン硫酸、ラムナン硫酸、フコイダン、カラギナン、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリルアミド－２－メチルプロパンスルホン酸、ポリアクリル酸及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、［１］～［６］のいずれか１つに記載の製造方法。
［８］前記混合物における、前記高分子電解質の含有量が、０．００５ｍｇ／ｍＬ以上である、［１］～［７］のいずれか１つに記載の製造方法。
［９］前記ゲル状組成物を得る工程の前に、前記混合物に外力を加えて、前記細胞、前記カチオン性物質、前記細胞外マトリックス成分及び前記高分子電解質を含む細胞集合体を得る工程を更に含み、前記ゲル状組成物を得る工程において、前記混合物に代えて前記細胞集合体をゲル化させてゲル状組成物を得る、［１］～［８］のいずれか１つに記載の製造方法。
［１０］細胞、カチオン性物質、細胞外マトリックス成分、高分子電解質及びゲル状成分を含む、立体的細胞組織。
［１１］細胞、カチオン性物質、高分子電解質及びゲル状成分を含む、立体的細胞組織。
［１２］前記ゲル状成分は、第１の細胞外マトリックス成分、アガロース、ペクチン及びフィブリン・モノマーからなる群より選択される少なくとも１種がゲル化したゲル状成分である［１１］に記載の立体的細胞組織。
［１３］さらに、第２の細胞外マトリックス成分を含み、前記ゲル状成分は、アガロース、ペクチン及びフィブリン・モノマーからなる群より選択される少なくとも１種がゲル化したゲル状成分である［１１］に記載の立体的細胞組織。
［１４］製造から８日目の前記立体的細胞組織の上面から見たときの重心を通る線に沿って取得した切片の厚さの最大値が、製造直後の前記立体的細胞組織の上面から見たときの重心を通る線に沿って取得した切片の厚さの最大値の８０％以上である、［１０］～［１３］のいずれか１つに記載の立体的細胞組織。
　本発明によれば、立体的細胞組織の経時的な厚さの減少を抑制する技術を提供することができる。
実験例１で測定した、立体的細胞組織の薄切切片の代表的な顕微鏡写真である。 実験例１で測定した、立体的細胞組織の薄切切片の代表的な顕微鏡写真である。 実験例１で測定した、立体的細胞組織の薄切切片の代表的な顕微鏡写真である。 実験例１で測定した、立体的細胞組織の薄切切片の代表的な顕微鏡写真である。
［立体的細胞組織の製造方法］
　一実施形態において、本発明は、細胞、カチオン性物質、細胞外マトリックス成分及び高分子電解質を含む混合物を得る工程と、前記混合物をゲル化させてゲル状組成物を得る工程と、前記ゲル状組成物をインキュベートして立体的細胞組織を得る工程と、を含む、立体的細胞組織の製造方法を提供する。
　本実施形態の製造方法によれば、立体的細胞組織の経時的な厚さの減少を抑制することができる。具体的には、実施例において後述するように、製造から８日目の立体的細胞組織の上面から見たときの重心を通る線に沿って取得した切片の厚さの最大値が、製造直後の前記立体的細胞組織の上面から見たときの重心を通る線に沿って取得した切片の厚さの最大値の８０％以上を維持することができる。ここで、製造から８日目の立体的細胞組織の前記最大値は、ゲル状組成物のインキュベートを開始してから８日間経過した立体的細胞組織を上面から見たときの重心を通る線に沿って、立体的細胞組織を切断して得られる切片において測定される立体的細胞組織の厚さの最大値ともいうことができる。また、製造直後の立体的細胞組織の前記最大値は、ゲル状組成物のインキュベート開始直後の立体的細胞組織を上面から見たときの重心を通る線に沿って、立体的細胞組織を切断して得られる切片において測定される立体的細胞組織の厚さの最大値ともいうことができる。本明細書において、立体的細胞組織の製造直後とは、ゲル状組成物のインキュベートを開始してから５分間～７２時間後であってもよく、１日後（好ましくは２４時間後）であってもよい。また、製造から８日目とは、ゲル状組成物のインキュベートを開始してから８日目（好ましくは１９２時間）であってもよい。
　また、実施例において後述するように、本実施形態の製造方法によれば、従来製造することが困難であった厚さの立体的細胞組織を作製することができる。
　立体的細胞組織の上面から見たときの重心を通る線に沿って取得した切片の厚さとは、立体的細胞組織のほぼ中央部における切片の厚さである。立体的細胞組織の形状は、立体的細胞組織の製造に使用した容器によって異なるが、例えば、円柱形状のセルカルチャーインサートを用いて立体的細胞組織を製造した場合には、円柱形状となる。この場合、立体的細胞組織を上面から見たときの形状は円であり、上面から見たときの重心は、円の中心となる。立体的細胞組織の形状は、円柱形状に限定されず、目的に応じて任意の形状であることができる。具体的には、例えば、三角柱形状及び四角柱形状等の多角柱形状等が例示できる。
　立体的細胞組織の上面から見たときの重心を通る線に沿って取得した切片の厚さは、具体的には以下のように測定される。培養した細胞集合体をホルマリン緩衝液（例えば、型番「062-01661」、富士フイルム和光純薬）を用いて各立体的細胞組織を固定する。続いて、立体的細胞組織をパラフィンで包埋後、立体的細胞組織の上面（セルカルチャーインサートを用いて立体的細胞組織を製造する場合には、セルカルチャーインサートの上面）から見たときの重心を通る線に沿って薄切切片を作製する。続いて、薄切切片をヘマトキシリン・エオシン（ＨＥともいう）染色して顕微鏡で観察し、立体的細胞組織の厚さの最大値を測定する。
　本明細書において、「立体的細胞組織」とは、立体的な細胞の集合体を意味する。立体的細胞組織の用途としては、生体組織モデル、固形癌モデルが挙げられるが、これらに限定されない。生体組織モデルとしては、皮膚、毛髪、骨、軟骨、歯、角膜、血管、リンパ管、心臓、肝臓、膵臓、神経、及び食道等のモデルが挙げられる。固形癌モデルとしては、胃癌、食道癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、腎細胞癌、及び肝癌等のモデルが挙げられる。
　また、立体的細胞組織の形態に特に制限は無く、例えば、セルカルチャーインサート等の容器の内部で細胞を培養して形成した立体的細胞組織であってもよいし、コラーゲン等の天然生体高分子や合成高分子によって構成されたスキャフォールド内で細胞を培養して形成した立体的細胞組織であってもよいし、細胞凝集体（スフェロイドともいう）であってもよいし、シート状の細胞構造体であってもよい。
　本実施形態の立体的細胞組織の製造方法は、細胞、カチオン性物質、細胞外マトリックス成分及び高分子電解質を含む混合物を得る工程（ａ）と、前記混合物をゲル化させてゲル状組成物を得る工程（ｂ）と、前記ゲル状組成物をインキュベートして立体的細胞組織を得る工程（ｃ）とを含む。以下、各工程について説明する。
　まず、工程（ａ）において、細胞、カチオン性物質、細胞外マトリックス成分及び高分子電解質を含む混合物を得る。細胞、カチオン性物質、細胞外マトリックス成分及び高分子電解質の混合は、水性溶媒中で行ってもよい。水性溶媒の例としては、水、緩衝液及び培地が挙げられるが、これらに限定されない。
（細胞）
　本実施形態の製造方法において、細胞としては特に限定されず、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウシ、マウス及びラット等の哺乳動物に由来する細胞を使用することができる。細胞の由来部位も特に限定されず、骨、筋肉、内臓、神経、脳、皮膚又は血液等に由来する体細胞であってもよく、生殖細胞であってもよく、癌細胞であってもよい。
　血液に由来する体細胞としては、リンパ球、好中球、マクロファージ及び樹状細胞等の免疫細胞が挙げられる。また、癌細胞としては、胃癌、食道癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、腎細胞癌及び肝癌等が挙げられる。
　また、細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）及び胚性幹細胞（ＥＳ細胞）等の多能性幹細胞であってもよく、組織幹細胞であってもよい。
　細胞は、初代細胞であってもよいし、継代培養細胞及び細胞株細胞等の培養細胞であってもよい。また、細胞は１種を単独で用いてもよいし、複数種類を混合して用いてもよい。
（カチオン性物質）
　カチオン性物質としては、細胞の生育及び後述する細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、任意の正電荷を有する物質を用いることができる。カチオン性物質には、トリス－塩酸、トリス－マレイン酸、ビス－トリス、ＨＥＰＥＳ等のカチオン性緩衝剤、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ポリビニルアミン、ポリアリルアミン、ポリリシン及びポリヒスチジン、ポリアルギニン等が挙げられるが、これらに限定されない。なかでもカチオン性緩衝剤が好ましく、トリス－塩酸がより好ましい。
　工程（ａ）における混合物中のカチオン性物質の濃度は、細胞の生育及び細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、特に限定されない。本実施形態で用いられるカチオン性物質の濃度は、混合物の総体積に対し１０～１００ｍＭであることが好ましく、例えば２０～９０ｍＭであってもよく、例えば３０～８０ｍＭであってもよく、例えば４０～７０ｍＭであってもよく、例えば４５～６０ｍＭであってもよい。
　カチオン性物質としてカチオン性緩衝剤を用いる場合、カチオン性緩衝液のｐＨは、細胞の生育及び細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、特に限定されない。本実施形態で用いられるカチオン性緩衝液のｐＨは６．０～８．０であることが好ましい。例えば、本実施形態で用いられるカチオン性緩衝液のｐＨは、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９又は８．０であってよい。本実施形態で用いられるカチオン性緩衝液のｐＨは７．２～７．６であることがより好ましく、約７．４であることが更に好ましい。
（細胞外マトリックス成分）
　細胞外マトリックス成分としては、細胞の生育及び後述する細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、細胞外マトリックス（ＥＣＭともいう）を構成する任意の成分を用いることができる。細胞外マトリックス成分としては、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、エラスチン、テネイシン、エンタクチン、フィブリン、プロテオグリカン及びこれらの組み合わせ等が挙げられるが、これらに限定されない。細胞外マトリックス成分は、上述したものの改変体又はバリアント等であってもよい。細胞外マトリックス成分は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　プロテオグリカンとしては、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ケラタン硫酸プロテオグリカン及びデルマタン硫酸プロテオグリカンが挙げられる。細胞外マトリックス成分としては、なかでも、コラーゲン、ラミニン及びフィブロネクチンが好ましく、コラーゲンが特に好ましい。
　工程（ａ）における混合物中の細胞外マトリックス成分の含有量の合計は、細胞の生育及び細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、特に限定されない。混合物の総体積に対する細胞外マトリックス成分の含有量の合計は、０．００５ｍｇ／ｍＬ以上１．５ｍｇ／ｍＬ以下であってもよく、０．００５ｍｇ／ｍＬ以上１．０ｍｇ／ｍＬ以下であってもよく、０．０１ｍｇ／ｍＬ以上１．０ｍｇ／ｍＬ以下であってもよく、０．０２５ｍｇ／ｍＬ以上１．０ｍｇ／ｍＬ以下であってもよく、０．０２５ｍｇ／ｍＬ以上０．１ｍｇ／ｍＬ以下であってもよい。細胞外マトリックス成分は、適切な溶媒に溶解して用いることができる。溶媒としては、水、緩衝液及び酢酸等が挙げられるが、これらに限定されない。なかでも、緩衝液又は酢酸が好ましい。
（高分子電解質）
　本明細書において、高分子電解質とは、高分子鎖中に解離可能な官能基を有する高分子を意味する。本実施形態で用いられる高分子電解質としては、細胞の生育及び細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、任意の高分子電解質を用いることができる。高分子電解質としては、ヘパリン、コンドロイチン硫酸（例えば、コンドロイチン４－硫酸及びコンドロイチン６－硫酸）、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸及びヒアルロン酸等のグリコサミノグリカン、デキストラン硫酸、ラムナン硫酸、フコイダン、カラギナン、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリルアミド－２－メチルプロパンスルホン酸、ポリアクリル酸及びこれらの組み合わせ等が挙げられるが、これらに限定されない。高分子電解質は、上述したものの誘導体であってもよい。これらの高分子電解質は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　高分子電解質は、グリコサミノグリカンであることが好ましい。なかでも、ヘパリン、コンドロイチン硫酸及びデルマタン硫酸が好ましく、ヘパリンが特に好ましい。
　工程（ａ）における混合物中の高分子電解質の濃度は、細胞の生育及び細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、特に限定されない。細胞外マトリックス成分と異なり、高分子電解質は溶解の限界以下であれば、どのような濃度であっても効果があり、また、細胞外マトリックス成分による効果を阻害しない。高分子電解質の濃度は、混合物の総体積に対し０．００５ｍｇ／ｍＬ以上であることが好ましく、０．００５ｍｇ／ｍＬ以上１．０ｍｇ／ｍＬ以下であってもよく、０．０１ｍｇ／ｍＬ以上１．０ｍｇ／ｍＬ以下であってもよく、０．０２５ｍｇ／ｍＬ以上１．０ｍｇ／ｍＬ以下であってもよく、０．０２５ｍｇ／ｍＬ以上０．１ｍｇ／ｍＬ以下であってもよい。
　高分子電解質は、適切な溶媒に溶解して用いることができる。溶媒の例としては、水及び緩衝液が挙げられるが、これらに限定されない。上述のカチオン性物質としてカチオン性緩衝液が用いられる場合、高分子電解質をカチオン性緩衝液に溶解して用いてもよい。
　工程（ａ）における混合物中の高分子電解質と細胞外マトリックス成分との配合比（終濃度比）は１：２～２：１であることが好ましく、１：１．５～１．５：１であってもよく、１：１であってもよい。
　工程（ａ）において、細胞、カチオン性物質、細胞外マトリックス成分及び高分子電解質の混合は、ディッシュ、チューブ、フラスコ、ボトル、ウェルプレート又はセルカルチャーインサート等の適当な容器中で行うことができる。これらの混合は、工程（ｂ）で使用する容器中で行ってもよい。
　また、工程（ａ）における混合物は、細胞、カチオン性物質、細胞外マトリックス成分及び高分子電解質以外の、その他の成分を含んでいてもよい。その他の成分としては、工程（ｂ）においてゲル状組成物を得るために必要なゲル化剤、細胞培養用培地等が挙げられる。
（ゲル化剤）
　ゲル化剤としては、細胞外マトリックス成分；アガロース；ペクチン；フィブリノゲン及びトロンビンの組み合わせ等が挙げられる。ゲル化剤は、予め工程（ａ）における混合物中に含有させていてもよいし、以下に説明する工程（ｂ）において、工程（ａ）における混合物に添加してもよい。
　工程（ａ）の後、工程（ｂ）において、工程（ａ）で得た混合物をゲル化させてゲル状組成物を得る。ゲル化の方法は、用いるゲル化剤によって異なり、例えば、工程（ａ）で得た混合物をゲル化条件下に置くことであってもよい。あるいは、工程（ａ）で得た混合物にゲル化剤を添加した後、ゲル化条件下に置くことであってもよい。
　例えば、細胞外マトリックス成分をゲル化してゲル状組成物を得る場合、ゲル化条件としては、例えば、工程（ａ）で得た混合物を約３７℃で静置する条件が挙げられる。また、工程（ａ）で得た混合物にカルシウム塩等の添加剤を加えてもよい。この結果、工程（ａ）における混合物に含まれていた細胞外マトリックス成分がゲル化し、ゲル状組成物が得られる。あるいは、工程（ａ）で得た混合物に、細胞外マトリックス成分を更に添加したうえで、約３７℃静置してゲル化してもよい。
　また、ゲル化剤としてアガロースを用いる場合、工程（ａ）で得た混合物にアガロースを添加して、使用するアガロースの融点以上の温度条件下でアガロースを溶解させた後、使用するアガロースの凝固点以下の温度条件下で静置してゲル化してもよい。一例として、アガロースを溶解させる温度は、５０℃～９０℃が挙げられる。また、溶解したアガロースをゲル化する温度は、３７℃～４０℃が挙げられる。混合物へのアガロースの添加割合は、混合物の総体積に対し０．５％～４％であってもよい。
　また、ゲル化剤としてペクチンを用いる場合、工程（ａ）で得た混合物にペクチンを添加してもよい。その結果、混合物中に含まれるカルシウムイオン等の２価のイオンによりペクチンがゲル化し、ゲル状組成物が得られる。混合物へのペクチンの添加割合は、混合物の総体積に対し０．３～１．０％であってもよい。
　また、ゲル化剤として、フィブリノゲン及びトロンビンを使用してもよい。セリンプロテアーゼの１種であるトロンビンが、フィブリノゲンを切断することにより、フィブリン・モノマーが形成される。フィブリン・モノマーは、カルシウムイオンの作用により互いに重合して難溶性のフィブリン・ポリマーを形成する。生体内では、第ＸＩＩＩ因子（フィブリン安定化因子）の作用でフィブリン・ポリマー間が架橋結合することにより安定化フィブリンと呼ばれるメッシュ状の繊維が形成され、血液凝固を引き起こす。本明細書では、フィブリン・ポリマーが形成されることでゲル化したゲル状組成物をフィブリンゲルということがある。本明細書においては、フィブリン・モノマーが重合しフィブリン・ポリマーを形成することを、フィブリン・モノマーがゲル化する、と記載する。
　すなわち、ゲル状組成物を得る工程（ｂ）が、工程（ａ）で得た混合物に、トロンビン及びフィブリノゲンを混合する工程を含んでいてもよい。そして、工程（ｂ）におけるゲル状組成物は、ゲル状成分としてフィブリンゲルを含んでいてもよい。
　この場合、ゲル状組成物を得る工程（ｂ）が、工程（ａ）で得た混合物にトロンビンを添加する工程（ｂ１）と、トロンビンを添加した混合物にフィブリノゲンを添加し、その結果、フィブリンゲルが形成されて混合物がゲル化する工程（ｂ２）とを含むことが好ましい。
　ゲル化剤としてフィブリノゲン及びトロンビンを使用する場合には、工程（ｂ）において、混合物中のフィブリノゲン濃度は、０．５ｍｇ／ｍＬ以上７０ｍｇ／ｍＬ以下であってもよく、０．５ｍｇ／ｍＬ以上４５ｍｇ／ｍＬ以下であることが好ましく、０．５ｍｇ／ｍＬ以上２５ｍｇ／ｍＬ以下であることがより好ましい。０．５ｍｇ／ｍＬ以上７０ｍｇ／ｍＬ以下であると、トロンビンと混合されることでフィブリン・モノマーがゲル化しやすくなる。また、２５ｍｇ／ｍＬ以下であることにより、混合物中に溶解しやすくなる。また、トロンビンは、工程（ｂ）において混合物中に溶解あるいは分散していることが好ましい。
　工程（ｂ）において、混合物中のトロンビン濃度は、１．０ｍｇ／ｍＬ以上であることが好ましく５．０ｍｇ／ｍＬ以上であることがより好ましい。混合物中のトロンビン濃度が１．０ｍｇ／ｍＬ以上であると、フィブリン・モノマーがゲル化しやすくなる。混合物中のトロンビン濃度の上限値は特に限定されないが、６０ｍｇ／ｍＬが挙げられる。混合物中のトロンビン濃度の上限値と下限値は、任意に組み合わせることができる。例えば、混合物中のトロンビン濃度は、１．０ｍｇ／ｍＬ以上６０ｍｇ／ｍＬ以下であってもよく、５．０ｍｇ／ｍＬ以上６０ｍｇ／ｍＬ以下であってもよい。
　工程（ｂ）における混合物中のトロンビン濃度及びフィブリノゲン濃度は、相互の濃度に応じて決定されることが好ましい。例えば、混合物中のフィブリノゲン濃度が０．５ｍｇ／ｍＬ以上５．０ｍｇ／ｍＬ以下であるとき、トロンビン濃度は、１．０ｍｇ／ｍＬ以上６０ｍｇ／ｍＬ以下であることが好ましい。また、混合物中のフィブリノゲン濃度が１０ｍｇ／ｍＬ以上７０ｍｇ／ｍＬ以下であるとき、トロンビン濃度は、５ｍｇ／ｍＬ以上６０ｍｇ／ｍＬ以下であることが好ましい。
　混合物が、抗凝固作用を有する物質（代表的には、高分子電解質としてヘパリンを選択した場合）を含む場合には、フィブリンがポリマー化しないことが考えられる。このため、通常は抗凝固作用を有する物質とフィブリンとを同時に使用することはない。これに対し、本実施形態では、材料の組み合わせによるものか、濃度が薄いことによるものか、理由は不明であるが、フィブリンのポリマー化が阻害されることがない。
　また、発明者らは、工程（ａ）で得た混合物に先にフィブリノゲンを添加すると、条件によっては、それのみでゲル化してしまう場合があることを見出した。これは、工程（ａ）で得た混合物中に含まれる何らかのプロテアーゼによりフィブリノゲンが切断され、フィブリン・モノマーが形成されることによるものと推察している。このため、工程（ａ）で得た混合物にトロンビン及びフィブリノゲンを混合する場合には、先にトロンビンを混合し、その後にフィブリノゲンを混合することが好ましい。あるいは、工程（ｂ）において、ゲル化剤としてフィブリノゲンのみを添加しても、ゲル状組成物を得ることができる。
　このように、工程（ｂ）で形成されるゲル状組成物は、細胞外マトリックス成分、アガロース、ペクチン、フィブリン・モノマーのうちの少なくとも１種がゲル化したゲル状成分を含んでいてもよい。
　続いて、工程（ｃ）において、工程（ｂ）で得たゲル状組成物をインキュベートして立体的細胞組織を得る。立体的細胞組織を得るためにゲル状組成物を培養する時間は、５分～１９２時間であってもよく、１２時間～１４４時間であってもよく、２４時間から７２時間であってもよい。工程（ｃ）により、ゲル状組成物に含まれる細胞同士の接着が促進されて立体的細胞組織として安定的なものになるという効果が得られる。
　工程（ｃ）における細胞の培養は、培養される細胞に適した培養条件下で行うことができる。当業者は、細胞の種類や所望の機能に応じて適切な培地を選択することができる。培地としては特に限定されないが、例えば、ＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、ＭＥＭα、ＲＰＭＩ－１６４０及びＭｃＣｏｙ’ｓ　５Ａ、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ－１２等の培地、及びこれらに血清を１～２０容量％程度添加した培地が挙げられる。血清としては、ウシ血清（ＣＳ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及びウマ胎児血清（ＨＢＳ）等が挙げられる。培養環境の温度や大気組成等の諸条件も、培養される細胞に適した条件に調整すればよい。
　工程（ｃ）で用いる容器としては、工程（ｂ）で用いる容器と同様のものが挙げられる。工程（ｃ）において、工程（ｂ）で用いた容器をそのまま用いてもよいし、別の容器に移し替えてもよい。
　細胞の培養時に、得られた立体的細胞組織の変形（例えば、組織の収縮、組織末端の剥離等）を抑制するための物質を培地に添加してもよい。このような物質としては、Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ　ｆｏｒｍｉｎｇ　ｋｉｎａｓｅ／Ｒｈｏ結合キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤であるＹ－２７６３２等が挙げられるが、これに限定されない。
　工程（ａ）及び工程（ｂ）を２回以上行った後に工程（ｃ）を行ってもよい。工程（ａ）及び工程（ｂ）を繰り返すことにより、複数の層を有する立体的細胞組織を製造することができる。すなわち、厚さの大きい立体的細胞組織を製造することができる。
　また、工程（ａ）及び工程（ｂ）を繰り返し、繰り返すたびに異なる細胞集団を使用して、異なる種類の細胞によって構成される立体的細胞組織を積層してもよい。例えば、１回目の工程（ａ）と工程（ｂ）を行った後に、１回目の工程（ａ）とは異なる細胞集団を用いて２回目の工程（ａ）を行う。その後、２回目の工程（ｂ）を行うことで、１回目の工程（ａ）で用いた細胞集団を含む層の上に、２回目の工程（ａ）で用いた細胞集団を含む層を形成することができる。このように工程（ａ）及び工程（ｂ）を複数回繰り返すことで、複数種の細胞集団によって構成される立体的細胞組織を積層することができる。
（細胞集合体）
　本実施形態の製造方法は、ゲル状組成物を得る工程（ｂ）の前に、工程（ａ）で得た混合物に外力を加えて、細胞、カチオン性物質、細胞外マトリックス成分及び高分子電解質を含む細胞集合体を得る工程（ａ’）を更に含み、ゲル状組成物を得る工程（ｂ）において、工程（ａ）で得た混合物に代えて工程（ａ’）で得た細胞集合体をゲル化させてゲル状組成物を得るものであってもよい。
　この場合、本実施形態の立体的細胞組織の製造方法は、細胞、カチオン性物質、細胞外マトリックス成分及び高分子電解質を含む混合物を得る工程（ａ）と、前記混合物に外力を加えて、細胞、カチオン性物質、細胞外マトリックス成分及び高分子電解質を含む細胞集合体を得る工程（ａ’）と、前記細胞集合体をゲル化させてゲル状組成物を得る工程（ｂ’）と、前記ゲル状組成物をインキュベートして立体的細胞組織を得る工程（ｃ）とを含むことになる。
　本明細書において、「細胞集合体」とは、細胞が集合して一体となった構造体を意味する。細胞集合体には、遠心分離やろ過等によって得られる細胞の沈殿体も含まれる。ある実施形態では、細胞集合体はスラリー状の粘稠体である。「スラリー状の粘稠体」とは、Akihiro Nishiguchi et al., Cell-cell crosslinking by bio-molecular recognition of heparin-based layer-by-layer nanofilms, Macromol Biosci., 15 (3), 312-317, 2015. に記載されるようなゲル状の細胞集合体を指す。
　細胞集合体は、工程（ａ）で得た混合物を適切な容器に入れて静置することによって形成することもできるし、工程（ａ）で得た混合物を適切な容器に入れて、例えば、遠心分離、磁性分離又はろ過等によって、細胞を集めて細胞集合体を形成してもよい。すなわち、工程（ａ’）における、外力を加えるとは、静置して重力を作用させること、遠心分離、磁性分離又はろ過等を行うこと等であってよい。静置、遠心分離、磁性分離又はろ過等によって細胞を集めた場合、液体部分は除去してもよいし、除去しなくてもよい。
　工程（ａ’）で用いる容器としては、細胞の培養に用いるための培養容器が挙げられる。培養容器は、細胞や微生物の培養に通常用いられている素材及び形状を有する容器であってよい。培養容器の素材としては、ガラス、ステンレス及びプラスチック等が挙げられるが、これらに限定されない。培養容器としては、ディッシュ、チューブ、フラスコ、ボトル、ウェルプレート及びセルカルチャーインサート等が挙げられるが、これらに限定されない。容器は、少なくともその一部が、液体中の細胞を通過させず、液体を通すことが可能な材料で形成されていることが好ましい。このような容器としては、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）インサート、Ｎｅｔｗｅｌｌ（登録商標）インサート、Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）セルカルチャーインサート及びＭｉｌｌｉｃｅｌｌ（登録商標）セルカルチャーインサート等のセルカルチャーインサートが挙げられるが、これらに限定されない。
　遠心分離の条件は、細胞の生育に悪影響を及ぼさない限り、特に限定されない。例えば、混合物をセルカルチャーインサートに入れ、１０℃、４００×ｇで１分間の遠心分離に供することで、細胞を集め、細胞集合体を得ることができる。
　細胞集合体をゲル化させてゲル状組成物を得る工程（ｂ’）は、上述した、工程（ａ）で得た混合物をゲル化させてゲル状組成物を得る工程（ｂ）と同様にして行うことができる。
　例えば、ゲル化剤として細胞外マトリックス成分を用いる場合、工程（ａ’）で得た細胞集合体を約３７℃で静置してもよいし、工程（ａ’）で得た細胞集合体に、細胞外マトリックス成分を更に添加したうえで、約３７℃で静置してゲル化してもよい。また、工程（ａ’）で得た混合物にカルシウム塩等の添加剤を加えてもよい。
　また、ゲル化剤としてアガロースを用いる場合、工程（ａ’）で得た細胞集合体にアガロースを添加して、使用するアガロースの融点以上の温度条件下でアガロースを溶解させた後、使用するアガロースの凝固点以下の温度条件下で静置してゲル化してもよい。一例として、アガロースを溶解させる温度は、５０℃～９０℃が挙げられる。また、溶解したアガロースをゲル化する温度は、３７℃～４０℃が挙げられる。
　また、ゲル化剤としてペクチンを用いる場合、工程（ａ’）で得た細胞集合体にペクチンを添加してもよい。その結果、混合物中に含まれるカルシウムイオン等の２価のイオンによりペクチンがゲル化し、ゲル状組成物が得られる。
　また、ゲル化剤として、フィブリノゲン及びトロンビンを使用してもよい。すなわち、ゲル状組成物を得る工程（ｂ’）が、工程（ａ’）で得た細胞集合体に、トロンビン及びフィブリノゲンを混合する工程を含んでいてもよい。そして、工程（ｂ’）におけるゲル状組成物は、ゲル状成分としてフィブリンゲルを含んでいてもよい。
　この場合、ゲル状組成物を得る工程（ｂ’）が、工程（ａ’）で得た細胞集合体にトロンビンを添加する工程（ｂ１’）と、トロンビンを添加した細胞集合体にフィブリノゲンを添加し、その結果、フィブリンゲルが形成されて混合物がゲル化する工程（ｂ２’）とを含むことが好ましい。
　続いて、工程（ｃ）において、工程（ｂ’）で得たゲル状組成物をインキュベートして立体的細胞組織を得る。工程（ｃ）については上述したものと同様である。
［立体的細胞組織］
　一実施形態において、本発明は、細胞、カチオン性物質、細胞外マトリックス成分、高分子電解質及びゲル状成分を含む、立体的細胞組織を提供する。もう一つの態様として、本発明は、細胞、カチオン性物質、高分子電解質及びゲル状成分を含む、立体的細胞組織を提供する。本実施形態の立体的細胞組織は、経時的な厚さの減少が抑制されている。
　本実施形態の立体的細胞組織は、製造から８日目の前記立体的細胞組織の上面から見たときの重心を通る線に沿って取得した切片の厚さの最大値が、製造直後の前記立体的細胞組織の上面から見たときの重心を通る線に沿って取得した切片の厚さの最大値の８０％以上であることが好ましく、９０％以上であることが好ましく、９５％以上であることが好ましく、１００％以上であってもよい。ここで、「製造から８日目」及び「製造直後」については上述したものと同様である。
　本実施形態の立体的細胞組織において、細胞、カチオン性物質、細胞外マトリックス成分、高分子電解質及びゲル状成分、については上述したものと同様である。
　なお、ゲル状成分とは、細胞外マトリックス成分、アガロース、ペクチン及びフィブリン・モノマーのうちの少なくとも１種がゲル化したゲル状成分である。
　ゲル状成分がゲル化した細胞外マトリックスである場合、別の細胞外マトリックスを含んでいなくてもよく、具体的には、立体的細胞組織は、細胞、カチオン性物質、高分子電解質及びゲル状成分を含んでいてもよい。また、ゲル状成分がアガロース、ペクチン及びフィブリン・モノマーのうちの少なくとも１種がゲル化したゲル状成分である場合、立体的細胞組織は、細胞、細胞外マトリックス成分、カチオン性物質、高分子電解質及びゲル状成分を含んでいてもよい。
　ゲル状成分が、アガロースがゲル化したゲル状成分である場合、立体的細胞組織に含まれるゲル状成分の含有量は、立体的細胞組織の総体積に対し０．５％～４％であってもよい。
　ゲル状成分が、ペクチンがゲル化したゲル状成分である場合、立体的細胞組織に含まれるゲル状成分の含有量は、立体的細胞組織の総体積に対し０．３～１．０％であってもよい。
　ゲル状成分が、フィブリン・モノマーがゲル化したゲル状成分である場合、立体的細胞組織に含まれるゲル状成分の含有量は、立体的細胞組織の総体積に対し、０．５ｍｇ／ｍＬ以上７０ｍｇ／ｍＬ以下であってもよく、０．５ｍｇ／ｍＬ以上４５ｍｇ／ｍＬ以下であることが好ましく、０．５ｍｇ／ｍＬ以上２５ｍｇ／ｍＬ以下であることがより好ましい。
　別の側面として、本発明は以下の態様を包含する。
［１］細胞、カチオン性物質、細胞外マトリックス成分及び高分子電解質を含む混合物を得る工程と、前記混合物にトロンビン及びフィブリノゲンの少なくとも一方を混合しゲル状組成物を得る工程と、前記ゲル状組成物をインキュベートして立体的細胞組織を得る工程と、を含む、立体的細胞組織の製造方法。
［２］前記ゲル状組成物を得る工程が、前記混合物に前記フィブリノゲンを混合し、ゲル状組成物を得る工程である、［１］に記載の立体的細胞組織の製造方法。
［３］前記ゲル状組成物を得る工程が、前記混合物に前記トロンビンを添加する工程と、前記トロンビンを添加した前記混合物に前記フィブリノゲンを添加する工程と、を含む、［１］に記載の製造方法。
［４］前記混合物における、前記フィブリノゲンの含有量が、０．５ｍｇ／ｍＬ以上６０ｍｇ／ｍＬ以下である、［１］～［３］のいずれか１つに記載の製造方法。
［５］前記混合物における、前記トロンビンの含有量が、１．０ｍｇ／ｍＬ以上４０ｍｇ／ｍＬ以下である、［１］～［４］のいずれか１つに記載の製造方法。
［６］前記細胞外マトリックス成分が、コラーゲン、ラミニン及びフィブロネクチンからなる群より選択される少なくとも一つの細胞外マトリックスである、［１］～［５］のいずれか１つに記載の製造方法。
［７］前記細胞外マトリックス成分が、コラーゲンである、［１］～［６］のいずれか１つに記載の製造方法。
［８］前記混合物における、前記細胞外マトリックス成分の含有量の合計が、０．００５ｍｇ／ｍＬ以上１．５ｍｇ／ｍＬ以下である、［１］～［７］のいずれか１つに記載の製造方法。
［９］前記高分子電解質が、グリコサミノグリカンである、［１］～［８］のいずれか１つに記載の製造方法。
［１０］前記高分子電解質が、ヘパリン、コンドロイチン硫酸及びデルマタン硫酸からなる群から選択される少なくとも一つのグリコサミノグリカンである、［９］に記載の製造方法。
［１１］前記混合物における、前記高分子電解質の含有量が、０．００５ｍｇ／ｍＬ以上である、［１］～［１０］のいずれか１つに記載の製造方法。
［１２］前記ゲル状組成物を得る工程の前に、前記混合物に外力を加えて、前記細胞、前記カチオン性物質、前記細胞外マトリックス成分及び前記高分子電解質を含む細胞集合体を得る工程を更に含み、前記ゲル状組成物を得る工程において、前記混合物に代えて前記細胞集合体をゲル化させてゲル状組成物を得る、［１］～［１１］のいずれか１つに記載の製造方法。
［１３］細胞、カチオン性物質、細胞外マトリックス成分、高分子電解質及びゲル化したフィブリン・モノマーを含む、立体的細胞組織。
［１４］前記立体細胞組織における、前記ゲル化したフィブリン・モノマーの含有量が、０．５ｍｇ／ｍＬ以上６０ｍｇ／ｍＬ以下である、［１３］に記載の立体的細胞組織。
［１５］製造から８日目の前記立体的細胞組織の上面から見たときの重心を通る線に沿って取得した切片の厚さの最大値が、製造直後の前記立体的細胞組織の上面から見たときの重心を通る線に沿って取得した切片の厚さの最大値の８０％以上である、［１３］又は［１４］に記載の立体的細胞組織。
　次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実験例１］
（立体的細胞組織の製造）
　フィブリンゲルを含まない立体的細胞組織、及び、フィブリンゲルを含む立体的細胞組織をそれぞれ製造した。細胞としてヒト新生児由来皮膚線維芽細胞ＮＨＤＦ（型番「ＣＣ－２５０９」、ロンザ社）を使用した。
《フィブリンゲルを含まない立体的細胞組織の製造》
　１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１％抗生物質溶液（ペニシリン、ストレプトマイシン）を含むＤＭＥＭ培地（型番「０４３－３００８５」、富士フイルム和光純薬）を調製した（以下、「汎用培地」という場合がある。）。また、汎用培地と血管細胞用培地（製品名「ＥＧＭ－２ＭＶ」、型番「ＣＣ－３２０２」、ロンザ社）を１：１（体積比）となるように混合した培地を調製した（以下、「専用培地」という場合がある。）。
　１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６及び８×１０６個のＮＨＤＦ細胞を、それぞれ０．０５ｍｇ／ｍＬヘパリン（型番「Ｈ３１４９－１００ＫＵ」、シグマ社）及び０．０５ｍｇ／ｍＬコラーゲン（型番「ＡＳＣ－１－１００－１００」、シグマ社）を含む、５０ｍＭトリス－塩酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）にそれぞれ懸濁した。
　続いて、各細胞懸濁液を、室温、１，０００×ｇ（重力加速度）で１分間遠心し、上清を取り除き、適量の専用培地でそれぞれ再懸濁した。続いて、各細胞懸濁液を、２４ウェルセルカルチャーインサート（型番「３４７０」、コーニング社）内に播種した。
　続いて、セルカルチャーインサートを、室温、４００×ｇで１分間遠心し、細胞集合体を得た。続いて、セルカルチャーインサートに、適量の専用培地を追加し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で８日間培養した。その間適宜培地交換を行った。
《フィブリンゲルを含む立体的細胞組織の製造》
　上述した汎用培地に、終濃度１０Ｕｎｉｔ／ｍＬとなるようにトロンビン（型番「Ｔ４６４８－１０ＫＵ」、シグマ社）を溶解し、トロンビン溶液を調製した。
　また、ＤＭＥＭ培地に終濃度１０ｍｇ／ｍＬとなるようにフィブリノゲン（型番「Ｆ８６３０－５Ｇ」、シグマ社）を溶解し、フィブリノゲン溶液を調製した。更に、フィブリノゲン溶液と汎用培地を１：１（体積比）となるように混合した培地を調製した（以下、「フィブリノゲン添加培地」という場合がある。）。
　続いて、１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、８×１０６個のＮＨＤＦ細胞を、０．０５ｍｇ／ｍＬヘパリン（型番「Ｈ３１４９－１００ＫＵ」、シグマ社）、０．０５ｍｇ／ｍＬコラーゲン（型番「ＡＳＣ－１－１００－１００」、シグマ社）を含む、５０ｍＭトリス－塩酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）にそれぞれ懸濁した。
　続いて、各細胞懸濁液を、室温、１，０００×ｇで１分間遠心し、上清を取り除いた後、トロンビン溶液でそれぞれ再懸濁した。続いて、細胞を溶解したトロンビン溶液とフィブリノゲン添加培地を１：２（体積比）となるように混合し、この混合溶液１００μＬを、２４ウェルセルカルチャーインサート（型番「３４７０」、コーニング社）内に播種した。
　続いて、セルカルチャーインサートを、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内でゲル化するまで静置した。続いて、セルカルチャーインサートに、適量の専用培地を追加し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で８日間培養した。その間適宜培地交換を行った。
《組織断面解析》
　細胞集合体の培養開始から１日後及び８日後に、ホルマリン緩衝液（型番「062-01661」、富士フイルム和光純薬）を用いて各立体的細胞組織を固定した。続いて、各立体的細胞組織をセルカルチャーインサートから取り出し、パラフィンで包埋後、立体的細胞組織の上面（言い換えると、セルカルチャーインサートの上面）から見たときの重心を通る線に沿って薄切切片を作製した。続いて、薄切切片をヘマトキシリン・エオシン（ＨＥともいう）染色して顕微鏡で観察し、立体的細胞組織の厚さの最大値を測定した。
　図１Ａ～図１Ｄは、各立体的細胞組織の薄切切片の代表的な顕微鏡写真である。図１Ａは、フィブリンゲルを含まない立体的細胞組織（細胞数２×１０６個で製造）の培養開始から１日後の組織切片の顕微鏡写真である。図１Ｂは、フィブリンゲルを含まない立体的細胞組織（細胞数２×１０６個で製造）の培養開始から８日後の組織切片の顕微鏡写真である。図１Ｃは、フィブリンゲルを含む立体的細胞組織（細胞数２×１０６個で製造）の培養開始から１日後の組織切片の顕微鏡写真である。図１Ｄは、フィブリンゲルを含む立体的細胞組織（細胞数２×１０６個で製造）の培養開始から８日後の組織切片の顕微鏡写真である。
　下記表１に、フィブリンゲルを含まない各立体的細胞組織の厚さの最大値を測定した結果を示す。表２に、フィブリンゲルを含む各立体的細胞組織の厚さの最大値を測定した結果を示す。表１及び２中、「１日後厚さ」は培養開始から１日後の立体的細胞組織の上面から見たときの重心を通る線に沿って取得した切片の厚さの最大値（μｍ）を意味し、「８日後厚さ」は培養開始から８日後の立体的細胞組織の上面から見たときの重心を通る線に沿って取得した切片の厚さの最大値（μｍ）を意味する。また、「作製不可」は、細胞がセルカルチャーインサートから剥離し、立体的細胞組織を作製できなかったことを意味し、「測定不能」は、測定できなかったことを意味する。
　また、表１及び２中、「厚さ維持率」は、下記式（１）に基づいて算出した値である。
　厚さ維持率（％）＝培養開始から８日後の立体的細胞組織の上面から見たときの重心を通る線に沿って取得した切片の厚さの最大値／培養開始から１日後の立体的細胞組織の上面から見たときの重心を通る線に沿って取得した切片の厚さの最大値×１００　…（１）
　また、表１及び２中、「維持可否」は以下の評価基準にしたがって評価した結果である。
　（評価基準）
　〇…上記式（１）に基づいて算出した厚さ維持率が８０％以上
　×…上記式（１）に基づいて算出した厚さ維持率が８０％未満
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　その結果、フィブリンゲルを含む立体的細胞組織は、いずれの細胞数の条件においても、厚さ維持率が８０％以上を達成でき、立体的細胞組織の経時的な厚さの減少を抑制できたことが確認された。
　これに対し、フィブリンゲルを含まない立体的細胞組織では、８×１０６個の細胞を用いた条件において、立体的細胞組織を作製することができなかった。また、その他の細胞数の条件においても、厚さ維持率が８０％未満となり、立体的細胞組織の経時的な厚さの減少が確認された。
　また、フィブリンゲルを含む立体的細胞組織では、フィブリンゲルを含まない立体的細胞組織と比較して、より厚い組織を形成することができることが明らかとなった。
［実験例２］
（立体的細胞組織の製造１）
　フィブリンゲルを含む立体的細胞組織を製造した。細胞としてヒト新生児由来皮膚線維芽細胞ＮＨＤＦ（型番「ＣＣ－２５０９」、ロンザ社）とヒト臍帯静脈内皮細胞（ＧＦＰ－ＨＵＶＥＣ）（型番：ｃＡＰ－０００１ＧＦＰ、フナコシ社製）を使用した。
　上述した汎用培地に、終濃度がそれぞれ０．５、１、５、１０、２０、及び４０Ｕｎｉｔ／ｍＬとなるようにトロンビン（型番「Ｔ４６４８－１０ＫＵ」、シグマ社）を溶解し、トロンビン溶液を調製した。
　また、ＤＭＥＭ培地に終濃度がそれぞれ０．５、１、５．１０、３０、６０ｍｇ／ｍＬとなるようにフィブリノゲン（型番「Ｆ８６３０－５Ｇ」、シグマ社）を溶解し、フィブリノゲン溶液を調製した。更に、フィブリノゲン溶液と汎用培地を１：１（体積比）となるように混合した培地を調製した（以下、「フィブリノゲン添加培地」という場合がある。）。
　続いて、２×１０６個のＮＨＤＦ細胞及び４×１０５個のＧＦＰ－ＨＵＶＥＣを０．００５ｍｇ／ｍＬヘパリン（型番「Ｈ３１４９－１００ＫＵ」、シグマ社）及び０．０５ｍｇ／ｍＬコラーゲン（型番「ＡＳＣ－１－１００－１００」、シグマ社）を含む、５０ｍＭトリス－塩酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）にそれぞれ懸濁した。
　続いて、各細胞懸濁液を、室温、１，０００×ｇで１分間遠心し、上清を取り除いた後、トロンビン溶液でそれぞれ再懸濁した。続いて、細胞を溶解したトロンビン溶液とフィブリノゲン添加培地を１：２（体積比）となるように混合し、この混合溶液１００μＬを、２４ウェルセルカルチャーインサート（型番「３４７０」、コーニング社）内に播種した。
　続いて、セルカルチャーインサートを、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内でゲル化するまで静置した。続いて、セルカルチャーインサートに、適量の上述の専用培地を追加し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で８日間培養した。その間適宜培地交換を行った。
《組織断面解析》
　細胞集合体の培養開始から１日後及び８日後に、ホルマリン緩衝液（型番「０６２-０１６６１」、富士フイルム和光純薬）を用いて各立体的細胞組織を固定した。続いて、各立体的細胞組織をセルカルチャーインサートから取り出し、パラフィンで包埋後、立体的細胞組織の上面（言い換えると、セルカルチャーインサートの上面）から見たときの重心を通る線に沿って薄切切片を作製した。続いて、薄切切片をヘマトキシリン・エオシン（ＨＥ）染色して顕微鏡で観察し、立体的細胞組織の厚さの最大値を測定した。
　下記表３に、実験例１と同様の評価基準で評価した各立体細胞組織の「維持可否」評価結果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　その結果、トロンビン終濃度が５ｍｇ／ｍＬ以上の場合、フィブリノゲン終濃度が０．５ｍｇ／ｍＬ以上であるいずれの条件で製造された立体的細胞組織においても、立体的細胞組織の厚さ維持率が８０％以上であることを達成でき、立体的細胞組織の経時的な厚さの減少を抑制できたことが確認された。
　トロンビン終濃度が１ｍｇ／ｍＬの場合は、フィブリノゲン終濃度が０．５～５ｍｇ／ｍＬの範囲において厚さ維持率が８０％以上であることを達成でき、立体的細胞組織の経時的な厚さの減少を抑制できたことが確認された。
［実験例３］
（立体的細胞組織の製造２）
　細胞外マトリックスをゲル化した立体的細胞組織を製造した。細胞としてヒト新生児由来皮膚線維芽細胞ＮＨＤＦ（型番「ＣＣ－２５０９」、ロンザ社）とヒト臍帯静脈内皮細胞（ＧＦＰ－ＨＵＶＥＣ）（型番：ｃＡＰ－０００１ＧＦＰ、フナコシ社製）を使用した。
《ゲル化した細胞外マトリックスを含まない立体的細胞組織の製造》
　１×１０６個のＮＨＤＦ細胞及び２×１０５個のＧＦＰ－ＨＵＶＥＣを０．０５ｍｇ／ｍＬヘパリン（型番「Ｈ３１４９－１００ＫＵ」、シグマ社）を含む、５０ｍＭトリス－塩酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）に懸濁した。同様に、２×１０６個のＮＨＤＦ細胞及び４×１０５個のＧＦＰ－ＨＵＶＥＣを上述の５０ｍＭトリス－塩酸緩衝溶液に懸濁した。
　続いて、各細胞懸濁液を、室温、１，０００×ｇ（重力加速度）で１分間遠心し、上清を取り除き、適量の上述の専用培地でそれぞれ再懸濁した。続いて、各細胞懸濁液を、２４ウェルセルカルチャーインサート（型番「３４７０」、コーニング社）内に播種した。
　続いて、セルカルチャーインサートを、室温、４００×ｇで１分間遠心し、細胞集合体を得た。続いて、セルカルチャーインサートに、適量の上述の専用培地を追加し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で８日間培養した。その間適宜培地交換を行った。
《ゲル化した細胞外マトリックスを含む立体的細胞組織の製造》
　１×１０６個のＮＨＤＦ細胞及び２×１０５個のＧＦＰ－ＨＵＶＥＣを０．０５ｍｇ／ｍＬヘパリン（型番「Ｈ３１４９－１００ＫＵ」、シグマ社）を含む５０ｍＭトリス－塩酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）に懸濁した。同様に、２×１０６個のＮＨＤＦ細胞４×１０５個のＧＦＰ－ＨＵＶＥＣを０．０５ｍｇ／ｍＬヘパリン（型番「Ｈ３１４９－１００ＫＵ」、シグマ社）を含む５０ｍＭトリス－塩酸緩衝溶液に懸濁した。
　続いて、各細胞懸濁液を、室温、１，０００×ｇで１分間遠心し、上清を取り除いた後、コラーゲン（ＣｅＩｌｍａｔｒｉｘ　Ｔｙｐｅ　Ｉ－Ａ、新田ゼラチン社）をメーカー所定の手順で調製後混合し、この混合溶液１００μＬを、２４ウェルセルカルチャーインサート（型番「３４７０」、コーニング社）内に播種した。
　続いて、セルカルチャーインサートを、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で混合溶液がゲル化するまで静置した。続いて、セルカルチャーインサートに、適量の上述の専用培地を追加し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で８日間培養した。その間適宜培地交換を行った。
《組織断面解析》
　細胞集合体の培養開始から１日後及び８日後に、ホルマリン緩衝液（型番「０６２-０１６６１」、富士フイルム和光純薬）を用いて各立体的細胞組織を固定した。続いて、各立体的細胞組織をセルカルチャーインサートから取り出し、パラフィンで包埋後、立体的細胞組織の上面（言い換えると、セルカルチャーインサートの上面）から見たときの重心を通る線に沿って薄切切片を作製した。続いて、薄切切片をヘマトキシリン・エオシン（ＨＥ）染色して顕微鏡で観察し、立体的細胞組織の厚さの最大値を測定した。
　下記表４に、ゲル化した細胞外マトリックスを含む各立体的細胞組織及びゲル化した細胞外マトリックスを含む立体的細胞組織の厚さの最大値を測定した結果、厚さ維持率及び実施例１と同様の評価基準で評価した各立体細胞組織の「維持可否」評価結果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　その結果、ゲル化した細胞外マトリックスを含む立体的細胞組織は、いずれの細胞数の条件においても、厚さ維持率が８０％以上を達成でき、立体的細胞組織の経時的な厚さの減少を抑制できたことが確認された。
　これに対し、ゲル化した細胞外マトリックスを含まない立体的細胞組織では、いずれの細胞数の条件においても、厚さ維持率が８０％未満となり、立体的細胞組織の経時的な厚さの減少が確認された。
　また、ゲル化した細胞外マトリックスを含む立体的細胞組織では、ゲル化した細胞外マトリックスを含まない立体的細胞組織と比較して、より厚い組織を形成することができることが明らかとなった。
　本発明によれば、立体的細胞組織の経時的な厚さの減少を抑制する技術を提供することができる。

Claims (14)

  1. 　細胞、カチオン性物質、細胞外マトリックス成分及び高分子電解質を含む混合物を得る工程と、
    　前記混合物をゲル化させてゲル状組成物を得る工程と、
    　前記ゲル状組成物をインキュベートして立体的細胞組織を得る工程と、
    　を含む、立体的細胞組織の製造方法。
  2. 　前記ゲル状組成物が、前記細胞外マトリックス成分、アガロース、ペクチン及びフィブリン・モノマーからなる群より選択される少なくとも１種がゲル化したゲル状成分を含む、請求項１に記載の製造方法。
  3. 　前記ゲル状成分が、フィブリン・モノマーがゲル化したフィブリンゲルであり、前記ゲル状組成物を得る工程が、前記混合物に、トロンビン及びフィブリノゲンを混合する工程を含む、請求項２に記載の製造方法。
  4. 　前記ゲル状組成物を得る工程が、
    　前記混合物に前記トロンビンを添加する工程と、
    　前記トロンビンを添加した前記混合物に前記フィブリノゲンを添加し、その結果、前記フィブリンゲルが形成されて前記混合物がゲル化する工程と、
    　を含む、請求項３に記載の製造方法。
  5. 　前記細胞外マトリックス成分が、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、エラスチン、テネイシン、エンタクチン、フィブリン、プロテオグリカン及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載の製造方法。
  6. 　前記混合物における、前記細胞外マトリックス成分の含有量の合計が、０．００５ｍｇ／ｍＬ以上１．５ｍｇ／ｍＬ以下である、請求項１～５のいずれか一項に記載の製造方法。
  7. 　前記高分子電解質が、グリコサミノグリカン、デキストラン硫酸、ラムナン硫酸、フコイダン、カラギナン、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリルアミド－２－メチルプロパンスルホン酸、ポリアクリル酸及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１～６のいずれか一項に記載の製造方法。
  8. 　前記混合物における、前記高分子電解質の含有量が、０．００５ｍｇ／ｍＬ以上である、請求項１～７のいずれか一項に記載の製造方法。
  9. 　前記ゲル状組成物を得る工程の前に、前記混合物に外力を加えて、前記細胞、前記カチオン性物質、前記細胞外マトリックス成分及び前記高分子電解質を含む細胞集合体を得る工程を更に含み、
    　前記ゲル状組成物を得る工程において、前記混合物に代えて前記細胞集合体をゲル化させてゲル状組成物を得る、請求項１～８のいずれか一項に記載の製造方法。
  10. 　細胞、カチオン性物質、細胞外マトリックス成分、高分子電解質及びゲル状成分を含む、立体的細胞組織。
  11. 　細胞、カチオン性物質、高分子電解質及びゲル状成分を含む、立体的細胞組織。
  12. 　前記ゲル状成分は、第１の細胞外マトリックス成分、アガロース、ペクチン及びフィブリン・モノマーからなる群より選択される少なくとも１種がゲル化したゲル状成分である請求項１１に記載の立体的細胞組織。
  13. 　さらに、第２の細胞外マトリックス成分を含み、前記ゲル状成分は、アガロース、ペクチン及びフィブリン・モノマーからなる群より選択される少なくとも１種がゲル化したゲル状成分である［１１］に記載の立体的細胞組織。
  14. 　製造から８日目の前記立体的細胞組織の上面から見たときの重心を通る線に沿って取得した切片の厚さの最大値が、製造直後の前記立体的細胞組織の上面から見たときの重心を通る線に沿って取得した切片の厚さの最大値の８０％以上である、請求項１０～１３のいずれか一項に記載の立体的細胞組織。
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