WO2022138708A1 - 抗ＥｐｈＡ４抗体 - Google Patents

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Definitions

  • the present disclosure relates to an antibody that binds to EphA4, a nucleic acid encoding the antibody, a vector containing the nucleic acid, a cell containing the vector, a method for producing the antibody, and a pharmaceutical composition containing the antibody.
  • EphA4 is a member of the receptor tyrosine kinase family. Ephrin type A and type B are known as ligands for EphA4, and binding of EphA4 and its ligand, ephrin, induces a debonding signal. So far, the involvement of EphA4 in the pathophysiology of Alzheimer's disease (hereinafter also referred to as "AD") has been suggested (Non-Patent Documents 1 to 4), and inhibition of binding between EphA4 and ephrin causes neurotransmission. (Patent Document 1) has been reported to relieve amyloid ⁇ (A ⁇ ) (1-42) oligomer-mediated dysfunction.
  • a ⁇ amyloid ⁇
  • Non-Patent Document 5 aggregates (neurofibrillary tangles) formed by excessively phosphorylated tau are considered to be involved in neuronal cell death (Non-Patent Document 5), and suppression of tau phosphorylation. It has been reported that neurodegeneration of synaptic disappearance is suppressed (Non-Patent Documents 6 and 7) and that memory impairment and cognitive dysfunction are improved (Non-Patent Documents 8 to 11). .. There are reports suggesting that the cause of tau phosphorylation is the activation of CDK5 (Non-Patent Documents 12 and 13).
  • EphA4 is highly expressed in the hippocampus and cerebral cortex, and is cleaved by matrix metalloproteinase (MMP), ADAM (a disintegrin and metalloproteinase) and ⁇ -secretase in a neural activity-dependent manner. It is known that this cleavage reaction of EphA4 stabilizes spine, which is a structure important for neural function (Non-Patent Document 14). It has been reported that the density of spines is reduced in AD (Non-Patent Document 15), and it is also confirmed that the cut fragments of EphA4 are reduced in AD of NFT stage V and VI. It is considered that the cleavage reaction of EphA4 is involved in the pathological condition (Non-Patent Document 16).
  • MMP matrix metalloproteinase
  • ADAM disintegrin and metalloproteinase
  • Non-Patent Documents 15 and 17 a decrease in spine density correlates with cognitive dysfunction, which is a clinical symptom of AD
  • stabilizing spines increase in spine density. It has also been reported to improve cognitive function in an Alzheimer's disease model (Non-Patent Document 18), suggesting that stabilizing spines has therapeutic potential for AD.
  • Vargas LM et al. PLoS One. 2014 Mar 21; 9 (3) Fu AK et al. , Proc Natl Acad Sci US A. 2014 Jul 8; 111 (27): 9959-64 Rosenberger AF et al. , Acta Neuropathol Commun. 2014 Jul 16; 2:79 Hung TY et al. , J Exp Med. 2017 Dec 4; 214 (12): 3669-3685. SantaCruz et al. , Science. 2005 Jul 15; 309 (5733): 476-81 Seo J et al. , J Neuroscience. 2017 Oct 11; 37 (41): 9917-9924 Patrick GN et al. , Nature.
  • the present inventors have completed a target anti-EphA4 antibody that can bind to EphA4 and promote cleavage of EphA4.
  • the anti-EphA4 antibody is (A) Heavy chain CDR1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 30; (B) Heavy chain CDR2 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 31; and (c) Heavy chain containing heavy chain CDR3 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 32; and (d) Heavy chain consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 33.
  • Light chain CDR1; An anti-EphA4 antibody comprising (e) a light chain CDR2 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 34; and (f) a light chain comprising a light chain CDR3 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 35. or, (G) Heavy chain CDR1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 42; (H) Heavy chain CDR2 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 31; and (i) Heavy chain containing heavy chain CDR3 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 43; and (j) Heavy chain consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 44.
  • Light chain CDR1 An anti-EphA4 antibody comprising (k) a light chain CDR2 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 34; and (l) a light chain comprising the light chain CDR3 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 35.
  • the anti-EphA4 antibody according to (1).
  • the anti-EphA4 antibody is a human antibody, Anti-EphA4 antibody.
  • the anti-EphA4 antibody according to (1) or (2).
  • the anti-EphA4 antibody specifically binds to EphA4 and promotes cleavage of EphA4.
  • Anti-EphA4 antibody specifically binds to EphA4 and promotes cleavage of EphA4.
  • the anti-EphA4 antibody according to any one of (1) to (3).
  • the anti-EphA4 antibody specifically binds to EphA4 and inhibits the binding between EphA4 and ephrin.
  • Anti-EphA4 antibody specifically binds to EphA4 and inhibits the binding between EphA4 and ephrin.
  • the anti-EphA4 antibody according to any one of (1) to (4).
  • the heavy chain contains a variable region consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7.
  • the light chain comprises a variable region consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8.
  • Anti-EphA4 antibody is a variable region consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8.
  • the anti-EphA4 antibody according to any one of (1) to (5).
  • the constant region of the heavy chain and the constant region of the light chain contain an amino acid sequence derived from a human antibody.
  • Anti-EphA4 antibody Anti-EphA4 antibody.
  • the anti-EphA4 antibody according to (6) The constant region of the heavy chain is the constant region of human IgG, Anti-EphA4 antibody.
  • the anti-EphA4 antibody according to (7).
  • the constant region of human IgG 2 is a constant region of human IgG 2.
  • the anti-EphA4 antibody according to (8).
  • the constant region of human IgG 2 comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 15. Anti-EphA4 antibody.
  • the anti-EphA4 antibody according to any one of (1) to (4).
  • the heavy chain contains a variable region consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11.
  • the light chain comprises a variable region consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 12.
  • Anti-EphA4 antibody is an antigen specific antibody.
  • the anti-EphA4 antibody according to any one of (1) to (4) and (10).
  • the constant region of the heavy chain and the constant region of the light chain contain an amino acid sequence derived from a human antibody.
  • Anti-EphA4 antibody is an antibody that is derived from a human antibody.
  • the anti-EphA4 antibody according to (11) The constant region of the heavy chain is the constant region of human IgG, Anti-EphA4 antibody.
  • the anti-EphA4 antibody according to (12) The constant region of human IgG is a constant region of human IgG composed of a combination of human IgG 1 and human IgG 2 . Anti-EphA4 antibody.
  • the anti-EphA4 antibody according to (13).
  • the constant region of human IgG consisting of the combination of human IgG 1 and human IgG 2 comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16.
  • Anti-EphA4 antibody is an anti-EphA4 antibody.
  • the anti-EphA4 antibody according to any one of (6) to (9) and (11) to (14).
  • the constant region of the light chain is the constant region of human Ig ⁇ .
  • the anti-EphA4 antibody according to (15).
  • the constant region of human Ig ⁇ comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 17.
  • Anti-EphA4 antibody is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 17.
  • the anti-EphA4 antibody comprises heavy and light chains.
  • the heavy chain comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 20, and the light chain comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 21.
  • the C-terminal lysine of the heavy chain may be deleted.
  • the anti-EphA4 antibody comprises heavy and light chains.
  • the heavy chain comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 26, and the light chain comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 27.
  • the C-terminal lysine of the heavy chain may be deleted.
  • an anti-EphA4 antibody capable of binding to EphA4 and promoting cleavage of EphA4, a nucleic acid encoding the antibody, a vector containing the nucleic acid, a cell containing the vector, a method for producing the antibody, and the antibody thereof are used.
  • a pharmaceutical composition comprising as an active ingredient is provided.
  • FIG. 1 shows the binding affinity of anti-EphA4 monoclonal antibodies (antibodies A and B) for human EphA4.
  • FIG. 2 shows the human EphA4-human ligand binding inhibitory activity of anti-EphA4 monoclonal antibodies (antibodies A and B).
  • FIG. 3 shows the selectivity of anti-EphA4 monoclonal antibodies (antibodies A and B) for each human Eph receptor.
  • FIG. 4 shows the reactivity of anti-EphA4 monoclonal antibodies (antibodies A and B) to mouse, rat, monkey and human EphA4.
  • FIG. 1 shows the binding affinity of anti-EphA4 monoclonal antibodies (antibodies A and B) for human EphA4.
  • FIG. 2 shows the human EphA4-human ligand binding inhibitory activity of anti-EphA4 monoclonal antibodies (antibodies A and B).
  • FIG. 3 shows the selectivity of anti-EphA4 monoclo
  • FIG. 5 shows the human EphA4 extracellular region (ECD), ligand binding domain (LBD), fibronectin type III domain 1 (FN1), and fibronectin type III domain 2 (FN2) of anti-EphA4 monoclonal antibodies (antibodies A and B). Shows responsiveness to.
  • FIG. 6 shows the EphA4 cleavage promoting activity of anti-EphA4 monoclonal antibodies (antibodies A and B) in hippocampal neurons.
  • FIG. 7 shows the human EphA4 cleavage promoting activity of anti-EphA4 monoclonal antibodies (antibodies A and B) in hippocampal neurons.
  • FIG. 8 shows the increasing effect of anti-EphA4 monoclonal antibodies (antibodies A and B) on the number of spines in hippocampal neurons.
  • the present disclosure relates to anti-EphA4 antibodies that bind to EphA4.
  • the anti-EphA4 antibody according to the present disclosure is an antibody capable of recognizing and binding to EphA4, and as described below, the antibody may be an intact antibody or has a binding affinity with EphA4. As long as it has sex, it may be a synthetic antibody (for example, recombinant antibody, chimeric antibody, humanized antibody, etc.).
  • EphA4 can be understood to refer to EphA4 from humans, mice, rats and monkeys.
  • EphA4 derived from humans, mice, rats and monkeys can be obtained from public databases in which sequence information is registered, such as Genbank provided by the US Center for Biological Engineering, and the nucleotide sequence information of EphA4 of closely related animal species. By designing a primer based on the above and cloning from RNA extracted from a desired animal species, it is possible to obtain sequence information of the EphA4 gene.
  • sequence information of the EphA4 gene For example, the nucleotide sequence information of EphA4 in humans, mice, rats, and monkeys can be found in Genbank Accession No. It is registered in the database as NM_004438.5, NM_007936.3, NM_001162411.1, NM_00126087.1.1.
  • the anti-EphA4 antibody is an antibody that specifically binds to EphA4.
  • the term "specific binding” is a term well known to those of skill in the art in the art, and methods for determining specific binding of an antibody or antigen-binding fragment thereof to an antigen or epitope are also well known.
  • "specific binding” means that the anti-EphA4 antibody has greater binding affinity, binding activity, faster and / or longer duration than binding to other target molecules. It is then understood that it can bind to EphA4 by an immunological reaction. This does not mean that the antibody that specifically binds to EphA4 does not bind to other target molecules.
  • “specific binding” is by an antibody having a KD of at least about 10-7 M, or at least about 10-8 M, or at least about 10-9 M, or less to EphA4. Can be shown. In yet another embodiment, it is understood that "specific binding” binds to EphA4 by an immunological reaction, but not substantially to other family molecules of the Eph receptor.
  • the anti-EphA4 antibody is an antibody that binds to the extracellular space of EphA4. In one embodiment, the anti-EphA4 antibody is an antibody that binds to the ligand binding domain (LBD) of the extracellular space of EphA4.
  • LBD ligand binding domain
  • the anti-EphA4 antibody can specifically bind to EphA4 and promote cleavage of EphA4. In certain embodiments, the anti-EphA4 antibody can specifically bind to EphA4 and promote cleavage of the EphA4 extracellular domain by matrix metalloproteinase (MMP) or ADAM (a disintegrin and metalloproteinase).
  • MMP matrix metalloproteinase
  • ADAM a disintegrin and metalloproteinase
  • the anti-EphA4 antibody can specifically bind to EphA4 and inhibit the binding of EphA4 to its ligand, ephrin.
  • the anti-EphA4 antibody can specifically bind to EphA4 to increase the number of spines in hippocampal neurons or stabilize spines in hippocampal neurons.
  • the present disclosure includes, in one embodiment, an anti-EphA4 antibody capable of specifically binding to at least one of human EphA4, mouse EphA4, rat EphA4, and monkey EphA4 and inhibiting binding to its ligand. do.
  • the present disclosure comprises, in another embodiment, an anti-EphA4 antibody capable of specifically binding to two or more of human EphA4, mouse EphA4, rat EphA4, and monkey EphA4 and inhibiting binding to its ligands. do.
  • the present disclosure includes, in yet another embodiment, an anti-EphA4 antibody capable of specifically binding to all of human EphA4, mouse EphA4, rat EphA4, and monkey EphA4 and inhibiting binding to its ligands.
  • binding affinities include Biacore® biosensors, KinExA biosensors, scintillation proximity assays, ELISAs, ORIGEN immunoassays (IGEN), flow cytometry, fluorescence quenching, fluorescence transfer, yeast displays, and / or. , May be measured using immunostaining, but is not limited to these.
  • the neutralizing activity of the anti-EphA4 antibody against the binding of EphA4 to its ligand may be measured using, but not limited to, Biacore® biosensor, ELISA, and / or flow cytometry.
  • the anti-EphA4 antibody according to the present disclosure may be a monoclonal antibody as long as it binds to EphA4.
  • the anti-EphA4 antibody according to the present disclosure may be any class such as IgG, IgA or IgM (or a subclass thereof), and is not limited to a specific class.
  • Immunoglobulins are classified into different classes by the antibody amino acid sequence of the constant region of the heavy chain (sometimes called the H chain). There are five major immunoglobulin classes: IgA, IgD, IgE, IgG and IgM, some of which are, for example, the subclasses IgG 1 , IgG 2 , IgG 3 , IgG 4 , and IgA 1 and IgA 2 . It can be further subdivided into isotypes).
  • the corresponding heavy chain constant regions of different classes of immunoglobulins are called ⁇ , ⁇ , ⁇ , ⁇ and ⁇ , respectively.
  • the anti-EphA4 antibody according to the present disclosure may be an IgG antibody, for example, an IgG 1 antibody or an IgG 2 antibody. Further, the anti-EphA4 antibody according to the present disclosure may be in the form of a monomer, a dimer or a multimer, as the case may be.
  • the anti-EphA4 antibody according to the present disclosure may be a combination of IgG antibodies of different subclasses, for example, a human IgG (also referred to as human IgG 1/2 in the present disclosure) antibody composed of a combination of IgG 1 and IgG 2 . It's okay.
  • variable region of the antibody may mean the variable region of the antibody light chain and / or the variable region of the antibody heavy chain
  • the constant region of the antibody is the constant region of the antibody light chain and / or the antibody heavy chain. It may mean a constant region.
  • the variable regions of the heavy and light chains each consist of four framework regions (FRs) linked by three CDRs, also known as complementarity determining regions. The CDRs in each strand are held in the vicinity by FR and, together with the CDRs in the other strand, contribute to the formation of the antigen-binding site of the antibody.
  • the anti-EphA4 antibody according to the present disclosure comprises a heavy chain constant region and / or a light chain constant region derived from a human antibody.
  • a monoclonal antibody may mean an antibody obtained from a substantially homogeneous population of antibodies. That is, the individual antibodies contained in the population are identical except for some naturally occurring mutants that may be present. Monoclonal antibodies are for a single antigenic site and are highly specific. Moreover, in contrast to typical polyclonal antibodies that target different antigens or different epitopes, each monoclonal antibody targets a single epitope of the antigen.
  • the modifier "monoclonal" indicates the properties of an antibody obtained from a substantially homogeneous antibody population and should not be construed as limiting as requiring the production of the antibody by a particular method.
  • a human antibody means an antibody whose variable region and constant region sequences are derived from a human immunoglobulin sequence, but as long as it is derived from a human immunoglobulin sequence, for example, it increases binding affinity for a target.
  • sequences into which the desired modifications have been introduced such as modifications to reduce the heterogeneity of antibodies produced by non-human cells, as well as modifications to reduce, reduce immunogenicity, increase stability, etc.
  • antibodies include antibodies.
  • Appropriate modifications eg, modification of the antibody, or partial substitution, addition and / or lack of the amino acid sequence of the antibody
  • the lost antibody is also included in the anti-EphA4 antibody according to the present disclosure.
  • antibodies in which the amino acid sequence of the constant region is modified to modify the effector function of the antibody are also included in the scope of the present disclosure, for example, antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) activity and / or antibody-dependent.
  • ADCC antibody-dependent cellular cytotoxicity
  • valine (Val) at position 234 in Eunumbering of the human IgG2 antibody was replaced with alanine (Ala), and glycine (Gly) at position 237 was replaced with alanin (Ala).
  • Substituted antibodies and the like are also included in the scope of the present disclosure. Further disclosed are bispecific antibodies (Kontermann (2012), mAbs 4, 182-97) having antigen binding sites that bind to different antigens as well as antigen binding sites having CDR sequences of the anti-EphA4 antibodies according to the present disclosure. Included in the range of.
  • Human antibodies can be produced by methods known in the art.
  • an antibody having binding affinity for EphA4 is obtained from a known phage display human antibody library (naive library, synthetic library, etc.), and the variable region thereof is sequenced. It can be produced as a recombinant antibody by introducing it into non-human animal cells in combination with a desired human constant region sequence.
  • the human antibody immunizes one of many non-human transgenic animals, including some or all of the human immunoglobulin heavy and light chain loci in its genome, with the EphA4 antigen. Can be generated by doing.
  • the non-human animal comprising the human immunoglobulin gene is an animal having a human immunoglobulin "mini-locus" (eg, GenPharm International, Inc.).
  • the human antibody is a XenoMouse® mouse (Abgenix, Inc., Fremont, CA), a HuMAb-Mouse® mouse (Medarex, Inc.), a VelocImmune® mouse (registered trademark). It can be generated using Regeneron Pharmaceuticals, Inc.), AlivaMab mice (Abrexis, LLC), and the like.
  • the anti-EphA4 antibody according to the present disclosure may be modified if desired.
  • Modifications of anti-EphA4 antibodies include (a) the three-dimensional structure of the amino acid sequence in the modified region, such as a sheet or helix conformation; (b) the charge or hydrophobic state of the molecule at the target site; or (C)
  • the modification may be a modification that alters the effect of the modification on the maintenance of the volume of the side chain, or it may be a modification such that these changes are not clearly observed.
  • Modification of the anti-EphA4 antibody according to the present disclosure may be achieved by, for example, substitution, deletion, addition or the like of a constituent amino acid residue.
  • amino acid is used in its broadest sense and is a natural amino acid such as serine (Ser), asparagine (Asn), valine (Val), leucine (Leu), isoleucine (Ile), alanine (Ala).
  • Tyrosine Tyr
  • Glycin Gly
  • Lycin Lycin
  • Alanine Arg
  • Histidine His
  • Aspartic acid Asp
  • Glutamic acid Glu
  • Glutamine Gln
  • Threonin Thr
  • Cysteine It includes not only Cys), methionine (Met), phenylalanine (Phe), tryptophan (Trp), proline (Pro), but also unnatural amino acids such as amino acid variants and derivatives.
  • amino acids herein include, for example, L-amino acids; D-amino acids; chemically modified amino acids such as amino acid variants, amino acid derivatives; norleucine, ⁇ -alanine, and the like. It is naturally understood that amino acids such as ornithine, which are not constituents of proteins in vivo; and chemically synthesized compounds having the characteristics of amino acids known to those skilled in the art can be mentioned.
  • unnatural amino acids include ⁇ -methyl amino acids ( ⁇ -methylalanine, etc.), D-amino acids (D-aspartic acid, D-glutamic acid, etc.), and histidine-like amino acids (2-amino-histidine, ⁇ -hydroxy-histidine, etc.).
  • Homo histidine, ⁇ -fluoromethyl-histidine, ⁇ -methyl-histidine, etc. amino acids with excess methylene in the side chain (“homo” amino acids) and carboxylic acid functional groups in the side chain are replaced with sulfonic acid groups.
  • examples include amino acids (such as cysteine acid).
  • Naturally occurring amino acid residues can be classified into the following groups, for example, based on general side chain properties: (1) Hydrophobicity: Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) Neutral hydrophilicity: Asn, Gln, Cys, Ser, Thr; (3) Acid: Asp, Glu; (4) Basicity: His, Lys, Arg; (5) Residues affecting chain orientation: Gly, Pro; and (6) Aromatic: Trp, Tyr, Phe.
  • Non-conservative substitution of the amino acid sequences constituting the antibody may be performed by exchanging an amino acid belonging to one of these groups with an amino acid belonging to the other group. More conservative substitutions may be made by exchanging amino acids belonging to one of these groups with other amino acids in the same group. Similarly, the amino acid sequence may be deleted or substituted as appropriate.
  • the modification of the amino acids constituting the antibody may be, for example, post-translational modification such as glycosylation, acetylation or phosphorylation with sugar.
  • the antibody can be glycosylated at a conserved position in its constant region.
  • Glycosylation of antibodies is usually either N-linked or O-linked.
  • the N-linked type means the binding of the carbohydrate moiety to the side chain of the asparagine residue.
  • O-linked glycosylation may be the binding of either N-acetylgalactosamine, galactose, or xylose to a hydroxyamino acid (eg, serine or threonine), optionally 5-hydroxyproline or 5-. It may be a bond to hydroxylysine.
  • hydroxyamino acid eg, serine or threonine
  • 5-hydroxyproline or 5- optionally 5-hydroxyproline or 5-. It may be a bond to hydroxylysine.
  • Those skilled in the art can appropriately select the conditions for glycosylation (for example, when glycosylation is performed using a biological method, the type of host cell or cell medium, pH, etc.). ..
  • the anti-EphA4 antibody according to the present disclosure may be further modified alone or in combination by other modification methods based on the common general knowledge known to those skilled in the art.
  • the anti-EphA4 antibody according to the present disclosure can be produced by a method well known to those skilled in the art.
  • the nucleic acid encoding the anti-EphA4 antibody according to the present disclosure may be incorporated into an expression vector, the expression vector may be introduced into a host cell, and the antibody may be produced by culturing the host cell. Therefore, the present disclosure includes a nucleic acid encoding an anti-EphA4 antibody, a vector containing the nucleic acid, a host cell containing the vector, and a method for producing an anti-EphA4 antibody, which comprises a step of culturing the host cell.
  • the nucleic acid encoding the anti-EphA4 antibody according to the present disclosure may have a DNA encoding a signal sequence, and may have a DNA encoding a heavy chain variable region and a DNA encoding a light chain variable region at the 5'end. It may have a DNA encoding a signal sequence.
  • the signal sequence is an amino acid residue present at the N-terminus of the protein, which is required for the secretory protein or the integral membrane protein to pass through the lipid bilayer after being synthesized on the ribosome, and is described in the present disclosure.
  • the sequence is not particularly limited as long as it has a function. Examples of the signal sequence that the anti-EphA4 antibody according to the present disclosure may contain include signal sequences derived from humans, mice, rats, rabbits, donkeys, goats, horses, birds, dogs, cats, yeasts and the like.
  • the anti-EphA4 antibody according to the present disclosure may be isolated or purified according to a method known to those skilled in the art.
  • isolated or purified means artificially isolated or purified from its natural state. If the molecule or composition is naturally occurring, it is “isolated” or “purified” when it is altered, removed from its natural environment, or both. be.
  • isolation or purification methods include electrophoretic, molecular biological, immunological or chromatographic techniques, specifically ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, reverse phase. HPLC chromatography, isoelectric point electrophoresis, alkali extraction method and the like can be mentioned, but the present invention is not limited thereto.
  • the anti-EphA4 antibody comprises the following CDRs: (A) Heavy chain CDR1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 30; (B) Heavy chain CDR2 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 31; (C) Heavy chain CDR3 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 32; (D) Light chain CDR1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 33; (E) Light chain CDR2 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 34; and (f) Light chain CDR3 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 35.
  • the anti-EphA4 antibody comprises the following CDRs: (G) Heavy chain CDR1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 42; (H) Heavy chain CDR2 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 31; (I) Heavy chain CDR3 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 43; (J) Light chain CDR1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 44; (K) Light chain CDR2 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 34; and (l) Light chain CDR3 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 35.
  • the anti-EphA4 antibody is a human antibody.
  • the anti-EphA4 antibody comprises a heavy chain and a light chain, the heavy chain comprising a variable region consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7 or 11, and / or said light chain. , Containing a variable region consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8 or 12.
  • the variable region of the heavy chain and / or the variable region of the light chain is 1 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 or 11 and / or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 or 12. It may contain an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, added and / or deleted.
  • plality is not limited as long as it retains the binding affinity for EphA4 and promotes cleavage of EphA4, but is limited to 2 to 15 or 2 to 10, for example, 9 or 8. 7, 6, 5, 4, 3 or 2, or within 10% of the number of amino acids in the amino acid sequence, such as within 9%, within 8%, within 7%, within 6%, 5 Within%, within 4%, within 3%, within 2%, or within 1%.
  • the anti-EphA4 antibody comprises a heavy chain and a light chain, wherein the heavy chain comprises a variable region consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7, and the light chain is set forth in SEQ ID NO: 8. It contains a variable region consisting of an amino acid sequence.
  • the anti-EphA4 antibody comprises a heavy chain and a light chain, wherein the heavy chain comprises a variable region consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11, and the light chain is set forth in SEQ ID NO: 12. It contains a variable region consisting of an amino acid sequence.
  • the heavy chain of anti-EphA4 antibody comprises a constant region of human IgG 2 .
  • the constant region of human IgG 2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15.
  • the heavy chain of anti-EphA4 antibody comprises a constant region of human IgG consisting of a combination of human IgG 1 and IgG 2 .
  • the constant region of human IgG consisting of a combination of human IgG 1 and IgG 2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16.
  • the light chain of the anti-EphA4 antibody comprises a constant region of human Ig ⁇ .
  • the constant region of human Ig ⁇ comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17.
  • the heavy chain of the anti-EphA4 antibody comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 20
  • the light chain of the anti-EphA4 antibody comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 21.
  • the heavy chain of the anti-EphA4 antibody comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 20
  • the light chain of the anti-EphA4 antibody comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 21, the heavy chain C.
  • the terminal lysine may be deleted.
  • the heavy chain of the anti-EphA4 antibody comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 20
  • the light chain of the anti-EphA4 antibody comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 21, the heavy chain C.
  • the terminal lysine has been deleted.
  • the heavy chain of the anti-EphA4 antibody comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 26 and the light chain of the anti-EphA4 antibody comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 27.
  • the heavy chain of the anti-EphA4 antibody comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 26, and the light chain of the anti-EphA4 antibody comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 27, C.
  • the terminal lysine may be deleted.
  • the heavy chain of the anti-EphA4 antibody comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 26, and the light chain of the anti-EphA4 antibody comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 27, C.
  • the terminal lysine has been deleted.
  • the anti-EphA4 antibody may be deficient in lysine located at the C-terminal (carboxy-terminal) of the heavy chain.
  • the anti-EphA4 antibody in which the heavy chain C-terminal lysine is deleted is the heavy chain C after translation with an anti-EphA4 antibody in which the heavy chain C-terminal lysine is deleted by genetic modification, carboxypeptidase, or the like.
  • anti-EphA4 antibodies in which the terminal lysine has been cleaved.
  • the anti-EphA4 antibody in which the C-terminal lysine of the heavy chain is deleted includes not only the anti-EphA4 antibody in which the C-terminal lysine is deleted in both heavy chains but also only one heavy chain.
  • an anti-EphA4 antibody in which the C-terminal lysine has been deleted is also included.
  • the present disclosure relates to an isolated nucleic acid encoding an anti-EphA4 antibody.
  • An isolated nucleic acid encoding an anti-EphA4 antibody refers to one or more nucleic acid molecules encoding a heavy and / or light chain of an anti-EphA4 antibody.
  • the nucleic acid according to the present disclosure encodes a heavy chain of an anti-EphA4 antibody.
  • the nucleic acid according to the present disclosure encodes the light chain of an anti-EphA4 antibody.
  • the nucleic acids according to the present disclosure encode heavy and light chains of anti-EphA4 antibodies.
  • the nucleic acids according to the present disclosure also include a first nucleic acid molecule encoding the heavy chain of an anti-EphA4 antibody and a second nucleic acid molecule encoding the light chain of an anti-EphA4 antibody.
  • the present disclosure relates to a vector comprising an isolated nucleic acid encoding an anti-EphA4 antibody.
  • the vector according to the present disclosure refers to one or more vectors containing an isolated nucleic acid encoding an anti-EphA4 antibody.
  • the vector according to the present disclosure is a vector containing a nucleic acid encoding a heavy chain of an anti-EphA4 antibody and a nucleic acid encoding a light chain of an anti-EphA4 antibody.
  • the vector according to the present disclosure is a vector comprising nucleic acids encoding the heavy and light chains of an anti-EphA4 antibody.
  • the vector according to the present disclosure comprises a first vector comprising a nucleic acid encoding a heavy chain of an anti-EphA4 antibody and a second vector comprising a nucleic acid encoding the light chain of an anti-EphA4 antibody. ..
  • the vector according to the present disclosure is not particularly limited to these, but may be a plasmid, cosmid, virus, phage or the like.
  • a retrovirus, a lentivirus, an adenovirus, an adeno-associated virus, a simple herpesvirus vector and the like are also included in the vector according to the present disclosure.
  • the present disclosure also includes a host cell containing the vector according to the present disclosure, and a method for producing an anti-EphA4 antibody, which comprises a step of culturing the host cell.
  • the host cells according to the present disclosure are not particularly limited, but may be Escherichia coli cells, monkey COS cells, Chinese hamster ovary (CHO) cells, NS0 cells and the like.
  • the method for producing an anti-EphA4 antibody comprises a step of culturing a host cell and a step of recovering the anti-EphA4 antibody secreted from the host cell (or a culture medium of the host cell).
  • the present disclosure relates to a pharmaceutical composition comprising an anti-EphA4 antibody.
  • the pharmaceutical composition according to the present disclosure can be produced according to a known method such as, for example, the method described in the Japanese Pharmacopoeia (JP), United States Pharmacopeia (USP) or European Pharmacopoeia (EP).
  • JP Japanese Pharmacopoeia
  • USP United States Pharmacopeia
  • EP European Pharmacopoeia
  • the anti-EphA4 antibody according to the present disclosure may be useful for the treatment of Alzheimer's disease. That is, in one aspect, the present disclosure comprises a pharmaceutical composition for the treatment of Alzheimer's disease, comprising an anti-EphA4 antibody. In another aspect, it comprises a method of treating Alzheimer's disease, comprising the step of administering a therapeutically effective amount of an anti-EphA4 antibody to a subject of Alzheimer's disease. The disclosure also includes the use of anti-EphA4 antibodies in other embodiments to produce a therapeutic agent for Alzheimer's disease. The present disclosure includes, in other embodiments, anti-EphA4 antibodies for use in the treatment of Alzheimer's disease.
  • the anti-EphA4 antibody according to the present disclosure can be used alone in a therapeutic method or in combination with other drugs or compositions.
  • the anti-EphA4 antibody according to the present disclosure may be administered simultaneously with or at different times with another drug.
  • Such combination therapies include combination administration (including two or more agents in the same or separate formulations) and separate administration (eg, simultaneously or sequentially).
  • the administration of the anti-EphA4 antibody according to the present disclosure may precede or follow the accompanying treatment.
  • the subject to which the pharmaceutical composition according to the present disclosure is administered is not limited, and can be used, for example, for human or non-human mammals (monkey, mouse, rat, rabbit, cow, horse, goat, etc.).
  • the method of administration of the pharmaceutical composition according to the present disclosure to a subject is not limited, and the health condition of the subject, the degree of disease, and the drug to be used in combination are not limited.
  • a person skilled in the art for example, a doctor can appropriately determine the type according to the type and the like.
  • the term "comprise” is intended to include the matters described (members, steps, elements or numbers, etc.) unless the context clearly requires a different understanding. It does not preclude the existence of other matters (members, steps, elements or numbers, etc.).
  • the term “consist of” includes aspects described by the terms “consist of” and / or “consentally of”.
  • neutralizing activity refers to the activity of inhibiting the binding of EphA4 to its ligand, and / or the signaling that EphA4 induces in the human body by the binding of its ligand, or to the cell. It means an activity that inhibits a molecular expression response or a functional change.
  • first and second are used to describe various elements, but these elements should not be limited by these terms themselves. These terms are used only to distinguish one element from the other, for example, the first element is referred to as the second element, and similarly, the second element is the first element. Is possible without departing from the scope of the present disclosure.
  • Example 1 Preparation of human anti-EphA4 monoclonal antibody
  • a monoclonal antibody that binds to human EphA4 Genbank Accession No. NP_004429.1, SEQ ID NO: 1
  • the extracellular region of human EphA4 positions 20 to 547) (sequence).
  • SEAP secretory alkaline phosphatase
  • histidine tag A protein in which secretory alkaline phosphatase (SEAP) and histidine tag are fused to No.
  • human EphA4 extracellular region-SEAP-His protein SEQ ID NO: 3
  • human IgG 1 in the extracellular region of human EphA4 Fc region (Fc) and histidine tag fused protein hereinafter referred to as "human EphA4 extracellular region-Fc-His protein", SEQ ID NO: 4
  • human EphA4 extracellular region-Fc-His protein SEQ ID NO: 4
  • MBP maltose binding protein
  • a protein fused with the tag hereinafter referred to as "human EphA4 extracellular region-MBP-His protein", SEQ ID NO: 5
  • human EphA4 extracellular region-MBP-His protein SEQ ID NO: 5
  • pcDNA3.1_rfcB vector By LR reaction of / LifeTechnologies, it was transferred to a pcDNA3.1_rfcB vector to construct a pcDNA3.11-human EphA4 extracellular region-SEAP-His expression vector and a pcDNA3.11-human EphA4 extracellular region-Fc-His expression vector.
  • pcDNA3.4-For the human EphA4 extracellular region-MBP-His expression vector the signal sequence of human EphA4 and the DNA sequence encoding the extracellular region are amplified by PCR, and the cDNA3 has a DNA sequence encoding the MBP and histidine tag.
  • .4 Vectors (Invitrogen / Life Technologies) were cloned to construct an expression vector for the human EphA4 extracellular region-MBP-His protein.
  • Expi293 expression system Thermo SCIENTIFIC
  • each of the above expression vectors was transfected into Expi293F cells (Thermo SCIENTIFIC). After 4 days, the culture broth was collected and clarified by removing the cells. Purification was performed using TALON resin (TaKaRa), and the buffer was replaced with PBS (FUJIFILM Wako Pure) by dialysis.
  • Reactivity to human EphA4 was evaluated by ELISA using human EphA4 extracellular region-Fc-His protein or human EphA4 extracellular region-MBP-His protein according to the following steps.
  • Anti-FLAG antibody SIGMA was coated on wells of 96-well plates (Nunc). After incubating overnight at 4 ° C., wells were blocked with 2% skim milk (BD) at room temperature for 2 hours. After washing 3 times with 0.02% Tween20 / PBS (Nakalitesk), each well was filled with human EphA4 extracellular region-Fc-His protein or human EphA4 extracellular region-MBP-His protein (final concentration 20 nM), scFv. E.
  • the clone was converted from scFv to IgG format by subcloning the DNA sequence encoding the variable region of the obtained human antibody fragment (scFv) into a vector expressing the antibody heavy chain and light chain constant region, respectively.
  • scFv human antibody fragment
  • pcDNA3.4 an expression vector containing a gene sequence encoding a human anti-EphA4 monoclonal antibody was transfected into Expi293F cells (ThermoFiser). The supernatant was collected and a human anti-EphA4 monoclonal antibody was obtained using MabSelectSuRe (Cytiva).
  • the obtained human anti-EphA4 monoclonal antibody was narrowed down from the viewpoints of cleavage promoting activity against EphA4, specificity against EphA4, phosphorylation state of downstream molecule of EphA4 signal, immunogenicity and the like. Immunogenicity was assessed using EpiScreen® (Abzena). In these series of evaluations, an antibody in which the heavy chain and the light chain of the human anti-EphA4 monoclonal antibody were recombined and an antibody in which a mutation was introduced into the CDR were also produced, and a total of 300 or more human anti-EphA4 monoclonal antibodies were evaluated.
  • rat hippocampal neurons The cleavage-promoting activity of the obtained human anti-EphA4 monoclonal antibody against EphA4 was evaluated using rat hippocampal neurons. Preparation of rat hippocampal neurons was performed according to the following steps. The fetus was taken out from a rat (Charles River, Japan) on the 18th day of gestation, and the head was incised to take out the brain.
  • digestion solution 137 mM NaCl (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 5 mM KCl (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 7 mM Na 2 HPO 4 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 25 mM Hepes (DOJINDO), 0.5 mg It was placed in / mL DNase (Sigma), 0.25% trypcin (Life technologies) and shaken at 37 ° C. for 10 minutes. The solution was removed and 20% Fetal bovine serum / Hanks buffer (Sigma) was added.
  • EphA4 cleavage promoting activity using hippocampal neurons was performed according to the following steps. Rat hippocampal neurons seeded in 96-weldish (Falcon) were treated with an anti-EphA4 monoclonal antibody (20 nM) and a ⁇ -secretase inhibitor, Compound E (50 nM, Enzo Life Sciences), and 24 hours later, PBS (Wako Pure Drug). The cells were collected with SDS sample buffer (Laemmli sample buffer (Bio-Rad), 5% 2-mercaptoethanol (Bio-Rad)), and the cells were boiled for 5 minutes.
  • SDS sample buffer Laemmli sample buffer (Bio-Rad), 5% 2-mercaptoethanol (Bio-Rad)
  • antibody A and antibody B which are human anti-EphA4 monoclonal antibodies having an activity of promoting cleavage of EphA4, were obtained.
  • Antibodies A and B were antibodies that did not phosphorylate downstream molecules of the EphA4 signal and had low immunogenicity (both T cell proliferation and IL-2 production were 10% or less).
  • the genes encoding the full lengths of the heavy and light chains of antibody A and antibody B were totally synthesized by GenScript.
  • the amino acid sequence of the heavy chain variable region of antibody A is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7, and the amino acid sequence of the light chain variable region is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8.
  • the amino acid sequence of the heavy chain variable region of antibody A is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 was used for the light chain variable region.
  • the amino acid sequence of the heavy chain variable region of antibody B is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11, and the amino acid sequence of the light chain variable region is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12.
  • the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 13 was used for the heavy chain variable region, and the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 was used for the light chain variable region.
  • the heavy chain constant region of antibody A the constant region of human IgG 2 (SEQ ID NO: 15) is used, and as the heavy chain constant region of antibody B, CH1 and the hinge portion are human IgG1, and CH2 and CH3 are human IgG.
  • a constant region of human IgG 1/2 (SEQ ID NO: 16), which is 2 was used.
  • Human Ig ⁇ (SEQ ID NO: 17) was used as the light chain constant region of antibody A and antibody B.
  • the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 18 was used for the heavy chain constant region
  • the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 19 was used for the light chain constant region.
  • the amino acid sequence of the full length of the heavy chain (not including the signal sequence) of antibody A is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20
  • the amino acid sequence of the full length of the light chain (not including the signal sequence) is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21. ..
  • the nucleic acid sequence encoding the full length of the heavy chain of antibody A is the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 22, and the nucleic acid sequence encoding the full length of the light chain is the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 23.
  • the gene sequence encoding the amino acid sequence of antibody B the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 24 was used for the heavy chain constant region, and the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 25 was used for the light chain constant region.
  • the amino acid sequence of the full length of the heavy chain (not including the signal sequence) of antibody B is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 26, and the amino acid sequence of the full length of the light chain (not including the signal sequence) is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 27.
  • the nucleic acid sequence encoding the full length of the heavy chain of antibody B is the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 28, and the nucleic acid sequence encoding the full length of the light chain is the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 29.
  • Expi293F cells (pcDNA3.4 or pEE6.4 and pEE12.4) containing gene sequences encoding the amino acid sequences of antibody A and antibody B using the Expi293 expression system (ThermoFiser) or GS system (Lonza) Thermo Fisher) or CHOK1SV cells (Lonza) were transfected. The supernatant was collected and MabSelectSuRe (Cytiva) was used to purify antibody A and antibody B, which are human anti-EphA4 monoclonal antibodies.
  • the CDRs of antibody A and antibody B were determined according to the Kabat definition (Kabat numbering system) for the identification of CDRs.
  • the amino acid sequence and nucleic acid sequence of the CDR of antibody A are shown in Tables 1 and 2, respectively.
  • the amino acid sequence and nucleic acid sequence of the CDR of antibody B are shown in Tables 3 and 4, respectively.
  • Example 2 Binding affinity of human anti-EphA4 monoclonal antibody to human EphA4 The binding affinity of antibody A and antibody B to human EphA4 was determined by surface plasmon resonance (SPR method) using Biacore T200 (Cytiva).
  • SPR method surface plasmon resonance
  • Biacore T200 Biacore T200
  • an anti-His antibody (Cytiva, 28-9950-56) was immobilized on the sensor chip CM5. Immobilization is performed by an amine coupling method using N-hydroxysuccinimide (NHS) and N-ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC), and ethanolamine is used for blocking.
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • EDC N-ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride
  • ethanolamine is used for blocking.
  • binding reaction curves at the time of addition (binding phase, 120 seconds) and after the completion of addition (dissociated phase, 600 seconds) were sequentially observed. After each observation, 3M MgCl 2 (60 seconds) was added to regenerate the sensor chip.
  • FIG. 1 shows a typical binding reaction curve as an example.
  • Example 3 Human EphA4-human ligand binding inhibitory activity of human anti-EphA4 monoclonal antibody
  • Anti-alkaline phosphatase antibody (Thermo SCIENTIFIC) was coated on wells of 96-well plates (Nunc). After incubating overnight at 4 ° C., wells were blocked overnight at 4 ° C. with 1% Block Ace (KAC). After washing 3 times with 0.02% Tween20 / PBS, human EphA4 extracellular space-SEAP-His protein (final concentration 10 nM) was inoculated into wells and incubated at room temperature for 1 hour.
  • KAC Block Ace
  • antibody A or antibody B (0, 0.003, 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30, 100) serially diluted with the ligand in the wells. , 300, 1000, 3000 nM was added.
  • ligands a biotinylated human EphrinA5-Fc chimera (R & D Systems, final concentration 0.7 nM) and a biotinylated human EphrinB3-Fc chimera (R & D Systems, final concentration 2.3 nM) were used.
  • Antibodies A and B suppress the binding between human EphA4 and human ligand in a concentration-dependent manner, and the IC50 values of antibody A for human EphrinA5 and EphrinB3 binding are 3.9 nM and 3.0 nM, respectively, and that of antibody B is human EphrinA5. , IC50 values for Ephrin B3 binding were 4.8 nM and 4.1 nM, respectively. Therefore, it was found that antibody A and antibody B inhibit the binding between human EphA4 and human ligand (FIG. 2).
  • Example 4 Selective antibody A and antibody B of the human anti-EphA4 monoclonal antibody against the human Eph receptor were evaluated for the binding activity of the human Eph receptor according to the following steps.
  • Rabbit anti-6-His antibody (Bethyl Laboratories) was coated on wells of 96-well plates (Nunc). After incubating for 1 hour at room temperature or overnight at 4 ° C., wells were blocked at room temperature for 1 hour with 1% Block Ace (KAC). After washing 3 times with 0.02% Tween 20 / PBS, each well was inoculated with each human Eph receptor extracellular space-His protein (Creative biomart, final concentration 1 nM) and incubated at room temperature for 1 hour.
  • KAC Block Ace
  • antibody A and antibody B (10 ⁇ g / mL) were added and incubated at room temperature for 1 hour.
  • horseradish peroxidase-labeled rabbit anti-human IgG Fc ⁇ fragment antibody (Jackson ImmunoResearch Laboratories) was added, and the mixture was incubated at room temperature for 1 hour.
  • TMBZ (3,3', 5,5'-tetramethylbenzidine, KPL) solution was added to the wells and incubated for 3 to 5 minutes at room temperature.
  • An equal amount of reaction arrest solution (2NH 2 SO 4 , FUJIFILM Wako Pure) was added to the wells, and the absorbance at 450 nm was read with a microplate reader (Thermo SCIENTIFIC).
  • Example 5 Reactive mouse, rat, monkey and human EphA4 of human anti-EphA4 monoclonal antibody
  • Preparation of mouse, rat, monkey and human EphA4 extracellular space-SEAP-His protein was carried out according to the following steps. Genes encoding SEAP-His and mouse, rat, monkey and human EphA4 extracellular regions were synthesized by Genscript. First, the synthesized gene fragment encoding SEAP-His was cloned into a pcDNA3.4 vector (Invitrogen / Life Technologies).
  • the binding activity of antibody A and antibody B to various EphA4s was evaluated according to the following steps. Rabbit anti-6-His antibody (Bethyl Laboratories) was coated on wells of 96-well plates (Nunc). After incubating for 1 hour at room temperature, the wells were blocked overnight at 4 ° C. with 1% Block Ace (KAC). After washing 3 times with 0.02% Tween20 / PBS, the wells were seeded with mouse, rat, monkey and human EphA4 extracellular space-SEAP-His protein (final concentration 1 nM) and incubated at room temperature for 1 hour.
  • Rabbit anti-6-His antibody Bethyl Laboratories
  • KAC Block Ace
  • Tween20 / PBS After washing 3 times with 0.02% Tween20 / PBS, the wells were seeded with mouse, rat, monkey and human EphA4 extracellular space-SEAP-His protein (final concentration 1 nM) and incubated at room temperature for 1 hour.
  • antibody A and antibody B (0, 0.00013, 0.00064, 0.0032, 0.016, 0.08, 0.4, 2, 10 ⁇ g / mL) were added and brought to room temperature. Incubated for 1 hour. After washing three times, horseradish peroxidase-labeled rabbit anti-human IgG Fc ⁇ fragment antibody (Jackson ImmunoResearch Laboratories) was added, and the mixture was incubated at room temperature for 1 hour. After washing 3 times, TMBZ (3,3', 5,5'-tetramethylbenzidine, KPL) solution was added to the wells and incubated for 3 to 5 minutes at room temperature. An equal amount of reaction arrest solution (2NH 2 SO 4 , FUJIFILM Wako Pure) was added to the wells, and the absorbance at 450 nm was read with a microplate reader (Thermo SCIENTIFIC).
  • Antibody A and antibody B had the same binding activity in all of mouse, rat, monkey and human EphA4 (Fig. 4).
  • Example 6 Human EphA4 extracellular region of human anti-EphA4 monoclonal antibody, ligand-binding domain, fibronectin type III domain 1, fibronectin type III domain 2, reactivity of human EphA4 extracellular region (ECD), ligand-binding domain (LBD) , Fibronectin type III domain 1 (FN1) or fibronectin type III domain 2 (FN2) fused with maltose binding protein (MBP) and histidine tag (hereinafter, "human EphA4 extracellular region-MBP-His protein”, “human” EphA4 ligand-binding domain-MBP-His protein ”,“ human EphA4 fibronectin type III domain 1-MBP-His protein ”, and“ human EphA4 fibronectin type III domain 2-MBP-His protein ”) are prepared by the following steps.
  • a pcDNA3.4 vector (Invitrogen / LifeTechnologies) having a DNA sequence encoding a histidine tag, human EphA4 extracellular region-MBP-His protein, human EphA4 ligand binding domain-MBP-His protein, human EphA4 fibronectin III.
  • Expression vectors for the type domain 1-MBP-His protein and the human EphA4 fibronectin type III domain 2-MBP-His protein were constructed.
  • the amino acid sequence of human EphA4 used in vector construction is SEQ ID NO: 1, its extracellular region is SEQ ID NO: 2, the ligand binding domain is SEQ ID NO: 58, fibronectin type III domain 1 is SEQ ID NO: 59, and fibronectin type III domain 2 is SEQ ID NO: 60, MBP and histidine tag (MBP-His protein) are shown as SEQ ID NO: 61.
  • the expression vector was transfected into Expi293F cells (Thermo SCIENTIFIC) using the Expi293 expression system (Thermo SCIENTIFIC). After 4 days, the culture broth was collected and clarified by removing the cells.
  • the human EphA4 extracellular region-MBP-His protein or the human EphA4 ligand-binding domain-MBP-His protein was purified using TALON resin (TaKaRa) and buffered with PBS (FUJIFILM Wako Pure) by dialysis.
  • Human EphA4 fibronectin type III domain 1-MBP-His protein and human EphA4 fibronectin type III domain 2-MBP-His protein were purified using Amylose resin (NEB) and AKTA Explore 10s / Superdex200 10/300 GL (Cytiva). ) was used to fractionally purify the monomer fraction.
  • -His protein (final concentration 1 nM) was seeded and incubated for 1 hour at room temperature. After washing three times, antibody A, antibody B, and human IgG (10 nM) were added, and the mixture was incubated at room temperature for 1 hour. After washing three times, horseradish peroxidase-labeled rabbit anti-human IgG Fc ⁇ fragment antibody (Jackson ImmunoResearch Laboratories) was added, and the mixture was incubated at room temperature for 1 hour. After washing 3 times, TMBZ (3,3', 5,5'-tetramethylbenzidine, KPL) solution was added to the wells and incubated for 3 to 5 minutes at room temperature.
  • TMBZ 3,3', 5,5'-tetramethylbenzidine, KPL
  • reaction arrest solution (2NH 2 SO 4 , FUJIFILM Wako Pure) was added to the wells, and the absorbances at 450 nm and 650 nm were read by a microplate reader (Thermo SCIENTIFIC).
  • Antibody A and antibody B had binding activity to the human EphA4 extracellular space (ECD) and ligand binding domain (LBD) (FIG. 5). It did not react with fibronectin type III domain 1 (FN1) and fibronectin type III domain 2 (FN2). Therefore, it was found that antibody A and antibody B specifically bind to the ligand-binding domain of the extracellular region of human EphA4.
  • Example 7 Preparation of EphA4 cleavage promoting active rat hippocampal neurons in hippocampal neurons of human anti-EphA4 monoclonal antibody was performed according to the following steps. The fetus was taken out from a rat (Charles River, Japan) on the 18th day of gestation, and the head was incised to take out the brain.
  • digestion solution 137 mM NaCl (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 5 mM KCl (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 7 mM Na 2 HPO 4 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 25 mM Hepes (DOJINDO), 0.5 mg It was placed in / mL DNase (Sigma), 0.25% Tripsin (Thermo Fisher Scientific) and shaken at 37 ° C. for 10 minutes. The solution was removed and 20% Fetal bovine serum / Hanks buffer (Sigma) was added.
  • the solution was removed, and the cells were washed twice with Hanks buffer, and then the hippocampal tissue was pipetted in Hanks buffer to prepare a cell suspension.
  • a culture medium Neobasal medium (Thermo Fisher Scientific), 1 ⁇ B-27supplement (Thermo Fisher Scientific), 0.5 mM L-glutamine (Thermo Fisher Scientific), 0.5 mM L-glutamine (Thermo Fisher Scientific), and a suspension coated with Polylysine 96-lysine) Cells were seeded in a dish (Falcon).
  • the evaluation of the EphA4 cleavage promoting activity using hippocampal neurons was performed according to the following steps.
  • a solvent PBS (FUJIFILM Wako Pure)
  • human IgG human IgG
  • antibody A or antibody B PBS (FUJIFILM Wako Pure)
  • a ⁇ -secretase inhibitor Combine E (50 nM, Enzo Life Sciences), and a solvent (PBS (FUJIFILM Wako Pure)) were added to the rat hippocampal neurons. 2.0, 6.7, 20 nM) was allowed to act for 24 hours.
  • Antibody A and antibody B promoted the EphA4 cleavage reaction in hippocampal neurons in a concentration-dependent manner (Fig. 6).
  • Example 8 Human EphA4 cleavage promoting activity of human anti-EphA4 monoclonal antibody
  • a pCAHA vector having a DNA sequence encoding human EphA4 and a DNA sequence encoding an HA tag was synthesized at Genscript Japan Co., Ltd., and then the pCAHA vector was used.
  • a DNA sequence encoding human EphA4 was inserted into the SalI / NotI site to construct a pCA-human EphA4-HA expression vector.
  • Preparation of rat hippocampal neurons was performed according to the following steps. The fetus was taken out from a rat (Charles River, Japan) on the 18th day of gestation, and the head was incised to take out the brain.
  • digestion solution (137 mM NaCl (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 5 mM KCl (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 7 mM Na 2 HPO 4 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 25 mM Hepes (DOJINDO), 0.5 mg It was placed in / mL DNase (Sigma), 0.25% Tripsin (Thermo Fisher Scientific) and shaken at 37 ° C. for 10 minutes. The solution was removed and 20% Fetal bovine serum / Hanks buffer (Sigma) was added. The solution was removed, and the cells were washed twice with Hanks buffer, and then the hippocampal tissue was pipetted in Hanks buffer to prepare a cell suspension.
  • a pCA-human EphA4-HA expression vector was introduced into rat hippocampal neurons using Nucleofector (Lonza), and a culture medium (Neurobasal medium (Thermo Fisher Scientific), 1 ⁇ B-27 supplement (Thermo Scientific) After suspending in Glutamine (Thermo Fisher Scientific), the cells were sown in 96 Weldish (Falcon) coated with poly-L-lysine.
  • Antibody A and antibody B promoted the human EphA4 cleavage reaction in hippocampal neurons (Fig. 7).
  • Example 9 Increasing Effect of Human Anti-EphA4 Monoclonal Antibody on Spine Density of Hippocampal Neurons
  • EGFP gene was introduced into rat hippocampal neurons using Nucleofector (Lonza), mixed with non-genetically introduced neurons, covered glass (Matsunami Glass Ind.), And coated with poly-L lysine (Falcon). Was sown in.
  • Counting of spines using hippocampal neurons was performed according to the following steps.
  • Control antibody human IgG 2 ; Sigma
  • antibody A or antibody B was added to rat hippocampal neurons on day 15 of culture inoculated into a 24-well plate (Falcon) coated with poly-L lysine with a cover glass (Matsunami Glass Industry). (6.7, 20 nM) was treated for 24 hours. Then, the cover glass was transferred to 2% PFA (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) / 4% Sucrose (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) / PBS and allowed to stand for 20 minutes to fix the cells.
  • the cover glass was removed from the fixation solution, transferred to PBS, washed three times, and then 0.25% Triton X-100 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) / PBS was added, and cell permeation treatment was performed for 15 minutes. Transfer the cover glass to 2% BSA (Sigma) / 0.25% TritonX-100 / OPTI-MEM (GIBCO), block for 1 hour, and then anti-GFP antibody (Nakalitesk) and anti-Math2 antibody (abcam). Was reacted at room temperature for 1 hour to 1 hour and 30 minutes. The primary antibody solution was removed, the cover glass was washed 3 times with PBS, and then the secondary antibody was exposed to light at room temperature for 1 hour.
  • Antibody A and antibody B increased the spine density of hippocampal neurons (Fig. 8). The results show that antibody A and antibody B have the activity of stabilizing spines in hippocampal neurons.

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Abstract

【課題】　ＥｐｈＡ４に結合し、ＥｐｈＡ４の切断を促進し得る、抗ＥｐｈＡ４抗体、および、前記抗体を有効成分として含む医薬組成物を提供する。 【解決手段】　配列番号３０の重鎖ＣＤＲ１；配列番号３１の重鎖ＣＤＲ２；および配列番号３２の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖；ならびに配列番号３３の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号３４の軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号３５の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖、または、配列番号４２の重鎖ＣＤＲ１；配列番号３１の重鎖ＣＤＲ２；および配列番号４３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖；ならびに配列番号４４の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号３４の軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号３５の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖、を含む抗ＥｐｈＡ４抗体。

Description

抗ＥｐｈＡ４抗体
　本開示は、ＥｐｈＡ４に結合する抗体、当該抗体をコードする核酸、当該核酸を含むベクター、当該ベクターを含む細胞、当該抗体の作製方法、および、当該抗体を含む医薬組成物に関する。
　ＥｐｈＡ４は、レセプター型チロシンキナーゼファミリーの１つである。Ｅｐｈｒｉｎ　ｔｙｐｅ　Ａおよびｔｙｐｅ　ＢがＥｐｈＡ４のリガンドとして知られており、ＥｐｈＡ４とそのリガンドであるｅｐｈｒｉｎが結合すると、脱接着シグナルが誘導される。これまでに、アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ　ｄｉｓｅａｓｅ、以下「ＡＤ」とも称する）の病態においてＥｐｈＡ４の関与が示唆されており（非特許文献１から４）、ＥｐｈＡ４とｅｐｈｒｉｎとの結合阻害が、神経伝達のアミロイドβ（Ａβ）（１－４２）オリゴマー媒介機能障害を救済することが報告されている（特許文献１）。ＡＤにおいては、過剰にリン酸化されたタウによって形成される凝集体（神経原線維変化）が神経細胞死に関与していると考えられており（非特許文献５）、また、タウのリン酸化抑制により、シナプス消失の神経変性が抑制されること（非特許文献６および非特許文献７）、および、記憶障害や認知機能障害が改善されることが報告されている（非特許文献８から１１）。タウのリン酸化の要因として、ＣＤＫ５の活性化によることを示唆する報告がある（非特許文献１２および非特許文献１３）。
　ＥｐｈＡ４は海馬や大脳皮質で多く発現しており、神経活動依存的にマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、ＡＤＡＭ（ａ　ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ　ａｎｄ　ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）およびγセクレターゼによって切断される。このＥｐｈＡ４の切断反応が、神経機能に重要な構造体であるスパインを安定化させることが知られている（非特許文献１４）。ＡＤにおいてはスパインの密度が減少していることが報告されており（非特許文献１５）、また、ＮＦＴ　ｓｔａｇｅ　ＶおよびＶＩのＡＤではＥｐｈＡ４の切断断片の減少も確認されていることから、ＡＤの病態にＥｐｈＡ４の切断反応が関与していることが考えられている（非特許文献１６）。さらに、スパイン密度の低下がＡＤの臨床症状である認知機能障害と相関することが知られており（非特許文献１５および非特許文献１７）、また、スパインの安定化（スパイン密度の増加）によりアルツハイマー病モデルにおいて認知機能を改善することも報告されていることから（非特許文献１８）、スパインを安定化させることがＡＤの治療可能性を有していることが示唆されている。
　既存のＥｐｈＡ４阻害薬として、ＫＹＬペプチドや化合物１等が知られているが（特許文献２、非特許文献１９および非特許文献２０）、ＥｐｈＡ４の切断を促進する活性を有する抗体については報告がない。
ＷＯ２０１６／０１９２８０Ａ１ ＷＯ２０１２／１５６３５１Ａ１
Ｖａｒｇａｓ　ＬＭ　ｅｔ　ａｌ．，，　ＰＬｏＳ　Ｏｎｅ．　２０１４　Ｍａｒ　２１；９（３） Ｆｕ　ＡＫ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ　Ｓ　Ａ．　２０１４　Ｊｕｌ　８；１１１（２７）：９９５９－６４ Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｅｒ　ＡＦ　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｃｔａ　Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ　Ｃｏｍｍｕｎ．　２０１４　Ｊｕｌ　１６；２：７９ Ｈｕａｎｇ　ＴＹ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ　Ｅｘｐ　Ｍｅｄ．　２０１７　Ｄｅｃ　４；２１４（１２）：３６６９－３６８５． ＳａｎｔａＣｒｕｚ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ．　２００５　Ｊｕｌ　１５；３０９（５７３３）：４７６－８１ Ｓｅｏ　Ｊ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．　２０１７　Ｏｃｔ　１１；３７（４１）：９９１７－９９２４ Ｐａｔｒｉｃｋ　ＧＮ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ．　１９９９　Ｄｅｃ　９；４０２（６７６２）：６１５－２２． Ｏｎｉｓｈｉ　Ｔ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．　２０１１　Ｄｅｃ；１１９（６）：１３３０－４０ Ｂｅｌｆｉｏｒｅ　Ｒ　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｇｉｎｇ　Ｃｅｌｌ．　２０１９　Ｆｅｂ；１８（１）：ｅ１２８７３． Ｗｅｂｓｔｅｒ　ＳＪ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｆｒｏｎｔ　Ｇｅｎｅｔ．　２０１４　Ａｐｒ　２３；５：８８． Ｇｒａｙｓｏｎ　Ｂ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｅｈａｖ　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ．　２０１５　Ｍａｙ　１５；２８５：１７６－９３． Ｃａｎｃｉｎｏ　ＧＩ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ　Ａｇｉｎｇ．　２０１１　Ｊｕｌ；３２（７）：１２４９－６１． Ｖａｒｇａｓ　ＬＭ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｈｉｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ａｃｔａ　Ｍｏｌ　Ｂａｓｉｓ　Ｄｉｓ．　２０１８　Ａｐｒ；１８６４：１１４８－１１５９. Ｉｎｏｕｅ　Ｅ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　２００９　Ｍａｙ　４；１８５（３）：５５１－６４ Ｂｏｒｏｓ　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｎｎ　Ｎｅｕｒｏｌ．　２０１７　Ｏｃｔ；８２（４）：６０２－６１４ Ｍａｔｓｕｉ　Ｃ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｒａｉｎ　Ｐａｔｈｏｌ．　２０１２　Ｎｏｖ；２２（６）：７７６－８７．　ｄｏｉ：　１０．１１１１／ｊ．１７５０－３６３９ Ａｋｒａｍａ　Ａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ　Ａｇｉｎｇ．　２００８　Ｓｅｐ；２９（９）：１２９６－１３０７ Ｓｕｚｕｋｉ　Ｋ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ. ２０２０ Ａｕｇ ２８；３６９（６５０７）：ｅａｂｂ４８５３ Ｇｏｌｄｓｈｍｉｔ　ｅｔ　ａｌ．，　ＰＬｏＳ　ｏｎｅ．　２０１１；６（９）：ｅ２４６３６ Ｖａｎ　Ｈｏｅｃｋｅ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．　２０１２　Ｓｅｐ；１８（９）：１４１８－２２，２０１２
　本開示において、ＥｐｈＡ４に結合し、ＥｐｈＡ４の切断を促進し得る、抗ＥｐｈＡ４抗体、および、前記抗体を有効成分として含む医薬組成物を提供することを課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ＥｐｈＡ４に結合し、ＥｐｈＡ４の切断を促進し得る、目的の抗ＥｐｈＡ４抗体を完成するに至った。
　（１）　抗ＥｐｈＡ４抗体であって、
　前記抗ＥｐｈＡ４抗体は、
　（ａ）配列番号３０に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１；
　（ｂ）配列番号３１に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２；および
　（ｃ）配列番号３２に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖；ならびに
　（ｄ）配列番号３３に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１；
　（ｅ）配列番号３４に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２；および
　（ｆ）配列番号３５に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖
を含む、抗ＥｐｈＡ４抗体、
　または、
　（ｇ）配列番号４２に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１；
　（ｈ）配列番号３１に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２；および
　（ｉ）配列番号４３に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖；ならびに
　（ｊ）配列番号４４に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１；
　（ｋ）配列番号３４に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２；および
　（ｌ）配列番号３５に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖
を含む、抗ＥｐｈＡ４抗体。
　（２）　（１）に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体であって、
　抗ＥｐｈＡ４抗体はヒト抗体である、
抗ＥｐｈＡ４抗体。
　（３）　（１）または（２）に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体であって、
　前記抗ＥｐｈＡ４抗体は、ＥｐｈＡ４に特異的に結合し、ＥｐｈＡ４の切断を促進する、
抗ＥｐｈＡ４抗体。
　（４）　（１）～（３）のいずれかに記載の抗ＥｐｈＡ４抗体であって、
　前記抗ＥｐｈＡ４抗体は、ＥｐｈＡ４に特異的に結合し、ＥｐｈＡ４とｅｐｈｒｉｎとの結合を阻害する、
抗ＥｐｈＡ４抗体。
　（５）　（１）～（４）のいずれかに記載の抗ＥｐｈＡ４抗体であって、
　前記重鎖は配列番号７に示すアミノ酸配列からなる可変領域を含み、
　前記軽鎖は配列番号８に示すアミノ酸配列からなる可変領域を含む、
抗ＥｐｈＡ４抗体。
　（６）　（１）～（５）のいずれかに記載の抗ＥｐｈＡ４抗体であって、
　前記重鎖の定常領域および前記軽鎖の定常領域がヒト抗体由来のアミノ酸配列を含む、
抗ＥｐｈＡ４抗体。
　（７）　（６）に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体であって、
　前記重鎖の定常領域はヒトＩｇＧの定常領域である、
抗ＥｐｈＡ４抗体。
　（８）　（７）に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体であって、
  前記ヒトＩｇＧの定常領域は、ヒトＩｇＧ２の定常領域である、
抗ＥｐｈＡ４抗体。
　（９）　（８）に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体であって、
　前記ヒトＩｇＧ２の定常領域は、配列番号１５に示すアミノ酸配列を含む、
抗ＥｐｈＡ４抗体。
　（１０）　（１）～（４）のいずれかに記載の抗ＥｐｈＡ４抗体であって、
　前記重鎖は配列番号１１に示すアミノ酸配列からなる可変領域を含み、
　前記軽鎖は配列番号１２に示すアミノ酸配列からなる可変領域を含む、
抗ＥｐｈＡ４抗体。
　（１１）　（１）～（４）及び（１０）のいずれかに記載の抗ＥｐｈＡ４抗体であって、
　前記重鎖の定常領域および前記軽鎖の定常領域がヒト抗体由来のアミノ酸配列を含む、
抗ＥｐｈＡ４抗体。
　（１２）　（１１）に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体であって、
　前記重鎖の定常領域はヒトＩｇＧの定常領域である、
抗ＥｐｈＡ４抗体。
　（１３）　（１２）に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体であって、
　前記ヒトＩｇＧの定常領域は、ヒトＩｇＧ１とヒトＩｇＧ２の組み合わせからなるヒトＩｇＧの定常領域である、
抗ＥｐｈＡ４抗体。
　（１４）　（１３）に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体であって、
　前記ヒトＩｇＧ１とヒトＩｇＧ２の組み合わせからなるヒトＩｇＧの定常領域は、配列番号１６示すアミノ酸配列を含む、
抗ＥｐｈＡ４抗体。
　（１５）　（６）～（９）および（１１）～（１４）のいずれかに記載の抗ＥｐｈＡ４抗体であって、
　前記軽鎖の定常領域は、ヒトＩｇλの定常領域である、
抗ＥｐｈＡ４抗体。
　（１６）　（１５）に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体であって、
　前記ヒトＩｇλの定常領域は、、配列番号１７に示すアミノ酸配列を含む、
抗ＥｐｈＡ４抗体。
　（１７）　抗ＥｐｈＡ４抗体であって、
　前記抗ＥｐｈＡ４抗体は、重鎖および軽鎖を含み、
　前記重鎖は、配列番号２０に示すアミノ酸配列を含み、かつ
　前記軽鎖は、配列番号２１に示すアミノ酸配列を含み、
　前記重鎖のＣ末端リシンが欠失されていてもよい、
抗ＥｐｈＡ４抗体。
　（１８）　（１７）に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体であって、
　前記重鎖のＣ末端リシンが欠失されている、
抗ＥｐｈＡ４抗体。
　（１９）　抗ＥｐｈＡ４抗体であって、
　前記抗ＥｐｈＡ４抗体は、重鎖および軽鎖を含み、
　前記重鎖は、配列番号２６に示すアミノ酸配列を含み、かつ
　前記軽鎖は、配列番号２７に示すアミノ酸配列を含み、
　前記重鎖のＣ末端リシンが欠失されていてもよい、
抗ＥｐｈＡ４抗体。
　（２０）　（１９）に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体であって、
　前記重鎖のＣ末端リシンが欠失されている、
抗ＥｐｈＡ４抗体。
　（２１）　（１）～（２０）のいずれかに記載の抗ＥｐｈＡ４抗体をコードする単離された核酸。
　（２２）　（２１）に記載の核酸を含むベクター。
　（２３）　（２２）に記載のベクターを含む宿主細胞。
　（２４）　（２３）に記載の宿主細胞を培養する工程を含む、抗ＥｐｈＡ４抗体の作製方法。
　（２５）　（１）～（２０）のいずれかに記載の抗ＥｐｈＡ４抗体を含む、医薬組成物。
　（２６）　（２５）に記載の医薬組成物であって、少なくとも一つの薬剤学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
　本開示において、ＥｐｈＡ４に結合し、ＥｐｈＡ４の切断を促進し得る抗ＥｐｈＡ４抗体、当該抗体をコードする核酸、当該核酸を含むベクター、当該ベクターを含む細胞、当該抗体の作製方法、および、当該抗体を有効成分として含む医薬組成物が提供される。
図１は、抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体（抗体ＡおよびＢ）のヒトＥｐｈＡ４に対する結合親和性を示す。 図２は、抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体（抗体ＡおよびＢ）のヒトＥｐｈＡ４－ヒトリガンド結合阻害活性を示す。 図３は、抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体（抗体ＡおよびＢ）の各ヒトＥｐｈレセプターに対する選択性を示す。 図４は、抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体（抗体ＡおよびＢ）のマウス、ラット、サルおよびヒトＥｐｈＡ４に対する反応性を示す。 図５は、抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体（抗体ＡおよびＢ）の、ヒトＥｐｈＡ４細胞外領域（ＥＣＤ）、リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン１（ＦＮ１）、およびフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン２（ＦＮ２）に対する反応性を示す。 図６は、抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体（抗体ＡおよびＢ）の海馬ニューロンにおけるＥｐｈＡ４切断促進活性を示す。 図７は、抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体（抗体ＡおよびＢ）の海馬ニューロンにおけるヒトＥｐｈＡ４切断促進活性を示す。 図８は、抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体（抗体ＡおよびＢ）による海馬ニューロンのスパイン数に対する増加効果を示す。
　本明細書で使用される配列番号によって特定またはコードされる領域は下記のとおりである：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
　本開示は、ＥｐｈＡ４に結合する抗ＥｐｈＡ４抗体に関する。
　本開示に係る抗ＥｐｈＡ４抗体は、ＥｐｈＡ４を認識して結合することができる抗体であり、以下に述べるように、当該抗体は、無傷の抗体であってもよいし、あるいは、ＥｐｈＡ４との結合親和性を有する限り、合成抗体（例えば組換え抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体等）であってもよい。本明細書において、ＥｐｈＡ４は、ヒト、マウス、ラットおよびサル由来のＥｐｈＡ４を指すものと理解することができる。ヒト、マウス、ラットおよびサル由来のＥｐｈＡ４は、米国生物工学情報センターが提供するＧｅｎｂａｎｋ等、配列情報が登録された公共のデータベースから入手できるほか、近縁関係にある動物種のＥｐｈＡ４の塩基配列情報を元にプライマーを設計し、所望の動物種から抽出したＲＮＡからクローニングすることで、ＥｐｈＡ４遺伝子の配列情報を入手することが可能である。例えば、ヒト、マウス、ラット、サルのＥｐｈＡ４の塩基配列情報は、それぞれＧｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿００４４３８．５、ＮＭ＿００７９３６．３、ＮＭ＿００１１６２４１１．１、ＮＭ＿００１２６０８７０．１としてデータベース上に登録されている。
　一態様において、抗ＥｐｈＡ４抗体は、ＥｐｈＡ４に特異的に結合する抗体である。「特異的な結合」という用語は、当該技術分野において当業者に周知の用語であり、抗体またはその抗原結合断片の、抗原やエピトープに対する特異的な結合を決定するための方法も周知である。一実施形態において、「特異的な結合」は、抗ＥｐｈＡ４抗体が、他の標的分子に結合するよりも、より大きな結合親和性、結合活性で、より迅速に、および／または、より長時間持続して、ＥｐｈＡ４に免疫学的反応により結合可能であると理解される。これは、ＥｐｈＡ４に特異的に結合する抗体が他の標的分子に結合しないことを意味するものではない。別の実施形態において、「特異的な結合」は、ＥｐｈＡ４に対して少なくとも約１０－７Ｍ、または少なくとも約１０－８Ｍ、または少なくとも約１０－９Ｍ、またはそれ以下のＫＤを持つ抗体によって示されうる。また、さらに別の実施形態では、「特異的な結合」は、ＥｐｈＡ４と免疫学的反応により結合するが、Ｅｐｈレセプターの他のファミリー分子とは実質的に結合しないと理解される。
　一態様において、抗ＥｐｈＡ４抗体は、ＥｐｈＡ４の細胞外領域に結合する抗体である。一実施形態において、抗ＥｐｈＡ４抗体は、ＥｐｈＡ４の細胞外領域のうちリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）に結合する抗体である。
　一実施形態において、抗ＥｐｈＡ４抗体は、ＥｐｈＡ４に特異的に結合し、ＥｐｈＡ４の切断を促進することができる。特定の実施形態において、抗ＥｐｈＡ４抗体は、ＥｐｈＡ４に特異的に結合し、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）やＡＤＡＭ（ａ　ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ　ａｎｄ　ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）によるＥｐｈＡ４細胞外ドメインの切断を促進することができる。
　一実施形態において、抗ＥｐｈＡ４抗体は、ＥｐｈＡ４に特異的に結合し、ＥｐｈＡ４とそのリガンドであるｅｐｈｒｉｎとの結合を阻害することができる。
　別の実施形態において、抗ＥｐｈＡ４抗体は、ＥｐｈＡ４に特異的に結合し、海馬ニューロンのスパイン数を増加または海馬ニューロンのスパインを安定化することができる。
　本開示は、一実施形態において、ヒトＥｐｈＡ４、マウスＥｐｈＡ４、ラットＥｐｈＡ４、およびサルＥｐｈＡ４のうちの少なくとも１つに特異的に結合し、そのリガンドとの結合を阻害することができる抗ＥｐｈＡ４抗体を包含する。本開示は、別の実施形態において、ヒトＥｐｈＡ４、マウスＥｐｈＡ４、ラットＥｐｈＡ４、およびサルＥｐｈＡ４のうち２つ以上に特異的に結合し、そのリガンドとの結合を阻害することができる抗ＥｐｈＡ４抗体を包含する。本開示は、さらに別の実施形態において、ヒトＥｐｈＡ４、マウスＥｐｈＡ４、ラットＥｐｈＡ４、およびサルＥｐｈＡ４の全てと特異的に結合し、そのリガンドとの結合を阻害することができる抗ＥｐｈＡ４抗体を包含する。
　抗ＥｐｈＡ４抗体の、抗原への結合特性（例えば、結合親和性および種交差反応性）を測定する方法は、当該技術分野において当業者に公知の方法を用いてよい。例えば、結合親和性は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）バイオセンサー、ＫｉｎＥｘＡバイオセンサー、シンチレーション近接アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＯＲＩＧＥＮ免疫測定法（ＩＧＥＮ社）、フローサイトメトリー、蛍光消光、蛍光転移、酵母ディスプレイ、および／または、免疫染色を使用して測定してよいが、これらに限定されない。抗ＥｐｈＡ４抗体の、ＥｐｈＡ４とそのリガンドの結合に対する中和活性は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）バイオセンサー、ＥＬＩＳＡ、および／または、フローサイトメトリーを使用して測定してよいが、これらに限定されない。
　本開示に係る抗ＥｐｈＡ４抗体は、ＥｐｈＡ４と結合する限り、モノクローナル抗体であってよい。
　本開示に係る抗ＥｐｈＡ４抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＭ（またはこれらのサブクラス）等の任意のクラスであってよく、特定のクラスに限定されない。重鎖（Ｈ鎖と呼ぶこともある）の定常領域の抗体アミノ酸配列により、免疫グロブリンは、異なるクラスに分類される。５つの主な免疫グロブリンのクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭがあり、これらの幾つかは、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ならびにＩｇＡ１およびＩｇＡ２というサブクラス（アイソタイプ）にさらに細分化され得る。異なるクラスの免疫グロブリンの対応する重鎖の定常領域は、それぞれ、α、δ、ε、γおよびμと呼ばれている。また、抗体の軽鎖（Ｌ鎖と呼ぶこともある）の種類にはλ鎖およびκ鎖が存在する。
　本開示に係る抗ＥｐｈＡ４抗体は、ＩｇＧ抗体であってよく、例えば、ＩｇＧ１抗体またはＩｇＧ２抗体等であってよい。また、本開示に係る抗ＥｐｈＡ４抗体は、場合により、単量体、二量体または多量体の形態であってよい。
　本開示に係る抗ＥｐｈＡ４抗体は、異なるサブクラスのＩｇＧ抗体の組み合わせであってよく、例えば、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２の組み合わせからなるヒトＩｇＧ（本開示においてヒトＩｇＧ１／２ともいう）抗体等であってよい。
　本開示に係る抗体の可変領域は、抗体軽鎖の可変領域および／または抗体重鎖の可変領域を意味してよく、抗体の定常領域は、抗体軽鎖の定常領域および／または抗体重鎖の定常領域を意味してよい。重鎖および軽鎖の可変領域は、それぞれ、相補性決定領域としても知られる３つのＣＤＲにより連結される４つのフレームワーク領域（ＦＲ）からなる。各鎖におけるＣＤＲは、ＦＲにより、近傍に保持されており、他方の鎖におけるＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している。ＣＤＲを決定するための技術としては、異種間配列可変性に基づくアプローチであるＫａｂａｔナンバリングシステム（Ｋａｂａｔ　ｅｔ　ａｌ，　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，　５ｔｈ　ｅｄ．，　１９９１，　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ，　Ｂｅｔｈｅｓｄａ　ＭＤ）が用いられる。
　一実施形態において、本開示に係る抗ＥｐｈＡ４抗体は、ヒト抗体由来の重鎖定常領域および／または軽鎖定常領域を含む。
　本明細書において、モノクローナル抗体は、実質的に均一な抗体のポピュレーションから得られる抗体を意味してよい。すなわち、そのポピュレーションに含まれる個々の抗体は、若干存在し得る可能性のある天然の突然変異体を除いて同一である。モノクローナル抗体は、単一抗原部位に対するものであり、非常に特異的である。さらに、異なる抗原や異なるエピトープを標的とする典型的なポリクローナル抗体とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原の単一のエピトープを標的とするものである。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体ポピュレーションから得られる抗体の特性を示し、特定の方法による抗体の生産を必要とするものとして限定的に解されるべきではない。
　本開示において、ヒト抗体は、可変領域および定常領域の配列がヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体を意味するが、ヒト免疫グロブリン配列に由来するものである限り、例えば、標的に対する結合親和性を増加させたり、免疫原性を低下させたり、安定性を増加させる改変のほか、非ヒト細胞によって産生される抗体の不均一性を減少させるための改変など、所望の修飾が導入された配列を含む抗体を包含する。
　ヒト抗体の機能を保持させたまま（あるいは、当該抗体の機能を付加、向上させるために）適宜改変（例えば、抗体の修飾、または、抗体のアミノ酸配列の部分的な置換、付加および／または欠失）した抗体も、本開示に係る抗ＥｐｈＡ４抗体に含まれる。より具体的には、抗体のエフェクター機能を修飾するために定常領域のアミノ酸配列を改変した抗体も本開示の範囲に含まれ、例えば、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性および／または抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）活性を低下させるために、ヒトＩｇＧ２抗体のＥｕ　ｎｕｍｂｅｒｉｎｇにおける２３４位のバリン（Ｖａｌ）がアラニン（Ａｌａ）に置換され、２３７位のグリシン（Ｇｌｙ）がアラニン（Ａｌａ）に置換された抗体等も本開示の範囲に含まれる。さらに、本開示に係る抗ＥｐｈＡ４抗体のＣＤＲ配列を有する抗原結合部位と共に、異なる抗原に結合する抗原結合部位を併せ持つ二重特異性抗体（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ（２０１２），ｍＡｂｓ　４, １８２－９７）も本開示の範囲に含まれる。
　ヒト抗体は、当該技術分野で公知の方法によって製造することができる。例えば、本開示のヒト抗体は、公知のファージディスプレイヒト抗体ライブラリー（ナイーブライブラリー、合成ライブラリーなど）から、ＥｐｈＡ４と結合親和性のある抗体を取得し、その可変領域の配列を決定し、所望のヒト定常領域の配列と組み合わせて非ヒト動物細胞に導入することで、組換え抗体として製造することができる。
　あるいは、ヒト抗体は、多くの非ヒトトランスジェニック動物（そのゲノムの中にヒト免疫グロブリン重鎖および軽鎖の遺伝子座のうちのいくらかもしくは全てを含む）のうちのいずれかを、ＥｐｈＡ４抗原で免疫することによって生成することができる。一実施形態において、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含む非ヒト動物は、ヒト免疫グロブリン「ミニ遺伝子座」を有する動物（例えば、ＧｅｎＰｈａｒｍ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，　Ｉｎｃ．）である。いくつかの実施形態において、ヒト抗体は、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）マウス（Ａｂｇｅｎｉｘ，　Ｉｎｃ．，　Ｆｒｅｍｏｎｔ，　ＣＡ）、ＨｕＭＡｂ－Ｍｏｕｓｅ（登録商標）マウス（Ｍｅｄａｒｅｘ，　Ｉｎｃ．）、ＶｅｌｏｃＩｍｍｕｎｅ（登録商標）マウス（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，　Ｉｎｃ．）、ＡｌｉｖａＭａｂマウス（Ａｂｌｅｘｉｓ，　ＬＬＣ）などを使用して、生成することができる。
　本開示に係る抗ＥｐｈＡ４抗体は、所望により、修飾してもよい。抗ＥｐｈＡ４抗体の修飾は、（ａ）例えばシートまたはヘリックスコンホメーション等の、修飾領域におけるアミノ酸配列の三次元的な構造；（ｂ）標的部位での分子の電荷または疎水性の状態；または、（ｃ）側鎖の容積の維持に対する修飾の効果、を変化させる修飾であってもよく、あるいはこれらの変化が明白に観察されないような修飾であってもよい。
　本開示に係る抗ＥｐｈＡ４抗体の修飾は、例えば、構成するアミノ酸残基の置換、欠失、付加等によって達成してよい。
　本明細書において、アミノ酸とは、その最も広い意味で用いられ、天然のアミノ酸、例えばセリン（Ｓｅｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、アラニン（Ａｌａ）、チロシン（Ｔｙｒ）、グリシン（Ｇｌｙ）、リシン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、システイン（Ｃｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、プロリン（Ｐｒｏ）のみならず、アミノ酸変異体および誘導体といった、非天然アミノ酸も含まれる。当業者であれば、この広い定義を考慮して、本明細書におけるアミノ酸として、例えばＬ－アミノ酸；Ｄ－アミノ酸；アミノ酸変異体、アミノ酸誘導体等の化学修飾されたアミノ酸；ノルロイシン、β－アラニン、オルニチン等、生体内でタンパク質の構成材料とならないアミノ酸；および当業者に公知のアミノ酸の特性を有する、化学的に合成された化合物等が挙げられることを当然に理解する。非天然アミノ酸の例としては、α－メチルアミノ酸（α－メチルアラニン等）、Ｄ－アミノ酸（Ｄ－アスパラギン酸、Ｄ－グルタミン酸等）、ヒスチジン様アミノ酸（２－アミノ－ヒスチジン、β－ヒドロキシ－ヒスチジン、ホモヒスチジン、α－フルオロメチル－ヒスチジン、α－メチル－ヒスチジン等）、側鎖に余分なメチレンを有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸）および側鎖中のカルボン酸官能基がスルホン酸基で置換されるアミノ酸（システイン酸等）等が挙げられる。
　天然に存在するアミノ酸残基は、例えば、一般的な側鎖特性に基づいて、次のグループに分類され得る：
（１）疎水性：Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
　抗体を構成するアミノ酸配列の非保存的置換は、これらのグループの１つに属するアミノ酸を他のグループに属するアミノ酸と交換することにより行ってもよい。より保存的な置換は、これらのグループの１つに属するアミノ酸を同一グループの他のアミノ酸と交換することにより行ってもよい。同様に、アミノ酸配列の欠失または置換を適宜行ってもよい。
　抗体を構成するアミノ酸の修飾としては、例えば、糖によるグリコシル化、アセチル化またはリン酸化等の翻訳後修飾であってもよい。抗体は、その定常領域における保存された位置でグリコシル化され得る。抗体のグリコシル化は、通常、Ｎ－結合型またはＯ－結合型のいずれかである。Ｎ－結合型は、アスパラギン残基の側鎖に対する糖質部分の結合を意味する。トリペプチド配列であるアスパラギン－Ｘ－セリン、アスパラギン－Ｘ－スレオニン、および、アスパラギン－Ｘ－システイン（式中、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖に対する糖質部分を酵素的に付加するための認識配列である。これらのトリペプチド配列のいずれかが抗体に存在することにより、潜在的なグリコシル化部位が存在する。Ｏ－結合型グリコシル化は、Ｎ－アセチルガラクトサミン、ガラクトース、または、キシロースのいずれかの、ヒドロキシアミノ酸（例えば、セリンまたはスレオニン）への結合であってよく、場合により、５－ヒドロキシプロリンまたは５－ヒドロキシリシンへの結合であってもよい。グリコシル化の条件（グリコシル化を、生物学的手法を用いて行う場合には、例えば、宿主細胞や細胞培地の種類、ｐＨ等）を、当業者は目的に応じて適宜、選択することができる。
　本開示に係る抗ＥｐｈＡ４抗体は、さらに、当業者に公知の技術常識に基づいて、その他の修飾方法により、単独または組み合わせて、修飾されてよい。
　本開示に係る抗ＥｐｈＡ４抗体は、当業者に周知の方法によって産生することができる。例えば、本開示に係る抗ＥｐｈＡ４抗体をコードする核酸を発現ベクターに組み込み、当該発現ベクターを宿主細胞に導入し、当該宿主細胞を培養することによって抗体を産生させてもよい。したがって、本開示は、抗ＥｐｈＡ４抗体をコードする核酸、当該核酸を含むベクター、当該ベクターを含む宿主細胞、および当該宿主細胞を培養する工程を含む抗ＥｐｈＡ４抗体の作製方法を包含する。
　本開示に係る抗ＥｐｈＡ４抗体をコードする核酸は、シグナル配列をコードするＤＮＡを有してもよく、重鎖可変領域をコードするＤＮＡ、および、軽鎖可変領域をコードするＤＮＡの５´末端にシグナル配列をコードするＤＮＡを有してもよい。シグナル配列は、分泌タンパク質や膜内在性タンパク質が、リボソーム上で合成された後に、脂質２重層を通り抜けるのに必要な、タンパク質のＮ末端に存在するアミノ酸残基であり、本開示においては、この機能を有する配列であれば特に限定されるものではない。本開示に係る抗ＥｐｈＡ４抗体が含み得るシグナル配列としては、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ロバ、ヤギ、ウマ、トリ、イヌ、ネコ、酵母等に由来するシグナル配列が挙げられる。
　本開示に係る抗ＥｐｈＡ４抗体は、当業者に公知の方法に従って、単離または精製されたものであってよい。
　本明細書において、「単離された」または「精製された」は、自然の状態から、人為的に単離されたか、精製されたことを意味する。分子または組成物が自然に発生したものである場合、それが変化したかもしくは本来の環境から除去されたか、またはその両方であるとき、それは「単離された」かまたは「精製された」である。単離または精製の方法の例としては、電気泳動的、分子生物学的、免疫学的またはクロマトグラフィー的手法等が挙げられ、具体的には、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー、等電点電気泳動、または、アルカリ抽出法等が挙げられるがこれらに限定されない。
　一実施形態において、抗ＥｐｈＡ４抗体は、以下のＣＤＲを含んでいる：
（ａ）配列番号３０に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号３１に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号３２に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号３３に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号３４に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号３５に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３。
　一実施形態において、抗ＥｐｈＡ４抗体は、以下のＣＤＲを含んでいる：
（ｇ）配列番号４２に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１；
（ｈ）配列番号３１に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２；
（ｉ）配列番号４３に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３；
（ｊ）配列番号４４に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１；
（ｋ）配列番号３４に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２；および
（ｌ）配列番号３５に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３。
　一実施態様において、前記抗ＥｐｈＡ４抗体はヒト抗体である。
　別の実施形態において、抗ＥｐｈＡ４抗体は、重鎖および軽鎖を含んでおり、前記重鎖は、配列番号７または１１に示すアミノ酸配列からなる可変領域を含み、および／または、前記軽鎖は、配列番号８または１２に示すアミノ酸配列からなる可変領域を含んでいる。なお、当該実施形態において、前記重鎖の可変領域および／または前記軽鎖の可変領域は、配列番号７または１１に示すアミノ酸配列、および／または、配列番号８または１２に示すアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸が置換、付加および／または欠失したアミノ酸配列を含んでもよい。ここで、「複数個」は、ＥｐｈＡ４に対する結合親和性を保持し、ＥｐｈＡ４の切断を促進する限り限定されないが、２個～１５個、または２個～１０個、例えば、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個または２個であり、またはアミノ酸配列中のアミノ酸数の１０％以内、例えば９％以内、８％以内、７％以内、６％以内、５％以内、４％以内、３％以内、２％以内または１％以内である。
　特定の実施形態において、抗ＥｐｈＡ４抗体は、重鎖および軽鎖を含んでおり、前記重鎖は、配列番号７に示すアミノ酸配列からなる可変領域を含み、前記軽鎖は、配列番号８に示すアミノ酸配列からなる可変領域を含んでいる。
　特定の実施形態において、抗ＥｐｈＡ４抗体は、重鎖および軽鎖を含んでおり、前記重鎖は、配列番号１１に示すアミノ酸配列からなる可変領域を含み、前記軽鎖は、配列番号１２に示すアミノ酸配列からなる可変領域を含んでいる。
　一実施形態において、抗ＥｐｈＡ４抗体の重鎖は、ヒトＩｇＧ２の定常領域を含んでいる。特定の実施形態において、ヒトＩｇＧ２の定常領域は、配列番号１５のアミノ酸配列を含んでいる。
　別の実施形態において、抗ＥｐｈＡ４抗体の重鎖は、ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ２の組み合わせからなるヒトＩｇＧの定常領域を含んでいる。特定の実施形態において、ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ２の組み合わせからなるヒトＩｇＧの定常領域は、配列番号１６のアミノ酸配列を含んでいる。
　一実施形態において、抗ＥｐｈＡ４抗体の軽鎖は、ヒトＩｇλの定常領域を含んでいる。特定の実施形態において、ヒトＩｇλの定常領域は、配列番号１７のアミノ酸配列を含んでいる。
　一実施形態において、抗ＥｐｈＡ４抗体の重鎖は、配列番号２０に示すアミノ酸配列を含み、かつ、抗ＥｐｈＡ４抗体の軽鎖は、配列番号２１に示すアミノ酸配列を含む。
　別の実施形態において、抗ＥｐｈＡ４抗体の重鎖は、配列番号２０に示すアミノ酸配列を含み、かつ、抗ＥｐｈＡ４抗体の軽鎖は、配列番号２１に示すアミノ酸配列を含んでおり、重鎖のＣ末端リシンが欠失されていてもよい。
　特定の実施形態において、抗ＥｐｈＡ４抗体の重鎖は、配列番号２０に示すアミノ酸配列を含み、かつ、抗ＥｐｈＡ４抗体の軽鎖は、配列番号２１に示すアミノ酸配列を含んでおり、重鎖のＣ末端リシンが欠失されている。
　一実施形態において、抗ＥｐｈＡ４抗体の重鎖は、配列番号２６に示すアミノ酸配列を含み、かつ、抗ＥｐｈＡ４抗体の軽鎖は、配列番号２７に示すアミノ酸配列を含む。
　別の実施形態において、抗ＥｐｈＡ４抗体の重鎖は、配列番号２６に示すアミノ酸配列を含み、かつ、抗ＥｐｈＡ４抗体の軽鎖は、配列番号２７に示すアミノ酸配列を含んでおり、重鎖のＣ末端リシンが欠失されていてもよい。
　特定の実施形態において、抗ＥｐｈＡ４抗体の重鎖は、配列番号２６に示すアミノ酸配列を含み、かつ、抗ＥｐｈＡ４抗体の軽鎖は、配列番号２７に示すアミノ酸配列を含んでおり、重鎖のＣ末端リシンが欠失されている。
　別の実施形態において、例えば、抗体産生細胞により産生される抗体の不均一性を減少させる等の理由から（米国特許出願公開第２０１０／０２９７６９７号明細書やＬｉｕ　Ｈ　ｅｔ　ａｌ．，　ＭＡｂｓ．　２０１４　Ｓｅｐ－Ｏｃｔ；６（５）：１１４５－１１５４）、抗ＥｐｈＡ４抗体は、重鎖のＣ末端（カルボキシ末端）に位置するリシンが欠失されていてもよい。本開示において、重鎖のＣ末端リシンが欠失されている抗ＥｐｈＡ４抗体には、重鎖のＣ末端リシンを遺伝子改変によって欠失させた抗ＥｐｈＡ４抗体やカルボキシペプチダーゼ等によって翻訳後に重鎖のＣ末端リシンが切断された抗ＥｐｈＡ４抗体等も含まれる。また、本開示において、重鎖のＣ末端リシンが欠失されている抗ＥｐｈＡ４抗体には、両方の重鎖においてＣ末端リシンが欠失されている抗ＥｐｈＡ４抗体だけでなく、片方のみの重鎖においてＣ末端リシンが欠失されている抗ＥｐｈＡ４抗体も含まれる。
　一態様において、本開示は、抗ＥｐｈＡ４抗体をコードする単離された核酸に関する。抗ＥｐｈＡ４抗体をコードする単離された核酸は、抗ＥｐｈＡ４抗体の重鎖および／または軽鎖をコードする一以上の核酸分子を指す。一実施形態において、本開示に係る核酸は抗ＥｐｈＡ４抗体の重鎖をコードする。別の実施形態において、本開示に係る核酸は抗ＥｐｈＡ４抗体の軽鎖をコードする。さらに別の実施形態において、本開示に係る核酸は、抗ＥｐｈＡ４抗体の重鎖および軽鎖をコードする。本開示に係る核酸には、抗ＥｐｈＡ４抗体の重鎖をコードする第一の核酸分子、および抗ＥｐｈＡ４抗体の軽鎖をコードする第二の核酸分子も含まれる。
　別の態様において、本開示は、抗ＥｐｈＡ４抗体をコードする単離された核酸を含むベクターに関する。本開示に係るベクターは、抗ＥｐｈＡ４抗体をコードする単離された核酸を含む一以上のベクターを指す。一実施形態において、本開示に係るベクターは、抗ＥｐｈＡ４抗体の重鎖をコードする核酸および抗ＥｐｈＡ４抗体の軽鎖をコードする核酸を含むベクターである。別の実施形態において、本開示に係るベクターは、抗ＥｐｈＡ４抗体の重鎖および軽鎖をコードする核酸を含むベクターである。さらに別の実施形態において、本開示に係るベクターは、抗ＥｐｈＡ４抗体の重鎖をコードする核酸を含む第一のベクター、および抗ＥｐｈＡ４抗体の軽鎖をコードする核酸を含む第二のベクターを含む。本開示に係るベクターは、特にこれらに限定されるものではないが、プラスミド、コスミド、ウイルス、ファージ等であってよい。例えば、ウイルスベクターとしては、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスまたは単純ヘルペスウイルスベクター等も本開示に係るベクターに含まれる。
　さらに別の態様において、本開示に係るベクターを含む宿主細胞、および当該宿主細胞を培養する工程を含む抗ＥｐｈＡ４抗体の作製方法も本開示に含まれる。本開示に係る宿主細胞は、特にこれらに限定されるものではないが、大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０細胞等であってよい。一実施形態において、抗ＥｐｈＡ４抗体の作製方法は、宿主細胞を培養する工程、および当該宿主細胞（または宿主細胞の培養培地）から分泌された抗ＥｐｈＡ４抗体を回収する工程を含む。
　一態様において、本開示は、抗ＥｐｈＡ４抗体を含む医薬組成物に関する。本開示に係る医薬組成物は、例えば、日本薬局方（ＪＰ）、米国薬局方（ＵＳＰ）または欧州薬局方（ＥＰ）に記載された方法等、既知の方法に従って製造することができる。
　本開示に係る抗ＥｐｈＡ４抗体は、アルツハイマー病の治療に有用であり得る。すなわち、一態様において、本開示は、抗ＥｐｈＡ４抗体を含む、アルツハイマー病の治療のための医薬組成物を包含する。他の態様において、治療上有効量の抗ＥｐｈＡ４抗体をアルツハイマー病の対象に投与する工程を含む、アルツハイマー病の治療方法を包含する。また、本開示は、他の態様において、アルツハイマー病の治療薬を製造するための、抗ＥｐｈＡ４抗体の使用を包含する。本開示は、他の態様において、アルツハイマー病の治療において使用するための抗ＥｐｈＡ４抗体を包含する。
　本開示に係る抗ＥｐｈＡ４抗体は、治療法において単独か、または、その他の薬剤または組成物と併用して用いることができる。例えば本開示に係る抗ＥｐｈＡ４抗体は、別の薬剤と同時または異時に投与されてよい。このような併用療法には、併用投与（同じかまたは別々の製剤に２以上の薬剤が含まれる）および分離投与（例えば同時にまたは連続的に）が含まれる。２以上の薬剤を別々に投与する場合、本開示に係る抗ＥｐｈＡ４抗体の投与は、付随する治療法に先立つか、または続いて行われてよい。
　本開示に係る医薬組成物を投与する対象は限定されず、例えば、ヒトまたは非ヒト哺乳動物（サル、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ウマ、ヤギ等）に対して用いることができる。
　本開示に係る医薬組成物の対象への投与方法（投与経路、投与量、１日の投与回数、投与のタイミング、等）は限定されず、対象の健康状態、疾患の程度、併用する薬剤の種類等に応じて、当業者（例えば、医師）が適宜決定することができる。
　技術的に矛盾しない限り、本明細書に記載の、あらゆる態様の任意の一または複数を、適宜組み合わせて、本開示を実施してよいことを当業者は理解する。さらに、技術的に矛盾しない限り、本明細書に記載の、好ましいまたは有利なあらゆる態様を、適宜組み合わせて、本開示を実施することが好ましいであろうことを当業者は理解する。
　本明細書中に引用される文献は、参照により、それらのすべての開示が、明確に本明細書に援用されているとみなされるべきであって、当業者は、本明細書の文脈に従って、本開示の精神および範囲を逸脱することなく、それらの文献における関連する開示内容を、本明細書の一部として援用して理解できる。
　本明細書中に引用される文献は、本出願の出願日前の関連技術の開示のみを目的として提供され、本発明者らが、先行発明または任意の他の理由によって、かかる開示に先行する権利を持たないことを自認するものとして解釈されてはならない。これらの文献のすべての記述は、本出願人が入手可能であった情報に基づいており、これらの記述内容が正確であるという自認を何ら構成しない。
　本明細書において用いられる用語は、特定の実施態様を説明するために用いられるのであり、発明を限定する意図ではない。
　本明細書において用いられる「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語は、文脈上明らかに異なる理解をすべき場合を除き、記載された事項（部材、ステップ、要素または数字等）が存在することを意図するものであり、それ以外の事項（部材、ステップ、要素または数字等）が存在することを排除しない。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ　ｏｆ）」という用語は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ　ｏｆ）」および／または「実質的に～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ　ｏｆ）」という用語で記載される態様を包含する。
　本明細書において用いられる「中和活性」という用語は、ＥｐｈＡ４とそのリガンドの結合を阻害する活性、および／または、ＥｐｈＡ４がそのリガンドの結合によりヒト生体内で誘導する、シグナル伝達や、細胞の分子発現応答もしくは機能性変化を阻害する活性を意味する。
　異なる定義が無い限り、ここに用いられるすべての用語（技術用語および科学用語を含む。）は、本開示が属する技術の当業者によって広く理解されるのと同じ意味を有する。ここに用いられる用語は、異なる定義が明示されていない限り、本明細書および関連技術分野における意味と整合的な意味を有するものとして解釈されるべきであり、理想化され、または、過度に形式的な意味において解釈されるべきではない。
　第１の、第２の等の用語が種々の要素を表現するために用いられるが、これらの要素はこれらの用語自身によって限定されるべきではないことが理解される。これらの用語は一つの要素を他の要素と区別するためのみに用いられているのであり、例えば、第１の要素を第２の要素と記し、同様に、第２の要素は第１の要素と記すことは、本開示の範囲を逸脱することなく可能である。
　本明細書において、成分含有量や数値範囲等を示すのに用いられる数値は、特に明示がない限り、用語「約」で修飾されているものと理解されるべきである。例えば、「４℃」とは、特に明示がない限り、「約４℃」を意味するものと理解され、その程度を、当業者は技術常識と本明細書の文意に従って、合理的に理解できることは当然である。
　文脈上明白に他の意味を示す場合を除き、本明細書および請求の範囲で使用される場合、単数形で表される各態様は、技術的に矛盾しない限り、複数形であってもよいことが理解され、逆もまた真である。
　以下において、本開示を、実施例を参照してより詳細に説明する。しかしながら、本開示はいろいろな態様により具現化することができ、ここに記載される実施例に限定されるものとして解釈されてはならない。関連技術分野の当業者は、本開示の精神または範囲を変更させることなく、様々な改変、付加、欠失、置換等を伴って本開示を実施できる。
実施例１：ヒト抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体の作製
　ヒトＥｐｈＡ４（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＰ＿００４４２９．１、配列番号１）に結合するモノクローナル抗体を作製するため、ヒトＥｐｈＡ４の細胞外領域（２０～５４７位）（配列番号２）に分泌型アルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）およびヒスチジンタグを融合したタンパク質（以下、「ヒトＥｐｈＡ４細胞外領域－ＳＥＡＰ－Ｈｉｓタンパク質」という、配列番号３）、ヒトＥｐｈＡ４の細胞外領域にヒトＩｇＧ１のＦｃ領域（Ｆｃ）およびヒスチジンタグを融合したタンパク質（以下、「ヒトＥｐｈＡ４細胞外領域－Ｆｃ－Ｈｉｓタンパク質」という、配列番号４）ならびにヒトＥｐｈＡ４の細胞外領域にマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）およびヒスチジンタグを融合したタンパク質（以下、「ヒトＥｐｈＡ４細胞外領域－ＭＢＰ－Ｈｉｓタンパク質」という、配列番号５）を以下の工程により調製した。
　最初に、ｐｃＤＮＡ３．１－ヒトＥｐｈＡ４細胞外領域－ＳＥＡＰ－Ｈｉｓ発現ベクター、ｐｃＤＮＡ３．１－ヒトＥｐｈＡ４細胞外領域－Ｆｃ－Ｈｉｓ発現ベクターおよびｐｃＤＮＡ３．４－ヒトＥｐｈＡ４細胞外領域－ＭＢＰ－Ｈｉｓ発現ベクターを構築した。まず、ヒトＥｐｈＡ４のシグナル配列（配列番号６）と細胞外領域をコードするＤＮＡ配列をヒトの脳由来のＴｏｔａｌ　ＲＮＡを用いて、ＲＴ－ＰＣＲによって増幅し、ＳＥＡＰおよびヒスチジンタグをコードするＤＮＡ配列を有するｐＥＮＴＲ１Ａベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）または、ＦｃおよびヒスチジンタグをコードするＤＮＡ配列を有するｐＥＮＴＲ１Ａベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のＳａｌＩ／ＮｏｔＩサイトにクローニングした。次に、ヒトのＥｐｈＡ４のシグナル配列と細胞外領域、ＳＥＡＰおよびヒスチジンタグをコードするＤＮＡ配列または、ヒトのＥｐｈＡ４のシグナル配列と細胞外領域、ＦｃおよびヒスチジンタグをコードするＤＮＡ配列をＧａｔｅｗａｙ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のＬＲ反応により、ｐｃＤＮＡ３．１＿ｒｆｃＢベクターに移し、ｐｃＤＮＡ３．１－ヒトＥｐｈＡ４細胞外領域－ＳＥＡＰ－Ｈｉｓ発現ベクターおよびｐｃＤＮＡ３．１－ヒトＥｐｈＡ４細胞外領域－Ｆｃ－Ｈｉｓ発現ベクターを構築した。ｐｃＤＮＡ３．４－ヒトＥｐｈＡ４細胞外領域－ＭＢＰ－Ｈｉｓ発現ベクターについては、ヒトＥｐｈＡ４のシグナル配列と細胞外領域をコードするＤＮＡ配列をＰＣＲによって増幅し、ＭＢＰおよびヒスチジンタグをコードするＤＮＡ配列を有するｐｃＤＮＡ３．４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にクローニングして、ヒトＥｐｈＡ４細胞外領域－ＭＢＰ－Ｈｉｓタンパク質の発現ベクターを構築した。Ｅｘｐｉ２９３発現システム（Ｔｈｅｒｍｏ　ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を用いて、上記それぞれの発現ベクターをＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ　ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）へ形質移入した。４日後に培養液を回収し、細胞を除いて清澄化した。ＴＡＬＯＮレジン（ＴａＫａＲａ）を用いて精製を行い、透析によりＰＢＳ（ＦＵＪＩＦＩＬＭ　Ｗａｋｏ　Ｐｕｒｅ）にバッファー置換した。
　ヒトＥｐｈＡ４タンパク質および完全ヒト抗体合成ファージライブラリーを用いてスクリーニングを実施し、ヒトＥｐｈＡ４と特異的に結合するヒト抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）を得た。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ磁気ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ　ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）、あるいはニッケルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてヒトＥｐｈＡ４細胞外領域－ＳＥＡＰ－Ｈｉｓタンパク質をキャプチャーし、完全ヒト抗体合成ファージライブラリーを添加して、１時間、あるいは２時間後に、未結合ファージをＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ（０．１％ｖ／ｖ）またはＰＢＳを使用して一連の洗浄サイクルによって除去した。結合したファージ粒子を溶出させた後、大腸菌ＴＧ１宿主細胞に感染を介して増幅した。感染ＴＧ１細胞を回収し、プレート上にまき、３０℃でインキュベートした。このパンニング処理を、増幅したファージを用いてさらに２回行った。
　３回のパンニング後、濃縮されたファージを感染させたＴＧ１細胞から単一コロニーを用いて、９６ウエルプレート中の培地に植菌した。ＩＰＴＧの添加により、ＦＬＡＧタグを付加したｓｃＦｖの発現を誘導し、３０℃で一晩振動培養した。ＴＧ１細胞をスピンダウンし、ｓｃＦｖを含む大腸菌培養上清を用いて、ヒトＥｐｈＡ４に対する反応性を有するウェルをピックアップした。
　ヒトのＥｐｈＡ４に対する反応性は、ヒトＥｐｈＡ４細胞外領域－Ｆｃ－Ｈｉｓタンパク質またはヒトＥｐｈＡ４細胞外領域－ＭＢＰ－Ｈｉｓタンパク質を用い、以下の工程に従ってＥＬＩＳＡにて評価した。抗ＦＬＡＧ抗体（ＳＩＧＭＡ）を、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）のウェル上にコートした。４℃にて一晩インキュベートした後、２％スキムミルク（ＢＤ）により、ウェルを室温にて２時間ブロッキングした。０．０２％　Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ（ナカライテスク）で３回洗浄した後、各ウェルにヒトＥｐｈＡ４細胞外領域－Ｆｃ－Ｈｉｓタンパク質またはヒトＥｐｈＡ４細胞外領域－ＭＢＰ－Ｈｉｓタンパク質と（最終濃度２０ｎＭ）、ｓｃＦｖを含む大腸菌培養上清を各ウェルに添加し、室温にて２時間インキュベートした。３回洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗Ｈｉｓ抗体（ＭＢＬ）を加え、室温にて１時間インキュベートした。５回洗浄した後、ウェルにＴＭＢＺ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン、ＫＰＬ）溶液を加え、１５～２０分室温にてインキュベートした。ウェルに等量の反応停止溶液（１Ｎ　Ｈ２ＳＯ４、ＦＵＪＩＦＩＬＭ　Ｗａｋｏ　Ｐｕｒｅ）を加え、マイクロプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）により４５０ｎｍの吸光度を読み取った。スクリーニングの結果、ヒトＥｐｈＡ４特異的なヒト抗体フラグメントを選抜し、シークエンスを行って各フラグメントの遺伝子配列を決定した。
　得られたヒト抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）の可変領域をコードするＤＮＡ配列を、それぞれ抗体重鎖および軽鎖定常領域を発現するベクターにサブクローニングすることによってクローンをｓｃＦｖからＩｇＧ形式に変換した。Ｅｘｐｉ２９３発現システム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて、ヒト抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体をコードする遺伝子配列を含む発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．４）をＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）へ形質移入した。上清を回収し、ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅ（Ｃｙｔｉｖａ）を用いてヒト抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体を得た。得られたヒト抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体については、ＥｐｈＡ４に対する切断促進活性やＥｐｈＡ４に対する特異性、ＥｐｈＡ４シグナルの下流分子のリン酸化状態、免疫原性等の観点から候補を絞った。免疫原性はＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（登録商標）（Ａｂｚｅｎａ）を用いて評価した。これら一連の評価においては、ヒト抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体の重鎖と軽鎖を組み替えた抗体やＣＤＲに変異を導入した抗体も作製し、全部で３００以上のヒト抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体を評価した。
　得られたヒト抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体のＥｐｈＡ４に対する切断促進活性は、ラット海馬ニューロンを用いて評価した。ラット海馬ニューロンの調製は、以下の工程に従って行った。妊娠１８日目のラット（日本チャールズ・リバー）から胎仔を取り出し、頭部を切開して脳を取り出した。実体顕微鏡下で海馬領域を切り出したのち、ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ溶液（１３７ｍＭ　ＮａＣｌ（和光純薬），５ｍＭ　ＫＣｌ（和光純薬），７ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４（和光純薬），２５ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ（ＤＯＪＩＮＤＯ）、０．５ｍｇ／ｍＬ　ＤＮａｓｅ（Ｓｉｇｍａ），０．２５％トリプシン（Ｌｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））に入れて３７℃で１０分間振とうした。溶液を除き、２０％Ｆｅｔａｌ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ／Ｈａｎｋｓ緩衝液（Ｓｉｇｍａ）を加えた。液を除いて、Ｈａｎｋｓ緩衝液で２回洗浄したのち、Ｈａｎｋｓ緩衝液中で海馬組織をピペッティングして細胞懸濁液を作製した。培養液（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ　ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１×Ｂ－２７ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｌｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、０．５ｍＭ　Ｌ－グルタミン（Ｌｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を入れたポリＬリジンをコートした９６ウェルディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ）に細胞を播種した。
　海馬ニューロンを用いたＥｐｈＡ４切断促進活性評価は、以下の工程に従って行った。９６ウェルディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ）に播種したラット海馬ニューロンに、抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体（２０ｎＭ）およびγセクレターゼ阻害薬であるＣｏｍｐｏｕｎｄ　Ｅ（５０ｎＭ、Ｅｎｚｏ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を処置して２４時間後にＰＢＳ（和光純薬）で洗浄して、ＳＤＳ　ｓａｍｐｌｅ　ｂｕｆｆｅｒ（Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（バイオ・ラッド）、５％　２－メルカプトエタノール（バイオ・ラッド））を加えて細胞を回収し、５分間煮沸した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥならびにウェスタンブロッティングによる分析あるいは全自動ウェスタンシステムＪｅｓｓ（プロテインシンプル）による分析を、抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体（Ａｂｎｏｖａ）を用いて行い、バンド強度を定量化したのち、ＥｐｈＡ４Ｃ末端フラグメント／全長ＥｐｈＡ４の値を算出した。
　上記のＥｐｈＡ４切断促進活性の評価により、ＥｐｈＡ４の切断を促進する活性を有するヒト抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体である抗体Ａおよび抗体Ｂを得た。抗体Ａおよび抗体Ｂは、ＥｐｈＡ４シグナルの下流分子のリン酸化を起こさず、かつ、免疫原性の低い（Ｔ細胞増殖及びＩＬ－２産生がともに１０％以下）抗体であった。
　抗体Ａおよび抗体Ｂの重鎖および軽鎖の全長をコードする遺伝子はＧｅｎＳｃｒｉｐｔにて全合成した。抗体Ａの重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号７に示すアミノ酸配列であり、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号８に示すアミノ酸配列である。抗体Ａのアミノ酸配列をコードする遺伝子配列として、重鎖可変領域については配列番号９に示す核酸配列を用い、軽鎖可変領域については配列番号１０に示す核酸配列を用いた。抗体Ｂの重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１１に示すアミノ酸配列であり、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１２に示すアミノ酸配列である。抗体Ｂのアミノ酸配列をコードする遺伝子配列として、重鎖可変領域については配列番号１３に示す核酸配列を用い、軽鎖可変領域については配列番号１４に示す核酸配列を用いた。抗体Ａの重鎖定常領域としては、ヒトＩｇＧ２の定常領域（配列番号１５）を用い、抗体Ｂの重鎖定常領域としては、ＣＨ１およびヒンジ部がヒトＩｇＧ１でありＣＨ２およびＣＨ３がヒトＩｇＧ２であるヒトＩｇＧ１／２の定常領域（配列番号１６）を用いた。抗体Ａ及び抗体Ｂの軽鎖定常領域としては、ヒトＩｇλ（配列番号１７）を用いた。抗体Ａのアミノ酸配列をコードする遺伝子配列として、重鎖定常領域については配列番号１８に示す核酸配列を用い、軽鎖定常領域については配列番号１９に示す核酸配列を用いた。抗体Ａの重鎖全長（シグナル配列は含まない）のアミノ酸配列は配列番号２０に示すアミノ酸配列であり、軽鎖全長（シグナル配列は含まない）のアミノ酸配列は配列番号２１に示すアミノ酸配列である。抗体Ａの重鎖全長をコードする核酸配列は配列番号２２に示す核酸配列であり、軽鎖全長をコードする核酸配列は、配列番号２３に示す核酸配列である。抗体Ｂのアミノ酸配列をコードする遺伝子配列として、重鎖定常領域については配列番号２４に示す核酸配列を用い、軽鎖定常領域については配列番号２５に示す核酸配列を用いた。抗体Ｂの重鎖全長（シグナル配列は含まない）のアミノ酸配列は、配列番号２６に示すアミノ酸配列であり、軽鎖全長（シグナル配列は含まない）のアミノ酸配列は、配列番号２７に示すアミノ酸配列である。抗体Ｂの重鎖全長をコードする核酸配列は、配列番号２８に示す核酸配列であり、軽鎖全長をコードする核酸配列は、配列番号２９に示す核酸配列である。Ｅｘｐｉ２９３発現システム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）もしくはＧＳシステム（Ｌｏｎｚａ）を用いて、抗体Ａおよび抗体Ｂのアミノ酸配列をコードする遺伝子配列を含む発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．４もしくはｐＥＥ６．４およびｐＥＥ１２．４）をＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）もしくはＣＨＯＫ１ＳＶ細胞（Ｌｏｎｚａ）へ形質移入した。上清を回収し、ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅ（Ｃｙｔｉｖａ）を用いてヒト抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体である抗体Ａおよび抗体Ｂを精製した。
　抗体Ａおよび抗体ＢのＣＤＲは、ＣＤＲの同定のためのＫａｂａｔの定義（Ｋａｂａｔナンバリングシステム）に従って決定した。抗体ＡのＣＤＲのアミノ酸配列と核酸配列をそれぞれ表１と表２に示す。抗体ＢのＣＤＲのアミノ酸配列と核酸配列をそれぞれ表３と表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
実施例２：ヒト抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体のヒトＥｐｈＡ４に対する結合親和性
　抗体Ａおよび抗体ＢのヒトＥｐｈＡ４に対する結合親和性をＢｉａｃｏｒｅ　Ｔ２００（Ｃｙｔｉｖａ）を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ法）により決定した。まず、抗Ｈｉｓ抗体（Ｃｙｔｉｖａ、２８－９９５０－５６）をセンサーチップＣＭ５へ固定化した。固定化は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、および、Ｎ－エチル－Ｎ’－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を用いたアミンカップリング法にて行い、ブロッキングにはエタノールアミンを用いた（センサーチップや固定化用試薬は、全てＣｙｔｉｖａ社製）。固定化用緩衝液（１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５）を用いて３μｇ／ｍＬに希釈し、Ｂｉａｃｏｒｅ　Ｔ２００付属のプロトコルに従い、センサーチップ上に固定した。ヒトＥｐｈＡ４細胞外領域－ＳＥＡＰ－Ｈｉｓ１０をランニング緩衝液ＨＢＳ－ＥＰ＋（Ｃｙｔｉｖａ、ＢＲ－１００１－６９）を用いて希釈し、フローセル上に１２０秒間送液しキャプチャーさせた（６ＲＵ程度のキャプチャー量）。続いてＨＢＳ－ＥＰ＋を用いて１００、５０、２５、１２．５、６．３、３．２、１．６、０ｎＭの範囲で系列希釈した抗体Ａおよび抗体Ｂを１２０秒間センサーチップに添加し、添加時（結合相、１２０秒間）、および、添加終了後（解離相、６００秒間）の結合反応曲線を順次観測した。各々の観測終了後に、３Ｍ　ＭｇＣｌ２（６０秒間）を添加してセンサーチップを再生した。得られた結合反応曲線に対して、システム付属ソフトＢＩＡ　ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトを用いた１：１の結合モデルによるフィッティング解析を行い、ヒトのＥｐｈＡ４に対する結合親和性（ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ）を算出した。上述の実験を３回実施し、各パラメーターについて平均値を算出した。
　抗体Ａおよび抗体ＢのヒトＥｐｈＡ４に対する結合親和性（ＫＤ値）は、それぞれ４．６７×１０－１０Ｍ、１．５６×１０－１０Ｍであった（図１）。抗体Ａおよび抗体Ｂは、ヒトのＥｐｈＡ４に対して同程度の結合親和性を持っていた。図１には、例として代表的な結合反応曲線を示す。
実施例３：ヒト抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体のヒトＥｐｈＡ４－ヒトリガンド結合阻害活性
　抗体Ａおよび抗体Ｂについて、ヒトＥｐｈＡ４とヒトリガンドとの結合阻害活性の評価は、以下の工程に従って行った。抗アルカリフォスファターゼ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）のウェル上にコートした。４℃にて一晩インキュベートした後、１％ブロックエース（ＫＡＣ）により、ウェルを４℃にて一晩ブロッキングした。０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで３回洗浄した後、ウェルにヒトＥｐｈＡ４細胞外領域－ＳＥＡＰ－Ｈｉｓタンパク質（最終濃度１０ｎＭ）を播種し室温にて１時間インキュベートした。３回洗浄した後、ウェルにリガンドと系列希釈した抗体Ａまたは抗体Ｂ（０、０．００３、０．０１、０．０３、０．１、０．３、１、３、１０、３０、１００、３００、１０００、３０００ｎＭ）を添加した。なお、リガンドにはビオチン化ヒトＥｐｈｒｉｎＡ５－Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、最終濃度０．７ｎＭ）およびビオチン化ヒトＥｐｈｒｉｎＢ３－Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、最終濃度２．３ｎＭ）を用いた。室温にて１時間インキュベートして３回洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を加え、室温にて１時間インキュベートした。３回洗浄した後、ウェルにＴＭＢＺ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン、ＫＰＬ）溶液を加え、１５～２０分室温にてインキュベートした。ウェルに等量の反応停止溶液（２Ｎ　Ｈ２ＳＯ４、ＦＵＪＩＦＩＬＭ　Ｗａｋｏ　Ｐｕｒｅ）を加え、マイクロプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）により４５０ｎｍの吸光度を読み取った。
　抗体Ａおよび抗体Ｂは、ヒトＥｐｈＡ４とヒトリガンドとの結合を濃度依存的に抑制し、抗体ＡのヒトＥｐｈｒｉｎＡ５、ＥｐｈｒｉｎＢ３結合に対するＩＣ５０値はそれぞれ３．９ｎＭ、３．０ｎＭ、抗体ＢのヒトＥｐｈｒｉｎＡ５、ＥｐｈｒｉｎＢ３結合に対するＩＣ５０値はそれぞれ４．８ｎＭ、４．１ｎＭであった。よって、抗体Ａおよび抗体Ｂは、ヒトＥｐｈＡ４とヒトリガンドとの結合を阻害することが分かった（図２）。
実施例４：ヒト抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体のヒトＥｐｈレセプターに対する選択性
　抗体Ａおよび抗体Ｂについて、ヒトＥｐｈレセプターの結合活性の評価は、以下の工程に従って行った。ウサギ抗６―Ｈｉｓ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）のウェル上にコートした。室温にて１時間もしくは４℃にて一晩インキュベートした後、１％ブロックエース（ＫＡＣ）により、ウェルを室温にて１時間ブロッキングした。０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで３回洗浄した後、各ウェルにヒトの各Ｅｐｈレセプター細胞外領域－Ｈｉｓタンパク質（Ｃｒｅａｔｉｖｅ　ｂｉｏｍａｒｔ、最終濃度１ｎＭ）を播種し、室温にて１時間インキュベートした。３回洗浄した後、抗体Ａおよび抗体Ｂ（１０μｇ／ｍＬ）を添加し、室温にて１時間インキュベートした。３回洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ヒトＩｇＧ　Ｆｃγフラグメント抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ　ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を加え、室温にて１時間インキュベートした。３回洗浄した後、ウェルにＴＭＢＺ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン、ＫＰＬ）溶液を加え、３～５分室温にてインキュベートした。ウェルに等量の反応停止溶液（２Ｎ　Ｈ２ＳＯ４、ＦＵＪＩＦＩＬＭ　Ｗａｋｏ　Ｐｕｒｅ）を加え、マイクロプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）により４５０ｎｍの吸光度を読み取った。
　抗体Ａおよび抗体Ｂは、ヒトＥｐｈレセプターファミリー間ではヒトＥｐｈＡ４に対して特異的に結合することが分かった（図３）。
実施例５：ヒト抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体のマウス、ラット、サルおよびヒトＥｐｈＡ４に対する反応性
　マウス、ラット、サルおよびヒトＥｐｈＡ４細胞外領域－ＳＥＡＰ－Ｈｉｓタンパク質の作製は、以下の工程に従って行った。ＳＥＡＰ－Ｈｉｓおよび、マウス、ラット、サルおよびヒトＥｐｈＡ４細胞外領域をコードする遺伝子の合成をＧｅｎｓｃｒｉｐｔにて行った。まず、合成されたＳＥＡＰ－Ｈｉｓをコードする遺伝子断片を、ｐｃＤＮＡ３．４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にクローニングした。構築したｐｃＤＮＡ３．４－ＳＥＡＰ－Ｈｉｓ発現ベクターに、合成されたマウス、ラット、サルおよびヒトＥｐｈＡ４細胞外領域の遺伝子断片をそれぞれクローニングし、マウス、ラット、サルおよびヒトＥｐｈＡ４細胞外領域－ＳＥＡＰ－Ｈｉｓ発現ベクターを構築した。ベクター構築において利用するヒトＥｐｈＡ４のアミノ酸配列を配列番号１、その細胞外領域は配列番号２、サルＥｐｈＡ４のアミノ酸配列を配列番号５１、その細胞外領域は配列番号５２、ラットＥｐｈＡ４のアミノ酸配列を配列番号５３、その細胞外領域は配列番号５４、マウスＥｐｈＡ４のアミノ酸配列を配列番号５５、その細胞外領域は配列番号５６として示す。ヒトＥｐｈＡ４細胞外領域－ＳＥＡＰ－Ｈｉｓタンパク質発現ベクター、サルＥｐｈＡ４細胞外領域－ＳＥＡＰ－Ｈｉｓタンパク質発現ベクター、ラットＥｐｈＡ４細胞外領域－ＳＥＡＰ－Ｈｉｓタンパク質発現ベクターおよびマウスＥｐｈＡ４細胞外領域－ＳＥＡＰ－Ｈｉｓタンパク質発現ベクターを用いて、各種ＥｐｈＡ４細胞外領域－ＳＥＡＰ－Ｈｉｓタンパク質を調製した。Ｅｘｐｉ２９３発現システム（Ｔｈｅｒｍｏ　ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を用いて、上記発現ベクターをＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ　ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）へ形質移入した。４日後に培養液を回収し、細胞を除いて清澄化した。ＴＡＬＯＮレジン（ＴａＫａＲａ）を用いて精製を行い、透析によりＰＢＳ（ＦＵＪＩＦＩＬＭ　Ｗａｋｏ　Ｐｕｒｅ）にバッファー置換した。
　抗体Ａおよび抗体Ｂについて、各種ＥｐｈＡ４との結合活性の評価は、以下の工程に従って行った。ウサギ抗６―Ｈｉｓ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）のウェル上にコートした。室温にて１時間インキュベートした後、１％ブロックエース（ＫＡＣ）により、ウェルを４℃にて一晩ブロッキングした。０．０２％　Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで３回洗浄した後、ウェルにマウス、ラット、サルおよびヒトＥｐｈＡ４細胞外領域－ＳＥＡＰ－Ｈｉｓタンパク質（最終濃度１ｎＭ）を播種し、室温にて１時間インキュベートした。３回洗浄した後、抗体Ａおよび抗体Ｂ（０、０．０００１３、０．０００６４、０．００３２、０．０１６、０．０８、０．４、２、１０μｇ／ｍＬ）を添加し、室温にて１時間インキュベートした。３回洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ヒトＩｇＧ　Ｆｃγフラグメント抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ　ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を加え、室温にて１時間インキュベートした。３回洗浄した後、ウェルにＴＭＢＺ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン、ＫＰＬ）溶液を加え、３～５分室温にてインキュベートした。ウェルに等量の反応停止溶液（２Ｎ　Ｈ２ＳＯ４、ＦＵＪＩＦＩＬＭ　Ｗａｋｏ　Ｐｕｒｅ）を加え、マイクロプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）により４５０ｎｍの吸光度を読み取った。
　抗体Ａおよび抗体Ｂは、マウス、ラット、サルおよびヒトＥｐｈＡ４いずれにおいても同等の結合活性を有していた（図４）。
実施例６：ヒト抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体のヒトＥｐｈＡ４細胞外領域、リガンド結合ドメイン、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン１、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン２に対する反応性
　ヒトＥｐｈＡ４の細胞外領域（ＥＣＤ）、リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン１（ＦＮ１）あるいはフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン２（ＦＮ２）とマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）およびヒスチジンタグを融合したタンパク質（以下、「ヒトＥｐｈＡ４細胞外領域－ＭＢＰ－Ｈｉｓタンパク質」、「ヒトＥｐｈＡ４リガンド結合ドメイン－ＭＢＰ－Ｈｉｓタンパク質」、「ヒトＥｐｈＡ４フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン１－ＭＢＰ－Ｈｉｓタンパク質」、および「ヒトＥｐｈＡ４フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン２－ＭＢＰ－Ｈｉｓタンパク質」という）の作製は、以下の工程に従って行った。最初に、ｐｃＤＮＡ３．４－ヒトＥｐｈＡ４細胞外領域、リガンド結合ドメイン、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン１、あるいはフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン２－ＭＢＰ－Ｈｉｓ発現ベクターを構築した。まず、ヒトＥｐｈＡ４のシグナル配列（配列番号６）あるいはプレプロトリプシンのシグナル配列（配列番号５７）とヒトＥｐｈＡ４の各ドメインをコードするＤＮＡ配列をＰＣＲによって増幅し、ＡＡＡ、またはＧ４ＳのリンカーのついたＭＢＰおよびヒスチジンタグをコードするＤＮＡ配列を有するｐｃＤＮＡ３．４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にクローニングして、ヒトＥｐｈＡ４細胞外領域－ＭＢＰ－Ｈｉｓタンパク質、ヒトＥｐｈＡ４リガンド結合ドメイン－ＭＢＰ－Ｈｉｓタンパク質、ヒトＥｐｈＡ４フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン１－ＭＢＰ－Ｈｉｓタンパク質、およびヒトＥｐｈＡ４フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン２－ＭＢＰ－Ｈｉｓタンパク質の発現ベクターを構築した。ベクター構築において利用するヒトＥｐｈＡ４のアミノ酸配列を配列番号１、その細胞外領域は配列番号２、リガンド結合ドメインは配列番号５８、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン１は配列番号５９、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン２は配列番号６０、ＭＢＰおよびヒスチジンタグ（ＭＢＰ－Ｈｉｓタンパク質）は配列番号６１として示す。Ｅｘｐｉ２９３発現システム（Ｔｈｅｒｍｏ　ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を用いて、上記発現ベクターをＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ　ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）へ形質移入した。４日後に培養液を回収し、細胞を除いて清澄化した。ヒトＥｐｈＡ４細胞外領域－ＭＢＰ－Ｈｉｓタンパク質、またはヒトＥｐｈＡ４リガンド結合ドメイン－ＭＢＰ－Ｈｉｓタンパク質はＴＡＬＯＮレジン（ＴａＫａＲａ）を用いて精製を行い、透析によりＰＢＳ（ＦＵＪＩＦＩＬＭ　Ｗａｋｏ　Ｐｕｒｅ）にバッファー置換した。ヒトＥｐｈＡ４フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン１－ＭＢＰ－Ｈｉｓタンパク質、およびヒトＥｐｈＡ４フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン２－ＭＢＰ－Ｈｉｓタンパク質はＡｍｙｌｏｓｅ　ｒｅｓｉｎ（ＮＥＢ）を用いて精製を行い、ＡＫＴＡ　Ｅｘｐｌｏｒｅ　１０ｓ／Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００　１０／３００　ＧＬ（Ｃｙｔｉｖａ）にて単量体画分を分画精製した。
　抗体Ａおよび抗体Ｂ、ヒトIｇＧ（Ｓｉｇｍａ）について、各種ＥｐｈＡ４との結合活性の評価は、以下の工程に従って行った。ウサギ抗６―Ｈｉｓ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）のウェル上にコートした。室温にて１時間インキュベートした後、１％ブロックエース（ＫＡＣ）により、ウェルを４℃にて一晩ブロッキングした。０．０２％　Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで３回洗浄した後、ウェルにヒトＥｐｈＡ４細胞外領域、ヒトＥｐｈＡ４リガンド結合ドメイン、ヒトＥｐｈＡ４フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン１、ヒトＥｐｈＡ４フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン２－ＭＢＰ－Ｈｉｓタンパク質またはＭＢＰ－Ｈｉｓタンパク質（最終濃度１ｎＭ）を播種し、室温にて１時間インキュベートした。３回洗浄した後、抗体Ａおよび抗体Ｂ、ヒトIｇＧ（１０ｎＭ）を添加し、室温にて１時間インキュベートした。３回洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ヒトＩｇＧ　Ｆｃγフラグメント抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ　ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を加え、室温にて１時間インキュベートした。３回洗浄した後、ウェルにＴＭＢＺ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン、ＫＰＬ）溶液を加え、３～５分室温にてインキュベートした。ウェルに等量の反応停止溶液（２Ｎ　Ｈ２ＳＯ４、ＦＵＪＩＦＩＬＭ　Ｗａｋｏ　Ｐｕｒｅ）を加え、マイクロプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）により４５０ｎｍおよび６５０ｎｍの吸光度を読み取った。
　抗体Ａおよび抗体Ｂは、ヒトＥｐｈＡ４細胞外領域（ＥＣＤ）およびリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）に結合活性を有していた（図５）。フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン１（ＦＮ１）およびフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン２（ＦＮ２）には反応しなかった。よって、抗体Ａおよび抗体ＢはヒトＥｐｈＡ４細胞外領域のリガンド結合ドメインに特異的に結合することが分かった。
実施例７：ヒト抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体の海馬ニューロンにおけるＥｐｈＡ４切断促進活性
　ラット海馬ニューロンの調製は、以下の工程に従って行った。妊娠１８日目のラット（日本チャールズ・リバー）から胎仔を取り出し、頭部を切開して脳を取り出した。実体顕微鏡下で海馬領域を切り出したのち、ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ溶液（１３７ｍＭ　ＮａＣｌ（和光純薬）、５ｍＭ　ＫＣｌ（和光純薬）、７ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４（和光純薬）、２５ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ（ＤＯＪＩＮＤＯ）、０．５ｍｇ／ｍＬ　ＤＮａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）、０．２５％トリプシン（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））に入れて３７℃で１０分間振とうした。溶液を除き、２０％Ｆｅｔａｌ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ／Ｈａｎｋｓ緩衝液（Ｓｉｇｍａ）を加えた。液を除いて、Ｈａｎｋｓ緩衝液で２回洗浄したのち、Ｈａｎｋｓ緩衝液中で海馬組織をピペッティングして細胞懸濁液を作製した。さらに、培養液（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ　ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１×Ｂ－２７ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、０．５ｍＭ　Ｌ－グルタミン（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））に懸濁したのち、ポリＬリジンをコートした９６ウェルディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ）に細胞を播種した。
　実施例１で得た抗体Ａおよび抗体Ｂについて、海馬ニューロンを用いたＥｐｈＡ４切断促進活性の評価は、以下の工程に従って行った。９６ウェルディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ）に播種したラット海馬ニューロンに、γセクレターゼ阻害薬であるＣｏｍｐｏｕｎｄ　Ｅ（５０ｎＭ、Ｅｎｚｏ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）とともに、溶媒（ＰＢＳ（ＦＵＪＩＦＩＬＭ　Ｗａｋｏ　Ｐｕｒｅ））、ヒトＩｇＧ、抗体Ａあるいは抗体Ｂ（２．０、６．７、２０ｎＭ）を２４時間作用させた。ＰＢＳ（ＦＵＪＩＦＩＬＭ　Ｗａｋｏ　Ｐｕｒｅ）で洗浄したのち、ＳＤＳ　ｓａｍｐｌｅ　ｂｕｆｆｅｒ（Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（バイオ・ラッド）、２．５％　２－メルカプトエタノール（バイオ・ラッド））を加えて細胞を回収し、５分間煮沸した。このサンプルを全自動ウェスタンシステムＪｅｓｓで解析した。解析には抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体（Ａｂｎｏｖａ）を用いた。ＥｐｈＡ４　Ｃ末端フラグメントと全長ＥｐｈＡ４のシグナルを定量し、ＥｐｈＡ４　Ｃ末端フラグメント／（全長ＥｐｈＡ４＋ＥｐｈＡ４　Ｃ末端フラグメント）の値を算出した。
　抗体Ａおよび抗体Ｂは、海馬ニューロンにおいて、濃度依存的にＥｐｈＡ４切断反応を促進した（図６）
実施例８：ヒト抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体のヒトＥｐｈＡ４切断促進活性
　まず、ヒトＥｐｈＡ４をコードするＤＮＡ配列およびＨＡタグをコードするＤＮＡ配列を有するｐＣＡＨＡベクターをジェンスクリプトジャパン株式会社において合成したのち、ｐＣＡＨＡベクターのＳａｌＩ／ＮｏｔＩサイトにヒトＥｐｈＡ４をコードするＤＮＡ配列を挿入し、ｐＣＡ－ヒトＥｐｈＡ４－ＨＡ発現ベクターを構築した。
　ラット海馬ニューロンの調製は、以下の工程に従って行った。妊娠１８日目のラット（日本チャールズ・リバー）から胎仔を取り出し、頭部を切開して脳を取り出した。実体顕微鏡下で海馬領域を切り出したのち、ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ溶液（１３７ｍＭ　ＮａＣｌ（和光純薬），５ｍＭ　ＫＣｌ（和光純薬），７ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４（和光純薬），２５ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ（ＤＯＪＩＮＤＯ）、０．５ｍｇ／ｍＬ　ＤＮａｓｅ（Ｓｉｇｍａ），０．２５％トリプシン（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））に入れて３７℃で１０分間振とうした。溶液を除き、２０％Ｆｅｔａｌ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ／Ｈａｎｋｓ緩衝液（Ｓｉｇｍａ）を加えた。液を除いて、Ｈａｎｋｓ緩衝液で２回洗浄したのち、Ｈａｎｋｓ緩衝液中で海馬組織をピペッティングして細胞懸濁液を作製した。
　実施例１で得た抗体Ａおよび抗体Ｂについて、ヒトＥｐｈＡ４に対する切断促進活性の評価は、以下の工程に従って行った。ラット海馬ニューロンにＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ(Ｌｏｎｚａ)を用いてｐＣＡ－ヒトＥｐｈＡ４－ＨＡ発現ベクターを導入し、培養液（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ　ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１×Ｂ－２７ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、０．５ｍＭ　Ｌ－グルタミン（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））に懸濁したのち、ポリＬリジンをコートした９６ウェルディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ）に播種した。播種したラット海馬ニューロンに、γセクレターゼ阻害薬であるＣｏｍｐｏｕｎｄ　Ｅ（５０ｎＭ、Ｅｎｚｏ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）とともに、溶媒（ＰＢＳ（和光純薬））、ヒトＩｇＧ、抗体Ａあるいは抗体Ｂ（６．７、２０、６７ｎＭ）を一晩作用させた。ＰＢＳで洗浄したのち、ＳＤＳ　ｓａｍｐｌｅ　ｂｕｆｆｅｒ（Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（バイオ・ラッド）、５％２－メルカプトエタノール（バイオ・ラッド））を加えて細胞を回収し、５分間煮沸した。このサンプルを用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、ラット抗ＨＡモノクローナル抗体（Ｒｏｃｈｅ）を用いたウェスタンブロッティングを行い、バンド強度を定量化し、ヒトＥｐｈＡ４　Ｃ末端フラグメント／（全長ヒトＥｐｈＡ４＋ヒトＥｐｈＡ４　Ｃ末端フラグメント）の値を算出した。
　抗体Ａおよび抗体Ｂは、海馬ニューロンにおいて、ヒトＥｐｈＡ４切断反応を促進した（図７）。
実施例９：ヒト抗ＥｐｈＡ４モノクローナル抗体の海馬ニューロンのスパイン密度に対する増加効果
　ラット海馬ニューロンの調製は、実施例７に記載されるように行った。ラット海馬ニューロンにＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を用いてＥＧＦＰ遺伝子を導入し、遺伝子導入していないニューロンと混合して、カバーガラス（松浪硝子工業）を入れ、ポリＬリジンをコートした２４ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ）に播種した。
　海馬ニューロンを用いたスパインの計数は、以下の工程に従って行った。カバーガラス（松浪硝子工業）を入れ、ポリＬリジンをコートした２４ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ）に播種した培養１５日目のラット海馬ニューロンに、コントロール抗体（ヒトIｇＧ２；Ｓｉｇｍａ）、抗体Ａあるいは抗体Ｂ（６．７、２０ｎＭ）を２４時間処置した。その後、カバーガラスを２％ＰＦＡ（和光純薬）／４％Ｓｕｃｒｏｓｅ（和光純薬）／ＰＢＳに移し、２０分間静置し、細胞を固定した。カバーガラスを固定液から取り出し、ＰＢＳに移して３回洗浄したのち、０．２５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（和光純薬）／ＰＢＳを加えて、１５分間、細胞透過処理を行った。２％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）／０．２５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００／ＯＰＴＩ－ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）にカバーガラスを移して、１時間ブロッキングを施したあと、抗ＧＦＰ抗体（ナカライテスク）および抗Ｍａｔｈ２抗体（ａｂｃａｍ）を室温で１時間～1時間３０分反応させた。１次抗体溶液を除き、カバーガラスをＰＢＳで３回洗浄したのち、２次抗体を室温で遮光して１時間反応させた。２次抗体溶液を除き、カバーガラスをＰＢＳで３回洗浄したのち、Ｐｒｏｌｏｎｇ　Ｇｏｌｄ　ａｎｔｉｆａｄｅ　ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｐｒｏｂｅｓ）を用いて封入し、ＬＳＭ８００（ＺＥＩＳＳ）で観察と解析画像の取り込みを行った。上述の実験を３回実施し、１回の実験につき、カバーガラス２枚からＭａｔｈ２陽性の錐体細胞様ニューロンを抽出し、それぞれの樹状突起にあるスパインを画像解析ソフトＩｍａｒｉｓ（登録商標）（Ｂｉｔｐｌａｎｅ）を用いて計数し、各ニューロンにおける１０ μｍあたりのスパイン数を算出した。
　抗体Ａおよび抗体Ｂは、海馬ニューロンのスパイン密度を増加させた（図８）。本結果は、抗体Ａおよび抗体Ｂが海馬ニューロンにおいてスパインを安定化させる活性を有することを示すものである。

Claims (24)

  1. 　抗ＥｐｈＡ４抗体であって、
    　前記抗ＥｐｈＡ４抗体は、
    　（ａ）配列番号３０に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１；
    　（ｂ）配列番号３１に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２；および
    　（ｃ）配列番号３２に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖；ならびに
    　（ｄ）配列番号３３に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１；
    　（ｅ）配列番号３４に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２；および
    　（ｆ）配列番号３５に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖
    を含む、抗ＥｐｈＡ４抗体、
    　または、
    　（ｇ）配列番号４２に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１；
    　（ｈ）配列番号３１に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２；および
    　（ｉ）配列番号４３に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖；ならびに
    　（ｊ）配列番号４４に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１；
    　（ｋ）配列番号３４に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２；および
    　（ｌ）配列番号３５に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖
    を含む、抗ＥｐｈＡ４抗体。
  2. 　請求項１に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体であって、
    　前記抗ＥｐｈＡ４抗体はヒト抗体である、
    抗ＥｐｈＡ４抗体。
  3. 　請求項１または２に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体であって、
    　前記抗ＥｐｈＡ４抗体は、ＥｐｈＡ４に特異的に結合し、ＥｐｈＡ４の切断を促進する、
    抗ＥｐｈＡ４抗体。
  4. 　請求項１～３のいずれか１項に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体であって、
    　前記抗ＥｐｈＡ４抗体は、ＥｐｈＡ４に特異的に結合し、ＥｐｈＡ４とｅｐｈｒｉｎとの結合を阻害する、
    抗ＥｐｈＡ４抗体。
  5. 　請求項１～４のいずれか１項に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体であって、
    　前記重鎖は配列番号７に示すアミノ酸配列からなる可変領域を含み、
    　前記軽鎖は配列番号８に示すアミノ酸配列からなる可変領域を含む、
    抗ＥｐｈＡ４抗体。
  6. 　請求項１～５のいずれか１項に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体であって、
    　前記重鎖の定常領域および前記軽鎖の定常領域がヒト抗体由来のアミノ酸配列を含む、
    抗ＥｐｈＡ４抗体。
  7. 　請求項６に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体であって、
    　前記重鎖の定常領域はヒトＩｇＧの定常領域である、
    抗ＥｐｈＡ４抗体。
  8.   請求項７に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体であって、
      前記ヒトＩｇＧの定常領域は、ヒトＩｇＧ２の定常領域である、
    抗ＥｐｈＡ４抗体。
  9. 　請求項８に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体であって、
    　前記ヒトＩｇＧ２の定常領域は、配列番号１５示すアミノ酸配列を含む、
    抗ＥｐｈＡ４抗体。
  10. 　請求項１～４のいずれか１項に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体であって、
    　前記重鎖は配列番号１１に示すアミノ酸配列からなる可変領域を含み、
    　前記軽鎖は配列番号１２に示すアミノ酸配列からなる可変領域を含む、
    抗ＥｐｈＡ４抗体。
  11. 　請求項１～４および請求項１０のいずれか１項に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体であって、
    　前記重鎖の定常領域および前記軽鎖の定常領域がヒト抗体由来のアミノ酸配列を含む、
    抗ＥｐｈＡ４抗体。
  12. 　請求項１１に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体であって、
    　前記重鎖の定常領域はヒトＩｇＧの定常領域である、
    抗ＥｐｈＡ４抗体。
  13. 　請求項１２に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体であって、
    　前記ヒトＩｇＧの定常領域は、ヒトＩｇＧ１とヒトＩｇＧ２の組み合わせからなるヒトＩｇＧの定常領域である、
    抗ＥｐｈＡ４抗体。
  14. 　請求項１３に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体であって、
    　前記ヒトＩｇＧ１とヒトＩｇＧ２の組み合わせからなるヒトＩｇＧの定常領域は、配列番号１６示すアミノ酸配列を含む、
    抗ＥｐｈＡ４抗体。
  15. 　請求項６～９および請求項１１～１４のいずれか１項に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体であって、
    　前記軽鎖の定常領域は、ヒトＩｇλの定常領域である、
    抗ＥｐｈＡ４抗体。
  16. 　請求項１５に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体であって、
    　前記ヒトＩｇλの定常領域は、配列番号１７に示すアミノ酸配列を含む、
    抗ＥｐｈＡ４抗体。
  17. 　抗ＥｐｈＡ４抗体であって、
    　前記抗ＥｐｈＡ４抗体は、重鎖および軽鎖を含み、
    　前記重鎖は、配列番号２０に示すアミノ酸配列を含み、かつ
    　前記軽鎖は、配列番号２１に示すアミノ酸配列を含み、
    　前記重鎖のＣ末端リシンが欠失されていてもよい、
    抗ＥｐｈＡ４抗体。
  18. 　請求項１７に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体であって、
    　前記重鎖のＣ末端リシンが欠失されている、
    抗ＥｐｈＡ４抗体。
  19. 　抗ＥｐｈＡ４抗体であって、
    　前記抗ＥｐｈＡ４抗体は、重鎖および軽鎖を含み、
    　前記重鎖は、配列番号２６に示すアミノ酸配列を含み、かつ
    　前記軽鎖は、配列番号２７に示すアミノ酸配列を含み、
    　前記重鎖のＣ末端リシンが欠失されていてもよい、
    抗ＥｐｈＡ４抗体。
  20. 　請求項１９に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体であって、
    　前記重鎖のＣ末端リシンが欠失されている、
    抗ＥｐｈＡ４抗体。
  21. 　請求項１～２０のいずれか１項に記載の抗ＥｐｈＡ４抗体をコードする単離された核酸。
  22. 　請求項２１に記載の核酸を含むベクター。
  23. 　請求項２２に記載のベクターを含む宿主細胞。
  24. 　請求項２３に記載の宿主細胞を培養する工程を含む、抗ＥｐｈＡ４抗体の作製方法。

     
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