WO2022146016A1 - Ｎｋ 세포를 포함한 면역 세포 활성을 우수하게 증진시키는 면역 강화 녹용 효소분해 추출물 - Google Patents

Ｎｋ 세포를 포함한 면역 세포 활성을 우수하게 증진시키는 면역 강화 녹용 효소분해 추출물 Download PDF

Info

Publication number
WO2022146016A1
WO2022146016A1 PCT/KR2021/020127 KR2021020127W WO2022146016A1 WO 2022146016 A1 WO2022146016 A1 WO 2022146016A1 KR 2021020127 W KR2021020127 W KR 2021020127W WO 2022146016 A1 WO2022146016 A1 WO 2022146016A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
enzyme
antler
extract
deer
deer antler
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/KR2021/020127
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
강종수
정경인
박일범
박현제
송애리
엄세미
전혜진
백신화
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yuhan Care Co Ltd
Original Assignee
Yuhan Care Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from KR1020210189206A external-priority patent/KR20220097277A/ko
Application filed by Yuhan Care Co Ltd filed Critical Yuhan Care Co Ltd
Priority to JP2023540829A priority Critical patent/JP7630628B2/ja
Priority to EP21915814.4A priority patent/EP4272575A4/en
Priority to NZ802127A priority patent/NZ802127B2/en
Priority to CN202180094498.0A priority patent/CN116887696A/zh
Priority to US18/259,738 priority patent/US20240050487A1/en
Publication of WO2022146016A1 publication Critical patent/WO2022146016A1/ko
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L13/00—Meat products; Meat meal; Preparation or treatment thereof
    • A23L13/20—Meat products; Meat meal; Preparation or treatment thereof from offal, e.g. rinds, skins, marrow, tripes, feet, ears or snouts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L13/00—Meat products; Meat meal; Preparation or treatment thereof
    • A23L13/40—Meat products; Meat meal; Preparation or treatment thereof containing additives
    • A23L13/48—Addition of, or treatment with, enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/32—Bones; Osteocytes; Osteoblasts; Tendons; Tenocytes; Teeth; Odontoblasts; Cartilage; Chondrocytes; Synovial membrane
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/12—Carboxylic acids; Salts or anhydrides thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/20—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing sulfur, e.g. dimethyl sulfoxide [DMSO], docusate, sodium lauryl sulfate or aminosulfonic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/46—Ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. skin, bone, milk, cotton fibre, eggshell, oxgall or plant extracts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0087—Galenical forms not covered by A61K9/02 - A61K9/7023
    • A61K9/0095—Drinks; Beverages; Syrups; Compositions for reconstitution thereof, e.g. powders or tablets to be dispersed in a glass of water; Veterinary drenches
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A61K9/1605—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/1611—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A61K9/1605—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/1617—Organic compounds, e.g. phospholipids, fats
    • A61K9/1623—Sugars or sugar alcohols, e.g. lactose; Derivatives thereof; Homeopathic globules
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/20—Pills, tablets, discs, rods
    • A61K9/2004—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/2013—Organic compounds, e.g. phospholipids, fats
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/20—Pills, tablets, discs, rods
    • A61K9/2004—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/2013—Organic compounds, e.g. phospholipids, fats
    • A61K9/2018—Sugars, or sugar alcohols, e.g. lactose, mannitol; Derivatives thereof, e.g. polysorbates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/20—Pills, tablets, discs, rods
    • A61K9/2004—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/2022—Organic macromolecular compounds
    • A61K9/205—Polysaccharides, e.g. alginate, gums; Cyclodextrin
    • A61K9/2059—Starch, including chemically or physically modified derivatives; Amylose; Amylopectin; Dextrin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/4841—Filling excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/4858—Organic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/4841—Filling excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/4866—Organic macromolecular compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2200/00—Function of food ingredients
    • A23V2200/30—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health
    • A23V2200/324—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health having an effect on the immune system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2300/00—Processes
    • A23V2300/14—Extraction
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2300/00—Processes
    • A23V2300/24—Heat, thermal treatment

Definitions

  • the present invention relates to a composition for enhancing immunity, and more particularly, to a food composition for enhancing immunity comprising an enzyme-decomposed extract of deer deer deer antler having excellent NK cell activity as an active ingredient, in particular, a health functional food for enhancing immunity, pharmaceutical composition for enhancing immunity it's about
  • Health promotion aims to increase resistance to diseases, particularly chronic degenerative diseases or infectious diseases, and continuous stress, and to increase daily activity. It is necessary to manage the overall lifestyle, including the continuation of activities.
  • Immune refers to a mechanism for physiologically recognizing and excluding foreign and endogenous foreign substances in the body of humans and animals, and maintaining homeostasis.
  • foreign substances are called antigens, and numerous types of white blood cells and proteins are involved in the process of removing them.
  • Immunity is largely divided into innate immunity, which is possessed from birth, and acquired immunity, which is acquired by adapting to life.
  • Innate immunity is also called natural immunity or natural resistance. It responds non-specifically to antigens and has no specific memory function.
  • the innate immune system includes the skin and mucous tissues that block the invasion of antigens, gastric acid of gastric acidity, and complement present in the blood.
  • Cells include macrophages, polymorphonuclear leukocytes, and NK cells capable of killing infected cells. There are also cytokines produced by macrophages. In fact, most infections are protected by the innate immunity.
  • the initial recognition of foreign infection is mainly carried out by macrophages.
  • macrophages phagocytosing antigens, cytokines that mediate immune responses are produced.
  • cytokines are glycoproteins used as signaling substances to control and stimulate the body's defense system, and play important functions in immunity, infectious diseases, hematopoietic function, tissue recovery, and cell development and growth. Cytokines are also called inflammatory cytokines because they have the function of causing immune cells to gather at the site of infection by inducing inflammation in a local area. The most important immune function is performed by a group of cytokines known as interleukins, interferon gamma, and tumor necrosis factor. Among them, interleukin is a substance that plays an important role in the defense of the human body by regulating the immune response by acting on various stages of the immune response, and the types include IL-1, IL-6, and IL-12. .
  • NK cells Natural killer cells; natural killer cells
  • NK cells perform the function of eliminating tumor cells, bacteria, intracellular parasites, or virus-infected host cells without prior sensitization by antigen, rejecting inappropriate bone marrow transplantation, and
  • a behavioral cell that acts at the first line of the immune system defense mechanism in vivo, such as regulating the immune response of cells it is known that the ability to attack and remove target cells is also increased when the NK cell activity is excellent.
  • antler (Cervi Parvum Corun, Antler) is made by cutting and drying young antlers that have not yet ossified or have been slightly ossified. , refers to male horns that have not keratinized within 2 months of starting to grow, so the tissue is soft and the hairs are evenly covered. Deer antlers that have not been keratinized are slightly soft, but in autumn, antlers are keratinized hard and the efficacy of antlers decreases, which is called antler.
  • antlers are tonic and promote growth and development. It is known to have many pharmacological effects, such as blood retention, hematopoiesis, enhancement of organs and organs, treatment of heart failure, enhancement of physical function, enhancement of physical vitality, and enhancement of diuretic function of the kidneys.
  • pharmacological effects such as blood retention, hematopoiesis, enhancement of organs and organs, treatment of heart failure, enhancement of physical function, enhancement of physical vitality, and enhancement of diuretic function of the kidneys.
  • Studies on the efficacy using animals include white paper growth promotion, hematopoiesis, lowering serum cholesterol, protein synthesis promotion, anti-aging, increasing spinal nerve enzyme activity, analgesic and anti-fatigue, immune activity enhancement, and sedative action. has been reported
  • Bioactive ingredients of antler include amino acids, calcium phosphate, calcium carbonate, collagen, phospholipids, chondroitin, glucosamine, pantocrin, ganglioside, hyaluronic acid acid) are known.
  • Conventional methods of taking antler used in oriental medicine include mixing and pulverizing dried antler with various kinds of herbal medicines, heating and extracting water as a solvent, and then taking the filtrate, and pulverizing dried antler and herbal medicines into powder. After making it, it is mainly used as a pill ( ⁇ ). While extracting and taking the active ingredient of deer antler is easy to absorb, there is a limitation in not being able to utilize the active ingredient contained in the extract. There was a problem that absorption was difficult.
  • Korean Patent Application Laid-Open No. 2005-0090041 describes a method of extracting deer antler that is pulverized and then extracted, followed by proteolytic enzyme treatment and hydrochloric acid decomposition treatment. The process was complicated, and there was a problem in that physiologically active substances useful in the human body were decomposed.
  • Korea Patent Publication No. 2013-0078724 describes a method of treating antler with pepsin and a lipolytic enzyme under acidic conditions and then with a protease again under neutral conditions. There was a limit that only described increased, but did not describe actual physiological activity or specific functionality.
  • Patent Document 1 Korea Patent Publication No. 2005-0090041
  • Patent Document 2 Korean Patent Publication No. 2013-0078724
  • the problem to be solved by the present invention is immunity containing, as an active ingredient, an enzyme-decomposed extract of deer antler with excellent NK cell activity obtained by decomposing deer antler with an enzyme of IUBMB enzyme naming class EC 3.4.11.1 or IUBMB enzyme naming class EC 3.4.24.28 To provide a food composition for enhancement.
  • Another problem to be solved by the present invention is a freeze-dried antler preparation step of freeze-drying raw or frozen antler; and an enzyme treatment step of adding 50 to 500 parts by weight of water and 0.01 to 1 part by weight of an enzyme to 10 parts by weight of the freeze-dried antler and reacting at 30 to 60° C. for 1 to 48 hours, wherein the enzyme is IUBMB enzyme naming class
  • the enzyme is IUBMB enzyme naming class
  • Another problem to be solved by the present invention is to decompose deer antler with an enzyme of IUBMB enzyme naming class EC 3.4.11.1 or IUBMB enzyme naming class EC 3.4.
  • IUBMB enzyme naming class EC 3.4.11.1 or IUBMB enzyme naming class EC 3.4.
  • the present invention is a food for enhancing immunity comprising, as an active ingredient, an enzyme-decomposed extract of deer antler decomposed with an enzyme of IUBMB enzyme naming class EC 3.4.11.1 or IUBMB enzyme naming class EC 3.4.24.28.
  • a composition is provided.
  • the enzyme-decomposed extract of deer antler may be an enzyme-decomposed extract of deer antler decomposed with an enzyme of IUBMB enzyme naming class EC 3.4.11.1 or IUBMB enzyme naming class EC 3.4.24.28. .
  • the enzyme of the IUBMB enzyme naming class EC 3.4.11.1 may be a complex of a fungal-derived protease and peptidase.
  • the complex of the fungal-derived protease and peptidase may be a complex of endoprotease and exopeptidase derived from Aspergillus oryzae .
  • the complex of the endoprotease and exopeptidase may be a flavozyme (Flavourzyme).
  • the enzyme of the IUBMB enzyme naming class EC 3.4.24.28 may be a neutral protease derived from Bacillus.
  • the neutral protease derived from Bacillus may be a neutral metallo (Zn) endoprotease produced by submerged fermentation of Bacillus amyloliquefaciens . .
  • the neutral metallo (Zn) endoprotease may be a neutrase (Neutrase).
  • the enzyme-decomposed extract of deer antler may be an enzyme-decomposed extract of deer antler obtained by hydrolyzing dried antlers obtained by lyophilizing raw or frozen antlers by enzyme treatment.
  • the present invention also provides a freeze-dried antler preparation step of freeze-drying a raw or frozen antler; and an enzyme treatment step of adding 50 to 500 parts by weight of water and 0.01 to 1 part by weight of an enzyme to 10 parts by weight of the freeze-dried antler and reacting at 30 to 60° C. for 1 to 48 hours, wherein the enzyme is IUBMB enzyme naming class It provides a method for producing an enzyme-decomposed extract of deer deer antler with immune enhancing activity, characterized in that it is an enzyme of EC 3.4.11.1 or IUBMB enzyme naming class EC 3.4.24.28.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for enhancing immunity comprising, as an active ingredient, an enzyme decomposed by an enzyme of IUBMB enzyme naming class EC 3.4.11.1 or an enzyme of IUBMB enzyme naming class EC 3.4.24.28.
  • the enzyme-decomposed extract of deer antler may be an enzyme-decomposed extract of deer deer deer antler with an enzyme of IUBMB enzyme naming class EC o 3.4.11.1 or IUBMB enzyme naming class EC 3.4.24.28.
  • composition comprising the deer deer deer antler decomposing extract having excellent NK cell activity of the present invention as an active ingredient proliferates immune cells or activates the function of immune cells, so it can be used as a food composition for enhancing immunity, furthermore, as a health functional food or pharmaceutical composition. have.
  • Figure 2 is a graph comparing the nitric oxide production effect in macrophages according to the type and concentration of the enzyme-decomposed extract of deer antler in Experimental Example 3.
  • FIG. 3 is a graph comparing iNOS gene expression levels in macrophages according to the type and concentration of deer antler enzymatic extract in Experimental Example 4.
  • TNF- ⁇ is a graph comparing the relative expression level of TNF- ⁇ according to the type and concentration of the enzyme-decomposed extract of deer antler in Experimental Example 5.
  • FIG. 6 is a graph comparing the relative expression level of IFN- ⁇ according to the type and concentration of the enzyme-decomposed extract of deer antler in Experimental Example 5.
  • FIG. 9 is a graph comparing macrophage proliferative capacity according to the change of incubation time according to the type and concentration of the enzyme-decomposed extract of deer antler in Experimental Example 6.
  • FIG. 10 is a graph comparing NK cell activity according to the type and administration concentration of an enzyme-decomposed deer antler extract in an immunosuppressed animal model in Experimental Example 7.
  • FIG. 11 is a graph comparing the TNF- ⁇ concentration according to the type and administration concentration of deer antler enzyme-decomposed extract in the immunosuppressed animal model in Experimental Example 7.
  • IFN- ⁇ interferon gamma
  • the antler refers to the antlers of deer that have not been ossified within 2 months of age.
  • dried antlers naturally dried over several weeks in a low-humidity environment may be used.
  • dried antlers obtained by freeze-drying raw antlers or frozen antlers may be used.
  • the IUBMB enzyme naming class EC 3.4.23.1 enzyme for example, pepsin (pepsin), enzymes such as aspartic proteinnase (Aspartic proteinnase) also does not show an immune enhancing effect even when the deer antler enzyme-decomposed extract is prepared.
  • pepsin is an aspartic endopeptidase that selectively cleaves hydrophobic, particularly aromatic amino acid residues.
  • Enzymes of the IUBMB enzyme naming class EC 3.4.11.1 for example, A-LAP, acidic M17 leucine aminopeptidase, AcLAP, adipocyte-derived leucine aminopeptidase, Aminopeptidase, "Flavourzyme” (Novozyme), etc.
  • A-LAP acidic M17 leucine aminopeptidase
  • AcLAP adipocyte-derived leucine aminopeptidase
  • Aminopeptidase "Flavourzyme” (Novozyme)
  • the Flavorzyme is a complex of endoprotease and exopeptidase produced by submerged fermentation of Aspergillus oryzae .
  • the enzyme of the IUBMB enzyme naming class EC 3.4.24.28 is a neutral protease derived from Bacillus, for example, bacillus lysine, bacillus metalloendopeptidase, anilozyme P10; Bacillus metalloproteinase, megateiopeptidase, "Neutrace” (Novozyme), etc. are much better than the conventional hot water extract of deer antler or supercritical deer antler extract when an enzyme-decomposed extract of deer antler is prepared through enzyme treatment. It exhibits an excellent immune enhancing effect.
  • the Neutrase is a neutral metallo (Zn) endoprotease produced by submerged fermentation of Bacillus amyloliquefaciens .
  • enzyme-treated deer antler enzyme-decomposed extracts are also conventionally processed by "Protease N 'Amano'” (Amano Enzyme) and "Corolase N” (AB Enzymes), which are neutral metalloproteinases of bacterial origin belonging to the enzyme class. It shows a much superior immune enhancing effect compared to the hot water extract of deer antler or the supercritical deer antler extract.
  • the enzyme-decomposed extract of deer antler is enzymatically treated by adding an appropriate amount of deer antler and enzyme to water.
  • an appropriate amount of deer antler and enzyme for example, 50 to 500 parts by weight, preferably 100 to 400 parts by weight of water, is added based on 10 parts by weight of dry antler such as freeze-dried antler, and the enzyme is 0.01 to 1 part by weight, preferably 0.02 to 0.8 parts by weight. , More preferably, 0.05 to 0.5 parts by weight may be added, but the amount may be arbitrarily changed as needed.
  • the enzyme treatment temperature can be selected in an appropriate range according to the optimum temperature of the selected enzyme, preferably 30 to 60 °C, more preferably 40 to 55 °C can be reacted.
  • the enzymatic treatment time may be selected according to the amount of the peptide produced by the enzyme treatment, the molecular weight of the peptide and its profile, and is preferably 1 hour or more, more preferably 2 hours or more, still more preferably 3 hour or longer, preferably 48 hours or less, more preferably 24 hours or less, even more preferably 12 hours or less, since the effect on the production yield is negligible even if the enzyme treatment is performed for a certain period of time or more, and only the process cost may increase.
  • the step of inactivating the enzyme may be further included.
  • Enzyme inactivation may be performed by any method known to those skilled in the art, for example, it may be inactivated by treatment at a temperature of 85° C. or higher for 20 minutes or more.
  • the 'enzyme decomposition extract of deer antler' includes a reaction product obtained through enzyme treatment on deer antler, a fraction fractionated therefrom, a concentrate obtained by further concentrating these decomposition products or fractions, and purified or separated purified product, and the reaction product, fraction , is used in the sense of including a dried product of a concentrate or a purified product or a powder obtained by pulverizing it.
  • the present invention relates to a food composition for enhancing immunity comprising an enzyme-decomposed extract of deer antler as an active ingredient.
  • the 'food composition' is an active ingredient, in addition to the enzyme-decomposed extract of deer deer antler, food ingredients that can be used as food listed in the standards and standards ('Food Code') of food commonly used in food manufacturing, and food additives described in the Food Additives Code.
  • examples thereof include proteins, carbohydrates, fats, nutrients, seasonings and flavoring agents.
  • the carbohydrates include monosaccharides such as glucose, fructose, and the like; disaccharides such as maltose, sugar, lactose and the like; oligosaccharides or polysaccharides such as dextrin, starch syrup, cyclodextrin and the like; Sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, erythritol and the like can be used.
  • natural flavoring agents [taumatin, stevia extract (eg, rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.)) and synthetic flavoring agents (saccharin, aspartame, etc.) may be used.
  • the enzyme-decomposed antler extract does not need to be particularly limited as long as the content exhibits an immune enhancing effect, for example, 0.1 to 99% by weight, 0.5 to 95% by weight, 1 to 90 wt%, 2 to 80 wt%, 3 to 70 wt%, 4 to 60 wt%, 5 to 50 wt% may be included.
  • the enzyme decomposed extract of deer deer antler which is an active ingredient in the food composition, varies depending on the condition, weight, presence or absence of disease, severity and duration of the ingestion, but may be appropriately selected by those skilled in the art. For example, it may be 1 to 5,000 mg, preferably 5 to 2,000 mg, more preferably 10 to 1,000 mg, still more preferably 20 to 800 mg, and most preferably 50 to 500 mg based on the daily dose. And, the number of administration does not need to be particularly limited, but can be adjusted by those skilled in the art within the range of 3 times a day to once a week. In the case of long-term intake for the purpose of health and hygiene or health control, it may be less than the above range.
  • the food composition is not particularly limited, but may be, for example, a powder, granules, tablets, capsules, pills, extracts, jelly formulations, tea bag formulations or beverage formulations.
  • the enzyme decomposed extract of deer antler can be added to give immunity enhancing function to general food, and there is no need to specifically limit the food that can be added, but for example, standards and specifications of food according to Article 7 of the Food Sanitation Act (' Confectionery, bread or rice cakes, cocoa processed products or chocolates, processed meat or eggs, processed fish meat products, tofu or jelly products, noodles, tea, coffee, beverages, special purpose foods, soy sauce, seasoned foods, dressings It can be added to vegetables, kimchi, salted fish, pickled foods, stewed foods, alcoholic beverages, raisins, and other foods. In addition, it can be added to dairy products, processed meat products, packaged meat, and processed eggs exemplified in the processing standards and ingredient specifications of livestock products according to Article 4 of the Livestock Products Sanitation Control Act ('Livestock Products Code').
  • the enzyme-decomposed extract of deer antler has excellent NK cell activity and promotes immune-related cytokine expression, so the food composition containing the enzyme-decomposed extract of deer deer deer antler as an active ingredient alone is "health functional food that helps to enhance immunity".
  • the 'health functional food' refers to food manufactured (including processing) according to legal standards using raw materials or ingredients useful for the human body (Article 3, Item 1 of the Health Functional Foods Act).
  • the term 'health functional food' may differ in terms or scope of each country, but 'Dietary Supplement' in the US, 'Food Supplement in Europe', 'Health functional food' or 'Health functional food' in Japan It may correspond to 'Food for Special Health Use (FoSHU)' and 'health food' in China.
  • the above food composition or health functional food may additionally contain food additives, and the suitability as a food additive is determined by the standards and standards for the item in accordance with the general rules and general test methods of the 'Food Additives Codex', unless otherwise specified. follow
  • the health functional food includes L-glutamine, germanium yeast, gold sand as a raw material announced as a 'functional raw material' or an individually recognized raw material used in "health functional food that helps to enhance immunity" together with the enzyme decomposed extract of deer antler.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for enhancing immunity comprising an enzyme-decomposed extract of deer antler as an active ingredient.
  • the 'pharmaceutical composition' has excellent NK cell activity as an active ingredient, and in addition to the deer antler enzymatic decomposition extract that enhances immune-related cytokine expression, suitable carriers, excipients and diluents commonly used in the manufacture of pharmaceutical compositions. can
  • the 'pharmaceutical composition for enhancing immunity' may be an immuno-cancer agent or an anti-cancer adjuvant.
  • the immuno-oncology agent induces the expression of immune factors to increase the activity of immune cells to kill cancer cells
  • the cancer cells may be solid cancer cells, and in more detail, the solid cancers include colorectal cancer, breast cancer, lung cancer, gastric cancer, epithelial cancer. It may be selected from the group consisting of sexual ovarian cancer, brain cancer, skin cancer, and liver cancer, but is not limited thereto.
  • the anticancer adjuvant may alleviate side effects caused by the administration of the anticancer agent, and the side effect caused by the administration of the anticancer agent may be selected from the group consisting of a decrease in body weight or immune factors and cachexia.
  • the 'pharmaceutical composition for enhancing immunity' may be an immune enhancer that amplifies the efficacy of an antiviral vaccine.
  • the adjuvant may be administered in parallel or sequentially with the antiviral vaccine.
  • the antiviral vaccine is influenza, hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, herpes simplex virus (type 2), polio, diphtheria, pertussis, haemophilus influenzae B (Hib), measles, mumps, rubella, Typhoid fever, chickenpox (chicken fox), dengue fever, Epstein-Barr virus infection, human papillomavirus infection, pneumococcal infection, meningococcal infection, pneumococcal infection, viral meningitis, rotavirus infection, tick-borne encephalitis, travel diarrhea , a vaccine for human use for the prevention of cholera, yellow fever or tuberculosis.
  • the 'carrier' is a compound that facilitates the addition of the compound into a cell or tissue.
  • the 'diluent' is a compound that is diluted in water to not only stabilize the biologically active form of the compound of interest, but also to dissolve the compound.
  • the carrier, excipient and diluent are not particularly limited, but for example, lactose, glucose, sugar, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia gum, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose , methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methyl hydroxy benzoate, propyl hydroxy benzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • the amount of the pharmaceutical composition used may vary depending on the age, sex, and weight of the patient, and, above all, will depend on the condition of the subject to be treated, the specific category or type of disease to be treated, the route of administration, and the properties of the therapeutic agent used.
  • the pharmaceutical composition is appropriately selected depending on the absorption of the active ingredient in the body, the excretion rate, the age and weight of the patient or the animal to be treated, sex and condition, the severity of the disease to be treated, etc., but generally 0.1 to 1,000 mg/kg per day , preferably 1 to 500 mg/kg, more preferably 5 to 250 mg/kg, most preferably 10 to 100 mg/kg.
  • the unit dosage form formulated in this way can be administered several times at regular time intervals as needed.
  • the pharmaceutical composition may be administered individually as a prophylactic or therapeutic agent, or may be administered in combination with other therapeutic agents, and may be administered sequentially or simultaneously with a conventional therapeutic agent.
  • the pharmaceutical composition may be prepared in oral formulations such as powders, granules, tablets, capsules, troches, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, etc., and sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, and freeze-dried formulations according to conventional methods, respectively. , it can be formulated and used in parenteral formulations such as suppositories.
  • a diluent or excipient such as a filler, extender, binder, wetting agent, disintegrant, surfactant, etc. commonly used.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, troches, and the like, and these solid preparations include at least one excipient, for example, starch, calcium carbonate, sugar or It may be prepared by mixing lactose, gelatin, etc.
  • lubricants such as magnesium stearate and talc may also be used.
  • Liquid formulations for oral use include suspensions, solutions, emulsions, syrups, etc.
  • various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives may be included. .
  • Formulations for parenteral administration include non-aqueous solutions, and suspensions include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate.
  • As the base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin, glycerogelatin, and the like can be used.
  • the deer antler supercritical extract, hot water extract of deer antler, and VARNZ RepaiRx were designated as C1, C2 and C3, respectively.
  • the antler supercritical extract (C1) was prepared by using the antler powder of Preparation Example 1 as a solvent, carbon dioxide and ethanol, extraction pressure 300 bar, extraction temperature 40 °C, separation pressure 54 bar, separation temperature 40 °C, feed weight 49.7 g, average carbon dioxide flow rate 7.9 g/min, average ethanol flow rate of 2.0 g/min, carbon dioxide supply ratio of 22:1, and ethanol supply ratio of 3:1 were extracted and collected every 15 minutes and dried under vacuum under vacuum.
  • antler hot water extract 10 g of the antler powder of Preparation Example 1 was mixed with 200 mL of water, put in a round bottom flask, hot water extracted in boiling water for 3 hours, cooled with ice, and centrifuged at 25,000 g for 30 minutes at 25 ° C. separated. 200 mL of the supernatant was prepared with water, filtered using Celite 545 under vacuum, and the dried powder was stored at -20°C for activity analysis.
  • VARNZ RepaiRx was prepared according to US Patent No. 07547761 and diluted to 1/25 was used as a C3 sample.
  • the enzyme-decomposed extracts of deer antler treated with all enzymes from 1F to 5F showed higher yields than the hot water extract of deer antler (C2).
  • the enzyme-decomposed extracts of deer antler the enzyme-decomposed extract of deer antler using Flavorzyme (2F)
  • the enzyme-decomposed extract of deer deer antler using Protamex (5F) are not only the deer antler hot water extract (C2), but also other enzyme Alcalase ( 1F) and Pepsin (4F) showed a yield that was about 2-3 times higher than that of the enzyme-decomposed extract of the deer antler.
  • Red blood cell lysis reagent (TAC buffer: 85 mM Tris, 78 mM NH4Cl, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) was preheated to 37°C before use. Add 45 mL of TAC buffer to 5 mL of each whole blood, and leave it in a 37°C water bath for 10 minutes. After centrifugation at 500 x g for 10 minutes, the supernatant is removed and evenly suspended in 25 mL of PBS (0.1 M EDTA).
  • TAC buffer 85 mM Tris, 78 mM NH4Cl, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA
  • Stimulators were SEB (200 ng/mL Staphylococcus enterotoxin B; Sigma-Aldrich), PWM (2 ⁇ g/mL pokeweed mitogen; Sigma-Aldrich), and lipopolysaccharide (LPS) (4 ng/mL LPS; Sigma-Aldrich), respectively.
  • Cell lysate was used by centrifuging the plate at 350 x g, removing the supernatant, and suspending the plate with 10 ⁇ l/well of Buffer RLT.
  • the antigen-stimulated leukocyte immune activity enhancing effect was shown in FIG. 1 by using NanoString to analyze the expression of immune-related cytokines.
  • up-regulation is indicated in red
  • down-regulation is indicated in blue.
  • red and blue indicate P ⁇ 0.05
  • orange and sky blue indicate P ⁇ 0.1.
  • the enzyme-decomposed extract of deer antler using Alcalase (1F) did not show any gene enhancement effect regardless of the manufacturing method of the antler powder.
  • the freeze-dried deer antler enzymatic extract (2F) increased the expression of a total of 6 genes 1FNB1, 1L12B, IL17A, IL2, IL4 and IL9.
  • the freeze-dried deer antler enzymatic extract (3F) increased the expression of a total of six genes, IFNB1, IL10, IL12B, IL17A, IL2 and IL9.
  • Control groups C1, C2 and C3 did not enhance the expression of any immune-related genes, and C3 only enhanced the expression of the PTGS2 gene.
  • the immune-related cytokine expression enhancing activity of the enzyme-decomposed extract of deer antler showed high activity in the enzyme-decomposed extract of deer antler using Flavorzyme (2F) and the enzyme-decomposed extract of deer deer antler using neutrase (3F). In this case, the activity of enhancing the expression of immune-related cytokines was very low.
  • the RAW 264.7 cell line a mouse-derived macrophage
  • DMEM Cat No. 11995-065, Gibco BRL, U.S.A
  • FBS Lit No. AE29155306, Hyclone, U.S.A.
  • Antibiotic-antimycotic 100x Batch No. ADD670076, Biopredic International, France.
  • CO2 incubator MCO-20AIC, Sanyo, Japan
  • 5% CO2 in a mixed medium of 445 mL, 50 mL, and 5 mL, respectively, and subculture at intervals of 2-3 days before use. did.
  • MTT analysis was performed to confirm the cytotoxicity of the sample.
  • the activated RAW 264.7 cell line was each dispensed in a 96-well plate at 3 ⁇ 10 4 cells/well and cultured at 37° C., 5% CO 2 incubator for 24 hours.
  • the deer antler enzyme-decomposed extract sample was exchanged with a medium prepared by concentration of 0.001 to 100 mg/mL, and after 24 hours of incubation, 10 ⁇ l of cck-8 (Cat No. CK04-13, Dojindo, Japan) was added and incubator at 37 ° C., CO2. After additional incubation for 1 hour, absorbance was measured at a wavelength of 450 nm using a microplate reader to determine the cell viability by concentration of each sample compared to the cell viability of the normal control group.
  • Deer antler enzyme-decomposed extract samples 2F, 3F, 5F and C2 showed no cytotoxicity at 0.5, 2.5, 6 and 50 mg/mL or less, respectively.
  • RAW 264.7 cell line was dispensed in a 6-well plate at 5 ⁇ 10 5 cells/well and cultured for 24 hours.
  • the culture medium was removed and exchanged with a sample containing medium prepared for each positive control group and concentration, followed by further incubation for 24 hours.
  • the cell culture medium was collected, centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes, and the supernatant was transferred to a new tube, followed by testing according to the protocol of the NO production kit (Cat No. ADI-917-020, Enzo, USA), and NO
  • the amount of production is shown in FIG. 2 by quantifying the absorbance value measured at a wavelength of 540 nm using 4-parameter logic regression of a standard curve.
  • the normal control group (N) not treated with the test substance produced 14.89 ⁇ mole/L of nitric oxide.
  • the positive control group (LPS 1 ⁇ g/mL) produced 47.74 ⁇ mole/L of nitric oxide, which was significantly increased compared to that of the normal control group (p ⁇ 0.01).
  • the amount of nitric oxide production in the deer antler decomposition extract (2F) treated group (100, 500 ⁇ g/mL) using flavorzyme increased with the concentration to 25.73 and 39.65 ⁇ mole/L, respectively, and significantly increased compared to the normal control group. (p ⁇ 0.05 and p ⁇ 0.01).
  • the amount of nitric oxide production in the group (500, 1000 ⁇ g/mL) treated with neutrase-treated deer antler enzymatically decomposed extract (3F) was significantly increased compared to that of the normal control group to values of 30.42 and 29.39 ⁇ mole/L, respectively (p ⁇ 0.01 and p ⁇ 0.01), the increase was about 23.3% lower than that of the antler decomposition extract (2F) treated group using Flavorzyme treated at the same concentration of 500 ⁇ g/mL.
  • the amount of nitric oxide produced in macrophages is an indicator that can determine whether macrophages, which have a protective action against foreign substances, are activated in the mammalian immune system. , it could be confirmed that the following was an enzyme-decomposed extract (3F) of deer antler using Neutrase.
  • RAW 264.7 cell line was dispensed in a 6-well plate at 5 ⁇ 10 5 cells/well and cultured for 24 hours. The culture medium was removed and exchanged with a sample containing medium prepared for each positive control group and concentration, followed by further incubation for 24 hours. Cells were harvested and total RNA was extracted according to the protocol of the RNA extract kit (Cat No. 74106, Quigen, Germany). The extracted total RNA is infinite?? Absorbance was measured at 260 nm and 280 nm wavelength using 200 Pro (TECAN, Switzerland), quantified, and then diluted according to the concentration. The TOPreal One-step kit (Cat No.
  • RT432M enzynomics, Korea
  • RT432M enzynomics, Korea
  • the iNOS expression level of the positive control group (LPS, 1 ⁇ g/mL) was increased 67.37-fold and was statistically significantly increased compared to that of the normal control group (p ⁇ 0.05).
  • the iNOS expression level of the deer antler enzymatically digested extract (2F) treated group (100, 500 ⁇ g/mL) using flavorzyme was 21.55 and 30.45 times higher than that of the normal control group, respectively, and significantly increased according to the concentration (p ⁇ 0.05 and p ⁇ 0.01).
  • the iNOS expression level increased 21.74 times compared to the normal control group (p ⁇ 0.01), but Flavorzyme treated with the same concentration of 500 ⁇ g/mL Compared to the antler decomposition extract (2F) treated group, the increase was about 28.4% lower.
  • the iNOS expression level of the antler hot water extract (C2)-treated group (500 ⁇ g/mL) increased 1.93 times that of the normal control group, but compared to the enzyme-decomposed extract for deer antler using Flavorzyme (2F) and the enzyme-decomposed extract for deer antler using neutrase (3F). showed a remarkably low value.
  • the COX2 expression level of the positive control group (LPS, 1 ⁇ g/mL) was increased by 264.54 times and was statistically significantly increased compared to that of the normal control group (p ⁇ 0.05).
  • the COX2 expression level of the deer antler decomposition extract (2F)-treated group (100, 500 ⁇ g/mL) using flavorzyme was significantly increased according to the concentration by 7.82 and 17.49 times compared with the normal control group, respectively (p ⁇ 0.01 and p ⁇ 0.01).
  • the COX2 expression level of the antler hot water extract (C2) treated group (500 ⁇ g/mL) was 0.98 times that of the normal control group, and there was no difference.
  • iNOS is a gene involved in NO production through L-arginine in activated macrophages
  • COX2 is a gene that is increased by NO production and other cytokines. It was confirmed that the expression level increased most significantly in , followed by an increase in the enzyme-decomposed extract of deer antler using Neutrase (3F).
  • the TNF- ⁇ expression level of the positive control group (LPS 1 ⁇ g/mL) was significantly increased (p ⁇ 0.01) as compared to the normal control group (N).
  • the TNF- ⁇ expression level of the deer antler decomposition extract (2F) treated group (100, 500 ⁇ g/mL) using flavorzyme was significantly increased according to the concentration by 3.17 and 3.58 times, respectively, compared with the normal control group (N) (p ⁇ 0.01 and p ⁇ 0.01).
  • the TNF- ⁇ expression level of the antler enzymatic decomposition extract (3F)-treated group (500, 1000 ⁇ g/mL) using neutrase was significantly increased according to the concentration by 3.2 and 3.38 times, respectively, compared to the normal control group (N) (p ⁇ 0.01 and p ⁇ 0.01).
  • the IFN- ⁇ expression level of the positive control group (LPS 1 ⁇ g/mL) was statistically significantly decreased compared to that of the normal control group (N) (p ⁇ 0.05).
  • IFN- ⁇ expression levels of the deer antler decomposition extract (2F) treated group (100, 500 ⁇ g/mL) using flavorzyme were statistically significantly decreased by 0.44 and 0.59 times, respectively, compared to the normal control group (N) (p ⁇ 0.05). and p ⁇ 0.05).
  • the IL-6 expression level of the positive control group (LPS 1 ⁇ g/mL) was significantly increased (p ⁇ 0.05) compared to the normal control group (N).
  • the IL-6 expression level of the deer antler enzymatically digested extract (2F) treated group (100, 500 ⁇ g/mL) using flavorzyme was 2.0 and 2.97 times higher than that of the normal control group (N), respectively, and increased according to the concentration, 500 ⁇ g/mL There was a statistically significant increase (p ⁇ 0.01) at the treatment concentration.
  • the IL-6 expression level of the antler decomposing extract (3F) treated group (500, 1000 ⁇ g/mL) using neutrase was 1.85 and 1.83 times, respectively, compared with the normal control group (N), and significantly increased according to the concentration (p ⁇ 0.05 and p ⁇ 0.05).
  • the IL-1 ⁇ expression level of the positive control group (LPS 1 ⁇ g/mL) was statistically significantly increased compared to that of the normal control group (N) (p ⁇ 0.05).
  • the IL-1 ⁇ expression level of the deer antler enzyme-decomposed extract (2F) treated group (100, 500 ⁇ g/mL) using flavorzyme was 3.18 and 6.9 times higher than that of the normal control group (N), respectively, and increased according to the concentration, 500 ⁇ g/mL There was a statistically significant increase (p ⁇ 0.01) at the treatment concentration.
  • the IL-1 ⁇ expression level of the group (500 ⁇ g/mL) treated with the enzyme-decomposed extract (3F) of deer antler using neutrase was significantly increased by 2.82 times compared to the normal control group (N) (p ⁇ 0.05), but 500 ⁇ g/mL The increase was about 59.1% lower than that of the deer antler enzyme-decomposed extract (2F) treated group using Flavorzyme treated at the same concentration.
  • the activated RAW 264.7 cell line was each dispensed in a 96-well plate at 5 ⁇ 10 3 cells/well and incubated at 37° C., 5% CO 2 in an incubator for 24 hours. Change to a medium containing deer antler decomposition extract prepared by positive control group and concentration and incubate for 24 hours, then add 10 ⁇ l of cck-8 (Cat No. CK04-13, Dojindo, Japan), and incubate for 1 hour at 37 ° C, CO2 incubator and Infinite?? By measuring the absorbance at a wavelength of 450 nm using 200 Pro (TECAN, Switzerland), the cell proliferation rate for each concentration was obtained compared to the cell proliferation rate of the normal control group, and it is shown in FIG. 9 .
  • Cell proliferative capacity was calculated based on the time period before the test substance administration (0h) after the test substance treatment, and statistical processing was calculated based on the normal control group at each time point.
  • the cell proliferation rate was increased by 10.6 and 11.0 times, respectively, at 48 hours of treatment with the test substance, compared with the cell proliferation rate of the normal control group at 48 hours, which was statistically significant. Differences were shown (p ⁇ 0.01, p ⁇ 0.01). At 72 hours, cell proliferation was increased by 21.68 and 20.71 times, respectively, compared to 72 hours in the normal control group.
  • Deer antler enzymatically digested extract (3F) treated group (500 ⁇ g/mL) using neutrase was increased by 11.2 and 22.4 times at 48 and 72 hours, respectively, compared to the normal control group, which was statistically significantly increased (p ⁇ 0.01).
  • the antler hot water extract (C2) treated group (500 ⁇ g/mL) showed no difference from the normal control group by 2.18, 6.34, and 15.90 times at all measurement time points.
  • deer deer antler decomposition extract The effect of deer deer antler decomposition extract on immune improvement was evaluated by measuring NK cell activity, interferon gamma (IFN- ⁇ ) concentration and TNF- ⁇ concentration in an animal model of reduced immunity.
  • IFN- ⁇ interferon gamma
  • Balb/c mice were divided into 9 groups of 6 mice each, a normal control group (G1), a negative control group (G2) and a test substance administration group (G3 to G9), and 50 mg/kg, 100 mg/kg and 200 mg/kg administration group (G3, G4, and G5, respectively), antler enzymatic decomposition extract using neutrase (3F) 100 mg/kg and 200 mg/kg administration group (G6 and G7, respectively), antler hot water extract (C2) ) 100 mg/kg and 200 mg/kg administration groups (G8 and G9, respectively) were set and the test substance was administered.
  • G1 normal control group
  • G2 negative control group
  • test substance administration group G3 to G9
  • Negative control group (G2) and test substance administration group (G3 to G9) except normal control group were administered with cyclophosphamide (CP) at a dose of 70 mg/kg for 3 days before administration of the test substance, and the test substance was administered 13 On the first day, it was administered intraperitoneally.
  • the test substance was orally administered once a day for 14 days, and the excipient was orally administered instead of the test substance to the normal control group (G1) and negative control group (G2). All test groups were observed for general symptoms every day and body weight was measured twice a week.
  • Body weight was decreased in the negative control group (G2) compared to the normal control group (G1), but the weight change of the test substance-administered group (G3 to G9) was not statistically different from the negative control group (G2).
  • an autopsy was performed to remove the spleen, and the spleen cells were isolated to measure NK cell activity.
  • NK cell activity was performed using a commercially available LDH assay kit (Cat.No.: 04744926001, Roche Diagnostics GmbH). Splenocytes isolated as effector cells were used, and YAC-1 cells, a mouse lymphoma cell line, were used as target cells. Effector cells (1 ⁇ 10 6 cells/well) and target cells (1 ⁇ 10 4 cells/well) were mixed in a ratio of 50:1 and incubated for 4 hours. The amount of LDH released by the target cell attacked by the effector cell was measured and shown in FIG. 10 .
  • NK cells are known to play an important role in innate immunity, and they directly kill cells or cancer cells infected by microorganisms and secrete cytokines to activate monocytes and dendritic cells.
  • the NK cell activity was 16.5% in the normal control group (G1), but was statistically significantly decreased to 2.3% in the negative control group (G2) compared to the normal control group (p ⁇ 0.01).
  • G3, G4 and G5 groups administered at 50, 100 and 200 mg/kg of deer deer antler enzymatic extract (2F) using flavorzyme showed NK cell activity of 23.1, 26.4 and 23.7%, respectively, compared with the negative control group (G2) to increase statistically significantly (p ⁇ 0.01, p ⁇ 0.01 and p ⁇ 0.01). In addition, there was a statistically significant increase (p ⁇ 0.01 and p ⁇ 0.01) even when compared with the same concentration of hot water extract (G8, G9).
  • NK cell activity was statistically significantly increased compared to the negative control group (G1) with values of 19.3 and 17.9%, respectively. (p ⁇ 0.01 and p ⁇ 0.01). However, the NK cell activity was low when compared with the enzyme-decomposed extract (2F) of deer antler using the same concentration of Flavorzyme, and also did not show a statistically significant difference compared with the hot-water extract (G8 and G9) of the same concentration.
  • G8 and G9 administered at 100 and 200 mg/kg of deer antler hot water extract (C2) showed a statistically significant increase in NK cell activity to 13.8 and 11.6%, respectively, compared to the negative control group, but using the same concentration of Flavorzyme
  • the enzyme-decomposed extract of deer antler (2F) and the enzyme-decomposed extract of deer antler using neutrase (3F) showed lower values.
  • TNF- ⁇ and IFN- ⁇ are known as cytokines that stimulate phagocytosis by increasing the activity of macrophages.
  • the blood collected during the autopsy was left at room temperature for 15 to 30 minutes and then centrifuged to separate the serum, and then TNF- ⁇ (Cat.No.: MTA00B, R&D systems) and IFN- ⁇ (Cat.No.: MIF00, R&D systems) IFN- ⁇ concentrations were measured according to the manufacturer's manual using an ELISA kit, and are shown in FIGS. 11 and 12, respectively.
  • the normal control group (G1) had a blood TNF- ⁇ concentration of 9.7 pg/mL
  • the negative control group (G2) had a value of 12.2 pg/mL. ) and increased statistically significantly (p ⁇ 0.01).
  • G3, G4 and G5 administered at 50, 100 and 200 mg/kg of deer antler enzymatically decomposed extract (2F) using flavorzyme had TNF- ⁇ concentrations of 10.1, 10.3 and 10.0 pg/mL, respectively, at low, medium and high concentrations. Regardless of the administration concentration in the administration group, it was significantly decreased compared to the negative control group (G1) (p ⁇ 0.05, p ⁇ 0.05 and p ⁇ 0.05).
  • the TNF- ⁇ concentration was 10.6 and 10.3 pg/mL, respectively, and at the medium concentration, the negative control group (G2) and There was no difference, and only the high concentration was significantly decreased compared to the negative control group (G2) (p ⁇ 0.05).
  • the TNF- ⁇ concentration was significantly reduced in the 50 mg/kg low-concentration group compared to the negative control group (G2), whereas the enzyme-decomposed extract (3F) of deer antler using neutrase was 200 In the mg/kg high concentration administration group, it was confirmed that the TNF- ⁇ concentration was significantly reduced compared to the negative control group (G2).
  • the IFN- ⁇ concentration in the blood of the normal control group (G1) was 12.7 pg/mL
  • the value of the negative control group (G2) was 10.2 pg/mL.
  • the statistically significantly p ⁇ 0.01.
  • G3, G4 and G5 administered at 50, 100 and 200 mg/kg of deer deer antler decomposition extract (2F) using flavorzyme had IFN- ⁇ concentrations of 10.8, 11.4 and 11.7 pg/mL, respectively, as a negative control group (G2) and increased according to the concentration, especially in G4 and G5 administered at 100 and 200 mg/kg, and increased statistically significantly (p ⁇ 0.05 and p ⁇ 0.01). In addition, there was a statistically significant increase (p ⁇ 0.05 and p ⁇ 0.01) even when compared with the same concentration of hot water extract (G8 and G9).
  • the above ingredients are mixed and filled in an airtight bag to prepare a powder.
  • tablets are prepared by tableting according to a conventional manufacturing method of tablets.
  • the above ingredients are mixed and filled in a gelatin capsule to prepare a capsule.
  • composition ratio of the vitamin and mineral mixture is mixed with ingredients suitable for health functional food in a preferred embodiment, but the blend ratio may be arbitrarily modified, and the ingredients are mixed according to a conventional health functional food manufacturing method.
  • the granules can be prepared and used in the preparation of a health functional food composition according to a conventional method.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Non-Alcoholic Beverages (AREA)

Abstract

본 발명은 면역 증강용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 NK 세포 활성이 우수한 녹용 효소분해 추출물을 유효성분으로 포함함으로써 면역세포를 증식시키고, 특히 NK 세포 활성을 증진시켜 면역 증강 효과를 나타내므로, 면역 증강용 식품 조성물, 나아가 건강기능식품 또는 약학 조성물로 활용될 수 있다.

Description

ＮＫ 세포를 포함한 면역 세포 활성을 우수하게 증진시키는 면역 강화 녹용 효소분해 추출물
본 발명은 면역 증강용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 NK 세포 활성이 우수한 녹용 효소분해 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 식품 조성물, 특히 면역 증강용 건강기능식품, 면역 증강용 약학 조성물에 관한 것이다.
생활수준이 높아지고 식생활이 서구화되면서 영양과잉, 운동부족 등으로 인한 비만, 당뇨, 고혈압 및 심장병 등과 같은 생활 습관병(성인병) 발병이 높아지고 있다. 또한, 평균수명 연장으로 인한 노령화 사회로의 진입 속도가 빨라지면서 건강증진에 대한 관심이 높아지고 있다.
건강증진(health promotion)이란 질병, 특히 만성 퇴행성질환이나 감염증, 계속되는 스트레스에 대한 저항력의 증가 그리고 일상의 활동력의 증대를 꾀하는 것으로 그 방책으로는 영양의 개선, 면역기능 강화, 적절한 운동과 휴식, 정신적 활동의 지속 등 생활양식 전반에 미치는 관리가 필요하다.
특히, 면역력이 높으면 평소에 질병이 잘 걸리지 않으며, 설혹 질병에 걸리더라도 회복이 빠르다. 이러한 건강한 상태를 지속적으로 유지하면서 나이를 먹으면 수명이 연장되는 것은 자명한 일이다. 따라서 면역력은 인간의 건강과 수명에 직결되어 있으며, 건강을 유지하고 수명을 연장하기 위해서는 면역력을 관리하는 것이 필수적이라고 할 수 있겠다.
면역(Immune)이란, 인간 및 동물의 체내에서 외래성 및 내인성 이물질을 생리적으로 인식하여 배제하고, 항상성을 유지시키기 위한 기작을 일컫는다. 여기에서 이물질을 항원(antigen)이라고 하며, 이를 제거하는 과정에 수많은 종류의 백혈구 세포와 단백질이 관여한다. 면역은 크게 태어날 때부터 지니고 있는 선천면역과 후천적으로 생활 등에 적응되어 얻어지는 획득면역으로 구분된다.
선천면역(innate immunity)은 자연면역, 자연저항이라고도 한다. 항원에 대해 비특이적으로 반응하며 특별한 기억작용은 없다. 선천적인 면역체계로는 항원의 침입을 차단하는 피부·점액조직, 상산성의 위산, 혈액에 존재하는 보체(complement) 등이 있다. 세포로는 식균작용을 담당하는 대식세포(macrophage)와 다형핵 백혈구(polymorphonuclear leukocyte), 감염세포를 죽일 수 있는 NK세포 등이 있다. 또한, 대식세포에 의해 생산되는 사이토카인(cytokine)이 있다. 실제로 대부분의 감염은 상기 선천면역에 의해 방어된다.
외부 감염에 대한 최초의 인식은 주로 대식세포(macrophage)가 수행한다. 대식세포가 항원을 탐식하는 과정에서 면역반응을 매개하는 사이토카인(cytokine)이 생산된다.
또한 사이토카인은 신체의 방어체계를 제어하고 자극하는 신호물질로 사용되는 당단백질로 면역, 감염병, 조혈기능, 조직회복, 세포의 발전 및 성장에 중요한 기능을 한다. 사이토카인은 국소부위에 염증을 유발함으로서 면역세포가 감염부위에 모이게 하는 기능을 가지고 있어, 염증성 사이토카인(inflammatory cytokine)이라 불리기도 한다. 가장 중요한 면역기능은 인터루킨, 인터페론 감마, 종양괴사인자로 알려진 사이토카인의 집단에 의해 수행된다. 이들 중 인터루킨(Interleukin)은 면역반응이 일어나는 여러 단계에 작용하여 면역반응을 조절함으로써 인체의 방어작용에 중요한 역할을 하는 물질로, 그 종류는 IL-1, IL-6, IL-12 등이 있다.
또한 NK 세포(Natural killer cell; 자연살해세포)는 항원에 의한 사전 감작 없이도 종양세포, 박테리아, 세포 내 기생생물 또는 바이러스에 감염된 숙주 세포를 제거하는 기능을 수행하며, 부적절한 골수 이식을 거부하고, T 세포의 면역반응을 조절하는 등 생체 내 면역계 방어기작의 제1선에서 작용하는 행동세포로서, NK세포의 활성이 뛰어날 경우 표적 세포를 공격 및 제거하는 능력 또한 증가하는 것으로 알려져 있다.
한편 녹용(Cervi Parvum Corun, Antler)은 매화록(梅花), 대록(大鹿) 또는 마록(馬鹿)의 숫사슴의 털이 밀생되고 아직 골질화되지 않았거나 약간 골질화된 어린 뿔을 절단하여 건조시킨 것으로, 자라기 시작한 지 2개월 이내의 각질화가 되지 않아 조직이 연하고 털이 골고루 덮여 있는 수컷의 뿔을 의미한다. 각질화가 되지 않은 사슴뿔은 약간 물렁하나, 시기적으로 가을에는 단단하게 각질화가 일어나 녹용이 효능이 떨어지는데, 이는 녹각이라 부른다.
동의보감 등의 고문헌에 따르면, 녹용은 강장, 생장발육 촉진. 보혈, 조혈, 오장육부의 항진, 심부전증 치료, 신체기능 항진, 신체활력 증강 및 신장의 이뇨기능 강화 등 많은 약리적 효능을 가지는 것으로 알려져 있다. 동물을 이용한 효능에 관한 연구로서는, 백서의 성장촉진, 조혈, 혈청 콜레스테롤 저하, 단백질 합성 촉진, 노화방지, 백서의 척추신경 효소활성 증대, 진통 및 항피로, 면역활성 증대 및 진정 작용 등이 있음이 보고되었다.
녹용의 생리활성 성분으로는, 아미노산, 인산칼슘, 탄산칼슘, 콜라겐, 인지질, 콘드로이틴(chondroitin), 글루코사민(glucosamine), 판토크린(pantocrin), 갱글리오사이드(ganglioside), 하이알루로닌산(hyaluronic acid) 등이 알려져 있다.
종래 한방에서 사용하는 녹용의 복용방법으로는, 건조 녹용을 여러 종류의 생약제들과 혼합, 분쇄한 후 물을 용매로 하여 가열 추출하여 그 여액을 복용하는 방법과, 건조 녹용과 생약제들을 분쇄하여 가루로 만든 뒤 환(丸)으로 해서 복용하는 방법이 주로 이용되고 있다. 추출하여 복용하는 것은 녹용의 유효성분을 흡수하기 쉬운 반면에 추출박에 포함되어 있는 유효성분을 활용하지 못하는 한계가 있었고, 환제형의 경우에는 녹용 자체를 섭취한다는 이점이 있으나 체내에서 유효성분의 완전한 흡수가 어렵다는 문제점이 있었다.
한국공개특허 제2005-0090041호에서는 녹용을 분쇄한 후 추출하고, 단백분해효소처리 및 염산 분해 처리를 하는 녹용 추출 방법을 기술하고 있는데, 추출, 단백분해효소처리 및 염산 분해 처리를 순차적으로 실시하므로 공정이 복잡하고, 인체에 유용한 생리활성물질이 분해되는 문제가 있었다.
또한 한국공개특허 제2013-0078724호에서는 녹용을 산성 조건에서 펩신과 지방분해효소로 처리한 후, 중성 조건에서 다시 단백질분해효소로 처리하는 방법을 기술하고 있는데, 단순히 유리 아미노산 함량 및 인지질의 함량이 증가되었다고만 기술하고 있을 뿐, 실제 생리활성이나 구체적 기능성에 대해서는 기술하고 있지 않은 한계가 있었다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
(특허문헌 1) 한국공개특허 제2005-0090041호
(특허문헌 2) 한국공개특허 제2013-0078724호
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 녹용을 IUBMB 효소 명명 클래스 EC　3.4.11.1의 효소 또는 IUBMB 효소 명명 클래스 EC　3.4.24.28의 효소로 분해시킨 NK 세포 활성이 우수한 녹용 효소분해 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 생녹용 또는 냉동 녹용을 동결건조하는 동결건조 녹용 준비 단계; 및 상기 동결건조 녹용 10 중량부에 물 50 내지 500 중량부 및 효소 0.01 내지 1 중량부를 넣고 30 내지 60 ℃에서 1 내지 48 시간 동안 반응시키는 효소처리 단계;를 포함하고, 상기 효소는 IUBMB 효소 명명 클래스 EC　3.4.11.1의 효소 또는 IUBMB 효소 명명 클래스 EC　3.4.24.28의 효소인 것을 특징으로 하는 면역 증강 활성을 가진 녹용 효소분해 추출물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 녹용을 IUBMB 효소 명명 클래스 EC　3.4.11.1의 효소 또는 IUBMB 효소 명명 클래스 EC　3.4.24.28의 효소로 분해시킨 NK 세포 활성이 우수한 녹용 효소분해 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명은 상기 과제를 달성하기 위하여, 녹용을 IUBMB 효소 명명 클래스 EC　3.4.11.1의 효소 또는 IUBMB 효소 명명 클래스 EC　3.4.24.28의 효소로 분해시킨 녹용 효소분해 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 녹용 효소분해 추출물은 녹용을 녹용을 IUBMB 효소 명명 클래스 EC　3.4.11.1의 효소 또는 IUBMB 효소 명명 클래스 EC　3.4.24.28의 효소로 분해시킨 녹용 효소분해 추출물일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 IUBMB 효소 명명 클래스 EC　3.4.11.1의 효소는 곰팡이 유래의 프로테아제 및 펩티다아제의 복합물일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 곰팡이 유래의 프로테아제 및 펩티다아제의 복합물은 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) 유래의 엔도프로테아제 및 엑소펩티데이즈의 복합물일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 엔도프로테아제 및 엑소펩티데이즈의 복합물은 플라보자임(Flavourzyme)일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 IUBMB 효소 명명 클래스 EC　3.4.24.28의 효소는 바실러스 유래의 중성의 프로테아제일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 바실러스 유래의 중성의 프로테아제는 바실러스 아밀로리퀘팍시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)의 수중 발효(submerged fermentation)에 의해 생산되는 중성의 메탈로(Zn) 엔도프로테아제일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 중성의 메탈로(Zn) 엔도프로테아제는 뉴트라아제(Neutrase)일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 녹용 효소분해 추출물은 생녹용 또는 냉동 녹용을 동결건조한 건조 녹용을 효소처리에 의해 가수분해시킨 녹용 효소분해 추출물일 수 있다.
또한 본 발명은 생녹용 또는 냉동 녹용을 동결건조하는 동결건조 녹용 준비 단계; 및 상기 동결건조 녹용 10 중량부에 물 50 내지 500 중량부 및 효소 0.01 내지 1 중량부를 넣고 30 내지 60 ℃에서 1 내지 48 시간 동안 반응시키는 효소처리 단계;를 포함하고, 상기 효소는 IUBMB 효소 명명 클래스 EC　3.4.11.1의 효소 또는 IUBMB 효소 명명 클래스 EC　3.4.24.28의 효소인 것을 특징으로 하는 면역 증강 활성을 가진 녹용 효소분해 추출물의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 IUBMB 효소 명명 클래스 EC　3.4.11.1의 효소 또는 IUBMB 효소 명명 클래스 EC　3.4.24.28의 효소로 분해시킨 녹용 효소분해 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 녹용 효소분해 추출물은 녹용을 IUBMB 효소 명명 클래스 EC　3.4.11.1의 효소 또는 IUBMB 효소 명명 클래스 EC　3.4.24.28의 효소로 분해시킨 녹용 효소분해 추출물일 수 있다.
본 발명의 NK 세포 활성이 우수한 녹용 효소분해 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 면역세포를 증식시키거나 면역세포의 기능을 활성화시키므로 면역 증강용 식품 조성물, 나아가 건강기능식품 또는 약학 조성물로 활용될 수 있다.
도 1은 실험예 2에서 녹용 효소분해 추출물의 항원 자극 백혈구 면역 활성 증진 효과를 NanoString을 이용하여 면역관련 사이토카인 발현을 분석법을 이용하여 확인한 것으로, up-regulation 될수록 붉은색, down-regulation 될수록 푸른색으로 표시한 것이다.
도 2는 실험예 3에서 녹용 효소분해 추출물의 종류 및 농도에 따른 대식세포에서의 산화질소 생성 효과를 비교한 그래프이다.
도 3은 실험예 4에서 녹용 효소분해 추출물의 종류 및 농도에 따른 대식세포에서 iNOS 유전자 발현량을 비교한 그래프이다.
도 4는 실험예 4에서 녹용 효소분해 추출물의 종류 및 농도에 따른 대식세포에서 COX2 유전자 발현량을 비교한 그래프이다.
도 5는 실험예 5에서 녹용 효소분해 추출물의 종류 및 농도에 따른 TNF-α의 상대 발현량을 비교한 그래프이다.
도 6은 실험예 5에서 녹용 효소분해 추출물의 종류 및 농도에 따른 IFN-γ의 상대 발현량을 비교한 그래프이다.
도 7은 실험예 5에서 녹용 효소분해 추출물의 종류 및 농도에 따른 IL-6의 상대 발현량을 비교한 그래프이다.
도 8은 실험예 5에서 녹용 효소분해 추출물의 종류 및 농도에 따른 IL-1β의 상대 발현량을 비교한 그래프이다.
도 9는 실험예 6에서 녹용 효소분해 추출물의 종류 및 농도에 따른 배양시간의 변화에 따른 대식세포 증식능을 비교한 그래프이다.
도 10은 실험예 7에서 면역 억제 동물모델에서 녹용 효소분해 추출물의 종류 및 투여 농도에 따른 NK 세포 활성을 비교한 그래프이다.
도 11은 실험예 7에서 면역 억제 동물모델에서 녹용 효소분해 추출물의 종류 및 투여 농도에 따른 TNF-α 농도를 비교한 그래프이다.
도12는 실험예 7에서 면역 억제 동물모델에서 녹용 효소분해 추출물의 종류 및 투여 농도에 따른 인터페론 감마(IFN-γ) 농도를 비교한 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 발명자들은 녹용 효소분해 추출물, 특히 녹용을 IUBMB 효소 명명 클래스 EC　3.4.11.1의 효소 또는 IUBMB 효소 명명 클래스 EC　3.4.24.28의 효소로 분해시킨 녹용 효소분해 추출물, 바람직하게는 IUBMB 효소 명명 클래스 EC　3.4.11.1의 효소로 분해시킨 녹용 효소분해 추출물이 NK세포 활성이 우수하며, 면역 관련 사이토카인 발현을 증진시켜 면역 증강 활성을 나타냄을 확인하였다.
상기 녹용은 생후 2개월 이내의 골질화되지 않은 사슴의 뿔을 말한다.
상기 녹용은 저습도 환경에서 수 주에 걸쳐 자연건조시킨 건조 녹용을 사용할 수도 있으나, 바람직하게 본 발명에서는 생녹용 또는 냉동 녹용을 동결건조한 건조 녹용을 사용할 수 있다.
생녹용 또는 냉동 녹용을 자연건조시키거나 또는 동결건조 전 살균하기 위해 열탕처리하는 경우, 녹용 심부의 온도가 효소 실활 온도까지 상승하기 전에 내인성 효소의 작용에 의해 비특이적이고 불균일한 효소 분해가 발생하는 문제가 있다. 따라서 생녹용 또는 냉동녹용을 자연건조시키거나 동결건조 전 열탕처리하지 않고, 바로 동결건조할 경우 품질이 균일하며 면역 증강 활성이 뛰어난 녹용 효소분해 추출물 제조가 가능하다. 일단 동결건조시킨 건조 녹용은 통상의 방법으로 살균 후 사용할 수 있고, 예를 들어 120 내지 130 ℃에서 30초 내지 20분 열처리한 후 사용할 수 있다.
상기 IUBMB 효소 명명 클래스 EC　3.4.23.1의 효소, 예를 들어 펩신(pepsin), 아스파틱 프로테나아제(Aspartic proteinnase)와 같은 효소 또한 녹용 효소분해 추출물을 제조하더라도 면역 증강 효과를 나타내지 않는다. Pepsin은 아스파틱 엔도펩티데이즈로소 선택적으로 소수성, 특히 방향족 아미노산 잔기를 절단한다.
상기 IUBMB 효소 명명 클래스 EC　3.4.11.1의 효소, 예를 들어 A-LAP, acidic M17 leucine aminopeptidase, AcLAP, adipocyte-derived leucine aminopeptidase, Aminopeptidase, "플라보자임(Flavourzyme)"(Novozyme 사) 등은 효소처리를 통해 녹용 효소분해 추출물을 제조할 경우 종래 녹용 열수 추출물 또는 초임계 녹용 추출물에 비해 훨씬 뛰어난 면역 증강 효과를 나타낸다. 상기 Flavourzyme은 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae)의 수중 발효(submerged fermentation)에 의해 생산되는 엔도프로테아제 및 엑소펩티데이즈의 복합물이다.
또한 상기 IUBMB 효소 명명 클래스 EC　3.4.24.28의 효소는 바실러스 유래의 중성의 프로테이제로서, 예를 들어 바실로라이신, 바실러스 메탈로엔도펩티다제, 아닐로자임 P10; 바실러스 메탈로프로테나제, 메가테리오펩티다제, "뉴트라아제(Neutrase)"(Novozyme 사) 등은 효소처리를 통해 녹용 효소분해 추출물을 제조할 경우 종래 녹용 열수 추출물 또는 초임계 녹용 추출물에 비해 훨씬 뛰어난 면역 증강 효과를 나타낸다. 상기 Neutrase는 바실러스 아밀로리퀘팍시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)의 수중 발효(submerged fermentation)에 의해 생산되는 중성의 메탈로(Zn) 엔도프로테아제이다. Neutrase 외에 상기 효소 클래스에 속하는 박테리아 기원의 중성 메탈로프로테나제인"Protease N 'Amano'"(Amano Enzyme 사) 및 "Corolase N"(AB Enzymes 사) 등에 의해 효소처리된 녹용 효소분해 추출물들도 종래 녹용 열수 추출물 또는 초임계 녹용 추출물에 비해 훨씬 뛰어난 면역 증강 효과를 나타낸다.
그러나 UBMB 효소 명명 클래스 EC　3.4.21.62의 효소, 예를 들어 알칼라아제(Alcalase), 섭틸리신, 콜로라아제 N(colorase N), ALK-효소; 바실로펩티다제 A; 바실로펩티다제 B; 바실러스 섭틸리스 알칼라인 프로테나제 바이오프라제(bioprase); 바이오프라제 AL 15; 바이오프라제 APL 30; 콜리스티나제(colistinase); 섭틸리신 J; 섭틸리신 S41; 섭틸리신 센다이(섭틸리신 Sendai); 섭틸리신 GX; 섭틸리신 E; 섭틸리신 BL; 섭틸리신 A (Type VIII); 제네나제(genenase) I; 에스페라제(esperase); 맥사타제(maxatase); 서르모아제(thermoase) PC 10; 프로테아제 XXVII; 서르모아제; 슈페라제(superase); 섭틸리신 DY; 섭틸로펩티다제; SP 266; 사비나제(savinase) 8.0L; 사비나제 4.0T; 카주사제(kazusase); 프로테아제 VIII; 옵티마제; 옵티클린(opticlean); 바실러스 섭틸리스 알칼라인 프로테나제; protin A 3L; 사비나제; 사비나제 16.0L; 사비나제 32.0 L EX; 오리엔타제(orientase) 10B; 프로테아제 S 및 유사한 세린 엔도펩티다제들은 효소처리를 통해 녹용 효소분해 추출물을 제조하더라도 면역 증강 효과를 나타내지 않는다.
또한 IUBMB 효소 명명 클래스 EC　3.4.24.28의 효소 및 IUBMB 효소 명명 클래스 EC　3.4.21.62의 효소의 복합물인 "프로타멕스(Protamex)"(Novozyme 사)의 경우에도 효소처리를 통해 녹용 효소분해 추출물을 제조하더라도 면역 증강 효과를 나타내지 않는다.
상기 녹용 효소분해 추출물 제조는 물에 적절한 양의 녹용과 효소를 투입하여 효소처리한다. 예를 들어 동결건조한 녹용과 같은 건조 녹용 10 중량부에 대하여 50 내지 500 중량부, 바람직하게는 100 내지 400 중량부의 물을 투입하고, 효소는 0.01 내지 1 중량부, 바람직하게는 0.02 내지 0.8 중량부, 더욱 바람직하게는 0.05 내지 0.5 중량부를 투입할 수 있으나, 그 투입량은 필요에 따라 임의로 변경하여 사용할 수 있다.
상기 효소처리 온도는 선택된 효소의 최적 온도에 따라 적절한 범위을 선택할 수 있고, 바람직하게는 30 내지 60 ℃, 더욱 바람직하게는 40 내지 55 ℃에서 반응시킬 수 있다.
상기 효소처리 시간은 효소처리에 의해 생성되는 펩타이드의 양, 펩타이드의 분자량 및 그 프로파일에 따라 적절한 시간을 선택할 수 있고, 바람직하게는 1 시간 이상, 더욱 바람직하게는 2 시간 이상, 더더욱 바람직하게는 3 시간 이상이며, 일정 시간 이상으로 효소처리하더라도 생산 수율에 미치는 영향이 거의 미미하고, 공정 비용만 상승할 수 있으므로 바람직하게는 48시간 이하, 더욱 바람직하게는 24시간 이하, 더더욱 바람직하게는 12 시간 이하로 반응시킨다.
상기 효소처리 단계 후에는 효소를 불활성화시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 효소 불활성화는 통상의 기술자에게 공지된 어떠한 방법을 적용하여도 되고, 예를 들어 85 ℃ 이상의 온도에서 20 분 이상 처리하여 불활성화 시킬 수 있다.
상기 '녹용 효소분해 추출물'은 녹용에 효소처리를 통해 얻어진 반응생성물, 이들로부터 분획한 분획물, 이들 분해물 또는 분획물을 추가적으로 농축한 농축물, 이를 정제 또는 분리한 정제물도 포함하고, 상기 반응생성물, 분획물, 농축물 또는 정제물을 건조한 건조물 또는 그를 분쇄한 분말을 포함하는 의미로 사용된다.
상기 농축물 또는 정제물의 제조를 위해 원리분리하거나, 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시키거나, 또는 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 부가할 수 있다.
본 발명은 녹용 효소분해 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 식품 조성물에 관한 것이다.
상기 '식품 조성물'은 유효성분으로 녹용 효소분해 추출물 이외에, 식품 제조에 통상적으로 사용되는 식품의 기준 및 규격('식품공전')에 기재된 식품으로 사용 가능한 식품 원료, 식품첨가물 공전에 기재된 식품첨가물을 포함한다.
특별히 한정할 필요는 없으나 예를 들어 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상기 탄수화물은 단당류, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 이당류, 예를 들어 말토스, 설탕, 유당 등; 올리고당 또는 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 물엿, 사이클로덱스트린 등; 당알코올, 예를 들어 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등을 사용할 수 있다. 상기 향미제는 천연 향미제[타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.
상기 녹용 효소분해 추출물을 유효성분으로 식품 조성물을 제조하는 경우 녹용 효소분해 추출물은 면역 증강 효능을 나타내는 함량이면 특별히 한정할 필요는 없으나, 예를 들어 0.1 내지 99 중량%, 0.5 내지 95 중량%, 1 내지 90 중량%, 2 내지 80 중량%, 3 내지 70 중량%, 4 내지 60 중량%, 5 내지 50 중량%로 포함될 수 있다.
상기 식품 조성물에서 유효성분인 녹용 효소분해 추출물은 섭취자의 상태, 체중, 질병의 유무나 정도 및 기간에 따라 다르지만, 통상의 기술자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예들 들어 1일 투여량을 기준으로 1 내지 5,000 mg, 바람직하게는 5 내지 2,000 mg, 더욱 바람직하게는 10 내지 1,000 mg, 더더욱 바람직하게는 20 내지 800 mg, 가장 바람직하게는 50 내지 500 mg일 수 있고, 투여 횟수는 특별히 한정할 필요는 없으나 1일 3회 내지 1주일에 1회의 범위 내에서 통상의 기술자가 조절할 수 있다. 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있다.
상기 식품 조성물은 특별히 한정할 필요는 없으나 예를 들어 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 엑스제, 젤리 제형, 티백 제형 또는 음료 제형일 수 있다.
또한 일반 식품에 면역 증강 기능성을 부여하기 위하여 상기 녹용 효소분해 추출물을 첨가할 수 있으며, 첨가가 가능한 식품은, 특별히 한정할 필요는 없으나 예를 들어 식품위생법 제7조에 따른 식품의 기준 및 규격('식품공전')에 예시된 과자류, 빵 또는 떡류, 코코아가공품류 또는 초콜릿류, 식육 또는 알가공품, 어육가공품, 두부류 또는 묵류, 면류, 다류, 커피, 음료류, 특수용도식품, 장류, 조미식품, 드레싱류, 김치류, 젓갈류, 절임식품, 조림식품, 주류, 건포류, 기타 식품류 등에 첨가될 수 있다. 또한 축산물위생관리법 제4조에 따른 축산물의 가공기준 및 성분규격('축산물공전')에 예시된 유가공품, 식육가공품 및 포장육, 알가공품에 첨가될 수 있다.
한편 상기 녹용 효소분해 추출물은 NK세포 활성이 우수하며, 면역 관련 사이토카인 발현을 증진시키므로, 상기 녹용 효소분해 추출물을 유효성분으로 하는 식품 조성물은 단독으로 "면역 증강에 도움을 주는 건강기능식품"으로 이용될 수 있다.
상기 '건강기능식품'은 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 법적 기준에 따라 제조(가공을 포함)한 식품(건강기능식품에 관한 법률 제3조 제1호)을 말한다. 상기 '건강기능식품'은 국가마다 용어나 범위에 차이가 있을 수 있으나, 미국의 '식이 보충제(Dietary Supplement)', 유럽의 '식품 보충제(Food Supplemnet)', 일본의 '보건기능식품' 또는 '특정보건용식품(Food for Special Health Use, FoSHU)', 중국의 '보건식품' 등에 해당할 수 있다.
상기 식품 조성물 또는 건강기능식품은 식품첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, 식품첨가물로서의 적합여부는 다른 규정이 없는 한 '식품첨가물공전'의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 따른다.
또한 상기 건강기능식품에는 상기 녹용 효소분해 추출물과 함께 "면역 증강에 도움을 주는 건강기능식품"에 사용되는 '기능성 원료'로 고시된 원료 또는 개별인정된 원료로서, L-글루타민, 게르마늄효모, 금사상황버섯, Enterococcus faecalis 가열처리건조분말, 당귀혼합추출물, 동충하초 주정추출물, 스피루리나, 클로렐라, 청국장균배양정제물(폴리감마글루탐산칼륨), 표고버섯균사체, 효모베타글루칸, 인삼다당체추출물 등의 면역 증강과 관련된 건강기능식품 소재를 복합하여 사용할 수 있다.
본 발명은 녹용 효소분해 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 약학 조성물에 관한 것이다.
상기 '약학 조성물'은 유효성분으로 NK세포 활성이 우수하며, 면역 관련 사이토카인 발현을 증진시키는 녹용 효소분해 추출물 이외에, 약학 조성물 등의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
상기 '면역 증강용 약학 조성물'은 면역항암제 또는 항암보조제일 수 있다. 상기 면역항암제는 면역인자의 발현을 유도하여 면역세포의 활성을 증가시켜 암세포를 사멸시키는 것이고, 상기 암세포는 고형암의 암세포일 수 있으며, 보다 상세하게 상기 고형암은 대장암, 유방암, 폐암, 위암, 상피성 난소암, 뇌암, 피부암 및 간암으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 항암보조제는 항암제 투여에 의한 부작용을 완화시킬 수 있으며, 상기 항암제 투여에 의한 부작용은 체중 또는 면역 인자의 감소 및 악액질(cachexia)로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
상기 '면역 증강용 약학 조성물'은 항바이러스용 백신의 효능을 증폭시키는 면역증강제일 수 있다. 상기 면역증강제는 항바이러스용 백신과 병행해서 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
상기 항바이러스용 백신은, 인플루엔자, A형 간염, B형 간염, C형 간염, 헤르페스 단순 바이러스(2형), 소아마비, 디프테리아, 백일해, 헤모필루스 B형 인플루엔자(Hib), 홍역, 유행성 이하선염, 풍진, 장티푸스열, 수두(치킨 폭스), 뎅그열, 엡스타인-바르 바이러스 감염, 사람 유두종 바이러스 감염, 폐렴구균 감염, 수막구균 감염, 폐렴알균 감염, 바이러스 수막염, 로타바이러스 감염, 진드기-매개 뇌염, 여행중 설사, 콜레라, 황열병 또는 결핵의 예방을 위한 인간용 백신일 수 있다.
상기 '담체'는 세포 또는 조직 내로의 화합물의 부가를 용이하게 하는 화합물이다. 상기 '희석제'는 대상 화합물의 생물학적 활성 형태를 안정화시킬 뿐만 아니라, 화합물을 용해시키게 되는 물에서 희석되는 화합물이다.
상기 담체, 부형제 및 희석제로는 특별히 한정할 필요는 없으나 예를 들어, 유당, 포도당, 설탕, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다.
상기 약학 조성물의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 무엇보다도, 치료대상 개체의 상태, 치료 대상 질환의 특정한 카테고리 또는 종류, 투여 경로, 사용되는 치료제의 속성에 의존적일 것이다.
상기 약학 조성물은 체내에서 활성성분의 흡수도, 배설속도, 환자 또는 치료대상 동물의 연령 및 체중, 성별 및 상태, 치료할 질병의 중증정도 등에 따라 적절히 선택되나, 일반적으로 1일 0.1 내지 1,000mg/kg, 바람직하게는 1 내지 500mg/kg, 더욱 바람직하게는 5 내지 250mg/kg, 가장 바람직하게는 10 내지 100mg/kg으로 투여하는 것이 바람직하다. 이렇게 제형화 된 단위 투여형 제제는 필요에 따라 일정시간 간격으로 수회 투여할 수 있다.
상기 약학 조성물은 개별적으로 예방제 또는 치료제로서 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다.
상기 약학조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 트로키제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구 제형, 그리고 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등의 비경구 제형으로 제형화하여 사용될 수 있다.
제형화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.
경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 녹용 효소분해 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 설탕 또는 유당, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌 글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
이하, 바람직한 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.
제조예 1: 녹용 분말의 제조
혈액을 포함하는 냉동 녹용(뉴질랜드 산)을 세척한 후 적절한 크기로 분쇄하여 동결건조한 후, 이를 다시 분쇄하고 123 ℃에서 7분 열처리하여 동결건조 녹용 분말을 제조하였다.
제조예 2: 녹용 효소분해 추출물의 제조
제조예 1의 녹용 분말 10 g을 취해 물 199 mL을 혼합하였다. 그 혼합물을 각 효소에 따른 필요 온도, 예를 들어 각각 Alcalase는 60℃, Flavourzyme, Neutrase 및 Protamex는 50℃, 로 수욕에서 100 rpm으로 교반하였다. 각각의 효소용액(100 mg/mL) 1 mL을 효소:기질 1:100 비율로 첨가하고 23시간까지 온도를 유지하며 교반하여 효소처리 하였다. 95℃ 수욕 상에서 85℃ 이상 유지하면서 20분 유지하여 효소를 불활성화시킨 후, 냉각한 효소 분해물을 25℃에서 원심분리하였다. 상층액을 물로 200 mL 정용하고 진공하에서 Celite545를 이용하여 여과 후 살균 및 건조하여 분말화 하였다. 분말은 생리활성 분석을 위해 -20℃에 보관하고, 이들 시료를 각각을 1F, 2F, 3F 및 5F라 하였다.
Pepsin의 경우, 제조예 1의 녹용 분말 10 g을 취해 pH 2의 묽은 염산 199 mL을 혼합하였다. 그 혼합물을 50℃로 수욕에서 100 rpm으로 교반하였다. Pepsin 효소용액(100 mg/mL) 1 mL을 효소:기질 1:100 비율로 첨가하고 23시간까지 온도를 유지하며 교반하여 효소처리 하였다. 6 M 수산화나트륨 8 mL을 넣어 pH 5.5-6으로 조절하여 분해를 중단시키고, 95℃ 수욕 상에서 85℃ 이상 유지하면서 20분 유지하여 효소를 불활성화시킨 후, 냉각한 효소 분해물을 25℃에서 원심분리하였다. 상층액을 물로 200 mL 정용하고 진공하에서 Celite545를 이용하여 여과 후 살균 및 건조하여 분말화 하였다. 분말은 생리활성 분석을 위해 -20℃에 보관하고 이 시료를 4F라 하였다.
제조예 3: 대조군의 제조
녹용 효소분해 추출물의 대조군으로 녹용 초임계 추출물, 녹용 열수 추출물 및 VARNZ RepaiRx를 각각 C1 및 C2 및 C3라 하였다.
녹용 초임계 추출물(C1)은 제조예 1의 녹용 분말을 용매로 이산화탄소 및 에탄올, 추출압력 300 bar, 추출온도 40 ℃, 분리 압력 54 bar, 분리온도 40 ℃, 공급중량 49.7 g, 평균 이산화탄소 유속 7.9 g/min, 평균 에탄올 유속 2.0 g/min, 이산화탄소 공급 비율 22:1 및 에탄올 공급비율 3:1 조건으로 추출하며 매 15분마다 회수하여 진공 감압건조하여 제조하였다.
녹용 열수 추출물(C2)은 제조예 1의 녹용 분말 10 g을 물 200 mL 와 섞어 둥근 바닥 플라스크에 넣고, 3시간동안 끓는 물에 열수 추출한 뒤 얼음으로 냉각하여 25℃에서 30분 간 25,000 g로 원심분리하였다. 상층액을 물로 200 mL 정용하고 진공하에서 Celite545를 이용하여 여과한 뒤 건조시킨 분말을 활성 분석을 위해 -20℃에 보관하였다.
VARNZ RepaiRx는 미국특허 제07547761호에 따라 제조된 것으로 1/25로 희석한 것을 C3 시료로 사용하였다.
실험예 1: 녹용 효소분해 추출물의 수율
제조예 2에서 제조된 1F 내지 5F의 녹용 효소분해 추출물 및 대조군 C2의 농도를 측정하고 그로부터 계산한 수율을 표 1에 나타내었다.
구분 수율(%)
1F 12.7
2F 29.1
3F 36.3
4F 18.3
5F 44.0
C2 8.5
1F부터 5F까지 모든 효소로 처리한 녹용 효소분해 추출물들은 녹용 열수 추출물(C2)에 비해 높은 수율을 나타내었다. 녹용 효소분해 추출물 중에서도 Flavourzyme을 이용한 녹용 효소분해 추출물(2F), Neutrase를 이용한 녹용 효소분해 추출물(3F) 및 Protamex를 이용한 녹용 효소분해 추출물(5F)는 녹용 열수 추출물(C2)은 물론 다른 효소 Alcalase(1F) 및 Pepsin(4F)로 처리한 녹용 효소분해 추출물에 비해서도 약 2 내지 3 배 정도 높은 수율을 나타내었다.
실험예 2: 녹용 효소분해 추출물의 항원 자극 백혈구 면역 활성 증진 효과
백혈구는 12명의 지원자(NZ Blood, Wellington, New Zealand)로부터 공급받은 혈액 샘플을 이용하여 분리하였다. 적혈구 용해 시약(TAC buffer: 85 mM Tris, 78 mM NH4Cl, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)은 37℃로 예열하여 사용하였다. 각 전혈 5 mL에 TAC buffer 45 mL을 첨가하여 37℃ water bath에 10분간 정치한다. 500 xg로 10분간 원심분리 후 상등액을 제거하고 PBS(0.1 M EDTA) 25 mL로 골고루 부유시킨다. 동일한 방법으로 원심분리 한 후 상등액을 제거하고 RPMI1640(Sigma-Aldrich, 5%의 FCS 첨가) 5mL로 부유시킨다. 해당 실험에 사용된 백혈구 세포의 수는 1 X 107 cells/mL이다.
96-well plate에 50 ㎕의 분리한 백혈구를 분주한 후, 각각 25 ㎕의 RPMI/FCS(control) 또는 제조예 2의 녹용 효소분해 추출물 및 대조군들을 각각 1/100으로 희석하여 첨가하여 37℃/5% CO2 incubator에 3시간 정치하였다. 25 ㎕의 stimulator를 첨가하여 37℃/5% CO2 incubator에 2시간 정치한다. Stimulator는 각각 SEB(200 ng/mL Staphylococcus enterotoxin B; Sigma-Aldrich), PWM(2 μg/mL pokeweed mitogen; Sigma-Aldrich), lipopolysaccharide(LPS)(4 ng/mL LPS; Sigma-Aldrich) 이다. Cell lysate는 plate를 350 x g 원심분리한 후 상등액을 제거하고 10 ㎕/well의 Buffer RLT로 부유시켜 사용하였다.
항원 자극 백혈구 면역 활성 증진 효과는 NanoString을 이용하여 면역관련 사이토카인 발현을 분석법을 이용하여 도 1에 나타내었다. 도 1에서 up-regulation 될수록 붉은색, down-regulation 될수록 파란색으로 표시하였고, 도 1에서 붉은색 및 파란색은 P<0.05이고, 주황색 및 하늘색은 P<0.1을 나타낸다.
효소 종류에 따른 녹용 효소분해 추출물의 면역 관련 유전자 증진 효과를 살펴보면, Alcalase를 이용한 녹용 효소분해 추출물(1F)는 녹용 분말의 제조방법에 관계없이 유전자 증진 효과를 나타내지 않았다.
Flavourzyme을 이용한 녹용 효소분해 추출물 중에서 동결건조 녹용 효소분해 추출물(2F)는 1FNB1, 1L12B, IL17A, IL2, IL4 및 IL9 총 6 종 유전자의 발현을 증가시켰다.
Neutrase를 이용한 녹용 효소분해 추출물 중에서 동결건조 녹용 효소분해 추출물(3F)는 IFNB1, IL10, IL12B, IL17A, IL2 및 IL9 총 6 종의 유전자 발현을 증가시켰다.
Pepsin을 이용한 녹용 효소분해 추출물 중에서 동결건조 녹용 효소분해 추출물(4F)는 어떠한 유전자 발현도 증가시키지 않았다.
Protamex를 이용한 녹용 효소분해 추출물 중에서 동결건조 녹용 효소분해 추출물(5F)는 어떠한 유전자 발현도 증가시키지 않았다.
대조군 C1, C2 및 C3는 면역 관련 어떠한 유전자 발현도 증진시키지 않았으며, C3는 PTGS2 유전자 발현만 증진시켰다.
녹용 효소분해 추출물의 면역 관련 사이토카인 발현 증진 활성은 Flavourzyme을 이용한 녹용 효소분해 추출물(2F) 및 Neutrase를 이용한 녹용 효소분해 추출물(3F)에서 높은 활성을 나타내었고, 다른 효소로 처리하거나 효소 처리하지 않은 경우는 면역 관련 사이토카인 발현 증진 활성이 매우 낮았다.
이후 실험에는 Flavourzyme을 이용한 녹용 효소분해 추출물(2F), Neutrase를 이용한 녹용 효소분해 추출물(3F), Pepsin을 이용한 녹용 효소분해 추출물(4F), Protamex를 이용한 녹용 효소분해 추출물(5F) 및 녹용 열수추출물(C2)를 이용하여 실시하였다.
실험예 3: 녹용 효소분해 추출물의 대식세포의 산화질소 생성 효과
마우스 유래 대식세포인 RAW 264.7 세포주를 DMEM (Cat No. 11995-065, Gibco BRL, U.S.A), FBS (Lot No. AE29155306, Hyclone, U.S.A.) 및 Antibiotic-antimycotic 100x (Batch No. ADD670076, Biopredic International, France)를 각각 445 mL, 50 mL 및 5 mL 혼합한 배지에서 37 ℃, 5% CO2 조건의 CO2 인큐베이터 (MCO-20AIC, Sanyo, Japan)에서 배양하고, 사용 전까지 2-3일 간격으로 계대배양하여 사용하였다.
녹용 효소분해 추출물의 대식세포 산화질소(NO) 생성 효과를 확인하기 전 시료의 세포독성을 확인하기 위해 MTT 분석을 실시하였다. 활성화된 RAW 264.7 세포주를 3 × 104 cells/well로 96 웰 플레이트에 각각 분주하고 24시간 동안 37 ℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 녹용 효소분해 추출물 시료를 0.001 내지 100 mg/mL로 농도별로 조제한 배지로 교환하고 24시간 배양 후 cck-8 (Cat No. CK04-13, Dojindo, Japan) 10 μl를 첨가하여 37 ℃, CO2 인큐베이터에서 1시간 추가 배양하고, 마이크로플레이트 리더를 이용하여 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 정상대조군의 세포생존율 대비 각 시료의 농도별 세포생존율을 구하였다.
녹용 효소분해 추출물 시료 2F, 3F, 5F 및 C2는 각각 0.5, 2.5, 6 및 50 mg/mL 이하에서는 세포독성을 나타내지 않았다.
산화질소 생성 효과는 RAW 264.7 세포주를 6 웰 플레이트에 5 × 105 cells/well로 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 배양 배지를 제거하고 양성대조군 및 농도별로 제조한 시료 함유 배지로 교환한 후 24 시간 추가 배양하였다. 세포배양액을 수거하여 1000 rpm에서 5분동안 원심분리하고 새로운 튜브에 상층액을 옮긴 후, NO production kit (Cat No. ADI-917-020, Enzo, U.S.A)의 protocol에 따라 시험을 실시하고, NO 생성량은 540 nm 파장에서 측정된 흡광도의 값을 표준곡선의 4-Parameter logic regression을 이용하여 정량하여 도 2에 나타내었다.
시험물질을 처리하지 않은 정상대조군(N)은 14.89 μmole/L 의 산화질소를 생성하였다. 양성대조군(LPS 1μg/mL)은 47.74 μmole/L 의 산화질소를 생성하였으며 정상대조군과 비교하여 유의적으로 증가하였다(p < 0.01).
Flavourzyme을 이용한 녹용 효소분해 추출물(2F) 처리군(100, 500 μg/mL)의 산화질소 생성량은 각각 25.73, 39.65 μmole/L 의 값으로 농도에 따라 증가하였으며 정상대조군과 비교하여 유의적으로 증가하였다(p < 0.05 및 p < 0.01).
Neutrase를 이용한 녹용 효소분해 추출물(3F) 처리군(500, 1000 μg/mL)의 산화질소 생성량은 각각 30.42, 29.39 μmole/L 의 값으로 정상대조군과 비교하여 유의적으로 증가하였으나(p < 0.01 및 p < 0.01), 500 μg/mL 동일 농도로 처리한 Flavourzyme을 이용한 녹용 효소분해 추출물(2F) 처리군에 비해서 증가폭은 약 23.3% 낮은 값을 나타내었다.
Protamex를 이용한 녹용 효소분해 추출물(5F) 및 녹용 열수추출물(C2) 처리군에서는 정상대조군과 비교하여 큰 차이를 보이지 않았다.
대식세포에서의 산화질소 생성량은 포유류 면역계에서 외부물질에 대해 방어작용을 하는 대식세포의 활성화 유무를 알 수 있는 지표로서, Flavourzyme을 이용한 녹용 효소분해 추출물(2F)이 산화질소 생성량에 있어서 가장 우수하고, 다음은 Neutrase를 이용한 녹용 효소분해 추출물(3F)임을 확인할 수 있었다.
실험예 4: 녹용 효소분해 추출물의 iNOS 및 COX2 유전자 발현 증대 효과
iNOS 및 COX-2 유전자 발현량은 RAW 264.7 세포주를 6 웰 플레이트에 5 × 105 cells/well로 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 배양 배지를 제거하고 양성대조군 및 농도별로 제조한 시료 함유 배지로 교환한 후 24 시간 추가 배양하였다. 세포를 수거하여 RNA extract kit (Cat No. 74106, Quigen, Germany)의 protocol에 따라 total RNA를 추출하였다. 추출된 total RNA는 Infinite?? 200 Pro (TECAN, Switzerland)를 이용하여 260 nm 및 280 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 정량 후, 농도에 맞게 희석하였다. TOPreal One-step kit (Cat No. RT432M, enzynomics, Korea)를 iNOS 및 COX2의 유전자 발현량 측정을 실시했고, 모든 반응은 β-actin으로 보정하고 정상대조군을 기준으로 2-ΔΔCT 방법으로 정규화하여, iNOS의 상대 발현량은 도 3에, COX2의 상대 발현량은 도 4에 각각 나타내었다.
도 3에서 양성대조군 (LPS, 1 μg/mL)의 iNOS 발현량은 67.37 배로 증가하였으며 정상대조군과 비교하여 통계학적으로 유의하게 증가하였다(p < 0.05 ).
Flavourzyme을 이용한 녹용 효소분해 추출물(2F) 처리군(100, 500 μg/mL)의 iNOS 발현량은 정상대조군과 비교하여 각각 21.55, 30.45 배로 농도에 따라 유의적으로 증가하였다(p < 0.05 및 p < 0.01).
Neutrase를 이용한 녹용 효소분해 추출물(3F) 처리군(500 μg/mL)의 비교하여 iNOS 발현량은 정상대조군과 비교하여 21.74 배로 증가하였으나(p < 0.01), 500 μg/mL 동일 농도로 처리한 Flavourzyme을 이용한 녹용 효소분해 추출물(2F) 처리군에 비해서 증가폭은 약 28.4% 낮은 값을 나타내었다.
녹용 열수추출물(C2) 처리군(500 μg/mL)의 iNOS 발현량은 정상대조군에 1.93 배로 증가하였으나, Flavourzyme을 이용한 녹용 효소분해 추출물(2F) 및 Neutrase를 이용한 녹용 효소분해 추출물(3F)에 비해서는 현저히 낮은 값을 나타내었다.
한편 도 4에서 양성대조군 (LPS, 1 μg/mL)의 COX2 발현량은 264.54 배로 증가하였으며 정상대조군과 비교하여 통계학적으로 유의하게 증가하였다(p < 0.05 ).
Flavourzyme을 이용한 녹용 효소분해 추출물(2F) 처리군(100, 500 μg/mL)의 COX2 발현량은 정상대조군과 비교하여 각각 7.82, 17.49 배로 농도에 따라 유의적으로 증가하였다(p < 0.01 및 p < 0.01).
Neutrase를 이용한 녹용 효소분해 추출물(3F) 처리군(500 μg/mL)의 비교하여 COX2 발현량은 정상대조군과 비교하여 8.86 배로 증가하였으나(p < 0.01), 500 μg/mL 동일 농도로 처리한 Flavourzyme을 이용한 녹용 효소분해 추출물(2F) 처리군에 비해서 증가폭은 약 49.3% 낮은 값을 나타내었다.
녹용 열수추출물(C2) 처리군(500 μg/mL)의 COX2 발현량은 정상대조군과 비교하여 0.98 배로 차이가 없었다.
iNOS 는 활성화된 대식세포에서 L-arginine 를 통해 NO 를 생성하는 작용에 관여하는 유전자이며 COX2 는 NO 생성 및 다른 사이토카인에 의해 증가되는 유전자로서, 두 유전자 모두 Flavourzyme을 이용한 녹용 효소분해 추출물(2F)에서 발현량이 가장 현저히 증가하고, 다음은 Neutrase를 이용한 녹용 효소분해 추출물(3F)에서 증가하였음을 확인할 수 있었다.
실험예 5: 녹용 효소분해 추출물의 면역 관련 사이토카인 증대 효과
실험예 4와 동일한 방법으로 TOPreal One-step kit를 이용하여 면역 관련 사이토카인 TNF-α, IFN-γ, IL-6 및 IL-1β 상대 발현량을 측정하여 각각 도 5, 도 6, 도 7 및 도 8에 나타내었다.
도 5에서 양성대조군(LPS 1 μg/mL)의 TNF-α 발현량은 정상대조군(N)과 비교하여 통계학적으로 유의하게 증가하였다(p < 0.01 ).
Flavourzyme을 이용한 녹용 효소분해 추출물(2F) 처리군(100, 500 μg/mL)의 TNF-α 발현량은 정상대조군(N)과 비교하여 각각 3.17 및 3.58 배로 농도에 따라 유의적으로 증가하였다(p < 0.01 및 p < 0.01).
Neutrase를 이용한 녹용 효소분해 추출물(3F) 처리군(500, 1000 μg/mL)의 TNF-α 발현량은 정상대조군(N)과 비교하여 각각 3.2 및 3.38 배로 농도에 따라 유의적으로 증가하였다(p < 0.01 및 p < 0.01).
Pepsin을 이용한 녹용 효소분해 추출물(4F) 처리군(100, 500, 2000 μg/mL), Protamex를 이용한 녹용 효소분해 추출물(5F) 처리군(100, 500, 2000 μg/mL) 및 녹용 열수추출물(C2) 처리군(100, 500 μg/mL)은 모든 처리농도에서 TNF-α 발현량이 정상대조군과 비교하여 차이가 없었다.
또한 도 6에서 양성대조군(LPS 1 μg/mL)의 IFN-γ 발현량은 정상대조군(N)과 비교하여 통계학적으로 유의하게 감소하였다(p < 0.05 ).
Flavourzyme을 이용한 녹용 효소분해 추출물(2F) 처리군(100, 500 μg/mL)의 IFN-γ 발현량은 정상대조군(N)과 비교하여 각각 0.44 및 0.59 배 통계적으로 유의하게 감소하였다(p < 0.05 및 p < 0.05).
Neutrase를 이용한 녹용 효소분해 추출물(3F) 처리군(500 μg/mL)의 IFN-γ 발현량도 정상대조군(N)과 비교하여 0.54 배 유의적으로 감소하였다(p < 0.05).
그러나 녹용 열수추출물(C2) 처리군(500 μg/mL)은 IFN-γ 발현량이 정상대조군(N)과 비교하여 차이가 없었다.
또한 도 7에서 양성대조군(LPS 1 μg/mL)의 IL-6 발현량은 정상대조군(N)과 비교하여 통계학적으로 유의하게 증가하였다(p < 0.05 ).
Flavourzyme을 이용한 녹용 효소분해 추출물(2F) 처리군(100, 500 μg/mL)의 IL-6 발현량은 정상대조군(N)과 비교하여 각각 2.0 및 2.97 배로 농도에 따라 증가하였으며, 500 μg/mL 처리 농도에서 통계적으로 유의하게 증가하였다(p < 0.01).
Neutrase를 이용한 녹용 효소분해 추출물(3F) 처리군(500, 1000 μg/mL)의 IL-6 발현량은 정상대조군(N)과 비교하여 각각 1.85 및 1.83 배로 농도에 따라 유의적으로 증가하였다(p < 0.05 및 p < 0.05).
Pepsin을 이용한 녹용 효소분해 추출물(4F) 처리군(100, 500, 2000 μg/mL), Protamex를 이용한 녹용 효소분해 추출물(5F) 처리군(100, 500, 2000 μg/mL) 및 녹용 열수추출물(C2) 처리군(100, 500 μg/mL)은 모든 처리농도에서 IL-6 발현량이 정상대조군(N)과 비교하여 차이가 없었다.
또한 도 8에서 양성대조군(LPS 1 μg/mL)의 IL-1β 발현량은 정상대조군(N)과 비교하여 통계학적으로 유의하게 증가하였다(p < 0.05 ).
Flavourzyme을 이용한 녹용 효소분해 추출물(2F) 처리군(100, 500 μg/mL)의 IL-1β 발현량은 정상대조군(N)과 비교하여 각각 3.18 및 6.9 배로 농도에 따라 증가하였으며, 500 μg/mL 처리 농도에서 통계적으로 유의하게 증가하였다(p < 0.01).
Neutrase를 이용한 녹용 효소분해 추출물(3F) 처리군(500 μg/mL)의 IL-1β 발현량은 정상대조군(N)과 비교하여 2.82 배로 유의적으로 증가하였으나(p < 0.05), 500 μg/mL 동일 농도로 처리한 Flavourzyme을 이용한 녹용 효소분해 추출물(2F) 처리군에 비해서 증가폭은 약 59.1% 낮은 값을 나타내었다.
녹용 열수추출물(C2) 처리군(500 μg/mL)은 모든 처리농도에서 IL-1β 발현량이 정상대조군(N)과 비교하여 차이가 없었다.
실험예 6: 녹용 효소분해 추출물의 대식세포 증식능
활성화된 RAW 264.7 세포주를 5 × 103 cells/well로 96 웰 플레이트에 각각 분주하고 24시간 동안 37 ℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 양성대조군 및 농도별로 조제한 녹용 효소분해 추출물을 포함한 배지로 교환하고 24시간 배양 후 cck-8 (Cat No. CK04-13, Dojindo, Japan) 10 μl를 첨가하여 37 ℃, CO2 인큐베이터에서 1시간 추가 배양하고, Infinite?? 200 Pro (TECAN, Switzerland)를 이용하여 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 정상대조군의 세포 증식률 대비 각 농도별 세포증식률을 구하여 도 9에 나타내었다.
세포증식능은 시험물질 투여전 (0h)을 기준으로 시험물질 처리 후 시간대별 세포증식율을 계산하였으며, 통계처리는 각각의 시점 별 정상대조군을 기준으로 산출하였다.
정상대조군은 24, 48 및 72 시간에서 각각 2.35, 6.09 및 14.52 배로 세포가 증식하였고, 양성대조군(LPS, 1μg/mL)은 24, 48 및 72 시간에서 각각 2.8, 11.3 및 17.7 배로 세포 증식이 증가하였으며 특히 24 시간과 48 시간 시점에서 정상대조군과 비교하여 통계학적으로 유의한 차이를 보였다(p < 0.05 및 p < 0.01).
Flavourzyme을 이용한 녹용 효소분해 추출물(2F) 처리군(100, 500 μg/mL)은 시험물질 처리 48 시간에서 각각 10.6, 11.0 배로 정상대조군의 48 시간의 세포증식율과 비교하여 증가하였으며 통계학적으로 유의한 차이를 나타내었다(p < 0.01, p < 0.01). 72 시간에서는 각각 21.68, 20.71 배로 정상대조군의 72 시간에 비해 세포 증식이 증가하였다.
Neutrase를 이용한 녹용 효소분해 추출물(3F) 처리군 (500 μg/mL)은 48, 72 시간에서 각각 11.2 및 22.4 배로 정상대조군과 비교하여 통계학적으로 유의하게 증가하였다(p < 0.01).
녹용 열수추출물(C2) 처리군 (500 μg/mL)은 모든 측정 시점에서 2.18, 6.34 및 15.90 배로 정상대조군과 차이를 보이지 않았다.
실험예 7: 면역 억제 동물모델에서 녹용 효소분해 추출물 투여에 따른 면역력 개선 효과
녹용 효소분해 추출물이 면역력 저하 동물모델에서 NK 세포 활성, 인터페론 감마(IFN-γ) 농도 및 TNF-α 농도를 측정하여 면역력 개선에 미치는 영향을 평가하였다.
Balb/c 마우스를 6마리씩 9 그룹, 정상대조군(G1), 음성대조군(G2) 및 시험물질투여군(G3 내지 G9)으로 나누고, Flavourzyme을 이용한 녹용 효소분해 추출물(2F)을 50 mg/kg, 100 mg/kg 및 200 mg/kg 투여군(각각 G3, G4 및 G5), Neutrase를 이용한 녹용 효소분해 추출물(3F) 100 mg/kg 및 200 mg/kg 투여군(각각 G6 및 G7), 녹용 열수추출물(C2) 100 mg/kg 및 200 mg/kg 투여군(각각 G8 및 G9)으로 설정하여 시험물질을 투여하였다. 정상대조군을 제외한 음성대조군(G2) 및 시험물질투여군(G3 내지 G9)은 면역억제를 유도하기 위하여 cyclophosphamide (CP)를 70 mg/kg 의 용량으로 시험물질 투여 전 3 일동안, 그리고 시험물질 투여 13 일 째에 복강투여하였다. 시험물질은 14 일 동안 1 일 1 회 경구투여 하였고, 정상대조군(G1) 및 음성대조군(G2)은 시험물질 대신 부형제를 경구투여하였다. 모든 시험군은 매일 일반증상 관찰 및 주 2 회 체중을 측정하였다.
체중은 정상대조군(G1)에 비해 음성대조군(G2)에서 감소하였으나 시험물질투여군(G3 내지 G9)의 체중변화는 음성대조군(G2)와 통계적으로 차이가 없었다.
1. NK 세포 활성 증진 효과
시험물질 투여 14 일 후, 부검을 실시하여 비장을 적출한 후, 비장세포를 분리하여 NK 세포 활성을 측정하였다.
NK 세포 활성은 상용화된 LDH assay kit (Cat.No.: 04744926001, Roche Diagnostics GmbH)를 사용하여 실시하였다. Effector cell로 분리된 비장세포를 사용하고 target cell은 mouse lymphoma 세포주인 YAC-1 세포를 사용하였다. Effector cell (1 × 106 cells/well)과 target cell (1 × 104 cells/well)을 50:1의 비율로 섞어 4시간 배양하였다. Effector cell에 의해 target cell이 공격받아 방출하는 LDH의 양을 측정하여 도 10에 나타내었다.
NK 세포는 선천성 면역에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며 미생물에 의해 감염된 세포나 암세포를 직접 살해하고 사이토카인을 분비하여 단핵구 및 수지상 세포를 활성화시키는 역할을 한다.
도 10에 따르면 NK세포 활성이 정상대조군(G1)은 16.5%이었으나, 음성대조군(G2)에서 2.3%로 정상대조군과 비교하여 통계적으로 유의하게 감소하였다(p < 0.01).
Flavourzyme을 이용한 녹용 효소분해 추출물(2F)을 50, 100 및 200 mg/kg로 투여한 G3, G4 및 G5군은 NK세포 활성이 각각 23.1, 26.4 및 23.7%의 값으로 음성대조군(G2)과 비교하여 통계적으로 유의하게 증가하였다(p < 0.01, p < 0.01 및 p < 0.01). 또한 동일 농도의 녹용 열수추출물(G8, G9)와 비교해서도 통계적으로 유의하게 증가하였다(p < 0.01 및 p < 0.01).
Neutrase를 이용한 녹용 효소분해 추출물(3F)을 100 및 200 mg/kg로 투여한 G6 및 G7은 NK세포 활성이 각각 19.3 및 17.9%의 값으로 음성대조군(G1)과 비교하여 통계적으로 유의하게 증가하였다(p < 0.01 및 p < 0.01). 그러나 동일 농도의 Flavourzyme을 이용한 녹용 효소분해 추출물(2F)과 비교했을 때에는 NK세포 활성이 낮았고, 또한 동일 농도의 녹용 열수추출물(G8 및 G9)와 비교해서도 통계적으로 유의한 차이를 나타내지 않았다.
녹용 열수추출물(C2)을 100 및 200 mg/kg로 투여한 G8 및 G9는 NK세포 활성이 각각 13.8 및 11.6%의 값으로 음성대조군과 비교하여 통계적으로 유의하게 증가하였으나, 동일 농도의 Flavourzyme을 이용한 녹용 효소분해 추출물(2F) 및 Neutrase를 이용한 녹용 효소분해 추출물(3F)에 비해서는 낮은 값을 나타내었다.
2. 혈액 내 면역 사이토카인 분석
Th1 세포에 의해 분비되는 대표적인 사이토카인은 TNF-α 및 IFN-γ로 대식세포의 활성을 증가시켜 탐식작용을 자극하는 사이토카인으로 알려져 있다. 상기 부검 시 채취한 혈액은 상온에서 15~30분간 방치 후 원심분리하여 혈청을 분리한 후, TNF-α (Cat.No.: MTA00B, R&D systems) 및 IFN-γ (Cat.No.: MIF00, R&D systems) ELISA 키트를 이용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 IFN-γ 농도를 측정하여 각각 도 11 및 도 12에 나타내었다.
도 11에서 정상대조군(G1)의 혈액 내 TNF-α 농도는 9.7 pg/mL이고, 음성대조군(G2)의 값은 12.2 pg/mL 로 면역 억제가 유도된 음성대조군(G2)에서 정상대조군(G1)과 비교하여 통계적으로 유의하게 증가하였다(p < 0.01).
Flavourzyme을 이용한 녹용 효소분해 추출물(2F)을 50, 100 및 200 mg/kg로 투여한 G3, G4 및 G5은 TNF-α 농도가 각각 10.1, 10.3 및 10.0 pg/mL 의 값으로 저, 중 및 고농도 투여군에 투여 농도에 관계없이 음성대조군(G1)과 비교하여 유의적으로 감소하였다(p < 0.05, p < 0.05 및 p < 0.05).
Neutrase를 이용한 녹용 효소분해 추출물(3F)을 100 및 200 mg/kg로 투여한 G6 및 G7은 TNF-α 농도가 각각 10.6 및 10.3 pg/mL 의 값으로 중농도에서는 음성대조군(G2)과 유의적인 차이가 없었고, 고농도에서만 음성대조군(G2)에 비해 유의적으로 감소하였다(p < 0.05).
따라서 Flavourzyme을 이용한 녹용 효소분해 추출물(2F)는 50 mg/kg 저농도 투여군에서 TNF-α 농도가 음성대조군(G2)에 비해 유의적으로 감소된 반면, Neutrase를 이용한 녹용 효소분해 추출물(3F)은 200 mg/kg 고농도 투여군에서 TNF-α 농도가 음성대조군(G2)에 비해 유의적으로 감소를 확인할 수 있었다.
또한 녹용 열수추출물(C2)을 100 및 200 mg/kg로 투여한 G8 및 G9는 음성대조군(G1)과 비교하여 TNF-α 농도에 유의적인 차이가 없었다.
도 12에서 정상대조군(G1)의 혈액 내 IFN-γ 농도는 12.7 pg/mL이고, 음성대조군(G2)의 값은 10.2 pg/mL 로 면역 억제가 유도된 음성대조군(G2)에서 정상대조군(G1)과 비교하여 통계적으로 유의하게 감소하였다(p < 0.01).
Flavourzyme을 이용한 녹용 효소분해 추출물(2F)을 50, 100 및 200 mg/kg로 투여한 G3, G4 및 G5은 IFN-γ 농도가 각각 10.8, 11.4 및 11.7 pg/mL 의 값으로 음성대조군(G2)과 비교하여 농도에 따라 증가하고, 특히 100 및 200 mg/kg 투여한 G4 및 G5에서 통계적으로 유의하게 증가하였다(p < 0.05 및 p < 0.01). 또한 동일 농도의 녹용 열수추출물(G8 및 G9)와 비교해서도 통계적으로 유의하게 증가하였다(p < 0.05 및 p < 0.01).
Neutrase를 이용한 녹용 효소분해 추출물(3F)을 100 및 200 mg/kg로 투여한 G6 및 G7, 그리고 녹용 열수추출물(C2)을 100 및 200 mg/kg로 투여한 G8 및 G9는 음성대조군(G2)과 차이가 없었다.
아래에 본 발명의 녹용 효소분해 추출물을 포함하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예 1: 산제의 제조
제조예 2의 녹용 효소분해 추출물 분말 20 mg
유당 100 mg
탈크 10 mg
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
제제예 2: 정제의 제조
제조예 2의 녹용 효소분해 추출물 분말 10 mg
옥수수전분 100 mg
유당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
제제예 3: 캡슐제의 제조
제조예 2의 녹용 효소분해 추출물 분말 10 mg
결정성 셀룰로오스 3 mg
락토오스 14.8 mg
마그네슘 스테아레이트 0.2 mg
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
제제예 4: 과립제의 제조
제조예 2의 녹용 효소분해 추출물 분말 1,000 mg
비타민 혼합물 적량
비타민 A 아세테이트 70 ㎍
비타민 E 1.0 mg
비타민 B1 0.13 mg
비타민 B2 0.15 mg
비타민 B6 0.5 mg
비타민 B12 0.2 ㎍
비타민 C 10 mg
비오틴 10 ㎍
니코틴산아미드 1.7 mg
엽산 50 ㎍
판토텐산 칼슘 0.5 mg
무기질 혼합물 적량
황산제1철 1.75 mg
산화아연 0.82 mg
탄산마그네슘 25.3 mg
제1인산칼륨 15 mg
제2인산칼슘 55 mg
구연산칼륨 90 mg
탄산칼슘 100 mg
염화마그네슘 24.8 mg
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 건강기능식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강기능식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강기능식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
제제예 5: 음료 제형의 제조
제조예 2의 녹용 효소분해 추출물 분말 1,000 mg
구연산 1,000 mg
올리고당 100 g
매실농축액 2 g
타우린 1 g
정제수를 가하여 전체 900 mL
통상의 음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1 시간 동안 85 ℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 기능성 음료 조성물 제조에 사용한다.

Claims (12)

  1. 녹용을 IUBMB 효소 명명 클래스 EC　3.4.11.1의 효소 또는 IUBMB 효소 명명 클래스 EC　3.4.24.28의 효소로 분해시킨 녹용 효소분해 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 식품 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 효소는 IUBMB 효소 명명 클래스 EC　3.4.11.1의 효소인 것을 특징으로 하는 면역 증강용 식품 조성물.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 IUBMB 효소 명명 클래스 EC　3.4.11.1의 효소는 곰팡이 유래의 프로테아제 및 펩티다아제의 복합물인 것을 특징으로 하는 면역 증강용 식품 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 곰팡이 유래의 프로테아제 및 펩티다아제의 복합물은 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) 유래의 엔도프로테아제 및 엑소펩티데이즈의 복합물인 것을 특징으로 하는 면역 증강용 식품 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 엔도프로테아제 및 엑소펩티데이즈의 복합물은 플라보자임(Flavourzyme)인 것을 특징으로 하는 면역 증강용 식품 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 IUBMB 효소 명명 클래스 EC　3.4.24.28의 효소는 바실러스 유래의 중성의 프로테아제인 것을 특징으로 하는 면역 증강용 식품 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 바실러스 유래의 중성의 프로테아제는 바실러스 아밀로리퀘팍시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)의 수중 발효(submerged fermentation)에 의해 생산되는 중성의 메탈로(Zn) 엔도프로테아제인 것을 특징으로 하는 면역 증강용 식품 조성물.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 중성의 메탈로(Zn) 엔도프로테아제는 뉴트라아제(Neutrase)인 것을 특징으로 하는 면역 증강용 식품 조성물.
  9. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 녹용 효소분해 추출물은 생녹용 또는 냉동 녹용을 동결건조한 건조 녹용을 효소처리에 의해 가수분해시킨 녹용 효소분해 추출물인 것을 특징으로 하는 면역 증강용 식품 조성물.
  10. 생녹용 또는 냉동 녹용을 동결건조하는 동결건조 녹용 준비 단계; 및
    상기 동결건조 녹용 10 중량부에 물 50 내지 500 중량부 및 효소 0.01 내지 1 중량부를 넣고 30 내지 60 ℃에서 1 내지 48 시간 동안 반응시키는 효소처리 단계;를 포함하고,
    상기 효소는 IUBMB 효소 명명 클래스 EC　3.4.11.1의 효소 또는 IUBMB 효소 명명 클래스 EC　3.4.24.28의 효소인 것을 특징으로 하는 면역 증강 활성을 가진 녹용 효소분해 추출물의 제조방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 효소는 IUBMB 효소 명명 클래스 EC　3.4.11.1의 효소인 것을 특징으로 하는 면역 증강 활성을 가진 녹용 효소분해 추출물의 제조방법.
  12. 녹용을 IUBMB 효소 명명 클래스 EC　3.4.11.1의 효소 또는 IUBMB 효소 명명 클래스 EC　3.4.24.28의 효소로 분해시킨 녹용 효소분해 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 약학 조성물.
PCT/KR2021/020127 2020-12-30 2021-12-29 Ｎｋ 세포를 포함한 면역 세포 활성을 우수하게 증진시키는 면역 강화 녹용 효소분해 추출물 Ceased WO2022146016A1 (ko)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2023540829A JP7630628B2 (ja) 2020-12-30 2021-12-29 Ｎｋ細胞を含む免疫細胞活性を大幅に増進させる免疫強化鹿茸酵素分解抽出物
EP21915814.4A EP4272575A4 (en) 2020-12-30 2021-12-29 IMMUNOPOTENTIAL ENZYMATIC EXTRACT FROM DEER ANTLER FOR EXCELLENT ENHANCEMENT OF IMMUNE CELL ACTIVITY WITH NK CELLS
NZ802127A NZ802127B2 (en) 2021-12-29 Immuno-potentiating enzymatic extract of deer antler that excellently enhances activity of immune cell including nk cell
CN202180094498.0A CN116887696A (zh) 2020-12-30 2021-12-29 显著增强包括nk细胞的免疫细胞的活性的免疫增强鹿茸酶法提取物
US18/259,738 US20240050487A1 (en) 2020-12-30 2021-12-29 Immuno-potentiating enzymatic extract of deer antler that excellently enhances activity of immune cell including nk cell

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2020-0187513 2020-12-30
KR20200187513 2020-12-30
KR1020210189206A KR20220097277A (ko) 2020-12-30 2021-12-28 Ｎｋ 세포를 포함한 면역 세포 활성을 우수하게 증진시키는 면역 강화 녹용 효소분해 추출물
KR10-2021-0189206 2021-12-28

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2022146016A1 true WO2022146016A1 (ko) 2022-07-07

Family

ID=82260665

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2021/020127 Ceased WO2022146016A1 (ko) 2020-12-30 2021-12-29 Ｎｋ 세포를 포함한 면역 세포 활성을 우수하게 증진시키는 면역 강화 녹용 효소분해 추출물

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20240050487A1 (ko)
EP (1) EP4272575A4 (ko)
JP (1) JP7630628B2 (ko)
KR (1) KR102783377B1 (ko)
WO (1) WO2022146016A1 (ko)

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20050090041A (ko) 2004-03-06 2005-09-09 안용근 녹용 또는 녹각으로부터 유효성분을 추출하는 방법
KR20060128117A (ko) * 2005-06-09 2006-12-14 김현수 발효녹용추출물을 포함하는 조성물
US7547761B2 (en) 2003-03-21 2009-06-16 Velvet Antler Research New Zealand Limited Low molecular weight extraction process
KR20120057699A (ko) * 2010-08-16 2012-06-07 주식회사 제이비티 녹용으로 수용성 물질의 제조를 위한 추출방법의 개발과 추출물의 생리 활성
KR20130078724A (ko) 2011-12-30 2013-07-10 케이비에프 주식회사 녹용의 효소 분해처리를 통하여 유효성분 함량이 높은 녹용 추출물을 제조하는 방법
KR101822752B1 (ko) * 2016-08-03 2018-01-29 전남대학교산학협력단 녹용의 고생리활성성분을 함유한 녹용효소가수분해추출물의 제조방법 및 녹용효소가수분해추출물
KR20180015343A (ko) * 2016-08-03 2018-02-13 전남대학교산학협력단 녹용 효소 가수분해 추출물을 포함하는 가공식품물
KR20200119011A (ko) * 2019-04-09 2020-10-19 최학주 면역 증강 기능이 있는 발효 녹용 조성물 및 이의 제조방법

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1193770C (zh) 2003-01-09 2005-03-23 长春市双阳区鹿业科学技术研究所 一种鹿茸药用成分的水解提取方法及产品
US9662368B2 (en) * 2006-06-15 2017-05-30 Murray Goulburn Co-Operative., Limited Formulation comprising whey protein and hydrolysates for improving muscle recovery
CN106071972A (zh) * 2016-06-08 2016-11-09 吉林省东华生物科技有限公司 一种补钙制品的制备方法
KR101895150B1 (ko) * 2017-01-19 2018-09-05 수산업협동조합중앙회 해삼 가수분해물을 포함하는 화장료 조성물
CN109306367A (zh) * 2017-07-28 2019-02-05 中国科学院大连化学物理研究所 一种鹿茸磷酸肽的制备方法及鹿茸磷酸肽与应用
CN110384715A (zh) * 2018-04-13 2019-10-29 中国科学院大连化学物理研究所 一种鹿茸脂质体及制备和应用
KR102255499B1 (ko) * 2019-02-28 2021-05-26 순천향대학교 산학협력단 신규 항산화 펩타이드 및 이를 포함하는 심혈관계 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물
CN110693025B (zh) * 2019-11-01 2023-06-23 东北林业大学 一种多功能成分协同降血糖的组合物及其应用

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7547761B2 (en) 2003-03-21 2009-06-16 Velvet Antler Research New Zealand Limited Low molecular weight extraction process
KR20050090041A (ko) 2004-03-06 2005-09-09 안용근 녹용 또는 녹각으로부터 유효성분을 추출하는 방법
KR20060128117A (ko) * 2005-06-09 2006-12-14 김현수 발효녹용추출물을 포함하는 조성물
KR20120057699A (ko) * 2010-08-16 2012-06-07 주식회사 제이비티 녹용으로 수용성 물질의 제조를 위한 추출방법의 개발과 추출물의 생리 활성
KR20130078724A (ko) 2011-12-30 2013-07-10 케이비에프 주식회사 녹용의 효소 분해처리를 통하여 유효성분 함량이 높은 녹용 추출물을 제조하는 방법
KR101822752B1 (ko) * 2016-08-03 2018-01-29 전남대학교산학협력단 녹용의 고생리활성성분을 함유한 녹용효소가수분해추출물의 제조방법 및 녹용효소가수분해추출물
KR20180015343A (ko) * 2016-08-03 2018-02-13 전남대학교산학협력단 녹용 효소 가수분해 추출물을 포함하는 가공식품물
KR20200119011A (ko) * 2019-04-09 2020-10-19 최학주 면역 증강 기능이 있는 발효 녹용 조성물 및 이의 제조방법

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANONYMOUS: "Development of processing technology for promoting the consumption of velvet antler", CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY- REPORT, 28 February 2017 (2017-02-28), XP055949889, Retrieved from the Internet <URL:https://scienceon.kisti.re.kr/commons/util/originalView.do?cn=TRKO201700006383&dbt=TRKO&rn=> [retrieved on 20220808], DOI: 10.23000/TRKO201700006383 *
See also references of EP4272575A4

Also Published As

Publication number Publication date
EP4272575A4 (en) 2024-11-27
JP2024501750A (ja) 2024-01-15
US20240050487A1 (en) 2024-02-15
JP7630628B2 (ja) 2025-02-17
KR20240105331A (ko) 2024-07-05
KR102783377B1 (ko) 2025-03-19
EP4272575A1 (en) 2023-11-08
NZ802127A (en) 2025-05-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101914858B1 (ko) 흰점박이꽃무지(Protaetia brevitarsis) 유충의 단백 가수분해물, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 조성물
WO2020262755A1 (ko) 장관면역 조절을 위한 신규한 프로바이오틱 조성물
WO2011136573A2 (ko) 비만 치료 및 항산화 활성을 갖는 효모 가수분해물
KR101935153B1 (ko) 장수풍뎅이(Allomyrina dichotoma) 유충의 단백 가수분해물, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 조성물
WO2018062777A1 (ko) 풋귤수로 처리한 발아콩 유래의 두즙 펩타이드를 포함하는 근력 및 근육량 향상용 조성물
WO2013024950A1 (ko) 누에탈지번데기 가수분해물을 포함하는 항비만 조성물 및 이를 제조하는 방법
WO2020013672A1 (ko) 락토바실러스 플란타럼 cjlp475 균주 및 락토바실러스 플란타럼 cjlp243 균주를 포함하는 조성물 및 이의 용도
KR20220097277A (ko) Ｎｋ 세포를 포함한 면역 세포 활성을 우수하게 증진시키는 면역 강화 녹용 효소분해 추출물
WO2019078381A1 (ko) 엔테로코커스 패칼리스, 이의 배양액 또는 이의 사균체를 유효성분으로 함유하는 근육감퇴, 약화 및 근위축 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물, 식품 조성물 및 식품첨가제
WO2020218890A1 (ko) 개다래 추출물을 포함하는 피부 손상 개선용 또는 피부 보습용 조성물
WO2017204547A1 (ko) 범용성 바이러스 포획 단백질 및 이의 제조방법
WO2020218727A9 (ko) 갈색거저리 유충의 단백가수분해물로부터 분리된 펩타이드 및 이를 유효성분으로 포함하는 간 손상 예방 또는 치료용 조성물
WO2015194809A1 (ko) 황칠나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역조절 또는 면역증강용 조성물 및 이의 용도
WO2016010340A1 (ko) 오풍칠 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증 또는 알러지 질환의 예방 및 치료용 조성물 및 이의 용도
WO2025053400A1 (ko) 저알레르기성 유청단백 가수분해물 및 이의 제조방법
WO2019045467A2 (ko) 항산화 및 항고혈압 효과를 가지는 광어 연육 및 이의 제조방법
WO2024196187A1 (ko) 면역 조절 기능을 가지는 신규한 라티락토바실러스 사케이 cnsc001wb (latilactobacillus sakei cnsc001wb) 균주 및 이의 용도
WO2020226204A1 (ko) 냉초 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증, 알레르기 및 천식의 예방 또는 치료용 조성물 및 이의 용도
WO2019083289A1 (ko) 장건강 및 장개선 효능을 가지는 수수 및 팥 발효물 및 이의 제조방법
KR102783377B1 (ko) Ｎｋ 세포를 포함한 면역 세포 활성을 우수하게 증진시키는 면역 강화 녹용 효소분해 추출물
WO2021201507A1 (ko) 갈색거저리 유충 단백질 또는 이의 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 근감소증의 예방, 개선 또는 치료용 조성물
WO2024038980A1 (ko) 락토바실러스 플란타럼 ku15120 균주 또는 이의 용도
KR20230075184A (ko) 흰점박이 꽃무지 유충 가수분해물 유래의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항고혈압 식품 조성물
WO2024049115A1 (ko) 녹용 효소분해 추출물(henkiv®)을 이용한 운동수행능력 향상 또는 피로 회복용 식품 조성물
WO2015105373A1 (ko) 화살나무 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 천식의 예방 또는 치료용 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 21915814

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 18259738

Country of ref document: US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2023540829

Country of ref document: JP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2021915814

Country of ref document: EP

Effective date: 20230731

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 202180094498.0

Country of ref document: CN

WWG Wipo information: grant in national office

Ref document number: 802127

Country of ref document: NZ