WO2022149837A1 - 항-fgfr3 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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서윤지
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention provides an anti-FGFR3 (Fibroblast growth factor receptor 3) antibody or antigen-binding fragment thereof, a nucleic acid encoding the same, a recombinant expression vector containing the nucleic acid, a host cell transfected with the recombinant expression vector, the antibody or antigen-binding thereof
  • a chimeric antigen receptor (CAR) comprising an antigen-binding site of an external domain, an immune cell into
  • Fibroblast growth factor and its tyrosine kinase receptor (FGFR) play important roles in embryonic development, maintenance of homeostasis in various tissues, wound healing processes and metabolic functions.
  • FGF Fibroblast growth factor
  • FGFR tyrosine kinase receptor
  • Dysregulation of signaling by FGFR1-4 is associated with the etiology of several types of cancer.
  • Genomic FGFR mutations including gene amplification, chromosomal translocation and activating mutations induce abnormal activation of the FGF pathway and promote tumor transformation of normal cells.
  • the amplification of FGFR3 is known to be associated with bladder cancer induction.
  • missense FGFR mutations are observed in several types of cancer, and FGF driving signaling and tumor cell proliferation can be enhanced by S249C of FGFR3, and represent a hot spot for somatic mutation.
  • fusion proteins caused by rearrangement of chromosomes as cancer-causing mutations have been found in glioblastoma, lung cancer, bladder cancer, oral cancer, head and neck squamous cell cancer, gallbladder cancer or cervical cancer.
  • Such a fusion protein is generated through fusion of the FGFR3 gene and the transforming acidic coiled-coil containing protein 3 (TAC3) gene by tandem duplication of chromosome 4.
  • TAC3 transforming acidic coiled-coil containing protein 3
  • TACC3 belongs to the TACC family, and the phenomenon of rearrangement in chromosome 4p16 corresponding to TACC3 and FGFR3 containing region is often found in multiple myelopathy, and this rearrangement leads to increased expression of FGFR3 or TACC3 (KN Nelson et al. ., Oncotarget. 2018 Sep 28; 9(76): 34306-34319).
  • B701 (Vofatamab) is a human immunoglobulin G1 monoclonal antibody against FGFR3, and clinical trials have been conducted to confirm whether it exhibits anti-tumor activity and the possibility of combination with docetaxel.
  • the anti-FGFR3 monoclonal antibody B-701 When the anti-FGFR3 monoclonal antibody B-701 is administered, it specifically binds and inhibits both wild-type and mutant FGFR3 to inhibit FGFR3 phosphorylation, thereby inhibiting FGFR3 activation and FGFR3-mediated signaling pathways. This inhibits cell proliferation and induces apoptosis in FGFR3-expressing tumors.
  • LY3076226 is an antibody-drug conjugate (ADC) in which an anti-FGFR3 antibody is conjugated to a microtubule inhibitor (DM4), and clinical trials have been conducted to determine whether it can be used for advanced or metastatic cancer.
  • a phase 1 clinical trial is underway to determine whether LY3076226 is effective in multiple myeloma with FGFR3 overexpression or modification and advanced or metastatic cancer including lymphoma, locally advanced, unresectable or metastatic urinary tract carcinoma (T Wheat et al., Bladder Cancer, vol. 5, no. 2, pp. 87-102, 2019).
  • An object of the present invention is to select an antibody having a more sensitive reactivity to FGFR3-TACC3-overexpressing brain tumor patient-derived cells than a known anti-FGFR3 antibody.
  • Another object of the present invention is to provide a nucleic acid encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • Another object of the present invention is to provide a recombinant expression vector containing the nucleic acid or a host cell transfected with the recombinant expression vector.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to FGFR3.
  • Another object of the present invention is to provide a bispecific or multispecific antibody comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • Another object of the present invention is to provide an immune cell engaging bispecific or multispecific antibody comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • Another object of the present invention is to provide an antibody-drug conjugate (ADC) in which the antibody or antigen-binding fragment thereof is bound to a drug.
  • ADC antibody-drug conjugate
  • Another object of the present invention is a chimeric antigen receptor (CAR) comprising the scFv of the anti-FGFR3 antibody as an antigen-binding site of an extracellular domain, an immune cell into which the chimeric antigen receptor is introduced, and a combination therapy comprising the immune cell
  • CAR chimeric antigen receptor
  • Another object of the present invention is to provide a composition for combination therapy comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof or the immune cell engaging bispecific or multispecific antibody.
  • Another object of the present invention is an antibody or antigen-binding fragment thereof, a bi- or multispecific antibody comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof, an antibody-drug conjugate comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof, the antibody or antigen thereof
  • a chimeric antigen receptor comprising a binding fragment
  • a composition for treating cancer comprising the chimeric antigen receptor, or a method for treating cancer.
  • Another object of the present invention is to provide an endoplasmic reticulum comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the present invention provides an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to FGFR3 (Fibroblast growth factor receptor 3) comprising:
  • Heavy chain CDR1 comprising at least one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 18;
  • heavy chain CDR2 comprising at least one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 19 to SEQ ID NO: 41;
  • Heavy chain CDR3 comprising at least one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 42 to SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 186 to 198;
  • a light chain CDR1 comprising at least one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 67 to SEQ ID NO: 88;
  • a light chain CDR2 comprising at least one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 89 to SEQ ID NO: 109;
  • a light chain CDR3 comprising at least one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 110 to SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 199 to SEQ ID NO: 202.
  • the present invention provides a nucleic acid encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the present invention also provides a recombinant expression vector comprising the nucleic acid.
  • the present invention also provides a host cell transfected with the recombinant expression vector.
  • the present invention also comprises the steps of culturing a host cell to produce an antibody; And it provides a method for producing an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to FGFR3, comprising the step of isolating and purifying the generated antibody.
  • the present invention also provides a bispecific or multispecific antibody comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the present invention also relates to an immune cell engage bispecific or multispecific scFv comprising an scFv of said antibody and a second binding domain comprising at least one scFv of an antibody that binds to an immune cell activating antigen.
  • Specific antibodies are provided.
  • the present invention also provides an antibody-drug conjugate (ADC) wherein the antibody or antigen-binding fragment thereof is bound to a drug.
  • ADC antibody-drug conjugate
  • the present invention also provides a chimeric antigen receptor (CAR) comprising an extracellular domain comprising an antigen-binding site, a transmembrane domain and an intracellular signaling domain, wherein the antigen-binding site of the extracellular domain is an scFv of the antibody. It provides a chimeric antigen receptor characterized.
  • CAR chimeric antigen receptor
  • the present invention also provides an immune cell comprising the chimeric antigen receptor (CAR).
  • CAR chimeric antigen receptor
  • the present invention also provides a composition for combination therapy comprising the immune cell and a drug other than the anti-FGFR3 antibody.
  • the present invention also provides a composition for combination therapy comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof and at least one selected from the group consisting of:
  • immune cells comprising an antigen receptor (CAR) comprising an scFv fragment for an antibody other than an anti-FGFR3 antibody as an extracellular domain; and
  • CAR antigen receptor
  • the present invention also provides a composition for combination therapy comprising the bispecific or multispecific antibody and at least one selected from the group consisting of:
  • immune cells comprising an antigen receptor (CAR) comprising an scFv fragment for an antibody other than an anti-FGFR3 antibody as an extracellular domain; and
  • CAR antigen receptor
  • the present invention also relates to the antibody or antigen-binding fragment thereof, a bi- or multispecific antibody comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof, an antibody-drug conjugate comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof, the antibody or antigen thereof It provides a composition for the treatment of cancer, comprising a chimeric antigen receptor containing a binding fragment or immune cells into which the chimeric antigen receptor is introduced.
  • the present invention also provides for the treatment of cancer in which the fusion gene of FGFR3 and TACC3 is amplified, there is a mutation in the fusion gene, the fusion gene is overexpressed, or the fusion gene is constitutive activation.
  • An antigen-binding fragment thereof, a bi- or multispecific antibody comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof, an antibody-drug conjugate comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof, a chimeric antigen receptor comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof Or, it provides a composition for treating cancer, comprising immune cells into which the chimeric antigen receptor is introduced.
  • the present invention also comprises the steps of confirming that the fusion gene of FGFR3 and TACC3 is amplified in a patient-derived sample, there is a mutation in the fusion gene, the fusion gene is overexpressed, or the fusion gene is always expressed (constitutive activation); When it is confirmed that the fusion gene of FGFR3 and TACC3 is amplified, there is a mutation in the fusion gene, the fusion gene is overexpressed, or the fusion gene is always expressed (constitutive activation), the antibody or antigen-binding fragment thereof, the antibody or its A dual or multispecific antibody comprising an antigen-binding fragment, an antibody-drug conjugate comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof, a chimeric antigen receptor comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof, or the chimeric antigen receptor is introduced It provides a cancer treatment method comprising the step of administering immune cells.
  • the present invention also provides a vesicle (vesicle) in which the antibody or antigen-binding fragment thereof is expressed to the outside or present therein.
  • FIG. 1 shows a schematic diagram of phage display-based biopanning used in the present invention.
  • Figure 1a shows a schematic diagram of cell panning using FGFR3-overexpressing patient-derived cells.
  • Figure 1b shows a schematic diagram of a stationary phase bio-panning using the FGFR3 recombinant protein.
  • Figure 1c shows a schematic diagram of solution phase biopanning using the FGFR3 recombinant protein.
  • Figure 1d shows a schematic diagram of magnetic-based semi-automated panning using the FGFR3 recombinant protein.
  • Figure 2a shows the results of biopanning for antibody screening according to the present invention.
  • Figure 2b shows the results of ELISA screening for antibody screening according to the present invention.
  • Figure 2c shows the results of magnetic beads based panning for antibody screening according to the present invention.
  • Figure 3a shows a schematic diagram of the conversion from scFv to IgG format.
  • Figure 3b shows the antibody production and purity / properties analysis results based on Expi293.
  • FIG. 4a to 4d show the results of the affinity ELISA of the FGFR3 antibody (IgG).
  • Figure 4a is the specific binding capacity of the antibody to the recombinant protein human FGFR3-IIIc
  • Figure 4b is the specific binding capacity of the antibody to the recombinant protein human FGFR3-IIIb
  • Figure 4c is the specific binding capacity of the antibody to the recombinant protein mouse FGFR3
  • a diagram 4d shows the specific binding ability of the antibody to the recombinant protein cynomolgus monkey FGFR3.
  • 5 shows the results of KD value evaluation through Biacore 3000 of the FGFR3 antibody (IgG).
  • FIG. 6 shows the results of FGFR3 expression confirmation and FGFR3-TACC3 fusion analysis of brain tumor patient-derived cells.
  • Figure 6a is the mRNA expression level (RPKM) analysis of patient-derived cells, protein expression level analysis (western blotting), cell surface expression analysis (FACS analysis) results
  • Figure 6b is FGFR3-TACC3 fusion confirmation through RT-PCR: fusion A specific primer is indicated.
  • FIG. 7a shows the results of cell surface binding analysis of FGFR3 antibody clones to FGFR3(-TACC3) overexpressing brain tumor patient-derived cells.
  • Figure 7b shows the results of analysis of the binding pattern for each concentration of the F309 antibody to FGFR3 (-TACC3) overexpressing brain tumor patient-derived cells.
  • Figure 7c shows the results of analysis of the binding affinity of the F309 and FS306 antibodies to a cell line without FGFR3 expression.
  • FIG. 8 shows the results of analysis and screening for FGFR3 (-TACC3) resolution on the patient-derived cell surface of the FACS-based FGFR3 antibody.
  • Figure 9a shows the results of analysis of the FGFR3-specific binding capacity of the F309 and FS306 antibodies, and confirming the non-competitive properties of the ligand.
  • Figure 9b shows the unique epitope domain identification of the F309 and FS306 antibodies: Domain I results.
  • Figure 9c shows the results of the recombinant domain design for epitope domain mapping.
  • FIG. 10 shows the target resolution analysis results of F309 and FS306 antibodies for FGFR3-TACC3 overexpressing brain tumor patient-derived cells and FGFR3 overexpressing cell lines.
  • Figure 10a shows the cell surface FGFR3-TACC3 and FGFR3 resolution analysis of the F309 and FS306 antibodies: FACS analysis results.
  • Figure 10b shows the total FGFR3-TACC3 and FGFR3 resolution analysis of the F309 and FS306 antibodies: Western blotting results.
  • 11 shows the results of cell internalization analysis of F309 and FS306 antibodies.
  • 11a shows the results of cell internalization analysis: ICC analysis in FGFR3-TACC3 overexpressing brain tumor patient-derived cells.
  • 11b shows the results of confirming the lysosomal degradation mechanism of F309 and FS306 antibodies through Lysosome inhibitor treatment.
  • 12 shows the results of analysis of FGFR3 sub-signaling inhibition of F309 and FS306 antibodies.
  • Figure 13a shows the results of the ligand-dependent cell growth inhibition assay (FGF1, FGF9).
  • 13B shows the results of a ligand-independent cell growth inhibition assay (FGFR3-TACC3-overexpressing brain tumor patient-derived cells, FGFR3 low-expression cell lines or brain tumor patient-derived cells).
  • 14A shows the results of short-term PK analysis of F309 and FS306.
  • FIG. 14B shows the results of evaluation of antibody efficacy in FGFR3-TACC3 overexpressing brain tumor patient-derived cell transplanted mice (PDX).
  • Figure 14c shows the efficacy evaluation (FGFR3-TACC3 overexpressing brain tumor patient-derived cells) results in the PDX model of the F309 antibody.
  • Figure 15a shows a schematic diagram of 3D, 2D structure and strategic affinity improvement of the F309 antibody.
  • 15B shows the affinity comparison results of the F309 affinity-improved antibody through affinity ELISA.
  • 15c shows the results of SPR analysis of the F309 affinity-improved antibody.
  • Figure 15c shows the results of the ligand-independent cell growth inhibition analysis (FGFR3-TACC3 overexpressing brain tumor patient-derived cells) of the improved antibody clones F309.
  • Figure 16a shows a manufacturing schematic diagram for confirming the applicability of the antibody-drug conjugate (ADC) of the F309 antibody.
  • Fig. 16 shows the cytotoxicity analysis results of F309-vc MMAE on FGFR3-TACC3 overexpressing brain tumor patient-derived cells and FGFR3 overexpressing cell lines.
  • Fig. 16c shows the results of cytotoxicity analysis-1 according to the FGFR3 expression level of F309-vc MMAE
  • Fig. 16d shows the results of cytotoxicity analysis-2 according to the FGFR3 expression level of F309-vc MMAE.
  • FIG 17 shows the Fv structure and epitope domain mapping and antigen-specific binding analysis results of the affinity matured antibody.
  • FIG. 23 shows a schematic diagram of ADC preparation including affinity matured antibody (Topoisomerase I inhibitor conjugation).
  • FIG. 24 is a schematic diagram of ADC preparation including affinity matured antibody (Topoisomerase I inhibitor conjugation).
  • Figure 31 shows the in vivo efficacy evaluation results of the affinity matured antibody-containing ADC.
  • Fig. 32 shows the results of evaluation of ADC efficacy in the FGFR3 (TACC3 fusion) brain tumor stereotactic animal model of ADC with affinity matured antibody.
  • the present invention provides a heavy chain CDR1 comprising at least one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 18, and a heavy chain CDR2 comprising at least one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 19 to SEQ ID NO: 41 , a heavy chain CDR3 comprising at least one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 42 to SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 186 to 198, a light chain CDR1 comprising at least one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 67 to SEQ ID NO: 88 , a light chain CDR2 comprising at least one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 89 to SEQ ID NO: 109, and at least one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 110 to SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 199 to SEQ ID NO: 202 It relates to an
  • the term “antibody” refers to an anti-FGFR3 antibody that specifically binds to FGFR3.
  • the scope of the present invention includes not only complete antibody forms that specifically bind to FGFR3, but also antigen-binding fragments of the antibody molecule.
  • the antibody according to the invention may target FGFR3-TACC3.
  • the antibody according to the present invention was selected as an antibody having better efficacy against FGFR3-TACC3 overexpressing cancer cells than a known anti-FGFR3 antibody.
  • a complete antibody has a structure having two full-length light chains and two full-length heavy chains, each light chain connected to the heavy chain by a disulfide bond.
  • the term “heavy chain” refers to a full-length heavy chain comprising a variable region domain VH comprising an amino acid sequence having sufficient variable region sequence to confer specificity to an antigen and three constant region domains CH1, CH2 and CH3. and fragments thereof.
  • the term “light chain” refers to a full-length light chain comprising a variable region domain VL and a constant region domain CL comprising an amino acid sequence having sufficient variable region sequence to confer specificity to an antigen, and fragments thereof. all means
  • the whole antibody includes subtypes of IgA, IgD, IgE, IgM and IgG, in particular, IgG includes IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4.
  • the heavy chain constant region has gamma ( ⁇ ), mu ( ⁇ ), alpha ( ⁇ ), delta ( ⁇ ) and epsilon ( ⁇ ) types and subclasses gamma 1 ( ⁇ 1), gamma 2 ( ⁇ 2), gamma 3 ( ⁇ 3). ), gamma 4 ( ⁇ 4), alpha 1 ( ⁇ 1) and alpha 2 ( ⁇ 2).
  • the constant region of the light chain has a kappa ( ⁇ ) and a lambda ( ⁇ ) type.
  • Antigen-binding fragment or antibody fragment of an antibody refers to a fragment having an antigen-binding function, and includes Fab, F(ab'), F(ab')2 and Fv.
  • Fab has a structure having variable regions of light and heavy chains, a constant region of a light chain and a first constant region (CH1) of a heavy chain, and has one antigen-binding site.
  • Fab' differs from Fab in that it has a hinge-region comprising one or more cysteine residues at the C-terminus of the heavy chain CH1 domain.
  • F(ab')2 is formed when a cysteine residue in the hinge region of Fab' forms a disulfide bond.
  • Fv corresponds to the smallest antibody fragment having only a heavy chain variable region and a light chain variable region.
  • double-chain Fv two-chain Fv
  • the heavy chain variable region and the light chain variable region are connected by a non-covalent bond
  • single-chain Fv scFv
  • scFv single-chain Fv
  • antibody fragments can be prepared using proteolytic enzymes (for example, by restriction digestion of the intact antibody with papain to obtain Fab, and by digestion with pepsin to obtain F(ab')2), or by genetic recombination technology. can be produced using proteolytic enzymes (for example, by restriction digestion of the intact antibody with papain to obtain Fab, and by digestion with pepsin to obtain F(ab')2), or by genetic recombination technology. can be produced using proteolytic enzymes (for example, by restriction digestion of the intact antibody with papain to obtain Fab, and by digestion with pepsin to obtain F(ab')2), or by genetic recombination technology. can be produced using proteolytic enzymes (for example, by restriction digestion of the intact antibody with papain to obtain Fab, and by digestion with pepsin to obtain F(ab')2), or by genetic recombination technology. can be produced using proteolytic enzymes (for example, by restriction digestion of the intact antibody with papain to obtain Fab
  • Fv fragment is an antibody fragment that contains a complete antibody recognition and binding site. This region is a dimer in which one heavy chain variable domain and one light chain variable domain are joined.
  • a “Fab” fragment comprises the variable and constant domains of a light chain and the variable and first constant domains (CH1) of a heavy chain.
  • F(ab')2 antibody fragments generally comprise a pair of Fab' fragments covalently linked by cysteines in the hinge region present at the C-terminus of the Fab' fragment.
  • a “single chain Fv (scFv)” antibody fragment is a construct consisting of a single polypeptide chain comprising the VH and VL domains of an antibody. It may further comprise a polypeptide linker between the VH domain and the VL domain that enables the scFv to form the desired structure for antigen binding.
  • the antibody of the invention is a monoclonal antibody, multispecific antibody, human antibody, humanized antibody, chimeric antibody, scFv, Fab fragment, F(ab')2 fragment, disulfide-bonded Fvs (sdFv) and anti-idiotypic (anti-Id) antibodies, or epitope-binding fragments of such antibodies, and the like.
  • the heavy chain constant region may be selected from any one isotype of gamma ( ⁇ ), mu ( ⁇ ), alpha ( ⁇ ), delta ( ⁇ ) or epsilon ( ⁇ ).
  • the constant region is gamma 1 (IgG1), gamma 2 (IgG2), gamma 3 (IgG3) or gamma 4 (IgG4).
  • the light chain constant region may be kappa or lambda type.
  • Said monoclonal antibody refers to an antibody obtained from a substantially homogeneous population of antibodies, i.e., the individual antibodies comprising the population are identical except for possible naturally occurring mutations that may be present in trace amounts.
  • Monoclonal antibodies are highly specific, being directed against a single antigenic site.
  • conventional (polyclonal) antibodies which typically include different antibodies against different determinants (epitopes)
  • each monoclonal antibody is directed against a single determinant on the antigen.
  • Epitope refers to a protein determinant to which an antibody can specifically bind. Epitopes are usually composed of a group of chemically active surface molecules, such as amino acids or sugar side chains, and generally have specific three-dimensional structural characteristics as well as specific charge properties. Conformational and non-steric epitopes are distinguished in that binding to the former is lost but not to the latter in the presence of a denaturing solvent.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention is, for example, any one selected from the group consisting of three immune domains D1, D2 and D3 present in the extracellular region of FGFR3, for example, D1, D2 or D3 can bind to a domain.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention may specifically bind to domain 1 (SEQ ID NO: 184) of FGFR3 of SEQ ID NO: 183 and may not compete for binding with an FGF ligand.
  • non-human antibodies are chimeric antibodies that contain minimal sequence derived from non-human immunoglobulin.
  • humanized antibodies are of a non-human species (donor antibody) that retain the desired specificity, affinity and ability for residues from the hypervariable region of the recipient, eg, mouse, rat, rabbit or non-human primate. It is a human immunoglobulin (recipient antibody) replaced with residues from the hypervariable region of
  • human antibody is a molecule derived from human immunoglobulin, and means that the entire amino acid sequence constituting the antibody, including the complementarity determining region and structural region, is composed of human immunoglobulin.
  • a portion of the heavy and/or light chain is identical to or homologous to the corresponding sequence in an antibody derived from a particular species or belonging to a particular antibody class or subclass, while the remaining chain(s) are derived from another species or are of another antibody class or subclass.
  • Included are "chimeric" antibodies (immunoglobulins) that are identical to or homologous to the corresponding sequence in antibodies belonging to subclasses, as well as fragments of such antibodies that exhibit the desired biological activity.
  • variable region of an antibody refers to the light and heavy chain portions of an antibody molecule comprising the amino acid sequences of complementarity determining regions (CDRs; ie, CDR1, CDR2, and CDR3) and framework regions (FR).
  • CDRs complementarity determining regions
  • FR framework regions
  • VH refers to the variable domain of a heavy chain
  • VL refers to the variable domain of the light chain.
  • CDR complementarity determining region
  • the anti-FGFR3 antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention is selected as an antibody having better efficacy against FGFR3-TACC3 overexpressing cancer cells than a known anti-FGFR3 antibody, and may include, for example:
  • a heavy chain variable region comprising heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 1, heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 19 and heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 42, light chain CDR1 of SEQ ID NO: 67, light chain CDR2 of SEQ ID NO: 89 and light chain CDR3 of SEQ ID NO: 110 light chain variable region,
  • heavy chain variable region comprising heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 2, heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 20 and heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 43, light chain CDR1 of SEQ ID NO: 68, light chain CDR2 of SEQ ID NO: 90 and light chain CDR3 of SEQ ID NO: 111 light chain variable region,
  • heavy chain variable region comprising heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 3, heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 21 and heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 44, light chain CDR1 of SEQ ID NO: 69, light chain CDR2 of SEQ ID NO: 91 and light chain CDR3 of SEQ ID NO: 112 light chain variable region,
  • heavy chain variable region comprising heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 4, heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 22 and heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 45, light chain CDR1 of SEQ ID NO: 70, light chain CDR2 of SEQ ID NO: 92 and light chain CDR3 of SEQ ID NO: 113 light chain variable region,
  • heavy chain variable region comprising heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 5, heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 23 and heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 46, light chain CDR1 of SEQ ID NO: 71, light chain CDR2 of SEQ ID NO: 93 and light chain CDR3 of SEQ ID NO: 114 light chain variable region,
  • a heavy chain variable region comprising heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 5, heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 23 and heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 186, light chain CDR1 of SEQ ID NO: 71, light chain CDR2 of SEQ ID NO: 93 and light chain CDR3 of SEQ ID NO: 114 light chain variable region,
  • a heavy chain variable region comprising heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 5, heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 23 and heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 187, light chain CDR1 of SEQ ID NO: 71, light chain CDR2 of SEQ ID NO: 93 and light chain CDR3 of SEQ ID NO: 114 light chain variable region,
  • a heavy chain variable region comprising heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 5, heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 23 and heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 188, light chain CDR1 of SEQ ID NO: 71, light chain CDR2 of SEQ ID NO: 93 and light chain CDR3 of SEQ ID NO: 114 light chain variable region,
  • a heavy chain variable region comprising heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 5, heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 23 and heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 189, light chain CDR1 of SEQ ID NO: 71, light chain CDR2 of SEQ ID NO: 93 and light chain CDR3 of SEQ ID NO: 114 light chain variable region,
  • a heavy chain variable region comprising heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 5, heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 23 and heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 190, light chain CDR1 of SEQ ID NO: 71, light chain CDR2 of SEQ ID NO: 93 and light chain CDR3 of SEQ ID NO: 114 light chain variable region,
  • a heavy chain variable region comprising heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 5, heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 23 and heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 191, light chain CDR1 of SEQ ID NO: 71, light chain CDR2 of SEQ ID NO: 93 and light chain CDR3 of SEQ ID NO: 114 light chain variable region,
  • a heavy chain variable region comprising heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 5, heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 23 and heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 192, light chain CDR1 of SEQ ID NO: 71, light chain CDR2 of SEQ ID NO: 93 and light chain CDR3 of SEQ ID NO: 114 light chain variable region,
  • a heavy chain variable region comprising heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 5, heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 23 and heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 193, light chain CDR1 of SEQ ID NO: 71, light chain CDR2 of SEQ ID NO: 93 and light chain CDR3 of SEQ ID NO: 114 light chain variable region,
  • a heavy chain variable region comprising heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 5, heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 23 and heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 194, light chain CDR1 of SEQ ID NO: 71, light chain CDR2 of SEQ ID NO: 93 and light chain CDR3 of SEQ ID NO: 114 light chain variable region,
  • a heavy chain variable region comprising heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 5, heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 23 and heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 195, light chain CDR1 of SEQ ID NO: 71, light chain CDR2 of SEQ ID NO: 93 and light chain CDR3 of SEQ ID NO: 114 light chain variable region,
  • heavy chain variable region comprising heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 5, heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 23 and heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 196, light chain CDR1 of SEQ ID NO: 71, light chain CDR2 of SEQ ID NO: 93 and light chain CDR3 of SEQ ID NO: 114 light chain variable region,
  • a heavy chain variable region comprising heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 5, heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 23 and heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 197, light chain CDR1 of SEQ ID NO: 71, light chain CDR2 of SEQ ID NO: 93 and light chain CDR3 of SEQ ID NO: 114 light chain variable region,
  • a heavy chain variable region comprising heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 5, heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 23 and heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 198, light chain CDR1 of SEQ ID NO: 71, light chain CDR2 of SEQ ID NO: 93 and light chain CDR3 of SEQ ID NO: 114 light chain variable region,
  • heavy chain variable region comprising heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 5, heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 23 and heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 46, light chain CDR1 of SEQ ID NO: 71, light chain CDR2 of SEQ ID NO: 93 and light chain CDR3 of SEQ ID NO: 199 light chain variable region,
  • heavy chain variable region comprising heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 5, heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 23 and heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 46, light chain CDR1 of SEQ ID NO: 71, light chain CDR2 of SEQ ID NO: 93 and light chain CDR3 of SEQ ID NO: 200 light chain variable region,
  • heavy chain variable region comprising heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 5, heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 23 and heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 46, light chain CDR1 of SEQ ID NO: 71, light chain CDR2 of SEQ ID NO: 93 and light chain CDR3 of SEQ ID NO: 201 light chain variable region,
  • heavy chain variable region comprising heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 5, heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 23 and heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 46, light chain CDR1 of SEQ ID NO: 71, light chain CDR2 of SEQ ID NO: 93 and light chain CDR3 of SEQ ID NO: 202 light chain variable region,
  • heavy chain variable region comprising heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 4, heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 24 and heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 47, light chain CDR1 of SEQ ID NO: 72, light chain CDR2 of SEQ ID NO: 94 and light chain CDR3 of SEQ ID NO: 115 light chain variable region,
  • heavy chain variable region comprising heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 6, heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 25 and heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 48, light chain CDR1 of SEQ ID NO: 73, light chain CDR2 of SEQ ID NO: 95 and light chain CDR3 of SEQ ID NO: 112 light chain variable region,
  • heavy chain variable region comprising heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 7, heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 26 and heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 49, light chain CDR1 of SEQ ID NO: 74, light chain CDR2 of SEQ ID NO: 96 and light chain CDR3 of SEQ ID NO: 116 light chain variable region,
  • heavy chain variable region comprising heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 8, heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 27 and heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 50, light chain CDR1 of SEQ ID NO: 75, light chain CDR2 of SEQ ID NO: 97 and light chain CDR3 of SEQ ID NO: 117 light chain variable region,
  • heavy chain variable region comprising heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 9, heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 28 and heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 51, light chain CDR1 of SEQ ID NO: 76, light chain CDR2 of SEQ ID NO: 98 and light chain CDR3 of SEQ ID NO: 118 light chain variable region,
  • heavy chain variable region comprising heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 10, heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 29 and heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 52, light chain CDR1 of SEQ ID NO: 77, light chain CDR2 of SEQ ID NO: 97 and light chain CDR3 of SEQ ID NO: 119 light chain variable region,
  • heavy chain variable region comprising heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 11, heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 30 and heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 53, light chain CDR1 of SEQ ID NO: 78, light chain CDR2 of SEQ ID NO: 99 and light chain CDR3 of SEQ ID NO: 120 light chain variable region,
  • heavy chain variable region comprising heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 11, heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 31 and heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 54, light chain CDR1 of SEQ ID NO: 79, light chain CDR2 of SEQ ID NO: 100 and light chain CDR3 of SEQ ID NO: 121 light chain variable region,
  • a heavy chain variable region comprising heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 12, heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 32 and heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 55, light chain CDR1 of SEQ ID NO: 80, light chain CDR2 of SEQ ID NO: 101 and light chain CDR3 of SEQ ID NO: 122 light chain variable region,
  • heavy chain variable region comprising heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 3, heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 33 and heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 56, light chain CDR1 of SEQ ID NO: 81, light chain CDR2 of SEQ ID NO: 102 and light chain CDR3 of SEQ ID NO: 123 light chain variable region,
  • a heavy chain variable region comprising heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 13, heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 34 and heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 57, light chain CDR1 of SEQ ID NO: 82, light chain CDR2 of SEQ ID NO: 103 and light chain CDR3 of SEQ ID NO: 124 light chain variable region,
  • heavy chain variable region comprising heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 14, heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 35 and heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 58, light chain CDR1 of SEQ ID NO: 83, light chain CDR2 of SEQ ID NO: 104 and light chain CDR3 of SEQ ID NO: 125 light chain variable region,
  • a heavy chain variable region comprising heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 1, heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 36 and heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 59, light chain CDR1 of SEQ ID NO: 84, light chain CDR2 of SEQ ID NO: 105 and light chain CDR3 of SEQ ID NO: 126 light chain variable region,
  • heavy chain variable region comprising heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 6, heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 23 and heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 60, light chain CDR1 of SEQ ID NO: 69, light chain CDR2 of SEQ ID NO: 91 and light chain CDR3 of SEQ ID NO: 127 light chain variable region,
  • heavy chain variable region comprising heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 15, heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 37 and heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 61, light chain CDR1 of SEQ ID NO: 85, light chain CDR2 of SEQ ID NO: 89 and light chain CDR3 of SEQ ID NO: 128 light chain variable region,
  • a heavy chain variable region comprising heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 16, heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 38 and heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 62, light chain CDR1 of SEQ ID NO: 86, light chain CDR2 of SEQ ID NO: 106 and light chain CDR3 of SEQ ID NO: 129 light chain variable region,
  • a heavy chain variable region comprising heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 17, heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 39 and heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 63, light chain CDR1 of SEQ ID NO: 87, light chain CDR2 of SEQ ID NO: 107 and light chain CDR3 of SEQ ID NO: 130 light chain variable region,
  • heavy chain variable region comprising heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 4, heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 19 and heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 64, light chain CDR1 of SEQ ID NO: 88, light chain CDR2 of SEQ ID NO: 108 and light chain CDR3 of SEQ ID NO: 131 light chain variable region,
  • a heavy chain variable region comprising heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 18, heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 40 and heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 65, light chain CDR1 of SEQ ID NO: 85, light chain CDR2 of SEQ ID NO: 89 and light chain CDR3 of SEQ ID NO: 128 a light chain variable region, or
  • a heavy chain variable region comprising heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 16, heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 41 and heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 66, light chain CDR1 of SEQ ID NO: 72, light chain CDR2 of SEQ ID NO: 109 and light chain CDR3 of SEQ ID NO: 132 light chain variable region.
  • a “framework region (FR)” is a variable domain residue other than a CDR residue.
  • Each variable domain typically has four FRs: FR1, FR2, FR3 and FR4.
  • the binding affinity of the anti-FGFR3 antibody to FGFR3 is in the range of 10 -5 M to 10 -12 M.
  • the binding affinity of an anti-FGFR3 antibody to FGFR3 is 10 -6 M to 10 -12 M, 10 -7 M to 10 -12 M, 10 -8 M to 10 -12 M, 10 -9 M to 10 -12 M, 10 -5 M to 10 -11 M, 10 -6 M to 10 -11 M, 10 -7 M to 10 -11 M, 10 -8 M to 10 -11 M, 10 -9 M to 10 -11 M, 10 -10 M to 10 -11 M, 10 -5 M to 10 -10 M, 10 -6 M to 10 -10 M, 10 -7 M to 10 -10 M, 10 -8 M to 10 -10 M, 10 -9 M to 10 -10 M, 10 -5 M to 10 -9 M, 10 -6 M to 10 -9 M, 10 -7 M to 10 -9 M, 10 -8 M to 10 -9 M, 10 -5 M to 10 -8 M, 10 -6 M
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof binding to FGFR3 may include a heavy chain variable region comprising one or more amino acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 133 to SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 203 to SEQ ID NO: 215.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof binding to FGFR3 may include a light chain variable region comprising at least one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 158 to SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 216 to SEQ ID NO: 219.
  • it may include:
  • An scFv is an antibody fragment, which is a construct consisting of a single polypeptide chain comprising the VH and VL domains of an antibody. It may further comprise a polypeptide linker between the VH domain and the VL domain that enables the scFv to form the desired structure for antigen binding.
  • the VH and VL domains may be linked via a linker.
  • the heavy chain variable region comprising at least one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 133 to SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 203 to SEQ ID NO: 215 is SEQ ID NO: 158 to SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 216 to SEQ ID NO: 219 through a linker It may be linked to a light chain variable region comprising one or more amino acid sequences selected from the group consisting of.
  • it may include:
  • the linker may be a peptide linker and may have a length of about 10-25 aa.
  • hydrophilic amino acids such as glycine and/or serine may be included, but are not limited thereto.
  • the linker may include, for example, (GS) n , (GGS) n , (GSGGS) n or (G n S) m (n and m are each 1 to 10), but the linker is For example, it may be (G n S) m (n and m are each 1 to 10).
  • the linker may include GGGGS, for example, GGGGSGGGGSGGGGS of SEQ ID NO: 185 repeated three times.
  • Phage display is a technique for displaying a variant polypeptide as a fusion protein with at least a portion of an envelope protein on the surface of a phage, eg, a filamentous phage particle.
  • the usefulness of phage display lies in the fact that it can rapidly and efficiently sort sequences that bind with high affinity to a target antigen by targeting a large library of randomized protein variants. Displaying peptide and protein libraries on phage has been used to screen millions of polypeptides for polypeptides with specific binding properties.
  • Phage display technology has provided a powerful tool for generating and screening novel proteins that bind specific ligands (eg antigens). Using phage display technology, large libraries of protein variants can be generated and sequences that bind with high affinity to target antigens can be rapidly sorted.
  • a nucleic acid encoding a variant polypeptide is fused with a nucleic acid sequence encoding a viral envelope protein, for example a gene III protein or a gene VIII protein.
  • a monovalent phage display system has been developed in which a nucleic acid sequence encoding a protein or polypeptide is fused with a nucleic acid sequence encoding a portion of a gene III protein. In a monovalent phage display system, the gene fusion is expressed at low levels and the wild-type gene III protein is also expressed to maintain particle infectivity.
  • Proving the expression of peptides on the surface of filamentous phage and functional antibody fragments in the periplasm of E. coli is important for developing antibody phage display libraries.
  • Libraries of antibodies or antigen-binding polypeptides have been prepared in a number of ways, for example by altering a single gene by inserting a random DNA sequence or by cloning a family of related genes.
  • the library can be screened for expression of an antibody or antigen-binding protein accompanied by a desired characteristic.
  • Phage display technology has several advantages over conventional hybridoma and recombinant methods for producing antibodies with desired characteristics. This technique allows the generation of large antibody libraries with various sequences in a short time without using animals. The production of hybridomas or humanized antibodies may require a production period of several months. In addition, since no immunization is required, the phage antibody library can generate antibodies against antigens that are toxic or of low antigenicity. Phage antibody libraries can also be used to generate and identify novel therapeutic antibodies.
  • phage display libraries Techniques for generating human antibodies from immunized, non-immunized human, germline sequences, or na ⁇ ve B cell Ig repertoires using phage display libraries can be used.
  • a variety of lymphoid tissues can be used to prepare na ⁇ ve or non-immune antigen-binding libraries.
  • a technology capable of identifying and isolating high-affinity antibodies from phage display libraries is important for isolating novel therapeutic antibodies.
  • Isolation of high affinity antibodies from a library may depend on the size of the library, production efficiency in bacterial cells, and diversity of the library.
  • the size of the library is reduced by improper folding of the antibody or antigen-binding protein and inefficient production due to the presence of stop codons.
  • Expression in bacterial cells can be inhibited if the antibody or antigen binding domain does not fold properly.
  • Expression can be improved by alternately mutating residues on the surface of the variable/constant interface or at selected CDR residues.
  • the sequence of the framework regions is one element to provide for proper folding when generating antibody phage libraries in bacterial cells.
  • CDR3 regions have been found to often participate in antigen binding. Since the CDR3 regions on the heavy chain vary considerably in size, sequence and structural conformation, they can be used to prepare a variety of libraries.
  • Diversity can also be generated by randomizing the CDR regions of the variable heavy and light chains using all 20 amino acids at each position.
  • the use of all 20 amino acids can result in highly diverse variant antibody sequences and increase the chances of identifying novel antibodies.
  • the antibody or antibody fragment of the present invention may include not only the sequence of the anti-FGFR3 antibody of the present invention described herein, but also a biological equivalent thereof to the extent that it can specifically recognize FGFR3.
  • additional changes may be made to the amino acid sequence of an antibody to further improve the binding affinity and/or other biological properties of the antibody.
  • modifications include, for example, deletions, insertions and/or substitutions of amino acid sequence residues of the antibody.
  • amino acid variations are made based on the relative similarity of amino acid side chain substituents, such as hydrophobicity, hydrophilicity, charge, size, and the like.
  • arginine, lysine and histidine are all positively charged residues; Alanine, glycine and serine have similar sizes; It can be seen that phenylalanine, tryptophan and tyrosine have similar shapes. Therefore, based on these considerations, arginine, lysine and histidine; alanine, glycine and serine; And phenylalanine, tryptophan and tyrosine can be said to be biologically functional equivalents.
  • the antibody or nucleic acid molecule encoding the antibody of the present invention is interpreted to include a sequence showing substantial identity to the sequence set forth in SEQ ID NO:.
  • the substantial identity is at least 90% when the sequence of the present invention and any other sequences are aligned to the maximum correspondence, and the aligned sequence is analyzed using an algorithm commonly used in the art. refers to a sequence exhibiting homology, most preferably at least 95% homology, at least 96% homology, at least 97% homology, at least 98% homology, at least 99% homology.
  • Alignment methods for sequence comparison are known in the art.
  • the NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) can be accessed from NBCI, etc.
  • BLAST can be accessed at www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.
  • a method for comparing sequence homology using this program can be found at www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention is 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% compared to the specified sequence or all of the sequences described in the specification. , 99%, or more homology.
  • homology can be determined by sequence comparison and/or alignment by methods known in the art. For example, a sequence comparison algorithm (ie, BLAST or BLAST 2.0), manual alignment, or visual inspection can be used to determine the percent sequence homology of a nucleic acid or protein of the invention.
  • the present invention relates to a nucleic acid encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • An antibody or antigen-binding fragment thereof can be recombinantly produced by isolating a nucleic acid encoding an antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention.
  • Nucleic acid has a meaning comprehensively encompassing DNA (gDNA and cDNA) and RNA molecules, and nucleotides, which are the basic building blocks of nucleic acids, include natural nucleotides as well as analogues in which sugar or base regions are modified. .
  • the sequences of the nucleic acids encoding the heavy and light chain variable regions of the present invention may be modified. Such modifications include additions, deletions, or non-conservative or conservative substitutions of nucleotides.
  • DNA encoding the antibody is easily isolated or synthesized using conventional molecular biological techniques (eg, by using an oligonucleotide probe capable of specifically binding to DNA encoding the antibody and the heavy and light chains)
  • the nucleic acid is isolated and inserted into a replicable vector for further cloning (amplification of DNA) or further expression.
  • the present invention relates to a recombinant expression vector comprising the nucleic acid in another aspect.
  • the term "vector” is a means for expressing a target gene in a host cell, and a viral vector such as a plasmid vector, a cosmid vector, a bacteriophage vector, an adenoviral vector, a retroviral vector, and an adeno-associated viral vector. etc.
  • Components of a vector generally include, but are not limited to, one or more of the following: a signal sequence, an origin of replication, one or more antibiotic resistance marker genes, an enhancer element, a promoter, a transcription termination sequence. Nucleic acids encoding antibodies are operatively linked, such as promoters and transcription termination sequences.
  • operably linked refers to a functional association between a nucleic acid expression control sequence (eg, an array of promoter, signal sequence or transcriptional regulator binding sites) and another nucleic acid sequence, such that the control sequence is the other nucleic acid sequence. to regulate transcription and/or translation of a nucleic acid expression control sequence (eg, an array of promoter, signal sequence or transcriptional regulator binding sites) and another nucleic acid sequence, such that the control sequence is the other nucleic acid sequence. to regulate transcription and/or translation of a nucleic acid expression control sequence (eg, an array of promoter, signal sequence or transcriptional regulator binding sites) and another nucleic acid sequence, such that the control sequence is the other nucleic acid sequence. to regulate transcription and/or translation of a nucleic acid expression control sequence (eg, an array of promoter, signal sequence or transcriptional regulator binding sites) and another nucleic acid sequence, such that the control sequence is the other nucleic acid sequence. to regulate transcription and/or translation of
  • a strong promoter capable of propagating transcription eg, tac promoter, lac promoter, lacUV5 promoter, lpp promoter, pL ⁇ promoter, pR ⁇ promoter, rac5 promoter, amp promoter, recA promoter, SP6 promoter, trp promoter and T7 promoter
  • a ribosome binding site for initiation of translation e.g, lac promoter, lacUV5 promoter, lpp promoter, pL ⁇ promoter, pR ⁇ promoter, rac5 promoter, amp promoter, recA promoter, SP6 promoter, trp promoter and T7 promoter
  • a promoter derived from the genome of a mammalian cell eg, a metallotionine promoter, a ⁇ -actin promoter, a human heglobin promoter, and a human muscle creatine promoter
  • a mammalian cell eg, a metallotionine promoter, a ⁇ -actin promoter, a human heglobin promoter, and a human muscle creatine promoter
  • Promoters derived from animal viruses eg, adenovirus late promoter, vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter, cytomegalovirus (CMV) promoter, tk promoter of HSV, mouse mammary tumor virus (MMTV) promoter, LTR promoter of HIV , the promoter of Moloney virus, the promoter of Epstein Barr virus (EBV) and the promoter of Loose Sacoma virus (RSV)), and generally has a polyadenylation sequence as a transcription termination sequence.
  • animal viruses eg, adenovirus late promoter, vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter, cytomegalovirus (CMV) promoter, tk promoter of HSV, mouse mammary tumor virus (MMTV) promoter, LTR promoter of HIV , the promoter of Moloney virus, the promoter of Epstein Barr virus (EBV) and the promoter of Loose Sacoma virus (RSV)
  • the vector may be fused with other sequences to facilitate purification of the antibody expressed therefrom.
  • Sequences to be fused include, for example, glutathione S-transferase (Pharmacia, USA), maltose binding protein (NEB, USA), FLAG (IBI, USA) and 6x His (hexahistidine; Quiagen, USA).
  • the vector contains an antibiotic resistance gene commonly used in the art as a selection marker, for example, ampicillin, gentamicin, carbenicillin, chloramphenicol, streptomycin, kanamycin, geneticin, neomycin and tetracycline. There is a resistance gene.
  • the present invention relates to a host cell transfected with the recombinant expression vector.
  • the host cell used to produce the antibody of the invention can be, but is not limited to, a prokaryotic, yeast or higher eukaryotic cell.
  • Bacillus genus strains such as Escherichia coli, Bacillus subtilus and Bacillus thuringiensis, Streptomyces, Pseudomonas (e.g., Pseudomonas) (Pseudomonas putida), Proteus mirabilis and Staphylococcus (eg, Staphylocus carnosus), such as prokaryotic host cells can be used.
  • animal cells are of greatest interest, and examples of useful host cell lines include COS-7, BHK, CHO, CHOK1, DXB-11, DG-44, CHO/-DHFR, CV1, COS-7, HEK293, BHK, TM4, VERO, HELA, MDCK, BRL 3A, W138, Hep G2, SK-Hep, MMT, TRI, MRC 5, FS4, 3T3, RIN, A549, PC12, K562, PER.C6, SP2/0, NS-0 , U20S, or may be HT1080, but is not limited thereto.
  • the present invention comprises the steps of culturing the host cell to generate an antibody; And it relates to a method for producing an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to FGFR3, comprising the step of isolating and purifying the produced antibody.
  • the host cells may be cultured in various media. Among commercially available media, it can be used as a culture medium without limitation. All other essential supplements known to those skilled in the art may be included in appropriate concentrations. Culture conditions, such as temperature, pH, etc., are already in use with the host cells selected for expression, as will be apparent to those skilled in the art.
  • impurities may be removed by, for example, centrifugation or ultrafiltration, and the resultant product may be purified using, for example, affinity chromatography. Additional other purification techniques may be used, such as anion or cation exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography, hydroxylapatite chromatography, and the like.
  • the present invention relates to a bispecific or multispecific antibody comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • Bispecific antibody refers to an antibody having binding ability or antagonistic ability to one or more targets, and a form in which an antibody having binding ability or antagonistic ability to two different targets is bound, or an antibody having binding ability to one target and a different target It refers to an antibody to which a substance having an antagonistic ability is bound.
  • a multispecific antibody refers to an antibody having binding specificities for at least three different antigens.
  • a multi-specific antibody is a tri-specific antibody or more, for example, a tri-specific antibody, a tetra-specific antibody, or a target that targets more. may include antibodies.
  • Antibodies belonging to bispecific or multispecific antibodies may be classified into scFv-based antibodies, Fab-based antibodies, and IgG-based antibodies.
  • a bispecific or multispecific antibody since two or more signals can be simultaneously inhibited or amplified, it can be more effective than when one signal is inhibited/amplified, and each signal can be treated with a respective signal inhibitor. Compared with the case, low dose administration is possible, and it is possible to suppress/amplify two or more signals in the same time and space.
  • bispecific or multispecific antibodies Methods for making bispecific or multispecific antibodies are well known. Traditionally, recombinant production of bispecific antibodies is based on the co-expression of two or more immunoglobulin heavy/light chain pairs under conditions in which the two or more heavy chains have different specificities.
  • a diabody can be made by combining the VL and VH of different scFvs with each other to prepare a hybrid scFv in a heterodimeric form, and different scFvs are linked to each other
  • tendem ScFv can be prepared
  • heterodimeric miniantibody can be prepared by expressing CH1 and CL of Fab at the ends of each scFv, and by substituting some amino acids in the CH3 domain, which is the homodimeric domain of Fc, 'knob' It is possible to prepare a minibody in the form of a heterodimeric scFv by changing into a heterodimeric structure in the form of 'into hole' and expressing these altered CH3 domains at different ends of each scFv.
  • Fab's directed against a specific antigen can be combined with each other using a disulfide bond or a mediator to form a heterodimeric Fab, and the heavy or light chain of a specific Fab can be It can be prepared to have two antigen valencies by expressing scFvs for different antigens at the ends, or to have four antigen valencies in homodimeric form by providing a hinge region between Fab and scFv.
  • bispecific or multispecific antibodies based on IgG hybrid hybridomas, also known as quadromas, were prepared by re-crossing mouse and rat hybridomas by Trion Pharma. Thus, a method for producing a bispecific antibody is known. In addition, while sharing the light chain portion, it is possible to prepare a bispecific antibody in the so-called 'Holes and Knob' form, which is produced in a heterodimeric form by modifying some amino acids of the CH3 homodimeric domain of Fc for different heavy chains.
  • two different scFvs can be fused to the constant domains instead of the light and heavy chain variable domains of IgG to produce homodimeric (scFv)4-IgG.
  • ImClone Inc. is based on IMC-1C11, a chimeric monoclonal antibody against human VEGFR-2, and mouse platelet-derived growth factor receptor- ⁇ at the amino terminus of the light chain of this antibody. ), a bispecific antibody was produced and reported by fusion of only a single variable domain.
  • bispecific or multispecific antibodies that are bivalent, trivalent or more tetravalent.
  • WO2001/077342, WO2009/080251, WO2009/080252, WO2009/080253, WO2009/080254, WO2010/112193, WO2010/115589 also included are the bivalent, trivalent or more tetravalent antibodies described in WO2010/136172, WO2010/145792, WO2010/145793 and WO2011/117330.
  • a bivalent, trivalent or more tetravalent antibody indicates that two or more binding domains, three or more binding domains, or four or more binding domains, respectively, are present in the antibody molecule.
  • the bi- or multispecific antibody according to the present invention comprises the anti-FGFR3 antibody or antigen-binding fragment, specifically in the form of an IgG complete antibody or fragment thereof, for example, single-chain Fv, VH domain and/or VL domain, It may be included in the form of Fab or (Fab)2.
  • a bispecific antibody according to the present invention may contain FGFR3 and PD-1, PD-L1, BTLA, CTLA-4, VISTA, LAG3, TIM3, CD137(4-1BB), VISTA, CD258(LIGHT), TIGIT , CD134 (OX40), CD28, CD278 (ICOS), CD27, CD154 (CD40L), CD357 (GITR), CD30, DR3, CD226 (DNAM1), CD96, CD200, CD200R, Transferrin receptor, c-Met, EGFR, HER2 , KDR, PDGFRa, NRP1, it is possible to simultaneously target one or more selected from the group consisting of MARCO.
  • the multispecific antibody according to the present invention may contain FGFR3 and PD-1, PD-L1, BTLA, CTLA-4, VISTA, LAG3, TIM3, CD137(4-1BB), VISTA, CD258(LIGHT), TIGIT , CD134 (OX40), CD28, CD278 (ICOS), CD27, CD154 (CD40L), CD357 (GITR), CD30, DR3, CD226 (DNAM1), CD96, CD200, CD200R, Transferrin receptor, c-Met, EGFR, HER2 , KDR, PDGFRa, NRP1, it is possible to simultaneously target two or more selected from the group consisting of MARCO.
  • the present invention provides an immune cell engage bispecific or Multispecific antibodies.
  • a cytolytic synapse between a cytotoxic T cell and a cancer target cell is temporarily induced to release a toxic substance.
  • the immune cells are T cells, NK cells, cytokine-induced killer cells (CIK), activated cytotoxic T lymphocytes (CTL), macrophages, infiltrating T in tumor tissue It may be one or more selected from the group consisting of cells (Tumor-Infiltrating Lymphocytes, TIL) and dendritic cells.
  • TIL Tumor-Infiltrating Lymphocytes
  • the immune cell activating antigen may be selected from, for example, an antibody binding thereto may serve to engage immune cells:
  • T cell activating antigens include CD3, TCR ⁇ , TCR ⁇ , TCR ⁇ , TCR ⁇ , ICOS, CD28, CD27, HVEM, LIGHT, CD40, 4-1BB, OX40, DR3, GITR, CD30, TIM1, SLAM, CD2, or CD226;
  • NK cell activating antigens are NKp30, NKp40, NKp44, NKp46, NKG2D, DNAM1, DAP10, CD16 (e.g., CD16a, CD16b), CRTAM, CD27, PSGL1, CD96, CD100 (SEMA4D), NKp80, CD244 (SLAMF4 or 2B4), SLAMF6, SLAMF7, KIR2DS2, KIR2DS4, KIR3DS1, KIR2DS3, KIR2DS5, KIR2DS1, CD94, NKG2C, NKG2E or CD160;
  • CD16 e.g., CD16a, CD16b
  • CRTAM CD27, PSGL1, CD96, CD100 (SEMA4D)
  • NKp80 CD244
  • SLAMF4 or 2B4 SLAMF6, SLAMF7, KIR2DS2, KIR2DS4, KIR3DS1, KIR2DS3, KIR2DS5, KIR2DS1, CD94, NKG2
  • B cell activating antigens include OX40, CD40 or CD70;
  • Macrophage activating antigens include CD2 agonists, CD40, CD70, Toll-like Receptor (TCR) agonists, CD47, STING or OX40L; or
  • the dendritic cell activating antigen is a CD2 agonist, OX40, OX40L, 41BB agonist, TCR agonist, CD47 agonist, or STING agonist.
  • Immune cell engager is specifically described in US Patent Application Publication No. 2017/0368169, and may be incorporated herein by reference.
  • the immune cell engaging bispecific or multispecific antibody comprises a tandem scFv and is capable of binding to the following antigens and surface antigens on cancer cells.
  • the surface antigen on said cancer cells is FGFR3 targeted by the antibody according to the invention:
  • CD16 e.g., CD16a, CD16b
  • CRTAM CD27, PSGL1, CD96, CD100 (SEMA4D)
  • NKp80 CD244
  • SLAMF4 or 2B4 SLAMF7, KIR2DS2, SLAMF7, KIR2DS2 , KIR2DS4, KIR3DS1, KIR2DS3, KIR2DS5, KIR2DS1,
  • CD2 agonist CD40, CD70, TCR (Toll-like Receptor) agonist, CD47, STING or OX40L; or
  • CD2 agonist OX40, OX40L, 41BB agonist, TCR agonist, CD47 agonist, or STING agonist.
  • Said immune cell engaging bispecific or multispecific antibody can be, for example, VL(FGFR3)-VH(FGFR3)-VH(CD3 or CD16A)-VL(CD3 or CD16A), VH(FGFR3)-VL(FGFR3) )-VH(CD3 or CD16A)-VL(CD3 or CD16A), VH(CD3 or CD16A)-VL(CD3 or CD16A)-VH(FGFR3)-VL(FGFR3) or VH(CD3 or CD16A)-VL(CD3) or CD16A)-VL(FGFR3)-VH(FGFR3) type structure.
  • the scFv is, for example, a heavy chain variable region comprising at least one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 133 to SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 203 to SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 158 to SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 216 to It includes a light chain variable region comprising at least one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 219, and the heavy chain variable region and the light chain variable region may be connected by a linker.
  • the linker may be a peptide linker and may have a length of about 10-25 aa.
  • hydrophilic amino acids such as glycine and/or serine may be included.
  • the linker may include, for example, (GS)n, (GGS)n, (GSGGS)n or (GnS)m (n and m are each from 1 to 10), but the linker may include, for example, (GnS) )m (n and m are each 1 to 10).
  • the linker may include GGGGS, for example, GGGGSGGGGSGGGGS of SEQ ID NO: 185 repeated three times.
  • Examples of the immune cell engaging bispecific or multispecific antibody include blinatumomab (Amgen), which binds to CD3 and CD19; solitomab (Amgen) that binds to CD3 and EpCAM; MEDI 565 (MedImmune, Amgen) that binds to CD3 and CEA; and BAY2010112 (Bayer, Amgen) that binds to CD3 and PSMA.
  • Exemplary DARTs include MGD006 (Macrogenics) that binds CD3 and CD123; and MGD007 (Macrogenics), which binds to CD3 and gpA33.
  • Exemplary TandAbs include AFM11 (Affimed Therapeutics), which binds to CD3 and CD19; and AFM13 (Affimed Therapeutics) that binds to CD30 and CD16A.
  • ADCs Antibody-Drug Conjugates
  • the present invention relates to an antibody-drug conjugate (ADC) in which the antibody or antigen-binding fragment thereof is bound to a drug.
  • ADC antibody-drug conjugate
  • the anticancer drug In the antibody-drug conjugate, the anticancer drug must be stably bound to the antibody until the anticancer drug is delivered to the target cancer cell.
  • the drug delivered to the target must be released from the antibody to induce the death of the target cell.
  • the drug when the drug is stably bound to the antibody and released from the target cell, it must have sufficient cytotoxicity to induce the death of the target cell.
  • the antibody may be coupled to the drug via a linker.
  • the linker is a site that connects the anti-FGFR3 antibody and the drug, and allows the drug to be released from the antibody in a form that is cleavable under intracellular conditions, that is, in the intracellular environment, and reflects the long half-life of the antibody, allowing the antibody to circulate throughout the body It should be stable, and binding of the linker to the drug should not affect the stability and pharmacokinetics of the antibody.
  • the linker may include, for example, a cleavable linker or a non-cleavable linker.
  • a cleavable linker like a peptide linker, it can be cleaved by an intracellular peptidase or protease enzyme such as a lysosomal or endosomal protease, and in the case of a non-cleavable linker, e.g. a thioether linker, where the antibody is cleaved by intracellular hydrolysis.
  • the drug may be released after non-selective degradation.
  • the cleavable linker may include a peptide linker.
  • the peptide linker has a length of at least two or more amino acids.
  • dipeptides of Val-Cit, Val-Ala, or Val-Cit or Phe-Leu or Gly-Phe-Leu-Gly may be included. Examples of linkers are specifically described in WO2004/010957, which may be incorporated herein by reference.
  • the antibody-drug conjugate is encapsulated into the cancer cell through the endo-lysosomal pathway after the antibody region of the ADC binds to the antigen of the target cancer cell to form the ADC-antigen complex.
  • the intracellular release of the cytotoxic drug is regulated by the internal environment of the endosome/lysosome.
  • the cleavable linker is pH sensitive, which may be sensitive to hydrolysis at certain pH values.
  • pH sensitive linkers can be hydrolyzed under acidic conditions.
  • acid labile linkers capable of being hydrolyzed in the lysosome such as hydrazones, semicarbazones, thiosemicarbazones, cis-aconitic amides, orthoesters, acetals, ketal or the like.
  • the linker may be cleaved under reducing conditions, for example, a disulfide linker.
  • SATA N-succinimidyl-S-acetylthioacetate
  • SPDP N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionate
  • SPDB N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)butyrate
  • SMPT N-succinimidyl-oxycarbonyl) -alpha-methyl-alpha-(2-pyridyl-dithio)toluene
  • These disulfide linkers can be cleaved by disulfide exchange with thiols of intracellular glutathione.
  • the drug and/or drug-linker may be randomly conjugated via lysine of the antibody or via cysteine exposed upon reduction of a disulfide bond chain.
  • the linker-drug may be bound through a genetically engineered tag, for example, a cysteine present in a peptide or protein.
  • the genetically engineered tag for example, a peptide or protein, may include an amino acid motif that can be recognized by, for example, isoprenoid transferase.
  • the peptide or protein has a deletion at the carboxy terminus of the peptide or protein, or has an addition through a covalent bond of a spacer unit to the carboxy (C) terminus of the peptide or protein.
  • the peptide or protein may be directly covalently bonded to an amino acid motif or may be covalently bonded to a spacer unit to be linked to the amino acid motif.
  • the amino acid spacer unit is composed of 1 to 20 amino acids, and among them, a glycine unit is preferable.
  • the isoprenoid transferase may be, for example, farnesyl transferase (FTase, farnesyl protein transferase) or geranylgeranyl transferase (GGTase, geranylgeranyl transferase), and FTase and GGTase I are CAAX motif, GGTase II can recognize XXCC, XCXC or CXX motif, where C is cysteine, A is an aliphatic amino acid, and X is an amino acid that determines the substrate specificity of an isoprenoid transferase. have.
  • FTase farnesyl transferase
  • GGTase II can recognize XXCC, XCXC or CXX motif, where C is cysteine, A is an aliphatic amino acid, and X is an amino acid that determines the substrate specificity of an isoprenoid transferase. have.
  • the linker may include a beta-glucuronide linker that is recognized and hydrolyzed by beta-glucuronidase, which is present in multiple numbers in lysosomes or is overexpressed in some tumor cells.
  • beta-glucuronidase beta-glucuronidase
  • beta-glucuronide linker disclosed in International Patent Application Publication No. WO2015/182984, for example, a beta-glucuronide linker comprising a self-immolative group may be used.
  • WO2015/182984 for example, a beta-glucuronide linker comprising a self-immolative group may be used.
  • the linker may be, for example, a non-cleavable linker, and the drug is released through only one step of antibody hydrolysis in the cell, for example, to produce an amino acid-linker-drug complex.
  • This type of linker may be a thioether group or a maleimidocaproyl group, and may maintain stability in blood.
  • the linker-drug may be bound through a cysteine exposed when the disulfide bond chain of the antibody is reduced, and the linker-drug may be bound by random linkage or by introducing an antibody terminal binding peptide having the sequence GGGGGGGCVIM.
  • the drug may be bound to an antibody as an agent exhibiting a pharmacological effect, and specifically may be a chemotherapeutic agent, a toxin, micro RNA (miRNA), siRNA, shRNA or a radioactive isotope.
  • the chemotherapeutic agent may be, for example, a cytotoxic agent or an immunosuppressive agent. Specifically, it may include a microtubulin inhibitor, a mitotic inhibitor, a topoisomerase inhibitor, or a chemotherapeutic agent capable of functioning as a DNA intercalator.
  • it may include a drug for treating cancer, inflammation, or immune disease.
  • it may include an immunomodulatory compound, an anticancer agent, an antiviral agent, an antibacterial agent, an antifungal agent, an anthelmintic agent, or a combination thereof.
  • the anticancer agent is, for example, maytansinoid, auristatin (including MMAE, MMAF), aminopterin, actinomycin, bleomycin, thalisomycin, camptothecin, N8-acetyl spermidine, 1-(2 Chloroethyl)-1,2-dimethyl sulfonyl hydrazide, esperamicin, etoposide, 6-mercaptopurine, dolastatin, trichothecene, calicheamicin, taxol, taxane, paclitaxel , docetaxel, methotrexate, vincristine, vinblastine, doxorubicin, melphalan, mitomycin A, mitomycin C, chlorambucil, duocarmycin, L-asparaginase (L-asparaginase), mercaptopurine (mercaptopurine), thioguanine, hydroxyurea, cytar
  • the anti-inflammatory agent is a steroid agent that reduces inflammation or swelling by binding to a glucocorticoid receptor, a non-steroidal anti-inflammatory agent (NSAIDs) that relieves pain in response to cyclic oxygenase (COX) that synthesizes prostaglandin that causes inflammation, or activation of inflammatory cells and immuno-specific anti-inflammatory drugs (ImSAIDs) that change transport and transport, but are not limited thereto.
  • NSAIDs non-steroidal anti-inflammatory agent
  • COX cyclic oxygenase
  • ImSAIDs immuno-specific anti-inflammatory drugs
  • the therapeutic agent for the immune disease may include, but is not limited to, azathioprine, chlorambucil, cyclophosphamide, cyclosporine, mycophenolate, azathioprine, or methotrexate.
  • the immunosuppressant may include, but is not limited to, a calcineurin inhibitor tacrolimus, a gene synthesis inhibitor mycopheno late mofetil, or an anti-inflammatory steroid prednisone. .
  • the drug is an amine, thiol, hydroxyl, hydrazide, oxime, hydrazine, thiosemicarbazone, hydrazine carboxylate, capable of reacting to form a covalent bond with an electrophilic group on the linker and linker reagent; and one or more nucleophilic groups selected from the group consisting of an arylhydrazide group.
  • ADC was prepared in which the antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention was linked to a drug, for example, auristatin (MMAE) through the MC-vc-PAB linker. It was confirmed that these ADCs exhibit the desired cytotoxicity.
  • a drug for example, auristatin (MMAE)
  • MMAE auristatin
  • the present invention is a chimeric antigen receptor (CAR) comprising an extracellular domain comprising an antigen-binding site, a transmembrane domain and an intracellular signaling domain, wherein the antigen-binding site of the extracellular domain is the scFv of the antibody It relates to a chimeric antigen receptor, characterized in that.
  • CAR chimeric antigen receptor
  • Chimeric antigen receptors are synthetic constructs designed to induce an immune response against a target antigen and cells expressing the antigen.
  • the CAR comprises an extracellular domain, a transmembrane domain and an intracellular signaling domain.
  • a second-generation CAR combining a co-stimulatory domain (CD28 or CD137/4-1BB) and CD3 ⁇ was prepared to improve responsiveness to immune cells. Compared with the first-generation CAR, the number of CAR-containing immune cells remaining in the body was significantly increased.
  • the second generation CAR used one auxiliary stimulation domain, whereas the third generation CAR used two or more auxiliary stimulation domains.
  • a co-stimulatory domain can be combined with 4-1BB, CD28 or OX40, etc. to achieve expansion and persistence of immune cells containing CAR in vivo.
  • the second-generation CAR is specifically described in U.S. Patent Nos. 7,741,465, 7,446,190 or 9,212,229, and the third-generation CAR is specifically described in U.S. Patent No. 8,822,647, which is incorporated herein by reference.
  • cytokines such as IL-12 or IL-15
  • the fifth-generation CAR includes interleukins to enhance immune cells. It further comprises a receptor chain such as IL-2R ⁇ .
  • the fourth-generation CAR is specifically described in U.S. Patent No. 10,316,102, and the fifth-generation CAR is specifically described in U.S. Patent No. 10,336,810, which is incorporated herein by reference.
  • the antigen binding site of the extracellular domain is an scFv of an antibody.
  • the VH and VL domains may be linked via a linker.
  • the heavy chain variable region comprising at least one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 133 to SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 203 to SEQ ID NO: 215 is SEQ ID NO: 158 to SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 216 to SEQ ID NO: 219 through a linker It may be linked to a light chain variable region comprising one or more amino acid sequences selected from the group consisting of.
  • the linker may be a peptide linker and may have a length of about 10-25 aa.
  • hydrophilic amino acids such as glycine and/or serine may be included.
  • the linker may include, for example, (GS) n , (GGS) n , (GSGGS) n or (G n S) m (n and m are each 1 to 10), but the linker is, for example (G n S) m (n and m are each 1 to 10).
  • the linker may include GGGGS, for example, GGGGSGGGGSGGGGS of SEQ ID NO: 185 repeated three times.
  • the trans membrane domain may be derived from a natural or synthetic source. When the source is natural, the domain may be derived from any membrane bound protein or trans membrane protein.
  • the transmembrane domain is the T-cell receptor, CD28, CD3 epsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, ICOS alpha, beta or zeta chains.
  • hydrophobic residues such as leucine and valine may be included, or a peptide including phenylalanine, tryptophan, and valine may be included at each end.
  • a short oligo- or polypeptide linker of 2 to 10 amino acids in length can form a bond between the trans membrane domain and the cytoplasmic signaling domain of the CAR.
  • a glycine-serine peptide may be used as a linker.
  • the signal transduction domain can induce activation of the normal effector function of the immune cell in which the CAR is located. For example, it can induce cytolytic activation or helper activation through the secretion of cytokines.
  • the signaling domain may comprise a truncated fragment of an intracellular signaling domain sufficient to transduce an effector function signal.
  • the cytoplasm of the T cell receptor (TCR) and the co-receptor, which act in concert to initiate signal transduction after antigen receptor engagement with the signal transduction domain, may be included.
  • Primary cytoplasmic signaling sequences regulate primary activation of the TCR complex in a stimulatory or inhibitory manner.
  • Primary cytoplasmic signaling sequences that act in a stimulatory manner may contain a signaling motif known as an immunoreceptor tyrosine-based activation motif or ITAM.
  • ITAMs containing primary cytoplasmic signaling sequences may include TCR zeta, FcR gamma, FcR beta, CD3 gamma, CD3 delta, CD3 epsilon, CD5, CD22, CD79a, CD79b, and CD66d.
  • the cytoplasmic domain of the CAR may include a CD3 zeta chain portion and a costimulatory signaling region.
  • a costimulatory signaling region refers to a portion of a CAR comprising the intracellular domain of a costimulatory molecule.
  • CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, Lymphocyte Function-Related Antigen-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7- H3, and a ligand that specifically binds to CD83, and the like may be included.
  • Cytoplasmic signaling sequences within the cytoplasmic signaling portion of the CAR may be linked via a peptide linker comprising 2 to 10 amino acids, eg, glycine-serine.
  • the present invention relates to an immune cell into which the chimeric antigen receptor (CAR) is introduced.
  • CAR chimeric antigen receptor
  • the immune cells are capable of inducing immunity to induce a desired cancer therapeutic effect, for example, T cells, NK cells, cytokine-induced killer cells (CIK), activated cytotoxic T lymphocytes (Cytotoxic).
  • T Lymphocyte, CTL cytokine-induced killer cells
  • macrophages cytotoxic T lymphocytes
  • TIL tumor tissue infiltrating Lymphocytes
  • a chimeric antigen receptor (CAR) in which an scFv for an antibody other than the anti-FGFR3 antibody is included as an antigen-binding site of an extracellular domain may be additionally introduced.
  • Antibodies other than the anti-FGFR3 antibody include, for example, PD-1, PD-L1, BTLA, CTLA-4, VISTA, LAG3, TIM3, CD137 (4-1BB), VISTA, CD258 (LIGHT), TIGIT, CD134 ( OX40), CD28, CD278 (ICOS), CD27, CD154 (CD40L), CD357 (GITR), CD30, DR3, CD226 (DNAM1), CD96, CD200, CD200R, Transferrin receptor, c-Met, EGFR, HER2, KDR, It may be an antibody or antigen-binding fragment thereof targeting one or more selected from the group consisting of PDGFRa, NRP1, and MARCO.
  • the present invention relates to an endoplasmic reticulum in which an antibody or antigen-binding fragment thereof is expressed outside or is present therein.
  • the endoplasmic reticulum includes a vecyclo, a cell membrane, and an antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention that can pass through a cell membrane and directly introduce a target protein into a cell.
  • the endoplasmic reticulum according to the present invention may be in a form including a cell membrane and a target agent to be delivered.
  • An example of such an endoplasmic reticulum is specifically described in US Patent Publication No. 2018/0177725, and may be incorporated herein by reference.
  • the endoplasmic reticulum may have, for example, an average diameter of 40-500 nm, specifically 100-300 nm, 80-200 nm or 100 nm.
  • the endoplasmic reticulum may be, for example, about 100, 200, 300, 400 or 500 nm.
  • the endoplasmic reticulum may not contain other intracellular organelles such as mitochondria, lysosomes, or Golgi bodies in addition to the cell membrane and the antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention.
  • the endoplasmic reticulum can be divided into internal and external including a membrane, and the antibody or antigen-binding fragment thereof is present in the membrane and expressed to the outside, or expressed inside, or separated from the membrane and can exist inside the ER.
  • the membrane of the endoplasmic reticulum may vary depending on the target to which the antibody or antigen-binding fragment thereof is to be applied, and for delivery to cancer cells expressing FGFR3 to which the antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention binds, for example, it may be a cancer cell membrane.
  • the present invention is not limited thereto.
  • the cancer cells are, for example, Hodgkin's lymphoma, non-Hodgkin's lymphoma (eg, B-cell lymphoma, diffuse large B-cell lymphoma, follicular lymphoma, chronic lymphocytic leukemia, mantle cell lymphoma, marginal zone B-cell lymphoma, Burkitt's lymphoma) , lymphoid cell lymphoma, hairy cell leukemia), acute myeloid leukemia, chronic myelogenous leukemia, myelodysplastic syndrome, multiple myeloma, or acute lymphocytic leukemia-causing cancer cells.
  • non-Hodgkin's lymphoma eg, B-cell lymphoma, diffuse large B-cell lymphoma, follicular lymphoma, chronic lymphocytic leukemia, mantle cell lymphoma, marginal zone B-cell lymphoma, Burkitt's lymphoma
  • solid cancers such as ovarian cancer, rectal cancer, stomach cancer, testicular cancer, anal region cancer, uterine cancer, colon cancer, rectal cancer, renal cell carcinoma, liver cancer, non-small cell carcinoma of the lung, small intestine cancer, esophageal cancer, melanoma, Kaposi's sarcoma, Endocrine cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, adrenal cancer, bone cancer, pancreatic cancer, skin cancer, head and neck cancer, skin or intraocular malignant melanoma, uterine cancer, brain stem glioma, pituitary adenocarcinoma, epidermal cancer, carcinoma of the squamous cell carcinoma of the cervix, fallopian tubes Carcinoma, endometrial carcinoma, vaginal carcinoma, soft tissue sarcoma, urethral cancer, vulvar carcinoma, penile cancer, bladder cancer, kidney or ureter cancer, renal pelvic carcinoma, spinal tumor, neoplasm of central nervous system (CNS), primary C
  • glioblastoma lung cancer, bladder cancer, oral cancer, head and neck squamous cell cancer, gallbladder cancer or cervical cancer causing cancer cells.
  • the endoplasmic reticulum may be, for example, an exosome.
  • the exosome refers to a small vesicle having a membrane structure with a size of 50 - 200 nm that is secreted out of the cell with proteins, DNA, RNA, etc. for signal transduction between cells.
  • Exosomes contain various proteins, DNA, RNA, etc. in the cell. Substances contained in these exosomes and secreted out of the cell are re-introduced into other cells by fusion or endocytosis with the cell membrane and serve as a communicator between cells. In addition, it can be used to diagnose a specific disease by analyzing the substances contained in the exosome and secreted out of the cell.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof is expressed outside the exosome or is present therein.
  • the exosome has a membrane structure, so that the inside and outside can be distinguished, and the antibody or antigen-binding fragment thereof exists in the exosome membrane and is expressed to the outside, expressed inside, or separated from the membrane and exo It may exist in some.
  • exosomes are loaded with specific drugs on artificial exosomes derived from immune cells/stem cells having various targeting properties and targeted and delivered to desired lesion tissues in the human body. It may also be in a form that can maximize therapeutic efficacy, and is specifically described in, for example, International Patent Publication No. WO2011/002239, which is incorporated herein by reference.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof When the antibody or antigen-binding fragment thereof is present in the exosome membrane and expressed externally or internally, the antibody or antigen-binding fragment thereof is expressed in a form fused to an exosome-specific marker, and the antibody or Its antigen-binding fragment can be captured.
  • the exosome membrane is fused to the cell membrane of a cell in which FGFR3 is expressed, the antibody or antigen-binding fragment thereof may be delivered to the cell.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof may be displayed on the surface of the exosome.
  • a PTGFRN Prostaglandin F2 Receptor Negative Regularator
  • another target protein may be fused to the PTGFRN protein.
  • exosomes containing the antibody or antigen-binding fragment thereof it can be prepared by temporarily binding the antibody or antigen-binding fragment thereof with the marker protein using a photospecific binding protein.
  • the target protein may be trapped inside the exosome in a state in which it is not bound to the membrane.
  • the exosome When the exosome is delivered into the cell by internalization, the exosome may be degraded and the antibody or antigen-binding fragment thereof may be delivered to the cell.
  • photospecific binding proteins CIBN and CRY2 may be used, and specifically, the CIBN is expressed in a fused form with CD9, one of the marker proteins, and the CRY2 is the antibody or antigen-binding fragment thereof. Genes encoding these fusion proteins can be introduced into exosome-producing cells so that they are expressed in a fused form.
  • the CIBN-CD9 fusion protein expressed in the exosome-producing cells is included in the exosome due to CD9.
  • the target protein expressed in the exosome-producing cells-CRY2 fusion protein Since the CRY2 domain of CRY2 is bound to the CIBN domain fused to CD9, a reversibly induced fusion protein in the form of the target protein-CRY2-CIBN-CD9 is formed, and such a fusion protein can be included in the exosome due to CD9.
  • the exosome containing the target protein is produced, if the blue LED light is no longer irradiated, the CIBN-CRY2 binding is released, and the target protein is not bound to the cell membrane of the exosome. can be included inside.
  • the present invention provides an antibody or antigen-binding fragment thereof, a bi- or multispecific antibody comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof, an antibody-drug conjugate comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof, the antibody or It relates to a composition for treating cancer, inflammation or an immune disease, comprising a chimeric antigen receptor comprising an antigen-binding fragment thereof or an immune cell comprising the chimeric antigen receptor.
  • the present invention includes, for example, (a) an antibody or antigen-binding fragment thereof against FGFR3 according to the present invention, a bi- or multispecific antibody comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof, the antibody or antigen-binding fragment thereof a pharmaceutically effective amount of an antibody-drug conjugate, a chimeric antigen receptor comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof, or an immune cell comprising the chimeric antigen receptor; And (b) it may be a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of cancer comprising a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the present invention also provides an antibody or antigen-binding fragment thereof against FGFR3 according to the present invention, a bi- or multispecific antibody comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof, and an antibody-drug conjugate comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof , It may be a method for preventing or treating cancer comprising administering to a cancer patient a chimeric antigen receptor comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof or an immune cell comprising the chimeric antigen receptor.
  • Prevention means any action that inhibits the growth or delays the progression of cancer by administration of the composition according to the present invention
  • treatment means inhibition of cancer development, alleviation of tumor or elimination of cancer.
  • the cancer is, for example, Hodgkin's lymphoma, non-Hodgkin's lymphoma (eg, B-cell lymphoma, diffuse large B-cell lymphoma, follicular lymphoma, chronic lymphocytic leukemia, mantle cell lymphoma, marginal area B-cell lymphoma, Burkitt's lymphoma) , lymphoid cell lymphoma, hairy cell leukemia), acute myeloid leukemia, chronic myelogenous leukemia, myelodysplastic syndrome, multiple myeloma, or acute lymphocytic leukemia.
  • non-Hodgkin's lymphoma eg, B-cell lymphoma, diffuse large B-cell lymphoma, follicular lymphoma, chronic lymphocytic leukemia, mantle cell lymphoma, marginal area B-cell lymphoma, Burkitt's lymphoma
  • Said cancer is, for example, ovarian cancer, rectal cancer, stomach cancer, testicular cancer, anal region cancer, uterine cancer, colon cancer, rectal cancer, renal cell carcinoma, liver cancer, non-small cell carcinoma of the lung, small intestine cancer, esophageal cancer, melanoma, Kaposi's sarcoma, Endocrine cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, adrenal cancer, bone cancer, pancreatic cancer, skin cancer, head and neck cancer, skin or intraocular malignant melanoma, uterine cancer, brain stem glioma, pituitary adenocarcinoma, epidermal cancer, carcinoma of the squamous cell carcinoma of the cervix, fallopian tubes Carcinoma, endometrial carcinoma, vaginal carcinoma, soft tissue sarcoma, urethral cancer, vulvar carcinoma, penile cancer, bladder cancer, kidney or ureter cancer, renal pelvic carcinoma, spinal tumor, neoplasm of central nervous system (CNS
  • the cancer may be, for example, glioblastoma, lung cancer, bladder cancer, oral cancer, head and neck squamous cell cancer, gallbladder cancer or cervical cancer.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof is a barrier formed by a tight junction in the capillary endothelial cell membrane of the brain that exists between the brain and spine and the surrounding circulatory system, the blood-brain barrier (blood-brain barrier). barrier) needs to be passed. It can be used in conjunction with a transporter to cross the BBB.
  • a method of disrupting the osmotic pressure of the BBB by using a method such as bradkinin or HIFU (Hign density fucues ultrasound). It may also include the use of delivery systems such as receptor-mediated transcytosis of glucose and amino acid transporters, insulin or transferrin, or blocking the active efflux transporter of glycoproteins in cells.
  • a method such as bradkinin or HIFU (Hign density fucues ultrasound). It may also include the use of delivery systems such as receptor-mediated transcytosis of glucose and amino acid transporters, insulin or transferrin, or blocking the active efflux transporter of glycoproteins in cells.
  • the inflammation is, for example, chronic obstructive pulmonary disease, chronic digestive disorder, conjunctivitis, otitis, allergic rhinitis, gingivitis, tongue needles, bronchitis, gastroesophageal reflux disease (GERD), esophagitis, gastritis, enteritis, peptic ulcer, inflammatory bowel disease. disease (IBD), Crohn's disease, irritable bowel syndrome (IBS), enteritis or allergy, urethritis, cystitis, vaginitis, proctitis, eosinophilic gastroenteritis, or rheumatoid arthritis, but is not limited thereto.
  • the immune disease may be, for example, acquired immunodeficiency, autoimmune disease, systemic lupus erythematosus, scleroderma, Sjogren's syndrome, polymyositis and dermatomyositis, polymyalgia rheumatica, temporal arteritis, polyarteritis nodosa, or Behcet's syndrome, and the like.
  • compositions of the present invention are commonly used in formulation, and include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia gum, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate. , microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, and mineral oil.
  • the composition of the present invention may further include a lubricant, a wetting agent, a sweetening agent, a flavoring agent, an emulsifying agent, a suspending agent, a preservative, and the like, in addition to the above components.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally, and in the case of parenteral administration, intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, endothelial administration, topical administration, intranasal administration, intrapulmonary administration and rectal administration etc. can be administered.
  • parenteral administration intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, endothelial administration, topical administration, intranasal administration, intrapulmonary administration and rectal administration etc. can be administered.
  • the protein or peptide When administered orally, the protein or peptide is digestible and therefore oral compositions should be formulated to coat the active agent or to protect it from degradation in the stomach.
  • the pharmaceutical composition may be administered by any device capable of transporting the active agent to a target cell.
  • a suitable dosage of the composition according to the present invention varies depending on factors such as formulation method, administration mode, age, weight, sex, pathological condition, food, administration time, administration route, excretion rate and reaction sensitivity of the patient, usually Thus, a skilled physician can easily determine and prescribe an effective dosage for the desired treatment or prevention.
  • the daily dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is 0.0001-100 mg/kg.
  • the term “pharmaceutically effective amount” refers to an amount sufficient to prevent or treat cancer or autoimmune disease.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is prepared in unit dosage form by formulating using a pharmaceutically acceptable carrier and/or excipient according to a method that can be easily carried out by a person of ordinary skill in the art to which the present invention pertains. or may be prepared by incorporation into a multi-dose container.
  • the formulation may be in the form of a solution, suspension, or emulsion in oil or aqueous medium, or may be in the form of an extract, powder, suppository, powder, granule, tablet, or capsule, and may additionally include a dispersant or stabilizer.
  • the present invention relates to a composition for combination therapy comprising an immune cell and a drug other than an anti-FGFR3 antibody.
  • the drug other than the anti-FGFR3 antibody may include a chemotherapeutic agent or an antibody other than the anti-FGFR3 antibody.
  • drugs include maytansinoids, auristatin (including MMAE, MMAF), aminopterin, actinomycin, bleomycin, thalisomycin, camptothecin, N8-acetyl spermidine, 1-(2 chloroethyl)- 1,2-dimethyl sulfonyl hydrazide, esperamicin, etoposide, 6-mercaptopurine, dolastatin, tricotecene, calicheamicin, taxol, taxane, paclitaxel, docetaxel ), methotrexate, vincristine, vinblastine, doxorubicin, melphalan, mitomycin A, mitomycin C, chlorambucil, duocarmycin, L-asparaginase (L-asparaginase), mercaptopurine, Thioguanine, hydroxyurea, cytarabine, cyclophosphamide, ifosf
  • the antibody other than the anti-FGFR3 antibody is, for example, PD-1, PD-L1, BTLA, CTLA-4, VISTA, LAG3, TIM3, CD137 (4-1BB), VISTA, CD258 (LIGHT). ), TIGIT, CD134 (OX40), CD28, CD278 (ICOS), CD27, CD154 (CD40L), CD357 (GITR), CD30, DR3, CD226 (DNAM1), CD96, CD200, CD200R, Transferrin receptor, c-Met, It may be an antibody or antigen-binding fragment thereof that targets at least one selected from the group consisting of EGFR, HER2, KDR, PDGFRa, NRP1, and MARCO.
  • the present invention relates to a composition for combination therapy comprising an antibody or antigen-binding fragment thereof and at least one selected from the group consisting of the following.
  • immune cells comprising an antigen receptor (CAR) comprising an scFv for an antibody other than an anti-FGFR3 antibody as an extracellular domain; and
  • CAR antigen receptor
  • composition for combination therapy comprising the above immune cell engaging bispecific or multispecific antibody and at least one selected from the group consisting of:
  • immune cells comprising an antigen receptor (CAR) comprising an scFv fragment for an antibody other than an anti-FGFR3 antibody as an extracellular domain; and
  • CAR antigen receptor
  • the immune cells may induce a desired cancer therapeutic effect by inducing immune treatment, for example, immunity, for example, T cells, NK cells, cytokine-induced killer cells (Cytokine Induced Killer cells, CIK), activated cells Cytotoxic T lymphocytes (CTL), macrophages, tumor tissue infiltrating T cells (Tumor-Infiltrating Lymphocytes, TIL), may be selected from the group consisting of dendritic cells, but is not limited thereto.
  • immunity for example, T cells, NK cells, cytokine-induced killer cells (Cytokine Induced Killer cells, CIK), activated cells Cytotoxic T lymphocytes (CTL), macrophages, tumor tissue infiltrating T cells (Tumor-Infiltrating Lymphocytes, TIL)
  • TIL tumor tissue infiltrating Lymphocytes
  • the antibody other than the anti-FGFR3 antibody is an antibody that targets a target other than FGFR3, for example, LAG3, TIM3, CD137 (4-1BB), VISTA, CD258 (LIGHT), TIGIT, CD134 (OX40), CD28, CD278 (ICOS), CD27, CD154 (CD40L), CD357 (GITR), CD30, DR3, CD226 (DNAM1), CD96, CD200, CD200R, Transferrin receptor, c-Met, EGFR, HER2, KDR, PDGFRa, NRP1, or MARCO It may be an antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to, but is not limited thereto.
  • the present invention relates to a composition for combination therapy comprising an antibody or antigen-binding fragment thereof and at least one selected from the group consisting of the following.
  • immune cells comprising an antigen receptor (CAR) comprising an scFv for an antibody other than an anti-FGFR3 antibody as an extracellular domain; and
  • CAR antigen receptor
  • composition for combination therapy comprising the above immune cell engaging bispecific or multispecific antibody and at least one selected from the group consisting of:
  • immune cells comprising an antigen receptor (CAR) comprising an scFv fragment for an antibody other than an anti-FGFR3 antibody as an extracellular domain; and
  • CAR antigen receptor
  • the immune cells may induce a desired cancer therapeutic effect by inducing immune treatment, for example, immunity, for example, T cells, NK cells, cytokine-induced killer cells (Cytokine Induced Killer cells, CIK), activated cells Cytotoxic T lymphocytes (CTL), macrophages, tumor tissue infiltrating T cells (Tumor-Infiltrating Lymphocytes, TIL), may be selected from the group consisting of dendritic cells, but is not limited thereto.
  • immunity for example, T cells, NK cells, cytokine-induced killer cells (Cytokine Induced Killer cells, CIK), activated cells Cytotoxic T lymphocytes (CTL), macrophages, tumor tissue infiltrating T cells (Tumor-Infiltrating Lymphocytes, TIL)
  • TIL tumor tissue infiltrating Lymphocytes
  • the antibody other than the anti-FGFR3 antibody is an antibody that targets a target other than FGFR3, for example, LAG3, TIM3, CD137 (4-1BB), VISTA, CD258 (LIGHT), TIGIT, CD134 (OX40), CD28, CD278 (ICOS), CD27, CD154 (CD40L), CD357 (GITR), CD30, DR3, CD226 (DNAM1), CD96, CD200, CD200R, Transferrin receptor, c-Met, EGFR, HER2, KDR, PDGFRa, NRP1 , or may be an antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to MARCO, but is not limited thereto.
  • the immune checkpoint inhibitor refers to an agent capable of inducing T cell activation by blocking the T cell suppression signal at a site where antigen presenting cells (APCs) and immune cells, for example, T cells meet.
  • the immune checkpoint inhibitor is, for example, PD-1, PD-L1, BTLA, CTLA-4, VISTA, LAG3, TIM3, CD137 (4-1BB), CD258 (LIGHT), TIGIT, CD134 (OX40), CD28, It may be a drug targeting CD278 (ICOS), CD27, CD154 (CD40L), CD357 (GITR), CD30, DR3, CD226 (DNAM1), CD96, CD200, or CD200R, but is not limited thereto.
  • Each of the first component and the second component to be administered in combination may be administered simultaneously.
  • each of the first component and the second component to be administered in combination may be administered separately at a predetermined time interval.
  • the second component may be separately administered before or after administration of the first component among the subject of the combined administration.
  • Companion diagnostics is a type of molecular diagnostic technique for predicting the patient's responsiveness to a specific drug treatment. Considering the sensitivity, it is possible to present a standard that allows the treatment of a drug suitable for the patient.
  • the fusion gene of FGFR3 and TACC3 is amplified, there is a mutation in the fusion gene, the fusion gene is overexpressed, or the fusion gene is always expressed (constitutive activation) for treating cancer identified as, An antibody or antigen-binding fragment thereof, a dual or multispecific antibody comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof, an antibody-drug conjugate, a chimeric antigen receptor or a composition for cancer treatment comprising immune cells comprising the chimeric antigen receptor is about
  • the present invention also provides that the fusion gene of FGFR3 and TACC3 is amplified in a patient-derived sample, there is a mutation in the fusion gene, the fusion gene is overexpressed, or when it is confirmed that the fusion gene is always expressed (constitutive activation), the antibody or A cancer treatment method comprising administering an antigen-binding fragment thereof, a bi- or multispecific antibody comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof, an antibody-drug conjugate, a chimeric antigen receptor, or an immune cell comprising the chimeric antigen receptor is about
  • the sample refers to a biological subject obtained from a tissue or body fluid of a patient.
  • Sources of tissue samples include solid tissue, such as those derived from frozen and/or preserved organs, tissue samples, biopsies, or aspirates; blood or any blood component (eg, serum, plasma); bone marrow or any component of bone marrow; It can be body fluids such as urine, cerebrospinal fluid, whole blood, plasma and serum.
  • a sample may comprise a non-cellular fraction (eg, urine, plasma, serum or other non-cellular body fluid).
  • a sample may include a bodily fluid, such as blood (eg, whole blood).
  • the sample may be a whole blood sample, a whole bone marrow sample, a whole peripheral blood sample, or a whole tumor sample obtained from a patient.
  • the "pre" sample is a sample that is substantially free of components (eg, cells) that have been removed or isolated from the sample.
  • the sample eg, a blood sample
  • a “pre” sample such as a whole tissue sample or a whole tumor sample, substantially retains the microenvironment from the tissue of origin, eg, may substantially retain the structure of the tumor or immune microenvironment.
  • a sample, such as a tumor sample can be processed (eg, triturated, minced, blended, milled, etc.) into smaller pieces and diluted (eg, with a physiologically compatible buffer or medium).
  • Confirmation of expression of the gene is a process of confirming the presence and level of expression of the gene, and may be performed by polymerase chain reaction (PCR), and in some cases transcription polymerase reaction (RT-PCR), competitive reverse transcription polymerization Competitive RT-PCR, Real-time RT-PCR, RNase protection assay (RPA), Northern blotting, can be performed using a DNA chip.
  • PCR polymerase chain reaction
  • RT-PCR transcription polymerase reaction
  • RPA RNase protection assay
  • Northern blotting can be performed using a DNA chip.
  • PCR Polymerase chain reaction
  • Multiplex PCR real-time PCR, differential display PCR (DD-PCR), rapid amplification of cDNA ends (RACE), inverse polymerase chain reaction chain reaction: IPCR), vectorette PCR, and thermal asymmetric interlaced PCR (TAIL-PCR) may be performed.
  • DD-PCR differential display PCR
  • RACE rapid amplification of cDNA ends
  • IPCR inverse polymerase chain reaction chain reaction chain reaction
  • TAIL-PCR thermal asymmetric interlaced PCR
  • Immunoelectrophoresis tissue immunostaining, Immunoprecipitation Assay, Complement Fixation Assay, Fluorescence Activated Cell Sorter (FACS), a method using a protein chip, etc. may be included. .
  • Example 1 Selection of phage antibodies specific for FGFR3, cell panning (phage display technology)
  • FGFR3 overexpressing cells (682T) and FGFR3 underexpressing cells (626T) were verified through RPKM analysis values and protein expression confirmation through western blotting, and the corresponding cells were selected.
  • the previously recovered phage library stock was treated with FGFR3 low-expressing cells and allowed to react at 4°C for 1 hour, then only the supernatant was recovered through a centrifuge and treated with FGFR3 overexpressing cells prepared in advance, followed by reaction at 4°C for 1 hour.
  • the non-specific phage was removed through the culture medium and cultured at 37°C for 30 minutes to recover the cell-internalized antibody.
  • the recovery method is to remove non-specific cell surface binding phage by washing with low pH buffer and then lysing the cells through lysis buffer to recover the antibody with cell internalization function through FGFR3-specific binding inside the cell. infected with .coli. Infected e.coli was amplified again, and the same cell panning method was additionally performed twice, and cell panning was performed three times in total, followed by ELISA screening to select FGFR3-specific antibodies. A schematic diagram of the experiment is shown in [Fig. 1a].
  • Example 2 Selection of phage antibodies specific for FGFR3, antigen immobilization panning (phage display technology)
  • FGFR3-IIIc/Fc antigen and negative/Fc antigen were coated on the immune-tube with 3ug/ml each (overnight, 4 degrees), and the recovered phage library stock was first reacted with pre-blocked negative/Fc antigen at room temperature for 1 hour. . After that, the supernatant was recovered and reacted in a pre-blocked FGFR3-IIIc/Fc tube at room temperature for 1 hour. After removing non-specific phages through washing with PBST, phages specific for FGFR3-lllc/Fc antigen were recovered through a low pH buffer.
  • Example 3 Selection of phage antibodies specific for FGFR3, magnetic bead panning; Semi-automated panning (phage display technology)
  • Magnetic beads-based panning which is a method that processes phage to the biotinylated target antigen in a manual method that has been conventionally used, undergoes a binding process, and then washes and recovers antigen-specific phage using a column or magnetic chamber.
  • the present inventors proceeded by introducing this series of processes into a semi-automated system.
  • Reagents such as phage library stock, biotinylated FGFR3-IIIc/Fc antigen, streptavidin-M280 dynabeads, 0.1% PBST wash buffer, and elution buffer are dispensed into Kingfisher Flex (Thermo scientific) instrument in Kingfisher Flex 24 deep wells and pre-made software Bio-panning was performed through the protocol (BindItTM Software) [Fig. 1d].
  • the phage that specifically binds to the FGFR3 antigen was amplified and recovered by repeating bio-panning 3 to 4 times. Using this, ELISA screening was performed to select FGFR3-specific antibodies.
  • each bio-panning method is the e.coli host cell (TG1) state, which was obtained by smearing them on Agar LB/Ampicillin medium as a single clone, and optionally inoculated into SB/ampicillin culture medium and cultured (3 hours, 37 hours). do). Then, for induction of scFv-pIII protein, each well was treated with IPTG at a final concentration of 1 mM and cultured at 30°C overnight.
  • TG1 e.coli host cell
  • 1x TES solution 20% w/v sucrose, 50 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0
  • the scFv-pIII protein present in the periplasmic region of e. coli was extracted by additionally treating with 0.2x TES solution and suspending for more than 2 hours.
  • each plate was treated with scFv-pIII extracted from FGFR3 recombinant protein and negative recombinant protein in a 96-well plate at 1 ug/ml overnight, at 4°C, and reacted at room temperature for 1 hour. After the reaction, washing was carried out through PBST, and the HRP-conjugated anti-HA antibody was treated for 1 hour and then washed again to induce a color reaction (TMB substrate) to measure the O.D value (450 nm).
  • TMB substrate color reaction
  • FGFR3-specific scFv-pIII clones were selected. Selection criteria were converted into relative ratios (positive / negative), and antibody sequence analysis was performed on clones with values of 2 or more.
  • ELISA screening was performed by taking 564 single clones for the completed output phages, and 10 positive clones were identified among them [Fig. 2a].
  • ELISA screening was performed for each 658 single clones in two separate experiments (a total of 1,316), and 328 positive clones were identified among them [Fig. 2b]. After the magnetic-based semi-automatic bio-panning was completed, 376 clones were screened by ELISA, and 26 positive clones were identified [Fig. 2c].
  • an IgG production vector was constructed by cloning into the heavy chain production vector and light chain production vector owned by our research team. Based on the constructed production vector, FGFR3 antibody was produced using the mammalian protein expression system (Expi293F), and high-purity antibody was recovered and purified using MabSelect SuReTM, an affinity chromatography column, based on AKTA prime plus equipment. The finished sample was analyzed for high-purity sample characteristics based on SDS-PAGE and size-exclusion chromatography HPLC (SEC-HPLC) analysis ( FIGS. 3a and 3b ).
  • Example 7 Evaluation of antigen binding ability of FGFR3 antibody; ELISA
  • Affinity ELISA was performed to confirm the binding ability of the produced antibody (IgG) to the FGFR3 antigen.
  • a 96-well plate was coated with FGFR3 antigen at 1 to 2 ug/ml (4 degrees, overnight), followed by blocking with 3% skim milk (PBS) (room temperature, 1 hour). After that, the previously serially diluted antibody samples were treated with duplicate and triplicate and reacted at room temperature for 1 hour. After washing with PBST 2-3 times, the HRP-conjugated anti-human Fab antibody was diluted in skim milk and treated (room temperature, 1 hour), washed again with PBST, and a color reaction (TMB substrate) was performed. . Then, the value was confirmed by measuring with O.D 450nm.
  • SPR analysis was performed to evaluate the binding ability of the produced antibody (IgG) to the FGFR3 subtype and subfamily.
  • the SRP-based affinity measurement of the FGFR3 antibody candidates for the FGFR3 antigen was performed using a Biacore-T200 instrument.
  • the same antigens as described in ELISA binding capacity were directly immobilized on a CM5 biosensor chip through amine coupling to achieve approximately 300RU.
  • Serial dilutions at a concentration of approximately 20 nM were sequentially injected (25 degrees) at a flow rate of 30 ug/min for a binding time of 180 seconds, and then the separation step was performed at the same flow rate for 180 seconds.
  • the CM5 biosensor chip was regenerated by injecting 10 mM glycine-HCl as buffer between each injection. Association rates and dissociation rates were calculated using a one-to-one Langmuir association model. The equilibrium dissociation constant (KD) was calculated as the ratio Koff/Kon. (Fig. 5, Table 6)
  • Example 9 FGFR3 protein expression level confirmation; Western blotting, FACS analysis
  • 682T and 526T patient-derived cells were identified as FGFR3-overexpressing cells.
  • 626T and 559T were confirmed to have little FGFR3 expression.
  • the same pattern was verified in the FACS results.
  • 682T cells are considered to have a very high level of FGFR3 expression on the cell surface (FIG. 6a).
  • FGFR3 was overexpressed, amplified, mutated, and fused in various carcinomas. Among them, it has been reported that patients with FGFR3-TACC3 fusion have poor prognosis in bladder cancer and brain tumors. Therefore, the treatment for this has the potential to overcome the unmet medical demand. Therefore, in the present invention, patient-derived cells were grouped based on FGFR3-TACC3 fusion analysis, and this was confirmed using RT-PCR technique. After proliferating patient-derived cells GBM15-682T, GBM14-526T, BT16-1154T, GBM14-606T, and NS10-783T through subculture, a certain amount was recovered and RNA was extracted using RNeasy Mini Kit (Qiagen).
  • RT-PCR Superscript IV Reverse transcriptase was performed to synthesize cDNA.
  • the fusion site studied was confirmed using the UCSC genome browser and primers were prepared to recognize the FGFR3-TACC3-specific region (FW: 5'-TGATCATGCGGGAGTGCTG-3', RV: 5'-CTCCTCACACCTGCTCCTC-3'). It was confirmed whether the FGFR3-TACC3 fusion-specific region was amplified through PCR experiments on cDNA using the prepared primer. At the same time, GAPDH was also confirmed as a control.
  • GBM15-682T, GBM14-526T, and BT16-1154T were confirmed as FGFR3-TACC3 fusion (PCR expected size, 400 ⁇ 500bp).
  • GBM15-682T and GBM14-526T are expected to be the same fusion
  • BT16-1154T is expected to be a different fusion [Fig. 6b].
  • the characteristics and anticancer effects of additional FGFR3 antibody clones were analyzed based on FGFR3-TACC3 fusion brain tumor patient-derived cells.
  • FACS analysis was performed to confirm the binding ability of the excavated antibody to the FGFR3-TACC3 overexpressing patient-derived cells identified in the present invention.
  • Each cell was divided into 3.0-5.0E+05 cells/tube, and after performing a washing (PBS) step, 100-200 nM of the excavated antibody was treated at 4 degrees. After that, after removing the non-adhered antibody sample through the same washing method, the antibody attached to the cell surface was treated with anti-human alexa-488 conjugate (Catalog # A-11013, Invitrogen) antibody to BD FACSAriaTM III (BD Biosciences). ) to confirm cell surface binding ability.
  • the excavated antibodies showed cell-binding ability of different affinities (FIG. 7a).
  • the cell surface binding ability according to the concentration was analyzed for the F309 clone under the same conditions, and it was confirmed that the cell surface binding ability was proportional to the concentration, thereby verifying the presence of the FGFR3-specific binding ability ( FIG. 7b ). For the cell line in which FGFR3 was not expressed, it was further confirmed that there was no binding (Fig. 7c).
  • Example 12 Evaluation of target resolution of FGFR3 antibody; FACS
  • FGFR3 target resolution of the candidate antibodies discovered in the present invention was screened through FACS.
  • GBM15-682T patient-derived cells which are FGFR3-overexpressing cells, were subcultured and seeded at 3.0E+05 cells/tube, and each candidate antibody was treated with 40ug/ml (2 hours, 37°C).
  • FGFR3-PE FAB766P, R&D
  • BD FACSAriaTM III BD Biosciences
  • Comparative analysis was performed based on the geomean value compared to the IgG control.
  • the cell surface FGFR3 decomposition ability of the excavated antibody according to time was confirmed by treating the antibody for each hour (4 hours, 2 hours, 1 hour, 30 minutes, 15 minutes). The same was done in the KMS11 cell line.
  • FGFR3 consists of three domains, each domain (FGFR3 Ig domain I, domain II, domain III) is attached with an Fc tag to analyze the FGFR3 binding domain of the excavated antibody.
  • purified Fig. 9c. Analysis of the binding capacity of the antibody to the purified domain was performed in the same manner as the ELISA described above, and after coating at 1 ug/ml, the antibody was treated and measured by inducing a TMB color reaction. F309 and FS306 clones were confirmed to specifically bind to FGFR3 domain 1 ( FIG. 9b ).
  • Comparative antibodies B701 (Vofatamab, Rainier Therapeutics) and D11 (LY3076226, Eli Lilly) were confirmed to bind between domains 2 and 3 as reported in the literature. However, the epitope of the comparative antibody is included in domain 2, which was performed in the present invention. In addition, it has been reported that ligands such as FGFR3, FGF1, and FGF9 bind to Ig domain II and domain III of FGFR3. Based on this, competition ELISA assay was performed. As a result, the B701 and D11 antibodies were observed to bind to FGFR3 competitively with the FGF ligand as expected, whereas the F309 antibody was observed to bind to FGFR3 regardless of the FGF ligand. This can be judged as supporting evidence for binding to the aforementioned FGFR3 Ig domain I. (Fig. 9a)
  • Example 14 Evaluation of target resolution of FGFR3 antibody; Western blotting
  • GBM15-682T patient-derived cells were used as representative cells similar to the FACS method.
  • 2.0E+06 cells/well were aliquoted into cells in a 6-well plate, and each antibody was treated at a concentration of 30ug/ml and reacted at 37°C for 3 hours. After that, lysate was prepared and 20 ⁇ g of each sample was counted through Bradford quantitation, and western blotting was performed. Total FGFR3 was observed with the sc-13121 antibody. In the KMS11 cell line, the experiment was performed with the same concentration and reaction conditions. As with the FACS results, it was confirmed that the overall FGFR3 resolution of the F309 and FS306 clones was excellent. (Fig. 10b)
  • the cell internalization mechanism of the antibody was further verified through the ICC method.
  • GBM15-682T was used as the FGFR3 overexpressing cell
  • U87MG was used as the underexpressing cell.
  • PLO reagent was coated in advance and the cells were cultured thereon.
  • U87MG the adherent cells were processed without PLO treatment.
  • each antibody was treated with 30ug/ml to the cells attached to the ICC slide and reacted at 37°C for 2 hours. Cell internalization inactivation conditions were reacted at the same concentration at 4 degrees for 2 hours.
  • washing was carried out and fixed with 2% PFA (10 minutes, 4 degrees). The same washing method was performed once more, and 0.1% Triton-X was reacted for 3 min at room temperature to permeate the cells and wash again. Then, blocking was performed with 1% BSA at room temperature for 30 minutes, and the primary antibody was treated overnight at 4°C.
  • the primary antibody the lysosomal marker LAMP-1 antibody and anti-human IgG were used.
  • washing was carried out, and the secondary antibody was reacted for 1 hour at 4 degrees under light-shielded conditions.
  • an antibody with fluorescence that probed the primary antibody was used (Alexa 488; Anti-human LAMP1, Alexa 594; Anti-human IgG).
  • Example 16 Target degradation mechanism of FGFR3 antibody; Antibody Mechanism Analysis Through Lysosomal Inhibition
  • a lysosomal inhibitor in order to identify the mechanism of degradation of the FGFR3 target of the excavated antibody described above, verification was performed using a lysosomal inhibitor.
  • an antibody binds to a specific antigen on the cell surface, receptor mediated endocytosis and a mechanism in which the receptor and antibody are both degraded in lysosomes have been reported. Therefore, among the FGFR3 antibodies, the degradation in the lysosome of the antibodies whose FGFR3 resolution was confirmed was verified, and the total FGFR3 levels of the lysosomal inhibitor-treated and untreated samples were confirmed through western blotting.
  • GBM15-682T was dispensed in a 6-well plate at 1.5E+06 cells/well, and Concanamycin, known as a lysosomal inhibitor, was treated at a concentration of 100 nM for 2 hours at 37°C.
  • Concanamycin known as a lysosomal inhibitor
  • DMSO was treated.
  • the antibody was treated at 37°C for 3 hours at 30 ug/ml, respectively.
  • the total FGFR3 level was confirmed by proceeding in the same manner as the western blotting method described above.
  • the total FGFR3 was not reduced even when the F309 and FS306 clones were treated, and the total FGFR3 was significantly decreased in the untreated condition. It is thought to be degraded together with FGFR3 in (Fig. 11b)
  • Example 17 Signaling pathway inhibition assay; Western blotting
  • Example 18 Cancer cell growth inhibitory ability assay; Ligand-dependent environment
  • GBM15-682T was dispensed at 10000 cells/well in a serum-free condition in a 96-well black-flat bottom plate, and after starvation for one day, the ligand FGF1 (232-FA, R&D) and FGF9 (273-F9, R&D) were treated to a final concentration of 50 ng/ml, and the antibody was also serially diluted and treated for each concentration. After that, culture was performed in a 37 degree CO2 incubator for 7 days.
  • the ability of the antibody to inhibit cancer cell growth in a ligand-independent environment was evaluated.
  • GBM15-682T patient-derived cells were dispensed in a 96-well black-flat bottom plate at 10000 cells/well, and the antibody was serially diluted and treated by concentration. After that, culture was performed in a 37 degree CO2 incubator for 7 days. Cell growth was measured through CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay, and the cell growth of the antibody-treated group compared to the control group was compared.
  • Example 20 In vivo short-term PK assay and efficacy evaluation in xenograft model
  • Short-term PK was performed to check whether the initial clearance of the excavated antibody was administered in vivo.
  • Antibody 10 mg/kg was administered to Balb/c mice, and blood samples were obtained for each individual immediately after administration at intervals of 1 hr, 2 hr, 4 hr, 1 day, and 2 days.
  • plasma was obtained through a centrifuge, and antibody titer in plasma was quantified based on ELISA.
  • F309 and FS306 antibodies had an initial PK of a normal antibody without an initial clearance pattern (FIG. 14a).
  • F309 and FS306 clones inhibited cancer growth by about 50% and 40%, respectively, when administered at 10 mg/kg (3 times a week), respectively ( FIG. 14A ).
  • F309 it is thought to inhibit cancer growth with an excellent anticancer effect when administered twice a week by concentration (30mpk, 10mpk, 3mpk) (FIG. 14b).
  • Affinity maturation was performed to further improve F309's excellent FGFR3 degradation and cancer growth inhibitory ability.
  • a phagemid vector displaying the F309 scFv fragment (heavy chain variable region; VH, light chain variable region; VL) on the surface of M13 bacteriophage was constructed and used as a library template.
  • CDR H1, H2, H3 and CDR L1, L2, L3 were selected based on Kabat numbering of the antibody, and F309 mutant library was constructed using primers containing NNK degeneration codon for each CDR ( 15a).
  • the biopanning (antigen-fixed panning) described above was performed 3 to 4 times, and based on this, an antibody with higher affinity than the F309 parent antibody was cloned by ELISA-based affinity screening.
  • the obtained clone was re-verified by performing a reproduction experiment, and finally, an affinity matured mutant of F309 was obtained through antibody sequence analysis. It is determined that the secured F309 mutants have significantly increased specific binding capacity to the FGFR3 recombinant protein compared to the parent antibody ( FIG. 15b ).
  • SSM023, SSM024, SSM026, SSM034, SSM036, SSM234, and SSM236 were designed and prepared as amino acid residue combinations for SSM001 to SSM010 mutants.
  • ELISA was performed to verify the FGFR3 antigen-specific binding capacity analysis for the antibodies against this, and as a result, further elevated FGFR3 antigen affinity was confirmed [ FIGS. 15b and 15c ].
  • Analysis of the biological activity of the mutant antibody was performed in GBM15-682T, and as a result, it was confirmed that increased cancer growth inhibition compared to the F309 parent antibody (FIG. 15d).
  • the antibody specifically binds to the antigen on the cell surface, flows into the cell through receptor-mediated cell internalization, and is degraded by lysosomes and proteases inside the cell, resulting in conjugated toxic substances. It has a mechanism to kill cells. This is a platform that can maximize the therapeutic effect and is widely used as a next-generation antibody therapeutic platform. In the present invention, it was attempted to confirm the applicability of the antibody-drug conjugates to clones with excellent internalization and target resolution for FGFR3, FGFR3-TACC3 fusion cells.
  • the F309 and FS306 clones were determined to be applicable as an antibody-drug conjugate platform because FGFR3 target resolution and cell internalization were demonstrated as described in the present invention.
  • the PerKitTM Antibody MMAE Conjugation Kit CellMosaic
  • CellMosaic was used to prepare the antibody-drug conjugate for the F309 clone, and this platform was developed as a first-generation antibody-drug conjugate technology (a method developed by Seattle Genetics: Sun et al. 2005, Bioconjugate Chem. 16, 1282-1290) is a method of optionally conjugating -vc MMAE to the interchain disulfide of an antibody (FIG. 16a).
  • F309-vc MMAE showed superior cytotoxicity than LY3076266-vc MMAE in FGFR3-TACC3 fusion GBM15-682T.
  • the growth inhibitory effect of ADC on cells according to the expression level of each FGFR3 was analyzed by IC50 and MAX inhibition, and is shown in the table of (FIG. 16d).
  • the previously performed epitope domain mapping was also performed on the affinity matured antibody F309#SSM236 (hereinafter, AMB302#1.2).
  • AMB302#1.2 affinity matured antibody F309#SSM236
  • binding to domain D1 was confirmed, and even when analyzed using the same domains (Domain, I, Domain, II, Domain III), the affinity matured antibody was found to specifically bind to domain D1. Confirmed.
  • the antibody it was reconfirmed that it has specific binding ability to human/cyno FGFR3 (FIG. 17).
  • the KD values for each antigen are shown in Table 14 below.
  • plasma was obtained through a centrifuge, and antibody titer in plasma was quantified based on quantification ELISA.
  • a single dose of 50 mg/kg was administered after administration of 25 mg/kg, and blood samples were collected for each hour (10 minutes, 1 and 6). hours, 1, 2, 3, 7, 10, 14, 21, and 28 days).
  • the obtained blood plasma was obtained through a centrifuge to remove blood cells, and the antibodies in the plasma were quantified through quantification ELISA.
  • a stable half-life (10 days or more) and CL tendency were confirmed similar to the results in mice.
  • biologically specific clinical side effects and weight changes were not observed at all administration concentrations (FIG. 22).
  • ADC preparation was performed for the mutants obtained through affinity maturation engineering in the present invention (FIG. 23).
  • the purified antibody sample was treated with tris(2-Carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) in an equivalent ratio of 8.0 or more, and completely reduced at 37°C for 2 hours.
  • TCEP tris(2-Carboxyethyl) phosphine hydrochloride
  • buffer exchange was performed with PBS pH7.4, and the linker-payload (Topoisomerase I inhibitor, equivalence ratio 10.0) was dissolved in DMA for the sample and conjugated to the reduced antibody at 37°C for 2 hours.
  • the buffer was exchanged through a centrifugal column (Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units).
  • the antigen affinity of the synthesized ADC sample was confirmed through ELISA.
  • high-purity properties of the prepared ADC were confirmed through SEC-HPLC analysis.
  • DAR analysis was performed through LC-MS, and mass spectrometry of the linker-payload attached to the heavy chain and light chain was performed on the prepared ADC, respectively, and it was confirmed that it was approximately DAR 6 or higher (Fig. 25). ).
  • Example 28 Affinity Mature Antibody ADC Assay (Duocarmycin, Linker-AMB401)
  • ADC efficacy evaluation was performed on organoids derived from patients overexpressing FGFR3 (TACC3 fusion).
  • TACC3 fusion organoids derived from patients overexpressing FGFR3
  • a single spheroid organoid model was created by isolating cancer cells from cancer tissues derived from brain tumor patients.
  • Two types of patient-derived cells with FGFR3-TACC3 fusion (AMB-BT-0050T, AMB-BT-0112T) and non-patient-derived cells (AMB-BT-0013T) were incubated overnight to form single spheroids, followed by ADC was treated and incubated for a week, and the results were checked.
  • Example 30 Efficacy evaluation of affinity matured mutant ADC in patient-derived organoid ex vivo model (ADC-Duocarmycin, linker-AMB401)
  • Example 31 FGFR3 (TACC3 fusion) evaluation of ADC efficacy in an orthotopic animal model of brain tumor (ADC-TOPOI)
  • the increase in survival rate in an orthotopic animal model of brain tumor (brain tumor, GBM) through ADC treatment was evaluated ( FIG. 29 ).
  • a brain tumor mouse model was prepared by injecting the prepared cell line at a depth of 3.2 mm at a position of 1.7 mm left and 0.5 mm above the bregma of immunodeficient mice.
  • Control, Control-TOPOI, and AMB302#1.2-TOPOI single administration, multiple administration
  • the candidate drug was administered once via intravenous injection on the 7th day after model production. On the 15th day, two intermediate samples per group were sampled for biomarker analysis. The weight of the mice was measured twice a week, and when there was a weight loss of 20% or more, euthanasia was carried out and the brains of the mice were removed. In the case of AMB302#1.2-TOPOI, it was confirmed that the survival period of mice increased by more than 70% even through a single administration.
  • Example 32 ADC efficacy evaluation in FGFR3 (TACC3 fusion) subcutaneous transplantation model (ADC-TOPOI)
  • Example 33 FGFR3 (TACC3 fusion) evaluation of ADC efficacy in an orthotopic animal model of brain tumor (ADC-Duocarmycin, linker-AMB401)
  • Efficacy evaluation was performed with a single dose (10 mg/kg) or multiple doses (10 mg/kg, Q4D) of AMB302#1.1-AMB401 in the same model as previously performed. It was confirmed that the survival rate was significantly increased in the ADC administration group, and in particular, it was confirmed that the survival rate increased by 30% or more in the group subjected to multiple administrations ( FIG. 32 ).
  • the anti-FGFR3 antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention exhibits superior binding to FGFR3 than the existing anti-FGFR3 antibody, and can be usefully used for the prevention or treatment of a desired tumor or cancer.

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Abstract

본 발명은 항-FGFR3 (Fibroblast growth factor receptor 3) 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 이를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 재조합 발현벡터, 상기 재조합 발현벡터로 형질감염된 숙주세포, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 이중 또는 다중특이적 항체, 상기 항체의 scFv 및 면역세포 활성화 항원에 결합하는 항체의 scFv를 하나 이상 포함하는 제2결합 도메인으로 구성된 scFv를 포함하는, 면역세포 인게이징(immune cell engage) 이중특이적 또는 다중특이적 항체, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 약물에 결합된 항체-약물 접합체(ADC), 상기 항-FGFR3 항체의 scFv를 세포외도메인의 항원 결합 부위로 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR), 상기 키메라 항원 수용체가 도입되어 있는 면역세포, 상기 면역세포를 포함하는 병용 치료용 조성물, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 병용 치료용 조성물, 암 치료용 조성물, 암 치료방법 및 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 소포체 (vesicle)에 관한 것이다.

Description

항-FGFR3 항체 및 이의 용도
본 발명은 항-FGFR3 (Fibroblast growth factor receptor 3) 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 이를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 재조합 발현벡터, 상기 재조합 발현벡터로 형질감염된 숙주세포, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 이중 또는 다중특이적 항체, 상기 항체의 scFv 및 면역세포 활성화 항원에 결합하는 항체의 scFv를 하나 이상 포함하는 제2결합 도메인으로 구성된 scFv를 포함하는, 면역세포 인게이징(immune cell engage) 이중특이적 또는 다중특이적 항체, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 약물에 결합된 항체-약물 접합체(ADC), 상기 항-FGFR3 항체의 scFv를 세포외도메인의 항원 결합 부위로 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR), 상기 키메라 항원 수용체가 도입되어 있는 면역세포, 상기 면역세포를 포함하는 병용 치료용 조성물, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 병용 치료용 조성물, 암, 염증 또는 면역질환 치료용 조성물, 암, 염증 또는 면역질환 치료방법 및 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 소포체 (vesicle)에 관한 것이다.
FGF (fibroblast growth factor)와 이의 티로신 키나아제 수용체 (FGFR)는 배아 발생, 다양한 조직의 항상성 유지, 상처 치유 과정 및 대사 기능에 중요한 역할을 한다. 인간에서는 고도의 상동성을 가지는 FGFR (FGFR1-4)과 22개의 FGF (FGF1-14과 FGF16-23)가 존재한다. FGFR은 3개의 면역 도메인인 D1, D2 및 D3를 포함하는 세포외 영역, 단일 막관통 영역 및 분할 세포질 키나제 모이어티를 포함한다.
FGFR1-4에 의한 신호전달 조절 부진은 여러 종류의 암을 일으키는 병인과 관련이 있다. 유전자 증폭, 염색체 전좌 및 활성화 돌연변이를 포함 게놈 FGFR의 변이에 의해 FGF 경로의 비정상적 활성화 유도 및 정상세포의 종양 형질 전환을 촉진된다. 특히, FGFR3의 증폭은 방광암 유발과 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 특히, 미스센스 FGFR 변이는 여러 종류의 암에서 관찰되며, FGFR3의 S249C에 의해 FGF 구동 신호 및 종양 세포 증식이 강화될 수 있고, 체세포 돌연변이에 대한 핫스팟을 나타낸다.
이러한 FGF/FGFR 경로를 타겟하여 중점을 두고 암 치료제 개발이 이루어져 왔다. 한편, 최근에는 암 유발변이로 염색체의 재배열을 통해 야기되는 융합 단백질이 교모세포종, 폐암, 방광암, 구강암, 두경부 편평세포암, 담낭암 또는 자궁경부암 등에서 발견되고 있다. 이러한 융합단백질은 염색체 4의 탠덤 중복에 의해, FGFR3 유전자와 TACC3 (transforming acidic coiled-coil containing protein 3) 유전자의 융합을 통해 생성된다. 융합단백질 중 FGFR 모노머가 충분히 가까워서 활성화될 수 있도록 하는 파트너 단백질의 다이머화 도메인 (dimerizing domain)에 의해 FGFR은 계속적으로 활성화될 수 있다. FGFR3-TACC3에서 TACC3의 코일-코일 도메인 (coiled-coil domain)에 의해 리간드 결합 없이도 FGFR3가 자가인산화 및 활성화되도록 한다.
TACC3는 TACC 패밀리에 속하고, TACC3와 FGFR3 포함 영역에 해당하는 염색체 4p16에서 재배열 되는 현상은 다발성 골수증에서 종종 확인되며, 이러한 재배열은 FGFR3 또는 TACC3의 증가된 발현으로 이어진다 (KN Nelson et al., Oncotarget. 2018 Sep 28; 9(76): 34306-34319).
위와 같이 확인된 내용에 근거하여, 최근에는 FGFR3 또는 FGFR3 유전자와의 융합 유전자를 타겟으로 하는 항체에 대한 임상시험이 진행중이다.
B701 (Vofatamab)은 FGFR3 대한 인간 면역글로불린 G1 단클론항체로, 항-종양 활성을 나타내는지 여부 및 도세탁셀과의 병용 가능성을 확인하기 위한 임상이 진행되었다. 항-FGFR3 단클론항체 B-701을 투여하면, FGFR3의 야생형과 돌연변이 모두에 특이적으로 결합하고 억제하여 FGFR3의 인산화를 저해함으로써, FGFR3의 활성화 및 FGFR3 매개 신호전달 경로를 억제한다. 이에 의해 세포 증식이 저해되고, FGFR3 발현 종양에서 세포사멸이 유도된다.
LY3076226은 항-FGFR3 항체가 DM4 (microtubule inhibitor)에 접합된 항체-약물 결합체 (ADC)로, 진행성 또는 전이암에 사용될 수 있는지 여부에 대한 임상이 진행되었다. LY3076226이 FGFR3의 과발현 또는 변형을 가지는 다발성 골수종 및 림프종 포함 진행성 또는 전이성 암, 국소 진행성, 절제 불가능한 또는 전이성 요로 암종에 효과를 나타내는지 여부를 확인하는 임상 1상이 진행되고 있다 (T Ibrahim et al., Bladder Cancer, vol. 5, no. 2, pp. 87-102, 2019).
이러한 종래 항-FGFR3 항체에서는 낮은 친화도, 타겟 분해능 및 효능을 나타내는 바, 본 발명자들은 기존의 항-FGFR3 항체에 비해 친화도, 타겟 분해능 및 효능 등이 개선된 신규 항-FGFR3 항체를 개발하고자 예의 노력한 결과, 항체의 특성 예를 들어 친화도 확인, FGFR3 결합 패턴 분석, FGFR3 분해능 확인, 암세포 생장 억제 결과 및 효력 시험 결과 등을 확인하고, 특히 공지의 항-FGFR3 항체보다 FGFR3-TACC3 과발현 뇌종양 환자유래세포에 더욱 민감한 반응성을 가지는 항체를 선별하는 전략을 통해 차별화된 특성을 지닌 항체를 선별하였고, 선별된 항체가 목적하는 암 치료에 사용될 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 FGFR3 (Fibroblast growth factor receptor 3)에 대한 신규 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는데 있다.
본 발명의 목적은 특히, 공지의 항-FGFR3 항체보다 FGFR3-TACC3 과발현 뇌종양 환자유래세포에 더욱 민감한 반응성을 가지는 항체를 선별하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 핵산을 포함하는 재조합 발현벡터 또는 상기 재조합 발현벡터로 형질감염된 숙주세포를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 FGFR3에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 이중 또는 다중특이적 항체를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 면역세포 인게이징(immune cell engage) 이중특이적 또는 다중특이적 항체를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편이 약물에 결합된 항체-약물 접합체 (ADC)를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항-FGFR3 항체의 scFv를 세포외도메인의 항원 결합 부위로 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR), 상기 키메라 항원 수용체가 도입되어 있는 면역세포, 상기 면역세포를 포함하는 병용 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 상기 면역세포 인게이징(immune cell engage) 이중특이적 또는 다중특이적 항체를 포함하는 병용 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 항체 또는 이의 항원 결합단편, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 이중 또는 다중특이적 항체, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 항체-약물 접합체, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 키메라 항원 수용체, 상기 키메라 항원 수용체를 포함하는 암 치료용 조성물 또는 암 치료방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 소포체를 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다음을 포함하는 FGFR3 (Fibroblast growth factor receptor 3)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편을 제공한다:
서열번호 1 내지 서열번호 18로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1,
서열번호 19 내지 서열번호 41로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2,
서열번호 42 내지 서열번호 66, 서열번호 186 내지 198로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3,
서열번호 67 내지 서열번호 88로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1,
서열번호 89 내지 서열번호 109로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 및
서열번호 110 내지 서열번호 132, 서열번호 199 내지 서열번호 202로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3.
본 발명은 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편을 코딩하는 핵산을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 핵산을 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 발현벡터로 형질감염된 숙주세포를 제공한다.
본 발명은 또한, 숙주세포를 배양하여 항체를 생성하는 단계; 및 생성된 항체를 분리 및 정제하는 단계를 포함하는, FGFR3에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 이중 또는 다중특이적 항체를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 항체의 scFv 및 면역세포 활성화 항원에 결합하는 항체의 scFv를 하나 이상 포함하는 제2결합 도메인으로 구성된 scFv를 포함하는, 면역세포 인게이징(immune cell engage) 이중특이적 또는 다중특이적 항체를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편이 약물에 결합된 항체-약물 접합체 (ADC)를 제공한다.
본 발명은 또한, 항원 결합 부위를 포함하는 세포외도메인, 트랜스 멤브레인 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)로, 상기 세포외도메인의 항원 결합 부위는 상기 항체의 scFv인 것을 특징으로 하는 키메라 항원 수용체를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 면역세포를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 면역세포 및 항-FGFR3 항체 이외의 약물을 포함하는 병용 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편과 다음으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 병용 치료용 조성물을 제공한다:
(i) 면역세포;
(ii) 항-FGFR3 항체 이외의 항체에 대한 scFv 단편을 세포외도메인으로 포함하는 항원 수용체(CAR)를 포함하는 면역세포; 및
(iii) 면역관문억제제 (Immune checkpoint inhibitor).
본 발명은 또한, 상기 이중특이적 또는 다중특이적 항체 및 다음으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 병용 치료용 조성물을 제공한다:
(i) 면역세포;
(ii) 항-FGFR3 항체 이외의 항체에 대한 scFv 단편을 세포외도메인으로 포함하는 항원 수용체(CAR)를 포함하는 면역세포; 및
(iii) 면역관문억제제 (Immune checkpoint inhibitor).
본 발명은 또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 이중 또는 다중특이적 항체, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 항체-약물 접합체, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 키메라 항원 수용체 또는 상기 키메라 항원 수용체가 도입되어 있는 면역세포를 포함하는, 암 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, FGFR3과 TACC3의 융합 유전자가 증폭되거나, 융합 유전자에 변이가 있거나, 융합 유전자가 과발현되거나 또는 융합 유전자가 항상 발현 (constitutive activation)되는 것으로 확인된 암을 치료하기 위한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 이중 또는 다중특이적 항체, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 항체-약물 접합체, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 키메라 항원 수용체 또는 상기 키메라 항원 수용체가 도입되어 있는 면역세포를 포함하는, 암 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 환자 유래 샘플에서 FGFR3과 TACC3의 융합 유전자가 증폭되거나, 융합 유전자에 변이가 있거나, 융합 유전자가 과발현되거나 또는 융합 유전자가 항상 발현 (constitutive activation)되는 것을 확인하는 단계; FGFR3과 TACC3의 융합 유전자가 증폭되거나, 융합 유전자에 변이가 있거나, 융합 유전자가 과발현되거나 또는 융합 유전자가 항상 발현 (constitutive activation)되는 것으로 확인된 경우, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 이중 또는 다중특이적 항체, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 항체-약물 접합체, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 키메라 항원 수용체 또는 상기 키메라 항원 수용체가 도입되어 있는 면역세포를 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편이 그 외부로 표출되거나 또는 그 내부에 존재하는 소포체 (vesicle)를 제공한다.
도 1은 본 발명에 사용한 파지 디스플레이 (phage display) 기반 바이오패닝 모식도를 나타낸 것이다.
도 1a는 FGFR3 과발현 환자유래세포를 이용한 세포 패닝 모식도를 나타낸 것이다.
도 1b는 FGFR3 재조합 단백질을 이용한 고정상 바이오 패닝 모식도를 나타낸 것이다.
도 1c는 FGFR3 재조합 단백질을 이용한 용액상 바이오 패닝 모식도를 나타낸 것이다.
도 1d는 FGFR3 재조합 단백질을 이용한 자성 기반 준-자동화 패닝 모식도를 나타낸 것이다.
도 2a는 본 발명에 따른 항체 스크리닝을 위한 바이오패닝 결과를 나타낸 것이다.
도 2b는 본 발명에 따른 항체 스크리닝을 위한 ELISA screening 결과를 나타낸 것이다.
도 2c는 본 발명에 따른 항체 스크리닝을 위한 Magnetic beads based panning 결과를 나타낸 것이다.
도 3a는 scFv에서 IgG 포맷으로의 전환 모식도를 나타낸 것이다.
도 3b는 Expi293 기반 항체 생산과 순도/물성 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4a 내지 도 4d는 FGFR3 항체 (IgG)의 Affinity ELISA 결과를 나타낸 것이다. 도 4a는 재조합단백질 human FGFR3-IIIc 에 대한 항체의 특이적 결합능, 도 4b는 재조합단백질 human FGFR3-IIIb 에 대한 항체의 특이적 결합능, 도 4c는 재조합단백질 mouse FGFR3 에 대한 항체의 특이적 결합능, 도 4d는 재조합단백질 cynomolgus monkey FGFR3 에 대한 항체의 특이적 결합능을 나타낸 것이다. 도 5는 FGFR3 항체 (IgG)의 Biacore 3000을 통한 KD value 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 뇌종양 환자유래세포의 FGFR3 발현 확인 및 FGFR3-TACC3 fusion 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 6a는 환자유래세포의 mRNA expression level (RPKM) 분석, 단백질 발현량 분석 (western blotting), 세포 표면 발현 분석 (FACS analysis) 결과, 도 6b는 RT-PCR을 통한 FGFR3-TACC3 fusion 여부 확인 : fusion specific primer를 나타낸 것이다.
도 7a는 FGFR3(-TACC3) 과발현 뇌종양 환자유래세포에 대한 FGFR3 항체 클론들의 세포 표면 결합 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 7b는 F309 항체의 FGFR3(-TACC3) 과발현 뇌종양 환자유래세포에 대한 농도별 결합 패턴 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 7c는 F309, FS306 항체의 FGFR3 발현없는 세포주에 대한 결합력 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 FACS 기반 FGFR3 항체의 환자유래세포 표면 FGFR3 (-TACC3) 분해능 분석 및 스크리닝 결과를 나타낸 것이다.
도 9a는 F309, FS306 항체의 FGFR3 특이적 결합능 분석, 리간드 비경쟁적 특성 확인 결과를 나타낸 것이다. 도 9b는 F309, FS306 항체의 고유의 에피토프 도메인 규명 : Domain I 결과를 나타낸 것이다. 도 9c는 에피토프 도메인 맵핑을 위한 재조합 도메인 디자인 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 F309, FS306 항체의 FGFR3-TACC3 과발현 뇌종양 환자유래세포 및 FGFR3 과발현 세포주에 대한 타겟 분해능 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 10a는 F309, FS306 항체의 세포표면 FGFR3-TACC3 및 FGFR3 분해능 분석 : FACS analysis 결과를 나타낸 것이다. 도 10b는 F309, FS306 항체의 total FGFR3-TACC3 및 FGFR3 분해능 분석 : Western blotting 결과를 나타낸 것이다. 도 11은 F309, FS306 항체의 세포 내재화 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 11a는 FGFR3-TACC3 과발현 뇌종양 환자유래세포에서 세포 내재화 분석 : ICC analysis 결과를 나타낸 것이다. 도 11b는 Lysosome inhibitor 처리를 통한 F309, FS306 항체의 lysosomal degradation 메커니즘 확인 결과를 나타낸 것이다. 도 12는 F309, FS306 항체의 FGFR3 하위 신호전달 억제 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 13a는 리간드 의존적 세포생장력 저해 분석 (FGF1, FGF9) 결과를 나타낸 것이다. 도 13b는 리간드 비의존적 세포생장력 저해 분석 (FGFR3-TACC3 과발현 뇌종양 환자유래세포, FGFR3 저발현 세포주 또는 뇌종양 환자유래세포) 결과를 나타낸 것이다. 도 14a는 F309, FS306의 short-term PK 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 14b는 FGFR3-TACC3 과발현 뇌종양 환자유래세포 이식 마우스 (PDX)에서의 항체 효능 평가 결과를 나타낸 것이다. 도 14c는 F309 항체의 PDX 모델에서의 효능평가 (FGFR3-TACC3 과발현 뇌종양 환자유래세포) 결과를 나타낸 것이다.
도 15a는 F309 항체의 3D, 2D 구조 및 전략적 친화도 개량 모식도를 나타낸 것이다. 도 15b는 F309 친화도 개량 항체의 affinity ELISA를 통한 친화도 비교 결과를 나타낸 것이다. 도 15c는 F309 친화도 개량 항체의 SPR 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 15c는 F309 개량 항체 클론들의 리간드 비의존적 세포생장력 저해 분석 (FGFR3-TACC3 과발현 뇌종양 환자유래세포) 결과를 나타낸 것이다.
도 16a는 F309 항체의 항체-약물 접합체 (ADC) 적용 가능성 확인을 위한 제조 모식도를 나타낸 것이다. 도 16ㅠ는 F309-vc MMAE의 FGFR3-TACC3 과발현 뇌종양 환자유래세포 및 FGFR3 과발현 세포주에 대한 세포 독성 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 16c는 F309-vc MMAE의 FGFR3 발현량에 따른 세포 독성 분석 -1, 도 16d는 F309-vc MMAE의 FGFR3 발현량에 따른 세포 독성 분석-2 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 친화도 성숙 항체의 Fv 구조와 에피토프 도메인 맵핑 및 항원 특이적 결합 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 FGFR3-TACC3 뇌종양 환자유래세포의 세포 및 세포주의 세포 표면 항원 발현정도 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 19는 친화도 성숙 항체의 세포 내재화 효율 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 20은 친화도 성숙 항체의 FGFR3 (-TACC3) 타겟 분해능 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 21은 친화도 성숙 항체의 마우스 PK 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 22는 친화도 성숙 항체의 원숭이 PK 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 23은 친화도 성숙 항체 포함 ADC 제조 모식도 (Topoisomerase I inhibitor 접합)를 나타낸 것이다.
도 24는 친화도 성숙 항체 포함 ADC 제조 모식도 (Topoisomerase I inhibitor 접합) 나타낸 것이다.
도 25는 친화도 성숙 항체 포함 ADC의 물성 및 결합능 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 26은 친화도 성숙 항체 포함 ADC의 물성 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 27은 친화도 성숙 항체 포함 ADC의 in vitro 효능 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 28은 친화도 성숙 항체 포함 ADC의 in vitro 효능 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 29는 친화도 성숙 항체 포함 ADC의 in vivo 효능 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 30은 친화도 성숙 항체 포함 ADC의 in vivo 효능 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 31은 친화도 성숙 항체 포함 ADC의 in vivo 효능 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 32는 친화도 성숙 항체 포함 ADC의 FGFR3 (TACC3 융합) 뇌종양 정위적 동물 모델에서의 ADC 효능 평가 결과를 나타낸 것이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
항-FGFR3 항체
본 발명은 일 관점에서, 서열번호 1 내지 서열번호 18로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열번호 19 내지 서열번호 41로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 서열번호 42 내지 서열번호 66, 서열번호 186 내지 198로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열번호 67 내지 서열번호 88로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호 89 내지 서열번호 109로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 및 서열번호 110 내지 서열번호 132, 서열번호 199 내지 서열번호 202로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 FGFR3 (Fibroblast growth factor receptor 3)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용된 용어, "항체(antibody)"는 FGFR3에 특이적으로 결합하는 항-FGFR3 항체를 의미한다. 본 발명의 범위에는 FGFR3에 특이적으로 결합하는 완전한 항체 형태 뿐 아니라, 상기 항체 분자의 항원 결합 단편도 포함된다. 경우에 따라서, 본 발명에 따른 항체는 FGFR3-TACC3를 타겟으로 할 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 항체는 공지의 항-FGFR3 항체보다 FGFR3-TACC3 과발현 암세포에 더욱 우수한 효능을 지닌 항체로 선별되었다.
완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "중쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VH 및 3개의 불변영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어, "경쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VL 및 불변영역 도메인 CL을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.
상기 전체 항체는 IgA, IgD, IgE, IgM 및 IgG의 아형(subtype)을 포함하며, 특히 IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다. 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.
항체의 항원 결합 단편 또는 항체 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변영역 및 중쇄의 첫 번째 불변영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge-region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 다이설파이드 결합을 이루면서 생성된다.
Fv는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역만을 가지고 있는 최소의 항체조각에 해당한다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유결합으로 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 연결되어 있고, 단쇄 Fv(single-chain Fv, scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변영역과 경쇄의 가변영역이 공유결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용하거나 (예를 들어, 완전한 형태의 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2를 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 이용하여 제작할 수 있다.
"Fv" 단편은 완전한 항체 인식 및 결합 부위를 함유하는 항체 단편이다. 이러한 영역은 1개의 중쇄 가변 도메인과 1개의 경쇄 가변 도메인이 결합된 이량체이다.
"Fab" 단편은 경쇄의 가변 및 불변 도메인과, 중쇄의 가변 및 제1 불변 도메인(CH1)을 포함한다. F(ab')2 항체 단편은 일반적으로 Fab'단편 C-말단에 존재하는 힌지 영역의 시스테인에 의해 공유적으로 연결된 한 쌍의 Fab' 단편을 포함한다.
"단일쇄 Fv (scFv)" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 단일 폴리펩티드 쇄로 이루어진 구조체이다. scFv가 항원 결합을 위해 목적하는 구조를 형성할 수 있도록 하는 폴리펩티드 링커를 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 추가로 포함할 수 있다.
하나의 실시예에서, 본 발명의 항체는 단일클론 항체, 다특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, scFv, Fab 단편, F(ab')2 단편, 다이설파이드-결합 Fvs (sdFv) 및 항-이디오타입(항-Id) 항체, 또는 상기 항체들의 에피토프-결합 단편 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 또는 엡실론(ε) 중의 어느 한 이소타입으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 불변영역은 감마1 (IgG1), 감마 2 (IgG2), 감마 3 (IgG3) 또는 감마 4 (IgG4)이다. 경쇄 불변영역은 카파 또는 람다 형일 수 있다.
상기 단일클론 항체는 실질적으로 동질적 항체 집단으로부터 수득한 항체, 즉 집단을 차지하고 있는 개개의 항체가 미량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생적 돌연변이를 제외하고는 동일한 것을 지칭한다. 단일클론 항체는 고도로 특이적이어서, 단일 항원 부위에 대항하여 유도된다. 전형적으로 상이한 결정인자(에피토프)에 대해 상이한 항체를 포함하는 통상의 (폴리클로날) 항체와는 대조적으로, 각각의 단일클론 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 지시된다.
"에피토프(epitope)"는 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정부위(determinant)를 의미한다. 에피토프는 통상 화학적으로 활성인 표면 분자군, 예를 들어 아미노산 또는 당 측쇄로 구성되며, 일반적으로 특정한 3차원의 구조적 특징뿐만 아니라 특정한 전하 특성을 갖는다. 입체적 에피토프 및 비입체적 에피토프는 변성 용매의 존재하에서 전자에 대한 결합은 소실되지만 후자에 대해서는 소실되지 않는 점에서 구별된다.
본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합단편은 예를 들어, FGFR3의 세포외 영역에 존재하는 3개의 면역 도메인인 D1, D2 및 D3으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나, 예를 들어 D1, D2 또는 D3 도메인에 결합할 수 있다. 경우에 따라서, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합단편은 상기 서열번호 183의 FGFR3 중 도메인 1 (서열번호 184)에 특이적으로 결합하고 FGF 리간드와 결합 경쟁하지 않을 수 있다.
상기 "인간화" 형태의 비-인간(예: 마우스) 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 수용자의 초가변영역으로부터의 잔기를 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 보유하고 있는 비-인간 종(공여자 항체), 예를 들어 마우스, 랫트, 토끼 또는 비-인간 영장류의 초가변영역으로부터의 잔기로 대체시킨 인간 면역글로불린 (수용자 항체)이다.
상기 "인간 항체"는 인간 면역글로불린으로부터 유래하는 분자로서 상보성 결정영역, 구조 영역을 포함한 항체를 구성하는 아미노산 서열 전체가 인간의 면역글로불린으로 구성되어 있는 것을 의미한다.
중쇄 및/또는 경쇄 일부가 특별한 종으로부터 유래되거나 특별한 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 반면, 나머지 쇄(들)는 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 내의상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 "키메라" 항체(면역글로불린) 뿐 아니라 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 상기 항체의 단편이 포함된다.
본 발명에서 사용된 항체의 "가변영역"은 상보성 결정 영역 (CDR; 즉 CDR1, CDR2, 및 CDR3) 및 골격 영역 (FR)의 아미노산 서열을 포함하는 항체 분자의 경쇄 및 중쇄 부분을 의미한다. VH는 중쇄의 가변 도메인을 의미한다. VL은 경쇄의 가변 도메인을 의미한다.
"상보성 결정 영역(complement determining region, CDR)"은 항원 결합을 위해 필요한 존재인, 항체 가변 도메인의 아미노산 잔기를 의미한다. 각 가변 도메인은 전형적으로 CDR1, CDR2 및 CDR3로 확인된 3개의 CDR 영역을 갖는다.
본 발명에 따른 항-FGFR3 항체 또는 이의 항원 결합단편은 공지의 항-FGFR3 항체보다 FGFR3-TACC3 과발현 암세포에 더욱 우수한 효능을 지닌 항체로 선별된 것으로, 예를 들어, 다음을 포함할 수 있다:
서열번호 1의 중쇄 CDR 1, 서열번호 19의 중쇄 CDR2 및 서열번호 42의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 67의 경쇄 CDR1, 서열번호 89의 경쇄 CDR2 및 서열번호 110의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 2의 중쇄 CDR 1, 서열번호 20의 중쇄 CDR2 및 서열번호 43의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 68의 경쇄 CDR1, 서열번호 90의 경쇄 CDR2 및 서열번호 111의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 3의 중쇄 CDR 1, 서열번호 21의 중쇄 CDR2 및 서열번호 44의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 69의 경쇄 CDR1, 서열번호 91의 경쇄 CDR2 및 서열번호 112의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 4의 중쇄 CDR 1, 서열번호 22의 중쇄 CDR2 및 서열번호 45의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 70의 경쇄 CDR1, 서열번호 92의 경쇄 CDR2 및 서열번호 113의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 5의 중쇄 CDR 1, 서열번호 23의 중쇄 CDR2 및 서열번호 46의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 71의 경쇄 CDR1, 서열번호 93의 경쇄 CDR2 및 서열번호 114의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 5의 중쇄 CDR 1, 서열번호 23의 중쇄 CDR2 및 서열번호 186의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 71의 경쇄 CDR1, 서열번호 93의 경쇄 CDR2 및 서열번호 114의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 5의 중쇄 CDR 1, 서열번호 23의 중쇄 CDR2 및 서열번호 187의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 71의 경쇄 CDR1, 서열번호 93의 경쇄 CDR2 및 서열번호 114의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 5의 중쇄 CDR 1, 서열번호 23의 중쇄 CDR2 및 서열번호 188의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 71의 경쇄 CDR1, 서열번호 93의 경쇄 CDR2 및 서열번호 114의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 5의 중쇄 CDR 1, 서열번호 23의 중쇄 CDR2 및 서열번호 189의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 71의 경쇄 CDR1, 서열번호 93의 경쇄 CDR2 및 서열번호 114의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 5의 중쇄 CDR 1, 서열번호 23의 중쇄 CDR2 및 서열번호 190의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 71의 경쇄 CDR1, 서열번호 93의 경쇄 CDR2 및 서열번호 114의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 5의 중쇄 CDR 1, 서열번호 23의 중쇄 CDR2 및 서열번호 191의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 71의 경쇄 CDR1, 서열번호 93의 경쇄 CDR2 및 서열번호 114의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 5의 중쇄 CDR 1, 서열번호 23의 중쇄 CDR2 및 서열번호 192의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 71의 경쇄 CDR1, 서열번호 93의 경쇄 CDR2 및 서열번호 114의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 5의 중쇄 CDR 1, 서열번호 23의 중쇄 CDR2 및 서열번호 193의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 71의 경쇄 CDR1, 서열번호 93의 경쇄 CDR2 및 서열번호 114의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 5의 중쇄 CDR 1, 서열번호 23의 중쇄 CDR2 및 서열번호 194의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 71의 경쇄 CDR1, 서열번호 93의 경쇄 CDR2 및 서열번호 114의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 5의 중쇄 CDR 1, 서열번호 23의 중쇄 CDR2 및 서열번호 195의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 71의 경쇄 CDR1, 서열번호 93의 경쇄 CDR2 및 서열번호 114의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 5의 중쇄 CDR 1, 서열번호 23의 중쇄 CDR2 및 서열번호 196의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 71의 경쇄 CDR1, 서열번호 93의 경쇄 CDR2 및 서열번호 114의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 5의 중쇄 CDR 1, 서열번호 23의 중쇄 CDR2 및 서열번호 197의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 71의 경쇄 CDR1, 서열번호 93의 경쇄 CDR2 및 서열번호 114의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 5의 중쇄 CDR 1, 서열번호 23의 중쇄 CDR2 및 서열번호 198의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 71의 경쇄 CDR1, 서열번호 93의 경쇄 CDR2 및 서열번호 114의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 5의 중쇄 CDR 1, 서열번호 23의 중쇄 CDR2 및 서열번호 46의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 71의 경쇄 CDR1, 서열번호 93의 경쇄 CDR2 및 서열번호 199의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 5의 중쇄 CDR 1, 서열번호 23의 중쇄 CDR2 및 서열번호 46의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 71의 경쇄 CDR1, 서열번호 93의 경쇄 CDR2 및 서열번호 200의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 5의 중쇄 CDR 1, 서열번호 23의 중쇄 CDR2 및 서열번호 46의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 71의 경쇄 CDR1, 서열번호 93의 경쇄 CDR2 및 서열번호 201의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 5의 중쇄 CDR 1, 서열번호 23의 중쇄 CDR2 및 서열번호 46의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 71의 경쇄 CDR1, 서열번호 93의 경쇄 CDR2 및 서열번호 202의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 4의 중쇄 CDR 1, 서열번호 24의 중쇄 CDR2 및 서열번호 47의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 72의 경쇄 CDR1, 서열번호 94의 경쇄 CDR2 및 서열번호 115의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 6의 중쇄 CDR 1, 서열번호 25의 중쇄 CDR2 및 서열번호 48의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 73의 경쇄 CDR1, 서열번호 95의 경쇄 CDR2 및 서열번호 112의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 7의 중쇄 CDR 1, 서열번호 26의 중쇄 CDR2 및 서열번호 49의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 74의 경쇄 CDR1, 서열번호 96의 경쇄 CDR2 및 서열번호 116의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 8의 중쇄 CDR 1, 서열번호 27의 중쇄 CDR2 및 서열번호 50의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 75의 경쇄 CDR1, 서열번호 97의 경쇄 CDR2 및 서열번호 117의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 9의 중쇄 CDR 1, 서열번호 28의 중쇄 CDR2 및 서열번호 51의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 76의 경쇄 CDR1, 서열번호 98의 경쇄 CDR2 및 서열번호 118의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 10의 중쇄 CDR 1, 서열번호 29의 중쇄 CDR2 및 서열번호 52의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 77의 경쇄 CDR1, 서열번호 97의 경쇄 CDR2 및 서열번호 119의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 11의 중쇄 CDR 1, 서열번호 30의 중쇄 CDR2 및 서열번호 53의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 78의 경쇄 CDR1, 서열번호 99의 경쇄 CDR2 및 서열번호 120의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 11의 중쇄 CDR 1, 서열번호 31의 중쇄 CDR2 및 서열번호 54의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 79의 경쇄 CDR1, 서열번호 100의 경쇄 CDR2 및 서열번호 121의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 12의 중쇄 CDR 1, 서열번호 32의 중쇄 CDR2 및 서열번호 55의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 80의 경쇄 CDR1, 서열번호 101의 경쇄 CDR2 및 서열번호 122의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 3의 중쇄 CDR 1, 서열번호 33의 중쇄 CDR2 및 서열번호 56의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 81의 경쇄 CDR1, 서열번호 102의 경쇄 CDR2 및 서열번호 123의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 13의 중쇄 CDR 1, 서열번호 34의 중쇄 CDR2 및 서열번호 57의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 82의 경쇄 CDR1, 서열번호 103의 경쇄 CDR2 및 서열번호 124의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 14의 중쇄 CDR 1, 서열번호 35의 중쇄 CDR2 및 서열번호 58의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 83의 경쇄 CDR1, 서열번호 104의 경쇄 CDR2 및 서열번호 125의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 1의 중쇄 CDR 1, 서열번호 36의 중쇄 CDR2 및 서열번호 59의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 84의 경쇄 CDR1, 서열번호 105의 경쇄 CDR2 및 서열번호 126의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 6의 중쇄 CDR 1, 서열번호 23의 중쇄 CDR2 및 서열번호 60의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 69의 경쇄 CDR1, 서열번호 91의 경쇄 CDR2 및 서열번호 127의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 15의 중쇄 CDR 1, 서열번호 37의 중쇄 CDR2 및 서열번호 61의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 85의 경쇄 CDR1, 서열번호 89의 경쇄 CDR2 및 서열번호 128의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 16의 중쇄 CDR 1, 서열번호 38의 중쇄 CDR2 및 서열번호 62의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 86의 경쇄 CDR1, 서열번호 106의 경쇄 CDR2 및 서열번호 129의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 17의 중쇄 CDR 1, 서열번호 39의 중쇄 CDR2 및 서열번호 63의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 87의 경쇄 CDR1, 서열번호 107의 경쇄 CDR2 및 서열번호 130의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 4의 중쇄 CDR 1, 서열번호 19의 중쇄 CDR2 및 서열번호 64의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 88의 경쇄 CDR1, 서열번호 108의 경쇄 CDR2 및 서열번호 131의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 18의 중쇄 CDR 1, 서열번호 40의 중쇄 CDR2 및 서열번호 65의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 85의 경쇄 CDR1, 서열번호 89의 경쇄 CDR2 및 서열번호 128의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 또는
서열번호 16의 중쇄 CDR 1, 서열번호 41의 중쇄 CDR2 및 서열번호 66의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 72의 경쇄 CDR1, 서열번호 109의 경쇄 CDR2 및 서열번호 132의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역.
"골격 영역(FR)"은 CDR 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다. 각 가변 도메인은 전형적으로, FR1, FR2, FR3 및 FR4의 4개의 FR을 갖는다.
항-FGFR3 항체의 FGFR3에 대한 결합 친화성은 10-5M 내지 10-12　M 범위 내에 있다. 예를 들어, 항-FGFR3 항체의 FGFR3에 대한 결합 친화성은 10-6　M 내지 10-12　M, 10-7　M 내지 10-12　M, 10-8　M 내지 10-12　M, 10-9　M 내지 10-12　M, 10-5　M 내지 10-11　M, 10-6　M 내지 10-11　M, 10-7　M 내지 10-11　M, 10-8　M 내지 10-11　M, 10-9　M 내지 10-11　M, 10-10　M 내지 10-11　M, 10-5　M 내지 10-10　M, 10-6　M 내지 10-10　M, 10-7　M 내지 10-10　M, 10-8　M 내지 10-10　M, 10-9　M 내지 10-10　M, 10-5　M 내지 10-9　M, 10-6　M 내지 10-9　M, 10-7　M 내지 10-9　M, 10-8　M 내지 10-9　M, 10-5　M 내지 10-8　M, 10-6　M 내지 10-8　M, 10-7　M 내지 10-8　M, 10-5　M 내지 10-7　M, 10-6　M 내지 10-7　M 또는 10-5　M 내지 10-6　M이다.
상기 FGFR3에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편은 서열번호 133 내지 서열번호 157, 서열번호 203 내지 서열번호 215로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함할 수 있다. 또한, 상기 FGFR3에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편은 서열번호 158 내지 서열번호 182, 서열번호 216 내지 서열번호 219로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 구체적 실시예에서, 다음을 포함할 수 있다:
서열번호 133의 중쇄 가변영역 및 서열번호 158의 경쇄 가변영역;
서열번호 134의 중쇄 가변영역 및 서열번호 159의 경쇄 가변영역;
서열번호 135의 중쇄 가변영역 및 서열번호 160의 경쇄 가변영역;
서열번호 136의 중쇄 가변영역 및 서열번호 161의 경쇄 가변영역;
서열번호 137의 중쇄 가변영역 및 서열번호 162의 경쇄 가변영역;
서열번호 203의 중쇄 가변영역 및 서열번호 162의 경쇄 가변영역;
서열번호 204의 중쇄 가변영역 및 서열번호 162의 경쇄 가변영역;
서열번호 205의 중쇄 가변영역 및 서열번호 162의 경쇄 가변영역;
서열번호 206의 중쇄 가변영역 및 서열번호 162의 경쇄 가변영역;
서열번호 207의 중쇄 가변영역 및 서열번호 162의 경쇄 가변영역;
서열번호 208의 중쇄 가변영역 및 서열번호 162의 경쇄 가변영역;
서열번호 209의 중쇄 가변영역 및 서열번호 162의 경쇄 가변영역;
서열번호 210의 중쇄 가변영역 및 서열번호 162의 경쇄 가변영역;
서열번호 211의 중쇄 가변영역 및 서열번호 162의 경쇄 가변영역;
서열번호 212의 중쇄 가변영역 및 서열번호 162의 경쇄 가변영역;
서열번호 213의 중쇄 가변영역 및 서열번호 162의 경쇄 가변영역;
서열번호 214의 중쇄 가변영역 및 서열번호 162의 경쇄 가변영역;
서열번호 215의 중쇄 가변영역 및 서열번호 162의 경쇄 가변영역;
서열번호 137의 중쇄 가변영역 및 서열번호 216의 경쇄 가변영역;
서열번호 137의 중쇄 가변영역 및 서열번호 217의 경쇄 가변영역;
서열번호 137의 중쇄 가변영역 및 서열번호 218의 경쇄 가변영역;
서열번호 137의 중쇄 가변영역 및 서열번호 219의 경쇄 가변영역;
서열번호 138의 중쇄 가변영역 및 서열번호 163의 경쇄 가변영역;
서열번호 139의 중쇄 가변영역 및 서열번호 164의 경쇄 가변영역;
서열번호 140의 중쇄 가변영역 및 서열번호 165의 경쇄 가변영역;
서열번호 141의 중쇄 가변영역 및 서열번호 166의 경쇄 가변영역;
서열번호 142의 중쇄 가변영역 및 서열번호 167의 경쇄 가변영역;
서열번호 143의 중쇄 가변영역 및 서열번호 168의 경쇄 가변영역;
서열번호 144의 중쇄 가변영역 및 서열번호 169의 경쇄 가변영역;
서열번호 145의 중쇄 가변영역 및 서열번호 170의 경쇄 가변영역;
서열번호 146의 중쇄 가변영역 및 서열번호 171의 경쇄 가변영역;
서열번호 147의 중쇄 가변영역 및 서열번호 172의 경쇄 가변영역;
서열번호 148의 중쇄 가변영역 및 서열번호 173의 경쇄 가변영역;
서열번호 149의 중쇄 가변영역 및 서열번호 174의 경쇄 가변영역;
서열번호 150의 중쇄 가변영역 및 서열번호 175의 경쇄 가변영역;
서열번호 151의 중쇄 가변영역 및 서열번호 176의 경쇄 가변영역;
서열번호 152의 중쇄 가변영역 및 서열번호 177의 경쇄 가변영역;
서열번호 153의 중쇄 가변영역 및 서열번호 178의 경쇄 가변영역;
서열번호 154의 중쇄 가변영역 및 서열번호 179의 경쇄 가변영역;
서열번호 155의 중쇄 가변영역 및 서열번호 180의 경쇄 가변영역;
서열번호 156의 중쇄 가변영역 및 서열번호 181의 경쇄 가변영역; 또는
서열번호 157의 중쇄 가변영역 및 서열번호 182의 경쇄 가변영역.
scFv
scFv는 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 단일 폴리펩티드 쇄로 이루어진 구조체로, 항체 단편이다. scFv가 항원 결합을 위해 목적하는 구조를 형성할 수 있도록 하는 폴리펩티드 링커를 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 추가로 포함할 수 있다.
하나의 실시예에서, 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 단일쇄 Fv (scFv)에서 VH 및 VL 도메인은 링커를 통해 연결될 수 있다. 서열번호 133 내지 서열번호 157, 서열번호 203 내지 서열번호 215로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역은 링커를 통해 서열번호 158 내지 서열번호 182, 서열번호 216 내지 서열번호 219로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역과 연결될 수 있다.
본 발명에 따른 구체적 실시예에서, 다음을 포함할 수 있다:
서열번호 133의 중쇄 가변영역 및 서열번호 158의 경쇄 가변영역;
서열번호 134의 중쇄 가변영역 및 서열번호 159의 경쇄 가변영역;
서열번호 135의 중쇄 가변영역 및 서열번호 160의 경쇄 가변영역;
서열번호 136의 중쇄 가변영역 및 서열번호 161의 경쇄 가변영역;
서열번호 137의 중쇄 가변영역 및 서열번호 162의 경쇄 가변영역;
서열번호 203의 중쇄 가변영역 및 서열번호 162의 경쇄 가변영역;
서열번호 204의 중쇄 가변영역 및 서열번호 162의 경쇄 가변영역;
서열번호 205의 중쇄 가변영역 및 서열번호 162의 경쇄 가변영역;
서열번호 206의 중쇄 가변영역 및 서열번호 162의 경쇄 가변영역;
서열번호 207의 중쇄 가변영역 및 서열번호 162의 경쇄 가변영역;
서열번호 208의 중쇄 가변영역 및 서열번호 162의 경쇄 가변영역;
서열번호 209의 중쇄 가변영역 및 서열번호 162의 경쇄 가변영역;
서열번호 210의 중쇄 가변영역 및 서열번호 162의 경쇄 가변영역;
서열번호 211의 중쇄 가변영역 및 서열번호 162의 경쇄 가변영역;
서열번호 212의 중쇄 가변영역 및 서열번호 162의 경쇄 가변영역;
서열번호 213의 중쇄 가변영역 및 서열번호 162의 경쇄 가변영역;
서열번호 214의 중쇄 가변영역 및 서열번호 162의 경쇄 가변영역;
서열번호 215의 중쇄 가변영역 및 서열번호 162의 경쇄 가변영역;
서열번호 137의 중쇄 가변영역 및 서열번호 216의 경쇄 가변영역;
서열번호 137의 중쇄 가변영역 및 서열번호 217의 경쇄 가변영역;
서열번호 137의 중쇄 가변영역 및 서열번호 218의 경쇄 가변영역;
서열번호 137의 중쇄 가변영역 및 서열번호 219의 경쇄 가변영역;
서열번호 138의 중쇄 가변영역 및 서열번호 163의 경쇄 가변영역;
서열번호 139의 중쇄 가변영역 및 서열번호 164의 경쇄 가변영역;
서열번호 140의 중쇄 가변영역 및 서열번호 165의 경쇄 가변영역;
서열번호 141의 중쇄 가변영역 및 서열번호 166의 경쇄 가변영역;
서열번호 142의 중쇄 가변영역 및 서열번호 167의 경쇄 가변영역;
서열번호 143의 중쇄 가변영역 및 서열번호 168의 경쇄 가변영역;
서열번호 144의 중쇄 가변영역 및 서열번호 169의 경쇄 가변영역;
서열번호 145의 중쇄 가변영역 및 서열번호 170의 경쇄 가변영역;
서열번호 146의 중쇄 가변영역 및 서열번호 171의 경쇄 가변영역;
서열번호 147의 중쇄 가변영역 및 서열번호 172의 경쇄 가변영역;
서열번호 148의 중쇄 가변영역 및 서열번호 173의 경쇄 가변영역;
서열번호 149의 중쇄 가변영역 및 서열번호 174의 경쇄 가변영역;
서열번호 150의 중쇄 가변영역 및 서열번호 175의 경쇄 가변영역;
서열번호 151의 중쇄 가변영역 및 서열번호 176의 경쇄 가변영역;
서열번호 152의 중쇄 가변영역 및 서열번호 177의 경쇄 가변영역;
서열번호 153의 중쇄 가변영역 및 서열번호 178의 경쇄 가변영역;
서열번호 154의 중쇄 가변영역 및 서열번호 179의 경쇄 가변영역;
서열번호 155의 중쇄 가변영역 및 서열번호 180의 경쇄 가변영역;
서열번호 156의 중쇄 가변영역 및 서열번호 181의 경쇄 가변영역; 또는
서열번호 157의 중쇄 가변영역 및 서열번호 182의 경쇄 가변영역.
상기 링커는 펩타이드 링커일 수 있으며, 약 10-25 aa 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, 글리신 및/또는 세린과 같은 친수성 아미노산이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 상기 링커는 예를 들어, (GS)n, (GGS)n, (GSGGS)n 또는 (GnS)m (n, m은 각각 1 내지 10)을 포함할 수 있으나, 상기 링커는 예를 들어 (GnS)m (n, m은 각각 1 내지 10)일 수 있다. 구체적으로, 상기 링커는 GGGGS를 포함할 수 있고, 예를 들어 3회 반복된 서열번호 185의 GGGGSGGGGSGGGGS일 수 있다.
"파지 디스플레이"는 변이체 폴리펩티드를 파지, 예를 들어 섬유상 파지 입자의 표면 상에 외피 단백질의 적어도 일부와의 융합 단백질로서 디스플레이하는 기술이다. 파지 디스플레이의 유용성은 무작위화 단백질 변이체의 큰 라이브러리를 대상으로 하여, 표적 항원과 고친화도로 결합하는 서열을 신속하고도 효율적으로 분류할 수 있다는 사실에 있다. 펩티드 및 단백질 라이브러리를 파지 상에 디스플레이하는 것은 특이적 결합 특성을 지닌 폴리펩티드를 알아보기 위해 수 백만개의 폴리펩티드를 스크리닝하는데 사용되어 왔다.
파지 디스플레이 기술은 특정 리간드(예: 항원)와 결합하는 신규 단백질을 생성 및 선별하기 위한 강력한 도구를 제공하였다. 파지 디스플레이 기술을 사용하여, 단백질 변이체의 큰 라이브러리를 생성시키고, 표적 항원과 고 친화성으로 결합하는 서열을 신속하게 분류할 수 있다. 변이체 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 바이러스성 외피 단백질, 예를 들어 유전자 III 단백질 또는 유전자 VIII 단백질을 암호화하는 핵산 서열과 융합시킨다. 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 유전자 III 단백질의 일부를 암호화하는 핵산 서열과 융합시킨 1가 파지 디스플레이 시스템이 개발되었다. 1가 파지 디스플레이 시스템에서는, 유전자 융합물이 저수준으로 발현되고 야생형 유전자 III 단백질이 또한 발현되어 입자 감염성이 유지된다.
섬유상 파지 표면 상에서의 펩티드의 발현과 E. coli의 주변세포질에서의 기능성 항체 단편의 발현을 입증하는 것이 항체 파지 디스플레이 라이브러리를 개발하는 데에 있어 중요하다. 항체 또는 항원 결합성 폴리펩티드의 라이브러리는 수 많은 방식, 예를 들어 무작위 DNA 서열을 삽입함으로써 단일 유전자를 변경시키는 방법 또는 관련 유전자 계열을 클로닝하는 방법으로 제조하였다. 라이브러리를 대상으로 하여, 목적하는 특징을 수반한 항체 또는 항원 결합성 단백질의 발현에 관하여 스크리닝할 수 있다.
파지 디스플레이 기술은 목적하는 특징을 지닌 항체를 제조하기 위한 통상적인 하이브리도마 및 재조합 방법에 비해 몇 가지 이점을 지니고 있다. 이러한 기술은 동물을 사용하지 않고서도 짧은 시간에 다양한 서열을 지닌 큰 항체 라이브러리를 생성시킬 수 있도록 한다. 하이브리도마의 제조나 인간화 항체의 제조는 수 개월의 제조기간을 필요로 할 수 있다. 또한, 면역이 전혀 요구되지 않기 때문에, 파지 항체 라이브러리는 독성이거나 항원성이 낮은 항원에 대해서도 항체를 생성시킬 수 있다. 파지 항체 라이브러리를 또한 사용하여 신규한 치료적 항체를 생성 및 확인할 수 있다.
파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 면역시킨, 비-면역시킨 인간, 생식세포계 서열, 또는 미감작 B 세포 Ig 레퍼토리 (repertory)로부터 인간 항체를 생성시키는 기술을 사용할 수 있다. 각종 림프계 조직을 사용하여, 미감작 또는 비면역 항원 결합성 라이브러리를 제조할 수 있다.
파지 디스플레이 라이브러리로부터 고친화성 항체를 확인 및 분리할 수 있는 기술은 치료용 신규 항체 분리에 중요하다. 라이브러리로부터 고친화성 항체를 분리하는 것은 라이브러리의 크기, 세균성 세포 중에서의 생산 효율 및 라이브러리의 다양성에 좌우될 수 있다. 라이브러리의 크기는 항체 또는 항원 결합성 단백질의 부적절한 폴딩과 정지 코돈의 존재로 인한 비효율적 생산에 의해 감소된다. 세균성 세포에서의 발현은 항체 또는 항원 결합성 도메인이 적절하게 폴딩되지 않는 경우에는 억제될 수 있다. 발현은 가변/불변 계면의 표면이나 선별된 CDR 잔기에서의 잔기를 교대로 돌연변이 시킴으로써 개선시킬 수 있다. 골격 영역의 서열은 세균성 세포에서 항체 파지 라이브러리를 생성시키는 경우에 적절한 폴딩을 제공하기 위한 하나의 요소이다.
고친화성 항체 분리에서 항체 또는 항원 결합성 단백질의 다양한 라이브러리를 생성시키는 것이 중요하다. CDR3 영역은 이들이 종종 항원 결합에 참여하는 것으로 밝혀졌다. 중쇄 상의 CDR3 영역은 크기, 서열 및 구조적 입체 형태 면에서 상당히 다양하므로, 이를 이용하여 다양한 라이브러리를 제조할 수 있다.
또한, 각 위치에서 20개 아미노산 모두를 사용하여 가변 중쇄 및 경쇄의 CDR 영역을 무작위화함으로써 다양성을 발생시킬 수 있다. 20개의 모든 아미노산을 사용하면 다양성이 큰 변이체 항체 서열이 생성되고 신규한 항체를 확인할 기회가 증가할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항체 단편은 FGFR3를 특이적으로 인식할 수 있는 범위 내에서, 본 명세서에 기재된 본 발명의 항-FGFR3 항체의 서열뿐만 아니라, 이의 생물학적 균등물도 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 보다 더 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 추가적인 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 가지며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 항체 또는 이를 코딩하는 핵산 분자는 서열번호에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)은 NBCI 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLAST는 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_ help.html에서 확인할 수 있다.
이에 기초하여, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 명세서에 기재된 명시된 서열 또는 전체와 비교하여 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상의 상동성을 가질 수 있다. 이러한 상동성은 당업계에 공지된 방법에 의한 서열 비교 및/또는 정렬에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 서열 비교 알고리즘(즉, BLAST 또는 BLAST 2.0), 수동 정렬, 육안 검사를 이용하여 본 발명의 핵산 또는 단백질의 퍼센트 서열 상동성을 결정할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산에 관한 것이다. 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산을 분리하여 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 재조합적으로 생산할 수 있다.
"핵산"은 DNA(gDNA 및 cDNA) 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산에서 기본 구성단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다. 본 발명의 중쇄 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산의 서열은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오타이드의 추가, 결실, 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.
상기 항체를 암호화하는 DNA는 통상적인 분자생물학적 수법을 사용하여 (예를 들어, 항체와 중쇄와 경쇄를 암호화하는 DNA와 특이적으로 결합할 수 있는 올리코뉴클레오타이드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 분리 또는 합성할 수 있으며, 핵산을 분리하고, 이를 복제 가능한 벡터 내로 삽입하여 추가로 클로닝하거나(DNA의 증폭) 또는 추가로 발현시킨다. 이를 바탕으로, 본 발명은 또 다른 관점에서 상기 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "벡터"는 숙주세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터 등을 포함한다. 벡터의 성분으로는 일반적으로 다음 중의 하나 이상이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다: 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 항생제 내성 마커 유전자, 증강인자 요소, 프로모터, 전사 종결 서열. 항체를 코딩하는 핵산은 프로모터 및 전사 종결 서열 등과 같이 작동적으로 연결되어 있다.
"작동적으로 연결"은 핵산 발현조절서열(예: 프로모터, 시그널 서열 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 따라 상기 조절서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
원핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ 프로모터, pRλ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 또한, 예를 들어, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터, β-액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈 프로모터 및 사람 근육 크레아틴 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, HSV의 tk 프로모터, 마우스 유방종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 LTR 프로모터, 몰로니 바이러스의 프로모터엡스타인바 바이러스(EBV)의 프로모터 및 로우스 사코마 바이러스(RSV)의 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
경우에 따라서, 벡터는 그로부터 발현되는 항체의 정제를 용이하게 하기 위하여 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은, 예컨대 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA) 및 6x His(hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있다.
상기 벡터는 선택표지로서 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 재조합 발현 벡터로 형질감염된 숙주세포에 관한 것이다. 본 발명의 항체를 생성시키기 위해 사용된 숙주세포는 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵생물 세포일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilus 및 바실러스 투링기엔시스 (Bacillus thuringiensis)와 같은 바실러스 속 균주, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas)(예를 들면, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)), 프로테우스미라빌리스(Proteus mirabilis) 및 스타필로코쿠스(Staphylococcus)(예를 들면, 스타필로코쿠스 카르노수스(Staphylocus carnosus))와 같은 원핵 숙주세포를 이용할 수 있다.
다만, 동물 세포에 대한 관심이 가장 크며, 유용한 숙주 세포주의 예는 COS-7, BHK, CHO, CHOK1, DXB-11, DG-44, CHO/-DHFR, CV1, COS-7, HEK293, BHK, TM4, VERO, HELA, MDCK, BRL 3A, W138, Hep G2, SK-Hep, MMT, TRI, MRC 5, FS4, 3T3, RIN, A549, PC12, K562, PER.C6, SP2/0, NS-0, U20S, 또는 HT1080일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 숙주세포를 배양하여 항체를 생성하는 단계; 및 생성된 항체를 분리 및 정제하는 단계를 포함하는, FGFR3에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편의 제조방법에 관한 것이다.
상기 숙주세포는 각종 배지에서 배양할 수 있다. 시판용 배지 중 제한없이 배양 배지로서 사용할 수 있다. 당업자에게 공지되어 있는 기타 모든 필수 보충물이 적당한 농도로 포함될 수도 있다. 배양 조건, 예를 들어 온도, pH 등이 발현을 위해 선별된 숙주세포와 함께 이미 사용되고 있고, 이는 당업자에게 명백할 것이다.
상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 회수는 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 불순물을 제거하고, 그 결과물을 예를 들어 친화 크로마토그래피 등을 이용하여 정제할 수 있다. 추가의 기타 정제 기술 예를 들어 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호 작용 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피 등이 사용될 수 있다.
이중 또는 다중특이적 항체
본 발명은 다른 관점에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 이중 또는 다중특이적 항체에 관한 것이다.
이중특이적 항체는 하나 이상의 타겟에 결합능 또는 길항능을 가지는 항체를 의미하며, 2개의 서로 다른 타겟에 대한 결합능 또는 길항능을 가지는 항체가 결합된 형태 또는 한 타겟에 대한 결합능을 가지는 항체와 다른 타겟에 대한 길항능을 가지는 물질이 결합되어 있는 항체를 의미한다.
다중특이적 항체는 적어도 3 이상의 상이한 항원에 대해 결합 특이성을 가지는 항체를 의미한다. 다중특이적(multi-specific) 항체는 삼중특이적(Tri-specific) 이상의 항체, 예를 들어 삼중특이적(Tri-specific) 항체, 사중특이적(Tetra-specific) 항체 또는 그 이상의 타겟을 표적하는 항체를 포함할 수 있다.
이중특이적 또는 다중특이적 항체에 속하는 항체들은 scFv 기반 항체, Fab 기반 항체 및 IgG 기반 항체 등으로 구분할 수 있다. 이중특이적 또는 다중특이적 항체의 경우 두 개 이상의 신호를 동시에 억제 또는 증폭시킬 수 있기 때문에 하나의 신호를 억제/증폭하는 경우보다 더욱 효과적일 수 있으며, 각각의 신호를 각각의 신호억제제로 처리했을 경우와 비교하면, 저용량 투약이 가능하며, 동일한 시간 및 공간에서의 두 개 이상의 신호를 억제/증폭시킬 수 있다.
이중특이적 또는 다중특이적 항체의 제조 방법은 널리 공지되어 있다. 전통적으로, 이중특이적 항체의 재조합 생산은 두 개 이상의 중쇄가 상이한 특이성을 가지는 조건에서 두 개 이상의 면역글로불린 중쇄/경쇄 쌍의 공동 발현을 근간으로 한다.
scFv를 기반으로 하는 이중특이적 또는 다중특이적 항체의 경우, 상이한 scFv들의 VL과 VH를 각기 서로 조합하여 혼성 scFv를 heterodimeric 형태로 제조하여 디아바디(diabody)를 만들 수 있고, 상이한 scFv를 서로 연결해서 tendem ScFv를 제조할 수 있으며, Fab의 CH1과 CL을 각각의 scFv의 말단에 발현시켜 heterodimeric 미니항체(miniantibody)를 제조할 수 있고, Fc의 homodimeric 도메인인 CH3 도메인의 일부 아미노산을 치환하여 'knob into hole' 형태의 heterodimeric 구조로 변경시켜, 이들 변경된 CH3 도메인을 상이한 각각의 scFv 말단에 발현시킴으로써 heterodimeric scFv 형태의 미니바디(minibody)를 제조할 수 있다.
Fab을 기반으로 하는 이중특이적 또는 다중특이적 항체의 경우, 특정 항원에 대한 개별 Fab'를 이황화결합 또는 매개체를 이용해서 서로 조합하여 heterodimeric Fab 형태로 제조할 수 있고, 특정 Fab의 중쇄 또는 경쇄의 말단에 상이한 항원에 대한 scFv를 발현시킴으로써 항원 결합가(valency)를 2개로 하거나, Fab과 scFv 사이에 경첩부위(hinge region)를 둠으로써 homodimeric 형태로 4개의 항원결합가를 가지도록 제조할 수 있다. 또한, Fab의 경쇄 말단과 중쇄 말단에 상이한 항원에 대한 scFv를 융합시킴으로써 항원에 대한 결합가를 3개로 만든 이중표적 바이바디(bibody), Fab의 경쇄 말단과 중쇄 말단에 상이한 scFv를 각각 융합시킴으로써 항원에 대한 결합가를 3개로 가지도록 한 삼중표적 바이바디, 상이한 Fab 3개를 화학적으로 접합시킴으로써 수득할 수 있다.
IgG를 기반으로 하는 이중특이적 또는 다중특이적 항체의 경우, 트리온파마(Trion Pharma)사에 의해 마우스와 렛트 하이브리도마를 다시 교잡함으로써, 하이브리드 하이브리도마, 일명 쿼드로마(quadromas)를 제조하여 이중특이적 항체를 생산하는 방법이 알려져 있다. 또한, 경쇄부분은 공유하면서, 상이한 중쇄에 대해서 Fc의 CH3 homodimeric 도메인의 일부 아미노산을 변형시켜 heterodimeric 형태로 제작한 이른 바 'Holes and Knob' 형태로 이중특이적 항체를 제조할 수 있다. heterodimeric 형태의 이중특이적 항체 이외에, 상이한 2종의 scFv를 IgG의 경쇄와 중쇄의 가변 도메인 대신 constant 도메인에 각각 융합 발현시켜 homodimeric 형태의 (scFv)4-IgG로 제조할 수 있다. 또한, 임클론(ImClone)사는 인간 VEGFR-2에 대한 키메릭 단클론항체인 IMC-1C11을 기반으로하여, 이 항체의 경쇄 아미노 말단에 마우스 혈소판유도성장인자수용체-알파(Platelet-derived Growth Factor Receptor-α)에 대한 single variable domain만을 융합시켜 이중특이적 항체를 제작하여 보고하였다. 또한, 단백질 카이네이즈 A(protein kinase A, PKA) R 서브유닛의 dimerization and docking domain(DDD)과 PKA의 anchoring domain을 이용한 이른 바 'dock and lock(DNL)' 방법을 통해서 CD20에 대한 다수의 항원결합가를 지니는 항체로 제작할 수 있다.
매우 다양한 재조합 항체 포맷, 예를 들면, 2가 이상, 3가 이상 또는 4가 이상의 이중특이적 또는 다중특이적 항체가 개발되었다. 예를 들어, 국제특허출원 공개 제WO2001/077342호, 제WO2009/080251호, 제WO2009/080252호, 제WO2009/080253호, 제WO2009/080254호, 제WO2010/112193호, 제WO2010/115589호, 제WO2010/136172호, 제WO2010/145792호, 제WO2010/145793호 및 제WO2011/117330호에 기재된 2가 이상, 3가 이상 또는 4가 이상의 항체도 포함한다. 2가 이상, 3가 이상 또는 4가 이상의 항체는 각각 2개 이상의 결합 도메인, 3개 이상의 결합 도메인 또는 4개 이상의 결합 도메인이 항체 분자에 존재한다는 것을 표시한다.
구체적 실시예에서, 본 발명에 따른 이중 또는 다중특이적 항체는 상기 항-FGFR3 항체 또는 항원 결합단편을 구체적으로 IgG 완전한 항체 또는 이의 단편 형태 예를 들어 단일쇄 Fv, VH 도메인 및/또는 VL 도메인, Fab 또는 (Fab)2의 형태로 포함할 수 있다.
또한, 상기 FGFR3을 타겟으로 하는 항체와 다른 타겟에 결합하는 항체 예를 들어, PD-1, PD-L1, BTLA, CTLA-4, VISTA, LAG3, TIM3, CD137(4-1BB), VISTA, CD258(LIGHT), TIGIT, CD134(OX40), CD28, CD278(ICOS), CD27, CD154(CD40L), CD357(GITR), CD30, DR3, CD226(DNAM1), CD96, CD200, CD200R, Transferrin receptor, c-Met, EGFR, HER2, KDR, PDGFRa, NRP1, MARCO으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 타겟하는 항체 구체적으로 IgG 완전한 항체 또는 이의 단편 형태 예를 들어 단일쇄 Fv, VH 도메인 및/또는 VL 도메인, Fab 또는 (Fab)2의 형태로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 이중 또는 다중특이적 항체를 통해 FGFR3 이외에, 다른 타겟에 의해 유도되거나 매개된 추가적 결합 특이성을 확보할 수 있다.
예를 들어, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 FGFR3와 PD-1, PD-L1, BTLA, CTLA-4, VISTA, LAG3, TIM3, CD137(4-1BB), VISTA, CD258(LIGHT), TIGIT, CD134(OX40), CD28, CD278(ICOS), CD27, CD154(CD40L), CD357(GITR), CD30, DR3, CD226(DNAM1), CD96, CD200, CD200R, Transferrin receptor, c-Met, EGFR, HER2, KDR, PDGFRa, NRP1, MARCO으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 동시에 타겟으로 할 수 있다.
예를 들어, 본 발명에 따른 다중특이적 항체는 FGFR3와 PD-1, PD-L1, BTLA, CTLA-4, VISTA, LAG3, TIM3, CD137(4-1BB), VISTA, CD258(LIGHT), TIGIT, CD134(OX40), CD28, CD278(ICOS), CD27, CD154(CD40L), CD357(GITR), CD30, DR3, CD226(DNAM1), CD96, CD200, CD200R, Transferrin receptor, c-Met, EGFR, HER2, KDR, PDGFRa, NRP1, MARCO으로 구성된 군에서 선택된 둘 이상을 동시에 타겟으로 할 수 있다.
면역세포 인게이징(immune cell engage) 이중특이적 또는 다중특이적 항체
본 발명은 또 다른 관점에서 항체의 scFv 및 면역세포 활성화 항원에 결합하는 항체의 scFv를 하나 이상 포함하는 제2결합 도메인으로 구성된 scFv를 포함하는, 면역세포 인게이징(immune cell engage) 이중특이적 또는 다중특이적 항체에 관한 것이다.
상기 면역세포 인게이징 이중특이적 또는 다중특이적 항체를 통해 세포독성 T 세포와 암 타겟 세포 사이의 세포 용해성 시냅스를 일시적으로 유도하여 독성물을 방출하도록 한다.
하나의 실시예에서, 상기 면역세포는 T 세포, NK 세포, 사이토카인 유도 살해세포(Cytokine Induced Killer cell, CIK), 활성화 세포독성 T 림프구(Cytotoxic T Lymphocyte, CTL), 마크로파지, 종양 조직 내 침투 T 세포 (Tumor-Infiltrating Lymphocytes, TIL), 수지상세포로 구성된 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
하나의 실시예에서, 상기 면역세포 활성화 항원은 예를 들어 다음에서 선택될 수 있으며, 이에 결합하는 항체가 면역세포 인게이징(immune cell engage) 역할을 할 수 있다:
T 세포 활성화 항원은 CD3, TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRξ, ICOS, CD28, CD27, HVEM, LIGHT, CD40, 4-1BB, OX40, DR3, GITR, CD30, TIM1, SLAM, CD2, 또는 CD226;
NK세포 활성화 항원은 NKp30, NKp40, NKp44, NKp46, NKG2D, DNAM1, DAP10, CD16 (e.g., CD16a, CD16b), CRTAM, CD27, PSGL1, CD96, CD100 (SEMA4D), NKp80, CD244 (SLAMF4 또는 2B4), SLAMF6, SLAMF7, KIR2DS2, KIR2DS4, KIR3DS1, KIR2DS3, KIR2DS5, KIR2DS1, CD94, NKG2C, NKG2E 또는 CD160;
B세포 활성화 항원은 OX40, CD40 또는 CD70;
대식세포 활성화 항원은 CD2 아고니스트, CD40, CD70, TCR (Toll-like Receptor) 아고니스트, CD47, STING 또는 OX40L; 또는
수지상세포 활성화 항원은 CD2 아고니스트, OX40, OX40L, 41BB 아고니스트, TCR 아고니스트, CD47 아고니스트, 또는 STING 아고니스트.
면역세포 인게이저(immune cell engager)는 미국특허출원공개 제2017/0368169호에 구체적으로 기재되어 있으며, 본 발명에 참조로서 도입될 수 있다.
구체적으로, 상기 면역세포 인게이징 이중특이적 또는 다중특이적 항체는 직렬 scFv를 포함하고, 다음의 항원 및 암세포 상의 표면 항원에 결합할 수 있다. 상기 암세포 상의 표면 항원은 본 발명에 따른 항체가 표적하는 FGFR3이다:
CD3, TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRξ, ICOS, CD28, CD27, HVEM, LIGHT, CD40, 4-1BB, OX40, DR3, GITR, CD30, TIM1, SLAM, CD2, 또는 CD226;
NKp30, NKp40, NKp44, NKp46, NKG2D, DNAM1, DAP10, CD16 (e.g., CD16a, CD16b), CRTAM, CD27, PSGL1, CD96, CD100 (SEMA4D), NKp80, CD244 (SLAMF4 또는 2B4), SLAMF6, SLAMF7, KIR2DS2, KIR2DS4, KIR3DS1, KIR2DS3, KIR2DS5, KIR2DS1, CD94, NKG2C, NKG2E 또는 CD160;
OX40, CD40 또는 CD70;
CD2 아고니스트, CD40, CD70, TCR (Toll-like Receptor) 아고니스트, CD47, STING 또는 OX40L; 또는
CD2 아고니스트, OX40, OX40L, 41BB 아고니스트, TCR 아고니스트, CD47 아고니스트, 또는 STING 아고니스트.
상기 면역세포 인게이징 이중특이적 또는 다중특이적 항체는 예를 들어, VL(FGFR3)-VH(FGFR3)-VH(CD3 또는 CD16A)-VL(CD3 또는 CD16A), VH(FGFR3)-VL(FGFR3)-VH(CD3 또는 CD16A)-VL(CD3 또는 CD16A), VH(CD3 또는 CD16A)-VL(CD3 또는 CD16A)-VH(FGFR3)-VL(FGFR3) 또는 VH(CD3 또는 CD16A)-VL(CD3 또는 CD16A)-VL(FGFR3)-VH(FGFR3) 형태의 구조를 포함할 수 있다.
상기 scFv는 예를 들어, 서열번호 133 내지 서열번호 157, 서열번호 203 내지 서열번호 215로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역과 서열번호 158 내지 서열번호 182, 서열번호 216 내지 서열번호 219로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하고, 상기 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역은 링커로 연결될 수 있다.
상기 링커는 펩타이드 링커일 수 있으며, 약 10-25 aa 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, 글리신 및/또는 세린과 같은 친수성 아미노산이 포함될 수 있다.
상기 링커는 예를 들어, (GS)n, (GGS)n, (GSGGS)n 또는 (GnS)m (n, m은 각각 1 내지 10)을 포함할 수 있으나, 상기 링커는 예를 들어 (GnS)m (n, m은 각각 1 내지 10)일 수 있다. 구체적으로, 상기 링커는 GGGGS를 포함할 수 있고, 예를 들어 3회 반복된 서열번호 185의 GGGGSGGGGSGGGGS일 수 있다.
상기 면역세포 인게이징 이중특이적 또는 다중특이적 항체의 예시로, CD3 및 CD19에 결합하는 블리나투모마브(blinatumomab)(Amgen); CD3 및 EpCAM에 결합하는 솔리토마브(solitomab)(Amgen); CD3 및 CEA에 결합하는 MEDI 565(MedImmune, Amgen); 및 CD3 및 PSMA에 결합하는 BAY2010112(Bayer, Amgen)를 포함한다. 예시적인 DART는 CD3 및 CD123에 결합하는 MGD006(Macrogenics); 및 CD3 및 gpA33에 결합하는 MGD007(Macrogenics)를 포함한다. 예시적인 TandAbs는 CD3 및 CD19에 결합하는 AFM11(Affimed Therapeutics); 및 CD30 및 CD16A에 결합하는 AFM13(Affimed Therapeutics)을 포함할 수 있다.
항체-약물 접합체 (ADC)
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편이 약물에 결합된 항체-약물 접합체 (ADC)에 관한 것이다.
항체-약물 접합체는 타겟 암세포로 항암 약물을 전달하기 전까지 항암 약물이 항체에 안정적으로 결합되어 있어야 한다. 타겟으로 전달된 약물은 항체로부터 유리되어 타겟 세포의 사멸을 유도해야 한다. 이를 위해서는 약물이 항체에 안정적으로 결합함과 동시에 타겟 세포에서 유리될 때는 타겟 세포의 사멸을 유도할 충분한 세포독성을 가져야 한다.
하나의 실시예에서, 상기 항체는 링커를 통하여 약물에 결합될 수 있다. 상기 링커는 항-FGFR3 항체와 약물 사이를 연결하는 부위로, 세포내 조건에서 절단 가능한 형태 즉, 세포 내 환경에서 항체에서 약물이 방출될 수 있도록 하며, 항체의 긴 반감기를 반영하여 항체가 전신 순환 중에는 안정하고, 링커와 약물의 결합이 항체의 안정성 및 약물 동태에 영향을 주지 않아야 한다.
상기 링커는 예를 들어 절단성 링커 또는 비절단성 링커를 포함할 수 있다. 절단성 링커의 경우 펩타이드 링커와 같이 세포 내 펩티다아제 또는 프로테아제 효소 예를 들어 리소좀 또는 엔도좀 프로테아제에 의해 절단될 수 있고, 비절단성 링커의 경우 예를 들어 티오에테르 링커는 항체가 세포내 가수분해에 의해 비선택적으로 분해된 후에 약물이 방출될 수 있다.
하나의 실시예에서, 상기 절단성 링커는 펩타이드 링커를 포함할 수 있다. 상기 펩타이드 링커는 적어도 2개 이상의 아미노산 길이를 가진다. 예를 들어, Val-Cit, Val-Ala, 또는 Val-Cit의 디펩티드 또는 Phe-Leu 또는 Gly-Phe-Leu-Gly가 포함될 수 있다. 링커의 예시는 국제특허출원공개 제WO2004/010957호에 구체적으로 기재되어 있으며, 본 발명에 참조로서 도입될 수 있다.
상기 항체-약물 접합체는 표적 암세포의 항원에 ADC의 항체영역이 결합하여 ADC-항원 복합체를 형성한 후 엔도좀-리소좀 경로로 암세포 내부로 내포화 된다. 이 경우 세포 독성 약물의 세포 내 방출은 엔도솜/리소좀의 내부 환경에 의해 조절된다.
하나의 실시예에서, 상기 절단성 링커는 pH 민감성으로, 특정 pH 값에서 가수분해에 민감할 수 있다. 일반적으로, pH 민감성 링커는 산성 조건에서 가수분해될 수 있음을 나타낸다. 예를 들어, 리소좀에서 가수분해될 수 있는 산성 불안정 링커 예를 들어, 하이드라존, 세미카바존, 티오세미카바존, 시스-아코니틱 아마이드 (cis-aconitic amide), 오르쏘에스테르, 아세탈, 케탈 등일 수 있다.
다른 실시예에서, 상기 링커는 환원 조건에서 절단될 수도 있으며, 예를 들어 이황화 링커가 이에 해당할 수 있다. SATA (N-succinimidyl-S-acetylthioacetate), SPDP (N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionate), SPDB (N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)butyrate) 및 SMPT (N-succinimidyl-oxycarbonyl-alpha-methyl-alpha-(2-pyridyl-dithio)toluene)를 사용하여 다양한 이황화 결합이 형성될 수 있다. 이러한 이황화 링커는 세포내 글루타치온의 티올과 이황화 교환에 의해 분해될 수 있다.
상기 약물 및/또는 약물-링커는 항체의 라이신을 통해 무작위로 접합되거나, 이황화 결합 사슬을 환원하였을 때 노출되는 시스테인을 통해 접합될 수 있다. 경우에 따라서, 유전공학적으로 제작된 태그 예를 들어, 펩타이드 또는 단백질에 존재하는 시스테인을 통해 링커-약물이 결합될 수 있다. 상기 유전공학적으로 제작된 태그 예를 들어, 펩타이드 또는 단백질은 예를 들어, 이소프레노이드 트랜스퍼라제에 의하여 인식될 수 있는 아미노산 모티프를 포함할 수 있다. 상기 펩타이드 또는 단백질은 펩타이드 또는 단백질의 카복시 말단에서 결실(deletion)을 가지거나, 펩타이드 또는 단백질의 카복시(C) 말단에 스페이서 유닛의 공유결합을 통한 부가를 갖는다.
상기 펩타이드 또는 단백질은 아미노산 모티프와 바로 공유결합되거나 스페이서 유닛과 공유결합되어 아미노산 모티프와 연결될 수 있다. 상기 아미노산 스페이서 유닛은 1 내지 20개의 아미노산으로 구성되며, 그 중에서 글리신(Glycine) 유닛이 바람직하다.
상기 이소프레노이드 트랜스퍼라제는 예를 들어, 파네실트랜스퍼라제 (FTase, farnesyl protein transferase) 또는 게라닐게라닐트랜스퍼라제 (GGTase, geranylgeranyl transferase)일 수 있고, FTase 및 GGTase I은 앞서 언급한 화학식 1 중 CAAX 모티프를 인식할 수 있고, GGTase II는 XXCC, XCXC 또는 CXX 모티프(여기서 C는 시스테인이고, A는 지방족 아미노산이고, X는 이소프레노이드 트랜스퍼라제의 기질 특이성을 결정하는 아미노산이다)를 인식할 수 있다.
또 다른 실시예에서, 상기 링커는 리소좀에서 다수 존재하거나, 또는 몇몇 종양세포에서 과발현되는 베타-글루쿠로니데이즈(β-glucuronidase)에 의해 인식되어 가수분해 되는 베타-글루쿠로나이드 링커를 포함할 수 있다. 펩타이드 링커와는 달리 친수성(hydrophilicity)이 커서 소수성의 성질이 높은 약물과 결합시 항체-약물 복합체의 용해도를 증가시킬 수 있는 장점을 지닌다.
이와 관련하여, 국제특허출원공개 제WO2015/182984호에 개시된 베타-글루쿠로나이드 링커, 예를 들어 자가-희생기 (self-immolative group)를 포함하는 베타-글루쿠로나이드 링커를 사용할 수 있으며, 위 문헌은 참조로 도입된다.
경우에 따라서, 상기 링커는 예를 들어 비절단성 링커일 수 있으며, 세포 내에서 항체 가수분해 한 단계만을 통해 약물이 방출되어, 예를 들어 아미노산-링커-약물 복합체를 생산한다. 이러한 유형의 링커는 티오에테르기 또는 말레이미도카프로일기 (maleimidocaproyl)일 수 있고, 혈액 내 안정성을 유지할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 항체의 이황화 결합 사슬을 환원하였을 때 노출되는 시스테인을 통해 링커-약물이 무작위 결합 또는 서열 GGGGGGGCVIM을 가지는 항체 말단 결합 펩타이드를 도입하여 링커-약물이 결합될 수 있다.
상기 약물 (화학식 (1)의 D 포함)은 약리학적 효과를 나타내는 제제로 항체에 결합될 수 있으며, 구체적으로 화학요법제, 독소, 마이크로 RNA (miRNA), siRNA, shRNA 또는 방사성 동위원소일 수 있다. 상기 화학요법제는 예를 들어, 세포독성 제제 또는 면역억제제일 수 있다. 구체적으로 마이크로투불린 억제제, 유사분열 억제제, 토포이소머라아제 억제제, 또는 DNA 인터컬레이터로서 기능할 수 있는 화학요법제를 포함할 수 있다. 또한, 암, 염증 또는 면역질환 치료용 약물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 면역조절 화합물, 항암제, 항바이러스제, 항박테리아제, 항진균제, 구충제 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
상기 항암제는 예를 들어, 마이탄시노이드, 오리스타틴 (MMAE, MMAF 포함), 아미노프테린, 악티노마이신, 블레오마이신, 탈리소마이신, 캄프토쎄신, N8-아세틸 스퍼미딘, 1-(2 클로로에틸)-1,2-다이메틸 술포닐 하이드라자이드, 에스퍼라마이신, 에토포사이드, 6-머캅토퓨린, 돌라스타틴, 트리코테센, 칼리케아미신, 탁솔(taxol), 탁산, 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 메토트렉세이트, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 A, 미토마이신 C, 클로람부실, 듀오카마이신, L-아스파라기나제(L-asparaginase), 머캡토퓨린(mercaptopurine), 티오구아닌(thioguanine), 하이드록시우레아(hydroxyurea), 시타라빈(cytarabine), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide), 니트로소우레아(nitrosourea), 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 미토마이신(mitomycin), 다카바진(dacarbazine), 프로카바진(procarbazine), 토포테칸(topotecan), 질소 머스터드(nitrogen mustard), 사이톡산(cytoxan), 에토포시드(etoposide),5-플루오로우라실(5-fluorouracil), CNU(bischloroethylnitrosourea), 이리노테칸(irinotecan), 캄포토테신(camptothecin), 블레오마이신(bleomycin), 이다루비신(idarubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 닥티노마이신(dactinomycin), 플리카마이신(plicamycin), 미톡산트론(mitoxantrone), 아스파라기나제(asparaginase), 비노렐빈(vinorelbine), 클로로람부실(chlorambucil), 멜파란(melphalan), 카르무스틴(carmustine), 로무스틴(lomustine), 부설판(busuLfan), 트레오설판(treosulfan), 데카바진(decarbazine), 에토포시드(etoposide), 테니포시드(teniposide), 토포테칸(topotecan), 9-아미노캠프토테신(9-aminocamptothecin), 크리스나톨(crisnatol), 미토마이신 C(mitomycin C), 트리메트렉세이트(trimetrexate), 마이코페놀산(mycophenolic acid), 티아조퓨린(tiazofurin), 리바비린(ribavirin), EICAR(5-ethynyl-1-beta-Dribofuranosylimidazole-4-carboxamide), 하이드록시우레아(hydroxyurea), 데프록사민(deferoxamine), 플룩수리딘(floxuridine), 독시플루리딘(doxifluridine), 랄티트렉세드(raltitrexed), 시타라빈(cytarabine(ara C)), 시토신 아라비노시드(cytosine arabinoside), 플루다라빈(fludarabine), 타목시펜(tamoxifen), 라록시펜(raloxifene), 메게스트롤(megestrol), 고세렐린(goserelin), 류프롤리드 아세 테이트(leuprolide acetate), 플루타미드(flutamide), 바이칼루타마이드(bicalutamide), EB1089, CB1093, KH1060, 베르테포르핀(verteporfin), 프탈로시아닌(phthalocyanine), 광감작제 Pe4(photosensitizer Pe4), 데메톡시-하이포크레린 A(demethoxy-hypocrellin A), 인터페론-α(Interferon-α), 인터페론-γ(Interferon-γ), 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor), 겜사이타빈(Gemcitabine), 벨케이드(velcade), 레발미드(revamid), 탈라미드(thalamid), 로바스타틴(lovastatin), 1-메틸-4-페닐피리디늄 이온(1-methyl-4-phenylpyridiniumion), 스타우로스포린(staurosporine), 악티노마이신 D(actinomycin D), 닥티노마이신(dactinomycin), 블레오마이신 A2(bleomycin A2), 블레오마이신 B2(bleomycinB2), 페플로마이신(peplomycin), 에피루비신(epirubicin), 피라루비신(pirarubicin), 조루비신(zorubicin), 마이토산트론(mitoxantrone), 베라파밀(verapamil) 및 탑시가르긴(thapsigargin), 핵산 분해 효소 및 세균이나 동식물 유래의 독소로 구성된 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 항염증제는 당질코르티코이드 수용체에 결합하여 염증이나 부기를 줄이는 스테로이드제제, 염증을 만드는 프로스타글란딘을 합성하는 고리형산소화효소(COX)에 대응하여 통증을 완화하는 비-스테로이드항염증제(NSAIDs) 또는 염증세포의 활성화와 이송을 바꾸는 면역특이소염제제(ImSAIDs) 등이 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 면역질환 치료제로 아자티오프린, 클로람부실, 사이클로포스파마이드, 사이클로스포린, 미코페놀레이트, 아자치오프린(azathioprine), 또는 메토트렉세이트(methotrexate)를 포함할 수 있으나, 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
구체적으로, 면역억제제로는 칼시뉴린 억제제인 타크로리무스 (tacrolimus), 유전자 합성 억제제인 마이코페노레이트 모페틸 (mycopheno late mofetil), 또는 항염증 스테로이드인 프레드니손 (predni sone) 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
경우에 따라서, 상기 약물은 링커 및 링커 시약 상의 친전자성 기와 공유결합을 형성하기 위해 반응할 수 있는 아민, 티올, 히드록실, 히드라지드, 옥심, 히드라진, 티오세미카바존, 히드라진 카르복실레이트, 및 아릴히드라지드기로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 친핵기를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 구체적 실시예에서 MC-vc-PAB 링커를 통해, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 약물 예를 들어, 오리스타틴 (MMAE)과 연결한 ADC를 제작하였다. 이러한 ADC는 목적하는 세포독성을 나타냄을 확인하였다.
키메라 항원 수용체(CAR)
본 발명은 다른 관점에서, 항원 결합 부위를 포함하는 세포외도메인, 트랜스 멤브레인 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)로, 상기 세포외도메인의 항원 결합 부위는 상기 항체의 scFv인 것을 특징으로 하는 키메라 항원 수용체에 관한 것이다.
키메라 항원 수용체(CAR)는 표적 항원 및 해당 항원을 발현하는 세포에 대하여 면역반응을 유도할 수 있도록 설계된 합성 컨스트럭트이다. CAR는 세포외도메인, 트랜스 멤브레인 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 암세포의 표면에 특이적으로 발현되는 암세포 표면 항원을 인식하는 수용체를 코딩하는 유전자를 면역세포에 도입하여, 암세포를 사멸시킬 수 있다. 암세포에서 특이적으로 발현하는 항원과 결합하는 수용체를 포함하는 면역세포를 통해, 암세포만 표적하여 면역반응을 일으킬 수 있다. 상기 CAR는 본 발명에 따른 항-FGFR3 항체의 scFv를 세포외도메인의 항원 인식 부위로 포함한다.
1세대 CAR에서는 암세포에서 특이적으로 발현하는 항원 인식 부위를 포함하는 세포외도메인, 트랜스 멤브레인 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하고, 신호전달 도메인으로서 CD3ζ만을 이용하였는데, 암에 대한 치료 효과가 미미하였고, 지속시간이 짧다는 문제가 있었다. 이러한 1세대 CAR는 미국등록특허 제6,319,494호에 구체적으로 기재되어 있으며, 본 발명에 참조로서 도입된다.
면역세포에 대한 반응성 향상을 위하여 보조 자극 도메인(CD28 또는 CD137/4-1BB)과 CD3ζ를 결합한 2세대 CAR가 제조되었는데 1세대 CAR와 비교하여 체내에 잔존하는 CAR 포함 면역세포의 수가 현저히 증가하였다. 2세대 CAR는 한 가지의 보조 자극 도메인을 이용한 것에 반해, 3세대 CAR에서는 두 가지 이상의 보조 자극 도메인을 이용하였다. 생체 내 CAR를 포함하는 면역세포의 확장 및 지속성 달성을 위해 보조 자극 도메인을 4-1BB, CD28 또는 OX40 등과 결합시킬 수 있다. 2세대 CAR는 미국등록특허 제7,741,465호, 제7,446,190호 또는 제9,212,229호에 구체적으로 기재되어 있고 3세대 CAR는 미국등록특허 제8,822,647호에 구체적으로 기재되어 있으며, 본 발명에 참조로서 도입된다.
4세대 CAR에서는 IL-12 또는 IL-15와 같은 사이토카인을 암호화하는 추가 유전자를 포함하여, 사이토카인의 CAR 기반 면역단백질이 추가로 발현될 수 있도록 하고, 5세대 CAR는 면역세포 강화를 위해 인터루킨 리셉터 체인 예를 들어, IL-2Rβ를 추가로 포함한다. 4세대 CAR는 미국등록특허 제10,316,102호, 5세대 CAR는 미국등록특허 제10,336,810호에 구체적으로 기재되어 있으며, 본 발명에 참조로서 도입된다.
하나의 실시예에서, 상기 세포외도메인의 항원 결합 부위는 항체의 scFv이다. 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 scFv에서 VH 및 VL 도메인은 링커를 통해 연결될 수 있다. 서열번호 133 내지 서열번호 157, 서열번호 203 내지 서열번호 215로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역은 링커를 통해 서열번호 158 내지 서열번호 182, 서열번호 216 내지 서열번호 219로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역과 연결될 수 있다.
상기 링커는 펩타이드 링커일 수 있으며, 약 10-25 aa 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, 글리신 및/또는 세린과 같은 친수성 아미노산이 포함될 수 있다.
상기 링커는 예를 들어, (GS)n, (GGS)n, (GSGGS)n 또는 (GnS)m (n, m은 각각 1 내지 10)을 포함할 수 있으나, 상기 링커는 예를 들어 (GnS)m (n, m은 각각 1 내지 10)일 수 있다. 구체적으로, 상기 링커는 GGGGS를 포함할 수 있고, 예를 들어 3회 반복된 서열번호 185의 GGGGSGGGGSGGGGS일 수 있다.
상기 트랜스 멤브레인 도메인은 천연 또는 합성 공급원으로부터 유래될 수 있다. 공급원이 천연인 경우, 도메인은 임의의 막 결합된 단백질 또는 트랜스 멤브레인 단백질로부터 유래될 수 있다. 상기 트랜스 멤브레인 도메인은 T-세포 수 용체, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, ICOS의 알파, 베타 또는 제타 쇄를 포함할 수 있다. 상기 트랜스 멤브레인 도메인을 합성하는 경우 류신과 발린과 같은 소수성 잔기를 포함하거나, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린 포함 펩타이드를 각 말단에 포함할 수 있다. 2개 내지 10개 아미노산 길이인 짧은 올리고- 또는 폴리펩티드 링커가 트랜스 멤브레인 도메인과 CAR의 세포질 신호전달 도메인 사이에 결합을 형성할 수 있다. 글리신-세린 펩타이드를 링커로 이용할 수 있다.
상기 신호 전달 도메인은 CAR이 위치된 면역세포의 정상 효과기 기능에 대한 활성화를 유도할 수 있다. 예를 들어 사이토카인의 분비를 통해 세포용해 활성화 또는 헬퍼 활성화를 유도할 수 있다. 상기 신호 전달 도메인은 효과기 기능 신호를 형질도입하기에 충분한 세포내 신호전달 도메인의 절단된 단편을 포함할 수 있다.
상기 신호 전달 도메인으로 항원 수용체 관여 후 신호 전달을 개시하기 위해 협력하여 작용하는 T 세포 수용체(TCR) 및 공동-수용체의 세포질이 포함될 수 있다.
TCR 단독을 통해 생성된 신호는 T 세포의 완전한 활성화를 위해 불충분하고 공동-자극 신호가 필요하다는 것이 또한 알려져 있다. 따라서, T 세포 활성화에 TCR을 통해 항원-의존성 일차 활성화를 개시하는 것 및 이차 또는 공동-자극 신호를 제공하도록 항원-의존성 방식으로 작용하는 것이 관여할 수 있다. 일차 세포질 신호전달 서열은 자극성 방식으로, 또는 억제성 방식으로 TCR 복합체의 일차 활성화를 조절한다. 자극성 방식으로 작용하는 일차 세포질 신호전달 서열은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로 서 공지된 신호전달 모티프를 함유할 수 있다. 일차 세포질 신호전달 서열을 함유하는 ITAM의 예로는 TCR 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b, 및 CD66d를 포함할 수 있다.
경우에 따라서, CAR의 세포질 도메인은 CD3 제타쇄 부분 및 공동자극 신호전달 영역을 포함할 수 있다. 공동자극 신호전달 영역은 공동자극 분자의 세포내 도메인을 포함하는 CAR의 일 부분을 의미한다. 예를 들어, CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-관련된 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 등이 포함될 수 있다. CAR의 세포질 신호전달 부분 내의 세포질 신호전달 서열은 2개 내지 10개 아미노산 예를 들어, 글리신-세린 포함 펩타이드 링커를 통해 연결될 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 키메라 항원 수용체(CAR)가 도입된 면역세포에 관한 것이다.
상기 면역세포는 면역을 유도하여 목적하는 암 치료 효과를 유발할 수 있는 것으로, 예를 들어, T 세포, NK 세포, 사이토카인 유도 살해세포(Cytokine Induced Killer cell, CIK), 활성화 세포독성 T 림프구(Cytotoxic T Lymphocyte, CTL), 마크로파지, 종양 조직 내 침투 T 세포 (Tumor-Infiltrating Lymphocytes, TIL), 수지상세포로 구성된 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
경우에 따라서, 상기 항-FGFR3 항체 이외의 항체에 대한 scFv가 세포외도메인의 항원 결합 부위로 포함된 키메라 항원 수용체(CAR)가 추가로 도입될 수 있다.
상기 항-FGFR3 항체 이외의 항체는 예를 들어 PD-1, PD-L1, BTLA, CTLA-4, VISTA, LAG3, TIM3, CD137(4-1BB), VISTA, CD258(LIGHT), TIGIT, CD134(OX40), CD28, CD278(ICOS), CD27, CD154(CD40L), CD357(GITR), CD30, DR3, CD226(DNAM1), CD96, CD200, CD200R, Transferrin receptor, c-Met, EGFR, HER2, KDR, PDGFRa, NRP1, MARCO으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 타겟하는 항체 또는 이의 항원 결합단편일 수 있다.
소포체 (vesicle) 및 엑소좀
본 발명은 또 다른 관점에서 항체 또는 이의 항원 결합단편이 그 외부로 표출되거나 또는 그 내부에 존재하는 소포체에 관한 것이다.
상기 소포체는 세포막을 통과하여 목적 단백질을 세포 내로 직접 유입시킬 수 있는 베시클로, 세포막 및 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함한다.
본 발명에 따른 소포체는 세포막 및 전달하고자 하는 타겟 제제를 포함하는 형태일 수 있다. 이러한 소포체의 예시로 미국특허공개 제2018/0177725호에 구체적으로 기재되어 있으며, 본 발명에 참조로 도입될 수 있다.
상기 소포체는 예를 들어 40-500nm, 구체적으로 100-300nm, 80-200nm 또는 100nm의 평균 직경을 가질 수 있다. 상기 소포체는 예를 들어 약 100, 200, 300, 400 또는 500nm일 수 있다.
상기 소포체는 세포막 및 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합단편 이외에 미토콘드리아, 리소좀 또는 골지체 등 다른 세포내 소기관을 포함하지 않을 수 있다.
상기 소포체는 막을 포함하여 내부 및 외부가 구분될 수 있으며, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편은 막에 존재하여 외부로 표출되거나, 내부로 표출되거나, 막으로부터 분리되어 소포체 내부에 존재할 수 있다.
상기 소포체의 막은 항체 또는 이의 항원 결합단편을 적용하고자 하는 타겟에 따라 달라질 수 있으며, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합단편이 결합하는 FGFR3가 발현되는 암세포에 전달하기 위하여 예를 들어 암세포 막일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 암세포는 예를 들어, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종(예컨대, B 세포 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, 여포성 림프종, 만성 림프구성 백혈병, 외투세포 림프종, 변연구역 B 세포 림프종, 버킷 림프종, 림프형질세포 림프종, 모상 세포 백혈병), 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 골수형성이상 증후군, 다발성 골수종, 또는 급성 림프구성 백혈병 유발 암세포를 포함할 수 있다.
또한, 고형암 예를 들어, 난소암, 직장암, 위암, 고환암, 항문 부위 암, 자궁암, 결장암, 직장암, 신장 세포 암종, 간암, 폐의 비-소세포 암종, 소장 암, 식도암, 흑색종, 카포시 육종, 내분비계 암, 갑상선암, 부갑상선 암, 부신암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안내 악성 흑색종, 자궁암, 뇌줄기 신경아교종, 뇌하수체 선암, 표피모양 암, 자궁경부 편평세포 암의 암종, 난관 암종, 자궁내막 암종, 질 암종, 연조직 육종, 요도암, 외음부 암종, 음경암, 방광암, 신장암 또는 요관암, 신우 암종, 척추 종양, 중추신경계(CNS)의 신생물, 원발성 CNS 림프종, 종양 혈관신생, 상기 암들의 전이 병변 유발 암세포를 포함할 수 있다.
더욱이, 예를 들어, 교모세포종, 폐암, 방광암, 구강암, 두경부 편평세포암, 담낭암 또는 자궁경부암 유발 암세포를 포함할 수 있다.
상기 소포체는 예를 들어 엑소좀일 수 있다. 상기 엑소좀은 세포 간 신호전달을 하기 위하여, 단백질, DNA, RNA 등을 가지고 세포 밖으로 분비되는 50 - 200 nm 크기의 막구조의 작은 베시클을 의미한다.
엑소좀에는 세포 내의 다양한 단백질, DNA, RNA 등이 포함되어 있다. 이러한 엑소좀에 포함되어 세포 밖으로 분비되는 물질들은 세포막과의 융합 (fusion) 혹은 내포작용 (endocytosis)에 의해 다른 세포 내로 다시 유입되어 세포 간의 통신자로서의 역할을 하기도 한다. 또한, 이러한 엑소좀에 포함되어 세포 밖으로 분비되는 물질들을 분석하여 특정 질환의 진단에 이용될 수 있다.
본 발명에 따라, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편은 엑소좀 외부로 표출되거나 또는 그 내부에 존재한다. 상기 엑소좀은 막 구조를 가지고 있어, 내부 및 외부가 구분될 수 있으며, 엑소좀 막에 존재하여 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편이 존재하여 외부로 표출되거나, 내부로 표출되거나, 막으로부터 분리되어 엑소좀 내부에 존재할 수 있다.
상기 엑소좀은 다양한 표적화 특성을 갖는 면역세포/줄기세포 유래 인공엑소솜에 특정 약물을 탑재하여 인체내의 원하는 병변 조직으로 표적화하여 전달함으로써, 다른 조직에 미치는 부작용은 획기적으로 감소시키고 적은 양의 약물로도 치료 효능을 극대화 할 수 있는 형태일 수 있고, 예를 들어 국제공개특허 제WO2011/002239호에 구체적으로 기재되어 있으며, 본 발명에 참조로서 도입된다.
상기 항체 또는 이의 항원 결합단편이 엑소좀 막에 존재하여 외부로 표출되거나 내부로 표출되는 경우 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편을 엑소좀 특이 마커에 융합시킨 형태로 발현시켜, 엑소좀 내부에 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포집할 수 있다. 상기 엑소좀 막이 FGFR3가 발현되는 세포의 세포막에 융합되는 경우 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편이 세포로 전달될 수 있다.
상기 엑소좀 표면에 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편 디스플레이될 수 있다. 예를 들어, PTGFRN (Prostaglandin F2 Receptor Negative Regularator) 단백질을 엑소좀 표면에 발현시키고, PTGFRN 단백질에 다른 타겟 단백질을 융합시킬 수 있다. 이러한 엑소좀은 국제공개특허 제WO2014/076137호, 제WO2018/09119호 등에 구체적으로 기재되어 있으며, 본 발명에 참조로서 도입된다.
상기 항체 또는 이의 항원 결합단편이 내부에 포함된 엑소좀의 경우 광특이적 결합 단백질을 사용하여, 일시적으로 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편을 상기 마커 단백질과 결합시켜서 제조할 수 있다. 상기 엑소좀 내부에 목적 단백질이 막에 결합되지 않은 상태로 포집될 수 있다. 상기 엑소좀이 내재화에 의해 세포 내로 전달되었을 때, 엑소좀이 분해되어 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편이 세포로 전달될 수 있다.
상기 항체 또는 이의 항원 결합단편이 내부에 존재할 수 있도록 하는 과정은 국제공개특허 제WO2016/178532호 및 제WO2018/062973호 등에 구체적으로 기재되어 있으며, 본 발명에 참조로서 도입된다.
예를 들어, 광특이적 결합 단백질인 CIBN과 CRY2을 이용할 수 있고, 구체적으로, 상기 CIBN은 상기 마커 단백질의 하나인 CD9과 융합된 형태로 발현되도록 하고, 상기 CRY2는 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편과 융합된 형태로 발현되도록 이들 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 엑소좀 생산 세포에 도입할 수 있다. 상기 엑소좀 생산세포에서 발현된 CIBN-CD9 융합 단백질은 CD9으로 인하여 엑소좀에 포함되는데, 이때, 상기 세포에 푸른 빛 LED 조명을 조사하면, 상기 엑소좀 생산세포에서 발현된 목적단백질-CRY2 융합 단백질의 CRY2 도메인이 CD9에 융합된 CIBN 도메인에 결합되므로, 목적단백질-CRY2-CIBN-CD9 형태의 가역적으로 유도된 융합 단백질이 형성되고, 이와 같은 융합 단백질은 CD9으로 인하여 엑소좀 내부에 포함될 수 있다. 이처럼 목적단백질이 내부에 포함된 엑소좀이 생산된 후, 상기 푸른 빛 LED 조명을 더 이상 조사하지 않으면, CIBN-CRY2 결합이 해제되어, 목적단백질이 엑소좀의 세포막에 결합되지 않은 상태로 엑소좀 내부에 포함될 수 있다.
치료용 조성물
본 발명은 또 다른 관점에서 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 이중 또는 다중특이적 항체, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 항체-약물 접합체, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 키메라 항원 수용체 또는 상기 키메라 항원 수용체를 포함하는 면역세포를 포함하는 암, 염증 또는 면역질환 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 예를 들어, (a) 본 발명에 따른 FGFR3에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 이중 또는 다중특이적 항체, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 항체-약물 접합체, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 키메라 항원 수용체 또는 상기 키메라 항원 수용체를 포함하는 면역세포의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물일 수 있다. 본 발명은 또한, 본 발명에 따른 FGFR3에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 이중 또는 다중특이적 항체, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 항체-약물 접합체, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 키메라 항원 수용체 또는 상기 키메라 항원 수용체를 포함하는 면역세포를 암 환자에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료방법일 수 있다.
"예방"은 본 발명에 따른 조성물의 투여로 암의 성장을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"는 암 발전의 억제, 종양의 경감 또는 암의 제거를 의미한다.
상기 암은 예를 들어, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종(예컨대, B 세포 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, 여포성 림프종, 만성 림프구성 백혈병, 외투세포 림프종, 변연구역 B 세포 림프종, 버킷 림프종, 림프형질세포 림프종, 모상 세포 백혈병), 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 골수형성이상 증후군, 다발성 골수종, 또는 급성 림프구성 백혈병을 포함한다.
상기 암은 예를 들어, 난소암, 직장암, 위암, 고환암, 항문 부위 암, 자궁암, 결장암, 직장암, 신장 세포 암종, 간암, 폐의 비-소세포 암종, 소장 암, 식도암, 흑색종, 카포시 육종, 내분비계 암, 갑상선암, 부갑상선 암, 부신암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안내 악성 흑색종, 자궁암, 뇌줄기 신경아교종, 뇌하수체 선암, 표피모양 암, 자궁경부 편평세포 암의 암종, 난관 암종, 자궁내막 암종, 질 암종, 연조직 육종, 요도암, 외음부 암종, 음경암, 방광암, 신장암 또는 요관암, 신우 암종, 척추 종양, 중추신경계(CNS)의 신생물, 원발성 CNS 림프종, 종양 혈관신생, 상기 암들의 전이 병변, 또는 상기 암의 조합을 포함한다.
상기 암은 예를 들어, 교모세포종, 폐암, 방광암, 구강암, 두경부 편평세포암, 담낭암 또는 자궁경부암일 수 있다. 특히, 교모세포종의 경우 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편이 뇌 및 척추와 그 주변 순환계 사이에 존재하는 뇌의 모세혈관 내피세포 막내에 타이트 결합 (junction)에 의해 형성된 장벽인 혈액뇌장벽 (blood-brain barrier)을 통과할 필요가 있다. BBB 통과를 위해 전달체와 연결되어 사용될 수 있다. BBB를 통하여 약물을 전달하기 위해 예를 들면 브래드키닌, 또는 HIFU(Hign density foucues ultrasound)과 같은 방법을 사용하여 BBB의 삼투압을 와해시키는 방법이 있다. 또한, 세포에 내재된 글루코스 및 아미노산 전달체, 인슐린 또는 트랜스페린의 수용체 매개 트랜스사이토시스와 같은 전달 시스템의 사용 또는 당단백질의 활성 유출 전달(efflux transporter)을 차단하는 것이 포함될 수 있다.
상기 염증은 예를 들어, 만성 폐쇄성 폐질환, 만성 소화 장애증, 결막염, 이염, 알레르기 비염, 치은염, 혓바늘, 기관지염, 위-식도 역류질환(GERD), 식도염, 위염, 장염, 소화성궤양, 염증성 장 질환(IBD), 크론병, 과민성 대장증후군(IBS), 장염이나 알레르기, 요도염, 방광염, 질염, 직장항문염, 호산구성 위장염 또는 류마티스 관절염일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 면역질환은 예를 들어, 후천성 면역결핍, 자가면역질환, 전신성 홍반성 낭창, 경피증, 쇼그렌 증후군, 다발성 근염과 피부근염, 류마티스 다발성 근육통, 측두동맥염, 결절성 다발 동맥염, 또는 베체트 증후군 등일 수 있다.
본 발명의 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장 내 투여 등으로 투여할 수 있다.
경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 약제학적 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.0001-100 ㎎/㎏이다. 본 명세서에서 용어 "약제학적 유효량"은 암 또는 자가면역질환의 예방 또는 치료하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이 때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 좌제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
병용치료
본 발명은 면역세포 및 항-FGFR3 항체 이외의 약물을 포함하는 병용 치료용 조성에 관한 것이다.
하나의 실시예에서, 상기 항-FGFR3 항체 이외의 약물은 화학요법제 또는 항-FGFR3 항체 이외의 항체를 포함할 수 있다.
상기 약물은 마이탄시노이드, 오리스타틴 (MMAE, MMAF 포함), 아미노프테린, 악티노마이신, 블레오마이신, 탈리소마이신, 캄프토쎄신, N8-아세틸 스퍼미딘, 1-(2 클로로에틸)-1,2-다이메틸 술포닐 하이드라자이드, 에스퍼라마이신, 에토포사이드, 6-머캅토퓨린, 돌라스타틴, 트리코테센, 칼리케아미신, 탁솔(taxol), 탁산, 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 메토트렉세이트, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 A, 미토마이신 C, 클로람부실, 듀오카마이신, L-아스파라기나제(L-asparaginase), 머캡토퓨린(mercaptopurine), 티오구아닌(thioguanine), 하이드록시우레아(hydroxyurea), 시타라빈(cytarabine), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide), 니트로소우레아(nitrosourea), 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 미토마이신(mitomycin), 다카바진(dacarbazine), 프로카바진(procarbazine), 토포테칸(topotecan), 질소 머스터드(nitrogen mustard), 사이톡산(cytoxan), 에토포시드(etoposide),5-플루오로우라실(5-fluorouracil), CNU(bischloroethylnitrosourea), 이리노테칸(irinotecan), 캄포토테신(camptothecin), 블레오마이신(bleomycin), 이다루비신(idarubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 닥티노마이신(dactinomycin), 플리카마이신(plicamycin), 미톡산트론(mitoxantrone), 아스파라기나제(asparaginase), 비노렐빈(vinorelbine), 클로로람부실(chlorambucil), 멜파란(melphalan), 카르무스틴(carmustine), 로무스틴(lomustine), 부설판(busuLfan), 트레오설판(treosulfan), 데카바진(decarbazine), 에토포시드(etoposide), 테니포시드(teniposide), 토포테칸(topotecan), 9-아미노캠프토테신(9-aminocamptothecin), 크리스나톨(crisnatol), 미토마이신 C(mitomycin C), 트리메트렉세이트(trimetrexate), 마이코페놀산(mycophenolic acid), 티아조퓨린(tiazofurin), 리바비린(ribavirin), EICAR(5-ethynyl-1-beta-Dribofuranosylimidazole-4-carboxamide), 하이드록시우레아(hydroxyurea), 데프록사민(deferoxamine), 플룩수리딘(floxuridine), 독시플루리딘(doxifluridine), 랄티트렉세드(raltitrexed), 시타라빈(cytarabine(ara C)), 시토신 아라비노시드(cytosine arabinoside), 플루다라빈(fludarabine), 타목시펜(tamoxifen), 라록시펜(raloxifene), 메게스트롤(megestrol), 고세렐린(goserelin), 류프롤리드 아세 테이트(leuprolide acetate), 플루타미드(flutamide), 바이칼루타마이드(bicalutamide), EB1089, CB1093, KH1060, 베르테포르핀(verteporfin), 프탈로시아닌(phthalocyanine), 광감작제 Pe4(photosensitizer Pe4), 데메톡시-하이포크레린 A(demethoxy-hypocrellin A), 인터페론-α(Interferon-α), 인터페론-γ(Interferon-γ), 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor), 겜사이타빈(Gemcitabine), 벨케이드(velcade), 레발미드(revamid), 탈라미드(thalamid), 로바스타틴(lovastatin), 1-메틸-4-페닐피리디늄 이온(1-methyl-4-phenylpyridiniumion), 스타우로스포린(staurosporine), 악티노마이신 D(actinomycin D), 닥티노마이신(dactinomycin), 블레오마이신 A2(bleomycin A2), 블레오마이신 B2(bleomycinB2), 페플로마이신(peplomycin), 에피루비신(epirubicin), 피라루비신(pirarubicin), 조루비신(zorubicin), 마이토산트론(mitoxantrone), 베라파밀(verapamil) 및 탑시가르긴(thapsigargin), 핵산 분해 효소 및 세균이나 동식물 유래의 독소로 구성된 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
하나의 실시예에서, 상기 항-FGFR3 항체 이외의 항체는 예를 들어 PD-1, PD-L1, BTLA, CTLA-4, VISTA, LAG3, TIM3, CD137(4-1BB), VISTA, CD258(LIGHT), TIGIT, CD134(OX40), CD28, CD278(ICOS), CD27, CD154(CD40L), CD357(GITR), CD30, DR3, CD226(DNAM1), CD96, CD200, CD200R, Transferrin receptor, c-Met, EGFR, HER2, KDR, PDGFRa, NRP1, MARCO으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 타겟하는 항체 또는 이의 항원 결합단편일 수 있다.
본 발명은 항체 또는 이의 항원 결합단편과 다음으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 병용 치료용 조성물에 관한 것이다.
(i) 면역세포;
(ii) 항-FGFR3 항체 이외의 항체에 대한 scFv를 세포외도메인으로 포함하는 항원 수용체(CAR)를 포함하는 면역세포; 및
(iii) 면역관문억제제 (Immune checkpoint inhibitor).
또한, 본 발명은 상기 면역세포 인게이징(immune cell engage) 이중특이적 또는 다중특이적 항체 및 다음으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 병용 치료용 조성물에 관한 것이다:
(i) 면역세포;
(ii) 항-FGFR3 항체 이외의 항체에 대한 scFv 단편을 세포외도메인으로 포함하는 항원 수용체(CAR)를 포함하는 면역세포; 및
(iii) 면역관문억제제 (Immune checkpoint inhibitor).
상기 면역세포는 면역 치료 예를 들어 면역을 유도하여 목적하는 암 치료 효과를 유발할 수 있는 것으로, 예를 들어, T 세포, NK 세포, 사이토카인 유도 살해세포(Cytokine Induced Killer cell, CIK), 활성화 세포독성 T 림프구(Cytotoxic T Lymphocyte, CTL), 마크로파지, 종양 조직 내 침투 T 세포 (Tumor-Infiltrating Lymphocytes, TIL), 수지상세포로 구성된 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 항-FGFR3 항체 이외의 항체는 FGFR3 이외의 표적을 타겟하는 항체로, 예를 들어 LAG3, TIM3, CD137(4-1BB), VISTA, CD258(LIGHT), TIGIT, CD134(OX40), CD28, CD278(ICOS), CD27, CD154(CD40L), CD357(GITR), CD30, DR3, CD226(DNAM1), CD96, CD200, CD200R, Transferrin receptor, c-Met, EGFR, HER2, KDR, PDGFRa, NRP1, 또는 MARCO에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 항체 또는 이의 항원 결합단편과 다음으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 병용 치료용 조성물에 관한 것이다.
(i) 면역세포;
(ii) 항-FGFR3 항체 이외의 항체에 대한 scFv를 세포외도메인으로 포함하는 항원 수용체(CAR)를 포함하는 면역세포; 및
(iii) 면역관문억제제 (Immune checkpoint inhibitor).
또한, 본 발명은 상기 면역세포 인게이징(immune cell engage) 이중특이적 또는 다중특이적 항체 및 다음으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 병용 치료용 조성물에 관한 것이다:
(i) 면역세포;
(ii) 항-FGFR3 항체 이외의 항체에 대한 scFv 단편을 세포외도메인으로 포함하는 항원 수용체(CAR)를 포함하는 면역세포; 및
(iii) 면역관문억제제 (Immune checkpoint inhibitor).
상기 면역세포는 면역 치료 예를 들어 면역을 유도하여 목적하는 암 치료 효과를 유발할 수 있는 것으로, 예를 들어, T 세포, NK 세포, 사이토카인 유도 살해세포(Cytokine Induced Killer cell, CIK), 활성화 세포독성 T 림프구(Cytotoxic T Lymphocyte, CTL), 마크로파지, 종양 조직 내 침투 T 세포 (Tumor-Infiltrating Lymphocytes, TIL), 수지상세포로 구성된 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 항-FGFR3 항체 이외의 항체는 FGFR3 이외의 표적을 타겟하는 항체로, 예를 들어 예를 들어 LAG3, TIM3, CD137(4-1BB), VISTA, CD258(LIGHT), TIGIT, CD134(OX40), CD28, CD278(ICOS), CD27, CD154(CD40L), CD357(GITR), CD30, DR3, CD226(DNAM1), CD96, CD200, CD200R, Transferrin receptor, c-Met, EGFR, HER2, KDR, PDGFRa, NRP1, 또는 MARCO에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 면역관문억제제는 항원 제시 세포 (APC, antigen presenting cell)와 면역세포 예를 들어 T세포가 만나는 부위로 T세포 억제 신호를 차단하여, T 세포 활성화를 유도할 수 있는 제제를 의미한다. 상기 면역관문억제제는 예를 들어, PD-1, PD-L1, BTLA, CTLA-4, VISTA, LAG3, TIM3, CD137(4-1BB), CD258(LIGHT), TIGIT, CD134(OX40), CD28, CD278(ICOS), CD27, CD154(CD40L), CD357(GITR), CD30, DR3, CD226(DNAM1), CD96, CD200, 또는 CD200R를 타겟으로 하는 약물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 병용 투여 대상 제1성분 및 제2성분 각각은 동시에 투여될 수 있다. 또한, 상기 병용 투여 대상 제1성분 및 제2성분 각각은 일정 시간 간격을 두고 별도로 투여할 수도 있다. 상기 병용 투여 대상 중 제1성분 투여 전 또는 후 제2성분이 별도로 투여될 수 있다.
동반진단(Companion diagnostics, CDx)
동반진단은 특정 약물치료에 대한 환자의 반응성을 예측하기 위한 분자 진단 기법의 일종으로, 약물의 적용에 있어, 적용 대상 환자의 선별 기준을 제시하고 이에 부합하는 진단, 예후 및 예측 바이오마커의 특이성 및 민감성을 고려하여, 환자에 적합한 약물을 처리할 수 있도록 하는 기준을 제시할 수 있다.
항암제의 경우 반응을 보이는 환자에게서는 높은 효과를 보이지만 반응하는 환자비율이 낮기 때문에 효과를 보일 환자를 선별해내는 것이 중요하며, 동반진단을 통해 항암제에 반응하는 환자를 선별하고, 환자의 치료 효율을 증대시킬 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, FGFR3과 TACC3의 융합 유전자가 증폭되거나, 융합 유전자에 변이가 있거나, 융합 유전자가 과발현되거나 또는 융합 유전자가 항상 발현 (constitutive activation)되는 것으로 확인된 암을 치료하기 위한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 이중 또는 다중특이적 항체, 항체-약물 접합체, 키메라 항원 수용체 또는 상기 키메라 항원 수용체를 포함하는 면역세포를 포함하는, 암 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 환자 유래 샘플에서 FGFR3과 TACC3의 융합 유전자가 증폭되거나, 융합 유전자에 변이가 있거나, 융합 유전자가 과발현되거나 또는 융합 유전자가 항상 발현 (constitutive activation)되는 것으로 확인된 경우, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 이중 또는 다중특이적 항체, 항체-약물 접합체, 키메라 항원 수용체 또는 상기 키메라 항원 수용체를 포함하는 면역세포를 투여하는 단계를 포함하는 암 치료방법에 관한 것이다.
상기 샘플은 환자의 조직 또는 체액으로부터 수득되는 생물학적 피검체를 의미한다. 조직 샘플의 공급원은 동결된 및/또는 보존된 기관, 조직 샘플, 생검 또는 흡인물에서 유래되는 것과 같은 고형 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 구성성분(예, 혈청, 혈장); 골수 또는 임의의 골수 구성성분; 소변, 뇌척수액, 전혈액, 혈장 및 혈청과 같은 체액일 수 있다. 샘플은 비-세포 분획(예, 소변, 혈장, 혈청 또는 다른 비세포 체액)을 포함할 수 있다. 샘플은 체액 예를 들어, 혈액(예, 전혈액)을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 샘플은 환자로부터 수득되는 전혈액 샘플, 전 골수 샘플, 전 말초혈액 샘플, 또는 전 종양 샘플일 수 있다. 상기 "전" 샘플은 해당 샘플로부터 제거되거나 분리된 성분(예, 세포)이 실질적으로 없는 샘플이다. 상기 샘플, 예를 들어 혈액 샘플은 사용되기 전에 희석(예컨대, 생리적 융화성 완충액 또는 배지에 의해)될 수 있다. 다른 구체예들에서, "전" 샘플, 예컨대 전 조직 샘플 또는 전 종양 샘플은 기원 조직 유래의 미세환경을 실질적으로 유지하고, 예를 들어 종양 또는 면역 미세환경의 구조를 실질적으로 유지할 수 있다. 구체적으로, 샘플, 예컨대 종양 샘플은 더 작은 조각으로 가공(예, 마쇄, 다짐, 블렌딩, 분쇄 등)되고 희석(예컨대, 생리적 융화성 완충액 또는 배지에 의해)될 수 있다.
상기 유전자의 발현 확인은 해당 유전자의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 중합효소연쇄반응(PCR)에 의해 수행될 수 있고, 경우에 따라서 전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블럿팅(Northern blotting), DNA 칩을 사용하여 수행될 수 있다.
중합효소연쇄반응(PCR)은 프라이머를 이용하여 유전자 증폭 반응을 통해 수행될 수 있다. 멀티플렉스 PCR, 실-시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR 및 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR) 등이 수행될 수 있다.
유전자 코딩에 의한 단백질 발현 여부를 검출할 수도 있다. 상기 유전자로부터 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정이다. 상기 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(Peptide nucleic acid) 또는 앱타머(aptamer) 등을 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있다.
이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, 엘라이자(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩(protein chip)을 이용한 방법 등이 포함될 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: FGFR3에 특이적인 파지 항체 선별, 세포 패닝 (파지 디스플레이 기술)
본 연구진은 synthetic scFv phage library {(1)Bai, Xuelian & Kim, Jihye & Kang, Seungmin & Kim, Wankyu & Shim, Hyunbo. (2015). A Novel Human scFv Library with Non-Combinatorial Synthetic CDR Diversity. PloS one. 10. e0141045. 10.1371/journal.pone.0141045., (2) Yang, Hye & Kang, Kyung & TCW, Julia & Shim, Hyunbo. (2009). Construction of a large synthetic human scFv library with six diversified CDRs and high functional diversity. Molecules and cells. 27. 225-35. 10.1007/s10059-009-0028-9.}를 사용하여, 세포 내재화 기능을 지닌 항체를 선별하기 위한 cell panning 방법을 수행하였다. FGFR3 과발현 세포 (682T), FGFR3 저발현 세포 (626T)를 RPKM 분석 값과 western blotting을 통한 단백질 발현 확인을 통해 검증하였으며, 해당 세포들을 선정하였다. 미리 회수한 phage library stock을 FGFR3 저발현 세포에 처리하여 4도에서 1시간 반응시킨 후, 원심분리기를 통해 상층액만 회수하여 미리 준비된 FGFR3 과발현 세포에 처리하여 4도 1시간 반응시켰다. 그 후, 배양 배지를 통해 비특이적인 phage를 제거하고 37도에서 30분 배양하여 세포 내재화 된 항체를 회수하였다. 회수 방법은 비특이적인 세포 표면 결합 phage를 제거하고자 low pH buffer를 통해 세척을 하여 제거한 후 lysis buffer를 통해 세포를 용해시켜 세포 내부에 있는 FGFR3 특이적 결합을 통한 세포 내재화 기능을 가진 항체를 회수하여 e.coli에 감염시켰다. 감염시킨 e.coli는 다시 증폭하여 동일한 cell panning 방법을 2회 추가 진행하여, 총 3회 cell panning을 진행한 후 ELISA screening을 진행하여 FGFR3 특이적인 항체를 선별하였다. 해당 실험 모식도는 [도1a]와 같다.
실시예 2: FGFR3에 특이적인 파지 항체 선별, 항원 고정 패닝 (파지 디스플레이 기술)
동일한 phage library를 사용하여, 통상적으로 널리 사용되고 있는 immobilized antigen panning을 진행하였다. FGFR3-IIIc/Fc 항원과 negative/Fc 항원을 immune-tube에 각각 3ug/ml 코팅 (overnight, 4도)하고 미리 회수한 phage library stock을 먼저 pre-blocked negative/Fc 항원에 상온에서 1시간 반응시켰다. 그 후 상층액을 회수하여, pre-blocked FGFR3-IIIc/Fc tube에 상온에서 1시간 반응시켰다. 그 후 PBST로 세척을 통해 비특이적인 phage를 제거한 후에 low pH buffer를 통해 FGFR3-lllc/Fc 항원에 특이적인 phage를 회수하였다. 이를 e.coli에 감염시킨 후 증폭과정을 거쳐 동일한 panning방법을 3회 추가 진행하여, 총 4회 bio-panning을 진행한 후 ELISA screening을 진행하여 FGFR3 특이적인 항체를 선별하였다. 해당 실험 모식도는 [도 1b]와 같다.
실시예 3: FGFR3에 특이적인 파지 항체 선별, 자성 비드 패닝; 준자동화 패닝 (파지 디스플레이 기술)
동일한 phage library를 사용하여, semi-automation bio-panning을 진행하였다. 해당 방법은 magnetic beads based panning으로 기존에 통상적으로 사용되었던 manual 방식으로 biotinylation된 타겟 항원에 phage를 처리하고 binding 과정을 거친 후 컬럼 또는 magnetic chamber 등을 이용하여 세척 및 항원 특이적인 phage를 회수하는 방식이다 [도 1c]. 본 발명자는 이러한 일련의 과정을 반-자동화 시스템에 도입하여 진행하였다. Kingfisher Flex (Thermo scientific) 기기에 phage library stock, biotinylated FGFR3-IIIc/Fc 항원, streptavidin-M280 dynabeads, 0.1% PBST wash buffer, elution buffer 등의 reagent를 Kingfisher Flex 24 deep well에 분주를 하고 미리 제작된 software protocol (BindIt™ Software)을 통해 bio-panning을 진행하였음 [도 1d]. 3~4회 bio-panning을 반복하여 FGFR3 항원에 특이적으로 결합하는 phage를 증폭하여 회수하였다. 이를 사용하여, ELISA screening을 진행하여 FGFR3 특이적인 항체를 선별하였다.
실시예 4: 친화도 ELISA 기반 항체 스크리닝
각 bio-panning 방법의 산출물은 e.coli 숙주세포(TG1) 상태이며, 이들을 단일 클론으로 Agar LB/Ampicillin 배지에 도말하여 확보하고, 임의로 SB/ampicillin 배양 배지에 접종하여 배양하였다 (3시간, 37도). 이후 scFv-pIII 단백질의 유도를 위해 각 well에 최종농도 1mM IPTG를 처리하여 30도, overnight 배양하였다. 다음날 배양 96well plate는 원심분리기를 사용하여 상층액은 제거하고, e.coli만을 회수하여 1x TES 용액 (20% w/v 수크로오스, 50mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0)을 처리하여 4도에서 1시간 이상 현탁하였고, 그 후 추가적으로 0.2x TES 용액을 처리하여 2시간 이상 현탁함으로써 e.coli 주변세포질 부위에 존재하는 scFv-pIII 단백질을 추출하였다. 미리 하루 전날 FGFR3 재조합 단백질과 negative 재조합 단백질을 96well plate에 1ug/ml로 overnight, 4도 조건에서 코팅한 plate에 추출한 scFv-pIII를 각 plate에 처리하여 상온에서 1시간 반응시켰다. 반응시킨 후 PBST를 통해 세척을 진행하였고, HRP가 접합된 항-HA 항체를 1시간 처리하고 다시 세척과정을 거쳐 발색반응(TMB substrate)을 유도하여 O.D값을 측정하였다 (450nm). FGFR3 재조합 단백질/ negative 재조합 단백질의 O.D ratio를 계산하여, FGFR3 특이적인 scFv-pIII 클론을 선별하였다. 선별 기준은 상대적인 ratio로 변환 계산 (positive / negative)하여 값이 2 이상의 클론들에 대해 항체 서열 분석을 진행하였다.
환자유래세포를 이용한 bio-panning의 경우에는 완료된 output 파지들에 대해 564개의 단일 클론을 취하여 ELISA 스크리닝을 진행하였으며, 그 중 10 개의 positive 클론이 확인되었다 [도 2a]. 항원 고정 bio-panning의 경우에는 2번의 별도 실험 진행으로 각각 658개의 단일 클론에 대한 ELISA 스크리닝을 진행하였고 (총 1,316개), 그 중 328 개의 positive 클론이 확인되었다 [도 2b]. 자성 기반 반-자동 bio-panning 완료 후, 376개의 클론을 ELISA 스크리닝 진행하였으며 26개의 positive 클론이 확인되었다 [도 2c].
실시예 5: 항체 서열 분석
Affinity ELISA screening 분석 결과 O.D ratio (FGFR3 항원/Negative 항원)가 2 이상의 클론들에 대한 항체 서열을 분석하였다. 14ml round tube에 선별한 클론의 phagemid vector를 지닌 e.coli를 LB/ampicillin 배지에 배양하여 키운 후, DAN prep (mini-prep)을 진행하여 plasmid DNA를 추출하였다. 추출한 DNA는 phagemid vector의 scFv 서열이 있는 부분에 맞게 primer를 사용하여 분석하였다.
각 방법에 따른 서열 분석 결과에 세포 패닝은 2종의 항체 고유 서열, 항원 고정 패닝은 26종의 항체 고유 서열, 반-자동 패닝의 경우에는 8종의 항체 고유 서열이 분석되었다. 이를 토대로 각각의 해당되는 클론들에 대해 scFv 형태로의 반복 ELISA를 진행한 결과 최종적으로 25종의 FGFR3 특이적 결합능을 보인 클론들이 확인되었으며 중쇄사슬, 경쇄사슬에 대한 서열을 분석하였다.
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실시예 6: scFv 항체 절편에서 IgG로의 전환 및 항체 생산
서열분석을 토대로 확인한 FGFR3 항체서열을 토대로, 본 연구진에서 보유하고 있는 중쇄사슬 생산벡터와 경쇄사슬 생산벡터에 클로닝을 진행하여 IgG 생산 벡터를 구축하였다. 구축한 생산 벡터를 토대로 mammalian protein expression system (Expi293F)을 사용하여 FGFR3 항체를 생산하였으며, AKTA prime plus 장비를 토대로 친화도 크로마토그래피 컬럼인 MabSelect SuRe™로 고순도 항체를 회수 및 정제하였다. 완성된 시료는 SDS-PAGE, size-exclusion chromatography HPLC (SEC-HPLC) 분석을 토대로 고순도 시료 특성을 분석하였다 (도 3a, 3b).
실시예 7: FGFR3 항체의 항원 결합능 평가; ELISA
생산된 항체(IgG)의 FGFR3 항원에 대한 결합능을 확인하기 위하여 Affinity ELISA를 수행하였다. 96well plate에 FGFR3 항원을 1~2 ug/ml로 코팅 (4도, overnight)을 한 후, 3% skim milk (PBS)로 blocking을 진행하였다 (상온, 1시간). 그 후, 미리 연속 희석된 항체 시료를 duplicate, triplicate 처리하여 상온에서 1시간 반응시켰다. 그 후 PBST 세척을 2~3회 진행시킨 후에 HRP가 접합된 anti-human Fab 항체를 skim milk에 희석하여 처리하고 (상온, 1시간), 다시 PBST 세척을 하고 발색 반응 (TMB substrate)을 진행하였다. 그 후 O.D 450nm으로 측정하여 값을 확인하였다.
동일한 방법으로 Human FGFR3 IIIb (1264-FR-050, R&D), IIIc (766-FR-050, R&D), mouse FGFR3 (9089-FR, R&D), monkey FGFR3 (90313-C02H, sino biological) 항원에서 확인하였다.
각 항체에 대한 결합능은 농도별로 확인하였으며 (도 4a~4d), O.D값은 상대값으로 변환하여 그래프화 하였다. EC50 기반으로 KD value를 계산하였다 (표 5a~5d).
[표 5a]
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[표 5b]
Figure PCTKR2022000119-appb-img-000012
[표 5c]
Figure PCTKR2022000119-appb-img-000013
[표 5d]
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실시예 8: FGFR3 항체의 항원 결합능 평가; SPR
생산된 항체 (IgG)의 FGFR3 subtype 및 subfamily에 대한 결합능을 평가하기 위해 SPR 분석을 수행하였다. FGFR3 항원에 대한 FGFR3 항체 후보군들의 SRP 기반 친화도 측정은 비아코어-T200 기기를 사용하였다. ELISA 결합능에서 기재된 바와 동일 항원들을 아민 커플링을 통해 CM5 바이오센서 칩 상에 직접 고정화하여 대략 300RU를 달성하였다. 30 ug/분의 유속으로 결합시간 180초 동안 대략 20nM 농도로 2배씩 연속 희석액을 (25도) 순서대로 주입하였으며, 그 다음 180초 동안 동일한 유속으로 분리 단계를 수행하였다. 각각의 주입 사이에 10mM 글리신-HCl을 완충제로 주입하여 CM5 바이오 센서 칩을 재생시켰다. 결합 속도 및 해리 속도를 일 대 일 랭뮤어 결합모델을 사용하여 계산하였다. 평형 해리 상수 (KD)를 Koff/Kon의 비율로 계산하였다. (도 5, 표 6)
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실시예 9: FGFR3 단백질 발현량 확인; Western blotting, FACS analysis
본 발명에서 발굴한 FGFR3 항체에 대한 cell surface binding 및 그 외에 따른 assay를 진행하기 위해 FGFR3 과발현 세포를 선정하기 위해 western blotting과 FACS 분석을 진행하였다. 환자유래세포 및 암 세포주를 mRNA expression level (RPKM)으로 선정을 하고 각각의 세포를 계대배양을 통해 일정한 세포수를 확보한 후에 Western blotting의 경우에는 lysate를 제작하여 검증하였으며, FACS 분석의 경우에는 직접적으로 세포 표면 FGFR3 발현을 확인하였다. 먼저, Western blotting의 경우에는 각각의 세포를 cOmplete™ Lysis-M (Roche)로 용해시킨 후에 bradford 단백질 정량 분석을 진행하여 20ug의 용해 산물을 western blotting을 진행하였다. Total FGFR3 (sc-13121, santa-cruz)와 beta-actin를 확인하여 세포주들간의 상대적인 FGFR3 단백질 발현량을 비교하였다. FACS의 경우에는 계대배양된 각각의 세포들을 3.0~5.0E+05 cells / tube으로 분주하여 FGFR3-PE direct antibody (FAB766P, R&D)를 1시간, 4도 반응한 후 세척을 2~3회 진행 후 BD FACSAria™ III (BD Biosciences)로 분석하였다.
Western blot 결과 682T, 526T 환자유래세포는 FGFR3 과발현 세포로 확인이 되었다. 그에 반해 626T, 559T는 FGFR3 발현이 거의 없는 것으로 확인되었다. 동일한 양상은 FACS 결과에서도 검증되었다. 특히 682T 세포는 세포 표면에 FGFR3 발현 레벨이 매우 높은 것으로 사료된다 (도 6a).
실시예 10: FGFR3-TACC3 fusion 검증; RT-PCR
FGFR3는 다양한 암종에서 과발현, 증폭, 변이, fusion 형태로 나타났다. 그 중에서 FGFR3-TACC3 fusion을 지닌 환자는 방광암 및 뇌종양에서 예후가 좋지 않음이 보고되고 있다. 그러므로 이에 대한 치료제는 미충족 의료 수요를 극복할 수 있는 가능성을 가지고 있다. 따라서 본 발명에서 환자유래세포들에 대한 FGFR3-TACC3 fusion 분석을 토대로 그룹화하였으며, 이에 RT-PCR 기법을 사용하여 확인하였다. 환자유래세포 GBM15-682T, GBM14-526T, BT16-1154T, GBM14-606T, NS10-783T를 계대배양을 통해 증식시킨 후, 일정량을 회수하여 RNeasy Mini Kit (Qiagen)를 사용하여 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA는 불안정하므로 RT-PCR (Superscript IV Reverse transcriptase)를 진행하여 cDNA로 합성하였다. FGFR3-TACC3의 fusion site를 분석하기 위해 UCSC genome browser를 사용하여 연구되어 있는 fusion site를 확인하고 FGFR3-TACC3 특이적인 구역을 인식할 수 있게 primer를 제작하였다 (FW: 5’-TGATCATGCGGGAGTGCTG-3’, RV: 5’-CTCCTCACACCTGCTCCTC-3’). 제작한 primer를 사용하여 cDNA에 PCR 실험을 통해 FGFR3-TACC3 fusion 특이적인 구역이 증폭되는지를 확인하였다. 그와 동시에 대조군으로 GAPDH도 같이 확인하였다. 그 결과 GBM15-682T, GBM14-526T, BT16-1154T는 FGFR3-TACC3 fusion으로 확인되었다 (PCR 예상 size, 400~500bp). 그 중, GBM15-682T, GBM14-526T는 동일한 fusion으로 예상되며, BT16-1154T는 다른 fusion으로 예상된다 [도 6b]. FGFR3-TACC3 fusion 뇌종양 환자유래세포를 기반으로 추가적인 FGFR3 항체 클론들의 특성 및 항암 효과를 분석하였다.
실시예 11. FGFR3 항체의 세포 결합능 평가; FACS analysis]
본 발명에서 확인한 FGFR3-TACC3 과발현 환자유래세포에 대한 발굴항체의 결합능을 확인하기 위해 FACS 분석을 수행하였다. 각 세포를 3.0~5.0E+05 cells / tube으로 분주하고, 세척 (PBS) 단계를 수행한 후에 발굴 항체를 100~200nM을 4도에서 처리하였다. 그 후, 동일한 세척 방법을 통해 부착되지 않은 항체 시료를 제거한 후에 anti-human alexa-488 conjugate (Catalog # A-11013, Invitrogen) 항체를 처리하여 세포 표면에 부착된 항체를 BD FACSAria™ III (BD Biosciences)를 통해 검출하여 세포 표면 결합능을 확인하였다. 발굴 항체는 각기 다른 친화도의 세포 결합능을 보였음 (도 7a). 동일한 조건으로 F309 클론에 대해 농도에 따른 세포 표면 결합능을 분석하였으며, 농도에 비례하게 세포 표면 결합능이 있음이 확인되어 FGFR3 특이적 결합능이 있음을 검증하였다 (도 7b). FGFR3가 발현되지 않은 세포주에 대해서는 결합되지 않음도 추가 확인을 수행하였다 (도 7c)
실시예 12: FGFR3 항체의 타겟 분해능 평가; FACS
본 발명에서 발굴한 후보 항체들에 대한 FGFR3 타겟 분해능을 FACS를 통해 스크리닝 하였다. 대표적으로 FGFR3 과발현 세포인 GBM15-682T 환자유래세포를 계대배양하여 3.0E+05 cells/tube로 분주하여 후보 항체를 각각 40ug/ml 처리 (2시간, 37도)하였다. 그 후, 세척을 2-3회 진행 후에 FGFR3-PE (FAB766P, R&D)를 처리하여 1시간, 4도 반응하였다. 동일한 방법으로 2-3회 세척을 진행 후에 BD FACSAria™ III (BD Biosciences)로 분석하였다. 이는 항체 처리 후 세포 표면에 전체 FGFR3 발현 수준을 비교할 수 있다. IgG control과 비교하여 Geomean 값을 바탕으로 비교 분석하였다. 동일한 방법으로 시간별 (4시간, 2시간, 1시간, 30분, 15분)로 항체를 처리하여 시간에 따른 발굴 항체의 세포 표면 FGFR3 분해능을 확인하였다. KMS11 세포주에서 동일하게 수행하였다.
우선적으로 발굴된 항체들에 대해서 동일한 조건으로 한 농도에서 상대적인 비교를 하였으며 이를 토대로 F309, FS306 항체가 세포 표면의 FGFR3를 효과적으로 감소시키는 것이 확인되었다 (도 8). 또한, F309, FS306 클론의 경우 시간에 세포 표면의 전체 FGFR3 발현이 감소하는 것으로 보아 해당 클론들은 FGFR3 분해능이 있는 것으로 추가 확인된다. 또한, F309, FS306은 타 항체인 B701, LY3076226 (D11) 항체보다 뛰어난 분해능이 있는 것으로 사료된다. (도 10a)
실시예 13: FGFR3 에피토프 도메인 맵핑
FGFR3는 세 개의 도메인으로 구성이 되어 있으므로, 발굴 항체의 FGFR3 결합 도메인을 분석하기 위해 각각의 도메인 (FGFR3 Ig domain I, domain II, domain III)을 Fc tag를 붙여 포유세포 단백질 발현 시스템을 통해 생산 및 정제하였다 (도 9c). 정제된 도메인에 대한 항체의 결합능 분석은 앞서 기재한 ELISA와 동일한 방식으로 수행하였으며, 1ug/ml로 코팅 한 후 항체를 처리하고 TMB 발색 반응을 유도하여 측정하였다. F309, FS306 클론은 FGFR3 도메인 1번에 특이적으로 결합하는 것으로 확인되었다 (도 9b). 비교군 항체인 B701 (Vofatamab, Rainier Therapeutics)와 D11 (LY3076226, Eli Lilly)은 문헌상에 보고된 것과 같이 도메인 2번, 3번 사이에 결합하는 것으로 확인되었다. 단, 본 발명에서 진행하였던 도메인 2번에 비교군 항체의 에피토프가 포함되어 있다. 또한, FGFR3와 FGF1, FGF9 등의 리간드는 FGFR3의 Ig domain II, domain III에 결합한다고 보고되어 있다. 이를 근거로 Competition ELISA assay를 진행하였다. 그 결과 B701, D11 항체는 예상대로 FGF 리간드와 경쟁적으로 FGFR3에 결합하는 양상을 보인 반면 F309 항체는 FGF 리간드와 관계없이 FGFR3에 결합하는 것으로 관찰된다. 이는 앞서 언급한 FGFR3 Ig domain I에 결합하는 뒷받침 근거로 판단할 수 있다. (도 9a)
실시예 14: FGFR3 항체의 타겟 분해능 평가; Western blotting
본 발명에서 발굴한 후보 항체들에 대한 FGFR3 타겟 분해능을 Western blotting을 통해 검증하고자 하였으며, FACS 방법과 유사하게 대표적인 세포로 GBM15-682T 환자유래세포를 사용하였다. 세포를 6 well 플레이트에 2.0E+06 cells/well을 분주하고 각 항체를 30ug/ml 농도로 처리하여 3시간, 37도에서 반응시켰다. 그 후 Lysate를 제작하여 Bradford 정량법을 통해 각 샘플을 20ug 계산하여 western blotting을 진행하였다. 전체 FGFR3는 sc-13121 항체로 관찰하였다. KMS11 세포주에서도 동일한 농도 및 반응 조건으로 실험을 수행하였다. FACS 결과와 동일하게 F309, FS306 클론의 전체 FGFR3 분해능이 뛰어남이 확인되었다. (도 10b)
실시예 15: Antibody cellular internalization; Immunocytochemistry (ICC)
항체의 세포 내재화 기작을 ICC 방법을 통해서 추가 검증하였다. FGFR3 과발현 세포로서 GBM15-682T를 사용하였으며, 저발현 세포로서 U87MG을 사용하였다. GBM15-682T 환자유래세포의 경우에는 ICC 슬라이드에 부착되지 않으므로 미리 PLO 시약을 코팅하여 그 위에 세포를 배양하였으며, U87MG의 경우에는 부착세포로서 PLO 처리하지 않고 진행하였다. 먼저 세포 내재화 조건으로는 각각의 항체를 ICC 슬라이드에 부착된 세포에 30ug/ml로 처리하고 37도, 2시간 반응시켰다. 세포 내재화 비활성화 조건은 동일 농도에서 4도에서 2시간 반응시켰다. 그 후 세척을 진행하고 2% PFA로 고정하였다 (10분, 4도). 동일한 세척방법을 한번 더 진행하고 0.1% Triton-X를 상온에서 3min 반응시켜 세포를 투과시키고 다시 세척을 진행하였다. 그 다음 1% BSA로 블록킹을 30분 상온에서 진행하였고, 1차 항체를 4도 조건에서 overnight 처리하였다. 1차 항체는 리소좀 마커인 LAMP-1 항체와 anti-human IgG를 사용하였다. 다음날 세척을 진행하고 2차 항체를 빛이 차폐된 조건에서 4도, 1시간 반응시켰음. 2차 항체는 1차 항체를 프로빙하는 형광 발색을 지닌 항체를 사용하였다 (Alexa 488; Anti-human LAMP1, Alexa 594; Anti-human IgG). 세척 후에 DAPI 염색후 confocal 현미경을 통해 각 샘플을 분석하였다. 분석 결과 F309, FS306 클론은 4도 조건에서 처리하게 되면 FGFR3 과발현 세포인 GBM15-682T 표면에 부착되어 있는 것으로 확인되며, 37도 조건에서는 세포 내재화가 진행되기 때문에 항체가 리소좀 위치 (LAMP-1)와 동일하게 관찰되는 것으로 확인된다. 이를 토대로, 클론들은 세포 표면 FGFR3에 결합 후 세포 내재화 되어 리소좀에서 분해될 것으로 예상된다. (도 11a)
실시예 16: FGFR3 항체의 타겟 분해 기작; 리소좀 저해를 통한 항체 메커니즘 분석
본 발명에서 앞서 기재한 발굴항체의 FGFR3 타겟 분해 기작을 규명하고자 리소좀 저해제를 통한 검증을 진행하였다. 항체는 세포표면에 특이적인 항원에 결합하면 수용체(항원) 매개 세포 내재화 (Receptor mediated endocytosis)가 되고 리소좀에서 수용체와 항체가 같이 분해되는 기작이 보고되었다. 그러므로 FGFR3 항체 중 FGFR3 분해능이 확인된 항체들의 리소좀에서의 분해를 검증하고 리소좀 저해제를 처리한 샘플과 처리하지 않은 샘플에 대한 전체 FGFR3 수준을 western blotting을 통해 확인하였다. GBM15-682T를 6 well 플레이트에 1.5E+06 cells/well로 분주하고 리소좀 저해제로 알려진 Concanamycin을 100nM농도로 2시간, 37도 조건으로 처리하였다. 대조군으로는 DMSO를 처리하였다. 2시간 후에 항체를 각각 30ug/ml 조건으로 37도에서 3시간 처리하였다. 그 후 앞서 기재한 western blotting 방법과 동일하게 진행하여 전체 FGFR3 수준을 확인하였다. 리소좀 저해제인 concanamycin 처리 조건에서는 F309, FS306 클론 처리하더라도 전체 FGFR3는 감소되지 않으며, 처리하지 않은 조건에서는 전체 FGFR3가 유의하게 감소되는 것으로 보아 F309, FS306 클론들은 세포 표면 FGFR3에 부착된 후 세포 내재화 되어 리소좀에서 FGFR3와 함께 분해되는 것으로 사료된다. (도 11b)
실시예 17: Signaling pathway inhibition assay; Western blotting
FGFR3 하위 신호 전달 억제 분석은 western blotting을 통해 분석하였다. 앞서 기재한 Western blotting 방법과 동일하게 진행하였으며, GBM15-682T 환자유래세포를 6 well 플레이트에 분주하고 각각의 항체를 30ug/ml 처리하였다 (37도, 3시간). 그 후, FGFR3 관련 하위 신호전달을 활성화시키기 위하여 FGF1, FGF9 대표 리간드를 50ng/ml (heparin sulfate 50ug/ml 함께 처리) 처리하고 37도, 30분 동안 반응시켰다. 그 후 lysate를 제작하여 각각의 샘플을 20ug에 대해 western blotting을 진행하였다. FGFR3 하위 신호전달 경로의 인산화 및 활성화는 다음 항체를 사용하여 검증하였다; p-FGFR3 (ab155960, Abcam), p-ERK(4370s, CST), p-AKT (9271s, CST). F309, FS306 클론은 FGFR3 하위 신호 전달인 p-FGFR3, p-ERK, p-AKT를 억제하는 것으로 확인되었다. (도 12)
실시예 18: 암세포 성장 억제능 분석; 리간드 의존적 환경
본 발명에서 발굴한 항체에 대한 리간드 의존적 환경에서의 암세포 생장 억제능을 확인하기 위해, GBM15-682T를 96well black-flat bottom 플레이트에 serum free 조건으로 10000 cells/well로 분주하고 하루 starvation 시킨 후에 다음날 리간드인 FGF1 (232-FA, R&D), FGF9 (273-F9, R&D)를 최종농도가 50ng/ml이 되도록 처리하고, 항체 또한 단계 희석하여 농도별로 처리하였다. 그 후, 7일간의 37도 CO2 인큐베이터에서 배양을 진행하였다. 세포 생장 측정은 CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay를 통하여 측정하였으며, 대조군 대비 항체 처리군의 세포 생장을 비교하였다. 해당 세포에 리간드를 처리하면 1.5~2배 정도 리간드에 의해 암 성장이 빠르다는 것을 확인할 수 있으며, 이에 클론을 농도별로 처리시 IgG control (대조군) 대비 20~30% 세포 성장이 억제됨을 확인하였다. (도 13a)
실시예 19: 암세포 성장 억제능 분석; 리간드 비의존적 환경
본 발명에서 기재하였던 세포 생장 측정법을 기반으로 리간드 비의존적 환경에서 항체의 암세포 성장 억제능을 평가하였다. GBM15-682T 환자유래세포를 96well black-flat bottom 플레이트에 10000 cells/well로 분주하고 항체를 단계 희석하여 농도별로 처리하였다. 그 후, 7일간의 37도 CO2 인큐베이터에서 배양을 진행하였다. 세포 생장 측정은 CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay를 통하여 측정하였으며, 대조군 대비 항체 처리군의 세포 생장을 비교하였다. 리간드 없는 환경에서 항체를 처리할 경우, F309, FS306 클론은 IgG control (대조군) 대비 30~40% 세포 성장을 억제하는 것으로 확인되었다. FGFR3 저발현 세포주인 U87MG 및 환자유래세포 (626T)에서는 암세포 생장 억제능이 보이지 않았다. 이는 FGFR3 발현에 따른 생장 저해 특징으로 사료된다. (도 13b)
실시예 20: In vivo 단기 PK 분석 및 이종 이식 모델에서의 효능 평가
발굴 항체의 생체 내 투여시 초기 clearance 여부를 확인하기 위해 단기 PK를 수행하였다. Balb/c 쥐에 항체를 10 mg/kg를 투여하고, 투여 직후, 1hr, 2hr, 4hr, 1 day, 2 day 간격으로 개체별 혈액 시료를 확보하였다. 혈액의 혈구를 제거하기 위해, 원심분리기를 통해 혈장을 확보를 하였으며, 혈장안의 항체 titer를 ELISA 기반으로 정량하였다. 그 결과, 대조 항체와 유사하게 F309, FS306 항체 모두 초기에 clearance 되는 패턴 없이 정상적인 항체의 초기 PK가 있음이 확인되었다 (도 14a).
발굴 항체의 in vivo 효력평가를 하기 위하여 본 연구진은 이종 이식 모델을 제작하였다. Bab/c nude 마우스에 피하주사를 통해 마우스의 옆구리에 GBM15-682T를 주입 (1.0E+06 cells)하여 종양 형성을 하였으며, 종양이 평균 100~150 mm3 형성이 되면 마우스를 다시 재그룹화하여 5마리씩 그룹을 지정하였다. 각 그룹별 항체 및 vehicle을 주 3회 또는 주 2회 농도별로 복강내 주사를 수행하였다. 종양 부피는 캘리퍼스(calipers)를 사용하여 V=0.5a X b2 (a: 종양 장축의 길이, b: 종양 단축의 길이) 공식으로 계산하였다. 종양 측정과 동일한 날에 마우스의 무게 측정도 진행하였다. F309, FS306 클론은 각각 10mg/kg (주 3회) 투여 시, 각각 암 생장을 약 50%, 40% 억제하는 것으로 확인되었다 (도 14a). F309의 경우에는 농도별 주 2회 투여 시 (30mpk, 10mpk, 3mpk)에서 뛰어난 항암 효과로 암 생장을 억제하는 것으로 사료된다 (도 14b).
실시예 21: F309 항체 친화도 성숙 엔지니어링
F309의 뛰어난 FGFR3 분해능과 암 성장 억제능에 대한 추가적인 개선을 위하여 친화도 성숙을 진행하였다. M13 박테리오파지 표면에 F309 scFv 절편 (중쇄 가변부위; VH, 경쇄 가변부위; VL)을 디스플레이 하는 파지미드 벡터를 제작하여 이를 라이브러리 주형으로 사용하였다. 친화도 성숙을 위해 항체의 Kabat 넘버링을 바탕으로 CDR H1, H2, H3 와 CDR L1, L2, L3를 선정하였고 각각의 CDR에 대해 NNK degeneration codon이 포함된 프라이머를 사용하여 F309 mutant 라이브러리를 제작하였다 (도 15a). 각각의 라이브러리에 대해 앞서 기재한 바이오패닝 (항원 고정 패닝)을 3~4회 진행하였으며, 이를 토대로 F309 모항체보다 더욱 친화도가 상승한 항체를 ELISA 기반 친화도 스크리닝으로 클론을 확보하였다. 확보한 클론은 재현 실험을 진행하여 재검증을 하였으며, 최종적으로 항체 서열 분석을 통해서 F309의 친화도 성숙 돌연변이체를 확보하였다. 확보된 F309 돌연변이체들은 FGFR3 재조합 단백질에 대한 특이적 결합능이 모항체 대비 유의하게 상승하는 것으로 판단된다 (도 15b). 더 나아가 SSM001~ SSM010 돌연변이체에 대한 아미노산 잔기 조합으로 추가적인 돌연변이체 SSM023, SSM024, SSM026, SSM034, SSM036, SSM234, SSM236를 디자인 및 제조하였다. 이에 대한 항체들에 대해 FGFR3 항원 특이적인 결합능 분석을 검증하고자 ELISA를 수행하였으며, 그 결과 더욱 상승된 FGFR3 항원 친화도가 확인되었다 [도 15b, 도 15c]. 돌연변이체 항체의 생물학적 활성에 대한 분석을 GBM15-682T에서 진행하였으며, 그 결과 F309 모항체 대비 증가된 암 생장 억제를 확인할 수 있었다 (도 15d).
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실시예 22: F309 항체의 ADC 적용 가능성 검증
항체-약물 접합체의 경우에는 항체가 세포 표면의 항원에 특이적으로 결합하고, 수용체-매개 세포 내재화를 통해 세포 내부로 유입되며 세포 내부의 리조솜 및 프로테아제에 의해 분해되어 접합되어 있는 독성 물질에 의해 세포를 사멸시키는 기작을 지님. 이는 치료 효과를 극대화할 수 있는 플랫폼으로 차세대 항체 치료제 플랫폼으로 널리 사용되고 있다. 본 발명에서는 FGFR3, FGFR3-TACC3 fusion 세포에 대한 내재화 및 타겟 분해능 탁월한 클론들에 대해서 항체-약물 접합체로의 적용 가능성을 확인하고자 하였다. F309, FS306 클론은 본 발명에서 기재되어 있듯이 FGFR3 타겟 분해능과 세포 내재화가 입증되었기 때문에 항체-약물 접합체 플랫폼으로서 적용 가능할 것으로 판단하여 이에 대해 수행하였다. 그 중 F309 클론에 대한 항체-약물 접합체 제조는 PerKit™ Antibody MMAE Conjugation Kit (CellMosaic)를 사용하였으며, 이 플랫폼은 1세대 항체-약물 접합체 기술로서 (a method developed by Seattle Genetics: Sun et al. 2005, Bioconjugate Chem. 16, 1282-1290) 항체의 interchain disulfide에 임의적으로 -vc MMAE를 접합시키는 방식이다 (도 16a). 다양한 환자유래세포 및 암세포주를 FACS 발현 기준으로 선정하여 High, Mild, Low로 상대적으로 그룹화 하였으며, 이에 대해 F309의 세포 독성 실험을 진행하였다. 평가 방법은 본 발명에서 기재하였듯이 CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay를 통하여 측정하였다. 그 결과 FGFR3 세포 표면 발현량에 비례하여 F309-vc MMAE의 세포독성이 탁월하게 나타남을 확인하였으며 (도 16b~16c), 추가적인 경쟁력을 확보하고자 FGFR3-ADC로 임상개발중인 LY3076226 모항체를 동일한 Kit로 적용하여 효과를 비교하였다. F309-vc MMAE는 FGFR3-TACC3 fusion인 GBM15-682T에서 LY3076266-vc MMAE보다 뛰어난 세포 독성을 보였다. 각 FGFR3 발현량에 따른 ADC의 세포에 대한 생장 억제 효과는 IC50 및 MAX inhibition으로 분석하였으며 (도 16d)의 table에 표기하였다.
실시예 23: 친화도 성숙 항체의 에피토프 도메인 맵핑 및 항원 친화력 분석
앞서 실시한 에피토프 도메인 맵핑을 친화도 성숙 항체 F309#SSM236 (이하, AMB302#1.2)에 대해서도 수행하였다. 모 항체의 경우에 도메인 D1에 결합하는 것으로 확인되었으며, 동일한 각 도메인 (Domain, I, Domain, II, Domain III)을 사용하여 분석하였을 경우에도 친화도 성숙 항체는 도메인 D1에 특이적으로 결합하는 것으로 확인되었다. 해당 항체의 경우에는 human/cyno FGFR3 에 특이적인 결합능이 지님을 재확인하였다 (도 17). 각 항원에 따른 KD value는 다음 표 14와 같다.
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실시예 24 : 친화도 성숙 항체의 세포 내재화 및 타겟 분해능 평가
친화도가 상당히 성숙된 F309 변이체들에 대해서, 세포 표면의 FGFR3 타겟을 효율적으로 분해하는 검증하였다. 앞선 발명에서 수행한 동일한 방법을 통해서, 먼저 FGFR3 세포 표면 발현량 확인 및 세포 내재화 평가는 FACS를 통해서 검증하였으며, Western blotting을 통해서는 타겟 분해능을 수행하였다. 친화도 성숙 변이체의 경우에는 상당한 세포내재화 효능과 타겟 분해능이 있음이 확인되었다 (도 18 내지 도 20).
실시예 25 : 친화도 성숙 항체의 쥐/원숭이 PK 분석
친화도 성숙 항체 (AMB302#1.2, SSM236)의 생체 PK 프로파일을 검증을 위해 쥐/원숭이 개체에 분석을 수행하였다. 쥐 BALB/c mice (8 weeks, ~20g, n=3, female)에 단일 클론 항체를 10 mg/kg, 1mg/kg, 0.1mg/kg를 투여하고, 투여 직후, 10 min, 1h, 3h, 5h, 8h, 24h, Day 2, 3, 7, 10, 14, 17, 21, 28 일 간격으로 살아있는 개체를 3두씩 교차하여 시간별 안와체혈을 하였다. 혈액의 혈구를 제거하기 위해, 원심분리기를 통해 혈장을 확보를 하였으며, 혈장안의 항체 titer를 quantification ELISA 기반으로 정량하였다. 그 결과, AMB302#1.2 항체의 경우에는 쥐 생체 내에서 10일 이상의 안정적인 반감기 (t 1/2) 특성과 CL를 가지고 있음을 확인하였다. 또한, 모든 투여 농도에서 생체적으로 특이적인 임상적 부작용과 무게변화는 관찰되지 않았다 (도 21).
원숭이 한 마리 개체 (2-3 years, ~ 3kg , female, naive) 에서는 25 mg/kg 투여 후 50 mg/kg 단 회 투여를 수행하였고, 각 시간 별로 혈액 시료를 채취하였다 (10 minutes, 1 and 6 hours, 1, 2, 3, 7, 10, 14, 21, and 28 days). 확보된 혈액은 혈구 제거를 위해 원심분리기를 통해 혈장을 확보하였으며 혈장안의 항체는 quantification ELISA 를 통해서 정량하였다. 그 결과, 쥐에서의 결과와 유사하게 안정적인 반감기 (10일 이상)와 CL 경향성이 확인되었다. 또한, 모든 투여 농도에서 생체적으로 특이적인 임상적 부작용과 무게변화는 관찰되지 않았다 (도 22).
실시예 26 : 친화도 성숙 항체의 ADC 제조
본 발명에서 친화도 성숙 엔지니어링을 통해 확보한 변이체들에 대해서 ADC 제조를 수행하였다 (도 23). 정제된 항체 시료에 tris(2-Carboxyethyl) phosphine hydrochloride(TCEP)를 당량비 8.0 이상을 처리하여 2시간 37도에서 완전 환원하였다. 환원 후에는 PBS pH7.4로 버퍼 교환을 수행하였고, 해당 시료에 대해서 링커-페이로드 (Topoisomerase I inhibitor, 당량비 10.0)를 DMA에 녹여 함께 환원된 항체에 2시간 37도에서 접합하였다. 접합 후에는 원심 컬럼( Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units)을 통해서 버퍼를 교환하였다.
동일한 방법으로 항체를 부분 환원하여 링커-페이로드 (Duocarmycin derivatives, linker-AMB401)을 접합한 ADC를 제조하였다 (도 24).
실시예 27: 친화도 성숙 항체 ADC 분석 (TOPOI)
합성 완료된 ADC 시료 (TOPOI 접합 ADC) 에 대해서 항원 친화도를 ELISA를 통해서 확인하였으며, 본 발명에서 수행한 affinity ELISA와 동일한 방법으로 진행하였으며 모 항체와 동일한 항원 결합능이 있음을 확인하였다. 또한, SEC-HPLC 분석을 통해서 제조된 ADC의 고순도 물성 특징을 확인하였다.
DAR 분석은 LC-MS를 통해서 수행하였으며, 제조된 ADC에 대해서 각각 중쇄 사슬, 경쇄 사슬에 부착된 링커-페이로드의 질량 분석을 수행하였으며 이를 환산하였을 경우 대략 DAR 6 이상임을 확인할 수 있었다 (도 25).
실시예 28: 친화도 성숙 항체 ADC 분석 (Duocarmycin, Linker-AMB401)
합성 완료된 ADC 시료 (duocarmycin, linker-AMB401; ADC) 에 대해서 해당 물질의 분석은 SEC-HPLC를 통해서 순도를 분석하였고, HIC-HPLC와 PLRP 분석을 통해서 DAR을 분석하였다. 해당 물질의 경우에는 순도 98%이상과 DAR 약 4정도의 균일한 물성 특징이 있음을 확인하였다 (도 26: 20 mM Histidine-acetate pH 6.0).
실시예 29 : 환자유래 오가노이드 Ex vivo 모델에서의 친화도 성숙 변이체 ADC 효능 평가 (ADC-TOPOI)
제조된 ADC를 사용하여, FGFR3 (TACC3 fusion) 과발현 환자유래 오가노이드에 대한 효능 평가를 수행하였다. 뇌종양 환자 유래 암 조직으로부터 암세포를 분리하여 single spheroid organoid 모델을 만들었다. FGFR3-TACC3 fusion 이 있는 환자유래세포 2종 (AMB-BT-0050T, AMB-BT-0112T)과 그렇지 않은 환자유래세포 (AMB-BT-0013T)를 활용하여 overnight incubation 하여 single spheroid 를 형성한 후 ADC를 처리하여 일주일 incubation 한 후 그 결과를 확인하였다. Negative control에서는 ADC와 control ADC 간의 sensitivity 차이는 없었고 FGFR3-TACC3 fusion 이 있는 환자유래세포 2종에서 control ADC대비 유의하게 spheroid growth를 FGFR3 발현량에 비례하여 특이적으로 저해하고 세포 사멸을 유도하는 것으로 분석되었다. 특히 친화도 성숙된 변이 항체-ADC의 경우에는 FGFR3 (TACC3 fusion) 과발현 세포에 모항체-ADC 대비 상당히 향상된 세포 독성과 사멸을 유도함을 확인하였다. FGFR3 (TACC3 fusion) 과발현 세포에 대해서는 0.3 nM 이하의 IC50를 보였으며, negative 세포에 대해서는 90 nM 이상의 IC50를 보였다(도 27).
실시예 30 : 환자유래 오가노이드 Ex vivo 모델에서의 친화도 성숙 변이체 ADC 효능 평가 (ADC-Duocarmycin, linker-AMB401)
실시예 27과 동일한 방법으로 AMB302#1.2-Duocarmycin ADC의 ex vivo 효능 평가를 수행하였다. FGFR3 (TACC3) 과발현 뇌종양 환자유래세포에 대해서는 약 0.3 nM 의 낮은 IC 50를 보였으며, negative 세포에 대해서는 100 nM 이상의 높은 IC50를 보였다. 이는 해당 ADC가 FGFR3 발현에 상당히 비례한 세포 사멸을 유도함을 보여준다 (도 28).
실시예 31 : FGFR3 (TACC3 융합) 뇌종양 정위적 동물 모델에서의 ADC 효능평가 (ADC-TOPOI)
ADC 치료를 통한 뇌종양 정위적 동물모델 (뇌종양, GBM)에서의 생존율 증가를 평가하였다 (도 29). FGFR3 과발현 세포인 AMB-BT-0050T (682T) 환자유래세포를 배양하여 2X10^5의 세포를 5 ul의 배지와 혼합하여 준비함. 준비된 세포주를 면역결핍 마우스의 브레그마에서 좌로 1.7 mm, 위로 0.5 mm의 위치에 3.2 mm 깊이로 주입하여 뇌종양 마우스 모델을 제작하였다. Control, Control-TOPOI, AMB302#1.2-TOPOI (단 회 투여, 다 회 투여)로 총 4 그룹으로 나누어 그룹당 7두의 마우스로 평가를 진행하였다. 후보약물은 모델 제작 후 7일 째에 정맥주사를 통해 단 회 투여하였다. 15일 째에 Biomarker 분석등을 위해 그룹당 2두씩 중간 샘플링을 하였다. 마우스의 체중을 주 2회 측정하였으며, 20%이상의 체중감소가 있을 시 안락사 진행하여 마우스의 뇌를 적출하였다. AMB302#1.2-TOPOI의 경우에는 단 회 투여를 통해서도, 마우스이 생존기간이 70% 이상 증가하였음을 확인하였다.
동일한 모델에서 AMB302#1.1-TOPO1을 2 회 투여 (1주일 간격, 10mg/kg) 하였을 경우에도 상당한 마우스 생존기간을 100% 이상 증가시켰다. 또한, 중간 샘플링을 통해 마우스 뇌의 종양 크기를 비교하였을 때에, ADC 처리 개체의 경우에는 control 집단 대비 종양이 발견되지 않았다. 또한, 모 항체 기반의 ADC보다 친화도 성숙 ADC가 확실히 향상된 종양 억제와 생존률 증가를 유도함을 확인하였다 (도 30).
실시예 32 : FGFR3 (TACC3 융합) 피하 이식 모델에서의 ADC 효능평가 (ADC-TOPOI)
Bab/c nude 마우스에 피하 주사 (s.c, subcutaneous)를 통해 마우스의 옆구리에 RT112 세포를 주입 (1.0E+06 cells)하여 종양 형성을 하였으며, 종양이 평균 100~150 mm3 형성이 되면 마우스를 다시 재그룹화하여 5마리씩 그룹을 지정하였다. 각 그룹별 ADC 및 vehicle을 2번 (1주일 간격, 5mp/kg) 로 정맥 주사를 수행하였다. 종양 부피는 캘리퍼스(calipers)를 사용하여 V=0.5a X b2 (a: 종양 장축의 길이, b: 종양 단축의 길이) 공식으로 계산하였다. 종양 측정과 동일한 날 마우스의 무게 측정도 진행하였다. ADC-TOPOI 투여 시, 각각 암 생장을 완전히 억제하는 것으로 확인되어, 뛰어난 항암 효과를 가짐을 확인하였다 (도 31).
실시예 33 : FGFR3 (TACC3 융합) 뇌종양 정위적 동물 모델에서의 ADC 효능평가 (ADC-Duocarmycin, linker-AMB401)
앞서 수행한 동일한 모델에서 AMB302#1.1-AMB401을 단 회 투여 (10 mg/kg) 또는 다 회 투여 (10 mg/kg, Q4D)로 효능평가를 수행하였다. 해당 ADC 투여 군에서 유의미하게 생존률이 증가함을 확인하였고, 특히 다 회 투여를 수행한 군에서는 30% 이상의 생존률 증가함을 확인하였다 (도 32).
본 발명에 따른 항-FGFR3 항체 또는 이의 항원 결합단편은 기존의 항-FGFR3 항체보다 FGFR3에 대한 우수한 결합력을 나타내며, 목적하는 종양 또는 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
특히, FGFR3-TACC3 과발현 뇌종양 환자유래세포를 통한 스크리닝으로, 공지의 항-FGFR3 항체보다 FGFR3-TACC3 과발현 암세포에 더욱 우수한 효능을 지닌 항체를 선별하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술한 바, 당 업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (45)

  1. 다음을 포함하는 FGFR3 (Fibroblast growth factor receptor 3)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편:
    서열번호 1 내지 서열번호 18로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1,
    서열번호 19 내지 서열번호 41로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2,
    서열번호 42 내지 서열번호 66, 서열번호 186 내지 198로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3,
    서열번호 67 내지 서열번호 88로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1,
    서열번호 89 내지 서열번호 109로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 및
    서열번호 110 내지 서열번호 132, 서열번호 199 내지 서열번호 202로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 133 내지 서열번호 157, 서열번호 203 내지 서열번호 215로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합단편.
  3. 제1항에 있어서, 서열번호 158 내지 서열번호 182, 서열번호 216 내지 서열번호 219로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합단편.
  4. 제1항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 5의 중쇄 CDR 1, 서열번호 23의 중쇄 CDR2 및 서열번호 203 내지 215로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 71의 경쇄 CDR1, 서열번호 93의 경쇄 CDR2 및 서열번호 216 내지 219로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합단편.
  5. 제1항에 있어서, 단쇄 Fvs (scFv), 단쇄 항체, Fab, F(ab'), 다이설파이드-결합 Fvs (sdFv)을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합단편.
  6. 제5항에 있어서, 상기 scFv는 서열번호 133 내지 서열번호 157로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역과 서열번호 158 내지 서열번호 182로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역이 링커를 통해 연결된 것을 특징으로 하는, 항체 또는 이의 항원 결합단편.
  7. 제6항에 있어서, 상기 링커는 (GnS)m (n, m은 각각 1 내지 10)을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합단편.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합단편을 코딩하는 핵산.
  9. 제8항의 핵산을 포함하는 재조합 발현벡터.
  10. 제9항의 재조합 발현벡터로 형질감염된 숙주세포.
  11. 제10항에 있어서, COS-7, BHK, CHO, CHOK1, DXB-11, DG-44, CHO/-DHFR, CV1, COS-7, HEK293, BHK, TM4, VERO, HELA, MDCK, BRL 3A, W138, Hep G2, SK-Hep, MMT, TRI, MRC 5, FS4, 3T3, RIN, A549, PC12, K562, PER.C6, SP2/0, NS-0, U20S, 또는 HT1080인 숙주세포.
  12. 제10항의 숙주세포를 배양하여 항체를 생성하는 단계; 및 생성된 항체를 분리 및 정제하는 단계를 포함하는, FGFR3에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편의 제조방법.
  13. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 이중 또는 다중특이적 항체.
  14. 제13항에 있어서, PD-1, PD-L1, BTLA, CTLA-4, VISTA, LAG3, TIM3, CD137(4-1BB), VISTA, CD258(LIGHT), TIGIT, CD134(OX40), CD28, CD278(ICOS), CD27, CD154(CD40L), CD357(GITR), CD30, DR3, CD226(DNAM1), CD96, CD200, CD200R, Transferrin receptor, c-Met, EGFR, HER2, KDR, PDGFRa, NRP1, MARCO으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 파트너로 포함하는 이중 또는 다중특이적 항체.
  15. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항체의 scFv 및 면역세포 활성화 항원에 결합하는 항체의 scFv를 하나 이상 포함하는 제2결합 도메인으로 구성된 scFv를 포함하는, 면역세포 인게이징(immune cell engage) 이중특이적 또는 다중특이적 항체.
  16. 제15항에 있어서, 상기 scFv는 서열번호 133 내지 서열번호 157, 서열번호 203 내지 서열번호 215로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역과 서열번호 158 내지 서열번호 182, 서열번호 216 내지 서열번호 219로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역이 링커를 통해 연결된 것을 특징으로 하는, 이중특이적 또는 다중특이적 항체.
  17. 제16항에 있어서, 상기 링커는 (GnS)m (n, m은 각각 1 내지 10)을 포함하는, 이중특이적 또는 다중특이적 항체.
  18. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합단편이 약물에 결합된 항체-약물 접합체 (ADC).
  19. 제18항에 있어서, 상기 약물은
    (1) 마이탄시노이드, 오리스타틴 (MMAE, MMAF 포함), 아미노프테린, 악티노마이신, 블레오마이신, 탈리소마이신, 캄프토쎄신, N8-아세틸 스퍼미딘, 1-(2 클로로에틸)-1,2-다이메틸 술포닐 하이드라자이드, 에스퍼라마이신, 에토포사이드, 6-머캅토퓨린, 돌라스타틴, 트리코테센, 칼리케아미신, 탁솔(taxol), 탁산, 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 메토트렉세이트, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 A, 미토마이신 C, 클로람부실, 듀오카마이신, L-아스파라기나제(L-asparaginase), 머캡토퓨린(mercaptopurine), 티오구아닌(thioguanine), 하이드록시우레아(hydroxyurea), 시타라빈(cytarabine), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide), 니트로소우레아(nitrosourea), 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 미토마이신(mitomycin), 다카바진(dacarbazine), 프로카바진(procarbazine), 토포테칸(topotecan), 질소 머스터드(nitrogen mustard), 사이톡산(cytoxan), 에토포시드(etoposide),5-플루오로우라실(5-fluorouracil), CNU(bischloroethylnitrosourea), 이리노테칸(irinotecan), 캄포토테신(camptothecin), 블레오마이신(bleomycin), 이다루비신(idarubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 닥티노마이신(dactinomycin), 플리카마이신(plicamycin), 미톡산트론(mitoxantrone), 아스파라기나제(asparaginase), 비노렐빈(vinorelbine), 클로로람부실(chlorambucil), 멜파란(melphalan), 카르무스틴(carmustine), 로무스틴(lomustine), 부설판(busuLfan), 트레오설판(treosulfan), 데카바진(decarbazine), 에토포시드(etoposide), 테니포시드(teniposide), 토포테칸(topotecan), 9-아미노캠프토테신(9-aminocamptothecin), 크리스나톨(crisnatol), 미토마이신 C(mitomycin C), 트리메트렉세이트(trimetrexate), 마이코페놀산(mycophenolic acid), 티아조퓨린(tiazofurin), 리바비린(ribavirin), EICAR(5-ethynyl-1-beta-Dribofuranosylimidazole-4-carboxamide), 하이드록시우레아(hydroxyurea), 데프록사민(deferoxamine), 플룩수리딘(floxuridine), 독시플루리딘(doxifluridine), 랄티트렉세드(raltitrexed), 시타라빈(cytarabine(ara C)), 시토신 아라비노시드(cytosine arabinoside), 플루다라빈(fludarabine), 타목시펜(tamoxifen), 라록시펜(raloxifene), 메게스트롤(megestrol), 고세렐린(goserelin), 류프롤리드 아세 테이트(leuprolide acetate), 플루타미드(flutamide), 바이칼루타마이드(bicalutamide), EB1089, CB1093, KH1060, 베르테포르핀(verteporfin), 프탈로시아닌(phthalocyanine), 광감작제 Pe4(photosensitizer Pe4), 데메톡시-하이포크레린 A(demethoxy-hypocrellin A), 인터페론-α(Interferon-α), 인터페론-γ(Interferon-γ), 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor), 겜사이타빈(Gemcitabine), 벨케이드(velcade), 레발미드(revamid), 탈라미드(thalamid), 로바스타틴(lovastatin), 1-메틸-4-페닐피리디늄 이온(1-methyl-4-phenylpyridiniumion), 스타우로스포린(staurosporine), 악티노마이신 D(actinomycin D), 닥티노마이신(dactinomycin), 블레오마이신 A2(bleomycin A2), 블레오마이신 B2(bleomycinB2), 페플로마이신(peplomycin), 에피루비신(epirubicin), 피라루비신(pirarubicin), 조루비신(zorubicin), 마이토산트론(mitoxantrone), 베라파밀(verapamil) 및 탑시가르긴(thapsigargin), 핵산 분해 효소 및 세균이나 동식물 유래의 독소로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 항암제,
    (2) 스테로이드제제, 비-스테로이드항염증제(NSAIDs) 또는 면역특이소염제제(ImSAIDs)를 포함하는 항염증제; 또는
    (3) 아자티오프린, 클로람부실, 사이클로포스파마이드, 사이클로스포린, 미코페놀레이트, 아자치오프린(azathioprine), 또는 메토트렉세이트(methotrexate)를 포함하는 면역질환 치료제인 것을 특징으로 하는 항체-약물 접합체.
  20. 제18항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편은 약물과 링커를 통하여 결합되는 것을 특징으로 하는 항체-약물 접합체.
  21. 제20항에 있어서, 상기 링커는 절단성 링커 또는 비절단성 링커인 것을 특징으로 하는 항체-약물 접합체.
  22. 제21항에 있어서, 상기 절단성 링커는 산성 불안정 링커 (acid-labile linker), 이황화 링커, 펩타이드 링커, 또는 베타-글루쿠로나이드 (beta-glucuronide) 링커이고, 또는 상기 비절단성 링커는 티오에테르기 또는 말레이미도카프로일기를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체-약물 접합체.
  23. 제20항에 있어서, 상기 링커는 항체의 이황화 결합 환원시 노출되는 시스테인 잔기 또는 항체에 결합된 태그에 존재하는 시스테인 잔기에 결합되는 것을 특징으로 하는 항체-약물 접합체.
  24. 항원 결합 부위를 포함하는 세포외도메인, 트랜스 멤브레인 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)로, 상기 세포외도메인의 항원 결합 부위는 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항체의 scFv인 것을 특징으로 하는 키메라 항원 수용체.
  25. 제24항에 있어서, 상기 scFv는 서열번호 133 내지 서열번호 157로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역과 서열번호 158 내지 서열번호 182로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역이 링커를 통해 연결된 것을 특징으로 하는, 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 상기 링커는 (GnS)m (n, m은 각각 1 내지 10)을 포함하는, 조성물.
  27. 제24항에 따른 키메라 항원 수용체(CAR)가 도입되어 있는 면역세포.
  28. 제27항에 있어서, T 세포, NK 세포, 사이토카인 유도 살해세포(Cytokine Induced Killer cell, CIK), 활성화 세포독성 T 림프구(Cytotoxic T Lymphocyte, CTL), 마크로파지, 종양 조직 내 침투 T 세포 (Tumor-Infiltrating Lymphocytes, TIL), 수지상세포로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 면역세포.
  29. 제27항에 있어서, 상기 항-FGFR3 항체 이외의 항체에 대한 scFv가 세포외도메인의 항원 결합 부위로 포함된 키메라 항원 수용체(CAR)가 추가로 도입되어 있는 면역세포.
  30. 제29항에 있어서, 상기 항-FGFR3 항체 이외의 항체는 PD-1, PD-L1, BTLA, CTLA-4, VISTA, LAG3, TIM3, CD137(4-1BB), VISTA, CD258(LIGHT), TIGIT, CD134(OX40), CD28, CD278(ICOS), CD27, CD154(CD40L), CD357(GITR), CD30, DR3, CD226(DNAM1), CD96, CD200, CD200R, Transferrin receptor, c-Met, EGFR, HER2, KDR, PDGFRa, NRP1, MARCO으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 타겟하는 항체인 면역세포.
  31. 제27항의 면역세포 및 항-FGFR3 항체 이외의 약물을 포함하는 병용 치료용 조성물.
  32. 제31항에 있어서, 상기 항-FGFR3 항체 이외의 약물은 PD-1, PD-L1, BTLA, CTLA-4, VISTA, LAG3, TIM3, CD137(4-1BB), VISTA, CD258(LIGHT), TIGIT, CD134(OX40), CD28, CD278(ICOS), CD27, CD154(CD40L), CD357(GITR), CD30, DR3, CD226(DNAM1), CD96, CD200, CD200R, Transferrin receptor, c-Met, EGFR, HER2, KDR, PDGFRa, NRP1, MARCO으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 타겟하는 항체인 조성물.
  33. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합단편과 다음으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 병용 치료용 조성물:
    (i) 면역세포;
    (ii) 항-FGFR3 항체 이외의 항체에 대한 scFv를 세포외도메인으로 포함하는 항원 수용체(CAR)를 포함하는 면역세포; 및
    (iii) 면역관문억제제 (Immune checkpoint inhibitor).
  34. 제33항에 있어서, 상기 면역세포는 T 세포, NK 세포, 사이토카인 유도 살해세포(Cytokine Induced Killer cell, CIK), 활성화 세포독성 T 림프구(Cytotoxic T Lymphocyte, CTL), 마크로파지, 종양 조직 내 침투 T 세포 (Tumor-Infiltrating Lymphocytes, TIL), 수지상세포로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 조성물.
  35. 제33항에 있어서, 상기 항-FGFR3 항체 이외의 항체는 PD-1, PD-L1, BTLA, CTLA-4, VISTA, LAG3, TIM3, CD137(4-1BB), VISTA, CD258(LIGHT), TIGIT, CD134(OX40), CD28, CD278(ICOS), CD27, CD154(CD40L), CD357(GITR), CD30, DR3, CD226(DNAM1), CD96, CD200, CD200R, Transferrin receptor, c-Met, EGFR, HER2, KDR, PDGFRa, NRP1, MARCO으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 타겟하는 항체인 조성물.
  36. 제33항에 있어서, 상기 면역관문억제제는 PD-1, PD-L1, BTLA, CTLA-4, VISTA, LAG3, TIM3, CD137(4-1BB), VISTA, CD258(LIGHT), TIGIT, CD134(OX40), CD28, CD278(ICOS), CD27, CD154(CD40L), CD357(GITR), CD30, DR3, CD226(DNAM1), CD96, CD200, CD200R, Transferrin receptor, c-Met, EGFR, HER2, KDR, PDGFRa, NRP1, MARCO으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 타겟으로 하는 약물인 조성물.
  37. 제13항에 따른 이중특이적 또는 다중특이적 항체 및 다음으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 병용 치료용 조성물:
    (i) 면역세포;
    (ii) 항-FGFR3 항체 이외의 항체에 대한 scFv 단편을 세포외도메인으로 포함하는 항원 수용체(CAR)를 포함하는 면역세포; 및
    (iii) 면역관문억제제 (Immune checkpoint inhibitor).
  38. 제37항에 있어서, 상기 항-FGFR3 항체 이외의 항체는 PD-1, PD-L1, BTLA, CTLA-4, VISTA, LAG3, TIM3, CD137(4-1BB), VISTA, CD258(LIGHT), TIGIT, CD134(OX40), CD28, CD278(ICOS), CD27, CD154(CD40L), CD357(GITR), CD30, DR3, CD226(DNAM1), CD96, CD200, CD200R, Transferrin receptor, c-Met, EGFR, HER2, KDR, PDGFRa, NRP1, MARCO으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 타겟하는 항체인 조성물.
  39. 제37항에 있어서, 상기 면역관문억제제는 PD-1, PD-L1, BTLA, CTLA-4, VISTA, LAG3, TIM3, CD137(4-1BB), VISTA, CD258(LIGHT), TIGIT, CD134(OX40), CD28, CD278(ICOS), CD27, CD154(CD40L), CD357(GITR), CD30, DR3, CD226(DNAM1), CD96, CD200, CD200R, Transferrin receptor, c-Met, EGFR, HER2, KDR, PDGFRa, NRP1, MARCO으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 타겟으로 하는 약물인 조성물.
  40. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합단편, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 이중 또는 다중특이적 항체, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 항체-약물 접합체, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 키메라 항원 수용체 또는 상기 키메라 항원 수용체를 포함하는 면역세포를 포함하는 암, 염증 또는 면역질환 치료용 조성물.
  41. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합단편, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 항체-약물 접합체를 포함하는 암, 염증 또는 면역질환 치료용 조성물.
  42. FGFR3과 TACC3의 융합 유전자가 증폭되거나, 융합 유전자에 변이가 있거나, 융합 유전자가 과발현되거나 또는 융합 유전자가 항상 발현 (constitutive activation)되는 것으로 확인된 암을 치료하기 위한, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합단편, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 이중 또는 다중특이적 항체, 항체-약물 접합체, 키메라 항원 수용체 또는 상기 키메라 항원 수용체를 포함하는 면역세포를 포함하는, 암, 염증 또는 면역질환 치료용 조성물.
  43. 환자 유래 샘플에서 FGFR3과 TACC3의 융합 유전자가 증폭되거나, 융합 유전자에 변이가 있거나, 융합 유전자가 과발현되거나 또는 융합 유전자가 항상 발현 (constitutive activation)되는 것을 확인하는 단계;
    FGFR3과 TACC3의 융합 유전자가 증폭되거나, 융합 유전자에 변이가 있거나, 융합 유전자가 과발현되거나 또는 융합 유전자가 항상 발현 (constitutive activation)되는 것으로 확인된 경우, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합단편, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 이중 또는 다중특이적 항체, 항체-약물 접합체, 키메라 항원 수용체 또는 상기 키메라 항원 수용체를 포함하는 면역세포를 투여하는 단계를 포함하는, 암, 염증 또는 면역질환 치료방법.
  44. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합단편이 그 외부로 표출되거나 또는 그 내부에 존재하는 소포체 (vesicle).
  45. 제44항에 있어서, 엑소좀인 소포체.
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