WO2022181062A1 - 測定方法及び測定システム - Google Patents

測定方法及び測定システム Download PDF

Info

Publication number
WO2022181062A1
WO2022181062A1 PCT/JP2022/000141 JP2022000141W WO2022181062A1 WO 2022181062 A1 WO2022181062 A1 WO 2022181062A1 JP 2022000141 W JP2022000141 W JP 2022000141W WO 2022181062 A1 WO2022181062 A1 WO 2022181062A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
nucleic acid
hybridization reaction
amount
microorganisms
microarray
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2022/000141
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
祐樹 宮内
朋之 田口
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yokogawa Electric Corp
Original Assignee
Yokogawa Electric Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yokogawa Electric Corp filed Critical Yokogawa Electric Corp
Priority to EP22759105.4A priority Critical patent/EP4299713A4/en
Priority to CN202280014962.5A priority patent/CN116848261A/zh
Priority to US18/278,868 priority patent/US20240150815A1/en
Publication of WO2022181062A1 publication Critical patent/WO2022181062A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/34—Measuring or testing with condition measuring or sensing means, e.g. colony counters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/06—Quantitative determination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes

Definitions

  • the nucleic acid in the step of subjecting to the hybridization reaction, is captured by a probe immobilized on the solid phase surface of each spot of the microarray and modified with a fluorescent molecule. you can By doing so, the amount of nucleic acid contained in the specimen sample in contact with each spot is measured as the brightness value of each spot. As a result, the accuracy of quantitative measurement of microorganisms is enhanced.
  • FIG. 1 shows an example of a quantitative measurement procedure by the qPCR method.
  • Nucleic acids are extracted from a specimen sample and purified (step S901).
  • a reaction solution is added to the purified sample (step S902).
  • a calibration sample is prepared by adding a reaction solution to a standard nucleic acid of known concentration (step S903).
  • Real-time PCR measurement of nucleic acids from the specimen sample and standard nucleic acids is performed (step S904).
  • Data analysis is performed to compare the Ct value of the real-time PCR measurement of a standard nucleic acid of known concentration with the Ct value of the nucleic acid from the specimen sample (step S905).
  • the amount of microorganisms is calculated based on the amount of nucleic acid in the specimen sample estimated by data analysis (step S906).
  • microarray detection including a PCR process
  • development costs and time spent on designing, prototyping, and evaluation for hybridizing nucleic acids other than target nucleic acids, or creating probes free of cross-reaction in which primers are hybridized and immobilized. increase.
  • different PCR reaction efficiencies for different target nucleic acids affect the quantitativeness of the calculation of the amount of microorganisms.
  • enzyme reaction inhibitors contained in the sample change the PCR reaction efficiency. Changes in PCR reaction efficiency reduce the quantitativeness of microbial load calculations.
  • the measurement method according to an embodiment of the present disclosure can perform microarray detection so that even when the number of target microorganism species increases, the test cost does not increase compared to qPCR. Also, the measurement method according to an embodiment of the present disclosure reduces primer development cost and time by performing microarray detection without the PCR step. In addition, the measurement method according to an embodiment of the present disclosure reduces the cost and labor of consumables such as reagents for the PCR reaction by performing microarray detection without the PCR step. In addition, the measurement method according to an embodiment of the present disclosure eliminates cross-reaction with the primers involved in probe development by performing microarray detection excluding the PCR process, facilitating development. As a result, development costs can be reduced. . In addition, the measurement method according to an embodiment of the present disclosure can reduce the risk of false positives or the risk of deterioration in quantification due to washing by performing microarray detection without the washing step.
  • the microorganism concentration device 10 carries out concentration purification of target microorganisms by the negative charge membrane method. It is assumed that the specimen sample to be concentrated and purified is a liquid containing microorganisms or a liquid in which microorganisms adhering to a solid are dispersed. Microorganisms in water, including bacteria and viruses, have an isoelectric point in a region where the surface charge is weakly acidic, negatively charged in neutral to alkaline waters, and positively charged in acidic waters. .
  • the negative charge membrane method can capture microorganisms from water using this property. Compared to conventional filtering using filters with pore sizes smaller than those of the target microorganisms, the negative charge membrane method is less susceptible to clogging and is expected to process large volumes of samples and increase the concentration rate. Play.
  • the computing device 70 can quantitatively acquire the brightness value of the spot and quantify the nucleic acid concentration by comparing it with the brightness value of a standard spot having a constant number of labeled molecules. Further, the computing device 70 can calculate the number of hybridized nucleic acids from the light intensity of the spot and the theoretical light intensity of the label by calculating the luminance value of the spot as the absolute value of the light intensity. Calculation of the absolute value of the amount of light must be set as a parameter for each device, and can be made possible by standardizing the sensor or optical system using a standard light source and assigning the amount of light to the sensor luminance value.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

検体試料に含まれる微生物の存在量を測定する測定方法は、検体試料に含まれる微生物を濃縮精製するステップと、濃縮精製した微生物から核酸を抽出するステップと、抽出した核酸に、抽出した核酸のハイブリダイズ反応に必要な塩類及び界面活性剤を含むハイブリダイズ反応液を添加してハイブリダイズ反応に供するステップと、ハイブリダイズした核酸の発光量を測定するステップと、核酸の発光量の測定値に基づいて抽出した核酸の量を推定するステップと、抽出した核酸の量の推定値に基づいて、検体試料に含まれる微生物の存在量を算出するステップとを含む。

Description

測定方法及び測定システム 関連出願へのクロスリファレンス
　本出願は、日本国特許出願２０２１－３０９４７号（２０２１年２月２６日出願）の優先権を主張するものであり、当該出願の開示全体を、ここに参照のために取り込む。
　本開示は、微生物の定量的な測定方法及び測定システムに関する。
　従来、サンプルに対して遺伝子の増幅を行い、増幅後の遺伝子を検出する方法が知られている（例えば、特許文献１参照）。
特開２０１５－４３７０２号公報
　遺伝子の検出結果に基づいて微生物量を測定する場合における利便性の向上が求められる。
　本開示は、微生物量測定における利便性を向上できる測定方法及び測定システムを提供することを目的とする。
　幾つかの実施形態に係る測定方法は、検体試料に含まれる微生物の存在量を測定する測定方法であって、前記検体試料に含まれる微生物を濃縮精製するステップと、濃縮精製した微生物から核酸を抽出するステップと、抽出した核酸に、前記抽出した核酸のハイブリダイズ反応に必要な塩類及び界面活性剤を含むハイブリダイズ反応液を添加して前記ハイブリダイズ反応に供するステップと、ハイブリダイズした核酸の発光量を測定するステップと、前記核酸の発光量の測定値に基づいて前記抽出した核酸の量を推定するステップと、前記抽出した核酸の量の推定値に基づいて、前記検体試料に含まれる微生物の存在量を算出するステップとを含む。このようにすることで、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）工程を実施せずに核酸の量が推定される。ＰＣＲ工程を実施せずに核酸の量を推定することによって、核酸の量の推定値に対するＰＣＲ反応効率の影響が低減される。ＰＣＲ反応効率の影響の低減によって、核酸の量の推定値に基づいて実施される標的微生物の定量的な測定精度が高まる。その結果、微生物測定における利便性が向上する。
　一実施形態において、前記測定方法は、前記ハイブリダイズ反応に供するステップで、マイクロアレイが有する複数のスポットそれぞれにおいて前記抽出した核酸をハイブリダイズ反応に供し、前記ハイブリダイズした核酸の発光量を測定するステップで、前記マイクロアレイが有する各スポットにおける発光量を測定してよい。このようにすることで、同時に多種類の微生物が定量的かつ高感度に測定される。その結果、微生物測定における利便性が向上する。
　一実施形態において、前記測定方法は、前記ハイブリダイズ反応に供するステップで、前記マイクロアレイが有する各スポットの固相面に固定化され、かつ、蛍光分子で修飾されているプローブに前記核酸を捕捉させてよい。このようにすることで、各スポットに接液した検体サンプルに含まれる核酸の量が各スポットの輝度値として測定される。その結果、微生物の定量測定の精度が高められる。
　幾つかの実施形態に係る測定システムは、検体試料に含まれる微生物の存在量を測定する。前記測定システムは、検体試料に含まれる微生物を濃縮精製する微生物濃縮装置と、前記微生物濃縮装置で濃縮精製した微生物から核酸を抽出する核酸抽出装置と、前記核酸抽出装置で抽出した核酸を前記ハイブリダイズ反応に供するハイブリダイズ反応装置と、前記ハイブリダイズ反応装置でプローブにハイブリダイズした核酸の発光量を測定し、前記核酸の発光量の測定値に基づいて前記抽出した核酸の量を推定する核酸検出装置とを備える。前記核酸検出装置は、演算装置に前記抽出した核酸の量の推定値に基づいて、前記検体試料に含まれる微生物の存在量を算出させ、前記演算装置の算出結果を前記微生物の存在量の測定結果として取得する。このようにすることで、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）工程を実施せずに核酸の量が推定される。ＰＣＲ工程を実施せずに核酸の量を推定することによって、核酸の量の推定値に対するＰＣＲ反応効率の影響が低減される。ＰＣＲ反応効率の影響の低減によって、核酸の量の推定値に基づいて実施される標的微生物の定量的な測定精度が高まる。その結果、微生物測定における利便性が向上する。
　一実施形態に係る前記測定システムにおいて、前記微生物濃縮装置が陰電荷膜法によって前記検体試料に含まれる微生物を濃縮精製してよい。このようにすることで、標的微生物より小さい孔径のフィルタによる通常のフィルタリングに対して、目詰まり等の影響が小さく、大容量のサンプルが処理できて濃縮率を高めることが期待される。
　本開示に係る測定方法及び測定システムによれば、微生物量測定における利便性が向上する。
比較例に係るｑＰＣＲ法による定量測定の手順例を示すフローチャートである。 比較例に係るマルチプレックスｑＰＣＲの前工程の手順例を示すフローチャートである。 比較例に係るマイクロアレイ法による定量測定の手順例を示すフローチャートである。 比較例に係るマイクロアレイ法の前工程の手順例を示すフローチャートである。 一実施形態に係る測定方法の手順例を示すフローチャートである。 一実施形態に係る測定システムの構成例を示すブロック図である。
　以下、本開示に係る実施形態が図面を参照して説明される。本開示の一実施形態に係る測定方法は、検体試料に含まれる少なくとも２種類の微生物の存在量を測定する方法である。
（比較例）
　まず、本実施形態に係る測定方法に対する比較例が説明される。検体試料中の微生物量を複数種同時に定量測定する方法の比較例として、以下、マルチプレックスｑＰＣＲ（quantitative Polymerase Chain Reaction）法、及び、マイクロアレイ法が説明される。
＜ｑＰＣＲ法による定量測定＞
　図１に、ｑＰＣＲ法による定量測定の手順例が示される。検体試料から核酸が抽出されて精製される（ステップＳ９０１）。精製された試料に反応液が添加される（ステップＳ９０２）。検体試料と別に、既知の濃度の標準核酸に反応液を添加することによって検量用試料が調製される（ステップＳ９０３）。検体試料からの核酸及び標準核酸のリアルタイムＰＣＲ測定が行われる（ステップＳ９０４）。既知の濃度の標準核酸のリアルタイムＰＣＲ測定のＣｔ値と、検体試料からの核酸のＣｔ値とを比較するデータ解析が行われる（ステップＳ９０５）。データ解析によって推定された検体試料の核酸量に基づいて、微生物量が算出される（ステップＳ９０６）。
　ステップＳ９０３の検量用の濃度既知の標準核酸の調製は、例えば１／１０希釈系列を調製したり、検体試料からの核酸濃度が含まれる範囲で調製したりすることによって実行される。検量用の濃度既知の標準核酸の調製は、ｑＰＣＲ装置の検出下限以上の濃度、かつ、反応阻害により定量性が失われないようにあらかじめ装置仕様に応じた濃度範囲になるように実行される必要がある。
　検体試料からの核酸は、ｑＰＣＲ装置の検出下限以上の濃度、かつ、反応阻害により定量性が失われるようにあらかじめ装置仕様に応じた濃度範囲に調製されるように、希釈系列をサンプルとすることがよい。
　ｑＰＣＲ反応において、核酸増幅の測定のためにインターカレータ（非特異的に２本鎖核酸を染色する蛍光試薬）又は蛍光核酸プローブが用いられる。蛍光核酸プローブは、ＴａｑＭａｎプローブとも称される。
　図２に、ｑＰＣＲ法をベースとして複数核酸を同時検出するためのマルチプレックスｑＰＣＲを実施するために必要となる前工程としてプライマセットを構築する手順例が示される。まず、標的微生物が有している遺伝子又はその他の核酸の中から、標的微生物に特有の核酸が標的核酸として選定される（ステップＳ９１１）。次に、ステップＳ９１１の手順で選定された標的核酸の核酸配列が取得される（ステップＳ９１２）。標的核酸の核酸配列は、公開されている核酸配列データベース等に含まれる核酸配列から取得されてよいし、核酸シーケンス等の手法によって取得されてもよい。
　次に、ステップＳ９１２の手順で取得された標的核酸配列に基づいて、標的核酸を増幅させるために必要なプライマ配列が設計される（ステップＳ９１３）。プライマ配列は、プライマ長がフォワードプライマとリバースプライマとでＴｍ値が同等になるように設計される。Ｔｍ値は、融解温度とも称され、プライマがターゲット配列と５０％の割合で２本鎖を形成する温度を表す。また、設計されたプライマによって標的核酸を効率的に増幅させることができるか確認するために、ＰＣＲ増幅反応が実行される。ＰＣＲ増幅反応は、公知の情報に基づいて反応に必要となる鋳型核酸、塩基類及び伸長酵素、並びに、酵素反応に必要となる塩類を添加した緩衝液中で実行される。また、ＰＣＲ増幅反応は、アニーリング、伸長、及び、熱変性解離の３つのステップで構成される、使用する酵素に適した温度サイクルで制御される。温度サイクルは、伸長と熱変性解離とを同一の温度で実行する２つのステップで構成されてもよい。
　ＰＣＲ増幅反応に続いて、ゲル電気泳動等によってＰＣＲ増幅産物が生成されたか確認するために、確認項目が満たされたかが判定される（ステップＳ９１４）。確認項目として、増幅量、増幅長、非特異産物の増幅の有無、又は、プライマダイマの生成の有無等が挙げられる。確認項目が条件を満たさない場合、プライマの改良又は再設計が実行される。そして、改良又は再設計されたプライマが標的核酸を増幅させることができるか確認する。確認項目が条件を満たすように設計されたプライマが、個別単独プライマとして決定される。
　また、複数の種類の核酸を同時に検出しようとする場合、各種類の核酸について個別単独プライマが構築される必要がある。全ての標的核酸について個別単独プライマを構築した後、各種類の核酸について構築した個別単独プライマを混合したプライマセットにおいてＰＣＲ増幅が実行される。そして、プライマセットによるＰＣＲ増幅でＰＣＲ増幅産物が生成されたか確認するために、確認項目が満たされたが判定される。プライマセットによるＰＣＲ増幅の確認項目は、個別単独プライマによるＰＣＲ増幅の確認項目と同じであってよい。
　プライマセットにおけるＰＣＲ増幅で、例えば、非特異産物が生じること等によって確認項目が条件を満たさない場合（ステップＳ９１４：ＮＯ）、ステップＳ９１３の手順に戻って、個別単独プライマが再設計される。確認項目が条件を満たした場合（ステップＳ９１４：ＹＥＳ）、非特異産物が生じないプライマセットの構築が完了する（ステップＳ９１５）。
　以上述べてきたｑＰＣＲ法は、以下の問題点を有する。標的核酸種ごとに異なる波長で検出されるため、蛍光波長の制限によって同時に検出される種類数が６種類程度に制限される。非特異ＰＣＲ増幅産物が生じないプライマを作製するために実行する設計、試作及び評価に費やされる開発コスト及び時間が増大する。特にマルチプレックスｑＰＣＲにおいて複数種類のプライマの交差反応の確認のために費やされる開発コスト及び時間が増大する。希釈系列で複数の検量用標準サンプルを同時に反応に供することによる反応数の増大が試薬等の消耗品コスト及び手間を増大させる。標的核酸ごとにＰＣＲ反応効率が異なることによって、検量用標準サンプルが標的核酸ごとに必要となる。そのため反応数が多くなる。反応数の増大が試薬等の消耗品コスト及び手間を増大させる。例えば、５種類の菌を検出する場合、５つの検体試料と５点検量のための標準サンプルとを組み合わせた２５種類の反応が必要になる。プライマセットを構築した後で標的微生物を追加するために費やされる開発コスト及び時間が増大する。未知検体のコンタミによる非特異産物の増幅の有無、又は、プライマダイマの生成の有無によって、擬陽性検出又は定量性の低下が生じる。サンプル中に含まれる酵素反応の阻害物質によってＰＣＲ反応効率が変化する。ＰＣＲ反応効率の変化がｑＰＣＲの定量性を低下させる。
＜マイクロアレイ法による定量測定＞
　図３に、マイクロアレイ法による定量測定の手順例が示される。検体試料から核酸が抽出されて精製される（ステップＳ９２１）。精製された試料にＰＣＲ反応液が添加される（ステップＳ９２２）。試料がＰＣＲ増幅反応に供され、ラベル化される（ステップＳ９２３）。ＰＣＲ増幅された試料にハイブリダイズ反応液が添加される（ステップＳ９２４）。マイクロアレイ上のプローブにおいて、検体試料からの核酸がハイブリダイズ反応に供される（ステップＳ９２５）。反応液が洗浄によって除去される（ステップＳ９２６）。ハイブリダイズ反応に供されたプローブの画像を取得するために、マイクロアレイ上のプローブがスキャンされる（ステップＳ９２７）。プローブにハイブリダイズ固定されたラベルの光量を数値化し、あらかじめ取得した既知濃度の標準核酸におけるラベルの光量と比較するデータ解析が実行される（ステップＳ９２８）。データ解析によって推定された核酸量に基づいて、微生物量が算出される（ステップＳ９２９）。
　ステップＳ９２３で試料をＰＣＲ増幅反応に供するために、ｑＰＣＲ法に関する説明でも述べたように、プライマセットの構築工程が必要となる。一般的に、マイクロアレイで使用されるプライマにおいて、ＰＣＲ増幅産物がラベル化されるように蛍光分子等のラベルが標識されている。
　図４に、マイクロアレイ法をベースとして複数核酸を同時検出するために必要となる前工程としてのプローブ構築手順例が示される。まず、標的微生物が有している遺伝子又はその他の核酸から、標的微生物に特異的な標的核酸が選定される（ステップＳ９３１）。次に、選定された標的核酸の核酸配列が入手される（ステップＳ９３２）。次に、核酸配列から標的核酸を検出させるために必要なプローブ配列が設計され試作される（ステップＳ９３３）。試作されたプローブを個別の核酸に対してハイブリダイズ反応に供することによって、試作されたプローブが検出能を有するか判定される（ステップＳ９３４）。試作されたプローブが個別の核酸に対して検出能を有しない場合（ステップＳ９３４：ＮＯ）、ステップＳ９３３の手順に戻って、プローブ配列が再設計される。試作されたプローブが個別の核酸に対して検出能を有する場合（ステップＳ９３４：ＹＥＳ）、試作されたプローブが複数の核酸を含む試料に対して検出能を有するか判定される（ステップＳ９３５）。試作されたプローブが複数の核酸を含むに対して検出能を有しない場合（ステップＳ９３５：ＮＯ）、ステップＳ９３３の手順に戻って、プローブ配列が再設計される。試作されたプローブが複数の核酸を含む試料に対して検出能を有する場合（ステップＳ９３５：ＹＥＳ）、プローブセットの構築が完了する（ステップＳ９３６）。
　ステップＳ９３４及びＳ９３５の判定において確認する項目は、例えば、プローブにハイブリダイズ固定されたラベルの光量を含む。確認する項目は、これに限られず、標的核酸以外の核酸がハイブリダイズ固定されないか、又は、プライマがハイブリダイズ固定される交差反応がないか等の擬陽性要因を排除するための項目を含む。
　ステップＳ９３２の核酸配列の入手において、公的に公開されている核酸配列データベース等から対応する核酸配列が入手されてよい。また、標的核酸配列は、独自に核酸シーケンス等の手法によって入手されてもよい。ステップＳ９３３のプローブ配列の設計において、プローブ長は、プローブセットの各プローブのＴｍ値が同等になるように設計される。ステップＳ９３４及びＳ９３５で実行されるハイブリダイズ反応は、公知の情報に基づいて反応に必要となる塩類又は界面活性剤を添加した緩衝液中で実施される。また、ハイブリダイズ反応は、設計したプローブのＴｍ値に適した温度でインキュベートすることによって実施される。
　他に、蛍光分子が付加された蛍光プローブと、蛍光分子の蛍光を消光する消光分子が付加された消光プローブとが検出プローブとして設けられた核酸配列計測用デバイス（ＤＮＡチップ）を用いてターゲットを計測する方法が考えられる。この方法によって、ターゲットに対する蛍光分子の付加、及びＤＮＡチップの洗浄（捕集されていないターゲット等を除去するための洗浄）を行うことなくターゲットを計測することが可能である。
　以上述べてきたマイクロアレイ法は、以下の問題点を有する。ＰＣＲ工程を含むマイクロアレイ検出において、標的核酸以外の核酸のハイブリダイズ固定、又は、プライマがハイブリダイズ固定される交差反応がないプローブを作製するための設計、試作及び評価に費やされる開発コスト及び時間が増大する。ＰＣＲ工程を含むマイクロアレイ検出において、標的核酸ごとにＰＣＲ反応効率が異なることが微生物量の算出の定量性に影響を及ぼす。ＰＣＲ工程を含むマイクロアレイ検出において、サンプル中に含まれる酵素反応の阻害物質によってＰＣＲ反応効率が変化する。ＰＣＲ反応効率の変化が微生物量の算出の定量性を低下させる。洗浄工程によって、ハイブリダイズした標的核酸の損失又はマイクロアレイ上で隣接するサンプルのコンタミネーションによる擬陽性が生じる。擬陽性の発生は、定量性を低下させる。マイクロアレイの感度はｑＰＣＲに対して低い。そのため、ＰＣＲ工程を除いた場合の検出下限が高い。
　以上述べてきたように、検体試料に含まれる微生物量を測定する方法の比較例として、種々の方法が考えられる。各種の方法は、上述したように問題点を有する。上述してきた問題点に鑑みて、以下、本開示に係る測定方法が説明される。
（本開示に係る実施形態）
　本開示の一実施形態に係る測定方法は、ＰＣＲ工程を除いたマイクロアレイ検出を実行することによって、同時に多種類の微生物を定量的かつ高感度に測定できる。また、本開示の一実施形態に係る測定方法は、検体試料の濃縮精製工程を含むＰＣＲ工程を除いたマイクロアレイ検出を実行することによって、標的微生物を高感度に測定できる。また、本開示の一実施形態に係る測定方法は、ＰＣＲ工程を除いたマイクロアレイ検出を実行することによって、ＰＣＲ反応効率の影響を排除し標的微生物を定量的に測定できる。また、本開示の一実施形態に係る測定方法は、ラベル化を除いたマイクロアレイ検出を実行することによって、ラベル化効率の影響を排除し標的微生物を定量的に測定できる。また、本開示の一実施形態に係る測定方法は、マイクロアレイ検出を実行することによって、標的微生物種が増えた場合においても、ｑＰＣＲに比して検査コストが増大しないように測定できる。また、本開示の一実施形態に係る測定方法は、ＰＣＲ工程を除いたマイクロアレイ検出を実行することによって、プライマの開発コストと時間を減少させる。また、本開示の一実施形態に係る測定方法は、ＰＣＲ工程を除いたマイクロアレイ検出を実行することによって、ＰＣＲ反応の試薬等の消耗品コスト及び手間を減少させる。また、本開示の一実施形態に係る測定方法は、ＰＣＲ工程を除いたマイクロアレイ検出を実行することによって、プローブ開発にかかるプライマとの交差反応をなくし開発を容易にする結果、開発コストを低減できる。また、本開示の一実施形態に係る測定方法は、洗浄工程を除いたマイクロアレイ検出を実行することによって、洗浄による擬陽性リスク又は定量性低下リスクを低減できる。
（測定方法の手順例）
　本開示の一実施形態に係る測定方法は、図５及び図６に例示されるフローチャートの手順として実行される。まず、図５を参照して、マイクロアレイ検出の実施例の工程が説明される。
　検体試料から標的微生物を回収するために、検体試料が濃縮精製される（ステップＳ１）。濃縮精製された標的微生物から核酸が抽出される（ステップＳ２）。核酸を抽出した試料にハイブリダイズ反応液が添加される（ステップＳ３）。ハイブリダイズ反応液を添加した核酸抽出液がハイブリダイズ反応に供される（ステップＳ４）。ステップＳ４の手順において、核酸抽出液は、マイクロアレイ上にスポット状に固定化されたプローブに接液させられる。ハイブリダイズ反応後のマイクロアレイの各プローブの蛍光画像を取得するために、マイクロアレイがマイクロアレイスキャンされる（ステップＳ５）。蛍光画像は、ハイブリダイズした核酸の発光量の測定のために取得される。蛍光画像から得られる各スポットの輝度値と、あらかじめ取得した既知濃度の標準核酸におけるスポットの輝度値とを比較するデータ解析が実行される（ステップＳ６）。輝度値は、核酸の発光量の測定値に対応する。データ解析によって推定された核酸の量に基づいて、微生物量が算出される（ステップＳ７）。データ解析によって推定された核酸の量は、抽出した核酸の量の推定値に対応する。
　図６に例示されるように、本実施形態に係る測定方法を実行する測定システム１は、微生物濃縮装置１０と、核酸抽出装置２０と、ハイブリダイズ反応装置３０と、核酸検出装置４０とを備える。図６において、各構成要素を結合する実線の矢印は、標的微生物又は標的核酸を含む試料の流れを表している。測定システム１は、試料の流れの上流から下流に向けて、微生物濃縮装置１０、核酸抽出装置２０、ハイブリダイズ反応装置３０及び核酸検出装置４０の順に備える。図６において、破線の矢印は、核酸検出装置４０から測定結果が出力されることを表している。
　微生物濃縮装置１０は、標的微生物を陰電荷膜法によって濃縮精製を実施する。濃縮精製する検体サンプルは、微生物が含まれる液体または固体に付着した微生物を液体に分散させたものであるとする。細菌及びウイルス等を含む水中の微生物は、表面電荷が弱酸性である領域において等電点が存在し、中性からアルカリ性の水域において負電荷を帯び、酸性の水域において正電荷を帯びる性質を有する。陰電荷膜法は、この性質を利用して水中から微生物を捕捉できる。陰電荷膜法は、標的微生物より小さい孔径のフィルタによる通常のフィルタリングに対して、目詰まり等の影響が小さく、大容量のサンプルが処理できて濃縮率を高めることが期待されるなどの効果を奏する。
　陰電荷膜法は、下記の文献に記載されている方法に基づいて実行されてもよい。
文献：H.Katayama他 2002. Development of a Virus concentration Method and Its Application to Detection of Enterovirus and Norwalk Virus from Coastal Seawater. Applied and Environmental Microbiology 2002 Vol. 68. p.1033-1039
　核酸抽出装置２０は、一般に実施される市販キットを用いた化学的又は物理的な処理によって抽出精製を実施できる。化学的な核酸抽出処理は、フェノール、微生物の細胞膜を分解する酵素、界面活性剤、核酸を安定化させるための塩類、ヌクレアーゼを不活性化して核酸の分解を防ぐキレート剤、若しくは、ｐＨ緩衝液が含まれるバッファ等による作用、又は、これらの作用に熱処理等を加えることによって実施されてよい。物理的な核酸抽出処理は、ホモジナイザーペッスル、超音波装置、凍結破砕装置、ビーズ振盪、又は、高圧式ホモジナイザ等によって実施されてよい。抽出した核酸は、必要に応じてフェノールクロロホルム抽出、クロロホルム抽出、エタノール沈殿、市販キット化もされているスピンカラム法、又は、磁性ビーズ法等の手法によって精製されてよい。核酸抽出液にハイブリダイズ反応液が添加される。ハイブリダイズ反応液は、核酸のハイブリダイズに必要な塩類及び界面活性剤を含む。例えば終濃度５×ＳＳＣ等の緩衝液が用いられてよい。
　ハイブリダイズ反応装置３０は、ハイブリダイズ反応液が添加された核酸抽出液を、プローブに接液させた状態でハイブリダイズ反応に供する。ハイブリダイズ反応装置３０において、マイクロアレイ上に設定された複数種類のプローブのスポット集合体である１つ又は複数のブロックと１対１で設置されたサンプルを保持するチャンバ等に核酸抽出液が入れられ、核酸抽出液がマイクロアレイ上のブロックに接液させられる。
　マイクロアレイは、複数のスポットを有する。蛍光分子で修飾されているプローブが各スポットの固相面に固定化されている。核酸抽出液は、マイクロアレイ上にスポット状に固定化されたプローブに接液させられる。核酸抽出液に含まれる核酸は、接液したプローブとハイブリダイズすることによって捕捉される。つまり、ハイブリダイズ反応装置３０は、ハイブリダイズ反応によって核酸をプローブに捕捉させる。
　ハイブリダイズ反応は、プローブのＴｍ値に対して適宜温度設定された状態でインキュベートすることで促進可能である。また、ハイブリダイズ反応は、インキュベート中のサンプル中の核酸の拡散を補助するために振盪又は回転を行うことでも促進される。ハイブリダイズ反応は、例えば６０℃で３０分間にわたって遮光状態でインキュベートすることで促進され得る。
　核酸検出装置４０は、マイクロアレイスキャナ５０と、記録装置６０と、演算装置７０とを備える。
　マイクロアレイスキャナ５０は、マイクロアレイのプローブが固定化されたスポットの蛍光画像を取得する。マイクロアレイスキャナ５０は、蛍光画像を検出信号として記録装置６０又は演算装置７０に出力する。マイクロアレイが透明の基材である場合、マイクロアレイスキャナ５０は、ハイブリダイズ反応後にマイクロアレイのスポット面と反対の面からスポットをスキャンする。マイクロアレイが不透明の基材である場合、マイクロアレイスキャナ５０は、ハイブリダイズ反応後にチャンバの底面からスポットをスキャンする。この場合、上述したチャンバのマイクロアレイと平行の面が透明である必要がある。
　演算装置７０は、マイクロアレイスキャナ５０から出力された蛍光画像信号に基いてスポット輝度値を算出する。スポット輝度値は、スポット部の画像認識による画像上のエリア指定及びスポット部の各ピクセルの輝度値の平均値から算出され得る。また、演算装置７０は、あらかじめ任意のハイブリダイズ反応時間後に取得した既知濃度の標準核酸におけるスポットの輝度値と核酸濃度の検量線から検体サンプルの核酸濃度を推定する。演算装置７０は、蛍光画像の輝度値を算出可能な任意の演算素子又は演算モジュールを含んでよい。スポット輝度値は、マイクロアレイスキャナ５０の装置仕様に基づいて、光量等の任意の値に変換されてもよい。スポット輝度値は、ハイブリダイズ反応装置３０によって実行される標的核酸とプローブとのハイブリダイズ反応における複数の時点の輝度値として測定されてもよい。ハイブリダイズ反応の進行中の輝度値は、反応の進行に応じて増加し得る。輝度値の増加は、標的核酸とプローブとのハイブリダイズ反応が平衡状態に達した時点で止まる。輝度値の増加が止まった状態における定量は不可能になる。演算装置７０は、複数の時点で輝度値を取得することによって、標的核酸が高濃度である場合にハイブリダイズ反応が平衡状態に達する前の輝度値から核酸濃度を推定できる。
　また、演算装置７０は、複数の時点の輝度値に基づいて検量線によって標的核酸を定量化してもよい。演算装置７０は、輝度値を算出せずに、画像の生データ（Raw Data）、又は、画像にフィルタ処理若しくは演算処理を行って得られる信号に基づいて、標的核酸を定量化してもよい。この場合、信号に基づく標的核酸の定量は、多変量解析又は機械学習による定量モデルからの算出結果の取得として実行されてもよい。また、標的核酸の定量は、本手法による定量結果と同時に参照値を取得して定量モデルにフィードバックされてもよい。
　演算装置７０は、標的核酸の定量結果から既報の１細胞当たりの核酸数の文献値等を参考にして微生物量を算出してよい。演算装置７０は、定量モデル構築においてあらかじめ既知濃度の標準微生物に対して本開示の測定方法を実施した際のスポットの輝度値と微生物濃度の検量線を取得し、検量線に基づいて検体試料の微生物濃度を算出してもよい。微生物量の算出は、多変量解析又は機械学習による定量モデルからの算出結果の取得として実行されてもよい。微生物量の算出は、本手法による定量結果と同時に参照値を取得して定量モデルにフィードバックされてもよい。
　微生物量は、演算装置７０に限られず、演算装置７０の外付け装置で算出されてもよい。つまり、核酸検出装置４０は、内部に備える演算装置７０又は外付けの装置に微生物量を算出させ、その算出結果を微生物の存在量の測定結果として取得してもよい。
　記録装置６０は、マイクロアレイスキャナ５０からの画像信号を適宜保存し、演算装置７０に出力する。また、記録装置６０は、演算装置７０からの標的核酸の定量結果、又は、微生物の定量結果を適宜保存できる。
　測定システム１は、表示装置を更に備えてもよい。表示装置は、標的核酸又は微生物の定量結果を演算装置７０又は記録装置６０から取得して表示してもよい。
　使用するプローブは、特許文献１（特開２０１５－４３７０２号公報）に記載されているプローブを使用することができる。具体的には、プローブは、蛍光分子が付加された蛍光プローブと、消光分子が付加された消光プローブとを有し、蛍光分子の蛍光が消光分子によって消光されるように蛍光プローブと消光プローブとが結合されたものであってよい。このように構成されたプローブは、計測対象であるターゲットが添加された場合に、ハイブリダイゼーションによって蛍光プローブと消光プローブとの結合が解消されて蛍光が発せられるようにされている。蛍光プローブは、蛍光色素等の標識を任意に設定可能である。蛍光プローブで使用される蛍光色素の吸収波長及び蛍光波長特性に基づいて、マイクロアレイスキャナ５０の励起波長及び蛍光検出波長が選択される。
　マイクロアレイスキャナ５０は、上述してきた実施形態に限定されず、マイクロアレイ上のスポットからの蛍光を検出するために、蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡、エバネッセント蛍光検出装置、薄膜斜光照明顕微鏡、シート照明顕微鏡、構造化照明顕微鏡、又は、多光子励起顕微鏡等を含んで構成されてよい。
　以上述べてきたように、本実施形態に係る測定方法によれば、マイクロアレイ検出によって、同時に多種類の微生物が定量的かつ高感度に測定される。また、検体試料の濃縮精製工程を含むマイクロアレイ検出によって、標的微生物が高感度に測定される。また、ＰＣＲ工程を除いたマイクロアレイ検出によって、ＰＣＲ反応効率の影響が低減される。ＰＣＲ反応効率の影響の低減によって、標的微生物の定量的な測定精度が高まる。また、マイクロアレイ検出によって、標的微生物種が増えた場合においてもｑＰＣＲに比して検査コストが増大しにくい。また、ＰＣＲ工程を除いたマイクロアレイ検出によって、プライマの開発に費やされるコスト及び時間が低減される。また、ＰＣＲ工程を除いたマイクロアレイ検出によって、ＰＣＲ反応の試薬等の消耗品コスト及びＰＣＲ反応の手間が低減される。また、ＰＣＲ工程を除いたマイクロアレイ検出によって、プローブ開発にかかるプライマとの交差反応がなくなる。交差反応がないことによって、開発が容易になるとともに、開発コストが低減される。また、ラベル化工程を除いたマイクロアレイ検出によって、ラベリング効率の影響が低減される。ラベリング効率の影響の低減によって、標的微生物を定量的な測定精度が高まる。また、洗浄工程を除いたマイクロアレイ検出によって、洗浄による擬陽性リスク又は定量性低下リスクが低減する。
　比較例として、マイクロアレイ検出の微生物量は、最終的にハイブリダイズした核酸量から、Ａ：微生物の回収効率、Ｂ：核酸抽出精製効率、Ｃ：ＰＣＲ反応効率、Ｄ：ハイブリダイズ効率、Ｅ：洗浄によるロス、及び、Ｆ：１細胞あたりの核酸量参照値の経過に基づいて算出される。本実施形態に係る測定方法においてＰＣＲ反応及び洗浄が実施されないことによって、サンプルに起因する効率変化が大きいＣ：ＰＣＲ反応効率、及び、手技による差が生じやすいＥ：洗浄によるロスの影響が低減される。このようにすることで、定量的な測定精度が高まる。
　以上の結果として、本実施形態に係る測定方法によれば、微生物測定における利便性が向上する。
（応用例）
　本実施形態に係る測定方法は、以下のように応用され得る。例えば、本実施形態に係る測定方法は、蛍光量計測におけるドライ画像測定、バイオチップの蛍光量液中観察、又は、連続反応におけるリアルタイム観察等で使用されてよい。本実施形態に係る測定方法は、具体的な実施例として、核酸分析による菌種判別、がん遺伝子、動植物判別、又は、腸内細菌の検査等に用いられてよい。
　また、本実施形態に係る測定方法は、水道、食品、又は飲料水等の他分野へ水平展開されてよい。この場合、検体サンプルのサンプリング量は、各アプリケーションの微生物量に応じて設定されてよい。
　演算装置７０は、あらかじめ任意のハイブリダイズ反応時間後に取得した既知濃度の標準核酸におけるスポットの輝度値と核酸濃度の検量線とに基づいて、検体サンプルの核酸濃度を推定できる。核酸濃度の推定方法は、これに限定されない。例えば、標的核酸とその標識の数が１：１など定量的な比率である場合、スポットの輝度値は、ハイブリダイズした核酸の数と相関する。また、特許文献１に記載のプローブを使用した場合にも同様にスポットの輝度値とハイブリダイズした核酸の数とが１：１で相関する。演算装置７０は、スポットの輝度値を定量的に取得し、標識分子数が一定の標準スポットの輝度値と比較することによって核酸濃度を定量化できる。また、演算装置７０は、スポットの輝度値を光量の絶対値として算出することによって、スポットの光量と標識の理論光量からハイブリダイズした核酸の数を算出できる。光量の絶対値の算出は、各装置パラメータとして設定されている必要があり、標準光源などを使用してセンサ又は光学系を規格化してセンサ輝度値に対する光量を値付けすることで可能となる。
　本開示は、上述した実施形態で特定された構成に限定されず、特許請求の範囲に記載した開示の要旨を逸脱しない範囲内で種々の変形が可能である。例えば、各ステップに含まれる機能等は、論理的に矛盾しないように再構成可能である。また、複数のステップを１つに組み合わせたり、１つのステップを分割したりすることが可能である。
　１　測定システム（１０：微生物濃縮装置、２０：核酸抽出装置、３０：ハイブリダイズ反応装置、４０：核酸検出装置、５０：マイクロアレイスキャナ、６０：記憶装置、７０：演算装置）

Claims (5)

  1. 　検体試料に含まれる微生物の存在量を測定する測定方法であって、
    　前記検体試料に含まれる微生物を濃縮精製するステップと、
    　濃縮精製した微生物から核酸を抽出するステップと、
    　抽出した核酸に、前記抽出した核酸のハイブリダイズ反応に必要な塩類及び界面活性剤を含むハイブリダイズ反応液を添加して前記ハイブリダイズ反応に供するステップと、
    　ハイブリダイズした核酸の発光量を測定するステップと、
    　前記核酸の発光量の測定値に基づいて前記抽出した核酸の量を推定するステップと、
    　前記抽出した核酸の量の推定値に基づいて、前記検体試料に含まれる微生物の存在量を算出するステップと
    を含む測定方法。
  2. 　前記ハイブリダイズ反応に供するステップで、マイクロアレイが有する複数のスポットそれぞれにおいて前記抽出した核酸をハイブリダイズ反応に供し、
    　前記ハイブリダイズした核酸の発光量を測定するステップで、前記マイクロアレイが有する各スポットにおける発光量を測定する、請求項１に記載の測定方法。
  3. 　前記ハイブリダイズ反応に供するステップで、前記マイクロアレイが有する各スポットの固相面に固定化され、かつ、蛍光分子で修飾されているプローブに前記核酸を捕捉させる、請求項２に記載の測定方法。
  4. 　検体試料に含まれる微生物の存在量を測定する測定システムであって、
    　検体試料に含まれる微生物を濃縮精製する微生物濃縮装置と、
    　前記微生物濃縮装置で濃縮精製した微生物から核酸を抽出する核酸抽出装置と、
    　前記核酸抽出装置で抽出した核酸に、前記抽出した核酸のハイブリダイズ反応に必要な塩類及び界面活性剤を含むハイブリダイズ反応液を添加して前記ハイブリダイズ反応に供するハイブリダイズ反応装置と、
    　前記ハイブリダイズ反応装置でプローブにハイブリダイズした核酸の発光量を測定し、前記核酸の発光量の測定値に基づいて前記抽出した核酸の量を推定する核酸検出装置と
    を備え、
    　前記核酸検出装置は、演算装置に前記抽出した核酸の量の推定値に基づいて、前記検体試料に含まれる微生物の存在量を算出させ、前記演算装置の算出結果を前記微生物の存在量の測定結果として取得する、測定システム。
  5. 　前記微生物濃縮装置が陰電荷膜法によって前記検体試料に含まれる微生物を濃縮精製する、請求項４に記載の測定システム。
PCT/JP2022/000141 2021-02-26 2022-01-05 測定方法及び測定システム Ceased WO2022181062A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP22759105.4A EP4299713A4 (en) 2021-02-26 2022-01-05 MEASURING METHOD AND MEASURING SYSTEM
CN202280014962.5A CN116848261A (zh) 2021-02-26 2022-01-05 测定方法和测定系统
US18/278,868 US20240150815A1 (en) 2021-02-26 2022-01-05 Measurement method and measurement system

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2021-030947 2021-02-26
JP2021030947A JP7414029B2 (ja) 2021-02-26 2021-02-26 測定方法及び測定システム

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2022181062A1 true WO2022181062A1 (ja) 2022-09-01

Family

ID=83048852

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2022/000141 Ceased WO2022181062A1 (ja) 2021-02-26 2022-01-05 測定方法及び測定システム

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20240150815A1 (ja)
EP (1) EP4299713A4 (ja)
JP (1) JP7414029B2 (ja)
CN (1) CN116848261A (ja)
WO (1) WO2022181062A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI881473B (zh) * 2023-09-22 2025-04-21 台達電子工業股份有限公司 核酸檢測裝置

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7168118B1 (ja) 2022-06-23 2022-11-09 横河電機株式会社 検量装置、検量方法および検量プログラム

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH08131199A (ja) * 1994-11-04 1996-05-28 Nippon Millipore Kk 単一微生物細胞の迅速検出法
JP2003038199A (ja) * 2000-11-09 2003-02-12 National Institute Of Advanced Industrial & Technology 汚染環境および環境試料の分子遺伝学的解析・評価法
JP2005518553A (ja) * 2001-09-06 2005-06-23 ジェノミック プロファイリング システムズ インコーポレイティッド 細胞およびウイルスの迅速かつ高感度な検出方法
JP2012531211A (ja) * 2009-06-26 2012-12-10 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 系統発生分析のための方法およびシステム
JP2015043702A (ja) 2013-08-27 2015-03-12 横河電機株式会社 核酸配列計測方法、核酸配列計測用デバイス、核酸配列計測用デバイスの製造方法および核酸配列計測装置
JP2015181356A (ja) * 2014-03-20 2015-10-22 Dic株式会社 精製ウイルス液の製造方法及びウイルス検出方法
JP2021030947A (ja) 2019-08-27 2021-03-01 ダイムラー・アクチェンゲゼルシャフトＤａｉｍｌｅｒ ＡＧ 電動トラック

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9626932D0 (en) 1996-12-24 1997-02-12 Lumitech Limited Assay methods and kits therefor
WO2000043552A2 (en) * 1999-01-25 2000-07-27 Ut-Battelle, Llc Multifunctional and multispectral biosensor devices and methods of use
US20020150887A1 (en) * 2000-11-09 2002-10-17 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology Methods and nucleic acid probes for molecular genetic analysis of polluted environments and environmental samples
GB0030727D0 (en) 2000-12-15 2001-01-31 Lumitech Uk Ltd Methods and kits for detecting kinase activity
JP3727026B2 (ja) 2003-04-10 2005-12-14 博行 野地 一分子酵素活性検出に用いられるマイクロチャンバと１０００ｆＬ以下の液滴を調製する方法
KR20050103085A (ko) * 2004-04-24 2005-10-27 한국생명공학연구원 유산균을 검출하기 위한 게놈 마이크로어레이 및 이를이용한 유산균의 검출 방법
WO2009069843A1 (en) * 2007-11-30 2009-06-04 Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology Methods for fabrication of metagenomes microarrays and quantitative detection of genes or microorganisms using metagenomes microarrays

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH08131199A (ja) * 1994-11-04 1996-05-28 Nippon Millipore Kk 単一微生物細胞の迅速検出法
JP2003038199A (ja) * 2000-11-09 2003-02-12 National Institute Of Advanced Industrial & Technology 汚染環境および環境試料の分子遺伝学的解析・評価法
JP2005518553A (ja) * 2001-09-06 2005-06-23 ジェノミック プロファイリング システムズ インコーポレイティッド 細胞およびウイルスの迅速かつ高感度な検出方法
JP2012531211A (ja) * 2009-06-26 2012-12-10 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 系統発生分析のための方法およびシステム
JP2015043702A (ja) 2013-08-27 2015-03-12 横河電機株式会社 核酸配列計測方法、核酸配列計測用デバイス、核酸配列計測用デバイスの製造方法および核酸配列計測装置
JP2015181356A (ja) * 2014-03-20 2015-10-22 Dic株式会社 精製ウイルス液の製造方法及びウイルス検出方法
JP2021030947A (ja) 2019-08-27 2021-03-01 ダイムラー・アクチェンゲゼルシャフトＤａｉｍｌｅｒ ＡＧ 電動トラック

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
H. KATAYAMA ET AL.: "Development of a Virus Concentration Method and Its Application to Detection of Enterovirus and Norwalk Virus from Coastal Seawater", APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, vol. 68, 2002, pages 1033 - 1039, XP055953924, DOI: 10.1128/AEM.68.3.1033-1039.2002
See also references of EP4299713A4

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI881473B (zh) * 2023-09-22 2025-04-21 台達電子工業股份有限公司 核酸檢測裝置

Also Published As

Publication number Publication date
US20240150815A1 (en) 2024-05-09
EP4299713A4 (en) 2025-01-22
JP7414029B2 (ja) 2024-01-16
CN116848261A (zh) 2023-10-03
EP4299713A1 (en) 2024-01-03
JP2022131809A (ja) 2022-09-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Aw et al. Detection of pathogens in water: from phylochips to qPCR to pyrosequencing
Lee et al. Rapid and in-situ detection of fecal indicator bacteria in water using simple DNA extraction and portable loop-mediated isothermal amplification (LAMP) PCR methods
Ushio et al. Quantitative monitoring of multispecies fish environmental DNA using high-throughput sequencing
Medlin et al. Molecular techniques for the detection of organisms in aquatic environments, with emphasis on harmful algal bloom species
Zhang et al. Ultrasensitive detection and rapid identification of multiple foodborne pathogens with the naked eyes
WO2022181062A1 (ja) 測定方法及び測定システム
Hu et al. Construction of a LAMP-CRISPR assay for the detection of Vibrio parahaemolyticus
US20230326553A1 (en) Identifying a target nucleic acid
CN105755134B (zh) 一种内切酶介导的实时多交叉置换核酸扩增技术及应用
Yang et al. Hybridization chain reaction-assisted enzyme cascade genosensor for the detection of Listeria monocytogenes
Alshehri Identification of algae species using advanced molecular techniques
Naranitus et al. Smartphone‐compatible, CRISPR‐based platforms for sensitive detection of acute hepatopancreatic necrosis disease in shrimp
Chen et al. Probe-based dual-chip digital loop-mediated isothermal amplification for the simultaneous detection of Staphylococcus aureus and Salmonella enteritidis in livestock and aquatic products
Li et al. A hairpin reporters-based one-pot LAMP-CRISPR/Cas12a assay for the highly sensitive and visual detection of Vibrio parahaemolyticus
CN103451310B (zh) 一种可并行检测多种弧菌的基因芯片及其检测方法
CN113853657A (zh) 用于检测对生物测定的抑制的系统和方法
Fu et al. Advances in multiplex molecular detection technologies for harmful algae
Sun et al. Point-of-care detection of mycobacterium in bovine feces using a portable real-time loop-mediated isothermal amplification system
US20200385793A1 (en) Method for the specific detection of microorganisms
WO2022115187A1 (en) Membrane-based, in-gel loop-mediated isothermal amplification (lamp) system and method for detecting microbes
Adeeyo et al. Detection of Microbial Contaminants in Water: Conventional Methods, Pragmatic Alternatives, and Nanosensing Techniques
JP6523472B2 (ja) 標的細胞の識別方法、及び標的細胞識別装置
RU2716115C1 (ru) Способ идентификации и количественной оценки патогенных и условно-патогенных бактерий в пищевых субстратах с использованием высокопроизводительного секвенирования
Trinh et al. Portable and point-of-care molecular detection of pathogenic Vibrio parahaemolyticus in shrimp
Bajinka et al. The validity of singleplex and multiplex real time PCR detection and quantification of waterborne pathogens from domestic to industrial water

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 22759105

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 202280014962.5

Country of ref document: CN

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 18278868

Country of ref document: US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2022759105

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2022759105

Country of ref document: EP

Effective date: 20230926