WO2022181515A1 - Ｐｄ－１シグナル阻害剤の併用療法 - Google Patents

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    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Definitions

  • Non-Patent Document 1- 4 The results of recent clinical trials have revealed that PD-1 signal inhibition therapy is more effective than conventional therapies in many cancer types (1-4) (Non-Patent Document 1- 4).
  • the response rate of anti-PD-1 antibody treatment was 20-30%, which was dramatically improved compared to conventional anticancer agents.
  • the purpose of the present invention is to provide a new combination therapy with PD-1 signal inhibition therapy.
  • T cell activation P. S. Chowdhury, K. Chamoto, T. Honjo, Combination therapy strategies for improving PD-1 blockade efficiency: a new era in cancer immunotherapy. J Intern Med 283, 110-120 (2016).; K. Chamoto et al., Mitochondrial activation chemicals synergize with surface receptor PD-1 blockade for T cell-dependent antitumor activity. A 114, E761-E770 (2017).).
  • T cell activation is facilitated by the T cell receptor (TCR) signaling cascade. Phosphorylation and dephosphorylation of TCR signaling molecules affect signal complex formation and TCR signal transduction.
  • CD45 is a transmembrane phosphatase that plays a major role in regulating TCR signaling by regulating the level of tyrosine phosphorylation of lymphocyte protein kinase (Lck) and its downstream factors (J. Rossy, D J. Williamson, K. Gauss, How does the kinase Lck phosphorylate the T cell receptor? Spatial organization as a regulatory mechanism. Front Immunol 3, 167 (2012).) (R. J. Brownlie, R. Zamoyska, T cell receptor signaling networks: branched, diversified and bounded. Nat Rev Immunol 13, 257-269 (2013).).
  • Lck lymphocyte protein kinase
  • CD45 inhibitors support anti-tumor immunity when used in combination with PD-1 signal inhibitors, maintain synergistic effects of suppressing cancer growth, and can be used as monotherapy for PD-1 signal inhibition. It is thought to be effective even against cancers that exhibit unresponsiveness. A similar effect was seen with cell transplantation (xenogeneic cells, allogeneic cells). Enhanced TCR signaling was also confirmed by cell transplantation.
  • the gist of the present invention is as follows.
  • a pharmaceutical composition comprising a substance capable of enhancing T-cell receptor (TCR) signaling and administered either before, after or simultaneously with administration of a PD-1 signaling inhibitor.
  • TCR T-cell receptor
  • the CD45 inhibitor is 2-(4-Acetylanilino)-3-chloronaphthoquinone, N-(9,10-Dioxo-9,10-dihydrophenanthren-2-yl)-2,2-dimethylpropionamide and analogues thereof
  • the pharmaceutical composition according to (2) which is at least one compound selected from the group consisting of: (4) The pharmaceutical composition according to (2), wherein the cells are xenocells, allocells or a combination thereof.
  • a PD-1 signal inhibitory activity enhancer comprising a CD45 inhibitor and/or cells.
  • a TCR signal enhancer comprising a CD45 inhibitor and/or cells.
  • a method of preventing and/or treating cancer, an infectious disease, or a combination thereof comprising: (11) administration of an effective amount of a substance capable of enhancing T cell receptor (TCR) signaling to the subject either before, after, or concurrently with the administration of the PD-1 signaling inhibitor; A method of enhancing PD-1 signaling inhibitory activity, comprising: (12) A method of enhancing TCR signaling, comprising administering an effective amount of a CD45 inhibitor and/or cells to a subject. (13) A substance capable of enhancing T-cell receptor (TCR) signaling for use in preventing and/or treating cancer, infectious disease, or a combination thereof, which is a PD-1 signal inhibitor The substance administered either before, after, or concurrently with the administration of
  • MC38 cells were inoculated into the skin of young and aged PD-1 KO mice.
  • A MC38 tumor size in young (3-4 months old) and aged (15 months old) PD-1 KO mice.
  • B Kaplan-Meier plot of survival of MC38 tumor-bearing PD-1 KO mice.
  • C and D Analysis of CD8-positive T cell subsets in young (C, 2-3 months old) or aged (D, 15-21 months old) PD-1 KO mice with or without inoculation of MC38 cells. . Peripheral and regional lymph node cells stained on Day 9.
  • CD44 and CD62L expression in CD3+CD8+ cells and percentages of CD8+ cell subsets CD44 low /CD62L high (naive; P1), CD44 high /CD62L high (central memory; P2), CD44 high /CD62L low (effects/memory; P3), CD44 low /CD62L low (P4).
  • MC38-OVA cells were injected into young OT-1 mice via the tail vein and the respective subsets were isolated from splenocytes. Five days after intradermal implantation of MC38-OVA cells, P3 or P4 subset cells were adoptively transferred into CD8 KO mice.
  • A Tumor volume in MC38-OVA tumor-bearing CD8 KO mice with or without transfer of P3 or P4 cells.
  • B FACS analysis of transplanted CD8-positive T cells in day 11 peripheral blood.
  • C Scheme of CD8-positive T-cell subset isolation from splenocytes of young PD-1 KO mice.
  • a to E Microarray analysis of P1, P2, P3, and P4 cells isolated from young PD-1 KO mice (1 to 3 months old; mix of 9 mice).
  • A Hierarchical clustering heatmap of all genes.
  • B Scatter plot showing the normalized log intensity of each probe. Dotted lines indicate log 2-fold differences. Genes that have been shown to be involved in the activation and differentiation of CD8-positive cells are listed.
  • C Top 10 gene ontology (GO) involving genes upregulated in P4 cells. GO terms involved in 1C metabolism are shown in red.
  • D Schematic representation of the 1C metabolic pathway. THF, tetrahydrofolate.
  • E Heatmap showing the expression of 1C metabolic-related genes in CD8-positive T-cell subsets.
  • OCR Oxygen consumption rate
  • FIG. 1 Representative diagrams showing the expression of CD44 and CD62L on CD8-positive T cells and the percentage of each CD8-positive T-cell subset in the mice shown 5 days after MC38-OVA transplantation.
  • C Percentage of pZAP70-positive CD8-positive T cells in peripheral lymph nodes from young or aged OT-1 mice with or without MC38-OVA transplantation.
  • D Representative plots of CD45RB expression levels and fluorescence intensity in total CD8+ T cells or respective subsets from young (2-3 months old) or aged (14-17 months old) OT-1 mice. (MFI).
  • A Schematic diagram of the experimental schedule.
  • mice Ten days after the transplantation (day 0), the mice were implanted with MC38 (E to G) or MC38-OVA (H and I) cells in the skin and used for the experiments described below.
  • G Percentage of pZAP70-positive cells in CD8-positive T cells from day 6 regional lymph nodes.
  • a and B MC38 cells were inoculated into the skin of young (2 months old) and aged (14 months old) C57BL/6 wild-type mice. The mice then received anti-PD-L1 antibody on days 5, 11, and 17.
  • A MC38 tumor size in young and aged wild-type mice.
  • B Kaplan-Meier plot of survival of MC38 tumor-bearing wild-type mice. P values were calculated by log-rank test.
  • C and D Analysis of CD8-positive T cell subsets in young (C, 2 months old) or aged (D, 15 months old) wild-type mice with or without inoculation of MC38 cells.
  • mice (B and C) MC38 tumor size in young (B) and aged (C) wild-type mice.
  • (D and E) MC38 tumor-bearing young (D) and aged (E) wild-type mouse survival. Data represent the mean ⁇ s.e.m. of mice (n 5-6). *p ⁇ 0.05; **p ⁇ 0.01; n.s., no significant difference (evaluated by ANOVA followed by Tukey's test or log-rank test). Restoration of age-related mitochondrial damage by xenotransplantation.
  • MC38-OVA cells were implanted into the skin of young (3-4 months old) and aged (17-18 months old) PD-1 KO mice that had been transplanted with PBS (Ctrl) or Daudi cells 10 days earlier. .
  • OCR trace (A), basal respiration (B) and reserve respiratory capacity were calculated from OCR values (C).
  • MMC-treated splenocytes from C57BL/6 (Ctrl) or Balb/c (Allo) mice were injected into the tail vein of young (1 month old) and aged (14 to 18 months old) C57BL/6 wild-type mice. ported by Subsequent experimental conditions are the same as in FIG. 9A.
  • C and D MC38 tumor-bearing young (C) and aged (D) survival of C57BL/6 wild-type mice.
  • Experimental method and flow Enhanced PD-1 signaling inhibitory effect by CD45 inhibition. Pre-administration: PD-1 knockout (KO) mice were administered vehicle (control) or 211 and 3 days later were transplanted with MC38 cells (1 ⁇ 10 6 ).
  • 211 was administered every 2 days from Day 5, 5 days after MC38 cell transplantation to PD-1 KO mice, for a total of 3 doses.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition comprising a substance capable of enhancing T cell receptor (TCR) signaling and administered either before, after or simultaneously with administration of a PD-1 signaling inhibitor. do.
  • TCR T cell receptor
  • T cell receptor is an antigen receptor molecule expressed on the cell membrane of T cells.
  • TCR T cell receptor
  • intracellular signals are transduced through the phosphorylation of downstream factors such as Lck and ZAP-70, resulting in activation of T cells.
  • the enhancement of TCR signals can be confirmed by evaluating the phosphorylation of ZAP-70 in CD8-positive T cells under antigen stimulation. A higher level of ZAP-70 phosphorylation indicates an enhanced TCR signal. Phosphorylation of ZAP-70 can be detected by flow cytometric analysis using an anti-p-ZAP-70 antibody.
  • TCR signal By enhancing the TCR signal, it is possible to enhance the anti-tumor immune effect of CD8-positive T cells. Therefore, by enhancing the TCR signal, it is possible to enhance the antitumor effect of PD-1 inhibition therapy, and to treat aging animals and humans that are resistant to PD-1 signal inhibition, as well as resistant cancers. can have an effect.
  • CD45 inhibitors and/or cells can be exemplified as substances capable of enhancing TCR signals. These substances may also have the effect of inducing P4 cells.
  • P4 cells are a CD44 low CD62L low CD8 positive T cell subset.
  • the surface markers CD44 and CD62L L-selectin are used to distinguish between three major CD8+ T cells: naive (also called P1; CD44 low CD62L high ) and central memory (P2; CD44 high CD62L high ). ), effector/memory (P3; CD44 high CD62L low ).
  • the remaining CD44 low CD62L low (P4) CD8 positive T cell subset is a very minor population.
  • CD45 inhibitors examples include 2-(4-Acetylanilino)-3-chloronaphthoquinone, N-(9,10-Dioxo-9,10-dihydrophenanthren-2-yl)-2,2-dimethylpropionamide and their analogues. can do.
  • analog is a concept including salts of compounds, derivatives of compounds, prodrugs for active metabolites, active metabolites for prodrugs, solvates thereof, and the like.
  • Compound salts include salts formed with acids such as hydrochloric acid, mesylic acid (methanesulfonic acid), fumaric acid, and phosphoric acid when the compound has an amino group (including substituted amino groups) or an amide group. can do.
  • a derivative of a compound is a compound that has undergone modifications such as introduction or substitution of a functional group, oxidation, reduction, or replacement of an atom, to the extent that the structure or properties of the parent substance are not significantly changed.
  • Derivatives of -chloronaphthoquinone include those in which the chloro (-Cl) group is replaced with other halogen groups (e.g., fluoro (-F) group, bromo (-Br) group, etc.), and those in which the acetyl (CH 3 CO-) group is substituted.
  • Derivatives of ,10-dihydrophenanthren-2-yl)-2,2-dimethylpropionamide include those in which the dimethylpropionyl group is substituted with other alkyl groups (e.g., methyl, ethyl, propyl, benzyl, etc.). can be exemplified.
  • prodrugs include compounds in which the amino group of the active compound is acylated, alkylated, or phosphorylated (for example, the amino group of the active compound is eicosanoylated, alanylated, pentylaminocarbonylated, (5-methyl-2 -oxo-1,3-dioxolen-4-yl)methoxycarbonylated, tetrahydrofuranylated, pyrrolidylmethylated, pivaloyloxymethylated, t-butylated compounds, etc.), where the amide group of the active compound is Alkylated (for example, methylated, ethylated, provylated, etc.) and the like can be exemplified.
  • the amino group of the active compound is acylated, alkylated, or phosphorylated
  • the amino group of the active compound is eicosanoylated, alanylated, pentylaminocarbonylated, (5
  • solvates include solvates with solvents such as water, methanol, ethanol, and acetonitrile.
  • the solvent may be a single solvent or a mixture of multiple solvents.
  • Cells capable of enhancing TCR signals may be xenocells (heterologous cells) or allocells (allogeneic cells) for humans or animals to which the pharmaceutical composition is administered. or a combination thereof.
  • xenogeneic Daudi cells and allogeneic splenocytes were transplanted into mice.
  • xenocells are heterogeneous cells, and allocells are homogenous cells with different HLA (human leukocyte antigen) or MHC (major histocompatibility complex).
  • Various cells xenocells, allocells
  • tissues to be administered to living bodies for the prevention or treatment of diseases are known, and these cells may be used in the present invention.
  • Allogeneic e.g., breast cancer cell lines, chronic myelogenous leukemia cell lines, lung cancer cells, non-small cell lung cancer cell lines, melanoma cell lines, monocytes, pancreatic cancer cell lines, prostate cancer cell lines, renal cancer cell lines, etc.
  • Cells are used to treat various cancers (Human Vaccines & Immunotherapeutics 10:1, 52-63; January 2014). These cells may be irradiated to prevent proliferation and may be genetically modified to secrete immune stimulators such as GM-CSF.
  • Heterologous cells such as murine melanoma B16 and Lewis lung carcinoma (LLC) cells have also been used in clinical trials to administer to melanoma patients (Eur J Dermatol 2016 Apr 1;26(2):138- 43).
  • cells used for blood products for transfusion erythrocyte products, platelet products, whole blood products
  • hematopoietic stem cells used for bone marrow transplantation can also be used. These cells may be either allo cells or xeno cells.
  • PD-1 signal refers to the information transduction mechanism carried by PD-1, and as one of them, PD-1 is its ligand PD-L1, in cooperation with PD-L2, Signal transduction mechanisms that suppress activation of T cells can be exemplified.
  • PD-1 programmed cell death-1
  • PD-L1 and PD-L2 are antigens of monocytes and dendritic cells. It is expressed in various cells such as presenting cells and cancer cells.
  • PD-1, PD-L1 and PD-L2 act as suppressors that suppress T cell activation.
  • Certain cancer cells and virus-infected cells express ligands for PD-1 to suppress T-cell activation and evade host immune surveillance.
  • PD-1 signal inhibitors include substances that specifically bind to PD-1, PD-L1 or PD-L2, and such substances include proteins, polypeptides, oligopeptides, nucleic acids (natural (including nucleic acids and artificial nucleic acids), low-molecular-weight organic compounds, inorganic compounds, cell extracts, extracts from animals, plants, soil, and the like. Substances may be natural or synthetic.
  • Preferred PD-1 signal inhibitors are antibodies, more preferably antibodies such as anti-PD-1 antibodies, anti-PD-L1 antibodies and anti-PD-L2 antibodies.
  • Antibodies may be any of polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, chimeric antibodies, single-chain antibodies, humanized antibodies, and humanized antibodies as long as they can inhibit PD-1 signaling. Methods for producing those antibodies are known. Antibodies can be derived from any organism, such as human, mouse, rat, rabbit, goat, guinea pig. Also, as used herein, the antibody refers to Fab, F (ab) '2, ScFv, Diabody, VH, VL, Sc (Fv) 2, Bispecific sc (Fv) 2, Minibody, scFv-Fc monomer, scFv- This concept also includes low-molecular-weight compounds such as Fc dimer.
  • PD-1 signaling inhibitors that target PD-1 include nivolumab (Bristol-Myers Squibb), pembrolizumab (Merck), cemiplimab (Regeneron/Sanofi), camrelizumab (Jiangsu Hengrui), sintilimab (Innovent Biologics/Lilly), toripalimab (Shanghai Junshi Bioscience), PD-L1-targeting atezolizumab (Genetech/Roche), durvalumab (AstraZeneca), avelumab (Merck/Pfizer) are approved globally and also target PD-1 tislelizumab (BeiGene), dostarlimab (AnaptysBio/Tesaro), HLX-04 (Shanghai Henlius Biotech), AK-105 (Akeso Biopharma), spartalizumab (Novartis), BCD-100 (Biocad), MGA-012 (
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used as an anticancer agent, a therapeutic agent for infectious diseases, or a combination thereof.
  • target cancers or tumors include leukemia, lymphoma (Hodgkin's disease, non-Hodgkin's lymphoma, etc.), multiple myeloma, brain tumor, breast cancer, and uterine body.
  • lymphoma Hodgkin's disease, non-Hodgkin's lymphoma, etc.
  • multiple myeloma brain tumor, breast cancer, and uterine body.
  • cancer cervical cancer, ovarian cancer, esophageal cancer, stomach cancer, appendix cancer, colon cancer, liver cancer, gallbladder cancer, bile duct cancer, pancreatic cancer, adrenal cancer, gastrointestinal stromal tumor, mesothelioma, head and neck cancer (Laryngeal cancer, etc.), Oral cancer (Floor of the mouth cancer, etc.), Gingival cancer, Tongue cancer, Buccal mucosa cancer, Salivary gland cancer, Paranasal sinus cancer (Maxillary sinus cancer, Frontal sinus cancer, Ethmoid sinus cancer, Sphenoid sinus cancer) ), thyroid cancer, kidney cancer, lung cancer, osteosarcoma, prostate cancer, testicular tumor (testicular cancer), renal cell carcinoma, bladder cancer, rhabdomyosarcoma, skin cancer (basal cell carcinoma, spinous cell cancer) cancer, malignant melanoma, actinic keratosis, Bowen's disease, Paget's disease, etc.), anal cancer,
  • target infectious diseases include bacterial infections (streptococci (group A ⁇ -hemolytic streptococci, pneumococci, etc.), Staphylococcus aureus (MSSA, MRSA), Staphylococcus epidermidis, Enterococcus, Listeria, Meningococcus, Neisseria gonorrhoeae, Pathogenic Escherichia coli (0157:H7, etc.), Klebsiella (Klebsiella pneumoniae), Proteus, Pertussis, Pseudomonas aeruginosa, Serratia, Citrobacter, Acinetobacter, Various infectious diseases caused by Enterobacter, Mycoplasma, Clostridium, etc., tuberculosis, cholera, plague, diphtheria, dysentery, scarlet fever, anthrax, syphilis, tetanus, lepros
  • bacterial infections streptococci (group A ⁇ -
  • the pharmaceutical composition of the present invention contains a substance capable of enhancing TCR signaling, and is administered either before, after, or at the same time as administration of a PD-1 signaling inhibitor.
  • the PD-1 signal inhibitor and the substance capable of enhancing the TCR signal may be administered separately at different times or at the same time, or may be administered together at the same time.
  • good. comprising a PD-1 signal inhibitor and a substance capable of enhancing TCR signal when the PD-1 signal inhibitor and the substance capable of enhancing TCR signal are administered together at the same time It may be used as a compounding agent.
  • composition of the present invention is administered to a subject systemically or locally, orally or parenterally.
  • Subjects include humans and non-human animals.
  • PD-1 signal inhibitors e.g., anti-PD-1 antibody, anti-PD-L1 antibody, anti-PD-L2 antibody
  • a buffer solution such as PBS, physiological saline, sterile water, etc.
  • this solution contains additives (for example, colorants, emulsifiers, suspending agents, surfactants, solubilizers, stabilizers, preservatives, antioxidants, buffers, tonicity agents, etc.).
  • additives for example, colorants, emulsifiers, suspending agents, surfactants, solubilizers, stabilizers, preservatives, antioxidants, buffers, tonicity agents, etc.
  • the route of administration includes intravenous, intramuscular, intraperitoneal, subcutaneous, and intradermal administration.
  • PD-1 signal inhibitors e.g., anti-PD-1 antibody, anti-PD-L1 antibody, anti-PD-L2 antibody
  • content in the formulation varies depending on the type of formulation, usually 1 to 100% by weight, preferably 50-100% by weight.
  • the formulations may be formulated in unit dosage formulations.
  • Dosage, number and frequency of administration of PD-1 signal inhibitors are subject to symptoms, age, body weight, administration method, administration Although it varies depending on the form and the like, for example, in terms of the amount of the active ingredient, an adult usually administers 0.1 to 100 mg/kg body weight, preferably 1 to 10 mg/kg body weight, at least once to achieve the desired effect. It should be administered at a frequency that can be confirmed.
  • Substances capable of enhancing TCR signaling may be included in formulations containing PD-1 signaling inhibitors, alone or mixed with excipients or carriers, in tablets, capsules, powders, granules. , liquids, syrups, aerosols, suppositories, injections and the like.
  • Excipients or carriers are conventionally used in the art and may be pharmaceutically acceptable, and their type and composition may be changed as appropriate. For example, water, vegetable oil and the like are used as the liquid carrier.
  • solid carriers saccharides such as lactose, white sugar and glucose, starches such as potato starch and corn starch, and cellulose derivatives such as crystalline cellulose are used.
  • a lubricant such as magnesium stearate, a binder such as gelatin and hydroxypropylcellulose, a disintegrant such as carboxymethylcellulose, and the like may be added.
  • antioxidants, coloring agents, corrigents, preservatives and the like may be added.
  • Substances capable of enhancing TCR signals can be administered by various routes such as oral, nasal, rectal, transdermal, subcutaneous, intravenous and intramuscular.
  • the content of a substance that can enhance the TCR signal in the formulation varies depending on the type of formulation, but is usually 1-100% by weight, preferably 50-100% by weight.
  • the content of the substance capable of enhancing the TCR signal in the formulation is preferably 1-100% by weight.
  • the content of the substance capable of enhancing the TCR signal in the formulation is usually about 10-100% by weight, preferably 50-100% by weight, and the balance is the carrier. is.
  • the formulations may be formulated in unit dosage formulations.
  • the dose, frequency and frequency of administration of the substance capable of enhancing the TCR signal vary depending on the type of the substance capable of enhancing the TCR signal, subject's symptoms, age, body weight, administration method, administration form, etc.
  • the substance capable of enhancing the TCR signal is a CD45 inhibitor
  • it is usually 0.005 ⁇ g (or ⁇ l) to 25000 mg (or ml) per adult in terms of the amount of the active ingredient.
  • the substance capable of enhancing the TCR signal is a cell, it is usually about 1 x 10 6 cells/person to 1 x 10 11 cells/person, preferably 5 x 10 6 cells/person to an adult. About 2 x 10 10 cells/person should be administered at least once at a frequency that allows confirmation of the desired effect.
  • the ratio of the PD-1 signal inhibitor (e.g., anti-PD-1 antibody, anti-PD-L1 antibody, anti-PD-L2 antibody) and the substance capable of enhancing the TCR signal is the substance capable of enhancing the TCR signal is a CD45 inhibitor, 1:0.1 to 1:100 (mass ratio) is suitable, preferably 1:1 to 1:50, and the substance capable of enhancing the TCR signal is the cell , 1 x 10 6 to 1 x 10 10 cells, preferably 5 x 10 6 to 2 x 10 9 cells, are suitable for 240 mg of the PD-1 signal inhibitor.
  • the present invention also provides administration of a pharmaceutically effective amount of a substance capable of enhancing TCR signaling to a subject either before, after, or at the same time as administration of a PD-1 signaling inhibitor. Also provided are methods of preventing and/or treating cancer, infectious diseases, or combinations thereof, including: Furthermore, the present invention relates to the use of a substance capable of enhancing TCR signaling for the treatment of cancer, infectious disease or a combination thereof, wherein the agent is administered before, after or simultaneously with a PD-1 signaling inhibitor. A substance capable of enhancing the TCR signal is administered during any of the above uses.
  • the present invention relates to the use of a substance capable of enhancing TCR signaling for use in a method of treating cancer, infectious disease or a combination thereof, comprising administering a PD-1 signaling inhibitor Also provided is said use wherein a substance capable of enhancing the TCR signal is administered either before, after or simultaneously.
  • the present invention provides a substance capable of enhancing T cell receptor (TCR) signaling for use in preventing and/or treating cancer, infectious diseases, or a combination thereof, which inhibits PD-1 signaling Also provided are said substances administered either before, after or concurrently with the administration of the agent.
  • TCR T cell receptor
  • the present invention also provides agents that enhance PD-1 signaling inhibitory activity, including substances capable of enhancing TCR signaling.
  • the present invention is to administer to a subject an effective amount of a substance capable of enhancing T cell receptor (TCR) signals either before, after or at the same time as administration of a PD-1 signal inhibitor.
  • TCR T cell receptor
  • methods of enhancing PD-1 signaling inhibitory activity comprising:
  • the drug of the present invention can be used as a combination drug or combination drug with a PD-1 signal inhibitor. Combinations and formulations of PD-1 signal inhibitors and substances capable of enhancing TCR signals are described above.
  • the agent of the present invention can be used not only as a medicine but also as an experimental reagent.
  • the present invention provides a TCR signal enhancer comprising a CD45 inhibitor and/or cells.
  • the invention also provides a method of enhancing TCR signaling comprising administering to a subject an effective amount of a CD45 inhibitor and/or cells.
  • CD45 inhibitors and cells are described above.
  • the agent of the present invention can be used not only as a medicine but also as an experimental reagent.
  • CD8-positive cells play a major role in anti-tumor responses and directly kill cancer cells. Strong suppression of CD8-positive cell immunity in the elderly is associated with cancer and other age-related diseases.
  • This study investigated the role of T-cell function in age-related resistance to PD-1 inhibitory therapy. We found that formation of CD44 low CD62L low CD8 positive T cells was reduced in regional lymph nodes of aged tumor-bearing mice. First, P4 cells were induced from naive CD8+ T cells by in vitro stimulation and then differentiated into effector/memory cells.
  • Immunosenescence is caused by quantitative and qualitative changes in immune cells.
  • One of the major quantitative changes in T cells is a reduction in TCR repertoire diversity due to thymic regression, leading to a reduction in naive cells in the periphery (13-15).
  • functional deficits such as impaired TCR signaling, reduced ability to differentiate into effector and memory cells, and reduced cytokine production accumulate in peripheral T cells in the elderly (16, 17).
  • age-related changes greatly affect the proportion of well-defined CD8-positive T-cell subsets (18-20).
  • CD44 and CD62L are used to distinguish between three major CD8+ T cells: naive (also called P1; CD44 low CD62L high ) and central memory (P2; CD44 high CD62L high ). ), effector/memory (P3; CD44 high CD62L low ).
  • the CD44 low CD62L low (P4) CD8 positive T cell subset that remains in naive mice is a very minor population.
  • Naive T cells differentiate into effector T cells upon antigen stimulation (14, 21). Some effector cells differentiate into memory cells and are capable of rapidly responding to the same antigenic stimulus and effector cell differentiation.
  • TCR T cell receptor
  • Phosphorylation and dephosphorylation of TCR signaling molecules affect signal complex formation and TCR signal propagation.
  • CD45 is a transmembrane phosphatase that plays a major role in regulating TCR signaling by regulating the level of tyrosine phosphorylation of lymphocyte protein kinase (Lck). This Lck acts as an activator of TCRz, z-chain-associated protein (ZAP)-70, and the linker of activated T cells (LAT), which are downstream factors of TCR signaling (24, 25).
  • Lck lymphocyte protein kinase
  • 1C metabolism In activated and proliferating cells, 1C metabolism is generally enhanced and supports survival and differentiation through purine and thymidine biosynthesis, amino acid production, epigenetic regulation, and redox regulation (29, 29). 30). Recent reports indicate that 1C metabolism is one of the most frequently induced metabolic pathways during early CD4+ or CD8+ T cell activation (31, 32). After T cell activation, increased 1C metabolism promotes serine processing required for the biosynthesis of new nucleic acids derived from the 1C unit, which is responsible for antigen-specific T cell proliferation and differentiation and effector function. is necessary. This 1C metabolic pathway is also involved in energy production through regulation of mitochondrial protein synthesis by mitochondrial tRNA methylation (33, 34). Since mitochondrial function and 1C metabolism are lower in aged CD4+ T cells than in young CD4+ T cells (35), aging of T cells may be involved in the inactivation of 1C metabolism. .
  • P4 cells are intermediate between P1 and P3 cells and retain potential for anti-tumor activity.
  • the P3 and P4 subsets of CD8-positive T cells were induced by intravenous injection of OVA-expressing MC38 tumor cells (MC38-OVA) into the tail vein of OT-1 mice and isolated from the spleens 5 days later.
  • the same number of P3 or P4 cells were adoptively transferred to young CD8 KO mice engrafted with MC38-OVA.
  • MC38-OVA proliferation was strongly suppressed in mice transfected with P3 or P4 cells (Fig. 2A).
  • Fig. 2B all transplanted P4 cells in peripheral blood 6 days after transplantation differentiated into P3 cells.
  • P1 and P2 cells are known to differentiate into P3 cells during activation, but the characteristics of P4 cells are scarce due to their low numbers.
  • P1, P2, and P4 cells were isolated from young PD-1 KO mice and treated with anti-CD3/CD28 antibodies in vitro. stimulated by IL-2 (Fig. 2C). Consistent with the in vivo results, isolated P4 cells differentiated predominantly into P3 cells under these conditions (Fig. 2D).
  • FIG. 2E and 2F P4 cells were formed from P1 cells, but not from P2 cells, two days after in vitro stimulation.
  • Tumor inoculation increased the expression of 1C metabolic-related genes in total CD8+ T cells from young wild-type and PD-1 KO mice (Fig. 3G), which could be explained by the formation of P4 cells. ( Figures 1C and 6C). Consistent with the high efficiency of P4 cell induction in PD-1 KO mice (Fig. 1C and Fig. 6C), CD8-positive T cells in young PD-1 KO mice were more likely to express most 1C metabolism-related genes than in wild-type mice. was expressed at high levels in response to MC38 tumor cell inoculation (Fig. 3G). In contrast, the expression of these genes in total CD8-positive T cells from aged mice showed no appreciable variation with tumor inoculation, regardless of mouse genotype.
  • MC38-OVA injection increased the percentage of CD8-positive T cells expressing phosphorylated ZAP-70 in young mice (Fig. 4C). This suggests that the activation of TCR signaling by antigen stimulation is inhibited in aged OT-1 mice. Remarkably, no significant difference was found in the intensity of OVA-specific MHC tetramers (Fig. 7A&B), indicating no difference in TCR expression levels and avidity of OT-I T cells from young and aged mice. matter was shown. Therefore, the inhibition of antigen-stimulated TCR activation seen in aged mice may involve mechanisms other than TCR-MHC/antigen interactions.
  • CD45RB an isoform of CD45 that is predominantly expressed on naive and memory T cells in mice.
  • the effect of aging on CD45RB expression was greater in P1 and P4 cells than in P2 and P3 cells (Fig. 4D).
  • the highest increase in CD45RB expression was observed in P1 cells of aged wild-type and PD-1 KO mice (Fig.
  • Heterologous cell therapy enhances P4 cell induction in aged mice and restores the antitumor potential of CD8+ T cells.
  • strong in vitro stimulation restores suppression of the P1 to P4 transition in aged mice, suggesting that strong stimulation using heterologous cells (human Burkitt's lymphoma, Daudi cells) is associated with aging.
  • Heterologous cells human Burkitt's lymphoma, Daudi cells
  • Fig. 5A Ten days after tail vein injection of Daudi cells (day 0: before MC38 tumor cell transplantation), the proportion of P4 cells was strongly increased in the peripheral lymph nodes of young and aged PD-1 KO mice, but the proportion of P1 to P3 cells decreased. The percentage did not increase significantly (Fig.
  • Daudi cell injection strongly suppressed MC38 tumor growth in aged mice and prolonged survival (Fig. 5E&F). Age-related unresponsiveness to anti-PD-L1 antibodies in wild-type mice was also restored by Daudi cell injection (FIGS. 9A-E).
  • Fig. 5G the percentage of p-ZAP-70-positive cells was increased in PD-1 KO mice injected with Daudi cells (Fig. 5G), indicating that xenostimulation enhances TCR signals to tumor antigens. It was suggested.
  • Daudi cell therapy enhanced the proliferation of tumor antigen-reactive CD8+ T cells.
  • MC38-OVA cells were transplanted into PD-1 KO mice 10 days after Daudi cell injection, and the appearance of OVA tetramer-positive CD8-positive T cells was monitored.
  • the percentage of OVA tetramer-positive CD8-positive T cells was increased by infusion of Daudi cells in regional lymph nodes and tumor tissues of aged PD-1 KO mice (Fig. 5H&I), indicating that this treatment resulted in antigen-specific CD8 It was shown to increase the induction of positive T cells. Given that prestimulation with Daudi cells enhances P4 cell induction and 1C metabolism in CD8+ T cells from aged mice, it is plausible that Daudi cell infusion increased both basal respiration and respiratory reserve. result (Fig. 10A-C).
  • T cells are directly (eg, donor peptide presented by donor MHC) or indirectly (eg, donor peptide presented by recipient MHC) activated by allo- or heterologous MHC molecules (54-56).
  • donor MHC donor peptide presented by donor MHC
  • recipient MHC donor peptide presented by recipient MHC
  • mice and Cells All mice were bred at Kyoto University graduate School of Medicine Animal Research Facility or RIKEN Life Science Research Center under an SPF environment free of specific pathogens that would interfere with experiments, and in accordance with appropriate experimental guidelines. and was used in PD-1-/- (PD-1KO) mice were generated in our laboratory by homologous recombination (59). C57BL/6 wild-type mice were obtained from Charles River Laboratories Japan. OT-1 TCR transgenic and CD8 ⁇ / ⁇ (CD8 KO) mice were purchased from The Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine USA) (deposited by M. B. Bevan, Washington Medical Center or T. Mak, University of Toronto). A mouse colon carcinoma (MC38) cell line was kindly provided by J. P.
  • OVA-expressing MC38 cells were isolated from MC38 by a pMXs-based OVA-F2A-EGFO retrovirus. generated by transformation. Cells were cultured in the absence of mycobacterial infection in RPMI 1640 (Gibco; 11875-093) containing 10% inactivated fetal bovine serum and 1% penicillin-streptomycin (Nacalai Tesque; 26253-84). did
  • mice Mouse Treatment Model MC38 cells (5 ⁇ 10 5 or 2 ⁇ 10 6 ) were implanted intradermally into the right abdomen of mice (day 0). Five days after MC38 cell transplantation (day 5), the mice were treated with an anti-PD-L1 antibody (clone 1-111A.4, produced and stored at Kyoto University graduate School of Medicine Immunology and Genomic Medicine Laboratory (Immunology Letters 84 (2002) ) 57-62) (6 mg/kg) was administered intraperitoneally, and this anti-PD-L1 antibody administration was repeated three times every 6 days (days 5, 11, and 17).
  • an anti-PD-L1 antibody clone 1-111A.4, produced and stored at Kyoto University graduate School of Medicine Immunology and Genomic Medicine Laboratory (Immunology Letters 84 (2002) ) 57-62
  • this anti-PD-L1 antibody administration was repeated three times every 6 days (days 5, 11, and 17).
  • Antibody isotype (Rat IgG2a) was used as a control.Tumor growth was monitored by measuring tumor size using a caliper, and volume was calculated by the formula ⁇ (length ⁇ width ⁇ height)/6.
  • the transfer of non-autologous cells was Burkitt's lymphoma Daudi cells or BALB/c treated with mitomycin C (MMC) 10 days before tumor cell transplantation, or C57BL/6N-derived splenocytes (2 ⁇ 10 6 cells/mouse) as a control. was performed by injection through the tail vein of
  • Peripheral and regional lymph node cells and tumor-infiltrating lymphocytes were isolated as previously described (39).
  • splenocyte analysis spleens were briefly disaggregated and suspended in potassium ammonium chloride solution to lyse red blood cells. Splenocytes were washed and treated with RPMI containing 10% fetal bovine serum, L-glutamine, 55 ⁇ M 2-mercap and ethanol, penicillin-streptomycin, 1 mM sodium pyruvate (Gibco), 1% MEM non-essential amino acids solution (Gibco). Resuspended in 1640 internal solution (T cell culture medium).
  • CD8a Ly-2 microbeads
  • FACSAria BD Biosciences
  • peripheral blood cells collected peripheral blood cells were treated with potassium ammonium chloride solution and washed with T cell culture medium. Purified cells were stimulated with T cell culture medium supplemented with anti-CD3/28 Dynabeads (Gibco) and recombinant human IL-2 (20 U/mL; PeptoTech).
  • CD8-positive T cells using MC38-OVA cells
  • CD8-positive T cells isolated from lymph nodes of OT-1 mice were combined with MMC-treated MC38-OVA cells in T-cell culture medium. cultured. One day after stimulation, the cells were treated with 0.05 ⁇ M CD45 inhibitor VI (EDM Millipore) for 1 hour.
  • CD3 (clone 145-2C11) and CD8 (clone 53-6.7) (Invitrogen); phospho-ZAP70/Syk (clone n3kobu5) (Invitrogen), CD45.1 (clone A20), CD45.2 (clone 104), CD44 ( Clone IM7) and CD62L (clone MEL-14) (TONBO biosciences or BioLegend); CD8 (clone KT15, MBL Life Science); CD45RB (clone 16A, BD Pharmingen).
  • H2Kb Negative (SIY) Tetramer-SIRYYGL-APC and H-2Kb OVA Tetramer-SINFEKL-APC (TS-M008-2) were analyzed by MBL Life Science flow cytometric analysis using FACSCant II (BD Biosciences) and FlowJo software (FlowJo LLC). was used.
  • CD8 KO and OT-1 Mouse Models To induce P3 and P4 cells, MC38-OVA cells (1-2 ⁇ 10 6 ) were transferred into OT-1 mice by tail vein injection. Five days later, P3 and P4 cells were isolated from those mice. Each isolated CD8-positive T cell was injected via the tail vein of CD8 KO mice that had been intradermally implanted with 2 ⁇ 10 5 MC38-OVA cells 5 days earlier. Peripheral blood was then obtained 6 days later to analyze the differentiation of the transplanted cells.
  • Real-time PCR was performed to amplify the indicated mRNAs using the Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCT system (ABI) and PowerUp SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems). The expression level of each gene was normalized by the ⁇ -actin mRNA level.
  • the primer sequences are as follows: Shmt1 forward (Fw), 5'-CCAGAGTGCTGTGGCAACTC-3' (SEQ ID NO: 1); Shmt1 reverse (Rv), 5'-GCAAAACACAGGCTGTTCCTG-3' (SEQ ID NO: 2); Shmt2 Fw, 5'-GACAGTTGAGGACACCTGGC-3' (SEQ ID NO: 3); Shmt2 Rv, 5'-CCAGAGAGGAGTGACATCTC-3' (SEQ ID NO: 4); Phgdh Fw, 5'-TGGCCTCGGCAGAATTGGAAG-3' (SEQ ID NO: 5); Phgdh Rv, 5'-TGTCATTCAGCAAGCCTGTGGT-3' (SEQ ID NO: 6); Psat1 Fw, 5'-GATGAACATCCCATTTCGCATTGG-3' (SEQ ID NO: 7); Psat1 Rv, 5'-GCGTTATACAGAGAGGCACGAATG-3' (SEQ ID
  • Oxygen Consumption Rate (OCR) Analysis The OCR assay was performed as previously described with some modifications (39). Oxygen consumption rates of CD8+ T cells isolated from regional lymph nodes were analyzed with the XFe96 Extracellular Flux analyzer (Agilent Technologies) using the Seahorse XFe96 Extracellular Flux assay kit and Seahorse XF Cell Mito Stress test kit (Agilent Technologies). rice field. CD8-positive T cells were seeded (3 ⁇ 10 5 /well) on XFe96 plates coated with Cell-Tak (Corning). Reserve respiratory capacity was calculated from OCR graphs as previously described (60). Basal respiration was calculated by subtraction with non-mitochondrial respiration (values before oligomycin addition to values after rotenone/antimycin A addition) (61).
  • mice and Cells All mice were bred at the Kyoto University graduate School of Medicine Animal Experimental Facility under an SPF environment free of specific pathogens that would interfere with experiments, and were used under appropriate experimental guidelines.
  • C57BL/6 was obtained from Charles River Laboratories Japan.
  • PD-1-/- (PD-1KO) mice were generated in our laboratory by homologous recombination (see Nishimura et al.) (11).
  • Mouse colon cancer-derived MC38 cells were a gift from J. P. Allison, Memorial Sloan-Kettering Cancer (New York, NY). LLC cells derived from Lewis lung carcinoma were purchased from the American Type Culture Collection (ATCC).
  • ATCC American Type Culture Collection
  • Mouse therapeutic model CD45 inhibition ( Figure 12): 2-(4-Acetylanilino)-3-chloronaphthoquinone (211) (530197, EDM Millipore) (12) (3 mg/kg) or N-(9,10-Dioxo-9) ,10-dihydrophenanthren-2-yl)-2,2-dimethylpropionamide (PTP) (540215, Sigma-Aldrich) (13) (3 mg/kg) was administered to mice before or after (5 or 7 days after) tumor cell implantation. was administered intraperitoneally. MC38 cells (5 ⁇ 10 5 or 1 ⁇ 10 6 ) or LLC cells (2 ⁇ 10 6 ) were implanted intradermally into the right flank of mice (day 0).
  • mice Seven days after LLC cell transplantation (day 7), the mice were intraperitoneally administered anti-PD-L1 antibody (clone 1-111A.4) (2 mg/kg). This anti-PD-L1 antibody administration was repeated three times every 6 days (days 7, 13, and 19). The tumor volume was measured with a caliper and calculated by the formula ⁇ (length ⁇ width ⁇ height)/6.
  • PD-1 KO mice (2 months old) were intraperitoneally injected with MC38 mouse colon cancer cells once 3 days before transplantation (pre-administration) or 3 times 5 days after transplantation (post-administration) with CD45 inhibitor 211 at 3 mg/day. kg was dosed (FIGS. 13A & B). MC38 cells were implanted intradermally into the right flank of mice at a rate of 1 ⁇ 10 6 /tumor. As a result, the tumor volume was significantly reduced in the group administered with 211 before or after MC38 transplantation, compared with the control group administered with only the vehicle (FIGS. 14A & B). These results suggest that CD45 inhibition enhances the antitumor effect of PD-1 signal inhibition.
  • Balb/c (allogeneic) spleen treated with anti-PD-L1 antibody (clone 1-111A.4) (1.5 mg/kg) intraperitoneally plus mitomycin C after 9, 16 and 23 days
  • Cells (5x105/mouse or 2x106/mouse) were injected (A) only once after 6 days, (B) only once after 9 days, or (C) after 9, 16 and 23 days for a total of 3 It was intravenously injected twice, and changes in tumor size over time were measured (Fig. 18). Points in each line graph are means of 5-6 mice, error bars are standard errors. * means p-value less than 0.05, ns means no significant difference (comparison by Tukey test after one-way ANOVA). As a result, it was found that three administrations of allogeneic cells had a higher effect in combination with an immune checkpoint inhibitor than one administration.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used as an anticancer agent, a therapeutic agent for infectious diseases, or a combination thereof.

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Abstract

PD-1シグナル阻害治療との新たな併用療法を提供する。T細胞受容体（TCR）シグナルを増強させることができる物質を含み、PD-1シグナル阻害剤を投与する前、後又は同時のいずれかの時期に投与する、医薬組成物。CD45阻害剤及び/又は細胞を含む、PD-1シグナル阻害活性増強剤。CD45阻害剤及び/又は細胞を含む、TCRシグナル増強剤。

Description

ＰＤ－１シグナル阻害剤の併用療法
　近年の臨床試験の結果より、PD-1シグナル阻害治療は、多くのがん種でこれまでの治療法よりも有効であることが明らかになってきた(1-4)（非特許文献１－４）。末期がん患者で抗PD-1抗体治療の奏功率は20-30%と従来の抗がん剤に比べて劇的に向上した。しかしながら、不応答性を示す患者が半数程度存在することが問題になっている(5, 6) （非特許文献５、６）。そのため、これらの患者に対して有効なPD-1シグナル阻害治療との併用療法の開発が急務となっている。
S. L. Topalian et al., Safety, activity, and immune correlates of anti-PD-1 antibody in cancer. N Engl J Med 366, 2443-2454 (2012). A. Ribas et al., Association of Pembrolizumab With Tumor Response and Survival Among Patients With Advanced Melanoma. JAMA 315, 1600-1609 (2016). M. Reck et al., Pembrolizumab versus Chemotherapy for PD-L1-Positive Non-Small-Cell Lung Cancer. N Engl J Med 375, 1823-1833 (2016). P. S. Chowdhury, K. Chamoto, T. Honjo, Combination therapy strategies for improving PD-1 blockade efficacy: a new era in cancer immunotherapy. J Intern Med 283, 110-120 (2018). W. Zou, J. D. Wolchok, L. Chen, PD-L1 (B7-H1) and PD-1 pathway blockade for cancer therapy: Mechanisms, response biomarkers, and combinations. Sci Transl Med 8, 328rv324 (2016). A. L. Shergold, R. Millar, R. J. B. Nibbs, Understanding and overcoming the resistance of cancer to PD-1/PD-L1 blockade. Pharmacol Res 145, 104258 (2019).
　本発明は、PD-1シグナル阻害治療との新たな併用療法を提供することを目的とする。
　PD-1シグナル経路の阻害効果は、主にT細胞の活性化を介して引き起こされる(P. S. Chowdhury, K. Chamoto, T. Honjo, Combination therapy strategies for improving PD-1 blockade efficacy: a new era in cancer immunotherapy. J Intern Med 283, 110-120 (2018).; K. Chamoto et al., Mitochondrial activation chemicals synergize with surface receptor PD-1 blockade for T cell-dependent antitumor activity. Proc Natl Acad Sci U S A 114, E761-E770 (2017).)。このT細胞の活性化はT細胞受容体（TCR）シグナリングカスケードにより促進される。TCRシグナリング分子のリン酸化や脱リン酸化はシグナル複合体形成やTCRシグナルの伝達に影響を及ぼす。CD45は膜貫通型の脱リン酸化酵素であり、lymphocyte protein kinase（Lck）やその下流因子のチロシンのリン酸化レベルを制御することでTCRシグナルの調整において主要な役割を果たす(J. Rossy, D. J. Williamson, K. Gaus, How does the kinase Lck phosphorylate the T cell receptor? Spatial organization as a regulatory mechanism. Front Immunol 3, 167 (2012).) (R. J. Brownlie, R. Zamoyska, T cell receptor signalling networks: branched, diversified and bounded. Nat Rev Immunol 13, 257-269 (2013).)。若いナイーブCD8陽性T 細胞において、高いCD45発現はZAP-70やPLCgの脱リン酸化を介してTCRシグナル伝達を阻害する(J. H. Cho et al., CD45-mediated control of TCR tuning in naive and memory CD8(+) T cells. Nat Commun 7, 13373 (2016).)。そのため、CD45の抑制によりTCRシグナル伝達を亢進させることで、PD-1シグナル阻害により増強されたT細胞の活性化をさらに補強し、抗腫瘍効果が増強すると考えられる（図１７）。
　本発明者らは、PD-1シグナル阻害と脱リン酸化酵素であるCD45の阻害剤を併用すると、相乗的に抗腫瘍効果が向上することを見出した。特にこの腫瘍抑制の効果は、PD-1シグナル阻害に対して耐性を示す加齢マウスや耐性がんに対して強く示された。以上の結果から、CD45阻害剤はPD-1シグナル阻害剤と併用することで抗腫瘍免疫をサポートし、相乗的にがん増殖を抑制する効果を保持し、PD-1シグナル阻害の単独治療に不応答性を示すがんに対しても効果を持つと考えられる。同様の効果が細胞移植（異種細胞、同種異系細胞）でも見られた。細胞移植によるTCRシグナル伝達の亢進も確認された。
　本発明の要旨は、以下の通りである。
（１）T細胞受容体（TCR）シグナルを増強させることができる物質を含み、PD-1シグナル阻害剤を投与する前、後又は同時のいずれかの時期に投与する、医薬組成物。
（２）TCRシグナルを増強させることができる物質が、CD45阻害剤及び/又は細胞である（１）記載の医薬組成物。
（３）CD45阻害剤が、2-(4-Acetylanilino)-3-chloronaphthoquinone、N-(9,10-Dioxo-9,10-dihydrophenanthren-2-yl)-2,2-dimethylpropionamide及びそれらの類似物からなる群より選択される少なくとも１つの化合物である（２）記載の医薬組成物。
（４）細胞が、ゼノ細胞、アロ細胞又はそれらの組み合わせである（２）記載の医薬組成物。
（５）PD-1シグナル阻害剤が抗体である（１）～（４）のいずれかに記載の医薬組成物。
（６）抗体が、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体及び抗PD-L2抗体からなる群より選択される少なくとも１つの抗体である（５）記載の医薬組成物。
（７）抗がん剤、感染症治療剤又はそれらの組み合わせとして使用される（１）～（６）のいずれかに記載の医薬組成物。
（８）CD45阻害剤及び/又は細胞を含む、PD-1シグナル阻害活性増強剤。
（９）CD45阻害剤及び/又は細胞を含む、TCRシグナル増強剤。
（１０）PD-1シグナル阻害剤を投与する前、後又は同時のいずれかの時期に、T細胞受容体（TCR）シグナルを増強させることができる物質を有効な量で被験者に投与することを含む、がん、感染症又はそれらの組み合わせを予防及び／又は治療する方法。
（１１）PD-1シグナル阻害剤を投与する前、後又は同時のいずれかの時期に、T細胞受容体（TCR）シグナルを増強させることができる物質を有効な量で被験者に投与することを含む、PD-1シグナル阻害活性を増強する方法。
（１２）CD45阻害剤及び/又は細胞を有効な量で被験者に投与することを含む、TCRシグナルを増強する方法。
（１３）がん、感染症又はそれらの組み合わせを予防及び／又は治療することに使用するためのT細胞受容体（TCR）シグナルを増強させることができる物質であって、PD-1シグナル阻害剤を投与する前、後又は同時のいずれかの時期に投与される前記物質。
　TCRシグナルを増強させることができる物質をPD-1シグナル阻害剤と併用することで、相乗的に抗腫瘍効果が向上する。
　本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願2021‐31041の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
加齢PD-1 KOマウスにおける抗腫瘍活性とP4細胞誘導の喪失。（AとB）MC38細胞は、若齢と加齢PD-1 KOマウスの皮中に接種された。（A）若齢（３－４ヶ月齢）と加齢（１５ヶ月齢）のPD-1 KOマウスにおけるMC38腫瘍サイズ。（B）MC38腫瘍担癌PD-1 KOマウスの生存率のカプラン・マイヤープロット。（CとD）MC38細胞の接種の有り又は無しの若齢（C、２から３ヶ月齢）又は加齢（D、１５から２１ヶ月齢）PD-1 KOマウスにおけるCD8陽性T細胞サブセットの解析。Day 9で染色した末梢リンパ節と所属リンパ節細胞。CD3陽性CD8陽性細胞におけるCD44とCD62Lの発現を示す代表的なプロットとCD8陽性細胞サブセットのパーセンテージ；CD44low/CD62Lhigh (ナイーブ; P1), CD44high/CD62Lhigh (セントラルメモリー; P2), CD44high/CD62Llow (エフェクター/メモリー; P3), CD44low/CD62Llow (P4)。P値はlog-rankテスト又はStudent-T検定により計算した。*p < 0.05; **p < 0.01; n.s., 有意差なし。データはマウスの平均値±標準誤差を示している(n = 8-10 for A & B; n = 5-6 for C & D)。 P3細胞への分化を介したP4細胞の抗腫瘍活性。（AとB）OT-I P3とP4サブセットを得るために、MC38-OVA細胞は若齢OT-1マウスに尾静脈から注入され、それぞれのサブセットは脾細胞から単離された。MC38-OVA細胞の皮中移植から５日後にP3又はP4サブセット細胞はCD8 KOマウスに養子導入された。（A）P3又はP4細胞の導入有り又は無しのMC38-OVA担癌CD8 KOマウスにおける腫瘍体積。（B）Day 11の末梢血における移植されたCD8陽性T細胞のFACS解析。（C）若齢PD-1 KOマウスの脾細胞からのCD8陽性T細胞サブセット単離のスキーム。（DからG）若齢（２から３ヶ月齢）又は加齢（１６から１８ヶ月齢）のPD-1 KOマウスから単離し、抗CD3/CD28抗体とIL-2で刺激後、２又は３日間培養したP4（D）、P1（E）、又はP2（F）細胞のFACS解析。示した培養細胞におけるCD44とCD62L発現やCD8陽性T細胞のパーセンテージを示す代表的なプロット。データはマウスの平均値±標準誤差を示している(n = 3-5)。**p < 0.01（ANOVAによる評価の後Tukey’s テスト）。 P4細胞における1C代謝関係遺伝子の発現増加。（AからE）若齢PD-1 KOマウスから単離したP1、P2、P3、とP4細胞のマイクロアレイ解析（1から3ヶ月齢；９マウスの混合）。（A）全ての遺伝子の階層的なクラスタリングヒートマップ。（B）それぞれのプローブの正規化したlog強度を示す散布図。点線はlog 2-foldの差を示す。これまでにCD8陽性細胞の活性化や分化への関与が示された遺伝子が収載されている。（C）P4細胞において上方制御された遺伝子が関与する上位１０の遺伝子オントロジー（GO）。1C代謝の関与するGO用語は赤で示されている。（D）1C代謝経路の模式図。THF, tetrahydrofolate。（E）CD8陽性T細胞サブセットにおける1C代謝関係遺伝子の発現を示すヒートマップ。（F）若齢PD-1 KOマウスの脾細胞由来のCD8陽性T細胞サブセットにおける1C代謝関係遺伝子のmRNA発現。（G）MC38腫瘍（day 9）有り又は無しの若性（２ヶ月齢、３マウス混合）又は加齢（１７ヶ月齢、６マウス混合）マウスの末梢又は所属リンパ節における野生型又はPD-1 KO CD8陽性T細胞のマイクロアレイ解析。ヒートマップは図中で示す細胞における1C代謝関係遺伝子の発現を表す。（HとI）若性（２から３ヶ月齢）又は加齢（１５から１９ヶ月齢）マウスの所属リンパ節由来の野生型又はPD-1 KO CD8陽性T細胞の酸素消費速度（OCR）はSeahorse XFe96 分析器を用いて測定した。OCR trace（H）、基礎呼吸や予備呼吸能はOCR値から算出した（I）。*p < 0.05; **p < 0.01（Student-T検定）。データは平均値±標準誤差を示している(n = 4)。 加齢CD8陽性T細胞におけるP4細胞誘導はCD45RBの高発現を介したTCRシグナル抑制により減弱される。（AとB）MC38-OVA細胞の尾静脈からの注射有り又は無しの若性（２から３ヶ月齢）（A）又は加齢（１５から１９ヶ月齢）（B）OT-1マウスの所属リンパ節におけるCD8陽性T細胞サブセットの解析。MC38-OVA移植から５日後の図に示すマウスにおけるCD8陽性T細胞上のCD44とCD62Lの発現とそれぞれのCD8陽性T細胞サブセットのパーセンテージを示す典型的な図。（C）MC38-OVA移植が有り又は無しの若性又は加齢OT-1マウス由来の末梢リンパ節におけるpZAP70陽性CD8陽性T細胞の割合。（D）若齢（２から３ヶ月齢）又は加齢（１４から１７ヶ月齢）のOT-1マウス由来のトータルCD8陽性T細胞又はそれぞれのサブセットにおけるCD45RB発現レベルの代表的なプロットと蛍光強度（MFI）。（E）CD8陽性T細胞は若齢又は加齢OT-1マウスの末梢リンパ節から単離され、１日間、MMC処理したMC38-OVA細胞有り又は無しで培養された。培養の最後の１時間、溶媒又はCD45阻害剤（0.05 μM）が添加された。データは平均値±標準誤差を示している(n = 3-6)。*p < 0.05; **p < 0.01; n.s., 有意差なし（ANOVAによる評価の後Tukey’s テスト又はStudent-T検定）。 異種細胞移植による加齢マウスにおけるP4細胞と抗腫瘍活性の回復。（A）実験スケジュールの模式図。（BからD）若齢（３から４ヶ月齢）と加齢（１６から１８ヶ月齢）PD-1 KOマウスはDaudi細胞を尾静脈から移植された。その移植から１０日後（day 0）、それらのマウスの末梢リンパ節細胞はFACSやreal-time PCRにより解析された。（B）末梢リンパ節のCD8陽性T細胞におけるP1からP4サブセットのパーセンテージ。（C）CD8陽性T細胞における1C代謝関連遺伝子の発現レベル。（D）末梢リンパ節由来のP1細胞におけるCD45RB発現レベル。（EからI）若齢（３から４ヶ月齢）と加齢（１７から１８ヶ月齢）PD-1 KOマウスはDaudi細胞を尾静脈から移植された（day -10）。その移植から１０日後（day 0）、それらのマウスは皮中にMC38（EからG）又はMC38-OVA（HとI）細胞を移植され、下記の実験に使用された。MC38腫瘍サイズ（E）と生存率（F）。（G）Day 6の所属リンパ節由来のCD8陽性T細胞におけるpZAP70陽性細胞のパーセンテージ。（HとI）Day 6の所属リンパ節又は腫瘍組織におけるOVAテトラマー陽性CD8陽性T細胞の割合。データは平均値±標準誤差を示している(n = 9-10 for B; n = 4-6 for C-I)。*p < 0.05; **p < 0.01（ANOVAによる評価の後Tukey’s テスト、log-rank検定又はStudent-T検定）。 加齢野生型マウスにおける抗腫瘍活性とP4細胞誘導の喪失。（AとB）MC38細胞は、若齢（２ヶ月齢）と加齢（１４ヶ月齢）C57BL/6野生型マウスの皮中に接種された。その後、それらのマウスはday 5、11、と17に抗PD-L1抗体を投与された。（A）若齢と加齢の野生型マウスにおけるMC38腫瘍サイズ。（B）MC38腫瘍担癌野生型マウスの生存率のカプラン・マイヤープロット。P値はlog-rank検定により算出された。（CとD）MC38細胞の接種有り又は無しの若齢（C、２ヶ月齢）又は加齢（D、１５ヶ月齢）野生型マウスにおけるCD8陽性T細胞サブセットの解析。染色したday 9の末梢リンパ節と所属リンパ節細胞。CD3陽性CD8陽性T細胞におけるCD44とCD62Lの発現を示す代表的なプロットとCD8陽性T細胞サブセットのパーセンテージ；CD44low/CD62Lhigh (ナイーブ; P1), CD44high/CD62Lhigh (セントラルメモリー; P2), CD44high/CD62Llow (エフェクター/メモリー; P3), CD44low/CD62Llow (P4)。*p < 0.05; **p < 0.01; n.s., 有意差なし（Student-T検定）。データはマウスの平均値±標準誤差を示している(n = 5 for A, C & D; n = 9-11 for B)。 若齢と加齢OT-I CD8陽性細胞間での似通ったTCRのOVA抗原に対する結合力。若齢又は加齢OT-1マウスにおけるOVA特異的なMHCテトラマーの平均蛍光強度（MFI）の代表的なプロット（A）とグラフ（B）。データはマウスの平均値±標準誤差を示している(n = 4-6)。n.s., 有意差なし（Student-T検定）。 加齢野生型又はPD-1 KOマウス由来のCD8陽性T細胞におけるCD45RB高発現。野生型（A）又はPD-1 KO（B）マウスの末梢リンパ節由来のCD8陽性T細胞におけるCD45RB発現レベルは抗CD45RB抗体を用いたFACS解析により測定された。データはマウスの平均値±標準誤差を示している(n = 3-6)。*p < 0.05; **p < 0.01; n.s., 有意差なし（Student-T検定）。 異種細胞移植による野生型マウスにおける加齢に伴うPD-1阻害治療に対する不応答性の回復。若齢（１ヶ月齢）と加齢（１７から１９ヶ月齢）C57BL/6 野生型マウスはDaudi細胞を静脈から移植された。細胞移植無しをコントロール（Ctrl）とする。その移植から１０日後、それらのマウスはMC38細胞を皮中に移植された。PD-L1抗体の投与はday 5からはじめられ、６日毎に３回行われた。（A）実験スケジュールの模式図。（BとC）若齢（B）と加齢（C）野生型マウスにおけるMC38腫瘍サイズ。（DとE）MC38腫瘍担癌若齢（D）と加齢（E）野生型マウスの生存率。データはマウスの平均値±標準誤差を示している(n = 5-6)。*p < 0.05; **p < 0.01; n.s., 有意差なし（ANOVAによる評価の後Tukey’s テスト又はlog-rank検定）。 異種細胞移植による加齢に伴うミトコンドリア障害の回復。MC38-OVA細胞は１０日前にPBS（Ctrl）又はDaudi細胞を移植された若齢（３から４ヶ月齢）と加齢（１７から１８ヶ月齢）PD-1 KOマウスの皮中に移植された。その移植から６日後、図中に示すマウスの所属リンパ節から単離されたCD8陽性T細胞のOCRはSeahorse XFe96分析器を用いて計測された。OCR trace（A）、基礎呼吸（B）や予備呼吸能はOCR値から算出した（C）。データは平均値±標準誤差を示している(n = 3)。*p < 0.05; **p < 0.01（ANOVAによる評価の後Tukey’s テスト）。 同種異系細胞の移植による加齢に伴うPD-1阻害治療耐性の回復。C57BL/6 (Ctrl)又はBalb/c（Allo）マウス由来のMMC処理した脾細胞は若齢（１ヶ月齢）と加齢（１４から１８ヶ月齢）のC57BL/6野生型マウスに尾静脈注射により移植された。以降の実験条件は図９Aと同じである。若齢（A）と加齢（B）C57BL/6野生型マウスにおけるMC38腫瘍サイズ。データは平均値±標準誤差を示している(n = 3)。*p < 0.05; n.s., 有意差なし（ANOVAによる評価の後Tukey’s テスト）。（CとD）MC38腫瘍担癌若齢（C）と加齢（D）C57BL/6野生型マウスの生存率。P値はlog-rank検定により算出された（n = 5-6）。 CD45阻害剤の名称とその構造式。A) 2-(4-Acetylanilino)-3-chloronaphthoquinone、以下「211」ともいう。B) N-(9,10-Dioxo-9,10-dihydrophenanthren-2-yl)-2,2-dimethylpropionamide、以下「PTP」ともいう。 実験の方法と流れ。 CD45阻害によるPD-1シグナル阻害効果の向上。前投与：PD-1 ノックアウト（KO）マウスに溶媒（コントロール）又は211を投与し、３日後にMC38細胞（1 ×106）を移植した。後投与：PD-1 KOマウスへのMC38細胞移植から５日後のDay 5から２日ごとに211を合計３回投与した。A)腫瘍体積増加曲線、B)MC38細胞移植から１７日後の腫瘍体積。データは５匹のマウスの平均値±標準誤差を示している。*p < 0.05; **p < 0.01; n.s., 有意差なし。 CD45阻害による加齢に伴うPD-1シグナル阻害耐性に対する効果の向上。幼若（１～２ヶ月齢）又は加齢（１４～１６ヶ月齢）PD-1 KOマウスに211を投与し、３日後にMC38細胞を移植した。A)腫瘍体積増加曲線、B)MC38細胞移植から２８日後の腫瘍体積。データは６匹のマウスの平均値±標準誤差を示している。**p < 0.01。 CD45阻害によるPD-1シグナル阻害耐性がんに対する効果の向上。A) 実験の方法と流れ。幼若（１～２ヶ月齢）野生型マウスに211又はPTPを免疫治療に耐性を示すLLC細胞移植から７日後のDay 7から２日ごとに合計３回投与した。抗PD-L1抗体は、Day 7から６日毎に合計３回投与した。BとD)腫瘍体積増加曲線、CとE)MC38細胞移植から２４日後の腫瘍体積。データは５～７匹のマウスの平均値±標準誤差を示している。**p < 0.01; n.s., 有意差なし。 TCRシグナル伝達のモデル図。 同種異系細胞の投与による免疫チェックポイント阻害剤の効果がの増強する。若齢(6週齢)のC57BL/6マウスにMC38がん細胞を皮内注射した（5x10^5個）。9、16、23日後に抗PD-L1抗体（clone 1-111A.4）（1.5 mg/kg）を腹腔内投与し、それに加え、マイトマイシンCで処理したBalb/cの(同種異系)脾臓細胞（5x10^5個/マウス or 2x10^6個/マウス）を(A) 6日後に1回のみ、(B) 9日後に１回のみ、または(C) 9、16、23日後に計3回、静注し腫瘍サイズの経時的変化を測定した。各折れ線グラフにおける点は5ないし6マウスの平均値であり、エラーバーは標準誤差である。＊はp値が0.05未満、n.s.は有意差が無いことを意味する(one-way ANOVA後のTukey検定による比較)。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明は、T細胞受容体（TCR）シグナルを増強させることができる物質を含み、PD-1シグナル阻害剤を投与する前、後又は同時のいずれかの時期に投与する、医薬組成物を提供する。
　T細胞受容体（TCR）とは、T細胞の細胞膜上に発現している抗原受容体分子である。TCRに抗原が結合すると、下流因子であるLckやZAP-70などのリン酸化を介して細胞内にシグナルが伝達されるため、T細胞の活性化が引き起こされる。
　TCRシグナルの増強は、抗原刺激下でのCD8陽性T細胞におけるZAP-70のリン酸化を評価することにより確認できる。ZAP-70のリン酸化レベルが高ければ、TCRシグナルが増強していると言える。ZAP-70のリン酸化は、抗p-ZAP-70抗体を用いて、フローサイトメトリー解析により検出することができる。
　TCRシグナルを増強することで、CD8陽性T細胞による抗腫瘍免疫効果を増強することができる。よって、TCRシグナルの増強により、PD-1阻害治療の抗腫瘍効果を亢進させることができ、PD-1シグナル阻害に対して耐性を示す加齢動物や人、また耐性がんに対しても治療効果が生じうる。
　TCRシグナルを増強させることができる物質としては、CD45阻害剤及び/又は細胞を例示することができる。これらの物質は、P4細胞を誘導する効果も奏しうる。P4細胞とは、CD44lowCD62Llow CD8陽性T細胞サブセットである。マウスでは表面マーカーであるCD44やCD62L（L-selectin）を用いて３つの主要なCD8陽性T細胞を区別する：ナイーブ（P1とも呼ばれる；CD44lowCD62Lhigh）やセントラルメモリー（P2；CD44highCD62Lhigh）、エフェクター/メモリー（P3；CD44highCD62Llow）。残るCD44lowCD62Llow（P4）CD8陽性T細胞サブセットはとてもマイナーな集団である。
　CD45阻害剤としては、2-(4-Acetylanilino)-3-chloronaphthoquinone、N-(9,10-Dioxo-9,10-dihydrophenanthren-2-yl)-2,2-dimethylpropionamide及びそれらの類似物を例示することができる。
　本明細書において、「類似物」とは、化合物の塩、化合物の誘導体、活性代謝物に対するプロドラッグ、プロドラッグに対する活性代謝物、それらの溶媒和物などを含む概念である。
　化合物の塩は、化合物がアミノ基（置換アミノ基も含む）やアミド基を有する場合には、塩酸、メシル酸（メタンスルホン酸）、フマル酸、リン酸などの酸と形成する塩などを例示することができる。
　化合物の誘導体は、官能基の導入や置換、酸化、還元、原子の置き換えなど、母体の構造や性質を大幅に変えない程度の改変がなされた化合物であり、2-(4-Acetylanilino)-3-chloronaphthoquinoneの誘導体としては、クロロ（-Cl）基を他のハロゲン基（例えば、フルオロ（-F）基、ブロモ（-Br）基など）に置換したもの、アセチル（CH3CO-）基を他の官能基（例えば、ヒドロキシ基（水酸基）、アミノ（-NH2）基、ピバロイル基、ベンゾイル基など）に置換したものなどを例示することができ、N-(9,10-Dioxo-9,10-dihydrophenanthren-2-yl)-2,2-dimethylpropionamideの誘導体としては、ジメチルプロピオニル基を他のアルキル基（例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ベンジル基など）に置換したものなどを例示することができる。
　プロドラッグとしては、活性な化合物のアミノ基がアシル化、アルキル化、リン酸化された化合物（例えば、活性な化合物のアミノ基がエイコサノイル化、アラニル化、ペンチルアミノカルボニル化、（５－メチル－２－オキソ－１，３－ジオキソレン－４－イル）メトキシカルボニル化、テトラヒドロフラニル化、ピロリジルメチル化、ピバロイルオキシメチル化、ｔ－ブチル化された化合物等）、活性な化合物のアミド基がアルキル化（例えば、メチル化、エチル化、プロビル化など）されたものなどを例示することができる。
　溶媒和物としては、水、メタノール、エタノール、アセトニトリルなどの溶媒との溶媒和物を例示することができる。溶媒は、単一の溶媒であっても、複数種の混合物であってもよい。
　TCRシグナルを増強させることができる細胞は、医薬組成物を投与する対象のヒトや動物に対して、ゼノ細胞（異種細胞）であってもよいし、アロ細胞（同種異系細胞）であってもよく、あるいは、それらの組み合わせであってもよい。後述の実施例では、異種Daudi細胞、同種異系脾細胞をマウスに移植した。本明細書において、ゼノ細胞とは、異種細胞であり、アロ細胞とは、HLA（Human leukocyte antigen）又はMHC（major histocompatibility complex）が異なる同種細胞である。
　疾患の予防又は治療のために、生体に投与する種々の細胞（ゼノ細胞、アロ細胞）や組織が知られており、本発明でも、それらの細胞を用いるとよい。例えば、乳癌細胞株、慢性骨髄性白血病細胞株、肺がん細胞、非小細胞肺がん細胞株、黒色腫細胞株、単球、膵癌細胞株、前立腺癌細胞株、腎がん細胞株などの同種異系細胞が種々の癌の治療に用いられている（Human Vaccines & Immunotherapeutics 10:1, 52-63; January 2014）。これらの細胞は、増殖を防止するために放射線処理がなされるとよく、GM-CSFなどの免疫活性化因子を分泌するように遺伝子改変がなされてもよい。また、マウス黒色腫B16やルイス肺がん（LLC）細胞のような異種細胞を用いて、黒色腫患者に投与する臨床試験も行われている(Eur J Dermatol 2016 Apr 1;26(2):138-43)。その他、輸血用血液製剤（赤血球製剤、血小板製剤、全血製剤）に用いられる細胞やその製剤そのもの、骨髄移植に用いられる造血幹細胞なども使用しうる。これらの細胞は、アロ細胞又はゼノ細胞のいずれであってもよい。
　本明細書において、「PD-1シグナル」とは、PD-1が担う情報伝達機構をいい、その一つとして、PD-1がそのリガンドであるPD-L1、PD-L2と共同して、T細胞の活性化を抑制する情報伝達機構を例示することができる。PD-1（Programmed cell death-1）は、活性化したT細胞やB細胞に発現する膜タンパク質であり、そのリガンドであるPD-L1とPD-L2は、単球や樹状細胞などの抗原提示細胞、がん等様々な細胞に発現する。PD-1、PD-L1及びPD-L2は、T細胞の活性化を抑制する抑制因子として働く。ある種の癌細胞やウイルス感染細胞は、PD-1のリガンドを発現することにより、T細胞の活性化を抑制し、宿主の免疫監視から逃避している。
　PD-1シグナル阻害剤としては、PD-1、PD-L1又はPD-L2に特異的に結合する物質が挙げられ、そのような物質としては、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、核酸（天然型核酸、人工核酸を含む）、低分子有機化合物、無機化合物、細胞抽出物、動植物や土壌などからの抽出物などがありうる。物質は、天然物であっても、合成物であってもよい。好ましいPD-1シグナル阻害剤は、抗体であり、より好ましくは、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体などの抗体である。抗体は、PD-1シグナルを阻害できるものであればよく、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体、ヒト型抗体のいずれであってもよい。それらの抗体の製造方法は公知である。抗体は、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、モルモットなど、いずれの生物に由来するものであってもよい。また、本明細書において、抗体とは、Fab、F(ab)’2、ScFv、Diabody、VH、VL、Sc(Fv)2、Bispecific sc(Fv)2、Minibody、scFv-Fc monomer、scFv-Fc dimerなどの低分子化されたものも含む概念である。PD-1シグナル阻害剤としては、PD-1を標的とするnivolumab (Bristol-Myers Squibb)、pembrolizumab (Merck)、cemiplimab (Regeneron/Sanofi)、camrelizumab (Jiangsu Hengrui)、sintilimab (Innovent Biologics/Lilly)、toripalimab (Shanghai Junshi Bioscience)、PD-L1を標的とするatezolizumab (Genetech/Roche)、durvalumab (AstraZeneca)、avelumab (Merck/Pfizer)が世界各国で承認されており、また、PD-1を標的とするtislelizumab (BeiGene)、dostarlimab (AnaptysBio/Tesaro)、HLX-04 (Shanghai Henlius Biotech)、AK-105 (Akeso Biopharma)、spartalizumab (Novartis)、BCD-100 (Biocad)、MGA-012 (Incyte)、genolimzumab (Genor Biopharma)、HX-008 (Taizhou Hanzhong BioMedical)、BAT-1306 (Bio-Thera Solutions/Sun Yat-sen University (SYSU))、AMP-224 (National Cancer Institute (NCI))、BI-754091 (Boehringer Ingelheim)、sasanlimab (Pfizer)、ABBV-181 (AbbVie)、AB-122 (Arcus Biosciences)、Sym-021 (Symphogen)、MGD-013 (MacroGenics)、GLS-010 (Harbin Gloria Pharmaceuticals/WuXi PharmaTech)、F-520 (Shandong New Time Pharmaceutical)、PD-L1を標的とするenvafolimab (Jiangsu Alphamab Biopharmaceuticals)、bintrafusp alfa (Merck KGaA)、SL-279252 (Shattuck Labs)、FS-118 (F-star)、CA-170 (Aurigene/Curis)が臨床開発中であり、これらのPD-1シグナル阻害剤を使用しうる。
　本発明の医薬組成物は、抗がん剤、感染症治療剤又はそれらの組み合わせとして使用することができる。
　本発明の医薬組成物を抗がん剤として投与する場合、対象となる癌又は腫瘍としては、白血病、リンパ腫（ホジキン病、非ホジキンリンパ腫など）、多発性骨髄腫、脳腫瘍、乳がん、子宮体がん、子宮頚がん、卵巣がん、食道癌、胃癌、虫垂癌、大腸癌、肝癌、胆嚢癌、胆管癌、膵臓がん、副腎癌、消化管間質腫瘍、中皮腫、頭頚部癌（喉頭癌など）、口腔癌（口腔底癌など）、歯肉癌、舌癌、頬粘膜癌、唾液腺癌、副鼻腔癌（上顎洞癌、前頭洞癌、篩骨洞癌、蝶型骨洞癌など）、甲状腺癌、腎臓がん、肺癌、骨肉腫、前立腺癌、精巣腫瘍（睾丸がん）、腎細胞癌、膀胱癌、横紋筋肉腫、皮膚癌（基底細胞がん、有棘細胞がん、悪性黒色腫(メラノーマ)、日光角化症、ボーエン病、パージェット病など）、肛門癌などが例示される。
　本発明の医薬組成物を感染症治療剤として投与する場合、対象となる感染症としては、細菌感染症（レンサ球菌（A群β溶連菌、肺炎球菌など）、黄色ブドウ球菌（MSSA、MRSA）、表皮ブドウ球菌、腸球菌、リステリア、髄膜炎球菌、淋菌、病原性大腸菌（0157:H7など）、クレブシエラ（肺炎桿菌）、プロテウス菌、百日咳菌、緑膿菌、セラチア菌、シトロバクター、アシネトバクター、エンテロバクター、マイコプラズマ、クロストリジウムなどによる各種感染症、結核、コレラ、ペスト、ジフテリア、赤痢、猩紅熱、炭疽、梅毒 、破傷風、ハンセン病、レジオネラ肺炎（在郷軍人病）、レプトスピラ症、ライム病、野兎病、Q熱など）、リケッチア感染症（発疹チフス、ツツガムシ病、日本紅斑熱など）、クラミジア感染症（トラコーマ、性器クラミジア感染症、オウム病など）、真菌感染症（アスペルギルス症、カンジダ症、クリプトコッカス症、白癬菌症、ヒストプラズマ症、ニューモシスチス肺炎など）、寄生性原虫感染症（アメーバ赤痢、マラリア、トキソプラズマ症、リーシュマニア症、クリプトスポリジウムなど）、寄生性蠕虫感染症（エキノコックス症、日本住血吸虫症、フィラリア症、回虫症、広節裂頭条虫症など）、ウイルス感染症（インフルエンザ、ウイルス性肝炎、ウイルス性髄膜炎、後天性免疫不全症候群 (AIDS)、成人T細胞性白血病、エボラ出血熱、黄熱、風邪症候群、狂犬病、サイトメガロウイルス感染症、重症急性呼吸器症候群 (SARS)、進行性多巣性白質脳症、水痘、帯状疱疹、手足口病、デング熱、伝染性紅斑、伝染性単核球症、天然痘、風疹、急性灰白髄炎（ポリオ）、麻疹 、咽頭結膜熱（プール熱）、マールブルグ出血熱、ハンタウイルス腎出血熱、ラッサ熱、流行性耳下腺炎、ウエストナイル熱、ヘルパンギーナ、チクングニア熱など）などが例示される。
　本発明の医薬組成物は、TCRシグナルを増強させることができる物質を含み、PD-1シグナル阻害剤を投与する前、後又は同時のいずれかの時期に投与される。
　本発明の医薬組成物において、PD-1シグナル阻害剤と、TCRシグナルを増強させることができる物質とは、異なる時期または同じ時期に別々に投与されてもよいし、同時に一緒に投与されてもよい。PD-1シグナル阻害剤と、TCRシグナルを増強させることができる物質とが、同時に一緒に投与される場合には、PD-1シグナル阻害剤と、TCRシグナルを増強させることができる物質とを含む配合剤とするとよい。
　本発明の医薬組成物は、全身又は局所的に、経口又は非経口で被験者に投与される。被験者は、ヒト及びヒト以外の動物を含む。
　PD-1シグナル阻害剤（例えば、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体）は、PBSなどの緩衝液、生理食塩水、滅菌水などに溶解し、必要に応じてフィルターなどで濾過滅菌した後、注射又は点滴により被験者に投与するとよい。また、この溶液には、添加剤（例えば、着色剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、溶解補助剤、安定化剤、保存剤、酸化防止剤、緩衝剤、等張化剤など）などを添加してもよい。投与経路としては、静脈、筋肉、腹腔、皮下、皮内投与などが可能である。
　PD-1シグナル阻害剤（例えば、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体）の製剤中における含量は、製剤の種類により異なるが、通常1～100 重量％、好ましくは50～100 重量％である。製剤は、単位投与製剤に製剤化するとよい。
　PD-1シグナル阻害剤（例えば、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体）の投与量、投与の回数及び頻度は、被験者の症状、年齢、体重、投与方法、投与形態などにより異なるが、例えば、通常、成人一人当たり、有効成分の量に換算して、0.1～100 mg/kg体重、好ましくは、1～10mg/kg体重を、少なくとも１回、所望の効果が確認できる頻度で投与するとよい。
　TCRシグナルを増強させることができる物質は、PD-1シグナル阻害剤を含む製剤に含有させてもよいが、単独で、あるいは賦形剤または担体と混合し、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、液剤、シロップ、エアロゾル、坐剤、注射剤等に製剤化してもよい。賦形剤または担体は、当分野で常套的に使用され、医薬的に許容されるものであればよく、その種類及び組成は適宜変更される。例えば、液状担体としては水、植物油などが用いられる。固体担体としては、乳糖、白糖、ブドウ糖などの糖類、バレイショデンプン、トウモロコシデンプンなどのデンプン、結晶セルロースなどのセルロース誘導体などが使用される。ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロースなどの結合剤、カルボキシメチルセルロースなどの崩壊剤等を添加してもよい。その他、抗酸化剤、着色剤、矯味剤、保存剤等を添加してもよい。
　TCRシグナルを増強させることができる物質は、経口、経鼻、直腸、経皮、皮下、静脈内、筋肉内などの種々の経路によって投与できる。
　TCRシグナルを増強させることができる物質の製剤中における含量は、製剤の種類により異なるが、通常1～100 重量％、好ましくは50～100 重量％である。例えば、液剤の場合には、TCRシグナルを増強させることができる物質の製剤中における含量は、1～100重量％が好ましい。カプセル剤、錠剤、顆粒剤、散剤の場合は、TCRシグナルを増強させることができる物質の製剤中における含量は、通常約10～100 重量％、好ましくは50～100 重量％であり、残部は担体である。製剤は、単位投与製剤に製剤化するとよい。
　TCRシグナルを増強させることができる物質の投与量、投与の回数及び頻度は、TCRシグナルを増強させることができる物質の種類、被験者の症状、年齢、体重、投与方法、投与形態などにより異なるが、例えば、TCRシグナルを増強させることができる物質がCD45阻害剤である場合には、通常、成人一人当たり、有効成分の量に換算して、0.005 μg（又はμl）～25000 mg（又はml）/kg体重程度、好ましくは0.05μg（又はμl）～12500 mg（又はml）/kg体重程度を少なくとも１回、所望の効果が確認できる頻度で投与するとよい。TCRシグナルを増強させることができる物質が細胞である場合には、通常、成人一人当たり、1 x 106個/人～1 x 1011個/人程度、好ましくは5 x 106個/人～2 x 1010個/人程度を少なくとも１回、所望の効果が確認できる頻度で投与するとよい。
　PD-1シグナル阻害剤（例えば、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体）とTCRシグナルを増強させることができる物質の比率は、TCRシグナルを増強させることができる物質がCD45阻害剤である場合には、1:0.1～1:100（質量の比率）が適当であり、好ましくは 1:1～1:50であり、TCRシグナルを増強させることができる物質が細胞である場合には、PD-1シグナル阻害剤 240 mgに対して、細胞1 x 106～1 x 1010個が適当であり、好ましくは5 x 106～2 x 109個である。
　本発明は、また、PD-1シグナル阻害剤を投与する前、後又は同時のいずれかの時期に、TCRシグナルを増強させることができる物質を医薬的に有効な量で被験者に投与することを含む、がん、感染症又はそれらの組み合わせを予防及び/又は治療する方法も提供する。さらに、本発明は、がん、感染症又はそれらの組み合わせの治療のための、TCRシグナルを増強させることができる物質の使用であって、PD-1シグナル阻害剤を投与する前、後又は同時のいずれかの時期に、TCRシグナルを増強させることができる物質が投与される前記使用を提供する。さらにまた、本発明は、がん、感染症又はそれらの組み合わせを治療する方法に使用するための、TCRシグナルを増強させることができる物質の使用であって、PD-1シグナル阻害剤を投与する前、後又は同時のいずれかの時期に、TCRシグナルを増強させることができる物質が投与される前記使用も提供する。本発明は、がん、感染症又はそれらの組み合わせを予防及び／又は治療することに使用するためのT細胞受容体（TCR）シグナルを増強させることができる物質であって、PD-1シグナル阻害剤を投与する前、後又は同時のいずれかの時期に投与される前記物質も提供する。
　また、本発明は、TCRシグナルを増強させることができる物質を含む、PD-1シグナル阻害活性を増強する薬剤を提供する。本発明は、PD-1シグナル阻害剤を投与する前、後又は同時のいずれかの時期に、T細胞受容体（TCR）シグナルを増強させることができる物質を有効な量で被験者に投与することを含む、PD-1シグナル阻害活性を増強する方法も提供する。
　本発明の薬剤は、PD-1シグナル阻害剤との併用薬又は配合剤として用いることができる。PD-1シグナル阻害剤と、TCRシグナルを増強させることができる物質との併用及び合剤化については、上述した。本発明の薬剤は、医薬としての用途の他、実験試薬としても利用できる。
　さらにまた、本発明は、CD45阻害剤及び/又は細胞を含む、TCRシグナル増強剤を提供する。本発明は、CD45阻害剤及び/又は細胞を有効な量で被験者に投与することを含む、TCRシグナルを増強する方法も提供する。CD45阻害剤や細胞については上述した。本発明の薬剤は、医薬としての用途の他、実験試薬としても利用できる。TCRシグナルを増強することで、PD-1シグナル阻害剤の抗腫瘍効果が向上する他、感染症に対する治療効果の亢進などの効果が得られうる。
　以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。
〔実施例１〕
[要旨]
　CD8陽性細胞は、抗腫瘍反応において主要な役割を果たし、がん細胞を直接殺傷する。高齢者におけるCD8陽性細胞免疫の強い抑制は、がんや他の加齢性疾患に関係する。本研究は、加齢に伴うPD-1阻害治療耐性におけるT細胞機能の役割を検討した。我々は、高齢担癌マウスの所属リンパ節において、CD44lowCD62Llow CD8陽性T細胞の形成が低下することを見出した。はじめに、P4細胞はin vitro刺激によりナイーブCD8陽性T細胞から誘導され、次に、エフェクター/メモリー細胞へと分化した。P4細胞では、抗原特異的なT細胞の活性化やミトコンドリアの機能に重要な、１炭素（1C）代謝に関連する遺伝子の発現が特異的に高かった。この知見と一致して、１C代謝関連遺伝子の発現やミトコンドリア呼吸が若齢CD8陽性T細胞に比べて、高齢CD8陽性T細胞では低下していた。オブアルブミン（OVA）特異的なT細胞受容体（TCR）遺伝子を導入した高齢マウスでは、OVAを発現する腫瘍細胞の移植によるZAP-70の活性化は誘導されなかった。このTCRシグナル抑制は加齢CD8陽性細胞におけるCD45RB脱リン酸化酵素の発現上昇が原因であることが示唆された。驚くべき事に、非自己細胞の加齢PD-1欠損マウスへの移植による強い刺激は、CD45RB発現を正常レベルへと減少させ、P4細胞の誘導やCD8陽性T細胞における１炭素代謝酵素の発現、抗腫瘍活性を回復させた。これらの知見は、P4サブセットの誘導不全が加齢に伴うPD-1阻害耐性に関与することを示唆し、それらが、強いTCR刺激により回復可能なことを示す。
[Significant Statement]
　加齢は抗腫瘍免疫を抑制することが知られているにも関わらず、詳細なメカニズムはほとんど分かっていなかった。ここで我々は、前エフェクター様のT細胞であるCD44lowCD62Llow CD8陽性T細胞サブセット（P4）の形成抑制により加齢マウスにおけるPD-1阻害抗腫瘍治療に対する耐性が説明出来ることを見出した。加齢ナイーブCD8陽性T細胞におけるCD45RB発現の増加はTCRシグナルを抑制し、その結果、１C代謝遺伝子を高発現するサブセットであるP4細胞が減少する。このP4細胞の減少や抗腫瘍活性の抑制は、非自己細胞による強い免疫刺激により回復した。これらの知見は加齢に伴う抗腫瘍免疫の抑制メカニズムについての有用な洞察を提供し、高齢がん患者のための治療戦略開発のための基礎となるであろう。
[緒言]
　加齢は多くの生理機能に影響し、その結果、多様な疾病の発症に関与する。ゲノムにおける変異の蓄積やがん細胞に対する免疫監視の低下などにより、がんの危険性は加齢に伴い増加する（1, 2）。抑制された免疫機能を再活性化する免疫治療は、がん治療のために効果的な方法として登場した。様々ながん免疫治療のうちで、PD-1/PD-L1経路を遮断する抗体は様々ながん種の患者において非常に高い有効性を示した（3-6）。しかしながら、臨床試験により多くのがん患者がPD-1阻害治療に対して反応しないことが示された（7, 8）。そのような治療は、加齢マウスモデルにおいて効果が示されず、また、同様の傾向がいくつかの臨床試験で示されている（9-12）。
　免疫老化は免疫細胞における量的・質的変化により生じる。T細胞における主要な量的変化の一つは胸腺の退縮によるTCRレパトアの多様性の減少であり、末梢でのナイーブ細胞を減少させる（13-15）。加えてTCRシグナル障害、エフェクターやメモリー細胞への分化能の抑制、サイトカイン産生の減少などの機能的な障害が高齢者にいて末梢のT細胞において蓄積する（16, 17）。実際に、加齢に伴う変化は明確に定義されたCD8陽性T細胞サブセットの割合に大きく影響する（18-20）。マウスでは表面マーカーであるCD44やCD62L（L-selectin）を用いて３つの主要なCD8陽性T細胞を区別する：ナイーブ（P1とも呼ばれる；CD44lowCD62Lhigh）やセントラルメモリー（P2；CD44highCD62Lhigh）、エフェクター/メモリー（P3；CD44highCD62Llow）。ナイーブマウスにおいて残るCD44lowCD62Llow（P4）CD8陽性T細胞サブセットはとてもマイナーな集団である。ナイーブT細胞は抗原刺激によりエフェクターT細胞へと分化する（14, 21）。いくつかのエフェクター細胞はメモリー細胞へと分化し、同じ抗原刺激に対して素早く反応しエフェクター細胞への分化が可能である。高齢のヒトやマウスは、胸腺からのT細胞の産生が減少するため、T細胞を維持するために自己抗原依存的な増殖（恒常性増殖）が必要とされる（22, 23）。高齢者において、この恒常性増殖は徐々にナイーブT細胞の分化を促進し、その結果、エフェクターやメモリー細胞を含む分化したT細胞の割合を増加させる。
　T細胞の増殖や分化はT細胞受容体（TCR）シグナリングカスケードにより促進される。TCRシグナリング分子のリン酸化や脱リン酸化はシグナル複合体形成やTCRシグナルの伝播に影響を及ぼす。CD45は膜貫通型の脱リン酸化酵素であり、lymphocyte protein kinase（Lck）のチロシンのリン酸化レベルを制御することでTCRシグナルの調整において主要な役割を果たす。このLckはTCRシグナルの下流因子であるTCRzやz-chain-associated protein（ZAP）-70、the linker of activated T cells（LAT）の活性化因子として働く（24, 25）。若いナイーブCD8陽性T 細胞において、高いCD45発現はZAP-70やPLCgの脱リン酸化を介してTCRシグナル伝達が阻害される（26）。しかしながら、加齢はTCRシグナルを変動させることが知られているにも関わらず、その分子機構はほとんど明らかになっていない（27, 28）。
　活性化や増殖している細胞では、1C代謝が一般的に亢進し、プリンやチミジンの生合成やアミノ酸生産生、エピジェネティック制御や酸化還元制御を介して生存や分化を支えている（29, 30）。近年の報告により、1C代謝は初期のCD4陽性又はCD8陽性T細胞の活性化の間に、最も良く誘導される代謝経路の一つであることが示されている（31, 32）。T細胞の活性化の後、1C代謝の亢進は１Cユニット由来の新たな核酸の生合成に必要なセリンのプロセシングを促進し、それは、抗原特異的なT細胞の増殖や分化、そしてエフェクター機能に必要である。この1C代謝経路はまたミトコンドリアのtRNAメチル化によるミトコンドリアのタンパク質合成制御を介してエネルギー産生に関与している（33, 34）。ミトコンドリアの機能や1C代謝は加齢CD4陽性T細胞において若齢CD4陽性T細胞よりも低いため（35）、T細胞の加齢が1C代謝の不活性化に関与している可能性が考えられる。
　加齢に伴うPD-1阻害による抗腫瘍効果の減弱の機構を解明するために、我々は若齢と高齢のPD-1ノックアウト（KO）又は野生型（WT）由来のCD8陽性T細胞を用いて腫瘍移植あり無しでの比較を行った。我々は、高齢マウスにおけるPD-1欠損又は阻害抗腫瘍治療に対する抵抗性はP4サブセットの誘導阻害によるものであることを見出し、P4細胞がナイーブとエフェクター細胞の中間体であり1C代謝関連遺伝子を強く発現していることを明らかにした。加齢マウスにおけるこの抑制はCD45RB発現の上昇を介したTCRシグナルの抑制によるものであり、強い免疫刺激により回復可能である。これらの知見は、代謝変動や抗腫瘍活性に関係するCD8陽性T細胞サブセットにおける加齢依存的な変化に関する機構を理解する上での新たな手がかりとなるだろう。
[結果]
加齢マウスにけるCD44lowCD62Llow（P4）CD8陽性T細胞誘導の抑制
　若齢PD-1 KOマウスは強く腫瘍増殖を抑制する一方で、加齢PD-1 KOマウスでは腫瘍増殖の拒絶は見られなかった（図1A＆B）。我々はまた高齢の野生型マウスがPD-1阻害腫瘍治療に対して耐性を示すことを観察した（図６A&B）。担がん有り無しのPD-1 KOマウス由来の末梢リンパ節と所属リンパ節の細胞におけるCD8陽性T細胞サブセットの比較解析によりマイナーCD8陽性T細胞サブセットであるP4のパーセンテージが若齢マウスにおいて腫瘍移植により増加し、高齢マウスにおいては増加しないことが示された（図1C＆D）。他のCD8陽性T細胞における腫瘍移植による変化は若齢と高齢PD-1KOの両マウスにおいてP4サブセットの変化よりも小さかった（図1C＆D）。同様の結果が野生型のマウスにおいても観察された（図６C&D）。これらの結果は、P4サブセットは腫瘍拒絶の間に誘導され、PD-1阻害又は欠損で見られる抗腫瘍活性に必要である可能性が示唆された。
P4細胞はP1とP3細胞との間の中間体であり、抗腫瘍活性の潜在能力を保持する。
　P4細胞誘導の抑制が高齢マウスにおけるPD-1阻害治療耐性に関与するかどうかを調べるために、CD8陽性P4サブセットの機能的な特徴を調べた。我々ははじめに、P4細胞の抗腫瘍活性を若齢の担がんCD8 KOマウスに単離したP4細胞を移植することで検討した。TCRレパトアの偏りを防ぐために、我々はOVAペプチドに対して特異的に反応するTCRを発現するCD8陽性T細胞を保持するTCR遺伝子導入OT-1マウスを使用した。CD8陽性T細胞のP3とP4サブセットはOVAを発現するMC38腫瘍細胞（MC38-OVA）をOT-1マウスの尾静脈内に投与することにより誘導し、その５日後に脾臓から単離した。同じ数のP3又はP4細胞はMC38-OVAを移植した若齢CD8 KOマウスに養子導入された。MC38-OVA増殖はP3又はP4細胞を導入したマウスにおいて強く抑制された（図2A）。注目すべきことに、移植から６日後の末梢血において移植された全てのP4細胞はP3細胞へと分化していた（図2B）。これらの結果は、P4細胞はP3細胞へと分化することで腫瘍を拒絶する能力を保持することを示唆する。
　P1やP2細胞は活性化の間にP3細胞へと分化することが知られているが、P4細胞はその数が少ないためほとんどその特徴が明らかにされていない。どのサブセットがP4細胞の起源なのかやどのサブセットに分化するかを調べるために、P1やP2、P4細胞は若齢のPD-1 KOマウスから単離され、in vitroで抗CD3/CD28抗体とIL-2により刺激された（図2C）。in vivoの結果と一致し、単離したP4細胞はこれらの条件下では主にP3細胞へと分化した（図2D）。次に、我々はP4細胞がP1又はP2細胞から形成されるかどうかを検討した。図2Eと2Fに示すように、P4細胞はin vitro 刺激から２日後にP1細胞から形成されたが、P2細胞からは形成されなかった。これらの結果は、刺激を受けたナイーブP1 CD8陽性T 細胞はP4細胞を形成し、さらにP3細胞へと分化することを示した。in vivo実験により、P4細胞は加齢マウスにおいて誘導されないことが示されているため（図1C＆D）、我々はin vitroにおける加齢P1細胞のP4細胞を生産する能力を検討した。驚くべき事に、P4とP3細胞は抗CD3/CD28抗体とIL-2との培養の後で若齢のP1細胞と同様に高齢のP1細胞から誘導された（図2G）。これらの知見は、高齢マウス由来のP1細胞は抗CD3/CD28抗体のような強いin vitro TCR刺激によりP4細胞へと分化することが可能であるが、通常の抗原刺激では誘導されないことが示唆された。
P４細胞における１炭素代謝関連遺伝子に発現亢進
　加齢マウスにおけるP4細胞の抗腫瘍活性における役割を理解するために、我々は若齢PD-1KOマウスにおけるCD8陽性T細胞サブセット間（P1, P2, P3とP4）の遺伝子発現プロファイルを比較した。グローバルな遺伝子発現の階層的なクラスタリングはCD8陽性T細胞のそれぞれのサブセットが異なる遺伝子発現特性を持つことを示した（図3A）。活性化T細胞で発現する遺伝子は（Ctl14, Prdm1やIl2rbのような）、P1細胞よりもP4細胞でより高い発現を示した（図3B）。一方、分化したT細胞で発現する遺伝子は（Il7r, IfngやTbx21のような）、P2やP3細胞よりもP4細胞において低い発現を示した（図3B）。これらの結果は、P4細胞は、活性化しているが成熟前の状態でありP2やP3細胞のようなより分化したCD8陽性T細胞のサブセットとは異なることを示唆し、P4細胞はP1細胞由来の前エフェクター様の細胞であるという我々の仮説を支持している。
　次に、どの生物学的過程がこれらのCD8陽性T細胞において上方制御されているかどうかをしらべるために、遺伝子オントロジーエンリッチメント解析を行った。P4細胞において、最も有意に上方制御されている過程はセリン、グリシンや葉酸類似体の転換に関与する1C代謝経路に関係していた（図3C＆D）。1C代謝関係遺伝子の発現は、マイクロアレイ解析やqPCRにより示すようにP4細胞において最も高かった（図3E＆F）。これらの結果は、1C代謝経路はCD8陽性T細胞の分化の間にP4細胞において選択的に発現上昇していることを示す。
　若齢の野生型やPD-1 KOマウスのトータルCD8陽性T細胞において、腫瘍の接種は1C代謝関係遺伝子の発現を増加させ（図3G）、そのことはP4細胞の形成により説明可能であろう（図1C と図６C）。PD-1 KOマウスにおけるP4細胞誘導の高い効率と一致して（図1C と図６C）、若齢PD-1 KOマウスのCD8陽性T細胞は野生型マウスに比べて、ほとんどの1C代謝関連遺伝子はMC38腫瘍細胞接種に応答して高いレベルで発現した（図3G）。対照的に、加齢マウス由来のトータルCD8陽性T細胞におけるこれらの遺伝子発現は、マウスの遺伝子型に関係なく、腫瘍接種による明らかな変動を示さなかった。
　免疫反応の間、ミトコンドリア機能の亢進はCD8陽性T細胞の活性化に非常に強く関与する（38, 39）。P4細胞はミトコンドリアtRNA修飾の制御因子であるShmt2の高い発現を示すため、我々は1C代謝の活性化は一部、ミトコンドリアの機能を亢進させることにより抗腫瘍活性を促進させるだろうと考えた。若齢や加齢マウスにおけるミトコンドリアの活性を調べるために、我々はトータルCD8陽性T細胞における酸素消費速度（OCR）を担がん若齢と加齢マウスでの比較を行った。野生型又はPD-1 KOマウス由来の加齢CD8陽性T細胞は基礎呼吸や予備呼吸能のかなりの減少を伴うOCRの明らかな異常を示した（図3H＆I）。合わせて考えると、これらの結果は加齢マウスにおけるP4細胞誘導の欠如はCD8陽性T細胞におけるミトコンドリア機能の減少に繋がり、おそらくそれは１C代謝の活性化の抑制を介することを示唆する。
加齢マウスにおけるCD45RB発現亢進
　P4細胞はin vitro 刺激によりP1細胞から形成されることが示されたため、我々は高齢マウスで見られた腫瘍移植に伴うP4細胞誘導の低下は高齢P1細胞におけるTCRシグナルの非効率的な伝達により引き起こされうると考えた。TCRシグナルとP4細胞形成との間の関係を検討するために、我々はOT-1マウスにMC38-OVAを注射した。末梢リンパ節におけるP4細胞のパーセンテージは若齢マウスにおいて著しく増加したが、加齢マウスでは増加しなかった（図4A＆B）。TCRシグナル伝達を評価するために、我々は若齢と加齢OT-1マウス由来のCD8陽性T細胞全体におけるTCRシグナリングに重要なZAP-70のリン酸化（40）を調べた。MC38-OVA注入は若齢マウスにおけるリン酸化ZAP-70を発現するCD8陽性T細胞の割合を増加させた（図4C）。このことは抗原刺激によるTCRシグナルの活性化は高齢OT-1マウスにおいて阻害されていることを示唆している。注目すべきことに、顕著な違いがOVA特異的なMHCテトラマーの強度において見られなかったため（図７A&B）、若齢や高齢マウスのOT-I T細胞のTCR発現レベル・結合力に違いが無い事が示された。そのため、加齢マウスで見られた抗原刺激によるTCRシグナルの活性化の阻害はTCRとMHC/抗原との相互作用以外の機構が関与するだろうと考えられる。
　ナイーブCD8陽性T細胞のTCR刺激に対する反応は細胞表面のCD45の密度が高い細胞において弱くなることから（26）、我々はマウスのナイーブやメモリーT細胞において主に発現するCD45のアイソフォームであるCD45RBの発現レベルを解析した。CD8陽性T細胞全体におけるCD45RB発現は加齢OT-1マウスで若齢OT-1マウスよりも著しく高かった（図4D）。CD45RB発現における加齢の影響は、P1やP4細胞においてP2やP3細胞よりも大きかった（図4D）。同様に、最も高いCD45RB発現の増加が加齢の野生型やPD-1 KOマウスのP1細胞において観察され（図８A&B）、P4細胞誘導の阻害はP1細胞におけるCD45RB発現上昇による可能性が示唆された。 CD45RB発現がTCRシグナル伝達によるCD8陽性T細胞の活性化を抑制するかどうかを調べるために、我々はCD45特異的な阻害剤処理後のOT-I CD8陽性T細胞におけるZAP-70のリン酸化を評価した。in vivo の結果と同様に、p-ZAP-70陽性CD8陽性T細胞に割合は若齢CD8陽性細胞において増加したが加齢CD8陽性T細胞では増加しなかった（図4E）。この条件下で、CD45阻害剤の添加は加齢CD8陽性細胞において若齢と同様にp-ZAP-70陽性細胞の誘導を増加させた。これらのデータは加齢に伴う腫瘍拒絶抑制は加齢CD8陽性T細胞におけるCD45RBの発現増加が原因である可能性を示す。
異種細胞治療は加齢マウスにおけるP4細胞誘導を促進させ、CD8陽性T細胞の抗腫瘍能を回復させる。
　上記に示すように、加齢マウスにおけるP1からP4への移行の抑制が強いin vitro刺激により回復することから、我々は異種細胞（ヒトバーキットリンパ腫、Daudi細胞）を用いた強い刺激が加齢PD-1 KOマウスにおけるP4 CD8陽性T細胞の誘導を回復させることができるかどうかを調べた（図5A）。Daudi細胞の尾静脈注射から１０日後（day 0:　MC38腫瘍細胞移植前）、P4細胞の割合は若齢と加齢PD-1 KOマウスの末梢リンパ節において強く増加したが、P1からP3細胞の割合は有意には増加しなかった（図5B）。予想通りに、加齢PD-1 KOマウス由来のCD8陽性T細胞において、1C代謝関連遺伝子の発現レベルはDaudi細胞の注入により増加した（図5C）。これらの知見と一致して、Daudi細胞注入は加齢PD-1 KOマウス由来のP1細胞におけるCD45RBの発現を減少させた（図5D）。
　Daudi細胞注入は加齢マウスにおけるMC38腫瘍増殖を強く抑制し、生存期間を延長させた（図5E&F）。野生型マウスにおける加齢に伴う抗PD-L1抗体に対する不応答性もまたDaudi細胞注入により回復した（図９A-E）。腫瘍移植から６日後、p-ZAP-70陽性細胞の割合は、Daudi細胞を注入したPD-1 KOマウスにおいて増加したことから（図5G）、異種刺激は腫瘍抗原に対するTCRシグナルを増強させることが示唆された。我々はさらに、Daudi細胞治療が腫瘍抗原反応性のCD8陽性T細胞の増殖を亢進させるかどうかを調べた。MC38-OVA細胞はDaudi細胞注入から１０日後にPD-1 KOマウスに移植し、OVAテトラマー陽性CD8陽性T細胞の出現をモニターした。OVAテトラマー陽性CD8陽性T細胞の割合は、加齢PD-1 KOマウスの所属リンパ節や腫瘍組織においてDaudi細胞の注入により増加したことから（図5H&I）、この治療は結果として抗原特異的なCD8陽性T細胞の誘導を増加させることが示された。Daudi細胞による前刺激が加齢マウスのCD8陽性T細胞におけるP4細胞誘導や1C代謝を亢進させると仮定するならば、Daudi細胞注入が基礎呼吸や予備呼吸能の両方を増加させたことは妥当な結果だろう（図１０A-C）。また、アロ抗原としてBalb/cマウス由来の脾細胞の注入も加齢野生型マウスにおけるPD-1阻害治療の抗腫瘍効果を亢進させた（図１１A-D）。これらのデータは異種又はアロ細胞治療による強い免疫刺激は加齢マウスおいて阻害されたCD8陽性T細胞の抗腫瘍反応を回復させ、PD-1欠損又は阻害の抗腫瘍効果を改善させることを示唆する。まとめると、これらの知見は、非自己の細胞による強い免疫刺激はTCRシグナル伝達の回復やP4サブセットの誘導を介して加齢マウスにおける不十分な抗腫瘍反応を回復させ、それは、PD-1欠如や阻害治療の効果を亢進させることを示す。
[考察]
　高齢者や加齢動物は加齢に伴うCD8陽性T細胞反応の抑制により免疫治療に対して不応答性を示すことが知られている（9-11）。CD8陽性T細胞の腫瘍抗原に対する反応抑制のメカニズムはほとんど分かっていない。我々は、高齢担がんマウスがCD45RB発現の増加によりTCRシグナルが減弱させられているため、P4細胞が少ないことを見出した。このP4細胞の特徴はこれまでに分かっていなかった。P4サブセットはナイーブP1サブセットから分化し、そして、抗腫瘍活性に重要なエフェクター/メモリーサブセット（P3）へと成熟する（42, 43）。P4サブセットは発達や増殖細胞の生存と関係する1C代謝関連遺伝子の発現が高いという特徴を示す（29, 32, 44, 45）。これらの加齢に伴うCD8陽性T細胞の分化やPD-1阻害治療効果の阻害は非自己の細胞を用いた強い免疫刺激により回復する。
　加齢に伴うナイーブT細胞レパトアの偏向は高齢者におけるT細胞反応の抑制の主な原因であると提唱されてきた（46, 47）。しかしながら、我々は全てのCD8陽性T細胞がOVA特異的なTCRを持つOT-1遺伝子導入マウスが、加齢に伴い腫瘍細胞に発現する特異的な抗原に対して非感受性を示すことを見出した。我々の研究はさらに、インビトロ又はインビボでの異種細胞治療による強いTCR刺激がP4細胞誘導を回復させることを明らかにした。同様に、OVA特異的なTCRを発現する加齢OT-II CD4陽性T細胞において見られる抗腫瘍反応の障害が加齢に伴うIL-6増化によるTh1分化阻害により引き起こされる（48）。これらの結果は、レパトア制限は高齢動物におけるT細胞反応抑制の主な原因ではない可能性を示した。
　これまでに、TCRシグナリングが加齢に伴い抑制され、細胞応障害を引き起こされることが報告されている（49, 50）。T細胞活性化によるp-ZAP-70レベルの増加は高齢者や加齢マウスにおいて減少する（51, 52）。これらの報告と一致して、我々はまたZAP-70のリン酸化が腫瘍細胞を移植した加齢マウスにおいて低いことを見出した。我々のデータはこの変化は加齢P1細胞におけるCD45RB発現の増加によって起きることを示した。CD45はチロシンリン酸化酵素であるLckの394番目のチロシンの脱リン酸化することでTCRシグナリングを負に制御し、ZAP-70の活性化の抑制を引き起こす（53）。実際に、p-ZAP-70陽性CD8陽性T細胞の誘導はCD45阻害剤の処理により回復した。これらの結果は、加齢動物におけるCD8陽性T細胞反応の阻害はCD45RBの発現増加を介したナイーブT細胞におけるTCRシグナリング欠損によって引き起こされるという仮説を強く支持する。
　多くのT細胞はアロ又は異種MHC分子により直接的（例、ドナーMHCが提示するドナーペプチド）又は間接的に（例、レシピエントMHCが提示するドナーペプチド）活性化される（54-56）。我々は、加齢マウスにおけるP4細胞の回復は非自己抗原のTCR認識によると推測する。TCRは本来、広い範囲の異なるペプチドを認識するため（57, 58）、非自己抗原により回復したP4細胞又はプレ活性化P1細胞は腫瘍抗原に交差反応し、抗腫瘍反応の増加に繋がる。我々のデータはまた異種細胞治療は加齢マウスのCD8陽性T細胞におけるCD45RB発現を減少させるポテンシャルを保持することを示唆する。CD45RB発現が加齢や非自己細胞により制御される分子メカニズムを明らかにするために更なる研究が必要とされる。
[材料及び方法]
マウスと細胞
　全てのマウスは京都大学大学院医学部動物実験施設又は理化学研究所生命科学研究センターにおいて、実験の障害になるような特定の病原体が存在しないSPF環境下で飼育され、適切な実験ガイドラインのもとで使用された。PD-1-/-（PD-1KO）マウスは相同組換えにより当研究室で作製したものを使用した（59）。C57BL/6野生型マウスはCharles River Laboratories Japanより入手した。OT-1 TCR遺伝子導入やCD8-/-（CD8 KO）マウスはThe Jackson Laboratory （Bar Harbor, Maine USA）から購入した（ワシントンメディカルセンターのM. B. Bevan又はトロント大学のT. Makにより寄託された）。マウス大腸がん（MC38）細胞系はJ. P. Allison、Memorial Sloan-Kettering Cancer（New York, NY）により譲渡され、オブアルブミン（OVA）発現MC38細胞はpMXs-based OVA-F2A-EGFOレトロウイルスによるMC38の形質転換により作製された。細胞は10%の非動化したウシ胎児血清および1%ペニシリン-ストレプトマイシン(Nacalai Tesque; 26253-84) を含むRPMI 1640 (Gibco; 11875-093) を用いて、マイコバクテリア感染の無い状況下で培養を行った。
マウス治療モデル
　MC38細胞は（5 × 105 又は 2 × 106）、マウスの右腹部の皮内に移植された（day 0）。MC38細胞移植から５日後（day 5）、それらのマウスは抗PD-L1抗体(clone 1-111A.4, 京都大学大学院医学研究科免疫ゲノム医学研究室にて作製・保管（Immunology Letters 84(2002) 57-62) (6 mg/kg)を腹腔内に投与された。この抗PD-L1抗体投与は、６日毎に３回繰り返された（day 5, 11, and 17）。抗PD-L1抗体のアイソタイプ（Rat IgG2a）はコントロールとして使用された。腫瘍増殖は測径器を使用した腫瘍サイズの計測によりモニターされ、体積は、π (縦 × 横 × 高さ)/6の式により算出した。非自己細胞の移入は腫瘍細胞移植１０日前にバーキットリンパ腫Daudi細胞又はマイトマイシンC（MMC）処理をしたBALB/c又はコントロールとしてのC57BL/6N由来の脾細胞（2 × 106細胞/マウス）の尾静脈からの注射により行った
解析や培養のための細胞単離
　末梢や所属リンパ節細胞や腫瘍浸潤リンパ球は以前記述したように単離した（３９）。脾細胞解析のために、脾臓は手早くほぐされ、赤血球を溶解させるために塩化アンモニウムカリウム溶液に懸濁された。脾細胞は洗浄され、10% ウシ胎児血清、L-グルタミン、55 μM 2-メルカプとエタノール、ペニシリン-ストレプトマイシン、1 mM ピルビン酸ナトリウム（Gibco）、1% MEM非必須アミノ酸溶液（Gibco）を含むPRMI 1640内溶液（T細胞培養液）に再懸濁された。我々はさらに、CD8陽性T細胞のサブセットをCD8a（Ly-2）マイクロビーズ（Miltenyi Biotec; 130-117-044）とFACSAria（BD Biosciences）により単離した。末梢血細胞の解析のために、集めた末梢血細胞は塩化アンモニウムカリウム溶液で処理され、T細胞培養液により洗浄された。精製された細胞は、抗CD3/28 Dynabeads（Gibco）とリコンビナントヒトIL-2（20 U/mL; PeptoTech）を加えたT細胞培養液で刺激された。MC38-OVA細胞を用いてCD8陽性T細胞を刺激するために、OT-1マウスのリンパ節から単離されたCD8陽性T細胞はT細胞培養液中でMMC処理をしたMC38-OVA細胞と共培養された。刺激から１日後に、その細胞は0.05 μM CD45阻害剤VI（EDM Millipore）で１時間、処理された。
フローサイトメトリー解析
　解析のために以下の抗体を使用した。CD3 (クローン145-2C11)とCD8 (クローン53-6.7)（Invitrogen）; phospho-ZAP70/Syk（クローンn3kobu5）（Invitrogen）、CD45.1（クローンA20）、CD45.2（クローン104）、CD44 (クローンIM7)と CD62L (クローンMEL-14) （TONBO biosciences又はBioLegend）; CD8 (クローンKT15、MBL Life Science); CD45RB (クローン16A、BD Pharmingen)。H2Kb Negative（SIY）Tetramer-SIRYYGL-APCとH-2Kb OVA Tetramer-SINFEKL-APC（TS-M008-2）はMBL Life Scienceフローサイトメトリー解析は、FACSCant II (BD Biosciences) と FlowJo software (FlowJo LLC)を用いて行った。
CD8 KOとOT-1マウスモデル
　P3とP4細胞を誘導するために、MC38-OVA細胞（1-2 × 106）はOT-1マウスに尾静脈注射により移入された。その５日後にP3とP4細胞はそれらのマウスから単離された。それぞれの単離されたCD8陽性T細胞は５日前に2 × 105のMC38-OVA細胞を皮内移植されたCD8 KOマウスの尾静脈より注入された。末梢血はそれから６日後に移植した細胞の分化を解析するために取得された。
マイクロアレイ解析
　トータルRNAは３から６匹を統合したトータルCD8陽性T細胞又は９匹を統合したCD8陽性T細胞サブセットからNucleospin RNA（Macherey-Nagel）を使用して生産者のプロトコールに従い抽出した。マイクロアレイ解析はマクロジェン株式会社によりマウス 8×60K v2マイクロアレイを使用して行われた。データはthe GEO repositoryに関連番号GSE161659とGSE161660として登録された（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）。Gene ontology enrichment解析は、Annotation, Visualization, and Integrated Discovery（DAVID; http://david.abcc.ncifcrf.gov/）のためのデータベースを用いて行われた。遺伝子発現変動はR3.1.2又はRStudio version 1.1.383を用いて可視化された。
リアルタイムPCR
　トータルRNAは細胞からNucleospin RNA（Macherey-Nagel）を使用して抽出し、製造者のマニュアルに沿ってRevatraAce逆転写酵素（Toyobo）とランダムプライマーを用いたcDNA合成のために使用された。リアルタイムPCRはthe Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCT system（ABI）とPowerUp SYBR Green Master Mix（Applied Biosystems）を用いて示したmRNAを増幅するために行った。それぞれの遺伝子の発現レベルはβ-actinのmRNAレベルでノーマライズした。プライマー配列は以下の通りである：Shmt1 forward (Fw), 5’-CCAGAGTGCTGTGGCAACTC-3’（配列番号１）; Shmt1 reverse (Rv), 5’-GCAAACACAGGCTGTTCCTG-3’ （配列番号２）; Shmt2 Fw, 5’-GACAGTTGAGGACACCTGGC-3’ （配列番号３）; Shmt2 Rv, 5’-CCAGAGAGGAGTGACATCTC-3’ （配列番号４）; Phgdh Fw, 5’-TGGCCTCGGCAGAATTGGAAG-3’ （配列番号５）; Phgdh Rv, 5’-TGTCATTCAGCAAGCCTGTGGT-3’ （配列番号６）; Psat1 Fw, 5’-GATGAACATCCCATTTCGCATTGG-3’ （配列番号７）; Psat1 Rv, 5’-GCGTTATACAGAGAGGCACGAATG-3’ （配列番号８）; β-actin Fw, 5’-TAAGGCCAACCGTGAAAG-3’ （配列番号９）; and β-actin Rv, 5’-GAGGCATACAGGGACAGCAC-3’ （配列番号１０）。
酸素消費速度（OCR）解析
　OCRアッセイは若干の改良をし、以前の記述に従い行った（39）。所属リンパ節から単離したCD8陽性T細胞の酸素消費速度はthe Seahorse XFe96 Extracellular Flux assay kit and Seahorse XF Cell Mito Stress test kit（Agilent Technologies）を使用してXFe96 Extracellular Flux analyzer（Agilent Technologies）で解析された。CD8陽性T細胞は（3 × 105/ウェル）Cell-Tak（Corning）でコートしたXFe96プレートに播種された。予備呼吸能はOCRグラフから以前に記述したように算出された（60）。基礎呼吸は非ミトコンドリア呼吸との引き算によって（オリゴマイシン添加前の値からロテノン/アンチマイシンA添加後の値）算出された（61）。
統計解析
　データはPrism 7 (Graph pad)を用いて解析し、結果は平均値±標準誤差として表される。二つの群を比較する場合は、スチューデントの検定（独立２群の両側検定）を行った。二つ以上の群を比較する場合、統計的有意性は一元配置分散分析（ANOVA）を用いて複数群について評価し、次に多重比較（Tukey’s post hoc test）により差を評価した。生存率はカプラン・マイヤー法により評価し、統計的有意性はログ・ランク検定により決定された。
データ利用可能性
　全てのシークエンスデータはNCBI GEOにアクセッションID GSE161659 and GSE161660として登録されている。
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〔実施例２〕
[材料及び方法]
マウスと細胞
　全てのマウスは京都大学大学院医学部動物実験施設において、実験の障害になるような特定の病原体が存在しないSPF環境下で飼育され、適切な実験ガイドラインのもとで使用された。C57BL/6はCharles River Laboratories Japanより入手した。PD-1-/-（PD-1KO）マウスは相同組換えにより当研究室で作製したものを使用した（西村らの文献参照）(11)。マウス大腸がん由来のMC38細胞はJ. P. Allison, Memorial Sloan-Kettering Cancer (New York, NY)から譲り受けた。ルイス肺癌由来のLLC細胞は、American Type Culture Collection（ATCC）より購入した。細胞は10%の非動化したウシ胎児血清および1%ペニシリン-ストレプトマイシン(Nacalai Tesque; 26253-84) を含むRPMI 1640 (Gibco; 11875-093) を用いて、マイコバクテリア感染の無い状況下で培養を行った。
マウス治療モデル
　CD45阻害（図１２）：2-(4-Acetylanilino)-3-chloronaphthoquinone（211） (530197, EDM Millipore) (12) (3 mg/kg)又はN-(9,10-Dioxo-9,10-dihydrophenanthren-2-yl)-2,2-dimethylpropionamide（PTP） (540215, Sigma-Aldrich) (13) (3 mg/kg)は腫瘍細胞移植の前又は後（５又は７日後）にマウスの腹腔内に投与された。MC38細胞（5 × 105 又は 1 × 106）又はLLC細胞（2 × 106）は、マウスの右腹部の皮内に移植された（day 0）。LLC細胞移植から７日後（day 7）、それらのマウスは抗PD-L1抗体(clone 1-111A.4) (2 mg/kg)を腹腔内に投与された。この抗PD-L1抗体投与は、６日毎に３回繰り返された（day 7, 13, and 19）。腫瘍体積は測径器により計測し、π (縦 × 横 × 高さ)/6の式により算出した。
統計解析
　データはPrism 7 (Graph pad)を用いて解析した。二つ以上の群を比較する場合、統計的有意性は一元配置分散分析（ANOVA）を用いて複数群について評価し、次に多重比較（Tukey’s post hoc test）により差を評価した。二つの群を比較する場合は、Student-T検定を行った。
CD45阻害剤のPD-1シグナル阻害による抗腫瘍効果の亢進効果の検討
　本実施例では、CD45阻害剤として2-(4-Acetylanilino)-3-chloronaphthoquinone（211）又はN-(9,10-Dioxo-9,10-dihydrophenanthren-2-yl)-2,2-dimethylpropionamide（PTP）を用い、PD-1シグナル阻害との併用による腫瘍増殖抑制効果を検討した（図１２）。
　PD-1 KOマウス（２ヶ月齢）の腹腔内にMC38マウス大腸がん細胞の移植３日前に一度（前投与）又は移植から５日後に３回（後投与）CD45阻害剤211を3 mg/kgの割合で投与した（図１３A & B）。MC38細胞は1 ×106/腫瘍の割合でマウスの右腹側に皮内移植した。その結果、溶媒のみを投与したコントロール群に比べて、211をMC38移植の前又は後に投与した群では、有意に腫瘍体積が減少していた（図１４A & B）。これらの結果から、CD45阻害はPD-1シグナル阻害による抗腫瘍効果を亢進させることが示唆された。
CD45阻害剤の加齢に伴うPD-1シグナル阻害耐性に対する改善効果の検討
　若齢（１～２ヶ月齢）又は高齢（１４～１６ヶ月齢）のPD-1 KOマウスの腹腔内にCD45阻害剤211を3 mg/kgの割合で投与した。211の投与から３日後に、MC38細胞を5×105/腫瘍の割合でマウスの右腹側に皮内移植し、腫瘍増殖を検討した。その結果、若齢PD-1 KOマウスで見られた腫瘍増殖の抑制は、高齢PD-1 KOマウスでは全く見られず、PD-1シグナル阻害耐性を示すことが明らかになった（図１５A & B）。一方で、加齢マウスに211を投与した場合は、強く腫瘍増殖が抑えられた（図１５A & B）。これらの結果から、CD45阻害は加齢に伴うPD-1シグナル阻害耐性を示す腫瘍の増殖を抑制させることが示された。
CD45阻害剤のPD-1シグナル阻害耐性を示すがんに対する改善効果の検討
　若齢（１～２ヶ月齢）の野生型マウスの皮内にLLC細胞を2×106/腫瘍の割合でマウスの右腹側に移植した（図１６A）。その７日後から、抗PD-L1抗体単独又はCD45阻害剤（211又はPTP）との併用治療を行い、腫瘍増殖を検討した（図１６A）。その結果、抗PD-L1単独治療ではほとんどみられなかった腫瘍抑制効果が、CD45阻害剤との併用治用により腫瘍増殖が有意に抑制された（図１６B & C）。これら２種類のCD45阻害剤のどちらも、同様に抗PD-L1抗体との併用治療により腫瘍増殖に対する抑制効果を示した（図１６B & C）。さらに、CD45阻害剤の単独治療効果を同様の条件下で検討した結果、LLC腫瘍増殖に対して有為な抑制効果を示さなかった（図１６D & E）。これらの結果から、CD45阻害はPD-1シグナル阻害治療の効果を亢進させることで不応答性を示すがんの進行を抑制させる可能性が示された。
〔実施例３〕
　若齢(6週齢)のC57BL/6マウスにMC38がん細胞を皮内注射した（5x10^5個）。9、16、23日後に抗PD-L1抗体（clone 1-111A.4）（1.5 mg/kg）を腹腔内投与し、それに加え、マイトマイシンCで処理したBalb/cの(同種異系)脾臓細胞（5x10^5個/マウス or 2x10^6個/マウス）を(A) 6日後に1回のみ、(B) 9日後に１回のみ、または(C) 9、16、23日後に計3回、静注し腫瘍サイズの経時的変化を測定した（図１８）。各折れ線グラフにおける点は5ないし6マウスの平均値であり、エラーバーは標準誤差である。＊はp値が0.05未満、n.s.は有意差が無いことを意味する(one-way ANOVA後のTukey検定による比較)。この結果、同種異系細胞を3回投与した方が１回よりも免疫チェックポイント阻害剤との併用効果が高いことがわかった。
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　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
　本発明の医薬組成物は、抗がん剤、感染症治療剤又はそれらの組み合わせとして利用できる。
＜配列番号１～１０＞
プライマーの塩基配列を示す。

Claims (13)

  1. T細胞受容体（TCR）シグナルを増強させることができる物質を含み、PD-1シグナル阻害剤を投与する前、後又は同時のいずれかの時期に投与する、医薬組成物。
  2. TCRシグナルを増強させることができる物質が、CD45阻害剤及び/又は細胞である請求項１記載の医薬組成物。
  3. CD45阻害剤が、2-(4-Acetylanilino)-3-chloronaphthoquinone、N-(9,10-Dioxo-9,10-dihydrophenanthren-2-yl)-2,2-dimethylpropionamide及びそれらの類似物からなる群より選択される少なくとも１つの化合物である請求項２記載の医薬組成物。
  4. 細胞が、ゼノ細胞、アロ細胞又はそれらの組み合わせである請求項２記載の医薬組成物。
  5. PD-1シグナル阻害剤が抗体である請求項１～４のいずれかに記載の医薬組成物。
  6. 抗体が、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体及び抗PD-L2抗体からなる群より選択される少なくとも１つの抗体である請求項５記載の医薬組成物。
  7. 抗がん剤、感染症治療剤又はそれらの組み合わせとして使用される請求項１～６のいずれかに記載の医薬組成物。
  8. CD45阻害剤及び/又は細胞を含む、PD-1シグナル阻害活性増強剤。
  9. CD45阻害剤及び/又は細胞を含む、TCRシグナル増強剤。
  10. PD-1シグナル阻害剤を投与する前、後又は同時のいずれかの時期に、T細胞受容体（TCR）シグナルを増強させることができる物質を有効な量で被験者に投与することを含む、がん、感染症又はそれらの組み合わせを予防及び／又は治療する方法。
  11. PD-1シグナル阻害剤を投与する前、後又は同時のいずれかの時期に、T細胞受容体（TCR）シグナルを増強させることができる物質を有効な量で被験者に投与することを含む、PD-1シグナル阻害活性を増強する方法。
  12. CD45阻害剤及び/又は細胞を有効な量で被験者に投与することを含む、TCRシグナルを増強する方法。
  13. がん、感染症又はそれらの組み合わせを予防及び／又は治療することに使用するためのT細胞受容体（TCR）シグナルを増強させることができる物質であって、PD-1シグナル阻害剤を投与する前、後又は同時のいずれかの時期に投与される前記物質。
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