WO2022181532A1 - ミオスタチンのスプライシングバリアントを発現させる核酸医薬 - Google Patents

ミオスタチンのスプライシングバリアントを発現させる核酸医薬 Download PDF

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WO2022181532A1
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salt
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雅文 松尾
和宏 前田
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    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid drug that expresses a splicing variant of myostatin.
  • Myostatin is a TGF beta-type cell growth factor, a protein encoded by the myostatin gene. Myostatin has the effect of suppressing proliferation and hypertrophy of muscle cells. Therefore, inhibition of myostatin function is attracting attention as a therapeutic target for muscle atrophy because it promotes proliferation and hypertrophy of muscle cells (Non-Patent Document 1). In addition, the decrease in the expression level of myostatin inhibits the proliferation of cancer cells (Non-Patent Document 2). This suggests that reduction of myostatin levels and inhibition of myostatin signaling are effective in cancer therapy.
  • Non-Patent Document 3 shows that inhibition of myostatin signaling is effective in suppressing diabetes and inhibiting its progression.
  • Non-Patent Documents 4 and 5 antibodies against myostatin or antisense oligonucleotides (ASO) that control the splicing of the myostatin gene to produce loss-of-function mRNA have been developed. However, a clinically useful myostatin inhibition method has not yet been established.
  • ASO antisense oligonucleotides
  • the purpose of the present invention is to provide a method for inhibiting the function of myostatin.
  • the myostatin (MSTN) gene has a simple structure with three exons. It was thought that only one type of mRNA was produced from the MSTN gene, but the inventors discovered that a cryptic splice site in the 3' untranslated region of this gene is activated, resulting in the production of a new splicing variant mRNA. was previously clarified (WO2020/179571). Furthermore, we revealed that this mRNA-encoded isoform has a myostatin inhibitory effect. This time, we searched for nucleic acid drugs that change the splicing pattern of the human myostatin gene and promote the production of novel mRNAs.
  • the gist of the present invention is as follows. (1) an antisense oligonucleotide having a nucleotide sequence complementary to the target sequence of exon 3 of the myostatin gene and having a length of 15 to 30 bases and capable of expressing a splicing variant of myostatin, a salt thereof, or Solvate.
  • the nucleotide sequence of exon 3 of the myostatin gene is the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1
  • the target sequence of exon 3 of the myostatin gene is the sequence of the region of nucleotide numbers 10 to 33 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1
  • the antisense oligonucleotide according to (1) whose nucleotide sequence is the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, or a salt or solvate thereof.
  • the nucleotide sequence of the antisense oligonucleotide is any of SEQ ID NOs: 24, 30, 31, 27, 32, 33, or 28 (where t in the sequence may be u, and u may be The antisense oligonucleotide according to (1) or (2) comprising a sequence consisting of at least 15 consecutive bases in (may be t), or a salt or solvate thereof.
  • the antisense oligonucleotide, salt or solvate thereof according to any one of (1) to (3), wherein the antisense oligonucleotide has a base length of 18.
  • the nucleotide sequence of the antisense oligonucleotide is any of SEQ ID NOS: 24, 30, 31, 27, 32, 33 or 28 (where t in the sequence may be u, and u may be t), the antisense oligonucleotide according to (4), or a salt or solvate thereof.
  • a medicament comprising the antisense oligonucleotide according to any one of (1) to (8), or a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof.
  • the medicament according to (9) for preventing and/or treating conditions and/or diseases associated with myostatin.
  • the medicament according to (10), wherein the condition and/or disease associated with myostatin is muscle atrophy.
  • the medicament according to (11), wherein the muscular atrophy is at least one selected from the group consisting of muscular dystrophy, myopathy, spinal muscular atrophy, sarcopenia and disuse muscular atrophy.
  • the pathology and/or disease associated with myostatin is a pathology and/or disease for which muscle mass recovery is therapeutically effective.
  • the condition and/or disease for which muscle mass recovery has a therapeutic effect is at least one selected from the group consisting of cancer cachexia, diabetes, cardiovascular disease, renal disease and bone disease (13) Medication as indicated.
  • a food comprising the antisense oligonucleotide according to any one of (1) to (8) and a food-acceptable salt or solvate thereof.
  • a feed comprising the antisense oligonucleotide according to any one of (1) to (8) and a feed-acceptable salt or solvate thereof.
  • a drug for promoting proliferation and/or hypertrophy of muscle cells comprising the antisense oligonucleotide, salt or solvate thereof according to any one of (1) to (8).
  • a drug for increasing muscle mass and/or suppressing muscle loss comprising the antisense oligonucleotide, salt or solvate thereof according to any one of (1) to (8).
  • a drug that reduces myostatin signaling comprising the antisense oligonucleotide, salt or solvate thereof according to any one of (1) to (8).
  • An anticancer agent comprising the antisense oligonucleotide, salt or solvate thereof according to any one of (1) to (8).
  • treating pathologies and/or diseases associated with myostatin comprising administering an effective amount of the antisense oligonucleotide, salt or solvate thereof according to any one of (1) to (8) to a subject; Methods of prevention and/or treatment.
  • Promoting muscle cell proliferation and/or hypertrophy comprising administering an effective amount of the antisense oligonucleotide, salt or solvate thereof according to any one of (1) to (8) to a subject how to.
  • Splicing of myostatin from myostatin to a splicing variant of myostatin comprising administering to a subject an effective amount of the antisense oligonucleotide, salt or solvate thereof according to any one of (1) to (8).
  • a method of reducing myostatin signaling comprising administering an effective amount of the antisense oligonucleotide, salt or solvate thereof according to any one of (1) to (8) to a subject.
  • a method for preventing and/or treating cancer comprising administering an effective amount of the antisense oligonucleotide, salt or solvate thereof according to any one of (1) to (8) to a subject. .
  • the ASO of the present invention modifies the splicing of the MSTN gene, promotes the production of splicing variants, and induces the expression of new isoforms of myostatin.
  • This new isoform has already been patented as a myostatin inhibitory protein (WO2020/179571). Therefore, the ASOs of the present invention are new myostatin inhibitors.
  • By administering the ASO of the present invention to humans it becomes possible to inhibit the function of myostatin and prevent/treat muscle atrophy. Specifically, it can be applied to the treatment of diseases such as muscular dystrophy and myopathy, in which muscle atrophy is the main symptom. Furthermore, it can be applied to the prevention of sarcopenia, cancer cachexia, and diabetes, as well as the treatment and prevention of a wide range of pathological conditions and diseases for which the therapeutic effect of muscle mass recovery is expected.
  • Myostatin signaling can be inhibited by promoting production of myostatin splice variants and inducing expression of isoforms of myostatin.
  • MSTN_Ex3_BP MSTN_Ex3_SS, MSTN_Ex3_Fox1, MSTN_Ex3_LESE12, MSTN_Ex3_LESE3, MSTN_Ex3_LESE4
  • A Recognition positions of six ASOs for intron 2 and exon 3 of MSTN pre-mRNA.
  • B Human rhabdomyosarcoma cells (CRL-2061) were transfected with ASOs, and the results of RT-PCR of MSTN mRNA, MSTN-b mRNA, and GAPDH mRNA are shown. w/o without ASO treatment.
  • a black arrowhead indicates MSTN
  • a white arrowhead indicates MSTN-b.
  • the graph shows the ratio of MSTN-b/total MSTN.
  • ASO MSTN_Ex3_Fox1+6, MSTN_Ex3_Fox1+4, MSTN_Ex3_Fox1+2, MSTN_Ex3_Fox1, MSTN_Ex3_Fox1-2, MSTN_Ex3_Fox1-4, MSTN_Ex3_Fox1-6) effectiveness comparison.
  • A Recognition positions of seven ASOs for exon 3 of MSTN pre-mRNA.
  • A Recognition positions of seven ASOs for exon 3 of MSTN pre-mRNA.
  • B Human rhabdomyosarcoma cells (CRL-2061) were transfected with ASOs, and the results of RT-PCR of MSTN mRNA, MSTN-b mRNA, and GAPDH mRNA are shown. w/o without ASO treatment. A black arrowhead indicates MSTN, and a white arrowhead indicates MSTN-b. The graph shows the ratio of MSTN-b/total MSTN. The results of three independent experiments were summarized. *P ⁇ 0.05.
  • ASO Comparison of effectiveness of ASO (MSTN_In2_4, MSTN_In2_3, MSTN_In2_2, MSTN_Ex3_BP, MSTN_Ex3_SS, MSTN_Ex3_7, MSTN_Ex3_Fox1).
  • A Recognition positions of seven ASOs for intron 2 and exon 3 of MSTN pre-mRNA.
  • B Human rhabdomyosarcoma cells (CRL-2061) were transfected with ASOs, and the results of RT-PCR of MSTN mRNA, MSTN-b mRNA, and GAPDH mRNA are shown. w/o without ASO treatment.
  • a black arrowhead indicates MSTN
  • a white arrowhead indicates MSTN-b.
  • the graph shows the ratio of MSTN-b/total MSTN.
  • the results of three independent experiments were summarized. **P ⁇ 0.01. Comparison of effectiveness of ASO (MSTN_Ex3_7+6, MSTN_Ex3_7+3, MSTN_Ex3_7, MSTN_Ex3_7-3, MSTN_Ex3_7-6, MSTN_Ex3_7-9).
  • A Recognition positions of six ASOs for exon 3 of MSTN pre-mRNA.
  • B Human rhabdomyosarcoma cells (CRL-2061) were transfected with ASOs, and the results of RT-PCR of MSTN mRNA, MSTN-b mRNA, and GAPDH mRNA are shown. w/o without ASO treatment.
  • a black arrowhead indicates MSTN
  • a white arrowhead indicates MSTN-b.
  • the graph shows the ratio of MSTN-b/total MSTN.
  • Comparison of effectiveness of ASO MSTN_Ex3_7, MSTN_Ex3_7-1, MSTN_Ex3_7-2, MSTN_Ex3_7-3, MSTN_Ex3_7-4, MSTN_Ex3_7-5, MSTN_Ex3_7-6, MSTN_Ex3_7-7, MSTN_Ex3_7-8, MSTN_Ex3_7-9).
  • A Recognition positions of five ASOs for exon 3 of MSTN pre-mRNA.
  • B Human rhabdomyosarcoma cells (CRL-2061) were transfected with ASOs, and the results of RT-PCR of MSTN mRNA, MSTN-b mRNA, and GAPDH mRNA are shown. w/o without ASO treatment. A black arrowhead indicates MSTN, and a white arrowhead indicates MSTN-b. The graph shows the ratio of MSTN-b/total MSTN. The results of three independent experiments were summarized. ***P ⁇ 0.001. Comparison of effectiveness of ASO (MSTN_Ex3_13, MSTN_Ex3_14, MSTN_Ex3_15).
  • A Recognition positions of three ASOs for exon 3 of MSTN pre-mRNA.
  • B Human rhabdomyosarcoma cells (CRL-2061) were transfected with ASOs, and the results of RT-PCR of MSTN mRNA, MSTN-b mRNA, and GAPDH mRNA are shown. w/o without ASO treatment. A black arrowhead indicates MSTN, and a white arrowhead indicates MSTN-b. The graph shows the ratio of MSTN-b/total MSTN. The results of three independent experiments were summarized. Comparison of effectiveness of ASO (MSTN_Ex3_16, MSTN_Ex3_17, MSTN_Ex3_18, MSTN_Ex3_19).
  • A Recognition positions of four ASOs for exon 3 of MSTN pre-mRNA.
  • B Human rhabdomyosarcoma cells (CRL-2061) were transfected with ASOs, and the results of RT-PCR of MSTN mRNA, MSTN-b mRNA, and GAPDH mRNA are shown. w/o without ASO treatment. A black arrowhead indicates MSTN, and a white arrowhead indicates MSTN-b. The graph shows the ratio of MSTN-b/total MSTN. The results of three independent experiments were summarized. Comparison of effectiveness of ASO (MSTN_Ex3_20, MSTN_Ex3_21, MSTN_Ex3_22, MSTN_Ex3_23).
  • A Recognition positions of four ASOs for exon 3 of MSTN pre-mRNA.
  • B Human rhabdomyosarcoma cells (CRL-2061) were transfected with ASOs, and the results of RT-PCR of MSTN mRNA, MSTN-b mRNA, and GAPDH mRNA are shown. w/o without ASO treatment. A black arrowhead indicates MSTN, and a white arrowhead indicates MSTN-b. The graph shows the ratio of MSTN-b/total MSTN. The results of three independent experiments were summarized. Comparison of effectiveness of ASO (MSTN_Ex3_24, MSTN_Ex3_25, MSTN_Ex3_26, MSTN_Ex3_27, MSTN_Ex3_28).
  • A Recognition positions of five ASOs for exon 3 of MSTN pre-mRNA.
  • B Human rhabdomyosarcoma cells (CRL-2061) were transfected with ASOs, and the results of RT-PCR of MSTN mRNA, MSTN-b mRNA, and GAPDH mRNA are shown. w/o without ASO treatment. A black arrowhead indicates MSTN, and a white arrowhead indicates MSTN-b. The graph shows the ratio of MSTN-b/total MSTN. The results of three independent experiments were summarized. Myostatin-b expression by ASO administration. A schematic diagram of promyostatin and myostatin-b protein is shown (left). Each domain and amino acid number are indicated.
  • Promyostatin consists of a total of 375 amino acids and myostatin-b a total of 251 amino acids.
  • Promyostatin and myostatin-b have a common sequence of amino acid numbers 1 to 250, and myostatin-b has a valine at the 251st amino acid.
  • Exon 3 of MSTN encodes the 250th to 375th amino acids
  • exon 3s of MSTN-b encodes the 250th and 251st amino acids.
  • Myostatin mature myostatin is produced by protease excision of the active domain of promyostatin translated from MSTN mRNA, and is not produced from MSTN-b mRNA that does not retain the region encoding the active domain.
  • ASO treatment decreased the promyostatin dimer, and the expression of myostatin-b dimer and myostatin-b monomer was confirmed.
  • Myostatin signal reduction by ASO administration A schematic diagram of the action of myostatin on the in vitro myostatin transcription activity assay system is shown (left). Binding of myostatin (mature myostatin) to the receptor activates the transcription factor Samd2/3, which activates the transcription of target genes.
  • luciferase reporter gene is used as the target gene of Samd2/3 activated by myostatin, and myostatin signaling can be evaluated by luciferase activity.
  • MSTN_Ex3_7-2 ASO was administered to rhabdomyosarcoma cells (CRL-2061), and myostatin signals were evaluated using an in vitro myostatin transcription activity measurement system (right panel).
  • the luciferase activity luciferase activity/ ⁇ -galactosidase activity
  • was shown as a relative value with the result of measuring the extract derived from cells without ASO administration (w/o) set to 1. The results of two independent experiments were summarized.
  • Target sequences of ASOs with high interspecies conservation. Alignment of human, canine, mouse, avian, bovine, porcine and ovine MSTN exon 3 nucleic acid sequences. Underlined is the same sequence as human MSTN. Validity of ASOs (MSTN_Ex3_7-2a, MSTN_Ex3_7-2b, MSTN_Ex3_7-2c, MSTN_Ex3_7-2d, MSTN_Ex3_7-2e, MSTN_Ex3_7-2f, MSTN_Ex3_7-2g, MSTN_Ex3_7-2h, MSTN_Ex3_7-2i) with different ENA configurations for MSTN_Ex3_7-2 comparison.
  • ASO was administered to human rhabdomyosarcoma cells (CRL-2061) at final concentrations of 0, 25, 50, 75, 100, 200 nM, and RT-PCR results of MSTN mRNA, MSTN-b mRNA, and GAPDH mRNA were obtained. show. A black arrowhead indicates MSTN, and a white arrowhead indicates MSTN-b. The graph shows the ratio of MSTN-b/total MSTN. The results of three independent experiments were summarized. ***P ⁇ 0.001. Concentration-dependent decrease in myostatin signal by administration of MSTN_Ex3_7-2b.
  • ASO was administered to human rhabdomyosarcoma cells (CRL-2061) at final concentrations of 0, 25, 50, 75, 100, 200, 300, and 400 nM, and myostatin signals were evaluated using an in vitro myostatin transcription activity measurement system.
  • the luciferase activity (luciferase activity/ ⁇ -galactosidase activity) derived from cells to which ASO was administered at each concentration is shown.
  • IC50 was 87.4 nM.
  • MSTN_Ex3_7-2b was administered to human myoblasts at final concentrations of 0, 1, 5, 10, 25, 50, and 100 nM, and CCK-8-mediated cell proliferation was tested.
  • the present invention provides an antisense oligonucleotide having a nucleotide sequence complementary to the target sequence of exon 3 of the myostatin gene, having a base length of 15 to 30 bases and capable of expressing a splicing variant of myostatin, and a salt thereof. or provide a solvate.
  • the present inventors have previously shown that expression of the isoform of myostatin (MSTN), myostatin-b (MSTN-b), reduces myostatin signaling in cultured cells (WO2020/179571). This suggests that myostatin-b inhibits myostatin and promotes myogenesis.
  • the nucleotide sequence of MSTN-b is shown in SEQ ID NO:68.
  • Myostatin is composed of a signal peptide (1-18), pro-domain (19-266) and mature myostatin (267-375) from the N-terminus.
  • the nucleic acid sequences of myostatin and myostatin-b are the same in exons 1 and 2, and are common up to amino acid 249. Since myostatin-b has a different base sequence in exon 3, the 250th amino acid from the N-terminus is asparagine (N), the 251st amino acid is valine (V), and the 252nd amino acid is a stop codon (*). Thus, myostatin-b lacks the domain of mature myostatin.
  • the amino acid sequence of myostatin-b protein is shown in SEQ ID NO:69.
  • the amino acid sequence of myostatin is shown in SEQ ID NO:70.
  • the antisense oligonucleotides of the invention can switch splicing from myostatin to myostatin-b.
  • the antisense oligonucleotides of the present invention can decrease myostatin or increase myostatin-b at the protein level in myostatin-expressing cells. Additionally, myostatin signaling can be reduced.
  • the nucleotide sequence of exon 3 of the human myostatin gene is shown in SEQ ID NO: 1.
  • the target sequence of exon 3 of the myostatin gene is present in the region of nucleotide numbers 10 to 33 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. do it.
  • SEQ ID NO:2 shows the base sequence of the region of base numbers 10 to 33 of the base sequence of SEQ ID NO:1.
  • target sequence refers to a sequence that promotes the production of myostatin splicing variants by an ASO having a sequence complementary to all or part of the sequence.
  • An ASO that promotes the production of a myostatin splicing variant preferably contains a sequence complementary to a sequence consisting of at least 15 consecutive bases in the nucleotide sequence of SEQ ID NO:2.
  • the nucleotide sequence of the antisense oligonucleotide is any of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 24, 30, 31, 27, 32, 33, or 28 (where t in the sequence is u optionally, u may be t).
  • the base sequences of SEQ ID NOS: 24, 30, 31, 27, 32, 33 and 28 have in common a sequence complementary to the region of base numbers 7-18 in the base sequence of SEQ ID NO:2.
  • Sequences of SEQ ID NOS:61-67 are examples of sequences in which t in the sequence of SEQ ID NO:31 is changed to u.
  • the base length of the antisense oligonucleotide may be 18, and the base sequence of the antisense oligonucleotide is any one of the base sequences of SEQ ID NOS: 24, 30, 31, 27, 32, 33, or 28 (wherein t may be u, u may be t).
  • the nucleotides constituting the antisense oligonucleotide may be natural DNA, natural RNA, or modified versions thereof, but at least one is preferably a modified nucleotide.
  • Modified nucleotides include sugar-modified nucleotides (e.g., 2'-O-alkylated D-ribofuranose, 2'-O, 4'-C-alkylenated D-ribofuranose, 2' hydroxyl group of D-ribofuranose modified), modified phosphodiester bond (e.g., thioated), modified base, combinations thereof, etc. can do.
  • sugar-modified nucleotides e.g., 2'-O-alkylated D-ribofuranose, 2'-O, 4'-C-alkylenated D-ribofuranose, 2' hydroxyl group of D-ribofuranose modified
  • modified phosphodiester bond e.g., thioated
  • Antisense oligonucleotides in which at least one D-ribofuranose is 2'-O-alkylated or 2'-O, 4'-C-alkylenated have high binding power to RNA
  • they are highly resistant to nucleases, they are expected to have higher therapeutic effects than natural nucleotides (ie, oligoDNA and oligoRNA).
  • oligonucleotides in which at least one phosphodiester bond constituting an oligonucleotide is thioated are also highly resistant to nucleases, and are expected to have a higher therapeutic effect than natural nucleotides (i.e., oligo DNA and oligo RNA).
  • Oligonucleotides containing both modified sugars and modified phosphates as described above are more resistant to nucleases, and are expected to have even higher therapeutic effects.
  • sugar modifications include 2'-O-alkylation of D-ribofuranose (e.g., 2'-O-methylation, 2'-O-aminoethylation, 2'-O -propylation, 2'-O-allylation, 2'-O-methoxyethylation, 2'-O-butylation, 2'-O-pentylation, 2'-O-propargylation, etc.), D-ribo 2'-O,4'-C-alkylenated furanoses (e.g., 2'-O,4'-C-ethylenated, 2'-O,4'-C-methylenated, 2'-O,4' -C-propylene, 2'-O,4'-C-tetramethylenation, 2'-O,4'-C-pentamethylene, etc.), 3'-deoxy-3'-amino-2'-deoxy -D-ribof
  • examples of modification of the phosphodiester bond include phosphorothioate bond, methylphosphonate bond, methylthiophosphonate bond, phosphorodithioate bond, and phosphoramidate bond.
  • examples of base modifications include cytosine 5-methylation, 5-fluorination, 5-bromination, 5-iodination, N4-methylation, thymidine 5-demethylation (uracil) , 5-fluorination, 5-bromination, 5-iodination, N6-methylation of adenine, 8-bromination, N2-methylation of guanine, 8-bromination, pseudouridination of uridine, 1-methylpseudo Uridination and the like can be mentioned.
  • the antisense oligonucleotides of the present invention may be in salt form.
  • the salt is preferably a pharmaceutically acceptable salt, and examples of such salts include alkali metal salts such as sodium salts, potassium salts, and lithium salts.
  • calcium salts, alkaline earth metal salts such as magnesium salts, metal salts such as aluminum salts, iron salts, zinc salts, copper salts, nickel salts, cobalt salts; inorganic salts such as ammonium salts, t-octylamine salts , dibenzylamine salt, morpholine salt, glucosamine salt, phenylglycine alkyl ester salt, ethylenediamine salt, N-methylglucamine salt, guanidine salt, diethylamine salt, triethylamine salt, dicyclohexylamine salt, N,N'-dibenzylethylenediamine salt amine salts such as organic salts such as, chloroprocaine salts, procaine salts, diethanolamine salts, N-benzyl-phenethylamine salts, piperazine salts, tetramethylammonium salts, tris(hydroxymethyl)aminomethane salts; hydrofluoride salts
  • Antisense oligonucleotides may also exist as solvates (eg, hydrates), and may be such solvates.
  • antisense oligonucleotides may be administered in the form of prodrugs, and examples of prodrugs include amides, esters, carbamates, carbonates, ureides, phosphates, and the like. These prodrugs can be produced by known methods.
  • synthesis method examples include a synthesis method using a genetic engineering technique, a chemical synthesis method, and the like. Genetic engineering techniques include, for example, an in vitro transcription synthesis method, a method using a vector, and a method using a PCR cassette.
  • the vector is not particularly limited, and includes non-viral vectors such as plasmids, viral vectors and the like.
  • the chemical synthesis method is not particularly limited, and examples thereof include the phosphoramidite method and the H-phosphonate method.
  • a commercially available automatic nucleic acid synthesizer can be used.
  • Said chemical synthesis methods generally use amidites.
  • the amidite is not particularly limited, and in the examples described later, antisense oligonucleotides were synthesized by the phosphoramidite method using ENA-2CE phosphoramidite and 2'-OMe-2CE phosphoramidite.
  • Phosphoramidite reagents are conjugated to naturally occurring nucleosides and 2'-O-methyl nucleosides (i.e., 2'-O-methylguanosine, 2'-O-methyladenosine, 2'-O-methylcytosine, 2'-O- Methyluridine), commercially available reagents can be used.
  • 2'-O-alkylguanosine, adenosine, cytosine and uridine having alkyl groups of 2 to 6 carbon atoms are as follows.
  • 2'-O-aminoethylguanosine, adenosine, cytosine, and uridine can be synthesized according to the literature (Blommers et al. Biochemistry (1998), 37, 17714-17725.).
  • 2'-O-propylguanosine, adenosine, cytosine, and uridine can be synthesized according to the literature (Lesnik, E.A. et al. Biochemistry (1993), 32, 7832-7838.).
  • reagents can be used for 2'-O-allylguanosine, adenosine, cytosine, and uridine.
  • 2'-O-Methoxyethylguanosine, adenosine, cytosine, and uridine can be synthesized according to the patent (US6261840) or the literature (Martin, P. Helv. Chim. Acta. (1995) 78, 486-504.
  • 2'-O-butylguanosine, adenosine, cytosine, and uridine can be synthesized according to the literature (Lesnik, E.A. et al. Biochemistry (1993), 32, 7832-7838.).
  • 2'-O-pentylguanosine, adenosine, cytosine, and uridine can be synthesized according to the literature (Lesnik, E.A. et al. Biochemistry (1993), 32, 7832-7838.).
  • 2'-O, 4'-C-methyleneguanosine, adenosine, 5-methylcytosine and thymidine 2'-O, 4 '-C-Alkyleneguanosine, adenosine, 5-methylcytosine and thymidine can be produced according to the method described in WO00/47599.
  • Antisense with phosphorothioate linkages by coupling phosphoramidite reagents followed by reaction with reagents such as sulfur, tetraethylthiuram disulfide (TETD, Applied Biosystems), Beaucage reagent (Glen Research), or xanthan hydride Oligonucleotides can be synthesized (Tetrahedron Letters, 32, 3005 (1991), J. Am. Chem. Soc. 112, 1253 (1990), PCT/WO98/54198).
  • reagents such as sulfur, tetraethylthiuram disulfide (TETD, Applied Biosystems), Beaucage reagent (Glen Research), or xanthan hydride Oligonucleotides can be synthesized (Tetrahedron Letters, 32, 3005 (1991), J. Am. Chem. Soc. 112, 1253 (1990), PCT/WO98/54198).
  • CPG controlled pore glass
  • 2'-O-methyl nucleosides As the controlled pore glass (CPG) used in the synthesizer, commercially available products with 2'-O-methyl nucleosides can be used. Further, for 2'-O, 4'-C-methyleneguanosine, adenosine, 5-methylcytosine and thymidine, 2'-O having 2 to 5 carbon atoms in the alkylene group according to the method described in WO99/14226. , For 4'-C-alkylene guanosine, adenosine, 5-methylcytosine and thymidine, a nucleoside prepared according to the method described in WO00/47599 is prepared according to the literature (Oligonucleotide Synthesis, Edited by M.J.
  • the antisense oligonucleotides of the present invention can be used for medicine.
  • antisense oligonucleotides may be in the form of their pharmaceutically acceptable salts, solvates or prodrugs.
  • the present invention provides a medicament containing the above antisense oligonucleotides, pharmaceutically acceptable salts or solvates thereof.
  • the medicament is preferably for preventing and/or treating pathologies and/or diseases associated with myostatin. , spinal muscular atrophy, sarcopenia, disuse muscle atrophy, etc.), conditions and/or diseases for which muscle mass recovery has therapeutic effects (e.g., cancer cachexia, diabetes, cardiovascular diseases (heart failure, arteriosclerosis, etc.).
  • renal diseases such as chronic renal failure
  • bone diseases such as inflammatory arthritis
  • Inhibition of myostatin results in an increase in skeletal muscle mass, and therefore can be used for treatment of all diseases exhibiting muscle atrophy regardless of the cause of muscle atrophy.
  • An increase in skeletal muscle mass increases the amount of exercise and contributes to the improvement of the metabolism of the whole body. It is also expected to act on the myocardium to restore its function.
  • myostatin inhibition is expected to act on osteoclasts to suppress bone destruction, activate homeostasis of vascular endothelial cells, induce apoptosis, and increase insulin sensitivity. be.
  • the present invention also provides a method for preventing and/or treating conditions and/or diseases associated with myostatin, comprising administering to a subject an effective amount of the antisense oligonucleotides, salts or solvates thereof described above. .
  • the present invention also provides the above antisense oligonucleotides, salts or solvates thereof for use in methods of preventing and/or treating conditions and/or diseases associated with myostatin.
  • the present invention provides use of the above antisense oligonucleotides, salts or solvates thereof for preventing and/or treating conditions and/or diseases associated with myostatin.
  • the antisense oligonucleotide of the present invention a pharmaceutically acceptable salt, solvate or prodrug thereof (hereinafter referred to as "active ingredient") is used alone or in combination with a pharmacologically acceptable carrier or dilution. It can be administered orally or parenterally to mammals (for example, humans, rabbits, dogs, cats, rats, mice) as formulations of suitable dosage forms together with agents or excipients. The dosage varies depending on the administration target, target disease, symptoms, administration route, etc.
  • a single dose of the active ingredient when used for the prevention and treatment of muscle atrophic diseases (e.g., muscular dystrophy), a single dose of the active ingredient , usually about 0.1 to 50 mg/kg body weight, preferably about 0.5 mg/kg body weight, once a week to once a month, preferably once a year, orally, intramuscularly or subcutaneously It may be administered by intravenous injection (preferably, continuous or every other day administration). In the case of other parenteral administration and oral administration, the amount according to this can be administered. If the symptoms are particularly severe, the dose may be increased according to the symptoms. For other diseases as well, it is preferable to administer the drug in an amount that is appropriately increased or decreased with reference to the above doses.
  • muscle atrophic diseases e.g., muscular dystrophy
  • Formulations for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including sugar-coated tablets and film-coated tablets), pills, granules, powders, capsules (including soft capsules), and syrups. , emulsions and suspensions.
  • Such formulations can be produced by conventional methods and may contain carriers, diluents or excipients commonly used in the pharmaceutical field.
  • carriers and excipients for tablets include lactose, starch, sucrose, magnesium stearate and the like.
  • Formulations for parenteral administration include, for example, injections and suppositories, and injections are in the form of intravenous injections, subcutaneous injections, intradermal injections, intramuscular injections, drip injections, and the like. Good to have.
  • Such injections are prepared by a conventional method, ie, by dissolving, suspending or emulsifying the active ingredient in a sterile aqueous or oily liquid commonly used for injections.
  • Aqueous solutions for injection include physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants, and suitable solubilizers such as alcohols (e.g., ethanol), polyalcohols (e.g., propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants (e.g., polysorbate 80, HCO-50 (polyoxyethylene (50 mol) adduct of hydrogenated castor oil)) and the like.
  • Oily liquids include sesame oil and soybean oil, and solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol may be used in combination.
  • the prepared injection solution is usually filled into a suitable ampoule.
  • Suppositories for rectal administration can be prepared by mixing the active ingredient with a conventional suppository base.
  • the above oral or parenteral pharmaceutical preparation should be prepared in a dosage unit form suitable for the dosage of the active ingredient.
  • dosage unit forms include tablets, pills, capsules, injections (ampoules), suppositories and the like, and each dosage unit form usually contains 0.1 to 1.000 mg of the active ingredient. It is preferably contained.
  • the antisense oligonucleotides of the present invention can also be used for food and feed.
  • the antisense oligonucleotides of the present invention are used as food or feed additives, or as supplements for humans or animals.
  • the antisense oligonucleotides of the invention may be in the form of salts, solvates or prodrugs that are acceptable as food or feed.
  • the present invention provides a food product comprising the above antisense oligonucleotide, a food acceptable salt or solvate thereof.
  • the present invention also provides a feed comprising the above antisense oligonucleotide, a feed-acceptable salt or solvate thereof.
  • food or feed acceptable salts, solvates or prodrugs may include pharmaceutically acceptable salts, solvates or prodrugs, which are described above.
  • the antisense oligonucleotides of the present invention can be used to promote muscle cell proliferation and/or hypertrophy.
  • Muscle cells are contractile cells that form the muscle tissue of humans and animals, and include skeletal muscle cells, smooth muscle cells, cardiac muscle cells, and the like. Inhibition of myostatin by the antisense oligonucleotides of the present invention is effective in myoblasts, and can induce proliferation/differentiation of myoblasts, resulting in proliferation/hypertrophy of muscle cells. Muscle cells also include progenitor cells such as myoblasts.
  • the antisense oligonucleotides of the invention may be in the form of salts, solvates or prodrugs.
  • salts, solvates or prodrugs can include pharmaceutically acceptable salts, solvates or prodrugs, which are described above. Any animal that expresses myostatin can be used, and mammals such as cats, dogs, sheep, pigs, cows, chickens, and turkeys, and fish such as salmon, trout, cod, tuna, and yellowtail can be used or eaten. can be exemplified. Accordingly, the present invention provides an agent for promoting muscle cell proliferation and/or hypertrophy, comprising the above antisense oligonucleotide, salt or solvate thereof.
  • the present invention also provides a method of promoting muscle cell proliferation and/or hypertrophy, comprising administering to a subject an effective amount of the above antisense oligonucleotide, salt or solvate thereof.
  • the present invention also provides the above antisense oligonucleotides, salts or solvates thereof for use in methods of promoting muscle cell proliferation and/or hypertrophy.
  • the present invention also provides the use of the above antisense oligonucleotides, salts or solvates thereof for promoting muscle cell proliferation and/or hypertrophy.
  • a subject can be a human or an animal. Animals have been described above.
  • the dosage form, dosage, route of administration, frequency of administration, etc. of the drug may conform to those of the above-mentioned drugs, and may be changed as appropriate so as to obtain desired effects.
  • the antisense oligonucleotides of the present invention can be used to increase muscle mass and suppress muscle weakness in humans and animals.
  • the antisense oligonucleotides of the invention may be in the form of salts, solvates or prodrugs.
  • salts, solvates or prodrugs can include pharmaceutically acceptable salts, solvates or prodrugs, which are described above. Any animal that expresses myostatin can be used, and mammals such as cats, dogs, sheep, pigs, cows, chickens, and turkeys, and fish such as salmon, trout, cod, tuna, and yellowtail can be used or eaten. can be exemplified.
  • the present invention provides a drug for increasing muscle mass and/or suppressing muscle loss, which contains the above antisense oligonucleotide, salt or solvate thereof.
  • the present invention also provides a method for increasing muscle mass and/or inhibiting muscle loss, comprising administering an effective amount of the antisense oligonucleotide, salt or solvate thereof to a subject.
  • the present invention also provides the above antisense oligonucleotides, salts or solvates thereof for use in methods for increasing muscle mass and/or inhibiting muscle loss.
  • the present invention also provides the use of the above antisense oligonucleotides, salts or solvates thereof for increasing muscle mass and/or inhibiting muscle loss.
  • a subject can be a human or an animal. Animals have been described above.
  • the dosage form, dosage, route of administration, frequency of administration, etc. of the drug may conform to those of the above-mentioned drugs, and may be changed as appropriate so as to obtain desired effects.
  • Foods to which the antisense oligonucleotides of the present invention, food acceptable salts, solvates or prodrugs thereof are added include plant foods, animal foods, fungal foods, fresh foods, processed foods, oriented foods, cooked foods. - Any food such as seasoning materials, beverages, health foods, space foods, and pet foods may be used.
  • the food of the present invention contains general ingredients such as proteins, lipids, carbohydrates and sodium; minerals such as potassium, calcium, magnesium and phosphorus; trace elements such as iron, zinc, copper, selenium and chromium; Vitamins such as carotene, vitamin B1, vitamin B2, vitamin B6, vitamin B12, vitamin C, niacin, folic acid, vitamin D3, vitamin E, biotin, pantothenic acid, coenzyme Q10, ⁇ -lipoic acid, galactooligosaccharides, dietary fiber, Excipients (water, carboxymethylcellulose, lactose, etc.), sweeteners, corrigents (malic acid, citric acid, amino acids, etc.), flavoring agents, etc. may be added.
  • minerals such as potassium, calcium, magnesium and phosphorus
  • trace elements such as iron, zinc, copper, selenium and chromium
  • Vitamins such as carotene, vitamin B1, vitamin B2, vitamin B6, vitamin B12, vitamin C, niacin,
  • the food of the present invention When the food of the present invention is used as a liquid formulation, water, physiological saline, soup, milk, fruit juice, etc. can be used as the liquid for dispersing or dissolving the food ingredients.
  • the food of the present invention may be in the form of powder, granules, tablets, liquid preparations and the like.
  • a gel-like product such as jelly is preferred so that sick and elderly people can easily ingest it.
  • Feeds to which the antisense oligonucleotide of the present invention, its feed-acceptable salts, solvates, or prodrugs are added include single feeds such as cereals, vegetable oil cakes, rice bran, manufactured cakes, and animal feeds. Any kind of feed may be used, such as a mixed feed containing feed ingredients or feed additives.
  • the feed of the present invention contains antioxidants (ethoxyquin, dibutylhydroxytoluene, butylhydroxyanisole, etc.), fungicides (propionic acid, calcium propionate, sodium propionate, etc.), binding agents (sodium alginate, sodium caseinate, Carboxymethylcellulose sodium, propylene glycol, sodium polyacrylate, etc.), emulsifiers (glycerin fatty acid ester, sucrose fatty acid ester, sorbitan fatty acid ester, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, polyoxyethylene glycerin fatty acid ester, etc.), modifiers (formic acid, etc.) ), amino acids, etc.
  • antioxidants ethoxyquin, dibutylhydroxytoluene, butylhydroxyanisole, etc.
  • fungicides propionic acid, calcium propionate, sodium propionate, etc.
  • binding agents sodium alginate, sodium caseinate, Carboxymethylcellulose sodium, propylene
  • Intake of food and feed should be done in such an amount, frequency, and duration that the desired effect (for example, promotion of muscle formation) is confirmed.
  • the antisense oligonucleotides of the present invention can switch myostatin splicing from myostatin to myostatin splicing variants. Accordingly, the present invention provides an agent that switches the splicing of myostatin from myostatin to a splicing variant of myostatin, comprising an antisense oligonucleotide as described above.
  • the agent of the present invention can be used as a pharmaceutical for humans or animals, as an additive or supplement to food or feed, as a growth promoter for animals, or as an experimental reagent.
  • the antisense oligonucleotides of the invention may be in the form of salts, solvates or prodrugs.
  • the present invention also provides a method of switching myostatin splicing from myostatin to a splicing variant of myostatin comprising administering to a subject an effective amount of an antisense oligonucleotide, salt or solvate thereof as described above.
  • the present invention also provides the above antisense oligonucleotides, salts or solvates thereof for use in methods for switching myostatin splicing from myostatin to a splicing variant of myostatin.
  • the present invention also provides the use of the above antisense oligonucleotides, salts or solvates thereof, for switching the splicing of myostatin from myostatin to a splicing variant of myostatin.
  • the antisense oligonucleotides of the present invention can reduce myostatin signaling. Accordingly, the present invention provides agents that reduce myostatin signaling, comprising the antisense oligonucleotides described above.
  • the myostatin signal-lowering agent of the present invention can be used as a pharmaceutical for humans or animals, as an additive or supplement to food or feed, as a growth promoter for animals, or as an experimental reagent.
  • Antisense oligonucleotides may be in the form of salts, solvates or prodrugs. Examples of salts, solvates or prodrugs can include pharmaceutically acceptable salts, solvates or prodrugs, which are described above.
  • the present invention also provides a method of reducing myostatin signaling comprising administering to a subject an effective amount of the antisense oligonucleotides, salts or solvates thereof described above.
  • the present invention also provides the above antisense oligonucleotides, salts or solvates thereof, for use in methods of reducing myostatin signaling.
  • the present invention also provides the use of the above antisense oligonucleotides, salts or solvates thereof for reducing myostatin signaling. Since inhibition of myostatin signaling is thought to be effective in suppressing diabetes and inhibiting progression, the above antisense oligonucleotides, salts or solvates thereof are effective in preventing and/or treating diabetes. sell. Therefore, the present invention also provides a preventive and/or therapeutic agent for diabetes comprising the above antisense oligonucleotide, salt or solvate thereof.
  • treatment of myostatin-expressing cells, tissues or organs with the antisense oligonucleotides, salts or solvates thereof of the present invention results in alteration of myostatin splicing from myostatin to myostatin splicing variants.
  • the antisense oligonucleotides, salts and solvates thereof of the present invention may be used in amounts effective to exhibit the desired functions.
  • myostatin-expressing cells include muscle cells, sarcoma cells, and cancer cells of digestive organs, lungs, esophagus, and the like.
  • myostatin-expressing tissues and organs include skeletal muscle, cardiac muscle, blood vessels, kidney, gastrointestinal tract, uterus, liver, pancreas, lung and the like.
  • Switching myostatin splicing from myostatin to a myostatin splicing variant can be performed by RT-PCR analysis of the myostatin splice variant mRNA in a sample and detection of the protein translated from the myostatin splice variant in a sample by Western blotting. or detected by mass spectrometry.
  • the antisense oligonucleotides of the invention are capable of inhibiting cancer cell proliferation.
  • Cancer cells include rhabdomyosarcoma cells, liver cancer cells, cervical cancer cells, alveolar basal epithelial adenocarcinoma cells, and the like.
  • the present invention provides anticancer agents containing the above antisense oligonucleotides.
  • Indications for the anticancer agent of the present invention include cancers such as sarcoma, liver cancer, cervical cancer, and lung cancer.
  • the anticancer agent of the present invention can be used as a pharmaceutical for humans and animals.
  • Antisense oligonucleotides may be in the form of salts, solvates or prodrugs.
  • the present invention also provides a method for preventing and/or treating cancer, comprising administering an effective amount of the antisense oligonucleotide, salt or solvate thereof to a subject.
  • the present invention also provides the above antisense oligonucleotides, salts or solvates thereof for use in methods of preventing and/or treating cancer.
  • the present invention also provides the use of the above antisense oligonucleotides, salts or solvates thereof for preventing and/or treating cancer.
  • Cancer prevention is a concept that includes prevention of cancer recurrence.
  • ENA modified nucleic acid
  • A adenine
  • G guanine
  • C cytosine
  • T thymine
  • a non-natural phosphoramidite is Example 22 (5'-O-dimethoxytrityl-2'-O,4'-C-ethylene-4-N-benzoyl-5-methylcytidine-3) of JP-A-2000-297097. '-O-(2-cyanoethyl N,N-diisopropyl) phosphoramidite), Example 9 (5'-O-dimethoxytrityl-2'-O,4'-C-ethylene-5-methyluridine-3' -O-(2-cyanoethyl N,N-diisopropyl) phosphoramidite) was used. Using a universal control pore glass (CPG) (manufactured by Glen Research, product No. 25-5040) as a solid-phase carrier, the title compound was synthesized. However, the time required for condensation of amidite was 15 minutes.
  • CPG universal control pore glass
  • the protected oligonucleotide analogue having the target sequence was heat-treated with concentrated aqueous ammonia (55°C, 8 hours) to cleave the oligomer from the support and protect the cyanoethyl group on the phosphorus atom and the nucleobase. removed the base.
  • This ammonia solution was used in a Glen-Pak DNA Purification Cartridge (product No. 60-5100 manufactured by Glen Research), and DMT was removed in the cartridge according to the protocol recommended by Glen Research.
  • Phase HPLC (Shimadzu Corporation LC-2a, column (YMC Triart C18 (10 x 150 mm)), A solution: 0.1M triethylamine acetate aqueous solution (TEAA), pH 7.0, B solution: acetonitrile, B%: 10% ⁇ Purified at 25% (30 min, linear gradient); 50°C; 4.7 mL/min; 280 nm). After distilling off the solvent, the residue was dissolved in a 10 mM NaOH solution, purified water was replaced by ultrafiltration using a Microsep centrifugal filtration device (product No. MCP003C manufactured by Nippon Pall Co., Ltd.), and the target compound was obtained after freeze-drying.
  • TEAA triethylamine acetate aqueous solution
  • B solution acetonitrile
  • B% 10% ⁇ Purified at 25% (30 min, linear gradient); 50°C; 4.7 mL/min; 280 nm). After distilling off the solvent, the
  • nucleotide sequence of this compound is complementary to nucleotide numbers 5058-5075 of Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1).
  • Example 2 Synthesis of aaaCggaTTCTgTTTgaa (MSTN_Ex3_SS) (Example 2) The compound of Example 2 having the target sequence similar to the compound of Example 1 was synthesized.
  • nucleotide sequence of this compound is complementary to nucleotide numbers 5083-5100 of Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1).
  • Example 3 Synthesis of TCaTCaCagTCaagaCCa (MSTN_Ex3_Fox1) (Example 3) The compound of Example 3 having the target sequence similar to that of Example 1 was synthesized.
  • nucleotide sequence of this compound is complementary to nucleotide numbers 5184-5165 of Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1).
  • Example 4 Synthesis of CCTgCTgaaCCTCTgggg (MSTN_Ex3_LESE12SF2) (Example 4) The compound of Example 4 having the target sequence similar to that of Example 1 was synthesized.
  • This compound was identified by negative ion MALDI-TOFMS (calculated value: 6510.38, measured value: 6503.83).
  • nucleotide sequence of this compound is complementary to nucleotide numbers 5337-5354 of Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1).
  • Example 5 Synthesis of aTTgTTgaggggaaaCC (MSTN_Ex3_LESE3) (Example 5) The compound of Example 5 having the desired sequence similar to that of Example 1 was synthesized.
  • the base sequence of this compound is complementary to nucleotide numbers 5512-5529 of Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1).
  • Example 6 Synthesis of TaTagCCTgTggTaCTTa (MSTN_Ex3_LESE4) (Example 6) The compound of Example 6 having the target sequence similar to that of Example 1 was synthesized.
  • nucleotide sequence of this compound is complementary to nucleotide numbers 5546-5563 of Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1).
  • Example 7 Synthesis of CagTCaagaCCaaaTCC (MSTN_Ex3_Fox1+6) (Example 7) The compound of Example 7 having the target sequence similar to the compound of Example 1 was synthesized.
  • the base sequence of this compound is complementary to nucleotide numbers 5142-5159 of Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1).
  • Example 8 Synthesis of CaCagTCaagaCCaaaT (MSTN_Ex3_Fox1+4) (Example 8) The compound of Example 8 having the target sequence similar to the compound of Example 1 was synthesized.
  • the base sequence of this compound is complementary to nucleotide numbers 5144-5161 of Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1).
  • Example 9 Synthesis of aTCaCagTCaagaCCaaa (MSTN_Ex3_Fox1+2) (Example 9) The compound of Example 9 having the target sequence similar to that of Example 1 was synthesized.
  • nucleotide sequence of this compound is complementary to nucleotide numbers 5146-5163 of Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1).
  • Example 10 Synthesis of gCTCaTCaCagTCaagaC (MSTN_Ex3_Fox1-2) (Example 10) The compound of Example 10 having the desired sequence similar to that of Example 1 was synthesized.
  • nucleotide sequence of this compound is complementary to nucleotide numbers 5150-5167 of Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1).
  • Example 11 Synthesis of gTgCTCaTCaCagTCaag (MSTN_Ex3_Fox1-4) (Example 11) The compound of Example 11 having the desired sequence similar to that of Example 1 was synthesized.
  • the base sequence of this compound is complementary to nucleotide numbers 5152-5169 of Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1).
  • This compound was identified by negative ion MALDI-TOFMS (calculated value: 6475.50, measured value: 6475.55).
  • nucleotide sequence of this compound is complementary to nucleotide numbers 5154-5171 of Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1).
  • nucleotide sequence of this compound is complementary to nucleotide numbers 5260-5277 of Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1).
  • nucleotide sequence of this compound is complementary to nucleotide numbers 5452-5469 of Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1).
  • Example 15 Synthesis of CTCgCCgaTgTTgTaaTa (MSTN_Ex3_3) (Example 15) The compound of Example 15 having the desired sequence similar to that of Example 1 was synthesized.
  • the base sequence of this compound is complementary to nucleotide numbers 5734-5751 of Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1).
  • nucleotide sequence of this compound is complementary to nucleotide numbers 5965-5982 of Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1).
  • nucleotide sequence of this compound is complementary to nucleotide numbers 6122-6139 of Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1).
  • nucleotide sequence of this compound is complementary to nucleotide numbers 6322-6339 of Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1).
  • the base sequence of this compound is complementary to nucleotide numbers 4866-4883 of Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1).
  • Example 20 Synthesis of gTTgaagTaaTaaaCTaa (MSTN_In2_3) (Example 20) The compound of Example 20 having the target sequence similar to that of Example 1 was synthesized.
  • This compound was identified by negative ion MALDI-TOFMS (calculated value: 6454.22, measured value: 6454.25).
  • nucleotide sequence of this compound is complementary to nucleotide numbers 4998-5015 of Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1).
  • Example 21 Synthesis of ggCCTggaaaCaCTTTTC (MSTN_In2_2) (Example 21) The compound of Example 21 having the desired sequence similar to that of Example 1 was synthesized.
  • nucleotide sequence of this compound is complementary to nucleotide numbers 5037-5054 of Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1).
  • nucleotide sequence of this compound is complementary to nucleotide numbers 5101-5118 of Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1).
  • nucleotide sequence of this compound is complementary to nucleotide numbers 5095-5112 of Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1).
  • the base sequence of this compound is complementary to nucleotide numbers 5098-5115 of Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1).
  • Example 25 Synthesis of gTCTgTTaCCTTgaCCTC (MSTN_Ex3_7-3) (Example 25) The compound of Example 25 having the desired sequence similar to that of Example 1 was synthesized.
  • the base sequence of this compound is complementary to nucleotide numbers 5104-5121 of Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1).
  • the base sequence of this compound is complementary to nucleotide numbers 5107-5124 of Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1).
  • Example 27 Synthesis of TggTgTgTCTgTTaCCTT (MSTN_Ex3_7-9) (Example 27) The compound of Example 27 having the desired sequence similar to that of Example 1 was synthesized.
  • nucleotide sequence of this compound is complementary to nucleotide numbers 5110-5127 of Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1).
  • nucleotide sequence of this compound is complementary to nucleotide numbers 5102-5119 of Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1).
  • This compound was identified by negative ion MALDI-TOFMS (calculated value: 6457.40, measured value: 6457.37).
  • the base sequence of this compound is complementary to nucleotide numbers 5103-5120 of Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1).
  • Example 30 Synthesis of TgTCTgTTaCCTTgaCCT (MSTN_Ex3_7-4) (Example 30) The compound of Example 30 having the desired sequence similar to that of Example 1 was synthesized.
  • nucleotide sequence of this compound is complementary to nucleotide numbers 5105-5122 of Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1).
  • Example 31 Synthesis of gTgTCTgTTaCCTTgaCC (MSTN_Ex3_7-5) (Example 31) The compound of Example 31 having the desired sequence similar to that of Example 1 was synthesized.
  • the base sequence of this compound is complementary to nucleotide numbers 5106-5123 of Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1).
  • Example 32 Synthesis of gTgTgTCTgTTaCCTTga (MSTN_Ex3_7-7) (Example 32) The compound of Example 32 having the desired sequence similar to that of Example 1 was synthesized.
  • nucleotide sequence of this compound is complementary to nucleotide numbers 5108-5125 of Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1).
  • Example 33 Synthesis of ggTgTgTCTgTTaCCTTg (MSTN_Ex3_7-8) (Example 33) The compound of Example 33 having the desired sequence similar to that of Example 1 was synthesized.
  • nucleotide sequence of this compound is complementary to nucleotide numbers 5109-5126 of Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1).
  • Example 34 Synthesis of gCTTCaaaaTCCaCagTT (MSTN_Ex3_8) (Example 34) The compound of Example 34 having the desired sequence similar to that of Example 1 was synthesized.
  • nucleotide sequence of this compound is complementary to nucleotide numbers 5202-5219 of Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1).
  • Example 35 Synthesis of TCTTTTaggagCgaTaaT (MSTN_Ex3_9) (Example 35) The compound of Example 35 having the desired sequence similar to that of Example 1 was synthesized.
  • nucleotide sequence of this compound is complementary to nucleotide numbers 5236-5253 of Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1).
  • Example 36 Synthesis of ggaTaTTTTTgTaaaaaT (MSTN_Ex3_10) (Example 36) The compound of Example 36 having the desired sequence similar to that of Example 1 was synthesized.
  • nucleotide sequence of this compound is complementary to nucleotide numbers 5292-5309 of Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1).
  • Example 37 Synthesis of agaCaTCTTTgTgggagT (MSTN_Ex3_11) (Example 37) The compound of Example 37 having the desired sequence similar to that of Example 1 was synthesized.
  • nucleotide sequence of this compound is complementary to nucleotide numbers 5365-5382 of Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1).
  • Example 38 Synthesis of aTaTaTTaTTTgTTCTTT (MSTN_Ex3_12) (Example 38) The compound of Example 38, which has the desired sequence in the same manner as the compound of Example 1, was synthesized.
  • nucleotide sequence of this compound is complementary to nucleotide numbers 5410-5427 of Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1).
  • Example 39 Synthesis of aCTCTggaaaTCaTaaaa (MSTN_Ex3_13) (Example 39) The compound of Example 39 having the desired sequence similar to that of Example 1 was synthesized.
  • nucleotide sequence of this compound is complementary to nucleotide numbers 5674-5691 of Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1).
  • Example 40 Synthesis of TaaTTCaTCagaaCTCaa (MSTN_Ex3_14) (Example 40) The compound of Example 40 having the desired sequence similar to that of Example 1 was synthesized.
  • the base sequence of this compound is complementary to nucleotide numbers 5771-5788 of Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1).
  • Example 41 Synthesis of TgTaaaTaTTaaaCaaaa (MSTN_Ex3_15) (Example 41) The compound of Example 41 having the desired sequence similar to that of Example 1 was synthesized.
  • the base sequence of this compound is complementary to nucleotide numbers 5822-5839 of Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1).
  • the base sequence of this compound is complementary to nucleotide numbers 6037-6054 of Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1).
  • nucleotide sequence of this compound is complementary to nucleotide numbers 6055-6072 of Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1).
  • Example 44 Synthesis of CCgTTggCaTggaTTgTT (MSTN_Ex3_18) (Example 44) The compound of Example 44 having the desired sequence similar to that of Example 1 was synthesized.
  • nucleotide sequence of this compound is complementary to nucleotide numbers 6019-6036 of Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1).
  • Example 45 Synthesis of gTTTTTTaTgTgaTaaC (MSTN_Ex3_19) (Example 45) The compound of Example 45 having the desired sequence similar to that of Example 1 was synthesized.
  • nucleotide sequence of this compound is complementary to nucleotide numbers 6073-6090 of Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1).
  • Example 46 Synthesis of agagaaaCTTaCTaTTTT (MSTN_Ex3_20) (Example 46) The compound of Example 46 having the desired sequence similar to that of Example 1 was synthesized.
  • nucleotide sequence of this compound is complementary to nucleotide numbers 6098-6115 of Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1).
  • Example 47 Synthesis of TCTTaCaTTaaagaaaaT (MSTN_Ex3_21) (Example 47) The compound of Example 47 having the desired sequence similar to that of Example 1 was synthesized.
  • nucleotide sequence of this compound is complementary to nucleotide numbers 6158-6175 of Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1).
  • Example 48 Synthesis of TgaaagCCaaCCTCTaga (MSTN_Ex3_22) (Example 48) The compound of Example 48 having the desired sequence similar to that of Example 1 was synthesized.
  • nucleotide sequence of this compound is complementary to nucleotide numbers 6187-6204 of Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1).
  • Example 49 Synthesis of aTaaaaCaaCaCCaTT (MSTN_Ex3_23) (Example 49) A compound of Example 49 having the desired sequence similar to that of Example 1 was synthesized.
  • nucleotide sequence of this compound is complementary to nucleotide numbers 6252-6269 of Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1).
  • Example 50 Synthesis of TTTCTaTTaTTTTaCCaT (MSTN_Ex3_24) (Example 50) The compound of Example 50 having the desired sequence similar to that of Example 1 was synthesized.
  • nucleotide sequence of this compound is complementary to nucleotide numbers 6356-6373 of Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1).
  • Example 51 Synthesis of aaagTaaaTaaaaagga (MSTN_Ex3_25) (Example 51) The compound of Example 51 having the desired sequence similar to that of Example 1 was synthesized.
  • nucleotide sequence of this compound is complementary to nucleotide numbers 6460-6477 of Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1).
  • nucleotide sequence of this compound is complementary to nucleotide numbers 6483-6500 of Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1).
  • Example 53 Synthesis of TTCTgTgaTgCaTgaCaT (MSTN_Ex3_27) (Example 53) The compound of Example 53 having the desired sequence similar to that of Example 1 was synthesized.
  • the base sequence of this compound is complementary to nucleotide numbers 6530-6547 of Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1).
  • Example 54 Synthesis of TCaTgTaaaaaaTaTaaa (MSTN_Ex3_28) (Example 54) The compound of Example 54 having the desired sequence similar to that of Example 1 was synthesized.
  • nucleotide sequence of this compound is complementary to nucleotide numbers 6642-6659 of Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1).
  • Example 55 Synthesis of Antisense Oligonucleotides (ASO)
  • the compound of Example 55 having the desired sequence similar to that of Example 1 was synthesized. This compound was identified by negative ion MALDI-TOFMS (calculated value: 6301.1, measured value: 6301.8).
  • the nucleotide sequence of this compound is a complementary sequence to nucleotide numbers 5103-5120 of Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1). Synthesis of TcTguTACCTTgacCTCT (MSTN_Ex3_7-2b) (Example 56) The compound of Example 56 having the desired sequence similar to that of Example 1 was synthesized. This compound was identified by negative ion MALDI-TOFMS (calculated value: 6391.3, measured value: 6398.1).
  • the nucleotide sequence of this compound is a complementary sequence to nucleotide numbers 5103-5120 of Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1). Synthesis of TcTguuACcTugaccTcT (MSTN_Ex3_7-2c) (Example 57) The compound of Example 57 having the desired sequence similar to that of Example 1 was synthesized. This compound was identified by negative ion MALDI-TOFMS (calculated value: 6261.1, measured value: 6262.4).
  • the nucleotide sequence of this compound is a complementary sequence to nucleotide numbers 5103-5120 of Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1). Synthesis of TcTguuaCcTugaccTcT (MSTN_Ex3_7-2d) (Example 58) The compound of Example 58 having the desired sequence similar to that of Example 1 was synthesized. This compound was identified by negative ion MALDI-TOFMS (calculated value: 6249.1, measured value: 6249.7).
  • the nucleotide sequence of this compound is a complementary sequence to nucleotide numbers 5103-5120 of Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1). Synthesis of TcTguuAccTugaccTcT (MSTN_Ex3_7-2e) (Example 59) The compound of Example 59 having the desired sequence similar to that of Example 1 was synthesized. This compound was identified by negative ion MALDI-TOFMS (calculated value: 6235.0, measured value: 6237.5).
  • the nucleotide sequence of this compound is a complementary sequence to nucleotide numbers 5103-5120 of Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1). Synthesis of TcTguTaCcTugaccTcT (MSTN_Ex3_7-2f) (Example 60) A compound of Example 60 having the desired sequence similar to that of Example 1 was synthesized. This compound was identified by negative ion MALDI-TOFMS (calculated value: 6275.1, measured value: 6275.4).
  • the nucleotide sequence of this compound is a complementary sequence to nucleotide numbers 5103-5120 of Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1). Synthesis of TcTguTaCcTugacCucT (MSTN_Ex3_7-2g) (Example 61) The compound of Example 61 having the desired sequence similar to that of Example 1 was synthesized. This compound was identified by negative ion MALDI-TOFMS (calculated value: 6275.1, measured value: 6275.0).
  • the nucleotide sequence of this compound is a complementary sequence to nucleotide numbers 5103-5120 of Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1). Synthesis of TcTguuAcCuTgaccTcT (MSTN_Ex3_7-2h) (Example 62) A compound of Example 62 having the desired sequence similar to that of Example 1 was synthesized. This compound was identified by negative ion MALDI-TOFMS (calculated value: 6261.1, measured value: 6262.4).
  • the nucleotide sequence of this compound is a complementary sequence to nucleotide numbers 5103-5120 of Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1). Synthesis of TcTguuAcCuTgacCucT (MSTN_Ex3_7-2i) (Example 63) The compound of Example 63 having the desired sequence similar to that of Example 1 was synthesized. This compound was identified by negative ion MALDI-TOFMS (calculated value: 6261.1, measured value: 6263.0).
  • nucleotide sequence of this compound is a complementary sequence to nucleotide numbers 5103-5120 of Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1).
  • ASO transfection 1 2 ⁇ l each of ASO (50 pmol/ ⁇ l with Nuclease-Free Water (#AM9932, Thermo Fisher Scientific)) was mixed with 100 ⁇ l of Opti-MEM medium (#31985070, Thermo Fisher Scientific). For ASO non-treatment, 2 ⁇ l of Nuclease-Free Water was mixed. 2) In a separate tube, 100 ⁇ l of Opti-MEM medium was mixed with 4 ⁇ l of Lipofectamine 3000 Transfection Reagent (#L3000015, Thermo Fisher Scientific). 3) Liquids 1) and 2) were mixed and allowed to stand at room temperature for 15 minutes.
  • RNA preparation 1 Cells transfected with each ASO were cultured for 24 hours, washed once with PBS, and 300 ⁇ l of RNA extraction reagent of High Pure RNA Isolation Kit (#11828665001, Roche Life Science) was added to the cells. 2) After standing at room temperature for 10 minutes, the RNA extraction reagent in the wells was collected in a tube. 3) RNA was extracted according to the protocol of High Pure RNA Isolation Kit to finally obtain 50 ⁇ l of RNA lysate.
  • step 3) was performed in 18 cycles.
  • Samples for SDS-PAGE were prepared by heat treatment after mixing the samples with 4x Laemmli Sample Buffer (#1610747, Bio-Rad). SDS-PAGE was performed using Mini-PROTEAN TGX Precast Gels 4-20% Gel (#456-1094, BIO-RAD). Protein Ladder One Plus, Triple-color for SDS-PAGE (#19593-25, Nacalai Tesque) was electrophoresed as a molecular weight marker. Trans-blot Turbo transfer system (Bio-Rad) was used for transfer to membrane. After protein transfer, the membrane was blocked with 2% ECL Prime Blocking Agent (#RPN418, Amersham) for 1 hour at room temperature.
  • ECL Prime Blocking Agent #RPN418, Amersham
  • a reporter gene (SBE4-Luc plasmid, #16495, Addgene) in which a luciferase gene is placed downstream of the Smad-binding sequence is introduced into cells, and the luminescence of the induced luciferase is measured to detect the myostatin signal. evaluated.
  • a ⁇ -galactosidase expression vector (pSV- ⁇ -Galactosidase Control Vector, #E1081, Promega) was also introduced at the same time as a control for introduction of the luciferase reporter gene.
  • ASO was introduced into human rhabdomyosarcoma cells (CRL-2061, ATCC) using Lipofectamine 3000 Transfection Reagent (#L3000015, Thermo Fisher Scientific). Twenty-four hours after ASO administration, the cells were disrupted using Reporter Lysis Buffer of Luciferase Assay System with Reporter Lysis Buffer (E4030, Promega) to obtain a soluble fraction as a sample. Protein quantification of the obtained samples was performed with Qubit Protein Assay Kit (#Q33211, Thermo Fisher Scientific).
  • Luciferase activity was evaluated by measuring the luciferase luminescence signal with a multilabel plate reader ARVO X3 (PerkinElmer) using the Luciferase Assay System with Reporter Lysis Buffer (#E4030, Promega) as a substrate.
  • the ⁇ -galactosidase activity was determined by reacting the ⁇ -Gal Assay System with Reporter Lysis Buffer (E2000, Promega) as a substrate at 37°C for 1 hour, then stopping the reaction by adding 1M Sodium Carbonate. After standing for a minute, evaluation was performed by measuring the absorbance at 420 nm with a multi-label plate reader ARVO X3 (PerkinElmer).
  • the luciferase activity was corrected by the ⁇ -galactosidase activity (luciferase activity/ ⁇ -galactosidase activity), and the results obtained by measuring the extract derived from the cells to which ASO was not administered were set to 1 and shown as relative values.
  • Cell proliferation was measured using the Cell Counting Kit-8 (CCK-8) for human myoblasts (Wada et al. 8) (347-07621, Dojindo Laboratories).
  • MSTN_Ex3_7 MSTN_Ex3_7-1, MSTN_Ex3_7-2, MSTN_Ex3_7 -3, MSTN_Ex3_7-4, MSTN_Ex3_7-5, and MSTN_Ex3_7-6 treatments significantly increased the proportion of MSTN-b in total MSTN (Fig. 8). From these ASO results, the sequence important for the splicing switch is 5'-TTAGAGGTCAAGGTAACAGACACA-3' (SEQ ID NO: 2).
  • myostatin-b human rhabdomyosarcoma cells (CRL-2061) were treated with MSTN_Ex3_7-2 ASO for 24 hours and verified by Western blotting, and the expression of myostatin-b was confirmed by ASO treatment.
  • MSTN_Ex3_7-2b which changed the ENA arrangement of MSTN_Ex3_7-2, showed a stronger MSTN-b production effect than MSTN_Ex3_7-2 (Fig. 17). This effect was concentration dependent ( Figure 18) and also caused a decrease in myostatin signal ( Figure 19). Furthermore, MSTN_Ex3_7-2b caused growth enhancement to human myoblasts ( Figure 20) and growth inhibition to human rhabdomyosarcoma cells ( Figure 21).
  • the ASO of the present invention enables splicing to be switched from MSTN to MSTN-b, and the ASO target sequence important for this splicing switch has been clarified. Analysis of the splicing factor that binds to this sequence is expected to reveal the factor that controls the splicing switch.
  • MSTN_Ex3_7-2b which changed the ENA arrangement of MSTN_Ex3_7-2, showed a stronger MSTN-b production effect than MSTN_Ex3_7-2.
  • the enhanced proliferation of human myoblasts shown by administration of MSTN_Ex3_7-2b leads to enhanced myogenesis.
  • MSTN_Ex3_7-2b is expected to be applied as an anti-cancer agent based on the results of inhibiting the growth of human rhabdomyosarcoma cells by administration of MSTN_Ex3_7-2b.
  • ASOs of the present invention are dual-acting, reducing myostatin and increasing myostatin-b by switching endogenous MSTN splicing to splicing for MSTN-b production.
  • myostatin-b production by ASO administration utilizes the myostatin-b produced by the individual and is non-immunogenic and safe. At the same time, it utilizes the functions of the patient's genes and does not require the introduction of large genes from outside the body.
  • the target sequence of the ASO of the present invention is highly conserved in bovine and porcine, and can be used to promote the growth of these domestic animals (Fig. 16). Since MSTN expression suppression by ASO administration to livestock does not correspond to production of genetically modified organisms, it is easy to use. In addition, it is considered to be effective for dogs as well, and can be used for muscle weakness in dogs, which are companion animals (Fig. 16). All publications, patents and patent applications cited herein are hereby incorporated by reference in their entirety.
  • the present invention can be used as a nucleic acid drug capable of expressing a splicing variant of myostatin.
  • ⁇ SEQ ID NO: 1> Shows the nucleotide sequence of exon 3 of the myostatin gene. MSTN Ex3 1939nt (NM_005259.3) ASO target sequences are shown in squares.
  • ⁇ SEQ ID NO: 2> Shows the base sequence of the ASO target sequence of exon 3 of the myostatin gene. 5'-TTAGAGGTCAAGGTAACAGACACA-3' ⁇ SEQ ID NOs: 3 to 56> The sequence of ASO synthesized in Example 1-54 is shown.
  • ⁇ SEQ ID NOS: 57-60> The sequences of primers used in test examples are shown.
  • ⁇ SEQ ID NOs: 61-67> The sequences of ASOs synthesized in Examples 55-63 are shown.
  • ⁇ SEQ ID NO: 68> The base sequence of MSTN-b (total 1860 bases. Initiation codon (atg) and stop codon (tga) are shown in ⁇ ).
  • ⁇ SEQ ID NO: 69> The amino acid sequence of the MSTN-b protein (total 251 amino acids) is shown.
  • ⁇ SEQ ID NO: 70> The amino acid sequence of the MSTN protein (total 375 amino acids) is shown.

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Abstract

ミオスタチンの機能を阻害する方法を提供する。ミオスタチン遺伝子のエクソン３の標的配列に相補的な塩基配列を有する、塩基長１５～３０のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、ミオスタチンのスプライシングバリアントを発現できる前記アンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物。前記アンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物を含む、医薬、食品、飼料、筋細胞の増殖及び/又は肥大を促進するための薬剤、筋量の増加及び/又は筋低下を抑制するための薬剤、ミオスタチンのスプライシングをミオスタチンからミオスタチンのスプライシングバリアントにスイッチする薬剤、ミオスタチンシグナルを低下させる薬剤、及び抗がん剤。

Description

ミオスタチンのスプライシングバリアントを発現させる核酸医薬
　本発明は、ミオスタチンのスプライシングバリアントを発現させる核酸医薬に関する。
　ミオスタチンはTGFベータ型の細胞増殖因子の1つで、ミオスタチン遺伝子にコードされたタンパクである。ミオスタチンは筋細胞の増殖・肥大を抑制する作用を有している。そのため、ミオスタチンの機能を阻害することは、筋細胞の増殖・肥大を促すため、筋萎縮の治療標的として注目されている(非特許文献１)。また、ミオスタチンの発現量の低下によりがん細胞の増殖は阻害される(非特許文献２)。このことは、がん治療においてミオスタチン量の低下ならびにミオスタチンシグナルの阻害が有効であることを示唆している。さらに、2型糖尿病患者におけるミオスタチン発現量は増加していることから、ミオスタチンと糖尿病との間に何らかの関係があると考えられている (非特許文献３)。これらのことから、ミオスタチンシグナルの阻害が、糖尿病の抑制や進行の阻害に対し有効であることが考えられる。
　これまでに、ミオスタチンに対する抗体あるいはミオスタチン遺伝子のスプライシングを制御して、機能喪失型のmRNAを産生させるアンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)などが開発されてきた（非特許文献４、５）。しかし、臨床的に有用なミオスタチン阻害法は未だ確立されていない。
Bogdanovich et al., Nature, 2002, 420;418-421 Han et al., Redox Biol. 2018, 19;412-4128 Palsgaard et al. 2009, 4;e6575 St Andre et al. Skeletal Muscle 2017,7;25 Kang et al. Mol Ther 2011,19;159-64
　本発明は、ミオスタチンの機能を阻害する方法を提供することを目的とする。
　ミオスタチン(MSTN)遺伝子はエクソンが3つの簡単な構造である。MSTN遺伝子からは1種のmRNAしか産生ないと考えられていたが、発明者らはこの遺伝子の3'非翻訳領域の潜在的スプライスサイトが活性化され、新たにスプライシングバリアントmRNAが産生されることを先に明らかにした（WO2020/179571）。さらに、このmRNAにコードされたアイソフォームがミオスタチン阻害作用を有することを明らかにした。今回、ヒトミオスタチン遺伝子のスプライシング様式を変え、新規のmRNAの産生を促進する核酸医薬を探索した。そして、エクソン3の配列に相補的な配列でENA(2'-O,4'-C-Ethylene-bridged Nucleic Acids)修飾核酸をモノマーとするASOをスクリーニングし、もっとも有効にスプライシングバリアントの産生を促すASOを同定した。さらに、このASOの導入により、細胞でミオスタチンアイソフォームが産生されることを明らかにした。ミオスタチンの機能阻害は筋萎縮の治療標的で、数多くのミオスタチン阻害薬が開発されてきた。しかし、今回のASOのようにスプライシングバリアントを産生させるものは世界で初めてである。
　本発明の要旨は、以下の通りである。
（１）ミオスタチン遺伝子のエクソン３の標的配列に相補的な塩基配列を有する、塩基長１５～３０のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、ミオスタチンのスプライシングバリアントを発現できる前記アンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物。
（２）ミオスタチン遺伝子のエクソン３の塩基配列が配列番号１の塩基配列であり、ミオスタチン遺伝子のエクソン３の標的配列が、配列番号１の塩基配列の塩基番号１０～３３の領域の配列であり、その塩基配列が配列番号２の塩基配列である（１）記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物。
（３）アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号２４、３０、３１、２７、３２、３３又は２８のいずれかの塩基配列（但し、配列中のtはuであってもよく、uはtであってもよい）中の連続する少なくとも１５個の塩基からなる配列を含む（１）又は（２）に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物。
（４）アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基長が１８である（１）～（３）のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物。
（５）アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号２４、３０、３１、２７、３２、３３又は２８のいずれかの塩基配列（但し、配列中のtはuであってもよく、uはtであってもよい）である（４）記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物。
（６）少なくとも１個のヌクレオチドが修飾されている（１）～（５）のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物。
（７）修飾ヌクレオチドを構成する糖がD-リボフラノースであり、D-リボフラノースの2’位の水酸基が修飾されている（６）記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物。
（８）D-リボフラノースが2’-O-アルキル化及び／又は2’-O, 4’-C-アルキレン化されている（７）記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物。
（９）（１）～（８）のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その医薬的に許容できる塩又は溶媒和物を含む、医薬。
（１０）ミオスタチンが関与する病態及び/又は疾病を予防及び/又は治療するための（９）記載の医薬。
（１１）ミオスタチンが関与する病態及び/又は疾病が、筋萎縮である（１０）記載の医薬。
（１２）筋萎縮が筋ジストロフィー、ミオパチー、脊髄性筋萎縮症、サルコペニア及び廃用性筋萎縮からなる群より選択される少なくとも１つである（１１）記載の医薬。
（１３）ミオスタチンが関与する病態及び/又は疾病が、筋量回復により治療効果がもたらされる病態及び/又は疾病である（１０）記載の医薬。
（１４）筋量回復により治療効果がもたらされる病態及び/又は疾病が、ガン悪液質、糖尿病、循環器疾患、腎疾患及び骨疾患からなる群より選択される少なくとも１つである（１３）記載の医薬。
（１５）循環器疾患が心不全及び/又は動脈硬化症であり、腎疾患が慢性腎不全であり、骨疾患が炎症性関節炎である（１４）記載の医薬。
（１６）（１）～（８）のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その食品に許容できる塩又は溶媒和物を含む、食品。
（１７）（１）～（８）のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その飼料に許容できる塩又は溶媒和物を含む、飼料。
（１８）（１）～（８）のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物を含む、筋細胞の増殖及び/又は肥大を促進するための薬剤。
（１９）（１）～（８）のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物を含む、筋量の増加及び/又は筋低下の抑制のための薬剤。
（２０）（１）～（８）のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物を含む、ミオスタチンのスプライシングをミオスタチンからミオスタチンのスプライシングバリアントにスイッチする薬剤。
（２１）（１）～（８）のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物を含む、ミオスタチンシグナルを低下させる薬剤。
（２２）（１）～（８）のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物を含む、抗がん剤。
（２３）（１）～（８）のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物を有効な量で被験者に投与することを含む、ミオスタチンが関与する病態及び/又は疾病を予防及び／又は治療する方法。
（２４）（１）～（８）のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物を有効な量で被験者に投与することを含む、筋細胞の増殖及び/又は肥大を促進する方法。
（２５）（１）～（８）のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物を有効な量で被験者に投与することを含む、筋量の増加及び/又は筋低下の抑制方法。
（２６）（１）～（８）のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物を有効な量で被験者に投与することを含む、ミオスタチンのスプライシングをミオスタチンからミオスタチンのスプライシングバリアントにスイッチする方法。
（２７）（１）～（８）のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物を有効な量で被験者に投与することを含む、ミオスタチンシグナルを低下させる方法。
（２８）（１）～（８）のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物を有効な量で被験者に投与することを含む、がんを予防及び/又は治療する方法。
（２９）ミオスタチンが関与する病態及び/又は疾病を予防及び／又は治療する方法に使用するための、（１）～（８）のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物。
（３０）筋細胞の増殖及び/又は肥大を促進する方法に使用するため、（１）～（８）のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物。
（３１）筋量の増加及び/又は筋低下の抑制方法に使用するための、（１）～（８）のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物。
（３２）ミオスタチンのスプライシングをミオスタチンからミオスタチンのスプライシングバリアントにスイッチする方法に使用するための、（１）～（８）のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物。
（３３）ミオスタチンシグナルを低下させる方法に使用するための、（１）～（８）のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物。
（３４）がんを予防及び/又は治療する方法に使用するための、（１）～（８）のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物。
（３５）ミオスタチンが関与する病態及び/又は疾病を予防及び／又は治療するための、（１）～（８）のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物の使用。
（３６）筋細胞の増殖及び/又は肥大を促進するための、（１）～（８）のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物の使用。
（３７）筋量の増加及び/又は筋低下の抑制のための、（１）～（８）のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物の使用。
（３８）ミオスタチンのスプライシングをミオスタチンからミオスタチンのスプライシングバリアントにスイッチするための、（１）～（８）のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物の使用。
（３９）ミオスタチンシグナルを低下させるための、（１）～（８）のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物の使用。
（４０）がんを予防及び/又は治療するための、（１）～（８）のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物の使用。
　本発明のASOは、MSTN遺伝子のスプライシングを修飾してスプライシングバリアントの産生を促進し、ミオスタチンの新しいアイソフォームの発現を誘導する。この新しいアイソフォームについては、すでにミオスタチン阻害タンパクとして特許申請している（WO2020/179571）。従って、本発明のASOは、新たなミオスタチン阻害薬となる。本発明のASOをヒトへ投与することにより、ミオスタチンの機能を阻害し、筋萎縮の予防・治療が可能となる。具体的には、筋ジストロフィー、ミオパチーなどの筋委縮を主症状とする疾患の治療に応用が可能と考えられる。さらに、サルコペニアの予防あるいはガン悪液質・糖尿病をはじめとして幅広く筋量回復による治療効果が期待される病態・疾病の治療・予防に応用が可能である。
　ミオスタチンスプライシングバリアントの産生を促進し、ミオスタチンのアイソフォームの発現を誘導することにより、ミオスタチンシグナルを阻害することができる。
　本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願2021‐029890の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
選択的スプライシングを促進するASOの探索。MSTN pre-mRNAのスプライシングをMSTN産出からMSTN-b産出へスイッチさせるASOの模式図。数字はMSTN pre-mRNAのエクソンを示す。MSTNはエクソン3の全長を有するのに対し、MSTN-bはエクソン3の一部であるエクソン3sを有する。 MSTN pre-mRNAのイントロン2、エクソン3の配列に相補的なASO。MSTN pre-mRNAに対し、54種のASOを作製。■はMSTN Pre-mRNAに相補的なASOの認識位置を示す。数字はMSTN pre-mRNAのエクソンを示す。 ASO (MSTN_Ex3_BP, MSTN_Ex3_SS, MSTN_Ex3_Fox1, MSTN_Ex3_LESE12, MSTN_Ex3_LESE3, MSTN_Ex3_LESE4) の有効性の比較。(A) MSTN pre-mRNAのイントロン2、エクソン3に対する6種類のASOの認識位置を示す。(B) ヒト横紋筋肉腫細胞 (CRL-2061) にASOをそれぞれ導入し、そのMSTN mRNA, MSTN-b mRNA, GAPDH mRNAのRT-PCRの結果を示す。w/oはASO無処理。黒矢頭はMSTN、白矢頭はMSTN-bを示す。グラフはMSTN-ｂ/全MSTNを割合で示す。独立した3回の実験結果をまとめた。 ASO (MSTN_Ex3_Fox1+6, MSTN_Ex3_Fox1+4, MSTN_Ex3_Fox1+2, MSTN_Ex3_Fox1, MSTN_Ex3_Fox1-2, MSTN_Ex3_Fox1-4, MSTN_Ex3_Fox1-6) の有効性の比較。(A) MSTN pre-mRNAのエクソン3に対する7種類のASOの認識位置を示す。(B) ヒト横紋筋肉腫細胞 (CRL-2061) にASOをそれぞれ導入し、そのMSTN mRNA, MSTN-b mRNA, GAPDH mRNAのRT-PCRの結果を示す。w/oはASO無処理。黒矢頭はMSTN、白矢頭はMSTN-bを示す。グラフはMSTN-ｂ/全MSTNを割合で示す。独立した3回の実験結果をまとめた。**P<0.01。 ASO (MSTN_Ex3_Fox1, MSTN_Ex3_1, MSTN_Ex3_2, MSTN_Ex3_3, MSTN_Ex3_4, MSTN_Ex3_5, MSTN_Ex3_6) の有効性の比較。(A) MSTN pre-mRNAのエクソン3に対する7種類のASOの認識位置を示す。(B) ヒト横紋筋肉腫細胞 (CRL-2061) にASOをそれぞれ導入し、そのMSTN mRNA, MSTN-b mRNA, GAPDH mRNAのRT-PCRの結果を示す。w/oはASO無処理。黒矢頭はMSTN、白矢頭はMSTN-bを示す。グラフはMSTN-ｂ/全MSTNを割合で示す。独立した3回の実験結果をまとめた。*P<0.05。 ASO (MSTN_In2_4, MSTN_In2_3, MSTN_In2_2, MSTN_Ex3_BP, MSTN_Ex3_SS, MSTN_Ex3_7, MSTN_Ex3_Fox1) の有効性の比較。(A) MSTN pre-mRNAのイントロン2、エクソン3に対する7種類のASOの認識位置を示す。(B) ヒト横紋筋肉腫細胞 (CRL-2061) にASOをそれぞれ導入し、そのMSTN mRNA, MSTN-b mRNA, GAPDH mRNAのRT-PCRの結果を示す。w/oはASO無処理。黒矢頭はMSTN、白矢頭はMSTN-bを示す。グラフはMSTN-ｂ/全MSTNを割合で示す。独立した3回の実験結果をまとめた。**P<0.01。 ASO (MSTN_Ex3_7+6, MSTN_Ex3_7+3, MSTN_Ex3_7, MSTN_Ex3_7-3, MSTN_Ex3_7-6, MSTN_Ex3_7-9) の有効性の比較。(A) MSTN pre-mRNAのエクソン3に対する6種類のASOの認識位置を示す。(B) ヒト横紋筋肉腫細胞 (CRL-2061) にASOをそれぞれ導入し、そのMSTN mRNA, MSTN-b mRNA, GAPDH mRNAのRT-PCRの結果を示す。w/oはASO無処理。黒矢頭はMSTN、白矢頭はMSTN-bを示す。グラフはMSTN-ｂ/全MSTNを割合で示す。独立した3回の実験結果をまとめた。*P<0.05, ***P<0.001。 ASO (MSTN_Ex3_7, MSTN_Ex3_7-1, MSTN_Ex3_7-2, MSTN_Ex3_7-3, MSTN_Ex3_7-4, MSTN_Ex3_7-5, MSTN_Ex3_7-6, MSTN_Ex3_7-7, MSTN_Ex3_7-8, MSTN_Ex3_7-9) の有効性の比較。(A) MSTN pre-mRNAのエクソン3に対する10種類のASOの認識位置を示す。(B) ヒト横紋筋肉腫細胞 (CRL-2061) にASOをそれぞれ導入し、そのMSTN mRNA, MSTN-b mRNA, GAPDH mRNAのRT-PCRの結果を示す。w/oはASO無処理。黒矢頭はMSTN、白矢頭はMSTN-bを示す。グラフはMSTN-ｂ/全MSTNを割合で示す。独立した3回の実験結果をまとめた。*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001。 ASO (MSTN_Ex3_8, MSTN_Ex3_9, MSTN_Ex3_10, MSTN_Ex3_11, MSTN_Ex3_12) の有効性の比較。(A) MSTN pre-mRNAのエクソン3に対する5種類のASOの認識位置を示す。(B) ヒト横紋筋肉腫細胞 (CRL-2061) にASOをそれぞれ導入し、そのMSTN mRNA, MSTN-b mRNA, GAPDH mRNAのRT-PCRの結果を示す。w/oはASO無処理。黒矢頭はMSTN、白矢頭はMSTN-bを示す。グラフはMSTN-ｂ/全MSTNを割合で示す。独立した3回の実験結果をまとめた。***P<0.001。 ASO (MSTN_Ex3_13, MSTN_Ex3_14, MSTN_Ex3_15) の有効性の比較。(A) MSTN pre-mRNAのエクソン3に対する3種類のASOの認識位置を示す。(B) ヒト横紋筋肉腫細胞 (CRL-2061) にASOをそれぞれ導入し、そのMSTN mRNA, MSTN-b mRNA, GAPDH mRNAのRT-PCRの結果を示す。w/oはASO無処理。黒矢頭はMSTN、白矢頭はMSTN-bを示す。グラフはMSTN-ｂ/全MSTNを割合で示す。独立した3回の実験結果をまとめた。 ASO (MSTN_Ex3_16, MSTN_Ex3_17, MSTN_Ex3_18, MSTN_Ex3_19) の有効性の比較。(A) MSTN pre-mRNAのエクソン3に対する4種類のASOの認識位置を示す。(B) ヒト横紋筋肉腫細胞 (CRL-2061) にASOをそれぞれ導入し、そのMSTN mRNA, MSTN-b mRNA, GAPDH mRNAのRT-PCRの結果を示す。w/oはASO無処理。黒矢頭はMSTN、白矢頭はMSTN-bを示す。グラフはMSTN-ｂ/全MSTNを割合で示す。独立した3回の実験結果をまとめた。 ASO (MSTN_Ex3_20, MSTN_Ex3_21, MSTN_Ex3_22, MSTN_Ex3_23) の有効性の比較。(A) MSTN pre-mRNAのエクソン3に対する4種類のASOの認識位置を示す。(B) ヒト横紋筋肉腫細胞 (CRL-2061) にASOをそれぞれ導入し、そのMSTN mRNA, MSTN-b mRNA, GAPDH mRNAのRT-PCRの結果を示す。w/oはASO無処理。黒矢頭はMSTN、白矢頭はMSTN-bを示す。グラフはMSTN-ｂ/全MSTNを割合で示す。独立した3回の実験結果をまとめた。 ASO (MSTN_Ex3_24, MSTN_Ex3_25, MSTN_Ex3_26, MSTN_Ex3_27, MSTN_Ex3_28) の有効性の比較。(A) MSTN pre-mRNAのエクソン3に対する5種類のASOの認識位置を示す。(B) ヒト横紋筋肉腫細胞 (CRL-2061) にASOをそれぞれ導入し、そのMSTN mRNA, MSTN-b mRNA, GAPDH mRNAのRT-PCRの結果を示す。w/oはASO無処理。黒矢頭はMSTN、白矢頭はMSTN-bを示す。グラフはMSTN-ｂ/全MSTNを割合で示す。独立した3回の実験結果をまとめた。 ASO投与によるミオスタチン-b発現。プロミオスタチンならびにミオスタチン-bタンパクの模式図を示す (左図)。各ドメインとアミノ酸番号を示す。プロミオスタチンは全375アミノ酸、ミオスタチン-bは全251アミノ酸から成る。プロミオスタチンとミオスタチン-bのアミノ酸番号1～250の配列は共通で、ミオスタチン-bは251番目のアミノ酸がバリンである。MSTNのエクソン3には250～375番目のアミノ酸がコードされ、MSTN-bのエクソン3sには250、251番目のアミノ酸がコードされる。ミオスタチン (成熟ミオスタチン) はMSTN mRNAから翻訳されたプロミオスタチンのactive domainがプロテアーゼにより切り出されることにより産出されるため、active domainをコードする領域を保時していないMSTN-b mRNAからは産出されない。MSTN_Ex3_7-2 ASO処理後のミオスタチンとアクチンの発現を検証した (右図)。ASO処理でプロミオスタチン二量体が減少し、ミオスタチン-b二量体、ミオスタチン-b単量体の発現が確認された。 ASO投与によるミオスタチンシグナル低下。ミオスタチンのin vitroミオスタチン転写活性測定系への作用の模式図を示す (左図)。ミオスタチン (成熟ミオスタチン) が受容体に結合すると転写因子Samd2/3が活性化され、標的遺伝子の転写が活性化される。in vitroミオスタチン転写活性測定系ではミオスタチンにより活性化されるSamd2/3の標的遺伝子にルシフェラーゼレポーター遺伝子を使用しており、ミオスタチンシグナルをルシフェラーゼの活性により評価できる。MSTN_Ex3_7-2 ASOを横紋筋肉腫細胞 (CRL-2061) に投与し、in vitroミオスタチン転写活性測定系によりミオスタチンシグナルを評価した (右図)。ルシフェラーゼ活性 (ルシフェラーゼ活性/β-ガラクトシダーゼ活性) を、ASO投与無 (w/o) の細胞由来の抽出液を測定した結果を１として、相対値で示した。独立した2回の実験結果をまとめた。 種間の保存性が高いASOの標的配列。ヒト、イヌ、マウス、トリ、ウシ、ブタ、ヒツジのMSTNエクソン３の核酸配列のアライメントを示す。下線はヒトMSTNと同じ配列である。 MSTN_Ex3_7-2のENA配置を変えたASO (MSTN_Ex3_7-2a, MSTN_Ex3_7-2b, MSTN_Ex3_7-2c, MSTN_Ex3_7-2d, MSTN_Ex3_7-2e, MSTN_Ex3_7-2f, MSTN_Ex3_7-2g, MSTN_Ex3_7-2h, MSTN_Ex3_7-2i) の有効性の比較。ヒト横紋筋肉腫細胞 (CRL-2061) にASOをそれぞれ導入し、そのMSTN mRNA, MSTN-b mRNA, GAPDH mRNAのRT-PCRの結果を示す。ConはASO無処理。黒矢頭はMSTN、白矢頭はMSTN-bを示す。グラフはMSTN-ｂ/全MSTNを割合で示す。独立した3回の実験結果をまとめた。*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001。 MSTN_Ex3_7-2bの濃度依存性の検討。ヒト横紋筋肉腫細胞 (CRL-2061) にASOを最終濃度0, 25, 50, 75, 100, 200 nMで投与し、そのMSTN mRNA, MSTN-b mRNA, GAPDH mRNAのRT-PCRの結果を示す。黒矢頭はMSTN、白矢頭はMSTN-bを示す。グラフはMSTN-ｂ/全MSTNを割合で示す。独立した3回の実験結果をまとめた。***P<0.001。 MSTN_Ex3_7-2b投与による濃度依存的なミオスタチンシグナルの低下。ヒト横紋筋肉腫細胞 (CRL-2061) にASOを最終濃度0, 25, 50, 75, 100, 200, 300, 400 nMで投与し、in vitroミオスタチン転写活性測定系によりミオスタチンシグナルを評価した。それぞれの濃度でASOを投与した細胞由来のルシフェラーゼ活性 (ルシフェラーゼ活性/β-ガラクトシダーゼ活性) を示した。IC50は87.4 nMであった。独立した3回の実験結果をまとめた。*P<0.05, ***P<0.001。 ヒト筋芽細胞 にMSTN_Ex3_7-2bを最終濃度0, 1, 5, 10, 25, 50, 100 nMで投与し、CCK-8による細胞増殖試験を行なった。投与3日目の結果を示す。独立した3回の実験結果をまとめた。*P<0.05, ***P<0.001。 ヒト横紋筋肉腫細胞 (CRL-2061) にMSTN_Ex3_7-2bを最終濃度0, 1, 5, 10, 25, 50, 100 nMで投与し、CCK-8による細胞増殖試験を行なった。投与3日目の結果を示す。独立した3回の実験結果をまとめた。*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001。
　以下、本発明の実施の形態についてより詳細に説明する。
　本発明は、ミオスタチン遺伝子のエクソン３の標的配列に相補的な塩基配列を有する、塩基長１５～３０のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、ミオスタチンのスプライシングバリアントを発現できる前記アンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物を提供する。本発明者らは、以前に培養細胞においてミオスタチン（MSTN）のアイソフォームであるミオスタチン-b(MSTN-b)の発現がミオスタチンシグナルを低下させることを示した (WO2020/179571)。このことから、ミオスタチン-bはミオスタチンを阻害し、筋形成を促進させることが示唆されている。MSTN-bの塩基配列を配列番号６８に示す。ミオスタチンはＮ末からシグナルペプチド (1番～18番)、プロドメイン (19番～266番)、成熟ミオスタチン (267番～375番) で構成される。ミオスタチンとミオスタチン-bの核酸配列は、エクソン１、エクソン２は同じで、アミノ酸249まで共通である。ミオスタチン-bでは、エクソン３の塩基配列が異なるため、Ｎ末から250番目のアミノ酸がアスパラギン (Ｎ)、251番目がバリン (Ｖ)、252番目はストップコドン (＊) となる。このため、ミオスタチン-bは成熟ミオスタチンのドメインを持たない。ミオスタチン-bタンパク質のアミノ酸配列を配列番号６９に示す。ミオスタチンのアミノ酸配列を配列番号70に示す。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドにより、ミオスタチンからミオスタチン-bにスプライシングをスイッチさせることができる。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ミオスタチンを発現する細胞において、タンパクレベルでミオスタチンを減少させたり、ミオスタチン-bを増加させることができる。さらに、ミオスタチンシグナルを低下させることもできる。
　ヒトミオスタチン遺伝子のエクソン３の塩基配列を配列番号１に示す。本発明において、ミオスタチン遺伝子のエクソン３の塩基配列が配列番号１の塩基配列である場合、ミオスタチン遺伝子のエクソン３の標的配列は、配列番号１の塩基配列の塩基番号１０～３３の領域内に存在するとよい。配列番号１の塩基配列の塩基番号１０～３３の領域の塩基配列を配列番号２に示す。本発明において、「標的配列」とは、その配列の全部又は一部に相補的な配列を持つASOにより、ミオスタチンのスプライシングバリアントの産生が促される配列をいう。ミオスタチンのスプライシングバリアントの産生を促すASOは、配列番号２の塩基配列中の連続する少なくとも１５個の塩基からなる配列に相補的な配列を含むとよい。
　さらに、本発明においては、アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号２４、３０、３１、２７、３２、３３又は２８のいずれかの塩基配列（但し、配列中のtはuであってもよく、uはtであってもよい）中の連続する少なくとも１５個の塩基からなる配列を含むとよい。配列番号２４、３０、３１、２７、３２、３３及び２８の塩基配列は、配列番号２の塩基配列中の塩基番号７～１８の領域の配列に相補的な配列を共通に持つ。配列番号６１～６７の配列は、配列番号３１の配列中のtをuに変えた配列の例である。
　アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基長は１８であってもよく、アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号２４、３０、３１、２７、３２、３３又は２８のいずれかの塩基配列（但し、配列中のtはuであってもよく、uはtであってもよい）であってもよい。
　アンチセンスオリゴヌクレオチドを構成するヌクレオチドは、天然型DNA、天然型RNA、これらの修飾体のいずれであってもよいが、少なくとも１つが修飾ヌクレオチドであることが好ましい。
　修飾ヌクレオチドとしては、糖が修飾されたもの（例えば、Ｄ－リボフラノースが2'-O-アルキル化されたもの、Ｄ－リボフラノースが2'-O, 4'-C-アルキレン化されたものなどのD-リボフラノースの2’位の水酸基が修飾されたもの）、リン酸ジエステル結合が修飾（例えば、チオエート化）されたもの、塩基が修飾されたもの、それらを組み合わせたものなどを例示することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドを構成する少なくとも１個のＤ－リボフラノースが2'-O-アルキル化されたものや2'-O, 4'-C-アルキレン化されたものは、ＲＮＡに対する結合力が高いこと、ヌクレアーゼに対する耐性が高いことから、天然型のヌクレオチド（すなわち、オリゴＤＮＡ、オリゴＲＮＡ）より高い治療効果が期待できる。また、オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも１個のリン酸ジエステル結合がチオエート化されたものも、ヌクレアーゼに対する耐性が高いことから、天然型のヌクレオチド（すなわち、オリゴＤＮＡ、オリゴＲＮＡ）より高い治療効果が期待できる。上記のような修飾された糖と修飾されたリン酸の両者を含むオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼに対する耐性がより高いことから、さらに高い治療効果が期待できる。
　アンチセンスオリゴヌクレオチドについて、糖の修飾の例としては、Ｄ－リボフラノースの2'-O-アルキル化（例えば、2'-O-メチル化、2'-O-アミノエチル化、2'-O-プロピル化、2'-O-アリル化、2'-O-メトキシエチル化、2'-O-ブチル化、2'-O-ペンチル化、2'-O-プロパルギル化など）、Ｄ－リボフラノースの2'-O,4'-C-アルキレン化（例えば、2'-O,4'-C-エチレン化、2'-O,4'-C-メチレン化、2'-O,4'-C-プロピレン化、2'-O,4'-C-テトラメチレン化、2'-O,4'-C-ペンタメチレン化など）、3'-デオキシ-3'-アミノ-2'-デオキシ-D-リボフラノース、3'-デオキシ-3'-アミノ-2'-デオキシ-2'-フルオロ-D-リボフラノースなどを挙げることができる。
　アンチセンスオリゴヌクレオチドについて、リン酸ジエステル結合の修飾の例としては、ホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合、メチルチオホスホネート結合、ホスホロジチオエート結合、ホスホロアミデート結合などを挙げることができる。
　アンチセンスオリゴヌクレオチドについて、塩基の修飾の例としては、シトシンの5-メチル化、5-フルオロ化、5-ブロモ化、5-ヨード化、N4-メチル化、チミジンの5-デメチル化（ウラシル）、5-フルオロ化、5-ブロモ化、5-ヨード化、アデニンのN6-メチル化、8-ブロモ化、グアニンのN2-メチル化、8-ブロモ化、ウリジンのシュードウリジン化、1-メチルシュードウリジン化などを挙げることができる。
　本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、塩の形態であってもよい。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを医薬に用いる場合には、塩は医薬的に許容される塩であるとよく、そのような塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩などの金属塩；アンモニウム塩のような無機塩、ｔ－オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ－メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ－ベンジル－フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニウム塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩のような有機塩などのアミン塩；弗化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、沃化水素酸塩のようなハロゲン原子化水素酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、燐酸塩などの無機酸塩；メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩のような低級アルカンルスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩のようなアリールスルホン酸塩、酢酸塩、リンゴ酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、蓚酸塩、マレイン酸塩などの有機酸塩；グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩のようなアミノ酸塩などを挙げることができる。これらの塩は、公知の方法で製造することができる。
　また、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、溶媒和物（例えば、水和物）としても存在することがあり、そのような溶媒和物であってもよい。
　さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、プロドラッグの形態で投与されてもよく、プロドラッグとしては、アミド、エステル、カルバミン酸塩、炭酸塩、ウレイド、リン酸塩などを挙げることができる。これらのプロドラッグは、公知の方法で製造することができる。
　アンチセンスオリゴヌクレオチドの合成方法としては、従来公知の方法が採用できる。前記合成方法は、例えば、遺伝子工学的手法による合成法、化学合成法等が挙げられる。遺伝子工学的手法は、例えば、インビトロ転写合成法、ベクターを用いる方法、PCRカセットによる方法が挙げられる。前記ベクターは、特に制限されず、プラスミド等の非ウイルスベクター、ウイルスベクター等が挙げられる。前記化学合成法は、特に制限されず、例えば、ホスホロアミダイト法及びH-ホスホネート法等が挙げられる。前記化学合成法は、例えば、市販の自動核酸合成機を使用可能である。前記化学合成法は、一般に、アミダイトが使用される。前記アミダイトは、特に制限されず、後述の実施例においては、アンチセンスオリゴヌクレオチドはENA-2CEホスホロアミダイトおよび2'-OMe-2CEホスホロアミダイトを用いてホスホロアミダイト法で合成した。
　ホスホロアミダイト試薬は、天然型のヌクレオシド及び2'-O-メチルヌクレオシド（すなわち、2'-O-メチルグアノシン、2'-O-メチルアデノシン、2'-O-メチルシトシン、2'-O-メチルウリジン）については、市販の試薬を用いることができる。アルキル基の炭素数が２～６個の2'-O-アルキルグアノシン、アデノシン、シトシンおよびウリジンについては、以下の通りである。
　2'-O-アミノエチルグアノシン、アデノシン、シトシン、ウリジンは、文献（Blommers et al. Biochemistry (1998), 37, 17714-17725.）に従って合成できる。
　2'-O-プロピルグアノシン、アデノシン、シトシン、ウリジンは、文献（Lesnik,E.A. et al. Biochemistry (1993), 32, 7832-7838.）に従って合成できる。
　2'-O-アリルグアノシン、アデノシン、シトシン、ウリジンは、市販の試薬を用いることができる。
　2'-O-メトキシエチルグアノシン、アデノシン、シトシン、ウリジンは、特許（US6261840）または、文献（Martin, P. Helv. Chim. Acta. (1995) 78, 486-504.に従って合成できる。
　2'-O-ブチルグアノシン、アデノシン、シトシン、ウリジンは、文献（Lesnik,E.A. et al. Biochemistry (1993), 32, 7832-7838.）に従って合成できる。
　2'-O-ペンチルグアノシン、アデノシン、シトシン、ウリジンは、文献（Lesnik,E.A. et al. Biochemistry (1993), 32, 7832-7838.）に従って合成できる。
　2'-O-プロパルギルグアノシン、アデノシン、シトシン、ウリジンは、市販の試薬を用いることができる。
　2'-O, 4'-C-メチレングアノシン、アデノシン、5-メチルシトシンおよびチミジンについては、WO99/14226に記載の方法に従って、アルキレン基の炭素数が２～５個の2'-O, 4'-C-アルキレングアノシン、アデノシン、5-メチルシトシンおよびチミジンについては、WO00/47599に記載の方法に従って製造することができる。
　ホスホロアミダイト試薬をカップリング後、硫黄、テトラエチルチウラムジスルフィド（TETD、アプライドバイオシステム社）、Beaucage試薬（Glen Research社）、または、キサンタンヒドリドなどの試薬を反応させることにより、ホスホロチオエート結合を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを合成することができる（Tetrahedron Letters, 32, 3005 (1991), J. Am. Chem. Soc. 112, 1253 (1990), PCT/WO98/54198）。
　合成機で用いるコントロールド　ポア　グラス（CPG）としては、2'-O-メチルヌクレオシドの結合したものは、市販のものを利用することができる。また、2'-O, 4'-C-メチレングアノシン、アデノシン、5-メチルシトシンおよびチミジンについては、WO99/14226に記載の方法に従って、アルキレン基の炭素数が２～５個の2'-O, 4'-C-アルキレングアノシン、アデノシン、5-メチルシトシンおよびチミジンについては、WO00/47599に記載の方法に従って製造したヌクレオシドを文献（Oligonucleotide Synthesis, Edited by M.J.Gait, Oxford University Press, 1984）に従って、CPGに結合することができる。修飾されたCPG（特開平７－８７９８２の実施例１２ｂに記載）を用いることにより、3'末端に2-ヒドロキシエチルリン酸基が結合したオリゴヌクレオチドを合成できる。また、3'-amino-Modifier C3 CPG, 3'-amino-Modifier C7 CPG, Glyceryl CPG, (Glen Research), 3'-specer C3 SynBase CPG 1000, 3'-specer C9 SynBase CPG 1000（link technologies）を使えば、3'末端にヒドロキシアルキルリン酸基、または、アミノアルキルリン酸基が結合したオリゴヌクレオチドを合成できる。
　本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、医薬に使用することができる。医薬として用いる場合、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、その医薬的に許容される塩、溶媒和物又はプロドラッグの形態であってもよい。よって、本発明は、上記のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その医薬的に許容できる塩又は溶媒和物を含む、医薬を提供する。医薬は、ミオスタチンが関与する病態及び/又は疾病を予防及び/又は治療するためのものであるとよく、ミオスタチンが関与する病態及び/又は疾病としては、筋萎縮（例えば、筋萎縮が筋ジストロフィー、ミオパチー、脊髄性筋萎縮症、サルコペニア、廃用性筋萎縮など）、筋量回復により治療効果がもたらされる病態及び/又は疾病（例えば、ガン悪液質、糖尿病、循環器疾患（心不全、動脈硬化症など）、腎疾患（慢性腎不全など）、骨疾患（炎症性関節炎など）など）を挙げることができる。ミオスタチンの阻害は、骨格筋量の増加をもたらすことから、筋萎縮の原因に関わらず全ての筋萎縮を呈する疾患の治療に用いることが可能と考えられる。骨格筋量の増加は運動量の増加を図り、全身の代謝の改善にも貢献する。また、心筋へ作用してその機能を回復させることが期待できる。一方、ミオスタチン阻害が、破骨細胞に作用して骨破壊を抑制すること、血管内皮細胞の恒常性維持能を活性化すること、アポトーシスを誘導すること、インスリンの感受性を高めることなども期待される。本発明は、上記のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物を有効な量で被験者に投与することを含む、ミオスタチンが関与する病態及び/又は疾病を予防及び／又は治療する方法も提供する。また、本発明は、ミオスタチンが関与する病態及び/又は疾病を予防及び／又は治療する方法に使用するための、上記のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物を提供する。さらに、本発明は、ミオスタチンが関与する病態及び/又は疾病を予防及び／又は治療するための、上記のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物の使用を提供する。
　本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その医薬的に許容される塩、溶媒和物又はプロドラッグ（以下、「有効成分」と記す。）は単独で、あるいは、薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とともに、適当な剤型の製剤として、哺乳動物（例えば、ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス）に対して経口的または非経口的に投与することができる。投与量は投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、筋萎縮性疾患（例えば、筋ジストロフィー）の予防・治療のために使用する場合には、有効成分の１回量として、通常0.1～50mｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは0.5 mｇ／ｋｇ体重程度を、週１～月１回程度の頻度で、好ましくは年１回程度の頻度で、経口・筋肉内注射・皮下注射・静脈注射により投与（好ましくは、連続または隔日投与）するとよい。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合にはその症状に応じて増量してもよい。他の疾患についても、上記の投与量を参考にして、適宜増減した量で投与するとよい。
　経口投与のための製剤としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などがあげられる。かかる製剤は常法により製造することができ、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有してもよい。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、庶糖、ステアリン酸マグネシウムなどがあげられる。
　非経口投与のための製剤としては、例えば、注射剤、坐剤などがあげられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤などの剤型であるとよい。かかる注射剤は常法、すなわち有効成分を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製される。注射用の水性液としては生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などがあげられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノール）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ－５０（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（５０ｍｏｌ）ａｄｄｕｃｔ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ  ｃａｓｔｏｒ  ｏｉｌ））などと併用してもよい。油性液としてはゴマ油、大豆油などがあげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。調製された注射液は通常適当なアンプルに充填される。直腸投与に用いられる坐剤は、有効成分を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製することができる。
　上記の経口用または非経口用医薬製剤は、有効成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されるとよい。かかる投薬単位の剤形としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤などが挙げられ、それぞれの投薬単位剤形当り通常０．１～１．０００ ｍｇの有効成分が含有されていることが好ましい。
　本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、食品、飼料にも利用することができる。例えば、食品や飼料の添加物として、あるいは、ヒト又は動物用のサプリメントとして、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いる。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、食品又は飼料として許容できる塩、溶媒和物又はプロドラッグの形態であってもよい。よって、本発明は、上記のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その食品に許容できる塩又は溶媒和物を含む、食品を提供する。また、本発明は、上記のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その飼料に許容できる塩又は溶媒和物を含む、飼料を提供する。食品又は飼料として許容できる塩、溶媒和物又はプロドラッグの一例として、医薬的に許容できる塩、溶媒和物又はプロドラッグを挙げることができ、それらについては上述した。
　本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、筋細胞の増殖及び/又は肥大を促進することができる。筋細胞は、ヒトや動物の筋肉組織を形成する収縮性のある細胞であり、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞などが含まれる。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドによるミオスタチン阻害は筋芽細胞において効果があり、筋芽細胞の増殖促進・分化促進を誘導することで、結果的に筋細胞の増殖/肥大を引き起こしうる。筋細胞には、筋芽細胞のような前駆細胞も含まれる。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、塩、溶媒和物又はプロドラッグの形態であってもよい。塩、溶媒和物又はプロドラッグの一例として、医薬的に許容できる塩、溶媒和物又はプロドラッグを挙げることができ、それらについては上述した。動物はミオスタチンを発現しているものであればよく、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ニワトリ、シチメンチョウなどの哺乳動物、サケ、マス、タラ、マグロ、ブリなどの魚類などの使役用、食用の飼育動物を例示することができる。よって、本発明は、上記のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物を含む、筋細胞の増殖及び/又は肥大を促進するための薬剤を提供する。また、本発明は、上記のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物を有効な量で被験者に投与することを含む、筋細胞の増殖及び/又は肥大を促進する方法を提供する。本発明は、筋細胞の増殖及び/又は肥大を促進する方法に使用するための、上記のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物も提供する。本発明は、筋細胞の増殖及び/又は肥大を促進するための、上記のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物の使用も提供する。被験者は、ヒト又は動物でありうる。動物については上述した。薬剤の剤型、投与量、投与ルート、投与頻度などは、上述の医薬に準じるものであるとよく、所望の効果が得られるように適宜変更しうる。
　また、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトや動物の筋量の増加や筋低下の抑制に用いることができる。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、塩、溶媒和物又はプロドラッグの形態であってもよい。塩、溶媒和物又はプロドラッグの一例として、医薬的に許容できる塩、溶媒和物又はプロドラッグを挙げることができ、それらについては上述した。動物はミオスタチンを発現しているものであればよく、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ニワトリ、シチメンチョウなどの哺乳動物、サケ、マス、タラ、マグロ、ブリなどの魚類などの使役用、食用の飼育動物を例示することができる。よって、本発明は、上記のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物を含む、筋量の増加及び/又は筋低下の抑制のための薬剤を提供する。また、本発明は、上記のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物を有効な量で被験者に投与することを含む、筋量の増加及び/又は筋低下の抑制方法を提供する。本発明は、筋量の増加及び/又は筋低下の抑制方法に使用するための、上記のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物も提供する。本発明は、筋量の増加及び/又は筋低下の抑制のための、上記のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物の使用も提供する。被験者は、ヒト又は動物でありうる。動物については上述した。薬剤の剤型、投与量、投与ルート、投与頻度などは、上述の医薬に準じるものであるとよく、所望の効果が得られるように適宜変更しうる。
　本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その食品に許容できる塩、溶媒和物又はプロドラッグを添加する食品は、植物性食品、動物性食品、真菌類性食品、生鮮食品、加工食品、指向食品、調理・調味用材料、飲料、健康食品、宇宙食、ペットフードなどいかなる食品であってもよい。
　本発明の食品には、たんぱく質、脂質、炭水化物、ナトリウムなどの一般成分、カリウム、カルシウム、マグネシウム、リンなどのミネラル類、鉄、亜鉛、銅、セレン、クロムなどの微量元素、ビタミンＡ、β－カロテン、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ、ナイアシン、葉酸、ビタミンＤ３、ビタミンＥ、ビオチン、パントテン酸などのビタミン類、コエンザイムQ10、α－リポ酸、ガラクトオリゴ糖、食物繊維、賦形剤（水、カルボキシメチルセルロース、乳糖など）、甘味料、矯味剤（リンゴ酸、クエン酸、アミノ酸など）、香料などを添加してもよい。本発明の食品を液剤とする場合、食品成分を分散または溶解する液体として、水、生理食塩水、スープ、牛乳、果汁等を用いることができる。本発明の食品は、粉末、顆粒、錠剤、液剤などの形状としてもよい。病人や高齢者が容易に摂取可能とするためには、ゼリーなどのゲル状製品とすることが好ましい。
　本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その飼料に許容できる塩、溶媒和物又はプロドラッグを添加する飼料は、穀類、植物性油粕類、ヌカ類、製造粕類、動物性飼料などの単体飼料、複数の飼料原料や飼料添加物を配合した配合飼料などいかなる飼料であってもよい。
　本発明の飼料には、抗酸化剤（エトキシキン、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソールなど）、防かび剤（プロピオン酸、プロピオン酸カルシウム、プロピオン酸ナトリウムなど）、粘結剤（アルギン酸ナトリウム、カゼインナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、プロピレングリコール、ポリアクリル酸ナトリウムなど）、乳化剤（グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステルなど）、調整剤（ギ酸など）、アミノ酸等（アミノ酢酸、ＤＬ－アラニン、Ｌ－アルギニン、塩酸Ｌ－リジン、Ｌ－カルニチン、グアニジノ酢酸、Ｌ－グルタミン酸ナトリウム、タウリン、２－デアミノ－２－ヒドロキシメチオニン、ＤＬ－トリプトファン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－トレオニン、Ｌ－バリン、ＤＬ－メチオニン、硫酸Ｌ－リジンなど）、ビタミン（Ｌ－アスコルビン酸、Ｌ－アスコルビン酸カルシウム、Ｌ－アスコルビン酸ナトリウム、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸エステルナトリウムカルシウム、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸エステルマグネシウム、アセトメナフトン、イノシトール、塩酸ジベンゾイルチアミン、エルゴカルシフェロール、塩化コリン、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシン、β－カロチン、コレカルシフェロール、酢酸ｄｌ－α－トコフェロール、シアノコバラミン、硝酸チアミン、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、パラアミノ安息香酸、Ｄ－パントテン酸カルシウム、ＤＬ－パントテン酸カルシウム、ｄ－ビオチン、ビタミンＡ粉末、ビタミンＡ油、ビタミンＤ粉末、ビタミンＤ３油、ビタミンＥ粉末、２５－ヒドロキシコレカルシフェロール、メナジオン亜硫酸水素ジメチルピリミジノール、メナジオン亜硫酸水素ナトリウム、葉酸、リボフラビン、リボフラビン酪酸エステルなど）、ミネラル（塩化カリウム、クエン酸鉄、グルコン酸カルシウム、コハク酸クエン酸鉄ナトリウム、酸化マグネシウム、水酸化アルミニウム、炭酸亜鉛、炭酸コバルト、炭酸水素ナトリウム、炭酸マグネシウム、炭酸マンガン、２－デアミノ－２－ヒドロキシメチオニン亜鉛、ＤＬ－トレオニン鉄、乳酸カルシウム、フマル酸第一鉄、ペプチド亜鉛、ペプチド鉄、ペプチド銅、ペプチドマンガン、ヨウ化カリウム、ヨウ素酸カリウム、ヨウ素酸カルシウム、硫酸亜鉛（乾燥）、硫酸亜鉛（結晶）、硫酸亜鉛メチオニン、硫酸ナトリウム（乾燥）、硫酸マグネシウム（乾燥）、硫酸マグネシウム（結晶）、硫酸コバルト（乾燥）、硫酸コバルト（結晶）、硫酸鉄（乾燥）、硫酸銅（乾燥）、硫酸銅（結晶）、硫酸マンガン、リン酸一水素カリウム（乾燥）、リン酸一水素ナトリウム（乾燥）、リン酸二水素カリウム（乾燥）、リン酸二水素ナトリウム（乾燥）、リン酸二水素ナトリウム（結晶）など）、色素、合成抗菌剤、抗生物質、着香料、呈味剤、酵素、生菌剤、有機酸などを添加してもよい。
　食品や飼料の摂取は、所望の効果（例えば、筋肉形成の促進）が確認されるような摂取量と頻度、摂取期間で行うとよい。
　本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ミオスタチンのスプライシングをミオスタチンからミオスタチンのスプライシングバリアントにスイッチすることができる。よって、本発明は、上記のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、ミオスタチンのスプライシングをミオスタチンからミオスタチンのスプライシングバリアントにスイッチする薬剤を提供する。本発明の薬剤は、ヒトや動物用の医薬として、食品や飼料への添加物やサプリメントとして、動物の成長促進剤として、あるいはまた、実験用試薬として用いることができる。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、塩、溶媒和物又はプロドラッグの形態であってもよい。塩、溶媒和物又はプロドラッグの一例として、医薬的に許容できる塩、溶媒和物又はプロドラッグを挙げることができ、それらについては上述した。また、本発明は、上記のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物を有効な量で被験者に投与することを含む、ミオスタチンのスプライシングをミオスタチンからミオスタチンのスプライシングバリアントにスイッチする方法を提供する。本発明は、ミオスタチンのスプライシングをミオスタチンからミオスタチンのスプライシングバリアントにスイッチする方法に使用するための、上記のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物も提供する。本発明は、ミオスタチンのスプライシングをミオスタチンからミオスタチンのスプライシングバリアントにスイッチするための、上記のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物の使用も提供する。
　本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ミオスタチンシグナルを低下させることができる。よって、本発明は、上記のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、ミオスタチンシグナルを低下させる薬剤を提供する。本発明のミオスタチンシグナル低下剤は、ヒトや動物用の医薬として、食品や飼料への添加物やサプリメントとして、動物の成長促進剤として、あるいはまた、実験用試薬として用いることができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、塩、溶媒和物又はプロドラッグの形態であってもよい。塩、溶媒和物又はプロドラッグの一例として、医薬的に許容できる塩、溶媒和物又はプロドラッグを挙げることができ、それらについては上述した。また、本発明は、上記のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物を有効な量で被験者に投与することを含む、ミオスタチンシグナルを低下させる方法を提供する。本発明は、ミオスタチンシグナルを低下させる方法に使用するための、上記のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物も提供する。本発明は、ミオスタチンシグナルを低下させるための、上記のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物の使用も提供する。ミオスタチンシグナルの阻害が、糖尿病の抑制や進行の阻害に対し有効であることが考えられることから、上記のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物は糖尿病の予防及び/又は治療に有効でありうる。よって、本発明は、上記のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物を含む、糖尿病の予防及び/又は治療剤も提供する。
　実験用試薬として用いる場合には、ミオスタチンを発現する細胞、組織又は器官を本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物で処理することにより、ミオスタチンのスプライシングをミオスタチンからミオスタチンのスプライシングバリアントにスイッチし、ミオスタチンアイソフォームの発現を誘導することができ、このアイソフォームによりミオスタチンシグナルを阻害することができる。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩及び溶媒和物は、所望の機能を発揮するのに有効な量で用いればよい。ミオスタチンを発現する細胞としては、筋細胞、筋肉腫細胞、消化器・肺・食道などのがん細胞などを例示することができる。また、天然由来の細胞の他、ミオスタチン遺伝子を導入した組み換え細胞を例示することもできる。ミオスタチンを発現する組織及び器官としては、骨格筋、心筋、血管、腎臓、消化管、子宮, 肝臓、膵臓、肺などを例示することができる。ミオスタチンのスプライシングをミオスタチンからミオスタチンのスプライシングバリアントにスイッチすることは、サンプル中のミオスタチンスプライシングバリアントのmRNAをRT-PCRで解析したり、サンプル中のミオスタチンスプライシングバリアントから翻訳されるタンパク質をウェスタンブロット法で検出したり、質量分析法で検出したりすることにより解析することができる。
　本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、がん細胞の増殖を阻害することができる。がん細胞としては、横紋筋肉腫細胞、肝がん細胞、子宮頸がん細胞、肺胞基底上皮腺がん細胞などを挙げることができる。よって、本発明は、上記のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、抗がん剤を提供する。本発明の抗がん剤の適応症としては、肉腫、肝臓がん、子宮頸がん、肺がんなどのがんを挙げることができる。本発明の抗がん剤は、ヒトや動物用の医薬として用いることができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、塩、溶媒和物又はプロドラッグの形態であってもよい。塩、溶媒和物又はプロドラッグの一例として、医薬的に許容できる塩、溶媒和物又はプロドラッグを挙げることができ、それらについては上述した。また、本発明は、上記のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物を有効な量で被験者に投与することを含む、がんを予防及び/又は治療する方法を提供する。本発明は、がんを予防及び/又は治療する方法に使用するための、上記のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物も提供する。本発明は、がんを予防及び/又は治療するための、上記のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物の使用も提供する。がんの予防は、がんの再発予防を含む概念である。
　以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
〔実施例１～54〕アンチセンスオリゴヌクレオチド (ASO) の合成
　MSTN-bを産出する選択的スプライシングを促進するASO (図1) の探索のため、表１に示すアンチセンスオリゴヌクレオチド (ASO) を合成した。MSTN pre-mRNAに相補的なASOの認識場所を図2に示す。ASOの配列中のA (アデニン)、G (グアニン)、C （シトシン)およびT (チミン)に修飾核酸のENA (2'-O,4'-C-Ethylene-bridged Nucleic Acids) を導入し、親和性と安定性を向上させた。
gaaCaaTCagTaaTaTCa （MSTN_Ex3_BP） の合成 (実施例１)
　核酸自動合成機 (日本テクノサービス社製DNA/RNA合成装置 NTS H-６) を用い、1μmolスケールで行った。各合成サイクルにおける溶媒、試薬、ホスホロアミダイトの濃度は天然オリゴヌクレオチド合成の場合と同じであり、試薬、2'-O-メチルヌクレオシドのホスホロアミダイト (アデノシン体product No. 10-3100-10、グアノシン体product No. 10-3121-10) はグレンリサーチ社製のものを用いた。溶媒は和光純薬工業のものを用いた。非天然型のホスホロアミダイトは特開2000-297097の実施例22 (5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O,4'-C-エチレン-4-N-ベンゾイル-5-メチルシチジン-3'-O-(2-シアノエチルN,N-ジイソプロピル)ホスホロアミダイト)、実施例9 (5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O,4'-C-エチレン-5-メチルウリジン-3'-O-(2-シアノエチルN,N-ジイソプロピル)ホスホロアミダイト) の化合物を用いた。固相担体としてユニバーサルコントロールポアグラス (CPG) (グレンリサーチ社製product No. 25-5040) を用い、表記の化合物を合成した。但し、アミダイトの縮合に要する時間は、15分とした。
　目的配列を有する保護されたオリゴヌクレオチド類縁体を濃アンモニア水で加熱処理 (55℃、8時間) することによってオリゴマーを支持体から切り出すとともに、リン原子上の保護基シアノエチル基と核酸塩基上の保護基を外した。本アンモニア溶液をGlen-Pak DNA Purification Cartridge (グレンリサーチ社製product No. 60-5100) を用い、グレンリサーチ推奨プロトコルに従いカートリッジ内で脱DMTを行い、回収した溶液を減圧留去し、残渣を逆相HPLC (島津製作所製LC-２a、カラム (YMC製Triart C18 (10×150 mm))、A溶液：0.1M酢酸トリエチルアミン水溶液 (TEAA), pH 7.0、B溶液：アセトニトリル、B%：10%→25% (30 min, linear gradient)；５0°C；4.7 mL/min；2８0 nm) にて精製した。溶媒留去後、10mM NaOH溶液に溶解し、マイクロセップ遠心濾過デバイス (日本ポール社製product No. MCP003C) を用いて限外濾過により純水置換し、凍結乾燥後目的化合物を得た。
　本化合物は負イオンMALDI-TOFMSにより、同定した (計算値：6440.35、測定値：6433.59)。
　本化合物の塩基配列は、Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1) のヌクレオチド番号5058-5075に相補的な配列である。
aaaCggaTTCTgTTTgaa （MSTN_Ex3_SS） の合成 (実施例２)
　実施例1の化合物と同様に目的配列を有する実施例2の化合物を合成した。
　本化合物は負イオンMALDI-TOFMSにより、同定した (計算値：6476.33、測定値：6469.82)。
　本化合物の塩基配列は、Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1) のヌクレオチド番号5083-5100に相補的な配列である。
TCaTCaCagTCaagaCCa （MSTN_Ex3_Fox1） の合成 (実施例３)
　実施例1の化合物と同様に目的配列を有する実施例３の化合物を合成した。
　本化合物は負イオンMALDI-TOFMSにより、同定した (計算値：6443.39、測定値：6436.58)。
　本化合物の塩基配列は、Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1) のヌクレオチド番号5184-5165に相補的な配列である。
CCTgCTgaaCCTCTgggg （MSTN_Ex3_LESE12SF2） の合成 (実施例４)
　実施例1の化合物と同様に目的配列を有する実施例４の化合物を合成した。
　本化合物は負イオンMALDI-TOFMSにより、同定した (計算値：6510.38、測定値：6503.83)。
　本化合物の塩基配列は、Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1) のヌクレオチド番号5337-5354に相補的な配列である。
aTTgTTgaggggaaaaCC （MSTN_Ex3_LESE3） の合成 (実施例5)
　実施例1の化合物と同様に目的配列を有する実施例５の化合物を合成した。
　本化合物は負イオンMALDI-TOFMSにより、同定した (計算値：6502.33、測定値：6495.71)。
　本化合物の塩基配列は、Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1) のヌクレオチド番号5512-5529に相補的な配列である。
TaTagCCTgTggTaCTTa （MSTN_Ex3_LESE4） の合成 （実施例６)
　実施例1の化合物と同様に目的配列を有する実施例６の化合物を合成した。
　本化合物は負イオンMALDI-TOFMSにより、同定した (計算値：6481.33、測定値：6474.94)。
　本化合物の塩基配列は、Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1) のヌクレオチド番号5546-5563に相補的な配列である。
CagTCaagaCCaaaaTCC （MSTN_Ex3_Fox1+6） の合成 （実施例7）
　実施例1の化合物と同様に目的配列を有する実施例7の化合物を合成した。
　本化合物は負イオンMALDI-TOFMSにより、同定した (計算値：6439.64、測定値：6439.92)。
　本化合物の塩基配列は、Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1) のヌクレオチド番号5142-5159に相補的な配列である。
CaCagTCaagaCCaaaaT （MSTN_Ex3_Fox1+4） の合成 (実施例8)
　実施例1の化合物と同様に目的配列を有する実施例8の化合物を合成した。
　本化合物は負イオンMALDI-TOFMSにより、同定した (計算値：6437.58、測定値：6437.93)。
　本化合物の塩基配列は、Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1) のヌクレオチド番号5144-5161に相補的な配列である。
aTCaCagTCaagaCCaaa （MSTN_Ex3_Fox1+2） の合成 (実施例9)
　実施例1の化合物と同様に目的配列を有する実施例9の化合物を合成した。
　本化合物は負イオンMALDI-TOFMSにより、同定した (計算値：6437.58、測定値：6437.82)。
　本化合物の塩基配列は、Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1) のヌクレオチド番号5146-5163に相補的な配列である。
gCTCaTCaCagTCaagaC （MSTN_Ex3_Fox1-2） の合成 （実施例10)
　実施例1の化合物と同様に目的配列を有する実施例10の化合物を合成した。
　本化合物は負イオンMALDI-TOFMSにより、同定した (計算値：6458.60、測定値：6458.70)。
　本化合物の塩基配列は、Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1) のヌクレオチド番号5150-5167に相補的な配列である。
gTgCTCaTCaCagTCaag （MSTN_Ex3_Fox1-4） の合成 (実施例11)
　実施例1の化合物と同様に目的配列を有する実施例11の化合物を合成した。
　本化合物は負イオンMALDI-TOFMSにより、同定した (計算値：6475.50、測定値：6475.67)。
　本化合物の塩基配列は、Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1) のヌクレオチド番号5152-5169に相補的な配列である。
gagTgCTCaTCaCagTCa （MSTN_Ex3_Fox1-6） の合成 (実施例12)
　実施例1の化合物と同様に目的配列を有する実施例12の化合物を合成した。
　本化合物は負イオンMALDI-TOFMSにより、同定した (計算値：6475.50、測定値：6475.55)。
　本化合物の塩基配列は、Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1) のヌクレオチド番号5154-5171に相補的な配列である。
TCCagagCagTaaTTggC （MSTN_Ex3_1） の合成 (実施例13)
　実施例1の化合物と同様に目的配列を有する実施例13の化合物を合成した。
　本化合物は負イオンMALDI-TOFMSにより、同定した（計算値：6489.44、測定値：6487.83）。
　本化合物の塩基配列は、Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1) のヌクレオチド番号5260-5277に相補的な配列である。
TgagCaCCCaCagCggTC （MSTN_Ex3_2） の合成 (実施例14)
　実施例1の化合物と同様に目的配列を有する実施例14の化合物を合成した。
　本化合物は負イオンMALDI-TOFMSにより、同定した (計算値：6489.70、測定値：6488.90)。
　本化合物の塩基配列は、Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1) のヌクレオチド番号5452-5469に相補的な配列である。
CTCgCCgaTgTTgTaaTa （MSTN_Ex3_3） の合成 (実施例15)
　実施例1の化合物と同様に目的配列を有する実施例15の化合物を合成した。
　本化合物は負イオンMALDI-TOFMSにより、同定した (計算値：6479.36、測定値：6477.62)。
　本化合物の塩基配列は、Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1) のヌクレオチド番号5734-5751に相補的な配列である。
CaTaTgCTgCaCCaTCCC （MSTN_Ex3_4） の合成 (実施例16)
　実施例1の化合物と同様に目的配列を有する実施例16の化合物を合成した。
　本化合物は負イオンMALDI-TOFMSにより、同定した (計算値：6449.68、測定値：6450.12)。
　本化合物の塩基配列は、Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1) のヌクレオチド番号5965-5982に相補的な配列である。
TgTaggaaaaTgCaCCTg （MSTN_Ex3_5） の合成 （実施例17)
　実施例1の化合物と同様に目的配列を有する実施例17の化合物を合成した。
　本化合物は負イオンMALDI-TOFMSにより、同定した (計算値：6487.38、測定値：6486.69)。
　本化合物の塩基配列は、Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1) のヌクレオチド番号6122-6139に相補的な配列である。
CaaaggCagTgTTgTaaT （MSTN_Ex3_6） の合成 (実施例18)
　実施例1の化合物と同様に目的配列を有する実施例18の化合物を合成した。
　本化合物は負イオンMALDI-TOFMSにより、同定した (計算値：6488.28、測定値：6488.01)。
　本化合物の塩基配列は、Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1) のヌクレオチド番号6322-6339に相補的な配列である。
CCCCTaaggTCagTaCCa （MSTN_In2_4） の合成 (実施例19)
　実施例1の化合物と同様に目的配列を有する実施例19の化合物を合成した。
　本化合物は負イオンMALDI-TOFMSにより、同定した (計算値：6460.66、測定値：6460.14)。
　本化合物の塩基配列は、Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1) のヌクレオチド番号4866-4883に相補的な配列である。
gTTgaagTaaTaaaCTaa （MSTN_In2_3） の合成 (実施例20)
　実施例1の化合物と同様に目的配列を有する実施例20の化合物を合成した。
　本化合物は負イオンMALDI-TOFMSにより、同定した (計算値：6454.22、測定値：6454.25)。
　本化合物の塩基配列は、Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1) のヌクレオチド番号4998-5015に相補的な配列である。
ggCCTggaaaCaCTTTTC （MSTN_In2_2） の合成 (実施例2１)
　実施例1の化合物と同様に目的配列を有する実施例21の化合物を合成した。
　本化合物は負イオンMALDI-TOFMSにより、同定した (計算値：6478.46、測定値：6478.47)。
　本化合物の塩基配列は、Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1) のヌクレオチド番号5037-5054に相補的な配列である。
TgTTaCCTTgaCCTCTaa （MSTN_Ex3_7） の合成 (実施例22)
　実施例1の化合物と同様に目的配列を有する実施例22の化合物を合成した。
　本化合物は負イオンMALDI-TOFMSにより、同定した (計算値：6452.38、測定値：6452.23)。
　本化合物の塩基配列は、Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1) のヌクレオチド番号5101-5118に相補的な配列である。
CTTgaCCTCTaaaaaCgg （MSTN_Ex3_7+6） の合成 (実施例23)
　実施例1の化合物と同様に目的配列を有する実施例23の化合物を合成した。
　本化合物は負イオンMALDI-TOFMSにより、同定した (計算値：6459.50、測定値：6458.24)。
　本化合物の塩基配列は、Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1) のヌクレオチド番号5095-5112に相補的な配列である。
TaCCTTgaCCTCTaaaaa （MSTN_Ex3_7+3） の合成 (実施例24)
　実施例1の化合物と同様に目的配列を有する実施例24の化合物を合成した。
　本化合物は負イオンMALDI-TOFMSにより、同定した (計算値：6430.46、測定値：6429.70)。
　本化合物の塩基配列は、Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1) のヌクレオチド番号5098-5115に相補的な配列である。
gTCTgTTaCCTTgaCCTC （MSTN_Ex3_7-3） の合成 (実施例25)
　実施例1の化合物と同様に目的配列を有する実施例25の化合物を合成した。
　本化合物は負イオンMALDI-TOFMSにより、同定した (計算値：6470.44、測定値：6469.11)。
　本化合物の塩基配列は、Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1) のヌクレオチド番号5104-5121に相補的な配列である。
TgTgTCTgTTaCCTTgaC （MSTN_Ex3_7-6） の合成 (実施例26)
　実施例1の化合物と同様に目的配列を有する実施例26の化合物を合成した。
　本化合物は負イオンMALDI-TOFMSにより、同定した (計算値：6485.28、測定値：6484.44)。
　本化合物の塩基配列は、Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1) のヌクレオチド番号5107-5124に相補的な配列である。
TggTgTgTCTgTTaCCTT （MSTN_Ex3_7-9） の合成 (実施例27)
　実施例1の化合物と同様に目的配列を有する実施例27の化合物を合成した。
　本化合物は負イオンMALDI-TOFMSにより、同定した (計算値：6502.18、測定値：6500.63)。
　本化合物の塩基配列は、Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1) のヌクレオチド番号5110-5127に相補的な配列である。
CTgTTaCCTTgaCCTCTa （MSTN_Ex3_7-1） の合成 (実施例28)
　実施例1の化合物と同様に目的配列を有する実施例28の化合物を合成した。
　本化合物は負イオンMALDI-TOFMSにより、同定した (計算値：6454.44、測定値：6454.34)。
　本化合物の塩基配列は、Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1) のヌクレオチド番号5102-5119に相補的な配列である。
TCTgTTaCCTTgaCCTCT （MSTN_Ex3_7-2） の合成 (実施例29)
　実施例1の化合物と同様に目的配列を有する実施例29の化合物を合成した。
　本化合物は負イオンMALDI-TOFMSにより、同定した (計算値：6457.40、測定値：6457.37)。
　本化合物の塩基配列は、Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1) のヌクレオチド番号5103-5120に相補的な配列である。
TgTCTgTTaCCTTgaCCT （MSTN_Ex3_7-4） の合成 (実施例30)
　実施例1の化合物と同様に目的配列を有する実施例30の化合物を合成した。
　本化合物は負イオンMALDI-TOFMSにより、同定した (計算値：6471.34、測定値：6471.68)。
　本化合物の塩基配列は、Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1) のヌクレオチド番号5105-5122に相補的な配列である。
gTgTCTgTTaCCTTgaCC （MSTN_Ex3_7-5） の合成 (実施例31)
　実施例1の化合物と同様に目的配列を有する実施例31の化合物を合成した。
　本化合物は負イオンMALDI-TOFMSにより、同定した (計算値：6484.38、測定値：6484.65)。
　本化合物の塩基配列は、Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1) のヌクレオチド番号5106-5123に相補的な配列である。
gTgTgTCTgTTaCCTTga （MSTN_Ex3_7-7） の合成 (実施例32)
　実施例1の化合物と同様に目的配列を有する実施例32の化合物を合成した。
　本化合物は負イオンMALDI-TOFMSにより、同定した (計算値：6515.22、測定値：6515.64)。
　本化合物の塩基配列は、Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1) のヌクレオチド番号5108-5125に相補的な配列である。
ggTgTgTCTgTTaCCTTg （MSTN_Ex3_7-8） の合成 (実施例33)
　実施例1の化合物と同様に目的配列を有する実施例33の化合物を合成した。
　本化合物は負イオンMALDI-TOFMSにより、同定した (計算値：6499.22、測定値：6499.59)。
　本化合物の塩基配列は、Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1) のヌクレオチド番号5109-5126に相補的な配列である。
gCTTCaaaaTCCaCagTT （MSTN_Ex3_8） の合成 (実施例34)
　実施例1の化合物と同様に目的配列を有する実施例34の化合物を合成した。
　本化合物はQ-TOF LC/MSにより、同定した (計算値：6446.35、測定値：6446.24)。
　本化合物の塩基配列は、Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1) のヌクレオチド番号5202-5219に相補的な配列である。
TCTTTTaggagCgaTaaT （MSTN_Ex3_9） の合成 (実施例35)
　実施例1の化合物と同様に目的配列を有する実施例35の化合物を合成した。
　本化合物はQ-TOF LC/MSにより、同定した (計算値：6478.31、測定値：6478.52)。
　本化合物の塩基配列は、Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1) のヌクレオチド番号5236-5253に相補的な配列である。
ggaTaTTTTTgTaaaaaT （MSTN_Ex3_10） の合成 (実施例36)
　実施例1の化合物と同様に目的配列を有する実施例36の化合物を合成した。
　本化合物はQ-TOF LC/MSにより、同定した (計算値：6461.28、測定値：6461.43)。
　本化合物の塩基配列は、Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1) のヌクレオチド番号5292-5309に相補的な配列である。
agaCaTCTTTgTgggagT （MSTN_Ex3_11） の合成 (実施例37)
　実施例1の化合物と同様に目的配列を有する実施例37の化合物を合成した。
　本化合物はQ-TOF LC/MSにより、同定した (計算値：6507.31、測定値：6507.26)。
　本化合物の塩基配列は、Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1) のヌクレオチド番号5365-5382に相補的な配列である。
aTaTaTTaTTTgTTCTTT （MSTN_Ex3_12） の合成 (実施例38)
　実施例1の化合物と同様に目的配列を有する実施例38の化合物を合成した。
　本化合物はQ-TOF LC/MSにより、同定した (計算値：6443.28、測定値：6443.39)。
　本化合物の塩基配列は、Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1) のヌクレオチド番号5410-5427に相補的な配列である。
aCTCTggaaaTCaTaaaa （MSTN_Ex3_13） の合成 (実施例39)
　実施例1の化合物と同様に目的配列を有する実施例39の化合物を合成した。
　本化合物はQ-TOF LC/MSにより、同定した (計算値：6439.33、測定値：6439.67)。
　本化合物の塩基配列は、Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1) のヌクレオチド番号5674-5691に相補的な配列である。
TaaTTCaTCagaaCTCaa （MSTN_Ex3_14） の合成 (実施例40)
　実施例1の化合物と同様に目的配列を有する実施例40の化合物を合成した。
　本化合物はQ-TOF LC/MSにより、同定した (計算値：6428.34、測定値：6428.49)。
　本化合物の塩基配列は、Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1) のヌクレオチド番号5771-5788に相補的な配列である。
TgTaaaTaTTaaaCaaaa （MSTN_Ex3_15） の合成 (実施例41)
　実施例1の化合物と同様に目的配列を有する実施例41の化合物を合成した。
　本化合物はQ-TOF LC/MSにより、同定した (計算値：6422.31、測定値：6422.37)。
　本化合物の塩基配列は、Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1) のヌクレオチド番号5822-5839に相補的な配列である。
CagCCTaTCgTaTTagCa （MSTN_Ex3_16） の合成 (実施例42)
　実施例1の化合物と同様に目的配列を有する実施例42の化合物を合成した。
　本化合物はQ-TOF LC/MSにより、同定した (計算値：6462.35、測定値：6462.34)。
　本化合物の塩基配列は、Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1) のヌクレオチド番号6037-6054に相補的な配列である。
CTggTagCCTCagaCaTT （MSTN_Ex3_17） の合成 (実施例43)
　実施例1の化合物と同様に目的配列を有する実施例43の化合物を合成した。
　本化合物はQ-TOF LC/MSにより、同定した (計算値：6478.35、測定値：6478.26)。
　本化合物の塩基配列は、Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1) のヌクレオチド番号6055-6072に相補的な配列である。
CCgTTggCaTggaTTgTT （MSTN_Ex3_18） の合成 (実施例44)
　実施例1の化合物と同様に目的配列を有する実施例44の化合物を合成した。
　本化合物はQ-TOF LC/MSにより、同定した (計算値：6512.32、測定値：6512.38)。
　本化合物の塩基配列は、Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1) のヌクレオチド番号6019-6036に相補的な配列である。
gTTTTTTaTgTgaTaaaC （MSTN_Ex3_19） の合成 (実施例45)
　実施例1の化合物と同様に目的配列を有する実施例45の化合物を合成した。
　本化合物はQ-TOF LC/MSにより、同定した (計算値：6466.29、測定値：6466.19)。
　本化合物の塩基配列は、Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1) のヌクレオチド番号6073-6090に相補的な配列である。
agagaaaCTTaCTaTTTT （MSTN_Ex3_20） の合成 (実施例46)
　実施例1の化合物と同様に目的配列を有する実施例46の化合物を合成した。
　本化合物はQ-TOF LC/MSにより、同定した (計算値：6446.31、測定値：6446.34)。
　本化合物の塩基配列は、Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1) のヌクレオチド番号6098-6115に相補的な配列である。
TCTTaCaTTaaagaaaaT （MSTN_Ex3_21） の合成 (実施例47)
　実施例1の化合物と同様に目的配列を有する実施例47の化合物を合成した。
　本化合物はQ-TOF LC/MSにより、同定した (計算値：6427.32、測定値：6427.14)。
　本化合物の塩基配列は、Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1) のヌクレオチド番号6158-6175に相補的な配列である。
TgaaagCCaaCCTCTaga （MSTN_Ex3_22） の合成 (実施例48)
　実施例1の化合物と同様に目的配列を有する実施例48の化合物を合成した。
　本化合物はQ-TOF LC/MSにより、同定した (計算値：6456.36、測定値：6456.24)。
　本化合物の塩基配列は、Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1) のヌクレオチド番号6187-6204に相補的な配列である。
aTaaaaaCaaaCaCCaTT （MSTN_Ex3_23） の合成 (実施例49)
　実施例1の化合物と同様に目的配列を有する実施例49の化合物を合成した。
　本化合物はQ-TOF LC/MSにより、同定した (計算値：6406.35、測定値：6406.36)。
　本化合物の塩基配列は、Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1) のヌクレオチド番号6252-6269に相補的な配列である。
TTTCTaTTaTTTTaCCaT （MSTN_Ex3_24） の合成 (実施例50)
　実施例1の化合物と同様に目的配列を有する実施例50の化合物を合成した。
　本化合物はQ-TOF LC/MSにより、同定した (計算値：6428.31、測定値：6428.34)。
　本化合物の塩基配列は、Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1) のヌクレオチド番号6356-6373に相補的な配列である。
aaagTaaaTaaaaaagga （MSTN_Ex3_25） の合成 (実施例51)
　実施例1の化合物と同様に目的配列を有する実施例51の化合物を合成した。
　本化合物はQ-TOF LC/MSにより、同定した (計算値：6515.37、測定値：6515.22)。
　本化合物の塩基配列は、Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1) のヌクレオチド番号6460-6477に相補的な配列である。
TgTCCTTagTgTaaaaaT （MSTN_Ex3_26） の合成 (実施例52)
　実施例1の化合物と同様に目的配列を有する実施例52の化合物を合成した。
　本化合物はQ-TOF LC/MSにより、同定した (計算値：6462.31、測定値：6462.37)。
　本化合物の塩基配列は、Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1) のヌクレオチド番号6483-6500に相補的な配列である。
TTCTgTgaTgCaTgaCaT （MSTN_Ex3_27） の合成 (実施例53)
　実施例1の化合物と同様に目的配列を有する実施例53の化合物を合成した。
　本化合物はQ-TOF LC/MSにより、同定した (計算値：6480.32、測定値：6480.14)。
　本化合物の塩基配列は、Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1) のヌクレオチド番号6530-6547に相補的な配列である。
TCaTgTaaaaaaaTaTaa （MSTN_Ex3_28） の合成 (実施例54)
　実施例1の化合物と同様に目的配列を有する実施例54の化合物を合成した。
　本化合物はQ-TOF LC/MSにより、同定した (計算値：6422.31、測定値：6422.49)。
　本化合物の塩基配列は、Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1) のヌクレオチド番号6642-6659に相補的な配列である。
（表１）
本実施例で合成したASOの配列。大文字はENA核酸、小文字は2'OMe。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001

Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
〔実施例55～63〕アンチセンスオリゴヌクレオチド (ASO) の合成
　MSTN_Ex3_7-2（実施例29）のENA配置を変えた、表２に示すアンチセンスオリゴヌクレオチド (ASO) を合成した。
TcTguTaCcuTgaCcTcT （MSTN_Ex3_7-2a） の合成 (実施例55)
　実施例1の化合物と同様に目的配列を有する実施例55の化合物を合成した。
　本化合物は負イオンMALDI-TOFMSにより、同定した (計算値：6301.1、測定値：6301.8)。
　本化合物の塩基配列は、Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1) のヌクレオチド番号5103-5120に相補的な配列である。

TcTguTACCTTgacCTCT （MSTN_Ex3_7-2b） の合成 (実施例56)
　実施例1の化合物と同様に目的配列を有する実施例56の化合物を合成した。
　本化合物は負イオンMALDI-TOFMSにより、同定した (計算値：6391.3、測定値：6398.1)。
　本化合物の塩基配列は、Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1) のヌクレオチド番号5103-5120に相補的な配列である。

TcTguuACcTugaccTcT （MSTN_Ex3_7-2c） の合成 (実施例57)
　実施例1の化合物と同様に目的配列を有する実施例57の化合物を合成した。
　本化合物は負イオンMALDI-TOFMSにより、同定した (計算値：6261.1、測定値：6262.4)。
　本化合物の塩基配列は、Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1) のヌクレオチド番号5103-5120に相補的な配列である。

TcTguuaCcTugaccTcT （MSTN_Ex3_7-2d） の合成 (実施例58)
　実施例1の化合物と同様に目的配列を有する実施例58の化合物を合成した。
　本化合物は負イオンMALDI-TOFMSにより、同定した (計算値：6249.1、測定値：6249.7)。
　本化合物の塩基配列は、Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1) のヌクレオチド番号5103-5120に相補的な配列である。

TcTguuAccTugaccTcT （MSTN_Ex3_7-2e） の合成 (実施例59)
　実施例1の化合物と同様に目的配列を有する実施例59の化合物を合成した。
　本化合物は負イオンMALDI-TOFMSにより、同定した (計算値：6235.0、測定値：6237.5)。
　本化合物の塩基配列は、Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1) のヌクレオチド番号5103-5120に相補的な配列である。

TcTguTaCcTugaccTcT （MSTN_Ex3_7-2f） の合成 (実施例60)
　実施例1の化合物と同様に目的配列を有する実施例60の化合物を合成した。
　本化合物は負イオンMALDI-TOFMSにより、同定した (計算値：6275.1、測定値：6275.4)。
　本化合物の塩基配列は、Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1) のヌクレオチド番号5103-5120に相補的な配列である。

TcTguTaCcTugacCucT （MSTN_Ex3_7-2g） の合成 (実施例61)
　実施例1の化合物と同様に目的配列を有する実施例61の化合物を合成した。
　本化合物は負イオンMALDI-TOFMSにより、同定した (計算値：6275.1、測定値：6275.0)。
　本化合物の塩基配列は、Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1) のヌクレオチド番号5103-5120に相補的な配列である。

TcTguuAcCuTgaccTcT （MSTN_Ex3_7-2h） の合成 (実施例62)
　実施例1の化合物と同様に目的配列を有する実施例62の化合物を合成した。
　本化合物は負イオンMALDI-TOFMSにより、同定した (計算値：6261.1、測定値：6262.4)。
　本化合物の塩基配列は、Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1) のヌクレオチド番号5103-5120に相補的な配列である。

TcTguuAcCuTgacCucT （MSTN_Ex3_7-2i） の合成 (実施例63)
　実施例1の化合物と同様に目的配列を有する実施例63の化合物を合成した。
　本化合物は負イオンMALDI-TOFMSにより、同定した (計算値：6261.1、測定値：6263.0)。
　本化合物の塩基配列は、Homo sapiens myostatin (MSTN), RefSeqGene (LRG_200) on chromosome 2 (Gene Bank accession No. NG_009800.1) のヌクレオチド番号5103-5120に相補的な配列である。
（表２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003

〔試験例〕
実験方法
MSTN mRNAの評価
　ASO導入後のMSTN pre-mRNAのスプライシングパターンの変化をヒト横紋筋肉腫細胞 (CRL-2061, ATCC) でRT-PCRにより評価した。
細胞培養
　ヒト横紋筋肉腫細胞 (CRL-2061, ATCC) は10%FBS (10270-106, gibco) を含むRPMI 1640培地 (#30263-95, ナカライテスク) で培養した。ヒト筋芽細胞 (Wada et al. Development 2002,129;2987-2995)) は20%FBS (10270-106, gibco), 2% Ultroser G (15950-017, Pall Life Sciences) を含むDMEM培地 (08458-16, ナカライテスク) で培養した。
ASOトランスフェクション
1) Opti-MEM培地 (#31985070, Thermo Fisher Scientific) 100μlにASO (Nuclease-Free Water (#AM9932, Thermo Fisher Scientific) で50pmol/μlとしたもの) を各々2μl混合した。ASO無処理は、Nuclease-Free Waterを2μl混合した。
2) 別のチューブでOpti-MEM培地 100μlにLipofectamine 3000 Transfection Reagent (#L3000015, Thermo Fisher Scientific) を4μl混合した。
3) 1)液と2)液を混合し、15分間室温で放置した。
4) 12-ウェルプレートで培養したヒト横紋筋肉腫細胞 (CRL-2061, ATCC) をPBSで1回洗浄した後、ウェルにOpti-MEM培地を800μl加えた。
5) 3)液を4)に添加し (ASO最終濃度100nM)、37℃ 5%CO2下で3時間培養した後、培地を、10%FBSを含むRPMI 1640培地に交換し、さらに培養を継続した。
RNA調製
1) 各ASOをトランスフェクションした細胞を、24時間培養した後、PBSにて１回洗浄し、High Pure RNA Isolation Kit (#11828665001, Roche Life Science) のRNA抽出試薬300μlを細胞に添加した。
2) 10分間室温に放置した後、ウェル内のRNA抽出試薬をチューブに回収した。
3) High Pure RNA Isolation Kitのプロトコルに従ってRNAを抽出し、最終的に50μlのRNA溶解液を得た。
逆転写反応
1) RNA 500 ngにRandom primers (#48190011, Thermo Fisher Scientific)、dNTP Mixture (各2.5 mM) (#4030, Takara) を加え、65℃で5分、25℃で10分間インキュベートした。
2) 1)液にM-MLV Reverse Transcriptase (#28025013, Thermo Fisher Scientific)、RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor (#10777-019, Thermo Fisher Scientific)、DTT (M-MLVに添付)、5x First Strand Buffer (M-MLVに添付) を加え、37℃で55分、70℃で10分間インキュベートしてcDNAを得た。
PCR反応と反応産物の確認
1) 得られたcDNA 2μlに対し、プライマーMSTN_Ex1F1 (5'-agattcactggtgtggcaag-3'：配列番号５７) 1μl、プライマーMSTN_R2 (5'-tgcatgacatgtctttgtgc-3'：配列番号５８) 1μl、Takara Ex Taq DNAポリメラーゼ (#RR001A, Takara) 0.1μl、dNTP Mixture (各2.5 mM) 1.6μl、10x Ex Taq Buffer 2μl、Nuclease-Free Water 12.3μlを添加した。
2) 94℃ 3分間加熱した。
3) 94℃ 0.5分・60℃ 0.5分・72℃ 1.5分の処理を30サイクル行った。
4) 72℃ 3分間加熱した。
5) PCR反応の反応産物は、2%アガロースゲル (#318-01195, ニッポンジーン) 電気泳動を行い、Image J (NIH, http://imagej.nih.gov/ij/)で定量を行った。また、Agilent2100 バイオアナライザ電気泳動システム （アジレント・テクノロジー株式会社） を用いてPCR反応産物の泳動、定量を行った。
6) GAPDHに対して、プライマーGAPDH H_F (5'-cccttcattgacctcaac-3'：配列番号５９、GAPDH H_R (5'-ttcacacccatgacgaac-3'：配列番号６０)を用いて上記の1)～5)を行った。このとき、3)のステップは18サイクルで行った。
ミオスタチンタンパク発現の確認
　ASO投与後のミオスタチンタンパクの発現は、Western Blottingにより確認した。ヒト横紋筋肉腫細胞 (CRL-2061, ATCC) に、ASOをLipofectamine 3000 Transfection Reagent (#L3000015, Thermo Fisher Scientific) を用いて導入した。ASO投与の24時間後にCell Lysis Buffer (#9803, Cell Signaling) (1 mM PMSF (#8553, Cell Signaling) 添加) を用いて細胞を破砕し、可溶性画分をサンプルとして得た。得られたサンプルのタンパク定量は、Qubit Protein Assay Kit (#Q33211, Thermo Fisher Scientific) で行った。SDS-PAGE用サンプルは、サンプルを4x Laemmli Sample Buffer (#1610747, Bio-Rad) と混合した後、熱処理にて調製した。SDS-PAGEでは、Mini-PROTEAN TGX Precast Gels 4-20% Gel (#456-1094, BIO-RAD) を使用して泳動を行った。分子量マーカーとして、Protein Ladder One Plus, Triple-color for SDS-PAGE (#19593-25, ナカライテスク) を泳動した。メンブレンへの転写には、トランスブロット Turbo 転写システム (Bio-Rad) を使用した。タンパク転写後のメンブレンを、2% ECL Prime Blocking Agent (#RPN418, Amersham) で、室温にて1時間ブロッキングした後、一次抗体としてミオスタチンのＮ末側を認識する抗体 (Anti-GDF8/Myostatin抗体, #ab71808, abcam) あるいはアクチン認識抗体 (β-Actin抗体 (C4), #sc-47778, Santa Cruz Biotechnology) で、4℃にてオーバーナイトで処理した。二次抗体には、HRP標識抗ウサギIgG抗体 (#NA934, GE)、HRP標識抗マウスIgG抗体 (#NA931, GE) を使用し、室温にて1時間処理した。検出は、Amersham ECL Select Western Blotting Detection Reagent (#RPN2235, GE) を用いて、ChemiDoc XRS+ システム (Bio-Rad) で行った。
ミオスタチンシグナルの解析
　ASO投与によるミオスタチンシグナル阻害をin vitroミオスタチン転写活性測定系で評価した。本評価系では、Smad結合配列の下流にルシフェラーゼ遺伝子を配したレポーター遺伝子 (SBE4-Luc plasmid, #16495, Addgene) を細胞に導入し、発現誘導されたルシフェラーゼの発光を測定することで、ミオスタチンシグナルを評価した。この時、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の導入のコントロールとしてβ-ガラクトシダーゼ発現ベクター (pSV-β-Galactosidase Control Vector, #E1081, Promega) も同時に導入した。
　ヒト横紋筋肉腫細胞 (CRL-2061, ATCC) に、ASOをLipofectamine 3000 Transfection Reagent (#L3000015, Thermo Fisher Scientific) を用いて導入した。ASO投与の24時間後にLuciferase Assay System with Reporter Lysis Buffer (E4030, Promega) のReporter Lysis Bufferを用いて細胞を破砕し、可溶性画分をサンプルとして得た。得られたサンプルのタンパク定量は、Qubit Protein Assay Kit (#Q33211, Thermo Fisher Scientific) で行った。ルシフェラーゼ活性は、Luciferase Assay System with Reporter Lysis Buffer (#E4030, Promega) のLuciferase Assay Systemを基質として、マルチラベルプレートリーダーARVO X3 (PerkinElmer) でルシフェラーゼ発光シグナルを測定することで評価した。β-ガラクトシダーゼ活性はβ-Gal Assay System with Reporter Lysis Buffer (E2000, Promega) のβ-Gal Assay Systemを基質として37℃で1時間反応させた後、1M Sodium Carbonate添加により反応を停止させて室温15分放置後にマルチラベルプレートリーダーARVO　X3 (PerkinElmer) で420 nmの吸光を測定することで評価した。ルシフェラーゼ活性をβ-ガラクトシダーゼ活性で補正し (ルシフェラーゼ活性/β-ガラクトシダーゼ活性)、ASOを投与しなかった細胞由来の抽出液を測定した結果を１として、相対値で示した。
細胞増殖測定
　細胞増殖は、ヒト筋芽細胞 (Wada et al. Development 2002,129;2987-2995) とヒト横紋筋肉腫細胞 (CRL-2061, ATCC)　の増殖をCell Counting Kit-8 (CCK-8) (347-07621, 同仁化学研究所) で評価した。
実験結果
　MSTNのエクソン3のスプライシングをMSTNからMSTN-bへスイッチさせることを目的に、MSTN pre-mRNAのエクソン3とイントロン2に対して相補的配列を持つ18塩基のASOを54種類作製した (図2)。各ASOは、MSTN pre-mRNAにおけるスプライシング因子の結合予測を基に作製した。ヒト横紋筋肉腫細胞 (CRL-2061) をそれぞれのASOで24時間処理した後、MSTN mRNAをRT-PCRで検証したところ (図3～13)、MSTN_Ex3_7, MSTN_Ex3_7-1, MSTN_Ex3_7-2, MSTN_Ex3_7-3, MSTN_Ex3_7-4, MSTN_Ex3_7-5, MSTN_Ex3_7-6処理で全MSTNに占めるMSTN-bの割合の増加が有意に認められた (図8)。これらのASOの結果からスプライシングスイッチに重要な配列は5'-TTAGAGGTCAAGGTAACAGACACA-3' (配列番号２)である。
　ミオスタチン-bの発現について、ヒト横紋筋肉腫細胞 (CRL-2061) をMSTN_Ex3_7-2 ASOで24時間処理し、Western Blottingにより検証したところ、ASO処理によってミオスタチン-bの発現が確認された。
　ミオスタチンシグナルについて、ヒト横紋筋肉腫細胞 (CRL-2061) をMSTN_Ex3_7-2 ASOで24時間処理し、in vitroミオスタチン転写活性測定系により検証したところ、ASOを処理した場合でルシフェラーゼ比活性の低下がみられた (図15)。本実験系のルシフェラーゼ活性は、ミオスタチンシグナルと相関し、ルシフェラーゼ活性の上昇はミオスタチンシグナルの亢進を示し、ルシフェラーゼ活性の低下はミオスタチンシグナルの抑制を示す。このことから、ASO処理によりミオスタチンシグナルが阻害されることが明らかになった。
　MSTN_Ex3_7-2のENA配置を変えたMSTN_Ex3_7-2bはMSTN_Ex3_7-2よりも強いMSTN-b産生効果を示した (図17)。この効果は濃度依存的であり (図18)、ミオスタチンシグナルの低下も引き起こした (図19)。さらに、MSTN_Ex3_7-2bはヒト筋芽細胞に対して増殖促進を引き起こし (図20)、ヒト横紋筋肉腫細胞に対して増殖阻害を引き起こした (図21)。
考察
　我々は以前に培養細胞においてミオスタチンのアイソフォームであるミオスタチン-bの発現がミオスタチンシグナルを低下させることを示した (WO2020/179571)。このことから、ミオスタチン-bはミオスタチンを阻害し、筋形成を促進させることが示唆されている。
　本発明のASOにより、MSTNからMSTN-bにスプライシングをスイッチさせることが可能であり、さらにこのスプライシングスイッチに重要なＡＳＯの標的配列が明らかになった。この配列に結合するスプライシング因子を解析することでスプライシングスイッチを制御する因子が明らかになると予想される。
　本発明のMSTN-ｂの発現を誘導するASO (MSTN_Ex3_7-2) の投与により、タンパクレベルでミオスタチンの減少とミオスタチン-bの増加が確認され、さらに、ミオスタチンシグナルの低下が観察された。ミオスタチンシグナルの低下の理由は、ミオスタチン量の低下とミオスタチン-bによるミオスタチン阻害のためと考えられる。
　MSTN_Ex3_7-2のENA配置を変えたMSTN_Ex3_7-2bはMSTN_Ex3_7-2よりも強いMSTN-b産生効果を示した。MSTN_Ex3_7-2bの投与で示されたヒト筋芽細胞の増殖促進は筋形成の促進につながる。また、MSTN_Ex3_7-2b投与によるヒト横紋筋肉腫細胞の増殖阻害の結果から、MSTN_Ex3_7-2bの抗がん剤としての応用も期待される。
　本発明のASOの最大の優位点は、内在のMSTNのスプライシングをMSTN-b産出のためのスプライシングにスイッチすることにより、ミオスタチンを減少させミオスタチン-bを増加させる2重作用型であることにある (図1)。それに加えて、ASO投与でのミオスタチン-b産出は個体が産生するミオスタチン-bを活用するもので、免疫原性がなく安全である。同時に、患者の有する遺伝子の機能を活用するのもので、大きな遺伝子を体外から導入する必要もない。
　また、骨格筋への移行が確認された修飾核酸のENAをASOの合成モノマーとして用いることにより、筋肉へのデリバリーの壁を取り除くものである。ENAを用いたASOの開発においては実績があり、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（Duchenne muscular dystrophy：DMD）に対する治療薬として、現在DS5141bのフェーズI/IIの治験が第一三共により実施中である。これは、前臨床試験を経て実施されたもので、今回創出するASOは同じモノマーで、問題なく臨床に用いられると想定される。
　本発明のASOの標的配列は、ウシやブタにおいても保存性が高く、これら家畜の成長促進への利用も可能である（図１6）。家畜に対するASO投与によるMSTN発現抑制は遺伝子組換え生物の作製に相当しないことから、利用が容易である。また、同様にイヌに対しても有効であると考えられ、愛玩動物であるイヌの筋低下に対しても利用可能であると考えられる（図１6）。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
　本発明は、ミオスタチンのスプライシングバリアントを発現できる核酸医薬として利用できる。
＜配列番号１＞ミオスタチン遺伝子のエクソン３の塩基配列を示す。
MSTN Ex3 1939 nt (NM_005259.3)
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
ASO標的配列を□内に示す。

＜配列番号２＞ミオスタチン遺伝子のエクソン３のASO標的配列の塩基配列を示す。
5'-TTAGAGGTCAAGGTAACAGACACA-3'

＜配列番号３～５６＞
実施例1-54で合成したASOの配列を示す。

＜配列番号５７～６０＞
試験例で使用したプライマーの配列を示す。

＜配列番号６１～６７＞
実施例55-63で合成したASOの配列を示す。

＜配列番号６８＞
MSTN-ｂの塩基配列(全1860塩基。開始コドン(atg)とストップコドン(tga)を□内に示す)を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000005
＜配列番号６９＞
MSTN-ｂタンパク質のアミノ酸配列（全251アミノ酸）を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000006
＜配列番号７０＞
MSTNタンパク質のアミノ酸配列（全375アミノ酸）を示す。
1 MQKLQLCVYIYLFMLIVAGPVDLNENSEQKENVEKEGLCNACTWRQNTKSSRIEAIKIQI  60
  LSKLRLETAPNISKDVIRQLLPKAPPLRELIDQYDVQRDDSSDGSLEDDDYHATTETIIT 120
  MPTESDFLMQVDGKPKCCFFKFSSKIQYNKVVKAQLWIYLRPVETPTTVFVQILRLIKPM 180
  KDGTRYTGIRSLKLDMNPGTGIWQSIDVKTVLQNWLKQPESNLGIEIKALDENGHDLAVT 240
  FPGPGEDGLNPFLEVKVTDTPKRSRRDFGLDCDEHSTESRCCRYPLTVDFEAFGWDWIIA 300
  PKRYKANYCSGECEFVFLQKYPHTHLVHQANPRGSAGPCCTPTKMSPINMLYFNGKEQII 360
  YGKIPAMVVDRCGCS　　　　　　375

Claims (40)

  1. ミオスタチン遺伝子のエクソン３の標的配列に相補的な塩基配列を有する、塩基長１５～３０のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、ミオスタチンのスプライシングバリアントを発現できる前記アンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物。
  2. ミオスタチン遺伝子のエクソン３の塩基配列が配列番号１の塩基配列であり、ミオスタチン遺伝子のエクソン３の標的配列が、配列番号１の塩基配列の塩基番号１０～３３の領域であり、その塩基配列が配列番号２の塩基配列である請求項１記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物。
  3. アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号２４、３０、３１、２７、３２、３３又は２８のいずれかの塩基配列（但し、配列中のtはuであってもよく、uはtであってもよい）中の連続する少なくとも１５個の塩基からなる配列を含む請求項１又は２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物。
  4. アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基長が１８である請求項１～３のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物。
  5. アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号２４、３０、３１、２７、３２、３３又は２８のいずれかの塩基配列（但し、配列中のtはuであってもよく、uはtであってもよい）である請求項４記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物。
  6. 少なくとも１個のヌクレオチドが修飾されている請求項１～５のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物。
  7. 修飾ヌクレオチドを構成する糖がD-リボフラノースであり、D-リボフラノースの2’位の水酸基が修飾されている請求項６記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物。
  8. D-リボフラノースが2’-O-アルキル化及び／又は2’-O, 4’-C-アルキレン化されている請求項７記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物。
  9. 請求項１～８のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その医薬的に許容できる塩又は溶媒和物を含む、医薬。
  10. ミオスタチンが関与する病態及び/又は疾病を予防及び/又は治療するための請求項９記載の医薬。
  11. ミオスタチンが関与する病態及び/又は疾病が、筋萎縮である請求項１０記載の医薬。
  12. 筋萎縮が筋ジストロフィー、ミオパチー、脊髄性筋萎縮症、サルコペニア及び廃用性筋萎縮からなる群より選択される少なくとも１つである請求項１１記載の医薬。
  13. ミオスタチンが関与する病態及び/又は疾病が、筋量回復により治療効果がもたらされる病態及び/又は疾病である請求項１０記載の医薬。
  14. 筋量回復により治療効果がもたらされる病態及び/又は疾病が、ガン悪液質、糖尿病、循環器疾患、腎疾患及び骨疾患からなる群より選択される少なくとも１つである請求項１３記載の医薬。
  15. 循環器疾患が心不全及び/又は動脈硬化症であり、腎疾患が慢性腎不全であり、骨疾患が炎症性関節炎である請求項１４記載の医薬。
  16. 請求項１～８のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その食品に許容できる塩又は溶媒和物を含む、食品。
  17. 請求項１～８のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その飼料に許容できる塩又は溶媒和物を含む、飼料。
  18. 請求項１～８のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物を含む、筋細胞の増殖及び/又は肥大を促進するための薬剤。
  19. 請求項１～８のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物を含む、筋量の増加及び/又は筋低下の抑制のための薬剤。
  20. 請求項１～８のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物を含む、ミオスタチンのスプライシングをミオスタチンからミオスタチンのスプライシングバリアントにスイッチする薬剤。
  21. 請求項１～８のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物を含む、ミオスタチンシグナルを低下させる薬剤。
  22. 請求項１～８のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物を含む、抗がん剤。
  23. 請求項１～８のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物を有効な量で被験者に投与することを含む、ミオスタチンが関与する病態及び/又は疾病を予防及び／又は治療する方法。
  24. 請求項１～８のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物を有効な量で被験者に投与することを含む、筋細胞の増殖及び/又は肥大を促進する方法。
  25. 請求項１～８のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物を有効な量で被験者に投与することを含む、筋量の増加及び/又は筋低下の抑制方法。
  26. 請求項１～８のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物を有効な量で被験者に投与することを含む、ミオスタチンのスプライシングをミオスタチンからミオスタチンのスプライシングバリアントにスイッチする方法。
  27. 請求項１～８のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物を有効な量で被験者に投与することを含む、ミオスタチンシグナルを低下させる方法。
  28. 請求項１～８のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物を有効な量で被験者に投与することを含む、がんを予防及び/又は治療する方法。
  29. ミオスタチンが関与する病態及び/又は疾病を予防及び／又は治療する方法に使用するための、請求項１～８のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物。
  30. 筋細胞の増殖及び/又は肥大を促進する方法に使用するため、請求項１～８のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物。
  31. 筋量の増加及び/又は筋低下の抑制方法に使用するための、請求項１～８のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物。
  32. ミオスタチンのスプライシングをミオスタチンからミオスタチンのスプライシングバリアントにスイッチする方法に使用するための、請求項１～８のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物。
  33. ミオスタチンシグナルを低下させる方法に使用するための、請求項１～８のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物。
  34. がんを予防及び/又は治療する方法に使用するための、請求項１～８のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物。
  35. ミオスタチンが関与する病態及び/又は疾病を予防及び／又は治療するための、請求項１～８のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物の使用。
  36. 筋細胞の増殖及び/又は肥大を促進するための、請求項１～８のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物の使用。
  37. 筋量の増加及び/又は筋低下の抑制のための、請求項１～８のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物の使用。
  38. ミオスタチンのスプライシングをミオスタチンからミオスタチンのスプライシングバリアントにスイッチするための、請求項１～８のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物の使用。
  39. ミオスタチンシグナルを低下させるための、請求項１～８のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物の使用。
  40. がんを予防及び/又は治療するための、請求項１～８のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、その塩又は溶媒和物の使用。
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