WO2022181782A1 - 発酵飲食品の製造方法、及び嫌気発酵方法 - Google Patents

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周作 多田
大 橋村
寛 山城
卓磨 林
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/745—Cephalosporium ; Acremonium

Definitions

  • the present invention relates to a method for promoting anaerobic fermentation. More specifically, the present invention relates to a production technique for shortening the anaerobic fermentation time by using carbohydrate oxidase to reduce the oxygen concentration contained in raw materials.
  • Patent Documents 1 to 3 Disclosed in Non-Patent Document 1, Patent Documents 1 to 3, etc. that the fermentation efficiency can be improved and the fermentation time of fermented milk can be shortened by replacing and reducing dissolved oxygen in raw milk with an inert gas such as nitrogen. It is Instead of mixing an inert gas, oxygen dissolved in raw material milk can be removed by deaeration. Furthermore, Patent Document 4 discloses a method for producing fermented milk using both a process of reducing the oxygen concentration contained in the raw material milk and yeast lactase, and maintains a constant flavor and quality regardless of the state of lactic acid bacteria and enzymes. It is said to be possible.
  • the conventional oxygen concentration reduction technology has the problem of requiring large-scale equipment such as a nitrogen replacement device that can replace inert gas.
  • the main purpose of this technology is to provide a new technology that shortens the anaerobic fermentation time by reducing the oxygen concentration contained in the raw material other than the inert gas replacement method that requires the introduction of equipment. do.
  • the inventors of the present application conducted intensive research on techniques for shortening the anaerobic fermentation time, and as a result, found that the anaerobic fermentation time can be shortened by allowing carbohydrate oxidase to act on raw milk, and completed the present invention. came to.
  • a carbohydrate oxidase acting step of causing carbohydrate oxidase to act on part or all of the carbohydrates in the raw material An anaerobic fermentation step of performing anaerobic fermentation;
  • the carbohydrate oxidase action step can be performed before and/or simultaneously with the anaerobic fermentation step.
  • the carbohydrate oxidase having the property of acting on one or more carbohydrates selected from glucose, maltotriose, maltose, galactose, maltotetraose, lactose, cellobiose, and maltodextrin.
  • a carbohydrate oxidase comprising a polypeptide shown in any one of (1) to (3) below can be used as the carbohydrate oxidase.
  • polypeptides consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1; (2) A substrate equivalent to a polypeptide having one or several amino acid residues substituted, added, inserted or deleted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and (3) a polypeptide having a sequence identity of 90% or more to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • Polypeptides exhibiting substrate specificity comparable to In the method for producing a fermented food or drink according to the present technology, lactic acid fermentation can be performed in the anaerobic fermentation step. In the method for producing a fermented food or drink according to the present technology, fermented milk can be produced as the fermented food or drink.
  • This technology then provides an oxygen concentration-reducing agent for anaerobic fermentation that contains carbohydrate oxidase.
  • the present technology further provides an anaerobic fermentation method that includes a carbohydrate oxidase acting step in which carbohydrate oxidase acts on part or all of the carbohydrates in the raw material.
  • the carbohydrate oxidase action step can be performed before and/or simultaneously with the anaerobic fermentation step.
  • anaerobic fermentation time can be shortened without the need to introduce equipment by performing a treatment that reduces the oxygen concentration contained in raw materials using carbohydrate oxidase in anaerobic fermentation. .
  • a method for producing a fermented food or drink according to the present technology is a method in which at least a carbohydrate oxidase action step and an anaerobic fermentation step are performed.
  • Carbohydrate oxidase action step is a step in which a part or all of the saccharides in the raw material are acted on by saccharide oxidase.
  • the concentration of oxygen contained in the raw material can be reduced by causing carbohydrate oxidase to act on the sugar in the raw material.
  • the anaerobic fermentation time in the anaerobic fermentation step which will be described later, can be shortened.
  • carbohydrate oxidase By allowing carbohydrate oxidase to act on the raw material, it is possible to improve the stringiness of the fermented food and drink obtained through the anaerobic fermentation process described later.
  • carbohydrate oxidases that can be used in the present technology are described in detail below.
  • stringiness refers to the property of a substance to “pull strings.” It can be evaluated by the time until the is interrupted. A unique texture can be imparted by improving the stringiness of the food and drink.
  • Carbohydrate Oxidase that can be used in the present technology is not particularly limited as long as it is an enzyme that can oxidize a carbohydrate, but an enzyme that oxidizes an oligosaccharide having two or more sugars is preferable. Specific examples include proteins having the physicochemical properties described below.
  • Carbohydrate oxidase that can be used in the present technology oxidizes sugars described later to produce sugar acids in the presence of oxygen. More specifically, sugar acid and hydrogen peroxide are produced by reacting a sugar described later with a sugar oxidase that can be used in the present technology in the presence of oxygen.
  • Carbohydrate oxidases that can be used in the present technology include one or more carbohydrates selected from glucose, maltotriose, maltose, galactose, maltotetraose, lactose, cellobiose, and maltodextrin. Any protein that exhibits activity against it can be used.
  • the relative activity for each substrate is maltotriose: about 92%, maltose: about 86%, galactose: about 79%, maltotetraose: about 60%, lactose: about 58%, when the activity for glucose is 100%.
  • cellobiose about 53%
  • maltodextrin about 24%.
  • the relative activity is 50% or more when the activity when glucose is used as a substrate is taken as the standard (100%), it is judged that "this enzyme is a substrate that works well".
  • carbohydrate oxidase that is active not only on monosaccharides such as glucose but also on a wide range of carbohydrates such as disaccharides, it is possible to treat a wide range of carbohydrates that cannot be treated by existing glucose oxidases and oligosaccharide oxidases. It is possible to function carbohydrate oxidation in various fields.
  • a specific method for calculating the Km value (Michaelis constant) of a protein is not particularly limited, and a known method can be freely selected for calculation.
  • Methods for calculating the Km value of protein include, for example, Lineweaver-Burk plot, Eadie-Hofstee plot, Hanes-Woolf plot and the like, preferably Hanes-Woolf plot.
  • the Km value of the carbohydrate oxidase that can be used in the present technology is not particularly limited, it is preferably [Km value of glucose]/[Km value of maltose] ⁇ 1, and 0.4 ⁇ [Km value of glucose ]/[Km value of maltose] ⁇ 1.
  • (D) Molecular Mass Carbohydrate oxidase that can be used in the present technology has a molecular mass of about 63 kDa as determined by the SDS-PAGE method.
  • Carbohydrate oxidase that can be used in the present technology can be a carbohydrate oxidase that is stable in the vicinity of pH 5.0 to 10.5 under treatment conditions of 37° C. for 15 minutes. .
  • Carbohydrate oxidase that can be used in the present technology has the highest carbohydrate oxidase activity at around 20°C to 55°C under reaction conditions of pH 7.0 for 5 minutes. can be used.
  • (H) Temperature stability A carbohydrate oxidase that can be used in the present technology maintains an activity of 80% or more even after treatment at pH 7.0 for 15 minutes and at temperatures up to 45°C. Carbohydrate oxidase that can be used can be used.
  • Origin of the carbohydrate oxidase that can be used in the present technology described above is not particularly limited, but examples thereof include those derived from microorganisms belonging to the genus Acremonium.
  • the microorganism belonging to the Acremonium genus includes Acremonium chrysogenum.
  • carbohydrate oxidase derived from Acremonium chrysogenum means a carbohydrate oxidase produced by a microorganism classified as Acremonium chrysogenum (whether a wild strain or a mutant), or a carbohydrate It means that it is a carbohydrate oxidase obtained by a genetic engineering technique using an oxidase gene. Therefore, a recombinant enzyme produced by a host microorganism into which a carbohydrate oxidase gene obtained from Acremonium chrysogenum (or a gene obtained by modifying the gene) has been introduced also corresponds to "a carbohydrate oxidase derived from Acremonium chrysogenum".
  • Acremonium chrysogenum from which carbohydrate oxidases that can be used in the present technology are derived examples include Acremonium chrysogenum NBRC30055 (NITE, Japan), ATCC15006 (ATCC, USA), and DSM880 (DSMZ, Germany). can be done.
  • amino acid sequence of the carbohydrate oxidase that can be used in the present technology is not limited, but can be specified by the following amino acid sequence, for example.
  • carbohydrate oxidase that can be used in this technology can be specified by the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:1.
  • the protein after modification may have the same function as the protein before modification. That is, the modification of the amino acid sequence does not substantially affect the function of the protein, and the function of the protein may be maintained before and after modification. Therefore, as another aspect of the present invention, a protein comprising an amino acid sequence in which one to several amino acids are deleted, substituted and/or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having carbohydrate oxidase activity I will provide a. "Deletion, substitution and/or addition of one to several amino acids constituting an amino acid sequence" typically refers to partial differences in amino acid sequences.
  • a difference in the amino acid sequence here is permissible as long as the carbohydrate oxidase activity can be maintained (the activity may vary slightly).
  • the positions where the amino acid sequences differ are not particularly limited, and differences may occur at multiple positions.
  • the plural here is, for example, a number corresponding to less than about 30% of the total amino acid sequence, preferably a number corresponding to less than about 20%, and more preferably a number corresponding to less than about 10%. , even more preferably a number corresponding to less than about 5%, and most preferably a number corresponding to less than about 1%. That is, for example, about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, even more preferably about 95% or more, most preferably about 99% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO:1 refers to having
  • a method of obtaining a protein by causing conservative amino acid substitutions in amino acid residues that are not essential for carbohydrate oxidase activity is good.
  • conservative amino acid substitution refers to substitution of an amino acid residue with an amino acid residue having a side chain with similar properties.
  • Amino acid residues have, depending on their side chain, a basic side chain (e.g. lysine, arginine, histidine), an acidic side chain (e.g. aspartic acid, glutamic acid), an uncharged polar side chain (e.g. glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine), nonpolar side chains (e.g.
  • alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan), beta-branched side chains (e.g. threonine, valine, isoleucine), aromatic side chains (e.g. tyrosine, phenylalanine). , tryptophan, histidine) are classified into several families. Conservative amino acid substitutions are preferably between amino acid residues within the same family.
  • the identity (%) of two amino acid sequences or two nucleic acids can be determined, for example, by the following procedure.
  • the two sequences are aligned for optimal comparison.
  • gaps may be introduced into the first sequence to optimize alignment with the second sequence.
  • comparison of two sequences and determination of identity can be realized using a mathematical algorithm.
  • mathematical algorithms that can be used for sequence comparison include Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68 and Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, modified algorithm, but not limited to this.
  • Such algorithms are described in Altschul et al. (1990) J. Am. Mol. Biol. 215:403-10, incorporated in the NBLAST and XBLAST programs (version 2.0).
  • Gapped BLAST can be used as described in Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Research 25(17):3389-3402.
  • the default parameters of the corresponding programs eg, XBLAST and NBLAST
  • XBLAST and NBLAST the default parameters of the corresponding programs
  • a carbohydrate oxidase that can be used in this technology may be part of a larger protein (eg, a fusion protein).
  • Additional sequences in the fusion protein include, for example, sequences that aid in purification such as multiple histidine residues, additional sequences that ensure stability during recombinant production, and the like.
  • a protein having the above amino acid sequence can be easily prepared by genetic engineering techniques. For example, it can be prepared by transforming a suitable host cell (eg, Escherichia coli, yeast, filamentous fungus) with a DNA encoding the present protein, and recovering the protein expressed in the transformant. The recovered protein is appropriately prepared according to the purpose.
  • a suitable host cell eg, Escherichia coli, yeast, filamentous fungus
  • the recovered protein is appropriately prepared according to the purpose.
  • the present protein as a recombinant protein in this manner, various modifications are possible. For example, if a DNA encoding the present protein and other suitable DNA are inserted into the same vector, and the vector is used to produce a recombinant protein, the recombinant protein consists of any peptide or protein linked thereto.
  • the present protein can be obtained.
  • addition of sugar chains and/or lipids, or modification that causes N-terminal or C-terminal processing may be performed. Such modifications enable extraction of
  • the pH, temperature, duration of action, etc. can be set according to the physicochemical properties of the carbohydrate oxidase to be used, such as optimum pH, stable pH range, optimum temperature, and temperature stability.
  • the pH can be set to, for example, pH 5.0 to 10.5, preferably pH 5.0 to 7.5.
  • the temperature can be set to, for example, 20°C to 55°C, preferably 30°C to 50°C, more preferably 35°C to 45°C.
  • the duration of action can be set to, for example, 1 to 12 hours, preferably 4 to 10 hours.
  • the amount of carbohydrate oxidase added in the carbohydrate oxidase action process can be freely set as long as it does not impair the effect of this technology.
  • carbohydrate oxidase action step other enzymes can be used in addition to carbohydrate oxidase as long as the effect of this technology is not impaired.
  • one or more enzymes selected from lactase, protease, transglutaminase, laccase, peroxidase, catalase, lipase, cellulase, and amylase can be used in combination.
  • sugar can be used in combination in the sugar oxidase action step.
  • sugar By using sugar together, the oxygen in the raw material of the food or drink is consumed during oxidation of the sugar, so that the deoxidizing effect can be improved.
  • the type of saccharide that can be used in combination in the present technology is not particularly limited as long as it does not impair the effect of the present technology.
  • one or more sugars selected from starch, modified starch, dextrin, cellulose, and processed cellulose. Quality can be used together.
  • the anaerobic fermentation step can be performed after the carbohydrate oxidase action step, or can be performed simultaneously with the carbohydrate oxidase action step.
  • anaerobic fermentation process of this technology fermentation can be performed using anaerobic microorganisms.
  • Anaerobic microorganisms that can be used in this technology are anaerobic microorganisms that can be used in the production of general fermented food and drink, depending on the type of fermented food and drink to be manufactured, as long as the effect of this technology is not impaired.
  • One or more types can be freely selected and used.
  • anaerobic microorganisms include lactic acid bacteria, yeast, and the like.
  • Lactic acid fermentation can be performed in the anaerobic fermentation process of this technology.
  • the lactic acid bacterium used for lactic acid fermentation one or more types of lactic acid bacteria that can be used for general lactic acid-fermented food and drink production are selected according to the type and purpose of the lactic acid-fermented food and drink to be produced, as long as the effect of the present technology is not impaired. , can be freely selected and used.
  • Examples of lactic acid bacteria include Lactococcus, Streptococcus, Pediococcus, lactic acid bacteria belonging to Leuconostoc, lactic acid bacteria belonging to Lactobacillus, and Bifidobacterium. etc., preferably Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii.
  • the oxygen concentration contained in the raw material is reduced by performing the carbohydrate oxidase action step, so the progress of anaerobic fermentation can be promoted, but performing aerobic fermentation is excluded. not something to do.
  • Various conditions for the anaerobic fermentation process can be freely set as long as they do not impair the effect of this technology.
  • fermentation conditions, heating conditions, etc. can be set according to the type of anaerobic microorganisms to be used.
  • the fermentation temperature can be set at, for example, 20°C to 55°C, preferably 30°C to 50°C, more preferably 35°C to 45°C.
  • Fermentation time can be set to, for example, 1 to 12 hours, preferably 4 to 10 hours.
  • Heating conditions include, for example, high-temperature short-time sterilization (HTST) method, high-temperature cooking (UHT) method, retort method, etc., and the temperature of food and drink materials is 90 ° C. or higher, preferably about 95 ° C. Just do it. Examples include a method of treating food and beverage materials at 90 to 100° C. for 1 to 5 minutes, and a method of treating them at 90 to 95° C. for 1 to 3 minutes.
  • fermented food and drink refers to food and drink obtained by fermenting food and drink ingredients. Specifically, for example, fermented milk (yogurt), lactic acid bacteria beverage, cheese, yogurt paste, alcoholic beverages (sake, beer, wine, shochu, etc.), various fermented seasonings (soy sauce, miso, vinegar, etc.), bran pickles, kimchi , natto, and kuzumochi.
  • fermented milk yogurt
  • lactic acid bacteria beverage cheese
  • yogurt paste alcoholic beverages
  • alcoholic beverages asake, beer, wine, shochu, etc.
  • various fermented seasonings sauce, miso, vinegar, etc.
  • bran pickles kimchi , natto, and kuzumochi.
  • “fermented food and drink” also includes secondary processed food and drink using these fermented food and drink.
  • “fermented milk” refers to animal-derived “animal fermented milk” and plant-derived “vegetable fermented milk”. “Fermented animal milk” is defined in the “Ministerial Ordinance Concerning Ingredient Standards, etc. for Milk and Dairy Products” as “milk or milk containing non-fat milk solids equal to or higher than milk is fermented with lactic acid bacteria or yeast and made into a paste. or liquefied or frozen”.
  • “Vegetable fermented milk” refers to fermented plant milk, and plant milk includes, for example, peas, soybeans, broad beans, chickpeas, barley, wheat, oats, rice, buckwheat, millet , millet, hemp (industrial hemp), algae, almonds, cashews, hazelnuts, pecans, macadamia nuts, pistachios, walnuts, brazil nuts, peanuts, coconut milk.
  • Oxygen concentration reducing agent for anaerobic fermentation contains carbohydrate oxidase as an active ingredient. Since the details of the carbohydrate oxidase are the same as those of the carbohydrate oxidase that can be used in the method for producing the fermented food and drink described above, the description is omitted here.
  • the oxygen concentration reducing agent for anaerobic fermentation contains the above-described carbohydrate oxidase, it may be composed only of the above-described carbohydrate oxidase. can be freely selected and contained.
  • examples of other ingredients that can be used include excipients, pH adjusters, colorants, flavoring agents, disintegrants, lubricants, stabilizers, and the like that are commonly used in formulations.
  • An anaerobic fermentation method is a method of performing at least a carbohydrate oxidase action step and an anaerobic fermentation step. Details of the carbohydrate oxidase action step and the anaerobic fermentation step performed in the anaerobic fermentation method according to the present technology are the same as the carbohydrate oxidase action step and the anaerobic fermentation step in the above-described method for producing fermented food and drink. I omit the explanation.
  • the following measurement method was used as a method for measuring the activity of carbohydrate oxidase.
  • Glucose oxidase activity measurement method A suitable amount of the enzyme was weighed, and a cooled potassium phosphate/sodium hydroxide buffer (0.1 mol/L) of pH 7.0 was added to dissolve or uniformly disperse to make 50 mL of the sample solution. 2.50 g of D(+)-glucose was weighed and dissolved by adding water to make 25 mL, which was used as a substrate solution.
  • Substrate solution 0.5 mL, potassium phosphate / sodium hydroxide buffer (0.1 mol / L, pH 7.0, containing phenol) 2 mL, peroxidase test solution (25 units / mL) 0.5 mL and 4-aminoantipyrine solution ( 1 ⁇ 250) was placed in a quartz cell and heated at 37° C. for 10 minutes. 0.1 mL of the sample solution was added to this solution, mixed well and heated at 37° C. to obtain a test solution.
  • a potassium phosphate/sodium hydroxide buffer 0.1 mol/L of pH 7.0 or water was used, and the same procedure as in the preparation of the test solution was performed to prepare a comparative solution.
  • the absorbance at a wavelength of 500 nm was measured 2 minutes and 5 minutes after the addition of the test solution and the comparison solution.
  • the amount of oxidized glucose was quantified from the molar extinction coefficient of the quinoneimine dye produced. One unit was defined as the amount of enzyme required to oxidize 1 ⁇ mol of glucose per minute under the conditions.
  • Lactase Y “Amano” LK lactase derived from Kluyveromyces lactis
  • a sterilized dairy raw material mix was prepared in the same manner as in Experimental Example 1, 10 mL was dispensed into 15 mL tubes in a clean bench, and 0.8 U (versus the dairy raw material mix) (0.08 U/mL) of carbohydrate oxidase was added. 0.02 to 0.1 v/v% (2 to 10 U/mL) of a lactase agent and 2 v/v% of a lactic acid bacteria starter are added, mixed by inversion five times, and then fermented at 37°C for several hours in a constant temperature water bath. rice field. 0.5 mL was sampled every hour to check the pH of the milk raw material mix.
  • the sterilized soymilk is water-cooled and Lactobacillus delbrueckii subsp. 0.6 mL of the lactic acid bacteria starter containing delbrueckii and 0.24 U (0.008 U/mL) of the carbohydrate oxidase used in Experimental Example 1 were added, and fermentation was performed overnight at 37°C. The pH was monitored with a pH sensor during the fermentation. An example in which no carbohydrate oxidase was added was designated as an enzyme-free group.
  • Oat milk (“Oat milk” manufactured by Oatly) was dispensed by 10 mL each, and Lactobacillus delbrueckii subsp. 0.2 mL of the lactic acid bacteria starter containing delbrueckii and 0.08 U (0.008 U/mL) of the carbohydrate oxidase used in Experimental Example 1 were added, and fermentation was performed overnight at 37°C. The pH was monitored with a pH sensor during the fermentation. An example in which no carbohydrate oxidase was added was designated as an enzyme-free group.

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Abstract

設備導入を必要とする不活性ガス置換法以外で原料中に含まれる酸素濃度を低減させることにより、嫌気発酵時間が短縮される技術を新たに提供することを主目的とする。　本技術では、原料中の糖質の一部または全部に糖質酸化酵素を作用させる糖質酸化酵素作用工程と、嫌気発酵を行う嫌気発酵工程と、を含む、発酵飲食品の製造方法を提供する。本技術では、また、糖質酸化酵素を含む、嫌気発酵用酸素濃度低減剤を提供する。本技術では、さらに、原料中の糖質の一部または全部に糖質酸化酵素を作用させる糖質酸化酵素作用工程を含む、嫌気発酵方法を提供する。

Description

発酵飲食品の製造方法、及び嫌気発酵方法
　本発明は、嫌気発酵の促進方法に関する。より具体的には、本発明は、糖質酸化酵素を用いて原料中に含まれる酸素濃度を低減させることで、嫌気発酵時間を短縮する製造技術に関する。
　原料乳中の溶存酸素を窒素などの不活性ガスにより置換し、低減することで発酵効率が向上し、発酵乳の発酵時間の短縮ができることが非特許文献１及び特許文献１～３等で開示されている。不活性ガスを混入する代わりに、原料乳中に溶解している酸素を脱気により取り除くこともできる。さらに特許文献４では原料乳中に含まれる酸素濃度を低減させる工程と酵母ラクターゼを併用した発酵乳の製造法が開示されており、乳酸菌や酵素の状態によらず、風味や品質を一定に維持できるとされている。
特開２００５－１７６６０３号公報 特開２００５－３４８７０３号公報 特開２００７－１０４９９５号公報 国際公開第２０１２／０２６３８４号パンフレット
生物工学　第９０巻　３３５－３３９頁
　前述の通り、発酵効率を向上させる技術は様々に開発されつつあるが、従来の酸素濃度低減技術は不活性ガスを置換できる窒素置換装置など大掛かりな設備が必要となるという課題があった。
　そこで、本技術では、設備導入を必要とする不活性ガス置換法以外で原料中に含まれる酸素濃度を低減させることにより、嫌気発酵時間が短縮される技術を新たに提供することを主目的とする。
　本願発明者らは、嫌気発酵時間が短縮される技術について鋭意研究を行った結果、原料乳中に糖質酸化酵素を作用させることで嫌気発酵時間が短縮されることを見出し、本発明を完成するに至った。
　即ち、本技術では、まず、原料中の糖質の一部または全部に糖質酸化酵素を作用させる糖質酸化酵素作用工程と、
　嫌気発酵を行う嫌気発酵工程と、
　を含む、発酵飲食品の製造方法を提供する。
　本技術に係る発酵飲食品の製造方法において、前記糖質酸化酵素作用工程は、前記嫌気発酵工程の前及び／又は前記嫌気発酵工程と同時に行うことができる。
　本技術では、前記糖質酸化酵素として、グルコース、マルトトリオース、マルトース、ガラクトース、マルトテトラオース、ラクトース、セロビオース、及びマルトデキストリンから選ばれる１以上の糖質に作用する性質を有する糖質酸化酵素を用いることができる。
　また、本技術では、前記糖質酸化酵素として、以下の（１）から（３）のいずれかに示すポリペプチドからなる糖質酸化酵素を用いることができる。
（１）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２）配列番号１に示すアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等の基質特異性を示すポリペプチド、及び
（３）配列番号１に示すアミノ酸配列において、配列番号１に示すアミノ酸配列に対する配列同一性が９０％以上であり、且つ配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等の基質特異性を示すポリペプチド。
　本技術に係る発酵飲食品の製造方法において、前記嫌気発酵工程では乳酸発酵を行うことができる。
　本技術に係る発酵飲食品の製造方法では、前記発酵飲食品として発酵乳を製造することができる。
　本技術では、次に、糖質酸化酵素を含む、嫌気発酵用酸素濃度低減剤を提供する。
　本技術では、さらに、原料中の糖質の一部または全部に糖質酸化酵素を作用させる糖質酸化酵素作用工程を含む、嫌気発酵方法を提供する。
　本技術に係る嫌気発酵方法において、前記糖質酸化酵素作用工程は、嫌気発酵工程の前及び／又は嫌気発酵工程と同時に行うことができる。
　本技術によれば、嫌気発酵において、糖質酸化酵素を用いて原料中に含まれる酸素濃度を低減させる処理を行うことで、設備導入を必要とせずに、嫌気発酵時間を短縮することができる。
　以下、本発明を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
　＜１．発酵飲食品の製造方法＞
　本技術に係る発酵飲食品の製造方法は、糖質酸化酵素作用工程と、嫌気発酵工程と、を少なくとも行う方法である。その他、発酵飲食品の種類等に応じて、各工程の前後や各工程と同時に、本技術の効果を損なわない範囲において、一般的な食品の製造工程を行うことも可能である。以下、各工程について詳細に説明する。
　（１）糖質酸化酵素作用工程
　糖質酸化酵素作用工程は、原料中の糖質の一部または全部に糖質酸化酵素を作用させる工程である。本技術では、原料中の糖質に糖質酸化酵素を作用させることで、原料中に含まれる酸素濃度を低減させることができる。その結果、後述する嫌気発酵工程における嫌気発酵時間を短縮することができる。
　また、原料に糖質酸化酵素を作用させることで、後述する嫌気発酵工程を経て得られる発酵飲食品の曵糸性を向上させることができる。特に、植物性原料を発酵させる場合、例えば、牛乳のような動物性原料を用いた発酵飲食品に比べて、粘性や曵糸性が劣る場合があるといった問題があったが、本技術を用いれば、植物性原料を用いた発酵飲食品における曵糸性も向上させることができる。以下、本技術に用いることができる糖質酸化酵素について、詳細に説明する。
　なお、本技術において、「曵糸性」とは、物質が持つ“糸を引く”性質のことであり、例えば、ザーンカップ（Ｚａｈｎ　Ｃｕｐ、株式会社離合社製）使用における、流出する試料の流れが途切れるまでの時間で評価することができる。飲食品の曵糸性が向上することで独特の食感を付与することができる。
　Ａ．糖質酸化酵素
　本技術に用いることができる糖質酸化酵素としては、糖質を酸化できる酵素であれば特に限定されないが、好ましくは２糖以上のオリゴ糖を酸化する酵素である。具体的には、後述する理化学的性質を有するタンパク質が挙げられる。
　（Ａ）作用
　本技術に用いることができる糖質酸化酵素は、酸素存在下において、後述する糖を酸化し糖酸を生成する。より詳しくは、酸素存在下において、後述する糖に、本技術に用いることができる糖質酸化酵素を作用させると、糖酸と過酸化水素が生成する。
　（Ｂ）基質特異性
　本技術に用いることができる糖質酸化酵素としては、グルコース、マルトトリオース、マルトース、ガラクトース、マルトテトラオース、ラクトース、セロビオース、及びマルトデキストリンから選ばれる１以上の糖質に対し活性を示すタンパク質を用いることができる。各基質に対する相対活性は、グルコースに対する活性を１００％とした場合、マルトトリオース：約９２％、マルトース：約８６％、ガラクトース：約７９％、マルトテトラオース：約６０％、ラクトース：約５８％、セロビオース：約５３％、マルトデキストリン：約２４％である。
　なお、本発明においては、グルコースを基質とした場合の活性を基準（１００％）としたときの相対活性が５０％以上あれば、「本酵素が良好に作用する基質である」と判断した。
　このように、グルコースのような単糖類のみならず、二糖類以上の広範囲な糖質にも活性を示す糖質酸化酵素を用いれば、既存のグルコースオキシダーゼやオリゴ糖酸化酵素では対応できなかった広範囲な分野において、糖質酸化作用を機能させることが可能である。
　（Ｃ）Ｋｍ値
　本技術において、タンパク質のＫｍ値（ミカエリス定数）の具体的な算出方法は特に限定されず、公知の方法を自由に選択して算出することができる。タンパク質のＫｍ値の算出方法として、例えば、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ－Ｂｕｒｋプロット、Ｅａｄｉｅ－Ｈｏｆｓｔｅｅプロット、Ｈａｎｅｓ－Ｗｏｏｌｆプロット等が挙げられ、好ましくはＨａｎｅｓ－Ｗｏｏｌｆプロットが挙げられる。本技術に用いることができる糖質酸化酵素のＫｍ値は特に限定されないが、［グルコースのＫｍ値］／［マルトースのＫｍ値］≦１であることが好ましく、０．４≦［グルコースのＫｍ値］／［マルトースのＫｍ値］≦１であることがより好ましい。
　（Ｄ）分子質量
　本技術に用いることができる糖質酸化酵素としては、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法による分子質量が約６３ｋＤａの糖質酸化酵素を用いることができる。
　（Ｅ）至適ｐＨ
　本技術に用いることができる糖質酸化酵素としては、３７℃で５分間の反応条件において、ｐＨ５．０～９．０付近で最も糖質酸化酵素活性が高い糖質酸化酵素を用いることができる。
　（Ｆ）安定ｐＨ範囲
　本技術に用いることができる糖質酸化酵素としては、３７℃で１５分間の処理条件において、ｐＨ５．０～１０．５付近において安定な糖質酸化酵素を用いることができる。
　（Ｇ）至適温度
　本技術に用いることができる糖質酸化酵素としては、ｐＨ７．０で５分間の反応条件において、２０℃～５５℃付近で最も糖質酸化酵素活性が高い糖質酸化酵素を用いることができる。
　（Ｈ）温度安定性
　本技術に用いることができる糖質酸化酵素としては、ｐＨ７．０で１５分間の処理条件において、４５℃までの温度条件で処理しても８０％以上の活性を維持することができる糖質酸化酵素を用いることができる。
　（Ｉ）由来について
　以上説明した本技術に用いることができる糖質酸化酵素の由来は特に限定されないが、例えば、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ属に属する微生物に由来するものが挙げられる。この場合、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ属に属する微生物としては、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ　ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍが挙げられる。
　ここでの「Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ　ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍに由来する糖質酸化酵素」とは、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ　ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍに分類される微生物（野生株であっても変異株であってもよい）が生産する糖質酸化酵素、あるいは糖質酸化酵素遺伝子を利用して遺伝子工学的手法によって得られた糖質酸化酵素であることを意味する。従って、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ　ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍより取得した糖質酸化酵素遺伝子（又は当該遺伝子を改変した遺伝子）を導入した宿主微生物によって生産された組換え酵素も「Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ　ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍに由来する糖質酸化酵素」に該当する。
　本技術に用いることができる糖質酸化酵素がそれに由来することとなるＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍ　ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍの例としては、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ　ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ　ＮＢＲＣ３００５５（ＮＩＴＥ、日本）、ＡＴＣＣ１５００６（ＡＴＣＣ、アメリカ）、ＤＳＭ８８０（ＤＳＭＺ、ドイツ）を挙げることができる。
　（Ｊ）アミノ酸配列
　本技術に用いることができる糖質酸化酵素のアミノ酸配列は限定されないが、一例を挙げると、以下のアミノ酸配列により特定することができる。
　具体的には、本技術に用いることができる糖質酸化酵素は、配列番号１で表されるアミノ酸配列で特定することができる。
　ここで、一般に、あるタンパク質のアミノ酸配列の一部に改変を施した場合において改変後のタンパク質が改変前のタンパク質と同等の機能を有することがある。即ち、アミノ酸配列の改変がタンパク質の機能に対して実質的な影響を与えず、タンパク質の機能が改変前後において維持されることがある。そこで、本発明は他の態様として、配列番号１で表されるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、糖質酸化酵素活性を有するタンパク質を提供する。「アミノ酸配列を構成する１から数個のアミノ酸の欠失、置換および／または付加」とは、典型的にアミノ酸配列の一部の相違のことをいう。
　ここでのアミノ酸配列の相違は、糖質酸化酵素活性が保持されうる限り許容される（活性の多少の変動があってもよい）。この条件を満たす限り、アミノ酸配列が相違する位置は特に限定されず、また複数の位置で相違が生じていてもよい。ここでの複数とは、例えば、全アミノ酸配列の約３０％未満に相当する数であり、好ましくは約２０％未満に相当する数であり、さらに好ましくは約１０％未満に相当する数であり、より一層好ましくは約５％未満に相当する数であり、最も好ましくは約１％未満に相当する数である。
　即ち、配列番号１のアミノ酸配列と、例えば約７０％以上、好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、より一層好ましくは約９５％以上、最も好ましくは約９９％以上の同一性を有することを指す。
　また、好ましくは、糖質酸化酵素活性に必須でないアミノ酸残基において、保存的アミノ酸置換を生じさせることによって、タンパク質を得る方法がよい。ここでの「保存的アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸残基を、同様の性質の側鎖を有するアミノ酸残基に置換することをいう。アミノ酸残基は、その側鎖によって塩基性側鎖（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）のように、いくつかのファミリーに分類されている。保存的アミノ酸置換は好ましくは、同一のファミリー内のアミノ酸残基間の置換である。
　ところで、二つのアミノ酸配列又は二つの核酸（以下、これらを含む用語として「二つの配列」を使用する）の同一性（％）は例えば以下の手順で決定することができる。まず、最適な比較ができるよう二つの配列を並べる。この際、例えば、第一の配列にギャップを導入して第二の配列とのアライメントを最適化してもよい。第一の配列の特定位置の分子（アミノ酸残基又はヌクレオチド）が、第二の配列における対応する位置の分子と同じであるとき、その位置の分子が同一であるといえる。二つの配列の同一性は、その二つの配列に共通する同一位置の数の関数であり（即ち、同一性（％）＝同一位置の数／位置の総数×１００）、好ましくは、アライメントの最適化に要したギャップの数及びサイズも考慮に入れる。
　また、二つの配列の比較及び同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて実現可能である。配列の比較に利用可能な数学的アルゴリズムの具体例としては、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８７：２２６４―６８に記載され、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　９０：５８７３―７７において改変されたアルゴリズムがあるが、これに限定されることはない。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．　２１５：４０３―１０に記載のＮＢＬＡＳＴプログラム及びＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。本発明の核酸分子に等価なヌクレオチド配列を得るには例えばＮＢＬＡＳＴプログラムでｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２としてＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を行えばよい。
　本発明のポリペプチド分子に等価なアミノ酸配列を得るには、例えば、ＸＢＬＡＳＴプログラムでｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３としてＢＬＡＳＴポリペプチド検索を行えばよい。比較のためのギャップアライメントを得るためにはＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　２５（１７）：３３８９－３４０２に記載のＧａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴが利用可能である。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴを利用する場合は、対応するプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用することができる。詳しくはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい。
　配列の比較に利用可能な他の数学的アルゴリズムの例としては、Ｍｙｅｒｓ及びＭｉｌｌｅｒ（１９８８）Ｃｏｍｐｕｔ　Ａｐｐｌ　Ｂｉｏｓｃｉ．　４：１１―１７に記載のアルゴリズムがある。このようなアルゴリズムは、例えばＧＥＮＥＳＴＲＥＡＭネットワークサーバー（ＩＧＨ　Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ、フランス）又はＩＳＲＥＣサーバーで利用可能なＡＬＩＧＮプログラムに組み込まれている。アミノ酸配列の比較にＡＬＩＧＮプログラムを使用する場合は例えば、ＰＡＭ１２０残基質量表を利用し、ギャップ長ペナルティ＝１２、ギャップペナルティ＝４とすることができる。
　本技術に用いることができる糖質酸化酵素は、より大きいタンパク質（例えば融合タンパク質）の一部であってもよい。融合タンパク質において付加される配列としては、例えば、多重ヒスチジン残基のような精製に役立つ配列、組み換え生産の際の安定性を確保する付加配列等が挙げられる。
　上記アミノ酸配列を有するタンパク質は、遺伝子工学的手法によって容易に調製することができる。例えば、本タンパク質をコードするＤＮＡで適当な宿主細胞（例えば大腸菌、酵母、糸状菌）を形質転換し、形質転換体内で発現されたタンパク質を回収することにより調製することができる。回収されたタンパク質は目的に応じて適宜調製される。このように組換えタンパク質として本タンパク質を得ることにすれば、種々の修飾が可能である。例えば、本タンパク質をコードするＤＮＡと他の適当なＤＮＡとを同じベクターに挿入し、当該ベクターを用いて組換えタンパク質の生産を行えば、任意のペプチドないしタンパク質が連結された組換えタンパク質からなる本タンパク質を得ることができる。また、糖鎖及び／又は脂質の付加や、あるいはＮ末端若しくはＣ末端のプロセッシングが生ずるような修飾を施してもよい。以上のような修飾により、組換えタンパク質の抽出、精製の簡便化、又は生物学的機能の付加等が可能である。
　糖質酸化酵素作用工程の各種条件は、本技術の効果を損なわない限り、自由に設定することができる。例えば、用いる糖質酸化酵素の至適ｐＨ、安定ｐＨ範囲、至適温度、温度安定性などの理化学的性質に応じて、ｐＨ、温度、作用時間等を設定することができる。ｐＨは例えば、ｐＨ５．０～１０．５、好ましくはｐＨ５．０～７．５に設定することができる。温度は例えば、２０℃～５５℃、好ましくは３０℃～５０℃、より好ましくは３５℃～４５℃に設定することができる。作用時間は例えば、１～１２時間、好ましくは４～１０時間に設定することができる。
　糖質酸化酵素作用工程における糖質酸化酵素の添加量は、本技術の効果を損なわない限り自由に設定することができる。例えば、発酵時間短縮効果の向上を目的とする場合は、原料に対して、０．００５Ｕ／ｍＬ以上添加することが好ましく、０．００８Ｕ／ｍＬ以上添加することがより好ましく、０．０８Ｕ／ｍＬ以上添加することが更に好ましく、０．１７Ｕ／ｍＬ以上添加することが更により好ましい。また、発酵飲食品の曵糸性向上を目的とする場合は、糖質酸化酵素を１．５Ｕ／ｍＬ以上添加することが好ましい。
　糖質酸化酵素作用工程では、本技術の効果を損なわない限り、糖質酸化酵素に加えて、他の酵素を併用することができる。例えば、ラクターゼ、プロテアーゼ、トランスグルタミナーゼ、ラッカーゼ、パーオキシダーゼ、カタラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、およびアミラーゼから選択される１以上の酵素を併用することが可能である。
　また、糖質酸化酵素作用工程では、糖質を併用することができる。糖質を併用することで、糖質の酸化時に飲食品原料中の酸素が消費されるため、脱酸素効果を向上させることができる。本技術で併用することができる糖質の種類は、本技術の効果を損なわない限り、特に限定されないが、例えば、澱粉、加工澱粉、デキストリン、セルロース、および加工セルロースから選択される１以上の糖質を併用することができる。
　（２）嫌気発酵工程
　嫌気発酵工程では、原料の一部または全部を、嫌気的条件下で発酵させる工程である。嫌気発酵工程は、前記糖質酸化酵素作用工程後に行うこともできるし、前記糖質酸化酵素作用工程と同時に行うこともできる。
　本技術の嫌気発酵工程では、嫌気性微生物を用いて発酵を行うことができる。本技術で用いることができる嫌気性微生物は、本技術の効果を損なわない限り、製造する発酵飲食品の種類等に応じて、一般的な発酵飲食品の製造に用いることができる嫌気性微生物を１種以上、自由に選択して用いることができる。例えば、嫌気性微生物としては、乳酸菌、酵母等が挙げられる。
　本技術の嫌気発酵工程では、乳酸発酵を行うことができる。乳酸発酵時に用いる乳酸菌としては、本技術の効果を損なわない限り、製造する乳酸発酵飲食品の種類や目的に応じて、一般的な乳酸発酵飲食品の製造に用いることができる乳酸菌を１種以上、自由に選択して用いることができる。乳酸菌としては、例えば、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）に属する乳酸球菌、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する乳酸桿菌、ビフィズス菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）等が挙げられ、好ましくは、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ.　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉが挙げられる。
　なお、本技術では、前記糖質酸化酵素作用工程を行うことで、原料中に含まれる酸素濃度を低減させるため、嫌気発酵の進行を促進することができるが、好気発酵を行うことを排除するものではない。例えば、前記糖質酸化酵素作用工程を行う前に、好気性微生物を用いた好気発酵工程を行うことも可能であるし、少ない酸素でも生育可能な微生物であれば、前記糖質酸化酵素作用工程や嫌気発酵工程と同時または後に、好気発酵工程を行うことも可能である。
　嫌気発酵工程を行う際の各種条件は、本技術の効果を損なわない限り、自由に設定することができる。例えば、用いる嫌気性微生物の種類に応じて、発酵条件、加熱条件等を設定することができる。発酵温度は、例えば２０℃～５５℃、好ましくは３０℃～５０℃、より好ましくは３５℃～４５℃に設定することができる。発酵時間は、例えば１～１２時間、好ましくは４～１０時間に設定することができる。加熱条件は、例えば、高温短時間殺菌（ＨＴＳＴ）法、高温加熱調理（ＵＨＴ）法、レトルト法等が挙げられ、飲食品材料の温度が９０℃以上、好ましくは９５℃程度になる条件であればよい。飲食品材料を９０～１００℃にて１～５分間で処理する方法や、９０～９５℃にて１～３分間で処理する方法等が挙げられる。
　以上説明した発酵飲食品の製造方法を用いれば、様々な発酵飲食品を効率的に製造することができる。本技術において、「発酵飲食品」とは、飲食品材料を発酵することにより得られる飲食品をいう。具体的には、例えば、発酵乳（ヨーグルト）、乳酸菌飲料、チーズ、ヨーグルトペースト、酒類（日本酒、ビール、ワイン、焼酎等）、各種発酵調味料（醤油、味噌、酢等）、ぬか漬け、キムチ、納豆、くずもち等が挙げられる。また、本技術において、「発酵飲食品」には、これらの発酵飲食品を用いた二次加工飲食品も包含する。
　本技術において、「発酵乳」とは、動物由来の「動物性発酵乳」と植物由来の「植物性発酵乳」を指す。「動物性発酵乳」とは、「乳及び乳製品の成分規格等に関する省令」において、「乳又はこれと同等以上の無脂乳固形分を含む乳等を乳酸菌又は酵母で発酵させ、糊状又は液状にしたもの又はこれらを凍結したもの」と定義されている「発酵乳」を指す。「植物性発酵乳」とは、植物性ミルクを発酵させたものを指し、植物性ミルクとは、例えば、エンドウ豆、大豆、そら豆、ひよこ豆、大麦、小麦、オーツ麦、米、そば、ひえ、あわ、ヘンプ（産業用ヘンプ）、藻類、アーモンド、カシューナッツ、ヘーゼルナッツ、ペカンナッツ、マカダミアナッツ、ピスタチオ、クルミ、ブラジルナッツ、ピーナッツ、ココナッツ由来の植物性ミルクが挙げられる。
　本技術に係る発酵飲食品の製造方法における各工程では、飲食品材料（動物性乳、植物性乳、穀物、野菜、果物、豆類、魚介類、肉類等）、各種酵素、各種微生物の他に、本技術の効果を損なわない限り、一般的な飲食品の製造時に用いる原料を自由に選択して用いることができる。例えば、各種調味料、ｐＨ調整剤、着色剤、矯味剤、安定剤等を用いることができる。
　＜２．嫌気発酵用酸素濃度低減剤＞
　本技術に係る嫌気発酵用酸素濃度低減剤は、糖質酸化酵素を有効成分として含有する。糖質酸化酵素の詳細は、前述した発酵飲食品の製造方法に用いることができる糖質酸化酵素と同一であるため、ここでは説明を割愛する。
　嫌気発酵用酸素濃度低減剤は、前述した糖質酸化酵素を含有していれば、前述した糖質酸化酵素のみで構成されていてもよいし、本技術の効果を損なわない限り、他の成分を１種又は２種以上、自由に選択して含有させることもできる。他の成分としては、例えば、通常製剤化に用いられている賦形剤、ｐＨ調整剤、着色剤、矯味剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤等の成分を用いることができる。更に、公知の又は将来的に見出される機能を有する成分を、適宜目的に応じて併用することも可能である。
　＜３．嫌気発酵方法＞
　本技術に係る嫌気発酵方法は、糖質酸化酵素作用工程と、嫌気発酵工程と、を少なくとも行う方法である。本技術に係る嫌気発酵方法で行う糖質酸化酵素作用工程及び嫌気発酵工程の詳細は、前述した発酵飲食品の製造方法における糖質酸化酵素作用工程及び嫌気発酵工程と同一であるため、ここでは説明を割愛する。
　以下、実施例に基づいて本発明を更に詳細に説明する。なお、以下に説明する実施例は、本発明の代表的な実施例の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
　なお、本技術では、糖質酸化酵素の活性測定法として、以下の測定方法を用いた。
　［グルコースオキシダーゼ活性測定法］
　適当量の酵素を量り、冷却したｐＨ７．０のリン酸カリウム・水酸化ナトリウム緩衝液（０．１ｍｏｌ／Ｌ）を加えて溶解又は均一に分散して５０ｍＬとしたものを試料液とした。Ｄ（＋）－グルコース２．５０ｇを量り、水を加えて溶かし、２５ｍＬとしたものを基質溶液とした。基質溶液０．５ｍＬ、リン酸カリウム・水酸化ナトリウム緩衝液（０．１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．０、フェノール含有）２ｍＬ、パーオキシダーゼ試液（２５単位／ｍＬ）０．５ｍＬ及び４－アミノアンチピリン溶液（１→２５０）０．１ｍＬを石英セルに入れ、３７℃で１０分間加温した。この液に試料液０．１ｍＬを加えてよく混ぜて３７℃で加温し、検液とした。別に試料液の代わりにｐＨ７．０のリン酸カリウム・水酸化ナトリウム緩衝液（０．１ｍｏｌ／Ｌ）又は水を用いて検液の調製と同様に操作し、比較液とした。検液及び比較液につき、試料液添加２分後及び５分後の波長５００ｎｍにおける吸光度を測定した。生成したキノンイミン色素のモル吸光係数から酸化されたグルコース量を定量した。条件下、１分間に１μｍｏｌのグルコースを酸化するのに必要な酵素量を１単位とした。
　＜実験例１＞
　実験例１では、乳原料の発酵時に、糖質酸化酵素を用いた場合の乳原料中の溶存酸素濃度の挙動と、発酵時間への影響を調べた。
　（１）実験方法
　市販牛乳（「明治おいしい牛乳」（無脂乳固形分８．３％以上、乳脂肪分３．５％以上）、株式会社明治製）３８０ｇ、市販スキムミルク（森永乳業株式会社製）１１ｇ、水５７ｇをガラス容器内で混ぜて乳原料ミックスを調製した後、９５℃で５分間殺菌処理した。続いて、室温まで戻した殺菌処理済み乳原料ミックスをクリーンベンチ内で５０ｍＬチューブ内に３０ｍＬずつ分注し、糖質酸化酵素の一例として、ＷＯ２０１４/０４２２３７に記載の方法で調製された酵素を５～１２０Ｕ（対乳原料ミックス）（０．１７～４Ｕ／ｍＬ）になるように添加後、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ.　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓならびにＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓを含む乳酸菌スターターを２ｖ／ｖ％添加し、５回転倒混和した後、恒温水槽にて３７℃で数時間発酵を行った。発酵時のｐＨおよび溶存酸素の挙動はそれぞれｐＨセンサー、ＤＯセンサーを用いることでモニタリングした。
　（２）結果
　結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
  
　（３）考察
　表１に示す通り、溶存酸素の挙動を確認した結果、酵素無添加区では溶存酸素が発酵初期の１０％未満になるまでにかかる時間が２．５時間であったが、これに対して糖質酸化酵素添加区では０．３時間まで短縮され、酵素処理により酸素を除去できることが明らかとなった。さらに、ｐＨ挙動を確認したところ、酵素無添加区では乳原料のカードが形成されるｐＨ５．５に到達するまでに２．８時間要したが、糖質酸化酵素添加区では０．１７Ｕ／ｍＬで２．３時間、０．８Ｕ／ｍＬ以上で１．９時間と、最大で１時間の発酵時間短縮が認められた。これらの結果から、糖質酸化酵素の作用によって乳原料の酸素濃度を低減させることで嫌気発酵を促進させ、発酵時間を短縮できることが明らかとなった。
　＜実験例２＞
　実験例２では、糖質酸化酵素とラクターゼの併用効果を確認した。
　（１）実験方法
　ラクターゼとしてＬａｃｔａｓｅ　Ｙ“Ａｍａｎｏ”Ｌ－Ｋ（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｌａｃｔｉｓ由来ラクターゼ）を用いた。実験例１と同様に殺菌処理済み乳原料ミックスを調製、クリーンベンチ内で１５ｍＬチューブに１０ｍＬずつ分注し、糖質酸化酵素を０．８Ｕ（対乳原料ミックス）（０．０８Ｕ／ｍＬ）、ラクターゼ剤を０．０２～０．１ｖ／ｖ％（２～１０Ｕ／ｍＬ）、乳酸菌スターターを２ｖ／ｖ％添加し、５回転倒混和した後、恒温水槽にて３７℃で数時間発酵を行った。１時間ごとに０．５ｍＬずつサンプリングし、乳原料ミックスのｐＨを確認した。
　（２）結果
　結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
  
　（３）考察
　表２に示す通り、発酵４時間で酵素併用効果が確認された。糖質酸化酵素単独処理では発酵４時間でカードは形成されているが、物性はややゆるく、チューブを逆さにすると少し垂れるのに対して、糖質酸化酵素とラクターゼ併用添加処理ではカードは垂れず、より強固な物性であることが明らかとなった。これらの結果から、糖質酸化酵素とラクターゼの併用効果が認められた。
　＜実験例３＞
　実験例３では、発酵工程前に、糖質酸化酵素による処理を行った場合の効果について確認した。
　（１）実験方法
　実験例１と同様に殺菌処理済み乳原料ミックスを調製、クリーンベンチ内で１５ｍＬチューブに１０ｍＬずつ分注し、糖質酸化酵素を無添加または０．８～３９．１Ｕ（対乳原料ミックス）（０．０８～３．９１Ｕ／ｍＬ）添加し、５回転倒混和した後、５℃低温庫で一晩（２０時間）反応させた。酵素無添加または０．８～３９．１Ｕ（対乳原料ミックス）（０．０８～３．９１Ｕ／ｍＬ）の糖質酸化酵素で処理した乳原料ミックスを１００℃で１０分間殺菌処理し、室温まで戻した後に乳酸菌スターターを２ｖ／ｖ％添加、５回転倒混和した後、恒温水槽にて３７℃で数時間発酵を行った。１時間ごとに０．５ｍＬずつサンプリングし、乳原料ミックスのｐＨを確認した。
　（２）結果
　結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
  
　（３）考察
　表３に示す通り、発酵工程前に、糖質酸化酵素による処理を行った場合でも、糖質酸化酵素添加量依存的に発酵時間が短縮されることが認められ、発酵前または発酵工程中でも効果を発揮できることが明らかとなった。
　＜実験例４＞
　実験例４では、植物性原料の発酵時に、糖質酸化酵素を用いた場合の発酵時間への影響を調べた。植物性原料として、豆乳を用いた。
　（１）実験方法
　大豆１００ｇに常水４００ｇ入れ、２４時間浸漬した。浸漬大豆を取り出し、１００ｇをミキサーで粉砕（２分程度）し、ご汁を調製した。得られたご汁に、ご汁の７倍の水を加えながら、ミキサーでさらに細かく破砕した。破砕したものを鍋に入れ、沸騰してから中火～弱火で焦げつかないようにヘラで混ぜながら１０分間火入れした。冷却後、こし袋に入れ、ご汁を漉して、豆乳を調製した。調製した豆乳を、５０ｍＬチューブに３０ｍＬ分注し、９５℃で５分間殺菌した。
　殺菌した豆乳を水冷し、クリーンベンチにてＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉを含む乳酸菌スターターを０．６ｍＬと、前記実験例１で用いた糖質酸化酵素を０．２４Ｕ（０．００８Ｕ／ｍＬ）添加し、３７℃で一晩発酵を行った。発酵中、ｐＨセンサーでｐＨをモニターした。なお、糖質酸化酵素を添加しなかった例を酵素無添加区とした。
　（２）結果
　結果を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
  
　（３）考察
　表４に示す通り、酵素無添加区では豆乳原料のカードが形成されるｐＨ４．５に到達するまでに９．３時間要したが、糖質酸化酵素添加区では８．２時間と、１．１時間の発酵時間短縮が認められた。この結果から、植物性原料である豆乳を用いた場合も、本技術を用いれば発酵時間を短縮できることが明らかとなった。
　＜実験例５＞
　実験例５では、植物性原料としてオーツミルクを用いて発酵を行った際、糖質酸化酵素を用いた場合の発酵時間への影響を調べた。
　（１）実験方法
　オーツミルク（Ｏａｔｌｙ社製「オーツミルク」）を１０ｍＬずつ分注し、クリーンベンチにてＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉを含む乳酸菌スターターを０．２ｍＬと、前記実験例１で用いた糖質酸化酵素を０．０８Ｕ（０．００８Ｕ／ｍＬ）添加し、３７℃で一晩発酵を行った。発酵中、ｐＨセンサーでｐＨをモニターした。なお、糖質酸化酵素を添加しなかった例を酵素無添加区とした。
　（２）結果
　結果を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
  
　（３）考察
　表５に示す通り、酵素無添加区ではオーツミルク原料のカードが形成されるｐＨ４．５に到達するまでに７．８時間要したが、糖質酸化酵素添加区では５．５時間と、２．３時間の発酵時間短縮が認められた。この結果から、植物性原料であるオーツミルクを用いた場合も、本技術を用いれば発酵時間を短縮できることが明らかとなった。
　＜実験例６＞
　実験例６では、植物性原料の発酵時に、糖質酸化酵素を用いた場合の曵糸性への影響を調べた。植物性原料として、豆乳を用いた。
　（１）実験方法
　滅菌済み３００ｍＬビーカーに、豆乳（マルサンアイ株式会社製「オーガニック　成分無調整豆乳」）を２８０ｍＬ分注し、水冷後、クリーンベンチにてＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉを含む乳酸菌スターターを５．６ｍＬと、前記実験例１で用いた糖質酸化酵素を１．５Ｕ／ｍＬ又はセルラーゼを２.０Ｕ／ｍＬとなるよう添加し、３７℃で一晩発酵を行った。発酵後、豆乳ヨーグルトの曵糸性について、ザーンカップを用いて流出時間を計測した。具体的には、ザーンカップのオリフィスから流出する試料の流れが途切れるまでの時間を流出時間とした。なお、糖質酸化酵素を添加しなかった例を酵素無添加区とした。
　（２）結果
　結果を表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
  
　（３）考察
　表６に示す通り、酵素無添加区では流出時間が６秒であるところ、糖質酸化酵素添加区では流出時間が１００秒と、飛躍的に曵糸性が向上していた。また、セルラーゼ添加区では、酵素無添加区に比べると曵糸性の向上が見られたが、曵糸性の向上効果は、糖質酸化酵素添加区でより顕著であった。この結果から、本技術を用いれば、植物性原料を用いた場合でも、曵糸性を向上させることが明らかとなった。
　＜実験例７＞
　実験例７では、植物性原料の発酵後の曵糸性について、添加する糖質酸化酵素の添加量の影響を調べた。植物性原料として、豆乳を用いた。
　（１）実験方法
　滅菌済み３００ｍＬビーカーに、豆乳（マルサンアイ株式会社製「オーガニック　成分無調整豆乳」）を２８０ｍＬ分注し、水冷後、クリーンベンチにてＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉを含む乳酸菌スターターを５．６ｍＬと、前記実験例１で用いた糖質酸化酵素を下記の表７に示す量添加し、３７℃で一晩発酵を行った。発酵後、豆乳ヨーグルトの曵糸性について、ザーンカップを用いて流出時間を計測した。
　（２）結果
　結果を表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
  
　（３）考察
　表７に示す通り、糖質酸化酵素の添加量が０．０１５Ｕ／ｍＬおよび０．１５Ｕ／ｍＬの場合に比べて、１．５Ｕ／ｍＬ以上添加した場合、飛躍的に流出時間が延びていた。この結果から、曵糸性向上を確実に実現するためには、糖質酸化酵素を１．５Ｕ／ｍＬ以上添加することが好ましいことが分かった。

Claims (9)

  1. 　原料中の糖質の一部または全部に糖質酸化酵素を作用させる糖質酸化酵素作用工程と、
    　嫌気発酵を行う嫌気発酵工程と、
    　を含む、発酵飲食品の製造方法。
  2. 　前記糖質酸化酵素作用工程は、前記嫌気発酵工程の前及び／又は前記嫌気発酵工程と同時に行われる、請求項１に記載の発酵飲食品の製造方法。
  3. 　前記糖質酸化酵素が、グルコース、マルトトリオース、マルトース、ガラクトース、マルトテトラオース、ラクトース、セロビオース、及びマルトデキストリンから選ばれる１以上の糖質に作用する性質を有する、請求項１又は２に記載の発酵飲食品の製造方法。
  4. 　前記糖質酸化酵素が、以下の（１）から（３）のいずれかに示すポリペプチドからなる、請求項１から３のいずれか一項に記載の発酵飲食品の製造方法。
    （１）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    （２）配列番号１に示すアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等の基質特異性を示すポリペプチド、及び
    （３）配列番号１に示すアミノ酸配列において、配列番号１に示すアミノ酸配列に対する配列同一性が９０％以上であり、且つ配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等の基質特異性を示すポリペプチド。
  5. 　前記嫌気発酵工程では乳酸発酵が行われる、請求項１から４のいずれか一項に記載の発酵飲食品の製造方法。
  6. 　前記発酵飲食品が発酵乳である、請求項１から５のいずれか一項に記載の発酵飲食品の製造方法。
  7. 　糖質酸化酵素を含む、嫌気発酵用酸素濃度低減剤。
  8. 　原料中の糖質の一部または全部に糖質酸化酵素を作用させる糖質酸化酵素作用工程を含む、嫌気発酵方法。
  9. 　前記糖質酸化酵素作用工程が、嫌気発酵工程の前及び／又は嫌気発酵工程と同時に行われる、請求項８に記載の嫌気発酵方法。
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