WO2022210708A1 - 組換え微生物及びｃ６化合物の製造方法 - Google Patents

組換え微生物及びｃ６化合物の製造方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2022210708A1
WO2022210708A1 PCT/JP2022/015439 JP2022015439W WO2022210708A1 WO 2022210708 A1 WO2022210708 A1 WO 2022210708A1 JP 2022015439 W JP2022015439 W JP 2022015439W WO 2022210708 A1 WO2022210708 A1 WO 2022210708A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
seq
nucleotide
dna
sequence shown
coa
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2022/015439
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
祐太朗 山田
章友 牛木
令 宮武
光二 井阪
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Asahi Kasei Corp
Asahi Chemical Industry Co Ltd
Original Assignee
Asahi Kasei Corp
Asahi Chemical Industry Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=83456322&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=WO2022210708(A1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from JP2021057325A external-priority patent/JP7038241B1/ja
Application filed by Asahi Kasei Corp, Asahi Chemical Industry Co Ltd filed Critical Asahi Kasei Corp
Priority to EP22780919.1A priority Critical patent/EP4317416A4/en
Priority to JP2023511377A priority patent/JP7625070B2/ja
Priority to CN202280025115.9A priority patent/CN117441008A/zh
Priority to US18/284,539 priority patent/US20240158803A1/en
Priority to KR1020237037089A priority patent/KR20230159611A/ko
Publication of WO2022210708A1 publication Critical patent/WO2022210708A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0008—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/001—Oxidoreductases (1.) acting on the CH-CH group of donors (1.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1096—Transferases (2.) transferring nitrogenous groups (2.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/001—Amines; Imines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/005—Amino acids other than alpha- or beta amino acids, e.g. gamma amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/18—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic polyhydric
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/44—Polycarboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01035—3-Hydroxyacyl-CoA dehydrogenase (1.1.1.35)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y103/00—Oxidoreductases acting on the CH-CH group of donors (1.3)
    • C12Y103/01—Oxidoreductases acting on the CH-CH group of donors (1.3) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12Y203/01174—3-Oxoadipyl-CoA thiolase (2.3.1.174)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/01—Hydro-lyases (4.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/72—Candida
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/84—Pichia
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the present invention relates to recombinant microorganisms and methods for producing C6 compounds.
  • the present invention also relates to recombinant microorganisms and methods for producing adipic acid or derivatives thereof.
  • C6 compounds such as adipic acid, hexamethylenediamine, 1,6-hexanediol, 6-aminohexanoic acid, 6-amino-1-hexanol and 6-hydroxyhexanoic acid are used as raw materials for polyamides and polyurethanes, etc. It is positioned as an important compound in industry.
  • adipic acid (CAS No. 124-04-9) is a monomer compound used as a raw material for polyamides such as nylon-66, urethane, and a raw material for plasticizers.
  • a common current method for producing adipic acid is chemical synthesis, such as oxidation of cyclohexanol alone or a mixture of cyclohexanol and cyclohexanone (K/A oil) with nitric acid.
  • microorganisms for adipic acid, 6-aminocaproic acid, or caprolactam biosynthesis have been reported (Patent Document 1).
  • Examples include "succinyl-CoA: acetyl-CoA acyltransferase” which converts succinyl-CoA and acetyl-CoA to 3-oxoadipyl-CoA; "3- hydroxyacyl-CoA dehydrogenase”; converts 3-hydroxyadipyl-CoA to 5-carboxy-2-pentenoyl-CoA; “3-hydroxyadipyl-CoA dehydratase”; converts 5-carboxy-2-pentenoyl-CoA to adipyl- Disclosed is a method of culturing a microorganism containing "5-carboxy-2-pentenoyl-CoA reductase" that converts to CoA; and "phosphotransadipylase” and "adipate kinase
  • Non-Patent Document 1 a culture of genetically modified E. coli in which the E. coli-derived enzymes PaaJ, PaaH, and PaaF and Acinetobacter baylyi-derived enzymes DcaA and TesB were co-expressed. 36 mg/L of adipic acid was produced using glucose as a carbon source. It has been reported that it can be done (Non-Patent Document 1).
  • adipic acid as a production method using biomass-derived raw materials, after converting a biomass-derived carbon source into cis, cis-muconic acid using genetically modified microorganisms, the obtained cis, cis-muconic acid is A method of hydrogenating to produce adipic acid has also been proposed (Patent Document 4). A method for producing adipic acid from ⁇ -ketoglutarate using a genetic recombinant has also been proposed (Patent Document 5).
  • An object of the present invention is to provide a recombinant microorganism having 2,3-dehydroadipyl-CoA reductase activity and an efficient method for producing C6 compounds.
  • a further object of the present invention is to provide a recombinant microorganism capable of producing adipic acid or an adipic acid derivative, and a method for producing adipic acid or an adipic acid derivative.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above-described problems of the prior art, and found that by expressing a specific exogenous enzyme in a host microorganism, 2,3-dehydroadipyl-CoA reductase activity The present inventors have found that it is possible to obtain a recombinant microorganism exhibiting a favorable reaction rate, and that the C6 compound can be efficiently produced by culturing the present recombinant microorganism, thereby completing the present invention.
  • a recombinant microorganism comprising an exogenous gene encoding a protein having an enzymatic activity that reduces 2,3-dehydroadipyl-CoA and converts it to adipyl-CoA
  • the exogenous gene is (i) a DNA encoding a protein consisting of an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 or 16; (ii) an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids are deleted, substituted, inserted and/or added to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 or 16
  • the recombinant microorganism according to any one of [1] to [3]; [5]
  • the recombinant microorganism is Escherichia genus, Bacillus genus, Corynebacterium genus, Arthrobacter genus, Brevibacterium genus, Clostridium genus , Zymomonas genus, Pseudomonas genus, Burkholderia genus, Streptomyces genus, Rhodococcus genus, Synechocystis genus, Alkalihalobacillus genus, Alkalihalobacillus genus any of [1] to [4] belonging to the genus Saccharomyces, the genus Schizosaccharomyces, the genus Yarrowia, the genus Candida, the genus Pichia, or the genus Aspergillus Recombinant microorganism according to paragraph 1;
  • a method for producing a C6 compound comprising a culturing step of culturing the recombinant microorganism according to any one of [1] to [7],
  • the C6 compound is at least one selected from the group consisting of adipic acid, hexamethylenediamine, 1,6-hexanediol, 6-aminohexanoic acid, 6-amino-1-hexanol and 6-hydroxyhexanoic acid.
  • the present inventors have found a microorganism newly isolated from nature, the genus Burkholderia (Burkholderia sp.) LEBP-3 strain (accession number: NITE BP-03334) has found that adipic acids can be efficiently produced by culturing genetically modified microorganisms that express a given enzyme, leading to the present invention.
  • the present invention further provides: [12] A recombinant microorganism comprising at least one of an exogenous gene encoding 3-hydroxyadipyl-CoA dehydratase and an exogenous gene encoding 2,3-dehydroadipyl-CoA reductase; [13] At least one of 3-hydroxyadipyl-CoA dehydratase and 2,3-dehydroadipyl-CoA reductase is derived from Burkholderia sp.
  • LEBP-3 strain (accession number: NITE BP-03334) the recombinant microorganism of [12]; [14] The 3-hydroxyadipyl-CoA dehydratase uses the chromosomal DNA of Burkholderia sp.
  • LEBP-3 strain as a template, (1a) a nucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 168 and a nucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 169, or (1b) a nucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 168 and a nucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 169 is 80% or more, 85% or more, 88% or more, 90% or more, 93% or more, 95% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more encoded in DNA
  • the 2,3-dehydroadipyl-CoA reductase uses the chromosomal DNA of Burkholderia sp.
  • LEBP-3 strain as a template, (2a) a nucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 170 and a nucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 171, or (2b) a nucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 170 and a nucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 171 is 80% or more, 85% or more, 88% or more, 90% or more, 93% or more, 95% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more encoded in DNA
  • the recombinant microorganism according to any one of [12] to [14], wherein the DNA has 924 to 1386 bp; [16]
  • the 3-hydroxyadipyl-CoA dehydratase uses the chromosomal DNA of Burkholderia sp.
  • LEBP-3 strain as a template, (1a) a nucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 168 and a nucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 169, or (1b) a nucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 168 and a nucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 169 encoded in a DNA that is a PCR amplification product using as a primer
  • the 2,3-dehydroadipyl-CoA reductase uses the chromosomal DNA of Burkholderia sp.
  • LEBP-3 strain as a template, (2a) a nucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 170 and a nucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 171, or (2b) a nucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 170 and a nucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 171 encoded in a DNA that is a PCR amplification product using as a primer
  • the recombinant microorganism according to any one of [12] to [14], wherein the DNA has 1155 or 1156 bp; [18]
  • the recombinant microorganism is of the genus Esselicia, Corynebacterium, Bacillus, Acinetobacter, Burkholderia, Pseudomonas, Clostridium, Saccharomyces, Schizosaccharomy
  • a method for producing a target compound comprising a culturing step of culturing the recombinant microorganism according to any one of [12] to [17], which belongs to a genus selected from the group consisting of the genus Aspergillus; [19] The recombinant microorganism according to any one of [12] to [18], which has an adipic acid production pathway; [20] The recombinant microorganism according to any one of [12] to [19], which has a hexamethylenediamine production pathway; [21] The recombinant microorganism according to any one of [12] to [19], which has a 1,6-hexanediol production pathway; [22] The recombinant microorganism according to any one of [12] to [19], which has a 6-amino-1-hexanol production pathway; [23] A method for producing a target compound, comprising a culturing step of
  • LEBP-3 strain as a template, (a1) a nucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 168 and a nucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 169, or (a2) a nucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 168 and a nucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 169 is 80% or more, 85% or more, 88% or more, 90% or more, 93% or more, 95% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more
  • a DNA-encoded recombinant polypeptide comprising: having 3-hydroxyadipyl CoA dehydratase activity, a recombinant polypeptide, wherein the DNA has 626-940 bp; (A-2) Using the chromosomal DNA of Burkholderia sp.
  • LEBP-3 strain as a template, (a1) a nucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 168 and a nucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 169, or (a2) a nucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 168 and a nucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 169
  • LEBP-3 strain as a template, (a1) a nucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 168 and a nucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 169, or (a2) a nucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 168 and a nucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 169
  • LEBP-3 strain as a template, (b1) a nucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 170 and a nucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 171, or (b2) a nucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 170 and a nucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 171 is 80% or more, 85% or more, 88% or more, 90% or more, 93% or more, 95% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more
  • LEBP-3 strain as a template, (b1) a nucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 170 and a nucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 171, or (b2) a nucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 170 and a nucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 171
  • LEBP-3 strain as a template, (b1) a nucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 170 and a nucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 171, or (b2) a nucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 170 and a nucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 171
  • the present invention provides a recombinant microorganism having 2,3-dehydroadipyl-CoA reductase activity and a method for producing a C6 compound.
  • the present invention also provides recombinant microorganisms capable of producing adipic acid or adipic acid derivatives, and methods for producing adipic acid or adipic acid derivatives.
  • FIG. 1 shows examples of biosynthetic pathways from acetyl-CoA and succinyl-CoA to C6 compounds.
  • FIG. 2 shows the amino acid sequences of each enzyme and the base sequences of primers.
  • FIG. 3 shows the amino acid sequences of each enzyme.
  • FIG. 4 shows the amino acid sequences of each enzyme.
  • FIG. 5 shows the amino acid sequences of each enzyme.
  • FIG. 6 shows the base sequences encoding each enzyme and the base sequences of primers.
  • FIG. 7 shows the nucleotide sequences encoding each enzyme and the nucleotide sequences of primers.
  • FIG. 8 shows the base sequences encoding each enzyme and the base sequences of primers.
  • FIG. 9 is a diagram showing base sequences encoding each enzyme.
  • FIG. 10 shows the base sequences encoding each enzyme.
  • FIG. 11 shows the nucleotide sequences of each primer.
  • FIG. 12 shows the base sequences encoding each enzyme and the base sequences of each primer.
  • FIG. 13 shows the nucleotide sequences of each primer.
  • FIG. 14 shows the nucleotide sequences encoding each enzyme and the nucleotide sequences of each primer.
  • FIG. 15 shows the amino acid sequence of each enzyme, the nucleotide sequence encoding each enzyme, and the nucleotide sequence of each primer.
  • FIG. 16 shows examples of adipic acid, adipic acid derivatives, hexamethylenediamine, 1,6-hexanediol and 6-amino-1-hexanol production pathways possessed by recombinant microorganisms of the present invention.
  • FIG. 17 shows the genes to be amplified in PCR and the primers used.
  • Figure 18 shows the amino acid sequence of each enzyme.
  • FIG. 19A shows the nucleotide sequences encoding each enzyme.
  • FIG. 19B shows the base sequences encoding each enzyme.
  • FIG. 20A shows amplification targets and primers used in PCR.
  • FIG. 20B shows amplification targets and primers used in PCR.
  • Figure 21 shows the amino acid sequence of the enzyme.
  • Figure 22A shows the amino acid sequence of the enzyme.
  • Figure 22B shows the amino acid sequence of the enzyme.
  • Figure 22C shows the amino acid sequence of the enzyme.
  • Figure 22D shows the amino acid sequence of the enzyme.
  • Figure 22E shows the amino acid sequence of the enzyme.
  • Figure 23A shows the amino acid sequence of the enzyme.
  • Figure 23B shows the amino acid sequence of the enzyme.
  • Figure 23C shows the amino acid sequence of the enzyme.
  • Figure 23D shows the amino acid sequence of the enzyme.
  • Figure 24A shows the amino acid sequence of the enzyme.
  • Figure 24B shows the amino acid sequence of the enzyme.
  • Figure 24C shows the amino acid sequence of the enzyme.
  • Figure 24D shows the amino acid sequence of the enzyme.
  • Figure 24E shows the amino acid sequence of the enzyme.
  • Figure 25 shows the amino acid sequence of the enzyme.
  • a numerical range indicated using "-" indicates a range that includes the numerical values before and after "-" as the minimum and maximum values, respectively.
  • the upper limit value or lower limit value of the numerical range in one step can be arbitrarily combined with the upper limit value or lower limit of the numerical range in another step.
  • endogenous refers to the gene to which the referred gene or the protein encoded thereby (typically is used to mean that the host microorganism has an enzyme) whether or not it is functionally expressed to the extent that it can drive a dominant biochemical reaction within the host cell.
  • exogenous or “exogenous” means that if the host microorganism before genetic recombination does not have the gene to be introduced according to the present invention, the enzyme resulting from the gene is substantially expressed. and where that gene or a different gene encodes the amino acid sequence of the enzyme but does not express comparable endogenous enzymatic activity after genetic recombination, the gene or nucleic acid sequence according to the present invention is introduced into the host. Used to mean to introduce.
  • Invention A Recombinant microorganism and method for producing C6 compound
  • the recombinant microorganism according to the present invention encodes a protein having an enzymatic activity that reduces 2,3-dehydroadipyl-CoA and converts it to adipyl-CoA. Contains exogenous genes. The reaction to reduce 2,3-dehydroadipyl-CoA to convert it to adipyl-CoA is shown in step D of FIG.
  • a "protein having an enzymatic activity to reduce 2,3-dehydroadipyl-CoA and convert it to adipyl-CoA” is also referred to as a "2,3-dehydroadipyl-CoA reductase.”
  • the enzymatic activity that reduces 2,3-dehydroadipyl-CoA and converts it to adipyl-CoA is referred to as "2,3-dehydroadipyl-CoA reductase activity" or "2,3-dehydroadipyl-CoA reductase enzymatic activity.” Also referred to as , and these terms are used interchangeably.
  • the exogenous gene contained in the recombinant microorganism according to the invention is selected from: (i) 80% or more, 85% or more, 88% or more, 90% or more, 93% or more, 95% or more of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 or 16 , a DNA encoding a protein consisting of an amino acid sequence having a sequence identity of 97% or more, 98% or more or 99% or more; (ii) 1-10, 1-7, 1-5 or 1-3 amino acids relative to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 or 16 A DNA encoding a protein consisting of an amino acid sequence in which is deleted, substituted, inserted and/or added, (iii) a polynucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64 or 65 and 80% or more, 85% or more, 88% or more, 90% or more,
  • the exogenous gene contained in the recombinant microorganism according to the invention is preferably selected from: (i) a DNA encoding a protein consisting of an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 or 16; (ii) an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids are deleted, substituted, inserted and/or added to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 or 16 DNA encoding a protein consisting of (iii) a DNA consisting of a polynucleotide sequence having 80% or more sequence identity with the polynucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64 or 65; (iv) deletions, substitutions of 1-10 amino acids relative to the amino acid sequence of the protein encoded by the polynucleotide sequence set forth in SEQ ID NOs: 57, 58
  • the exogenous gene contained in the recombinant microorganism of the present invention is (xi) a DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 or 16, or (xiii) DNA consisting of the polynucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64 or 65 is.
  • the recombinant microorganism has good 2,3-dehydroadipyl-CoA reductase activity.
  • a target compound can be produced by using a recombinant microorganism having such enzymatic activity. Examples of target compounds include C6 compounds.
  • C6 compound includes - Adipic acid (CAS No. 124-04-9), - Hexamethylenediamine (CAS No. 124-09-4), - 1,6-hexanediol (CAS No. 629-11-8), - 6-aminohexanoic acid (CAS No. 60-32-2), ⁇ 6-amino-1-hexanol (CAS No.4048-33-3), and ⁇ 6-hydroxyhexanoic acid (CAS No.1191-25-9) and "C6 compound” refers to one or more compounds selected from the group consisting of these compounds.
  • C6 compound herein can take a neutral or ionized form, including any salt form, and that this form is pH dependent.
  • the microorganism of the present invention is a genetically modified microorganism into which an exogenous enzyme gene has been introduced.
  • a "genetically modified microorganism” is also simply referred to as a "recombinant microorganism”.
  • the host microorganism into which the exogenous gene of interest is introduced is not particularly limited, and may be either prokaryote or eukaryote. It can be arbitrarily selected from those that have already been isolated and preserved, those that have been newly isolated from nature, and those that have been genetically modified.
  • Host microorganisms include, for example, the genera Escherichia, Bacillus, Corynebacterium, Arthrobacter, Brevibacterium, Clostridium, Zymomonas ( Genus Zymomonas, Pseudomonas, Burkholderia, Streptomyces, Rhodococcus, Synechocystis, Alkalihalobacillus (Saccharomyces) genus Schizosaccharomyces, Yarrowia, Candida, Pichia, or Aspergillus.
  • the host microorganism preferably belongs to the genus Escherichia, more preferably Escherichia coli.
  • the recombinant microorganism according to the present invention in which an exogenous gene is introduced into the host microorganism is, for example, Escherichia genera, Bacillus genera, Corynebacterium genera, Arthrobacter genera , Brevibacterium genus, Clostridium genus, Zymomonas genus, Pseudomonas genus, Burkholderia genus, Streptomyces genus, Rhodococcus genus, Synechococcus genus Synechocystis, Alkalihalobacillus, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Yarrowia, Candida, Pichia, or Aspergillus belong to the genus
  • the recombinant microorganism according to the present invention preferably belongs to the genus Escherichia, more preferably Escherichia coli.
  • the genetically modified microorganism of the present invention expresses a sufficient amount of the enzyme for each reaction step in the production pathway of the compound to proceed. , means that the compound can be biosynthesized.
  • the recombinant microorganism of the present invention may be one using a host microorganism that originally has the ability to produce the compound, and the compound is produced against the host microorganism that originally does not have the ability to produce the compound. It may be modified so as to have productivity.
  • derived from means that the gene or the protein (typically an enzyme) encoded thereby is endogenously possessed by the particular species referred to. .
  • the genetically modified microorganism of the present invention is an exogenous protein encoding a protein having an enzymatic activity that reduces 2,3-dehydroadipyl-CoA and converts it to adipyl-CoA (that is, a 2,3-dehydroadipyl-CoA reductase activity).
  • Including the sex gene expresses sufficient amounts of the enzyme (ie, 2,3-dehydroadipyl-CoA reductase) for the reaction to proceed. This enzyme participates in the reaction of step D in FIG.
  • the recombinant microorganism according to the invention comprises - a gene encoding 3-oxoadipyl CoA thiolase, a gene encoding 3-hydroxyadipyl-CoA dehydrogenase, a gene encoding 3-hydroxyadipyl CoA dehydratase, - a combination of a gene encoding phosphate adipyltransferase and a gene encoding adipic kinase, a gene encoding adipyl-CoA hydrolase, - a gene encoding adipic acid CoA transferase, a gene encoding a dehydrogenase, - a gene encoding a carboxylic acid reductase, - a gene encoding a transaminase (aminotransferase) - a gene encoding an alcohol dehydrogenase, and - a gene encoding a CoA
  • 3-oxoadipyl-CoA thiolase performs the reaction of step A in FIG.
  • 3-Hydroxyadipyl-CoA dehydrogenase performs the reaction in step B of FIG.
  • 3-hydroxyadipyl-CoA dehydratase performs the reaction in step C of FIG.
  • a combination of adipyl phosphate transferase and adipic kinase, adipyl-CoA hydrolase, adipate CoA transferase performs the reaction in step E of FIG. - the dehydrogenase performs at least one reaction of steps F, U and V of FIG.
  • the carboxylic acid reductase performs at least one reaction of steps G, I, K and N of FIG. -
  • the transaminase (aminotransferase) performs at least one reaction of steps J, M, P and R of FIG. -
  • the alcohol dehydrogenase performs at least one reaction of steps H, L, O and Q of FIG. •
  • CoA transferase or acid thiol ligase catalyzes at least one reaction of steps S and T;
  • the recombinant microorganism according to the invention is - a gene encoding 3-oxoadipyl CoA thiolase, a gene encoding 3-hydroxyadipyl-CoA dehydrogenase, a gene encoding 3-hydroxyadipyl CoA dehydratase, - a gene encoding a carboxylic acid reductase, - a gene encoding an alcohol dehydrogenase; and - a gene encoding a transaminase (aminotransferase).
  • the genetically modified microorganism of the present invention expresses a sufficient amount of an enzyme that catalyzes the reaction step of the C6 compound production pathway without introducing a foreign gene, the enzyme encoded by the endogenous gene reacts. may proceed.
  • Fig. 1 shows an example of the C6 compound production pathway that the genetically modified microorganism of the present invention can have. Enzymes that catalyze each reaction step are described below with reference to FIG.
  • step A of Figure 1 succinyl-CoA and acetyl-CoA are condensed and converted to 3-oxoadipyl-CoA.
  • enzymes that can catalyze this conversion include ⁇ -ketothiolase.
  • EC 2.3.1.9 acetoacetyl-CoA thiolase
  • EC 2.3.1.16 3-ketoacyl-CoA thiolase
  • EC 2.3.1.174 3-oxoadipyl- Enzymes falling into groups such as CoA thiolase
  • Enzymes that can be used in this conversion are not limited as long as they have activity for this conversion, and include, for example, succinyl-CoA:acetyl-CoA acyltransferase and 3-oxoadipyl-CoA thiolase.
  • PaaJ from E. coli consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 is used.
  • 3-oxoadipyl-CoA is converted to 3-hydroxyadipyl-CoA.
  • enzymes that can catalyze this conversion include oxidoreductases classified in group EC 1.1.1.
  • EC 1.1.1.35 (3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase)
  • EC 1.1.1.36 (acetoacetyl-CoA dehydrogenase)
  • EC 1.1.1.157 (3-hydroxybutane noyl-CoA dehydrogenase
  • EC 1.1.1.211 long-chain 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase
  • EC 1.1.1.259 (3-hydroxypymeloyl-CoA dehydrogenase)
  • Enzymes can be exemplified as enzymes that may have activity for this conversion.
  • Enzymes that can be used in the present invention are not limited as long as they have activity for this conversion, and are, for example, 3-hydroxyadipyl-CoA dehydrogenase.
  • PaaH from E. coli consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 is used.
  • step C of FIG. 1 3-hydroxyadipyl-CoA is converted to 2,3-dehydroadipyl-CoA.
  • enzymes capable of catalyzing this conversion include hydrolyases classified in group EC 4.2.1.
  • EC 4.2.1.17 enoyl-CoA hydratase
  • EC 4.2.1.55 3-hydroxybutanoyl-CoA dehydratase
  • EC 4.2.1.74 long-chain enoyl- Enzymes falling into groups such as CoA hydratase
  • Enzymes that can be used in the present invention are not limited as long as they have activity for this conversion, but for example, 3-hydroxyadipyl-CoA dehydratase.
  • an E. coli-derived PaaF consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:3 is used.
  • the enzyme uses the chromosomal DNA of Burkholderia sp.
  • the 3-hydroxyadipyl-CoA dehydratase PaaF (L3) encoded by the nucleotide sequence (783 bp) of the PCR amplicon obtained from the PCR amplification product is used. Burkholderia sp.
  • L3 strain The LEBP-3 strain (hereinafter also abbreviated as “L3 strain”) is an independent administrative agency Product Evaluation Technology National Institute Patent Microorganism Depositary Center (NPMD) (Address: 2-5-8 Kazusa Kamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture Room 122 ) on December 4, 2020 (receipt number: NITE ABP-03334), and has been internationally deposited as "acceptance number: NITE BP-03334".
  • NPMD Product Evaluation Technology National Institute Patent Microorganism Depositary Center
  • DNA polymerase used to prepare the PCR amplification product those known in the art are used, for example, Taq DNA polymerase, hot-start adjusted DNA polymerase, 3'-5' exonuclease in addition to the polymerase activity Examples include, but are not limited to, proofreading DNA polymerases having activity.
  • 1 ⁇ M of a specific nucleotide is used as a forward primer and a reverse primer
  • PrimeSTAR Max DNA Polymerase product name, manufactured by Takara Bio Inc.
  • 25 ⁇ L of liquid is 30 cycles of heat treatment at 98° C. for 10 seconds, annealing at 55° C. for 15 seconds, and elongation at 72° C. for 5 seconds/kb.
  • step D of FIG. 1 2,3-dehydroadipyl-CoA is converted to adipyl-CoA.
  • enzymes that can catalyze this conversion include oxidoreductases that fall into the group of EC 1.3.1.
  • EC 1.3.1.8 acyl-CoA dehydrogenase (NADP + )
  • EC 1.3.1.9 enoyl-ACP reductase (NADH)
  • EC 1.3.1.38 trans -2-enoyl-CoA reductase (NADP + )
  • EC 1.3.1.44 trans-2-enoyl-CoA reductase (NAD + )
  • EC 1.3.1.86 crotonyl-CoA reductase
  • EC 1.3.1.93 long-chain acyl-CoA reductase
  • EC 1.3.1.104 enoyl-ACP reductase (NADPH)
  • the 2,3-dehydroadipyl-CoA reductase used in the present invention is, for example, an enzyme derived from the following species: Candida auris (SEQ ID NO: 8), Kluyveromyces marxianus (SEQ ID NO: 9), Pichia kudriavzevii (SEQ ID NO: 9) ⁇ 10) ⁇ Thermothelomyces thermophilus( ⁇ 11) ⁇ Thermothielavioides terrestris( ⁇ 12) ⁇ Chaetomium thermophilum( ⁇ 13) ⁇ Podospora anserina( ⁇ 14) ⁇ Purpureocillium lilacinum( ⁇ 15) ⁇ Pyrenophora teres( ⁇ 16 ).
  • At least one of the enzymes consisting of the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 8 to 16 is used, more preferably at least one of the enzymes consisting of the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 11, 12, 13, 14 and 16 is used. used (Fig. 3).
  • adipyl-CoA is converted to adipic acid.
  • enzymes capable of catalyzing this transformation include thioester hydrolases, which are classified in group EC 3.1.2.
  • enzymes classified into groups such as EC 3.1.2.1 (acetyl-CoA hydrolase) and EC 3.1.2.20 (acyl-CoA hydrolase) have activity for this conversion. It can be exemplified as an enzyme to be obtained.
  • Enzymes that can be used in the present invention are not limited as long as they have activity for this conversion, and for example, adipyl-CoA hydrolase.
  • CoA-transferase Another example of an enzyme that can catalyze the reaction in step E of FIG. 1 is CoA-transferase, which is classified in the group EC 2.8.3.
  • EC 2.8.3.5 (3-oxoacid CoA-transferase)
  • EC 2.8.3.6 (3-oxoadipate CoA-transferase)
  • EC 2.8.3.18 succinyl -CoA: acetyl-CoA-transferase
  • Enzymes that can be used in the present invention are not limited as long as they have activity for this conversion, but for example, adipic acid CoA transferase.
  • a pathway that undergoes dephosphorylation by phosphotransferases classified in the group of EC 2.7.2 after producing adipyl phosphate can also be exemplified.
  • acyltransferases enzymes classified into groups such as EC 2.3.1.8 (phosphate acetyltransferase) and EC 2.3.1.19 (phosphate butyryltransferase) are suitable for this conversion. Examples can be given as enzymes that can have activity against.
  • enzymes classified into groups such as EC 2.7.2.1 (acetate kinase) and EC 2.7.2.7 (butanoate kinase) have activity for this conversion. It can be exemplified as an enzyme to be obtained. Enzymes that can be used in the present invention are not limited as long as they have activity for this conversion, and examples include adipyl phosphate transferase and adipic kinase.
  • acyl-CoA is converted to aldehyde.
  • enzymes that can catalyze this conversion include enzymes classified in group EC 1.2.1.
  • EC 1.2.1.10 acetaldehyde dehydrogenase (acetylation)
  • EC 1.2.1.17 glyoxylate dehydrogenase (acylation)
  • EC 1.2.1.42 hexadecanal dehydrogenase (acylation)
  • EC 1.2.1.44 cinnamoyl-CoA reductase (acylation)
  • EC 1.2.1.75 malonyl-CoA reductase (malonic semialdehyde formation)
  • EC 1.2.1.10 acetaldehyde dehydrogenase (acetylation)
  • EC 1.2.1.17 glyoxylate dehydrogenase (acylation)
  • EC 1.2.1.42 hexadecanal dehydrogenase (acylation)
  • EC 1.2.1.44
  • Enzymes classified into groups such as 2.1.76 succinic semialdehyde dehydrogenase (acylation) catalyze conversion reactions that eliminate CoA and generate aldehydes, similar to this conversion. It can also be exemplified as an enzyme that can have activity against Enzymes that can be used in the present invention are not limited as long as they have activity for this conversion.
  • 2.1.76 succinic semialdehyde dehydrogenase (acylation)
  • the carboxyl group is converted to an aldehyde.
  • Enzymes that can catalyze this conversion include, for example, carboxylic acid reductase (CAR).
  • CAR carboxylic acid reductase
  • EC 1.2.1.30 carboxylic acid reductase (NADP + )
  • EC 1.2.1.31 L-aminoadipate semialdehyde dehydrogenase
  • EC 1.2.1.95 L- 2-aminoadipate reductase
  • EC 1.2.99.6 carboxylic acid reductase catalyzes the conversion reaction of carboxylic acid to aldehyde in the same manner as this conversion.
  • carboxylic acid reductase can be converted to an active holoenzyme by phosphopantetheinylation (Venkitasubramanian et al., Journal of Biological Chemistry, Vol. 282, No. 1, 478-485 (2007) ).
  • Phosphopantetheinylation is catalyzed by phosphopantetheinyl transferase (PT).
  • Enzymes that can catalyze this reaction include, for example, enzymes classified under EC 2.7.8.7. Accordingly, the microorganism of the invention may be further modified to increase the activity of phosphopantetheinyltransferase.
  • Methods for increasing the activity of phosphopantetheinyl transferase include a method of introducing an exogenous phosphopantetheinyl transferase gene and a method of enhancing expression of an endogenous phosphopantetheinyl transferase gene. include, but are not limited to. Enzymes that can be used in the present invention are not limited to these as long as they have phosphopantetheinyl group transfer activity. Venkitasubramanian et al., Journal of Biological Chemistry, Vol.282, No.1, 478-485 (2007)), Lys5 of Saccharomyces cerevisiae (Ehmann et al., Biochemistry 61-7:1919) (19). mentioned.
  • Enzymes that can be used in the present invention are not limited as long as they have activity for this conversion.
  • at least one enzyme consisting of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 23 to 26 may be used.
  • Npt of Nocardia iowensis derived from Nocardia iowensis consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 24 is used (Fig. 5).
  • steps J, M, P and R in Figure 1 are transamination reactions.
  • enzymes that can catalyze this conversion include the transaminases (aminotransferases) that fall into the group of EC 2.6.1.
  • EC 2.6.1.19 (4-aminobutanoic acid-2-oxoglutarate transaminase)
  • EC 2.6.1.29 (diamine transaminase)
  • EC 2.6.1.48 (5-aminobutyric acid transaminase)
  • Enzymes classified into groups such as herbal acid transaminase can be exemplified as enzymes that may also have activity for this conversion.
  • Enzymes that can be used in the present invention are not particularly limited as long as they have the conversion activity of each step. (Samsonova., et al., BMC Microbiology 3.1 (2003): 2.) and Pseudomonas putrescine aminotransferase SpuC (Lu et al., Journal of bacteria 184.14 (2002): 3765-3773 , Galman et al., Green Chemistry 19.2 (2017): 361-366.), E.
  • coli GABA aminotransferase GabT and PuuE may be used.
  • ⁇ Ruegeria pomeroyi ⁇ Chromobacterium violaceum ⁇ Arthrobacter citreus ⁇ Sphaerobacter thermophilus ⁇ Aspergillus fischeri ⁇ Vibrio fluvialis ⁇ Agrobacterium tumefaciens ⁇ Mesorhizobium loti ⁇ - ⁇ 1,8- ⁇ 1,10- ⁇ and may be used in the present invention (Sung et al., Green Chemistry 20.20 (2016): 4591-4595., Sattler et al.). , Angewandte Chemie 124.36 (2012): 9290-9293.).
  • Enzymes that can be used in the present invention are not limited as long as they have activity for this conversion. (Figs. 5 and 15).
  • Typical amino group donors include, but are not limited to, L-glutamic acid, L-alanine and glycine.
  • the aldehyde is converted to an alcohol.
  • enzymes that can catalyze this conversion include oxidoreductases that fall into the group of EC 1.1.1.
  • EC 1.1.1.1 (alcohol dehydrogenase), EC 1.1.1.2 (alcohol dehydrogenase (NADP + )), EC 1.1.1.71 (alcohol dehydrogenase [NAD(P) + ])
  • enzymes that can also have activity for this conversion since they catalyze the conversion reaction from aldehyde to alcohol as well as this conversion.
  • Enzymes that can be used in the present invention are not limited as long as they have activity for this conversion.
  • E. coli-derived Ahr described in SEQ ID NO: 32 (FIG. 5).
  • CoA is added to the carboxyl group.
  • enzymes that can catalyze this conversion include CoA transferases classified in group EC 2.8.3 and acid thiol ligases classified in group EC 6.2.1. Enzymes used in the present invention are not limited as long as they have activity for this conversion.
  • Genes encoding the above enzymes that can be used in the present invention may be derived from organisms other than the exemplified organisms, or may be artificially synthesized. Any material can be used as long as it can express activity.
  • the recombinant microorganism according to the present invention may be a host microorganism in which any gene is appropriately disrupted. Targeted gene disruption is performed by methods known in the art.
  • amino acid sequences of the enzymes or the base sequences of the genes encoding the enzymes that can be used in the present invention include all possible sequences that can occur in nature, as long as they can express substantial enzyme activity in the host microbial cells. and artificially introduced mutations and modifications, including mutations such as deletions, substitutions, insertions and additions.
  • 1 or more, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, still more preferably 1 to 7, even more preferably 1 to 5, particularly preferably 1 to 5 relative to the amino acid sequence of the above enzyme may contain amino acid sequences with deletions, substitutions, insertions and/or additions of 1-3 amino acids.
  • nucleotide sequence of the gene encoding the above enzyme that can be used in the present invention includes DNA having a complementary nucleotide sequence and under stringent conditions, as long as it can express substantial enzyme activity in the host microbial cell. DNAs that hybridize with are also available. “Stringent conditions” are, for example, conditions of about “1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, 60° C.”, and more stringent conditions are conditions of about “0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, 60° C.” A more severe condition is "0.1 x SSC, 0.1% SDS, 68°C".
  • the base sequence of the enzyme gene for example, 80% or more, 85% or more, 88% or more, 90% or more, 93% or more, It may include nucleotide sequences with 95% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more sequence identity.
  • an amino acid sequence having, for example, 80% or more, 85% or more, 88% or more, 90% or more, 95% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more sequence identity with the amino acid sequence of the above enzyme. It may contain genes that encode proteins containing.
  • sequence identity As used herein, the percentage of "sequence identity" of a comparative amino acid sequence relative to a reference amino acid sequence is expressed by aligning the sequences so that the identity between these two sequences is maximized, and if necessary Defined as the percentage of amino acid residues in a comparison sequence that are identical to amino acid residues in a reference sequence when gaps are introduced in one or both of the two sequences. At this time, conservative substitutions are not considered part of sequence identity. Sequence identity can be determined by using publicly available computer software, for example, using an alignment search tool such as BLAST (registered trademark) (Basic Local Alignment Search Tool). can decide. Those skilled in the art can determine appropriate parameters for maximal alignment of the comparison sequences in the alignment. "Sequence identity" of nucleotide sequences can also be determined by similar methods.
  • an "expression cassette” refers to a nucleic acid to be expressed or a nucleotide containing nucleic acid sequences that regulate transcription and translation operably linked to a gene to be expressed.
  • an expression cassette of the invention comprises a promoter sequence 5′ upstream from the coding sequence, a terminator sequence 3′ downstream, and optionally further conventional regulatory elements operably linked, such that In some cases, the nucleic acid to be expressed or the gene to be expressed is introduced into the host microorganism.
  • a promoter is defined as a DNA sequence that causes RNA polymerase to bind to DNA and initiate RNA synthesis, regardless of whether it is a constitutive or inducible promoter.
  • a strong promoter is a promoter that initiates mRNA synthesis at a high frequency, and is also preferably used in the present invention.
  • glycolytic enzymes e.g., 3-phosphoglycerate kinase, glyceraldehyde-3-phosphorus Acid dehydrogenase
  • glutamic acid decarboxylase A glutamic acid decarboxylase A
  • promoters for serine hydroxymethyltransferase promoter regions of T7 phage-derived RNA polymerase, and the like can be used.
  • HCE high-level constitutive expression
  • cspB promoter cspB promoter
  • sodA promoter elongation factor (EF-Tu) promoter
  • Terminators that can be used include T7 terminator, rrnBT1T2 terminator, lac terminator, and the like.
  • other regulatory elements may include selectable markers, amplification signals, origins of replication, and the like. Suitable regulatory sequences are described, for example, in “Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185", Academic Press (1990).
  • the expression cassette described above is incorporated into a vector consisting of, for example, a plasmid, phage, transposon, IS element, fosmid, cosmid, or linear or circular DNA, and inserted into a host microorganism. Plasmids and phages are preferred. These vectors may replicate autonomously in the host microorganism or may replicate chromosomally. Suitable plasmids are, for example, E.
  • a conventional method can be used as a method applicable when introducing the vector into a host microorganism.
  • a method applicable when introducing the vector into a host microorganism examples thereof include, but are not limited to, the calcium chloride method, electroporation method, conjugative transfer method, and protoplast fusion method, and a method suitable for the host microorganism can be selected.
  • a second aspect of the present invention relates to a method for producing a target compound, which includes a culturing step of culturing the aforementioned recombinant microorganism.
  • the compound is preferably a C6 compound.
  • the C6 compound is at least one selected from the group consisting of adipic acid, hexamethylenediamine, 1,6-hexanediol, 6-aminohexanoic acid, 6-amino-1-hexanol and 6-hydroxyhexanoic acid.
  • the method for producing the C6 compound includes a culturing step of culturing the genetically modified microorganism according to the present invention.
  • the recombinant microorganism is cultured in a medium containing a carbon source and a nitrogen source to obtain a culture containing bacterial cells.
  • the genetically modified microorganism of the present invention is cultured under conditions suitable for C6 compound production, growth and maintenance of the microorganism, and suitable medium composition, culture time, and culture conditions can be easily set by those skilled in the art.
  • Carbon sources include D-glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, oligosaccharides, polysaccharides, starch, cellulose, rice bran, blackstrap molasses, fats and oils (such as soybean oil, sunflower oil, peanut oil, coconut oil, etc.), fatty acids ( Examples thereof include palmitic acid, linoleic acid, oleic acid, linolenic acid, etc.), alcohols (eg, glycerol, ethanol, etc.), organic acids (eg, acetic acid, lactic acid, succinic acid, etc.), corn decomposing solutions, and cellulose decomposing solutions. D-glucose, sucrose or glycerol are preferred. These carbon sources can be used individually or as a mixture.
  • C6 compounds produced using raw materials derived from biomass are measured for biobased carbon content based on Carbon-14 (radiocarbon) analysis specified in ISO 16620-2 or ASTM D6866, for example oil, natural gas, coal It can be clearly distinguished from synthetic raw materials derived from
  • Nitrogen sources include nitrogen-containing organic compounds (e.g. peptones, casamino acids, tryptones, yeast extracts, meat extracts, malt extracts, corn steep liquor, soy flour, amino acids and urea), or inorganic compounds (e.g. ammonia aqueous solution, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate, sodium nitrate, ammonium nitrate, etc.). These nitrogen sources can be used individually or as a mixture.
  • organic compounds e.g. peptones, casamino acids, tryptones, yeast extracts, meat extracts, malt extracts, corn steep liquor, soy flour, amino acids and urea
  • inorganic compounds e.g. ammonia aqueous solution, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate, sodium nitrate, ammonium nitrate, etc.
  • the medium may also contain corresponding antibiotics if the recombinant microorganism expresses useful additional traits, for example if it has markers for resistance to antibiotics. This reduces the risk of contamination by germs during culture.
  • Antibiotics include, but are not limited to, ⁇ -lactam antibiotics such as ampicillin, aminoglycoside antibiotics such as kanamycin, macrolide antibiotics such as erythromycin, tetracycline antibiotics, chloramphenicol, and the like. not.
  • Cultivation may be batch or continuous. Moreover, in any case, it may be possible to replenish the additional carbon source or the like at an appropriate point in the culture.
  • the culture may be cultured while controlling conditions such as suitable temperature, oxygen concentration, and pH. Suitable culture temperatures for transformants derived from common microbial host cells are usually in the range of 15°C to 55°C, preferably 25°C to 40°C. If the host microorganism is aerobic, shaking (such as flask culture) or stirring/aeration (such as jar fermenter culture) may be performed to ensure an appropriate oxygen concentration during fermentation. Those culture conditions can be easily set by those skilled in the art.
  • the culturing step may include obtaining a culture of the recombinant microorganism and/or an extract of the culture.
  • the method for producing a compound according to the present invention may further include a mixing step of mixing the culture and/or the extract of the culture with a substrate compound to obtain a mixed solution.
  • a substrate compound may be appropriately selected according to the enzyme and target compound.
  • the method for producing a compound according to the present invention may include a step of isolating and/or purifying the target compound, the C6 compound.
  • any technique such as centrifugation, filtration, membrane separation, crystallization, extraction, distillation, adsorption, phase separation, ion exchange and various types of chromatography can be used. is not limited to
  • one type of method may be selected, or multiple methods may be combined.
  • a further aspect of the invention relates to proteins.
  • the protein is (a) having an enzymatic activity that reduces 2,3-dehydroadipyl-CoA to convert it to adipyl-CoA; (b) below: (i) 80% or more, 85% or more, 88% or more, 90% or more, 93% or more, 95% or more of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 or 16 , consisting of amino acid sequences having 97% or greater, 98% or greater or 99% or greater sequence identity, (ii) 1-10, 1-7, 1-5 or 1-3 amino acids relative to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 or 16 consists of a deleted, substituted, inserted and/or added amino acid sequence, (iii) a polynucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64 or 65 and 80% or more,
  • the protein is preferably (a) having an enzymatic activity that reduces 2,3-dehydroadipyl-CoA to convert it to adipyl-CoA; (b) below: (i) consisting of an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 or 16; (ii) an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids are deleted, substituted, inserted and/or added to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 or 16 consisting of (iii) encoded by a DNA consisting of a polynucleotide sequence having 80% or more sequence identity with the polynucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64 or 65; (iv) deletions, substitutions of 1-10 amino acids relative to the amino acid sequence of the protein encoded by the polynucleotide sequence set forth in SEQ
  • the recombinant protein is (xi) consists of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 or 16, or (xiii) is encoded by a DNA consisting of the polynucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64 or 65;
  • Yet another aspect of the present invention relates to a method for producing a C6 compound, including using the aforementioned protein.
  • 2,3-dehydroadipyl-CoA reductase activity by introducing a gene encoding a protein having 2,3-dehydroadipyl-CoA reductase activity into a host microorganism, 2,3-dehydroadipyl-CoA reductase activity can obtain a good recombinant microorganism of Also provided are proteins with good 2,3-dehydroadipyl CoA reductase activity.
  • the target C6 compound can be efficiently produced by using the recombinant microorganism or the protein. Also, depending on the desired C6 compound, different C6 compounds can be obtained by performing the conversion with additional enzymes. Furthermore, since the recombinant microorganism according to the present invention has a good C6 compound-producing ability, it is expected that it can be used for the production of the target compound on an industrial scale.
  • Invention B Recombinant microorganism and method for producing adipic acid or a derivative thereof It is a microorganism in which the host microorganism has been genetically modified so that it can be produced efficiently.
  • an "adipic acid derivative” is an aliphatic carboxylic acid having an aliphatic hydrocarbon group with 3 to 5 carbon atoms and one or more carboxyl groups.
  • the aliphatic hydrocarbon group possessed by the adipic acid derivative is saturated or unsaturated.
  • carbon may be substituted with substituents such as hydroxyl, carboxyl, ketone, amino, and the like.
  • the number of carbon atoms in the aliphatic hydrocarbon group of the "adipic acid derivative” is preferably 3 or 4.
  • the "adipic acid derivative” preferably has 1 or 2 carboxyl groups.
  • adipic acid derivative examples include 3-oxoadipic acid (3-OA) having an aliphatic hydrocarbon group of 4 carbon atoms and two carboxylic acids, an aliphatic Levulinic acid (LEV) having a hydrocarbon group and one carboxylic acid, 3-hydroxyadipic acid (3HA) having an aliphatic hydrocarbon group with 4 carbon atoms and two carboxylic acids and 2,3-dehydroadipic acid (23DA) having an aliphatic hydrocarbon group of 4 carbon atoms and two carboxylic acids (see FIG. 16).
  • 3-OA 3-oxoadipic acid
  • LUV aliphatic Levulinic acid
  • 3HA 3-hydroxyadipic acid
  • 23DA 2,3-dehydroadipic acid
  • adipic acid and adipic acid derivatives herein can take a neutral or ionized form including any salt form, and that this form depends on pH.
  • adipic acid and adipic acid derivatives include the free acid form as well as any salt and ionized forms.
  • adipic acid and adipic acid derivatives may be collectively referred to as “adipic acids” or “adipic acid analogues.”
  • the synthesis method may be a chemical synthesis method, a biological synthesis method using an enzyme or a microorganism containing an enzyme, or the like.
  • the microorganism contains a metabolic pathway for converting adipic acid into the above compound, metabolic conversion from a raw material using adipic acid as an intermediate in the cell is also possible.
  • the genetically modified microorganism according to the present invention specifically contains at least one of an exogenous gene encoding 3-hydroxyadipyl-CoA dehydratase and an exogenous gene encoding 2,3-dehydroadipyl-CoA reductase. include.
  • the recombinant microorganism has an adipic acid production pathway and can produce adipic acid or an adipic acid derivative.
  • "genetically modified microorganism" is also simply referred to as "recombinant microorganism”.
  • At least one of 3-hydroxyadipyl-CoA dehydratase and 2,3-dehydroadipyl-CoA reductase is derived from Burkholderia sp. strain LEBP-3 (accession number: NITE BP-03334).
  • both the 3-hydroxyadipyl-CoA dehydratase and the 2,3-dehydroadipyl-CoA reductase are derived from Burkholderia sp. strain LEBP-3.
  • At least one of the exogenous gene encoding 3-hydroxyadipyl-CoA dehydratase and the exogenous gene encoding 2,3-dehydroadipyl-CoA reductase is Burkholderia sp. Number: Derived from NITE BP-03334).
  • both the exogenous gene encoding 3-hydroxyadipyl-CoA dehydratase and the exogenous gene encoding 2,3-dehydroadipyl-CoA reductase are from Burkholderia sp. LEBP-3 strain ( Accession number: Derived from NITE BP-03334).
  • the genetically modified microorganism of the present invention may be introduced with at least one of the foreign genes encoding the above enzymes.
  • the genetically modified microorganism of the present invention is preferably introduced with at least one exogenous gene encoding an enzyme that catalyzes each reaction step in the adipic acid production pathway, and expresses the exogenous enzyme.
  • the genetically modified microorganism of the present invention expresses a sufficient amount of an enzyme that catalyzes the reaction step of the adipic acid production pathway without introduction of an exogenous gene, the enzyme encoded by the endogenous gene reacts. may proceed.
  • the recombinant microorganism of the present invention preferably expresses at least one of 3-hydroxyadipyl-CoA dehydratase and 2,3-dehydroadipyl-CoA reductase.
  • the reaction steps of the adipic acid production pathway proceed and the target compound can be produced.
  • the recombinant microorganism of the present invention expresses both 3-hydroxyadipyl-CoA dehydratase and 2,3-dehydroadipyl-CoA reductase.
  • these enzymes in the recombinant microorganism according to the present invention each of the reaction steps in the adipic acid production pathway proceeds and the target compound can be produced.
  • the recombinant microorganism according to the present invention expresses oxidoreductase and/or ⁇ -ketothiolase in addition to 3-hydroxyadipyl-CoA dehydratase and 2,3-dehydroadipyl-CoA reductase.
  • oxidoreductase and/or ⁇ -ketothiolase in addition to 3-hydroxyadipyl-CoA dehydratase and 2,3-dehydroadipyl-CoA reductase.
  • 3-Hydroxyadipyl-CoA dehydratase is an enzyme that catalyzes the reaction that converts 3-hydroxyadipyl-CoA to 2,3-dehydroadipyl-CoA (step C in FIG. 16).
  • the 3-hydroxyadipyl-CoA dehydratase has a sequence identity of 65 to a PCR amplification product using Burkholderia sp. strain LEBP-3 chromosomal DNA as a template and given nucleotides as primers. % or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 88% or more, 90% or more, 93% or more, 95% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more coded.
  • the DNA has, for example, 626-940 bp, preferably 740-862 bp, more preferably 743-823 bp, still more preferably 767-799 bp, particularly preferably 775-791 bp, and most preferably 778-788 bp. Primers used for PCR are described later.
  • 3-hydroxyadipyl-CoA dehydratase is encoded by DNA that is a PCR amplification product using chromosomal DNA of Burkholderia sp. LEBP-3 strain as a template and given nucleotides as primers. be done.
  • the DNA has, for example, 626-940 bp, preferably 740-862 bp, more preferably 743-823 bp, still more preferably 767-799 bp, particularly more preferably 775-791 bp, most preferably 778-788 bp.
  • the 3-hydroxyadipyl-CoA dehydratase is selected from: (A-1) Sequence identity with a PCR amplified product using chromosomal DNA of Burkholderia sp. LEBP-3 strain as a template and using predetermined nucleotides as primers 65% or more, 70% or more, 75 % or more, 80% or more, 85% or more, 88% or more, 90% or more, 93% or more, 95% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more of There is having 3-hydroxyadipyl CoA dehydratase activity, a recombinant polypeptide, wherein the DNA has the base pair number (bp) as described above; (A-2) Against the amino acid sequence of a polypeptide encoded by DNA, which is a PCR amplification product using chromosomal DNA of Burkholderia sp.
  • LEBP-3 strain as a template and predetermined nucleotides as primers for example, 1 to 10, preferably 1 to 7, more preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3 amino acids are deleted, substituted, inserted and/or added.
  • Recombination consisting of an amino acid sequence a polypeptide, having 3-hydroxyadipyl CoA dehydratase activity, a recombinant polypeptide, wherein the DNA has the base pair number (bp) as described above; and (A-3) a set encoded by a DNA consisting of degenerate isomers of a PCR amplification product using chromosomal DNA of Burkholderia sp.
  • LEBP-3 strain as a template and predetermined nucleotides as primers a replacement polypeptide, having 3-hydroxyadipyl CoA dehydratase activity, A recombinant polypeptide, wherein said DNA has a base pair number (bp) as described above.
  • 3-hydroxyadipyl-CoA dehydratase is encoded in a PCR amplification product using chromosomal DNA of Burkholderia sp. LEBP-3 strain as a template and given nucleotides as primers. It is a recombinant polypeptide, and the base pair number of the amplicon is 783 or 784 bp.
  • the primers (forward and reverse) used for PCR include the following (see Figure 17).
  • nucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 168 and the nucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 169" in (1b) are respectively "the base sequence shown in SEQ ID NO: 168" and "the base sequence shown in SEQ ID NO: 169.” , for example 1-20 bp, preferably 1-15 bp, more preferably 5-15 bp, even more preferably 10-15 bp, has an additional nucleotide length.
  • nucleotide containing a codon-optimized base sequence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 168 and the nucleotide containing a codon-optimized base sequence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 169" in (1d) are respectively "SEQ ID NO: 168
  • it contains a sequence homologous to the end of the vector for example, 1 to 20 bp, preferably 1 ⁇ 15 bp, more preferably 5-15 bp, even more preferably 10-15 bp has an additional nucleotide length.
  • nucleotides containing a codon-optimized base sequence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 168 and nucleotides containing a codon-optimized base sequence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 169 include: (1d') includes a nucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 198 and a nucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 199 (Fig. 20A).
  • preferred primers are (1a) a nucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 168 and a nucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 169, and (1b) a nucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 168 and a nucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 169 is.
  • DNA which is a PCR amplified product using the above nucleotides as primers and using the chromosomal DNA of Burkholderia sp. LEBP-3 strain as a template, preferably has 783 or 784 bp.
  • DNA polymerase used in PCR those known in the art are used, such as Taq DNA polymerase, hot-start adjusted DNA polymerase, proofreading having 3'-5' exonuclease activity in addition to polymerase activity DNA polymerase and the like.
  • 2,3-Dehydroadipyl-CoA reductase is an enzyme that catalyzes the reaction that converts 2,3-dehydroadipyl-CoA to adipyl-CoA (see step D in Figure 16).
  • the 2,3-dehydroadipyl-CoA reductase has sequence identity with a PCR amplification product using Burkholderia sp. LEBP-3 strain chromosomal DNA as a template and given nucleotides as primers. is 65% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 88% or more, 90% or more, 93% or more, 95% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more encoded in DNA.
  • the DNA is, for example, 924-1386 bp, preferably 1039-1249 bp, more preferably 1097-1213 bp, even more preferably 1131-1179 bp, particularly more preferably 1143-1167 bp, even more preferably 1145-1165 bp, most preferably It has 1150-1160 bp.
  • the 2,3-dehydroadipyl-CoA reductase is a DNA that is a PCR amplification product using chromosomal DNA of Burkholderia sp. LEBP-3 strain as a template and predetermined nucleotides as primers.
  • coded to The DNA is, for example, 924-1386 bp, preferably 1039-1249 bp, more preferably 1097-1213 bp, even more preferably 1131-1179 bp, particularly more preferably 1143-1167 bp, even more preferably 1145-1165 bp, most preferably It has 1150-1160 bp.
  • the 2,3-dehydroadipyl-CoA reductase is selected from: (B-1) 65% or more, 70% or more, sequence identity with a PCR amplified product using chromosomal DNA of Burkholderia sp.
  • LEBP-3 strain as a template and using predetermined nucleotides as primers, 75% or more % or more, 80% or more, 85% or more, 88% or more, 90% or more, 93% or more, 95% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more of There is having 2,3-dehydroadipyl CoA reductase activity, a recombinant polypeptide, wherein the DNA has the base pair number (bp) as described above; (B-2) Against the amino acid sequence of a polypeptide encoded by a DNA that is a PCR amplification product using chromosomal DNA of Burkholderia sp.
  • LEBP-3 strain as a template and predetermined nucleotides as primers
  • 1 to 10 preferably 1 to 7, more preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3 amino acids are deleted, substituted, inserted and/or added.
  • LEBP-3 strain as a template and predetermined nucleotides as primers a replacement polypeptide, having 2,3-dehydroadipyl CoA reductase activity, A recombinant polypeptide, wherein said DNA has a base pair number (bp) as described above.
  • exogenous 2,3-dehydroadipyl-CoA reductase is amplified by PCR using chromosomal DNA of Burkholderia sp. LEBP-3 strain as a template and predetermined nucleotides as primers. and the base pair number of the amplicon is 1155 or 1156 bp.
  • the primers (forward and reverse) used for PCR include the following (see Figure 17).
  • nucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 170 and the nucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 171" in (2b) are respectively "the base sequence shown in SEQ ID NO: 170" and "the base sequence shown in SEQ ID NO: 171.” , for example 1-20 bp, preferably 1-15 bp, more preferably 5-15 bp, even more preferably 10-15 bp, has an additional nucleotide length.
  • nucleotide containing a codon-optimized base sequence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 170 and nucleotide containing a codon-optimized base sequence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 171" are respectively "SEQ ID NO: 170
  • it contains a sequence homologous to the end of the vector for example, 1 to 20 bp, preferably 1 ⁇ 15 bp, more preferably 5-15 bp, even more preferably 10-15 bp has an additional nucleotide length.
  • Examples of (2d) "a nucleotide containing a codon-optimized base sequence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 170 and a nucleotide containing a codon-optimized base sequence of SEQ ID NO: 171" include: (2d') A nucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 210 and a nucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 211 are included (Fig. 20A).
  • preferred primers are (2a) a nucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 170 and a nucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 171, and (2b) A nucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO:170 and a nucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO:171.
  • DNA which is a PCR amplified product using the above nucleotides as primers and using the chromosomal DNA of Burkholderia sp. LEBP-3 strain as a template, preferably has 1155 or 1156 bp.
  • DNA polymerase used in PCR those known in the art are used, such as Taq DNA polymerase, hot-start adjusted DNA polymerase, proofreading having 3'-5' exonuclease activity in addition to polymerase activity DNA polymerase and the like.
  • PCR amplification product refers to a product obtained as a result of PCR using specific nucleotides as primers. Unless otherwise specified, in this specification, in PCR amplification, 1 ⁇ M of specific nucleotides were used as forward primers and reverse primers, and PrimeSTAR Max DNA Polymerase (product name, manufactured by Takara Bio Inc.) was used as the enzyme. , heat treatment at 98°C for 10 seconds, annealing at 55°C for 15 seconds, and elongation at 72°C for 5 seconds/kb for 30 cycles.
  • the host microorganism into which the exogenous gene of interest is introduced is not particularly limited, and may be either a prokaryote or a eukaryote. It can be arbitrarily selected from those that have already been isolated and preserved, those that have been newly isolated from nature, and those that have been genetically modified.
  • Host microorganisms include, for example, Esselicia, Corynebacterium, Bacillus, Acinetobacter, Burkholderia, Pseudomonas, Clostridium, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Yarrowia, Candida, Pichia, Aspergillus.
  • the host microorganism of the present invention is preferably of the genera Esselicia, Corynebacterium, Bacillus, Acinetobacter, Burkholderia, Pseudomonas, Clostridium, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Yarrowia, Candida, Pichia. belongs to a genus selected from the group consisting of the genus Aspergillus and the genus Aspergillus.
  • the host microorganism is more preferably Escherichia coli.
  • the recombinant microorganism according to the present invention in which an exogenous gene has been introduced into the host microorganism is, for example, the genera Esselicia, Corynebacterium, Bacillus, Acinetobacter, Burkholderia, Pseudomonas, Clostridium, Saccharomyces.
  • Schizosaccharomyces, Yarrowia, Candida, Pichia, Aspergillus, Klebsiella, Gluconobacter, Zymomonas, Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus and Streptomyces preferably belongs to the genus Esselicia, Corynebacterium, Bacillus, Acinetobacter, Burkholderia, Pseudomonas, Clostridium, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Yarrowia, Candida, Pichia and It belongs to a genus selected from the group consisting of the genus Aspergillus.
  • the recombinant microorganism according to the present invention is more preferably Escherichia coli.
  • adipic acid adipic acid derivatives, hexamethylenediamine, 1,6-hexanediol and 6-amino-1-hexanol production pathways possessed by the genetically modified microorganism of the present invention, and enzymes that catalyze each reaction step of the pathways, Description will be made below with reference to FIG.
  • the conversion in step A of FIG. 16 involves, for example, succinyl-CoA:acetyl-CoA acyltransferase, or 3-oxoadipyl-CoA thiolase to condense succinyl-CoA and acetyl-CoA and convert them to 3-oxoadipyl-CoA.
  • Other examples of enzymes that can catalyze this conversion include ⁇ -ketothiolase.
  • EC 2.3.1.9 acetoacetyl-CoA thiolase
  • EC 2.3.1.16 (3-ketoacyl-CoA thiolase)
  • EC 2.3.1.174 (3-oxoadipyl- Enzymes falling into groups such as CoA thiolase)
  • the enzyme used in the present invention is not limited as long as it has activity for this conversion, but in one aspect, E. coli-derived PaaJ consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 172 is used.
  • the enzyme is PCR-amplified using the nucleotide shown in SEQ ID NO: 164 and the nucleotide shown in SEQ ID NO: 165 as primers and using the chromosomal DNA of Burkholderia sp. It is a succinyl-CoA:acetyl-CoA acyltransferase encoded by a DNA sequence (1203 bp) that is a product.
  • 3-hydroxyadipyl-CoA dehydrogenase is involved and 3-oxoadipyl-CoA is converted to 3-hydroxyadipyl-CoA.
  • Examples of other enzymes that can catalyze this conversion include the oxidoreductases classified in group EC 1.1.1.
  • EC 1.1.1.35 (3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase)
  • EC 1.1.1.36 (acetoacetyl-CoA dehydrogenase)
  • EC 1.1.1.157 (3 - hydroxybutanoyl-CoA dehydrogenase)
  • EC 1.1.1.211 long chain 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase
  • EC 1.1.1.259 (3-hydroxypymeloyl-CoA dehydrogenase)
  • Enzymes classified into groups can be exemplified as enzymes that may have activity for this conversion.
  • the enzyme used in the present invention is not limited as long as it has activity for this conversion.
  • the enzyme is PCR amplified using the nucleotides shown in SEQ ID NO: 166 and the nucleotides shown in SEQ ID NO: 167 as primers and the chromosomal DNA of Burkholderia sp. It is a 3-hydroxyadipyl-CoA dehydrogenase encoded by the DNA sequence (1521 bp) of the product.
  • 3-hydroxyadipyl-CoA dehydratase is involved and 3-hydroxyadipyl-CoA is converted to 2,3-dehydroadipyl-CoA.
  • Examples of other enzymes that can catalyze this conversion include hydrolyases classified in group EC 4.2.1. Specifically, for example, EC 4.2.1.17 (enoyl-CoA hydratase), EC 4.2.1.55 (3-hydroxybutanoyl-CoA dehydratase) and EC 4.2.1.74 (long Enzymes falling into groups such as chain enoyl-CoA hydratase) can be exemplified as enzymes that may have activity for this conversion.
  • the enzyme is 3-hydroxyadipyl-CoA dehydratase as described above.
  • the conversion in step D of FIG. 16 involves, for example, 2,3-dehydroadipyl-CoA reductase to convert 2,3-dehydroadipyl-CoA to adipyl-CoA.
  • Other examples of enzymes that can catalyze this conversion include the oxidoreductases that fall into the group of EC 1.3.1.
  • EC 1.3.1.8 (acyl-CoA dehydrogenase (NADP + )
  • EC 1.3.1.9 (enoyl-ACP reductase (NADH)
  • EC 1.3.1 .38 trans-2-enoyl-CoA reductase (NADP + )
  • EC 1.3.1.44 trans-2-enoyl-CoA reductase (NAD + )
  • EC 1.3.1.86 crotonyl -CoA reductase
  • EC 1.3.1.93 long chain acyl-CoA reductase
  • EC 1.3.1.104 (enoyl-ACP reductase (NADPH)).
  • It can be exemplified as an enzyme that may have activity on the conversion.
  • the enzyme is 2,3-dehydroadipyl-CoA reductase as described above.
  • adipyl-CoA is converted to adipic acid.
  • enzymes that can catalyze this conversion include thioester hydratases that are classified in group EC 3.1.2.
  • groups such as EC 3.1.2.1 (acetyl-CoA hydratase) and EC 3.1.2.20 (acyl-CoA hydratase) have activity towards this conversion. It can be exemplified as an enzyme to be obtained.
  • the enzyme is not limited as long as it has activity for this conversion, but tesB (Ab) derived from Acinetobacter ADP1 strain shown in SEQ ID NO: 179 is used.
  • the CoA of 3-oxoadipyl-CoA, 3-hydroxyadipyl-CoA and 2,3-dehydroadipyl-CoA is eliminated to form 3-oxoadipyl-CoA, 3-hydroxyadipyl-CoA, respectively. It produces the acid 2,3-dehydroadipic acid.
  • CoA-transferase Another example of an enzyme that can catalyze the conversion in step E of FIG. 16 is CoA-transferase, which is classified in the group EC 2.8.3.
  • EC 2.8.3.5 (3-oxoacid CoA-transferase)
  • EC 2.8.3.6 (3-oxoadipate CoA-transferase)
  • EC 2.8.3.18 succinyl -CoA: Acetate (CoA-transferase) can be exemplified as enzymes that may have activity for this conversion.
  • a pathway that undergoes dephosphorylation by phosphotransferases classified in the group of EC 2.7.2 after producing adipyl phosphate can also be exemplified.
  • EC 2.7.2 Enzymes classified into groups such as .1 (acetate kinase) and EC 2.7.2.7 (butanoate kinase) can be exemplified as enzymes that may have activity for this conversion.
  • 3-oxoadipic acid is converted to levulinic acid. This conversion is either catalyzed by an enzyme (3-oxoadipate decarboxylase) or occurs spontaneously.
  • adipyl-CoA is converted to adipic acid semialdehyde.
  • enzymes that can catalyze this conversion include enzymes classified in group EC 1.2.1.
  • EC 1.2.1.10 acetaldehyde dehydrogenase (acetylation)
  • EC 1.2.1.17 glyoxylate dehydrogenase (acylation)
  • EC 1.2.1.42 hexadecanal dehydrogenase (acylation)
  • EC 1.2.1.44 cinnamoyl-CoA reductase (acylation)
  • EC 1.2.1.75 malonyl-CoA reductase (malonic semialdehyde formation)
  • EC 1.2.1.10 acetaldehyde dehydrogenase (acetylation)
  • EC 1.2.1.17 glyoxylate dehydrogenase (acylation)
  • EC 1.2.1.42 hexadecanal dehydrogenase (acylation)
  • Enzymes classified into groups such as 2.1.76 succinic semialdehyde dehydrogenase (acylation) catalyze conversion reactions that eliminate CoA and generate aldehydes, similar to this conversion. It can also be exemplified as an enzyme that can have activity against The enzyme used in the present invention is not limited as long as it has activity for this conversion.
  • 2.1.76 succinic semialdehyde dehydrogenase (acylation)
  • carboxyl groups are converted to aldehydes.
  • Enzymes that can catalyze this conversion include, for example, carboxylic acid reductase (CAR).
  • CAR carboxylic acid reductase
  • EC 1.2.1.30 carboxylic acid reductase (NADP+)
  • EC 1.2.1.31 L-aminoadipate semialdehyde dehydrogenase
  • EC 1.2.1.95 L-2 -Aminoadipate reductase
  • EC 1.2.99.6 carboxylic acid reductase catalyzes the conversion reaction that produces aldehyde from carboxylic acid as in this conversion, It can be exemplified as an enzyme that can also have activity for this conversion.
  • Nocardia iowensis nocardia asteroides
  • Nocardia brasiliensis nocardia farcinica ⁇ Segniliparus rugosus ⁇ Segniliparus
  • MaCar from Mycobacterium abscessus consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 239, MaCar (m ) is used, more preferably MaCar(m) consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 241 is used.
  • carboxylic acid reductase can be converted to an active holoenzyme by phosphopantetheinylation (Venkitasubramanian et al., Journal of Biological Chemistry, Vol. 282, No. 1, 478-485 (2007) ).
  • Phosphopantetheinylation is catalyzed by phosphopantetheinyl transferase (PT).
  • Enzymes that can catalyze this reaction include, for example, enzymes classified under EC 2.7.8.7. Accordingly, the microorganism of the invention may be further modified to increase the activity of phosphopantetheinyltransferase.
  • Methods for increasing the activity of phosphopantetheinyl transferase include a method of introducing an exogenous phosphopantetheinyl transferase gene and a method of enhancing expression of an endogenous phosphopantetheinyl transferase gene. include, but are not limited to. Enzymes used in the present invention are not limited to these as long as they have phosphopantetheinyl group transfer activity. Venkitasubramanian et al., Journal of Biological Chemistry, Vol.282, No.1, 478-485 (2007)), Lys5 of Saccharomyces cerevisiae (Ehmann et al., Biochemistry 61-7:1919) (19). mentioned.
  • the enzyme used in the present invention is not limited as long as it has activity for this conversion.
  • at least one enzyme consisting of the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOS: 242 to 245 may be used.
  • Npt of Nocardia iowensis derived from Nocardia iowensis consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 243 is preferably used.
  • the transformations in steps M, N, S of Figure 16 are transamination reactions.
  • Examples of enzymes that can catalyze this conversion include the transaminases (aminotransferases) that fall into the group of EC 2.6.1.
  • EC 2.6.1.19 (4-aminobutanoic acid-2-oxoglutarate transaminase), EC 2.6.1.29 (diamine transaminase), EC 2.6.1.48 (5-aminobutyric acid transaminase),
  • Enzymes classified into groups such as herbal acid transaminase) can be exemplified as enzymes that may also have activity for this conversion.
  • the enzyme used in the present invention is not particularly limited as long as it has the conversion activity of each step.
  • coli GABA aminotransferase GabT and PuuE may be used.
  • Ruegeria pomeroyi ⁇ Chromobacterium violaceum ⁇ Arthrobacter citreus ⁇ Sphaerobacter thermophilus ⁇ Aspergillus fischeri ⁇ Vibrio fluvialis ⁇ Agrobacterium tumefaciens ⁇ Mesorhizobium loti ⁇ - ⁇ 1,8- ⁇ 1,10- ⁇ and may be used in the present invention (Sung et al., Green Chemistry 20.20 (2018): 4591-4595. , Sattler et al. , Angewandte Chemie 124.36 (2012): 9290-9293. ).
  • the enzyme used in the present invention is not limited as long as it has activity for this conversion.
  • at least one enzyme consisting of the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 246-250 may be used.
  • Typical amino group donors include, but are not limited to, L-glutamic acid, L-alanine, glycine.
  • aldehydes are converted to alcohols.
  • enzymes that can catalyze this conversion include oxidoreductases that fall into the group of EC 1.1.1.
  • EC 1.1.1.1 (alcohol dehydrogenase), EC 1.1.1.2 (alcohol dehydrogenase (NADP + )), EC 1.1.1.71 (alcohol dehydrogenase [NAD(P) + ])
  • EC 1.1.1.71 alcohol dehydrogenase [NAD(P) + ]
  • the enzyme used in the present invention is not limited as long as it has activity for this conversion.
  • E. coli-derived Ahr described in SEQ ID NO: 251 is used (Fig. 25).
  • CoA is added to the carboxyl group in the conversion in steps I and O of FIG.
  • Examples of enzymes capable of catalyzing this conversion include CoA transferases classified in group EC 2.8.3 and acid thiol ligases classified in group EC 6.2.1. Enzymes used in the present invention are not limited as long as they have activity for this conversion.
  • Genes encoding the above enzymes that can be used in the present invention may be derived from organisms other than the exemplified organisms, or may be artificially synthesized. Any material can be used as long as it can express activity.
  • the genetically modified microorganism according to the present invention contains, in addition to the exogenous gene encoding the aforementioned 3-hydroxyadipyl-CoA dehydratase and/or 2,3-dehydroadipyl-CoA reductase, succinyl-CoA:acetyl-CoA acyltransferase and 3-
  • an exogenous gene encoding at least one enzyme selected from the group consisting of hydroxyadipyl-CoA dehydrogenase is introduced.
  • the recombinant microorganism according to the present invention preferably further comprises at least one of an exogenous gene encoding succinyl-CoA:acetyl-CoA acyltransferase and an exogenous gene encoding 3-hydroxyadipyl-CoA dehydrogenase. .
  • the recombinant microorganism according to the present invention contains exogenous genes other than the above exogenous genes, that is, 3-hydroxyadipyl-CoA dehydratase, 2,3-dehydroadipyl-CoA reductase, succinyl-CoA:acetyl-CoA acyltransferase and 3-hydroxyadipyl-CoA dehydrogenase. may also contain additional exogenous genes.
  • the recombinant microorganism according to the present invention may be a host microorganism in which any gene is appropriately disrupted. Targeted gene disruption may be performed according to methods known in the art.
  • the enzyme gene that can be used for the purpose of the present invention includes all mutations that can occur in nature and artificially introduced mutations, as long as they can express substantial enzyme activity in the host microbial cells. and may have modifications. For example, it is known that there are extra codons for various codons that code for specific amino acids. Therefore, also in the present invention, alternative codons that are ultimately translated into the same amino acid may be used. That is, because the genetic code is degenerate, multiple codons can be used to encode a particular amino acid, such that an amino acid sequence can be encoded by any set of similar DNA oligonucleotides.
  • the base sequence of the enzyme gene is, for example, 65% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more. % or greater, 90% or greater, 95% or greater, 97% or greater, 98% or greater, or 99% or greater sequence identity.
  • the genetically modified microorganism according to the present invention has a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the above enzyme, for example, 65% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more % or greater, 97% or greater, 98% or greater or 99% or greater sequence identity.
  • an "expression cassette” refers to a nucleic acid to be expressed or a nucleotide containing nucleic acid sequences that regulate transcription and translation operably linked to a gene to be expressed.
  • an expression cassette of the invention comprises a promoter sequence 5′ upstream from the coding sequence, a terminator sequence 3′ downstream, and optionally further conventional regulatory elements operably linked, such that In some cases, the nucleic acid to be expressed or the gene to be expressed is introduced into the host microorganism.
  • a promoter is defined as a DNA sequence that causes RNA polymerase to bind to DNA and initiate RNA synthesis, regardless of whether it is a constitutive promoter or an inducible promoter.
  • a strong promoter is a promoter that initiates mRNA synthesis at a high frequency, and is also preferably used in the present invention.
  • coli the lac system, trp system, tac or trc system, the major operator and promoter region of ⁇ phage, the regulatory region of the fd coat protein, glycolytic enzymes (e.g., 3-phosphoglycerate kinase, glyceraldehyde-3-phosphorus Acid dehydrogenase), glutamic acid decarboxylase A, promoters for serine hydroxymethyltransferase, promoter regions of T7 phage-derived RNA polymerase, and the like can be used.
  • glycolytic enzymes e.g., 3-phosphoglycerate kinase, glyceraldehyde-3-phosphorus Acid dehydrogenase
  • glutamic acid decarboxylase A glutamic acid decarboxylase A
  • promoters for serine hydroxymethyltransferase promoter regions of T7 phage-derived RNA polymerase, and the like
  • HCE high-level constitutive expression
  • a terminator As a terminator, a T7 terminator, rrnBT1T2 terminator, lac terminator, etc. can be used.
  • regulatory elements include, for example, selectable markers, amplification signals and replication origins. Suitable regulatory elements are described, for example, in “Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185", Academic Press (1990).
  • the host microorganism used in the present invention may be a microorganism in which the enzyme-encoding gene originally possessed by the microorganism has been disrupted.
  • Genes encoding the enzyme include, for example, the ldh gene encoding lactate dehydrogenase, the atoB gene encoding acetyl-CoA acetyltransferase, and the sucD gene encoding succinyl-CoA synthetase ⁇ -subunit.
  • the production of lactic acid as an impurity can be reduced.
  • Disruption of the atoB gene, which encodes acetyl-CoA acetyltransferase, and the sucD gene, which encodes the succinyl-CoA synthetase ⁇ -subunit can improve the yield of adipic acid.
  • the expression cassette described above is incorporated into a vector consisting of, for example, a plasmid, phage, transposon, IS element, fosmid, cosmid, or linear or circular DNA, and inserted into a host microorganism. Plasmids and phages are preferred. These vectors may replicate autonomously in the host microorganism or may replicate chromosomally. Suitable plasmids are, for example, E.
  • a conventional method can be used as a method applicable when introducing the vector into a host microorganism.
  • a method applicable when introducing the vector into a host microorganism examples thereof include, but are not limited to, the calcium chloride method, electroporation method, conjugative transfer method, and protoplast fusion method, and a method suitable for the host microorganism can be selected.
  • Another aspect of the present invention relates to a method for producing a target compound using the recombinant microorganism. More specifically, it relates to a method for producing a target compound, which includes a culturing step of culturing the recombinant microorganism.
  • the target compound is selected from the group consisting of adipic acid, adipic acid derivatives, hexamethylenediamine, 1,6-hexanediol and 6-amino-1-hexanol.
  • Adipic acid derivatives include, as described above, for example, 3-oxoadipic acid (3-OA), levulinic acid (LEV), 3-hydroxyadipic acid (3HA) and 2,3-dehydroadipic acid (23DA). be done.
  • the recombinant microorganism of the present invention has an adipic acid production pathway.
  • the present invention also relates to a method for producing adipic acid, comprising a culturing step of culturing the recombinant microorganism.
  • the recombinant microorganism according to the present invention has a hexamethylenediamine production pathway.
  • the present invention also relates to a method for producing hexamethylenediamine, comprising a culturing step of culturing the recombinant microorganism.
  • the recombinant microorganism according to the present invention has a 1,6-hexanediol production pathway.
  • the invention also relates to a method for producing 1,6-hexanediol, comprising a culturing step of culturing the recombinant microorganism.
  • the recombinant microorganism according to the present invention has a 6-amino-1-hexanol production pathway.
  • the invention also relates to a process for producing 6-amino-1-hexanol, comprising a culturing step of culturing the recombinant microorganism.
  • a culture containing bacterial cells is obtained by culturing the recombinant microorganism in a medium containing a carbon source and a nitrogen source.
  • the genetically modified microorganism of the present invention is cultured under conditions suitable for adipic acid production, growth and maintenance of the microorganism, and suitable medium composition, culture time and culture conditions can be easily set by those skilled in the art.
  • Carbon sources include D-glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, oligosaccharides, polysaccharides, starch, cellulose, rice bran, molasses, fats and oils (such as soybean oil, sunflower oil, peanut oil, coconut oil, etc.), fatty acids ( palmitic acid, linoleic acid, oleic acid, linolenic acid, etc.), alcohols (e.g., glycerol, ethanol, etc.), organic acids (e.g., acetic acid, lactic acid, succinic acid, etc.), corn decomposition solution, cellulose decomposition solution, carbon dioxide, monoxide carbon and the like. D-glucose, sucrose or glycerol are preferred. These carbon sources can be used individually or as a mixture.
  • Adipic acid produced using biomass-derived raw materials is measured for biobased carbon content based on Carbon-14 (radiocarbon) analysis specified in ISO 16620-2 or ASTM D6866, for example, petroleum, natural gas, coal It can be clearly distinguished from synthetic raw materials derived from
  • Nitrogen sources can be nitrogen-containing organic compounds such as peptones, casamino acids, tryptones, yeast extracts, meat extracts, malt extracts, corn steep liquor, soybean flour, amino acids and urea, or inorganic compounds such as ammonia aqueous solution, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate, sodium nitrate, ammonium nitrate, etc.). These nitrogen sources can be used individually or as a mixture.
  • the medium may also contain corresponding antibiotics if the recombinant microorganism expresses useful additional traits, for example if it has markers for resistance to antibiotics. This reduces the risk of contamination by germs during culture.
  • Antibiotics include, but are not limited to, ⁇ -lactam antibiotics such as ampicillin, aminoglycoside antibiotics such as kanamycin, macrolide antibiotics such as erythromycin, tetracycline antibiotics, chloramphenicol, and the like. not.
  • Cultivation may be batch or continuous. Moreover, in any case, it may be possible to replenish the additional carbon source or the like at an appropriate point in the culture.
  • the culture may be cultured while controlling conditions such as suitable temperature, oxygen concentration, and pH. Suitable culture temperatures for transformants derived from common microbial host cells are usually in the range of 15°C to 45°C, preferably 25°C to 37°C. If the host microorganism is aerobic, shaking (such as flask culture) or stirring/aeration (such as jar fermenter culture) may be performed to ensure an appropriate oxygen concentration during fermentation. Those culture conditions can be easily set by those skilled in the art.
  • the method for producing the target compound according to the present invention may include a separation and purification step of separating and purifying the produced compound from the culture.
  • a separation and purification step of separating and purifying the produced compound from the culture.
  • any technique such as centrifugation, membrane filtration, membrane separation, crystallization, extraction, distillation, adsorption, phase separation and various types of chromatography can be used, but not limited thereto.
  • the separation and purification step may consist of one type of step, or may consist of a combination of a plurality of steps.
  • a polynucleotide encoding PaaJ(Ec) (SEQ ID NO: 1) of Escherichia coli was obtained by cloning from Escherichia coli strain W3110 (NBRC12713) genomic DNA.
  • PCR was performed using the oligonucleotides of SEQ ID NOs: 34 and 35 as primers to obtain a PCR product containing the paaJ(Ec) gene coding region (SEQ ID NO: 33).
  • PCR was performed using pRSFDuet-1 (product name, manufactured by Merck) as a template and oligonucleotides of SEQ ID NOs: 36 and 37 as primers to obtain a pRSFDuet-1 fragment.
  • a DNA fragment containing the paaJ(Ec) gene coding region and the pRSFDuet-1 fragment were ligated using In-Fusion (registered trademark, abbreviated hereinafter) HD cloning kit (product name, manufactured by Clontech). Escherichia coli strain JM109 was transformed, and a plasmid was extracted from the resulting transformant. "paaJ(Ec)-pRSFDuet" was obtained as a PaaJ(Ec) expression plasmid.
  • a polynucleotide encoding Eshcherichia coli PaaH(Ec) was obtained by cloning from the genomic DNA of Eshcherichia coli strain W3110 (NBRC12713). PCR was performed using the oligonucleotides of SEQ ID NOs: 39 and 40 as primers to obtain a PCR product containing the paaH(Ec) gene coding region (SEQ ID NO: 38). Next, PCR was performed using "paaJ(Ec)-pRSFDuet" as a template and oligonucleotides of SEQ ID NOS: 41 and 42 as primers to obtain a "paaJ(Ec)-pRSFDuet” fragment.
  • a DNA fragment containing the paaH(Ec) gene coding region and the "paaJ(Ec)-pRSFDuet” fragment were ligated using In-Fusion HD cloning kit (product name, manufactured by Clontech). Escherichia coli strain JM109 was transformed, and a plasmid was extracted from the resulting transformant. "paaJ(Ec)-paaH(Ec)-pRSFDuet" was obtained as a PaaJ(Ec)/PaaH(Ec) co-expression plasmid.
  • a polynucleotide encoding Eshcherichia coli PaaF(Ec) was obtained by cloning from Eshcherichia coli strain W3110 (NBRC12713) genomic DNA. PCR was performed using the oligonucleotides of SEQ ID NOS: 44 and 45 as primers to obtain a PCR product containing the paaF(Ec) gene coding region (SEQ ID NO: 43).
  • the nucleotide sequence encoding the L3 strain PaaF (L3) encoded in the nucleotide sequence of the PCR amplification product using the chromosomal DNA of the L3 strain as a template is , the base sequence was optimized for E. coli expression and obtained using the artificial gene synthesis service of Eurofins Genomics.
  • PCR was performed using the oligonucleotides of SEQ ID NOS: 47 and 48 as primers to obtain a PCR product containing the optimized sequence of the coding region of the paaF (L3) gene.
  • PCR was performed using pETDuet-1 (product name, manufactured by Merck) as a template and oligonucleotides of SEQ ID NOS: 49 and 50 as primers to obtain a pETDuet-1 fragment.
  • the DNA fragment containing the paaF (Ec) and paaF (L3) coding regions and the pETDuet-1 fragment were ligated using the In-Fusion HD cloning kit (product name, manufactured by Clontech). Escherichia coli strain JM109 was transformed, and a plasmid was extracted from the resulting transformant.
  • paaF(Ec)-pETDuet was obtained as a PaaF(Ec) expression plasmid, and "paaF(L3)-pETDuet” as a PaaF(L3) expression plasmid.
  • a polynucleotide encoding Acinetobacter baylyi dcaA (Ab) was obtained by optimizing the base sequence for E. coli expression and using the artificial gene synthesis service of Eurofins Genomics.
  • PCR was performed using the oligonucleotides of SEQ ID NOs: 52 and 53 as primers to obtain a PCR product containing the coding region of the dcaA (Ab) gene (SEQ ID NO: 51).
  • PCR was performed using "paaF(Ec)-pETDuet" as a template and oligonucleotides of SEQ ID NOs: 84 and 85 as primers to obtain a "paaF(Ec)-pETDuet” fragment.
  • a DNA fragment containing the coding region of the dcaA(Ab) gene and the "paaF(Ec)-pETDuet” fragment were ligated using In-Fusion HD cloning kit (product name, manufactured by Clontech). Escherichia coli strain JM109 was transformed, and a plasmid was extracted from the resulting transformant. "paaF(Ec)-dcaA(Ab)-pETDuet” was obtained as a PaaF(Ec)/DcaA(Ab) co-expression plasmid.
  • Candida tropicalis Ter(Ct) (SEQ ID NO: 6) was cloned as a sequence (SEQ ID NO: 7) in which 22 residues of the N-terminal region were removed.
  • the encoding polynucleotide was sequence-optimized for E. coli expression and obtained using the artificial gene synthesis service of Eurofins Genomics.
  • PCR was performed using the oligonucleotides of SEQ ID NOs: 55 and 56 as primers to obtain a PCR product containing the coding region of the ter(Ct) gene (SEQ ID NO: 54).
  • PCR was performed using "paaF(L3)-pETDuet” as a template and oligonucleotides of SEQ ID NOs: 84 and 85 as primers to obtain a "paaF(L3)-pETDuet” fragment.
  • a DNA fragment containing the coding region of the ter(Ct) gene and the "paaF(L3)-pETDuet” fragment were ligated using In-Fusion HD cloning kit (product name, manufactured by Clontech). Escherichia coli strain JM109 was transformed, and a plasmid was extracted from the resulting transformant.
  • "paaF(L3)-ter(Ct)-pETDuet” was obtained as a PaaF(L3), Ter(Ct) co-expression plasmid.
  • the polynucleotide encoding the selected 2,3-dehydroadipyl-CoA reductase candidate protein is optimized for base sequence expression for E. coli expression, obtained using the artificial gene synthesis service of Eurofins Genomics, and each A DNA fragment containing the coding region of the enzyme gene was obtained by PCR.
  • Table 2 shows the nucleotide sequence of the coding region of each enzyme gene and the sequence numbers of the nucleotide sequences of the primer sets used for PCR.
  • PCR was performed using "paaF(L3)-pETDuet" as a template and oligonucleotides of SEQ ID NOs: 84 and 85 as primers to obtain a "paaF(L3)-pETDuet” fragment.
  • a DNA fragment containing the coding region of each gene and the "paaF(L3)-pETDuet" fragment were ligated using In-Fusion HD cloning kit (product name, manufactured by Clontech). Escherichia coli strain JM109 was transformed, and a plasmid was extracted from the resulting transformant. Co-expression plasmids of PaaF (L3) and each 2,3-dehydroadipyl-CoA reductase candidate protein were obtained.
  • Mycobacterium abscessus carboxylic acid reductase MaCar (SEQ ID NO: 20) is used as a mutant MaCar(m) in which the 283rd tryptophan residue in the amino acid sequence is replaced with an arginine residue and the 303rd alanine residue is replaced with a methionine residue. (SEQ ID NO: 22).
  • a polynucleotide encoding MaCar(m) was obtained by optimizing the base sequence for E. coli expression and using the artificial gene synthesis service of Eurofins Genomics. PCR was performed using the oligonucleotides of SEQ ID NOS: 87 and 88 as primers to obtain a PCR product containing the Macar(m) gene coding region (SEQ ID NO: 86).
  • a polynucleotide encoding Nocardia iowensis Npt (SEQ ID NO: 24) was obtained by cloning from the genomic DNA of the Nocardia iowensis strain JCM18299 (provided by RIKEN BRC via the National BioResource Project of the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology). PCR was performed using the oligonucleotides of SEQ ID NOS: 90 and 91 as primers to obtain a PCR product containing the npt gene coding region (SEQ ID NO: 89).
  • PCR was performed using "MaCar(m)-pACYCDuet” as a template and oligonucleotides of SEQ ID NOs: 92 and 93 as primers to obtain a "Macar(m)-pACYCDuet” fragment.
  • the PCR products were ligated together using the In-Fusion HD cloning kit (product name, manufactured by Clontech). Escherichia coli strain JM109 was transformed, and a plasmid was extracted from the resulting transformant.
  • "Macar(m)-npt-pACYCDuet” was obtained as a MaCar(m), Npt co-expression plasmid.
  • a polynucleotide encoding Escherichia coli Ahr was obtained by cloning from Escherichia coli strain W3110 (NBRC12713) genomic DNA. PCR was performed using the oligonucleotides of SEQ ID NOS:95 and 96 as primers to obtain a PCR product containing the coding region of the ahr gene (SEQ ID NO:94). Next, PCR was performed using "Macar(m)-npt-pACYCDuet" as a template and oligonucleotides of SEQ ID NOs: 97 and 98 as primers to obtain a "macar(m)-npt-pACYCDuet" fragment.
  • the PCR product containing the coding region of each gene and the "macar(m)-npt-pACYCDuet" fragment were connected using In-Fusion HD cloning kit (product name, manufactured by Clontech). Escherichia coli strain JM109 was transformed, and a plasmid was extracted from the resulting transformant. 'ahr-macar(m)-npt-pACYCDuet' was obtained as an Ahr, MaCar, and Npt co-expression plasmid.
  • Transformants ADA1-11 were added to 2 mL (14 mL round-bottom tube) of LB liquid medium (tryptone 10 g/L, yeast extract 5 g/L, sodium chloride 5 g/L) containing ampicillin sodium 50 mg/L and kanamycin sulfate 30 mg/L. ) and cultured with shaking at 37° C. for 24 hours to obtain a preculture solution. 10 ⁇ L of the obtained preculture solution was inoculated into 1 mL of MM medium (96-well deep well plate) containing 50 mg/L of ampicillin sodium and 30 mg/L of kanamycin sulfate, and cultured with shaking at 37° C. for 48 hours. The composition of MM medium is shown in Table A-4.
  • reaction solution 100 ⁇ L of a 20 mg/mL pyridine solution of methoxyamine hydrochloride was added to the obtained dried product, and the mixture was shaken at 30° C. for 90 minutes. 50 ⁇ L of N-methyl-N-trimethylsilyltrifluoroacetamide was added and shaken at 37° C. for 30 minutes. The reaction solution was used as a GC/MS measurement sample and analyzed under the following conditions.
  • Transformants ADA1 to ADA11 are transformants introduced with expression plasmids of enzyme genes capable of advancing the reactions of steps A, B, C and D in FIG.
  • the reaction of step E proceeds by endogenous enzymes of E. coli.
  • adipic acid content exceeding that of the comparative example was obtained. It was shown that expression of the enzymes Ter(mtm), Ter(ttt), Ter(cthr), Ter(pan), or Ter(pte) improved C6 compound production. These results also show that the microorganisms shown in the examples exhibit good 2,3-dehydroadipyl-CoA reductase activity.
  • 10 ⁇ L of the obtained preculture solution was inoculated into 1 mL of MM medium (96-well deep well plate) containing 50 mg/L of ampicillin sodium, 30 mg/L of kanamycin sulfate, and 30 mg/L of chloramphenicol, and incubated at 37° C. for 48 hours. Shaking culture was performed.
  • the 1,6-hexanediol concentration and 6-hydroxyhexanoic acid concentration in the culture medium were analyzed.
  • the 6-hydroxyhexanoic acid concentration was analyzed using GC/MS under the same conditions as the adipic acid concentration analysis. Analysis of 1,6-hexanediol concentration was performed under the following conditions using a high-performance liquid chromatograph Prominence system (manufactured by Shimadzu Corporation).
  • High performance liquid chromatograph (HPLC) analysis conditions Detector Differential refractive index detector Column: Shim-Pack Fast-OA (G), Fast-OA (manufactured by Shimadzu Corporation) Oven temperature: 40°C Mobile phase: 8 mM methanesulfonic acid aqueous solution Flow rate: 0.6 mL/min Injection volume: 10 ⁇ L
  • Transformant HDO1 is a transformant into which expression plasmids for carboxylic acid reductase and alcohol dehydrogenase have been introduced in addition to expression plasmids for enzyme genes that allow the reactions of steps A, B, C and D in FIG. 1 to proceed.
  • Cultivation of transformant HDO1 (Example 10) produced 6-hydroxyhexanoic acid and 1,6-hexanediol.
  • pHAK1 (receipt number NITE P-02919), National Institute of Technology and Evaluation, Biotechnology Center, Patent Microorganism Depositary Center (NPMD) (Address: 2-Kazusa Kamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture) 5-8 Room 122) on March 18, 2019.
  • International deposit number: NITE BP-02919 was carried out by the homologous recombination method.
  • pHAK1 contains a temperature-sensitive mutant repA gene, a kanamycin resistance gene, and a Bacillus subtilis-derived levansucrase gene sacB.
  • the levansucrase gene is lethal to host microorganisms in the presence of sucrose.
  • PrimeSTAR Max DNA Polymerase product name, manufactured by Takara Bio
  • KOD FX Neo product name, manufactured by Toyobo
  • Escherichia coli HST08 strain was used for plasmid preparation.
  • this PCR product was inserted into the pHAK1 plasmid fragment amplified using the primers of SEQ ID NOs: 115 and 116 and circularized. Escherichia coli HST08 strain was transformed, and a plasmid was extracted from the resulting transformant.
  • pHAK1 plasmid in which the DNA fragments of the 5′ homologous region, coding region, and 3′ homologous region of the disruption target gene were inserted as a template, PCR was performed using the primers listed in Table A-8 below. , a portion or the entire coding region of the disruption target gene was removed to obtain a pHAK1 plasmid fragment containing the 5' and 3' homologous regions.
  • the resulting plasmid fragment was circularized by terminal phosphorylation and self-ligation.
  • Escherichia coli HST08 strain was transformed, and a plasmid was extracted from the resulting transformant to obtain a gene-disrupting plasmid.
  • a plasmid for gene insertion was designed so that the paaJ (Ec) and paaH (Ec) genes were inserted into the pflB gene region as an expression cassette.
  • Promoter region SEQ ID NO: 133
  • paaJ (Ec) gene coding region linker sequence
  • SEQ ID NO: 134 linker sequence
  • the paaH gene coding region and the terminator region (SEQ ID NO: 135).
  • the nucleotide sequence encoding the L3 strain PaaF (L3) encoded in the nucleotide sequence of the PCR amplification product using the chromosomal DNA of the L3 strain as a template is , the base sequence was optimized for E. coli expression and obtained using the artificial gene synthesis service of Eurofins Genomics.
  • a polynucleotide encoding MmgC (L3) of the L3 strain encoded by the nucleotide sequence of the PCR amplification product using the chromosomal DNA of the L3 strain as a template (1155 bp) was obtained by optimizing the base sequence for E. coli expression and using the synthetic gene synthesis service of Eurofins Genomics.
  • a gene insertion plasmid was designed so that the optimized sequences of the paaF (L3) and mmgC (L3) gene coding regions were inserted into the yahK gene region as an expression cassette.
  • Promoter region SEQ ID NO: 136
  • paaF L3) gene coding region
  • linker sequence SEQ ID NO: 137
  • the mmgC L3) gene coding region
  • terminator region SEQ ID NO: 138
  • Mycobacterium abscessus carboxylic acid reductase MaCar uses a mutant MaCar(m) in which the 283rd tryptophan residue in the amino acid sequence is replaced with an arginine residue and the 303rd alanine residue is replaced with a methionine residue. (SEQ ID NO: 22).
  • a polynucleotide (SEQ ID NO: 86) encoding MaCar(m) was obtained by optimizing the base sequence for E. coli expression and using the artificial gene synthesis service of Eurofins Genomics.
  • a polynucleotide (SEQ ID NO: 89) encoding Nocardia iowensis Npt (SEQ ID NO: 24) was cloned from the genomic DNA of the Nocardia iowensis strain JCM18299 (provided by RIKEN BRC via the National BioResource Project of the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology). obtained.
  • a plasmid for gene insertion was designed so that the macar(m) and npt genes were inserted into the ldhA gene region as an expression cassette. Between the 5' homologous region and the 3' homologous region of the ldhA gene coding region contained in the previously constructed ldhA gene disruption plasmid, a promoter region (SEQ ID NO: 139), macar(m) gene coding region, linker sequence (SEQ ID NO: 140), the npt gene coding region, and the terminator region (SEQ ID NO: 141).
  • E. coli BL21 (DE3) strain was transformed with a plasmid for disruption or insertion of the desired gene by electroporation (see Genetic Engineering Experimental Notebook, Yodosha, Takaaki Tamura).
  • LB agar medium containing tryptone 10 g / L, yeast extract 5 g / L, sodium chloride 5 g / L, agar powder 15 g / L), incubate at 30 ° C.
  • ⁇ Construction of hexamethylenediamine production pathway enzyme gene expression plasmid> PrimeSTAR Max DNA Polymerase (product name, manufactured by Takara Bio) or KOD FX Neo (product name, manufactured by Toyobo) was used to amplify the PCR fragment, and Escherichia coli JM109 strain was used to prepare the plasmid.
  • YgjG (SEQ ID NO: 27) of Escherichia coli used mutant YgjG(m) (SEQ ID NO: 158) in which a part of the amino acid sequence was substituted.
  • a polynucleotide encoding YgjG(m) was subjected to PCR using the oligonucleotides of SEQ ID NOS: 160 and 161 as primers to obtain a PCR product containing the coding region of the ygjG(m) gene (SEQ ID NO: 159).
  • the culture solution was separated into bacterial cells and supernatant by centrifugation, and the concentration of hexamethylenediamine in the supernatant was analyzed. Analysis of the hexamethylenediamine concentration was performed using an ion chromatograph under the following conditions.
  • Ion chromatograph analysis conditions Equipment: ICS-3000 (manufactured by Dionex) Detector: Electrical conductivity detector Column: IonPac CG19 (2 x 50 mm) / CS19 (2 x 250 mm) (manufactured by Thermo Scientific) Oven temperature: 30°C
  • Mobile phase 8 mM methanesulfonic acid aqueous solution (A), 70 mM methanesulfonic acid aqueous solution (B)
  • Gradient conditions (A: 100%, B: 0%) - (10 min) - (A: 0%, B: 100%) - (hold for 1 min)
  • Flow rate 0.28 mL/min
  • Injection volume 20 ⁇ L
  • Transformant HMD1 is a transformant into which carboxylic acid reductase and aminotransferase genes have been introduced in addition to enzyme genes capable of advancing the reactions of steps A, B, C and D in FIG. Cultivation of transformant HMD1 (Example 11) produced hexamethylenediamine.
  • Burkholderia sp. LEBP-3 strain was isolated from activated sludge in Japan using a medium containing adipic acid as the sole carbon source and energy source.
  • the Burkholderia sp. LEBP-3 strain was transferred to the National Institute of Technology and Evaluation Patent Microorganism Depositary Center NPMD) (Address: 2-5-8 122 Kazusa Kamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture) in 2020.
  • paaJ as succinyl-CoA:acetyl-CoA acyltransferase
  • paaH as 3-hydroxyadipyl-CoA dehydrogenase
  • paaF as 3-hydroxyadipyl-CoA dehydratase
  • 2, mmgC was identified as a 3-dehydroadipyl CoA reductase.
  • Table B-1 shows the results of a BLAST search performed using the PaaJ (L3) sequence as a query
  • Table B-2 shows the results of a BLAST search performed using the PaaH (L3) sequence as a query
  • PaaF (L3) sequence as a query shows the results of the BLAST search
  • Table B-3 shows the results of the BLAST search
  • Table B-4 shows the results of the BLAST search using the MmgC(L3) sequence as a query.
  • "Refseq_Protein” was designated as the database for the sequence search.
  • the above enzyme possessed by the LEBP-3 strain was identified as a novel sequence.
  • the paaJ(L3) gene can be amplified by PCR using the nucleotide shown in SEQ ID NO: 164 and the nucleotide shown in SEQ ID NO: 165 as primers.
  • the paaH(L3) gene can be amplified by PCR using the nucleotide shown in SEQ ID NO: 166 and the nucleotide shown in SEQ ID NO: 167 as primers.
  • the paaF(L3) gene can be amplified by PCR using the nucleotide shown in SEQ ID NO: 168 and the nucleotide shown in SEQ ID NO: 169 as primers.
  • the mmgC (L3) gene can be amplified by PCR using the nucleotide shown in SEQ ID NO: 170 and the nucleotide shown in SEQ ID NO: 171 as primers.
  • the primers used for PCR, each enzyme, and the base sequences encoding the enzymes are shown in FIGS. 17-20.
  • PCR amplification conditions An example of PCR amplification conditions is shown below.
  • PrimeSTAR Max DNA Polymerase product name, manufactured by Takara Bio
  • Heat treatment at 98°C for 10 seconds, annealing at 55°C for 15 seconds, and elongation at 72°C for 5 seconds/kb were performed for 30 cycles.
  • Oligonucleotides used as primers were added at 1 ⁇ M each. The liquid volume was 25 ⁇ L.
  • a polynucleotide encoding Escherichia coli PaaJ (Ec) was cloned from Escherichia coli strain W3110 (NBRC12713) genomic DNA.
  • PCR was performed using the oligonucleotides of SEQ ID NOS: 188 and 189 ( Figure 20A) as primers to obtain a PCR amplification product containing the paaJ(Ec) gene coding region (SEQ ID NO: 180) ( Figure 19A).
  • PCR was performed using pRSFDuet-1 (product name, manufactured by Merck) as a template and the nucleotides shown in SEQ ID NOs: 190 and 191 (FIG.
  • a polynucleotide encoding Escherichia coli PaaH(Ec) was cloned from the genomic DNA of Escherichia coli strain W3110 (NBRC12713). PCR was performed using the nucleotides shown in SEQ ID NOS: 192 and 193 ( Figure 20A) as primers to obtain a PCR amplification product containing the paaH(Ec) gene coding region (SEQ ID NO: 181) ( Figure 19A). Next, PCR was performed using prm203 as a template and the nucleotides shown in SEQ ID NOs: 194 and 195 (Fig. 20A) as primers to obtain a prm203 fragment.
  • the DNA fragment containing each gene coding region and the prm203 fragment were connected using In-Fusion HD cloning kit (product name, manufactured by Clontech). Escherichia coli strain JM109 was transformed, and a plasmid was extracted from the resulting transformant. "prm69" was obtained as a PaaJ(Ec)-PaaH(Ec) expression plasmid.
  • a polynucleotide encoding Escherichia coli PaaF (Ec) was cloned from Escherichia coli strain W3110 (NBRC12713) genomic DNA. PCR was performed using the nucleotides shown in SEQ ID NOS: 196 and 197 ( Figure 20A) as primers to obtain a PCR amplification product containing the paaF(Ec) gene coding region (SEQ ID NO: 182) ( Figure 19A).
  • a polynucleotide encoding PaaF (L3) of the L3 strain was obtained by optimizing the base sequence for E. coli expression and using the artificial gene synthesis service of Eurofins Genomics.
  • PCR was performed using the nucleotides shown in SEQ ID NOS: 198 and 199 ( Figure 20A) as primers to obtain a PCR amplification product containing the coding region of the paaF (L3) gene.
  • PCR was performed using pETDuet-1 (product name, manufactured by Merck) as a template and the nucleotides shown in SEQ ID NOs: 204 and 205 (FIG. 20A) as primers to obtain a pETDuet-1 fragment.
  • the DNA fragment containing the coding region of each gene and the pETDuet-1 fragment were connected using the In-Fusion HD cloning kit (product name, manufactured by Clontech).
  • Escherichia coli strain JM109 was transformed, and a plasmid was extracted from the resulting transformant.
  • 'prm74' was obtained as a PaaF(Ec) expression plasmid
  • 'prm194' was obtained as a PaaF(L3) expression plasmid.
  • dcaA (Ab) of Acinetobacter baylyi, Tfu1647 of Thermobifida fusca, and MmgC (L3) of L3 strain were sequence-optimized for E. coli expression, and the artificial gene synthesis service of Eurofins Genomics was used. and obtained.
  • the dcaA (Ab) gene (SEQ ID NO: 185) (FIG. 19B) was generated using the nucleotides shown in SEQ ID NOS: 206 and 207 (FIG. 20A) as primers, and Thermobifida fusca Tfu1647 gene (SEQ ID NO: 186) (FIG. 19B) was generated using SEQ ID NO: 208.
  • FIG. 20A mmgC5 (L3) gene was subjected to PCR using the nucleotides shown in SEQ ID NOS: 210 and 211 (FIG. 20A) as primers to obtain dcaA (Ab), Tfu1647, and mmgC5 (L3).
  • Each PCR amplicon containing the coding region of the gene was obtained.
  • PCR was performed using prm74 and prm194 as templates and the nucleotides shown in SEQ ID NOs: 212 and 213 (Fig. 20A) as primers to obtain prm74 and prm194 fragments, respectively.
  • a DNA fragment containing the coding region of each gene was ligated with the prm74 fragment and the prm194 fragment using the In-Fusion HD cloning kit (product name, manufactured by Clontech).
  • Escherichia coli strain JM109 was transformed, and a plasmid was extracted from the resulting transformant.
  • "prm127" as the PaaF(Ec)-dcaA(Ab) expression plasmid
  • prm234" as the PaaF(Ec)-mmgC(L3) expression plasmid
  • prm166 as the PaaF(L3)-mmgC(L3) expression plasmid.
  • a polynucleotide encoding Acinetobacter baylyi tesB (Ab) was obtained by PCR from the Acinetobacter baylyi chromosomal DNA using the nucleotides shown in SEQ ID NOS: 214 and 215 (Fig. 20A) as primers, and a PCR containing the coding region of the tesB (Ab) gene was performed. Each amplicon was obtained. PCR was performed using pCDFDuet-1 as a template and the nucleotides shown in SEQ ID NOs: 216 and 217 (FIG. 20A) as primers to obtain a pCDFDuet-1 fragment.
  • a DNA fragment containing each tesB (Ab) gene coding region was ligated with the pCDFDuet-1 fragment using In-Fusion HD cloning kit (product name, manufactured by Clontech). Escherichia coli strain JM109 was transformed, and a plasmid was extracted from the resulting transformant. "prm92" was obtained as a TesB(Ab) expression plasmid.
  • a gene-disrupted strain of E. coli BL21 (DE3) strain was prepared as follows. Disruption of the ldh gene, which encodes lactate dehydrogenase, the atoB gene, which encodes acetyl-CoA acetyltransferase, and the sucD gene, which encodes succinyl-CoA synthetase ⁇ -subunit, was identified as pHAK1 (acceptance number NITE P-02919, Independent Administrative Agency Product Evaluation Technology). Deposited at the Patent Microorganism Depositary Center (NPMD), Biotechnology Center, Infrastructure Organization (Address: Room 122, 2-5-8 Kazusa Kamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture) on March 18, 2019.
  • NPMD Patent Microorganism Depositary Center
  • NITE BP-02919 was performed by the homologous recombination method using pHAK1 contains a temperature-sensitive mutant repA gene, a kanamycin resistance gene, and a Bacillus subtilis-derived levansucrase gene SacB.
  • the levansucrase gene is lethal to host microorganisms in the presence of sucrose.
  • PrimeSTAR Max DNA Polymerase product name, manufactured by Takara Bio was used to amplify the PCR fragment, and Escherichia coli HST08 strain was used to prepare the plasmid.
  • a PCR amplification product containing the upstream region, coding region, and downstream region of the disruption target gene was obtained.
  • the ldh gene peripheral region was subjected to PCR using the nucleotides shown in SEQ ID NOs: 218 and 219 (FIG. 20B) as primers
  • the atoB gene peripheral region was subjected to PCR using the nucleotides shown in SEQ ID NOS: 220 and 221 (FIG. 20B) as primers
  • the sucD gene The surrounding region was subjected to PCR using the nucleotides shown in SEQ ID NOs: 222 and 223 (Fig. 20B) as primers to obtain respective fragments.
  • the pHAK1 plasmid in which DNA fragments of the resulting disruption target gene upstream region, coding region, and downstream region were inserted the ldh gene peripheral region was subjected to PCR using the nucleotides shown in SEQ ID NOs: 226 and 227 (FIG. 20B) as primers.
  • PCR was performed for the atoB gene peripheral region using the nucleotides shown in SEQ ID NOS: 228 and 229 (FIG. 20B) as primers, and for the sucD gene peripheral region, PCR was performed using the nucleotides shown in SEQ ID NOS: 230 and 231 as primers (FIG. 20B).
  • a plasmid fragment was obtained in which part or all of the coding region of the disruption target gene was deleted.
  • the resulting plasmid fragment was circularized by terminal phosphorylation and self-ligation to obtain a plasmid for gene disruption.
  • E. coli BL21 (DE3) strain was transformed with a plasmid for disruption of the desired gene by the calcium chloride method (see Takaaki Tamura, Genetic Engineering Laboratory Notes, Yodosha), and then kanamycin sulfate was added at 100 mg/L.
  • Spread on LB agar medium tryptone 10 g/L, yeast extract 5 g/L, sodium chloride 5 g/L, agar powder 15 g/L
  • culture overnight at 30°C to obtain single colonies, and obtain transformants. rice field.
  • One platinum loop of this transformant was inoculated into 1 mL of LB liquid medium (tryptone 10 g/L, yeast extract 5 g/L, sodium chloride 5 g/L) containing kanamycin sulfate 100 mg/L, and cultured with shaking at 30°C. gone.
  • the resulting culture medium was spread on an LB agar medium containing 100 mg/L of kanamycin sulfate and cultured overnight at 42°C.
  • the resulting colonies have the plasmid inserted into the genome by single crossover.
  • a loopful of colonies was inoculated into 1 mL of LB liquid medium, and cultured with shaking at 30°C.
  • the resulting culture solution was spread on an LB agar medium containing 10% sucrose and cultured overnight.
  • the resulting colonies were confirmed by colony direct PCR to confirm that the desired gene was disrupted.
  • an ldh gene-disrupted strain was constructed, an atoB gene-disrupted strain was constructed based on this ldh gene-disrupted strain, and a sucD gene-disrupted strain was constructed based on the ldh and atoB double-disrupted strain.
  • the triple disrupted strain of the ldh, atoB, and sucD genes thus prepared was designated as the ASL000 strain.
  • the constructed plasmid was transformed into ASL000 strain, and LB agar medium containing 50 mg/L ampicillin sodium, 30 mg/L kanamycin sulfate, and 50 mg/L streptomycin sulfate (tryptone 10 g/L, yeast extract 5 g/L, sodium chloride 5 g /L, agar powder 15 g/L) and incubated at 37°C for 24 hours to obtain a single transformant colony.
  • the obtained transformants are shown in Table B-5.
  • ⁇ Adipic acid production test by recombinant E. coli expressing acquired enzyme gene> The strains shown in Table B-5 were added to LB liquid medium containing 50 mg/L ampicillin sodium, 30 mg/L kanamycin sulfate, and 50 mg/L streptomycin sulfate (tryptone 10 g/L, yeast extract 5 g/L, sodium chloride 5 g/L).
  • MM medium 96-well deep well plate
  • 50 mg/L ampicillin sodium, 30 mg/L kanamycin sulfate, and 50 mg/L streptomycin sulfate were inoculated into 1 mL of MM medium (96-well deep well plate) containing 50 mg/L ampicillin sodium, 30 mg/L kanamycin sulfate, and 50 mg/L streptomycin sulfate, and incubated at 37°C. Shaking culture was performed for 48 hours.
  • the composition of MM medium is shown in Table B-6.
  • reaction solution 100 ⁇ L of a 20 mg/mL pyridine solution of methoxyamine hydrochloride was added to the obtained dried product, and the mixture was shaken at 30° C. for 90 minutes. 50 ⁇ L of N-methyl-N-trimethylsilyltrifluoroacetamide was added and shaken at 37° C. for 30 minutes. The reaction solution was used as a GC/MS measurement sample and analyzed under the following conditions.
  • Inventive strains that expressed both PaaF (L3) and mmgC (L3) from strain L3, namely strains ADA500 and ADA496, 3-oxoadipate (3-OA), levulinic acid (LEV), 3- Hydroxyadipic acid (3HA), 2,3-dehydroadipic acid (23DA), and adipic acid (ADA) were produced more than the control strain, and the combined values of these were 355 mg/L and 613 mg/L, respectively.
  • the above results indicate that the enzymes encoded by these genes have high activity in advancing the adipic acid pathway reaction and improve the production of adipic acid and adipic acid derivatives.
  • the present invention can provide, for example, an efficient manufacturing process for C6 compounds, and is expected to be applied to production on an industrial scale.
  • the present invention can also be suitably used in direct fermentation production of adipic acids from biomass raw materials.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

【課題】　２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡ還元酵素活性を有する組換え微生物、及び、Ｃ６化合物の製造方法を提供すること、並びに、アジピン酸またはアジピン酸誘導体を生産することのできる組換え微生物、及び、アジピン酸またはアジピン酸誘導体の製造方法を提供すること。 【解決手段】　２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡを還元してアジピルＣｏＡに変換する酵素活性を有するタンパク質をコードする外来性遺伝子、及び、３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼをコードする外来性遺伝子のうちの少なくとも１つを含む組換え微生物。

Description

組換え微生物及びＣ６化合物の製造方法
　本発明は、組換え微生物及びＣ６化合物の製造方法に関する。本発明はまた、組換え微生物及びアジピン酸又はその誘導体の製造方法にも関する。
　アジピン酸、ヘキサメチレンジアミン、１，６－ヘキサンジオール、６－アミノヘキサン酸、６－アミノ－１－ヘキサノールおよび６－ヒドロキシヘキサン酸といったＣ６化合物は、ポリアミドやポリウレタン原料等に用いられており、化学産業において重要な化合物として位置づけられている。例えば、アジピン酸（ＣＡＳ　Ｎｏ．１２４－０４－９）は、ナイロン－６６などに代表されるポリアミド原料、ウレタン、および可塑剤原料として使用されるモノマー化合物である。アジピン酸の現在の一般的な製造方法は、化学合成法、例えば、シクロヘキサノール単独、または、シクロヘキサノールとシクロヘキサノンとの混合物（Ｋ／Ａオイル）を硝酸で酸化する方法である。
　近年、化石燃料は、枯渇が危惧され、かつ地球温暖化の一因とされていることから、化学品製造プロセスにおいては、化石燃料由来の原料から再生可能な原料、例えばバイオマス由来原料への移行が望まれており、遺伝子組換えにより代謝が改変された微生物の発酵生産による製造方法が提案されている。
　例えば、アジピン酸、６－アミノカプロン酸、またはカプロラクタム生合成のための微生物が報告されている（特許文献１）。一例として、スクシニル－ＣｏＡおよびアセチル－ＣｏＡを３－オキソアジピル－ＣｏＡに変換する「スクシニル－ＣｏＡ：アセチル－ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ」；３－オキソアジピル－ＣｏＡを３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡに変換する「３－ヒドロキシアシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ」；３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを５－カルボキシ―２－ペンテノイル－ＣｏＡに変換する「３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡデヒドラターゼ」；５－カルボキシ―２－ペンテノイル－ＣｏＡをアジピル－ＣｏＡに変換する「５－カルボキシ－２－ペンテノイル－ＣｏＡレダクターゼ」；ならびに、アジピル－ＣｏＡをアジペートに変換する「ホスホトランスアジピラーゼ」および「アジピン酸キナーゼ」を含む微生物を培養する方法を開示しているが、各酵素の例示として反応を進める可能性がある遺伝子を示しているに留まり、これら酵素の遺伝子に関し、バイオマス由来炭素源から効率的にＣ６化合物を生産することができることについては実証されていない。
　また、酵素的に２，３－デヒドロアジピン酸チオエステルをアジピン酸チオエステルに変換する工程を含むアジピン酸チオエステルの調製方法も提案されているものの（特許文献２）、Ｃａｎｄｉｄａ　ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｅｕｇｌｅｎａ　ｇｒａｃｉｌｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉおよびＹａｒｒｏｗｉａ　ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａといった生物種由来のエノイルＣｏＡレダクターゼなどの一部が酵素活性を示すに留まり、Ｃ６化合物の発酵生産を実証した例は示されていない。
　さらに、大腸菌由来の酵素ＰａａＪ、ＰａａＨ、及びＰａａＦ、ならびに、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｂａｙｌｙｉ由来の酵素ＤｃａＡ及びＴｅｓＢを共発現させた遺伝子組換え大腸菌の培養を用い、グルコースを炭素源として３６ｍｇ／Ｌのアジピン酸を生産できることが報告されている（非特許文献１）。
　複数の生物種に由来するトランス－エノイルＣｏＡレダクターゼの酵素活性を示しており、さらに、Ｃａｎｄｉｄａ　ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓまたはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ　ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ由来のトランス－エノイルＣｏＡレダクターゼ、もしくはそれらの酵素の変異体を発現させた大腸菌を培養することにより、アジピン酸および６－アミノカプロン酸を生産した例も提案されている（特許文献３）。
　しかしながら、上記先行技術による発酵生産の例は、必ずしも工業的利用に資する上で十分な生産性を満たしているとは限らず、微生物の生産能を改善することが求められている。
　また、アジピン酸に関しては、バイオマス由来原料を用いた製造方法として、遺伝子組換え微生物を用いてバイオマス由来炭素源をｃｉｓ，ｃｉｓ－ムコン酸に変換した後、得られたｃｉｓ，ｃｉｓ－ムコン酸を水素化してアジピン酸を生産する方法も提案されている（特許文献４）。また、遺伝子組み換え体を用いてα－ケトグルタル酸からアジピン酸を生産する方法も提案されている（特許文献５）。
　さらに、バイオマス由来原料からの直接的なアジピン酸の発酵生産方法についても提案されている（特許文献６）。この方法では、アジピン酸を生産することのできる天然に存在しない微生物として、スクシニル－ＣｏＡおよびアセチル－ＣｏＡを３－オキソアジピル－ＣｏＡに変換する「スクシニル－ＣｏＡ：アセチル－ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ」；３－オキソアジピル－ＣｏＡを３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡに変換する「３－ヒドロキシアシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ」；３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを５－カルボキシ―２－ペンテノイル－ＣｏＡに変換する「３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡデヒドラターゼ」；５－カルボキシ―２－ペンテノイル－ＣｏＡをアジピル－ＣｏＡに変換する「５－カルボキシ－２－ペンテノイル－ＣｏＡレダクターゼ」；およびアジピル－ＣｏＡをアジペートに変換する「ホスホトランスアジピラーゼ」／「アジピン酸キナーゼ」を含む天然に存在しない微生物が挙げられているが、各酵素に関し、反応を進める可能性がある酵素をコードする遺伝子を示しているに留まり、これらの遺伝子を用いることによってバイオマス由来炭素原料からアジピン酸を良好な収率で生産できることについては実証されていない。
特許第５９５１９９０号明細書 特表２０１１－５１２８６８号公報 国際公開第２０２０／２１９８５９号 国際公開第１９９５／００７９９６号 国際公開第２０１０／１０４３９１号 特開２０１１－５１５１１１号公報
Ｋａｌｌｓｃｈｅｕｅｒ，　Ｎｉｃｏｌａｉ，　ｅｔ　ａｌ．　"Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｄｉｐａｔｅ　ｗｉｔｈ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｂｙ　ｒｅｖｅｒｓａｌ　ｏｆ　β－ｏｘｉｄａｔｉｏｎ．"　Ａｐｐｌｉｅｄ　ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１０１．６　（２０１７）：　２３７１－２３８２．
　本発明の目的は、２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡ還元酵素活性を有する組換え微生物、及び、Ｃ６化合物の効率的な製造方法を提供することにある。
　本発明のさらなる目的は、アジピン酸またはアジピン酸誘導体を生産することのできる組換え微生物、及び、アジピン酸またはアジピン酸誘導体の製造方法を提供することにある。
　本発明者らは上記従来技術の課題を解決するために鋭意検討を行った結果、宿主微生物において、外来性の特定の酵素を発現させることで、２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡ還元酵素活性の良好な組換え微生物を取得できること、さらには本組換え微生物を培養することでＣ６化合物を効率的に生産できることを見出し、本発明をなすに至った。
　すなわち、本発明は以下を提供する。
［１］２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡを還元してアジピルＣｏＡに変換する酵素活性を有するタンパク質をコードする外来性遺伝子を含む組換え微生物であって、
　前記外来性遺伝子が、
　（ｉ）配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６に示すアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
　（ｉｉ）配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６に示すアミノ酸配列に対して１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
　（ｉｉｉ）配列番号５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４または６５に示すポリヌクレオチド配列と８０％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡ、
　（ｉｖ）配列番号５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４または６５に示すポリヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列に対して１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
　（ｖ）配列番号５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４または６５に示すポリヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡと緊縮条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、または
　（ｖｉ）配列番号５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４または６５に示すポリヌクレオチド配列の縮重異性体からなるＤＮＡ
である、組換え微生物；
［２］前記外来性遺伝子が、
　（ｘｉ）配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、または、
　（ｘｉｉｉ）配列番号５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４または６５に示すポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡ
である、［１］に記載の組換え微生物；
［３］前記外来性遺伝子が、Ｃａｎｄｉｄａ　ａｕｒｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ｐｉｃｈｉａ　ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｔｈｅｌｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｈｉｅｌａｖｉｏｉｄｅｓ　ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ、Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｏｄｏ
ｓｐｏｒａ　ａｎｓｅｒｉｎａ、Ｐｕｒｐｕｒｅｏｃｉｌｌｉｕｍ　ｌｉｌａｃｉｎｕｍおよびＰｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ　ｔｅｒｅｓから選択される少なくとも１つに由来する、［１］または［２］に記載の組換え微生物；
［４］前記組換え微生物が、Ｃ６化合物の生産経路を有し、
　前記Ｃ６化合物が、アジピン酸、ヘキサメチレンジアミン、１，６－ヘキサンジオール、６－アミノヘキサン酸、６－アミノ－１－ヘキサノールおよび６－ヒドロキシヘキサン酸からなる群から選択される少なくとも一つである、［１］～［３］のいずれか１項に記載の組換え微生物；
［５］前記組換え微生物が、エスケリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）属、アルカリハロバチルス（Ａｌｋａｌｉｈａｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、カンジタ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、またはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属する、［１］～［４］のいずれか１項に記載の組換え微生物；
［６］前記組換え微生物が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）である、［１］～［５］のいずれか１項に記載の組換え微生物；
［７］・３－オキソアジピルＣｏＡチオラーゼをコードする遺伝子、
　・３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、
　・３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼをコードする遺伝子、
　・カルボン酸レダクターゼをコードする遺伝子、
　・アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、および
　・トランスアミナーゼ（アミノトランスフェラーゼ）をコードする遺伝子
からなる群より選択される少なくとも１つをさらに含む、［１］～［６］のいずれか１項に記載の組換え微生物；
［８］［１］～［７］のいずれか１項に記載の組換え微生物を培養する培養工程を含む、Ｃ６化合物の製造方法であって、
　前記Ｃ６化合物が、アジピン酸、ヘキサメチレンジアミン、１，６－ヘキサンジオール、６－アミノヘキサン酸、６－アミノ－１－ヘキサノールおよび６－ヒドロキシヘキサン酸からなる群から選択される少なくとも一つである、製造方法；
［９］（ａ）２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡを還元してアジピルＣｏＡに変換する酵素活性を有し、
　（ｂ）以下：
　（ｉ）配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６に示すアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、
　（ｉｉ）配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６に示すアミノ酸配列に対して１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる、
　（ｉｉｉ）配列番号５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４または６５に示すポリヌクレオチド配列と８０％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡによってコードされる、
　（ｉｖ）配列番号５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４または６５に示すポリヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列に対して１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる、
　（ｖ）配列番号５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４または６５に示すポリヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡと緊縮条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされる、および
　（ｖｉ）配列番号５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４または６５に示すポリヌクレオチド配列の縮重異性体からなるＤＮＡによってコードされる
のいずれかである、組換えタンパク質；
［１０］（ｘｉ）配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６に示すアミノ酸配列からなるか、または、
　（ｘｉｉｉ）配列番号５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４または６５に示すポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡによってコードされる、組換えタンパク質；
［１１］［９］または［１０］に記載の組換えタンパク質を用いることを含む、Ｃ６化合物の製造方法。
　さらに、本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、新たに自然界より単離された微生物であるバークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株（受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３３３４）が有する所定の酵素を発現させた遺伝子組換え微生物物を培養することで効率的にアジピン酸類を生産できることを見出し、本発明に至った。
　すなわち、本発明は、さらに以下を提供する：
［１２］３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼをコードする外来性遺伝子および２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼをコードする外来性遺伝子のうちの少なくとも１つを含む、組換え微生物；
［１３］前記３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼおよび２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼの少なくとも１つが、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｐ．）ＬＥＢＰ－３株（受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３３３４）に由来する、［１２］に記載の組換え微生物；
［１４］前記３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼが、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、
　（１ａ）配列番号１６８に示す塩基配列からなるヌクレオチドおよび配列番号１６９に示す塩基配列からなるヌクレオチド、または
　（１ｂ）配列番号１６８に示す塩基配列を含むヌクレオチドおよび配列番号１６９に示す塩基配列を含むヌクレオチド
をプライマーとして使用したＰＣＲ増幅物と配列同一性が８０％以上、８５％以上、８８％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上であるＤＮＡにコードされ、
　当該ＤＮＡは、６２６～９４０ｂｐを有する、［１２］または［１３］に記載の組換え微生物；
［１５］前記２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼが、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、
　（２ａ）配列番号１７０に示す塩基配列からなるヌクレオチドおよび配列番号１７１に示す塩基配列からなるヌクレオチド、または
　（２ｂ）配列番号１７０に示す塩基配列を含むヌクレオチドおよび配列番号１７１に示す塩基配列を含むヌクレオチド
をプライマーとして使用したＰＣＲ増幅物と配列同一性が８０％以上、８５％以上、８８％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上であるＤＮＡにコードされ、
　当該ＤＮＡは、９２４～１３８６ｂｐを有する、［１２］～［１４］のいずれか１項に記載の組換え微生物；
［１６］前記３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼが、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、
　（１ａ）配列番号１６８に示す塩基配列からなるヌクレオチドおよび配列番号１６９に示す塩基配列からなるヌクレオチド、または
　（１ｂ）配列番号１６８に示す塩基配列を含むヌクレオチドおよび配列番号１６９に示す塩基配列を含むヌクレオチド
をプライマーとして使用したＰＣＲ増幅物であるＤＮＡにコードされ、
　当該ＤＮＡは、７８３または７８４ｂｐを有する、［１２］または［１３］に記載の組換え微生物；
［１７］前記２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼが、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、
　（２ａ）配列番号１７０に示す塩基配列からなるヌクレオチドおよび配列番号１７１に示す塩基配列からなるヌクレオチド、または
　（２ｂ）配列番号１７０に示す塩基配列を含むヌクレオチドおよび配列番号１７１に示す塩基配列を含むヌクレオチド
をプライマーとして使用したＰＣＲ増幅物であるＤＮＡにコードされ、
　当該ＤＮＡは、１１５５または１１５６ｂｐを有する、［１２］～［１４］のいずれか１項に記載の組換え微生物；
［１８］上記組換え微生物が、エッセリシア属、コリネバクテリウム属、バチルス属、アシネトバクター属、バークホルデリア属、シュードモナス属、クロストリジウム属、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、ヤロウィア属、カンジタ属、ピキア属およびアスペルギルス属からなる群より選択される属に属する、［１２］～［１７］のいずれか１項に記載の組換え微生物；
［１９］アジピン酸生産経路を有する、［１２］～［１８］のいずれか一項に記載の組換え微生物；
［２０］ヘキサメチレンジアミン生産経路を有する、［１２］～［１９］のいずれか一項に記載の組換え微生物；
［２１］１，６－ヘキサンジオール生産経路を有する、［１２］～［１９］のいずれか一項に記載の組換え微生物；
［２２］６－アミノ－１－ヘキサノール生産経路を有する、［１２］～［１９］のいずれか一項に記載の組換え微生物；
［２３］［１２］～［１８］のいずれか１項に記載の組換え微生物を培養する培養工程を含む、目的化合物の製造方法であって、
　前記目的化合物が、アジピン酸、アジピン酸誘導体、ヘキサメチレンジアミン、１，６－ヘキサンジオールおよび６－アミノ－１－ヘキサノールからなる群より選択され、
　前記アジピン酸誘導体が、オキソアジピン酸、レブリン酸、３－ヒドロキシアジピン酸および２，３－デヒドロアジピン酸からなる群より選択される、製造方法；
［２４］［１９］に記載の組換え微生物を培養する培養工程を含む、アジピン酸の製造方法；
［２５］［２０］に記載の組換え微生物を培養する培養工程を含む、ヘキサメチレンジアミンの製造方法；
［２６］［２１］に記載の組換え微生物を培養する培養工程を含む、１，６－ヘキサンジオールの製造方法；
［２７］［２２］に記載の組換え微生物を培養する培養工程を含む、６－アミノ－１－ヘキサノールの製造方法；
［２８］（Ａ－１）バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、
　　（ａ１）配列番号１６８に示す塩基配列からなるヌクレオチドおよび配列番号１６９に示す塩基配列からなるヌクレオチド、または
　　（ａ２）配列番号１６８に示す塩基配列を含むヌクレオチドおよび配列番号１６９に示す塩基配列を含むヌクレオチド
をプライマーとして使用したＰＣＲ増幅物と配列同一性が８０％以上、８５％以上、８８％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上であるＤＮＡにコードされる組換えポリペプチドであって、
　３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼ活性を有し、
　前記ＤＮＡは、６２６～９４０ｂｐを有する、組換えポリペプチド；
　（Ａ－２）バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、
　　（ａ１）配列番号１６８に示す塩基配列からなるヌクレオチドおよび配列番号１６９に示す塩基配列からなるヌクレオチド、または
　　（ａ２）配列番号１６８に示す塩基配列を含むヌクレオチドおよび配列番号１６９に示す塩基配列を含むヌクレオチド
をプライマーとして使用したＰＣＲ増幅物であるＤＮＡによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列に対して１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる組換えポリペプチドであって、
　３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼ活性を有し、
　前記ＤＮＡは、６２６～９４０ｂｐを有する、組換えポリペプチド；
または
　（Ａ－３）バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、
　　（ａ１）配列番号１６８に示す塩基配列からなるヌクレオチドおよび配列番号１６９に示す塩基配列からなるヌクレオチド、または
　　（ａ２）配列番号１６８に示す塩基配列を含むヌクレオチドおよび配列番号１６９に示す塩基配列を含むヌクレオチド
をプライマーとして使用したＰＣＲ増幅物の縮重異性体からなるＤＮＡにコードされる組換えポリペプチドであって、
　３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼ活性を有し、
　前記ＤＮＡは、６２６～９４０ｂｐを有する、組換えポリペプチド；
［２９］（Ｂ－１）バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、
　　（ｂ１）配列番号１７０に示す塩基配列からなるヌクレオチドおよび配列番号１７１に示す塩基配列からなるヌクレオチド、または
　　（ｂ２）配列番号１７０に示す塩基配列を含むヌクレオチドおよび配列番号１７１に示す塩基配列を含むヌクレオチド
をプライマーとして使用したＰＣＲ増幅物と配列同一性が８０％以上、８５％以上、８８％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上であるＤＮＡにコードされる組換えポリペプチドであって、
　２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼ活性を有し、
　前記ＤＮＡは、９２４～１３８６ｂｐを有する、組換えポリペプチド；
　（Ｂ－２）バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、
　　（ｂ１）配列番号１７０に示す塩基配列からなるヌクレオチドおよび配列番号１７１に示す塩基配列からなるヌクレオチド、または
　　（ｂ２）配列番号１７０に示す塩基配列を含むヌクレオチドおよび配列番号１７１に示す塩基配列を含むヌクレオチド
をプライマーとして使用したＰＣＲ増幅物であるＤＮＡによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列に対して１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる組換えポリペプチドであって、
　２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼ活性を有し、
　前記ＤＮＡは、９２４～１３８６ｂｐを有する、組換えポリペプチド；
または
　（Ｂ－３）バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、
　　（ｂ１）配列番号１７０に示す塩基配列からなるヌクレオチドおよび配列番号１７１に示す塩基配列からなるヌクレオチド、または
　　（ｂ２）配列番号１７０に示す塩基配列を含むヌクレオチドおよび配列番号１７１に示す塩基配列を含むヌクレオチド
をプライマーとして使用したＰＣＲ増幅物の縮重異性体からなるＤＮＡにコードされる組換えポリペプチドであって、
　２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼ活性を有し、
　前記ＤＮＡは、９２４～１３８６ｂｐを有する、組換えポリペプチド。
　本発明により、２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡ還元酵素活性を有する組換え微生物、及び、Ｃ６化合物の製造方法が提供される。
　また、本発明により、アジピン酸またはアジピン酸誘導体を生産することのできる組換え微生物、及び、アジピン酸またはアジピン酸誘導体の製造方法が提供される。
図１は、アセチル－ＣｏＡ及びスクシニル－ＣｏＡから、Ｃ６化合物への生合成経路の例を示す図である。 図２は、各酵素のアミノ酸配列、およびプライマーの塩基配列を示す図である。 図３は、各酵素のアミノ酸配列を示す図である。 図４は、各酵素のアミノ酸配列を示す図である。 図５は、各酵素のアミノ酸配列を示す図である。 図６は、各酵素をコードする塩基配列、および、プライマーの塩基配列を示す図である。 図７は、各酵素をコードする塩基配列、および、プライマーの塩基配列を示す図である。 図８は、各酵素をコードする塩基配列、および、プライマーの塩基配列を示す図である。 図９は、各酵素をコードする塩基配列を示す図である。 図１０は、各酵素をコードする塩基配列を示す図である。 図１１は、各プライマーの塩基配列を示す図である。 図１２は、各酵素をコードする塩基配列、および、各プライマーの塩基配列を示す図である。 図１３は、各プライマーの塩基配列を示す図である。 図１４は、各酵素をコードする塩基配列、および、各プライマーの塩基配列を示す図である。 図１５は、各酵素のアミノ酸配列、各酵素をコードする塩基配列、および、各プライマーの塩基配列を示す図である。 図１６は、本発明に係る組換え微生物が有するアジピン酸、アジピン酸誘導体、ヘキサメチレンジアミン、１，６－ヘキサンジオールおよび６－アミノ－１－ヘキサノール生産経路の例を示す。 図１７は、ＰＣＲにおける増幅対象の遺伝子および用いたプライマーを示す。 図１８は、各酵素のアミノ酸配列を示す。 図１９Ａは、各酵素をコードする塩基配列を示す。 図１９Ｂは、各酵素をコードする塩基配列を示す。 図２０Ａは、ＰＣＲにおける増幅対象および用いたプライマーを示す。 図２０Ｂは、ＰＣＲにおける増幅対象および用いたプライマーを示す。 図２１は、酵素のアミノ酸配列を示す。 図２２Ａは、酵素のアミノ酸配列を示す。 図２２Ｂは、酵素のアミノ酸配列を示す。 図２２Ｃは、酵素のアミノ酸配列を示す。 図２２Ｄは、酵素のアミノ酸配列を示す。 図２２Ｅは、酵素のアミノ酸配列を示す。 図２３Ａは、酵素のアミノ酸配列を示す。 図２３Ｂは、酵素のアミノ酸配列を示す。 図２３Ｃは、酵素のアミノ酸配列を示す。 図２３Ｄは、酵素のアミノ酸配列を示す。 図２４Ａは、酵素のアミノ酸配列を示す。 図２４Ｂは、酵素のアミノ酸配列を示す。 図２４Ｃは、酵素のアミノ酸配列を示す。 図２４Ｄは、酵素のアミノ酸配列を示す。 図２４Ｅは、酵素のアミノ酸配列を示す。 図２５は、酵素のアミノ酸配列を示す。
　以下に本発明の実施形態について詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。また、本明細書に記述されているＤＮＡの取得、ベクターの調製および形質転換等の遺伝子操作は、特に明記しない限り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　４ｔｈ　Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　２０１２）、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、および、遺伝子工学実験ノート（羊土社　田村隆明）等公知の文献に記載されている方法により行うことができる。本明細書において特に断りのない限りヌクレオチド配列は５’方向から３’方向に向けて記載される。本明細書において、「ポリペプチド」および「タンパク質」の語は、互換可能に使用される。
　本明細書において、「～」を用いて示された数値範囲は、「～」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。本明細書に段階的に記載されている数値範囲において、ある段階の数値範囲の上限値又は下限値は、他の段階の数値範囲の上限値又は下限値と任意に組み合わせることができる。
　本明細書において、「内因」または「内因性」という用語は、言及している遺伝子組換えによる改変がなされていない宿主微生物が、言及している遺伝子またはそれによりコードされるタンパク質（典型的には酵素）を、当該宿主細胞内で優位な生化学的反応を進行させ得る程度に機能的に発現しているかどうかに関わらず、宿主微生物が有していることを意味するために用いられる。
　本明細書において、「外来」または「外来性」という用語は、遺伝子組換え前の宿主微生物が本発明により導入されるべき遺伝子を有していない場合、その遺伝子による酵素を実質的に発現していない場合、及びその遺伝子もしくは異なる遺伝子により当該酵素のアミノ酸配列をコードしているが、遺伝子組換え後に匹敵する内因性酵素活性を発現しない場合において、本発明に基づく遺伝子または核酸配列を宿主に導入することを意味するために用いられる。
＜１＞発明Ａ：組換え微生物及びＣ６化合物の製造方法
　本発明にかかる組換え微生物は、２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡを還元してアジピルＣｏＡに変換する酵素活性を有するタンパク質をコードする外来性遺伝子を含む。２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡを還元してアジピルＣｏＡに変換する反応は、図１のステップＤに示される。「２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡを還元してアジピルＣｏＡに変換する酵素活性を有するタンパク質」は、「２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼ」とも称される。また、２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡを還元してアジピルＣｏＡに変換する酵素活性は、「２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼ活性」または「２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼ酵素活性」とも称され、これらの語は互換可能に用いられる。
　本発明にかかる組換え微生物に含まれる外来性遺伝子は、以下から選択される：
　（ｉ）配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６に示すアミノ酸配列と８０％以上、８５％以上、８８％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
　（ｉｉ）配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６に示すアミノ酸配列に対して１～１０個、１～７個、１～５個または１～３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
　（ｉｉｉ）配列番号５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４または６５に示すポリヌクレオチド配列と８０％以上、８５％以上、８８％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡ、
　（ｉｖ）配列番号５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４または６５に示すポリヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列に対して１～１０個、１～７個、１～５個または１～３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
　（ｖ）配列番号５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４または６５に示すポリヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡと緊縮条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、
　（ｖｉ）配列番号５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４または６５に示すポリヌクレオチド配列の縮重異性体からなるＤＮＡ。
　本発明にかかる組換え微生物に含まれる外来性遺伝子は、好ましくは以下から選択される：
　（ｉ）配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６に示すアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
　（ｉｉ）配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６に示すアミノ酸配列に対して１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
　（ｉｉｉ）配列番号５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４または６５に示すポリヌクレオチド配列と８０％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡ、
　（ｉｖ）配列番号５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４または６５に示すポリヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列に対して１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
　（ｖ）配列番号５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４または６５に示すポリヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡと緊縮条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、
　（ｖｉ）配列番号５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４または６５に示すポリヌクレオチド配列の縮重異性体からなるＤＮＡ。
　本発明にかかる組換え微生物に含まれる外来性遺伝子は、より好ましくは、
　（ｘｉ）配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、または、
　（ｘｉｉｉ）配列番号５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４または６５に示すポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡ
である。
　上記外来性遺伝子は、例えば、Ｃａｎｄｉｄａ　ａｕｒｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ｐｉｃｈｉａ　ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｔｈｅｌｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｈｉｅｌａｖｉｏｉｄｅｓ　ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ、Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ　ａｎｓｅｒｉｎａ、Ｐｕｒｐｕｒｅｏｃｉｌｌｉｕｍ　ｌｉｌａｃｉｎｕｍおよびＰｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ　ｔｅｒｅｓから選択される少なくとも１つに由来する。
　上記外来性遺伝子を含むことにより、組換え微生物は、良好な２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡ還元酵素活性を有する。かかる酵素活性を有する組換え微生物を用いることにより、目的化合物を製造することができる。目的化合物としては、例えばＣ６化合物が挙げられる。
　本明細書中において、「Ｃ６化合物」には、
　・アジピン酸（ＣＡＳ　Ｎｏ．１２４－０４－９）、
　・ヘキサメチレンジアミン（ＣＡＳ　Ｎｏ．１２４－０９－４）、
　・１，６－ヘキサンジオール（ＣＡＳ　Ｎｏ．６２９－１１－８）、
　・６－アミノヘキサン酸（ＣＡＳ　Ｎｏ．６０－３２－２）、
　・６－アミノ－１－ヘキサノール（ＣＡＳ　Ｎｏ．４０４８－３３－３）、及び
　・６－ヒドロキシヘキサン酸（ＣＡＳ　Ｎｏ．１１９１－２５－９）
が包含され、「Ｃ６化合物」とは、これら化合物からなる群から選択される１または複数の化合物をいう。
　本明細書中における「Ｃ６化合物」は、任意の塩形態を含めた中性または電離形態を取り得ること、および、本形態がｐＨに依存することは当業者により理解される。
　本発明の微生物は、上記のとおり、外来性の酵素遺伝子を導入した遺伝子組換え微生物である。「遺伝子組換え微生物」は、単に「組換え微生物」とも称する。
　本発明に関連して、目的の外来性遺伝子が導入される宿主微生物は特に限定されず、原核生物および真核生物のいずれであってもよい。既に単離保存されているもの、新たに天然から分離したものおよび遺伝子改変をされたものから任意に選択することができる。宿主微生物は、例えば、エスケリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）属、アルカリハロバチルス（Ａｌｋａｌｉｈａｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、カンジタ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、またはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属する。宿主微生物は、好ましくは、エスケリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属し、より好ましくは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）である。
　したがって、上記宿主微生物に外来性遺伝子を導入した本発明にかかる組換え微生物は、例えば、エスケリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）属、アルカリハロバチルス（Ａｌｋａｌｉｈａｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、カンジタ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、またはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属する。本発明にかかる組換え微生物は、好ましくは、エスケリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属し、より好ましくは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）である。
　本明細書において、ある化合物に関し、「生産経路を有する」とは、本発明にかかる遺伝子組換え微生物が、その化合物の生産経路の各反応段階が進行するために十分な量の酵素を発現し、その化合物を生合成可能であることを意味する。本発明の組換え微生物は、当該化合物を生産する能力を本来有する宿主微生物を用いたものであってもよく、本来は当該化合物を生産する能力を有さない宿主微生物に対して、その化合物の生産能を有するように改変を行ったものであってもよい。
　本明細書において、「由来する」とは、遺伝子またはそれによりコードされるタンパク質（典型的には酵素）が、言及する特定の生物種が内因的に有しているものであることを意味する。
　本発明の遺伝子組換え微生物は、２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡを還元してアジピルＣｏＡに変換する酵素活性（すなわち、２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼ活性）を有するタンパク質をコードする外来性遺伝子を含んでいることにより、反応が進行するために十分な量の酵素（すなわち、２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼ）を発現する。本酵素は、図１のステップＤの反応に関与する。
　また、Ｃ６化合物生産経路の反応段階を触媒する酵素をさらに発現することで、Ｃ６化合物生産経路を有する遺伝子組換え微生物となり得る。
　一態様において、本発明にかかる組換え微生物は、
　・３－オキソアジピルＣｏＡチオラーゼをコードする遺伝子、
　・３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、
　・３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼをコードする遺伝子、
　・リン酸アジピルトランスフェラーゼをコードする遺伝子とアジピン酸キナーゼをコードする遺伝子との組み合わせ、
　・アジピル－ＣｏＡヒドロラーゼをコードする遺伝子、
　・アジピン酸　ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子、
　・デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、
　・カルボン酸レダクターゼをコードする遺伝子、
　・トランスアミナーゼ（アミノトランスフェラーゼ）をコードする遺伝子
　・アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、および、
　・ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子、
　・酸チオールリガーゼをコードする遺伝子、
からなる群より選択される少なくとも１つをさらに含む。
　・３－オキソアジピルＣｏＡチオラーゼは、図１のステップＡの反応を、
　・３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドロゲナーゼは、図１のステップＢの反応を、
　・３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼは、図１のステップＣの反応を、
　・リン酸アジピルトランスフェラーゼとアジピン酸キナーゼとの組み合わせ、アジピル－ＣｏＡヒドロラーゼ、アジピン酸　ＣｏＡトランスフェラーゼは、図１のステップＥの反応を、
　・デヒドロゲナーゼは、図１のステップＦ、ＵおよびＶの少なくとも１つの反応を、
　・カルボン酸レダクターゼは、図１のステップＧ、Ｉ、ＫおよびＮの少なくとも１つの反応を、
　・トランスアミナーゼ（アミノトランスフェラーゼ）は、図１のステップＪ、Ｍ、ＰおよびＲの少なくとも１つの反応を、
　・アルコールデヒドロゲナーゼは、図１のステップＨ、Ｌ、ＯおよびＱの少なくとも１つの反応を、
　・ＣｏＡトランスフェラーゼまたは酸チオールリガーゼは、ステップＳおよびＴの少なくとも１つの反応を
触媒する。
　好ましい一態様において、本発明にかかる組換え微生物は、
　・３－オキソアジピルＣｏＡチオラーゼをコードする遺伝子、
　・３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、
　・３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼをコードする遺伝子、
　・カルボン酸レダクターゼをコードする遺伝子、
　・アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、および
　・トランスアミナーゼ（アミノトランスフェラーゼ）をコードする遺伝子
からなる群より選択される少なくとも１つをさらに含む。
　なお、本発明の遺伝子組換え微生物が、外来遺伝子の導入によらずとも、Ｃ６化合物生産経路の反応段階を触媒する十分な量の酵素を発現する場合は、内因遺伝子にコードされる酵素によって反応が進行してもよい。
　本発明にかかる遺伝子組換え微生物が有しうるＣ６化合物生産経路の一例を図１に示す。以下、各反応段階を触媒する酵素について図１を参照しながら説明する。
　図１のステップＡでは、スクシニル－ＣｏＡとアセチル－ＣｏＡが縮合し、３－オキソアジピル－ＣｏＡへと変換される。本変換を触媒し得る酵素の例としては、β－ケトチオラーゼが挙げられる。更には、例えば、ＥＣ　２．３．１．９（アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ）、ＥＣ　２．３．１．１６（３－ケトアシル－ＣｏＡチオラーゼ）およびＥＣ　２．３．１．１７４（３－オキソアジピル－ＣｏＡチオラーゼ）などの群に分類される酵素も、本変換に対して活性を有し得る酵素として例示することができる。本変換で使用され得る酵素は、本変換に対する活性を有するものであれば限定されないが、例えば、スクシニルＣｏＡ：アセチルＣｏＡアシルトランスフェラーゼ、および、３－オキソアジピルＣｏＡチオラーゼが挙げられる。一態様において、配列番号１に記載されるアミノ酸配列からなる大腸菌由来のＰａａＪが使用される。
　図１のステップＢでは、３－オキソアジピル－ＣｏＡが、３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡへと変換される。本変換を触媒し得る酵素の例としては、ＥＣ　１．１．１の群に分類されるオキシドレダクターゼが挙げられる。例えば、ＥＣ　１．１．１．３５（３－ヒドロキシアシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ）や、ＥＣ　１．１．１．３６（アセトアセチル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ）、ＥＣ　１．１．１．１５７（３－ヒドロキシブタノイル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ）、ＥＣ　１．１．１．２１１（長鎖３－ヒドロキシアシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ）、ＥＣ　１．１．１．２５９（３－ヒドロキシピメロイル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ）といった群に分類される酵素は、本変換に対して活性を有し得る酵素として例示することができる。本発明で使用され得る酵素は、本変換に対する活性を有するものであれば限定されないが、例えば、３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドロゲナーゼである。一態様において、配列番号２に記載されるアミノ酸配列からなる大腸菌由来のＰａａＨが使用される。
　図１のステップＣでは、３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡが、２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡへと変換される。本変換を触媒し得る酵素の例としては、ＥＣ　４．２．１の群に分類されるヒドロリアーゼが挙げられる。例えば、ＥＣ　４．２．１．１７（エノイル－ＣｏＡヒドラターゼ）や、ＥＣ　４．２．１．５５（３－ヒドロキシブタノイル－ＣｏＡデヒドラターゼ）、ＥＣ　４．２．１．７４（長鎖エノイル－ＣｏＡヒドラターゼ）といった群に分類される酵素は、本変換に対して活性を有し得る酵素として例示することができる。本発明で使用され得る酵素は、本変換に対する活性を有するものであれば限定されないが、例えば、３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼである。一態様において、配列番号３に記載されるアミノ酸配列からなる大腸菌由来のＰａａＦが使用される。また、別の態様として、当該酵素としては、配列番号４に示すヌクレオチドおよび配列番号４６に示すヌクレオチドをプライマーとして使用した、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ増幅物の塩基配列（７８３ｂｐ）にコードされる３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼＰａａＦ（Ｌ３）が使用される。Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｐ．ＬＥＢＰ－３株（以下、「Ｌ３株」とも略称する。）は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（住所：千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２２号室）に２０２０年１２月４日に寄託申請し（受領番号：ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３３３４）、「受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３３３４」として国際寄託されている。
　ここで、ＰＣＲ増幅物の調製に用いるＤＮＡポリメラーゼとしては当該分野で既知のものが用いられ、例えば、Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ、ホットスタート調整されたＤＮＡポリメラーゼ、ポリメラーゼ活性とは別に３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を有するプルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼ等が挙げられるが、これらには限定されない。ＰＣＲ増幅物の調製条件の好ましい一態様において、特定のヌクレオチドを１μＭずつ、フォワードプライマーおよびリバースプライマーとして用い、且つ、酵素としてＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　Ｍａｘ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（製品名、タカラバイオ製）を用いて、２５μＬ液の量で熱処理９８℃１０秒、アニーリング５５℃１５秒、伸長７２℃５秒／ｋｂの条件での処理を３０サイクル実施することで調製される。
　図１のステップＤでは、２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡが、アジピル－ＣｏＡへと変換される。本変換を触媒し得る酵素の例としては、ＥＣ　１．３．１の群に分類されるオキシドレダクターゼが挙げられる。例えば、ＥＣ　１．３．１．８（アシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋））や、ＥＣ　１．３．１．９（エノイル－ＡＣＰレダクターゼ（ＮＡＤＨ））、ＥＣ　１．３．１．３８（トランス－２－エノイル－ＣｏＡレダクターゼ（ＮＡＤＰ＋））、ＥＣ　１．３．１．４４（トランス－２－エノイル－ＣｏＡレダクターゼ（ＮＡＤ＋））、ＥＣ　１．３．１．８６（クロトニル－ＣｏＡレダクターゼ）、ＥＣ　１．３．１．９３（長鎖アシル－ＣｏＡレダクターゼ）、ＥＣ　１．３．１．１０４（エノイル－ＡＣＰレダクターゼ（ＮＡＤＰＨ））といった群に分類される酵素は、本変換に対して活性を有し得る酵素として例示することができる。本発明では、ステップＤの変換に、先述の２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼが使用される。
　本発明で使用される２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼは、例えば、以下の生物種に由来する酵素である：Ｃａｎｄｉｄａ　ａｕｒｉｓ（配列番号８）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｍａｒｘｉａｎｕｓ（配列番号９）、Ｐｉｃｈｉａ　ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ（配列番号１０）、Ｔｈｅｒｍｏｔｈｅｌｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（配列番号１１）、Ｔｈｅｒｍｏｔｈｉｅｌａｖｉｏｉｄｅｓ　ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ（配列番号１２）、Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ（配列番号１３）、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ　ａｎｓｅｒｉｎａ（配列番号１４）、Ｐｕｒｐｕｒｅｏｃｉｌｌｉｕｍ　ｌｉｌａｃｉｎｕｍ（配列番号１５）、Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ　ｔｅｒｅｓ（配列番号１６）。好ましくは配列番号８～１６に記載されるアミノ酸配列からなる酵素の少なくとも１つが使用され、より好ましくは配列番号１１、１２、１３、１４および１６に記載されるアミノ酸配列からなる酵素の少なくとも１つが使用される（図３）。
　図１のステップＥでは、アジピル－ＣｏＡがアジピン酸へと変換される。本変換を触媒し得る酵素の例としては、ＥＣ　３．１．２の群に分類されるチオエステルヒドロラーゼが挙げられる。例えば、ＥＣ　３．１．２．１（アセチル－ＣｏＡヒドロラーゼ）や、ＥＣ　３．１．２．２０（アシル－ＣｏＡヒドロラーゼ）といった群に分類される酵素は、本変換に対して活性を有し得る酵素として例示することができる。本発明で使用され得る酵素は、本変換に対する活性を有するものであれば限定されないが、例えば、アジピル－ＣｏＡヒドロラーゼである。
　また、図１のステップＥの反応を触媒し得る別の酵素の例として、ＥＣ　２．８．３の群に分類されるＣｏＡ－トランスフェラーゼも挙げることができる。例えば、ＥＣ　２．８．３．５（３－オキソ酸　ＣｏＡ－トランスフェラーゼ）や、ＥＣ　２．８．３．６（３－オキソアジピン酸　ＣｏＡ－トランスフェラーゼ）、ＥＣ　２．８．３．１８（スクシニル－ＣｏＡ：アセチル－ＣｏＡ－トランスフェラーゼ）といった群に分類される酵素は、本変換に対して活性を有し得る酵素として例示することができる。本発明で使用され得る酵素は、本変換に対する活性を有するものであれば限定されないが、例えば、アジピン酸　ＣｏＡトランスフェラーゼである。
　さらには、図１のステップＥの反応を触媒し得る別の酵素変換の例として、ＥＣ　２．３．１の群に分類されるアシルトランスフェラーゼによって、アジピル－ＣｏＡのアジピル基をリン酸に転移してアジピルリン酸を生成した後、ＥＣ　２．７．２の群に分類されるホスホトランスフェラーゼによる脱リン酸化を経る経路も例示することができる。例えば、アシルトランスフェラーゼとしては、ＥＣ　２．３．１．８（リン酸アセチルトランスフェラーゼ）や、ＥＣ　２．３．１．１９（リン酸ブチリルトランスフェラーゼ）といった群に分類される酵素は、本変換に対して活性を有し得る酵素として例示することができる。ホスホトランスフェラーゼとしては、ＥＣ　２．７．２．１（酢酸キナーゼ）や、ＥＣ　２．７．２．７（ブタン酸キナーゼ）といった群に分類される酵素は、本変換に対して活性を有し得る酵素として例示することができる。本発明で使用され得る酵素は、本変換に対する活性を有するものであれば限定されないが、例えば、リン酸アジピルトランスフェラーゼおよびアジピン酸キナーゼである。
　図１のステップＦ、ＵおよびＶでは、アシル－ＣｏＡがアルデヒドへと変換される。本変換を触媒し得る酵素の例としては、ＥＣ　１．２．１の群に分類される酵素が挙げられる。例えば、ＥＣ　１．２．１．１０（アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（アセチル化））、ＥＣ　１．２．１．１７（グリオキシル酸デヒドロゲナーゼ（アシル化））、ＥＣ　１．２．１．４２（ヘキサデカナールデヒドロゲナーゼ（アシル化））、ＥＣ　１．２．１．４４（シナモイル－ＣｏＡレダクターゼ（アシル化））、ＥＣ　１．２．１．７５（マロニル－ＣｏＡレダクターゼ（マロン酸セミアルデヒド形成））、ＥＣ　１．２．１．７６（コハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（アシル化））といった群に分類される酵素は、本変換と同様に、ＣｏＡを脱離しアルデヒドを生成する変換反応を触媒することから、本変換に対しても活性を有し得る酵素として例示することができる。本発明で使用され得る酵素は、本変換に対する活性を有するものであれば限定されないが、例えば、配列番号１７に記載されるアミノ酸配列からなるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｋｌｕｙｖｅｒｉ由来のｓｕｃＤが使用される（図４）。
　図１のステップＧ、Ｉ、ＫおよびＮでは、カルボキシル基がアルデヒドへと変換される。本変換を触媒し得る酵素としては、例えば、カルボン酸レダクターゼ（Ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ；ＣＡＲ）が挙げられる。例えば、ＥＣ　１．２．１．３０（カルボン酸レダクターゼ（ＮＡＤＰ＋））、ＥＣ　１．２．１．３１（Ｌ－アミノアジピン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ）、ＥＣ　１．２．１．９５（Ｌ－２－アミノアジピン酸レダクターゼ）、ＥＣ　１．２．９９．６（カルボン酸レダクターゼ）といった群に分類される酵素が、本変換と同様に、カルボン酸からアルデヒドを生成する変換反応を触媒することから、本変換に対しても活性を有し得る酵素として例示することができる。酵素の由来となる生物種の典型的な例としては、Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｉｏｗｅｎｓｉｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａ　ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｆａｒｃｉｎｉｃａ、Ｓｅｇｎｉｌｉｐａｒｕｓ　ｒｕｇｏｓｕｓ、Ｓｅｇｎｉｌｉｐａｒｕｓ　ｒｏｔｕｎｄｕｓ、Ｔｓｕｋａｍｕｒｅｌｌａ　ｐａｕｒｏｍｅｔａｂｏｌａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍａｒｉｎｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｅｏａｕｒｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｂｓｃｅｓｓｕｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｖｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｃｈｅｌｏｎａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ｓｅｒｐｕｌａ　ｌａｃｒｙｍａｎｓ、Ｈｅｔｅｒｏｂａｓｉｄｉｏｎ　ａｎｎｏｓｕｍ、Ｃｏｐｒｉｎｏｐｓｉｓ　ｃｉｎｅｒｅａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｆｌａｖｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｔｅｒｒｅｕｓ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ　ｃｒａｓｓａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが挙げられるが、これらに限定されない。本発明で使用され得る酵素は、本変換に対する活性を有するものであれば限定されないが、例えば、配列番号１８～２２のいずれかに記載されるアミノ酸配列からなる酵素の少なくとも一種が使用されてもよく、好ましくは、配列番号２０に記載されるアミノ酸配列からなるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｂｓｃｅｓｓｕｓ由来の酵素ＭａＣａｒ、配列番号２２に記載されるアミノ酸配列からなるＭａＣａｒの変異体であるＭａＣａｒ（ｍ）の少なくとも一方が使用され、より好ましくは配列番号２２に記載されるアミノ酸配列からなるＭａＣａｒ（ｍ）が使用される（図４）。
　また、カルボン酸レダクターゼは、ホスホパンテテイニル化されることにより活性型のホロ酵素に変換され得る（Ｖｅｎｋｉｔａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２８２，Ｎｏ．１，４７８－４８５（２００７））。ホスホパンテテイニル化はホスホパンテテイニル基転移酵素（Ｐｈｏｓｐｈｏｐａｎｔｅｔｈｅｉｎｙｌ　Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ＰＴ）により触媒される。本反応を触媒し得る酵素としては、例えば、ＥＣ　２．７．８．７に分類される酵素が挙げられる。したがって、本発明の微生物は更に、ホスホパンテテイニル基転移酵素の活性が増大するように改変されていて良い。ホスホパンテテイニル基転移酵素の活性を増大する方法としては、外来のホスホパンテテイニル基転移酵素遺伝子を導入する方法や、内因性のホスホパンテテイニル基転移酵素遺伝子の発現を強化する方法が挙げられるが、これらに限定されない。本発明で使用され得る酵素は、ホスホパンテテイニル基転移活性を有する限り、これらに限定されないが、典型的な酵素としては、例えば、大腸菌のＥｎｔＤや、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓのＳｆｐ、Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｉｏｗｅｎｓｉｓのＮｐｔ（Ｖｅｎｋｉｔａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２８２，Ｎｏ．１，４７８－４８５（２００７））、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＬｙｓ５（Ｅｈｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３８．１９　（１９９９）：　６１７１－６１７７．）が挙げられる。本発明で使用され得る酵素は、本変換に対する活性を有するものであれば限定されないが、例えば、配列番号２３～２６に記載されるアミノ酸配列からなる酵素の少なくともいずれか一種が使用されてもよく、好ましくは、配列番号２４に記載されるアミノ酸配列からなるＮｏｃａｒｄｉａ　ｉｏｗｅｎｓｉｓ由来のＮｏｃａｒｄｉａ　ｉｏｗｅｎｓｉｓのＮｐｔが使用される（図５）。
　図１のステップＪ、Ｍ、ＰおよびＲの変換は、アミノ基転移反応である。この変換を触媒し得る酵素の例としては、ＥＣ　２．６．１の群に分類されるトランスアミナーゼ（アミノトランスフェラーゼ）が挙げられる。例えば、ＥＣ　２．６．１．１９（４－アミノブタン酸－２－オキソグルタル酸トランスアミナーゼ）や、ＥＣ　２．６．１．２９（ジアミントランスアミナーゼ）、ＥＣ　２．６．１．４８（５－アミノ吉草酸トランスアミナーゼ）といった群に分類される酵素は、本変換に対しても活性を有し得る酵素として例示することができる。本発明で使用され得る酵素は、各ステップの変換活性を有するものであれば、特に限定されないが、例えば、カダベリンやスペルミジンをアミノ基転移することが報告されている大腸菌のプトレシンアミノトランスフェラーゼであるＹｇｊＧ（Ｓａｍｓｏｎｏｖａ．，　ｅｔ　ａｌ．，　ＢＭＣ　ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　３．１　（２００３）：　２．）や、シュードモナス属のプトレシンアミノトランスフェラーゼであるＳｐｕＣ（Ｌｕ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　１８４．１４　（２００２）：　３７６５－３７７３．、Ｇａｌｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｇｒｅｅｎ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１９．２　（２０１７）：　３６１－３６６．）、大腸菌のＧＡＢＡアミノトランスフェラーゼＧａｂＴや、ＰｕｕＥが使用されてもよい。さらには、Ｒｕｅｇｅｒｉａ　ｐｏｍｅｒｏｙｉ、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｖｉｏｌａｃｅｕｍ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｉｔｒｅｕｓ、Ｓｐｈａｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｆｉｓｃｈｅｒｉ、Ｖｉｂｒｉｏ　ｆｌｕｖｉａｌｉｓ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｌｏｔｉ等の生物種由来のω－トランスアミナーゼも、１，８－ジアミノオクタンや１，１０－ジアミノデカンなどのジアミン化合物へのアミノ基転移活性を有することが報告されており、本発明で使用されてもよい（Ｓｕｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇｒｅｅｎ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２０．２０　（２０１８）：　４５９１－４５９５．、Ｓａｔｔｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ　Ｃｈｅｍｉｅ　１２４．３６　（２０１２）：　９２９０－９２９３．）。本発明で使用され得る酵素は、本変換に対する活性を有するものであれば限定されないが、例えば、配列番号２７～３１および１５８に記載されるアミノ酸配列からなる酵素の少なくともいずれか一種が使用されてもよい（図５および図１５）。典型的なアミノ基供与体としては、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－アラニンおよびグリシンが挙げられるが、これらには限定されない。
　図１のステップＨ、Ｌ、ＯおよびＱでは、アルデヒドがアルコールに変換される。本変換を触媒し得る酵素の例としては、ＥＣ　１．１．１の群に分類されるオキシドレダクターゼが挙げられる。例えば、ＥＣ　１．１．１．１（アルコールデヒドロゲナーゼ）や、ＥＣ　１．１．１．２（アルコールデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋））、ＥＣ　１．１．１．７１（アルコールデヒドロゲナーゼ［ＮＡＤ（Ｐ）＋］）といった群に分類される酵素は、本変換と同様に、アルデヒドからアルコールへの変換反応を触媒することから、本変換に対しても活性を有し得る酵素として例示することができる。本発明で使用され得る酵素は、本変換に対する活性を有するものであれば限定されないが、例えば、配列番号３２に記載される大腸菌由来のＡｈｒである（図５）。
　図１のステップＳおよびＴの反応では、カルボキシル基にＣｏＡが付加される。本変換を触媒し得る酵素の例としては、ＥＣ　２．８．３の群に分類されるＣｏＡトランスフェラーゼ、ＥＣ　６．２．１の群に分類される酸チオールリガーゼが挙げられる。本発明で使用される酵素は、本変換に対する活性を有するものであれば限定されない。
　本発明に利用できる上記の酵素をコードする遺伝子は、例示された生物以外に由来するものであっても、または人工的に合成したものであってもよく、宿主微生物細胞内で実質的な酵素活性を発現できるものであればよい。
　本発明にかかる組換え微生物は、宿主微生物において、適宜、任意の遺伝子が破壊されたものであってもよい。標的遺伝子の破壊は、当該分野で公知の方法により行われる。
　また、本発明に利用できる上記の酵素のアミノ酸配列、または酵素をコードする遺伝子の塩基配列には、前記宿主微生物細胞で実質的な酵素活性を発現できるものであれば、自然界で発生し得るすべての変異や、人工的に導入された変異及び修飾を有していてよく、例えば、欠失、置換、挿入、付加といった変異が含有され得る。例えば、上記の酵素のアミノ酸配列に対して１又は複数個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個、さらに好ましくは１～７個、さらにより好ましくは１～５個、特に好ましくは１～３個のアミノ酸の欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含んでいてよい。
　さらに、本発明で利用できる上記の酵素をコードする遺伝子の塩基配列には、前記宿主微生物細胞で実質的な酵素活性を発現できるものであれば、相補的な塩基配列を有するＤＮＡと緊縮条件下でハイブリダイズするＤＮＡも利用可能である。「緊縮条件」とは、例えば、「１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃」程度の条件であり、より厳しい条件としては「０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃」程度の条件であり、さらに厳しい条件としては「０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６８℃」程度の条件である。
　加えて、特定のアミノ酸をコードする種々のコドンには余分のコドンが存在することが知られており、そのため本発明においても同一のアミノ酸に最終的に翻訳されることになる代替コドンを利用してよい。つまり、遺伝子コードは縮重しているので、ある特定のアミノ酸をコードするのに複数のコドンを使用でき、そのためアミノ酸配列は任意の１セットの類似のＤＮＡオリゴヌクレオチドでコードされ得る。なお、ほとんどの生物は特定のコドン（最適コドン）のサブセットを優先的に用いることが知られているので（Ｇｅｎｅ、Ｖｏｌ．１０５、ｐｐ．６１－７２、１９９１等）、宿主微生物に応じて「コドン最適化」を行うことは本発明においても有用であり得る。
　したがって、本発明にかかる遺伝子組換え微生物は、酵素活性を発現できることを条件に、上記酵素遺伝子の塩基配列と、例えば８０％以上、８５％以上、８８％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の配列同一性を有する塩基配列を含み得る。あるいは、上記酵素のアミノ酸配列と、例えば８０％以上、８５％以上、８８％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする遺伝子を含み得る。
　なお、本明細書において、参照アミノ酸配列に対する比較アミノ酸配列の「配列同一性」の割合（％）は、これら２つの配列間の同一性が最大となるように配列を整列させ、必要であれば２つの配列の一方または双方にギャップが導入されたときの、参照配列中のアミノ酸残基と同一である、比較配列中のアミノ酸残基の百分率として定義される。このとき、保存的置換は配列同一性の一部として考慮しない。配列同一性は、公に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用することによって決定することができ、例えば、ＢＬＡＳＴ（登録商標。以下、省略。）（Ｂａｓｉｃ　Ｌｏｃａｌ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　Ｓｅａｒｃｈ　Ｔｏｏｌ）等のアライメントサーチツールを用いて決定することができる。当業者は、アラインメントにおいて、比較配列の最大のアラインメントを得るために適切なパラメーターを決定することができる。ヌクレオチド配列の「配列同一性」についても、同様の方法によって決定することができる。
　本発明において、上記のＣ６化合物生合成酵素遺伝子が「発現カセット」として宿主微生物細胞内に導入されることで、より安定的で高レベルの酵素活性を得ることができる。本明細書において、「発現カセット」とは、発現対象の核酸または発現対象の遺伝子に機能的に結合された転写および翻訳をレギュレートする核酸配列を含むヌクレオチドを意味する。典型的に、本発明の発現カセットは、コード配列から５’上流にプロモーター配列、３’下流にターミネーター配列、場合により更なる通常の調節エレメントを機能的に結合された状態で含み、そのような場合に、発現対象の核酸または発現対象の遺伝子が宿主微生物に導入される。
　プロモーターとは、構成発現型プロモーターであるか誘導発現型プロモーターであるかに拘わらず、ＲＮＡポリメラーゼをＤＮＡに結合させ、ＲＮＡ合成を開始させるＤＮＡ配列と定義される。強いプロモーターとはｍＲＮＡ合成を高頻度で開始させるプロモーターであり、本発明においても好適に使用される。大腸菌ではｌａｃ系、ｔｒｐ系、ｔａｃまたはｔｒｃ系、λファージの主要オペレーター及びプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、解糖系酵素（例えば、３－ホスホグリセレートキナーゼ、グリセルアルデヒド‐３‐リン酸脱水素酵素）、グルタミン酸デカルボキシラーゼＡ、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼに対するプロモーター、Ｔ７ファージ由来ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター領域等が利用可能である。コリネ菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ではＨＣＥ（ｈｉｇｈ－ｌｅｖｅｌ　ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）プロモーター、ｃｓｐＢプロモーター、ｓｏｄＡプロモーター、伸長因子（ＥＦ－Ｔｕ）プロモーターなどが利用可能である。ターミネーターとしては、Ｔ７ターミネーター、ｒｒｎＢＴ１Ｔ２ターミネーター、ｌａｃターミネーターなどが利用可能である。プロモーターおよびターミネーター配列のほかに、他の調節エレメントの例として挙げられ得るのは、選択マーカー、増幅シグナル、複製起点などである。好適な調節配列については、例えば、”Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１８５”、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　（１９９０）に記載されている。
　上記で説明した発現カセットは、例えば、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、ＩＳエレメント、フォスミド、コスミド、又は線状もしくは環状のＤＮＡ等から成るベクターに組み入れて、宿主微生物中に挿入される。プラスミドおよびファージが好ましい。これらのベクターは、宿主微生物中で自律複製されるものでもよいし、また染色体により複製されてもよい。好適なプラスミドは、例えば、大腸菌のｐＬＧ３３８、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＫＣ３０、ｐＲｅｐ４、ｐＨＳ１、ｐＫＫ２２３－３、ｐＤＨＥ１９．２、ｐＨＳ２、ｐＰＬｃ２３６、ｐＭＢＬ２４、ｐＬＧ２００、ｐＵＲ２９０、ｐＩＮ－ＩＩＩ１１３－Ｂ１、λｇｔ１１又はｐＢｄＣＩ；桿菌のｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４又はｐＢＤ２１４；コリネバクテリウム属のｐＳＡ７７又はｐＡＪ６６７などである。バチルス属などの桿菌ではｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４またはｐＢＤ２１４などが挙げられる。これらの他にも使用可能なプラスミド等は、”Ｇｅｎｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ＤＮＡ　ａｎａｌｙｓｉｓ　７ｔｈ　ｅｄｉｔｉｏｎ”、Ｗｉｌｅｙ－Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ（２０１６）に記載されている。ベクターへの発現カセットの導入は、適当な制限酵素による切り出し、クローニング、及びライゲーションを含む慣用の方法によって可能である。各々の発現カセットは、１つのベクター上に配置されてもよく、２つまたはそれ以上のベクターに配置されてもよい。
　上記のようにして本発明の発現カセットを有するベクターが構築された後、該ベクターを宿主微生物に導入する際に適用できる手法は慣用の方法を用いることができる。例えば、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法、接合伝達法、プロトプラスト融合法などが挙げられるが、これらに限定されず、宿主微生物に好適な方法が選択可能である。
　本発明の第二の側面は、先述の組換え微生物を培養する培養工程を含む、目的化合物の製造方法に関する。
　ここで、当該化合物は、好ましくはＣ６化合物である。Ｃ６化合物は、アジピン酸、ヘキサメチレンジアミン、１，６－ヘキサンジオール、６－アミノヘキサン酸、６－アミノ－１－ヘキサノールおよび６－ヒドロキシヘキサン酸からなる群から選択される少なくとも一つである。
　Ｃ６化合物の製造方法には、本発明にかかる遺伝子組換え微生物を培養する培養工程が含まれる。培養工程では、組換え微生物を、炭素源および窒素源を含有する培地で培養することによって、菌体を含む培養物が得られる。本発明の遺伝子組換え微生物は、Ｃ６化合物生産、及び微生物の生育・維持に適した条件下で培養され、好適な培地組成、培養時間、培養条件は当業者により容易に設定できる。
　炭素源としては、Ｄ－グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、オリゴ糖、多糖、でんぷん、セルロース、米ぬか、廃糖蜜、油脂（例えば大豆油、ヒマワリ油、ピーナッツ油、ヤシ油など）、脂肪酸（例えばパルミチン酸、リノール酸、オレイン酸、リノレン酸など）、アルコール（例えばグリセロール、エタノールなど）、有機酸（例えば酢酸、乳酸、コハク酸など）、トウモロコシ分解液、セルロース分解液が挙げられる。好ましくは、Ｄ－グルコース、スクロースまたはグリセロールである。これらの炭素源は、個別にあるいは混合物として使用することができる。
　バイオマス由来の原料を用いて製造されたＣ６化合物は、ＩＳＯ１６６２０－２またはＡＳＴＭ　Ｄ６８６６に規定されるＣａｒｂｏｎ－１４（放射性炭素）分析に基づくバイオベース炭素含有率の測定により、例えば石油、天然ガス、石炭などを由来とする合成原料と明確に区別することができる。
　窒素源としては、含窒素有機化合物（例えば、ペプトン、カザミノ酸、トリプトン、酵母抽出物、肉抽出物、麦芽抽出物、コーンスティープリカー、大豆粉、アミノ酸および尿素など）、または無機化合物（例えば、アンモニア水溶液、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウムなど）が挙げられる。これらの窒素源は、個別にあるいは混合物として使用することが出来る。
　また、培地は、組換え微生物が有用な付加的形質を発現する場合、例えば抗生物質への耐性マーカーを有する場合、対応する抗生物質を含んでいてよい。それにより、培養時の雑菌による汚染リスクが低減される。抗生物質としては、アンピシリンなどのβ－ラクタム系抗生物質、カナマイシンなどのアミノグリコシド系抗生物質、エリスロマイシンなどのマクロライド系抗生物質、テトラサイクリン系抗生物質、クロラムフェニコールなどが挙げられるが、これらに限定されない。
　培養は、バッチ式であっても連続式であってもよい。また、いずれの場合にも、培養の適切な時点で追加の前記炭素源等を補給する形式であってもよい。更に、培養は、好適な温度、酸素濃度、ｐＨ等の条件を制御しながら培養されてもよい。一般的な微生物宿主細胞に由来する形質転換体の好適な培養温度は、通常１５℃～５５℃、好ましくは２５℃～４０℃の範囲である。宿主微生物が好気性の場合、発酵中の適切な酸素濃度を確保するために振盪（フラスコ培養等）、攪拌／通気（ジャー・ファーメンター培養等）を行ってもよい。それらの培養条件は、当業者にとって容易に設定可能である。
　培養工程において、組換え微生物の培養物および／または培養物の抽出物を得ることを含んでもよい。
　本発明にかかる化合物の製造方法は、前記培養物および／または前記培養物の抽出物を、基質化合物と混合して混合液を得る混合工程をさらに含んでもよい。基質化合物は、酵素および目的化合物に応じて適宜選択されてよい。
　本発明にかかる化合物の製造方法は、目的化合物であるＣ６化合物を分離および／または精製する工程を含んでよい。当該分離および／または精製する工程では、任意の手法、例えば、遠心分離、ろ過、膜分離、晶析、抽出、蒸留、吸着、相分離、イオン交換および各種のクロマトグラフィーなどが挙げられるが、これらに限定されない。分離および／または精製工程では、一種類の方法を選択しても良く、また複数の方法を組み合わせても良い。
　本発明の更なる側面は、タンパク質に関する。具体的には、当該タンパク質は、
　（ａ）２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡを還元してアジピルＣｏＡに変換する酵素活性を有し、
　（ｂ）以下：
　（ｉ）配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６に示すアミノ酸配列と８０％以上、８５％以上、８８％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、
　（ｉｉ）配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６に示すアミノ酸配列に対して１～１０個、１～７個、１～５個または１～３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる、
　（ｉｉｉ）配列番号５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４または６５に示すポリヌクレオチド配列と８０％以上、８５％以上、８８％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡによってコードされる、
　（ｉｖ）配列番号５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４または６５に示すポリヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列に対して１～１０個、１～７個、１～５個または１～３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる、
　（ｖ）配列番号５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４または６５に示すポリヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡと緊縮条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされる、および
　（ｖｉ）配列番号５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４または６５に示すポリヌクレオチド配列の縮重異性体からなるＤＮＡによってコードされる
のいずれかである、組換えタンパク質である。
　当該タンパク質は、好ましくは、
　（ａ）２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡを還元してアジピルＣｏＡに変換する酵素活性を有し、
　（ｂ）以下：
　（ｉ）配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６に示すアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、
　（ｉｉ）配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６に示すアミノ酸配列に対して１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる、
　（ｉｉｉ）配列番号５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４または６５に示すポリヌクレオチド配列と８０％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡによってコードされる、
　（ｉｖ）配列番号５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４または６５に示すポリヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列に対して１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる、
　（ｖ）配列番号５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４または６５に示すポリヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡと緊縮条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされる、および
　（ｖｉ）配列番号５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４または６５に示すポリヌクレオチド配列の縮重異性体からなるＤＮＡによってコードされる
のいずれかである、組換えタンパク質である。
　好ましい一態様において、組換えタンパク質は、
　（ｘｉ）配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６に示すアミノ酸配列からなるか、または、
　（ｘｉｉｉ）配列番号５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４または６５に示すポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡによってコードされる。
　本発明のさらに別の側面は、先述のタンパク質を用いることを含む、Ｃ６化合物の製造方法に関する。
　以上説明したとおり、本発明によれば、宿主微生物に前記２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を導入することにより、２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡ還元酵素活性の良好な組換え微生物を得ることができる。また、良好な２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼ活性を有するタンパク質も提供される。
　前記組換え微生物または前記タンパク質を用いることにより、目的のＣ６化合物を効率的に製造できる。また、所望のＣ６化合物に応じて、追加の酵素を用いて変換を行うことにより、種々のＣ６化合物を得ることができる。さらに、本発明にかかる組換え微生物は、良好なＣ６化合物生産能を有するので、工業的規模での目的化合物の生産に利用できることが期待される。
＜２＞発明Ｂ：組換え微生物及びアジピン酸又はその誘導体の製造方法
　本発明にかかる組換え微生物は、アジピン酸（Ａｄｉｐｉｃ　ａｃｉｄ；ＡＤＡ）（ＣＡＳ　Ｎｏ．１２４－０４－９）またはアジピン酸誘導体を効率よく生産することができるよう、宿主微生物に対して遺伝子の改変が行われた微生物である。
　本明細書において、「アジピン酸誘導体」は、炭素数３～５の脂肪族炭化水素基と、１または複数のカルボキシル基とを有する、脂肪族カルボン酸である。アジピン酸誘導体の有する脂肪族炭化水素基は、飽和または不飽和である。脂肪族炭化水素基において、炭素は、例えば、ヒドロキシル基、カルボキシル基、ケトン基、アミノ基等の置換基によって置換されていても良い。「アジピン酸誘導体」の有する脂肪族炭化水素基の炭素数は、好ましくは、３または４である。「アジピン酸誘導体」の有するカルボキシル基は、好ましくは、１または２である。「アジピン酸誘導体」の具体例としては、炭素数４の脂肪族炭化水素基と２つのカルボン酸とを有する３－オキソアジピン酸（３－Ｏｘｏａｄｉｐｉｃ　ａｃｉｄ；３－ＯＡ）、炭素数３の脂肪族炭化水素基と１つのカルボン酸とを有するレブリン酸（Ｌｅｖｕｌｉｎｉｃ　ａｃｉｄ；ＬＥＶ）、炭素数４の脂肪族炭化水素基と２つのカルボン酸とを有する３－ヒドロキシアジピン酸（３－Ｈｙｄｒｏｘｙａｄｉｐｉｃ　ａｃｉｄ；３ＨＡ）および炭素数４の脂肪族炭化水素基と２つのカルボン酸とを有する２，３－デヒドロアジピン酸（２，３－Ｄｅｈｙｄｒｏａｄｉｐｉｃ　ａｃｉｄ；２３ＤＡ）が挙げられる（図１６参照）。
　本明細書中におけるアジピン酸およびアジピン酸誘導体は、任意の塩形態を含めた中性または電離形態を取り得ることや、本形態がｐＨに依存することは当業者により理解される。したがって、「アジピン酸」および「アジピン酸誘導体」には、遊離酸の形態のほか、任意の塩形態および電離形態が包含される。本明細書において、アジピン酸およびアジピン酸誘導体をまとめて、「アジピン酸類」または「アジピン酸類縁体」と総称することがある。
　本発明にかかる組換え微生物によって生産されたアジピン酸を原料として、６－アミノカプロン酸、ヘキサメチレンジアミン、１，６－ヘキサンジオールおよび６－アミノ－１－ヘキサノールを合成することも可能である。合成方法は化学合成法や酵素や酵素を内在する微生物を利用する生物学的合成法などを問わない。また、アジピン酸を上記化合物に変換するための代謝経路を含む微生物であれば、細胞内でアジピン酸を中間体として使用する原料からの代謝変換も可能である。
　本発明にかかる遺伝子組換え微生物は、具体的に、３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼをコードする外来性遺伝子および２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼをコードする外来性遺伝子のうちの少なくとも１つを含む。このような外来性遺伝子の少なくとも１つを含むことにより、組換え微生物は、アジピン酸生産経路を有することとなり、アジピン酸またはアジピン酸誘導体を製造することができる。本明細書において、「遺伝子組換え微生物」は、単に「組換え微生物」とも称する。
　３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼおよび２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼの少なくとも１つは、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｐ．）ＬＥＢＰ－３株（受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３３３４）に由来する。好ましくは、３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼおよび２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼの両方が、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｐ．）ＬＥＢＰ－３株に由来する。
　３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼをコードする外来性遺伝子および２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼをコードする外来性遺伝子の少なくとも１つは、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｐ．）ＬＥＢＰ－３株（受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３３３４）に由来する。好ましくは、３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼをコードする外来性遺伝子および２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼをコードする外来性遺伝子の両方が、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｐ．）ＬＥＢＰ－３株（受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３３３４）に由来する。
　本発明の遺伝子組換え微生物は、上記酵素をコードする外来遺伝子のうちの少なくとも１つが導入されていればよい。本発明の遺伝子組換え微生物は、好ましくは、アジピン酸生産経路の各反応段階を触媒する酵素をコードする外来遺伝子のうち少なくとも１つが導入され、外来性酵素を発現する。また、本発明の遺伝子組換え微生物が、外来遺伝子の導入によらずとも、アジピン酸生産経路の反応段階を触媒する十分な量の酵素を発現する場合は、内因遺伝子にコードされる酵素によって反応が進行してもよい。
　本発明にかかる組換え微生物は、３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼおよび２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼの少なくとも１つを発現していることが好ましい。本発明にかかる組換え微生物が、これら酵素の少なくとも一方を発現していることにより、アジピン酸生産経路の反応段階が進行し、目的化合物を生産することができる。
　より好ましくは、本発明にかかる組換え微生物は、３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼおよび２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼの双方を発現する。本発明にかかる組換え微生物が、これら酵素を発現していることにより、アジピン酸生産経路の反応段階の各々が進行し、目的化合物を生産することができる。
　さらにより好ましくは、本発明にかかる組換え微生物は、３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼおよび２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼに加えて、オキシドレダクターゼおよび／またはβ－ケトチオラーゼを発現する。本発明にかかる組換え微生物が、これら酵素を発現していることにより、アジピン酸生産経路の反応段階の各々が進行し、目的化合物を効率よく生産することができる（図１６参照）。
　以下、本発明にかかる組換え微生物が含む遺伝子がコードする酵素の各々について詳述する。
　＜３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼ＞
　３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼは、３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡへと変換する反応を触媒する酵素である（図１６のステップＣ）。
　一態様において、３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼは、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、所定のヌクレオチドをプライマーとして使用したＰＣＲ増幅物と配列同一性が６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、８８％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上であるＤＮＡにコードされる。ここで、当該ＤＮＡは、例えば６２６～９４０ｂｐ、好ましくは７４０～８６２ｂｐ、より好ましくは７４３～８２３ｂｐ、さらにより好ましくは７６７～７９９ｂｐ、特により好ましくは７７５～７９１ｂｐ、最も好ましくは７７８～７８８ｂｐを有する。ＰＣＲに用いるプライマーについては後述する。
　好ましい一態様において、３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼは、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｐ．）ＬＥＢＰ－３株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、所定のヌクレオチドをプライマーとして使用したＰＣＲ増幅物であるＤＮＡにコードされる。当該ＤＮＡは、例えば６２６～９４０ｂｐ、好ましくは７４０～８６２ｂｐ、より好ましくは７４３～８２３ｂｐ、さらにより好ましくは７６７～７９９ｂｐ、特により好ましくは７７５～７９１ｂｐ、最も好ましくは７７８～７８８ｂｐを有する。
　更なる態様において、３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼは、以下から選択される：
（Ａ－１）バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、所定のヌクレオチドをプライマーとして使用したＰＣＲ増幅物と配列同一性が６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、８８％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上であるＤＮＡにコードされる組換えポリペプチドであって、
　３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼ活性を有し、
　前記ＤＮＡは、先述の塩基対数（ｂｐ）を有する、組換えポリペプチド；
（Ａ－２）バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、所定のヌクレオチドをプライマーとして使用したＰＣＲ増幅物であるＤＮＡによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列に対して例えば１～１０個、好ましくは１～７個、より好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる組換えポリペプチドであって、
　３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼ活性を有し、
　前記ＤＮＡは、先述の塩基対数（ｂｐ）を有する、組換えポリペプチド；
および
（Ａ－３）バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、所定のヌクレオチドをプライマーとして使用したＰＣＲ増幅物の縮重異性体からなるＤＮＡにコードされる組換えポリペプチドであって、
　３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼ活性を有し、
　前記ＤＮＡは、先述の塩基対数（ｂｐ）を有する、組換えポリペプチド。
　更なる好ましい態様において、３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼは、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、所定のヌクレオチドをプライマーとして使用したＰＣＲ増幅物にコードされる組換えポリペプチドであり、当該増幅物の塩基対数は７８３または７８４ｂｐである。
　３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼに関し、ＰＣＲに用いられるプライマー（フォワードおよびリバース）としては、以下が挙げられる（図１７参照）。
　（１ａ）配列番号１６８に示す塩基配列からなるヌクレオチドおよび配列番号１６９に示す塩基配列からなるヌクレオチド、
　（１ｂ）配列番号１６８に示す塩基配列を含むヌクレオチドおよび配列番号１６９に示す塩基配列を含むヌクレオチド、
　（１ｃ）配列番号１６８に示す塩基配列をコドン最適化した塩基配列からなるヌクレオチドおよび配列番号１６９に示す塩基配列をコドン最適化した塩基配列からなるヌクレオチド、
　（１ｄ）配列番号１６８に示す塩基配列をコドン最適化した塩基配列を含むヌクレオチドおよび配列番号１６９に示す塩基配列をコドン最適化した塩基配列を含むヌクレオチド。
　前記（１ｂ）の「配列番号１６８に示す塩基配列を含むヌクレオチドおよび配列番号１６９に示す塩基配列を含むヌクレオチド」は、それぞれ、「配列番号１６８に示す塩基配列」および「配列番号１６９に示す塩基配列」に加えて、例えば１～２０ｂｐ、好ましくは１～１５ｂｐ、より好ましくは５～１５ｂｐ、さらに好ましくは１０～１５ｂｐがさらに追加されたヌクレオチド長を有する。
　前記（１ｄ）の「配列番号１６８に示す塩基配列をコドン最適化した塩基配列を含むヌクレオチドおよび配列番号１６９に示す塩基配列をコドン最適化した塩基配列を含むヌクレオチド」は、それぞれ、「配列番号１６８に示す塩基配列をコドン最適化した塩基配列」および「配列番号１６９に示す塩基配列をコドン最適化した塩基配列」に加えて、ベクター末端との相同配列を含み、例えば１～２０ｂｐ、好ましくは１～１５ｂｐ、より好ましくは５～１５ｂｐ、さらに好ましくは１０～１５ｂｐがさらに追加されたヌクレオチド長を有する。前記（１ｄ）の「配列番号１６８に示す塩基配列をコドン最適化した塩基配列を含むヌクレオチド、および、配列番号１６９に示す塩基配列をコドン最適化した塩基配列を含むヌクレオチド」の例としては、
　（１ｄ’）配列番号１９８に示す塩基配列からなるヌクレオチドおよび配列番号１９９に示す塩基配列からなるヌクレオチド
が挙げられる（図２０Ａ）。
　３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼに関し、好ましいプライマーは、
　（１ａ）配列番号１６８に示す塩基配列からなるヌクレオチドおよび配列番号１６９に示す塩基配列からなるヌクレオチド、および
　（１ｂ）配列番号１６８に示す塩基配列を含むヌクレオチドおよび配列番号１６９に示す塩基配列を含むヌクレオチド
である。
　上記ヌクレオチドをプライマーとして用いた、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ増幅物であるＤＮＡは、好ましくは７８３または７８４ｂｐを有する。ここで、ＰＣＲで用いるＤＮＡポリメラーゼとしては当該分野で既知のものが用いられ、例えばＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ、ホットスタート調整されたＤＮＡポリメラーゼ、ポリメラーゼ活性とは別に３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を有するプルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼ等が挙げられる。
＜２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼ＞
　２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼは、２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡをアジピル－ＣｏＡへと変換する反応を触媒する酵素である（図１６のステップＤ参照）。
　一態様において、２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼは、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、所定のヌクレオチドをプライマーとして使用したＰＣＲ増幅物と配列同一性が６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、８８％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上であるＤＮＡにコードされる。当該ＤＮＡは、例えば９２４～１３８６ｂｐ、好ましくは１０３９～１２４９ｂｐ、より好ましくは１０９７～１２１３ｂｐ、さらにより好ましくは１１３１～１１７９ｂｐ、特により好ましくは１１４３～１１６７ｂｐ、さらに特により好ましくは１１４５～１１６５ｂｐ、最も好ましくは１１５０～１１６０ｂｐを有する。
　好ましい一態様において、２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼは、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、所定のヌクレオチドをプライマーとして使用したＰＣＲ増幅物であるＤＮＡにコードされる。当該ＤＮＡは、例えば９２４～１３８６ｂｐ、好ましくは１０３９～１２４９ｂｐ、より好ましくは１０９７～１２１３ｂｐ、さらにより好ましくは１１３１～１１７９ｂｐ、特により好ましくは１１４３～１１６７ｂｐ、さらに特により好ましくは１１４５～１１６５ｂｐ、最も好ましくは１１５０～１１６０ｂｐを有する。
　更なる態様において、２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼは、以下から選択される：
（Ｂ－１）バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、所定のヌクレオチドをプライマーとして使用したＰＣＲ増幅物と配列同一性が６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、８８％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上であるＤＮＡにコードされる組換えポリペプチドであって、
　２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼ活性を有し、
　前記ＤＮＡは、先述の塩基対数（ｂｐ）を有する、組換えポリペプチド；
（Ｂ－２）バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、所定のヌクレオチドをプライマーとして使用したＰＣＲ増幅物であるＤＮＡによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列に対して、例えば１～１０個、好ましくは１～７個、より好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる組換えポリペプチドであって、
　２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼ活性を有し、
　前記ＤＮＡは、先述の塩基対数（ｂｐ）を有する、組換えポリペプチド；
および
（Ｂ－３）バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、所定のヌクレオチドをプライマーとして使用したＰＣＲ増幅物の縮重異性体からなるＤＮＡにコードされる組換えポリペプチドであって、
　２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼ活性を有し、
　前記ＤＮＡは、先述の塩基対数（ｂｐ）を有する、組換えポリペプチド。
　更なる好ましい態様において、外来性の２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼは、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、所定のヌクレオチドをプライマーとして使用したＰＣＲ増幅物であり、当該増幅物の塩基対数は１１５５または１１５６ｂｐである。
　２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼに関し、ＰＣＲに用いられるプライマー（フォワードおよびリバース）としては、以下が挙げられる（図１７参照）。
　（２ａ）配列番号１７０に示す塩基配列からなるヌクレオチドおよび配列番号１７１に示す塩基配列からなるヌクレオチド、
　（２ｂ）配列番号１７０に示す塩基配列を含むヌクレオチドおよび配列番号１７１に示す塩基配列を含むヌクレオチド、
　（２ｃ）配列番号１７０に示す塩基配列をコドン最適化した塩基配列からなるヌクレオチドおよび配列番号１７１に示す塩基配列をコドン最適化した塩基配列からなるヌクレオチド、
　（２ｄ）配列番号１７０に示す塩基配列をコドン最適化した塩基配列を含むヌクレオチドお
よび配列番号１７１に示す塩基配列をコドン最適化した塩基配列を含むヌクレオチド。
　前記（２ｂ）の「配列番号１７０に示す塩基配列を含むヌクレオチドおよび配列番号１７１に示す塩基配列を含むヌクレオチド」は、それぞれ、「配列番号１７０に示す塩基配列」および「配列番号１７１に示す塩基配列」に加えて、例えば１～２０ｂｐ、好ましくは１～１５ｂｐ、より好ましくは５～１５ｂｐ、さらに好ましくは１０～１５ｂｐがさらに追加されたヌクレオチド長を有する。
　前記（２ｄ）の「配列番号１７０に示す塩基配列をコドン最適化した塩基配列を含むヌクレオチドおよび配列番号１７１に示す塩基配列をコドン最適化した塩基配列を含むヌクレオチド」は、それぞれ、「配列番号１７０に示す塩基配列をコドン最適化した塩基配列」および「配列番号１７１に示す塩基配列をコドン最適化した塩基配列」に加えて、ベクター末端との相同配列を含み、例えば１～２０ｂｐ、好ましくは１～１５ｂｐ、より好ましくは５～１５ｂｐ、さらに好ましくは１０～１５ｂｐがさらに追加されたヌクレオチド長を有する。前記（２ｄ）の「配列番号１７０に示す塩基配列をコドン最適化した塩基配列を含むヌクレオチドおよび配列番号１７１に示す塩基配列をコドン最適化した塩基配列を含むヌクレオチド」の例としては、
　（２ｄ’）配列番号２１０に示す塩基配列からなるヌクレオチドおよび配列番号２１１に示す塩基配列からなるヌクレオチド
が挙げられる（図２０Ａ）。
　２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼに関し、好ましいプライマーは、
　（２ａ）配列番号１７０に示す塩基配列からなるヌクレオチドおよび配列番号１７１に示す塩基配列からなるヌクレオチド、および、
　（２ｂ）配列番号１７０に示す塩基配列を含むヌクレオチドおよび配列番号１７１に示す塩基配列を含むヌクレオチド
である。
　上記ヌクレオチドをプライマーとして用いた、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ増幅物であるＤＮＡは、好ましくは１１５５または１１５６ｂｐを有する。ここで、ＰＣＲで用いるＤＮＡポリメラーゼとしては当該分野で既知のものが用いられ、例えばＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ、ホットスタート調整されたＤＮＡポリメラーゼ、ポリメラーゼ活性とは別に３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を有するプルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼ等が挙げられる。
　本明細書において、「ＰＣＲ増幅物」とは、特定のヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行った結果得られた産物をいう。なお、特段示さない限り、本明細書において、ＰＣＲ増幅では、特定のヌクレオチドを１μＭずつ、フォワードプライマーおよびリバースプライマーとして用い、且つ、酵素としてＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　Ｍａｘ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（製品名、タカラバイオ製）を用いて、２５μＬ液の量で熱処理９８℃１０秒、アニーリング５５℃１５秒、伸長７２℃５秒／ｋｂの条件での処理を３０サイクル実施する。
　本発明に関し、目的の外来性遺伝子が導入される宿主微生物は特に限定されず、原核生物および真核生物のいずれであってもよい。既に単離保存されているもの、新たに天然から分離したものおよび遺伝子改変をされたものから任意に選択することができる。宿主微生物は、例えば、エッセリシア属、コリネバクテリウム属、バチルス属、アシネトバクター属、バークホルデリア属、シュードモナス属、クロストリジウム属、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、ヤロウィア属、カンジタ属、ピキア属、アスペルギルス属、クレブシエラ属、グルコノバクター属、ザイモモナス属、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属、ストレプトコッカス属およびストレプトマイセス属からなる群より選択される属に属する。本発明の宿主微生物は、好ましくは、エッセリシア属、コリネバクテリウム属、バチルス属、アシネトバクター属、バークホルデリア属、シュードモナス属、クロストリジウム属、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、ヤロウィア属、カンジタ属、ピキア属およびアスペルギルス属からなる群より選択される属に属する。宿主微生物は、より好ましくは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）である。
　したがって、上記宿主微生物に外来性遺伝子を導入した本発明にかかる組換え微生物は、例えば、エッセリシア属、コリネバクテリウム属、バチルス属、アシネトバクター属、バークホルデリア属、シュードモナス属、クロストリジウム属、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、ヤロウィア属、カンジタ属、ピキア属、アスペルギルス属、クレブシエラ属、グルコノバクター属、ザイモモナス属、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属、ストレプトコッカス属およびストレプトマイセス属からなる群より選択される属に属し、好ましくは、エッセリシア属、コリネバクテリウム属、バチルス属、アシネトバクター属、バークホルデリア属、シュードモナス属、クロストリジウム属、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、ヤロウィア属、カンジタ属、ピキア属およびアスペルギルス属からなる群より選択される属に属する。本発明にかかる組換え微生物は、より好ましくは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）である。
　本発明にかかる遺伝子組換え微生物が有するアジピン酸、アジピン酸誘導体、ヘキサメチレンジアミン、１，６－ヘキサンジオールおよび６－アミノ－１－ヘキサノール生産経路および当該経路の各反応段階を触媒する酵素について、図１６を参照しながら以下に説明する。
　図１６のステップＡの変換では、例えば、スクシニルＣｏＡ：アセチルＣｏＡアシルトランスフェラーゼ、または３－オキソアジピルＣｏＡチオラーゼが関与し、スクシニル－ＣｏＡとアセチル－ＣｏＡとが縮合し、３－オキソアジピル－ＣｏＡへと変換される。本変換を触媒し得る酵素他の例としては、β－ケトチオラーゼが挙げられる。更には、例えば、ＥＣ　２．３．１．９（アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ）、ＥＣ　２．３．１．１６（３－ケトアシル－ＣｏＡチオラーゼ）およびＥＣ　２．３．１．１７４（３－オキソアジピル－ＣｏＡチオラーゼ）などの群に分類される酵素も、本変換に対して活性を有し得る酵素として例示することができる。本発明で使用される酵素は、本変換に対する活性を有するものであれば限定されないが、一態様において、配列番号１７２に示すアミノ酸配列からなる大腸菌由来のＰａａＪが使用される。好ましい一態様において、当該酵素は、配列番号１６４に示すヌクレオチドおよび配列番号１６５に示すヌクレオチドをプライマーとして使用した、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ増幅物であるＤＮＡ配列（１２０３ｂｐ）にコードされるスクシニルＣｏＡ：アセチルＣｏＡアシルトランスフェラーゼである。
　図１６のステップＢの変換では、３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドロゲナーゼが関与し、３－オキソアジピル－ＣｏＡが、３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡへと変換される。本変換を触媒し得る他の酵素の例としては、ＥＣ　１．１．１の群に分類されるオキシドレダクターゼが挙げられる。具体的に、例えば、ＥＣ　１．１．１．３５（３－ヒドロキシアシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ）、ＥＣ　１．１．１．３６（アセトアセチル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ）、ＥＣ　１．１．１．１５７（３－ヒドロキシブタノイル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ）、ＥＣ　１．１．１．２１１（長鎖３－ヒドロキシアシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ）およびＥＣ　１．１．１．２５９（３－ヒドロキシピメロイル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ）などの群に分類される酵素が、本変換に対して活性を有し得る酵素として例示することができる。本発明で使用される酵素は、本変換に対する活性を有するものであれば限定されないが、例えば配列番号１７３に示すアミノ酸配列からなる大腸菌由来のＰａａＨが使用される（図１８）。好ましい一態様において、当該酵素は、配列番号１６６に示すヌクレオチドおよび配列番号１６７に示すヌクレオチドをプライマーとして使用した、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ増幅物のＤＮＡ配列（１５２１ｂｐ）にコードされる３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドロゲナーゼである。
　図１６のステップＣの変換では、例えば、３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼが関与し、３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡが、２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡへと変換される。本変換を触媒し得る他の酵素の例としては、ＥＣ　４．２．１の群に分類されるヒドロリアーゼが挙げられる。具体的に、例えば、ＥＣ　４．２．１．１７（エノイル－ＣｏＡヒドラターゼ）、ＥＣ　４．２．１．５５（３－ヒドロキシブタノイル－ＣｏＡデヒドラターゼ）およびＥＣ　４．２．１．７４（長鎖エノイル－ＣｏＡヒドラターゼ）などの群に分類される酵素は、本変換に対して活性を有し得る酵素として例示することができる。好ましい一態様において、当該酵素は、先述の３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼである。
　図１６のステップＤの変換では、例えば２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼが関与し、２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡが、アジピル－ＣｏＡへと変換される。本変換を触媒し得る酵素の他の例としては、ＥＣ　１．３．１の群に分類されるオキシドレダクターゼが挙げられる。具体的に、例えば、ＥＣ　１．３．１．８（アシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋））や、ＥＣ　１．３．１．９（エノイル－ＡＣＰレダクターゼ（ＮＡＤＨ））、ＥＣ　１．３．１．３８（トランス－２－エノイル－ＣｏＡレダクターゼ（ＮＡＤＰ＋））、ＥＣ　１．３．１．４４（トランス－２－エノイル－ＣｏＡレダクターゼ（ＮＡＤ＋））、ＥＣ　１．３．１．８６（クロトニル－ＣｏＡレダクターゼ）、ＥＣ　１．３．１．９３（長鎖アシル－ＣｏＡレダクターゼ）およびＥＣ　１．３．１．１０４（エノイル－ＡＣＰレダクターゼ（ＮＡＤＰＨ））などの群に分類される酵素は、本変換に対して活性を有し得る酵素として例示することができる。好ましい一態様において、当該酵素は、先述の２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼである。
　図１６のステップＥの変換では、アジピル－ＣｏＡがアジピン酸へと変換される。本変換を触媒し得る酵素の例としては、ＥＣ　３．１．２の群に分類されるチオエステルヒドラターゼが挙げられる。例えば、ＥＣ　３．１．２．１（アセチル－ＣｏＡヒドラターゼ）およびＥＣ　３．１．２．２０（アシル－ＣｏＡヒドラターゼ）などの群に分類される酵素は、本変換に対して活性を有し得る酵素として例示することができる。好ましい一態様において、当該酵素は、本変換に対する活性を有するものであれば限定されないが、配列番号１７９に示す、アシネトバクターＡＤＰ１株由来のｔｅｓＢ（Ａｂ）が使用される。使用する酵素の基質特異性に応じて、３－オキソアジピル－ＣｏＡ、３－ヒドロキシアジピルＣｏＡおよび２，３－デヒドロアジピルＣｏＡのＣｏＡが脱離され、それぞれ３－オキソアジピン酸、３－ヒドロキシアジピン酸、２，３－デヒドロアジピン酸を生成する。
　また、図１６のステップＥの変換を触媒し得る別の酵素の例として、ＥＣ　２．８．３の群に分類されるＣｏＡ－トランスフェラーゼも挙げることができる。例えば、ＥＣ　２．８．３．５（３－オキソ酸　ＣｏＡ－トランスフェラーゼ）や、ＥＣ　２．８．３．６（３－オキソアジピン酸　ＣｏＡ－トランスフェラーゼ）、ＥＣ　２．８．３．１８（スクシニル－ＣｏＡ：酢酸　ＣｏＡ－トランスフェラーゼ）といった群に分類される酵素は、本変換に対して活性を有し得る酵素として例示することができる。
　さらには、図１６のステップＥの変換を触媒し得る別の酵素変換の例として、ＥＣ　２．３．１の群に分類されるアシルトランスフェラーゼによって、アジピル－ＣｏＡのアジピル基をリン酸に転移してアジピルリン酸を生成した後、ＥＣ　２．７．２の群に分類されるホスホトランスフェラーゼによる脱リン酸化を経る経路も例示することができる。例えば、アシルトランスフェラーゼとしては、ＥＣ　２．３．１．８（リン酸アセチルトランスフェラーゼ）や、ＥＣ　２．３．１．１９（リン酸ブチリルトランスフェラーゼ）、ホスホトランスフェラーゼについては、ＥＣ　２．７．２．１（酢酸キナーゼ）や、ＥＣ　２．７．２．７（ブタン酸キナーゼ）といった群に分類される酵素は、本変換に対して活性を有し得る酵素として例示することができる。
　図１６のステップＴでは、３－オキソアジピン酸がレブリン酸へと変換される。本変換は、酵素（３－オキソアジピン酸デカルボキシラーゼ）によって触媒されるか、または、自然発生的に起こる。
　図１６のステップＦの変換では、アジピル－ＣｏＡからアジピン酸セミアルデヒドへと変換される。本変換を触媒し得る酵素の例としては、ＥＣ　１．２．１の群に分類される酵素が挙げられる。例えば、ＥＣ　１．２．１．１０（アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（アセチル化））、ＥＣ　１．２．１．１７（グリオキシル酸デヒドロゲナーゼ（アシル化））、ＥＣ　１．２．１．４２（ヘキサデカナールデヒドロゲナーゼ（アシル化））、ＥＣ　１．２．１．４４（シナモイル－ＣｏＡレダクターゼ（アシル化））、ＥＣ　１．２．１．７５（マロニル－ＣｏＡレダクターゼ（マロン酸セミアルデヒド形成））、ＥＣ　１．２．１．７６（コハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（アシル化））といった群に分類される酵素は、本変換と同様に、ＣｏＡを脱離しアルデヒドを生成する変換反応を触媒することから、本変換に対しても活性を有し得る酵素として例示することができる。本発明で使用される酵素は、本変換に対する活性を有するものであれば限定されないが、例えば、配列番号２３６に記載されるアミノ酸配列からなるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｋｌｕｙｖｅｒｉ由来のｓｕｃＤが使用される（図２１）。
　図１６のステップＧ、Ｊ、Ｑの変換では、カルボキシル基がアルデヒドへと変換される。本変換を触媒し得る酵素としては、例えば、カルボン酸レダクターゼ（Ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ；ＣＡＲ）が挙げられる。例えば、ＥＣ　１．２．１．３０（カルボン酸レダクターゼ（ＮＡＤＰ＋））、ＥＣ　１．２．１．３１（Ｌ－アミノアジピン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ）、ＥＣ　１．２．１．９５（Ｌ－２－アミノアジピン酸レダクターゼ）、ＥＣ　１．２．９９．６（カルボン酸レダクターゼ）といった群に分類される酵素が、本変換と同様に、カルボン酸からアルデヒドを生成する変換反応を触媒することから、本変換に対しても活性を有し得る酵素として例示することができる。酵素の由来となる生物種の典型的な例としては、Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｉｏｗｅｎｓｉｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａ　ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｆａｒｃｉｎｉｃａ、Ｓｅｇｎｉｌｉｐａｒｕｓ　ｒｕｇｏｓｕｓ、Ｓｅｇｎｉｌｉｐａｒｕｓ　ｒｏｔｕｎｄｕｓ、Ｔｓｕｋａｍｕｒｅｌｌａ　ｐａｕｒｏｍｅｔａｂｏｌａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍａｒｉｎｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｅｏａｕｒｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｂｓｃｅｓｓｕｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｖｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｃｈｅｌｏｎａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ｓｅｒｐｕｌａ　ｌａｃｒｙｍａｎｓ、Ｈｅｔｅｒｏｂａｓｉｄｉｏｎ　ａｎｎｏｓｕｍ、Ｃｏｐｒｉｎｏｐｓｉｓ　ｃｉｎｅｒｅａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｆｌａｖｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｔｅｒｒｅｕｓ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ　ｃｒａｓｓａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが挙げられるが、これらに限定されない。本発明で使用される酵素は、本変換に対する活性を有するものであれば限定されないが、例えば、配列番号２３７～２４１のいずれかに記載されるアミノ酸配列からなる酵素の少なくとも一種が使用されてもよく（図２２Ａ～図２２Ｅ）、好ましくは、配列番号２３９に記載されるアミノ酸配列からなるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｂｓｃｅｓｓｕｓ由来の酵素ＭａＣａｒ、配列番号２４１に記載されるアミノ酸配列からなるＭａＣａｒの変異体であるＭａＣａｒ（ｍ）の少なくとも一方が使用され、より好ましくは配列番号２４１に記載されるアミノ酸配列からなるＭａＣａｒ（ｍ）が使用される。
　また、カルボン酸レダクターゼは、ホスホパンテテイニル化されることにより活性型のホロ酵素に変換され得る（Ｖｅｎｋｉｔａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２８２，Ｎｏ．１，４７８－４８５（２００７））。ホスホパンテテイニル化はホスホパンテテイニル基転移酵素（Ｐｈｏｓｐｈｏｐａｎｔｅｔｈｅｉｎｙｌ　Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ＰＴ）により触媒される。本反応を触媒し得る酵素としては、例えば、ＥＣ　２．７．８．７に分類される酵素が挙げられる。したがって、本発明の微生物は更に、ホスホパンテテイニル基転移酵素の活性が増大するように改変されていて良い。ホスホパンテテイニル基転移酵素の活性を増大する方法としては、外来のホスホパンテテイニル基転移酵素遺伝子を導入する方法や、内因性のホスホパンテテイニル基転移酵素遺伝子の発現を強化する方法が挙げられるが、これらに限定されない。本発明で使用される酵素は、ホスホパンテテイニル基転移活性を有する限り、これらに限定されないが、典型的な酵素としては、例えば、大腸菌のＥｎｔＤや、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓのＳｆｐ、Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｉｏｗｅｎｓｉｓのＮｐｔ（Ｖｅｎｋｉｔａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２８２，Ｎｏ．１，４７８－４８５（２００７））、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＬｙｓ５（Ｅｈｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３８．１９　（１９９９）：　６１７１－６１７７．）が挙げられる。本発明で使用される酵素は、本変換に対する活性を有するものであれば限定されないが、例えば、配列番号２４２～２４５に記載されるアミノ酸配列からなる酵素の少なくともいずれか一種が使用されてもよく（図２３Ａ～図２３Ｄ）、好ましくは、配列番号２４３に記載されるアミノ酸配列からなるＮｏｃａｒｄｉａ　ｉｏｗｅｎｓｉｓ由来のＮｏｃａｒｄｉａ　ｉｏｗｅｎｓｉｓのＮｐｔが使用される。
　図１６のステップＭ、Ｎ、Ｓの変換は、アミノ基転移反応である。この変換を触媒し得る酵素の例としては、ＥＣ　２．６．１の群に分類されるトランスアミナーゼ（アミノトランスフェラーゼ）が挙げられる。例えば、ＥＣ　２．６．１．１９（４－アミノブタン酸－２－オキソグルタル酸トランスアミナーゼ）や、ＥＣ　２．６．１．２９（ジアミントランスアミナーゼ）、ＥＣ　２．６．１．４８（５－アミノ吉草酸トランスアミナーゼ）といった群に分類される酵素は、本変換に対しても活性を有し得る酵素として例示することができる。本発明で使用される酵素は、各ステップの変換活性を有するものであれば、特に限定されないが、例えば、カダベリンやスペルミジンをアミノ基転移することが報告されている大腸菌のプトレシンアミノトランスフェラーゼであるＹｇｊＧ（Ｓａｍｓｏｎｏｖａ．，　ｅｔ　ａｌ．，　ＢＭＣ　ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　３．１　（２００３）：　２．）や、シュードモナス属のプトレシンアミノトランスフェラーゼであるＳｐｕＣ（Ｌｕ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　１８４．１４　（２００２）：　３７６５－３７７３．、Ｇａｌｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｇｒｅｅｎ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１９．２　（２０１７）：　３６１－３６６．）、大腸菌のＧＡＢＡアミノトランスフェラーゼＧａｂＴや、ＰｕｕＥが使用されてもよい。さらには、Ｒｕｅｇｅｒｉａ　ｐｏｍｅｒｏｙｉ、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｖｉｏｌａｃｅｕｍ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｉｔｒｅｕｓ、Ｓｐｈａｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｆｉｓｃｈｅｒｉ、Ｖｉｂｒｉｏ　ｆｌｕｖｉａｌｉｓ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｌｏｔｉ等の生物種由来のω－トランスアミナーゼも、１，８－ジアミノオクタンや１，１０－ジアミノデカンなどのジアミン化合物へのアミノ基転移活性を有することが報告されており、本発明で使用されてもよい（Ｓｕｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇｒｅｅｎ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２０．２０　（２０１８）：　
４５９１－４５９５．、Ｓａｔｔｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ　Ｃｈｅｍｉｅ　１２４．３６　（２０１２）：　９２９０－９２９３．）。本発明で使用される酵素は、本変換に対する活性を有するものであれば限定されないが、例えば、配列番号２４６～２５０に記載されるアミノ酸配列からなる酵素の少なくともいずれか一種が使用されてもよい（図２４Ａ～図２４Ｅ）。典型的なアミノ基供与体としては、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－アラニン、グリシンが挙げられるが、これらには限定されない。
　図１６のステップＨ、Ｌ、Ｒの変換では、アルデヒドがアルコールに変換される。本変換を触媒し得る酵素の例としては、ＥＣ　１．１．１の群に分類されるオキシドレダクターゼが挙げられる。例えば、ＥＣ　１．１．１．１（アルコールデヒドロゲナーゼ）や、ＥＣ　１．１．１．２（アルコールデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋））、ＥＣ　１．１．１．７１（アルコールデヒドロゲナーゼ［ＮＡＤ（Ｐ）＋］）といった群に分類される酵素は、本変換と同様に、アルデヒドからアルコールへの変換反応を触媒することから、本変換に対しても活性を有し得る酵素として例示することができる。本発明で使用される酵素は、本変換に対する活性を有するものであれば限定されないが、例えば、配列番号２５１に記載される大腸菌由来のＡｈｒが使用される（図２５）。
　図１６のステップＩ、Ｏの変換では、カルボキシル基にＣｏＡが付加される。本変換を触媒し得る酵素の例としてはＥＣ　２．８．３の群に分類されるＣｏＡトランスフェラーゼ、ＥＣ　６．２．１の群に分類される酸チオールリガーゼが挙げられる。本発明で使用される酵素は、本変換に対する活性を有するものであれば限定されない。
　本発明に利用できる上記の酵素をコードする遺伝子は、例示された生物以外に由来するものであっても、または人工的に合成したものであってもよく、宿主微生物細胞内で実質的な酵素活性を発現できるものであればよい。
　本発明にかかる遺伝子組換え微生物は、先述の３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼおよび／または２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼをコードする外来性遺伝子に加え、スクシニルＣｏＡ：アセチルＣｏＡアシルトランスフェラーゼおよび３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドロゲナーゼからなる群より選択される少なくとも１つの酵素をコードする外来性遺伝子が導入されていることが好ましい。
　すなわち、本発明にかかる組換え微生物は、好ましくは、スクシニルＣｏＡ：アセチルＣｏＡアシルトランスフェラーゼをコードする外来性遺伝子および３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドロゲナーゼをコードする外来性遺伝子のうちの少なくとも１つをさらに含む。
　本発明にかかる組換え微生物は、上記外来性遺伝子、すなわち、３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼ、２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼ、スクシニルＣｏＡ：アセチルＣｏＡアシルトランスフェラーゼおよび３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドロゲナーゼ以外にも、更なる外来性遺伝子が導入されていてもよい。
　本発明にかかる組換え微生物は、宿主微生物において、適宜、任意の遺伝子が破壊されたものであってもよい。標的遺伝子の破壊は、当該分野で既知の方法に従って行われてよい。
　また、本発明の目的に利用できる上記酵素遺伝子は、前記宿主微生物細胞内で実質的な酵素活性を発現できるものであれば、自然界で発生し得るすべての変異や、人工的に導入された変異及び修飾を有していてもよい。例えば、特定のアミノ酸をコードする種々のコドンには余分のコドンが存在することが知られている。そのため本発明においても同一のアミノ酸に最終的に翻訳されることになる代替コドンを利用してよい。つまり、遺伝子コードは縮重しているので、ある特定のアミノ酸をコードするのに複数のコドンを使用でき、そのためアミノ酸配列は任意の１セットの類似のＤＮＡオリゴヌクレオチドでコードされ得る。そのセットの唯一のメンバーだけが天然型酵素の遺伝子配列に同一であるが、ミスマッチのあるＤＮＡオリゴヌクレオチドでさえ適切な緊縮条件下（例えば、３ｘＳＳＣ、６８℃でハイブリダイズし、２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ及び６８℃で洗浄）で天然型配列にハイブリダイズでき、天然型配列をコードするＤＮＡを同定、単離でき、更にそのような遺伝子も本発明において利用できる。特に、ほとんどの生物は特定のコドン（最適コドン）のサブセットを優先的に用いることが知られているので（Ｇｅｎｅ、Ｖｏｌ．１０５、ｐｐ．６１－７２、１９９１等）、宿主微生物に応じて「コドン最適化」を行うことは本発明においても有用であり得る。
　したがって、本発明にかかる遺伝子組換え微生物は、実質的な酵素活性を発現できることを条件に、上記酵素遺伝子の塩基配列と、例えば６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の配列同一性を有する塩基配列を含み得る。あるいは、本発明にかかる遺伝子組換え微生物は、上記酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列と、例えば６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の配列同一性を有する塩基配列を含み得る。
　本発明において、上記の生合成酵素遺伝子が「発現カセット」として宿主微生物細胞内に導入されることで、より安定的で高レベルの酵素活性を得ることができる。本明細書において、「発現カセット」とは、発現対象の核酸または発現対象の遺伝子に機能的に結合された転写および翻訳をレギュレートする核酸配列を含むヌクレオチドを意味する。典型的に、本発明の発現カセットは、コード配列から５’上流にプロモーター配列、３’下流にターミネーター配列、場合により更なる通常の調節エレメントを機能的に結合された状態で含み、そのような場合に、発現対象の核酸または発現対象の遺伝子が宿主微生物に導入される。
　本明細書において、プロモーターとは、構成発現型プロモーターであるか誘導発現型プロモーターであるかに拘わらず、ＲＮＡポリメラーゼをＤＮＡに結合させ、ＲＮＡ合成を開始させるＤＮＡ配列と定義される。強いプロモーターとはｍＲＮＡ合成を高頻度で開始させるプロモーターであり、本発明においても好適に使用される。大腸菌ではｌａｃ系、ｔｒｐ系、ｔａｃまたはｔｒｃ系、λファージの主要オペレーター及びプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、解糖系酵素（例えば、３－ホスホグリセレートキナーゼ、グリセルアルデヒド‐３－リン酸脱水素酵素）、グルタミン酸デカルボキシラーゼＡ、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼに対するプロモーター、Ｔ７ファージ由来ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター領域等が利用可能である。コリネ菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ではＨＣＥ（ｈｉｇｈ－ｌｅｖｅｌ　ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）プロモーター、ｃｓｐＢプロモーター、ｓｏｄＡプロモーターおよび伸長因子（ＥＦ－Ｔｕ）プロモーターなどが利用可能である。
　ターミネーターとしては、Ｔ７ターミネーター、ｒｒｎＢＴ１Ｔ２ターミネーター、ｌａｃターミネーターなどが利用可能である。
　プロモーターおよびターミネーター配列のほかに、他の調節エレメントとしては、例えば、選択マーカー、増幅シグナルおよび複製起点などが挙げられる。好適な調節エレメントについては、例えば、”Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１８５”、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　（１９９０）に記載されている。
　本発明で用いる宿主微生物は、当該微生物が本来有する酵素をコードする遺伝子が破壊された微生物であってもよい。当該酵素をコードする遺伝子としては、例えば、乳酸デヒドロゲナーゼをコードするｌｄｈ遺伝子、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼをコードするａｔｏＢ遺伝子、およびスクシニルＣｏＡシンセターゼαサブユニットをコードするｓｕｃＤ遺伝子が挙げられる。このように、宿主微生物が本来有する酵素の遺伝子のうちの一部を破壊した宿主微生物を用いることで、不純物の混入を避け、目的外の反応の進行を抑制することができる。具体的には、乳酸デヒドロゲナーゼをコードするｌｄｈ遺伝子を破壊することで、不純物である乳酸の生成を低減することができる。アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼをコードするａｔｏＢ遺伝子、およびスクシニルＣｏＡシンセターゼαサブユニットをコードするｓｕｃＤ遺伝子を破壊することで、アジピン酸の収率を改善することができる。
　上記で説明した発現カセットは、例えば、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、ＩＳエレメント、フォスミド、コスミド、又は線状もしくは環状のＤＮＡ等から成るベクターに組み入れて、宿主微生物中に挿入される。プラスミドおよびファージが好ましい。これらのベクターは、宿主微生物中で自律複製されるものでもよいし、また染色体により複製されてもよい。好適なプラスミドは、例えば、大腸菌のｐＬＧ３３８、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＫＣ３０、ｐＲｅｐ４、ｐＨＳ１、ｐＫＫ２２３－３、ｐＤＨＥ１９．２、ｐＨＳ２、ｐＰＬｃ２３６、ｐＭＢＬ２４、ｐＬＧ２００、ｐＵＲ２９０、ｐＩＮ－ＩＩＩ１１３－Ｂ１、λｇｔ１１又はｐＢｄＣＩ；桿菌のｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４又はｐＢＤ２１４；コリネバクテリウム属のｐＳＡ７７又はｐＡＪ６６７などである。バチルス属などの桿菌ではｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４またはｐＢＤ２１４などが挙げられる。これらの他にも使用可能なプラスミド等は、”Ｇｅｎｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ＤＮＡ　ｎａｌｙｓｉｓ　６ｔｈ　ｅｄｉｔｉｏｎ”、Ｗｉｌｅｙ－Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ（２０１６）に記載されている。ベクターへの発現カセットの導入は、適当な制限酵素による切り出し、クローニング、及びライゲーションを含む慣用の方法によって可能である。各々の発現カセットは、１つのベクター上に配置されてもよく、２つまたはそれ以上のベクターに配置されてもよい。
　上記のようにして本発明の発現カセットを有するベクターが構築された後、該ベクターを宿主微生物に導入する際に適用できる手法は慣用の方法を用いることができる。例えば、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法、接合伝達法、プロトプラスト融合法などが挙げられるが、これらに限定されず、宿主微生物に好適な方法が選択可能である。
　本発明の別の側面は、前記組換え微生物を用いた、目的化合物の製造方法に関する。より具体的には、前記組換え微生物を培養する培養工程を含む、目的化合物の製造方法に関する。
　ここで、目的化合物は、アジピン酸、アジピン酸誘導体、ヘキサメチレンジアミン、１，６－ヘキサンジオールおよび６－アミノ－１－ヘキサノールからなる群より選択される。アジピン酸誘導体としては、上記のとおり、例えば、３－オキソアジピン酸（３－ＯＡ）、レブリン酸（ＬＥＶ）、３－ヒドロキシアジピン酸（３ＨＡ）および２，３－デヒドロアジピン酸（２３ＤＡ）が挙げられる。
　一態様において、本発明にかかる組換え微生物は、アジピン酸生産経路を有する。この場合、本発明は、当該組換え微生物を培養する培養工程を含む、アジピン酸の製造方法にも関する。
　一態様において、本発明にかかる組換え微生物は、ヘキサメチレンジアミン生産経路を有する。この場合、本発明は、当該組換え微生物を培養する培養工程を含む、ヘキサメチレンジアミンの製造方法にも関する。
　一態様において、本発明にかかる組換え微生物は、１，６－ヘキサンジオール生産経路を有する。この場合、本発明は、当該組換え微生物を培養する培養工程を含む、１，６－ヘキサンジオールの製造方法にも関する。
　一態様において、本発明にかかる組換え微生物は、６－アミノ－１－ヘキサノール生産経路を有する。この場合、本発明は、当該組換え微生物を培養する培養工程を含む、６－アミノ－１－ヘキサノールの製造方法にも関する。
　培養工程では、組換え微生物を、炭素源および窒素源を含有する培地で培養することによって、菌体を含む培養物が得られる。本発明の遺伝子組換え微生物は、アジピン酸生産、ならびに、微生物の生育および維持に適した条件下で培養され、好適な培地組成、培養時間および培養条件は当業者により容易に設定できる。
　炭素源は、Ｄ－グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、オリゴ糖、多糖、でんぷん、セルロース、米ぬか、廃糖密、油脂（例えば大豆油、ヒマワリ油、ピーナッツ油、ヤシ油など）、脂肪酸（例えばパルミチン酸、リノール酸、オレイン酸、リノレン酸など）、アルコール（例えばグリセロール、エタノールなど）、有機酸（例えば酢酸、乳酸、コハク酸など）、トウモロコシ分解液、セルロース分解液、二酸化炭素、一酸化炭素などが挙げられる。好ましくは、Ｄ－グルコース、スクロースまたはグリセロールである。これらの炭素源は、個別にあるいは混合物として使用することが出来る。
　バイオマス由来の原料を用いて製造されたアジピン酸は、ＩＳＯ１６６２０－２またはＡＳＴＭ　Ｄ６８６６に規定されるＣａｒｂｏｎ－１４（放射性炭素）分析に基づくバイオベース炭素含有率の測定により、例えば石油、天然ガス、石炭などを由来とする合成原料と明確に区別することができる。
　窒素源は、含窒素有機化合物（例えば、ペプトン、カザミノ酸、トリプトン、酵母抽出物、肉抽出物、麦芽抽出物、コーンスティープリカー、大豆粉、アミノ酸および尿素など）、または無機化合物（例えば、アンモニア水溶液、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウムなど）が挙げられる。これらの窒素源は、個別にあるいは混合物として使用することが出来る。
　また、培地は、組換え微生物が有用な付加的形質を発現する場合、例えば抗生物質への耐性マーカーを有する場合、対応する抗生物質を含んでいてよい。それにより、培養時の雑菌による汚染リスクが低減される。抗生物質としては、アンピシリンなどのβ－ラクタム系抗生物質、カナマイシンなどのアミノグリコシド系抗生物質、エリスロマイシンなどのマクロライド系抗生物質、テトラサイクリン系抗生物質、クロラムフェニコールなどが挙げられるが、これらに限定されない。
　培養は、バッチ式であっても連続式であってもよい。また、いずれの場合にも、培養の適切な時点で追加の前記炭素源等を補給する形式であってもよい。更に、培養は、好適な温度、酸素濃度、ｐＨ等の条件を制御しながら培養されてもよい。一般的な微生物宿主細胞に由来する形質転換体の好適な培養温度は、通常１５℃～４５℃、好ましくは２５℃～３７℃の範囲である。宿主微生物が好気性の場合、発酵中の適切な酸素濃度を確保するために振盪（フラスコ培養等）、攪拌／通気（ジャー・ファーメンター培養等）を行ってもよい。それらの培養条件は、当業者にとって容易に設定可能である。
　本発明にかかる目的化合物の製造方法は、培養物から生産化合物を分離精製する分離精製工程を含んでもよい。当該工程では、任意の手法を、例えば、遠心分離、膜ろ過、膜分離、晶析、抽出、蒸留、吸着、相分離および各種のクロマトグラフィーといった手法を用いることができるが、これらに限定されない。分離精製工程は、一種類の工程からなっても良く、また複数の工程の組み合わせからなってもよい。
　以上の説明を与えられた当業者は、本発明を十分に実施できる。以下、更なる説明の目的として実施例を与え、従って、本発明は当該実施例に限定されるものではない。
＜１＞発明Ａ
　以下、本発明Ａを実施例に基づいて説明するが、本発明Ａはこれらの実施例に限定されるものではない。
　実施例で用いた試料のアミノ酸配列および塩基配列を、図２～１５に示す。
　＜Ｃ６化合物生産経路酵素遺伝子発現プラスミドの構築＞
　ＰＣＲ断片の増幅にはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　Ｍａｘ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（製品名、タカラバイオ製）、または、ＫＯＤ　ＦＸ　Ｎｅｏ（製品名、東洋紡製）、プラスミドの調製には大腸菌ＪＭ１０９株を用いた。塩基配列の最適化には、ＧｅｎｅＡｒｔ　ＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒ（ソフトウェア名、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、または、ユーロフィンジェノミクス社の人工遺伝子合成サービスを用いた。
　Ｅｓｈｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉのＰａａＪ（Ｅｃ）（配列番号１）をコードするポリヌクレオチドは、Ｅｓｈｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０株（ＮＢＲＣ１２７１３）ゲノムＤＮＡからクローニングを行って取得した。配列番号３４および３５のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い、ｐａａＪ（Ｅｃ）遺伝子のコード領域（配列番号３３）を含むＰＣＲ産物を得た。次に、ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１（製品名、Ｍｅｒｃｋ社製）を鋳型として、配列番号３６および３７のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い、ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１断片を得た。ｐａａＪ（Ｅｃ）遺伝子コード領域を含むＤＮＡ断片とｐＲＳＦＤｕｅｔ－１断片とを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標。以下、省略。）　ＨＤ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔ（製品名、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて接続した。大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換し、得られた形質転換体からプラスミドを抽出した。ＰａａＪ（Ｅｃ）発現プラスミドとして「ｐａａＪ（Ｅｃ）－ｐＲＳＦＤｕｅｔ」を得た。
　Ｅｓｈｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉのＰａａＨ（Ｅｃ）（配列番号２）をコードするポリヌクレオチドは、Ｅｓｈｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０株（ＮＢＲＣ１２７１３）のゲノムＤＮＡからクローニングを行って取得した。配列番号３９および４０のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い、ｐａａＨ（Ｅｃ）遺伝子のコード領域（配列番号３８）を含むＰＣＲ産物を得た。次に、「ｐａａＪ（Ｅｃ）－ｐＲＳＦＤｕｅｔ」を鋳型とし、配列番号４１および４２のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い、「ｐａａＪ（Ｅｃ）－ｐＲＳＦＤｕｅｔ」断片を得た。ｐａａＨ（Ｅｃ）遺伝子コード領域を含むＤＮＡ断片と「ｐａａＪ（Ｅｃ）－ｐＲＳＦＤｕｅｔ」断片とを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔ（製品名、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて接続した。大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換し、得られた形質転換体より、プラスミドを抽出した。ＰａａＪ（Ｅｃ）、ＰａａＨ（Ｅｃ）共発現プラスミドとして「ｐａａＪ（Ｅｃ）－ｐａａＨ（Ｅｃ）－ｐＲＳＦＤｕｅｔ」を得た。
　Ｅｓｈｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉのＰａａＦ（Ｅｃ）（配列番号３）をコードするポリヌクレオチドは、Ｅｓｈｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０株（ＮＢＲＣ１２７１３）ゲノムＤＮＡからクローニングを行って取得した。配列番号４４および４５のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い、ｐａａＦ（Ｅｃ）遺伝子のコード領域（配列番号４３）を含むＰＣＲ産物を得た。配列番号４に示すヌクレオチドおよび配列番号４６に示すヌクレオチドをプライマーとして使用し、Ｌ３株の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ増幅物の塩基配列にコードされるＬ３株のＰａａＦ（Ｌ３）をコードするヌクレオチドは、大腸菌発現用に塩基配列の最適化を行い、ユーロフィンジェノミクス社の人工遺伝子合成サービスを利用して取得した。配列番号４７および４８のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い、ｐａａＦ（Ｌ３）遺伝子のコード領域の最適化配列を含むＰＣＲ産物を得た。ｐＥＴＤｕｅｔ－１（製品名、Ｍｅｒｃｋ社製）を鋳型として、配列番号４９および５０のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い、ｐＥＴＤｕｅｔ－１断片を得た。ｐａａＦ（Ｅｃ）、ｐａａＦ（Ｌ３）それぞれのコード領域を含むＤＮＡ断片とｐＥＴＤｕｅｔ－１断片とを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔ（製品名、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて接続した。大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換し、得られた形質転換体からプラスミドを抽出した。ＰａａＦ（Ｅｃ）発現プラスミドとして「ｐａａＦ（Ｅｃ）－ｐＥＴＤｕｅｔ」を、ＰａａＦ（Ｌ３）発現プラスミドとして「ｐａａＦ（Ｌ３）－ｐＥＴＤｕｅｔ」を得た。
　Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｂａｙｌｙｉのｄｃａＡ（Ａｂ）（配列番号５）をコードするポリヌクレオチドは、大腸菌発現用に塩基配列の最適化を行い、ユーロフィンジェノミクス社の人工遺伝子合成サービスを利用して取得した。配列番号５２および５３のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い、ｄｃａＡ（Ａｂ）遺伝子のコード領域（配列番号５１）を含むＰＣＲ産物を得た。「ｐａａＦ（Ｅｃ）－ｐＥＴＤｕｅｔ」を鋳型とし、配列番号８４および８５のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い、「ｐａａＦ（Ｅｃ）－ｐＥＴＤｕｅｔ」断片を得た。ｄｃａＡ（Ａｂ）遺伝子のコード領域を含むＤＮＡ断片と、「ｐａａＦ（Ｅｃ）－ｐＥＴＤｕｅｔ」断片とをＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔ（製品名、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて接続した。大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換し、得られた形質転換体より、プラスミドを抽出した。ＰａａＦ（Ｅｃ）、ＤｃａＡ（Ａｂ）共発現プラスミドとして「ｐａａＦ（Ｅｃ）－ｄｃａＡ（Ａｂ）－ｐＥＴＤｕｅｔ」を得た。
　Ｃａｎｄｉｄａ　ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓのＴｅｒ（Ｃｔ）（配列番号６）は、Ｎ末端領域を２２残基分除去した配列（配列番号７）としてクローニングされた。コードするポリヌクレオチドは、大腸菌発現用に塩基配列の最適化を行い、ユーロフィンジェノミクス社の人工遺伝子合成サービスを利用して取得した。配列番号５５および５６のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い、ｔｅｒ（Ｃｔ）遺伝子のコード領域（配列番号５４）を含むＰＣＲ産物を得た。「ｐａａＦ（Ｌ３）－ｐＥＴＤｕｅｔ」を鋳型とし、配列番号８４および８５のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い、「ｐａａＦ（Ｌ３）－ｐＥＴＤｕｅｔ」断片を得た。ｔｅｒ（Ｃｔ）遺伝子のコード領域を含むＤＮＡ断片と、「ｐａａＦ（Ｌ３）－ｐＥＴＤｕｅｔ」断片とをＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔ（製品名、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて接続した。大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換し、得られた形質転換体より、プラスミドを抽出した。ＰａａＦ（Ｌ３）、Ｔｅｒ（Ｃｔ）共発現プラスミドとして「ｐａａＦ（Ｌ３）－ｔｅｒ（Ｃｔ）－ｐＥＴＤｕｅｔ」を得た。
　ＢＬＡＳＴ　Ｓｅａｒｃｈ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｔｏｏｌｓ／ｂｌａｓｔ／）ＢＬＡＳＴＰを用いて、ＫＥＧＧ　ＧＥＮＥＳデータベース中から、２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡレダクターゼの機能を有すると推測されるタンパク質を選択した。選択した候補酵素タンパク質を表Ａ－１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　選択した２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡレダクターゼ候補タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、大腸菌発現用に塩基配列の最適化を行い、ユーロフィンジェノミクス社の人工遺伝子合成サービスを利用して取得し、各酵素遺伝子のコード領域を含むＤＮＡ断片をＰＣＲによって得た。各酵素遺伝子のコード領域の塩基配列と、ＰＣＲに用いたプライマーセットの塩基配列の配列番号を表２に示す。「ｐａａＦ（Ｌ３）－ｐＥＴＤｕｅｔ」を鋳型とし、配列番号８４および８５のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い、「ｐａａＦ（Ｌ３）－ｐＥＴＤｕｅｔ」断片を得た。各遺伝子のコード領域を含むＤＮＡ断片と、「ｐａａＦ（Ｌ３）－ｐＥＴＤｕｅｔ」断片とをＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔ（製品名、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて接続した。大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換し、得られた形質転換体より、プラスミドを抽出した。ＰａａＦ（Ｌ３）と、各２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡレダクターゼ候補タンパク質
の共発現プラスミドを得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｂｓｃｅｓｓｕｓのカルボン酸レダクターゼＭａＣａｒ（配列番号２０）は、アミノ酸配列の２８３番目のトリプトファン残基をアルギニン残基に、３０３番目のアラニン残基をメチオニン残基に置換した変異体ＭａＣａｒ（ｍ）として使用した（配列番号２２）。ＭａＣａｒ（ｍ）をコードするポリヌクレオチドは、大腸菌発現用に塩基配列の最適化を行い、ユーロフィンジェノミクス社の人工遺伝子合成サービスを利用して取得した。配列番号８７および８８のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い、Ｍａｃａｒ（ｍ）遺伝子のコード領域（配列番号８６）を含むＰＣＲ産物を得た。
　次に本ＰＣＲ産物をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔ（製品名、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて、ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１（製品名、Ｍｅｒｃｋ社製）の制限酵素ＮｄｅＩおよびＡｖｒＩＩ切断部位間に挿入した。大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換し、得られた形質転換体からプラスミドを抽出した。ＭａＣａｒ（ｍ）発現プラスミドとして「Ｍａｃａｒ（ｍ）－ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ」を得た。
　Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｉｏｗｅｎｓｉｓのＮｐｔ（配列番号２４）をコードするポリヌクレオチドは、Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｉｏｗｅｎｓｉｓ　ＪＣＭ１８２９９株（文部科学省ナショナルバイオリソースプロジェクトを介して理研ＢＲＣから提供された。）のゲノムＤＮＡからクローニングを行って取得した。配列番号９０および９１のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い、ｎｐｔ遺伝子のコード領域（配列番号８９）を含むＰＣＲ産物を得た。次に、「ＭａＣａｒ（ｍ）－ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ」を鋳型とし、配列番号９２および９３のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い、「Ｍａｃａｒ（ｍ）－ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ」断片を得た。ＰＣＲ産物同士をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔ（製品名、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて接続した。大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換し、得られた形質転換体より、プラスミドを抽出した。ＭａＣａｒ（ｍ）、Ｎｐｔ共発現プラスミドとして「Ｍａｃａｒ（ｍ）－ｎｐｔ－ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ」を得た。
　Ｅｓｈｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉのＡｈｒ（配列番号３２）をコードするポリヌクレオチドは、Ｅｓｈｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０株（ＮＢＲＣ１２７１３）ゲノムＤＮＡからクローニングを行って取得した。配列番号９５および９６のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い、ａｈｒ遺伝子（配列番号９４）のコード領域を含むＰＣＲ産物を得た。次に「Ｍａｃａｒ（ｍ）－ｎｐｔ－ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ」を鋳型とし、配列番号９７および９８のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い、「ｍａｃａｒ（ｍ）－ｎｐｔ－ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ」断片を得た。各遺伝子のコード領域を含むＰＣＲ産物と「ｍａｃａｒ（ｍ）－ｎｐｔ－ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ」断片とをＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔ（製品名、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて接続した。大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換し、得られた形質転換体より、プラスミドを抽出した。Ａｈｒ、ＭａＣａｒ、Ｎｐｔ共発現プラスミドとして「ａｈｒ－ｍａｃａｒ（ｍ）－ｎｐｔ－ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ」をそれぞれ得た。
　＜Ｃ６化合物生産菌株の構築＞
　構築したプラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株コンピテントセル（ニッポンジーン社製）に形質転換し、アンピシリンナトリウム５０ｍｇ／Ｌ、カナマイシン硫酸塩３０ｍｇ／Ｌ、（菌株ＨＤＯ１の構築はさらにクロラムフェニコール３０ｍｇ／Ｌ）を含むＬＢ寒天培地（トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、寒天末１５ｇ／Ｌ）に塗布し、３７℃で２４時間インキュベートして形質転換体のシングルコロニーを得た。取得した形質転換体を表Ａ－３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　＜組換え大腸菌培養によるアジピン酸生産試験＞
　形質転換体ＡＤＡ１～１１を、アンピシリンナトリウム５０ｍｇ／Ｌ、カナマイシン硫酸塩３０ｍｇ／Ｌを含むＬＢ液体培地（トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ）２ｍＬ（１４ｍＬ容ラウンドボトムチューブ）に一白金耳植菌し、３７℃で２４時間振盪培養を行い、前培養液を得た。得られた前培養液１０μＬを、アンピシリンナトリウム５０ｍｇ／Ｌ、カナマイシン硫酸塩３０ｍｇ／Ｌを含むＭＭ培地１ｍＬ（９６穴ディープウェルプレート）に植菌し、３７℃で４８時間振盪培養を行った。ＭＭ培地の組成を表Ａ－４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　培養終了後、培養液中のアジピン酸濃度を分析した。分析は、トリメチルシリル誘導体化を用いたＧＣ／ＭＳ分析によって行った。培養液遠心上清４０μＬ（内部標準としてセバシン酸二ナトリウムを終濃度１０ｍＭとなるように添加）に水：メタノール：クロロホルム＝５：２：２（ｖ／ｖ／ｖ）となるように混合された抽出液を３６０μＬ添加し、ボルテックスミキサーでよく攪拌した。遠心分離（１６，０００×ｇ、５分）後、上清４０μＬを別のマイクロチューブに採取し、遠心エバポレータで１時間遠心乾固した。得られた乾固物にメトキシアミン塩酸塩２０ｍｇ／ｍＬピリジン溶液１００μＬを添加し、３０℃で９０分振盪した。Ｎ－メチル－Ｎ－トリメチルシリルトリフルオロアセトアミド５０μＬを添加し、３７℃で３０分振盪した。反応溶液をＧＣ／ＭＳ測定試料とし、下記の条件で分析を行った。
　ＧＣ／ＭＳ分析条件
装置：ＧＣＭＳ－ＱＰ－２０２０ＮＸ（島津製作所製）
カラム：フューズドシリカキャピラリーチューブ　不活性処理チューブ（長さ１ｍ、外径０．３５ｍｍ、内径０．２５ｍｍ、ＧＬサイエンス社製）、ＩｎｅｒｔＣａｐ　５ＭＳ／ＮＰ（長さ３０ｍ、内径０．２５ｍｍ、膜厚０．２５μｍ、ＧＬサイエンス社製）
試料注入量：１μＬ
試料導入法：スプリット（スプリット比２５：１）
気化室温度：２３０℃
キャリアガス：ヘリウム
キャリアガス線速度：３９．０ｃｍ／秒
オーブン温度：８０℃、２分保持→１５℃／分昇温→３２５℃、１３分保持
イオン化法：電子イオン化法（ＥＩ）
イオン化エネルギー：７０ｅＶ
イオン源温度：２３０℃
スキャン範囲：ｍ／ｚ＝５０～５００
　結果を表Ａ－５に示す。形質転換体ＡＤＡ１～ＡＤＡ１１は、図１のステップＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄの反応を進行させ得る酵素遺伝子の発現プラスミドを導入した形質転換体である。ステップＥの反応は、大腸菌の内因性酵素によって進行する。
　大腸菌由来のＰａａＪ（Ｅｃ）、ＰａａＨ（Ｅｃ）、ＰａａＦ（Ｅｃ）、及びＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｂａｙｌｙｉ由来のｄｃａＡ（Ａｂ）を発現させた形質転換体ＡＤＡ１の培養（比較例１）では、アジピン酸が０．１４ｇ／Ｌ生成した。大腸菌由来のＰａａＪ（Ｅｃ）、ＰａａＨ（Ｅｃ）、Ｌ３株由来のＰａａＦ（Ｌ３）、及びＣａｎｄｉｄａ　ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓのＴｅｒ（Ｃｔ）を発現させた形質転換体ＡＤＡ２の培養（比較例２）では、アジピン酸が０．３３ｇ／Ｌ生成した。
　大腸菌由来のＰａａＪ（Ｅｃ）、ＰａａＨ（Ｅｃ）、Ｌ３株由来のＰａａＦ（Ｌ３）、図１のステップＤの反応を触媒させる酵素として、Ｔｅｒ（ｃａｕｒ）、Ｔｅｒ（ｋｍｘ）、Ｔｅｒ（ｐｋｚ）、Ｔｅｒ（ｍｔｍ）、Ｔｅｒ（ｔｔｔ）、Ｔｅｒ（ｃｔｈｒ）、Ｔｅｒ（ｐａｎ）、Ｔｅｒ（ｐｌｊ）、またはＴｅｒ（ｐｔｅ）を発現させた形質転換体ＡＤＡ３～ＡＤＡ１１の培養（実施例１～９）では、それぞれアジピン酸を生成し、Ｔｅｒ（ｃａｕｒ）、Ｔｅｒ（ｋｍｘ）、Ｔｅｒ（ｐｋｚ）、Ｔｅｒ（ｍｔｍ）、Ｔｅｒ（ｔｔｔ）、Ｔｅｒ（ｃｔｈｒ）、Ｔｅｒ（ｐａｎ）、Ｔｅｒ（ｐｌｊ）、またはＴｅｒ（ｐｔｅ）が、アジピン酸生産経路反応を進行させる酵素活性を有することが示された。
　また、形質転換体ＡＤＡ６（実施例４）、ＡＤＡ７（実施例５）、ＡＤＡ８（実施例６）、ＡＤＡ９（実施例７）およびＡＤＡ１１（実施例９）の培養では、比較例を上回るアジピン酸を生成し、酵素Ｔｅｒ（ｍｔｍ）、Ｔｅｒ（ｔｔｔ）、Ｔｅｒ（ｃｔｈｒ）、Ｔｅｒ（ｐａｎ）、またはＴｅｒ（ｐｔｅ）を発現させることによりＣ６化合物生成量が向上したことが示された。また、これらの結果から、実施例として示される微生物では、良好な２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡ還元酵素活性を示すことがわかる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　＜組換え大腸菌培養による１，６－ヘキサンジオールおよび６－ヒドロキシヘキサン酸生産試験＞
　形質転換体ＨＤＯ１を、アンピシリンナトリウム５０ｍｇ／Ｌ、カナマイシン硫酸塩３０ｍｇ／Ｌ、クロラムフェニコール３０ｍｇ／Ｌを含むＬＢ液体培地２ｍＬ（１４ｍＬ容ラウンドボトムチューブ）に一白金耳植菌し、３７℃で２４時間振盪培養を行い、前培養液を得た。得られた前培養液１０μＬをアンピシリンナトリウム５０ｍｇ／Ｌ、カナマイシン硫酸塩３０ｍｇ／Ｌ、クロラムフェニコール３０ｍｇ／Ｌを含むＭＭ培地１ｍＬ（９６穴ディープウェルプレート）に植菌し、３７℃で４８時間振盪培養を行った。
　培養終了後、培養液中の１，６－ヘキサンジオール濃度、６－ヒドロキシヘキサン酸濃度を分析した。６－ヒドロキシヘキサン酸濃度はＧＣ／ＭＳを用いてアジピン酸濃度分析と同様の条件で分析した。１，６－ヘキサンジオール濃度の分析は、高速液体クロマトグラフＰｒｏｍｉｎｅｎｃｅシステム（島津製作所製）を用いて下記の条件で行った。
　高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）分析条件
検出器：示差屈折率検出器
カラム：Ｓｈｉｍ－Ｐａｃｋ　Ｆａｓｔ－ＯＡ（Ｇ）、Ｆａｓｔ－ＯＡ（島津製作所製）
オーブン温度：４０℃　
移動相：８ｍＭメタンスルホン酸水溶液
流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ
注入量：１０μＬ
　結果を表Ａ－６に示す。形質転換体ＨＤＯ１は、図１のステップＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄの反応を進行させ得る酵素遺伝子の発現プラスミドに加え、カルボン酸レダクターゼ、アルコールデヒドロゲナーゼの発現プラスミドを導入した形質転換体である。形質転換体ＨＤＯ１の培養（実施例１０）では、６－ヒドロキシヘキサン酸および１，６－ヘキサンジオールを生成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　＜遺伝子破壊用プラスミドの構築＞
　大腸菌の遺伝子の破壊・挿入には、ｐＨＡＫ１（受領番号ＮＩＴＥ　Ｐ－０２９１９として、独立行政法人製品評価技術基盤機構　バイオテクノロジーセンター　特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（住所：千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２２号室）に２０１９年３月１８日に寄託した。国際寄託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２９１９）を用いた相同組換え法により行った。ｐＨＡＫ１は温度感受性変異型ｒｅｐＡ遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来レバンスクラーゼ遺伝子ｓａｃＢを含む。レバンスクラーゼ遺伝子は、スクロース存在下において宿主微生物に対して致死的に作用する。ＰＣＲ断片の増幅にはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　Ｍａｘ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（製品名、タカラバイオ製）、または、ＫＯＤ　ＦＸ　Ｎｅｏ（製品名、東洋紡製）、プラスミド調製は大腸菌ＨＳＴ０８株を用いて行った。
　大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、破壊標的遺伝子の５’相同領域、コード領域、および３’相同領域を含むＰＣＲ産物を得た。標的遺伝子とプライマー配列の組み合わせを下記表Ａ－７に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　次に本ＰＣＲ産物をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔ（製品名、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて、配列番号１１５及び１１６のプライマーを用いて増幅したｐＨＡＫ１プラスミド断片に挿入し、環状化した。大腸菌ＨＳＴ０８株に形質転換し、得られた形質転換体からプラスミドを抽出した。
　上記で抽出した、破壊標的遺伝子の５’相同領域、コード領域、および３’相同領域のＤＮＡ断片が挿入されたｐＨＡＫ１プラスミドを鋳型として、下記表Ａ－８に記載するプライマーを用いてＰＣＲを行い、破壊標的遺伝子のコード領域の一部領域または全領域が除かれ、５’相同領域および３’相同領域を内含するｐＨＡＫ１プラスミド断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　得られたプラスミド断片を末端リン酸化、セルフライゲーションにより環状化した。大腸菌ＨＳＴ０８株に形質転換し、得られた形質転換体からプラスミドを抽出し、遺伝子破壊用プラスミドを得た。
　＜ヘキサメチレンジアミン生産経路酵素遺伝子挿入用プラスミドの構築＞
　Ｅｓｈｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉのＰａａＪ（Ｅｃ）（配列番号１）をコードするポリヌクレオチド（配列番号３３）は、Ｅｓｈｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０株（ＮＢＲＣ１２７１３）ゲノムＤＮＡからクローニングを行った。Ｅｓｈｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉのＰａａＨ（Ｅｃ）（配列番号２）をコードするポリヌクレオチド（配列番号３８）は、Ｅｓｈｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０株（ＮＢＲＣ１２７１３）のゲノムＤＮＡからクローニングを行って取得した。
　ｐａａＪ（Ｅｃ）およびｐａａＨ（Ｅｃ）遺伝子は、発現カセットとしてｐｆｌＢ遺伝子領域に挿入されるよう、遺伝子挿入用プラスミドを設計した。先に構築したｐｆｌＢ遺伝子破壊用プラスミドに内含されるｐｆｌＢ遺伝子コード領域の５’相同領域と３’相同領域の間に、プロモーター領域（配列番号１３３）、ｐａａＪ（Ｅｃ）遺伝子コード領域、リンカー配列（配列番号１３４）、ｐａａＨ遺伝子コード領域、ターミネーター領域（配列番号１３５）の順に配置した発現カセットを組み込んだ。
　配列番号４に示すヌクレオチドおよび配列番号４６に示すヌクレオチドをプライマーとして使用し、Ｌ３株の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ増幅物の塩基配列にコードされるＬ３株のＰａａＦ（Ｌ３）をコードするヌクレオチドは、大腸菌発現用に塩基配列の最適化を行い、ユーロフィンジェノミクス社の人工遺伝子合成サービスを利用して取得した。配列番号１６２に示すヌクレオチドおよび配列番号１６３に示すヌクレオチドをプライマーとして使用し、Ｌ３株の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ増幅物の塩基配列にコードされるＬ３株のＭｍｇＣ（Ｌ３）をコードするポリヌクレオチド（１１５５ｂｐ）は、大腸菌発現用に塩基配列の最適化を行い、ユーロフィンジェノミクス社の人工遺伝子合成サービスを利用して取得した。
　ｐａａＦ（Ｌ３）およびｍｍｇＣ（Ｌ３）遺伝子のコード領域の最適化配列は、発現カセットとしてｙａｈＫ遺伝子領域に挿入されるよう、遺伝子挿入用プラスミドを設計した。先に構築したｙａｈＫ遺伝子破壊用プラスミドに内含されるｙａｈＫ遺伝子コード領域の５’相同領域と３’相同領域の間に、プロモーター領域（配列番号１３６）、ｐａａＦ（Ｌ３）遺伝子コード領域、リンカー配列（配列番号１３７）、ｍｍｇＣ（Ｌ３）遺伝子コード領域、ターミネーター領域（配列番号１３８）の順に配置した発現カセットを組み込んだ。
　Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｂｓｃｅｓｓｕｓのカルボン酸レダクターゼＭａＣａｒ（配列番号２０）は、アミノ酸配列の２８３番目のトリプトファン残基をアルギニン残基に、３０３番目のアラニン残基をメチオニン残基に置換した変異体ＭａＣａｒ（ｍ）を用いた（配列番号２２）。ＭａＣａｒ（ｍ）をコードするポリヌクレオチド（配列番号８６）は、大腸菌発現用に塩基配列の最適化を行い、ユーロフィンジェノミクス社の人工遺伝子合成サービスを利用して取得した。Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｉｏｗｅｎｓｉｓのＮｐｔ（配列番号２４）をコードするポリヌクレオチド（配列番号８９）は、Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｉｏｗｅｎｓｉｓ　ＪＣＭ１８２９９株（文部科学省ナショナルバイオリソースプロジェクトを介して理研ＢＲＣから提供された。）のゲノムＤＮＡからクローニングを行って取得した。
　ｍａｃａｒ（ｍ）およびｎｐｔ遺伝子は、発現カセットとしてｌｄｈＡ遺伝子領域に挿入されるよう、遺伝子挿入用プラスミドを設計した。先に構築したｌｄｈＡ遺伝子破壊用プラスミドに内含されるｌｄｈＡ遺伝子コード領域の５’相同領域と３’相同領域の間に、プロモーター領域（配列番号１３９）、ｍａｃａｒ（ｍ）遺伝子コード領域、リンカー配列（配列番号１４０）、ｎｐｔ遺伝子コード領域、ターミネーター領域（配列番号１４１）の順に配置した発現カセットを組み込んだ。
　＜大腸菌改変株の構築＞
　エレクトロポレーション法（羊土社　遺伝子工学実験ノート　田村隆明著、参照）により、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に所望の遺伝子の破壊または挿入のためのプラスミドを形質転換した後、カナマイシン硫酸塩１００ｍｇ／Ｌを含有するＬＢ寒天培地（トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、寒天末１５ｇ／Ｌ）に塗布し、３０℃で一晩インキュベートしてシングルコロニーを取得し、形質転換体を得た。本形質転換体をカナマイシン硫酸塩１００ｍｇ／Ｌを含有するＬＢ液体培地（トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ）１ｍＬに一白金耳植菌し、３０℃で振盪培養を行った。得られた培養液を、カナマイシン硫酸塩１００ｍｇ／Ｌを含有するＬＢ寒天培地に塗布し、４２℃で一晩インキュベートし、コロニーを取得した。得られたコロニーをＬＢ液体培地１ｍＬに一白金耳植菌し、３０℃で振盪培養を行った。得られた培養液を、スクロース２０％を含有するＬＢ寒天培地に塗布し、３０℃で２日間インキュベートした。得られたコロニーについて、所望の遺伝子が破壊または挿入されていることを、表Ａ－９に示すプライマーセットを用いたコロニーダイレクトＰＣＲにより確認した。
　以上の操作を繰り返し、表Ａ－１０に示す、複数の遺伝子破壊および遺伝子挿入を含む大腸菌株「Ｎｏ．０６０」を構築した。表中、Δは該酵素遺伝子が欠損していることを示し、「遺伝子名Ａ：：遺伝子名Ｂ」は、遺伝子Ａ領域が遺伝子Ｂを含む領域に置換されていることを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　＜ヘキサメチレンジアミン生産経路酵素遺伝子発現プラスミドの構築＞
　ＰＣＲ断片の増幅にはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　Ｍａｘ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（製品名、タカラバイオ製）、または、ＫＯＤ　ＦＸ　Ｎｅｏ（製品名、東洋紡製）、プラスミドの調製には大腸菌ＪＭ１０９株を用いた。
　Ｅｓｈｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉのＹｇｊＧ（配列番号２７）は、一部のアミノ酸配列を置換した変異型ＹｇｊＧ（ｍ）（配列番号１５８）を用いた。ＹｇｊＧ（ｍ）をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１６０および１６１のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い、ｙｇｊＧ（ｍ）遺伝子（配列番号１５９）のコード領域を含むＰＣＲ産物を得た。次に本ＰＣＲ産物をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔ（製品名、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて、ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１（製品名、Ｍｅｒｃｋ社製）の制限酵素ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ切断部位間に挿入した。大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換し、得られた形質転換体からプラスミドを抽出した。ＭａＣａｒ（ｍ）発現プラスミドとして「ｙｇｊＧ（ｍ）－ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ」を得た。
　＜組換え大腸菌培養によるヘキサメチレンジアミン生産試験＞
　エレクトロポレーション法により、大腸菌改変株Ｎｏ．０６０に「ｐａａＦ（Ｌ３）－ｔｅｒ（ｍｔｍ）－ｐＥＴＤｕｅｔ」および「ｙｇｊＧ（ｍ）－ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ」を形質転換し、アンピシリンナトリウム５０ｍｇ／Ｌ、クロラムフェニコール３０ｍｇ／Ｌを含むＬＢ寒天培地上で、３７℃、一日間培養して、コロニーを形成させ、形質転換体ＨＭＤ１を得た。アンピシリンナトリウム５０ｍｇ／Ｌ、クロラムフェニコール３０ｍｇ／Ｌを含むＬＢ液体培地２ｍＬ（１４ｍＬ容ラウンドボトムチューブ）に形質転換体ＨＭＤ１のコロニーを一白金耳植菌し、３７℃、３～５時間振盪培養を行い、前培養液を得た。２５０ｍＬ容のＪａｒ培養装置（機種名　バイオＪｒ．８、バイオット社製）に、カルベニシリンナトリウム５０ｍｇ／Ｌ、クロラムフェニコール３０ｍｇ／Ｌ、ＩＰＴＧ０．０２ｍＭを含む合成培地（下表）に前培養液０．５ｍＬを添加し、本培養を行った。培養条件は次の通り；培養温度　３７℃；培養ｐＨ　７．０；ｐＨ調整　１０％（ｗ／ｖ）アンモニア水；撹拌　７５０ｒｐｍ；通気　１ｖｖｍ。前培養液植菌から２２時間経過時点でグルコースを終濃度３５ｇ／Ｌとなるよう追添し、４１時間経過まで培養した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　培養終了後、培養液を遠心分離により菌体と上清に分離し、上清中のヘキサメチレンジアミン濃度を分析した。ヘキサメチレンジアミン濃度の分析はイオンクロマトグラフを用いて下記の条件で行った。
　イオンクロマトグラフ分析条件
装置：ＩＣＳ－３０００（Ｄｉｏｎｅｘ社製）
検出器：電気伝導度検出器
カラム：ＩｏｎＰａｃ　ＣＧ１９（２×５０ｍｍ）／ＣＳ１９（２×２５０ｍｍ）（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）
オーブン温度：３０℃
移動相：８ｍＭメタンスルホン酸水溶液（Ａ）、７０ｍＭメタンスルホン酸水溶液（Ｂ）
グラジエント条件：（Ａ：１００％、Ｂ：０％）－（１０ｍｉｎ）－（Ａ：０％、Ｂ：１００％）－（１ｍｉｎ保持）
流速：０．２８ｍＬ／ｍｉｎ
注入量：２０μＬ
　結果を表Ａ－１２に示す。形質転換体ＨＭＤ１は、図１のステップＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄの反応を進行させ得る酵素遺伝子に加え、カルボン酸レダクターゼ、アミノトランスフェラーゼ遺伝子を導入した形質転換体である。形質転換体ＨＭＤ１の培養（実施例１１）でヘキサメチレンジアミンを生成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
＜２＞発明Ｂ
　以下、本発明Ｂを実施例に基づいて説明するが、本発明Ｂはこれらの実施例に限定されるものではない。
＜バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株の単離と同定＞
　日本国内の活性汚泥より、アジピン酸を唯一の炭素源及びエネルギー源とする培地を用いて、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株を分離した。バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター　ＮＰＭＤ）（住所：千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２２号室）に２０２０年１２月４日（原寄託日）付けで寄託申請し（受領番号：ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３３３４）、「受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３３３４」として国際寄託されている。Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｐ．ＬＥＢＰ－３株の分類的性状は以下に示す通りである。
＜ＬＥＢＰ－３株の菌学的諸性質＞
　培養温度：３７℃、
　細胞形態：桿菌（０．７ｘ１．７－３．０μｍ）、
　グラム染色性：－、
　芽胞の有無：－、
　運動性：＋、
　ＬＢ寒天培地４８ｈ培養時のコロニー形態：直径１．９～２．５ｍｍ、淡黄色、円形、
レンズ状、全縁、平滑、不透明、バター様、
　３０℃生育：＋、
　４５℃生育：＋、
　カタラーゼ反応：＋、
　オキシダーゼ反応：＋、
　グルコースからの酸／ガス産生：＋／－、
　Ｏ／Ｆテスト（酸化／発酵）：＋／－、
　硝酸塩還元性：－、
　インドール産生性：－、
　ブドウ糖酸性化性：－、
　ウレアーゼ：持たない、
　エスクリン分解性：＋、
　ブドウ糖、Ｌ－アラビノース、Ｄ－マンノース、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン、グルコン酸、ｎ－カプリン酸、アジピン酸、リンゴ酸、クエン酸および酢酸フェニル：資化できる、
　マルトース：資化できない。
＜ＬＥＢＰ－３株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列相同性による系統解析＞
　１６ＳｒＤＮＡ遺伝子の塩基配列解析を行うことにより同定を行った。１６ＳｒＤＮＡ遺伝子の塩基配列をＰＣＲにて増幅し、シーケンス解析を行った。ＢＬＡＳＴ相同性検索のデータベースはＤＢ－ＢＡ１１．０（テクノスルガ・ラボ社）および国際塩基配列データベースを使用した。その結果、ＬＥＢＰ－３株はＢｕｒｋｈｌｄｅｒｉａ属で構成されるクラスター内に含まれたが、何れの既知種とも異なる分子系統学的位置を示したことから、種名の同定に至らなかった。
＜ＰＣＲ増幅による酵素遺伝子の取得と相同性評価＞
　Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｐ．ＬＥＢＰ－３株の全ゲノムドラフト解析を実施した。ＬＥＢＰ－３株を２ｍＬのＬＢ培地(トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ)で３７℃振とう培養を実施した。培養終了後、培養液から菌体を回収し、Ｎｕｃｌｅｏ　Ｓｐｉｎ　Ｔｉｓｓｕｅ（製品名、ＭＡＣＨＥＲＥＹ－ＮＡＧＥＬ社製）を使用してゲノムＤＮＡを抽出した。Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｐ．ＬＥＢＰ－３株の全ゲノムドラフト解析およびアノテーションを実施し、７６７９個のオープンリーディングフレーム（Ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ；ＯＲＦ）を同定した。この情報を元に、スクシニルＣｏＡ：アセチルＣｏＡアシルトランスフェラーゼとしてｐａａＪ（Ｌ３）を、３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドロゲナーゼとしてｐａａＨ（Ｌ３）を、３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼとしてｐａａＦ（Ｌ３）を、２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼとしてｍｍｇＣ（Ｌ３）を同定した。
　ＰａａＪ（Ｌ３）配列をクエリとしてＢＬＡＳＴ検索を実施した結果を表Ｂ－１に、ＰａａＨ（Ｌ３）配列をクエリとしてＢＬＡＳＴ検索を実施した結果を表Ｂ－２に、ＰａａＦ（Ｌ３）配列をクエリとしてＢＬＡＳＴ検索を実施した結果を表Ｂ－３に、ＭｍｇＣ（Ｌ３）配列をクエリとしてＢＬＡＳＴ検索を実施した結果を表Ｂ－４に示す。なお、配列検索時のデータベースは「Ｒｅｆｓｅｑ＿Ｐｒｏｔｅｉｎ」を指定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　以上の結果より、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｐ．ＬＥＢＰ－３株の持つ上記酵素は新規配列として同定された。ｐａａＪ（Ｌ３）遺伝子は配列番号１６４に示すヌクレオチドおよび配列番号１６５に示すヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ増幅を行うことができる。ｐａａＨ（Ｌ３）遺伝子は配列番号１６６に示すヌクレオチドおよび配列番号１６７に示すヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ増幅を行うことができる。ｐａａＦ（Ｌ３）遺伝子は配列番号１６８に示すヌクレオチドおよび配列番号１６９に示すヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ増幅を行うことができる。ｍｍｇＣ（Ｌ３）遺伝子は配列番号１７０に示すヌクレオチドおよび配列番号１７１に示すヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ増幅を行うことができる。ＰＣＲに用いたプライマー、各酵素および酵素をコードする塩基配列を、図１７～２０に示す。
　ＰＣＲ増幅条件の一例を下記に示す。酵素はＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　Ｍａｘ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（製品名、タカラバイオ製）を用いた。熱処理９８℃　１０秒、アニーリング５５℃　１５秒、伸長７２℃　５秒／ｋｂを３０サイクル実施した。プライマーとして使用するオリゴヌクレオチドは各１μＭ添加した。液量は２５μＬで実施した。
＜取得酵素遺伝子を発現する組換え大腸菌の構築＞
　ＰＣＲ断片の増幅にはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　Ｍａｘ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（製品名、タカラバイオ製）、プラスミドの調製には大腸菌ＪＭ１０９株を用いた。塩基配列のコドン最適化には、ＧｅｎｅＡｒｔ　ＧｅｎｅＯｐｔｉｎｉｚｅｒ（ソフトウェア名、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、または、ユーロフィンジェノミクス社の人工遺伝子合成サービスを用いた。
　Ｅｓｈｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉのＰａａＪ（Ｅｃ）をコードするポリヌクレオチドは、Ｅｓｈｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０株（ＮＢＲＣ１２７１３）ゲノムＤＮＡからクローニングを行った。配列番号１８８および１８９のオリゴヌクレオチド（図２０Ａ）をプライマーとしてＰＣＲを行い、ｐａａＪ（Ｅｃ）遺伝子のコード領域（配列番号１８０）（図１９Ａ）を含むＰＣＲ増幅物を得た。次に、ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１（製品名、Ｍｅｒｃｋ社製）を鋳型として、配列番号１９０および１９１に示すヌクレオチド（図２０Ａ）をプライマーとしてＰＣＲを行い、ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１断片を得た。遺伝子コード領域を含むＤＮＡ断片とｐＲＳＦＤｕｅｔ－１断片とを、をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔ（製品名、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて接続した。大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換し、得られた形質転換体からプラスミドを抽出した。ＰａａＪ（Ｅｃ）発現プラスミドとして「ｐｒｍ２０３」を得た。
　Ｅｓｈｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉのＰａａＨ（Ｅｃ）をコードするポリヌクレオチドは、Ｅｓｈｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０株（ＮＢＲＣ１２７１３）のゲノムＤＮＡからクローニングを行った。配列番号１９２および１９３に示すヌクレオチド（図２０Ａ）をプライマーとしてＰＣＲを行い、ｐａａＨ（Ｅｃ）遺伝子のコード領域（配列番号１８１）（図１９Ａ）を含むＰＣＲ増幅物を得た。次に、ｐｒｍ２０３を鋳型とし、配列番号１９４および１９５に示すヌクレオチド（図２０Ａ）をプライマーとしてＰＣＲを行い、ｐｒｍ２０３断片を得た。各遺伝子コード領域を含むＤＮＡ断片とｐｒｍ２０３断片とを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔ（製品名、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて接続した。大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換し、得られた形質転換体より、プラスミドを抽出した。ＰａａＪ（Ｅｃ）－ＰａａＨ（Ｅｃ）発現プラスミドとして「ｐｒｍ６９」を得た。
　Ｅｓｈｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉのＰａａＦ（Ｅｃ）をコードするポリヌクレオチドは、Ｅｓｈｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０株（ＮＢＲＣ１２７１３）ゲノムＤＮＡからクローニングを行った。配列番号１９６および１９７に示すヌクレオチド（図２０Ａ）をプライマーとしてＰＣＲを行い、ｐａａＦ（Ｅｃ）遺伝子のコード領域（配列番号１８２）（図１９Ａ）を含むＰＣＲ増幅物を得た。Ｌ３株のＰａａＦ（Ｌ３）をコードするポリヌクレオチドは、大腸菌発現用に塩基配列の最適化を行い、ユーロフィンジェノミクス社の人工遺伝子合成サービスを利用して取得した。配列番号１９８および１９９に示すヌクレオチド（図２０Ａ）をプライマーとしてＰＣＲを行い、ｐａａＦ（Ｌ３）遺伝子のコード領域を含むＰＣＲ増幅物を得た。ｐＥＴＤｕｅｔ－１（製品名、Ｍｅｒｃｋ社製）を鋳型として、配列番号２０４および２０５に示すヌクレオチド（図２０Ａ）をプライマーとしてＰＣＲを行い、ｐＥＴＤｕｅｔ－１断片を得た。各遺伝子のコード領域を含むＤＮＡ断片とｐＥＴＤｕｅｔ－１断片とを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔ（製品名、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて接続した。大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換し、得られた形質転換体からプラスミドを抽出した。ＰａａＦ（Ｅｃ）発現プラスミドとして「ｐｒｍ７４」を、ＰａａＦ（Ｌ３）発現プラスミドとして「ｐｒｍ１９４」を得た。
　Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｂａｙｌｙｉのｄｃａＡ（Ａｂ）、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ　ｆｕｓｃａのＴｆｕ１６４７、Ｌ３株のＭｍｇＣ（Ｌ３）をコードするポリヌクレオチドは、大腸菌発現用に塩基配列の最適化を行い、ユーロフィンジェノミクス社の人工遺伝子合成サービスを利用して取得した。ｄｃａＡ（Ａｂ）遺伝子（配列番号１８５）（図１９Ｂ）は、配列番号２０６および２０７に示すヌクレオチド（図２０Ａ）をプライマーとして、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ　ｆｕｓｃａのＴｆｕ１６４７遺伝子（配列番号１８６）（図１９Ｂ）は配列番号２０８および２０９に示すヌクレオチド（図２０Ａ）をプライマーとして、ｍｍｇＣ５（Ｌ３）遺伝子は配列番号２１０および２１１（図２０Ａ）に示すヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い、ｄｃａＡ（Ａｂ）、Ｔｆｕ１６４７、ｍｍｇＣ５（Ｌ３）各遺伝子のコード領域を含むＰＣＲ増幅物をそれぞれ得た。ｐｒｍ７４およびｐｒｍ１９４を鋳型とし、配列番号２１２および２１３に示すヌクレオチド（図２０Ａ）をプライマーとしてＰＣＲを行い、ｐｒｍ７４断片およびｐｒｍ１９４断片をそれぞれ得た。各遺伝子のコード領域を含むＤＮＡ断片と、ｐｒｍ７４断片およびｐｒｍ１９４断片とをＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔ（製品名、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて接続した。大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換し、得られた形質転換体より、プラスミドを抽出した。ＰａａＦ（Ｅｃ）－ｄｃａＡ（Ａｂ）発現プラスミドとして「ｐｒｍ１２７」を、ＰａａＦ（Ｅｃ）－ｍｍｇＣ（Ｌ３）発現プラスミドとして「ｐｒｍ２３４」を、ＰａａＦ（Ｌ３）－ｍｍｇＣ（Ｌ３）発現プラスミドとして「ｐｒｍ１６６」を、それぞれ得た。
　Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｂａｙｌｙｉのｔｅｓＢ（Ａｂ）をコードするポリヌクレオチドは、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｂａｙｌｙｉの染色体ＤＮＡから配列番号２１４および２１５に示すヌクレオチド（図２０Ａ）をプライマーとしてＰＣＲを行い、ｔｅｓＢ（Ａｂ）遺伝子のコード領域を含むＰＣＲ増幅物をそれぞれ得た。ｐＣＤＦＤｕｅｔ－１を鋳型とし、配列番号２１６および２１７に示すヌクレオチド（図２０Ａ）をプライマーとしてＰＣＲを行い、ｐＣＤＦＤｕｅｔ－１断片を得た。各ｔｅｓＢ（Ａｂ）遺伝子コード領域を含むＤＮＡ断片と、ｐＣＤＦＤｕｅｔ－１断片とをＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔ（製品名、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて接続した。大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換し、得られた形質転換体より、プラスミドを抽出した。ＴｅｓＢ（Ａｂ）発現プラスミドとして「ｐｒｍ９２」を得た。
　大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株の遺伝子破壊株を下記の通りに作製した。乳酸デヒドロゲナーゼをコードするｌｄｈ遺伝子、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼをコードするａｔｏＢ遺伝子、およびスクシニルＣｏＡシンセターゼαサブユニットをコードするｓｕｃＤ遺伝子の破壊は、ｐＨＡＫ１（受領番号ＮＩＴＥ　Ｐ－０２９１９として、独立行政法人製品評価技術基盤機構　バイオテクノロジーセンター　特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（住所：千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２２号室）に２０１９年３月１８日に寄託した。国際寄託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２９１９）を用いた相同組換え法により行った。ｐＨＡＫ１は温度感受性変異型ｒｅｐＡ遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来レバンスクラーゼ遺伝子ＳａｃＢを含む。レバンスクラーゼ遺伝子は、スクロース存在下において宿主微生物に対して致死的に作用する。ＰＣＲ断片の増幅にはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　Ｍａｘ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（製品名、タカラバイオ製）、プラスミド調製は大腸菌ＨＳＴ０８株を用いて行った。
　大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、破壊標的遺伝子の上流領域、コード領域、および下流領域を含むＰＣＲ増幅物を得た。ｌｄｈ遺伝子周辺領域は配列番号２１８および２１９に示すヌクレオチド（図２０Ｂ）をプライマーとしてＰＣＲを行い、ａｔｏＢ遺伝子周辺領域は配列番号２２０および２２１に示すヌクレオチド（図２０Ｂ）をプライマーとしてＰＣＲを行い、ｓｕｃＤ遺伝子周辺領域は配列番号２２２および２２３に示すヌクレオチド（図２０Ｂ）をプライマーとしてＰＣＲを行い、それぞれの断片を得た。
　次に本ＰＣＲ増幅物をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔ（製品名、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて、配列番号２２４及び２２５に示すプライマーを（図２０Ｂ）用いて増幅したｐＨＡＫ１プラスミド断片に挿入し、環状化した。
　得られた破壊標的遺伝子の上流領域、コード領域、および下流領域のＤＮＡ断片が挿入されたｐＨＡＫ１プラスミドを鋳型として、ｌｄｈ遺伝子周辺領域は配列番号２２６および２２７に示すヌクレオチド（図２０Ｂ）をプライマーとしてＰＣＲを行い、ａｔｏＢ遺伝子周辺領域は配列番号２２８および２２９に示すヌクレオチド（図２０Ｂ）をプライマーとしてＰＣＲを行い、ｓｕｃＤ遺伝子周辺領域は配列番号２３０および２３１に示すヌクレオチドをプライマー（図２０Ｂ）としてＰＣＲを行い、破壊標的遺伝子のコード領域の一部領域または全領域が除かれたプラスミド断片を得た。
　得られたプラスミド断片を末端リン酸化、セルフライゲーションにより環状化し、遺伝子破壊用プラスミドを得た。
　塩化カルシウム法（羊土社　遺伝子工学実験ノート　田村隆明著、参照）により、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に所望の遺伝子の破壊のためのプラスミドを形質転換した後、カナマイシン硫酸塩１００ｍｇ／Ｌを含有するＬＢ寒天培地（トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、寒天末１５ｇ／Ｌ）に塗布し、３０℃で一晩培養してシングルコロニーを取得し、形質転換体を得た。本形質転換体をカナマイシン硫酸塩１００ｍｇ／Ｌを含有するＬＢ液体培地（トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ）１ｍＬに一白金耳植菌し、３０℃で振盪培養を行った。得られた培養液を、カナマイシン硫酸塩１００ｍｇ／Ｌを含有するＬＢ寒天培地に塗布し、４２℃で一晩培養した。得られるコロニーはシングルクロスオーバーにより、プラスミドがゲノム中に挿入されている。コロニーをＬＢ液体培地１ｍＬに一白金耳植菌し、３０℃で振盪培養を行った。得られた培養液を、スクロース１０％を含有するＬＢ寒天培地に塗布し、一晩培養した。得られたコロニーについて、所望の遺伝子が破壊されていることをコロニーダイレクトＰＣＲにより確認した。まず、ｌｄｈ遺伝子破壊株を構築し、本ｌｄｈ遺伝子破壊株を元にａｔｏＢ遺伝子破壊株を構築し、さらにｌｄｈ、ａｔｏＢ二重破壊株を元にｓｕｃＤ遺伝子破壊株を構築した。作製したｌｄｈ、ａｔｏＢ、ｓｕｃＤ遺伝子の三重破壊株をＡＳＬ０００株とした。
　構築したプラスミドをＡＳＬ０００株に形質転換し、アンピシリンナトリウム５０ｍｇ／Ｌ、カナマイシン硫酸塩３０ｍｇ／Ｌ、ストレプトマイシン硫酸塩５０ｍｇ／Ｌを含むＬＢ寒天培地（トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、寒天末１５ｇ／Ｌ）に塗布し、３７℃で２４時間インキュベートして形質転換体のシングルコロニーを得た。取得した形質転換体を表Ｂ－５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
＜取得酵素遺伝子を発現する組換え大腸菌によるアジピン酸生産試験＞
　表Ｂ－５に示す菌株を、アンピシリンナトリウム５０ｍｇ／Ｌ、カナマイシン硫酸塩３０ｍｇ／Ｌ、およびストレプトマイシン硫酸塩５０ｍｇ／Ｌを含むＬＢ液体培地（トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ）２ｍＬ（１４ｍＬ容ラウンドボトムチューブ）に一白金耳植菌し、３７℃で２４時間振盪培養を行い、前培養液を得た。前得られた前培養液１０μＬを、アンピシリンナトリウム５０ｍｇ／Ｌ、カナマイシン硫酸塩３０ｍｇ／Ｌ、およびストレプトマイシン硫酸塩５０ｍｇ／Ｌを含むＭＭ培地１ｍＬ（９６穴ディープウェルプレート）に植菌し、３７℃で４８時間振盪培養を行った。
ＭＭ培地の組成を表Ｂ－６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
　培養終了後、培養液中のアジピン酸およびアジピン酸類縁体の濃度を分析した。分析は、トリメチルシリル誘導体化を用いたＧＣ／ＭＳ分析によって行った。培養液遠心上清４０μＬ（内部標準としてセバシン酸二ナトリウムを終濃度１０ｍＭとなるように添加）に水：メタノール：クロロホルム＝５：２：２（ｖ／ｖ／ｖ）で混合した抽出液を３６０μＬ添加し、よく混合した。遠心分離（１６，０００×ｇ、５分）後、上清１００μＬを別のマイクロチューブに採取し、遠心エバポレータで１時間遠心濃縮した。得られた乾固物にメトキシアミン塩酸塩２０ｍｇ／ｍＬピリジン溶液１００μＬを添加し、３０℃で９０分振盪した。Ｎ－メチル－Ｎ－トリメチルシリルトリフルオロアセトアミド５０μＬを添加し、３７℃で３０分振盪した。反応溶液をＧＣ／ＭＳ測定試料とし、下記の条件で分析を行った。
　ＧＣ／ＭＳ分析条件
装置：ＧＣＭＳ－ＱＰ－２０２０ＮＸ（島津製作所製）
カラム：フューズドシリカキャピラリーチューブ　不活性処理チューブ（長さ１ｍ、外径０．３５ｍｍ、内径０．２５ｍｍ、ＧＬサイエンス社製）、ＩｎｅｒｔＣａｐ　５ＭＳ／ＮＰ（長さ３０ｍ、内径０．２５ｍｍ、膜厚０．２５μｍ、ＧＬサイエンス社製）
試料注入量：１μＬ
試料導入法：スプリット（スプリット比２５：１）
気化室温度：２３０℃
キャリアガス：ヘリウム
キャリアガス線速度：３９．０ｃｍ／秒
オーブン温度：８０℃、２分保持→１５℃／分昇温→３２５℃、１３分保持
イオン化法：電子イオン化法（ＥＩ）
イオン化エネルギー：７０ｅＶ
イオン源温度：２３０℃
スキャン範囲：ｍ／ｚ＝５０～５００
注入量：１μＬ
　結果を表Ｂ－７に示す。表中、「３ＯＡ」は３－オキソアジピン酸を、「ＬＥＶ」はレブリン酸を、「３ＨＡ」は３－ヒドロキシアジピン酸を、「２３ＤＡ」は２，３－デヒドロアジピン酸を、「ＡＤＡ」はアジピン酸を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
　Ｌ３株由来のＰａａＦ（Ｌ３）およびｍｍｇＣ（Ｌ３）の双方を発現させた発明株、すなわち、ＡＤＡ５００株およびＡＤＡ４９６株では、３－オキソアジピン酸(３－ＯＡ)、レブリン酸（ＬＥＶ）、３－ヒドロキシアジピン酸（３ＨＡ）、２，３－デヒドロアジピン酸（２３ＤＡ）、およびアジピン酸（ＡＤＡ）が対照株に比べ多く生成し、これらの合算値としてそれぞれ、３５５ｍｇ／Ｌおよび６１３ｍｇ／Ｌ生成した。以上の結果より、これらの遺伝子にコードされる酵素はアジピン酸経路反応を進行させる高い活性を有しており、アジピン酸およびアジピン酸誘導体の生成量を向上させることが示された。
　本発明は、例えば、Ｃ６化合物の効率的な製造プロセスを提供することができ、工業的規模での生産への応用が期待される。
　本発明はまた、バイオマス原料からの直接的なアジピン酸類の発酵生産において好適に利用できる。

Claims (29)

  1. 　２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡを還元してアジピルＣｏＡに変換する酵素活性を有するタンパク質をコードする外来性遺伝子を含む組換え微生物であって、
    　前記外来性遺伝子が、
    　（ｉ）配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６に示すアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
    　（ｉｉ）配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６に示すアミノ酸配列に対して１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
    　（ｉｉｉ）配列番号５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４または６５に示すポリヌクレオチド配列と８０％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡ、
    　（ｉｖ）配列番号５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４または６５に示すポリヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列に対して１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
    　（ｖ）配列番号５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４または６５に示すポリヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡと緊縮条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、または
    　（ｖｉ）配列番号５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４または６５に示すポリヌクレオチド配列の縮重異性体からなるＤＮＡ
    である、組換え微生物。
  2. 　前記外来性遺伝子が、
    　（ｘｉ）配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、または、
    　（ｘｉｉｉ）配列番号５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４または６５に示すポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡ
    である、請求項１に記載の組換え微生物。
  3. 　前記外来性遺伝子が、Ｃａｎｄｉｄａ　ａｕｒｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ｐｉｃｈｉａ　ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｔｈｅｌｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｈｉｅｌａｖｉｏｉｄｅｓ　ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ、Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ　ａｎｓｅｒｉｎａ、Ｐｕｒｐｕｒｅｏｃｉｌｌｉｕｍ　ｌｉｌａｃｉｎｕｍおよびＰｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ　ｔｅｒｅｓから選択される少なくとも１つに由来する、請求項１または２に記載の組換え微生物。
  4. 　前記組換え微生物が、Ｃ６化合物の生産経路を有し、
    　前記Ｃ６化合物が、アジピン酸、ヘキサメチレンジアミン、１，６－ヘキサンジオール、６－アミノヘキサン酸、６－アミノ－１－ヘキサノールおよび６－ヒドロキシヘキサン酸からなる群から選択される少なくとも一つである、請求項１～３のいずれか１項に記載の組換え微生物。
  5. 　前記組換え微生物が、エスケリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）属、アルカリハロバチルス（Ａｌｋａｌｉｈａｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、カンジタ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、またはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属する、請求項１～４のいずれか１項に記載の組換え微生物。
  6. 　前記組換え微生物が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）である、請求項１～５のいずれか１項に記載の組換え微生物。
  7. 　・３－オキソアジピルＣｏＡチオラーゼをコードする遺伝子、
    　・３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、
    　・３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼをコードする遺伝子、
    　・カルボン酸レダクターゼをコードする遺伝子、
    　・アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、および
    　・トランスアミナーゼ（アミノトランスフェラーゼ）をコードする遺伝子
    からなる群より選択される少なくとも１つをさらに含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の組換え微生物。
  8. 　請求項１～７のいずれか１項に記載の組換え微生物を培養する培養工程を含む、Ｃ６化合物の製造方法であって、
    　前記Ｃ６化合物が、アジピン酸、ヘキサメチレンジアミン、１，６－ヘキサンジオール、６－アミノヘキサン酸、６－アミノ－１－ヘキサノールおよび６－ヒドロキシヘキサン酸からなる群から選択される少なくとも一つである、製造方法。
  9. 　（ａ）２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡを還元してアジピルＣｏＡに変換する酵素活性を有し、
    　（ｂ）以下：
    　（ｉ）配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６に示すアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、
    　（ｉｉ）配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６に示すアミノ酸配列に対して１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる、
    　（ｉｉｉ）配列番号５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４または６５に示すポリヌクレオチド配列と８０％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡによってコードされる、
    　（ｉｖ）配列番号５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４または６５に示すポリヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列に対して１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる、
    　（ｖ）配列番号５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４または６５に示すポリヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡと緊縮条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされる、および
    　（ｖｉ）配列番号５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４または６５に示すポリヌクレオチド配列の縮重異性体からなるＤＮＡによってコードされる
    のいずれかである、組換えタンパク質。
  10. 　（ｘｉ）配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６に示すアミノ酸配列からなるか、または、
    　（ｘｉｉｉ）配列番号５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４または６５に示すポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡによってコードされる、組換えタンパク質。
  11. 　請求項９または１０に記載の組換えタンパク質を用いることを含む、Ｃ６化合物の製造方法。
  12. 　３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼをコードする外来性遺伝子および２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼをコードする外来性遺伝子のうちの少なくとも１つを含む、組換え微生物。
  13. 　前記３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼおよび２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼの少なくとも１つが、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｐ．）ＬＥＢＰ－３株（受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３３３４）に由来する、請求項１２に記載の組換え微生物。
  14. 　前記３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼが、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、
    　（１ａ）配列番号１６８に示す塩基配列からなるヌクレオチドおよび配列番号１６９に示す塩基配列からなるヌクレオチド、または
    　（１ｂ）配列番号１６８に示す塩基配列を含むヌクレオチドおよび配列番号１６９に示す塩基配列を含むヌクレオチド
    をプライマーとして使用したＰＣＲ増幅物と配列同一性が８０％以上、８５％以上、８８％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上であるＤＮＡにコードされ、
    　当該ＤＮＡは、６２６～９４０ｂｐを有する、請求項１２または１３に記載の組換え微生物。
  15. 　前記２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼが、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、
    　（２ａ）配列番号１７０に示す塩基配列からなるヌクレオチドおよび配列番１７１に示す塩基配列からなるヌクレオチド、または
    　（２ｂ）配列番号１７０に示す塩基配列を含むヌクレオチドおよび配列番号１７１に示す塩基配列を含むヌクレオチド
    をプライマーとして使用したＰＣＲ増幅物と配列同一性が８０％以上、８５％以上、８８％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上であるＤＮＡにコードされ、
    　当該ＤＮＡは、９２４～１３８６ｂｐを有する、請求項１２～１４のいずれか１項に記載の組換え微生物。
  16. 　前記３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼが、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、
    　（１ａ）配列番号１６８に示す塩基配列からなるヌクレオチドおよび配列番号１６９に示す塩基配列からなるヌクレオチド、または
    　（１ｂ）配列番号１６８に示す塩基配列を含むヌクレオチドおよび配列番号１６９に示す塩基配列を含むヌクレオチド
    をプライマーとして使用したＰＣＲ増幅物であるＤＮＡにコードされ、
    　当該ＤＮＡは、７８３または７８４ｂｐを有する、請求項１２または１３に記載の組換え微生物。
  17. 　前記２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼが、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、
    　（２ａ）配列番号１７０に示す塩基配列からなるヌクレオチドおよび配列番号１７１に示す塩基配列からなるヌクレオチド、または
    　（２ｂ）配列番号１７０に示す塩基配列を含むヌクレオチドおよび配列番号１７１に示す塩基配列を含むヌクレオチド
    をプライマーとして使用したＰＣＲ増幅物であるＤＮＡにコードされ、
    　当該ＤＮＡは、１１５５または１１５６ｂｐを有する、請求項１２～１４のいずれか１項に記載の組換え微生物。
  18. 　上記組換え微生物が、エッセリシア属、コリネバクテリウム属、バチルス属、アシネトバクター属、バークホルデリア属、シュードモナス属、クロストリジウム属、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、ヤロウィア属、カンジタ属、ピキア属およびアスペルギルス属からなる群より選択される属に属する、請求項１２～１７のいずれか１項に記載の組換え微生物。
  19. 　アジピン酸生産経路を有する、請求項１２～１８のいずれか一項に記載の組換え微生物。
  20. 　ヘキサメチレンジアミン生産経路を有する、請求項１２～１９のいずれか一項に記載の組換え微生物。
  21. 　１，６－ヘキサンジオール生産経路を有する、請求項１２～１９のいずれか一項に記載の組換え微生物。
  22. 　６－アミノ－１－ヘキサノール生産経路を有する、請求項１２～１９のいずれか一項に記載の組換え微生物。
  23. 　請求項１２～１８のいずれか１項に記載の組換え微生物を培養する培養工程を含む、目的化合物の製造方法であって、
    　前記目的化合物が、アジピン酸、アジピン酸誘導体、ヘキサメチレンジアミン、１，６－ヘキサンジオールおよび６－アミノ－１－ヘキサノールからなる群より選択され、
    　前記アジピン酸誘導体が、オキソアジピン酸、レブリン酸、３－ヒドロキシアジピン酸および２，３－デヒドロアジピン酸からなる群より選択される、製造方法。
  24. 　請求項１９に記載の組換え微生物を培養する培養工程を含む、アジピン酸の製造方法。
  25. 　請求項２０に記載の組換え微生物を培養する培養工程を含む、ヘキサメチレンジアミンの製造方法。
  26. 　請求項２１に記載の組換え微生物を培養する培養工程を含む、１，６－ヘキサンジオールの製造方法。
  27. 　請求項２２に記載の組換え微生物を培養する培養工程を含む、６－アミノ－１－ヘキサノールの製造方法。
  28. 　（Ａ－１）バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、
    　　（ａ１）配列番号１６８に示す塩基配列からなるヌクレオチドおよび配列番号１６９に示す塩基配列からなるヌクレオチド、または
    　　（ａ２）配列番号１６８に示す塩基配列を含むヌクレオチドおよび配列番号１６９に示す塩基配列を含むヌクレオチド
    をプライマーとして使用したＰＣＲ増幅物と配列同一性が８０％以上、８５％以上、８８％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上であるＤＮＡにコードされる組換えポリペプチドであって、
    　３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼ活性を有し、
    　前記ＤＮＡは、６２６～９４０ｂｐを有する、組換えポリペプチド；
    　（Ａ－２）バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、
    　　（ａ１）配列番号１６８に示す塩基配列からなるヌクレオチドおよび配列番号１６９に示す塩基配列からなるヌクレオチド、または
    　　（ａ２）配列番号１６８に示す塩基配列を含むヌクレオチドおよび配列番号１６９に示す塩基配列を含むヌクレオチド
    をプライマーとして使用したＰＣＲ増幅物であるＤＮＡによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列に対して１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる組換えポリペプチドであって、
    　３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼ活性を有し、
    　前記ＤＮＡは、６２６～９４０ｂｐを有する、組換えポリペプチド；
    または
    　（Ａ－３）バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、
    　　（ａ１）配列番号１６８に示す塩基配列からなるヌクレオチドおよび配列番号１６９に示す塩基配列からなるヌクレオチド、または
    　　（ａ２）配列番号１６８に示す塩基配列を含むヌクレオチドおよび配列番号１６９に示す塩基配列を含むヌクレオチド
    をプライマーとして使用したＰＣＲ増幅物の縮重異性体からなるＤＮＡにコードされる組換えポリペプチドであって、
    　３－ヒドロキシアジピルＣｏＡデヒドラターゼ活性を有し、
    　前記ＤＮＡは、６２６～９４０ｂｐを有する、組換えポリペプチド。
  29. 　（Ｂ－１）バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、
    　　（ｂ１）配列番号１７０に示す塩基配列からなるヌクレオチドおよび配列番号１７１に示す塩基配列からなるヌクレオチド、または
    　　（ｂ２）配列番号１７０に示す塩基配列を含むヌクレオチドおよび配列番号１７１に示す塩基配列を含むヌクレオチド
    をプライマーとして使用したＰＣＲ増幅物と配列同一性が８０％以上、８５％以上、８８％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上であるＤＮＡにコードされる組換えポリペプチドであって、
    　２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼ活性を有し、
    　前記ＤＮＡは、９２４～１３８６ｂｐを有する、組換えポリペプチド；
    　（Ｂ－２）バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、
    　　（ｂ１）配列番号１７０に示す塩基配列からなるヌクレオチドおよび配列番号１７１に示す塩基配列からなるヌクレオチド、または
    　　（ｂ２）配列番号１７０に示す塩基配列を含むヌクレオチドおよび配列番号１７１に示す塩基配列を含むヌクレオチド
    をプライマーとして使用したＰＣＲ増幅物であるＤＮＡによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列に対して１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる組換えポリペプチドであって、
    　２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼ活性を有し、
    　前記ＤＮＡは、９２４～１３８６ｂｐを有する、組換えポリペプチド；
    または
    　（Ｂ－３）バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｐ.）ＬＥＢＰ－３株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、
    　　（ｂ１）配列番号１７０に示す塩基配列からなるヌクレオチドおよび配列番号１７１に示す塩基配列からなるヌクレオチド、または
    　　（ｂ２）配列番号１７０に示す塩基配列を含むヌクレオチドおよび配列番号１７１に示す塩基配列を含むヌクレオチド
    をプライマーとして使用したＰＣＲ増幅物の縮重異性体からなるＤＮＡにコードされる組換えポリペプチドであって、
    　２，３－デヒドロアジピルＣｏＡレダクターゼ活性を有し、
    　前記ＤＮＡは、９２４～１３８６ｂｐを有する、組換えポリペプチド。
PCT/JP2022/015439 2021-03-30 2022-03-29 組換え微生物及びｃ６化合物の製造方法 Ceased WO2022210708A1 (ja)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP22780919.1A EP4317416A4 (en) 2021-03-30 2022-03-29 Recombinant microorganism and method for producing a C6 compound
JP2023511377A JP7625070B2 (ja) 2021-03-30 2022-03-29 組換え微生物及びｃ６化合物の製造方法
CN202280025115.9A CN117441008A (zh) 2021-03-30 2022-03-29 重组微生物和c6化合物的制造方法
US18/284,539 US20240158803A1 (en) 2021-03-30 2022-03-29 Recombinant microorganism and method for producing c6 compound
KR1020237037089A KR20230159611A (ko) 2021-03-30 2022-03-29 재조합 미생물 및 c6 화합물의 제조 방법

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2021057325A JP7038241B1 (ja) 2021-03-30 2021-03-30 組換え微生物及びアジピン酸又はその誘導体の製造方法
JP2021-057325 2021-03-30
JP2021069632 2021-04-16
JP2021-069632 2021-04-16

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2022210708A1 true WO2022210708A1 (ja) 2022-10-06

Family

ID=83456322

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2022/015439 Ceased WO2022210708A1 (ja) 2021-03-30 2022-03-29 組換え微生物及びｃ６化合物の製造方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20240158803A1 (ja)
EP (1) EP4317416A4 (ja)
JP (1) JP7625070B2 (ja)
KR (1) KR20230159611A (ja)
WO (1) WO2022210708A1 (ja)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117821351A (zh) * 2023-12-29 2024-04-05 淮北矿业绿色化工新材料研究院有限公司 一种生产己二胺的菌株及其制备方法
CN118185844A (zh) * 2023-12-29 2024-06-14 淮北矿业绿色化工新材料研究院有限公司 一种己二胺高产菌株及其制备方法
EP4317437A4 (en) * 2021-03-30 2024-11-20 Asahi Kasei Kabushiki Kaisha Recombinant polypeptide having carboxylic acid reducing activity

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995007996A1 (en) 1993-09-16 1995-03-23 Purdue Research Foundation Synthesis of adipic acid from biomass-derived carbon sources
WO2010104391A2 (en) 2009-03-11 2010-09-16 Dsm Ip Assets B.V. Preparation of adipic acid
JP2011512868A (ja) 2008-03-11 2011-04-28 ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． アジピン酸（エステルまたはチオエステル）の合成
JP2011515111A (ja) 2008-03-27 2011-05-19 ジェノマティカ， インコーポレイテッド アジピン酸および他の化合物を生成するための微生物
JP2016533162A (ja) * 2013-09-17 2016-10-27 ズィモケム インコーポレイテッドＺｙｍｏｃｈｅｍ Ｉｎｃ． 再生可能資源から化合物を生成するための高収量経路
JP2018500911A (ja) * 2014-12-23 2018-01-18 ジェノマティカ， インコーポレイテッド ジアミンの製造および処理方法
WO2020219859A1 (en) 2019-04-24 2020-10-29 Genomatica, Inc. Engineered trans-enoyl coa reductase and methods of making and using

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH077996A (ja) 1991-06-12 1995-01-10 Yuuji Tanose 水中で気体を発生させ、その浮力を利用して発電する浮力発電 システム
JP2010104391A (ja) 2008-10-28 2010-05-13 Hoya Corp 蛍光観察用プローブ
WO2012089613A1 (en) * 2010-12-28 2012-07-05 Dsm Ip Assets B.V. Process to increase the production of a succinyl-coa derived compound

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995007996A1 (en) 1993-09-16 1995-03-23 Purdue Research Foundation Synthesis of adipic acid from biomass-derived carbon sources
JP2011512868A (ja) 2008-03-11 2011-04-28 ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． アジピン酸（エステルまたはチオエステル）の合成
JP2011515111A (ja) 2008-03-27 2011-05-19 ジェノマティカ， インコーポレイテッド アジピン酸および他の化合物を生成するための微生物
JP5951990B2 (ja) 2008-03-27 2016-07-13 ジェノマティカ， インコーポレイテッド アジピン酸および他の化合物を生成するための微生物
WO2010104391A2 (en) 2009-03-11 2010-09-16 Dsm Ip Assets B.V. Preparation of adipic acid
JP2016533162A (ja) * 2013-09-17 2016-10-27 ズィモケム インコーポレイテッドＺｙｍｏｃｈｅｍ Ｉｎｃ． 再生可能資源から化合物を生成するための高収量経路
JP2018500911A (ja) * 2014-12-23 2018-01-18 ジェノマティカ， インコーポレイテッド ジアミンの製造および処理方法
WO2020219859A1 (en) 2019-04-24 2020-10-29 Genomatica, Inc. Engineered trans-enoyl coa reductase and methods of making and using

Non-Patent Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Gene Cloning and DNA analysis", 2016, WILEY-BLACKWELL
"Gene Expression Technology: Methods in Enzymology", vol. 185, 1990, ACADEMIC PRESS, pages: 185
CAS , no. 1191-25-9
DATABASE PROTEIN 15 November 2017 (2017-11-15), ANONYMOUS : "hypothetical protein B9J08_005027 [[Candida] auris]", XP055974415, retrieved from NCBI Database accession no. B9J08_005027 *
EHMANN ET AL., BIOCHEMISTRY, vol. 38, no. 19, 1999, pages 6171 - 6177
GALMAN ET AL., GREEN CHEMISTRY, vol. 19, no. 2, 2017, pages 361 - 366
GENE, vol. 105, 1991, pages 61 - 72
KALLSCHEUER, NICOLAI ET AL.: "Improved production of adipate with Escherichia coli by reversal of β-oxidation.", APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, vol. 101, no. 6, 2017, pages 2371 - 2382
LU ET AL., JOURNAL OF BACTERIOLOGY, vol. 184, no. 14, 2002, pages 3765 - 3773
SAMSONOVA ET AL., BMC MICROBIOLOGY, vol. 3, no. 1, 2003, pages 2
SATTLER ET AL., ANGEWANDTE CHEMIE, vol. 124, no. 36, 2012, pages 9290 - 9293
See also references of EP4317416A4
SUNG ET AL., GREEN CHEMISTRY, vol. 20, no. 20, 2018, pages 4591 - 4595
VENKITASUBRAMANIAN ET AL., JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 282, no. 1, 2007, pages 478 - 485

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4317437A4 (en) * 2021-03-30 2024-11-20 Asahi Kasei Kabushiki Kaisha Recombinant polypeptide having carboxylic acid reducing activity
CN117821351A (zh) * 2023-12-29 2024-04-05 淮北矿业绿色化工新材料研究院有限公司 一种生产己二胺的菌株及其制备方法
CN118185844A (zh) * 2023-12-29 2024-06-14 淮北矿业绿色化工新材料研究院有限公司 一种己二胺高产菌株及其制备方法
CN118185844B (zh) * 2023-12-29 2024-12-03 淮北矿业绿色化工新材料研究院有限公司 一种己二胺高产菌株及其制备方法
CN117821351B (zh) * 2023-12-29 2024-12-03 淮北矿业绿色化工新材料研究院有限公司 一种生产己二胺的菌株及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
KR20230159611A (ko) 2023-11-21
JP7625070B2 (ja) 2025-01-31
JPWO2022210708A1 (ja) 2022-10-06
EP4317416A4 (en) 2025-06-25
US20240158803A1 (en) 2024-05-16
EP4317416A1 (en) 2024-02-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230022583A1 (en) Adipate (ester or thioester) synthesis
US20200255840A1 (en) High yield route for the production of 1, 6-hexanediol
JP7625070B2 (ja) 組換え微生物及びｃ６化合物の製造方法
CN102690774A (zh) 重组微生物、重组载体及制备3-羟基丙酸的方法
WO2009089457A1 (en) Methods for producing 3-hydroxypropionic acid and compounds thereof
EP3155108A1 (en) Methods, reagents and cells for biosynthesizing compounds
JP2022530475A (ja) 遺伝子操作された微生物及びアルデヒド脱水素酵素活性の改善方法
US12104160B2 (en) Production of 4,6-dihydroxy-2-oxo-hexanoic acid
JP7038241B1 (ja) 組換え微生物及びアジピン酸又はその誘導体の製造方法
CN117441008A (zh) 重组微生物和c6化合物的制造方法
JP7827466B2 (ja) 改変微生物及び化合物の製造方法
JP7696228B2 (ja) 組換え微生物及び化合物の製造方法
CN117500912A (zh) 具有二胺生产能力的重组微生物和二胺的制造方法
JP7672486B2 (ja) ジアミン生産能を有する組換え微生物およびジアミンの製造方法
JP2023132560A (ja) １，２－シクロヘキサンジオール生合成のための微生物および製造方法
JP2025087535A (ja) 組換え微生物、組換えタンパク質およびｃ６化合物の製造方法
JP2024092581A (ja) カルボン酸生産能を有する好塩性の組換え微生物
JP2023127841A (ja) ２，６－キシレノール生合成のための微生物および製造方法
JP2023012570A (ja) リジンアンモニアリアーゼ活性を有する組換えポリペプチド
AU2015203845B2 (en) Adipate ester or thioester synthesis
WO2025170543A1 (en) Production of 1,4-butanediol via condensation of c1-derived formyl-coa and 3-hydroxypropionaldehyde derived from glycerol, ethylene glycol, and c1 feedstocks

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 22780919

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 202280025115.9

Country of ref document: CN

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2301006250

Country of ref document: TH

Ref document number: 2023511377

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 18284539

Country of ref document: US

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20237037089

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1020237037089

Country of ref document: KR

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2022780919

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2022780919

Country of ref document: EP

Effective date: 20231030