WO2022215749A1

WO2022215749A1 - 分析方法および前処理装置

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Publication number: WO2022215749A1
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Inventors: 大輔川上; 大樹瀬戸山; 東天康; 泰植柳
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Abstract

分析システム（１０００）において、前処理装置（４００）は、代謝異常症に関する試料（被験者の代謝物に基づく試料）を、試薬と反応させる。試薬は、３－ニトロフェニルヒドラジンを含む。試料が試薬と反応することにより、試料に含まれる有機酸が誘導体化される。前処理装置（４００）は、誘導体化された有機酸を含む試料をＬＣ質量分析計（１００）へ搬送する。ＬＣ質量分析計（１００）は、搬送されてきた試料を分析する。

Description

分析方法および前処理装置

　本発明は、代謝異常症に関する試料の分析に関する。

　代謝異常症の検査について開示する文献の一つとして、久原とみ子、タンデムマスを用いる先天性代謝異常症の拡大スクリーニングの現状、日衛誌、一般社団法人日本衛生学会、２０１４年、６９，ｐ６０－ｐ７４が挙げられる。この文献は、簡易検査（一次スクリーニング）と、簡易検査より精密な検査であって、簡易検査の結果に基づいて実施される確認検査（二次スクリーニング）とを開示している。この文献は、また、確認検査に利用される試料の分析方法の一つとして、ガスクロマトグラフィー－質量分析法（ＧＣ／ＭＳ）を利用した方法を開示している。この文献は、さらに、ＧＣ／ＭＳを利用した検査方法について、液体クロマトグラフィー－質量分析法（ＬＣ／ＭＳ）等の他の分析方法を利用した検査方法と比較して、情報やデータの蓄積が圧倒的に多いことを開示している。そして、従来、代謝異常症の確認検査のための分析方法として、ＧＣ／ＭＳが採用されていた。

久原とみ子、タンデムマスを用いる先天性代謝異常症の拡大スクリーニングの現状、日衛誌、一般社団法人日本衛生学会、２０１４年、６９，ｐ６０－ｐ７４

　患者の容体が急激に変化した場合など、代謝異常症の精密な検査の結果が即時に必要とされる場合がある。しかしながら、ＧＣ／ＭＳによる分析は、試料の前処理（有機溶媒による有機酸の抽出、有機層の乾固、など）に長時間を必要とする。したがって、試料を短時間で分析でき、これにより、代謝異常症の確認検査を短時間で実施できるようにするための技術が求められていた。

　本発明は、係る実情に鑑み考え出されたものであり、その目的は、代謝異常症の精密な検査が短時間で実施されるようにするための技術を提供することである。

　本開示のある局面に従う分析方法は、代謝異常症に関する試料の分析方法であって、３－ニトロフェニルヒドラジンを含む試薬と反応させることにより、被験者の代謝物に基づく試料を誘導体化するステップと、誘導体化された試料を、液体クロマトグラフ質量分析装置に導入するステップと、液体クロマトグラフ質量分析装置によって、誘導体化された試料を分析するステップとを備える。

　本開示の他の局面に従う分析方法は、代謝異常症に関する試料の分析方法であって、分析の種類の入力を受け付けるステップと、入力が第１の種類の入力である場合に、被験者の代謝物に基づく試料を、第１の流れに従い、液体クロマトグラフ質量分析装置を用いて分析するステップと、入力が第２の種類の入力である場合に、被験者の代謝物に基づく試料を、第２の流れに従い、液体クロマトグラフ質量分析装置を用いて分析するステップと、を備える。第１の流れは、３－ニトロフェニルヒドラジンを含む試薬と反応させることにより、試薬を誘導体化することと、誘導体化された試料を、液体クロマトグラフ質量分析装置に導入することと、液体クロマトグラフ質量分析装置によって、誘導体化された試料を分析することと、を含み、第２の流れは、試料を誘導体化することなく液体クロマトグラフ質量分析装置に導入することと、液体クロマトグラフ質量分析装置によって、試料を分析することと、を含む。

　本開示のさらに他の局面に従う分析方法は、代謝異常症に関する試料の分析方法であって、被験者の代謝物に基づく試料にアルコールを添加するステップと、アルコールを添加された試料をろ過するステップと、試薬と反応させることにより、ろ過された試料を誘導体化するステップと、誘導体化された試料を、液体クロマトグラフ質量分析装置に導入するステップと、液体クロマトグラフ質量分析装置によって、誘導体化された試料を分析するステップとを備える。

　本開示のある局面に従う前処理装置は、代謝異常症に関する試料の前処理を実施する前処理装置であって、３－ニトロフェニルヒドラジンを含む試薬と反応させることにより、被験者の代謝物に基づく試料を誘導体化する誘導体化部と、誘導体化された試料を、液体クロマトグラフ質量分析装置に導入する搬送部と、を備える。

　本開示の他の局面に従う前処理装置は、代謝異常症に関する試料の前処理を実施する前処理装置であって、分析の種類の入力を受け付ける入力部と、試料を３－ニトロフェニルヒドラジンを含む試薬と反応させることにより、誘導体化する誘導体化部と、試料を液体クロマトグラフ質量分析装置に導入する搬送部と、を備える。入力が第１の種類の入力である場合に、誘導体化部は、被験者の代謝物に基づく試料を試薬と反応させることによって誘導体化し、搬送部は、誘導体化部によって誘導体化された試料を、液体クロマトグラフ質量分析装置に導入する。入力が第２の種類の入力である場合に、搬送部は、誘導体化部によって誘導体化されていない試料を、液体クロマトグラフ質量分析装置に導入する。

　本開示のさらに他の局面に従う前処理装置は、代謝異常症に関する試料の前処理を実施する前処理装置であって、被験者の代謝物に基づく試料にアルコールを添加する添加部と、アルコールを添加された試料をろ過するろ過部と、試薬と反応させることにより、ろ過された試料を誘導体化する誘導体化部と、誘導体化された試料を、液体クロマトグラフ質量分析装置に導入する搬送部と、を備える。

　本開示のある局面に従うと、第１項に記載の分析方法によれば、試料に含まれる有機酸は、３－ニトロフェニルヒドラジンを含む試薬と反応することにより誘導体化され、これにより、短時間で誘導体化される。

　本開示の他の局面に従うと、液体クロマトグラフ質量分析装置が、確認検査用の分析にも簡易検査用の分析にも利用される。また、確認検査用の分析では、試料に含まれる有機酸は、３－ニトロフェニルヒドラジンを含む試薬と反応することにより誘導体化され、これにより、短時間で誘導体化される。

　本開示のさらに他の局面に従うと、誘導体化において有機溶媒の乾固が必要とされず、これにより、試料に含まれる有機酸が短時間で誘導体化される。

本開示の一実施の形態に従う分析システム１０００の概略構成図である。２５種類の疾患の種別を示す図である。疾患の有無などの判定のために分析システム１０００において測定対象とされる、有機酸の具体例を示す図である。誘導体化部４０６における誘導体化反応を示す化学反応式の一例である。分析システム１０００による、代謝異常症に関する試料の分析方法の一例を示すフローチャートである。２３種類の有機酸のそれぞれの回収率の一例を示す図である。図５に示された分析方法の変形例を示すフローチャートである。

　以下、本開示の実施の形態について、図面を参照しながら詳細に説明する。なお、図中同一または相当部分には同一符号を付してその説明は繰り返さない。本開示の実施の形態について、試薬などの分量、温度、および濃度などの数値が開示されているが、この数値は、開示されている値そのもののみならず、該開示されている値の近傍または該開示されている値によって奏される効果と同質の効果を奏する範囲も含むものとする。

　［分析システムの構成］
　図１は、本開示の一実施の形態に従う分析システム１０００の概略構成図である。図１を参照して、分析システム１０００は、液体クロマトグラフ質量分析計１００（以下、「ＬＣ質量分析計１００」という）と、前処理装置４００とを備える。

　［ＬＣ質量分析計の構成］
　次に、図１を参照しながら、ＬＣ質量分析計１００の構成を説明する。ＬＣ質量分析計１００は、移動相を収容する溶媒容器１１０と、送液ポンプ１２０と、インジェクタ１３０と、カラムオーブン１４０と、質量分析器１５０と、制御部２００と、データ処理部３００とを備える。

　制御部２００は、ＣＰＵ（Central　Processing　Unit）２１０と、メモリ２２０と、インターフェース（Ｉ／Ｆ）２３０とを含む。制御部２００は、ＬＣ質量分析計１００内の要素（送液ポンプ１２０、質量分析器１５０、データ処理部３００、表示部２６０、など）の動作を制御する。制御部２００は、Ｉ／Ｆ２３０を介して、ユーザインターフェースである入力部２５０および表示部２６０と接続されている。接続は、有線であってもよいし、無線であってもよい。

　入力部２５０は、たとえばキーボードおよび／またはポインティングデバイス（マウスなど）であり、ユーザ（たとえば、分析担当者）からの入力を受け付ける。表示部２６０は、たとえば液晶パネルで構成され、ユーザに情報を表示する。ユーザインターフェースとしてタッチパネルが用いられる場合には、入力部２５０と表示部２６０とが一体的に形成される。

　送液ポンプ１２０は、溶媒容器１１０から液体の移動相を吸引し、当該液体をカラム１４５に向けて一定流量で供給する。インジェクタ１３０は、送液ポンプ１２０によって供給された移動相に、分析対象の試料を注入する。

　インジェクタ１３０は、制御部２００からの指令に基づくタイミングで移動相中に分析対象の試料を注入する。注入された試料は、送液ポンプ１２０によって送給された移動相の流れに乗ってカラム１４５に供給される。インジェクタ１３０は、たとえば、オートサンプラを含む。試料は、前処理装置４００からインジェクタ１３０へ導入され得る。

　カラムオーブン１４０は、カラム１４５を収容する。制御部２００は、カラムオーブン１４０において、カラム１４５の周囲温度を所定の温度に調整する。

　インジェクタ１３０に注入された試料は、移動相の液体とともに、カラム１４５に導入される。カラム１４５は、試料中の各種成分を分離する。

　質量分析器１５０は、検出対象となる目的成分をイオンとして抽出し、このイオンを測定することにより、目的成分の濃度（および／または量）などを検出する。質量分析器１５０は、検出値を示すデータを、データ処理部３００に出力する。目的成分は、たとえば、後述される、図３に示された２３種類の有機酸のそれぞれである。

　質量分析器１５０は、内部標準法に従って、目的成分の濃度を特定してもよい。内部標準法は、目的成分および内部標準物質のそれぞれの、ピーク面積比と濃度比の間の関係に基づいて、目的成分の濃度を求める方法である。

　データ処理部３００は、検出値を示すデータを処理することにより、クロマトグラムを生成する。データ処理部３００は、たとえば、コンピュータにインストールされた専用のソフトウェアを当該コンピュータ上で動作させることによって具現化される。データ処理部３００は、制御部２００からの指令に基づいて、質量分析器１５０から出力されたデータをクロマトグラムデータとして格納し、得られたクロマトグラムデータに基づいてクロマトグラムを作成する。作成されたクロマトグラムは、制御部２００内のメモリ２２０に記憶される。制御部２００は、ユーザからの要求に応じて、クロマトグラムを表示部２６０に表示する。制御部２００は、また、前処理装置４００からの指令に応じて、クロマトグラムを前処理装置４００へ送信する。

　［代謝異常症］
　分析システム１０００は、被験者の代謝物を分析することにより、被験者の代謝異常症の有無を判定するためのデータを出力する。被験者の代謝物は、たとえば、液体であり、典型的には、血清、血漿または尿である。被験者の代謝物は、全血であってもよい。分析システム１０００は、さらに、代謝異常症の種別を判定するためのデータを出力することができる。以下、代謝異常症は、先天性代謝異常症であってもよく、「疾患」とも称される。

　図２は、２５種類の疾患の種別を示す図である。図２の例に示されるように、疾患は、アミノ酸代謝異常と、有機酸代謝異常と、脂肪酸代謝異常とに大別される。図２の例では、アミノ酸代謝異常は、フェニルケトン症（識別番号１）を含む。有機酸代謝異常は、メチルマロン酸血症（識別番号９）を含む。脂肪酸代謝異常は、三頭酵素欠損症（識別番号１９）を含む。

　図３は、疾患の有無などの判定のために分析システム１０００において測定対象とされる、有機酸の具体例を示す図である。図３には、２３種類の化合物が示される。なお、図３では、水酸基を示す「hydroxy」が「ＯＨ」で示されている。

　図３の例では、代謝物に含まれる有機酸として、３－ヒドロキシプロピオン酸（識別番号１）と、メチルマロン酸（識別番号２）と、イソバレリルグリシン（識別番号３）と、３－イソバレリック酸（識別番号４）と、３－メチルクロトニルグリシン（識別番号５）と、３－ヒドロキシ－３－メチルグルタル酸（識別番号６）と、２－メチル－３－ヒドロキシブチル酸（識別番号７）と、グルタル酸（識別番号８）と、３－メチルグルタコン酸（識別番号９）と、３－メチルグルタル酸（識別番号１０）と、３－ヒドロキシグルタル酸（識別番号１１）と、２－ヒドロキシグルタル酸（識別番号１２）と、３－ヒドロキシブチル酸（識別番号１３）と、ピルビン酸（識別番号１４）と、乳酸（識別番号１５）と、３－ヒドロキシイソ酪酸（識別番号１６）と、エチルマロン酸（識別番号１７）と、メチルコハク酸（識別番号１８）と、アジピン酸（識別番号１９）と、Ｎ－ヘキサノイルグリシン（識別番号２０）と、スベリン酸（識別番号２１）と、セバシン酸（識別番号２２）と、スベロイルグリシン（識別番号２３）とが示されている。測定対象の有機酸（被験者の疾患の有無を判定するための有機酸）は、識別番号１～２３からなる群より選ばれる少なくとも１種類を含む。

　分析システム１０００では、質量分析器１５０は、有機酸（目的成分）の検出値（たとえば、試料中の濃度）を導出する。分析システム１０００は、各有機酸の検出値を、分析結果として出力してもよい。医師は、各有機酸の検出値が各有機酸について予め定められた正常範囲に属するか否かに基づいて、各有機酸に対応する疾患の有無および該疾患の種別を判定することができる。

　たとえば、医師は、被験者の代謝物に含まれる有機酸のうち３－ヒドロキシプロピオン酸（図３の識別番号１）の検出値が正常範囲に属していないと判断すると、該被験者の疾患がプロピオン酸血症（図２の識別番号１０）であると判定する。

　また、医師は、被験者の代謝物に含まれる有機酸のうちのメチルマロン酸（図３の識別番号２）の検出値が正常範囲に属していないと判断すると、該被験者の疾患がメチルマロン酸血症（図２の識別番号９）であると判定する。

　［前処理装置の構成］
　再び図１を参照しながら、前処理装置４００の構成を説明する。前処理装置４００は、制御部４０１と、添加部４０２と、ろ過部４０４と、誘導体化部４０６と、搬送部４０８とを含む。

　制御部４０１は、ＣＰＵ４１０と、メモリ４２０と、Ｉ／Ｆ４３０とを含む。制御部４０１は、前処理装置４００内の要素（添加部４０２、ろ過部４０４、誘導体化部４０６、搬送部４０８、表示部４６０、など）の動作を制御する。制御部４０１は、Ｉ／Ｆ４３０を介して、入力部４５０および表示部４６０と接続されている。接続は、有線であってもよいし、無線であってもよい。入力部４５０は、たとえばキーボードおよび／またはポインティングデバイス（マウスなど）であり、ユーザからの入力を受け付ける。表示部４６０は、たとえば液晶パネルで構成され、ユーザに情報を表示する。ユーザインターフェースとしてタッチパネルが用いられる場合には、入力部４５０と表示部４６０とが一体的に形成される。

　制御部４０１は、分析システム１０００を統括的に制御する。すなわち、制御部４０１は、ＬＣ質量分析計１００の制御部２００と、Ｉ／Ｆ４３０およびＩ／Ｆ２３０を介して接続されており、制御部２００に指令を送信する。接続は、有線であってもよいし、無線であってもよい。

　前処理装置４００は、被験者の代謝物（血清、血漿または尿）に基づく試料を受ける。代謝物に基づく試料は、乾燥ろ紙血（Dried　Blood　Sample）から取得された血液であってもよいし、被験者から採取された代謝物そのものであってもよいし、ろ紙血検体であってもよい。

　添加部４０２は、試料に対して除蛋白用の溶液を添加する。添加部４０２は、試料に対して除蛋白用の溶液を添加（分注）する機構を含む。溶液は、溶媒と、測定対象の有機酸に対応する内部標準物質とを含む。溶媒は、たとえばアルコールである。内部標準物質は、たとえば２－エチル酪酸（2-Ethylbutyric　Acid）である。

　上記溶液を添加された上記試料は、ろ過部４０４によりろ過されることによりこの物質から蛋白質が除去される。ろ過部４０４は、たとえば、厚さ０．４５μｍのテフロン（登録商標）フィルタを利用して吸引ろ過する機構を含む。

　蛋白質が除去された後の試料は、誘導体化部４０６によって誘導体化される。より具体的には、誘導体化部４０６は、蛋白質が除去された後の試料に試薬を試薬と反応させることにより、該試料に含まれる有機酸のカルボキシル基を誘導体化させる。誘導体化部４０６は、たとえば、上記試薬を、試料に分注する機構を含む。この誘導体化により、質量分析器１５０におけるイオン化効率を向上させることができる。また、誘導体化により有機酸のモル質量を大きくすることができ、これにより、質量分析器１５０による分析精度を向上させることができる。

　次に、誘導体化に用いられる試薬について説明する。試薬は、第１物質と、該第１物質と同量の第２物質とが混在されることにより生成される。

　第１物質は、たとえば、３－ニトロフェニルヒドラジン（以下、「３－ＮＰＨ」とも称する）を、７５％のメタノールに溶解させて、３－ＮＰＨの濃度を２００ｍＭとした物質である。

　第２物質は、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（以下、「ＥＤＣ」とも称する）およびピリジンを、７５％のメタノールに溶解させて、ＥＤＣの濃度を２００ｍＭとしかつピリジンの濃度を９％とした物質である。

　７５％のメタノールは、たとえば、メタノールを水に混合させて生成される。「Ｍ」は、モル濃度（モル／リットル）を表す。ピリジンの濃度である「％」は、重量濃度（重さ／体積）を表す。

　図４は、誘導体化部４０６における誘導体化反応を示す化学反応式の一例である。図４の化学反応式の左辺の第１項は、試料に含まれる有機酸（カルボン酸）を表す。左辺の第２項は、３－ＮＰＨを表す。右辺は、誘導体化された有機酸を表す。本明細書では、試料に含まれる有機酸が誘導体化された場合、誘導体化された有機酸を含む状態の試料を、「誘導体化された試料」と称する。

　図４の例は、蛋白質が除去された後の試料（有機酸）を、室温（たとえば、２５度）で１５分間試薬と反応させる。これにより、有機酸のカルボキシル基が誘導体化される。図４の例では、ＥＤＣとピリジンとは触媒として機能する。

　誘導体化後の有機酸（化学反応式の右辺に示される物質）では、Ｎ－Ｎ結合は切れやすい傾向にある。つまり、前処理装置４００は、カルボキシル基を誘導体化することにより、イオン化し易い物質（誘導体化後の有機酸）を生成する。また、誘導体化後の物質の分子量（モル質量）は、元の有機酸の分子量（モル質量）よりも大きい。したがって、前処理装置４００は、カルボキシル基を誘導体化させることにより、元の有機酸のモル質量よりも大きいモル質量の物質（誘導体化後の有機酸）を生成する。

　再度、図１を参照する。搬送部４０８は、前処理装置４００内の試料（の容器）を、ＬＣ質量分析計１００のインジェクタ１３０へ搬送する。前処理装置４００内の試料は、インジェクタ１３０へ搬送される前に、誘導体化されていてもよいし、誘導体化されていなくてもよい。

　［分析方法］
　図５は、分析システム１０００による、代謝異常症に関する試料の分析方法の一例を示すフローチャートである。図５の例では、試料の一例として、被験者の１０μＬの血清が利用される。

　まず、ステップＳ１００において、ユーザは、前処理装置４００に試料をセットする。試料は、被験者の代謝物そのものであってもよいし、ユーザまたは前処理装置４００におて、被験者の代謝物から調整されてもよい。

　次に、ステップＳ１０４において、添加部４０２は、試料に、上述の溶媒と内部標準物質とを含む溶液を添加する。

　次に、ステップＳ１０６において、ろ過部４０４は、ステップＳ１０４において溶液を添加された試料をろ過することにより、試料から蛋白質を除去する。

　次に、ステップＳ１０８において、誘導体化部４０６は、蛋白質が除去された試料を誘導体化させる。

　誘導体化において、誘導体化部４０６は、ステップＳ１０６においてタンパク質を除去された試料に試薬を添加する。試薬は、２５μＬの第１物質と、２５μＬの第２物質とから構成される。上述のように、第１物質は、２００ｍＭの濃度で３－ＮＰＨを含む物質であってもよい。第２物質は、２００ｍＭの濃度でＥＤＣを含み、９％の濃度でピリジンを含む、物質であってもよい。

　誘導体化部４０６は、上記試料に上記試薬を添加した後、誘導体化のための反応条件を実現する。反応条件は、たとえば、撹拌しながら１５分室温（たとえば、２５℃）を維持することである。誘導体化部４０６は、試料の容器を撹拌のために揺動する機構、および、試料の容器が載置された領域の温度を調整する機構を含んでいてもよい。

　次に、ステップＳ１１０において、搬送部４０８は、誘導体化された試料１０μＬを、ＬＣ質量分析計１００のインジェクタ１３０に搬送する。

　次に、ステップＳ１１２において、制御部４０１は、ＬＣ質量分析計１００に向けて、試料の分析の指令を出力する。当該指令に応じて、ＬＣ質量分析計１００の制御部２００は、カラム１４５を介して質量分析器１５０に試料を導入し、質量分析器１５０に、試料の分析結果を出力させる。制御部２００は、当該分析結果を、前処理装置４００の制御部４０１へ送信する。

　次に、ステップＳ１１４において、制御部４０１は、分析結果を表示部４６０に表示する。制御部４０１は、分析結果に含まれる２以上の有機酸のそれぞれの検出値のうち、それぞれの有機酸について予め定められた正常範囲に属しない検出値を、強調して表示してもよい。また、制御部４０１は、検出値が正常範囲に属しない有機酸について、当該有機酸に予め関連付けられた代謝異常症の名称（図２に示された、２５種類の疾患の名称のいずれか）を、参考として表示部４６０に表示してもよい。

　［小括］
　上述の実施の形態では、ＬＣ質量分析計が、被験者の代謝物に基づく試料を分析する。従来のガスクロマトグラフ質量分析計（以下、「ＧＣ質量分析計」という）を用いた分析と比較して、上述の実施の形態によれば、分析が簡便に実施され得る。

　より具体的には、ＧＣ質量分析計を用いた分析では、測定対象の物質がガスであることから、代謝物の気化が必要とされる。なお、代謝物の加熱による気化は、代謝異常症の有無を判定するための物質が熱により分解される場合があることから、好ましくない。したがって、従来、メチルマロン酸血症の判定のための分析では、前処理として、有機酸（メチルマロン酸）を有機溶媒を用いて抽出する工程、抽出された有機層を乾固させる工程、および乾固された物質の誘導体化工程が行なわれてきた。しかしながら、これらの工程は多大な時間（たとえば５時間）を要するという問題がある。代謝異常症を有するか否かの判定を所望する患者が医療施設で受験したとしても、多大な時間を要するため、判定が該患者が医療施設に滞在している間に完了しない場合があった。また、上記の前処理のための工程を行うためには、分析担当者には多くの経験が必要とされ、経験の浅い分析担当者では、これらの工程を行うことは困難である場合があった。

　一方、本実施の形態では、上述の工程が必要とされない。したがって、本実施の形態によれば、分析が簡便に実施され得る。

　一般的に、被験者の代謝物に基づく試料に含まれる物質であって代謝異常症の有無を判定するための物質（有機酸）には、カルボキシル基が含まれる。上述の実施の形態は、上述のように被験者の代謝物に基づく試料に含まれるカルボキシル基と反応することにより該カルボキシル基を誘導体化させる成分を含む試薬を用いて、有機酸の誘導体化が行われる。これにより、上述の実施の形態は、従来必要とされていた（有機酸を有機溶媒を用いて抽出する工程を含む）長時間を要する前処理を必要とすることなく、有機酸を誘導体化させることができる。また、当該誘導体化は、前処理装置４００によって実施される。

　この意味においても、上述の実施の形態は、前処理に前処理装置４００を利用することにより、分析担当者が経験の浅い者であっても簡便に前処理が実施され得る。

　また、従来のＧＣ質量分析計を用いた前処理に要する時間は５時間程度であったのに対し、上述の実施の形態の前処理に要する時間は、３０分程度である。したがって、従来と比較して、代謝異常症を判定するための前処理に要する時間を短くすることができる。

　また、上述の実施の形態の前処理装置４００は、図５のステップＳ１０８として説明されたように、３－ＮＰＨを含む試薬を用いることにより、カルボキシル基を短時間で誘導体化させることができる。これにより、誘導体化の反応条件において、反応時間は１５分程度で充分とされる。

　さらに、上述の実施の形態の前処理装置４００は、上記試薬がＥＤＣとピリジンとを含むことにより、カルボキシル基をより短時間で誘導体化させることができる。

　さらに、上述の実施の形態の前処理装置４００は、誘導体化において、第１物質（２００ｍＭの濃度で３－ＮＰＨを含む物質）と、第２物質（２００ｍＭの濃度でＥＤＣを含み、９％の濃度でピリジンを含む物質）とが同量となる試薬を用いることにより、カルボキシル基を短時間で誘導体化させることができる。

　また、図５のステップＳ１１４として説明されたように、制御部４０１は、試料の分析結果として、図３に示された２３種類の有機酸のそれぞれについての検出値を表示し得る。すなわち、ＬＣ質量分析計１００では、質量分析器１５０は、２３種類の有機酸のそれぞれについての検出値を導出することができ、また、制御部２００は、２３種類の有機酸のそれぞれについての検出値を制御部４０１に送信し得る。これにより、試料の分析結果を視認した医師は、被験者について、代謝異常症の有無だけでなく、代謝異常症の種別も判定することができる。

　また、図５のステップＳ１０４として説明されたように、試料から蛋白質を除去する際の溶媒としてアルコールが利用される。利用されるアルコールは、メタノールであってもよい。試料から蛋白質を除去する際の溶媒は、アセトニトリルであってもよい。アルコールまたはアセトニトリルが利用されることによって有機層の乾固が不要になり、これによっても、前処理に要する時間が短縮され得る。

　特に、試料からの蛋白質の除去にメタノールが利用されることにより、図３に示された２３種類の有機酸のそれぞれの試料からの回収率が向上し得る。図６は、２３種類の有機酸のそれぞれの回収率の一例を示す図である。回収率は、試料における各有機酸の濃度の、蛋白質除去前の値に対する蛋白質除去後の値の割合を表す。たとえば、蛋白質除去後の濃度が蛋白質除去後の濃度の５０％である場合の回収率は、「０．５」である。図６において、実線は、溶媒としてメタノール（ＭｅＯＨ）が採用されたときの回収率を表す。破線は、比較として、溶媒としてアセトニトリル（ＡＣＮ）が採用されたときの回収率を表す。

　破線で示されるように、溶媒としてアセトニトリルが採用された場合、一部の有機酸（メチルマロン酸、３－ヒドロキシ－３－メチルグルタル酸、等）の回収率は０．４を下回っている。一方、実線で示されるように、溶媒としてメタノールが採用された場合、回収率は、すべての有機酸について０．６を超えた。

　上述の実施の形態の分析システム１０００では、前処理装置４００の制御部４０１が、分析システム１０００を統括的に制御する。すなわち、制御部４０１が、ＬＣ質量分析計１００に対して分析の指令を出力する。なお、ＬＣ質量分析計１００の制御部２００が分析システム１０００を統括的に制御してもよい。たとえば、制御部２００は、前処理装置４００に対して、試料の前処理（蛋白質の除去、誘導体化、など）の実施および前処理後の試料のＬＣ質量分析計１００への搬送について、指令を出力してもよい。制御部４０１は、制御部２００からの指令に応じて、添加部４０２、ろ過部４０４、および、誘導体化部４０６に試料の前処理を実施させてもよく、また、搬送部４０８に前処理後の試料のＬＣ質量分析計１００への搬送を実施させてもよい。また、ＬＣ質量分析計１００および前処理装置４００とは異なる第３の装置が、分析システム１０００を統括的に制御してもよい。

　［変形例］
　図７は、図５に示された分析方法の変形例を示すフローチャートである。図７に示された分析方法は、図５に示された分析方法と比較して、ステップＳ１０１～Ｓ１０３の工程をさらに含む。

　ステップＳ１００で試料をセットされた後、前処理装置４００の制御部４０１は、ステップＳ１０１において、たとえば表示部４６０にメッセージ「分析モードを入力してください。」を表示しながら、分析モードの入力を受け付ける。分析モードの入力は、２種類のモードからの選択であってもよい。２種類のモードは、「簡易検査用の分析モード」と「確認検査用の分析モード」であってもよい。

　ステップＳ１０２において、制御部４０１は、入力された分析モードの種類を確認する。制御部４０１は、入力された分析モードが「簡易検査用の分析モード」であれば、ステップＳ１０３へ制御を進める。制御部４０１は、入力された分析モードが「確認検査用の分析モード」であれば、ステップＳ１０４へ制御を進める。

　ステップＳ１０３において、搬送部４０８は、試料をＬＣ質量分析計１００のインジェクタ１３０へ搬送する。これにより、ＬＣ質量分析計１００には、誘導体化されていない試料が搬送される。そして、ステップＳ１１２において、ＬＣ質量分析計１００は、誘導体化されていない試料を分析する。ステップＳ１１４において、制御部４０１は、誘導体化されていない試料の分析結果を表示部４６０に表示する。

　一方、ステップＳ１０４に制御が進められると、図５を参照して説明されたように、ＬＣ質量分析計１００には、誘導体化された試料が搬送される（ステップＳ１０４～Ｓ１１０）。そして、ステップＳ１１２において、ＬＣ質量分析計１００は、誘導体化された試料を分析する。ステップＳ１１４において、制御部４０１は、誘導体化された試料の分析結果を表示部４６０に表示する。

　以上、図７を参照して説明された分析方法では、前処理装置４００の制御部４０１は、分析モードの入力を受け付ける。分析システム１０００は、簡易検査用の分析モードを指定する入力を受け付けると、誘導体化されていない試料を分析し、その分析結果を表示する。一方、分析システム１０００は、確認検査用の分析モードを指定する入力を受け付けると、誘導体化された試料を分析し、その分析結果を表示する。すなわち、分析システム１０００は、入力された検査モードの種類に応じて、ＬＣ質量分析計１００を用いて、簡易検査用の分析結果を出力することもできるし、確認検査用の分析結果を出力することもできる。

　［態様］
　上述した複数の例示的な実施形態は、以下の態様の具体例であることが当業者により理解される。

　（第１項）　一態様にかかる分析方法は、代謝異常症に関する試料の分析方法であって、３－ニトロフェニルヒドラジンを含む試薬と反応させることにより、被験者の代謝物に基づく試料を誘導体化するステップと、誘導体化された試料を、液体クロマトグラフ質量分析装置に導入するステップと、液体クロマトグラフ質量分析装置によって、誘導体化された試料を分析するステップとを備える。

　第１項に記載の分析方法によれば、試料に含まれる有機酸は、３－ニトロフェニルヒドラジンを含む試薬と反応することにより誘導体化され、これにより、短時間で誘導体化される。

　（第２項）　一態様に係る分析方法は、代謝異常症に関する試料の分析方法であって、分析の種類の入力を受け付けるステップと、入力が第１の種類の入力である場合に、被験者の代謝物に基づく試料を、第１の流れに従い、液体クロマトグラフ質量分析装置を用いて分析するステップと、入力が第２の種類の入力である場合に、被験者の代謝物に基づく試料を、第２の流れに従い、液体クロマトグラフ質量分析装置を用いて分析するステップと、を備える。第１の流れは、３－ニトロフェニルヒドラジンを含む試薬と反応させることにより、試薬を誘導体化することと、誘導体化された試料を、液体クロマトグラフ質量分析装置に導入することと、液体クロマトグラフ質量分析装置によって、誘導体化された試料を分析することと、を含み、第２の流れは、試料を誘導体化することなく液体クロマトグラフ質量分析装置に導入することと、液体クロマトグラフ質量分析装置によって、試料を分析することと、を含む。

　第２項に記載の分析方法によれば、液体クロマトグラフ質量分析装置が、確認検査用の分析にも簡易検査用の分析にも利用される。また、確認検査用の分析では、試料に含まれる有機酸は、３－ニトロフェニルヒドラジンを含む試薬と反応することにより誘導体化され、これにより、短時間で誘導体化される。

　（第３項）　第１項または第２項に記載の分析方法は、試料を試薬と反応させる前に、試料にアルコールを添加するステップと、アルコールを添加された試料をろ過するステップと、をさらに備える。

　第３項に記載の分析方法によれば、誘導体化において有機溶媒の乾固が必要とされず、これにより、試料に含まれる有機酸が短時間で誘導体化される。

　（第４項）　一態様に係る分析方法は、代謝異常症に関する試料の分析方法であって、被験者の代謝物に基づく試料にアルコールを添加するステップと、アルコールを添加された試料をろ過するステップと、試薬と反応させることにより、ろ過された試料を誘導体化するステップと、誘導体化された試料を、液体クロマトグラフ質量分析装置に導入するステップと、液体クロマトグラフ質量分析装置によって、誘導体化された試料を分析するステップとを備える。

　第４項に記載の分析方法によれば、誘導体化において有機溶媒の乾固が必要とされず、これにより、試料に含まれる有機酸が短時間で誘導体化される。

　（第５項）　第１項～第４項のいずれか１項に記載の分析方法において、試料を誘導体化するステップは、試料を試薬と少なくとも１５分反応させることを含む。

　第５項に記載の分析方法によれば、１５分という短時間で試料に含まれる有機酸の誘導体化が実施される。

　（第６項）　第１項～第５項のいずれか１項に記載の分析方法は、液体クロマトグラフ質量分析装置による分析の結果として、試料における、代謝異常症に対して予め定められた化合物の濃度を出力するステップをさらに備える。

　第６項に記載の分析方法によれば、代謝異常症の有無だけでなく種別を判定するための情報が提供される。

　（第７項）　一態様に係る前処理装置は、代謝異常症に関する試料の前処理を実施する前処理装置であって、３－ニトロフェニルヒドラジンを含む試薬と反応させることにより、被験者の代謝物に基づく試料を誘導体化する誘導体化部と、誘導体化された試料を、液体クロマトグラフ質量分析装置に導入する搬送部と、を備える。

　第７項に記載の前処理装置によれば、試料に含まれる有機酸は、３－ニトロフェニルヒドラジンを含む試薬と反応することにより誘導体化され、これにより、短時間で誘導体化される。

　（第８項）　一態様に係る前処理装置は、代謝異常症に関する試料の前処理を実施する前処理装置であって、分析の種類の入力を受け付ける入力部と、試料を３－ニトロフェニルヒドラジンを含む試薬と反応させることにより、誘導体化する誘導体化部と、試料を液体クロマトグラフ質量分析装置に導入する搬送部と、を備える。入力が第１の種類の入力である場合に、誘導体化部は、被験者の代謝物に基づく試料を試薬と反応させることによって誘導体化し、搬送部は、誘導体化部によって誘導体化された試料を、液体クロマトグラフ質量分析装置に導入する。入力が第２の種類の入力である場合に、搬送部は、誘導体化部によって誘導体化されていない試料を、液体クロマトグラフ質量分析装置に導入する。

　第８項に記載の前処理装置によれば、液体クロマトグラフ質量分析装置が、確認検査用の分析にも簡易検査用の分析にも利用される。また、確認検査用の分析では、試料に含まれる有機酸は、３－ニトロフェニルヒドラジンを含む試薬と反応することにより誘導体化され、これにより、短時間で誘導体化される。

　（第９項）　第７項または第８項に記載の前処理装置は、試料を試薬と反応させる前に、試料にアルコールを添加する添加部と、アルコールを添加された試料をろ過するろ過部と、をさらに備える。

　第９項に記載の前処理装置によれば、誘導体化において有機溶媒の乾固が必要とされず、これにより、試料に含まれる有機酸が短時間で誘導体化される。

　（第１０項）　一態様に係る前処理装置は、代謝異常症に関する試料の前処理を実施する前処理装置であって、被験者の代謝物に基づく試料にアルコールを添加する添加部と、アルコールを添加された試料をろ過するろ過部と、試薬と反応させることにより、ろ過された試料を誘導体化する誘導体化部と、誘導体化された試料を、液体クロマトグラフ質量分析装置に導入する搬送部と、を備える。

　第１０項に記載の前処理装置によれば、誘導体化において有機溶媒の乾固が必要とされず、これにより、試料に含まれる有機酸が短時間で誘導体化される。

　（第１１項）　第７項～第１０項のいずれか１項に記載の前処理装置において、誘導体化部は、試料を試薬と少なくとも１５分反応させる。

　第１１項に記載の前処理装置によれば、１５分という短時間で試料に含まれる有機酸の誘導体化が実施される。

　（第１２項）　第７項～第１１項のいずれか１項に記載の前処理装置は、液体クロマトグラフ質量分析装置において取得された試料の分析結果として、試料における、代謝異常症に対して予め定められた化合物の濃度を表示する表示部をさらに備える。

　第１２項に記載の前処理装置によれば、代謝異常症の有無だけでなく種別を判定するための情報が提供される。

　今回開示された実施の形態は、すべての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本開示の範囲は、上記した実施の形態の説明ではなくて請求の範囲によって示され、請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。また、実施の形態中の各技術は、単独でも、また、必要に応じて実施の形態中の他の技術と可能な限り組み合わされても、実施され得ることが意図される。

　１００　液体クロマトグラフ質量分析計（ＬＣ質量分析計）、１１０　溶媒容器、１２０　送液ポンプ、１３０　インジェクタ、１４０　カラムオーブン、１４５　カラム、１５０　質量分析器、２００，４０１　制御部、２２０，４２０　メモリ、２５０，４５０　入力部、２６０，４６０　表示部、３００　データ処理部、４００　前処理装置、４０２　添加部、４０４　ろ過部、４０６　誘導体化部、４０８　搬送部、１０００　分析システム。

Claims

　代謝異常症に関する試料の分析方法であって、
　３－ニトロフェニルヒドラジンを含む試薬と反応させることにより、被験者の代謝物に基づく試料を誘導体化するステップと、
　誘導体化された前記試料を、液体クロマトグラフ質量分析装置に導入するステップと、
　前記液体クロマトグラフ質量分析装置によって、誘導体化された前記試料を分析するステップとを備える、分析方法。
　代謝異常症に関する試料の分析方法であって、
　分析の種類の入力を受け付けるステップと、
　前記入力が第１の種類の入力である場合に、被験者の代謝物に基づく試料を、第１の流れに従い、液体クロマトグラフ質量分析装置を用いて分析するステップと、
　前記入力が第２の種類の入力である場合に、前記被験者の代謝物に基づく試料を、第２の流れに従い、液体クロマトグラフ質量分析装置を用いて分析するステップと、を備え、
　前記第１の流れは、
　　３－ニトロフェニルヒドラジンを含む試薬と反応させることにより、前記試薬を誘導体化することと、
　　誘導体化された前記試料を、液体クロマトグラフ質量分析装置に導入することと、
　　前記液体クロマトグラフ質量分析装置によって、誘導体化された前記試料を分析することと、を含み、
　前記第２の流れは、
　　前記試料を誘導体化することなく前記液体クロマトグラフ質量分析装置に導入することと、
　　前記液体クロマトグラフ質量分析装置によって、前記試料を分析することと、を含む、分析方法。
　前記試料を前記試薬と反応させる前に、前記試料にアルコールを添加するステップと、
　アルコールを添加された前記試料をろ過するステップと、をさらに備える、請求項１または請求項２に記載の分析方法。
　代謝異常症に関する試料の分析方法であって、
　被験者の代謝物に基づく試料にアルコールを添加するステップと、
　アルコールを添加された前記試料をろ過するステップと、
　試薬と反応させることにより、ろ過された前記試料を誘導体化するステップと、
　誘導体化された前記試料を、液体クロマトグラフ質量分析装置に導入するステップと、
　前記液体クロマトグラフ質量分析装置によって、誘導体化された前記試料を分析するステップとを備える、分析方法。
　前記試料を誘導体化するステップは、前記試料を前記試薬と少なくとも１５分反応させることを含む、請求項１、請求項２および請求項４のいずれか１項に記載の分析方法。
　前記液体クロマトグラフ質量分析装置による分析の結果として、前記試料における、代謝異常症に対して予め定められた化合物の濃度を出力するステップをさらに備える、請求項１、請求項２および請求項４のいずれか１項に記載の分析方法。
　代謝異常症に関する試料の前処理を実施する前処理装置であって、
　３－ニトロフェニルヒドラジンを含む試薬と反応させることにより、被験者の代謝物に基づく試料を誘導体化する誘導体化部と、
　誘導体化された前記試料を、液体クロマトグラフ質量分析装置に導入する搬送部と、を備える、前処理装置。
　代謝異常症に関する試料の前処理を実施する前処理装置であって、
　分析の種類の入力を受け付ける入力部と、
　試料を３－ニトロフェニルヒドラジンを含む試薬と反応させることにより、誘導体化する誘導体化部と、
　試料を液体クロマトグラフ質量分析装置に導入する搬送部と、を備え、
　前記入力が第１の種類の入力である場合に、
　　前記誘導体化部は、被験者の代謝物に基づく試料を前記試薬と反応させることによって誘導体化し、
　　前記搬送部は、前記誘導体化部によって誘導体化された前記試料を、前記液体クロマトグラフ質量分析装置に導入し、
　前記入力が第２の種類の入力である場合に、
　　前記搬送部は、前記誘導体化部によって誘導体化されていない前記試料を、前記液体クロマトグラフ質量分析装置に導入する、前処理装置。
　前記試料を前記試薬と反応させる前に、前記試料にアルコールを添加する添加部と、
　アルコールを添加された前記試料をろ過するろ過部と、をさらに備える、請求項７または請求項８に記載の前処理装置。
　代謝異常症に関する試料の前処理を実施する前処理装置であって、
　被験者の代謝物に基づく試料にアルコールを添加する添加部と、
　アルコールを添加された前記試料をろ過するろ過部と、
　試薬と反応させることにより、ろ過された前記試料を誘導体化する誘導体化部と、
　誘導体化された前記試料を、液体クロマトグラフ質量分析装置に導入する搬送部と、を備える、前処理装置。
　前記誘導体化部は、前記試料を前記試薬と少なくとも１５分反応させる、請求項７、請求項８および請求項１０のいずれか１項に記載の前処理装置。
　前記液体クロマトグラフ質量分析装置において取得された前記試料の分析結果として、前記試料における、代謝異常症に対して予め定められた化合物の濃度を表示する表示部をさらに備える、請求項７、請求項８および請求項１０のいずれか１項に記載の前処理装置。