WO2022220146A1 - Ｔ細胞受容体遺伝子を導入するためのｉＰＳ細胞により構成される細胞バンク - Google Patents

Ｔ細胞受容体遺伝子を導入するためのｉＰＳ細胞により構成される細胞バンク Download PDF

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    • C12N2760/18843—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Definitions

  • the present invention is intended to produce induced pluripotent stem cell (iPS cell)-derived T cells (regenerative T cells) into which a T cell receptor (T cell receptor: TCR) gene that recognizes antigens derived from tumors or pathogens has been introduced.
  • iPS cell induced pluripotent stem cell
  • T cell receptor T cell receptor: TCR
  • cell banks containing iPS cell-derived hematopoietic stem cells, immature T cells and mature T cells as intermediates of
  • the present invention relates to the use of cell banks containing hematopoietic stem cells, immature T cells and mature T cells for the production of regenerative T cell preparations for cancer prevention and/or treatment.
  • T cells play a central role in the immune response against foreign pathogens such as bacteria or viruses, or abnormal cells such as cancer cells. Therefore, it is believed that decreased function of T cells contributes to the development of cancer and pathogen infection.
  • T-cell replacement therapy or regenerative therapy for patients with diseases caused by T-cell dysfunction can be extremely effective means for ameliorating and treating disease conditions in patients.
  • T cell replacement therapy In studies using humans and mice, when T cell replacement therapy is performed for cancer or infectious diseases, it specifically recognizes antigens possessed by cancer cells or abnormal cells infected with foreign pathogens such as bacteria or viruses. It is known that a high therapeutic effect can be obtained by using T cells that treat cancer. On the other hand, it is difficult to secure a sufficient amount of T cells, it takes a long time to produce T cells, and when patient-derived cells are used as materials, the proliferative ability of T cells is reduced and Exhaustion of T cells, such as decreased immune response to antigens such as target cells, is an obstacle in T cell replacement therapy.
  • iPS cells are established from antigen-specific T cells, and after proliferating the iPS cells, T cell replacement therapy using regenerated T cells differentiated into T cells. , or T cell replacement therapy using regenerated T cells differentiated from iPS cells into which TCRs have been introduced to recognize target antigens.
  • T cells specific for target antigens or TCRs for recognizing target antigens as raw materials for producing iPS cells, regenerated T cells exhibiting the same antigen specificity as the original T cells are produced. It is possible to manufacture (Patent Document 1 and Non-Patent Document 1).
  • Patent Document 2 When producing regenerated T cells from iPS cells, long-term differentiation culture is required (Patent Document 2).
  • an acquired TCR is introduced into allogeneic iPS cells, the produced regenerated T cells can be stored, so the long production period of the regenerated T cells is not a particular problem.
  • an acquired TCR is used in a patient different from the individual from which the TCR was derived, there is a risk of side reactions due to alloreactions. For this reason, the use of patient-specific antigen-specific TCRs is attracting attention for the purpose of risk avoidance.
  • each individual has different genetic mutations that make them neoantigens, which are good targets for T-cell therapy. To date, administration of vaccines against neoantigens has shown high efficacy, and therapeutic agents manufactured by methods using antigen-specific TCRs for individual patients have great benefits in cancer treatment.
  • Nishimura T et al. Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell. 2013; 12:114-126.
  • iPS-T cells regenerative T cells
  • the use of patient-specific TCRs is important in ensuring the safety and efficacy of regenerative T cell replacement therapy in therapy.
  • prompt initiation of iPS-T cell replacement therapy is important for improving treatment results.
  • the production of cell preparations using a patient's antigen-specific TCR needs to be performed on a patient-by-patient basis, and the problems of the labor required for production and the long production period have hindered the development of cell preparations. Particularly in allogeneic regenerated T cell preparations, the length of the manufacturing period has been a problem.
  • the present invention provides a cell group containing hematopoietic stem cells, immature T cells and mature T cells, which are cells differentiated from iPS cells, for rapid production of iPS-T cells into which a patient-specific antigen-specific TCR has been introduced,
  • the purpose is to construct a cell bank that can be provided as a manufacturing intermediate.
  • the present invention includes the use of said cell bank for the production of regenerative T-cell preparations for use in the prevention and/or treatment of cancer or infectious diseases from said production intermediates.
  • T cell clones (5 to 10 clones) recognize the antigen using different TCRs for one antigen epitope. Moreover, it has been clarified that each patient has a different TCR repertoire for one antigenic epitope.
  • cancer cells have genetic mutations that differ from one another in individual patients, making them neoantigens that are good targets for T-cell therapy. It is highly likely that regenerative T cells produced using TCRs obtained from individual patients will be T cells with TCRs that are optimal for attacking the target of T cell therapy within the corresponding patient's body. It is clear that regenerative T cells produced using TCRs obtained from individual patients do not elicit an alloreactive attack on recipient cells. Therefore, the benefits of using TCRs obtained from individual patients to produce regenerative T cells in terms of safety and efficacy in the prevention and/or treatment of cancer or infectious diseases are extremely high.
  • the present inventors obtained various TCRs with antigen specificity from T cell populations reactive to tumor-associated antigens or pathogen-specific antigens of individual patients, and induced differentiation of these TCRs from iPS cells. and can be introduced into prestored hematopoietic stem cells, immature T cells or mature T cells, or can be replaced with endogenous TCR to produce regenerated T cells; hematopoietic stem cells previously differentiated from iPS cells , the construction of a cell bank with immature T cells and mature T cells can greatly shorten the production period of regenerated T cells; and the use of the cells contained in the cell bank as an intermediate for producing regenerated T cell preparations By doing so, the inventors have found that homogenization and standardization of regenerated T cell preparations are facilitated, and have completed the present invention.
  • the present invention can also be applied to the production of regenerated T cells into which an acquired TCR has been introduced and regenerated T cells into which a chimeric antigen receptor (CAR)
  • a cell bank composed of cells into which a T cell receptor gene is introduced, wherein the cells are iPS cells and hematopoietic stem cells differentiated from the iPS cells, immature T cells and mature T cells.
  • the cell bank which is one or more types of cells selected from.
  • the cell bank of [1] wherein the cell is a cell into which a chimeric antigen receptor gene is introduced.
  • the iPS cells are peripheral blood mononuclear cells of a subject, iPS cells obtained by reprogramming peripheral blood mononuclear cells from which B cells and T cells have been removed, [1] or The cell bank of [2].
  • [4] introduction of a T cell receptor gene into the iPS cell clone or the hematopoietic stem cells or immature T cells differentiated from the iPS cell clone uses a viral vector, transposon vector or genome editing technology; Cell bank as indicated.
  • [6] The cell bank of [5], wherein a genome editing technique is used to introduce the T cell receptor gene into the mature T cells.
  • the cell bank of [5], wherein the mature T cells express a T cell receptor that does not recognize non-tumor cells derived from a subject separate from the subject from which the mature T cells were derived.
  • the cell bank of any one of [1] to [14], wherein the immature T cells are CD8 ⁇ -chain/ ⁇ -chain double-positive.
  • the cell bank of any one of [1] to [15], wherein the mature T cells are CD8 ⁇ -chain/ ⁇ -chain double-positive and TCR ⁇ -chain/ ⁇ -chain double-positive.
  • the T cell receptor gene is prepared from a T cell population obtained from a subject, wherein each single cell is prepared from a T cell population having reactivity to a tumor-associated antigen, [1] to [ 16], the cell bank according to any one of the above.
  • the T cell receptor gene is prepared for each single cell from a T cell population reactive to the tumor-associated antigen by contacting T cells obtained from a subject with a tumor-associated antigen; [1] The cell bank according to any one of [16].
  • the T-cell receptor gene contacts T cells obtained from a subject to whom a tumor-associated antigen has been administered with the tumor-associated antigen; The cell bank according to any one of [1] to [16], which is prepared for each cell.
  • the tumor-associated antigen is selected from the group consisting of GPC3, WT1, XAGE1, LMP2, NY-ESO-1, EB virus antigens, neoantigens, and peptide fragments thereof; cell bank as described in .
  • the tumor-associated antigen is HLA-A24-restricted GPC3 peptide EYILSLEEL (SEQ ID NO: 1), HLA-A2-restricted GPC3 peptide FVGEFFTDV (SEQ ID NO: 2), or a mixture thereof;
  • the cell bank according to any one of to [19].
  • the cell into which the T-cell receptor gene or the T-cell receptor gene and the chimeric antigen receptor are introduced is an intermediate for the production of a T-cell preparation used for the prevention and/or treatment of cancer; , the cell bank according to any one of [1] to [25].
  • the cell bank of the present invention contains pre-stored hematopoietic stem cells, immature T cells and/or mature T cells that have been induced to differentiate from iPS cells, these cells can be treated with cancer or infectious diseases.
  • TCRs harvested from or acquired TCRs or CARs can be transfected to produce regenerative T cells in a short period of time. Therefore, the time required from the production of regenerated T cells into which an antigen-specific TCR has been introduced to the use of the regenerated T cells for treatment can be dramatically shortened, and the amount of regenerated T cells necessary for treatment can be reduced. can be stably secured.
  • the cell bank of the present invention can be constructed using either iPS cell clones derived from non-T non-B cells or monocytes or iPS cell clones derived from T cells.
  • Introduction of the TCR to hematopoietic stem cells, immature T cells and mature T cells differentiated from iPS cell clones derived from non-T non-B cells or monocytes allowed these cells to differentiate into regenerative T cells followed by expansion. Since rearrangement of the TCR gene does not easily occur when cultured, the antigen specificity of the introduced TCR is maintained, and as a result, the safety of the regenerated T cell preparation is enhanced.
  • regenerated T cells that are less exhausted due to expansion culture can be produced.
  • iPS cell clones with good differentiation efficiency into T cells are selected in advance and used as cells that make up the cell bank. Therefore, it is possible to minimize the influence of variations in cell yield and degree of cell differentiation between production batches of regenerated T cells, and individual differences in subjects from whom cells are collected, on the quality, etc. of the regenerated T cells obtained. Become.
  • the cell bank of the present invention it becomes possible to efficiently and rapidly produce T cells having TCRs that recognize antigens and efficiently kill targets.
  • iPS cell-derived differentiated cells iPS cell-derived differentiated cells, iPS cell-derived differentiated cells, iPS cell-differentiated hematopoietic stem cells, immature T cells, and mature T cells, which are differentiated from iPS cells in advance and constitute the cell bank of the present invention.
  • the cells that make up the cell bank are differentiated from the cloned iPS cells, so the quality of the cells is more uniform and stable.
  • the number of cells used for a single TCR introduction is 10 7 to 10 9 or more
  • the cell bank of the present invention can contain, in aliquot form, the number of cells required for 1000 or more TCR transductions. Therefore, it is expected that the cost for implementing TCR introduction once will be reduced. For this reason, in cancer therapy applying regenerative T cell replacement therapy, antigen-specific expression of tumor antigen change in cancer patients to be treated, development of treatment resistance, or cancer recurrence It is possible to quickly and easily prepare regenerative T cells.
  • the subject from whom T cells used for preparing the cDNA encoding the TCR are cancer patients to be treated by regenerative T cell replacement therapy. It may be the same individual as the subject, or it may be a separate entity from each other. Thus, safe and effective TCRs with optimal antigen specificity can be selected for individual cancer patients.
  • Fig. 2 shows the production of tumor-specific regenerative T cells from mature T cells that are induced to differentiate from iPS cells and constitute a cell bank.
  • Introduction of tumor-specific TCRs into mature T cells is done by gene replacement using genome modification techniques such as CRISPR/Cas9. It takes about two weeks from the introduction of the TCR into the cells to the administration of the TCR-introduced cells to the patient. Desirably, TCRs expressed in mature T cells do not induce alloreactions.
  • the TCR to be introduced into the cells is a TCR obtained from a cancer patient to whom the regenerative T cell preparation is scheduled, a cancer-specific TCR that has already been obtained, or a cancer-specific CAR.
  • FIG. 2 shows the production of tumor-specific regenerative T cells from immature T cells that are induced to differentiate from iPS cells and constitute a cell bank.
  • Introduction of a tumor-specific TCR into immature T cells is performed using gene replacement using genome modification technology such as CRISPR/Cas9, lentivirus, transposon vector, or the like. It takes about 4 weeks from the introduction of the TCR into the cells to the administration of the TCR-introduced cells to the patient.
  • the TCR to be introduced into the cells is a TCR obtained from a cancer patient to whom the regenerative T cell preparation is scheduled, a cancer-specific TCR that has already been obtained, or a cancer-specific CAR.
  • FIG. 1 shows the process of introducing TCR genes into hematopoietic stem cells, immature T cells or mature T cells using transposons.
  • FIG. 2 shows phenotypes of mature T cells (CD8-positive cytotoxic T cells) induced from iPS cells. Mature T cells that make up the cell bank adopt the phenotype shown in FIG.
  • FIG. 2 shows the results of analyzing telomeres as a cellular senescence marker in mature T cells induced from iPS cells.
  • FIG. 2 shows the results of analyzing the expression of PD-1 and TIGHT molecules as cell exhaustion markers in mature T cells induced from iPS cells.
  • FIG. 2 shows phenotypes of immature T cells (CD8-positive immature T cells) induced from iPS cells.
  • the immature T cells that make up the cell bank adopt the phenotype shown in FIG.
  • FIG. 2 shows phenotypes of iPS cell-derived mature T cells into which a GPC3 antigen-specific TCR gene was introduced at the stage of mature T cells.
  • the CD19 gene is a gene integrated in the same piggyBac (registered trademark) transposon vector in tandem with the TCR gene, and is used as a marker for gene insertion into host chromosomes and gene expression.
  • FIG. 1 shows phenotypes of immature T cells (CD8-positive immature T cells) induced from iPS cells.
  • the immature T cells that make up the cell bank adopt the phenotype shown in FIG.
  • FIG. 2 shows phenotypes of iPS cell-derived mature T cells into which a GPC3 antigen-specific
  • FIG. 2 is a diagram illustrating a method for selecting iPS cell clones with high differentiation efficiency into T cells in the process of producing regenerated T cells from iPS cells reprogrammed from peripheral blood T cells.
  • iPS cell clones selected as cells with high differentiation efficiency into T cells are subjected to genome editing to produce regenerated T cells. It is a figure explaining a method.
  • This regenerated T cell is used as a master cell bank of host T cells.
  • FIG. 2 is a diagram illustrating a method for producing regenerative T cells that recognize cancer antigens from host T cells.
  • FIG. 2 is a diagram showing an outline of a process for producing regenerated T cells from allogeneic iPS cells reprogrammed peripheral blood T cells.
  • the differentiated T cells serve as a master cell bank of host T cells.
  • a "cell bank” is a collection of multiple types of cells composed of cells into which a T-cell receptor gene is to be introduced. CAR can also be introduced into the cells that make up the cell bank.
  • the cell bank of the present invention is composed of iPS cells and one or more types of cells selected from the group consisting of hematopoietic stem cells differentiated from the iPS cells, immature T cells and mature T cells. Cells contained in the cell bank of the present invention can be used to produce regenerative T cells for use in preventing and/or treating cancer or infectious diseases.
  • the “aggregate of cells” is obtained by dividing cells based on the origin of the cells, the stage of differentiation of the cells, etc., and distributing and accumulating each of the cells in independent cell containers.
  • the cell bank of the present invention can be stored in any facility or repository that allows cryopreservation of cells.
  • the "mature T cells" constituting the cell bank are differentiated cells that have been induced to differentiate from iPS cells, express CD3 and CD4 or CD8 as cell surface antigens, and express major histocompatibility complex ( cells that express functional TCRs on their cell surface that can induce cell proliferation, cytokine production and cytotoxicity in response to antigens presented on the major histocompatibility complex.
  • TCRs include heterodimers consisting of ⁇ and ⁇ chains and heterodimers consisting of ⁇ and ⁇ chains. T cells with a TCR consisting of ⁇ and ⁇ chains are called ⁇ type T cells, and T cells with a TCR consisting of ⁇ and ⁇ chains are called ⁇ type T cells.
  • the mature T cells of the present invention are preferably CD3/ ⁇ T cells, but may be CD3/ ⁇ T cells.
  • the mature T cells may be cells expressing endogenous TCR in which TCR gene rearrangement has been completed, or cells expressing exogenously introduced TCR.
  • the "immature T cells" that constitute the cell bank are differentiated cells that have been induced to differentiate from iPS cells, but are in the process of differentiating into T cells and do not express TCR on the cell surface.
  • Immature T cells include T cells at each stage from CD4/CD8 double-negative cells to CD4/CD8 double-positive cells to CD8 single-positive cells.
  • CD8 expressed on immature T cells is preferably a CD8 ⁇ heterodimer, but may be a CD8 ⁇ homodimer.
  • the "hematopoietic stem cells” that make up the cell bank are cells that can differentiate into hematopoietic cells such as lymphocytes, eosinophils, neutrophils, basophils, erythrocytes, and megakaryocytes.
  • Hematopoietic stem cells and hematopoietic progenitor cells (HPC) are not to be distinguished from each other, and refer to the same cell unless otherwise specified.
  • Hematopoietic stem cells or hematopoietic progenitor cells are recognized, for example, by being double positive for the surface antigens CD34 and CD43.
  • the term "genetically modified cells so that the expression of endogenous TCR can be controlled” refers to a method using microRNA or the like, or replacing the endogenous TCR promoter with a tetotacycline-regulated promoter or the like. Thus, it is a cell that has been genetically modified so that the expression of endogenous TCR can be suppressed or regulated.
  • the TCRs expressed by the mature T cells that make up the cell bank recognize a single antigen and produce no or almost no alloreaction.
  • Antigens recognized by the TCR include influenza virus antigens, EB virus antigens, HPV antigens, HBV antigens, HCV antigens, HIV antigens, coronavirus antigens, HTLV antigens, and cancer antigens.
  • the antigen recognized by the TCR to be introduced into the cells constituting the cell bank is an antigen that is expressed specifically or non-specifically in the tumor, and is derived from a protein that is overexpressed in tumor cells and These include its variants, tumor virus-derived antigens, certain differentiation antigens and novel tumor-associated antigens (neoantigens) due to gene mutations and splice abnormalities. Tumor-associated antigens are sometimes referred to herein as tumor antigens. In the case of a protein antigen, it may be a peptide fragment (peptide fragment).
  • Antigens specifically or non-specifically expressed in tumors include WT1, GPC3, XAGE1, MUC1, MUC5AC, MUC6, EGFRvIII, HER-2/neu, MAGE A3, MAGE A1, telomerase, PRAME, SSX2/4, PSCA , CTLA-4, gp100, GD2, GD3, Fucosyl GM1, GM3, sLe(a), Glycolipid F77, Mesothelin, PD-L1, trp1, trp2, CD19, CD20, CD22, ROR1, CD33, c-Met, p53 , p53 mutant, NY-ESO-1, PSMA, ETV6-AML, CEA, PSA, AFP, hTERT, EpCAM, ALK, androgen receptor, EphA2, CYP1B1, OY-TES-1, MAD-CT-2, MelanA /MART1, survivin, Ras, Ras mutants, ERG, bcr-abl, XBP
  • Viral antigens include inactivated HBV and inactivated viruses such as HPV, and various virus-derived proteins EBV LMP1, EBV LMP2, EBNA (EBV nuclear antigen), HPV E1, HPV E2, HPV E6, HPV E7, HBV HBs, HTLV-1 Tax and HBZ (HTLV-1 bZIP Factor), etc., but not limited thereto.
  • HPV LMP1, EBV LMP2, EBNA EBV nuclear antigen
  • HPV E1, HPV E2, HPV E6, HPV E7, HBV HBs, HTLV-1 Tax and HBZ (HTLV-1 bZIP Factor), etc. but not limited thereto.
  • antigens recognized by TCRs introduced into cells constituting a cell bank consist of GPC3, WT1, XAGE1, LMP2, NY-ESO-1, EB virus antigens and neoantigens, and peptide fragments thereof. You can choose from the group.
  • the antigen recognized by the TCR introduced into the cells constituting the cell bank is EYILSLEEL, an HLA-A24-restricted GPC3 peptide, FVGEFFTDV, an HLA-A2-restricted GPC3 peptide, or a mixture thereof.
  • amino acids are represented by conventional one-letter abbreviations.
  • T cells are tumor-associated with major histocompatibility complex (MHC) class I or class II on antigen-presenting cells. It means that T cells have a reaction caused by selectively binding / joining to an epitope peptide derived from an antigen via the TCR, and binding / joining of T cells to something other than the epitope peptide means that T cells have a reaction. It means that no reaction occurs.
  • MHC major histocompatibility complex
  • T cell responses resulting from binding/conjugation to epitope peptides derived from tumor-associated antigens presented on MHC class I or class II via the TCR include cytotoxicity, IFN- ⁇ and granzyme production, T Expression of cell activation markers, as well as activation of transcription factors such as NF-AT.
  • the TCR to be introduced into the cells that make up the cell bank is collected from subjects who are cancer patients or non-cancer patients.
  • Subjects from whom T cells are collected may be cancer patients who have been administered cancer vaccines, are currently being administered, or are scheduled to be administered in the future, and cancer vaccines are not administered. It may be a non-cancer patient.
  • One or more cancer vaccines may be administered.
  • a cancer vaccine is a cancer or tumor specific protein or peptide, a composition comprising a vaccine antigen derived from a cancer or said antigen, for inducing a cancer or tumor specific immune response. Cancer vaccines usually contain an adjuvant to enhance the specific immune response induced by the vaccine antigen.
  • T cells are preferably ⁇ T cells.
  • peripheral blood is preferable because of its low invasiveness, but it is not limited thereto.
  • Other preferred collection sources include cancer tissue or tumor tissue, lymph nodes or other tissues or organs, blood, umbilical cord blood, lymph, tissue fluid (interstitial fluid, intercellular fluid and interstitial fluid), body cavity fluid (ascites , pleural fluid, pericardial fluid, cerebrospinal fluid, synovial fluid and aqueous humor).
  • preferred T cells are tumor tissue-derived T cells. Tumor tissue-derived T cells are usually tumor-infiltrating T cells.
  • the cancer of the cancer patient is ovarian cancer, hepatoblastoma, hepatocellular carcinoma, gastric cancer, esophageal cancer, pancreatic cancer, renal cell carcinoma, breast cancer, malignant melanoma cancer, non-small cell lung cancer, cervical cancer, glioblastoma, prostate cancer, neuroblastoma, chronic lymphocytic leukemia, papillary thyroid cancer, colon cancer or B-cell non-Hodgkin's lymphoma.
  • Said cancer is preferably hepatocellular carcinoma or hepatoblastoma.
  • iPS cells may be produced by reprogramming non-T, non-B cells or monocytes. It may also be already made from non-T non-B cells or monocytes.
  • non-T non-B cells mononuclear cells that are not classified as T cells nor are they classified as B cells.
  • Non-T non-B cells can be prepared by collecting peripheral blood mononuclear cells and removing T cells and B cells contained in the mononuclear cells.
  • Peripheral blood mononuclear cells can be isolated from human whole blood with a mononuclear cell separation solution. Mononuclear cell separation solutions include, for example, Lymphoprep®.
  • the B cell surface antigens CD19, CD20, CD22 or B cell receptor and the T cell surface antigens CD3, CD4 or CD8 Antibodies may be used, for example, using flow cytometry or magnetic beads such as MACS® beads.
  • T cells can be prepared as cells expressing CD3 and CD8 after collection as peripheral blood mononuclear cells.
  • antibodies against the surface antigens of T cells, CD3, CD4 or CD8, are used, for example, by flow cytometry or magnetic beads such as MACS (registered trademark) beads. may be used.
  • iPS cells can preferably be induced by introducing cell reprogramming factors into non-T non-B cells or monocytes or T cells.
  • Cell reprogramming factors include, for example, Oct3/4, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, klf4, klf2, c-Myc, N-Myc, L-Myc, Nanog, Lin28, Fbx15, ERAs, ECAT15-2 , Tcl1, ⁇ -catenin, Lin28b, Sall1, Sall4, Esrrb, Nr5a2, Tbx3 and Glis1.
  • These cell reprogramming factors may be used alone or in combination.
  • Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-Myc are selected from the viewpoint that iPS cells can be efficiently established. Introduction into T cells is preferred.
  • the method of introducing the cell reprogramming factor into the non-T non-B cells or monocytes or T cells is not particularly limited, and methods known in the art can be adopted.
  • the gene encoding the cell reprogramming factor when the gene encoding the cell reprogramming factor is introduced into the non-T non-B cells or monocytes or T cells, the gene (e.g., cDNA) encoding the cell reprogramming factor can function intracellularly.
  • the expression vector can be introduced into cells by infection, lipofection, liposome, calcium phosphate coprecipitation, DEAE dextran, microinjection or electroporation.
  • the cell reprogramming factor When the cell reprogramming factor is in the form of a protein and the protein is introduced into the non-T non-B cells or monocytes or T cells, a method using a protein introduction reagent, a method using a protein transfer domain fusion protein , electroporation and microinjection methods.
  • a method using a protein introduction reagent When the cell reprogramming factor is in the form of messenger RNA (mRNA) and the mRNA is introduced into the non-T non-B cells or monocytes or T cells, a method using an mRNA introduction reagent and addition to the culture medium method.
  • mRNA messenger RNA
  • Expression vectors used for gene transfer by infection include, for example, viral vectors such as lentiviruses, retroviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, herpes viruses, Sendai viruses, and animal cell expression plasmids.
  • viral vectors such as lentiviruses, retroviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, herpes viruses, Sendai viruses, and animal cell expression plasmids.
  • Sendai virus it is preferable to use to transfer the gene encoding the cell reprogramming factor into the cell.
  • promoters used in expression vectors for introducing the cell reprogramming factor-encoding gene into cells include SR ⁇ promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV promoter, RSV promoter, HSV-TK promoter, and ubiquitin promoter. etc. These promoters may be able to control the expression of genes inserted downstream of the promoter depending on the presence or absence of drugs such as tetracycline.
  • the expression vector can contain, in addition to the promoter, an enhancer, poly A addition signal, selectable marker gene (eg, neomycin resistance gene), SV40 origin of replication, and the like.
  • the culture medium used for culturing iPS cells obtained by reprogramming is not particularly limited. can be prepared by adding cytokines of Examples of the basal culture medium include Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) medium, Medium 199 medium, Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) medium, ⁇ MEM medium, Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) medium, and Ham's F12 medium. , RPMI 1640 culture medium, Fischer' culture medium, Neurobasal Medium (Life Technologies), StemFit (registered trademark) AK03N (Ajinomoto Healthy Supply Co.) and mixed cultures thereof.
  • the culture medium may be serum-supplemented or serum-free.
  • Cytokines preferably include bFGF, and its concentration in the culture medium is, for example, 1 to 100 ⁇ g/mL (preferably 50 ⁇ g/mL).
  • the iPS cell culture method may be adherent culture or suspension culture, but adherent culture is preferred.
  • Methods for isolating iPS cells include, for example, a method of physically isolating with a cell scraper or the like, a dissociation solution having protease activity, a dissociation solution having collagenase activity, or a dissociation solution having protease activity and collagenase activity (e.g., Examples include isolation methods using Accutase (registered trademark) and Accumax (registered trademark).
  • iPS cells are preferably 1 ⁇ 10 3 to 1 ⁇ 10 4 cells/cm 2 , 1 ⁇ 10 4 to 1 ⁇ 10 5 cells/cm 2 or 1 ⁇ 10 5 to 1 ⁇ 10 cells/cm 2 . Passage to another incubator when a cell density of 6 cells/cm 2 is reached. The number of passages may be any number as long as the required amount of iPS cells is obtained, preferably 1 to 5 times or 5 to 10 times.
  • iPS cells reprogrammed by introducing Yamanaka factors consist of a large number of iPS cell clones.
  • the method of colony picking is not particularly limited, but a method using a Pipetman under a microscope, a limiting dilution method, a method using a fully automatic colony picker, and the like are used.
  • One or more, preferably 3 or more, more preferably 6 or more iPS cell clones obtained are preferably preserved to constitute a cell bank.
  • iPS cell clones are preferably cryopreserved.
  • iPS cell clones are collected, washed with a buffer or culture medium, counted, concentrated by centrifugation or the like, and suspended in a freezing medium (e.g., culture medium containing 10% DMSO). After turbidity, it can be cryopreserved.
  • a freezing medium e.g., culture medium containing 10% DMSO. After turbidity, it can be cryopreserved.
  • iPS cell clones that have already been established and that have good differentiation efficiency into T cells may be used.
  • “Differentiation efficiency” refers to hematopoietic stem cells, immature T cells, and mature T cells in all viable cells at each stage of differentiation from iPS cells to hematopoietic stem cells, from hematopoietic stem cells to immature T cells, and from immature T cells to mature T cells. It refers to the existence ratio. Identification of differentiated cells at each stage of differentiation can be performed by FACS analysis of surface markers. The efficiency of differentiation into hematopoietic stem cells is expressed as the percentage of CD34/CD43 double-positive cells in total viable cells, and the efficiency of differentiation into immature T cells is expressed as the percentage of CD4/CD8 double-positive cells or the percentage of CD5-positive cells in total viable cells. , and the efficiency of differentiation into mature T cells is shown as the percentage of cells positive for all of the CD8 ⁇ , CD8 ⁇ , TCR ⁇ and TCR ⁇ chains among all viable cells.
  • “Good differentiation efficiency” means that the percentage of CD34/CD43 double-positive cells, which are hematopoietic stem cells, is 5 to 15% or more in the differentiation from iPS cells to hematopoietic stem cells; In differentiation into cells, the percentage of CD4 / CD8 double positive cells or CD5 positive cells that are immature T cells refers to 10% or more or 50% or more, respectively; from immature T cells to mature T cells In differentiation, it refers to 50% or more of cells in which all of the CD8 ⁇ chain, CD8 ⁇ chain, TCR ⁇ chain and TCR ⁇ chain are positive.
  • the mature T cells in the present invention preferably differentiate the iPS cell clone first into hematopoietic stem cells, then differentiate the hematopoietic stem cells into immature T cells, and finally convert the immature T cells into CD8 single-positive T cells. It is produced by differentiating into The immature T cells in the present invention are preferably produced by first differentiating the iPS cell clone into hematopoietic stem cells and then differentiating the hematopoietic stem cells into immature T cells. Hematopoietic stem cells in the present invention are preferably produced by differentiating the iPS cell clone into hematopoietic stem cells.
  • Hematopoietic stem cells are preferably produced by culturing iPS cells in a culture medium supplemented with vitamin Cs.
  • vitamin C refers to L-ascorbic acid and its derivatives
  • L-ascorbic acid derivative means one that is converted to vitamin C in vivo by an enzymatic reaction.
  • L-ascorbic acid includes, for example, vitamin C phosphate, glucoside ascorbate, ethyl ascorbyl, vitamin C esters, ascorbyl tetrahexyldecanoate, ascorbyl stearate and ascorbate-diphosphate-6-palmitate.
  • the derivative of L-ascorbic acid is preferably vitamin C phosphate, for example phosphate-L ascorbate salts such as sodium phosphate-L-ascorbate or magnesium phosphate-L-ascorbate.
  • Vitamin C is contained, for example, at a concentration of 5-500 ⁇ g/mL in the culture solution.
  • the culture solution used for the production of hematopoietic stem cells is not particularly limited, but it can be prepared by using the culture solution used for culturing animal cells as the basal culture solution and adding vitamin C or the like to this.
  • basic culture media include Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) culture medium, Medium 199 culture medium, Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) culture medium, ⁇ MEM culture medium, Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) culture medium, and Ham's F12 culture medium.
  • liquid RPMI 1640 culture medium, Fischer's culture medium, Neurobasal Medium (Life Technologies), StemPro34 (Life Technologies), and mixed cultures thereof.
  • the culture medium may contain serum or may be serum-free.
  • the basal medium contains e.g. albumin, insulin, transferrin, selenium, fatty acids, trace elements, 2-mercaptoethanol, thiolglycerol, monothiolglycerol, lipids, amino acids, L-glutamine, non-essential amino acids, vitamins , growth factors, low-molecular-weight compounds, antibiotics, antioxidants, pyruvic acid, buffers, inorganic salts, cytokines, and the like.
  • albumin e.g. albumin, insulin, transferrin, selenium, fatty acids, trace elements, 2-mercaptoethanol, thiolglycerol, monothiolglycerol, lipids, amino acids, L-glutamine, non-essential amino acids, vitamins , growth factors, low-molecular-weight compounds, antibiotics, antioxidants, pyruvic acid, buffers, inorganic salts, cytokines, and the like.
  • BMP4 (Bone morphogenetic protein 4), VEGF (vascular endothelial growth factor), bFGF (basic fibroblast growth factor), SCF (stem cell factor), TPO (thrombopoietin), and FLT3L ( A cytokine selected from the group consisting of Flt3 ligand) may be further added.
  • concentrations are, for example, 1-100 ng/mL for BMP4, 1-100 ng/mL for VEGF, 1-100 ng/mL for bFGF, and 10-100 ng/mL for SCF.
  • TPO is 1–100 ng/mL
  • FLT3L is 1–100 ng/mL.
  • a TGF ⁇ inhibitor may be added to the hematopoietic stem cell culture medium.
  • a "TGF ⁇ inhibitor” is a small molecule inhibitor that interferes with the signaling of the TGF ⁇ family, e.g. , NPC30345, SD093, SD908 and SD208 (Scios), and LY2109761, LY364947 and LY580276 (Lilly Research Laboratories), and the concentration added to the culture medium is preferably 0.5-100 ⁇ M.
  • iPS cells are C3H10T1/2 (Takayama N., et al. J Exp Med. 2817-2830, 2010) or heterologous stromal cells (Niwa A et al. J Ce11 Physiol. 2009 Nov; 221 (2): 367-77) and other feeder cells.
  • the method for culturing iPS cells during production of hematopoietic stem cells may be adherent culture or suspension culture, but suspension culture is preferred.
  • iPS cells can be cultured to 80% confluency in the dish used, released, dissociated into single cells, and subjected to suspension culture.
  • Methods for isolating iPS cells include, for example, a method of physically isolating with a cell scraper or the like, a dissociation solution having protease activity and collagenase activity (e.g., Accutase (registered trademark) and Accumax (registered trademark), etc.), or Isolation methods using a dissociation solution with collagenase activity are included.
  • Suspension culture is to culture cells in a non-adherent state to the culture vessel.
  • Suspension culture is not particularly limited, but culture vessels that have not undergone artificial treatment (for example, coating treatment with extracellular matrix, etc.) for the purpose of improving adhesion to cells, or artificially suppress adhesion (For example, coating treatment with polyhydroxyethyl methacrylate (poly-HEMA) or nonionic surfactant polyol (Pluronic F-127, etc.)).
  • poly-HEMA polyhydroxyethyl methacrylate
  • Pluronic F-127 nonionic surfactant polyol
  • Hematopoietic stem cells can also be prepared from cyst-like structures (also called iPS-sac) obtained by culturing iPS cells.
  • cyst-like structure also called iPS-sac
  • cyst-like structure refers to a three-dimensional sac-like structure (having a space inside) derived from iPS cells, formed of an endothelial cell population or the like, and containing hematopoietic stem cells inside. be.
  • the temperature conditions for culturing to produce hematopoietic stem cells from iPS cells are not particularly limited, but are, for example, about 37°C to about 42°C, preferably about 37°C to about 39°C.
  • a person skilled in the art can appropriately determine the culture period while monitoring the number of hematopoietic stem cells and the like.
  • the number of days of culture is not particularly limited as long as hematopoietic stem cells can be obtained. Or 14 days or more, preferably 14 days. A long culture period is not a problem in the production of hematopoietic stem cells.
  • hypoxic conditions include, for example, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5% or less. of oxygen concentration.
  • CD4/CD8 double-positive T cells are T cells that are positive for both the surface antigens CD4 and CD8 (CD8 + CD4 + ), and the T cells are positive for the surface antigens CD3 and CD45.
  • CD4/CD8 double positive T cells can be identified as cells that are positive for CD4, CD8, CD3 and CD45 since they can be recognized by being .
  • CD4/CD8 double positive T cells can be induced to differentiate into CD4 single positive cells or CD8 single positive cells.
  • CD4/CD8 double-positive T cells can be produced by a method comprising culturing hematopoietic stem cells in a culture medium supplemented with a p38 inhibitor and/or SDF-1.
  • p38 inhibitor is defined as a substance that inhibits the function of p38 protein (p38MAP kinase). p38 inhibitors include, but are not limited to, for example, chemical inhibitors of p38, dominant-negative mutants of p38, or nucleic acids encoding same.
  • Chemical inhibitors of p38 include SB203580 (4-(4-fluorophenyl)-2-(4-methylsulfonylphenyl)-5-(4-pyridyl)-1H-imidazole) and its derivatives, SB202190(4- (4-fluorophenyl)-2-(4-hydroxyphenyl)-5-(4-pyridyl)-1H-imidazole) and its derivatives, SB239063 (trans-4-[4-(4-fluorophenyl)-5- (2-Methoxy-4-pyrimidinyl)-1H-imidazol-1-yl]cyclohexanol) and its derivatives, SB220025 and its derivatives, PD169316, RPR200765A, AMG-548, BIRB-796, SCl0-469, SCIO-323, Examples include but are not limited to VX-702, or FR167653.
  • a p38 inhibitor is added to the culture medium, for example, in the range of about 1 ⁇ M to about 50 ⁇ M.
  • the dominant-negative mutants of p38 include p38T180A, in which threonine at position 180 located in the p38 DNA-binding region is mutated to alanine, and p38Y182F, in which tyrosine at position 182 of p38 is mutated to phenylalanine in humans and mice. is mentioned.
  • SDF-1 stromal cell-derived factor 1
  • SDF-1 ⁇ includes not only SDF-1 ⁇ or its mature form, but also isoforms such as SDF-1 ⁇ , SDF-1 ⁇ , SDF-1 ⁇ , SDF-1 ⁇ or SDF-1 ⁇ , or their or a mixture thereof at any ratio.
  • SDF-1 ⁇ is used.
  • SDF-1 is sometimes referred to as CXCL-12 or PBSF.
  • SDF-1 may have one or several amino acid substitutions, deletions and/or additions in its amino acid sequence as long as it has activity as a chemokine, and similarly sugar chains may be substituted or deleted. and/or may be added. A range in which at least four cysteine residues (Cys30, Cys32, Cys55 and Cys71 in the case of human SDF-1 ⁇ ) are retained in SDF-1 and have 90% or more identity to the natural amino acid sequence Amino acid mutations are allowed.
  • the SDF-1 may be of a mammal, eg, a non-human mammal such as a human, eg, monkey, sheep, cow, horse, pig, dog, cat, rabbit, rat, or mouse.
  • GenBank accession number: NP_954637 can be used as human SDF-1 ⁇
  • NP_000600 can be used as SDF-1 ⁇ .
  • SDF-1 may be commercially available, purified from nature, or produced by peptide synthesis or genetic engineering techniques. SDF-1 is added to the culture medium, for example, in the range of about 10 ng/mL to about 100 ng/mL.
  • the culture medium used for the production of CD4/CD8 double-positive T cells is not particularly limited. It can be prepared by adding vitamin C.
  • the types of vitamin C used in the production of CD4/CD8 double-positive T cells are, for example, as described above, and the concentration of vitamin C is, for example, 5-200 ⁇ g/mL.
  • Examples of the basal culture medium include Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) medium, Medium 199 medium, Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) medium, ⁇ MEM medium, Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) medium, and Ham's F12 medium. , RPMI 1640 culture medium, Fischer's Neurobasal Medium culture medium (Life Technologies), and their mixed culture medium.
  • the culture medium may be serum-supplemented or serum-free.
  • the basal medium contains e.g. albumin, insulin, transferrin, selenium, fatty acids, trace elements, 2-mercaptoethanol, thiolglycerol, lipids, amino acids, L-glutamine, non-essential amino acids, vitamins, growth factors , low-molecular-weight compounds, antibiotics, antioxidants, pyruvic acid, buffers, inorganic salts, cytokines, and the like.
  • a cytokine selected from the group consisting of SCF, TPO (thrombopoietin), FLT3L and IL-7 may be further added to the culture medium used to produce CD4/CD8 double-positive T cells.
  • concentrations are, for example, 10-100 ng/mL for SCF, 10-200 ng/mL for TPO, 1-100 ng/mL for FLT3L, and 1-100 ng/mL for IL-7. is.
  • Hematopoietic stem cells may be adherently cultured or suspended cultured, but adherently cultured is preferred.
  • the culture vessel may be coated.
  • coating agents include matrigel (Niwa A, et al. PLoS One. 6(7):e22261, 2011), collagen, gelatin, laminin, heparan sulfate proteoglycan, retronectin, Fc-DLL4 or entactin, and combinations thereof. is mentioned.
  • the culture temperature conditions for culturing hematopoietic stem cells to produce CD4/CD8 double-positive T cells are not particularly limited. is more preferred.
  • the culture period can be appropriately determined by those skilled in the art while monitoring the number of CD4/CD8 double-positive T cells and the like.
  • the number of days of culture is not particularly limited as long as CD4/CD8 double-positive T cells can be obtained. , or 23 days or more, preferably 23 days.
  • the obtained CD4/CD8 double-positive T cells may be isolated and used, or may be used as a cell population containing other cell types.
  • methods well known to those skilled in the art can be used. Examples thereof include a method of labeling with an antibody against CD4, CD8, CD3 and/or CD45 and isolation using a flow cytometer, or a method of purification using an affinity column or the like on which a desired antigen is immobilized.
  • CD8 single-positive T cells are T cells whose surface antigen CD8 is positive (CD8 + CD4 ⁇ ), and are also called cytotoxic T cells. Since T cells can be recognized by being positive for the surface antigens CD3 and CD45, CD8 single positive T cells can be identified as cells that are CD8, CD3 and CD45 positive and CD4 negative.
  • CD8 single-positive T cells can be produced by a method that includes the step of culturing CD4/CD8 double-positive T cells in a culture medium supplemented with an adrenocortical hormone agent.
  • the corticosteroid is preferably a glucocorticoid or a derivative thereof, such as cortisone acetate, hydrocortisone, fludrocortisone acetate, prednisolone, triamcinolone, methylprednisolone, dexamethasone, betamethasone, or beclomethasone propionate.
  • the corticosteroid is dexamethasone. Its concentration in the culture medium is, for example, 1-100 nM.
  • the culture medium used for the production of CD8 single-positive T cells is not particularly limited, but can be prepared by using the culture medium used for culturing animal cells as the basal culture medium and adding an adrenocortical hormone agent thereto.
  • Examples of basic culture media include Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) culture medium, Medium 199 culture medium, Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) culture medium, ⁇ MEM culture medium, Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) culture medium, and Ham's F12 culture medium.
  • IMDM Iscove's Modified Dulbecco's Medium
  • EMEM Eagle's Minimum Essential Medium
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's Medium
  • Ham's F12 culture medium Ham's F12 culture medium.
  • liquid RPMI 1640 culture medium, Fischer's Neurobasal Medium culture medium (Life Technologies), and mixed culture medium thereof.
  • the culture medium may be serum-supplemented or serum-free
  • the basal medium contains, for example, albumin, insulin, transferrin, selenium, fatty acids, trace elements, 2-mercaptoethanol, thiolglycerol, monothiolglycerol, lipids, amino acid, L-glutamine, non-essential amino acids, It may also contain one or more substances selected from vitamins, growth factors, low molecular weight compounds, antibiotics, antioxidants, pyruvic acid, buffers, inorganic salts, cytokines, and the like.
  • the culture medium used for producing CD8 single-positive T cells preferably further contains anti-CD3 antibodies, vitamin Cs, or cytokines.
  • cytokines include, for example, IL-2, IL-7, IL-15 and IL-21.
  • the anti-CD3 antibody is not particularly limited as long as it specifically recognizes CD3, but examples include antibodies produced from OKT3 clones.
  • the concentration of the anti-CD3 antibody in the culture medium is, for example, 10-1000 ng/mL.
  • the vitamin Cs used for the production of CD8 single-positive T cells are, for example, those mentioned above, and can be used under the same conditions as above.
  • the concentrations of cytokines used in the production of CD8 single-positive T cells in the culture medium are, for example, 10-1000 U/mL for IL-2 and 1-100 ng/mL for IL-7.
  • the temperature conditions for culturing CD4/CD8 double-positive T cells for producing CD8 single-positive T cells are not particularly limited. °C is more preferable.
  • a person skilled in the art can appropriately determine the culture period while monitoring the number of CD8 single-positive T cells and the like.
  • the number of culture days is not particularly limited as long as CD8 single-positive T cells can be obtained. For example, it is at least 1 day or more, 2 days or more, 3 days or more, 4 days or more, or 5 days or more, preferably 3 days. .
  • the cDNAs encoding the TCR ⁇ chain and ⁇ chain to be introduced into the cells constituting the cell bank are preferably prepared for each single cell.
  • T cells collected from a subject are a T cell population with genetic diversity as a whole. Specificity is different.
  • the CAR-encoding cDNA to be introduced into the cells constituting the cell bank comprises a target binding site of an antibody or phage that binds to a target cell surface antigen or a ligand or receptor, a linker and a cell transmembrane site (e.g., CD8).
  • the CD3 ⁇ gene and the CD28 or CD137 intracellular signaling site linked via the transmembrane site of the molecule are prepared by constructing a plasmid vector or a viral vector.
  • T cells obtained from the subject with the target tumor-associated antigen may be isolated from the T cell population that responds to the tumor-associated antigen used using an activation marker, such as by a cell sorter.
  • a preferred activation marker is cell surface CD137.
  • Known techniques for isolating human T cells include, for example, flow cytometry using antibodies against T cell surface markers such as CD3 and CD137 and a cell sorter. Gene cloning can be performed from the obtained single T cell using the PCR method to amplify cDNAs encoding the TCR ⁇ chain and ⁇ chain, respectively.
  • TCR gene by single cell PCR tumor antigen-specific CD8-positive T cells obtained from peripheral blood or the like are combined with an MHC dextramer (registered trademark) that forms a complex with the antigen peptide.
  • MHC dextramer registered trademark
  • single cell sorting can be performed by a cell sorter.
  • An MHC dextramer is a compound composed of a dextran polymer backbone in which MHC and a fluorescent dye molecule are bound. MHC tetramer may be used instead of MHC dextramer.
  • An MHC tetramer is a tetramer of a complex of an antigen peptide and an MHC molecule with biotin and avidin.
  • tumor antigen-specific CD8-positive T cells obtained from peripheral blood or the like are cultured in the presence of the antigen, and then CD3/CD137 double-positive cells are isolated by a cell sorter. Single cell sorting is possible.
  • the cell population that binds to the MHC dextramer complexed with the antigenic peptide can be single cell sorted by a cell sorter from the CD3/CD137 double positive cells.
  • a TCR gene pair (TCR ⁇ chain gene and TCR ⁇ chain gene) can be isolated by PCR method using cDNA obtained by extracting RNA from the obtained single cell and reverse transcription reaction. Sequence analysis can be performed on the isolated TCR gene pair to analyze the types of tumor antigen-reactive T cells (TCR repertoire) and their frequency of occurrence.
  • a PCR fragment amplified using the isolated TCR cDNA as a template can be incorporated into a viral vector or non-viral vector (transposon vector) using, for example, the Gibson assembly system.
  • a gene in which the isolated TCR ⁇ chain gene and TCR ⁇ chain gene are linked via the T2A sequence is bound, and further downstream thereof, an IRES (internal ribosome entry site) sequence is attached.
  • IRES internal ribosome entry site
  • viral vectors and non-viral vectors can be used, but non-viral vectors are preferred.
  • PiggyBac vectors are preferred among transposon vectors as non-viral vectors.
  • the transposon method is a cheap and safe next-generation gene transfer method compared to the conventional viral vector method.
  • iPS cell clones derived from non-T non-B cells or monocytes in a good state of differentiation into T cells the hematopoietic stem cells differentiated from the iPS cell clones, or the TCR ⁇ chain and ⁇ to the immature T cells differentiated from the hematopoietic stem cells
  • Either a method using a viral vector or a method using a non-viral vector can be adopted as a method for introducing a cDNA pair encoding each strand.
  • Viral vectors include viral vectors such as lentivirus, retrovirus, adenovirus, adeno-associated virus, herpes virus and Sendai virus, and animal cell expression plasmids, preferably retroviruses or lentiviruses. When retrovirus or lentivirus infection is performed, it is preferable to use a spin infection method or the like. When using non-viral vectors, the transposon method is preferred. Non-viral vector gene transfer methods include the lipofection method, the liposome method, the calcium phosphate co-precipitation method, the DEAE dextran method, the microinjection method and the electroporation method. PCR products can also be introduced directly into cells without using vectors. Electroporation is preferably used for cell introduction of transposon vectors or PCR products. As an electroporation device, the gene transfer device ExPERT (registered trademark) system (MaxCyte) is preferred.
  • ExPERT registered trademark
  • MaxCyte MaxCyte
  • promoters used in expression vectors for introducing the cDNA pair into the cells include EF-1 ⁇ promoter, SR ⁇ promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV promoter, RSV promoter, HSV-TK promoter, and ubiquitin promoter. etc. These promoters may be able to control the expression of genes inserted downstream of the promoter depending on the presence or absence of drugs such as tetracycline.
  • the expression vector can contain, in addition to the promoter, an enhancer, poly A addition signal, selectable marker gene (eg, neomycin resistance gene), SV40 origin of replication, and the like.
  • TCR into mature T cells using genome editing technology Introduction of TCR into mature T cells can be performed using genome editing technology.
  • the endogenous TCR ⁇ chain and ⁇ chain gene sequences to be targeted confirming the sequences including the upstream thereof, having high cleavage activity for the endogenous TCR ⁇ chain and ⁇ chain genes, and genome other than the target gene Create guide RNAs (guide RNA for the sense strand and guide RNA for the antisense strand) that do not cut the above sequence.
  • donor DNA is generated that contains homologous recombination sites upstream and downstream of the insertion sites for the TCR ⁇ and ⁇ chains to be introduced.
  • the target TCR By introducing the guide RNA, Cas9 and the donor DNA into mature T cells, the target TCR can be introduced.
  • Introduction of the guide RNA, Cas9 and the donor DNA can be performed by using a viral vector, a non-viral vector, an electroporation method, or the like.
  • Mature T cells in which the endogenous TCR has been replaced with the desired TCR can be selected using binding to the desired tumor-associated antigen as an index.
  • marker genes such as EGFRt (truncated EGFR) and CD19t (truncated CD19
  • Regenerative T cell production can be initiated by introducing a TCR pair reactive to a tumor-associated antigen into the mature T cells, immature T cells or hematopoietic stem cells that make up the cell bank of the present invention. Therefore, it is possible to rapidly produce regenerative T cells used for prevention and/or treatment of cancer or infectious disease.
  • T cells from which TCR pairs corresponding to tumor-associated antigens are obtained are preferably collected from the patient's tumor tissue or patient's peripheral blood.
  • the tumor-associated antigen is administered from the tumor tissue or peripheral blood after administration of the tumor-associated antigen to the subject.
  • T cells are harvested.
  • tumor-associated antigens include, for example, GPC3.
  • tumor-specific T cells are present in peripheral blood without administration of tumor-associated antigens
  • MHC dextramer can be used to extract tumor cells from peripheral blood without administration of tumor-associated antigens.
  • Relevant antigen-specific T cells may be isolated.
  • tumor-associated antigens include, for example, WT1, NYESO-1 and EBV antigens.
  • T cells harvested from tumor tissue or peripheral blood of a subject after administration of a tumor-associated antigen to the subject, or without administration of the tumor-associated antigen are in any case preferred.
  • In vitro stimulation with a tumor-associated antigen may not be performed when the appearance frequency of tumor-associated antigen-specific T cells is extremely high in peripheral blood.
  • the TCR It is preferable to confirm that the pair does not elicit an allo-response against the cells of the subject to be treated for cancer.
  • a pharmaceutical composition containing regenerated T cells produced by introducing an antigen-specific TCR into the iPS cell-derived differentiated cells of the present invention can be used for treating cancer and infectious diseases.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be produced by a method commonly used in the field of formulation technology, such as the method described in the Japanese Pharmacopoeia.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain pharmaceutically acceptable additives. Examples of such additives include cell culture media, physiological saline, and suitable buffers (eg, phosphate buffers).
  • the pharmaceutical composition can be produced by suspending regenerated T cells in physiological saline or an appropriate buffer (eg, phosphate buffer). It is preferable to contain, for example, 1 ⁇ 10 7 cells or more as a single dosage amount so as to exert the desired therapeutic effect. More preferably, the cell content is 1 ⁇ 10 8 or more, more preferably 1 ⁇ 10 9 or more. The content of cells can be appropriately adjusted in consideration of the sex, age, weight, condition of the affected area, condition of cells, etc. of the subject to be administered.
  • the pharmaceutical composition may contain dimethylsulfoxide (DMSO), serum albumin, etc. for the purpose of protecting the cells, in addition to the regenerated T cells as active ingredients.
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • the pharmaceutical composition may contain antibiotics, etc., and vitamins, cytokines, etc., for the purpose of promoting activation and differentiation of cells.
  • the pharmaceutical composition may contain other pharmaceutically acceptable components (e.g., carriers, excipients, disintegrants, buffers, emulsifiers, suspending agents, soothing agents, stabilizers, preservatives, preservatives, physiological saline solution, etc.).
  • the hematopoietic stem cells, immature T cells, or mature T cells that constitute the cell bank of the present invention are divided according to the amount (1 ⁇ 10 7 to 1 ⁇ 10 9 ) to be used for one TCR introduction, and cryopreserved. can be done.
  • the preservation temperature is not particularly limited as long as it is suitable for preserving cells. For example, it may be -150 to -196°C, preferably -150°C or lower.
  • cryopreserved cells are preferably stored in suitable containers such as cryovials and cryobags. Manipulations to minimize the risk of cell damage during freezing and thawing of regenerated T cells are well known to those skilled in the art.
  • the amount of cells that constitute the cell bank of the present invention is preferably an amount that allows TCR transduction to be performed 1000 times or more.
  • the pharmaceutical composition is used for prevention and/or treatment of cancer or infectious disease.
  • Cancers include ovarian cancer, hepatoblastoma, hepatocellular carcinoma, gastric cancer, esophageal cancer, pancreatic cancer, renal cell carcinoma, breast cancer, malignant melanoma, non-small cell lung cancer, cervical cancer, and glioblastoma. including, but not limited to, blastoma, prostate cancer, neuroblastoma, chronic lymphocytic leukemia, papillary thyroid cancer, colorectal cancer, and B-cell non-Hodgkin's lymphoma.
  • FIG. 1 shows the process of producing antigen-specific regenerative T cells from mature T cells that constitute the cell bank of the present invention.
  • TCR genes isolated from patient-derived T cells that specifically react to tumor antigen X, TCR genes specific to tumor antigen X, or chimeric receptor genes specific to tumor antigen X constitute a cell bank. Introduce into mature T cells. It takes about two weeks to produce regenerated T cells from the mature T cells that make up the cell bank.
  • FIG. 3 shows the steps of introducing a TCR gene using a transposon.
  • the cell bank of the present invention which is an aggregate of frozen cells, was constructed.
  • the mature T cells are T cells that recognize a single antigen and do not initiate an alloreaction, and after thawing the frozen cells that constitute the cell bank, tumor-specific TCRs are introduced.
  • regenerative T cells can be produced by introducing a TCR gene that reacts with tumor antigen X into mature T cells that have been induced to differentiate from iPS cells and cryopreserved in advance. can. For this reason, compared to the case where the step of producing iPS cells, the step of inducing the differentiation of iPS cells into mature T cells, and the step of producing regenerated T cells by introducing a TCR gene into mature T cells are sequentially performed, the time period is shorter. (approximately 2 weeks), tumor-specific regenerative T cells can be produced. Therefore, administration of tumor-specific regenerative T cells to patients can be performed rapidly.
  • FIG. 4 shows the results of flow cytometric analysis of regenerated T cells using cell surface antigen markers. Mature T cells induced from iPS cells were confirmed to express CD45 + TCR ⁇ + CD3 + CD4 ⁇ CD8 ⁇ + , the expression of which is observed in mature cytotoxic T cells in vivo.
  • Fig. 5 shows the results of analyzing telomeres (indicators of rejuvenation), which are cell senescence markers, for mature T cells that are induced to differentiate from iPS cells and constitute the cell bank of the present invention.
  • telomeres indicator of rejuvenation
  • iPS cells prepared from the tumor antigen-specific T cells C
  • C tumor antigen-specific T cells
  • D tumor antigen-specific regenerative T cells
  • the expression of PD-1 which is one of the cell exhaustion markers related to immune checkpoints, and the TIGIT molecule, is measured with anti-TIGIT antibody and anti-PD-1. They were stained with antibodies and analyzed by a flow cytometer. For comparison, pre-regeneration tumor antigen-specific T cells were also analyzed. The results are shown in FIG. It was confirmed that the regenerated T cells of the present invention have greatly reduced expressions of PD-1 and TIGIT molecules compared to tumor antigen-specific T cells before regeneration. Therefore, it is suggested that the regenerated T cells of the present invention have high cytotoxic activity.
  • FIG. 2 shows the process of producing antigen-specific regenerative T cells from immature T cells that constitute the cell bank of the present invention.
  • TCR genes isolated from patient-derived T cells that specifically react to tumor antigen X, TCR genes specific to tumor antigen X, or chimeric receptor genes specific to tumor antigen X constitute a cell bank. Introduce into immature T cells. In patients undergoing cancer therapy, it is possible to reselect a therapeutically effective TCR gene even in the event of tumor recurrence or tumor cell mutations. It takes about 4 weeks to produce regenerated T cells from the immature T cells that make up the cell bank. Genome editing using CRISPR/Cas9 or the like, lentivirus, or transposon vector can be used to introduce the tumor antigen X-specific TCR gene or CAR gene.
  • the cell bank of the present invention which is an aggregate of frozen cells, was constructed.
  • the immature T cells are T cells that do not express T cell receptors, and after thawing the frozen cells that make up the cell bank, a tumor-specific TCR is introduced.
  • regenerative T cells can be produced by introducing a TCR gene that reacts with tumor antigen X into immature T cells that have been induced to differentiate from iPS cells and cryopreserved in advance. can. For this reason, compared to the case where the step of producing iPS cells, the step of inducing the differentiation of iPS cells into immature T cells, and the step of producing regenerated T cells by introducing a TCR gene into the immature T cells are performed sequentially, the time period is shorter. In (approximately 4 weeks), tumor-specific regenerative T cells can be produced. Therefore, administration of tumor-specific regenerative T cells to patients can be performed rapidly.
  • FIG. 7 shows the analysis results of immature T cells by flow cytometry using cell surface antigen markers. Immature T cells induced from iPS cells were confirmed to express CD45 + TCR ⁇ ⁇ CD3 + CD4 ⁇ CD8 ⁇ + , which is observed to be expressed in mature cytotoxic T cells in vivo.
  • Mononuclear cells were isolated from peripheral blood drawn from patients with hepatocellular carcinoma or hepatoblastoma using the mononuclear cell separation solution Lymphoprep®. From the obtained mononuclear cells, CD19/CD20 positive B cells and CD3/CD4/CD8 positive T cells were depleted using FACS or MACS beads to obtain non-T non-B cells or monocytes.
  • Sendai virus (CytoTune (registered trademark) 2.0) carrying Yamanaka 4 factors (Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-Myc) and Sendai Viruses were infected at an MOI (multiplicity of infection) of 5-20. Note that the SV40 may be omitted.
  • the obtained iPS cells consist of a large number of iPS cell clones. Therefore, a colony pick was performed and cloned. All cloned iPS cells were cryopreserved. The cloned iPS cells were cultured in a differentiation medium for about 10 days to induce hematopoietic stem cells, and CD34/CD43 double-positive hematopoietic stem cells were isolated. The isolated hematopoietic stem cells were cultured for about 21 days on a plate coated with FcDLL4, which is a fusion protein of DLL4 protein and the Fc region of immune immunoglobulin, to induce differentiation into T cells.
  • FcDLL4 is a fusion protein of DLL4 protein and the Fc region of immune immunoglobulin
  • the frequency of immature cytotoxic T cells obtained after the above 21 days of culture was verified by the CD8 ⁇ -chain/ ⁇ -chain double-positive rate, and clones with the highest appearance frequency of CD8 ⁇ -chain/ ⁇ -chain double-positive cells were selected.
  • iPS cell clones with good differentiation efficiency into T cells are cultured for 2 weeks in an iPS cell maintenance medium, then dispensed into cell storage containers and cryopreserved to construct a master cell bank. did.
  • T-cell receptor ⁇ -chain and ⁇ -chain whose tumor antigen specificity was confirmed for iPS cell clones derived from non-T non-B cells or monocytes with good differentiation efficiency into T cells obtained in Example 2 was introduced using the electroporation method.
  • iPS cells expressing the desired T-cell receptor ⁇ -chain and ⁇ -chain were isolated by a cell sorter using the expression of the marker molecule CD19 as an indicator.
  • the isolated iPS cells were cultured in a differentiation medium for about 10 days to induce CD34/CD43 double-positive hematopoietic stem cells and isolated by a cell sorter.
  • the isolated blood stem cells were cultured on an FcDLL4-coated plate for about 21 days to induce differentiation into T cells.
  • the CD8 ⁇ -chain/ ⁇ -chain double-positive immature T cells obtained after the above 21 days of culture were isolated and purified using a cell sorter.
  • immature T cells were co-expressed in the presence of PHA (phytohemagglutinin) and peripheral blood mononuclear cells as feeder cells, in the presence of Retronectin (registered trademark) and anti-CD3 antibody, or in the presence of anti-CD3 antibody and anti-CD28 antibody. cultured and induced into mature cytotoxic T cells. These stimulations were performed one or more times. The performance of the obtained T cells was confirmed by GPC3-specific target cell cytotoxic activity, IFN- ⁇ production and antigen-binding ability.
  • TCR gene into mature T cells differentiated from iPS cell clones For mature T cells differentiated via hematopoietic stem cells and immature T cells from non-T non-B cells or monocyte-derived iPS cell clones with good differentiation efficiency into T cells obtained in Example 3, A gene (cDNA) encoding the GPC3 antigen-specific T-cell receptor ⁇ -chain ⁇ -chain was introduced in the same manner as in Example 4 using the piggyBac (registered trademark) system.
  • Fig. 8 shows the results of analyzing the phenotype of mature T cells derived from transfected iPS cells using a flow cytometer.
  • No EP is the mature T cell used for gene transfer, the analysis result of the mature T cell expressing the WT1 antigen-specific T cell receptor ⁇ chain ⁇ chain
  • EGFP is the analysis result of the mature T cells introduced with an expression vector incorporating a tracer gene (EGFP (enhanced green fluorescent protein) gene) as an indicator of gene introduction manipulation
  • "Empty-CD19” is an intracellular defect as a tracer gene.
  • Fig. 3 shows the analysis results of the mature T cells introduced with a piggyBac (registered trademark) transposon vector in which defective human CD19 gene is tandemly integrated.
  • TCR-CD19 In the iPS cell-derived mature T cells indicated by "TCR-CD19", in addition to the expression of the CD3 gene and the intracellularly defective human CD19 gene, which is a tracer gene incorporated in the piggyBac (registered trademark) transposon vector, GPC3 antigen-specific Binding to the GPC3 peptide/HLA complex (GPC3-Dex) recognized by the target T-cell receptor ⁇ -chain ⁇ -chain was detected.
  • GPC3 antigen-specific Binding to the GPC3 peptide/HLA complex (GPC3-Dex) recognized by the target T-cell receptor ⁇ -chain ⁇ -chain was detected.
  • GPC3 antigen-specific T cell receptor ⁇ -chain ⁇ -chain gene by introducing a GPC3 antigen-specific T cell receptor ⁇ -chain ⁇ -chain gene into iPS cell-derived mature T cells using the piggyBac (registered trademark) system, GPC3 antigen-specific T expressed on the cells
  • the cell receptor ⁇ -chain ⁇ -chain functions as a molecule that recognizes the GPC3 peptide/HLA complex (GPC3-Dex). Therefore, novel tumor-associated antigens (neoantigens) and other tumor-associated antigen-specific T-cell receptor ⁇ -chain ⁇ -chain genes can be used as T-cell receptor ⁇ -chain ⁇ -chain genes to be introduced into iPS cell-derived mature T cells. demonstrated that iPS cell-derived mature T cells that recognize these antigens can be generated.
  • FIG. 9 shows a method of selecting iPS cell clones with high differentiation efficiency into T cells in the process of producing regenerated T cells from iPS cells reprogrammed from peripheral blood T cells.
  • Mononuclear cells are isolated from the peripheral blood of a subject infected with EBV (Epstein-Barr virus), and the isolated mononuclear cells are stimulated with EBV antigen in vitro to generate a CD8-positive T cell population that recognizes the EBV antigen. Isolated.
  • EBV Epstein-Barr virus
  • iPS cell clones were isolated from the obtained iPS cell population, each clone was examined for its ability to differentiate into T cells, and iPS cell clones with high differentiation efficiency into T cells were selected.
  • T cells that recognize EBV antigens are cells that are less likely to produce allo-reactivity even when allografts are performed.
  • FIG. 10 shows that in the process of producing regenerated T cells from iPS cells reprogrammed from peripheral blood T cells, genome editing is performed on iPS cell clones selected as cells with high differentiation efficiency into T cells, and regenerated T cells are produced. A method of manufacturing cells is shown.
  • iPS cell clones derived from CD8-positive T cells that recognize EBV antigens and have high differentiation efficiency into T cells are ⁇ 2M gene and CIITA gene involved in the expression of MHC class I and MHC class II, natural killer (NK) cells
  • the PVR gene which is involved in the activation of T cell receptors, as well as the Rag2 gene, which is involved in rearrangement of the T cell receptor, were deleted using CRISPR/Cas9, while the inhibitory ligand of NK cells, ⁇ 2 ⁇ /binding peptide/HLA -E fusion gene (HLA-E * ) was expressed to make iPS cells immune to attack by host T cells and NK cells.
  • iPS cell-derived regenerated T cells may be preserved as clones to construct a master cell bank.
  • Regenerated T cells differentiated and proliferated from iPS cells are host T cells for producing regenerated T cells for cancer treatment, and a master cell bank may be constructed from the host T cells.
  • the host T cells can be used as materials for producing regenerative T cells into which a TCR gene or CAR (chimeric antigen receptor) gene has been introduced. Since the host T cells are T cells that recognize EBV antigens, they are unlikely to cause an alloreaction even when transferred into the body. "Host T cells” are used as starting materials for the manufacture of cancer preventive or therapeutic agents containing regenerated T cells as active ingredients, although the cells themselves are not used for treatment of patients. means T cells.
  • FIG. 11 shows a method for producing regenerative T cells that recognize cancer antigens from the host T cells.
  • host T cells that recognize EBV antigen gene replacement by genome editing using CRISPR / Cas9, rearranged T cell receptor ⁇ chain that recognizes EBV antigen T cells that recognize cancer antigens It was replaced with a T2a-mediated conjugate of the receptor ⁇ chain and the T cell receptor ⁇ chain.
  • the T cell receptor ⁇ chain that recognizes the EBV antigen was removed by genome editing using CRISPR/Cas9.
  • FIG. 12 summarizes the methods shown in FIGS.
  • Regenerated T cells produced from allogeneic universal iPS cells reprogrammed peripheral blood T cells (iPS-T cells) can be used as a starting material for producing T cells introduced with the TCR gene or CAR gene.
  • "Universal iPS cells” are very low immunogenicity, so they can be used in patients with any type of MHC (Major Histocompatibility Complex) without causing rejection. It means iPS cells that can be used. That is, iPS cells that can be administered to patients without consideration of MHC matching.
  • Universal iPS cells can be generated by knocking out MHC class I or MHC class II molecules and expressing ligands that suppress NK cells.
  • a viral vector used for producing T cells used in conventional T cell replacement therapy or regenerative therapy may be used to introduce the TCR gene or CAR gene.
  • iPS-T cells as a starting material, it becomes possible to produce desired T cells, which are active ingredients of cancer preventive or therapeutic agents, in a short period of time.
  • it is easy to introduce a TCR that recognizes a neoantigen and by introducing a plurality of TCR genes that recognize different neoantigens, it is possible to produce iPS-T cells while maintaining polyclonality.

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Abstract

【課題】患者個別の抗原特異的Ｔ細胞受容体を導入した再生Ｔ細胞を迅速に製造するための、ｉＰＳ細胞から分化誘導した造血幹細胞、未熟Ｔ細胞および／または成熟Ｔ細胞を製造中間体として含む細胞バンクの提供。 【解決手段】ｉＰＳ細胞ならびにｉＰＳ細胞から分化した造血幹細胞、未熟Ｔ細胞および成熟Ｔ細胞からなる群より選ばれる１種類以上の細胞を含む細胞バンクを構築する。前記ｉＰＳ細胞は、Ｂ細胞およびＴ細胞が除去された末梢血単核球の初期化、またはＴ細胞の初期化により得られる。前記造血幹細胞もしくは前記未熟Ｔ細胞へのＴ細胞受容体遺伝子の導入は、ウイルスベクター、トランスポゾンベクターまたはゲノム編集技術を用いる。前記成熟Ｔ細胞へのＴ細胞受容体遺伝子の導入は、ゲノム編集技術を用いる。

Description

Ｔ細胞受容体遺伝子を導入するためのｉＰＳ細胞により構成される細胞バンク
　本発明は、腫瘍または病原体に由来する抗原を認識するＴ細胞受容体（T cell receptor：ＴＣＲ）遺伝子を導入した人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）由来Ｔ細胞(再生Ｔ細胞)を製造するための中間体としてのｉＰＳ細胞由来の造血幹細胞、未熟Ｔ細胞および成熟Ｔ細胞を含む細胞バンクに関する。さらに本発明は、がんの予防および／または治療に用いる再生Ｔ細胞製剤の製造のための、造血幹細胞、未熟Ｔ細胞および成熟Ｔ細胞を含む細胞バンクの使用に関する。
　Ｔ細胞は、細菌もしくはウイルス等の外来病原体またはがん細胞等の異常な細胞に対する免疫応答において中心的な役割を果たしている。このため、Ｔ細胞の機能低下は、がんや病原体感染の発生に寄与すると考えられている。Ｔ細胞の機能低下に起因する疾患を有する患者へのＴ細胞の補充療法または再生療法は、患者における疾患の病態改善や治療に極めて有効な手段となり得る。
　ヒトおよびマウスを用いた研究において、がんまたは感染症に対してＴ細胞補充療法を行う場合、がん細胞または細菌もしくはウイルス等の外来病原体の感染した異常な細胞が有する抗原を特異的に認識するＴ細胞を用いることにより、高い治療効果が得られることが知られている。一方で、Ｔ細胞を十分量確保することが難しいこと、Ｔ細胞を製造するのには長期間が必要であること、ならびに患者由来の細胞を材料とする場合、Ｔ細胞の増殖能の低下および標的細胞等の抗原に対する免疫反応の低下などのＴ細胞の疲弊化がＴ細胞補充療法における障害となっている。
　Ｔ細胞補充療法における上記の障害を克服するため、抗原特異的なＴ細胞からｉＰＳ細胞を樹立し、該ｉＰＳ細胞を増殖させた後、Ｔ細胞へ分化させた再生Ｔ細胞を用いるＴ細胞補充療法、または標的抗原を認識するためのＴＣＲを導入したｉＰＳ細胞からＴ細胞へ分化させた再生Ｔ細胞を用いるＴ細胞補充療法が提案されている。ｉＰＳ細胞を製造するための原料として、標的抗原に対して特異的なＴ細胞または標的抗原を認識するためのＴＣＲを使用することにより、元のＴ細胞と同じ抗原特異性を示す再生Ｔ細胞を製造することが可能である（特許文献１および非特許文献１）。
　ｉＰＳ細胞から再生Ｔ細胞を製造する場合は、長期間の分化培養が必要である（特許文献２）。既得されたＴＣＲを同種ｉＰＳ細胞に導入する場合は、製造された再生Ｔ細胞を保存しておくことができるため、再生Ｔ細胞の製造期間が長いことは特に問題にはならない。一方で、既得されたＴＣＲを、ＴＣＲが由来する個体とは異なる患者に対して使用する場合は、アロ反応による副反応のリスクがある。このため、リスクを回避する目的で、患者個別の抗原特異的ＴＣＲを使用する方法に注目が集まっている。がんにおいては、各個人で異なる遺伝子変異を有しており、それらがＴ細胞治療の格好の標的であるネオアンチゲンとなる。これまでに、ネオアンチゲンに対するワクチン投与により高い薬効が示されていることもあり、患者個別の抗原特異的ＴＣＲを使用する方法により製造された治療剤のがん治療におけるベネフィットは非常に大きい。
ＷＯ２０１１／０９６４８２号パンフレット ＷＯ２０１３／１７６１９７号パンフレット
Nishimura T, et al. Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell. 2013; 12:114-126.
　ｉＰＳ細胞を介して製造された再生Ｔ細胞（ｉＰＳ－Ｔ細胞）を用いるがんおよび感染症の治療において、腫瘍細胞または腫瘍組織、ならびに感染細胞および感染部位に存在する標的抗原を特異的に認識する患者個別のＴＣＲを使用することは、治療における再生Ｔ細胞補充療法の安全性および有効性を担保する上で重要である。しかも、がんの発症またはがんの再発が検出された場合、速やかにｉＰＳ－Ｔ細胞補充療法を開始することが、治療成績を向上させるために重要である。しかしながら、患者個別に患者の抗原特異的ＴＣＲを使用する細胞製剤の製造は、患者ごとに行う必要があり、製造に要する労力および長期に及ぶ製造期間の問題が細胞製剤の開発を妨げてきた。特に同種再生Ｔ細胞製剤においては、その製造期間の長さが問題であった。
　本発明は、患者個別の抗原特異的ＴＣＲを導入したｉＰＳ－Ｔ細胞を迅速に製造するための、ｉＰＳ細胞から分化した細胞である造血幹細胞、未熟Ｔ細胞および成熟Ｔ細胞を含む細胞群を、製造中間体として提供することができる細胞バンクの構築を目的とする。さらに本発明は、前記製造中間体から、がんもしくは感染症の予防および／または治療に用いる再生Ｔ細胞製剤の製造のための、前記細胞バンクの利用を含む。
　最近の研究で、１つの抗原エピトープに対して複数のＴ細胞クローン（５～１０クローン）がそれぞれ異なるＴＣＲを用いて抗原を認識していることが明らかになっている。また、１つの抗原エピトープに対して、患者それぞれが異なるＴＣＲレパトアを持つことが明らかにされている。また、がん細胞は、個々の患者において相互に異なる遺伝子変異を有しており、それらがＴ細胞治療の格好の標的であるネオアンチゲンとなる。個々の患者から得られたＴＣＲを用いて製造した再生Ｔ細胞が、対応する患者の体内でＴ細胞治療の標的を傷害するのに最適なＴＣＲを有するＴ細胞である可能性は高い。個々の患者から得られたＴＣＲを用いて製造した再生Ｔ細胞が、レシピエントの細胞を攻撃するアロ反応を起こさないことは明白である。したがって、がんもしくは感染症の予防および／または治療において、安全性および薬効に関して、個々の患者から得られたＴＣＲを用いて再生Ｔ細胞を製造するベネフィットは極めて高い。
　現状では、患者から得られた細胞由来のｉＰＳ細胞クローンを用いて再生Ｔ細胞を製造する場合、その製造に要する期間は長期にわたる。再生Ｔ細胞補充療法を、それが必要な患者に速やかに提供するためには、製造期間の短縮が大きな課題となっている。
　本発明者らは、個々の患者の腫瘍関連抗原または病原体特異的抗原に対して反応性を有するＴ細胞集団から抗原特異性を持つ種々のＴＣＲを取得し、このＴＣＲを、ｉＰＳ細胞から分化誘導し、予め保存した造血幹細胞、未熟Ｔ細胞または成熟Ｔ細胞に対して導入すること、または内在性ＴＣＲと置き換えることにより、再生Ｔ細胞を製造することができること；予めｉＰＳ細胞から分化誘導した造血幹細胞、未熟Ｔ細胞および成熟Ｔ細胞により細胞バンクを構築することにより、再生Ｔ細胞の製造期間の大幅な短縮ができること；および細胞バンクに含まれる細胞を、再生Ｔ細胞製剤を製造する中間体として使用することにより、再生Ｔ細胞製剤の均質化および標準化が容易となることを見出し、本発明を完成するに至った。また本発明は、既得されたＴＣＲを導入した再生Ｔ細胞およびキメラ受容体(chimeric antigen receptor：ＣＡＲ)を導入するための再生Ｔ細胞の製造にも応用することが可能である。
　すなわち、本発明の目的は、以下の発明により達成される。
　〔１〕Ｔ細胞受容体遺伝子を導入するための細胞により構成される細胞バンクであって、前記細胞が、ｉＰＳ細胞ならびに前記ｉＰＳ細胞から分化した造血幹細胞、未熟Ｔ細胞および成熟Ｔ細胞からなる群より選ばれる１種類以上の細胞である、前記細胞バンク。
　〔２〕前記細胞が、さらにキメラ抗原受容体遺伝子を導入するための細胞である、〔１〕に記載の細胞バンク。
　〔３〕前記ｉＰＳ細胞が、被験者の末梢血単核球であって、Ｂ細胞およびＴ細胞が除去された末梢血単核球を初期化することにより得られるｉＰＳ細胞である、〔１〕または〔２〕に記載の細胞バンク。
　〔４〕前記ｉＰＳ細胞クローンまたは前記ｉＰＳ細胞クローンから分化した前記造血幹細胞もしくは前記未熟Ｔ細胞へのＴ細胞受容体遺伝子の導入が、ウイルスベクター、トランスポゾンベクターまたはゲノム編集技術を用いる、〔３〕に記載の細胞バンク。
　〔５〕前記ｉＰＳ細胞が、被験者のＴ細胞を初期化することにより得られるｉＰＳ細胞である、〔１〕または〔２〕に記載の細胞バンク。
　〔６〕前記成熟Ｔ細胞へのＴ細胞受容体遺伝子の導入が、ゲノム編集技術を用いる、〔５〕に記載の細胞バンク。
　〔７〕前記ｉＰＳ細胞が、成熟Ｔ細胞への分化効率が良好なｉＰＳ細胞クローンである、〔１〕～〔６〕のいずれかに記載の細胞バンク。
　〔８〕前記細胞が、凍結保存される、〔１〕～〔７〕のいずれかに記載の細胞バンク。
　〔９〕前記細胞が、内在性Ｔ細胞受容体の発現を制御することができるように遺伝子改変した細胞である、〔５〕に記載の細胞バンク。
　〔１０〕前記造血幹細胞および前記未熟Ｔ細胞が、Ｔ細胞受容体を発現しない細胞である、〔１〕～〔９〕のいずれかに記載の細胞バンク。
　〔１１〕前記成熟Ｔ細胞が、前記成熟Ｔ細胞が由来する被験者とは別個体の被験者に由来する非腫瘍細胞を認識しないＴ細胞受容体を発現する、〔５〕に記載の細胞バンク。
　〔１２〕前記成熟Ｔ細胞が、単一抗原を認識する、〔１１〕に記載の細胞バンク。
　〔１３〕前記単一抗原が、インフルエンザウイルス抗原、ＥＢウイルス抗原、ＨＰＶ抗原、ＨＢＶ抗原、ＨＣＶ抗原、ＨＩＶ抗原、コロナウイルス抗原またはＨＴＬＶ抗原である、〔１２〕に記載の細胞バンク。
　〔１４〕前記造血幹細胞が、ＣＤ３４／ＣＤ４３ダブルポジティブである、〔１〕～〔１３〕のいずれかに記載の細胞バンク。
　〔１５〕前記未熟Ｔ細胞が、ＣＤ８α鎖／β鎖ダブルポジティブである、〔１〕～〔１４〕のいずれかに記載の細胞バンク。
　〔１６〕前記成熟Ｔ細胞が、ＣＤ８α鎖／β鎖ダブルポジティブおよびＴＣＲα鎖／β鎖ダブルポジティブである、〔１〕～〔１５〕のいずれかに記載の細胞バンク。
　〔１７〕前記Ｔ細胞受容体遺伝子が、被験者から得られるＴ細胞であって、腫瘍関連抗原に対して反応性を有するＴ細胞集団から、単一細胞ごとに調製される、〔１〕～〔１６〕のいずれかに記載の細胞バンク。
　〔１８〕前記Ｔ細胞受容体遺伝子が、被験者から得られるＴ細胞を腫瘍関連抗原と接触させ、前記腫瘍関連抗原に対して反応性を有するＴ細胞集団から、単一細胞ごとに調製される、〔１〕～〔１６〕のいずれかに記載の細胞バンク。
　〔１９〕前記Ｔ細胞受容体遺伝子が、腫瘍関連抗原が投与された被験者から得られるＴ細胞を前記腫瘍関連抗原と接触させ、前記腫瘍関連抗原に対して反応性を有するＴ細胞集団から、単一細胞ごとに調製される、〔１〕～〔１６〕のいずれかに記載の細胞バンク。
　〔２０〕腫瘍関連抗原が、ＧＰＣ３、ＷＴ１、ＸＡＧＥ１、ＬＭＰ２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＥＢウイルス抗原およびネオアンチゲンならびにこれらのペプチド断片からなる群より選択される、〔１７〕～〔１９〕のいずれかに記載の細胞バンク。
　〔２１〕前記腫瘍関連抗原が、ＨＬＡ－Ａ２４拘束性ＧＰＣ３ペプチドであるＥＹＩＬＳＬＥＥＬ（配列番号１）、ＨＬＡ－Ａ２拘束性ＧＰＣ３ペプチドであるＦＶＧＥＦＦＴＤＶ（配列番号２）またはこれらの混合物である、〔１７〕～〔１９〕のいずれかに記載の細胞バンク。
　〔２２〕前記Ｔ細胞集団が、ＣＤ３／ＣＤ１３７ダブルポジティブである、〔１７〕～〔１９〕のいずれかに記載の細胞バンク。
　〔２３〕前記Ｔ細胞集団が、前記腫瘍関連抗原ペプチドと複合体を形成するＭＨＣテトラマーまたはＭＨＣデキストラマー（登録商標）と結合する、〔１７〕～〔１９〕のいずれかに記載の細胞バンク。
　〔２４〕前記ｉＰＳ細胞を得るための細胞を提供する被験者および前記Ｔ細胞受容体遺伝子を調製するための細胞を提供する被験者が、同一個体である、〔１〕～〔２３〕のいずれかに記載の細胞バンク。
　〔２５〕前記ｉＰＳ細胞を得るための細胞を提供する被験者および前記Ｔ細胞受容体遺伝子を調製するための細胞を提供する被験者が、互いに別個体である、〔１〕～〔２３〕のいずれかに記載の細胞バンク。
　〔２６〕Ｔ細胞受容体遺伝子またはＴ細胞受容体遺伝子およびキメラ抗原受容体を導入するための前記細胞が、がんの予防および／または治療に用いるＴ細胞製剤の製造のための中間体である、〔１〕～〔２５〕のいずれかに記載の細胞バンク。
　〔２７〕がんの予防および／または治療に用いるＴ細胞製剤の製造のための、〔１〕～〔２６〕のいずれかに記載の細胞バンクの使用。
　〔２８〕〔１〕～〔２６〕のいずれか１項に記載の細胞バンクにより製造された再生Ｔ細胞。
　〔２９〕〔２８〕に記載の再生Ｔ細胞を含有する医薬組成物。
　〔３０〕〔２９〕に記載の医薬組成物を用いる、がんの予防または治療方法。
 
　本発明の細胞バンクは、ｉＰＳ細胞から分化誘導し、予め保存した造血幹細胞、未熟Ｔ細胞および／または成熟Ｔ細胞を含むため、これらの細胞に、がん治療または感染症治療の対象となる被験者から採取したＴＣＲまたは既得のＴＣＲもしくはＣＡＲを、遺伝子導入し、短時間で再生Ｔ細胞を製造することができる。このため、抗原特異的ＴＣＲを導入した再生Ｔ細胞の製造から、該再生Ｔ細胞を治療に使用するまでに要する時間を飛躍的に短縮することができ、かつ治療に必要な量の再生Ｔ細胞を安定的に確保することができる。また本発明の細胞バンクは、非Ｔ非Ｂ細胞もしくは単球から誘導されたｉＰＳ細胞クローンまたはＴ細胞から誘導されたｉＰＳ細胞クローンのいずれを用いても構築することができる。非Ｔ非Ｂ細胞または単球から誘導されたｉＰＳ細胞クローンから分化した造血幹細胞、未熟Ｔ細胞および成熟Ｔ細胞に対してＴＣＲを導入すると、これらの細胞を再生Ｔ細胞へ分化させた後、拡大培養した場合に、ＴＣＲ遺伝子の再構成が起きにくいため、導入されたＴＣＲの抗原特異性が維持され、その結果、再生Ｔ細胞製剤の安全性が高まる。また、本発明の細胞バンクを構成する細胞を用いることにより、拡大培養に起因する疲弊化が少ない再生Ｔ細胞を製造することができる。さらに、本発明の細胞バンクを構成するｉＰＳ細胞を用いて再生Ｔ細胞を製造する際には、Ｔ細胞への分化効率が良好なｉＰＳ細胞クローンを予め選別し、細胞バンクを構成する細胞として用いるため、再生Ｔ細胞の製造バッチ間における細胞収量および細胞分化の程度の変動、ならびに細胞を採取する被験者の個体差が、得られる再生Ｔ細胞の品質等におよぼす影響を最小にすることが可能となる。また本発明の細胞バンクを用いることにより、抗原を認識し、標的を効率よく殺傷するＴＣＲを持つＴ細胞を、効率よくかつ迅速に製造することが可能となる。
　ＴＣＲをコードするｃＤＮＡの細胞への導入は、あらかじめｉＰＳ細胞から分化誘導され、本発明の細胞バンクを構成するｉＰＳ細胞由来分化細胞、すなわちｉＰＳ細胞から分化した造血幹細胞、未熟Ｔ細胞および成熟Ｔ細胞に対して行われる。細胞バンクを構成する細胞は、クローン化されたｉＰＳ細胞より分化誘導されているため、該細胞の品質はより均質で安定している。ｉＰＳ細胞由来分化細胞、すなわちｉＰＳ細胞から分化した造血幹細胞、未熟Ｔ細胞または成熟Ｔ細胞に関して、一回のＴＣＲの導入に使用される細胞数は、１０７～１０９個またはそれ以上であり、本発明の細胞バンクは、１０００回またはそれ以上のＴＣＲ導入に必要な細胞数を、分注した形態で含むことができる。そのため、ＴＣＲ導入を一回実施することに対するコストの低減が見込まれる。このため、再生Ｔ細胞補充療法を適用するがん治療において、治療対象のがん患者における腫瘍の抗原変化もしくは治療耐性の発現またはがんの再発に対しても、発現している抗原に特異的な再生Ｔ細胞の準備を迅速に、かつ容易に行うことが可能となる。
　本発明の細胞バンクに含まれる細胞に対して導入されるＴＣＲに関して、ＴＣＲをコードするｃＤＮＡの調製するために使用するＴ細胞を採取する被験者は、再生Ｔ細胞補充療法による治療対象のがん患者である被験者と同一個体であってもよく、また互いに別個体であってもよい。このため、個々のがん患者に最適な抗原特異性を有する安全で有効なＴＣＲを選択することができる。
ｉＰＳ細胞から分化誘導され、細胞バンクを構成する成熟Ｔ細胞から腫瘍特異的再生Ｔ細胞を製造する図である。成熟Ｔ細胞への腫瘍特異的ＴＣＲの導入は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９などのゲノム改変技術を用いた遺伝子置き換えにより行う。細胞へのＴＣＲ導入からＴＣＲ導入細胞の患者への投与までに要する期間は約２週間である。成熟Ｔ細胞に発現するＴＣＲは、アロ反応を誘導しないものが望ましい。細胞に導入されるＴＣＲは、再生Ｔ細胞製剤の投与が予定されるがん患者から得られるＴＣＲ、すでに取得されているがん特異的ＴＣＲまたはがん特異的ＣＡＲである。 ｉＰＳ細胞から分化誘導され、細胞バンクを構成する未熟Ｔ細胞から腫瘍特異的再生Ｔ細胞を製造する図である。未熟Ｔ細胞への腫瘍特異的ＴＣＲの導入は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９などのゲノム改変技術を用いた遺伝子置き換えまたはレンチウイルスもしくはトランスポゾンベクターなどを用いて行う。細胞へのＴＣＲ導入からＴＣＲ導入細胞の患者への投与までに要する期間は約４週間である。細胞に導入されるＴＣＲは、再生Ｔ細胞製剤の投与が予定されるがん患者から得られるＴＣＲ、すでに取得されているがん特異的ＴＣＲまたはがん特異的ＣＡＲである。 トランスポゾンを使用して、ＴＣＲ遺伝子を造血幹細胞、未熟Ｔ細胞または成熟Ｔ細胞へ導入する工程を示す図である。 ｉＰＳ細胞から誘導された成熟Ｔ細胞（ＣＤ８ポジティブ細胞傷害性Ｔ細胞）の表現型を示す図である。細胞バンクを構成する成熟Ｔ細胞は、図４で示される表現形をとる。 ｉＰＳ細胞から誘導された成熟Ｔ細胞における細胞老化マーカーとして、テロメアを解析した結果を示す図である。 ｉＰＳ細胞から誘導された成熟Ｔ細胞における細胞疲弊マーカーとして、ＰＤ－１およびＴＩＧＨＴ分子の発現を解析した結果を示す図である。 ｉＰＳ細胞から誘導された未熟Ｔ細胞（ＣＤ８ポジティブ未熟Ｔ細胞）の表現型を示す図である。細胞バンクを構成する未熟Ｔ細胞は、図７で示される表現形をとる。 成熟Ｔ細胞の段階でＧＰＣ３抗原特異的ＴＣＲ遺伝子を導入した、ｉＰＳ細胞由来の成熟Ｔ細胞の表現型を示す図である。ＣＤ１９遺伝子は、同一のpｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）トランスポゾンベクターに、前記ＴＣＲ遺伝子とタンデムに組み込まれた遺伝子であり、宿主染色体への遺伝子挿入および遺伝子発現のマーカーとして使用される。 末梢血Ｔ細胞を初期化したｉＰＳ細胞から再生Ｔ細胞を製造する工程において、Ｔ細胞への分化効率が高いｉＰＳ細胞クローンを選別する方法を説明する図である。 末梢血Ｔ細胞を初期化したｉＰＳ細胞から再生Ｔ細胞を製造する工程において、Ｔ細胞への分化効率が高い細胞として選別されたｉＰＳ細胞クローンに対してゲノム編集を行い、再生Ｔ細胞を製造する方法を説明する図である。この再生Ｔ細胞をホストＴ細胞のマスターセルバンクとする。 ホストＴ細胞から、がん抗原を認識する再生Ｔ細胞を製造する方法を説明する図である。 末梢血Ｔ細胞を初期化した同種のｉＰＳ細胞から、再生Ｔ細胞を製造する工程の概略を示す図である。分化したT細胞をホストＴ細胞のマスターセルバンクとする。
　本発明において、「細胞バンク」とは、Ｔ細胞受容体遺伝子を導入するための細胞により構成される複数種類の細胞の集合体である。細胞バンクを構成する細胞にはＣＡＲを導入することもできる。本発明の細胞バンクは、ｉＰＳ細胞ならびに前記ｉＰＳ細胞から分化した造血幹細胞、未熟Ｔ細胞および成熟Ｔ細胞からなる群より選ばれる１種類以上の細胞により構成される。本発明の細胞バンクに含まれる細胞を用いて、がんもしくは感染症の予防および／または治療に用いる再生Ｔ細胞を製造することができる。「細胞の集合体」とは、細胞の由来および細胞の分化段階等に基づいて細胞を区分し、それぞれを独立した細胞容器に分注して集積したものである。本発明の細胞バンクは、細胞の凍結保存ができる任意の施設または保管庫に保管することができる。
〔細胞〕
　本発明において、細胞バンクを構成する「成熟Ｔ細胞」は、ｉＰＳ細胞より分化誘導された分化細胞であり、細胞表面抗原として、ＣＤ３およびＣＤ４またはＣＤ８を発現し、かつ主要組織適合遺伝子複合体（major histocompatibility complex）上に提示された抗原に応答して、細胞増殖、サイトカイン産生および細胞傷害性を誘導し得る機能性ＴＣＲを細胞表面に発現する細胞である。ＴＣＲには、α鎖およびβ鎖からなるヘテロ二量体と、γ鎖およびδ鎖からなるヘテロ二量体がある。α鎖およびβ鎖からなるＴＣＲを有するＴ細胞は、αβ型Ｔ細胞と呼ばれ、またγ鎖およびδ鎖からなるＴＣＲを有するＴ細胞は、γδ型Ｔ細胞と呼ばれる。本発明の一態様において、本発明の成熟Ｔ細胞は、ＣＤ３／αβ型Ｔ細胞が好ましいが、ＣＤ３／γδ型Ｔ細胞であってもよい。成熟Ｔ細胞は、ＴＣＲ遺伝子再構成が終了した内在性ＴＣＲを発現する細胞であってもよく、外来性に導入したＴＣＲを発現する細胞であってもよい。
　本発明において、細胞バンクを構成する「未熟Ｔ細胞」とは、ｉＰＳ細胞より分化誘導された分化細胞であるが、Ｔ細胞への分化の途上にあり、細胞表面にＴＣＲを発現していない細胞である。未熟Ｔ細胞は、ＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞からＣＤ４／ＣＤ８ダブルポジティブ細胞、さらにＣＤ８シングルポジティブ細胞までの各段階のＴ細胞を含む。未熟Ｔ細胞に発現するＣＤ８は、ＣＤ８αβヘテロ二量体であることが好ましいが、ＣＤ８ααホモ二量体であってもよい。
　本発明において、細胞バンクを構成する「造血幹細胞」とは、リンパ球、好酸球、好中球、好塩基球、赤血球および巨核球等の血球系細胞に分化可能な細胞である。なお造血幹細胞と造血前駆細胞（hematopoietic progenitor cells、ＨＰＣ）とは区別されるものではなく、特に断らない限り同一の細胞を指す。造血幹細胞または造血前駆細胞は、例えば、表面抗原であるＣＤ３４およびＣＤ４３がダブルポジティブであることによって認識される。
　本発明において、「内在性ＴＣＲの発現を制御することができるように遺伝子改変した細胞」とは、マイクロＲＮＡ等を用いる方法により、または内在性ＴＣＲのプロモーターをテトタサイクリン制御性のプロモーター等に置き換えることにより、内在性ＴＣＲの発現を抑制または制御することができるように遺伝子改変した細胞である。
　本発明において、細胞バンクを構成する成熟Ｔ細胞が発現するＴＣＲは、単一抗原を認識し、かつアロ反応を生じない、またはほとんど生じないものである。前記ＴＣＲが認識する抗原として、インフルエンザウイルス抗原、ＥＢウイルス抗原、ＨＰＶ抗原、ＨＢＶ抗原、ＨＣＶ抗原、ＨＩＶ抗原、コロナウイルス抗原、ＨＴＬＶ抗原およびがん抗原が挙げられる。
　本発明において、細胞バンクを構成する細胞に導入されるＴＣＲが認識する抗原は、腫瘍に特異的または非特異的に発現する抗原であって、腫瘍細胞で過剰発現しているタンパク質由来の抗原およびその変異体、腫瘍ウイルス由来抗原、ある種の分化抗原および遺伝子変異およびスプライス異常による新規腫瘍関連抗原（ネオアンチゲン）などである。本明細書においては、腫瘍関連抗原を腫瘍抗原と記載する場合もある。タンパク質抗原である場合には、これを断片化したペプチド（ペプチド断片）であってもよい。腫瘍に特異的または非特異的に発現する抗原としては、ＷＴ１、ＧＰＣ３、ＸＡＧＥ１、ＭＵＣ１、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ６、ＥＧＦＲｖIII、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ、ＭＡＧＥ Ａ３、ＭＡＧＥ Ａ１、テロメラーゼ、ＰＲＡＭＥ、ＳＳＸ２／４、ＰＳＣＡ、ＣＴＬＡ－４、ｇｐ１００、ＧＤ２、ＧＤ３、フコシルＧＭ１、ＧＭ３、ｓＬｅ（ａ）、糖脂質Ｆ７７、メソテリン、ＰＤ－Ｌ１、ｔｒｐ１、ｔｒｐ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、ＣＤ３３、ｃ－Ｍｅｔ、ｐ５３、ｐ５３変異体、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＳＭＡ、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、ＣＥＡ、ＰＳＡ、ＡＦＰ、ｈＴＥＲＴ、ＥｐＣＡＭ、ＡＬＫ、アンドロゲン受容体、ＥｐｈＡ２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＯＹ－ＴＥＳ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１、サバイビン、Ｒａｓ、Ｒａｓ変異体、ＥＲＧ、ｂｃｒ－ａｂｌ、ＸＢＰ１などが挙げられるが、これらに限定されない。ウイルス抗原としては、不活化ＨＢＶおよびＨＰＶ等の不活化ウイルス、ならびに各種ウイルス由来のタンパク質であるＥＢＶ ＬＭＰ１、ＥＢＶ ＬＭＰ２、ＥＢＮＡ（ＥＢＶ nuclear antigen）、ＨＰＶ Ｅ１、ＨＰＶ Ｅ２、ＨＰＶ Ｅ６、ＨＰＶ Ｅ７、ＨＢＶ　ＨＢｓ、ＨＴＬＶ－１ ＴａｘおよびＨＢＺ（ＨＴＬＶ－１ ｂＺＩＰ Ｆａｃｔｏｒ）等が挙げられるが、これらに限定されない。
　本発明の一態様において、細胞バンクを構成する細胞に導入されるＴＣＲが認識する抗原は、ＧＰＣ３、ＷＴ１、ＸＡＧＥ１、ＬＭＰ２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＥＢウイルス抗原およびネオアンチゲンならびにこれらのペプチド断片からなる群より選択することができる。
　本発明の一態様において、細胞バンクを構成する細胞に導入されるＴＣＲが認識する抗原は、ＨＬＡ－Ａ２４拘束性ＧＰＣ３ペプチドであるＥＹＩＬＳＬＥＥＬ、ＨＬＡ－Ａ２拘束性ＧＰＣ３ペプチドであるＦＶＧＥＦＦＴＤＶまたはこれらの混合物である。なお本発明において、アミノ酸は慣用的な１文字表記による略号で表示される。
　本発明において、「特異的抗原に対して反応性を有する」とは、Ｔ細胞が、抗原提示細胞上の主要組織適合抗原（major histocompatibility complex：ＭＨＣ）クラスIまたはクラスIIに提示された腫瘍関連抗原に由来するエピトープペプチドに、ＴＣＲを介して選択的に結合／接合して生じる反応をＴ細胞が有することを意味し、前記エピトープペプチド以外のものへのＴ細胞の結合／接合ではＴ細胞の反応が生じないことを指す。ＴＣＲを介して、ＭＨＣクラスIまたはクラスIIに提示された腫瘍関連抗原に由来するエピトープペプチドへの結合／接合により生じるＴ細胞の反応には、細胞傷害性、ＩＦＮ－γおよびグランザイムの産生、Ｔ細胞活性化マーカーの発現、ならびにＮＦ－ＡＴ等の転写因子の活性化が挙げられる。
　本発明において、細胞バンクを構成する細胞に導入されるＴＣＲは、がん患者また非がん患者である被験者から採取される。Ｔ細胞が採取される被験者は、がんワクチンを投与されたことがあるか、現在投与されているか、または今後投与される予定のがん患者であってもよく、またがんワクチンが投与されない非がん患者であってもよい。投与されるがんワクチンは、１種類またはそれ以上が投与されてもよい。がんワクチンとは、がんもしくは腫瘍特異的タンパク質またはペプチドであって、がんまたは前記抗原に由来し、がんまたは腫瘍特異的免疫応答を誘導するためのワクチン抗原を含む組成物である。通常、がんワクチンは、ワクチン抗原が誘導する特異的免疫応答を増強するためのアジュバントを含んでいる。Ｔ細胞は、αβＴ細胞が好ましい。Ｔ細胞の採取源としては、侵襲性が低いことから末梢血が好ましいが、それに限定されない。その他の好ましい採取源として、がん組織もしくは腫瘍組織、リンパ節もしくはその他の組織もしくは臓器、または血液、臍帯血、リンパ液、組織液（組織間液、細胞間液および間質液）、体腔液（腹水、胸水、心嚢液、脳脊髄液、関節液および眼房水）等の体内のすべての採取源が挙げられる。本発明の一態様において、好ましいＴ細胞は、腫瘍組織由来Ｔ細胞である。腫瘍組織由来Ｔ細胞は、通常、腫瘍浸潤Ｔ細胞である。
　被験者ががん患者である場合、前記がん患者のがんは、卵巣がん、肝芽腫、肝細胞がん、胃がん、食道がん、膵臓がん、腎細胞がん、乳がん、悪性黒色腫、非小細胞肺がん、子宮頸がん、膠芽腫、前立腺がん、神経芽腫瘍、慢性リンパ性白血病、甲状腺乳頭がん、大腸がんまたはＢ細胞非ホジキンリンパ腫から選ばれる。前記がんは、好ましくは肝細胞がんまたは肝芽腫である。
　本発明において、ｉＰＳ細胞は、非Ｔ非Ｂ細胞または単球を初期化して作製してもよい。また、非Ｔ非Ｂ細胞または単球から既に作製されたものであってもよい。「非Ｔ非Ｂ細胞」とは、Ｔ細胞として分類されず、かつＢ細胞とも分類されない単核球を意味する。非Ｔ非Ｂ細胞は、末梢血単核球として採取した後、単核球に含まれるＴ細胞およびＢ細胞を除去することにより調製することができる。末梢血単核球は、ヒト全血から単核球分離溶液により単離することができる。単核球分離溶液としては、例えばLymphoprep（登録商標）が挙げられる。単核球よりＢ細胞およびＴ細胞を除去するためには、Ｂ細胞の持つ表面抗原であるＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２またはＢ細胞受容体、およびＴ細胞の持つ表面抗原であるＣＤ３、ＣＤ４またはＣＤ８に対する抗体を利用して、例えばフローサイトメトリーまたはＭＡＣＳ（登録商標）ビーズなどの磁気ビーズを使用してもよい。
　「Ｔ細胞」は、末梢血単核球として採取した後、ＣＤ３およびＣＤ８を発現する細胞として調製することができる。末梢血単核球よりＴ細胞を精製するためには、Ｔ細胞の持つ表面抗原であるＣＤ３、ＣＤ４またはＣＤ８に対する抗体を利用して、例えばフローサイトメトリーまたはＭＡＣＳ（登録商標）ビーズなどの磁気ビーズを使用してもよい。
　ｉＰＳ細胞の製造方法は当該分野で公知である。本発明において、ｉＰＳ細胞は、好ましくは、非Ｔ非Ｂ細胞もしくは単球またはＴ細胞に細胞初期化因子を導入することにより誘導することができる。細胞初期化因子としては、例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ１７、ｋｌｆ４、ｋｌｆ２、ｃ－Ｍｙｃ、Ｎ－Ｍｙｃ、Ｌ－Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｆｂｘ１５、ＥＲａｓ、ＥＣＡＴ１５－２、Ｔｃｌ１、β－ｃａｔｅｎｉｎ、Ｌｉｎ２８ｂ、Ｓａｌｌ１、Ｓａｌｌ４、Ｅｓｒｒｂ、Ｎｒ５ａ２、Ｔｂｘ３およびＧｌｉｓ１等の遺伝子または遺伝子産物が挙げられる。これらの細胞初期化因子は、単独で用いてもよく、また組み合わせて用いてもよい。これらの細胞初期化因子の中で、効率良くｉＰＳ細胞を樹立できるという観点からは、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ－Ｍｙｃ（いわゆる山中４因子）を前記非Ｔ非Ｂ細胞もしくは単球またはＴ細胞に導入することが好ましい。
　前記非Ｔ非Ｂ細胞もしくは単球またはＴ細胞への細胞初期化因子を導入する方法としては特に制限はなく、当該分野で公知の方法を採用することができる。例えば、前記細胞初期化因子をコードする遺伝子を前記非Ｔ非Ｂ細胞もしくは単球またはＴ細胞に導入する場合においては、前記細胞初期化因子をコードする遺伝子（例えばｃＤＮＡ）を、細胞内で機能するプロモーターを含む発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを、感染、リポフェクション法、リポソーム法、リン酸カルシウム共沈殿法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法またはエレクトロポレーション法により細胞に導入することができる。前記細胞初期化因子がタンパク質の形態にあって、該タンパク質を前記非Ｔ非Ｂ細胞もしくは単球またはＴ細胞に導入する場合においては、タンパク質導入試薬を用いる方法、タンパク質導入ドメイン融合タンパク質を用いる方法、エレクトロポレーション法およびマイクロインジェクション法が挙げられる。前記細胞初期化因子がメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態にあって、該ｍＲＮＡを前記非Ｔ非Ｂ細胞もしくは単球またはＴ細胞に導入する場合においては、ｍＲＮＡ導入試薬を用いる方法および培養液に添加する方法が挙げられる。
　感染による遺伝子導入に用いる発現ベクターとしては、例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、センダイウイルス等のウイルスベクター、動物細胞発現プラスミドが挙げられるが、挿入変異が生じにくく、また遺伝子導入効率が高く、導入される遺伝子のコピー数も多いという観点から、センダイウイルスを用いて、前記細胞初期化因子をコードする遺伝子を前記細胞に導入することが好ましい。
　前記細胞初期化因子をコードする遺伝子を細胞に導入する場合に用いる発現ベクターにおいて使用されるプロモーターとしては、例えばＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＨＳＶ－ＴＫプロモーター、ユビキチンプロモーター等が挙げられる。これらのプロモーターは、テトラサイクリン等の薬剤の有無等によって、該プロモーターの下流に挿入された遺伝子の発現を制御できるものであってもよい。発現ベクターは、プロモーターに加えて、エンハンサー、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー遺伝子（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子）、ＳＶ４０複製起点等を含むことができる。
　初期化して得られたｉＰＳ細胞の培養に用いられる培養液としては、特に限定されないが、動物細胞の培養に用いられる培養液を基礎培養液とし、これにｉＰＳ細胞の未分化能を維持するためのサイトカイン類を添加して調製することができる。基礎培養液としては、例えばIscove's Modified Dulbecco's Medium（IMDM）培養液、Medium 199培養液、Eagle's Minimum Essential Medium（EMEM）培養液、αMEM培養液、Dulbecco's modified Eagle's Medium（DMEM）培養液、Ham's F12培養液、RPMI 1640培養液、Fischer'培養液、Neurobasal Medium (ライフテクノロジーズ社)、StemFit（登録商標）AK03N（味の素ヘルシーサプライ社）およびこれらの混合培養液が挙げられる。培養液には、血清を添加してもよく、または無血清であってもよい。サイトカイン類としては、好ましくは、bFGFが挙げられ、培養液中におけるその濃度は、例えば、1～100μg/mL（好ましくは50μg/mL）である。
　本発明の一態様において、ｉＰＳ細胞の培養方法は、接着培養または浮遊培養であってもよいが、接着培養が好ましい。ｉＰＳ細胞の単離方法としては、例えば、セルスクレーパー等により物理的に単離する方法、プロテアーゼ活性を有する解離溶液、コラゲナーゼ活性を有する解離溶液、またはプロテアーゼ活性およびコラゲナーゼ活性を有する解離溶液（例えば、Accutase（登録商標）およびAccumax（登録商標）等）を用いた単離方法が挙げられる。
　本発明の一態様において、ｉＰＳ細胞は、好ましくは、１×１０３～１×１０４ cells/cm2、１×１０４～１×１０５ cells/cm2または１×１０５～１×１０６ cells/cm2の細胞密度に到達した場合に、別の培養器に継代される。継代の回数は、必要な量のｉＰＳ細胞が得られれば何回でもよく、好ましくは、１～５回または５～１０回である。
　山中因子を導入して初期化したｉＰＳ細胞は多数のｉＰＳ細胞クローンからなる。後述するが、Ｔ細胞への分化効率が良好なｉＰＳ細胞クローンを選別するために、コロニーピックを行いてｉＰＳ細胞のクローン化を行うことが好ましい。コロニーピックの方法としては、特に制限はされないが、顕微鏡下にピペットマンを用いる方法、限界希釈法および全自動コロニーピッカーを用いた方法等が用いられる。得られたｉＰＳ細胞クローンは、１種類以上、好ましくは３種類以上、より好ましくは６種類以上を保存し、細胞バンクを構成することが好ましい。細胞バンクにおいては、ｉＰＳ細胞クローンを凍結保存することが好ましい。細胞の凍結保存方法は、当業者に周知である。例えば、培養したｉＰＳ細胞クローンを回収し、緩衝液または培養液により洗浄し、細胞数を計数し、遠心分離等により濃縮して、凍結媒質（例えば、10％ DMSOを含む培養液）中に懸濁した後、低温凍結保存することができる。他の一態様において、すでに樹立されたｉＰＳ細胞クローンであって、Ｔ細胞への分化効率が良好なクローンを用いてもよい。
　「分化効率」とは、ｉＰＳ細胞から造血幹細胞、造血幹細胞から未熟Ｔ細胞および未熟Ｔ細胞から成熟Ｔ細胞への各分化段階において、全生存細胞におけるそれぞれ造血幹細胞、未熟Ｔ細胞および成熟Ｔ細胞の存在割合を指す。各分化段階における分化細胞の同定は、表面マーカーのＦＡＣＳ解析により行うことができる。造血幹細胞への分化効率は、全生存細胞におけるＣＤ３４／ＣＤ４３ダブルポジティブ細胞の割合として、未熟Ｔ細胞への分化効率は、全生存細胞におけるＣＤ４／ＣＤ８ダブルポジティブ細胞の割合またはＣＤ５ポジティブ細胞の割合として、また成熟Ｔ細胞への分化効率は、全生存細胞におけるＣＤ８α鎖、ＣＤ８β鎖、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖のすべてがポジティブである細胞の割合として示される。
　「分化効率が良好」とは、ｉＰＳ細胞から造血幹細胞への分化において、造血幹細胞であるＣＤ３４／ＣＤ４３ダブルポジティブ細胞の割合が５～１５％またはそれ以上であることを指し；造血幹細胞から未熟Ｔ細胞への分化において、未熟Ｔ細胞であるＣＤ４／ＣＤ８ダブルポジティブ細胞の割合またはＣＤ５ポジティブ細胞の割合が、それぞれ１０％以上または５０％以上であることを指し；未熟Ｔ細胞から成熟Ｔ細胞への分化において、ＣＤ８α鎖、ＣＤ８β鎖、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖のすべてがポジティブである細胞の割合が５０％以上であることを指す。
　本発明における成熟Ｔ細胞は、好ましくは、前記ｉＰＳ細胞クローンを、先ず造血幹細胞に分化させ、次に前記造血幹細胞を未熟Ｔ細胞に分化させ、最終的に、未熟Ｔ細胞をＣＤ８シングルポジティブＴ細胞に分化させることにより製造する。本発明における未熟Ｔ細胞は、好ましくは、前記ｉＰＳ細胞クローンを、先ず造血幹細胞に分化させ、次に前記造血幹細胞を未熟Ｔ細胞に分化させることにより製造する。本発明における造血幹細胞は、好ましくは、前記ｉＰＳ細胞クローンを、造血幹細胞に分化させることにより製造する。
〔造血幹細胞および未熟Ｔ細胞の培養〕
　造血幹細胞は、好ましくは、ビタミンC類を添加した培養液中でｉＰＳ細胞を培養することによって製造される。ここで、「ビタミンC類」とは、L-アスコルビン酸およびその誘導体を指し、「L-アスコルビン酸誘導体」とは、生体内で酵素反応によりビタミンCに変換されるものを意味する。L-アスコルビン酸の誘導体としては、例えば、リン酸ビタミンC、アスコルビン酸グルコシド、アスコルビルエチル、ビタミンCエステル、テトラヘキシルデカン酸アスコルビル、ステアリン酸アスコルビルおよびアスコルビン酸-2リン酸-6パルミチン酸が挙げられる。L-アスコルビン酸の誘導体は、好ましくは、リン酸ビタミンCであり、例えば、リン酸-Lアスコルビン酸ナトリウムまたはリン酸-L-アスコルビン酸マグネシウム等のリン酸-Lアスコルビン酸塩が挙げられる。ビタミンC類は、例えば、培養液において、5～500μg/mLの濃度で含有される。
　造血幹細胞の製造に用いる培養液は、特に限定されないが、動物細胞の培養に用いられる培養液を基礎培養液とし、これにビタミンC類等を添加して調製することができる。基礎培養液としては、例えば、Iscove's Modified Dulbecco's Medium（IMDM）培養液、Medium 199培養液、Eagle's Minimum Essential Medium（EMEM）培養液、αMEM培養液、Dulbecco's modified Eagle's Medium（DMEM）培養液、Ham's F12培養液、RPMI 1640培養液、Fischer's培養液、Neurobasal Medium（ライフテクノロジーズ社）、StemPro34（ライフテクノロジーズ社）およびこれらの混合培養液が挙げられる。培養液には、血清が含有されていてもよく、または無血清であってもよい。必要に応じて、基礎培養液は、例えば、アルブミン、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸、微量元素、2-メルカプトエタノール、チオールグリセロール、モノチオールグリセロール、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、およびサイトカイン等から選ばれる１つ以上の物質も含有し得る。
　造血幹細胞の製造に用いる培養液には、BMP4（Bone morphogenetic protein 4）、VEGF（vascular endothelial growth factor）、bFGF（basic fibroblast growth factor）、SCF（stem cell factor）、TPO（トロンボポエチン）、およびFLT3L（Flt3 ligand）からなる群より選ばれるサイトカインをさらに添加してもよい。これらの濃度は、例えば、BMP4は1～100 ng/mLであり、VEGFは1～100 ng/mLであり、bFGFは1～100 ng/mLであり、SCFは10～100 ng/mLであり、TPOは1～100 ng/mLであり、またFLT3Lは1～100 ng/mLである。
　造血幹細胞の培養液には、TGFβ阻害剤を培養液に添加してもよい。「TGFβ阻害剤」とは、TGFβファミリーのシグナル伝達に干渉する低分子阻害剤であり、例えば、SB431542およびSB202190（R.K.Lindemann et al., Mol. Cancer 2: 20 (2003))、SB505124 (GlaxoSmithKline)、NPC30345、SD093、SD908およびSD208 (Scios)、ならびにLY2109761、LY364947およびLY580276（Lilly Research Laboratories）が挙げられ、培養液への添加濃度は、好ましくは0.5～100μMである。
　ｉＰＳ細胞は、C3H10T1/2（Takayama N., et al. J Exp Med. 2817-2830, 2010）、または異種由来のストローマ細胞（Niwa A et al. J Ce11 Physiol. 2009 Nov; 221 (2) :367-77）等のフィーダー細胞と共培養してもよい。
　造血幹細胞の製造時のｉＰＳ細胞の培養方法は、接着培養または浮遊培養であってもよいが、浮遊培養が好ましい。例えば、ｉＰＳ細胞は、使用したディッシュに対して80％コンフルエントになるまで培養されたコロニーを遊離し、単細胞に解離させたのちに、浮遊培養に供することができる。ｉＰＳ細胞の単離方法としては、例えば、セルスクレーパー等で物理的に単離する方法、プロテアーゼ活性およびコラゲナーゼ活性を有する解離溶液（例えば、Accutase（登録商標）およびAccumax（登録商標）等)、またはコラゲナーゼ活性を有する解離溶液を用いた単離方法が挙げられる。
　浮遊培養とは、細胞を培養容器に対して非接着の状態で培養することである。浮遊培養は、特に限定はされないが、細胞との接着性を向上させる目的で人工的な処理（例えば、細胞外マトリックス等によるコーティング処理）が施されていない培養容器、または人工的に接着を抑制する処理（例えば、ポリヒドロキシエチルメタクリル酸（po1y-HEMA）もしくは非イオン性の界面活性ポリオール（Pluronic F-127等）によるコーティング処理）した培養容器を使用して行うことができる。浮遊培養の際には、胚様体（EB）を形成させて培養することが好ましい。胚様体を浮遊培養して造血幹細胞を得た場合は、これを単細胞に解離させたのちに、接着培養を行うことが好ましい。
　造血幹細胞は、ｉＰＳ細胞を培養することにより得られる嚢胞様構造物（iPS-sacとも称する）から調製することもできる。ここで、「嚢胞様構造物」とは、ｉＰＳ細胞由来の立体的な嚢状（内部に空間を伴うもの）構造体で、内皮細胞集団等で形成され、内部に造血幹細胞を含む構造体である。
　ｉＰＳ細胞から造血幹細胞を製造するために培養する際の温度条件は、特に限定されないが、例えば、約37℃～約42℃程度、好ましくは約37℃～約39℃程度である。また、培養期間については、当業者であれば造血幹細胞の細胞数等をモニターしながら、適宜決定することが可能である。造血幹細胞が得られる限り、培養日数は特に限定されないが、例えば、少なくとも6日以上、7日以上、8日以上、9日以上、10日以上、11日以上、12日以上、13日以上、または14日以上であり、好ましくは14日である。培養期間が長いことについては、造血幹細胞の製造において問題とされない。また、低酸素条件で培養してもよく、本発明の一態様において、低酸素条件としては、例えば、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％またはそれら未満の酸素濃度が挙げられる。
　「ＣＤ４／ＣＤ８ダブルポジティブＴ細胞」は、Ｔ細胞のうち、表面抗原のＣＤ４およびＣＤ８が共にポジティブである細胞（ＣＤ８＋ ＣＤ４＋）であり、Ｔ細胞は、表面抗原であるＣＤ３およびＣＤ４５がポジティブであることによって認識できることから、ＣＤ４／ＣＤ８ダブルポジティブＴ細胞は、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３およびＣＤ４５がポジティブである細胞として同定することができる。ＣＤ４／ＣＤ８ダブルポジティブＴ細胞は、誘導によってＣＤ４シングルポジティブ細胞またはＣＤ８シングルポジティブ細胞へと分化させることができる。
　ＣＤ４／ＣＤ８ダブルポジティブＴ細胞は、p38阻害剤および／またはSDF-1を添加した培養液中で、造血幹細胞を培養する工程を含む方法によって製造することができる。
　「p38阻害剤」とは、p38タンパク質（p38MAPキナーゼ）の機能を阻害する物質として定義される。p38阻害剤は、例えば、p38の化学的阻害剤、p38のドミナントネガティブ変異体、またはそれをコードする核酸が挙げられるが、これらに限定されない。
　p38の化学的阻害剤としては、SB203580(4-(4-フルオロフェニル)-2-(4-メチルスルホニルフェニル)-5-(4-ピリジル)-1H-イミダゾール)およびその誘導体、SB202190 (4-(4-フルオロフェニル)-2-(4-ヒドロキシフェニル)-5-(4-ピリジル)-1H-イミダゾール)およびその誘導体、SB239063 (trans-4-[4-(4-フルオロフェニル)-5-(2-メトキシ-4-ピリミジニル)-1H-イミダゾール-1-イル]シクロヘキサノール)およびその誘導体、SB220025およびその誘導体、PD169316、RPR200765A、AMG-548、BIRB-796、SCl0-469、SCIO-323、VX-702、またはFR167653が挙げられるが、これらに限定されない。これらの化合物は市販されており、例えば、SB203580、SB202190、SC239063、SB220025およびPD169316についてはCalbiochem社、SCl0-469およびSCIO-323についてはScios社等から入手可能である。p38阻害剤は、例えば、約1μM～約50μMの範囲で培養液に添加される。
　p38のドミナントネガティブ変異体としては、p38のDNA結合領域に位置する180位のスレオニンをアラニンに点変異させたp38T180A、ならびにヒトおよびマウスにおけるp38の182位のチロシンをフェニルアラニンに点変異させたp38Y182F等が挙げられる。
　SDF-1（Stromal cell-derived factor 1）は、SDF-1αまたはその成熟型だけでなく、SDF-1β、SDF-1γ、SDF-1δ、SDF-1εもしくはSDF-1φ等のアイソフォーム、またはそれらの成熟型であってもよく、もしくはこれらの任意の割合の混合物等であってもよい。好ましくは、SDF-1αが使用される。なお、SDF-1は、CXCL-12またはPBSFと称される場合もある。
　SDF-1は、そのケモカインとしての活性を有する限り、そのアミノ酸配列中の1または数個のアミノ酸が置換、欠失および／または付加されていてもよく、また同様に糖鎖が置換、欠失および／または付加されていてもよい。SDF-1において少なくとも４つのシステイン残基（ヒトSDF-1αの場合、Cys30、Cys32、Cys55およびCys71）が保持されており、かつ天然体のアミノ酸配列に対して90％以上の同一性を有する範囲であれば、アミノ酸変異が許容される。SDF-1は、哺乳動物、例えば、ヒト、例えば、サル、ヒツジ、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、またはマウス等の非ヒト哺乳動物のものであってもよい。例えば、ヒトのSDF-1αとして、GenBank登録番号:NP_954637で登録されているタンパク質が使用でき、SDF-1βとして、GenBank登録番号:NP_000600で登録されているタンパク質が使用できる。
　SDF-1は、市販のものを使用してもよいし、天然から精製されたものを使用してもよいし、またはペプチド合成や遺伝子工学的手法によって製造されたものを使用してもよい。SDF-1は、例えば、約10 ng/mL～約100 ng/mLの範囲で培養液に添加される。
　ＣＤ４／ＣＤ８ダブルポジティブＴ細胞の製造に用いる培養液は、特に限定されないが、動物細胞の培養に用いられる培養液を基礎培養液とし、これにp38阻害剤および／またはSDF-1、さらに好ましくはビタミンC類を添加して調製することができる。なお、CD4／CD8ダブルポジティブT細胞の製造において使用されるビタミンC類の種類は、例えば上述のとおりであるが、ビタミンC類の濃度は、例えば、5～200μg/mLである。基礎培養液としては、例えばIscove's Modified Dulbecco's Medium（IMDM）培養液、Medium 199培養液、Eagle's Minimum Essential Medium（EMEM）培養液、αMEM培養液、Dulbecco's modified Eagle's Medium（DMEM）培養液、Ham's F12培養液、RPMI 1640培養液、Fischer's　Neurobasal Medium培養液（ライフテクノロジーズ社）、およびこれらの混合培養液が挙げられる。培養液には、血清を添加してもよく、または無血清であってもよい。必要に応じて、基礎培養液には、例えば、アルブミン、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸、微量元素、2-メルカプトエタノール、チオールグリセロール、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、およびサイトカイン等から選ばれる1つ以上の物質も含有し得る。
　ＣＤ４／ＣＤ８ダブルポジティブＴ細胞の製造に用いる培養液には、SCF、TPO（トロンボポエチン）、FLT3LおよびIL-7からなる群より選ばれるサイトカインをさらに添加してもよい。これらの濃度は、例えば、SCFは10～100 ng/mLであり、TPOは1O～200 ng/mLであり、FLT3Lは1～100 ng/mLであり、IL-7は1～100 ng/mLである。
　造血幹細胞は、接着培養しても、または浮遊培養してもよいが、接着培養することが好ましい。接着培養の場合、培養容器をコーティングして用いてもよい。例えば、コーティング剤としては、マトリゲル（Niwa A, et al. PLoS One. 6(7):e22261, 2011）、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、レトロネクチン、Fc-DLL4またはエンタクチン、およびこれらの組み合わせが挙げられる。
　ＣＤ４／ＣＤ８ダブルポジティブＴ細胞を製造するために造血幹細胞を培養する際の培養温度条件は、特に限定されないが、例えば、約37℃～約42℃程度が好ましく、約37℃～約39℃程度がより好ましい。また、培養期間については、当業者であれば、ＣＤ４／ＣＤ８ダブルポジティブＴ細胞の細胞数等をモニターしながら、適宜決定することが可能である。ＣＤ４／ＣＤ８ダブルポジティブＴ細胞が得られる限り、培養日数は特に限定されないが、例えば、少なくとも10日以上、12日以上、14日以上、16日以上、18日以上、20日以上、22日以上、または23日以上であり、好ましくは23日である。
　得られたＣＤ４／ＣＤ８ダブルポジティブＴ細胞は、単離して用いても良く、他の細胞種が含有される細胞集団として用いても良い。単離する場合、当業者に周知の方法を用いることができる。例えば、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３および／またはＣＤ４５に対する抗体により標識し、フローサイトメーターを用いて単離する方法、または所望の抗原を固定化したアフィニティカラム等を用いて精製する方法が挙げられる。
　「ＣＤ８シングルポジティブＴ細胞」は、Ｔ細胞のうち、表面抗原のＣＤ８がポジティブである細胞（ＣＤ８＋ ＣＤ４－）であり、細胞傷害性Ｔ細胞とも呼ばれる。Ｔ細胞は、表面抗原であるＣＤ３およびＣＤ４５がポジティブであることによって認識できることから、ＣＤ８シングルポジティブＴ細胞は、ＣＤ８、ＣＤ３およびＣＤ４５がポジティブであり、ＣＤ４ネガティブである細胞として同定することができる。
　ＣＤ８シングルポジティブＴ細胞は、副腎皮質ホルモン剤を添加した培養液中で、ＣＤ４／ＣＤ８ダブルポジティブＴ細胞を培養する工程を含む方法によって製造することができる。
　副腎皮質ホルモン剤は、好ましくは、糖質コルチコイドまたはその誘導体であり、例えば、酢酸コルチゾン、ヒドロコルチゾン、酢酸フルドロコルチゾン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、またはプロピオン酸ベクロメタゾンが挙げられる。好ましくは、副腎皮質ホルモン剤は、デキサメタゾンである。培養液中におけるその濃度は、例えば、1～100 nMである。
　ＣＤ８シングルポジティブＴ細胞の製造に用いる培養液は、特に限定されないが、動物細胞の培養に用いられる培養液を基礎培養液とし、これに副腎皮質ホルモン剤を添加して調製することができる。基礎培養液としては、例えば、Iscove's Modified Dulbecco's Medium（IMDM）培養液、Medium 199培養液、Eagle's Minimum Essential Medium（EMEM）培養液、αMEM培養液、Dulbecco's modified Eagle's Medium（DMEM）培養液、Ham's F12培養液、RPMI 1640培養液、Fischer's　Neurobasal Medium培養液（ライフテクノロジーズ社）、およびこれらの混合培養液が挙げられる。培養液には、血清を添加してもよく、または無血清であってもよい。必要に応じて、基礎培養液は、例えば、アルブミン、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸、微量元素、2-メルカプトエタノール、チオールグリセロール、モノチオールグリセロール、脂質、アミノ殿、L-グルタミン、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、およびサイトカイン等から選ばれる１つ以上の物質も含有し得る。
　ＣＤ８シングルポジティブＴ細胞の製造に用いる培養液は、抗ＣＤ３抗体、ビタミンC類、またはサイトカインをさらに含有することが好ましい。当該サイトカインとしては、例えば、IL-2、IL-7、IL-15およびIL-21等が挙げられる。
　抗ＣＤ３抗体としては、ＣＤ３を特異的に認識する抗体であれば特に限定されないが、例えば、OKT3クローンから産生される抗体が挙げられる。抗ＣＤ３抗体の培養液中における濃度は、例えば、10～1000 ng/mLである。
　ＣＤ８シングルポジティブＴ細胞の製造に用いるビタミンC類は、例えば上述したものであり、上述と同じ条件で用いることができる。
　ＣＤ８シングルポジティブＴ細胞の製造に用いるサイトカインの培養液中における濃度は、例えば、IL-2は10～1000 U/mLであり、IL-7は1～100 ng/mLである。
　ＣＤ８シングルポジティブＴ細胞を製造するためのＣＤ４／ＣＤ８ダブルポジティブＴ細胞を培養する際の温度条件は、特に限定されないが、例えば、約37℃～約42℃程度が好ましく、約37℃～約38℃程度がより好ましい。また、培養期間については、当業者であればＣＤ８シングルポジティブＴ細胞の細胞数等をモニターしながら、適宜決定することが可能である。ＣＤ８シングルポジティブＴ細胞が得られる限り、培養日数は特に限定されないが、例えば、少なくとも1日以上、2日以上、3日以上、4日以上、または5日以上であり、好ましくは3日である。
〔ＴＣＲをコードするｃＤＮＡの調製〕
　本発明において、細胞バンクを構成する細胞に導入されるＴＣＲα鎖およびβ鎖をそれぞれコードするｃＤＮＡの調製は、単一細胞ごとに行うことが好ましい。被験者から採取されるＴ細胞は、全体として遺伝的多様性を有するＴ細胞集団であるが、個々のＴ細胞が有するＴＣＲが認識する抗原またはペプチド配列が決定されており、個々のＴ細胞の抗原特異性は異なる。個々の腫瘍関連抗原に対して最適な、すなわち個々の腫瘍関連抗原に対する反応性が高いＴＣＲを選択するために、単一細胞ごとにｃＤＮＡを調製することが好ましい。
〔ＣＡＲをコードするｃＤＮＡの調製〕
　本発明において、細胞バンクを構成する細胞に導入されるＣＡＲをコードするｃＤＮＡは、標的細胞表面抗原に結合する抗体もしくはファージまたはリガンドもしくは受容体の標的結合部位を、リンカーおよび細胞膜貫通部位（例えばＣＤ８分子の膜貫通部位）を介して、ＣＤ３ζ遺伝子およびＣＤ２８またはＣＤ１３７の細胞内シグナル部位に連結させた遺伝子を、プラスミドベクターまたはウイルスベクターに構築して調製される。
　被験者から得られたＴ細胞は、目的とする腫瘍関連抗原とともに培養し、増殖させることが好ましい。用いた腫瘍関連抗原に応答するＴ細胞集団から活性化マーカーを用いて、セルソーターなどにより単一の細胞を単離してもよい。活性化マーカーとしては、細胞表面ＣＤ１３７が好ましい。ヒトＴ細胞を単離するための公知の手法としては、例えば、ＣＤ３およびＣＤ１３７等のＴ細胞表面マーカーに対する抗体とセルソーターとを用いたフローサイトメトリーが挙げられる。得られた単一Ｔ細胞よりＰＣＲ法を用いて遺伝子クローニングを行い、ＴＣＲα鎖およびβ鎖をそれぞれコードするｃＤＮＡを増幅することができる。
〔シングルセルＰＣＲによるＴＣＲ遺伝子の単離〕
　単一細胞を得るために、末梢血などから得られる腫瘍抗原に対して特異的なＣＤ８ポジティブＴ細胞を、抗原ペプチドと複合体を形成するＭＨＣデキストラマー（Dextramer）（登録商標）との結合により、セルソーターによる単一細胞ソーティングを行うことができる。ＭＨＣデキストラマーとは、ＭＨＣと蛍光色素分子を結合させたデキストランポリマー骨格から構成される化合物である。ＭＨＣデキストラマーに代えて、ＭＨＣテトラマーを用いてもよい。ＭＨＣテトラマーとは、抗原ペプチドとＭＨＣ分子との複合体を、ビオチンおよびアビジンにより四量体としたものである。他の態様において、末梢血などから得られる腫瘍抗原に対して特異的なＣＤ８ポジティブＴ細胞を、前記抗原の存在下で培養を行い、増殖させた後、ＣＤ３／ＣＤ１３７ダブルポジティブ細胞をセルソーターにより単一細胞ソーティングすることができる。他の態様において、ＣＤ３／ＣＤ１３７ダブルポジティブ細胞から、抗原ペプチドと複合体を形成するＭＨＣデキストラマーに結合する細胞集団を、セルソーターにより単一細胞ソーティングすることができる。得られた単一細胞からＲＮＡを抽出し、逆転写反応により得られたｃＤＮＡを用いてＰＣＲ法によりＴＣＲ遺伝子対（ＴＣＲα鎖遺伝子およびＴＣＲβ鎖遺伝子）を単離することができる。単離したＴＣＲ遺伝子対についてシークエンス解析を行い、腫瘍抗原反応性Ｔ細胞の種類（ＴＣＲレパトア）およびその出現頻度の解析を行うことができる。
〔ベクターの構築〕   
　単離したＴＣＲのｃＤＮＡを鋳型として増幅したＰＣＲ断片を、例えばギブソン・アッセンブリー・システムを用いて、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクター（トランスポゾンベクター）に組み込むことができる。具体的には、ユビキチンプロモーターの下流に、単離したＴＣＲα鎖遺伝子とＴＣＲβ鎖遺伝子とをＴ２Ａ配列を介して連結した遺伝子を結合し、さらにその下流に、ＩＲＥＳ（internal ribosome entry site）配列に対してリガンド結合部位および細胞内ドメインを除いたＥＧＦＲ（ＥＧＦＲｔ、truncated EGFR）または細胞内ドメインを欠損するＣＤ１９等のマーカー遺伝子を連結し、この構築物をウイルスベクターまたは非ウイルスベクターに組み込む。ベクターとしては、ウイルスベクターおよび非ウイルスベクターを用いることができるが、非ウイルスベクターが好ましい。非ウイルスベクターとしては、トランスポゾンベクターの中でもＰｉｇｇｙＢａｃベクターが好ましい。トランスポゾン法は、従来のウイルスベクター法と比較して、安価で安全な次世代の遺伝子導入法である。
〔ＴＣＲ ｃＤＮＡの細胞導入〕
　Ｔ細胞への分化状態が良好な非Ｔ非Ｂ細胞または単球由来のｉＰＳ細胞クローン、前記ｉＰＳ細胞クローンから分化した前記造血幹細胞もしくは前記造血幹細胞から分化した前記未熟Ｔ細胞へのＴＣＲα鎖およびβ鎖をそれぞれコードするｃＤＮＡ対を導入する方法としては、ウイルスベクターを用いる方法または非ウイルスベクターを用いる方法のいずれも採用することができる。ウイルスベクターとしては、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスおよびセンダイウイルス等のウイルスベクター、ならびに動物細胞発現プラスミドが挙げられるが、レトロウイルスまたはレンチウイルスが好ましい。レトルウイルスまたはレンチウイルス感染を行う場合は、スピンインフェクション法等を用いることが好ましい。非ウイルスベクターを用いる場合は、トランスポゾン法が好ましい。非ウイルスベクターの遺伝子導入方法としては、リポフェクション法、リポソーム法、リン酸カルシウム共沈殿法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法およびエレクトロポレーション法が挙げられる。ベクターを用いずに、ＰＣＲ産物を直接細胞に導入することもできる。トランスポゾンベクターまたはＰＣＲ産物の細胞導入には、エレクトロポレーション法を用いることが好ましい。エレクトロポレーション機器としては、遺伝子導入装置ExPERT（登録商標）システム（MaxCyte社）が好ましい。
　前記ｃＤＮＡ対を前記細胞に導入する場合に用いる発現ベクターにおいて使用されるプロモーターとしては、例えばEF-１αプロモーター、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＨＳＶ－ＴＫプロモーター、ユビキチンプロモーター等が挙げられる。これらのプロモーターは、テトラサイクリン等の薬剤の有無等によって、該プロモーターの下流に挿入された遺伝子の発現を制御できるものであってもよい。発現ベクターは、プロモーターに加えて、エンハンサー、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー遺伝子（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子）、ＳＶ４０複製起点等を含むことができる。
〔ゲノム編集技術を用いる成熟Ｔ細胞へのＴＣＲの導入〕
　成熟Ｔ細胞へのＴＣＲの導入は、ゲノム編集技術を用いて行うことができる。標的となる内在性ＴＣＲα鎖およびβ鎖の遺伝子配列について、その上流を含めて配列を確認し、内在性ＴＣＲα鎖およびβ鎖の遺伝子に対して高い切断活性を有し、かつ標的遺伝子以外のゲノム上の配列を切断しないガイドＲＮＡ（センス鎖に対するガイドＲＮＡおよびアンチセンス鎖に対するガイドＲＮＡ）を作製する。並行して、導入の対象であるＴＣＲα鎖およびβ鎖の挿入部位の上流および下流の相同組み換え部位を含むドナーＤＮＡを作製する。前記ガイドＲＮＡ、Ｃａｓ９および前記ドナーＤＮＡを成熟Ｔ細胞へ導入することにより、目的とするＴＣＲの導入を行うことができる。前記ガイドＲＮＡ、Ｃａｓ９および前記ドナーＤＮＡの導入は、ウイルスベクター、非ウイルスベクターおよびエレクトロポレーション法等を用いることにより行うことができる。内在性ＴＣＲが目的とするＴＣＲに置き換えられた成熟Ｔ細胞は、目的とする腫瘍関連抗原への結合を指標にして選択することができる。
　前記ｃＤＮＡ対が導入された、前記ｉＰＳ細胞クローンから分化した前記造血幹細胞、前記造血幹細胞から分化した前記未熟Ｔ細胞および成熟T細胞は、上述した培養液、培養液組成、培養温度等の培養条件で培養することにより、前記ｃＤＮＡ対がそれぞれコードするα鎖およびβ鎖からなるＴＣＲを発現する再生Ｔ細胞が得られる。目的のＴＣＲが発現しているか否かは、例えば、ＴＣＲＶβ解析キット（BECKMAN COULTER社：カタログ番号IM-3497）を用いるＴＣＲβ遺伝子のレパトア解析に基づき、確認することができる。ベクターには、ＥＧＦＲｔ（truncated EGFR）およびＣＤ１９ｔ（truncated CD19）等のマーカー遺伝子が組み込まれているため、マーカー遺伝子の発現を解析することにより、ＴＣＲα鎖およびβ鎖の発現を推測することができる。
〔再生Ｔ細胞の製造〕
　腫瘍関連抗原に対して反応性を有するＴＣＲ対を、本発明の細胞バンクを構成する成熟Ｔ細胞、未熟Ｔ細胞または造血幹細胞に導入することにより再生Ｔ細胞の製造を開始できる。このため、がんもしくは感染症の予防および／または治療に用いる再生Ｔ細胞を迅速に製造することが可能である。
〔ＴＣＲ取得源のＴ細胞〕
　腫瘍関連抗原に対応するＴＣＲ対の取得源となるＴ細胞は、患者腫瘍組織または患者末梢血から採取することが好ましい。腫瘍組織または末梢血に腫瘍関連抗原特異的なＴ細胞を出現させるために、予め被験者に腫瘍関連抗原を投与する必要がある場合は、被験者に前記腫瘍関連抗原を投与後に腫瘍組織または末梢血からＴ細胞を採取することが好ましい。このような腫瘍関連抗原としては、例えばＧＰＣ３が挙げられる。一方、腫瘍関連抗原の投与がなくとも、腫瘍特異的なＴ細胞が末梢血に存在する場合には、腫瘍関連抗原の投与を行うことなく、例えばＭＨＣデキストラマーを使用して、末梢血から腫瘍関連抗原特異なＴ細胞を単離してもよい。このような腫瘍関連抗原としては、例えばＷＴ１、ＮＹＥＳＯ－１およびＥＢＶ抗原などが挙げられる。
　上記のように、被験者に対して腫瘍関連抗原を投与した後、または腫瘍関連抗原を投与することなく被験者の腫瘍組織または末梢血から採取されたＴ細胞は、いずれの場合であっても、好ましくは試験管内で腫瘍関連抗原により刺激し、腫瘍応答性の細胞集団を増幅した後、活性化マーカーを用いた細胞単離を行うことができる。末梢血中において、腫瘍関連抗原特異的なＴ細胞の出現頻度が極めて高い場合には、試験管内での腫瘍関連抗原による刺激を行わない場合があってもよい。
　ＴＣＲ対を得るためのＴ細胞を採取する被験者と、得られたＴＣＲを導入した再生Ｔ細胞による再生Ｔ細胞補充療法によるがん治療の対象となる被験者が別個体である場合には、前記ＴＣＲ対が、がん治療の対象となる被験者の細胞に対するアロ反応を惹起しないことを確認することが好ましい。
〔医薬組成物〕
　本発明のｉＰＳ細胞由来の分化細胞に、抗原特異的なＴＣＲを導入することにより製造される再生Ｔ細胞を含有する医薬組成物は、がんおよび感染症治療に使用することができる。本発明の医薬組成物は、製剤技術分野において慣用の方法、例えば、日本薬局方に記載の方法等により製造することができる。本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される添加剤を含んでいてもよい。該添加剤としては、例えば、細胞培養液、生理食塩水や適当な緩衝液（例えば、リン酸系緩衝液）等が挙げられる。
　前記医薬組成物は、再生Ｔ細胞を生理食塩水または適当な緩衝液（例えばリン酸系緩衝液）等に懸濁することによって製造することができる。所望の治療効果が発揮されるように、一回投与分の量として、例えば１×１０７個以上の細胞を含有することが好ましい。より好ましい細胞含有量は１×１０８個以上、さらに好ましくは１×１０９個以上である。細胞の含有量は、投与対象の性別、年齢、体重、患部の状態、細胞の状態等を考慮して適宜調整することができる。前記医薬組成物は、有効成分としての再生Ｔ細胞の他、細胞を保護する目的でジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）および血清アルブミン等を含有してもよい。また、細菌の混入を防止するために、抗生物質等ならびに細胞の活性化および分化を促す目的でビタミン類やサイトカイン等を含有してもよい。さらに前記医薬組成物は、製剤上許容される他の成分（例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水等）を含有してもよい。
　本発明の細胞バンクを構成する造血幹細胞、未熟Ｔ細胞または成熟Ｔ細胞は、１回のＴＣＲ導入における使用量(１×１０７～１×１０９)に応じて分注し、凍結保存することができる。凍結保存する場合、保存温度は、細胞の保存に適した温度であれば特に限定されない。例えば、－１５０～－１９６℃が挙げられるが、－１５０℃以下が好ましい。凍結保存する場合、細胞は、凍結バイアルおよび凍結バッグ等の適切な容器中で保存することが好ましい。再生Ｔ細胞の凍結時および解凍時の細胞損傷リスクを最小限にするための操作は、当業者に周知である。
　本発明の細胞バンクを構成する細胞の保存量は、ＴＣＲ導入が１０００回またはそれ以上実施できるだけの数量であることが好ましい。
　前記医薬組成物は、がんもしくは感染症の予防および／または治療のために用いられる。がんとしては、卵巣がん、肝芽腫、肝細胞がん、胃がん、食道がん、膵臓がん、腎細胞がん、乳がん、悪性黒色腫、非小細胞肺がん、子宮頸がん、膠芽腫、前立腺がん、神経芽腫瘍、慢性リンパ性白血病、甲状腺乳頭がん、大腸がん、およびＢ細胞非ホジキンリンパ腫が挙げられるが、これらに限定されない。
　以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
〔ｉＰＳ細胞から製造された分化細胞により構築された細胞バンクの、再生Ｔ細胞の製造のための使用（１）〕
　図１は、本発明の細胞バンクを構成する成熟Ｔ細胞から、抗原特異的な再生Ｔ細胞を製造する工程を示す。腫瘍抗原Ｘに特異的に反応する患者由来Ｔ細胞から単離したＴＣＲ遺伝子、既得の腫瘍抗原Ｘに特異的なＴＣＲ遺伝子または腫瘍抗原Ｘに特異的なキメラ受容体遺伝子を、細胞バンクを構成する成熟Ｔ細胞へ導入する。細胞バンクを構成する成熟Ｔ細胞から再生Ｔ細胞を製造するのに要する期間は約２週間である。がんの治療に使用する再生Ｔ細胞を前記期間で製造することができるため、がんの治療を受けている患者において、腫瘍の再発または腫瘍細胞の変異が生じた場合であっても、治療に有効なＴＣＲ遺伝子を再度選択することが可能である。腫瘍抗原Ｘに特異的なＴＣＲ遺伝子またはＣＡＲ遺伝子の導入には、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９等を用いたゲノム編集またはレンチウイルスもしくはトランスポゾンベクターを用いることができる。図３は、トランスポゾンを使用して、ＴＣＲ遺伝子を導入する工程を示す。
　ｉＰＳ細胞から製造された成熟Ｔ細胞を用いて、凍結細胞の集合体である本発明の細胞バンクを構築した。前記成熟Ｔ細胞は、単一抗原を認識し、アロ反応を起こさないＴ細胞であり、前記細胞バンクを構成する凍結細胞を解凍した後、腫瘍に特異的なＴＣＲが導入される。
　本発明の細胞バンクにおいては、ｉＰＳ細胞から分化誘導され、予め凍結保存された成熟Ｔ細胞に対して、腫瘍抗原Ｘに反応するＴＣＲ遺伝子を導入することにより、再生Ｔ細胞の製造を行うことができる。このため、ｉＰＳ細胞の作製工程、ｉＰＳ細胞から成熟Ｔ細胞への分化誘導工程および成熟Ｔ細胞へのＴＣＲ遺伝子の導入による再生Ｔ細胞を製造する工程を順次行う場合と比較して、より短期間（約２週間）で、腫瘍特異的再生Ｔ細胞を製造できる。したがって、腫瘍特異的再生Ｔ細胞の患者への投与を迅速に行うことができる。
　上記のようにしてｉＰＳ細胞より誘導された成熟Ｔ細胞（腫瘍抗原特異的ＣＤ８ポジティブ細胞傷害性Ｔ細胞）について、その表現型を解析した。細胞表面抗原マーカーによる再生Ｔ細胞のフローサイトメーターによる解析結果を図４に示す。ｉＰＳ細胞から誘導された成熟Ｔ細胞は、生体内の成熟した細胞傷害性Ｔ細胞において発現が認められるＣＤ４５＋ＴＣＲαβ＋ＣＤ３＋ＣＤ４－ＣＤ８αβ＋の発現が確認された。
　ｉＰＳ細胞より分化誘導され、本発明の細胞バンクを構成する成熟Ｔ細胞について、細胞老化マーカーであるテロメア（若返りの指標）を解析した結果を図５に示す。患者末梢血単核球（Ａ）および再生前の腫瘍抗原特異的Ｔ細胞（Ｂ）のテロメア長に比較して、前記腫瘍抗原特異的Ｔ細胞から作製されたｉＰＳ細胞（Ｃ）では約３倍、また腫瘍抗原特異的再生Ｔ細胞（Ｄ）では約２倍のテロメア長であり、ＣおよびＤにおいてテロメア長の回復が確認された。すなわち、本発明の細胞バンクを構成する細胞から作製された再生Ｔ細胞においては、細胞老化の改善が示唆される。
　ｉＰＳ細胞より分化誘導し、本発明の細胞バンクを構成する成熟Ｔ細胞について、免疫チェックポイントに関連する細胞疲弊マーカーのひとつあるＰＤ－１およびＴＩＧＩＴ分子の発現を、抗ＴＩＧＩＴ抗体および抗ＰＤ－１抗体で染色し、フローサイトメーターにより解析した。比較として、再生前の腫瘍抗原特異的Ｔ細胞についても解析した。結果を図６に示す。本発明の再生Ｔ細胞は、再生前の腫瘍抗原特異的Ｔ細胞に比べて、ＰＤ－１およびＴＩＧＩＴ分子の発現が大きく低下していることが確認された。したがって、本発明の再生Ｔ細胞は、高い細胞傷害活性を有することが示唆される。
〔ｉＰＳ細胞から製造された分化細胞により構築された細胞バンクの、再生Ｔ細胞の製造のための使用（２）〕
　図２は、本発明の細胞バンクを構成する未熟Ｔ細胞から、抗原特異的な再生Ｔ細胞を製造する工程を示す。腫瘍抗原Ｘに特異的に反応する患者由来Ｔ細胞から単離したＴＣＲ遺伝子、既得の腫瘍抗原Ｘに特異的なＴＣＲ遺伝子または腫瘍抗原Ｘに特異的なキメラ受容体遺伝子を、細胞バンクを構成する未熟Ｔ細胞へ導入する。がんの治療を受けている患者において、腫瘍の再発または腫瘍細胞の変異が生じた場合であっても、治療に有効なＴＣＲ遺伝子を再度選択することが可能である。細胞バンクを構成する未熟Ｔ細胞から再生Ｔ細胞を製造するのに要する期間は約４週間である。腫瘍抗原Ｘに特異的なＴＣＲ遺伝子またはＣＡＲ遺伝子の導入には、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９等を用いたゲノム編集またはレンチウイルスもしくはトランスポゾンベクターを用いることができる。
　ｉＰＳ細胞から製造された未熟Ｔ細胞を用いて、凍結細胞の集合体である本発明の細胞バンクを構築した。前記未熟Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体を発現していないＴ細胞であり、前記細胞バンクを構成する凍結細胞を解凍した後、腫瘍に特異的なＴＣＲが導入される。
　本発明の細胞バンクにおいては、ｉＰＳ細胞から分化誘導され、予め凍結保存された未熟Ｔ細胞に対して、腫瘍抗原Ｘに反応するＴＣＲ遺伝子を導入することにより、再生Ｔ細胞の製造を行うことができる。このため、ｉＰＳ細胞の作製工程、ｉＰＳ細胞から未熟Ｔ細胞への分化誘導工程および未熟Ｔ細胞へのＴＣＲ遺伝子の導入による再生Ｔ細胞を製造する工程を順次行う場合と比較して、より短期間（約４週間）で、腫瘍特異的再生Ｔ細胞を製造することができる。したがって、腫瘍特異的再生Ｔ細胞の患者への投与を迅速に行うことができる。
　上記のようにしてｉＰＳ細胞より誘導された未熟Ｔ細胞（腫瘍抗原特異的ＣＤ８ポジティブ細胞傷害性Ｔ細胞）について、その表現型を解析した。細胞表面抗原マーカーによる未熟Ｔ細胞のフローサイトメーターによる解析結果を図７に示す。ｉＰＳ細胞より誘導された未熟Ｔ細胞は、生体内の成熟した細胞傷害性Ｔ細胞において発現が認められるＣＤ４５＋ＴＣＲαβ-ＣＤ３＋ＣＤ４±ＣＤ８αβ＋の発現が確認された。
〔ｉＰＳ細胞クローンの作製〕
　肝細胞がんまたは肝芽腫患者から採取された末梢血から、単核球分離溶液Lymphoprep（登録商標）を用いて単核球を単離した。得られた単核球から、ＣＤ１９／ＣＤ２０陽性のＢ細胞およびＣＤ３／ＣＤ４／ＣＤ８陽性のＴ細胞を、ＦＡＣＳまたはＭＡＣＳビーズを用いて除去し、非Ｔ非Ｂ細胞または単球を得た。得られた非Ｔ非Ｂ細胞または単球細胞集団に、山中４因子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ－Ｍｙｃ）を搭載したセンダイウイルス（CytoTune（登録商標）2.0）およびＳＶ４０Ｔａｇをコードしたセンダイウイルスを、５～２０のＭＯＩ（multiplicity of infection）で感染させた。なおＳＶ４０は除いてもよい。
　得られたｉＰＳ細胞は、数多くのｉＰＳ細胞クローンからなる。このため、コロニーピックを行い、クローン化した。すべてのクローン化されたｉＰＳ細胞は凍結保存した。クローン化されたｉＰＳ細胞を、分化培地により約１０日培養して造血幹細胞を誘導し、ＣＤ３４／ＣＤ４３ダブルポジティブ造血幹細胞を単離した。単離した造血幹細胞は、ＤＬＬ４タンパク質と免疫イムノグロブリンのＦｃ領域との融合タンパク質であるＦｃＤＬＬ４でコートされたプレート上で約２１日間培養し、Ｔ細胞への分化誘導を行った。
　上記２１日間培養後に得られる未熟細胞傷害性Ｔ細胞の頻度を、ＣＤ８α鎖／β鎖ダブルポジティブ率で検証し、ＣＤ８α鎖／β鎖ダブルポジティブ細胞の出現頻度が最も高いクローンを選別した。
　Ｔ細胞への分化効率が良好ないくつかのｉＰＳ細胞クローンは、ｉＰＳ細胞維持培地により２週間の拡大培養を行った後、細胞保存容器に分注し、凍結保存することにより、マスターセルバンクを構築した。
〔ｉＰＳ細胞クローンに対するＴＣＲ遺伝子の導入〕
　実施例２において得られた、Ｔ細胞への分化効率が良好な非Ｔ非Ｂ細胞または単球由来のｉＰＳ細胞クローンに対し、腫瘍抗原特異性が確認されたＴ細胞受容体α鎖およびβ鎖をコードした遺伝子を有するｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）トランスポゾンベクターを、エレクトロポレーション法を用いて導入した。次に、目的のＴ細胞受容体α鎖およびβ鎖を発現するｉＰＳ細胞を、マーカー分子であるＣＤ１９の発現を指標に、セルソーターにより単離した。単離されたｉＰＳ細胞は、分化培地により約１０日培養し、ＣＤ３４／ＣＤ４３ダブルポジティブの造血幹細胞を誘導し、セルソーターにより単離した。単離した血幹細胞は、ＦｃＤＬＬ４でコートされたプレート上で約２１日間培養し、Ｔ細胞への分化誘導を行った。
　上記２１日間培養後に得られるＣＤ８α鎖／β鎖ダブルポジティブの未熟Ｔ細胞を、セルソーターを用いて単離精製した。次に、未熟Ｔ細胞を、ＰＨＡ（phytohemagglutinin）およびフィーダー細胞として末梢血単核球の存在下、レトロネクチン（登録商標）および抗ＣＤ３抗体の存在下または抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体の存在下で共培養し、成熟細胞傷害性Ｔ細胞へと誘導した。これらの刺激は１回以上行った。得られたＴ細胞の性能は、ＧＰＣ３特異的な標的細胞の細胞傷害活性、ＩＦＮ－γ産生および抗原結合能で確認した。
〔ｉＰＳ細胞クローンから分化した成熟Ｔ細胞に対するＴＣＲ遺伝子の導入〕
　実施例３において得られた、Ｔ細胞への分化効率が良好な非Ｔ非Ｂ細胞または単球由来のｉＰＳ細胞クローンから、造血幹細胞および未熟Ｔ細胞を経由して分化した成熟Ｔ細胞に対し、ＧＰＣ３抗原特異的Ｔ細胞受容体α鎖β鎖をコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）を、pｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）システムを用いて、実施例４と同様にして導入した。
　遺伝子導入したｉＰＳ細胞由来の成熟Ｔ細胞の表現型を、フローサイトメーターにより解析した結果を図８に示す。図８において、「Ｎｏ ＥＰ」は、遺伝子導入に用いた前記成熟Ｔ細胞であって、ＷＴ１抗原特異的Ｔ細胞受容体α鎖β鎖を発現させた前記成熟Ｔ細胞の解析結果；「ＥＧＦＰ」は、遺伝子導入操作の指標とするトレーサー遺伝子（ＥＧＦＰ（enhanced green fluorescent protein）遺伝子）を組み込んだ発現ベクターを導入した前記成熟Ｔ細胞の解析結果；「Ｅｍｐｔｙ‐ＣＤ１９」は、トレーサー遺伝子として細胞内欠損型ヒトＣＤ１９遺伝子のみを組込んだpｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）トランスポゾンベクターを導入した前記成熟Ｔ細胞の解析結果；「ＴＣＲ‐ＣＤ１９」は、ＧＰＣ３抗原特異的Ｔ細胞受容体α鎖β鎖遺伝子および細胞内欠損型ヒトＣＤ１９遺伝子をタンデムに組込んだpｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）トランスポゾンベクターを導入した前記成熟Ｔ細胞の解析結果を示す。
　「Ｎｏ ＥＰ」で示されるｉＰＳ細胞由来の成熟Ｔ細胞では、Ｔ細胞マーカーであるＣＤ３のみが検出された。すなわち、遺伝子導入に用いた細胞は、Ｔ細胞であることが確認された。
　「ＥＧＦＰ」で示されるｉＰＳ細胞由来の成熟Ｔ細胞では、ＣＤ３遺伝子およびＥＧＦＰ遺伝子の発現が検出された。すなわち、遺伝子導入操作は適切に行われたことが分かる。
　「Ｅｍｐｔｙ‐ＣＤ１９」で示されるｉＰＳ細胞由来の成熟Ｔ細胞では、ＣＤ３遺伝子およびpｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）トランスポゾンベクターに組み込まれたトレーサー遺伝子である細胞内欠損型ヒトＣＤ１９遺伝子の発現が検出された。すなわち、遺伝子導入操作は適切に行われたことが分かる。
　「ＴＣＲ‐ＣＤ１９」で示されるｉＰＳ細胞由来の成熟Ｔ細胞では、ＣＤ３遺伝子およびpｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）トランスポゾンベクターに組み込まれたトレーサー遺伝子である細胞内欠損型ヒトＣＤ１９遺伝子の発現に加え、ＧＰＣ３抗原特異的Ｔ細胞受容体α鎖β鎖が認識するＧＰＣ３ペプチド／ＨＬＡ複合体（ＧＰＣ３‐Ｄｅｘ）との結合が検出された。すなわち、pｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）システムを用いて、ｉＰＳ細胞由来の成熟Ｔ細胞にＧＰＣ３抗原特異的Ｔ細胞受容体α鎖β鎖遺伝子を導入することにより、前記細胞上に発現したＧＰＣ３抗原特異的Ｔ細胞受容体α鎖β鎖が、ＧＰＣ３ペプチド／ＨＬＡ複合体（ＧＰＣ３‐Ｄｅｘ）を認識する分子として機能することが示された。したがって、ｉＰＳ細胞由来の成熟Ｔ細胞に導入するＴ細胞受容体α鎖β鎖遺伝子として、新規腫瘍関連抗原（ネオアンチゲン）およびその他の腫瘍関連抗原特異的Ｔ細胞受容体α鎖β鎖遺伝子を用いることにより、これらの抗原を認識するｉＰＳ細胞由来の成熟Ｔ細胞を作製することができることが示された。
〔末梢血Ｔ細胞を初期化したｉＰＳ細胞からの再生Ｔ細胞の製造〕
　図９は、末梢血Ｔ細胞を初期化したｉＰＳ細胞から再生Ｔ細胞を製造する工程において、Ｔ細胞への分化効率が高いｉＰＳ細胞クローンを選別する方法を示す。ＥＢＶ（Epstein-Barrウイルス）に感染者した被験者の末梢血より単核球を分離し、分離した単核球を、試験管内でＥＢＶ抗原により刺激し、ＥＢＶ抗原を認識するＣＤ８陽性Ｔ細胞集団を単離した。単離したＣＤ８陽性Ｔ細胞集団に、山中４因子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ－Ｍｙｃ）およびＳＶ４０Ｔ抗原を、センダイウイルスベクターを用いて導入し、ｉＰＳ細胞集団を得た。得られたｉＰＳ細胞集団からｉＰＳ細胞クローンを分取し、それぞれのクローンについて、Ｔ細胞への分化能を調べ、Ｔ細胞への分化効率が高いｉＰＳ細胞クローンを選別した。ＥＢＶ抗原を認識するＴ細胞は、同種移植を行った場合であっても、アロ反応を生じにくい細胞である。
　図１０は、末梢血Ｔ細胞を初期化したｉＰＳ細胞から再生Ｔ細胞を製造する工程において、Ｔ細胞への分化効率が高い細胞として選別されたｉＰＳ細胞クローンに対してゲノム編集を行い、再生Ｔ細胞を製造する方法を示す。ＥＢＶ抗原を認識するＣＤ８陽性Ｔ細胞に由来し、Ｔ細胞への分化効率が高いｉＰＳ細胞クローンは、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩの発現に関与するβ２Ｍ遺伝子およびＣＩＩＴＡ遺伝子、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性化に関与するＰＶＲ遺伝子ならびにＴ細胞受容体の再々構成に関与するＲａｇ２遺伝子を、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いて削除し、一方で、ＮＫ細胞の抑制性のリガンドであるβ２Μ／結合ペプチド／ＨＬＡ－Ｅの融合遺伝子（ＨＬＡ－Ｅ＊）を発現させて、宿主のＴ細胞およびＮＫ細胞からの攻撃を受けないｉＰＳ細胞とした。このゲノム編集において、薬剤誘導型カスパーゼ９などの自殺遺伝子および／または特異的なマーカー遺伝子（ＥＧＦＲ（epidermal growth factor receptor）、ＣＤ１９およびＣＤ２０など）を発現させることにより、生体内への投与後に細胞を除去することも可能となる。ゲノム編集後に再クローン化を行い、Ｔ細胞への分化効率が高いことを確認後、ｉＰＳ細胞由来の再生Ｔ細胞のクローンとして保存し、マスターセルバンクを構築してもよい。ｉＰＳ細胞から分化および増殖させた再生Ｔ細胞は、がん治療用再生Ｔ細胞を製造するためのホストＴ細胞であり、前記ホストＴ細胞によりマスターセルバンクを構築してもよい。前記ホストＴ細胞は、ＴＣＲ遺伝子またはＣＡＲ（chimeric antigen receptor）遺伝子を導入した再生Ｔ細胞を作製する材料として使用することができる。前記ホストＴ細胞は、ＥＢＶ抗原を認識するＴ細胞であるため、生体内に移入されてもアロ反応を起こしにくい。「ホストＴ細胞」とは、この細胞そのものは患者の治療に供されることはないが、再生Ｔ細胞を有効成分とするがんの予防または治療剤を製造するための出発原料として使用されるＴ細胞を意味する。
　図１１は、前記ホストＴ細胞から、がん抗原を認識する再生Ｔ細胞を製造する方法を示す。ＥＢＶ抗原を認識するホストＴ細胞において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いたゲノム編集による遺伝子置換により、再構成を生じたＥＢＶ抗原を認識するＴ細胞受容体β鎖を、それぞれがん抗原を認識するＴ細胞受容体β鎖とＴ細胞受容体α鎖とのＴ２ａを介する連結体に置換した。一方、ＥＢＶ抗原を認識するＴ細胞受容体α鎖は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いたゲノム編集により除去した。図１１に記載された方法により、がん抗原を認識する再生Ｔ細胞の製造を行うことが可能であった。
　図１２は、図９～１１に示された方法をまとめて説明するものである。末梢血Ｔ細胞を初期化した同種のユニバーサルｉＰＳ細胞から製造された再生Ｔ細胞（ｉＰＳ－Ｔ細胞）は、ＴＣＲ遺伝子またはＣＡＲ遺伝子を導入したＴ細胞を作製するための出発原料とすることができる。「ユニバーサルｉＰＳ細胞」とは、免疫原性が非常に低いため、どのような種類のＭＨＣ（Major Histocompatibility Complex；主要組織適合性複合体）を持つ患者に対しても、拒絶反応を招来することなく使用することができるｉＰＳ細胞を意味する。即ち、ＭＨＣのマッチングを考慮することなく、患者に投与することができるｉＰＳ細胞である。ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ分子をノックアウトし、ＮＫ細胞を抑制するリガンドを発現させることにより、ユニバーサルｉＰＳ細胞を作製することができる。
　ＴＣＲ遺伝子またはＣＡＲ遺伝子の導入には、従来のＴ細胞の補充療法または再生療法に用いられるＴ細胞の製造に使用されるウイルスベクターを用いてもよい。ｉＰＳ－Ｔ細胞を出発原料とすることにより、がんの予防または治療剤の有効成分となる所望のＴ細胞を短期間に製造することが可能となる。またネオアンチゲンを認識するＴＣＲの導入も容易であり、異なるネオアンチゲンを認識する複数のＴＣＲ遺伝子を導入することにより、多クローン性を維持したままのｉＰＳ－Ｔ細胞の製造も可能である。
 

Claims (30)

  1. 　Ｔ細胞受容体遺伝子を導入するための細胞により構成される細胞バンクであって、前記細胞が、ｉＰＳ細胞ならびに前記ｉＰＳ細胞から分化した造血幹細胞、未熟Ｔ細胞および成熟Ｔ細胞からなる群より選ばれる１種類以上の細胞である、前記細胞バンク。
  2. 　前記細胞が、さらにキメラ抗原受容体遺伝子を導入するための細胞である、請求項１に記載の細胞バンク。
  3. 　前記ｉＰＳ細胞が、被験者の末梢血単核球であって、Ｂ細胞およびＴ細胞が除去された末梢血単核球を初期化することにより得られるｉＰＳ細胞である、請求項１または２に記載の細胞バンク。
  4. 　前記ｉＰＳ細胞クローンまたは前記ｉＰＳ細胞クローンから分化した前記造血幹細胞もしくは前記未熟Ｔ細胞へのＴ細胞受容体遺伝子の導入が、ウイルスベクター、トランスポゾンベクターまたはゲノム編集技術を用いる、請求項３に記載の細胞バンク。
  5. 　前記ｉＰＳ細胞が、被験者のＴ細胞を初期化することにより得られるｉＰＳ細胞である、請求項１または２に記載の細胞バンク。
  6. 　前記成熟Ｔ細胞へのＴ細胞受容体遺伝子の導入が、ゲノム編集技術を用いる、請求項５に記載の細胞バンク。
  7. 　前記ｉＰＳ細胞が、成熟Ｔ細胞への分化効率が良好なｉＰＳ細胞クローンである、請求項１～６のいずれか１項に記載の細胞バンク。
  8. 　前記細胞が、凍結保存される、請求項１～７のいずれか１項に記載の細胞バンク。
  9. 　前記細胞が、内在性Ｔ細胞受容体の発現を制御することができるように遺伝子改変した細胞である、請求項５に記載の細胞バンク。
  10. 　前記造血幹細胞および前記未熟Ｔ細胞が、Ｔ細胞受容体を発現しない細胞である、請求項１～９のいずれか１項に記載の細胞バンク。
  11. 　前記成熟Ｔ細胞が、前記成熟Ｔ細胞が由来する被験者とは別個体の被験者に由来する非腫瘍細胞を認識しないＴ細胞受容体を発現する、請求項５に記載の細胞バンク。
  12. 　前記成熟Ｔ細胞が、単一抗原を認識する、請求項１１に記載の細胞バンク。
  13. 　前記単一抗原が、インフルエンザウイルス抗原、ＥＢウイルス抗原、ＨＰＶ抗原、ＨＢＶ抗原、ＨＣＶ抗原、ＨＩＶ抗原、コロナウイルス抗原またはＨＴＬＶ抗原である、請求項１２に記載の細胞バンク。
  14. 　前記造血幹細胞が、ＣＤ３４／ＣＤ４３ダブルポジティブである、請求項１～１３のいずれか１項に記載の細胞バンク。
  15. 　前記未熟Ｔ細胞が、ＣＤ８α鎖／β鎖ダブルポジティブである、請求項１～１４のいずれか１項に記載の細胞バンク。
  16. 　前記成熟Ｔ細胞が、ＣＤ８α鎖／β鎖ダブルポジティブおよびＴＣＲα鎖／β鎖ダブルポジティブである、請求項１～１５のいずれか１項に記載の細胞バンク。
  17. 　前記Ｔ細胞受容体遺伝子が、被験者から得られるＴ細胞であって、腫瘍関連抗原に対して反応性を有するＴ細胞集団から、単一細胞ごとに調製される、請求項１～１６のいずれか１項に記載の細胞バンク。
  18. 　前記Ｔ細胞受容体遺伝子が、被験者から得られるＴ細胞を腫瘍関連抗原と接触させ、前記腫瘍関連抗原に対して反応性を有するＴ細胞集団から、単一細胞ごとに調製される、請求項１～１６のいずれか１項に記載の細胞バンク。
  19. 　前記Ｔ細胞受容体遺伝子が、腫瘍関連抗原が投与された被験者から得られるＴ細胞を前記腫瘍関連抗原と接触させ、前記腫瘍関連抗原に対して反応性を有するＴ細胞集団から、単一細胞ごとに調製される、請求項１～１６のいずれか１項に記載の細胞バンク。
  20. 　腫瘍関連抗原が、ＧＰＣ３、ＷＴ１、ＸＡＧＥ１、ＬＭＰ２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＥＢウイルス抗原およびネオアンチゲンならびにこれらのペプチド断片からなる群より選択される、請求項１７～１９のいずれか１項に記載の細胞バンク。
  21. 　前記腫瘍関連抗原が、ＨＬＡ－Ａ２４拘束性ＧＰＣ３ペプチドであるＥＹＩＬＳＬＥＥＬ（配列番号１）、ＨＬＡ－Ａ２拘束性ＧＰＣ３ペプチドであるＦＶＧＥＦＦＴＤＶ（配列番号２）またはこれらの混合物である、請求項１７～１９のいずれか１項に記載の細胞バンク。
  22. 　前記Ｔ細胞集団が、ＣＤ３／ＣＤ１３７ダブルポジティブである、請求項１７～１９のいずれか１項に記載の細胞バンク。
  23. 　前記Ｔ細胞集団が、前記腫瘍関連抗原ペプチドと複合体を形成するＭＨＣテトラマーまたはＭＨＣデキストラマー（登録商標）と結合する、請求項１７～１９のいずれか１項に記載の細胞バンク。
  24. 　前記ｉＰＳ細胞を得るための細胞を提供する被験者および前記Ｔ細胞受容体遺伝子を調製するための細胞を提供する被験者が、同一個体である、請求項１～２３のいずれか１項に記載の細胞バンク。
  25. 　前記ｉＰＳ細胞を得るための細胞を提供する被験者および前記Ｔ細胞受容体遺伝子を調製するための細胞を提供する被験者が、互いに別個体である、請求項１～２３のいずれか１項に記載の細胞バンク。
  26. 　Ｔ細胞受容体遺伝子またはＴ細胞受容体遺伝子およびキメラ抗原受容体を導入するための前記細胞が、がんの予防および／または治療に用いるＴ細胞製剤の製造のための中間体である、請求項１～２５のいずれか１項に記載の細胞バンク。
  27. 　がんの予防および／または治療に用いるＴ細胞製剤の製造のための、請求項１～２６のいずれか１項に記載の細胞バンクの使用。
  28. 　請求項１～２６のいずれか１項に記載の細胞バンクにより製造された再生Ｔ細胞。
  29. 　請求項２８に記載の再生Ｔ細胞を含有する医薬組成物。
  30. 　請求項２９に記載の医薬組成物を用いる、がんの予防または治療方法。
     

     
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