WO2022220265A1 - サーチュイン又はクロトー活性化又は発現増強剤、ｎａｄ＋増加剤、及び老化細胞抑制剤 - Google Patents

サーチュイン又はクロトー活性化又は発現増強剤、ｎａｄ＋増加剤、及び老化細胞抑制剤 Download PDF

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nad
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佳代 藤井
美由希 高嶋
里美 三木
光保 牛島
利曉 松友
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    • A23V2200/00—Function of food ingredients
    • A23V2200/30—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health

Definitions

  • the present invention relates to agents used for activating or enhancing the expression of sirtuins or klotho, increasing NAD + , and suppressing senescent cells.
  • Sirtuin and Klotho are known as molecules whose life span is extended by high expression in nematodes, flies, mammals, etc., and whose life span is shortened by deletion.
  • Sirtuins are NAD + -dependent deacetylases whose genes are widely conserved from bacteria to eukaryotes. Deletion of Sir2, a sirtuin homolog of yeast and nematodes, shortens lifespan, and overexpression extends lifespan.
  • SIRT1-7 sirtuins in mammals, among which SIRT1, which is most similar in structure and function to yeast Sir2, is involved in gene expression associated with aging, intracellular metabolism, energy consumption, inflammation and stress response.
  • Non-Patent Document 1 Possibility of involvement in regulation of a wide range of cell functions such as pathways has been clarified (Non-Patent Document 1).
  • sirtuins may be related to specific diseases.
  • Non-Patent Document 2 shows that cognitive functions including immediate memory, classical conditioning, and spatial learning are impaired in SIRT1 knockout mice.
  • overexpression of SIRT1 was found to exhibit ordered synaptic plasticity and memory. From this, it has been clarified that SIRT1 acts on normal learning, memory, and synaptic plasticity.
  • Nicotinamide mononucleotide functions in vivo as a coenzyme for dehydrogenase and as a substrate for sirtuins. Also, increasing NAD + levels are known to increase the activity of sirtuins. NAD synthesis is controlled by nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT). Since the function of NAMPT declines with age, it is known that the amount of NAD + decreases and the activity of sirtuins declines.
  • Non-Patent Document 3 discloses that administration of nicotinamide riboside, which is a precursor of NAD + , suppresses senescent cells in the brain.
  • Klotho maintains phosphorus homeostasis as a receptor for fibroblast growth factor 23.
  • CKD chronic kidney disease
  • Cellular senescence is caused by excessive DNA damage caused by the accumulation of DNA replication errors accompanying cell division, oxidative stress, radiation, activation of oncogenes, etc., resulting in the activation of the p16/RB and p53/p21 pathways. It is a phenomenon in which irreversible cell cycle arrest occurs due to the induction of inhibitors of cyclin inhibitory kinases.
  • Cells undergoing cellular senescence (senescent cells) accumulate in tissues due to accelerated cell senescence and reduced ability to eliminate mitochondria and immune functions associated with aging.
  • Senescent cells accumulated in tissues secrete inflammatory cytokines, proteases, and the like called senescence-related secretory factors, which damage surrounding tissues and promote aging of tissues and living organisms.
  • Non-Patent Document 5 removal of senescent cells has been suggested to prevent or delay tissue dysfunction and suppress aging.
  • Non-Patent Document 6 it has been clarified that an increase in senescent cells is involved in renal damage.
  • S-1-propenylcysteine is a cysteine derivative represented by the following formula (1), and is one of the sulfur-containing components that can be contained in Allium plants such as garlic.
  • S-1-propenylcysteine has immunoregulatory action (Patent Document 1), hypotensive action (Patent Document 2), antioxidant action (Patent Document 3), blood flow improving action (Patent Document 4), and autophagy activation action. (Patent Document 5), and has been reported to have pharmacological effects such as periodontal disease prevention, treatment, or amelioration (Patent Document 6).
  • Patent Document 1 S-1-propenylcysteine's activation of sirtuins and Klotho and its inhibition of senescent cells.
  • the present invention relates to providing new uses for S-1-propenylcysteine, salts thereof, or compositions containing these.
  • the present inventors have made various studies on the usefulness of S-1-propenylcysteine or salts thereof, and have found that S-1-propenylcysteine or salts thereof are excellent in sirtuin or Klotho activation, p16, p21 and p53 genes or The inventors have found that senescent cells that express proteins can be suppressed, and have completed the present invention.
  • the present invention relates to the following 1) to 26).
  • a NAD + increasing agent that contains S-1-propenylcysteine or a salt thereof and is administered to an animal.
  • a senescent cell inhibitor containing S-1-propenylcysteine or a salt thereof as an active ingredient 6) A non-cancer cell senescent cell inhibitor containing S-1-propenylcysteine or a salt thereof and administered to an animal.
  • a method for activating or enhancing expression of sirtuin or klotho comprising administering S-1-propenylcysteine or a salt thereof to an animal in need thereof.
  • a method of increasing NAD + comprising administering S-1-propenylcysteine or a salt thereof to an animal in need thereof.
  • a method for suppressing senescence of non-cancer cells comprising administering S-1-propenylcysteine or a salt thereof to an animal in need thereof.
  • novel uses of S-1-propenylcysteine, salts thereof, or compositions containing these can be provided.
  • Fig. 1 shows sirtuin activation in the cerebral cortex by administration of S-1-propenylcysteine. **: Significant difference at 1% level compared to the control group.
  • Fig. 2 shows changes in hippocampal SIRT1 protein level due to administration of S-1-propenylcysteine. *: Significant difference at the 5% level from the control group.
  • Fig. 2 shows changes in hippocampal NAD + levels due to administration of S-1-propenylcysteine. **: Significant difference at 1% level compared to the control group.
  • Fig. 2 shows changes in p53 protein, a senescent cell marker, in the hippocampus due to administration of S-1-propenylcysteine.
  • FIG. 4 shows changes in the expression levels of SIRT1 and Klotho genes in the kidney due to administration of S-1-propenylcysteine. *: Significant difference at the 5% level from the control group.
  • Fig. 2 shows changes in the expression levels of p16 and p21 genes, which are senescent cell markers in the kidney, due to administration of S-1-propenylcysteine. *: Significant difference at the 5% level from the control group.
  • FIG. 1 shows changes in KIM-1 and NGAL gene protein levels, which are markers of renal damage in the kidney, due to administration of S-1-propenylcysteine.
  • S-1-propenylcysteine has a cis or trans configuration as indicated by the wavy line in formula (1) below.
  • S-1-propenylcysteine preferably has a large proportion of the trans form, and the proportion of the trans form is more preferably 50 to 100% when the total of the trans form and the cis form is taken as 100%. It is preferably 75 to 100%, more preferably 80 to 100%, even more preferably 90 to 100%.
  • optical isomers which may be D-, L-, or racemic.
  • the salt of S-1-propenylcysteine is a physiologically acceptable salt, and may be either an acid addition salt or a base addition salt.
  • acid addition salts include (a) salts with mineral acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid and phosphoric acid, and (b) formic acid, acetic acid, citric acid, fumaric acid, gluconic acid, malic acid, succinic acid and tartaric acid.
  • salts with organic carboxylic acids such as trichloroacetic acid and trifluoroacetic acid
  • salts with sulfonic acids such as methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, mesitylenesulfonic acid and naphthalenesulfonic acid
  • base addition salts include, for example, (a) salts with alkali metals such as sodium and potassium, (b) salts with alkaline earth metals such as calcium and magnesium, (c) ammonium salts, (d) trimethylamine, triethylamine, tributylamine, pyridine, N,N-dimethylaniline, N-methylpiperidine, N-methylmorpholine, diethylamine, dicyclohexylamine, procaine, dibenzylamine, N-benzyl- ⁇ -phenethylamine, 1-ephenamine, N,N Salts with nitrogen-
  • S-1-propenylcysteine or a salt thereof can exist not only in an unsolvated form but also as a hydrate or solvate, and such a hydrate or solvate is optional depending on the manufacturing conditions. can exist as a crystalline form of Accordingly, the sulfur-containing compounds or salts thereof in the present invention include all stereoisomers, hydrates, solvates, and all polymorphic crystalline or amorphous forms.
  • S-1-propenylcysteine or a salt thereof can be obtained by organic synthesis techniques ([1] Tetrahedron Letter, 1975, 37, 3201-3202; [2] Synthesis, 2006, 20, 3367-3369; [3 ] Bull. Korean Chem. Soc. 2011, 32(1), 319-320).
  • S-1-propenylcysteine or a salt thereof can be obtained by processing plants of the genus Allium by various methods. For example, a method for obtaining S-1-propenylcysteine by reacting a heat-treated plant of the genus Allium with an enzyme containing protease or lactase derived from Bacillus subtilis (Patent No.
  • a method of obtaining S-1-propenylcysteine by coexisting an enzyme having gamma-glutamyltranspeptidase or glutaminase activity in garlic Japanese Patent Application Laid-Open No. 2015-144571
  • a method of inoculating garlic with yeast and fermenting it to obtain S-1-propenylcysteine Korean Patent No. 2010-072874-5
  • a method to obtain S-1-propenylcysteine by aging an Allium plant in an aqueous ethanol solution for one month or longer International Publication No. 2016/088892, Molecules. 2017;22: 570.
  • Allium plants belonging to the genus Allium include garlic (Allium sativum L.), onion (Allium cepa L.), elephant garlic (Allium ampeloprasum L.), Chinese chive (Allium tuberosum) and green onion (Allium fistulosum L.). . These plants may be used singly or in combination.
  • the allium genus plant is raw, or if necessary, the outer skin is removed, cut or shredded, or powdered, and a solvent that can be used in the production of medicines and foods is used. can be used. Examples of the solvent include water, alcohol, and a solvent added with an acid or basic substance.
  • S-1-propenylcysteine or a salt thereof of the present invention is not only isolated and purified, but also a crude product, the above plant or a processed product thereof, S-1-propenylcysteine or S-1-propenylcysteine obtained by extraction from the above plant.
  • a fraction enriched in its salt content can be used. For example, as shown below, 1) a plant belonging to the genus Allium is extracted in a 10-50% ethanol aqueous solution at 0-80°C for one month or more (step 1), and 2) the resulting extract is subjected to solid-liquid separation. After that, the ethanol-eluted fraction is collected (step 2), so that it can be obtained.
  • the ethanol aqueous solution used in step 1) can be a 10-50% ethanol aqueous solution, preferably adjusted to an ethanol concentration of 20-40%.
  • the treatment temperature can be set in the range of 0 to 80.degree. C., preferably 10 to 60.degree. C., more preferably 20 to 40.degree.
  • the treatment period can be at least one month or longer under the above conditions, preferably 1 to 20 months, more preferably 1 to 10 months.
  • this step can be performed in an airtight, sealed, or airtight container in consideration of sanitation, volatilization of ethanol, etc., but it is preferable to use a sealed container.
  • step 2) the extract obtained in step 1) is subjected to solid-liquid separation, and the ethanol-eluted fraction is collected.
  • an extracted fraction containing a sulfur-containing compound or a salt thereof can be obtained.
  • the extract fraction can be used as it is, but can also be used after being dried by spray drying or the like as appropriate.
  • isolation of S-1-propenylcysteine or a salt thereof from the extract fraction containing S-1-propenylcysteine or a salt thereof may be performed by dialysis using a dialysis membrane having a molecular exclusion size of 3000 to 4000, if necessary. It can be carried out by appropriately combining adsorption/separation using a cation exchange resin, normal phase chromatography or reversed phase chromatography for separation and purification.
  • adsorption/separation using a cation exchange resin is adsorbed on a cation exchange resin (e.g., Amberlite (Dow Chemical Co.), DOWEX (Dow Chemical Co.), DIAION (Mitsubishi Chemical Co.), etc.). and eluting with 0.1 to 3N aqueous ammonia.
  • a cation exchange resin e.g., Amberlite (Dow Chemical Co.), DOWEX (Dow Chemical Co.), DIAION (Mitsubishi Chemical Co.), etc.
  • Normal phase chromatography includes, for example, a method of using a silica gel column and eluting with a chloroform/methanol/water mixture or the like.
  • Reversed-phase chromatography includes, for example, a method of using an octadecylsilyl column and eluting with a 0.01 to 3% aqueous formic acid solution.
  • the ethanol extraction fraction is dialyzed (dialysis membrane: molecular exclusion size 3000 to 4000), then adsorbed on a cation exchange resin, eluted with 0.5 to 2N aqueous ammonia, and the eluate is filtered through silica gel.
  • Column chromatography (solvent: chloroform/methanol/water mixture) to collect fractions containing the desired product, followed by preparative reverse phase column chromatography (solvent: 0.1-0.5% formic acid aqueous solution) and recovering the target object.
  • the S-1-propenylcysteine obtained by the above steps 1) and 2) has a ratio of the trans isomer of approximately 70 to 90% when the sum of the trans and cis isomers is 100%.
  • S-1-propenylcysteine or a salt thereof in the present invention for example, the LD50 value of dilute ethanol extract of garlic (extract content 14.5%, alcohol number 1.18), which is one of the raw materials, is oral, intraperitoneal and 50 ml/kg or more for any subcutaneous administration route (The Journal of Toxicological Sciences. 1984; 9:57.) and Allium genus plants such as garlic and onions are commonly used as foods, etc. It is generally of low toxicity due to
  • S-1-propenylcysteine or a salt thereof increased SIRT1 activity in the cerebral cortex of senescent mice.
  • repeated administration for 2 weeks increased the expression of SIRT1 in hippocampus and kidney.
  • NAD + a function that enhances the function of sirtuins
  • S-1-propenylcysteine, a salt thereof, or a composition containing these can be a sirtuin or klotho activator or expression enhancer.
  • S-1-propenylcysteine or a salt thereof suppressed cells expressing senescent cell markers p16 and p21 in the kidney and p53 in the hippocampus. Therefore, S-1-propenylcysteine, salts thereof, or compositions containing these can be senescent cell inhibitors.
  • sirtuin and klotho activation or expression enhancement have common mechanisms, S-1-propenylcysteine, a salt thereof, or a composition containing these , as a sirtuin or klotho activator or expression enhancer, NAD + increasing agent, or senescent cell inhibitor to act in the kidney and brain.
  • the sirtuin or klotho activator or expression enhancer and senescent cell inhibitor of the present invention are used for the prevention, treatment, or improvement of symptoms caused by low activity or low expression of sirtuin or klotho, or symptoms caused by an increase in senescent cells.
  • renal disorders there are diseases in which KIM-1 and NGAL are highly expressed, acute renal disorders, diabetic nephropathy, nephrotic syndrome and the like.
  • Cognitive/memory disorders include neurological disorders of the cerebral cortex or hippocampus, learning disorders, memory disorders (including short-term and long-term), and the like.
  • sirtuin or klotho activator or expression enhancer and senescent cell inhibitor of the present invention are used for the prevention, treatment, or improvement of symptoms or diseases such as renal impairment, cognitive/memory impairment (including short-term and long-term), etc. may be used for
  • sirtuin means a sirtuin protein and its homologues.
  • Human sirtuins 1 to 7 (SIRT1 to 7) are known, but SIRT1 is preferred in the present invention.
  • Klotho is meant the Klotho protein and its homologues. ⁇ , ⁇ , and ⁇ are known for human Klotho, but ⁇ -Klotho is preferred in the present invention.
  • sirtuin or klotho activation includes, for example, increasing the amount of sirtuin or klotho activity.
  • sirtuin or Klotho expression enhancement means that transcription products of sirtuin or Klotho genes and/or sirtuin or Klotho proteins are increased, for example, activation of gene transcription and/or translation, transcription products and/or Improving protein stability, inhibiting transcript and/or proteolytic degradation, and the like are included.
  • cellular senescence refers to a phenomenon in which cells undergo irreversible cell cycle arrest. Cellular senescence has been observed, for example, in brain cells (eg, hippocampal cells, cerebral cortical cells), renal cells. “Senescent cell inhibition” refers to one or both of removing senescent cells and preventing or delaying cellular senescence. The p16, p21 and p53 genes are known as molecular markers for DNA damage that causes cellular senescence. more preferred. In addition, senescent cells can be suppressed more effectively by enhancing immune function.
  • sirtuin or klotho activator and senescent cell inhibitor of the present invention may be in the form of pharmaceuticals or foods, or may be in the form of materials or preparations added thereto.
  • Such foods include foods with the concept of activating sirtuins or Klotho or suppressing senescent cells, and where necessary, foods with explanations and indications based on their functions, functional foods, foods with function claims, foods for the sick, and specified foods. Health foods and dietary supplements (supplements) are included.
  • the dosage form of the medicament S-1-propenylcysteine is preferably a dosage form suitable for oral administration.
  • Specific formulations for oral administration include tablets, capsules, fine granules, pills, and granules as solid agents, and emulsions, solutions, suspensions, syrups as liquid agents, and the like. morphology.
  • Such pharmaceutical formulations are obtained by appropriately blending the sulfur-containing compound of the present invention or a salt thereof with excipients, binders, disintegrants, lubricants, coloring agents, flavoring agents, pH adjusters, etc., if necessary. , can be prepared according to a conventional method.
  • dosage form of the drug is not particularly limited, and dosage forms suitable for parenteral administration, such as intravenous (injection, catheter), transmucosal (liquid or ointment), and agents suitable for intracranial administration (catheter) may be in the form
  • the form of the S-1-propenylcysteine food is not particularly limited, and can take various forms such as solid food, semi-liquid food, gel-like food, tablets, caplets, capsules, etc. More specifically, it can be in the form of various foods such as confectionery, beverages, seasonings, processed marine foods, processed meat foods, breads, and health foods. Such foods can be produced by conventional methods by appropriately blending the food materials used for producing these foods with the sulfur-containing compound or salt thereof of the present invention.
  • the above medicines or foods can contain other substances involved in sirtuin or klotho activation, expression enhancement, and senescent cell suppression, such as resveratrol and nicotinamide mononucleotide.
  • vitamins, lipids, minerals that relieve inflammation such as vitamin C, vitamin E, vitamin B2, vitamin B6, niacin, hesperidin, ⁇ -lipoic acid, glutathione, coenzyme Q10, zinc, magnesium, omega 3 It can contain fatty acids and the like.
  • the preferred daily intake of the above medicine or food varies depending on factors such as the subject to be ingested, the form of ingestion, the types of materials and additives to be ingested at the same time, the interval between ingestions, etc.
  • the daily intake is preferably 0.001 to 10 mg/kg, more preferably 0.1 to 1 mg/kg. Also, if desired, this daily dose can be divided into 2 to 4 times and ingested.
  • Targets for administration or intake include organisms with reduced activity or expression of sirtuin or klotho, or organisms with increased senescent cells, but may also be healthy organisms without these.
  • the organisms are not limited to the animals described so far, but also include plants, fungi (including yeast), nematodes, cells (which may be derived from the above animals or plants), but animals are preferred.
  • Such animals include vertebrates (preferably rodents and primates), fish, birds, insects and reptiles, especially rodents (especially rats and mice) and primates (especially humans and monkeys). preferable.
  • Examples include humans suffering from renal disorders and cognitive/memory disorders, or animals (for example, humans) who wish to prevent such diseases, but healthy organisms are also preferred.
  • Plant sirtuins have been suggested to be involved in genome instability, protection of cells from oxidative damage, gametogenesis, fruit development and maturation, leaf senescence, and regulation of photosynthetic activity (Front Plant Sci. 2018 Jul 5;9:961.).
  • Plants are not particularly limited, but for example, eggplants such as tomatoes, green peppers, peppers, and eggplants; melons such as cucumbers, pumpkins, melons, and watermelons; raw and spicy vegetables such as celery, parsley, and lettuce; , green onions such as garlic, beans such as soybeans, peanuts, green beans, peas, adzuki beans, other fruit vegetables such as strawberries, tap roots such as radish, turnips, carrots, burdock, taro, cassava, potato, sweet potato, Chinese yam, etc.
  • eggplants such as tomatoes, green peppers, peppers, and eggplants
  • melons such as cucumbers, pumpkins, melons, and watermelons
  • raw and spicy vegetables such as celery, parsley, and lettuce
  • green onions such as garlic
  • beans such as soybeans, peanuts, green beans, peas, adzuki beans
  • other fruit vegetables such as strawberries
  • tap roots such as radish, turnips, carrots, burdock, taro, cas
  • Potatoes soft vegetables such as asparagus, spinach, Japanese honeywort, flowering plants such as lisianthus, stock, carnations, chrysanthemums, grains such as rice and corn, grasses such as bentgrass and Kouraishiba, oils such as rapeseed and sunflower Crops, sugar crops such as sugar cane and sugar beet, fiber crops such as cotton and rush, fodder crops such as clover, sorghum and dent corn, deciduous fruit trees such as apples, pears, grapes and peaches, mandarin oranges , citrus fruits such as lemons and grapefruits, and woody plants such as azaleas, azaleas and cedars.
  • Dosage forms for administration to plants include powders, granules, granules, wettable powders, flowables, emulsions and pastes. It may be directly administered to the plant, or indirectly administered via soil, hydroponic solution or culture medium. Specific examples include soil treating agents, foliage treating agents, pre-sowing seed treating agents, pre-transplanting plant treating agents, plant treating agents at the time of transplanting, hydroponic solutions, media, and the like.
  • Production Example 2 Isolation of S-1-propenylcysteine from the ethanol-extracted fraction of garlic (1)
  • the ethanol-extracted fraction of garlic obtained in Production Example 1 was placed in a dialysis tube with a pore size of 3500 and dialyzed against purified water. did The dialysate was passed through a cation exchange resin Dowex 50Wx8 (H+), and the resin was thoroughly washed with purified water. Amino acids adsorbed on the resin were eluted with 2N ammonia and concentrated under reduced pressure. The concentrate was applied to a silica gel column and subjected to column chromatography using a chloroform/methanol/water mixture as solvent.
  • Fractions containing the desired product were collected and concentrated.
  • the concentrate was dissolved in water and chromatographed using a preparative reverse phase column (octadecylsilyl column) with 0.1% formic acid as a solvent to collect the desired product and remove the solvent by freeze-drying.
  • Test Example Sirtuin or Klotho Activating Action (1) Sample Preparation A test solution for evaluating biological activity was prepared as follows. When evaluating biological activity, all test solutions were prepared just before use. (a) About 5 mg of S-1-propenylcysteine (cis/trans mixture) produced in Production Example 2 was precisely weighed and dissolved in 10 mL of purified water to prepare an administration solution. (b) About 6 mg of S-1-propenylcysteine (cis/trans mixture) produced in Production Example 2 was accurately weighed and dissolved in 1 mL of the culture medium. This solution was used as a stock solution, diluted appropriately and used for in vitro tests.
  • a SIRT1_GLO kit manufactured by Promega was purchased to measure sirtuin activity.
  • the cerebral cortex lysate was placed in a 96-well plate, various reaction reagents were added, and then luciferase luminescence intensity was measured using a plate reader.
  • SIRT1 activation in vivo: A single dose of the sample prepared in (1)(a) was orally administered to the animal for evaluation test in (2) above, and then the cerebral cortex was excised 15, 30, 60 and 180 minutes later. The cerebral cortex was solubilized by adding a cell lysate after crushing using an automatic tissue crusher. Centrifugation was performed and sirtuin activity in the supernatant was measured. The results are shown in FIG. Sirtuin activity increased 180 minutes after administration of S-1-propenylcysteine. (Fig. 3)
  • SIRT1 protein increasing action (in vivo): After repeated oral administration of the sample prepared in (1)(a) above for 2 weeks using the animal for evaluation test in (2) above, the hippocampus was excised. After the hippocampus was disrupted using an automatic tissue disrupter, the cells were lysed with RIPA cell lysis buffer (Millipore) diluted 10-fold with purified water containing a mixed protease/phosphatase inhibitor (Thermo Fisher Scientific). After dissolution, it was centrifuged (10000 rpm, 10 minutes, 4° C.) and the supernatant was used as a cell extract. This cell extract was used for analysis by Western blotting according to a standard method.
  • Anti-SIRT1 antibody (manufactured by Biolegend) and anti- ⁇ -actin antibody (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) were used as antibodies. The results are shown in FIG. S-1-propenylcysteine increased SIRT1 protein abundance.
  • NAD + amount increasing effect (in vivo): A single dose of the sample prepared in (1)(a) was orally administered to the animal for evaluation test described in (2) above, and 180 minutes later, the cerebral cortex was excised. In addition, the samples prepared in (1)(a) above were mixed with food using the evaluation test animals of (2) above, and the animals were fed for one month, after which the cerebral cortex was excised. The amount of NAD + in the cerebral cortex was measured using NAD + /NADH Assay Kit manufactured by Dojindo Laboratories. The results are shown in FIG. S-1-propenylcysteine increased NAD + levels.
  • cell senescence marker p53 protein expression suppression effect in hippocampus (in vivo): After repeatedly orally administering the sample prepared in (1)(a) above for 6 weeks using the animal for evaluation test in (2) above, the hippocampus was excised. After the hippocampus was crushed using an automatic tissue disrupter, the cells were lysed with Millipore's RIPA cell lysis buffer diluted 10-fold with purified water containing a Roche protease inhibitor and a phosphatase inhibitor. After centrifugation (10000 rpm, 10 minutes, 4° C.), the supernatant was used as a cell extract. This cell extract was used for analysis by Western blotting according to a standard method.
  • Anti-p53 antibody manufactured by Protein Tech
  • anti- ⁇ -actin antibody manufactured by Medical and Biological Laboratories
  • S-1-propenylcysteine decreased p53 protein abundance.
  • Senescent cell marker p16 and p21 gene expression inhibitory action in the kidney (in vivo): After repeatedly orally administering the sample prepared in (1)(a) above for 2 weeks using the animal for evaluation test in (2) above, the kidney was excised. The kidney was disrupted using an automatic tissue disrupter, and then RNA was extracted using a TRIzol solution manufactured by Thermo Fisher Scientific. cDNA was synthesized using the PRIMEscript RT reagent Kit with gEraser manufactured by TAKARA. Real-Time PCR was performed on the synthesized cDNA using KAPA SYBR Fast qPCR kit manufactured by Nippon Genetics. The results are shown in FIG. S-1-propenylcysteine reduced p16 and p21 gene-expressing cells in the kidney of senescent mice.
  • kidney injury inhibitory action (in vivo) After repeatedly orally administering the sample prepared in (1)(a) above for 2 weeks using the animal for evaluation test in (2) above, the kidney was excised. After crushing the kidneys using an automatic tissue disrupter, the cells were lysed with Millipore's RIPA cell lysis buffer diluted 10-fold with purified water containing Roche's protease inhibitors and phosphatase inhibitors. After centrifugation (10000 rpm, 10 minutes, 4° C.), the supernatant was used as a cell extract. This cell extract was used for analysis by Western blotting according to a standard method.
  • Antibodies are kidney injury molecule (KIM-1) antibody (manufactured by R & D system) and lipocalin-2 (NGAL) antibody (manufactured by Proteintech), which is a marker of renal damage, and anti-GAPDH antibody (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd. ) was used. The results are shown in FIG. S-1-propenylcysteine reduced KIM-1 and NGAL.

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Abstract

Ｓ－１－プロペニルシステイン、その塩、又はこれらを含有する組成物の新規用途を提供する。　Ｓ－１－プロペニルシステイン又はその塩を有効成分とするサーチュイン又はクロトーの活性化又は発現増強剤。

Description

サーチュイン又はクロトー活性化又は発現増強剤、ＮＡＤ＋増加剤、及び老化細胞抑制剤
　本発明は、サーチュイン又はクロトーの活性化又は発現増強、ＮＡＤ＋増加、及び老化細胞の抑制に用いられる剤に関する。
　線虫、ハエ、哺乳動物などで高発現することにより寿命が延長され、欠損により寿命が短くなる分子として、サーチュイン（Ｓｉｒｔｕｉｎ）やクロトー（Ｋｌｏｔｈｏ）が知られている。サーチュインは、ＮＡＤ＋依存性脱アセチル化酵素であり、その遺伝子は細菌から真核生物まで広く保存されている。酵母や線虫のサーチュインホモログであるＳｉｒ２を欠損させると寿命が短縮し、過剰発現させると寿命が延長することから、サーチュインは動物における長寿遺伝子の候補として注目されている。哺乳類には、７つのサーチュイン（ＳＩＲＴ１～７）が存在し、中でも構造や機能が酵母Ｓｉｒ２と最も類似しているＳＩＲＴ１は、老化に伴う遺伝子の発現、細胞内代謝、エネルギー消費、炎症及びストレス応答経路等の幅広い細胞機能の制御に関与する可能性が明らかにされている（非特許文献１）。
　また、近年、サーチュインは特定の疾患との関係の可能性も明らかにされている。例えば、非特許文献２にはＳＩＲＴ１のノックアウトマウスでは即時記憶、古典的条件付け及び空間学習を含む認知機能が低下した。逆に、ＳＩＲＴ１の過剰発現は規則正しいシナプス可塑性と記憶を示すことが認められた。このことから、ＳＩＲＴ１が正常な学習、記憶、シナプス可塑性に作用することが明らかにされている。
　ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＡＤ＋）は、生体内において、脱水素酵素の補酵素やサーチュインの基質として機能している。またＮＡＤ＋量の増加は、サーチュインの活性を増大することが知られている。ＮＡＤの合成はニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ：ＮＡＭＰＴ）によって制御されている。ＮＡＭＰＴの働きは年齢とともに低下するため、ＮＡＤ＋量が減少し、サーチュインの活性は低下することが知られている。非特許文献３には、ＮＡＤ＋の前駆体であるニコチンアミドリボシドの投与が脳内の老化細胞を抑制することが開示されている。
　また、クロトーは、線維芽細胞増殖因子２３の受容体としてリン恒常性を維持している。非特許文献４には、クロトーの発現量と、慢性腎臓病（ＣＫＤ）の発症、進行及びその合併症とが有意に相関することから、ＣＫＤの診断や予防のためのバイオマーカーへの応用など、クロトーの潜在的用途が開示されている。
　細胞老化は、細胞分裂に伴うＤＮＡ複製エラーの蓄積、酸化ストレス、放射線、がん遺伝子の活性化等を介して過度なＤＮＡ損傷が生じることにより、ｐ１６／ＲＢ経路やｐ５３／ｐ２１経路が活性化され、サイクリン阻害キナーゼの阻害因子が誘導されることにより不可逆的な細胞周期の停止が起こる現象である。細胞老化を起こした細胞（老化細胞）は、加齢に伴うミトコンドリア及び免疫機能の低下による細胞老化の促進や除去能力の低下により組織内に蓄積する。組織内に蓄積した老化細胞は細胞老化関連分泌因子と呼ばれる炎症性サイトカインやプロテアーゼ等を分泌することで、周囲の組織を障害し、組織や生体の老化を促進する。一方、老化細胞の除去は組織の機能障害を防止あるいは遅延させ、老化を抑制することが示唆されている（非特許文献５）。また、老化細胞の増加が腎障害（非特許文献６）に関与することが明らかになっている。
　一方、Ｓ－１－プロペニルシステインは、下記式（１）で示されるシステイン誘導体であり、ニンニク等のアリウム属植物に含まれ得る含硫成分の一つである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　Ｓ－１－プロペニルシステインは、免疫調節作用（特許文献１）、血圧降下作用（特許文献２）、抗酸化作用（特許文献３）、血流改善作用（特許文献４）、オートファジー活性化作用（特許文献５）、歯周病予防、治療又は改善作用（特許文献６）等の薬理作用を有することが報告されている。しかしながら、Ｓ－１－プロペニルシステインの、サーチュイン、クロトーの活性化や老化細胞抑制については全く知られていない。
国際公開第２０１６／０８８８９２号 国際公開第２０１６／１９９８８５号 特開２０２０－０２９５２９号公報 国際公開第２０１９／０３１４４２号 国際公開第２０１９／２３５５９７号 国際公開第２０２０／２３０８１３号
Trends Cell Biol. 2014;24(8):464-71. J Neurosci 2010;30(29):9695-9707. Cell Metab. 2018 Mar 6;27(3):513-528. BMC Nephrol. 2018;19:285. Nature. 2011 Nov 2;479(7372):232-6. Front Pharmacol. 2019;10:770.
　本発明は、Ｓ－１－プロペニルシステイン、その塩、又はこれらを含有する組成物の新規用途を提供することに関する。
　本発明者らは、Ｓ－１－プロペニルシステイン又はその塩の有用性について種々検討したところ、Ｓ－１－プロペニルシステイン又はその塩に優れたサーチュイン又はクロトー活性化と、ｐ１６、ｐ２１及びｐ５３遺伝子あるいはタンパク質を発現する老化細胞を抑制することを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、以下の１）～２６）に係るものである。
　１）Ｓ－１－プロペニルシステイン又はその塩を有効成分とするサーチュイン又はクロトーの活性化又は発現増強剤。
　２）Ｓ－１－プロペニルシステイン又はその塩を含有し、動物に投与されて、サーチュイン又はクロトーの活性化又は発現増強に用いられる剤。
　３）Ｓ－１－プロペニルシステイン又はその塩を有効成分とするＮＡＤ＋増加剤。
　４）Ｓ－１－プロペニルシステイン又はその塩を含有し、動物に投与されるＮＡＤ＋増加剤。
　５）Ｓ－１－プロペニルシステイン又はその塩を有効成分とする老化細胞抑制剤。
　６）Ｓ－１－プロペニルシステイン又はその塩を含有し、動物に投与される、非がん細胞の老化細胞抑制剤。
　７）ｐ１６、ｐ２１又はｐ５３遺伝子の発現細胞を抑制する、５）又は６）記載の老化細胞抑制剤。
　８）腎臓、及び脳からなる群より選ばれる１種以上の器官に作用させるための１）～７）のいずれか１項記載の剤。
　９）食品添加剤又は食品の形態である、１）～８）のいずれか１項記載の剤。
　１０）サーチュイン又はクロトーの低活性又は低発現に起因する症状、又は老化細胞の蓄積に起因する症状の予防、治療又は改善のために用いられる、１）～９）のいずれか１項記載の剤。
　１１）腎障害、及び認知／記憶障害から選ばれる症状若しくは疾患の予防、治療又は改善のために用いられる１）～１０）のいずれか１項記載の剤。
　１２）サーチュイン又はクロトーの活性化又は発現増強剤を製造するための、Ｓ－１－プロペニルシステイン又はその塩の使用。
　１３）動物に投与されて、サーチュイン又はクロトーの活性化又は発現増強に用いられる剤を製造するための、Ｓ－１－プロペニルシステイン又はその塩の使用。
　１４）ＮＡＤ＋増加剤を製造するための、Ｓ－１－プロペニルシステイン又はその塩の使用。
　１５）動物に投与されるＮＡＤ＋増加剤を製造するための、Ｓ－１－プロペニルシステイン又はその塩の使用。
　１６）老化細胞抑制剤を製造するための、Ｓ－１－プロペニルシステイン又はその塩の使用。
　１７）動物に投与される、非がん細胞の老化細胞抑制剤を製造するための、Ｓ－１－プロペニルシステイン又はその塩の使用。
　１８）サーチュイン又はクロトーの活性化又は発現増強に使用するための、Ｓ－１－プロペニルシステイン又はその塩。
　１９）動物に投与されて、サーチュイン又はクロトーの活性化又は発現増強に用いられる、Ｓ－１－プロペニルシステイン又はその塩。
　２０）ＮＡＤ＋増加に使用するための、Ｓ－１－プロペニルシステイン又はその塩。
　２１）動物に投与されて、ＮＡＤ＋増加に使用するための、Ｓ－１－プロペニルシステイン又はその塩。
　２２）老化細胞抑制に使用するための、Ｓ－１－プロペニルシステイン又はその塩。
　２３）動物に投与されて、非がん細胞の老化細胞抑制に使用するための、Ｓ－１－プロペニルシステイン又はその塩。
　２４）Ｓ－１－プロペニルシステイン又はその塩を、それを必要とする動物に投与する、サーチュイン又はクロトーの活性化又は発現増強方法。
　２５）Ｓ－１－プロペニルシステイン又はその塩を、それを必要とする動物に投与する、ＮＡＤ＋増加方法。
　２６）Ｓ－１－プロペニルシステイン又はその塩を、それを必要とする動物に投与する、非がん細胞の老化細胞抑制方法。
　本発明によれば、Ｓ－１－プロペニルシステイン、その塩、又はこれらを含有する組成物の新規用途を提供できる。
Ｓ－１－プロペニルシステインの投与による大脳皮質のサーチュイン活性化作用を示す。＊＊：対照群に対し１％レベルで有意差あり。 Ｓ－１－プロペニルシステインの投与による海馬のＳＩＲＴ１タンパク質量の変化を示す。＊：対照群に対し５％レベルで有意差あり。 Ｓ－１－プロペニルシステインの投与による海馬のＮＡＤ＋量の変化を示す。＊＊：対照群に対し１％レベルで有意差あり。 Ｓ－１－プロペニルシステインの投与による海馬における老化細胞マーカーであるｐ５３タンパク質の変化を示す。＊＊：対照群に対し１％レベルで有意差あり。 Ｓ－１－プロペニルシステインの投与による腎臓のＳＩＲＴ１及びクロトー遺伝子の発現量の変化を示す。＊：対照群に対し５％レベルで有意差あり。 Ｓ－１－プロペニルシステインの投与による腎臓における老化細胞マーカーであるｐ１６及びｐ２１遺伝子の発現量の変化を示す。＊：対照群に対し５％レベルで有意差あり。 Ｓ－１－プロペニルシステインの投与による腎臓における腎障害のマーカーであるＫＩＭ－１及びＮＧＡＬ遺伝子タンパク質量の変化を示す。＊：対照群に対し５％レベルで有意差あり、＊＊：対照群に対し１％レベルで有意差あり。 Ｓ－１－プロペニルシステインの投与による認知・記憶の維持を示す。＊＊：対照群に対し１％レベルで有意差あり。
　「Ｓ－１－プロペニルシステイン」は、下記式（１）の波線で示されるように、シス又はトランスの立体配置が存在する。本発明において、Ｓ－１－プロペニルシステインはトランス体の割合が多いものが好ましく、トランス体の割合がトランス体とシス体の合計を１００％とした場合に、５０～１００％であるのがより好ましく、７５～１００％であるのがより好ましく、８０～１００％であるのがより好ましく、９０～１００％であるのがさらに好ましい。
　また、システイン構造中に不斉炭素が存在することから光学異性体が存在するが、Ｄ体、Ｌ体あるいはラセミ体のいずれであってもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　Ｓ－１－プロペニルシステインの塩は、生理学的に許容される塩であり、また、酸付加塩又は塩基付加塩の何れでもよい。酸付加塩としては、たとえば、（イ）塩酸、硫酸、硝酸、リン酸などの鉱酸との塩、（ロ）ギ酸、酢酸、クエン酸、フマル酸、グルコン酸、リンゴ酸、コハク酸、酒石酸、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸などの有機カルボン酸との塩、（ハ）メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、メシチレンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸などのスルホン酸類との塩を、また、塩基付加塩としては、たとえば、（イ）ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属との塩、（ロ）カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属との塩、（ハ）アンモニウム塩、（ニ）トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリブチルアミン、ピリジン、Ｎ，Ｎ－ジメチルアニリン、Ｎ－メチルピペリジン、Ｎ－メチルモルホリン、ジエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、プロカイン、ジベンジルアミン、Ｎ－ベンジル－β－フェネチルアミン、１－エフェナミン、Ｎ，Ｎ′－ジベンジルエチレンジアミンなどの含窒素有機塩基との塩を挙げることができる。
　更に、Ｓ－１－プロペニルシステイン又はその塩は、未溶媒和型のみならず、水和物や溶媒和物としても存在することができ、斯かる水和物又は溶媒和物は製造条件により任意の結晶形として存在することができる。従って、本発明における含硫化合物又はその塩は、全ての立体異性体、水和物、溶媒和物、及び全ての多形結晶形態もしくは非晶形を包含するものである。
　Ｓ－１－プロペニルシステイン又はその塩は、有機合成手法により取得することができる（〔１〕Tetrahedron Letter, 1975, 37, 3201-3202；〔２〕Synthesis, 2006, 20, 3367-3369；〔３〕Bull. Korean Chem. Soc. 2011, 32(1), 319-320）。
　また、Ｓ－１－プロペニルシステイン又はその塩は、アリウム属植物を種々の方法で加工することにより得ることができる。例えば、加熱処理したアリウム属植物に、Bacillus　subtilis由来のプロテアーゼ又はラクターゼを含む酵素を作用させＳ－１－プロペニルシステインを得る方法（特許第６１０５８７１号公報）、アリウム属の植物の搾汁又は抽出物にガンマグルタミルトランスペプチダーゼ又はグルタミナーゼ活性を有する酵素を共存させＳ－１－プロペニルシステインを得る方法（特開２０１５－１４４５７１号公報）、ニンニクに酵母を接種し発酵させＳ－１－プロペニルシステインを得る方法（韓国特許第２０１０－０７２８７４－５号）、アリウム属植物をエタノール水溶液中で１ヵ月以上熟成し、Ｓ－１－プロペニルシステインを得る方法（国際公開第２０１６／０８８８９２号、Molecules. 2017;22:570.）等が挙げられる。
　ここでアリウム属植物としては、ニンニク（Allium　sativum　L.）、タマネギ（Allium　cepa　L.）、エレファントガーリック（Allium　ampeloprasum　L.）、ニラ（Allium　tuberosum）及びネギ（Allium　fistulosum　L.）等が挙げられる。これらの植物は、単独あるいは組み合わせて用いてもよい。また、上記アリウム属植物は生のものをそのまま、あるいは必要に応じて外皮を取り除き、切断又は細断したもの、あるいはこれらを粉末化したもの、また、医薬や食品の製造に可能な溶媒を用いて抽出したものを用いることができる。溶媒としては、水やアルコールなどや、酸あるいは塩基性物質を溶媒に添加したものなどが挙げられる。
　本発明のＳ－１－プロペニルシステイン又はその塩は、単離・精製されたもののみならず、粗生成物、上記植物又はその加工物、上記植物からの抽出操作によりＳ－１－プロペニルシステイン又はその塩の含有量が高められた画分を用いることができる。例えば、以下に示すように、１）アリウム属植物を１０～５０％のエタノール水溶液中、０～８０℃で、１ヶ月以上抽出し（工程１）、２）得られた抽出物を固液分離後、エタノール溶出画分を回収する（工程２）、ことにより取得することができる。
　工程１）で使用するエタノール水溶液は、１０～５０％のエタノール水溶液を使用することができるが、好ましくは２０～４０％のエタノール濃度に調製されたものである。また、処理温度は０～８０℃の範囲に設定することができるが、好ましくは１０～６０℃、更に好ましくは２０～４０℃である。処理期間は上記条件下で少なくとも１ヶ月以上抽出に付すことができるが、好ましくは１～２０ヶ月、更に好ましくは１～１０ヶ月である。また、本工程は衛生面やエタノールの揮発等を考慮し、気密、密封あるいは密閉容器内で行うことができるが、密閉容器を使用するのが好ましい。
　工程２）では、工程１）で得られた抽出物を固液分離後、エタノール溶出画分が回収される。回収物を適宜濃縮することにより、含硫化合物又はその塩を含む抽出画分を得ることができる。当該抽出画分は、そのまま使用することができるが、適宜、スプレードライなどにより乾燥させて使用することもできる。
　更に、上記Ｓ－１－プロペニルシステイン又はその塩を含む抽出画分からのＳ－１－プロペニルシステイン又はその塩の単離は、必要に応じて分子排除サイズ３０００～４０００の透析膜を用いて透析に付し、次いで陽イオン交換樹脂を用いた吸着・分離、順相クロマトグラフィー又は逆相クロマトグラフィーによる分離精製手段を適宜組み合わせることにより行うことができる。
　ここで、陽イオン交換樹脂を用いた吸着・分離は、陽イオン交換樹脂（例えば、アンバーライト（ダウ・ケミカル社）、ＤＯＷＥＸ（ダウ・ケミカル社製）、ＤＩＡＩＯＮ（三菱化学製）等）に吸着させ、０．１～３Ｎのアンモニア水で溶出させる方法が挙げられる。
　順相クロマトグラフィーとしては、例えばシリカゲルカラムを用いて、クロロフォルム／メタノール／水混合物等で溶出させる方法が挙げられる。
　逆相クロマトグラフィーとしては、例えばオクタデシルシリルカラムを用いて、０．０１～３％ギ酸水溶液等で溶出させる方法が挙げられる。
　好ましくは、上記エタノール抽出画分を透析（透析膜：分子排除サイズ３０００～４０００）し、次いで陽イオン交換樹脂に吸着させた後、０．５～２Ｎのアンモニア水で溶出し、溶出物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶媒：クロロフォルム／メタノール／水混合物）に付して目的物を含む画分を回収し、さらに分取用逆相カラムクロマトグラフィー（溶媒：０．１～０．５％ギ酸水溶液）に付して目的物を回収する方法が挙げられる。
　上記工程１）及び２）によって得られるＳ－１－プロペニルシステインは、トランス体の割合が、トランス体とシス体の合計を１００％とした場合に、大凡７０～９０％である。
　本発明におけるＳ－１－プロペニルシステイン又はその塩は、例えば原料の一つであるニンニクの希エタノール抽出液（エキス分１４．５％，アルコール数１．１８）のＬＤ５０値が、経口、腹腔及び皮下のいずれの投与経路においても、５０ｍｌ／ｋｇ以上であること（The Journal of Toxicological Sciences. 1984;9:57.）及びニンニクやタマネギ等のアリウム属植物が食品として常用されていること、等により一般に低毒性である。
　後記試験例に示すように、Ｓ－１－プロペニルシステイン又はその塩は、老化促進マウスの大脳皮質においてＳＩＲＴ１活性量を増加させた。また、２週間の反復投与により海馬及び腎臓においてＳＩＲＴ１の発現を増加させた。加えて、実際に動物の脳でＮＡＤ＋（サーチュインの機能を向上する機能が知られている。）を増加させた。また、２週間の反復投与により腎臓においてクロトーの発現を増加させた。よって、Ｓ－１－プロペニルシステイン、その塩又はこれらを含有する組成物はサーチュイン又はクロトーの活性化又は発現増強剤、となり得る。
　また、後記試験例に示すように、Ｓ－１－プロペニルシステイン又はその塩は、老化細胞のマーカーであるｐ１６及びｐ２１を腎臓で、ｐ５３を海馬で発現した細胞を抑制した。よって、Ｓ－１－プロペニルシステイン、その塩又はこれらを含有する組成物は老化細胞抑制剤となり得る。
　サーチュイン及びクロトーの活性化又は発現増強、老化細胞抑制、及びＮＡＤ＋増加は、互いに共通する機構を有するという技術常識を考慮すると、Ｓ－１－プロペニルシステイン、その塩又はこれらを含有する組成物は、腎臓及び脳において作用させるための、サーチュイン又はクロトー活性化又は発現増強剤、ＮＡＤ＋増加剤、又は老化細胞抑制剤として使用し得る。
　本発明のサーチュイン又はクロトーの活性化又は発現増強剤及び老化細胞抑制剤は、サーチュイン又はクロトーの低活性又は低発現に起因する症状、又は老化細胞の増加に起因する症状の予防、治療又は改善のために用いられてよい。
　これらの症状は、特に限定されないが、腎障害又は認知／記憶障害であってよい。腎障害の中でも、ＫＩＭ－１及びＮＧＡＬが高発現する疾患、急性腎障害、糖尿病性腎症、ネフローゼ症候群等が挙げられる。認知／記憶障害の中でも、大脳皮質又は海馬の神経障害、学習障害、記憶障害（短期及び長期を含む。）等が挙げられる。
　ＳＩＲＴ１又はクロトーの機能低下や細胞老化の亢進は、既に述べたように、腎障害、認知／記憶障害等の症状や疾患に関わっているとされている（非特許文献２、４、６）。したがって、本発明のサーチュイン又はクロトーの活性化又は発現増強剤及び老化細胞抑制剤は、腎障害、認知／記憶障害（短期及び長期を含む。）等の症状若しくは疾患の予防、治療又は改善のために用いられてよい。
　本発明において、「サーチュイン」とは、サーチュインタンパク質及びそのホモログを意味する。ヒトのサーチュインには、１～７（ＳＩＲＴ１～７）が知られているが、本発明においてはＳＩＲＴ１が好ましい。
　「クロトー」とは、クロトータンパク質及びそのホモログを意味する。ヒトのクロトーには、α、β、γが知られているが、本発明においてはα－クロトーが好ましい。
　本発明において、「サーチュイン又はクロトー活性化」とは、例えば、サーチュイン又はクロトーの活性量を増加することが挙げられる。
　「サーチュイン又はクロトー発現増強」とは、サーチュイン又はクロトー遺伝子の転写産物及び／又はサーチュイン又はクロトータンパク質が増加することであって、例えば、遺伝子の転写及び／又は翻訳の活性化、転写産物及び／又はタンパク質の安定性の向上、転写産物及び／又はタンンパク質分解の阻害等、が包含される。
　本発明において、「細胞老化」とは、細胞に不可逆的な細胞周期の停止が起こる現象を指す。細胞老化は、例えば、脳細胞（例えば、海馬細胞、大脳皮質細胞）、腎細胞で認められている。「老化細胞抑制」とは、老化細胞の除去、細胞老化現象の予防又は遅延、の一方又は双方を指す。
　ｐ１６、ｐ２１及びｐ５３遺伝子は、細胞老化を引き起こすＤＮＡ損傷の分子マーカーとして知られているが、本発明の老化細胞抑制剤は、細胞老化を促進するミトコンドリアの機能不全やＤＮＡ損傷を抑制するものがより好ましい。また、免疫機能を高めることにより老化細胞をより効果的に抑制することができる。
　本発明のサーチュイン又はクロトー活性化剤及び老化細胞抑制剤は、医薬又は食品の形態であってもよく、あるいはこれらに添加される素材又は製剤の形態であってもよい。
　また、当該食品には、サーチュイン又はクロトー活性化又は老化細胞抑制をコンセプトとし、必要に応じてその機能に基づく作用を説明表示した食品、機能性食品、機能性表示食品、病者用食品、特定保健用食品、栄養補助食品（サプリメント）が包含される。
　当該医薬Ｓ－１－プロペニルシステインの剤形は、経口に適した剤形であることが好ましい。経口投与製剤の具体的な剤形として、例えば、固形剤としては錠剤、カプセル剤、細粒剤、丸剤、顆粒剤、液剤としては乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤等の形態が挙げられる。斯かる医薬製剤は、本発明の含硫化合物又はその塩に、必要に応じて賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色料、矯味矯臭剤、ｐＨ調整剤等を適宜配合し、常法に従って調製することができる。
　ただし、当該医薬の剤形は、特に限定されず、非経口に適した剤形、例えば、静脈内（注射、カテーテル）、経粘膜（液剤又は軟膏）、頭蓋内投与（カテーテル）に適した剤形であってもよい。
　Ｓ－１－プロペニルシステイン食品の形態は、特に限定されるものではなく、例えば、固形食品、半流動食品、ゲル状食品、錠剤、キャプレット、カプセル剤等、種々の形態をとることができ、更に具体的には、菓子、飲料、調味料、水産加工食品、食肉加工食品、パン、健康食品等の種々の食品の形態であり得る。
　斯かる食品は、これらの食品を通常製造する場合に用いられる食品素材と、本発明の含硫化合物又はその塩を適宜配合し、常法により製造することができる。
　上記医薬又は食品には、サーチュイン又はクロトーの活性化、発現増強や老化細胞抑制に関与する他の物質、例えば、レスベラトロールやニコチンアミドモノヌクレオチドを含有することができる。また、炎症を和らげるようなビタミン類、脂質類、ミネラル類、例えば、ビタミンＣ、ビタミンＥ，ビタミンＢ２，ビタミンＢ６，ナイアシン、ヘスペリジン、α-リポ酸、グルタチオン、コエンザイムＱ１０、亜鉛、マグネシウム、オメガ３脂肪酸などを含有することができる。
　上記医薬又は食品の、一日当たりの好ましい摂取量は、摂取する対象、摂取の形態、同時に摂取する素材や添加剤等の種類、摂取の間隔等の要因に依存して変動するものであるが、Ｓ－１－プロペニルシステイン又はその塩として、一日当たり０．００１～１０ｍｇ ／ｋｇ摂取することが好ましく、０．１～１ｍｇ／ｋｇ摂取することがより好ましい。また、所望により、この一日量を２～４回に分割して摂取することもできる。
　投与又は摂取対象としては、サーチュイン又はクロトーの活性量低下又は発現低下、あるいは老化細胞が増加している生物が挙げられるが、これらのない健常生物であってもよい。当該生物は、これまでに説明してきた動物に限らず、植物、真菌類（酵母を含む）、線虫、細胞（前記の動物又は植物に由来してよい。）も含むが、動物が好ましい。当該動物としては、脊椎動物（好ましくはげっ歯類及び霊長類）、魚類、鳥類、昆虫類及び爬虫類が挙げられ、特にげっ歯類（特にラット及びマウス）及び霊長類（特にヒト及びサル）が好ましい。
　アリウム属植物の加工物やアリウム属植物に含まれる含硫成分が動物に投与されて、動物体内でサーチュイン活性化、クロトー活性化又は発現増強、ＮＡＤ＋増加を実証された事実、及び、動物体内の非がん細胞の老化抑制を実証された事実は、本発明者らが知る限り存在しない。これらは、本発明者らの鋭意検討の結果、予想外に発見されたものである。
　腎障害、及び認知／記憶障害に罹患したヒト、あるいは当該疾患の予防を望む動物（例えばヒト）等が挙げられるが、健常生物も好ましい。
　植物のサーチュインは、ゲノムの不安定性や細胞の酸化ダメージからの保護、配偶子形成、果実の発生と成熟、葉の老化、光合成活性の調節に関与することが示唆されている（Front Plant Sci. 2018 Jul 5;9:961.）。
　植物は、特に限定されないが、例えば、トマト、ピーマン、トウガラシ、ナス等のナス類、キュウリ、カボチャ、メロン、スイカ等のウリ類、セルリー、パセリー、レタス等の生菜・香辛菜類、ネギ、タマネギ、ニンニク等のネギ類、ダイズ、ラッカセイ、インゲン、エンドウ、アズキ等の豆類、イチゴ等のその他果菜類、ダイコン、カブ、ニンジン、ゴボウ等の直根類、サトイモ、キャッサバ、バレイショ、サツマイモ、ナガイモ等の芋類、アスパラガス、ホウレンソウ、ミツバ等の柔菜類、トルコギキョウ、ストック、カーネーション、キク等の花卉類、イネ、トウモロコシ等の穀物類、ベントグラス、コウライシバ等の芝類、ナタネ、ヒマワリ等の油料作物類、サトウキビ、テンサイ等の糖料作物類、ワタ、イグサ等の繊維料作物類、クローバー、ソルガム、デントコーン等の飼料作物類、リンゴ、ナシ、ブドウ、モモ等の落葉性果樹類、ウンシュウミカン、レモン、グレープフルーツ等の柑橘類、サツキ、ツツジ、スギ等の木本類が挙げられる 。
　植物に投与する剤形としては、粉剤、顆粒剤、粒剤、水和剤、フロアブル剤、乳剤及びペースト剤等が挙げられる。植物に対し、直接投与してもよく、土壌、水耕液又は培地を介して間接的に投与してもよい。具体的には、土壌処理剤、茎葉処理剤、播種前の種子処理剤、移植前植物の処理剤及び移植時の植物に対する処理剤等、水耕液、培地等が挙げられる。
製造例１　ニンニクのエタノール抽出画分
　外皮を取り除いたニンニク鱗茎約１ｋｇと約１０００ｍＬの３０％エタノールを容器に入れ密閉した。この容器を室温で１～１０ヶ月放置し、適宜攪拌した。この混合物から固体と液体を分離し、液体をスプレードライによって乾燥させ、黄褐色の粉末を得た。
製造例２　ニンニクのエタノール抽出画分からのＳ－１－プロペニルシステインの単離
（１）製造例１で得られたニンニクのエタノール抽出画分をポアサイズ３５００の透析チューブに入れ、精製水に対して透析を行った。透析外液を陽イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ５０Ｗｘ８（Ｈ＋）に通じ、精製水で樹脂を良く洗浄した。樹脂に吸着したアミノ酸類を２Ｎのアンモニアで溶出させ、減圧濃縮した。濃縮物をシリカゲルカラムに付し、クロロフォルム／メタノール／水混合物を溶媒としてカラムクロマトグラフィーを行った。目的物（Ｓ－１－プロペニルシステイン）を含む画分を回収し、濃縮した。濃縮物を水に溶解し、分取用逆相カラム（オクタデシルシリルカラム）を用いて、０．１％ギ酸を溶媒としてクロマトグラフィーを行い、目的物を回収し溶媒を凍結乾燥によって取り除いた。得られた凍結乾燥物は、ＮＭＲ（溶媒：重水）及び質量分析装置にて、構造を以下に示す標準物質から得られたスペクトルと比較し、トランス－Ｓ－１－プロペニルシステインとシス－Ｓ－１－プロペニルシステイン（トランス体：シス体＝８：２）の混合物であることを確認した。
ｔｒａｎｓ－Ｓ－１－プロペニルシステイン
　1H-NMR (500 MHz, in D2O-NaOD, δ): 1.76 (d, 3H, J = 7.0 Hz), 2.98 (dd, 1H, J = 7.5, 14.5 Hz), 3.14 (dd, 1H, J = 4.5, 14.5 Hz) 3.69 (dd, 1H, J = 4.5, 7.5Hz), 5.10-5.14 (m, 1H), 6.02(d, 1H, J = 15.5 Hz); 
　13C-NMR (125 MHz, in D2O-NaOD, δ): 17.61, 33.53, 53.70, 119.92, 132.12, 172.73,
　HRMS: observed [M+H]+ = 162.0583, calculated [M+H] +  = 162.0581
ｃｉｓ－Ｓ－１－プロペニルシステイン
　1H-NMR (500 MHz, in D2O, δ): 1.74 (d, 3H, J = 7.0 Hz), 3.21 (dd, 1H, J = 7.5, 15.0 Hz), 3.31 (dd, 1H, J = 4.5, 15.0 Hz), 3.95 (dd, 1H, J = 4.5, 7.5 Hz), 5.82-5.86 (m, 1H), 6.01(d, 1H, J = 9.5 Hz);
　13C-NMR (125 MHz, in D2O-NaOD, δ): 13.89, 33.88, 54.16, 122.58, 127.78, 172.63.
　HRMS: observed [M+H] +  = 162.0580, calculated [M+H] +  = 162.0581
（２）ニンニクのエタノール抽出画分中のＳ－１－プロペニルシステインの測定
　製造例１（１）で得られたニンニクのエタノール抽出画分を５００ｍｇから１ｇ容器に取り、内部標準としてＳ－ｎ－３－ブテニルシステインの２０ｍＭ塩酸溶液を加え、２０ｍＭ塩酸にて２０ｍＬとした。良く攪拌した後、一部を取り１７５０Ｇにて遠心分離を約１０分間行った。得られた上清を一部取り、遠心式ろ過ユニット（Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ、ｃｕｔｏｆｆ：３０００）を用いて遠心ろ過を行った（１５０００ｒｐｍ、１０分）。得られたろ過物２０μＬを取り、ＡｃｃＱ・Ｔａｇ　Ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｗａｔｅｒｓ）を用いて誘導体化をおこなった。別途、標準化合物を２０ｍＭ塩酸に溶解し、試料と同様の操作を行い、検量線用標準液を調製した。試料溶液及び標準液をＡｃｑｕｉｔｙ　ＵＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ）にてクロマトグラフィーを行い、含量を求めた。その結果、Ｓ－１－プロペニルシステインは、３．７±０．３ｍｇ／ｇ乾燥物であった。
試験例
　サーチュイン又はクロトー活性化作用
（１）試料の調製
　生物活性を評価するための被検液の調製を以下の通り行った。生物活性評価に際し、被検液はいずれも用時調製を行った。
　（ａ）製造例２で製造したＳ－１－プロペニルシステイン（シス／トランス混合物）を約５ｍｇ精密に量り取り、精製水１０ｍＬに溶解し、投与液とした。
　（ｂ）製造例２で製造したＳ－１－プロペニルシステイン（シス／トランス混合物）を約６ｍｇ精密に量り取り、培養液１ｍＬに溶解した。この液を原液とし、適宜希釈してｉｎ　ｖｉｔｒｏ試験に供した。
（２）評価試験用動物
　生物活性を評価するための動物を以下のように飼育した。試験用老化促進マウスＳＡＭＰ８（雄性）を日本エスエルシーより購入した。購入後、１週間の順化を行い、評価試験用動物とした。
（３）評価試験用ヒト神経芽細胞の調製
　ヒト神経芽細胞株ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞を１０％ウシ胎児血清、抗生物質ペニシリン、ストレプトマイシン溶液を添加したダルベッコ改変イーグル培地で培養し、評価試験用細胞とした。
（４）サーチュイン活性化試験
　サーチュインの活性を測定するためにプロメガ社製のＳＩＲＴ１＿ＧＬＯキットを購入した。大脳皮質の溶解液を９６穴プレートに入れ、各種反応試薬を添加したのちにプレートリーダーによりルシフェラーゼの発光強度を測定した。
（ａ）ＳＩＲＴ１活性化作用（ｉｎ　ｖｉｖｏ）：
　上記（２）の評価試験用動物を用いて上記（１）（ａ）で調製した試料を単回経口投与した後、１５、３０、６０、１８０分後に大脳皮質を摘出した。大脳皮質は組織自動破砕機を用いて破砕後に細胞溶解液を加え可溶化した。遠心分離を行い、その上清中のサーチュインの活性を測定した。結果を図１に示す。
　Ｓ－１－プロペニルシステインを投与１８０分後にサーチュイン活性が増加した。（図３）
（ｂ）ＳＩＲＴ１タンパク質増加作用（ｉｎ　ｖｉｖｏ）：
　上記（２）の評価試験用動物を用いて上記（１）（ａ）で調製した試料を２週間反復経口投与した後、海馬を摘出した。海馬は組織自動破砕機を用いて破砕後にサーモフィッシャーサイエンティフィック社製のプロテアーゼ／ホスファターゼ混合型阻害剤を添加した精製水で１０倍に希釈したミリポア社製のＲＩＰＡ細胞溶解用緩衝液により細胞を溶解した後、遠心（１００００ｒｐｍ、１０分、４℃）し、上清を細胞抽出液とした。この細胞抽出液を用いて定法に従いウエスタンブロッティング法により解析した。抗体は、抗ＳＩＲＴ１抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、及び抗β－アクチン抗体（富士フィルム和光純薬社製）を用いた。結果を図２に示す。Ｓ－１－プロペニルシステインは、ＳＩＲＴ１タンパク質量を増加させた。
（Ｃ）ＮＡＤ＋量増加作用（ｉｎ　ｖｉｖｏ）：
　上記（２）の評価試験用動物を用いて上記（１）（ａ）で調製した試料を単回経口投与した１８０分後に大脳皮質を摘出した。また、上記（２）の評価試験用動物を用いて上記（１）（ａ）で調製した試料を餌に混ぜ、１カ月間摂餌した後、大脳皮質を摘出した。大脳皮質中のＮＡＤ＋量は同仁化学研究所製ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔを用いて測定した。結果を図３に示す。Ｓ－１－プロペニルシステインは、ＮＡＤ＋量を増加させた。
（５）海馬における細胞老化マーカーｐ５３タンパク質発現抑制作用（ｉｎ　ｖｉｖｏ）：
　上記（２）の評価試験用動物を用いて上記（１）（ａ）で調製した試料を６週間反復経口投与した後、海馬を摘出した。海馬は組織自動破砕機を用いて破砕後にロシュ社製のプロテアーゼ阻害剤及びホスファターゼ阻害剤を添加した精製水で１０倍に希釈したミリポア社製のＲＩＰＡ細胞溶解用緩衝液により細胞を溶解した後、遠心（１００００ｒｐｍ、１０分、４℃）し、上清を細胞抽出液とした。この細胞抽出液を用いて定法に従いウエスタンブロッティング法により解析した。抗体は、抗ｐ５３抗体（プロテインテック社製）、及び抗β－アクチン抗体（医学生物学研究所製）を用いた。結果を図４に示す。Ｓ－１－プロペニルシステインは、ｐ５３タンパク質量を減少させた。
（６）腎臓におけるＳＩＲＴ１及びクロトー遺伝子発現増強作用（ｉｎ　ｖｉｖｏ）：
　上記（２）の評価試験用動物を用いて上記（１）（ａ）で調製した試料を２週間反復経口投与した後、腎臓を摘出した。腎臓は組織自動破砕機を用いて破砕後にサーモフィッシャーサイエンティフィック社製のＴＲＩｚｏｌ溶液を用いてＲＮＡを抽出した。ＴＡＫＡＲＡ社製のＰＲＩＭＥＳｃｒｉｐｔ　ＲＴ　ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔ　ｗｉｔｈ　ｇＥｒａｓｅｒを用いて、ｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡを日本ジェネティクス社製のＫＡＰＡ　ＳＹＢＲ　Ｆａｓｔ　ｑＰＣＲキットを用いてＲｅａｌ－Ｔｉｍｅ　ＰＣＲを行った。結果を図５に示す。Ｓ－１－プロペニルシステインは、マウス腎臓においてＳＩＲＴ１及びクロトー遺伝子の発現を増加させた。
（７）腎臓における老化細胞マーカーｐ１６及びｐ２１遺伝子発現抑制作用（ｉｎ　ｖｉｖｏ）：
　上記（２）の評価試験用動物を用いて上記（１）（ａ）で調製した試料を２週間反復経口投与した後、腎臓を摘出した。腎臓は組織自動破砕機を用いて破砕後にサーモフィッシャーサイエンティフィック社製のＴＲＩｚｏｌ溶液を用いてＲＮＡを抽出した。
　ＴＡＫＡＲＡ社製のＰＲＩＭＥＳｃｒｉｐｔ　ＲＴ　ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔ　ｗｉｔｈ　ｇＥｒａｓｅｒを用いて、ｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡを日本ジェネティクス社製のＫＡＰＡ　ＳＹＢＲ　Ｆａｓｔ　ｑＰＣＲキットを用いてＲｅａｌ－Ｔｉｍｅ　ＰＣＲを行った。結果を図６に示す。Ｓ－１－プロペニルシステインは、老化促進マウスの腎臓においてｐ１６及びｐ２１遺伝子発現した細胞を減少させた。
（８）腎障害抑制作用（ｉｎ　ｖｉｖｏ）
　上記（２）の評価試験用動物を用いて上記（１）（ａ）で調製した試料を２週間反復経口投与した後、腎臓を摘出した。腎臓は組織自動破砕機を用いて破砕後にロシュ社製のプロテアーゼ阻害剤及びホスファターゼ阻害剤を添加した精製水で１０倍に希釈したミリポア社製のＲＩＰＡ細胞溶解用緩衝液により細胞を溶解した後、遠心（１００００ｒｐｍ、１０分、４℃）し、上清を細胞抽出液とした。この細胞抽出液を用いて定法に従いウエスタンブロッティング法により解析した。抗体は、腎障害のマーカーである腎臓障害分子（ＫＩＭ－１）抗体（Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍ社製）及びリポカリンー２（ＮＧＡＬ）抗体（プロテインテック社製）、及び抗ＧＡＰＤＨ抗体（富士フィルム和光純薬社製）を用いた。結果を図７に示す。Ｓ－１－プロペニルシステインは、ＫＩＭ－１及びＮＧＡＬを低下させた。
（９）認知・記憶維持作用（ｉｎ　ｖｉｖｏ）：
　上記（２）の評価試験用動物を用いて上記（１）（ａ）で調製した試料を餌に混ぜ、４カ月間摂餌した後、受動回避試験を行った。受動回避試験はマウスが暗い場所を好む習性を利用した試験で、初日に、明室に入れたマウスが暗室に移動すると電気刺激を受ける（５０Ｖ・１秒間）暗室に移動するまでの時間を獲得試行の反応潜時とした。２か月後、再びマウスを明室に入れ、暗室への移動時間（保持試行の反応潜時）を記憶の指標とする評価方法である。結果を図８に示す。Ｓ－１－プロペニルシステインは加齢による認知・記憶機能低下を改善した。

Claims (26)

  1. 　Ｓ－１－プロペニルシステイン又はその塩を有効成分とするサーチュイン又はクロトーの活性化又は発現増強剤。
  2. 　Ｓ－１－プロペニルシステイン又はその塩を含有し、動物に投与されて、サーチュイン又はクロトーの活性化又は発現増強に用いられる剤。
  3. 　Ｓ－１－プロペニルシステイン又はその塩を有効成分とするＮＡＤ＋増加剤。
  4. 　Ｓ－１－プロペニルシステイン又はその塩を含有し、動物に投与されるＮＡＤ＋増加剤。
  5. 　Ｓ－１－プロペニルシステイン又はその塩を有効成分とする老化細胞抑制剤。
  6. 　Ｓ－１－プロペニルシステイン又はその塩を含有し、動物に投与される、非がん細胞の老化細胞抑制剤。
  7. 　ｐ１６、ｐ２１又はｐ５３の発現細胞を抑制する、請求項５又は６記載の老化細胞抑制剤。
  8. 　腎臓、及び脳からなる群より選ばれる１種以上の器官に作用させるための請求項１～７のいずれか１項記載の剤。
  9. 　食品添加剤又は食品の形態である、請求項１～８のいずれか１項記載の剤。
  10. 　サーチュイン又はクロトーの低活性又は低発現に起因する症状、又は老化細胞の蓄積に起因する症状の予防、治療又は改善のために用いられる、請求項１～９のいずれか１項記載の剤。
  11. 　腎障害、及び認知／記憶障害から選ばれる症状若しくは疾患の予防、治療又は改善のために用いられる請求項１～１０のいずれか１項記載の剤。
  12. 　サーチュイン又はクロトーの活性化又は発現増強剤を製造するための、Ｓ－１－プロペニルシステイン又はその塩の使用。
  13. 　動物に投与されて、サーチュイン又はクロトーの活性化又は発現増強に用いられる剤を製造するための、Ｓ－１－プロペニルシステイン又はその塩の使用。
  14. 　ＮＡＤ＋増加剤を製造するための、Ｓ－１－プロペニルシステイン又はその塩の使用。
  15. 　動物に投与されるＮＡＤ＋増加剤を製造するための、Ｓ－１－プロペニルシステイン又はその塩の使用。
  16. 　老化細胞抑制剤を製造するための、Ｓ－１－プロペニルシステイン又はその塩の使用。
  17. 　動物に投与される、非がん細胞の老化細胞抑制剤を製造するための、Ｓ－１－プロペニルシステイン又はその塩の使用。
  18. 　サーチュイン又はクロトーの活性化又は発現増強に使用するための、Ｓ－１－プロペニルシステイン又はその塩。
  19. 　動物に投与されて、サーチュイン又はクロトーの活性化又は発現増強に用いられる、Ｓ－１－プロペニルシステイン又はその塩。
  20. 　ＮＡＤ＋増加に使用するための、Ｓ－１－プロペニルシステイン又はその塩。
  21. 　動物に投与されて、ＮＡＤ＋増加に使用するための、Ｓ－１－プロペニルシステイン又はその塩。
  22. 　老化細胞抑制に使用するための、Ｓ－１－プロペニルシステイン又はその塩。
  23. 　動物に投与されて、非がん細胞の老化細胞抑制に使用するための、Ｓ－１－プロペニルシステイン又はその塩。
  24. 　Ｓ－１－プロペニルシステイン又はその塩を、それを必要とする動物に投与する、サーチュイン又はクロトーの活性化又は発現増強方法。
  25. 　Ｓ－１－プロペニルシステイン又はその塩を、それを必要とする動物に投与する、ＮＡＤ＋増加方法。
  26. 　Ｓ－１－プロペニルシステイン又はその塩を、それを必要とする動物に投与する、非がん細胞の老化細胞抑制方法。
PCT/JP2022/017713 2021-04-13 2022-04-13 サーチュイン又はクロトー活性化又は発現増強剤、ｎａｄ＋増加剤、及び老化細胞抑制剤 Ceased WO2022220265A1 (ja)

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