WO2022250165A1 - 藻類を培養するための組成物および藻類の培養方法 - Google Patents

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culturing
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達也 清水
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    • A01G33/00—Cultivation of seaweed or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/70—Undefined extracts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/89—Algae ; Processes using algae

Definitions

  • the present invention relates to a composition for culturing algae and a method for culturing algae.
  • the present invention also provides a recycling culture method for algae and animal cells.
  • the Food and Agriculture Organization predicts that the demand for meat will increase by 100% between 1999 and 2050 due to the global population explosion. This demand raises concerns about global food shortages and rising food costs. Furthermore, it is expected that there will be a shortage of protein supply leading to a global "protein crisis”.
  • cultured foods are considered one way to solve these global food-related problems, and the production of cultured foods is considered environmentally friendly (Non-Patent Documents 1, 2).
  • cultured foods refer to the in vitro cultivation of animal cells in a medium of defined composition followed by processing of the animal cells to produce a protein-rich food alternative to meat.
  • the greatest advantage of cultured foods is their high efficiency in nutrient production.
  • the protein content of cultured mammalian cells is approximately 75% (dry weight), which is higher than the protein content of animal muscle tissue (43% dry weight).
  • the social implementation of cultured foods is expected to substantially reduce the environmental burden from the livestock industry.
  • Non-Patent Document 2 The global cultured food market in 2040 is estimated to exceed US$600 billion.
  • the high demand for cultured food necessitates the consumption of huge amounts of media by large-scale production of animal cells.
  • Approximately 5 ⁇ 10 10 cells and 50 L of culture medium are required per 1 kg of cultured food produced (Non-Patent Document 2). Therefore, as the consumption of cultured food increases, the production of the cultured food is expected to increase as well.
  • Waste media containing nitrogen- and phosphorus-containing nutrients can lead to eutrophication of water bodies.
  • the eutrophication resulting from cultured food production is assumed to be equivalent to that resulting from poultry production.
  • Microalgae that grow in freshwater, seawater, or both.
  • Microalgae such as Chlorococcums and Chlorellas are used in the production of petroleum alternatives/biodiesel, bioethanol, fine chemicals, biopharmaceuticals, edible vaccines, and hydrogen (Non-Patent Documents 3-9).
  • Chlorococcum littorale which has extremely high CO 2 tolerance, is expected to be used for effective fixation of CO 2 (Non-Patent Documents 10-12).
  • active research is being conducted on microalgae/microbial fuel cells that convert light energy into electricity through the metabolic reaction of microalgae.
  • microalgae including Chlorella vulgaris
  • cyanobacteria Arthorospira and the green microalgae Chlorella are cultivated for the production of health foods (dry weight: 3,000 t and 2,000 t respectively).
  • Microalgae culture requires large amounts of media containing inorganic salts, including nitrogen and phosphorus containing compounds. Reportedly, C.I. Microalgae, including vulgaris, can prevent eutrophication of water bodies caused by domestic, agricultural, and industrial wastewaters (13-15).
  • Dialysis drainage generated by peritoneal dialysis is known as one type of drainage.
  • Peritoneal dialysis is a convenient, less restrictive, and beneficial treatment that allows patients with chronic renal failure to self-manage by exchanging dialysate at home or at work.
  • a large amount of dialysis wastewater is generated during peritoneal dialysis, and its disposal has been a problem.
  • a method of using them for culturing Euglenoid algae has been reported (Patent Document 1).
  • the purpose of the present invention is to establish a new method to reduce the environmental load and the risk of environmental change caused by discarded animal cell culture medium.
  • microalgae for various purposes has been previously reported, but it is unknown to use microalgae to treat media after culturing animal cells.
  • the present inventors discovered that waste medium discharged after culturing animal cells can be used for culturing microalgae, and have completed the present invention. That is, the present invention includes the following aspects.
  • a method for culturing algae wherein a composition containing cultured animal cells is used as a culture medium.
  • the method according to Item 1 wherein the animal cell is a vertebrate cell.
  • the method according to item 1 or 2 wherein the animal cells are muscle or liver cells.
  • the method according to any one of items 1 to 3 wherein the algae are microalgae.
  • the method according to any one of items 1 to 4 wherein the algae are marine and/or broadhaline microalgae.
  • a composition for culturing algae containing a culture medium after culturing animal cells.
  • the composition according to item 13, wherein the animal cell is a vertebrate cell.
  • the composition according to item 13 or 14, wherein the animal cells are muscle or liver cells.
  • composition according to any one of items 13 to 18, wherein the osmotic pressure of the composition is adjusted to be equal to or within ⁇ 10% of the osmotic pressure of a standard medium for algae culture. thing.
  • the inorganic salts are one or more selected from the group consisting of sodium salts, potassium salts, magnesium salts, and calcium salts.
  • the concentration of ammonia in the composition is 0.5 mM or higher.
  • animal cells produced in large quantities in the animal cell culturing process in the fields of regenerative medicine or biopharmaceuticals, and the field of cultured foods, which is expected to expand in the future, are cultured.
  • the discarded medium after the treatment can be utilized for culturing algae (for example, microalgae).
  • culturing algae for example, microalgae
  • Nutrients (a: glucose; b: glutamine; c: total amount of all 14 amino acids excluding glutamine contained in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM); d: pyruvic acid), vitamins (e: vitamins B1, B2, B6 , total amount of folic acid), and inorganic salts (f: sodium; g: potassium; h: calcium; i: magnesium; j: phosphorus; k: ammonia) in C2C12 myoblasts without (-) or with (+ ) in DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum and 1% penicillin/streptomycin and analyzed after 3 days of culture.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • FIG. 2 shows the variation of nitrogen- and phosphorus-containing compounds and inorganic salts in media in which microalgae were cultured.
  • Ammonia (a) and phosphorus (b), sodium in the medium when cultured without microalgae (-) or with microalgae (+) using waste medium after culturing C2C12 myoblasts for 3 days (c), showing variations in potassium (d), calcium (e), and magnesium (f). Data are shown as mean ⁇ standard deviation (n 4).
  • Cell growth of Chlorella vulgaris (ai) in either microalgal standard media or animal cell culture waste media. Chlorella vulgaris was cultured for 7 days in either microalgal standard medium or discarded medium after 3 days of C2C12 myoblast culture. Data are shown as mean ⁇ standard deviation (n 4).
  • Waste medium was used undiluted (100% waste medium, micrograph: a-ii) or diluted 1/10 with pure water (10% waste medium, a-iii). Scale bar: 50 ⁇ m.
  • Microalgae Media Cell growth of Chlorococcum littorale (bi) in either microalgae standard media or animal cell culture waste media. Chlorococcum littorale was cultured for 7 days in either standard microalgal medium or in discarded medium after 3 days of culture of C2C12 myoblasts. Data are shown as mean ⁇ standard deviation (n 4).
  • FIG. 5 shows the results of culturing algae (Synechococcus) using the animal cell discarded medium.
  • FIG. 6 shows the result (micrograph) of culturing algae (Synechococcus) using the animal cell discarded medium.
  • FIG. 7 shows the results of culturing animal cells using algae extracts extracted from algae cultured using animal cell waste media.
  • the present invention provides a composition for culturing algae containing a medium after culturing animal cells. Moreover, in one embodiment, the present invention provides a method for culturing algae using as a medium a composition containing a medium after culturing animal cells. In one embodiment, the present invention also provides methods for recycling algae and animal cells. According to the present invention, the medium after culturing animal cells that have been produced in large amounts in the animal cell culture process in the field of regenerative medicine or biopharmaceuticals and the field of cultured foods and had to be discarded is algae (e.g., Microalgae) can be utilized for culturing. This contributes to the reduction of environmental load.
  • algae e.g., Microalgae
  • the medium for animal cells before culturing animal cells that can be applied to the present invention is not limited as long as it is known, but examples include Eagle's medium, Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), DMEM: F12 medium, Glasgow minimum essential medium, Grace's insect medium, Ham medium, Iscove's modified Eagle medium, RPMI-1640 medium, L-15 medium, McCoy's 5A medium, M199 medium, etc., and a medium capable of culturing animal cells. can be used if
  • animal cells refer to cells of vertebrates (mammals (also referred to as “mammals”), birds, amphibians, reptiles or fish), or invertebrates (e.g., sea squirts, arthropods (crustaceans) (e.g., shrimp, crab, etc.), insects, etc.), echinoderms (e.g., sea urchin, sea cucumber, starfish, etc.), mollusks (e.g., shellfish, squid, octopus, etc.), etc.).
  • vertebrates mamammals
  • invertebrates e.g., sea squirts, arthropods (crustaceans) (e.g., shrimp, crab, etc.), insects, etc.
  • echinoderms e.g., sea urchin, sea cucumber, starfish, etc.
  • mollusks e.g., shellfish, squid, octopus, etc
  • the animal cell is a mammal such as a vertebrate (e.g., human, monkey, bovine, whale, bear, deer, horse, pig, boar, sheep, rabbit, rat, mouse, hamster, goat, dog, or cat).
  • a vertebrate e.g., human, monkey, bovine, whale, bear, deer, horse, pig, boar, sheep, rabbit, rat, mouse, hamster, goat, dog, or cat.
  • Animals birds such as chickens, ducks, geese, quails, ducks, pheasants, amphibians such as frogs, salamanders, newts, reptiles such as crocodiles, lizards, snakes, turtles, soft-shelled turtles, tuna, salmon, trout, carp, sharks, eels , puffer fish) cells, invertebrates (e.g., sea squirts, arthropods (crustaceans (e.g., shrimp, crabs, etc.), insects, etc.), echinoderms (sea urchins, sea cucumbers, starfish, etc.), mollusks (e.g., shellfish, squid, octopus, etc.)) cells, or primary cells, established cells, pluripotent stem cells derived therefrom (e.g., ES cells, ntES cells, Muse cells, iPS cells), or tissue stem cells
  • animal cells in living tissue is, for example, muscle system (e.g., myoblasts), skin system (e.g., fibroblasts, keratinocytes), liver system (e.g., hepatocytes), renal system (e.g., kidney cells (e.g., HEK293)), cardiac system (e.g., cardiomyocytes), digestive system (e.g., oral mucosal cells, intestinal epithelial cells, parietal cells), hematopoietic system (e.g., hematopoietic stem cells), reproductive tissue system (e.g., , ovarian cells (e.g., CHO cells), sperm cells, uterine epithelial cells), mucosal cells (e.g., epithelial cells), bone tissue systems (e.g., osteoblasts, chondrocytes), and the like. It may be derived from tissue.
  • muscle system e.g., myoblasts
  • skin system e.g
  • the method for culturing animal cells to supply the waste medium applicable to the present invention is not particularly limited and may follow a known culture method (eg, 37° C., saturated steam, 5% CO 2 humidified atmosphere).
  • algae is a general term for organisms that produce oxygen through photosynthesis, excluding bryophytes, fern plants, and seed plants that live mainly on the ground. If the environment necessary for photosynthesis is prepared, algae can produce oxygen and nutrients (for example, glucose and amino acids) by themselves and grow.
  • algae to which the present invention can be applied may be "microalgae (also referred to as "unicellular algae”).
  • microalgae refers to algae, among algae, in which individuals consist of a single cell, and a plurality of microalgae individuals gather to form colonies.
  • narrow-haline or broad-haline microalgae For example, green algae with chlorophyll a and b as main pigments in chloroplasts, unicellular cyanobacteria with chlorophyll d as main pigments, and unicellular red algae with chlorophyll a and phycobilin protein as main pigments.
  • microalgae examples include: To give a more detailed example, in green algae, Chlamydomonas reinhardtii (Japanese name: Chlamydomonas) (freshwater) of the order Chlamydomonas order, and Dunaliella salina (Japanese name: Donaliella salina) of the order Donaliella ) (marine), Volvox carteri (Japanese name: Volvox) (freshwater), Chlorococcum littorale (marine), Chlorococcum littorale (marine), Hydrodictyon reticulatum) (Japanese name: Amimidoro) (produced in freshwater), Pediastrum duplex (Japanese name: Kunshoumo) (produced in freshwater), Scenedesmus dimorphus (Japanese name: Ikadamo) (produced in freshwater) ), Chlorella sp.
  • Chlorella of the order Trebouxia algal order Chlorella (for example, Chlorella vulgaris (freshwater), Chlorella pyrenoidosa (freshwater), Chlorella ⁇ Elpsoidea (Chlorella ellipsoidea) (freshwater), Chlorella regularis (freshwater)), Euglena gracilis and Euglena proxima ( Japanese name: euglena (freshwater), etc.
  • Chlorella of the order Trebouxia algal order Chlorella
  • Chlorella vulgaris freshwater
  • Chlorella pyrenoidosa freshwater
  • Chlorella ⁇ Elpsoidea Chlorella ellipsoidea
  • Chlorella regularis freshwater
  • Euglena gracilis Japanese name: euglena (freshwater)
  • Japanese name: euglena (freshwater) Japanese name: euglena (freshwater), etc.
  • the Cyanobacteria phylum Acaryochloris marina marine
  • Cyanidium caldarium (Freshwater) of Cyanidium caldarium (Freshwater) of the order Rhophyta or Galdieria partita ( freshwater) and the like.
  • unicellular charophytes include the genus Stichococcus (Freshwater) of the order Charophyta Krebsormedium of the phylum Chlorophyta.
  • Filamentous-ulvophyte which is a unicellular Algae of Ulva Algae.
  • the algae to which the present invention can be applied may be the algae mentioned above, genetically modified organisms thereof, or algae other than the above.
  • algae to which the present invention can be applied may be freshwater or marine, and/or narrow- or broad-haline microalgae, but preferably marine and/or broad-haline microalgae. , for example, Chlorococcum littorale, Synechococcus algae, etc., but not limited thereto.
  • Algae to which the present invention can be applied may be natural algae or algae grown by a known culture method.
  • a composition containing a culture medium for animal cells used for culturing algae may optionally be a standard medium normally used for culturing the algae of interest, such as a medium for freshwater algae.
  • a standard medium normally used for culturing the algae of interest such as a medium for freshwater algae.
  • medium AF6 medium, C medium, URO medium, VT medium, etc.
  • an osmotic pressure equal to or ⁇ 10% (preferably ⁇ 5%, more preferably ⁇ 3%) as the osmotic pressure of the standard microalgae medium can be used.
  • the osmotic pressure is adjusted by measuring the osmotic pressure by a known method before culturing the algae, and if necessary, for example, the osmotic pressure of the standard medium normally used for culturing the algae of interest ⁇ 10% (preferably ⁇ 5%, more preferably ⁇ 3%), it may be adjusted.
  • the osmotic pressure value is monitored during the cultivation of the algae, and if necessary, for example, the osmotic pressure of the standard medium normally used for culturing the algae of interest ⁇ 10% (preferably ⁇ 5%, more preferably is outside the range of ⁇ 3%), it may be adjusted. This can further enhance the algae growth effect.
  • the method of adjusting the osmotic pressure may be according to a known method, and when the osmotic pressure is high, for example, dilute with a hypotonic medium such as water (e.g., distilled water, ion-exchanged water, sterilized water), or If the osmotic pressure is low, sodium salts (e.g., sodium chloride, sodium hydroxide, sodium carbonate, etc.), potassium salts (e.g., potassium chloride, potassium carbonate, potassium hydrogen carbonate, potassium phosphate, etc.), magnesium salts (e.g., Magnesium chloride, magnesium oxide, etc.) and/or calcium salts (eg, calcium chloride, calcium carbonate, calcium hydroxide, etc.) may be added to adjust the osmotic pressure. For example, when the target algae to be cultured is Chlorococcum littorale, the osmotic pressure of the resulting composition is may be adjusted.
  • a hypotonic medium such as water (e.
  • the composition provided by the present invention is for culturing microalgae, for example, freshwater or marine, or narrow- or broad-halal microalgae.
  • the microalgae to which the present invention can be applied are preferably marine and/or broadhaline microalgae, such as Chlorococcum littorale and Synechococcus sp.
  • Algae culture conditions depend on the type of algae to be cultured, and the temperature is 5 to 40° C., preferably 10 to 35° C., more preferably 10 to 30° C., usually for 1 to 10 days, preferably 3 to 7 days.
  • the culture is carried out for a day and can be carried out by aeration or anaerobic stirring culture, shaking culture or static culture.
  • the concentration of ammonia in the composition used for culturing algae is 0.5 mM or higher, which enables efficient culturing of algae using ammonia as a nitrogen source.
  • the upper limit of the concentration of ammonia in the composition used for culturing algae is not particularly limited, since it contains a culture medium after culturing animal cells, it can be provided at a concentration that allows culturing of animal cells.
  • the concentration of ammonia in compositions used to culture algae can be provided, for example, from 0.5 mM to 10 mM, from 0.5 mM to 5 mM, from 0.5 mM to 3 mM.
  • Ammonia can be a source of nitrogen in the cultivation of algae, so if consumed by the cultivation, ammonia may be added as a nitrogen source, and alternatively or additionally nitrates may be added.
  • the present invention can provide recycling culture methods for algae and animal cells.
  • the method is (1) recovering the algae cultured by the method described in (1) above; (2) degrading the algae to obtain an algae extract; and (3) culturing animal cells using an animal cell culture medium containing the algae extract.
  • the step (2) is, for example, referring to the method described in WO 2021/066113 and obtaining an algal extract from algae by performing some or all of the steps described therein.
  • only acid hydrolysis treatment may be performed, only alkaline hydrolysis treatment may be performed, or both acid hydrolysis treatment and alkaline hydrolysis treatment are performed to obtain the algae extract.
  • acid hydrolysis treatment and alkali hydrolysis treatment are carried out, the acid hydrolysis treatment may be followed by alkali hydrolysis treatment, or the alkali hydrolysis treatment may be followed by acid hydrolysis treatment.
  • a neutralization treatment may be performed between the acid hydrolysis treatment and the alkaline hydrolysis treatment.
  • the algae used in the above step (2a-1) may be subjected to drying treatment before being subjected to acid hydrolysis treatment and/or alkaline hydrolysis treatment.
  • the hydrolyzate is neutralized by performing the step of neutralizing the hydrolyzate obtained in the above step (2-1) (step (2-2)), and the cell culture An algae extract is obtained which can be used for
  • a basic substance or an aqueous solution thereof e.g., sodium hydroxide, potassium hydroxide or an aqueous solution thereof
  • an acidic substance e.g., sodium hydroxide, potassium hydroxide, etc.
  • an aqueous solution thereof hydroochloric acid, sulfuric acid, trifluoroacetic acid, p - toluenesulfonic acid, methanesulfonic acid, etc.
  • the step of (2) decomposing the algae to obtain an algal extract may be (2b) decomposing the algae with ultrasonic waves to obtain an algal extract.
  • a known method may be used, for example, Prabakaran et al. 53(2) 150-154 (2011)).
  • an algal extract can be obtained by crushing algae on ice for 10 minutes at 200 W using a known ultrasonicator (eg, Bioruptor UCD-200TM (Cosmo Bio, Japan)).
  • the step (2) above may be a combination of (2b) and (2a-1) and (2a-2) above.
  • step (2) above may be carried out under pressure.
  • under pressure refers to atmospheric pressure, that is, pressure conditions higher than 1 atmosphere, for example, 1.1 atmosphere or more, 1.5 atmosphere or more, 1.8 atmosphere or more, or 2 atmosphere or more may be implemented in For example, it may be 1.1 to 300 atmospheres, 1.5 to 200 atmospheres, 1.8 to 100 atmospheres, 2 to 50 atmospheres, such as 2 to 20 atmospheres.
  • Pressurization conditions may be implemented by any device or method, and for example, pressurization conditions can be achieved by using an autoclave.
  • Example 1 Materials and methods 1-1. Animal Myoblast Culture C2C12 mouse myoblasts (ATCC® CRL-1772TM) were cultured in 10% fetal bovine serum (FBS, Thermo Fisher Scientific, MA, USA) and 1% penicillin/streptomycin ( PS, Invitrogen, Carlsbad, Calif., USA) supplemented with DMEM (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo., USA) at 37° C. in a humidified atmosphere containing 5% CO 2 37 . 2 ⁇ 10 5 C2C12 cells were seeded in 100 mm culture dishes (Greiner Bio-One, Kremsmunster, Austria), cultured overnight and the spent medium was replaced with 10 ml fresh medium. After 3 days of culture, medium with/without cells was harvested. After centrifugation (1,700 ⁇ g, 5 min), each factor in the collected culture supernatant (waste medium) was outsourced for further analysis (SRL, Tokyo, Japan) (Table 1).
  • FBS fetal bovine
  • Daigo IMK medium manufactured by Nihon Pharmaceutical (Tokyo, Japan); sold by FUJIFILM Wako Pure Chemical (Osaka, Japan)
  • Daigo Artificial Seawater SP manufactured by Nihon Pharmaceutical (Tokyo, Japan); sold by FUJIFILM Wako Pure Chemical ( Osaka, Japan)
  • PPFD photosynthetic photon flux density
  • a microalgae standard medium is a medium commonly used for culturing the algae of interest. For example, in the above case, a mixture of C medium, Daigo IMK medium and Daigo artificial seawater SP corresponds.
  • the medium was recovered by centrifugation (1,700 xg, 5 minutes) and each factor in the culture supernatant was analyzed (Table 1). Nitrate was detected using a nitrate meter (LAQUAtwin, AS ONE Co., Ltd., Osaka, Japan).
  • C.I. C medium was used as the microalgae standard medium for Vulgaris.
  • C.I. The mixture of Daigo IMK medium and Daigo artificial seawater SP used above as the littorale microalgae standard medium is Daigo artificial seawater SP (Fujifilm Wako Pure Chemical (Osaka, Japan), product code: 395-01343) 36 g, Daigo IMK medium (Fujifilm Wako Pure Chemical (Osaka, Japan), product code: 392-01331) was prepared by dissolving 252 mg in 1 L of Milli-Q water and autoclaving.
  • Factor consumption was calculated by dividing the value after culturing without myoblasts/microalgae by the value after culturing with myoblasts/microalgae. Pure water (Merck Millipore, Burlington, MA, USA) or sodium chloride (Fujifilm Wako Pure Chemical Co., Ltd., Osaka, Japan), magnesium chloride ( Fuji Film Wako Pure Chemical) and calcium chloride (Fuji Film Wako Pure Chemical Co., Ltd., Osaka, Japan) were used, respectively.
  • C.I. littorale or C.I. vulgaris was seeded at 5 ⁇ 10 6 in 35 mm culture dishes (Greiner Bio-One) and the microalgae were cultured for 7 days at 30° C. in a humidified atmosphere containing 5% CO 2 as described above.
  • each microalgae standard medium or the discarded medium after culturing C2C12 cells for 3 days was used.
  • the microalgae concentration was measured with a hemocytometer (Waken Bee Tech Co., Ltd., Kyoto, Japan), and the medium volume was measured using a micropipette (MS Equipment Co., Ltd., Osaka, Japan). Cell numbers were calculated based on cell concentration and medium volume.
  • Microalgae images were recorded by microscope (ECLIPSE TS2, Nikon, Tokyo, Japan) using NIS-Elements BR software (Nikon).
  • Microalgae Cultivation Microalgae were cultured in normal medium for 3 days and analyzed for variation of factors in the medium. Microalgae contain ammonia (C. vulgaris: 39%; C. littorale: 100%) (Fig. 2a), phosphorus (C. vulgaris: 100%; C. littorale: 100%) (Fig. 2b), nitrates (C. vulgaris: 67%; C. littorale: 17%) (Fig. 2c). However, negligible changes occurred in the amounts of sodium (Fig. 2d), potassium (Fig. 2e), calcium (Fig. 2f), and magnesium (Fig. 2g).
  • C. littorale is C.I. Ingested more ammonia than C. vulgaris (C. littorale; 80%, C. vulgaris; 26%). Both microalgae consumed phosphorus (C. littorale; 16%, C. vulgaris; 15%).
  • sodium (Fig. 3c), potassium (Fig. 3d) and calcium (Fig. 3e) levels changed little, and magnesium levels were lower than C.I. Although it increased in the case of littorale, C.I. There was little change in the case of vulgaris (Fig. 3f).
  • littorale grew 6.8-fold in the microalgae standard medium, but further grew 2.2-fold in the discarded medium after 7 days of culture (Fig. 4-2).
  • C. Sodium, magnesium and calcium concentrations in the medium of littorale were significantly higher than those in the waste medium (FIGS. 1 and 2), so sodium chloride, magnesium chloride and calcium chloride were added to adjust the concentrations.
  • the final osmotic pressure of the discarded medium was approximately equal to that of the microalgal standard medium (Table 2).
  • C. littorale cell proliferation was enhanced 3.2-fold by adjusting the salt concentration of the discarded medium (Fig. 4-2).
  • littorale prefers ammonia as a nitrogen source
  • C. littorale prefers ammonia as a nitrogen source
  • vulgaris is thought to be due to the fact that it prefers nitrates.
  • Ammonia is the major nitrogen source in cultured cell waste media; littorale in discarded medium. It grows faster than C. vulgaris and also C. vulgaris. This may be one reason why the growth of L. littorale was slower in waste media than in normal microalgae standard media (Fig. 4-2). Both post-myoblast culture waste media and microalgae standard media contained ammonia and phosphorus, but only microalgae standard media contained nitrates (FIGS. 2 and 3). C.
  • littorale's standard medium contains significantly more nitrate than ammonia (Figs. 2a and 2c).
  • the amount of ammonia contained in the waste medium may not be sufficient for high density and long-term cultivation of microalgae for more than a week.
  • Optimization of medium components and selection of microalgal strains, such as brackish water-derived microalgae 28 , ammonia-preferring microalgae or microalgae capable of fixing nitrogen 29 are topics of future research.
  • Establishment of microalgae culture system by using waste medium from animal cell culture is caused by (1) preservation of fresh water and inorganic salts including ammonia and phosphorus in microalgae culture, and (2) disposal of waste medium. Contributes to the prevention of eutrophication of water bodies.
  • Glucose is the primary carbon source for cell biosynthesis and energy production and is essential for cell culture 30 .
  • Glutamine constitutes approximately 5% of all amino acid residues in the human proteome 31 .
  • glutamine is closely associated with the biosynthesis of non-essential amino acids and purine and pyrimidine base -31 .
  • glutamine serves as a biosynthetic precursor for the tricarboxylic acid (TCA) cycle.
  • TCA tricarboxylic acid
  • C2C12 myoblasts prefer glucose over pyruvate, in contrast to primary bovine muscle tissue-derived cells, which prefer both glucose and pyruvate. Since essential nutrients are highly cell-type dependent, media preparation by cell-type metabolism provides a more efficient cultured food production system. Additionally, recycling of glucose, pyruvate, amino acids, vitamins, and mineral salts in the waste medium is required.
  • microalgae synthesize nutrients most efficiently with little residue35 .
  • C.I. littorale and C.I. Although animal cell culture systems have been established using nutrients obtained from B. vulgaris, these do not compete with food production and efficiently synthesize the nutrients needed by animal cells 36 .
  • animal cells can grow using nutrients produced by microalgae, and microalgae can grow by recycling waste media from animal cell cultures.
  • C.I. Littorale is also expected to be efficient in immobilizing carbon dioxide gas discharged from thermal power plants and steel plants.
  • a recycling cell culture system using animal cells and microalgae would establish a sustainable energy, nutrition, environment and resource saving solution.
  • the waste medium used for culturing Synechococcus after culturing animal cells was prepared in the same manner as in Example 1.
  • Fig. 5 shows the results of microalgae observation after 7 days of culturing, showing the culture density of microalgae and the morphology and appearance of cells in both cases of culturing using waste medium after culturing animal cells and culturing using microalgae standard medium. This indicates that no change was observed in .
  • Example 3 The RL34 mouse hepatocyte line and the bovine muscle tissue-derived cells were cultured for 3 days under the same conditions as in Example 1. littorale was cultured and could be cultured with any of the discarded media.
  • Nutrients were extracted from algae (C. littorale) cultured for 7 days in a waste medium of animal muscle cells (C2C12 cells) by acid treatment (0.5N HCl, 100°C, 24 hours treatment). After acid treatment, neutralization with NaOH (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan) followed by centrifugation (12,500 ⁇ g, 5 minutes) and the supernatant was used as an algae extract.
  • Each nutritional component of the algae extract and the animal cell basal medium was extracted by the following method: - Glucose analysis method: Hexokinase method ⁇ Amino acid analysis method: Liquid chromatography-mass spectrometry (LCMS) were analyzed and compared.
  • - Glucose analysis method Hexokinase method
  • Amino acid analysis method Liquid chromatography-mass spectrometry (LCMS) were analyzed and compared.
  • Example 5 Cultivation of animal cells using nutrients (algae extract) extracted from algae cultured using animal cell waste medium (demonstration of recycling culture)
  • the inorganic salt medium of (2) above has the following composition.

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Abstract

本発明は、動物細胞の培養後の培地を含有する組成物を培地として用いる、藻類の培養方法を提供する。また、本発明は、動物細胞の培養後の培地を含有する藻類培養用の組成物を提供する。また、本発明は、藻類及び動物細胞のリサイクル培養方法を提供する。

Description

藻類を培養するための組成物および藻類の培養方法
　本発明は、藻類を培養するための組成物および藻類の培養方法に関する。また、本発明は、藻類及び動物細胞のリサイクル培養方法を提供する。
　食糧農業機関（ＦＡＯ）は世界的な人口爆発のために、１９９９年から２０５０年の間に肉の需要が１００％増大すると予測している。この需要により、世界的な食料不足と食料コストの上昇が懸念されている。さらに、世界的な「タンパク質危機」につながるタンパク質供給の不足も起こることが予想されている。
　畜産業は地球規模の温室効果ガスの１８％を排出しており、これは運輸部門の排出量を上回っている。「培養食品」はこれらの地球規模の食品関連問題を解決する一つの方法であると考えられており、培養食品の製造は環境にやさしいと考えられている（非特許文献１、２）。簡単に言えば、培養食品とは、組成が明確な培地中で動物細胞をインビトロで培養した後に当該動物細胞に加工を加え、肉の代わりとしてタンパク質に富む食品を生産したものを意味する。培養食品の最大の利点は、栄養素製造におけるその高い効率である。例えば、培養哺乳動物細胞のタンパク質含量は約７５％（乾燥重量）であり、これは動物筋肉組織のタンパク質含量（４３％乾燥重量）よりも多い。培養食品の社会的な実施は、畜産業からの環境負荷を実質的に低減するものと考えられる。
　２０４０年の世界の培養食品マーケットは、６，０００億米ドルを超えるものと試算されている。培養食品に対する高い需要は、動物細胞の大規模生産により膨大な量の培地の消費を必要とする。生産される培養食品１ｋｇにつき、約５×１０１０個の細胞と５０Ｌの培養培地が必要である（非特許文献２）。従って、培養食品の消費量が増加することにつれて、その生産量も増加するものと考えられる。結果として、培養食品生産中に発生する大量の廃棄培地は避けられない課題である。窒素およびリン含有栄養素を含有する廃棄培地は、水体の富栄養化をもたらしかねない。培養食品生産に起因する富栄養化は、家禽生産に起因する富栄養化と同等であるものと推定される。
　淡水中、海水中、またはその両方で生育する様々な微細藻類が存在する。Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ類やＣｈｌｏｒｅｌｌａ類などの微細藻類は、石油代替／バイオディーゼル、バイオエタノール、ファインケミカルズ、バイオ医薬品、食用ワクチン、水素の製造に使用されている（非特許文献３～９）。さらに、極めて高いＣＯ２耐性を持つＣｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ　ｌｉｔｔｏｒａｌｅは、ＣＯ２の効果的な固定に使用されることが期待される（非特許文献１０～１２）。また、微細藻類の代謝反応により光エネルギーを電気に変換する微細藻類・微生物燃料電池の研究も積極的にされている。さらに、クロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ　ｖｕｌｇａｒｉｓ）を含む微細藻類は、栄養補助食品、ペットフード、および有機肥料として使用される。現在、大量のシアノバクテリアＡｒｔｈｏｒｏｓｐｉｒａおよび緑色微細藻類Ｃｈｌｏｒｅｌｌａが、健康食品の製造のために培養されている（乾燥重量：それぞれ３，０００ｔおよび２，０００ｔ）。微細藻類培養のためには、窒素およびリン含有化合物を含む無機塩を含有する大量の培地が必要である。報告によれば、Ｃ．　ｖｕｌｇａｒｉｓを含む微細藻類は、家庭、農業、および工業廃水によって引き起こされる水体の富栄養化を予防することができる（非特許文献１３～１５）。
　排水の一つに、腹膜透析を行うことで発生する透析排水が知られている。腹膜透析は、慢性腎不全の患者が、家庭や職場で透析液交換することによって患者自身の手で処置することのできる簡便で拘束の少ない利点の多い治療方法である。腹膜透析の際に出る透析排水は大量であり、その廃棄処理が課題となっていたところ、それらをユーグレナ藻類の培養に用いる方法について報告されている（特許文献１）
特許第６１２８５１０号
Tuomisto, H. L. & de Mattos, M. J. Environmental impacts of cultured meat production. Environ. Sci. Technol. 45, 6117-6123 (2011). Post, M.J. An alternative animal protein source: cultured beef. Ann. N Y Acad. Sci. 1328, 29-33 (2014). Ho, S.H. et al. Bioethanol production using carbohydrate-rich microalgae biomass as feedstock. Bioresour. Technol. 135, 191-198 (2013). Harun, R. et al. Algal biomass conversion to bioethanol - a step-by-step assessment. Biotechnol. J. 9, 73-86 (2014). Norsker, N. H., Barbosa, M. J., Vermue, M. H. & Wijffels, R. H. Microalgal production-a close look at the economics. Biotechnol. Adv. 29, 24-27 (2011). Rasala, B. A. et al. Production of therapeutic proteins in algae, analysis of expression of seven human proteins in the chloroplast of Chlamydomonas reinhardtii. Plant Biotechnol. J. 8, 719-733 (2010). Gregory, J. A., Topol, A. B., Doerner, D. Z. & Mayfield, S. Alga-produced cholera toxin-Pfs25 fusion proteins as oral vaccines. Appl. Environ. Microbiol. 79, 3917-3925 (2013). Specht, E. A. & Mayfield, S. P. Algae-based oral recombinant vaccines. Front. Microbiol. 5, 60 (2014). Osanai, T. et al. Pleiotropic effect of sigE over-expression on cell morphology, photosynthesis and hydrogen production in Synechocystis sp. PCC 6803. Plant J. 76, 456-465 (2013). Satoh, A., Kurano, N., Harayama, S. & Miyachi, S. Effects of chloramphenicol on photosynthesis, protein profiles and transketolase activity under extremely high CO2 concentration in an extremely-high-CO2-tolerant green microalga, Chlorococcum littorale. Plant Cell Physiol. 45, 1857-1862 (2004). Rossi, F., Olguin, E. J., Diels, L. & De Philippis, R. Microbial fixation of CO2 in water bodies and in drylands to combat climate change, soil loss and desertification. N. Biotechnol. 32, 109-120 (2015). Cheng, J., Zhu, Y., Zhang, Z. & Yang, W. Modification and improvement of microalgae strains for strengthening CO2 fixation from coal-fired flue gas in power plants. Bioresour. Technol. 291, 121850 (2019). Wang, L. et al. Culture of green algae Chlorella sp. in different wastewaters from municipal wastewater treatment plant. Appl. Biochem. Biotechnol. 162, 1174-1186 (2010). Chiu, S. Y. et al. Culture of microalgal Chlorella for biomass and lipid production using wastewater as nutrient resource. Bioresour. Technol. 184, 179-189 (2015). Wang, J. H. et al. Microalgae-based advanced municipal wastewater treatment for reuse in water bodies. Appl. Microbiol. Biotechnol. 101, 2659-2675 (2017).
　本発明は、動物細胞の廃棄培地による環境負荷と環境変化への影響のリスクを減らす、新たな方法を確立することを目的とする。
　様々な目的での微細藻類の使用は以前に報告されているが、動物細胞培養後の培地の処理に微細藻類を用いることは知られていない。本発明者らは、鋭意研究を行うことにより、動物細胞の培養後に排出される廃棄培地が、微細藻類の培養に用いられ得ることを発見し、本発明をするに至った。すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
　［１］　動物細胞の培養後の培地を含有する組成物を培地として用いる、藻類の培養方法。
　［２］　前記動物細胞が、脊椎動物の細胞である、項目１に記載の方法。
　［３］　前記動物細胞が、筋肉系又は肝臓系の細胞である、項目１または２に記載の方法。
　［４］　前記藻類が、微細藻類である、項目１～３のいずれか１項に記載の方法。
　［５］　前記藻類が、海産および／または広塩性の微細藻類である、項目１～４のいずれか１項に記載の方法。
　［６］　前記藻類が、クロロコックム・リトラレ（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ　ｌｉｔｔｏｒａｌｅ）またはシネココッカス属である、項目１～５のいずれか１項に記載の方法。
　［７］　前記組成物の浸透圧を、必要に応じて藻類培養用の標準培地の浸透圧と同等または±１０％の範囲の浸透圧に調節して用いる、項目１～６のいずれか１項に記載の方法。
　［８］　前記組成物に、さらに無機塩類を添加する、項目１～７のいずれか１項に記載の方法。
　［９］　前記無機塩類は、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、およびカルシウム塩からなる群より一つ以上選択される、項目８に記載の方法。
　［１０］　前記組成物におけるアンモニアの濃度を０．５ｍＭ以上とする、項目１～９のいずれか１項に記載の方法。
　［１１］　（１）項目１～１０のいずれか１項に記載の方法により培養した前記藻類を回収する工程、
　（２）前記藻類を分解処理し、藻類抽出物を得る工程、及び
　（３）前記藻類抽出物を含む培地を用い、動物細胞を培養する工程を含む、藻類及び動物細胞のリサイクル培養方法。
　［１２］　前記工程（３）の後に、さらに、項目１～１０のいずれか１項に記載の方法を実施する、項目１１に記載の方法。
　［１３］　動物細胞の培養後の培地を含有する藻類培養用の組成物。
　［１４］　前記動物細胞が、脊椎動物の細胞である、項目１３に記載の組成物。
　［１５］　前記動物細胞が、筋肉系又は肝臓系の細胞である、項目１３または１４に記載の組成物。
　［１６］　前記組成物が、微細藻類培養用の組成物である、項目１３～１５のいずれか１項に記載の組成物。
　［１７］　前記組成物が、海産および／または広塩性の微細藻類用の組成物である、項目１３～１６のいずれか１項に記載の組成物。
　［１８］　前記組成物が、クロロコックム・リトラレ（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ　ｌｉｔｔｏｒａｌｅ）またはシネココッカス属の培養に用いられる、項目１３～１７のいずれか１項に記載の組成物。
　［１９］　前記組成物の浸透圧が、藻類培養用の標準培地の浸透圧と同等または±１０％の範囲の浸透圧に調節されている、項目１３～１８のいずれか１項に記載の組成物。
　［２０］　無機塩類がさらに添加されている、項目１３～１９のいずれか１項に記載の組成物。
　［２１］　前記無機塩類は、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、およびカルシウム塩からなる群より一つ以上選択される、項目２０に記載の組成物。
　［２２］　前記組成物におけるアンモニアの濃度が０．５ｍＭ以上である、項目１３～２１のいずれか１項に記載の組成物。
　本発明の方法によれば、再生医療またはバイオ医薬などの分野や、今後拡大するであろう培養食品の分野における動物細胞の培養工程において大量に産生され、廃棄されるしかなかった動物細胞を培養した後の廃棄培地が、藻類（例えば、微細藻類）の培養に活用することが可能となる。これにより、動物細胞培養の有効利用が図れることとともに、藻類を用いた炭酸固定にも寄与し、環境負荷を低減し得る新たな方法が提供可能となる。
動物細胞培養培地中の因子の変動。栄養素（ａ：グルコース；　ｂ：グルタミン；　ｃ：ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に含まれるグルタミンを除く全１４種のアミノ酸の総量；　ｄ：ピルビン酸）、ビタミン類（ｅ：ビタミンＢ１、Ｂ２、Ｂ６、葉酸の総量）、および無機塩類（ｆ：ナトリウム；　ｇ：カリウム；　ｈ：カルシウム；　ｉ：マグネシウム；　ｊ：リン；　ｋ：アンモニア）の変動について、Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞なし（－）または有り（＋）で、１０％ウシ胎児血清および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭを用いて培養し、培養３日後に解析した。ＤＭＥＭに含まれるグルタミンを除く１４種のアミノ酸：アルギニン、シスチン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン。データは平均値±標準偏差で示す（ｎ＝４）。 図２は、微細藻類を培養した培地中の窒素およびリン含有化合物および無機塩の変動を示す。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ　ｖｕｌｇａｒｉｓなし（－）または有り（＋）、あるいはＣｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ　ｌｉｔｔｏｒａｌｅなし（－）または有り（＋）で、３日間培養した後のＣｈｌｏｒｅｌｌａ　ｖｕｌｇａｒｉｓまたはＣｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ　ｌｉｔｔｏｒａｌｅの微細藻類標準培地中のアンモニア（ａ）、リン（ｂ）、硝酸塩（ｃ）、ナトリウム（ｄ）、カリウム（ｅ）、カルシウム（ｆ）、およびマグネシウム（ｇ）の変動を示す。データは平均値±標準偏差で示す（ｎ＝４）。ＮＤ：検出されない。 微細藻類を培養した培地中の窒素およびリン含有化合物および無機塩の変動。Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞を３日間培養した後の廃棄培地を用いて、微細藻類なし（-）または微細藻類あり（＋）で培養した場合の当該培地中のアンモニア（ａ）およびリン（ｂ）、ナトリウム（ｃ）、カリウム（ｄ）、カルシウム（ｅ）、およびマグネシウム（ｆ）の変動を示す。データは平均値±標準偏差で示す（ｎ＝４）。 微細藻類標準培地または動物細胞培養の廃棄培地のいずれかにおけるＣｈｌｏｒｅｌｌａ　ｖｕｌｇａｒｉｓ（ａ－ｉ）の細胞増殖。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ　ｖｕｌｇａｒｉｓを、微細藻類標準培地またはＣ２Ｃ１２筋芽細胞を３日間培養した後の廃棄培地のいずれかで７日間培養した。データは平均値±標準偏差で示す（ｎ＝４）。廃棄培地を希釈せずに（１００％廃棄培地、顕微鏡写真：ａ-ｉｉ）使用、または廃棄培地を純水で１／１０希釈して（１０％廃棄培地、ａ-ｉｉｉ）使用した。スケールバー：５０μｍ。 微細藻類培地微細藻類標準培地または動物細胞培養の廃棄培地のいずれかにおけるＣｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ　ｌｉｔｔｏｒａｌｅ（ｂ－ｉ）の細胞増殖。Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ　ｌｉｔｔｏｒａｌｅを、微細藻類標準培地またはＣ２Ｃ１２筋芽細胞を３日間培養した後の廃棄培地のいずれかで７日間培養した。データは平均値±標準偏差で示す（ｎ＝４）。添加なしの廃棄培地（１００％廃棄培地、ｂ－ｉｉ）を用い、または塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウムを添加した廃棄培地（１００％廃棄培地＋　ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、ｂ－ｉｉｉ）、または微細藻類培地微細藻類標準培地を用いた（ｂ－ｉｖ）。スケールバー：５０μｍ。 図５は、動物細胞廃棄培地を用いて藻類（シネココッカス）を培養した結果を示す。 図６は、動物細胞廃棄培地を用いて藻類（シネココッカス）を培養した結果（顕微鏡写真）を示す。 図７は、動物細胞廃棄培地を用いて培養した藻類から抽出した藻類抽出物を用いて動物細胞を培養した結果を示す。
　以下、本発明の実施形態について、必要に応じて図面を参照にしながら説明する。実施形態の構成は例示であり、本発明の構成は、実施形態の具体的構成に限定されない。なお、本明細書で引用されている先行技術文献は、参照により本明細書に取り込まれる。
　一実施態様において、本発明は、動物細胞の培養後の培地を含有する藻類培養用の組成物を提供する。また、一実施態様において、本発明は、動物細胞の培養後の培地を含有する組成物を培地として用いる、藻類の培養方法を提供する。また、一実施態様において、本発明は藻類及び動物細胞のリサイクル培養方法を提供する。本発明によって、再生医療またはバイオ医薬などの分野や、培養食品の分野における動物細胞の培養工程において大量に産生され、廃棄されるしかなかった動物細胞を培養した後の培地が、藻類（例えば、微細藻類）の培養に活用することが可能となる。これにより、環境負荷の低減に寄与する。
　本発明に適用し得る動物細胞の培養後の培地（本明細書において、便宜的に「廃棄培地」とも記載されるが、実際に廃棄されることを意味するものではない。）としては、動物細胞の培養に通常用いられ得る培地であって、動物細胞を培養した後の培地を使用することが可能である。本発明に適用され得る、動物細胞を培養する前の動物細胞用の培地は、公知のものであれば限定されるわけではないが、例えば、イーグル培地、ダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＤＭＥＭ：Ｆ１２培地、グラスゴー最小必須培地、グレース昆虫培地、ハム培地、イスコフ改良イーグル培地、ＲＰＭＩ－１６４０培地、Ｌ－１５培地、マッコイ５Ａ培地、Ｍ１９９培地などであってもよく、動物細胞を培養可能な培地であれば用いることができる。
　本発明に適用し得る廃棄培地は、動物細胞の培養に用いられた廃棄培地が適用可能である。本明細書において、動物細胞とは、脊椎動物（哺乳類（「哺乳動物」ともいう。）、鳥類、両生類、爬虫類または魚類）の細胞、または無脊椎動物（例えば、ホヤ、節足動物（甲殻類（例えば、エビ、カニなど）、昆虫類など）、棘皮動物（ウニ、ナマコ、ヒトデなど）、軟体動物（例えば、貝、イカ、タコなど）など）の細胞を含む意味で用いられる。一実施態様において、動物細胞は、脊椎動物（例えば、ヒト、サル、ウシ、クジラ、クマ、シカ、ウマ、ブタ、イノシシ、ヒツジ、ウサギ、ラット、マウス、ハムスター、ヤギ、イヌまたはネコなどの哺乳動物、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、カモ、キジなどの鳥類、カエル、サンショウウオ、イモリなどの両生類、ワニ、トカゲ、ヘビ、カメ、スッポンなどの爬虫類、マグロ、サケ、マス、コイ、サメ、ウナギ、フグなどの魚類）の細胞、無脊椎動物（例えば、ホヤ、節足動物（甲殻類（例えば、エビ、カニなど）、昆虫類など）、棘皮動物（ウニ、ナマコ、ヒトデなど）、軟体動物（例えば、貝、イカ、タコなど）など）の細胞、あるいはそれら由来の初代細胞、株化細胞、多能性幹細胞（例えば、ＥＳ細胞、ｎｔＥＳ細胞、Ｍｕｓｅ細胞、ｉＰＳ細胞）、または組織幹細胞（例えば、間葉系幹細胞）あるいはそれらから分化誘導された細胞であってもよい。また、動物細胞の生体組織における由来は、例えば、筋肉系（例えば、筋芽細胞）、皮膚系（例えば、線維芽細胞、ケラチノサイト）、肝臓系（例えば、肝実質細胞）、腎臓系（例えば、腎細胞（例えば、ＨＥＫ２９３））、心臓系（例えば、心筋細胞）、消化器系（例えば、口腔粘膜細胞、腸管上皮細胞、壁細胞）、造血系（例えば、造血幹細胞）、生殖組織系（例えば、卵巣細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）、精細胞、子宮上皮細胞）、粘膜系（例えば、上皮細胞）、骨組織系（例えば、骨芽細胞、軟骨細胞）などであってもよく、これら以外の組織に由来するものであってもよい。
　本発明に適用し得る廃棄培地を供給する動物細胞の培養方法は、公知の培養方法（例えば、３７℃、飽和水蒸気下、５％ＣＯ２の加湿雰囲気下）に従えばよく、特に限定されない。
　本明細書において、「藻類」とは、光合成により酸素を産生する生物のうち、主に地上に生息するコケ植物、シダ植物、種子植物を除いたものの総称をいう。藻類は光合成に必要な環境が整えば、酸素、栄養分（例えば、グルコース、アミノ酸）を自ら作り出すことができ、増殖することができる。
　一実施態様において、本発明を適用し得る藻類は、「微細藻類（「単細胞藻類」ともいう。）であってもよい。本明細書において、「微細藻類」とは、藻類の中でも、個体が単一の細胞からなる藻類をいい、複数の微細藻類個体が集まり、群体を形成する微細藻類も含み、淡水産または海産、あるいは、狭塩性または広塩性の微細藻類が存在する。例えば、クロロフィルａおよびｂを葉緑体の主要色素とする緑藻類、クロロフィルｄを主要色素とする単細胞性の藍藻類（シアノバクテリア）、クロロフィルａおよびフィコビリンタンパク質を主要色素とする単細胞性の紅藻類が微細藻類の例として挙げられる。さらに詳しく例を挙げると、緑藻類では、緑藻綱クラミドモナス目のクラミドモナス・レインハルドティ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ　ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）（和名：クラミドモナス）（淡水産）、ドナリエラ目のドナリエラ・サリナ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ　ｓａｌｉｎａ）（和名：ドナリエラ）（海産）、オオヒゲマワリ目のボルボックス・カルテリ（Ｖｏｌｖｏｘ　ｃａｒｔｅｒｉ）（和名：ボルボックス）（淡水産）、クロロコックム目のクロロコックム・リットラレ（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ　ｌｉｔｔｏｒａｌｅ）（海産）、ヨコワミドロ目のヒドロディクティオン・レティキュラツム（Ｈｙｄｒｏｄｉｃｔｙｏｎ　ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）（和名：アミミドロ）（淡水産）、ペディアストラム・デュプレックス（Ｐｅｄｉａｓｔｒｕｍ　ｄｕｐｌｅｘ）（和名：クンショウモ）（淡水産）、セネデスムス・ディモルファウス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ　ｄｉｍｏｒｐｈｕｓ）（和名：イカダモ）（淡水産）、トレボウキシア藻綱クロレラ目のクロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ　ｓｐ．）（和名：クロレラ）（例えば、クロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ　ｖｕｌｇａｒｉｓ）（淡水産）、クロレラ・ピレノイドサ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ　ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ）（淡水産）、クロレラ・エルプソイデア（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ　ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ）（淡水産）、クロレラ・レギラリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ　ｒｅｇｕｌａｒｉｓ）など）（淡水産））、ユーグレナ植物門ユーグレナ藻綱ユーグレナ目のユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ　ｇｒａｃｉｌｉｓ）およびユーグレナ　プロキシマ（Ｅｕｇｌｅｎａ　ｐｒｏｘｉｍａ）（和名：ミドリムシ）（淡水産）などが挙げられる。単細胞性の藍藻類では、シアノバクテリア門のアカリオクロリス・マリナ（Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ　ｍａｒｉｎａ）（海産）、スピルリナ・サブサルサ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ　ｓｕｂｓａｌｓａ）（淡水産）、アルスロスピラ・プラテンシス（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ　ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）（淡水産）、シネココッカス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．）（海産または淡水産）などが挙げられる。単細胞性の紅藻類では、紅藻植物門イデユコゴメ綱イデユコゴメ目のシアニジウム　カルダリウム（Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ　ｃａｌｄａｒｉｕｍ）（和名：イデユコゴメ）（淡水産）または紅藻植物門イデユコゴメ綱イデユコゴメ目のガルディエリア　パルティータ（Ｇａｌｄｉｅｒｉａ　ｐａｒｔｉｔａ）（淡水産）などが挙げられる。単細胞性の車軸藻類では、緑色植物門の車軸藻網クレブソルミディウム目のスティココックス属（Ｓｔｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．）（淡水産）が挙げられる。また、単細胞性のアオサ藻網の藻類であるフィラメントス－ウルボフィテ（Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ－ｕｌｖｏｐｈｙｔｅ）が挙げられる。本発明が適用され得る藻類は、上記で挙げられた藻類の他、それらの遺伝子操作が行われた遺伝子組換え体であってもよく、上記以外の藻類であってもよい。例えば、本発明が適用し得る藻類は、淡水産もしくは海産、および／または狭塩性もしくは広塩性の微細藻類であってもよいが、好ましくは海産および／または広塩性の微細藻類であり、例えばクロロコックム・リトラレ（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ　ｌｉｔｔｏｒａｌｅ）や、シネココッカス属の藻類などに適用可能であるが、これに限定されない。
　本発明が適用し得る藻類は、天然の藻類であってもよく、公知の培養法によって増殖させた藻類であってもよい。
　一実施態様において、藻類の培養に用いる、動物細胞の培養後の培地を含有する組成物は、必要に応じて、目的とする藻類の培養に通常用いられる標準培地、例えば、淡水産藻類用の培地の場合（ＡＦ６培地、Ｃ培地、ＵＲＯ培地、ＶＴ培地等）、または海産藻類用培地の場合（ＥＳＭ培地、ｆ／２培地、ＩＭＲ培地、ＭＮＫ培地、Ｃ培地＋１０％海水、ダイゴＩＭＫ及びダイゴ人工海水ＳＰの混合物等）の微細藻類標準培地の浸透圧と同等または±１０％（好ましくは±５％、より好ましくは±３％）の範囲の浸透圧に調節されたものが用いられ得る。浸透圧の調節は、藻類の培養の前に公知の方法によって浸透圧を測定し、必要に応じて、例えば、目的とする藻類の培養に通常用いられる標準培地の浸透圧±１０％（好ましくは±５％、より好ましくは±３％）の範囲を逸脱している場合など、調整するものであってもよい。また、藻類の培養中に浸透圧の値をモニタリングして、必要に応じて、例えば、目的とする藻類の培養に通常用いられる標準培地の浸透圧±１０％（好ましくは±５％、より好ましくは±３％）の範囲を逸脱している場合など、調整するものであってもよい。これにより、藻類の増殖効果がより増強され得る。浸透圧の調整方法は、公知の方法に従えばよく、浸透圧が高い場合は、例えば、水（例えば、蒸留水、イオン交換水、滅菌水）などの低張の媒体によって希釈する、あるいは、浸透圧が低い場合は、ナトリウム塩（例えば、塩化ナトリウム、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウムなど）、カリウム塩（例えば、塩化カリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、リン酸カリウムなど）、マグネシウム塩（例えば、塩化マグネシウム、酸化マグネシウムなど）、および／またはカルシウム塩（例えば、塩化カルシウム、炭酸カルシウム、水酸化カルシウムなど）などを添加するなどの方法により、浸透圧を調整してもよい。例えば、目的とする培養対象としての藻類がクロロコックム・リトラレ（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ　ｌｉｔｔｏｒａｌｅ）である場合、動物細胞の廃棄培地に、塩化ナトリウム、塩化マグネシウムおよび塩化カリウムを添加することにより、得られる組成物の浸透圧を調整してもよい。
　一実施態様において、本発明で提供される組成物は、微細藻類培養用、例えば、淡水産または海産、あるいは、狭塩性または広塩性の微細藻類用の組成物が提供される。一態様において、本発明が適用され得る微細藻類としては、海産および／または広塩性の微細藻類が好ましく、例えば、クロロコックム・リトラレ（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ　ｌｉｔｔｏｒａｌｅ）や、シネココッカス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ）などが挙げられる。
　藻類の培養条件は、培養する藻類の種類に依存し、温度は５～４０℃、好ましくは１０～３５℃、より好ましくは１０～３０℃にて、通常１～１０日間、好ましくは３～７日間培養を行い、通気または嫌気攪拌培養、振とう培養または静置培養で行うことができる。
　一実施態様において、藻類の培養に用いられる組成物のアンモニアの濃度は、０．５ｍＭ以上であり、これにより、アンモニアを窒素源とする藻類の効率的な培養が可能となる。藻類の培養に用いられる組成物のアンモニアの濃度の上限は特に限定されないが、動物細胞の培養後の培地を含有するため、動物細胞を培養可能な濃度で提供され得る。従って、限定されるわけではないが、藻類の培養に用いられる組成物のアンモニアの濃度は、例えば、例えば０．５ｍＭ～１０ｍＭ、０．５ｍＭ～５ｍＭ、０．５ｍＭ～３ｍＭで提供され得る。アンモニアは、藻類の培養において窒素源となり得るため、培養によって消費された場合は、さらに窒素原としてアンモニアを添加してもよく、代替的に又は追加的に、硝酸塩を添加してもよい。
　本発明は、藻類及び動物細胞のリサイクル培養方法を提供し得る。当該方法は、
　（１）上記の方法によりに記載の方法により培養した前記藻類を回収する工程、
　（２）前記藻類を分解処理し、藻類抽出物を得る工程、及び
　（３）前記藻類抽出物を含む動物細胞培養用培地を用い、動物細胞を培養する工程
を含み得る。
　一実施態様において、上記工程（２）は、例えば、国際公開第２０２１／０６６１１３号に記載の方法を参考に、それに記載の工程の一部または全部を実施することによって藻類から藻類抽出物を得てもよく、例えば、以下の工程を含んでもよい：
　（２ａ－１）藻類を、酸加水分解処理及び／又はアルカリ加水分解処理に供する工程；及び
　（２ａ－２）前記工程（２ａ－１）により得られる加水分解産物を中和し、藻類抽出物を得る工程。
　一実施態様において、藻類抽出物を得るために、酸加水分解処理のみが実施されてもよく、アルカリ加水分解処理のみが行われてもよく、酸加水分解処理及びアルカリ加水分解処理の両方が実施されてもよい。酸加水分解処理及びアルカリ加水分解処理が実施される場合、酸加水分解処理に続いてアルカリ加水分解が行われても良く、アルカリ加水分解処理に続いて酸加水分解処理が行われてもよい。酸加水分解処理とアルカリ加水分解処理の間に、中和処理が実施されてもよい。
　一実施態様において、上記の工程（２ａ－１）で用いられる藻類は、酸加水分解処理及び／又はアルカリ加水分解処理に供される前に、乾燥処理に供されてもよい。
　一実施態様において、上記の工程（２－１）により得られる加水分解産物を、中和する工程（工程（２－２））を実施することにより、加水分解産物が中和され、細胞の培養に用いることができる藻類抽出物が得られる。例えば、工程（２－１）において、最終的に酸加水分解が実施された場合は、塩基性物質又はその水溶液（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム又はその水溶液など）を添加し、中和してもよい。例えば、工程（２－１）において、最終的にアルカリ加水分解が実施された場合は、酸性物質（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなど）又はその水溶液（塩酸、硫酸、トリフルオロ酢酸、ｐ－トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸など）を添加し、中和してもよい。
　他の実施態様において、上記の（２）前記藻類を分解処理し、藻類抽出物を得る工程は、（２ｂ）前記藻類を超音波によって分解処理し、藻類抽出物を得る工程
であってもよい。超音波によって分解処理する方法は、公知の方法を用いればよく、例えば、Prabakaranらの文献（P. Prabakaran, A.D. Ravindran, A comparative study on effective cell disruption methods for lipid extraction from microalgae. Letters in Applied Microbiology, 53(2) 150-154 (2011)）に記載の方法を参考に実施することが可能である。例えば、公知の超音波破砕装置（例えば、Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ　ＵＣＤ－２００ＴＭ（コスモバイオ、日本））を用い、２００Ｗ、１０分間、氷上において藻類を破砕することによって藻類抽出物を得ることも可能である。
　上記の（２）の工程は、（２ｂ）と上記の（２ａ－１）及び（２ａ－２）との組み合わせであってもよい。
　一実施態様において、上記の工程（２）は、加圧下で実施されてもよい。本明細書において、「加圧下」とは、大気圧、すなわち１気圧よりも高い気圧条件をいい、例えば、１．１気圧以上、１．５気圧以上、１．８気圧以上、又は２気圧以上で実施されてもよい。例えば、１．１～３００気圧、１．５～２００気圧、１．８～１００気圧、２～５０気圧、例えば２～２０気圧であってもよい。加圧条件は、任意の装置や方法によって実施されてもよく、例えば、オートクレーブを用いることによって加圧条件を実現することができる。
　以下に、本発明を実施例に基づいて更に詳しく説明するが、これらは本発明を何ら限定するものではない。
＜実施例１＞
１．材料と方法
１－１．動物の筋芽細胞の培養
　Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ-１７７２（商標））を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ、ＵＳＡ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ＰＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を補充したＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＳｔＬｏｕｉｓ，ＭＯ、ＵＳＡ）中、３７℃で、５％　ＣＯ２を含む加湿大気中で培養した３７。２×１０５個のＣ２Ｃ１２細胞を１００ｍｍ培養皿（Ｇｒｅｉｎｅｒ　Ｂｉｏ－Ｏｎｅ、Ｋｒｅｍｓｍｕｎｓｔｅｒ、Ａｕｓｔｒｉａ）に播種した後、一晩培養し、使用済み培地を１０ｍｌの新鮮な培地と交換した。３日間の培養後、細胞を含む／含まない培地を回収した。遠心分離（１，７００×ｇ、５分）後、採取した培養上清（廃棄培地）中の各因子をさらなる分析のために外部委託した（ＳＲＬ、東京、日本）（表１）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
１－２．微細藻類の培養
　淡水緑藻植物　Ｃ．　ｖｕｌｇａｒｉｓ（ＮＩＥＳ－２１７０、国立環境研究所、茨城、日本）および海水緑藻植物　Ｃ．　ｌｉｔｔｏｒａｌｅ（ＮＢＲＣ　１０２７６１、製品評価技術基盤機構、東京、日本）を、それぞれＣ培地（国立環境研究所、茨城、日本）（参考：「https://mcc.nies.go.jp/medium/ja/c.pdf」；Ichimura, T. 1971 Sexual cell division and conjugation-papilla formation in sexual reproduction of Closterium strigosum. In Proceedings of the Seventh International Seaweed Symposium, University of Tokyo Press, Tokyo, p. 208-214.）またはダイゴＩＭＫ培地（製造：日本製薬（東京、日本）；販売：富士フイルム和光純薬（大阪、日本））およびダイゴ人工海水ＳＰ（製造：日本製薬（東京、日本）；販売：富士フイルム和光純薬（大阪、日本））の混合物中で連続光（光合成光子束密度、ＰＰＦＤ：　１２±１μｍｏｌ／ｍ２／ｓ、ｎ＝５）３６，３８下で、培養した。ＰＰＦＤは、量子光度計（オガワ精機株式会社、東京、日本）を用いて測定した。２×１０８　Ｃ．　ｖｕｌｇａｒｉｓまたは１０×１８　Ｃ．　ｌｉｔｔｏｒａｌｅ細胞を１００ｍｍ培養皿（Ｇｒｅｉｎｅｒ　Ｂｉｏ－Ｏｎｅ）に播種した後、細胞を、３０℃の連続光下、５％　ＣＯ２を含む加湿大気中で、連続光下で３日間培養した（ＰＰＦＤ：１５±１μｍｏｌ／ｍ２／ｓ、ｎ＝６）３９。培養のために、各微細藻類標準培地またはＣ２Ｃ１２細胞を３日間培養した後の廃棄培地を、微細藻類を伴う／伴わない培養の３日後のもので、分析に供した。微細藻類標準培地とは、目的とする藻類の培養に通常用いられる培地のことである。例えば、上記の場合Ｃ培地、ダイゴＩＭＫ培地及びダイゴ人工海水ＳＰの混合物が該当する。遠心分離（１，７００×ｇ、５分）により培地を回収し、培養上清中の各因子を分析した（表１）。硝酸塩は、硝酸塩計（ＬＡＱＵＡｔｗｉｎ、アズワン株式会社、大阪、日本）を用いて検出した。
　なお、Ｃ．　ｖｕｌｇａｒｉｓの微細藻類標準培地としてＣ培地を用いた。また、Ｃ．　ｌｉｔｔｏｒａｌｅの微細藻類標準培地として上記で用いたダイゴＩＭＫ培地及びダイゴ人工海水ＳＰの混合物は、ダイゴ人工海水ＳＰ（富士フイルム和光純薬（大阪、日本）、製品コード：３９５－０１３４３）３６ ｇと、ダイゴＩＭＫ培地（富士フイルム和光純薬（大阪、日本）、製品コード：３９２－０１３３１）２５２ ｍｇをミリＱ水 １Ｌに溶解し、オートクレーブすることによって調製した。
　筋芽細胞／微細藻類なしで培養した後の値を、筋芽細胞／微細藻類で培養した後の値で割ることによって、因子の消費（％）を計算した。動物細胞培養後の廃棄培地の浸透圧を低下または上昇させるために、純水（Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）または塩化ナトリウム（富士フイルム和光純薬株式会社、大阪、日本）、塩化マグネシウム（ＦＵＪＩＦＩＬＭ　Ｗａｋｏ　Ｐｕｒｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、および塩化カルシウム（富士フイルム和光純薬株式会社、大阪、日本）をそれぞれ使用した。
　細胞増殖の分析のために、Ｃ．　ｌｉｔｔｏｒａｌｅまたはＣ．　ｖｕｌｇａｒｉｓを３５ｍｍ培養皿（Ｇｒｅｉｎｅｒ　Ｂｉｏ－Ｏｎｅ）に５×１０６個で播種し、微細藻類を、上記のように、５％　ＣＯ２を含む加湿大気中で３０℃で７日間培養した。培養には各微細藻類標準培地またはＣ２Ｃ１２細胞を３日間培養後の廃棄培地を使用した。培養後、血球計（ワケンビーテック株式会社、京都、日本）により微細藻類濃度を測定し、マイクロピペット（エムエス機器株式会社、大阪、日本）を用いて培地量を測定した。細胞数は、細胞濃度および培地量に基づいて計算した。ＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔｓ　ＢＲソフトウェア（Ｎｉｋｏｎ）を用いて顕微鏡（ＥＣＬＩＰＳＥ　ＴＳ２、Ｎｉｋｏｎ，Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）により微細藻類画像を記録した。
１－３．統計解析
　対応のないスチューデントのｔ検定またはｐｏｓｔ－ｈｏｃ　ＴｕｋｅｙのＨＳＤ検定による一元配置分散分析により、それぞれ２群または多群間比較を行った。
２．結果
２－１．動物筋芽細胞培養
　Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞を３日間培養した後、培地中の因子の変動を分析した。筋芽細胞はグルコース（９９％）（図１ａ）およびグルタミン（６９％）（図１ｂ）を活発に消費した。しかしながら、グルタミンを除く基礎培地（ダルベッコ改変イーグル培地、ＤＭＥＭ）中の１４アミノ酸の量は、わずか２６％減少しか減少していなかった（図１ｃ）。さらに、培地中のピルビン酸塩（図１ｄ）およびビタミンＢ１、Ｂ２、Ｂ６および葉酸（図１ｅ）の量は、わずかに減少していた。さらに、培地中のナトリウム（図１ｆ）、カリウム（図１ｇ）、カルシウム（図１ｈ）、およびマグネシウム（図１ｉ）の量はほとんど変化しなかった。しかしながら、細胞は培養培地中のリンを１６％消費していた（図１ｊ）。アンモニアは、アミノ酸、とりわけグルタミンの分解によって産生されるので２７、培養前でも培養培地中に存在した（データは示さず）。培地中のアンモニアは、細胞の培養中に増加する傾向があった（図１ｋ）。
　以上より、培養培地中の栄養素、ビタミン、およびリンを含む無機塩のレベルは、細胞によって消費されたグルコースおよびグルタミン、ならびに廃棄培地中に排泄されたアンモニアを除いて、ほとんど同じままであることが明らかとなった。
２－２．微細藻類培養
　微細藻類を通常の培地中で３日間培養し、培地中の因子の変動を分析した。微細藻類は、アンモニア（Ｃ．　ｖｕｌｇａｒｉｓ：３９％；　Ｃ．　ｌｉｔｔｏｒａｌｅ：１００％）（図２ａ）、リン（Ｃ．　ｖｕｌｇａｒｉｓ：１００％；　Ｃ．　ｌｉｔｔｏｒａｌｅ：１００％）（図２ｂ）、硝酸塩（Ｃ．　ｖｕｌｇａｒｉｓ：６７％；　Ｃ．　ｌｉｔｔｏｒａｌｅ：１７％）を積極的に消費した（図２ｃ）。しかし、ナトリウム（図２ｄ）、カリウム（図２ｅ）、カルシウム（図２ｆ）、およびマグネシウム（図２ｇ）の量は無視できる変化しか生じなかった。
　筋芽細胞培養の廃棄培地中で増殖させると、微細藻類はアンモニアおよびリンを活発に消費した（図３ａおよび３ｂ）。Ｃ．　ｌｉｔｔｏｒａｌｅはＣ．　ｖｕｌｇａｒｉｓよりも多くのアンモニアを摂取した（Ｃ．　ｌｉｔｔｏｒａｌｅ；８０％、Ｃ．　ｖｕｌｇａｒｉｓ；２６％）。両微細藻類はリンを消費した（Ｃ．　ｌｉｔｔｏｒａｌｅ；１６％、Ｃ．　ｖｕｌｇａｒｉｓ；１５％）。しかし、ナトリウム（図３ｃ）、カリウム（図３ｄ）、カルシウム（図３ｅ）のレベルはほとんど変化せず、マグネシウムのレベルはＣ．　ｌｉｔｔｏｒａｌｅの場合には増加したが、Ｃ．　ｖｕｌｇａｒｉｓの場合にはほとんど変化しなかった（図３ｆ）。
　本発明者らはまた、微細藻類が動物細胞培養物の廃棄培地中で増殖し得るかどうかを分析した。Ｃ．　ｖｕｌｇａｒｉｓは微細藻類標準培地中で１３．４倍増殖したが、７日間の培養後に廃棄培地中では１．４倍しか増殖しなかった（図４－１）。微細藻類標準培地中の無機塩のレベルは、廃棄培地のレベルよりも有意に低かった（図１および２）。従って、我々は廃棄培地を水で希釈してその濃度を低下させた。浸透圧モル濃度の低下は、培地の希釈に依存して変化した（表２）。Ｃ．　ｖｕｌｇａｒｉｓは希釈廃棄培地中で１．６倍しか増加しない（図４－１）。対照的に、海水微細藻類、Ｃ．　ｌｉｔｔｏｒａｌｅは微細藻類標準培地で６．８倍増殖したが、培養７日後に廃棄培地ではさらに２．２倍増殖した（図４－２）。Ｃ．　ｌｉｔｔｏｒａｌｅの培地中のナトリウム、マグネシウム、カルシウム濃度は廃棄培地（図１、２）よりも有意に高かったため、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウムを添加して濃度を調整した。廃棄培地の最終浸透圧は、微細藻類標準培地の浸透圧にほぼ等しかった（表２）。Ｃ．　ｌｉｔｔｏｒａｌｅの細胞増殖は、廃棄培地の塩濃度を調整することによって３．２倍に増強された（図４－２）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
３．考察
　報告によれば、Ｃ．　ｖｕｌｇａｒｉｓを含む淡水微細藻類は、家庭、農業、および産業廃水の処理に役立ち得る２４－２６。反対に、海水微細藻類は動物細胞培養廃棄培地を効率的に処理できることが観察された（図３、図４－１および図４－２）。本発明者らは２つの微細藻類間の差異が無機塩の最適濃度に関連し、微細藻類が窒素含有化合物に対して異なる優先性を示していると推定する。Ｃ．　ｌｉｔｔｏｒａｌｅは硝酸塩よりもアンモニアを優先的に消費したが、Ｃ．　ｖｕｌｇａｒｉｓはアンモニアよりも硝酸塩を優先的に消費した（図２ａおよび２ｃ）。アンモニア消費の違いは、おそらくＣ．　ｌｉｔｔｏｒａｌｅが窒素源としてアンモニアを好むのに対し、Ｃ．　ｖｕｌｇａｒｉｓは硝酸塩を好むという事実によるものと考えられる。アンモニアは培養細胞廃棄培地中の主要な窒素源であり、Ｃ．　ｌｉｔｔｏｒａｌｅが廃棄培地中でＣ．　ｖｕｌｇａｒｉｓよりも速く増殖し、またＣ．　ｌｉｔｔｏｒａｌｅの増殖が通常の微細藻類標準培地よりも廃棄培地中で遅かった理由の１つの理由であるものと考えられる（図４－２）。筋芽細胞培養後の廃棄培地および微細藻類標準培地はいずれもアンモニアおよびリンを含有していたが、微細藻類標準培地のみが硝酸塩を含有していた（図２および３）。Ｃ．　ｌｉｔｔｏｒａｌｅの標準培地は、アンモニアよりも有意に多くの硝酸塩を含んでいる（図２ａおよび２ｃ）。廃棄培地中に含まれるアンモニアの量は、微細藻類の高密度かつ１週間以上の長期培養の場合には十分ではないかもしれない。培地成分の最適化および微細藻類株、例えば、汽水由来の微細藻類２８、アンモニアを好むか、または窒素２９を固定することができる微細藻類の選択が、将来の研究のトピックスである。動物細胞培養からの廃棄培地を用いることによる微細藻類の培養系の確立は、（１）微細藻類培養における淡水およびアンモニアおよびリンを含む無機塩の保存、ならびに（２）廃棄培地の処分によって引き起こされる水体の富栄養化の防止に寄与する。
　動物の筋芽細胞は、培地中に存在するグルコースおよびグルタミンを活発に消費する（図１）。グルコースは細胞生合成とエネルギー生成の主要な炭素源であり、細胞培養３０に不可欠である。グルタミンは、ヒトプロテオーム３１中の全アミノ酸残基の約５％を構成する。さらに、グルタミンは、非必須アミノ酸ならびにプリンおよびピリミジンベース３１の生合成に密接に関連している。さらに、増殖細胞において、グルタミンは、トリカルボン酸（ＴＣＡ）周期のための生合成前駆体として働く。しかし、培養液中の栄養素、ビタミン、無機塩類の量はほとんど変化しなかった（図１）。上記の培養食品の効率の推定において、培地に含まれるグルコースおよびアミノ酸の１００％が消費されたと仮定した。しかしながら、我々の研究は、約１６％のグルコースおよびアミノ酸、１００％のピルビン酸、および９６％のビタミンが残存することを示した（図１）。以前の研究ではウシ初代筋組織由来細胞がグルコースとアミノ酸のわずか１１％しか消費していなかったが、培養３日間ではピルビン酸の４３％を消費していた（データは示していない）。Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞の代謝を分析すると、グルコースとピルビン酸消費レベルが同様の傾向を示すことが観察された。簡単に述べると、細胞がグルコースを消費した後にのみ、主にピルビン酸を消費した（データは示さず）。これが、図１ｄで示されるように、ピルビン酸レベルにおいて高い偏差を示した理由であると考えられる。これらの知見はいずれも、グルコースとピルビン酸の両方を好むウシの初代筋組織由来細胞とは対照的に、Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞はピルビン酸よりもグルコースを好むことを示唆している。必須栄養素は細胞型に大きく依存するため、細胞型の代謝による培地調製は、より有効な培養食品生産システムをもたらす。さらに、グルコース、ピルビン酸塩、アミノ酸、ビタミン、および無機塩の廃棄培地中での再循環が必要である。
　筋芽細胞の廃棄培地での微細藻類培養ではナトリウム、カリウム、カルシウムの量はほとんど変化しなかったが、マグネシウムはＣ．　ｌｉｔｔｏｒａｌｅの場合にはわずかに増加したが、Ｃ．　ｖｕｌｇａｒｉｓの場合には増加しなかった（図３ｆ）。これらのデータの違いは培養培地間のマグネシウム濃度の違いに関連していると考えられる。Ｃ．　ｌｉｔｔｏｒａｌｅの標準培地中のマグネシウム濃度は、Ｃ．　ｖｕｌｇａｒｉｓの標準培地または動物細胞の培地中のマグネシウム濃度よりも有意に高かったため（図１ｉおよび２ｇ）、マグネシウムはＣ．　ｌｉｔｔｏｒａｌｅから低度に分泌されると考えられる。
　現在、哺乳動物細胞培養培地に含まれる栄養素およびビタミンは、穀物に直接的および間接的に由来する。穀物由来の栄養素の使用は食品生産と競合し、培養食品中の極めて多量の栄養素の使用は穀物の価格の上昇につながる可能性がある。さらに、化学肥料および農薬を使用する穀物生産は大量のエネルギーおよび天然資源を消費し、環境ストレスを引き起こす。主な化学肥料であるアンモニアの製造は地球規模の年間電力供給量の１～２％、地球規模の天然ガスの３～５％を消費し、地球規模の二酸化炭素排出３２，３３の３％に関連している。また、もう１つの重要な化学肥料であるリンは、リン酸塩岩石に由来するものであり、その質は低下しており、その量は３４限られている。ほとんどすべての農薬は石油由来である。反対に、微細藻類はほとんど残留３５を伴わずに、最も効率的に栄養素を合成する。近年、Ｃ．　ｌｉｔｔｏｒａｌｅとＣ．　ｖｕｌｇａｒｉｓから得た栄養素を用いて動物細胞の培養系を確立したが、これらは食品産生と競合せず、動物細胞３６に必要な栄養素を効率的に合成する。したがって、動物細胞は、微細藻類によって産生された栄養素を使用して増殖することができ、微細藻類は、動物細胞培養物からの廃棄培地のリサイクルによって増殖することができる。また、Ｃ．　ｌｉｔｔｏｒａｌｅは、火力発電所や製鉄工場から排出される二酸化炭素ガスの固定化にも効率的であると期待されている。化石燃料を燃焼させて発生する二酸化炭素を吸収して生育した微細藻類から抽出した栄養素や、動物細胞で生産された培養食品から発生する廃棄培地で動物細胞を培養するリサイクル培養システムを想定している。動物細胞と微細藻類を利用したリサイクル細胞培養システムは、持続可能なエネルギー、栄養、環境、資源を節約する溶液を確立すると考えられる。
＜実施例２＞
　広塩性の微細藻類として知られているシネココッカス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．）の微細藻類（以下、「シネココッカス」という。）が、動物細胞の培養後の廃棄培地によって培養可能であるかどうかを調べた。
　シネココッカスの培養に用いて動物細胞の培養後の廃棄培地は、実施例１と同様の方法で準備した。
　細胞増殖の分析のために、シネココッカス（ＮＩＥＳ－３７５８、国立環境研究所）を１００ｍｍ培養皿（Ｇｒｅｉｎｅｒ　Ｂｉｏ－Ｏｎｅ）に、Ｃ培地＋１０％海水（Ｃ＋１０％　Ｓｅａｗａｔｅｒ、国立環境研究所）またはＣ２Ｃ１２細胞を３日間培養した後の廃棄培地で連続光（光合成光子束密度、ＰＰＦＤ：　１５±１μｍｏｌ／ｍ２／ｓ、ｎ＝６）下で、７日間培養した。微細藻類を遠心操作（２３００×ｇ）で回収後、培地成分を除いた湿重量を秤量天秤（ＭＥＴＬＥＲ　ＴＯＬＥＤＯ）で測定し、７日間培養前後の藻類の増殖率を解析した。また、ＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔｓ　ＢＲソフトウェア（Ｎｉｋｏｎ）を用いて顕微鏡（ＥＣＬＩＰＳＥ　ＴＳ２、Ｎｉｋｏｎ，Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）により培養後の微細藻類画像を記録した。
　その結果、シネココッカスは動物細胞の培養後の廃棄培地を用いた培養で、微細藻類標準培地を用いた場合とほぼ同程度の増殖率を示した（図５）。図６は培養７日後の顕微鏡観察の結果であるが、動物細胞の培養後の廃棄培地を用い培養した場合でも微細藻類標準培地を用い培養した場合でも微細藻類の培養密度および細胞の形態・様子に変化が認められないことを示している。これらの結果は広塩性の微細藻類シネココッカスは動物細胞の培養後の廃棄培地で微細藻類標準培地と同様に培養増殖できることを示している。
＜実施例３＞
　実施例１と同じ条件で、ＲＬ３４マウス肝細胞株、及びウシ筋組織由来細胞を３日間培養し、それぞれの廃棄培地を用いて、Ｃ．　ｌｉｔｔｏｒａｌｅを培養したところ、いずれの廃棄培地によっても培養可能であった。
＜実施例４＞
　動物細胞廃棄培地を用いて培養した藻類からの栄養素抽出
　動物筋細胞（Ｃ２Ｃ１２細胞）の廃棄培地で７日間培養した藻類（Ｃ．　ｌｉｔｔｏｒａｌｅ）を酸処理（０．５Ｎ　ＨＣｌ，１００℃，２４時間処理）で栄養素抽出を行った。酸処理後ＮａＯＨ（富士フイルム和光純薬、大阪、日本）で中和処理後、遠心処理（１２，５００ × ｇ、５分）上清を藻類抽出液として利用した。
　藻類抽出液と動物細胞基礎培地の各栄養成分を、以下の方法：
・グルコース解析法：Ｈｅｘｏｋｉｎａｓｅ　ｍｅｔｈｏｄ
・アミノ酸解析法：Ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ　（ＬＣＭＳ）
により解析して比較を行った。
　その結果、以下のように、動物細胞の廃棄培地を用いて培養した藻類からも効率的に栄養素を抽出でき、それに含まれるグルコース及びタンパク質構成アミノ酸量は、市販の動物細胞培養用基礎培地ＤＭＥＭよりも多いことが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
＜実施例５＞
　動物細胞廃棄培地を用いて培養した藻類から抽出した栄養素（藻類抽出物）を用いた動物細胞の培養（リサイクル培養の実証）
　実施例４において抽出した藻類抽出物を用い、動物筋細胞（Ｃ２Ｃ１２細胞）を培養可能か確かめた。
　以下の３つの培地：
（１）動物細胞培養用基礎培地ＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＳｔＬｏｕｉｓ，ＭＯ、ＵＳＡ）
（２）（１）の基礎培地に含まれる無機塩のみの培地（無機塩培地）
（３）（２）の無機塩培地＋実施例３で得られた藻類抽出液（５％（ｖ／ｖ））
を用いて動物筋細胞（Ｃ２Ｃ１２細胞）を２日間培養し、相対生細胞数をXTTアッセイによって測定し、比較した（図７）。
　なお、上記（２）の無機塩培地は、以下の組成である。
（ｉ）糖質
　・グルコース：０ｍｇ／Ｌ
（ｉｉ）アミノ酸
　・Ｌ－アルギニン：０ｍｇ／Ｌ
　・Ｌ－シスチン：０ｍｇ／Ｌ
　・Ｌ－グルタミン：０ｍｇ／Ｌ
　・グリシン：０ｍｇ／Ｌ
　・Ｌ－ヒスチジン：０ｍｇ／Ｌ
　・Ｌ－イソロイシン：０ｍｇ／Ｌ
　・Ｌ－ロイシン：０ｍｇ／Ｌ
　・Ｌ－リジン：０ｍｇ／Ｌ
　・Ｌ－メチオニン：０ｍｇ／Ｌ
　・Ｌ－フェニルアラニン：０ｍｇ／Ｌ
　・Ｌ－セリン：０ｍｇ／Ｌ
　・Ｌ－トレオニン：０ｍｇ／Ｌ
　・Ｌ－トリプトファン：０ｍｇ／Ｌ
　・Ｌ－チロシン：０ｍｇ／Ｌ
　・Ｌ－バリン：０ｍｇ／Ｌ
（ｉｉｉ）ビタミン
　・パントテン酸：０ｍｇ／Ｌ
　・塩化コリン：０ｍｇ／Ｌ
　・葉酸：０ｍｇ／Ｌ
　・ｉ－イノシトール：０ｍｇ／Ｌ
　・ナイアシンアミド：０ｍｇ／Ｌ
　・ピリドキシン：０ｍｇ／Ｌ
　・リボフラビン：０ｍｇ／Ｌ
　・チアミン：０ｍｇ／Ｌ
（ｉｖ）ミネラル
　・ＣａＣｌ２：２００ｍｇ／Ｌ
　・ＫＣｌ：４００ｍｇ／Ｌ
　・Ｆｅ（ＮＯ３）３・９Ｈ２Ｏ：０．１０ｍｇ／Ｌ
　・ＭｇＳＯ４：９８ｍｇ／Ｌ
　・ＮａＣｌ：６４００ｍｇ／Ｌ
　・ＮａＨＣＯ３：３７００ｍｇ／Ｌ
　・ＮａＨ２ＰＯ４：１０９ｍｇ／Ｌ
　・フェノールレッド：１５ｍｇ／Ｌ
　その結果、動物筋細胞廃棄培地で増幅した藻類から抽出した藻類抽出物を用いて、動物筋細胞を培養可能であることが示され、藻類及び動物細胞のリサイクル培養系が確立可能であることが実証された。
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Claims (16)

  1. 　動物細胞の培養後の培地を含有する組成物を培地として用いる、藻類の培養方法。
  2. 　前記藻類が、微細藻類である、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記藻類が、海産および／または広塩性の微細藻類である、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　前記組成物の浸透圧を、必要に応じて藻類培養用の標準培地の浸透圧と同等または±１０％の範囲の浸透圧に調節して用いる、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　前記組成物に、さらに無機塩類を添加する、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　前記無機塩類は、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、およびカルシウム塩からなる群より一つ以上選択される、請求項５に記載の方法。
  7. 　前記組成物におけるアンモニアの濃度を０．５ｍＭ以上とする、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　（１）請求項１～７のいずれか１項に記載の方法により培養した前記藻類を回収する工程、
    　（２）前記藻類を分解処理し、藻類抽出物を得る工程、及び
    　（３）前記藻類抽出物を含む培地を用い、動物細胞を培養する工程を含む、藻類及び動物細胞のリサイクル培養方法。
  9. 　前記工程（３）の後に、さらに、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法を実施する、請求項８に記載の方法。
  10. 　動物細胞の培養後の培地を含有する藻類培養用の組成物。
  11. 　前記組成物が、微細藻類培養用の組成物である、請求項１０に記載の組成物。
  12. 　前記組成物が、海産および／または広塩性の微細藻類用の組成物である、請求項１０または１１に記載の組成物。
  13. 　前記組成物の浸透圧が、藻類培養用の標準培地の浸透圧と同等または±１０％の範囲の浸透圧に調節されている、請求項１０～１２のいずれか１項に記載の組成物。
  14. 　無機塩類がさらに添加されている、請求項１０～１３のいずれか１項に記載の組成物。
  15. 　前記無機塩類は、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、およびカルシウム塩からなる群より一つ以上選択される、請求項１４に記載の組成物。
  16. 　前記組成物におけるアンモニアの濃度が０．５ｍＭ以上である、請求項１０～１５のいずれか１項に記載の組成物。
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