WO2022250450A1 - 항 메소텔린 scFv를 포함하는 키메릭 항원 수용체 및 이의 용도 - Google Patents

항 메소텔린 scFv를 포함하는 키메릭 항원 수용체 및 이의 용도 Download PDF

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    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C12N5/0638—Cytotoxic T lymphocytes [CTL] or lymphokine activated killer cells [LAK]

Definitions

  • An anti-mesothelin chimeric antigen receptor that specifically binds to mesothelin and uses thereof.
  • immuno-anticancer agents such as immune checkpoint inhibitors and CAR-T cell therapeutics have demonstrated their effectiveness in various cancers, but it is reported that solid cancers do not respond significantly to these new types of immuno-anticancer agents. This is presumed to be because the fibrous tissue surrounding the tumor interferes with the immunotherapy response and makes drug delivery difficult. Therefore, as a specific and more effective CAR-T cancer treatment method, there is a need for research on how to develop an antibody that targets a protein specifically overexpressed on the surface of solid cancer cells as a cancer antigen, and to effectively treat solid cancer using this antibody. is emerging
  • mesothelin is a glycoprotein anchored on the cell surface by a glycosylphosphatidylinositol (GPI) domain. It is normally expressed at a low level and restricted to the mesothelium surrounding the human cavity and internal organs, but pancreatic cancer. , it is known to be abundantly expressed in cancers such as mesothelioma, ovarian cancer, and non-small cell lung cancer.
  • GPI glycosylphosphatidylinositol
  • One aspect is to provide an anti-mesothelin antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • Another aspect is to provide an isolated nucleic acid encoding the anti-mesothelin antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • Another aspect is to provide a vector comprising the isolated nucleic acid.
  • Another aspect is to provide an isolated host cell transformed with the vector.
  • Another aspect is to provide a method for producing an anti-mesothelin antibody comprising culturing the isolated host cell to express the antibody.
  • Another aspect is to provide a chimeric antigen receptor comprising an antigen binding domain, a hinge domain, a transmembrane domain and an intracellular signaling domain.
  • Another aspect is to provide a polynucleotide encoding the chimeric antigen receptor.
  • Another aspect is to provide a vector comprising the polynucleotide.
  • Another aspect is to provide isolated cells transformed with the vector.
  • Another aspect is a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising the isolated cells; medicinal use of the cells; and administering a therapeutically effective amount of the cells to a subject to provide a method for preventing or treating cancer.
  • One aspect provides an anti-mesothelin antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • MSLN mesothelin
  • Mesothelin shows low expression in normal mesothelial cells, but is highly expressed in solid cancer (solid tumor), esophageal cancer, breast cancer, triple-negative breast cancer (TNBC) , gastric cancer, cholangiocarcinoma, pancreatic cancer, colon cancer, lung cancer, thymic carcinoma, mesothelioma, ovarian cancer, Overexpression was confirmed in endometrial cancer, cervical cancer, uterin serous carcinoma (USC), and acute myeloid leukemia (AML) in children (Cancer Discov.
  • MSLN3 was discovered as an antibody that specifically binds to the target antigen, mesothelin, through phage display antibody library panning.
  • the term "antibody” refers to a generic term for proteins involved in in vivo immunity by selectively acting on antigens, and the types thereof are not particularly limited.
  • the heavy and light chains of the antibody have an antigen binding site that recognizes an epitope including a variable region, and antigen specificity is revealed according to a change in the sequence of the variable region.
  • the variable region of the antigen binding site is divided into a framework region (FR) with low variability and a complementarity determining region (CDR) with high variability, and both heavy and light chains are divided into CDR1, 2, and 3. It has a CDR region and four FR regions.
  • the CDRs of each chain are typically named CDR1, CDR2, CDR3 sequentially starting from the N-terminus, and also identified by the chain in which the particular CDR is located.
  • complementarity determining region refers to a region that imparts binding specificity to an antigen among variable regions of an antibody.
  • epitope refers to a specific three-dimensional molecular structure within an antigen molecule to which an antibody can specifically bind.
  • the antibody includes all of monoclonal antibodies, multispecific antibodies, human antibodies, humanized antibodies, and chimeric antibodies (eg, humanized murine antibodies).
  • the antibody may include diabodies, triabodies, and tetrabodies.
  • an antibody includes an "antigen-binding fragment” or “antibody fragment” of an antibody having antigen-binding ability.
  • the antigen-binding fragment may be an antibody fragment comprising at least one complementarity determining region, for example, one selected from the group consisting of scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' and F(ab')2.
  • Fab has a structure having variable regions of light and heavy chains, constant regions of light chains, and a first constant region (CH1) of heavy chains, and has one antigen-binding site.
  • Fab' differs from Fab in that it has a hinge region containing one or more cysteine residues at the C-terminus of the heavy chain CH1 domain.
  • An F(ab')2 antibody is produced by forming a disulfide bond between cysteine residues in the hinge region of Fab'.
  • Fv is a minimal antibody fragment having only a heavy chain variable region and a light chain variable region.
  • Double-chain Fv two-chain Fv
  • scFv Single-chain Fv (scFv) generally has a dimer-like structure like double-chain Fv because the heavy chain variable region and light chain variable region are covalently linked through a peptide linker or directly linked at the C-terminus.
  • the anti-mesothelin antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a heavy chain CDR1 comprising an amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 1, a heavy chain CDR2 comprising an amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 2, and an amino acid sequence comprising SEQ ID NO: 3 It may be characterized in that it comprises a heavy chain CDR3, and a light chain CDR1 comprising the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 4, a light chain CDR2 comprising the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 5, and a light chain CDR3 comprising the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 6. have.
  • the anti-mesothelin antibody or antigen-binding fragment thereof has 80% or more sequence homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, preferably 90% or more sequence homology, more preferably 95% or more sequence homology. It may be characterized by comprising a heavy chain variable region comprising sequences having homology, more preferably 100% homology.
  • the anti-mesothelin antibody or antigen-binding fragment thereof has 80% or more sequence homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, preferably 90% or more sequence homology, more preferably 95% or more sequence homology. It may be characterized by comprising a light chain variable region comprising a sequence having homology, more preferably 100% homology.
  • the anti-mesothelin antibody or antigen-binding fragment thereof may include a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 and a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.
  • the anti-mesothelin antibody or antigen-binding fragment thereof comprises an anti-mesothelin antibody or antigen-binding fragment comprising a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 and a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8. It may be a mesothelin scFv (anti-MSLN3 scFv).
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof according to the above aspect may include not only the sequence of the anti-mesothelin-specific binding antibody described herein, but also a biological equivalent thereof, to the extent that it can specifically recognize mesothelin. have.
  • additional changes may be made to the amino acid sequence of the antibody to further improve its binding affinity and/or other biological properties.
  • amino acid sequence of the antibody may be substituted through conservative substitution.
  • a “conservative substitution” as used herein refers to a modification of a polypeptide that involves substituting one or more amino acids with amino acids having similar biochemical properties that do not result in loss of biological or biochemical function of the polypeptide.
  • a “conservative amino acid substitution” is a substitution in which an amino acid residue is replaced with an amino acid residue having a similar side chain.
  • Classes of amino acid residues with similar side chains have been defined in the art. These classes include amino acids with basic side chains (e.g. lysine, arginine, histidine), amino acids with acidic side chains (e.g. aspartic acid, glutamic acid), and amino acids with uncharged polar side chains (e.g.
  • glycine glycine
  • amino acids with non-polar side chains e.g., alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan
  • beta-branched side chains and amino acids with aromatic side chains eg, tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine. It can be expected that the antibody according to one aspect may still retain its original activity even if some amino acid sequences of the antibody are substituted through conservative amino acid substitutions.
  • the antibody of one aspect or the nucleic acid molecule encoding the same is interpreted as including a sequence showing substantial identity with the sequence described in SEQ ID NO.
  • the substantial identity is at least 61% when the sequence and any other sequence are aligned so as to correspond as much as possible and the aligned sequence is analyzed using an algorithm commonly used in the art.
  • homology more preferably 70% homology, still more preferably 80% homology, still more preferably 90% homology, still more preferably 95% homology, most preferably 98% homology It means a sequence showing % homology. Alignment methods for sequence comparison are known in the art.
  • Another aspect provides an isolated nucleic acid encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • nucleic acid is meant to comprehensively include DNA and RNA molecules, and nucleotides, which are basic structural units in nucleic acids, include not only natural nucleotides, but also analogs in which sugar or base sites are modified.
  • sequences of nucleic acids encoding the heavy and light chain variable regions of one aspect may be modified. Such modifications include additions, deletions, or non-conservative or conservative substitutions of nucleotides.
  • the nucleic acid is also construed to include a nucleotide sequence that exhibits substantial identity to the nucleotide sequence of the nucleic acid. Substantial identity is at least 80% when the nucleotide sequence of one aspect and any other sequence are aligned so as to correspond as much as possible, and the aligned sequence is analyzed using an algorithm commonly used in the art. A nucleotide sequence exhibiting homology, more preferably at least 90% homology, most preferably at least 95% homology.
  • Another aspect provides a vector comprising the isolated nucleic acid.
  • the vector is used to convert DNA encoding partial or full-length light and heavy chains to standard molecular biology techniques (e.g., PCR amplification or high-resolution expression of the antibody of interest).
  • cDNA cloning using hybridoma and may contain essential regulatory elements operably linked so that the DNA (gene) insert can be expressed.
  • "Operably linked" means that a nucleic acid expression control sequence and a nucleic acid sequence encoding a protein or RNA of interest are functionally linked so as to perform a general function, and a gene is produced by an expression control sequence. It means that it is connected so that it can be expressed.
  • expression control sequence refers to a DNA sequence that controls the expression of an operably linked DNA sequence in a specific host cell.
  • regulatory sequences include a promoter for effecting transcription, any operator sequence for regulating transcription, a sequence encoding a suitable mRNA ribosome binding site, a sequence for regulating termination of transcription and translation, an initiation codon, a stop codon, a polyadede nylation signals and enhancers; and the like.
  • a person skilled in the art can recognize that the design of an expression vector can be varied by selecting a regulatory sequence differently depending on factors such as the selection of a host cell to be transformed, the expression level of a protein, and the like.
  • the type of vector is not particularly limited as long as it is a vector commonly used in the fields of cloning and antibody production, and examples thereof include, but are not limited to, plasmid vectors, cosmid vectors, bacteriophage vectors, and viral vectors.
  • the plasmids include Escherichia coli-derived plasmids (pBR322, pBR325, pUC118, and pUC119, pET-21b(+)), Bacillus subtilis-derived plasmids (pUB110 and pTP5), and yeast-derived plasmids (YEp13, YEp24, and YCp50).
  • the virus may be an animal virus such as retrovirus, adenovirus or vaccinia virus, or an insect virus such as baculovirus.
  • a pComb3 series vector commonly used for phage display, etc. may be used, or a vector commonly used for protein expression in mammalian cells, such as pcDNA or pVITRO, may be used to express antibodies in mammalian cells. have.
  • Another aspect provides an isolated host cell transformed with the vector.
  • the term "transformation” means that a piece of DNA chain or a plasmid having a foreign gene of a different kind from that of the original cell penetrates into cells and binds to the DNA existing in the original cell, thereby inheriting the cell's inheritance. It refers to molecular biological techniques that change traits.
  • the vector is transfected or transfected into a host cell.
  • a variety of techniques commonly used to introduce exogenous nucleic acids (DNA or RNA) into prokaryotic or eukaryotic host cells for transfection or transfection, such as electrophoresis, calcium phosphate precipitation, DEAE-dextran Transfection or lipofection or the like can be used.
  • Antibodies or antigen-binding fragments thereof may be expressed in eukaryotic cells, preferably mammalian host cells, considering the possibility of application to microorganisms such as bacteria ( E. coli ) or yeast (Yeast), or mammalian cells.
  • the mammalian host cell is, for example, any one selected from the group consisting of Chinese Hamster Ovary (CHO) cells, NSO myeloma cells, COS cells, SP2 cells, F2N cells, HEK293 cells, and antibody-producing hybridoma cells. It may be, but is not limited thereto.
  • Another aspect provides a method for preparing an anti-mesothelin antibody comprising culturing the isolated host cell to express the antibody.
  • the method may include transforming a host cell for producing an antibody or antigen-binding fragment thereof of one aspect with a vector to which DNA encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof is operably linked.
  • the types of selected host cells and recombinant expression vectors are as described above, and this step can be carried out by selecting an appropriate transformation method.
  • a recombinant expression vector encoding the antibody gene is introduced into a mammalian host cell, the antibody is secreted for a period of time sufficient to allow expression of the antibody in the host cell, or more preferably, secretion of the antibody into the culture medium in which the host cell is cultured. It can be prepared by culturing the host cells for a sufficient period of time.
  • the method may additionally include the step of culturing the transformed isolated host cell to produce a polypeptide of an antibody or antigen-binding fragment thereof according to one aspect from a recombinant expression vector introduced into the host cell.
  • the medium composition, culture conditions, culture time, etc. for culturing the selected host cell can be appropriately selected, and the antibody molecules produced in the host cell are accumulated in the cytoplasm of the cell or secreted outside the cell or into the culture medium by an appropriate signal sequence. or targeted to a periplasm or the like.
  • the antibody according to one aspect may be refolded to have a functional structure by using a method known in the art to maintain the binding specificity to mesothelin.
  • the heavy chain and light chain when producing an antibody in the form of IgG, may be expressed in separate cells and the heavy chain and light chain may be contacted in a separate step to form a complete antibody, or the heavy chain and light chain may be expressed in the same cell to It can also be made to form complete antibodies inside cells.
  • the method may additionally include a step of obtaining an antibody or antigen-binding fragment thereof produced in the isolated host cell.
  • the method of obtaining the antibody or antigen-binding fragment thereof produced in the host cell may be appropriately selected and adjusted in consideration of the characteristics of the polypeptide, the characteristics of the host cell, the expression method, or targeting of the polypeptide.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof secreted into the culture medium can be recovered by obtaining the medium in which the host cells are cultured and removing impurities by centrifugation, etc. Cells may be lysed in a range that does not affect the functional structure of the antibody or antigen-binding fragment thereof in order to release and recover the antibody present in the organelle or cytoplasm to the outside of the cell.
  • the obtained antibody may be further subjected to a process of further removing impurities and concentrating through a method such as chromatography, filtration through a filter, or dialysis. Separation or purification of the obtained antibody can be performed by separation and purification methods commonly used for proteins, such as chromatography.
  • the chromatography may include, for example, affinity chromatography including a protein A column, protein G column, or protein L column, ion exchange chromatography, or hydrophobic chromatography.
  • antibodies can be separated and purified by further combining filtration, ultrafiltration, salting out, dialysis and the like.
  • Another aspect provides a chimeric antigen receptor comprising an antigen binding domain, a hinge domain, a transmembrane domain and an intracellular signaling domain.
  • the chimeric antigen receptor is characterized in that it specifically binds to mesothelin, it includes an antigen-binding domain that specifically binds to mesothelin.
  • the antigen-binding domain consists of heavy chain CDR1 comprising the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 1, heavy chain CDR2 comprising the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 2, heavy chain CDR3 comprising the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 3, and SEQ ID NO: 4. It may include a light chain CDR1 comprising the amino acid sequence, a light chain CDR2 comprising the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 5, and a light chain CDR3 comprising the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 6, which is an anti-mesothelin antibody or Since it is the same as its antigen-binding fragment, overlapping descriptions are omitted.
  • chimeric antigen receptor means that the structure of a chimeric antigen receptor includes an antigen binding (recognition) domain, a transmembrane domain, and an intracellular signaling domain.
  • the antigen-binding fragment may be a scFv (single chain variable fragment).
  • a hinge domain, a transmembrane domain, and an intracellular signaling domain included in the chimeric antigen receptor are well known in the art.
  • the hinge domain is a domain connecting the anti-mesothelin antibody or antigen-binding fragment thereof and the transmembrane domain, and is also called a spacer, and has the purpose of extending the antigen-binding domain from the T cell membrane.
  • the hinge domain may be a CD8 hinge domain, an IgG1 hinge domain, an IgG4 hinge domain, a CD28 extracellular region, a KIR (killer immunoglobulin-like receptor) extracellular region, and a combination thereof, but is not limited thereto, and is commonly used in the art. You can use any hinge domain you use.
  • the transmembrane domain serves as a support for the chimeric antigen receptor molecule and can connect the hinge domain and the intracellular signaling domain.
  • the transmembrane domain can penetrate the cell membrane of a cell so that the anti-mesothelin antibody or antigen-binding fragment thereof of the chimeric antigen receptor is located on the cell surface and the intracellular signaling domain is located within the cell.
  • the transmembrane domain may be a transmembrane domain of CD3zeta (CD3z), CD4, CD8, CD28 or KIR protein, preferably a transmembrane domain of CD8 or CD28 may be used, but used for preparing a chimeric antigen receptor Any common transmembrane domain may be used without limitation.
  • the intracellular signaling domain serves to receive the signal transmitted by the anti-mesothelin antibody or antigen-binding fragment thereof and deliver it into the cell to which the chimeric antigen receptor is bound.
  • the intracellular signaling domain is not particularly limited to the type, as long as it is a part that transmits a signal that can lead to T cell activation when an antibody binds to an antigen-binding site present outside the cell, and various types of intracellular signaling domains can be used
  • the intracellular signaling domain may be, for example, an immunoreceptor tyrosine-based activation motif or ITAM, and the ITAM is CD3zeta, FcR gamma, FcR beta, CD3 gamma, CD3 delta, CD3 but is not limited to those derived from epsilon, CDS, CD22, CD79a, CD79b, CD66d or Fc ⁇ RI ⁇ .
  • the chimeric antigen receptor according to one aspect may further include a costimulatory domain together with an intracellular signaling domain.
  • the costimulatory domain is a part that serves to transmit a signal to a T cell in addition to a signal by an intracellular signaling domain, and is an intracellular portion of a chimeric antigen receptor, including an intracellular domain of a costimulatory molecule.
  • the costimulatory molecule is a cell surface molecule, and refers to a molecule required to bring about a sufficient response of lymphocytes to an antigen, such as CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, LFA- 1 (lymphocyte function-associated antigen-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, or B7-H3, but is not limited thereto.
  • the costimulatory domain may be an intracellular portion of a molecule selected from the group consisting of such costimulatory molecules and combinations thereof.
  • Each domain of the chimeric antigen receptor may optionally be linked by a short oligopeptide or polypeptide linker.
  • a linker is capable of inducing T cell activation through an intracellular domain when an antigen is bound to an antibody located outside the cell, a linker known in the art may be used without being particularly limited in its length.
  • the chimeric antigen receptor may include a modified form of the antibody and domains as described above.
  • the modification may be performed by substituting, deleting, or adding one or more amino acids in the amino acid sequence of the wild-type antibody and domain without modifying the functions of the antibody and domain.
  • the substitution is an alanine, or can be made by conservative amino acid substitution that does not affect the charge, polarity or hydrophobicity of the entire protein.
  • Another aspect provides a polynucleotide encoding the chimeric antigen receptor.
  • the polynucleotide is a coding region within a range that does not change the amino acid sequence of an antigen receptor expressed from the coding region due to codon degeneracy or in consideration of codons preferred in organisms intended to express the antigen receptor.
  • Various modifications may be made to, and various modifications or modifications may be made within a range that does not affect gene expression even in parts other than the coding region, and those skilled in the art can understand that such modified genes are also included in the scope of the present invention. There will be.
  • nucleic acid bases may be mutated by substitution, deletion, insertion, or a combination thereof, and these are also included in the scope of the present invention.
  • Another aspect provides a vector comprising the polynucleotide and an isolated cell transformed with the vector.
  • Vectors of the present invention include, but are not limited to, plasmid vectors, cosmid vectors, bacteriophage vectors and viral vectors. Suitable vectors include expression control elements such as promoters, operators, initiation codons, stop codons, polyadenylation signals and enhancers, as well as signal sequences or leader sequences for membrane targeting or secretion, and may be prepared in various ways depending on the purpose.
  • cells may be transformed by introducing the vector into cells, and the isolated cells may be, but are not limited to, T cells, NK cells, NKT cells, or gamma delta ( ⁇ ) T cells.
  • the isolated cells may be obtained or prepared from bone marrow, peripheral blood, peripheral blood mononuclear cells, or umbilical cord blood.
  • Another aspect is a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising the isolated cells; medical use of the isolated cells; And it provides a method for preventing or treating cancer comprising administering a therapeutically effective amount of the isolated cells to a subject.
  • the pharmaceutical composition or medicinal use may be for preventing or treating cancer.
  • prevention refers to any activity that suppresses or delays the onset of cancer (tumor) by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention.
  • treatment refers to any activity in which symptoms of cancer (tumor) are improved or advantageously changed by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention.
  • the term "individual” means a subject in need of treatment of a disease, and more specifically, a human or non-human primate, rodent (rat, mouse, guinea pig, etc.), mouse, dog, Mammals such as cats, horses, cattle, sheep, pigs, goats, camels, and antelopes.
  • rodent rat, mouse, guinea pig, etc.
  • Mammals such as cats, horses, cattle, sheep, pigs, goats, camels, and antelopes.
  • cancer refers to aggressive characteristics in which cells divide and grow beyond normal growth limits, invasive characteristics infiltrating surrounding tissues, and metastatic characteristics spreading to other parts of the body and outside the body. It is a general term for diseases caused by cells with In the present specification, the cancer is used in the same sense as a malignant tumor, and may preferably be mesothelin-positive or mesothelin overexpressing cancer.
  • the cancer may preferably be a solid cancer, for example, more preferably a mesothelin-positive or mesothelin overexpressing solid cancer.
  • the solid cancer is esophageal cancer, breast cancer, triple-negative breast cancer (TNBC), gastric cancer, cholangiocarcinoma, pancreatic cancer, colon Colon cancer, lung cancer, thymic carcinoma, mesothelioma, ovarian cancer, endometrial cancer, cervical cancer, uterine serous carcinoma (uterine serous carcinoma: USC), non-small cell lung cancer (non-small cell lung cancer), and pediatric acute myeloid leukemia (acute myeloid leukemia: AML), but may be any one selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition may include 10 to 95% by weight of cells of one aspect, which are active ingredients, based on the total weight of the pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further contain at least one active ingredient exhibiting the same or similar function in addition to the above active ingredient.
  • the dose of the cells depends on the type of disease, the severity of the disease, the type and amount of active ingredients and other ingredients contained in the pharmaceutical composition, the type of formulation and the patient's age, weight, general health condition, sex and diet, administration time , it can be adjusted according to various factors including the route of administration, duration of treatment, and drugs used concurrently.
  • the effective amount of the cells included in the pharmaceutical composition according to the present invention may be 1 x 10 5 to 1 x 10 11 cells/kg. At this time, the administration may be administered once a day, or may be divided and administered several times. An effective amount of a cell or pharmaceutical composition presented herein can be determined empirically without undue experimentation.
  • the pharmaceutical composition may be a formulation having a formulation suitable for the purpose according to a conventional method in the pharmaceutical field.
  • the composition may be administered after being formulated into a unit dosage form suitable for administration into the body of a patient according to a conventional method in the pharmaceutical field.
  • one or more pharmaceutically acceptable conventional inert carriers for example, in the case of injections, preservatives, analgesics, solubilizers or stabilizers, etc., and in the case of formulations for topical administration, A base, excipient, lubricant or preservative may be further included.
  • the cells or pharmaceutical compositions containing them may be administered to a subject by various methods known in the art, for example, intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, or oral administration. , It may be administered by topical administration, intranasal administration, intrapulmonary administration, intrarectal administration, etc., but is not limited thereto.
  • the anti-mesothelin chimeric antigen receptor exhibits a specific binding ability to mesothelin, and thus can be usefully used for preventing or treating cancer in which mesothelin is overexpressed.
  • FIG. 1 is a diagram schematically illustrating an antibody screening process through panning of a phage display antibody library.
  • FIG. 2 shows the results of solid phase panning.
  • FIG. 2A is a diagram showing phage output titers and
  • FIG. 2B is an elution titer ratio (B) according to panning rounds.
  • Figure 3 is a diagram showing the results of comparative analysis of the specific binding to the antigen MSLN of the clones obtained through phage ELISA.
  • FIG. 4 is a view showing the result of confirming through flow cytometry whether clones selected using mesothelin-overexpressing cell lines bind to mesothelin present in actual cell membranes.
  • 5 is a diagram showing the relative peak shift values of binding specificity to mesothelin of clones selected using a mesothelin-overexpressing cell line.
  • Figure 6 is a diagram showing the results of SDS-PAGE analysis of purified anti-MSLN-scFv antibodies (loading 2 ⁇ g for each protein).
  • NR Non-reducing condition
  • R Reducing condition (100°C, 10 minutes).
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of analyzing the affinity of the anti-MSLN-scFv antibody to the antigen MSLN through ELISA.
  • FIG. 8 is a schematic diagram of an anti-MSLN-CAR expression system according to an aspect comprising an MSLN-specific antigen-binding domain.
  • Figure 9a is the result of confirming the expression of CAR in T cells into which the anti-MSLN-CAR was introduced; and FIG. 9B is a diagram showing the results of measuring the ratio of CD4+ and CD8+ T cells among CD3 positive T cells.
  • Figure 10 shows the ovarian cancer (OVCAR-3) mouse model administered with HBSS (G1), Mock (G2), CD19-CAR-T (G3), and anti-MSLN3-CAR-introduced CAR-T cells (G4). It is a diagram confirming the change in weight by date.
  • Figure 11 shows the ovarian cancer (OVCAR-3) mouse model administered with HBSS (G1), Mock (G2), CD19-CAR-T (G3), and anti-MSLN3-CAR-introduced CAR-T cells (G4).
  • This is a diagram confirming the change in tumor volume by date. (*p ⁇ 0.05 vs. the vehicle control treated group (G1))
  • Figure 12 shows the ovarian cancer (OVCAR-3) mouse model administered with HBSS (G1), Mock (G2), CD19-CAR-T (G3), and anti-MSLN3-CAR-introduced CAR-T cells (G4). It is a diagram confirming the size of the tumor on the 27th day.
  • Figure 13 shows the ovarian cancer (OVCAR-3) mouse model administered with HBSS (G1), Mock (G2), CD19-CAR-T (G3), and anti-MSLN3-CAR-introduced CAR-T cells (G4). It is a diagram confirming the weight of the tumor on the 27th day.
  • Figure 14 shows the ovarian cancer (OVCAR-3) mouse model administered with HBSS (G1), Mock (G2), CD19-CAR-T (G3), and anti-MSLN3-CAR-introduced CAR-T cells (G4). It is a diagram showing the result of confirming the result of immunohistochemical staining at a magnification of 5x.
  • Figure 15 shows the ovarian cancer (OVCAR-3) mouse model administered with HBSS (G1), Mock (G2), CD19-CAR-T (G3), and anti-MSLN3-CAR-introduced CAR-T cells (G4). It is a diagram showing the result of confirming the result of immunohistochemical staining at 20x magnification.
  • mesothelin MSLN
  • KBIO human synthetic scFv phage display library KscFv-I was used according to the phage panning protocol established by the Osong Advanced Medical Industry Promotion Foundation New Drug Development Support Center. Phage panning against MSLN (Acro Biosystems) was performed up to 4 rounds.
  • the phage display antibody library panning process is schematically shown in FIG. 1 .
  • Panning was performed in two ways (solid and bead) depending on the method of immobilizing the antigen.
  • solid phase panning immunization with 1 mL of human mesothelin protein (in PBS, 1st: 10 ⁇ g/mL, 2nd: 5 ⁇ g/mL, 3rd: 2.5 ⁇ g/mL, 4th: 1.25 ⁇ g/mL) It was fixed in a tube (immuunotube), and 1.3 x 10 13 cfu of the blocked phage library was mixed with 5mL of PBS (MPBS) containing 5% skim milk in the immunotube, and then bound at 37°C for 1.5 hours.
  • MPBS PBS
  • Example 2 Selection of positive clones through phage-specific ELISA
  • the plate contents were removed and the plate was blocked with 150 ⁇ L of 5% MPBS for 1 hour at room temperature. Then, the contents of the plate were removed, and 30 ⁇ L of phage ( ⁇ 10 11 cfu) was added and incubated for 1.5 hours at room temperature. For negative control, 30 ⁇ L of PBS was added instead of phage.
  • PBS-T PBS-0.05% Tween 20
  • anti-M13-HRP diluted 1:5,000 in PBS
  • the plate was washed 4 times with PBS-T solution, and 30 ⁇ L of TMB substrate reagent was added to each well and incubated for 8 minutes at room temperature to induce a color reaction. After stopping the color reaction by adding 30 ⁇ L of 2N H 2 SO 4 per well, absorbance (OD) at 450 nm was measured.
  • Example 3 In order to determine whether the 19 phage clones selected in Example 3 bind to mesothelin present in the actual cell membrane, flow cytometry was performed using the pancreatic cancer cell line AsPC-1, a mesothelin overexpressing cell line, and the human chronic myeloid leukemia cell line K562 as a control. A flow cytometry analysis was performed.
  • K562 and AsPC-1 cells were prepared to be 10 6 cells/well and washed with 300 ⁇ L of PBS. Cells were blocked for 30 minutes at 4°C with 300 ⁇ L of 4% MPBS, and at the same time, phage clones (10 12 /well) were blocked for 1 hour at room temperature, and then the phages and cells were incubated together at 4°C for 2 hours. After washing the cells with PBS, the cells were treated with 1 ⁇ g/mL of anti-M13-FITC and incubated at 4° C. for 1 hour. After washing the cells with PBS, the cells were resuspended in PBS and the results were analyzed using a flow cytometer (BD biosciences). The results are shown in Figures 4 and 5.
  • MSLN3, MSLN6, and MSLN10 exhibited a relative peak shift value of 3.0% or more in the pancreatic cancer cell line AsPC-1. In the control K562 cell line, no significant peak shift was observed. From the above results, it was found that among the 19 clones, MSLN3, MSLN6 and MSLN10 showed high binding affinity to mesothelin present in the actual cell membrane.
  • MSLN3, MSLN6, and MSLN10 showed relative peak shift values of 23.8%, 7.2%, and 4.8%, respectively, compared to the control K562 cells.
  • all three clones specifically bind to the cell line in which mesothelin is overexpressed, and finally selected as clones for producing anti-MSLN antibody fragments.
  • Example 6 Affinity analysis of anti-MSLN antibodies to antigens and selection of clones to be used as final anti-MSLN chimeric antigen receptors
  • the affinity of each antibody to the antigen MSLN was compared and analyzed through ELISA using the three anti-MSLN antibody proteins prepared in Example 5 above. Specifically, a MaxiSorb ELISA plate (Nunc) was coated with 30 ⁇ L of human mesothelin protein at a concentration of 1 ⁇ g/mL per well and incubated at 4° C. overnight. Plate contents were removed and plates were blocked with 300 ⁇ L of 5% MPBS for 1 hour at room temperature. The purified antibody was serially diluted in PBS, and 30 ⁇ L was added to each well and incubated for 2 hours at room temperature. As a negative control, 60 ⁇ L of PBS was added instead of the purified antibody and incubated at 37° C. for 2 hours.
  • the EC 50 values of the three antibodies were 145 nM, 67 nM, and 91 nM for MSLN3, MSLN6, and MSLN10, respectively, confirming that MSLN3 showed the highest binding affinity among the three antibodies (see Table 4 below). ).
  • the MSLN3 was finally selected as a clone for producing an anti-MSLN antibody fragment, and the amino acid sequence of MSLN3 was confirmed and shown in Table 5 below.
  • the heavy chain CDR1-3 amino acid sequence of MSLN3 is shown in SEQ ID NOS: 1 to 3
  • the light chain CDR1-3 amino acid sequence is shown in SEQ ID NOS: 4 to 6, respectively
  • the heavy chain amino acid sequence and light chain amino acid sequence are shown in SEQ ID NOS: 7 and 8, respectively. shown in
  • Heavy chain CDR1-3 and light chain CDR1-3 amino acid sequences of MSLN3 from MSLN3 clones area amino acid sequence sequence number HCDR1 DYAMS One HCDR2 AISSSGGTTYYADSVKG 2 HCDR3 EEEGEWREYFDV 3 LCDR1 RASQSISSYLN 4 LCDR2 ATSTLQS 5 LCDR3 QQSYTFPYT 6 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISSSGGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKEEEGEWREYFDVWGQGTLVTVSS 7 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYATSTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQSYTFPYTFGQGTKVEIK 8
  • anti-MSLN-CAR anti-MSLN chimeric antigen receptor
  • the vector belongs to the second-generation CAR lentiviral vector (pLV lentiviral vector) system possessed by the New Drug Development Support Center, and the system includes pMDLg / pRRE (addgene) encoding gag / pol, envelope encoding Rev protein ) plasmid pRSV-Rev (addgene) and the envelope plasmid pMD2.G (addgene) encoding the VSV-G protein.
  • pMDLg / pRRE addgene
  • pRSV-Rev addgene
  • pMD2.G addgene
  • Example 6 gene cloning was performed on the anti-MSLN scFv (antigen-binding domain) prepared in Example 6.
  • Each anti-MSLN scFv and lentiviral vector of MSLN3 was digested with XhoI (R0146S, NEB) and EcoRI (R0101, NEB) at 37°C for 2 hours, subjected to agarose gel electrophoresis, and the identified products Purification was performed using FavorPrep Gel/PCR purification Mini kit (Favorgen).
  • Each purified anti-MSLN scFv (100 ng) and vector (50 ng) were reacted at a ratio of 2:1 at 16 ° C for 16 hours to ligation, and then transformed into Stbl3 competent cells to form colonies was obtained.
  • the colony was picked and grown in 5 mL of LB medium (ampicillin) to obtain plasmid DNA using a DNA plasmid mini-prep method.
  • the plasmid DNA was digested with XhoI and EcoRI to confirm whether each inserted anti-MSLN scFv was well cloned into the vector. Afterwards, sequencing was performed to finally confirm the DNA sequence.
  • the CD8 hinge and CD8 TM transmembrane as transmembrane regions
  • the cytoplasmic region of 4-1BB as a signaling domain
  • the intracellular domain of CD3 zeta (CD3z) as a T cell activation domain
  • CD8 signal peptide SEQ ID NO: 10
  • anti-MSLN3 scFv SEQ ID NO: 11
  • CD8 hinge region SEQ ID NO: 12
  • CD8 transmembrane region SEQ ID NO: 13
  • 4-1BB It consists of a signaling domain (SEQ ID NO: 14) and a CD3 zeta signaling domain (SEQ ID NO: 15).
  • SEQ ID NO: 14 signaling domain
  • CD3 zeta signaling domain SEQ ID NO: 15
  • the anti-MSLN-CAR lentivirus was produced by introducing the recombinant vector prepared in Example 7-1 into HEK293T cells.
  • a schematic diagram of an anti-MSLN-CAR expression system according to one aspect comprising an MSLN-specific antigen-binding domain is shown in FIG. 8 .
  • HEK293T cells were seeded in 100 mm tissue culture dishes at 6 x 10 6 cells/dish.
  • MSLN-CAR-pLV, pMDLg/pRRE (addgene), pRSV-Rev (addgene), pMD2 were treated with Lipofectamine 3000 (Thermofisher) according to the reagent instructions. Transformation of .G (addgene) (5.5 ⁇ g:3.5 ⁇ g:1.5 ⁇ g:2 ⁇ g) was performed. CD19 (FMC63) was used as a control. After 4 hours of transformation, the medium was replaced with DMEM medium containing 3% FBS (Gibco), and the virus culture medium was harvested after 48 hours.
  • Anti-CD3 (1 ⁇ g/mL) and anti-CD28 (3 ⁇ g/mL) antibodies were prepared in 5 mL of DPBS to the designated concentrations, vortexed, and then coated on a 24-well plate at 500 ⁇ l/well and stored overnight in a refrigerator at 4°C. did The next day, PBMC (primary human PBMC) was dissolved in 9 mL of T cell culture medium (10% FBS + RPMI1640 + 200 IU IL-2) and centrifuged at 1,500 rpm for 5 minutes.
  • the supernatant was removed, resuspended in 1 mL of the culture medium, and cell counting was performed, diluted to 1 x 10 6 cells/mL, seeded in an antibody-coated 24-well plate, and cultured in a CO 2 incubator at 37°C. .
  • all the PBMC cells were harvested, and the lentivirus was adjusted to an MOI (multiple of infection) of 5 at 5 x 10 5 cells/500 ⁇ L for lentiviral infection, and 10 ⁇ g/mL of protamine sulfate was added to infect new cells.
  • 24-well plates were seeded (a). The 24-well plate was centrifuged at 300 g and 32° C. for 90 minutes, and then placed in a 37° C.
  • T cells into which the anti-MSLN-CAR prepared in Example 8-1 was introduced Five days after the completion of lentiviral transduction of T cells, some anti-MSLN-CAR-T cells were harvested, biotin-MSLN (Acrobiosystems or Biolegend) was added, and incubated on ice for 20 minutes, the cells were washed, and PE-antibody - Add 1 ⁇ L of biotin and incubate on ice for 20 minutes. After washing the cells, the CAR expression rate was confirmed using FACS Canto II (BD), which is shown in FIG. 9A and Table 7.
  • BD FACS Canto II
  • Example 9 Confirmation of cancer cell killing effect of anti-MSLN-CAR-T cells based on tumor animal model
  • the cells used in the ovarian cancer animal model were tested for Mycoplasma pneumoniae , Murine coronavirus (Mouse hepatitis virus, MHV), and Murine respirovirus (Sendai virus, SeV) and were confirmed negative before use.
  • a medium composed of RPMI 1640, 20% FBS, and 1% P/S (penicillin/streptomycin) the cells were cultured in a CO 2 incubator at 37° C. and 5% CO 2 conditions.
  • RPMI 1640 (LM01 51, Welgene) medium was used.
  • the transplanted cancer cells and CAR-T cells and the composition of the test group are shown in Table 8 below.
  • Cell concentration was adjusted using PBS, and 200 ⁇ L of each cell was subcutaneously implanted into mice, and groups were separated by random distribution method based on tumor size. Individual identification was performed using the ear-punch method during the test period, and An identification card was attached to each group.
  • anti-MSLN-CAR-T cells were administered single-dose through a tail vein, and the body weight, tumor size, tumor volume, and tumor weight of the test group were measured twice a week from the start of administration.
  • Weight gain was calculated using the formula below.
  • Tumor volume (mm 3 ) was calculated using the following formula after measuring the short axis (A) and long axis (B) of the tumor using calipers.
  • the tumor volume of the anti-MSLN3-CAR-T administration group which is the G4 group compared to the G1, G2, and G3 groups, hardly increased from the day of administration, and the tumor began to decrease from the 8th day after administration. A decreasing trend was confirmed.
  • Figure 12 is a visual confirmation of the tumor size of each test group and control group on day 27 after CAR-T cell administration, and as confirmed in Figure 12, it was confirmed that the tumor size of the G4 group was significantly smaller than that of the G1 control group. .
  • tumor weight did not increase after CAR-T administration, and tumor volume, tumor size and tumor It was confirmed that the weight of was also significantly decreased, confirming the cancer cell killing effect of anti-MSLN3-CAR-T in an ovarian cancer animal model expressing mesothelin.
  • a single dose of anti-MSLN-CAR-T cells was administered intravenously, and anesthesia was induced by intraperitoneal injection of 50 mg/kg of Zoletil TM and 10 mg/kg of Xylazine, and the peritoneal cavity was induced. Euthanasia was performed by exsanguination after blood was drawn from the abdominal vena cava by opening the stomach. Thereafter, 3 cells per group were randomly selected, and some of the isolated tumors were fixed in 10% neutral formalin, and then slides were prepared and immunohistochemical staining (Immunohistochemistry: IHC) was performed for hCD3 ⁇ (cell signaling, Cat. No 58061). .
  • IHC immunohistochemical staining
  • intratumoral T cell infiltration was confirmed in the G2, G3, and G4 groups, and it was confirmed that the prepared MSLN-CAR-T cells effectively infiltrated intratumoral T cells.
  • the tumor was in a very small state at the time of autopsy, and it was confirmed that the tumor was completely remitted (CR).
  • CR remitted
  • necrosis was confirmed in the tumor. Therefore, overall, it was confirmed that T cell infiltration into tumors was relatively high in a large number of individuals in the G4 group to which MSLN-CAR-T was administered.

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Abstract

메소텔린에 특이적으로 결합하는 항-메소텔린 키메릭 항원 수용체에 관한 것이다. 일 양상에 따른 항-메소텔린 키메릭 항원 수용체는 메소텔린에 대한 특이적 결합능을 나타내어, 메소텔린이 과발현되는 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

항 메소텔린 scFv를 포함하는 키메릭 항원 수용체 및 이의 용도
메소텔린에 특이적으로 결합하는 항-메소텔린 키메릭 항원 수용체 및 이의 용도에 관한 것이다.
최근 면역관문억제제, CAR-T 세포 치료제와 같은 면역항암제가 다양한 암에서 효과를 입증하고 있지만, 고형암은 이러한 새로운 형태의 면역항암제에도 치료효율이 크게 반응하지 않는다고 보고된다. 이는 종양을 둘러싼 섬유 조직이 면역치료 반응을 방해하고, 약물 전달이 어렵기 때문으로 추정된다. 따라서, 특이적이고 보다 효과적인 CAR-T 암 치료 방법으로서 고형암 세포 표면에 특이적으로 과발현되는 단백질을 암 항원으로써 표적하는 항체를 개발하고, 이를 이용하여 효과적으로 고형암을 치료할 수 있는 방법에 대한 연구의 필요성이 대두되고 있다.
한편, 메소텔린은 글리코실포스파티딜이노시톨 (GPI) 도메인에 의해 세포 표면에 앵커링된 당단백질로, 인체의 강 (cavity)과 내부기관을 둘러싸는 중피 (mesothelium)에 제한적으로 낮게 발현하는 것이 정상이나 췌장암, 중피종, 난소암, 비소세포성 폐암 등의 암에서 풍부하게 발현되는 것으로 알려져 있다.
일 양상은 항-메소텔린 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 항-메소텔린 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 분리된 핵산을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 분리된 핵산을 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 벡터로 형질전환된 분리된 숙주세포를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 분리된 숙주세포를 배양하여 항체를 발현시키는 단계를 포함하는 항-메소텔린 항체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 항원 결합 도메인, 힌지 (hinge) 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메릭 항원 수용체를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 키메릭 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 벡터로 형질전환된 분리된 세포를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 분리된 세포를 포함하는 약학적 조성물; 상기 세포의 의약적 용도; 및 치료학적 유효량의 상기 세포를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 목적 및 이점은 첨부한 청구범위 및 도면과 함께 하기의 상세한 설명에 의해 보다 명확해질 것이다. 본 명세서에 기재되지 않은 내용은 본 출원의 기술 분야 또는 유사한 기술 분야 내 숙련된 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략한다.
본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
일 양상은 항-메소텔린 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
상기 "메소텔린 (mesothelin: MSLN)"은 총 아미노산 길이가 630aa인 세포 표면 당단백질로 (NCBI Gene ID: 10232), 일부 세포, 특히 특정 종양 세포에서 선택적으로 발현되며, 하기에 메소텔린 단백질의 아미노산 서열을 나타내었다.
MALPTARPLLGSCGTPALGSLLFLLFSLGWVQPSRTLAGETGQEAAPLDGVLANPPNISSLSPRQLLGFPCAEVSGLSTERVRELAVALAQKNVKLSTEQLRCLAHRLSEPPEDLDALPLDLLLFLNPDAFSGPQACTRFFSRITKANVDLLPRGAPERQRLLPAALACWGVRGSLLSEADVRALGGLACDLPGRFVAESAEVLLPRLVSCPGPLDQDQQEAARAALQGGGPPYGPPSTWSVSTMDALRGLLPVLGQPIIRSIPQGIVAAWRQRSSRDPSWRQPERTILRPRFRREVEKTACPSGKKAREIDESLIFYKKWELEACVDAALLATQMDRVNAIPFTYEQLDVLKHKLDELYPQGYPESVIQHLGYLFLKMSPEDIRKWNVTSLETLKALLEVNKGHEMSPQAPRRPLPQVATLIDRFVKGRGQLDKDTLDTLTAFYPGYLCSLSPEELSSVPPSSIWAVRPQDLDTCDPRQLDVLYPKARLAFQNMNGSEYFVKIQSFLGGAPTEDLKALSQQNVSMDLATFMKLRTDAVLPLTVAEVQKLLGPHVEGLKAEERHRPVRDWILRQRQDDLDTLGLGLQGGIPNGYLVLDLSMQEALSGTPCLLGPGPVLTVLALLLASTLA (서열번호 9)
메소텔린은 정상 중피 세포 (mesothelial cells)에서는 낮은 발현을 보이지만, 고형암 (고형 종양)에서 높게 발현되며, 식도암 (esophageal cancer), 유방암 (breast cancer), 삼중음성 유방암 (triple-negative breast cancer: TNBC), 위암 (gastric cancer), 담관암 (cholangiocarcinoma), 췌장암 (pancreatic cancer), 대장암 (colon cancer), 폐암 (lung cancer), 흉선암 (thymic carcinoma), 중피종 (mesothelioma), 난소암 (ovarian cancer), 자궁내막암 (endometrial cancer), 자궁경부암 (cervical cancer), 자궁 장액성 암종 (uterin serous carcinoma: USC) 및 소아 급성 골수성 백혈병 (acute myeloid leukemia: AML) 등에서 과발현이 확인되었다 (Cancer Discov. 2016 Feb;6(2):133-46.; J Reprod Immunol. 2020;139:103115.; Gynecol Oncol. 2007;105(3):563-570.; Eur J Haematol. 2007;79(4):281-286.).
일 실시예에서는, 파지 디스플레이 항체 라이브러리 패닝을 통해 표적 항원인 메소텔린에 특이적으로 결합하는 항체로서 MSLN3을 발굴하였다.
본 명세서에서 용어 "항체"는 항원에 선택적으로 작용하여 생체 면역에 관여하는 단백질의 총칭을 말하는 것으로, 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 항체의 중쇄와 경쇄는 가변영역을 포함하는 에피토프를 인식하는 항원 결합 부위를 가지고 있고, 가변영역의 서열 변화에 따라 항원 특이성이 나타나게 된다. 항원 결합 부위의 가변영역은 가변성이 적은 구조 영역 (Framework region: FR)과 가변성이 큰 상보성 결정 영역 (Complementarity determining region: CDR)으로 나눠지고, 중쇄와 경쇄 모두 CDR1, 2, 3 로 나눠지는 3개의 CDR 부위와, 4개의 FR 부위를 가진다. 각각의 사슬의 CDR은 전형적으로 N-말단으로부터 시작하여 순차적으로 CDR1, CDR2, CDR3로 명명되고, 또한 특정 CDR이 위치하고 있는 사슬에 의해서 식별된다.
본 명세서에서 용어 "상보성 결정 영역"은 항체의 가변영역 중에서 항원과의 결합 특이성을 부여하는 부위를 의미한다.
본 명세서에서 용어 "에피토프"는 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 항원분자 내의 특정한 입체분자구조를 의미한다.
상기 항체는 단일클론 항체, 다특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메릭 항체(예를 들어, 인간화 뮤린 항체)를 모두 포함한다. 또한, 상기 항체는 디아바디, 트리아바디, 및 테트라바디를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 항체란 항원 결합능을 보유한 항체의 "항원 결합 단편" 또는 "항체 단편"을 포함한다. 상기 항원 결합 단편은 상보성 결정 영역을 하나 이상 포함하는 항체 단편, 예컨대, scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' 및 F(ab')2로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변영역 및 중쇄의 첫번째 불변영역 (CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역 (hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역만을 가지고 있는 최소의 항체조각이다. 이중쇄 Fv (two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 연결되어 있다. 단쇄 Fv (single-chain Fv: scFv)는 일반적으로 펩티드 링커를 통하여 중쇄의 가변영역과 경쇄의 가변영역이 공유결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다.
일 양상의 항-메소텔린 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 1로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열번호 2로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 서열번호 3으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 및 서열번호 4로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호 5로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 서열번호 6으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 항-메소텔린 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 7로 이루어진 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 상동성 (sequence homology), 바람직하게는 90% 이상의 서열 상동성, 보다 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성, 보다 더 바람직하게는 100%의 상동성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 항-메소텔린 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 8로 이루어진 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 상동성 (sequence homology), 바람직하게는 90% 이상의 서열 상동성, 보다 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성, 보다 더 바람직하게는 100%의 상동성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 항-메소텔린 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 7로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 8로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 항-메소텔린 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 7로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 8로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항-메소텔린 scFv일 수 있다 (항-MSLN3 scFv).
상기 일 양상에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 메소텔린을 특이적으로 인식할 수 있는 범위 내에서, 본 명세서에 기재된 항-메소텔린 특이적 결합 항체의 서열뿐만 아니라, 이의 생물학적 균등물도 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 보다 더 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 추가적인 변화를 줄 수 있다.
예를 들어, 상기 항체는 보존적 치환을 통해서 항체의 아미노산 서열이 치환될 수 있다. 여기서 "보존적 치환"이란 1개 이상의 아미노산을 해당 폴리펩티드의 생물학적 또는 생화학적 기능의 손실을 야기하지 않는 유사한 생화학적 특성을 갖는 아미노산으로 치환하는 것을 포함하는 폴리펩티드의 변형을 지칭한다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기를 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체시키는 치환이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 부류는 당업계에 규정되어 있다. 이들 부류는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 대전되지 않은 극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 글리신, 아스파라진, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비-극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지된 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 일 양상에 따른 항체가 보존적 아미노산 치환을 통해 항체의 일부 아미노산 서열이 치환되더라도 여전히 원래의 활성을 보유할 수 있음을 예상할 수 있다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 일 양상의 항체 또는 이를 코딩하는 핵산 분자는 서열번호에 기재된 서열과 실질적인 동일성 (substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인 (align)하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 61%의 상동성, 보다 바람직하게는 70%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 80%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 90%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 95%의 상동성, 가장 바람직하게는 98%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다.
다른 양상은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 분리된 핵산을 제공한다.
본 명세서에서 용어 "핵산"은 DNA 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미이며, 핵산에서 기본 구성단위인 뉴클레오티드는 자연의 뉴클레오티드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다. 일 양상의 중쇄 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산의 서열은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오티드의 추가, 결실, 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.
상기 핵산은 상기 핵산의 뉴클레오티드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오티드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 실질적인 동일성은 일 양상의 뉴클레오티드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인 (align)하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인 된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성을 나타내는 뉴클레오티드 서열을 의미한다.
또 다른 양상은 상기 분리된 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
상기 벡터는 적합한 숙주세포 (host cell)에서 항체 또는 그의 항체 단편의 발현을 위하여, 부분적이거나 전장인 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA를 표준 분자 생물학 기술 (예를 들어 PCR 증폭 또는 목적 항체를 발현하는 하이브리도마를 사용한 cDNA 클로닝)로 수득할 수 있으며, DNA (유전자) 삽입물이 발현될 수 있도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함할 수 있다. "작동가능하게 연결된 (operably linked)"이란 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현 조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결 (functional linkage)되어 있는 것으로, 발현 조절 서열에 의해 유전자가 발현될 수 있도록 연결된 것을 의미한다.
상기 "발현 조절 서열 (expression control sequence)"이란 특정한 숙주세포에서 작동가능하게 연결된 DNA 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 전사, 및 해독의 종결을 조절하는 서열, 개시 코돈, 종결 코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 등을 포함한다. 당업자는 형질전환시킬 숙주세포의 선택, 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자에 따라 조절 서열을 달리 선택하여, 발현 벡터의 디자인이 달라질 수 있음을 인식할 수 있다.
상기 벡터는 클로닝과 항체 제조 분야에서 통상적으로 사용되는 벡터라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으며, 그 예로는 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 박테리오파지 벡터, 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 상기 플라스미드에는 대장균 유래 플라스미드 (pBR322, pBR325, pUC118, 및 pUC119, pET-21b(+)), 바실러스 서브틸리스 유래 플라스미드 (pUB110 및 pTP5), 및 효모 유래 플라스미드 (YEp13, YEp24, 및 YCp50) 등이 있으며, 상기 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 백시니아 바이러스와 같은 동물 바이러스, 배큘로 바이러스와 같은 곤충 바이러스 등이 사용될 수 있다. 파지 표시 등에 통상적으로 사용되는 pComb3 계열의 벡터를 사용할 수도 있고, 항체를 포유류 세포에서 발현하기 위하여 포유류 세포에서 단백질을 발현하기 위하여 통상적으로 사용되는 벡터, 예를 들어 pcDNA 나 pVITRO 등의 벡터를 사용할 수 있다.
또 다른 양상은 상기 벡터로 형질전환된 분리된 숙주세포를 제공한다.
본 명세서에서 용어 "형질전환 (transformation)"은 본래의 세포가 가지고 있던 것과 다른 종류의 외래 유전자가 있는 DNA사슬 조각 또는 플라스미드가 세포들 사이에 침투되어 원래 세포에 존재하던 DNA와 결합함으로써 세포의 유전형질을 변화시키는 분자생물학적 기술을 의미한다. 상기 벡터는 숙주세포에 형질주입 또는 트랜스펙션 (transfection)된다. 형질주입 또는 트랜스펙션시키기 위해 원핵 또는 진핵 숙주세포 내로 외인성 핵산 (DNA 또는 RNA)을 도입하는 데에 통상 사용되는 여러 종류의 다양한 기술, 예를 들어 전기 영동법, 인산칼슘 침전법, DEAE-덱스트란 트랜스펙션 또는 리포펙션 (lipofection) 등을 사용할 수 있다.
일 양상에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 박테리아 (E. coli)나 효모 (Yeast)등의 미생물, 또는 포유류 세포에의 적용 가능성을 고려하여 진핵 세포, 바람직하게는 포유류 숙주세포에서 발현될 수 있다. 상기 포유류 숙주세포는 예를 들어, 중국 햄스터 난소 (Chinese Hamster Ovary: CHO) 세포, NSO 골수종 세포, COS 세포, SP2 세포, F2N 세포, HEK293 세포 및 항체 생산 하이브리도마 세포로 이루어지는 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또 다른 양상은 상기 분리된 숙주세포를 배양하여 항체를 발현시키는 단계를 포함하는 항-메소텔린 항체를 제조하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 일 양상의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생산하기 위한 숙주세포를 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 DNA가 작동가능하게 연결된 벡터로 형질전환하는 단계를 포함할 수 있다. 선택된 숙주세포와 재조합 발현 벡터의 종류는 앞서 서술한 바와 같으며, 적절한 형질전환 방법을 선택하여 본 단계를 실시할 수 있다. 상기 항체 유전자를 코딩하는 재조합 발현 벡터가 포유류 숙주세포 내로 도입될 경우 항체는 숙주세포에서 항체가 발현되게 하기에 충분한 기간 동안, 또는 더 바람직하게는 숙주세포가 배양되는 배양 배지 내로 항체가 분비되게 하기에 충분한 기간 동안 숙주세포를 배양함으로써 제조될 수 있다.
또한, 상기 방법은 추가적으로 상기 형질전환된 분리된 숙주세포를 배양하여 숙주세포에 도입된 재조합 발현 벡터로부터 일 양상에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 폴리펩티드가 생산되도록 하는 단계를 포함할 수 있다. 선택한 숙주세포를 배양하기 위한 배지 조성과 배양 조건, 배양 시간 등을 적절하게 선택할 수 있으며, 숙주세포에서 생산되는 항체 분자는 세포의 세포질 내에 축적되거나, 적절한 신호 서열에 의하여 세포 외부 또는 배양 배지로 분비되거나, 페리플라즘 등으로 표적화되도록 할 수 있다. 또한, 일 양상에 따른 항체가 메소텔린에 대한 결합특이성을 유지하도록 당업계에 공지되어 있는 방법을 이용하여 단백질 리폴딩 시키고 기능성 구조를 갖도록 할 수 있다. 또한 IgG 형태의 항체를 생산하는 경우, 중쇄와 경쇄는 별개의 세포에서 발현시키고 별도의 단계에서 중쇄와 경쇄를 접촉시켜 완전한 항체를 구성하도록 제조할 수도 있고, 중쇄와 경쇄를 동일한 세포에서 발현되도록 하여 세포 내부에서 완전한 항체를 형성하도록 할 수도 있다.
또한, 상기 방법은 분리된 숙주세포에서 생산된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 수득하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 숙주세포에서 생산된 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 폴리펩티드의 특성, 숙주세포의 특성, 발현 방식 또는 폴리펩티드의 표적화 여부 등을 고려하여 수득 방법을 적절히 선택 및 조절할 수 있다. 예를 들어, 배양 배지로 분비된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 숙주세포를 배양한 배지를 수득하고, 원심 분리하여 불순물을 제거하는 등의 방법으로 항체를 회수할 수 있고, 필요에 따라 세포 내 특정 소기관이나 세포질에 존재하는 항체를 세포 외부로 방출하여 회수하기 위하여 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 기능적 구조에 영향을 미치지 않는 범위에서 세포를 용해시킬 수도 있다.
수득한 항체는 크로마토그래피, 필터 등에 의한 여과, 투석 등의 방법을 통해 불순물을 더욱 제거하고 농축하는 과정을 추가로 거칠 수 있다. 수득한 항체의 분리 또는 정제는 통상의 단백질에서 사용되고 있는 분리, 정제 방법, 예를 들어 크로마토그래피에 의해 수행될 수 있다. 상기 크로마토그래피는 예를 들어, 단백질 A 컬럼, 단백질 G 컬럼, 단백질 L 컬럼을 포함하는 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 또는 소수성 크로마토그래피를 포함할 수 있다. 상기 크로마토그래피 이외에, 추가로 여과, 초여과, 염석, 투석 등을 조합함으로써 항체를 분리, 정제할 수 있다.
또 다른 양상은 항원 결합 도메인, 힌지 (hinge) 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메릭 항원 수용체를 제공한다.
상기 키메릭 항원 수용체는 메소텔린에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하므로, 메소텔린에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인을 포함한다.
상기 항원 결합 도메인은 서열번호 1로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열번호 2로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 서열번호 3으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 및 서열번호 4로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호 5로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 서열번호 6으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함할 수 있으며, 이는 일 양상에 따른 항-메소텔린 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 동일하므로 중복되는 설명은 생략한다.
본 명세서에서 용어 "키메릭 항원 수용체 (chimeric antigen receptor: CAR)"는 항원 결합 (인식) 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인이 포함되어 키메릭 항원 수용체의 구조를 이루고 있는 것을 의미한다.
일 구체예에 있어서, 상기 항원 결합 단편은 scFv (single chain variable fragment)일 수 있다.
상기 키메릭 항원 수용체에 포함되는 힌지 (hinge) 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다.
상기 힌지 도메인은 항-메소텔린 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 막관통 도메인을 연결하는 도메인으로서, 스페이서 (spacer)라고도 명명되고, T 세포막으로부터 항원 결합 도메인을 확장하기 위한 목적을 갖는다. 상기 힌지 도메인은 CD8 힌지 도메인, IgG1 힌지 도메인, IgG4 힌지 도메인, CD28 세포외 영역, KIR (killer immunoglobulin-like receptor) 세포외 영역 및 이의 조합일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 본 기술분야에서 통상적으로 사용하는 힌지 도메인을 사용할 수 있다.
상기 막관통 도메인은 키메릭 항원 수용체 분자의 지지대 역할을 함과 동시에 힌지 도메인과 세포내 신호전달 도메인을 연결할 수 있다. 막관통 도메인은 키메릭 항원 수용체의 항-메소텔린 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 세포 표면에 위치하고, 세포내 신호전달 도메인이 세포 내에 위치하도록 세포의 세포막을 관통할 수 있다. 상기 막관통 도메인은 CD3제타 (CD3z), CD4, CD8, CD28 또는 KIR 단백질의 막관통 영역일 수 있으며, 바람직하게는 CD8 또는 CD28의 막관통 도메인을 사용할 수 있으나, 키메릭 항원 수용체 제조에 사용되는 통상적인 막관통 도메인이라면 제한없이 사용할 수 있다.
상기 세포내 신호전달 도메인은 항-메소텔린 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 의해 전달된 신호를 받아, 키메릭 항원 수용체가 결합된 세포 내로 이를 전달하는 역할을 한다. 상기 세포내 신호전달 도메인은 세포 외에 존재하는 항원 결합 부위에 항체가 결합하면, T 세포 활성화를 가져올 수 있는 신호를 전달하는 부분이라면 특별히 그 종류에 제한되지 않으며, 다양한 종류의 세포내 신호전달 도메인이 사용될 수 있다. 상기 세포내 신호전달 도메인은 예를 들어, 면역수용체 티로신-기초한 활성화 모티프 (tyrosine-based activation motif) 또는 ITAM일 수 있으며, 상기 ITAM은 CD3제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CDS, CD22, CD79a, CD79b, CD66d 또는 FcεRIγ에서 유래한 것을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 일 양상에 따른 키메릭 항원 수용체는 세포내 신호전달 도메인과 함께 공동자극 도메인 (costimulatory domain)을 추가로 포함할 수 있다.
상기 공동자극 도메인은, 세포내 신호전달 도메인에 의한 신호에 더하여, T 세포에 신호를 전달하는 역할을 수행하는 부분으로서, 공동자극 분자의 세포 내 도메인을 포함하는, 키메릭 항원 수용체의 세포 내 부분을 의미한다.
상기 공동자극 분자는 세포 표면 분자로서, 항원에 대한 림프구의 충분한 반응을 가져오는데 필요한 분자를 의미하며, 그 예로 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, LFA-1 (lymphocyte function-associated antigen-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, 또는 B7-H3일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 공동자극 도메인은 이러한 공동자극 분자 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 분자의 세포 내 부분일 수 있다.
상기 막통과 도메인, 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메릭 항원 수용체의 각 도메인들은 선택적으로 짧은 올리고펩티드 또는 폴리펩티드 링커에 의해 연결될 수 있다. 상기 링커는 세포 외에 위치한 항체에 항원이 결합하였을 때, 세포 내 도메인을 통한 T 세포 활성화를 유도할 수 있는 것이라면, 특별히 그 길이에 제한되지 않고 당업계에 알려진 링커를 사용할 수 있다.
또한, 상기 키메릭 항원 수용체는 전술한 바와 같은 항체 및 도메인들의 변형된 형태를 포함할 수 있다. 이때, 상기 변형은 상기 항체 및 도메인들의 기능을 변형시키지 않고, 야생형의 항체 및 도메인의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산을 치환, 결실 또는 추가하여 수행될 수 있다. 통상적으로, 상기 치환은 알라닌이거나, 전체 단백질의 전하, 극성 또는 소수성에 영향을 주지 않는 보존적 아미노산 치환 (conservative amino acid substitution)에 의해 수행될 수 있다.
또 다른 양상은 상기 키메릭 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
상기 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성 (degeneracy)으로 인하여 또는 상기 항원 수용체를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩영역으로부터 발현되는 항원 수용체의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함됨을 당업자는 잘 이해할 수 있을 것이다. 즉, 일 양상에 따른 폴리뉴클레오티드는 이와 동등한 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 한, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 이들 또한 본 발명의 범위에 포함된다.
또 다른 양상은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 분리된 세포를 제공한다.
상기 벡터는 당 분야에 공지된 벡터를 다양하게 사용할 수 있고, 상기 항원 수용체를 생산하고자 하는 숙주세포의 종류에 따라 프로모터 (promoter), 종결자 (terminator), 인핸서 (enhancer) 등과 같은 발현조절 서열, 막 표적화 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 선택하고 목적에 따라 다양하게 조합할 수 있다. 본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오 파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다.
또한, 상기 벡터를 세포에 도입하여 세포를 형질전환시킬 수 있고, 상기 분리된 세포는 이에 제한되는 것은 아니나 T 세포, NK 세포, NKT 세포 또는 감마델타 T 세포 (gamma delta (γδ) T cells)일 수 있다. 상기 분리된 세포는 골수, 말초혈액, 말초혈액단핵세포 또는 제대혈로부터 얻거나 제조될 수 있다.
또 다른 양상은 상기 분리된 세포를 포함하는 약학적 조성물; 상기 분리된 세포의 의약적 용도; 및 치료학적 유효량의 상기 분리된 세포를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
상기 약학적 조성물은 전술한 분리된 세포를 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
상기 약학적 조성물 또는 의약적 용도는 암의 예방 또는 치료를 위한 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어, "예방"이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 암 (종양)을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서 용어, "치료"란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 암 (종양)에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서 용어, "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 설치류 (랫트, 생쥐, 기니피그 등), 생쥐 (mouse), 개, 고양이, 말, 소, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양 등의 포유류를 의미한다.
본 명세서에서 용어 "암"은 세포가 정상적인 성장 한계를 무시하고 분열 및 성장하는 공격적 (aggressive) 특성, 주위 조직에 침투하는 침투적(invasive) 특성 및 체내외 다른 부위로 퍼지는 전이적(metastatic) 특성을 갖는 세포에 의한 질병을 총칭한다. 본 명세서에서, 상기 암은 악성 종양 (malignant tumor)과 동일한 의미로 사용되며, 바람직하게는 메소텔린-양성 또는 메소텔린을 과발현하는 암일 수 있다.
상기 암은 바람직하게는 고형암일 수 있으며, 예를 들어, 보다 바람직하게는 메소텔린-양성 또는 메소텔린을 과발현하는 고형암일 수 있다. 예를 들어, 상기 고형암은 식도암 (esophageal cancer), 유방암 (breast cancer), 삼중음성 유방암 (triple-negative breast cancer: TNBC), 위암 (gastric cancer), 담관암 (cholangiocarcinoma), 췌장암 (pancreatic cancer), 대장암 (colon cancer), 폐암 (lung cancer), 흉선암 (thymic carcinoma), 중피종 (mesothelioma), 난소암 (ovarian cancer), 자궁내막암 (endometrial cancer), 자궁경부암 (cervical cancer), 자궁 장액성 암종 (uterine serous carcinoma: USC), 비소세포성 폐암(non-small cell lung cancer) 및 소아 급성 골수성 백혈병 (acute myeloid leukemia: AML)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 약학적 조성물은 약학적 조성물 전체 중량에 대하여 유효성분인 일 양상의 세포를 10 내지 95 중량%로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 상기 유효성분 외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 추가로 함유할 수 있다.
상기 세포의 투여량은 질환의 종류, 질환의 중증도, 약학적 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로, 치료기간 및 동시에 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함되는 세포의 유효량은 1 x 105 내지 1 x 1011 cells/kg일 수 있다. 이때, 투여는 하루에 한번 투여할 수 있고, 수회에 나누어 투여할 수도 있다. 본원에 제시된 세포 또는 약학적 조성물의 유효량은 과도한 실험 없이도 경험적으로 결정될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약학적 분야에서 통상의 방법에 따라, 목적에 적합한 제형을 갖는 제제일 수 있다. 또한, 상기 조성물은 약학적 분야에서 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위 투여형의 제제로 제형화시켜 투여할 수 있다. 상기 약학적 제제에는 상기 유효성분 외에 하나 또는 그 이상의 약학적으로 허용 가능한 통상의 불활성 담체, 일 예로, 주사제의 경우에는 보존제, 무통화제, 가용화제 또는 안정화제 등을, 국소 투여용 제제의 경우에는 기제 (base), 부형제, 윤활제 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 상기 세포 또는 이를 포함하는 약학적 조성물은 당업계에 공지된 다양한 방법으로 개체에 투여될 수 있고, 예를 들어 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 등으로 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 양상에 따른 항-메소텔린 키메릭 항원 수용체는 메소텔린에 대한 특이적 결합능을 나타내어, 메소텔린이 과발현되는 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 파지 디스플레이 항체 라이브러리 패닝을 통한 항체 스크리닝 과정을 모식화한 도이다.
도 2는 고체상 패닝 (solid phase panning)에 따른 결과로서, 도 2a는 패닝 회차에 따른 파지 산출 역가 (output titer) 및 도 2b는 용리 역가 비율 (elution titer ratio, B)을 나타낸 도이다.
도 3은 파지 ELISA를 통해 얻어진 클론들의 항원 MSLN에 대한 특이적 결합을 비교분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 메소텔린 과발현 세포주를 이용하여 선별된 클론이 실제 세포막에 존재하는 메소텔린에 결합하는지를 유세포 분석 (flow cytometry)을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 메소텔린 과발현 세포주를 이용하여 선별된 클론의 메소텔린에 대한 결합 특이성을 상대적 피크 이동 (peak shift) 값으로 나타낸 도이다.
도 6은 정제된 항-MSLN-scFv 항체를 SDS-PAGE로 분석한 결과를 나타낸 도이다 (각 단백질 당 2μg씩 로딩). NR: Non-reducing condition, R: Reducing condition (100℃, 10분).
도 7은 ELISA를 통해 항-MSLN-scFv 항체의 항원 MSLN에 대한 친화도를 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 MSLN 특이적 항원결합 도메인을 포함하는 일 양상에 따른 항-MSLN-CAR 발현 시스템의 모식도이다.
도 9a는 항-MSLN-CAR가 도입된 T 세포에서 CAR의 발현 확인한 결과; 및 도 9b는 CD3 양성 T 세포 중에서 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 비율을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 HBSS(G1), Mock(G2), CD19-CAR-T(G3) 및 항-MSLN3-CAR가 도입된 CAR-T 세포(G4)를 투여한 난소암(OVCAR-3) 마우스 모델의 날짜 별 체중의 변화를 확인한 도이다.
도 11은 HBSS(G1), Mock(G2), CD19-CAR-T(G3) 및 항-MSLN3-CAR가 도입된 CAR-T 세포(G4)를 투여한 난소암(OVCAR-3) 마우스 모델의 날짜 별 종양의 부피이 변화를 확인한 도이다.(*p<0.05 vs. the vehicle control treated group(G1))
도 12는 HBSS(G1), Mock(G2), CD19-CAR-T(G3) 및 항-MSLN3-CAR가 도입된 CAR-T 세포(G4)를 투여한 난소암(OVCAR-3) 마우스 모델의 27일째의 종양의 크기를 확인한 도이다.
도 13은 HBSS(G1), Mock(G2), CD19-CAR-T(G3) 및 항-MSLN3-CAR가 도입된 CAR-T 세포(G4)를 투여한 난소암(OVCAR-3) 마우스 모델의 27일째의 종양의 무게를 확인한 도이다.
도 14는 HBSS(G1), Mock(G2), CD19-CAR-T(G3) 및 항-MSLN3-CAR가 도입된 CAR-T 세포(G4)를 투여한 난소암(OVCAR-3) 마우스 모델의 면역조직화학염색의 결과를 5x의 배율로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 15는 HBSS(G1), Mock(G2), CD19-CAR-T(G3) 및 항-MSLN3-CAR가 도입된 CAR-T 세포(G4)를 투여한 난소암(OVCAR-3) 마우스 모델의 면역조직화학염색의 결과를 20x의 배율로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
이하 일 양상을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 일 양상을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 일 양상의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니며, 일 양상의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 일 양상을 보다 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다.
실시예 1: 파지 디스플레이 항체 라이브러리 패닝
표적 항원인 메소텔린 (mesothelin: MSLN)에 결합하는 항체를 선별하기 위해, KBIO 인간 합성 scFv 파지디스플레이 라이브러리 KscFv-I을 이용하여 오송첨단의료산업진흥재단 신약개발지원센터에서 구축한 파지 패닝 프로토콜에 따라 MSLN (Acro Biosystems)에 대한 파지 패닝을 4회차까지 수행하였다. 파지 디스플레이 항체 라이브러리 패닝 과정을 도 1에 모식화하여 나타내었다.
패닝은 항원을 고정하는 방식에 따라 두 가지 방법 (solid, bead)으로 수행하였다. 고체상 패닝 (solid phase panning)의 경우, 인간 메소텔린 단백질 (PBS에서, 1차: 10μg/mL, 2차: 5μg/mL, 3차: 2.5μg/mL, 4차: 1.25μg/mL 1mL를 면역 튜브 (immuunotube)에 고정시키고, 상기 면역 튜브에 5% 탈지유 (skim milk)가 포함된 PBS (MPBS) 5mL로 블로킹한 파지 라이브러리 1.3 x 1013 c.f.u.를 섞어준 다음 37℃에서 1.5시간 동안 결합시켰다. 그런 다음, PBS-Tween20 (0.05%) (PBS-T) 5mL로 세척하여 결합되지 않은 파지들을 제거하였다 (1차: 3회 세척, 2~4차: 5회 세척). 여기에 100mM 트리메틸아민 (trimethylamine: TEA) 1mL를 튜브에 첨가하여 상온에서 10분간 반응시켜 결합된 파지를 용출시키고, 용출된 파지는 50mL 팔콘 튜브 (Falcon tube)로 옮기고 1M Tris-HCl (pH 7.4) 0.5mL와 잘 섞어 중화시켰다. 상기 용출된 파지를 중간-로그 단계의 E. coli TG1 (OD600 = 0.5~0.8) 8.5mL에 감염시켰다. 형질감염된 E. coli TG1의 일부는 서열 확인을 위해 플라스미드 DNA를 추출하고, 일부는 파지 ELISA를 통해 항체 스크리닝을 진행하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 고체상 패닝 3회차부터 농축이 시작되어 항원 MSLN 에 대한 산출 역가는 PBS 대조군 대비 약 53.4배 (3차), 1061.6배 (4차)의 큰 차이를 보였다.
실시예 2: 파지 ELISA (phage-specific ELISA)를 통한 양성 클론의 선별
상기 실시예 1의 파지 패닝에 따라 수득한 파지들 중에서 항원 MSLN에 특이적으로 결합하는 클론 (clone)을 선별하기 위해, 면역 튜브를 이용한 패닝 3회차에서 얻은 470 (94 콜로니 x 5 플레이트)개 클론에 대하여 단일클론 파지 ELISA를 수행하였다. 구체적으로, 96-하프 (half) 웰 ELISA 플레이트에 1μg/mL의 인간 MSLN 단백질 (항원)을 웰당 30μL씩 넣고 4℃에서 밤새 배양하여 코팅하였다. 음성 대조군으로, 다른 플레이트에는 PBS를 웰당 30μL씩 넣고 4℃에서 밤새 배양하였다. 다음 날, 플레이트 내용물을 제거하고, 5% MPBS 150μL를 사용하여 플레이트를 실온에서 1시간 동안 블로킹하였다. 그런 다음, 플레이트 내용물을 제거하고, 파지 (~1011 c.f.u.) 30μL를 첨가하여 상온에서 1.5시간 동안 배양하였다. 음성 대조군의 경우, 파지 대신 PBS 30μL를 첨가하였다. PBS-T (PBS-0.05% Tween 20) 용액으로 플레이트를 4회 세척하고, 항-M13-HRP (PBS에서 1:5,000으로 희석)를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. PBS-T 용액으로 플레이트를 4회 세척하고 각 웰당 TMB 기질 시약 (TMB substrate)을 30μL씩 첨가하여 실온에서 8분 동안 배양해 발색반응을 유도하였다. 웰당 2N H2SO4 30μL을 첨가하여 발색반응을 정지시킨 뒤 450nm에서의 흡광도 (O.D.)를 측정하였다.
그 결과, 항원 MSLN에 대해 흡광도 컷-오프 (cut-off)를 각각 0.7 또는 0.5 이상으로 정하여 선별하였을 때 3회차에서 총 105개의 양성 클론을 확보하였다. 추가적으로, 면역 튜브를 이용한 패닝 4회차에서 얻은 클론에 대하여도 동일한 방법으로 단일클론 파지 ELISA를 수행하였다. 패닝 4회차에서 얻은 282 (94 콜로니 x 3 플레이트)개 클론에 대하여 파지 ELISA를 수행하고 흡광도 컷-오프를 각각 0.7 이상으로 정하여 선별한 결과, 총 15개의 양성 클론을 확보하였다 (표 1 내지 3).
3회차 패닝
(3 Round)		 흡광도 (450nm) 양성 클론 (positive clone)의 수 특이 클론 (unique clone)의 수
3R-1 > 0.7 35 6
3R-2 > 0.7 4 1
3R-3 > 0.7 8 2
3R-4 > 0.5 34 9
3R-5 > 0.5 24 2
총합 105 20
4회차 패닝
(4 Round)		 흡광도 (450nm) 양성 클론 (positive clone)의 수 특이 클론 (unique clone)의 수
4R-1 > 0.7 6 1
4R-2 > 0.7 2 0
4R-3 > 0.7 7 1
총합 15 2
3 + 4회차 패닝 총합
양성 클론 (positive clone)의 수 120
특이 클론 (unique clone)의 수 22
실시예 3: 항-MSLN 항체 단편 후보 선별을 위한 서열분석 및 ELISA
상기 실시예 2에서 선별한 총 120 종의 양성 클론들로부터 파지를 회수한 다음 DNA 서열 분석을 진행하였고, 카밧 (Kabat) 넘버링 시스템에 따라 서열들을 정렬하여 그룹핑하였다. 그 결과, CDR 서열이 다른 항원 MSLN에 대한 22종의 특이 클론 (unique clone)을 선별하였다. 상기 22종 클론의 항원 MSLN에 대한 특이적 결합을 확인하기 위하여 각 파지를 정제하여 파지 역가 (phage titer)를 동일하게 맞춘 후 (3.3E+11 pfu/웰), ELISA를 통해 비교하였다. 음성 대조군으로는 MSLN과 동일하게 히스티딘 태그 (His tag)에 접합된 TLR4 항원을 사용하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 22종 클론 중 MSLN1, MSLN18 및 MSLN19를 제외한 19종 클론이 항원 MSLN에 특이적으로 결합함을 확인하였다.
실시예 4: 메소텔린 과발현 세포주를 이용한 결합능 확인
상기 실시예 3에서 선별한 19종의 파지 클론이 실제 세포막에 존재하는 메소텔린에 결합하는지 알아보기 위하여, 메소텔린 과발현 세포주인 췌장암 세포주 AsPC-1 및 대조군으로 인간 만성골수백혈병 세포주 K562를 사용하여 유세포 분석 (flow cytometry analysis)을 수행하였다.
구체적으로, K562 및 AsPC-1 세포를 106 cells/웰이 되도록 준비하여 PBS 300μL로 세척하였다. 4% MPBS 300μL로 4℃에서 30분 동안 세포를 블로킹하고, 동시에 파지 클론 (1012/웰)을 상온에서 1시간 동안 동일하게 블로킹한 후 파지와 세포를 4℃에서 2시간 동안 함께 배양하였다. PBS로 세포를 세척한 후 항-M13-FITC를 1μg/mL을 처리하고 4℃에서 1시간 동안 배양하였다. PBS로 세포를 세척한 후, PBS에 세포를 재현탁 시켜 유세포분석기 (BD biosciences)를 이용하여 결과를 분석하였다. 그 결과를 도 4 및 5에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, MSLN3, MSLN6 및 MSLN10이 췌장암 세포주 AsPC-1에서 3.0% 이상의 상대적 피크 이동 (peak shift) 값을 나타냄을 확인하였다. 대조군인 K562 세포주에서는 유의한 수준의 피크의 이동이 나타나지 않았다. 상기 결과를 통해, 19종의 클론 중 MSLN3, MSLN6 및 MSLN10이 실제 세포막에 존재하는 메소텔린에 대해 높은 결합 친화성을 보임을 알 수 있었다.
또한, 도 5에 나타낸 바와 같이, 유세포 분석 결과를 정량화 한 결과 MSLN3, MSLN6 및 MSLN10은 대조군인 K562 세포에 비해 각각 23.8%, 7.2% 및 4.8%의 상대적 피크 이동 값을 보임을 확인하였다. 상기 결과를 통해, 3개 클론 모두 메소텔린이 과발현된 세포주에 특이적으로 결합함을 확인하여, 항-MSLN 항체 단편 생산을 위한 클론으로 최종 선별하였다.
실시예 5: 항-MSLN 항체 단편 생산 및 정제
상기 실시예 4에서 선별한 3종 클론을 사용하여, 항체 단편 발현 균주인 Top10F' competent E. coli를 형질전환 (transformation)하였다. 그런 다음, 3종 클론으로 형질전환된 E. coli 균주를 각각 TB 배지 200mL에서 배양하면서, IPTG (최종농도 0.5mM)로 단백질 발현을 유도한 뒤, 30℃에서 밤새 배양하였다. 상기 배양액을 원심분리하여 세포를 획득하고, 세포형질 추출 (periplasmic extraction)을 통해 수용성 단백질을 확보한 후, 단백질 L 레진 (Protein L resin)을 이용한 친화도 크로마토그래피 (affinity chromatography)를 통해 항-MSLN-scFv 항체를 정제하였다. 상기 정제된 항체 단백질을 SDS-PAGE로 분석하여, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
실시예 6: 항-MSLN 항체의 항원에 대한 친화도 분석 및 최종 항-MSLN 키메릭 항원 수용체로 활용할 클론의 선별
상기 실시예 5에서 제조한 3종의 항-MSLN 항체 단백질을 이용한 ELISA를 통해 각 항체의 항원 MSLN에 대한 친화도를 비교 분석하였다. 구체적으로, MaxiSorb ELISA 플레이트 (Nunc)에 인간 메소텔린 단백질 30μL을 웰당 1μg/mL의 농도로 코팅하고 4℃에서 밤새 배양하였다. 플레이트 내용물을 제거하고, 5% MPBS 300μL를 사용하여 플레이트를 실온에서 1시간 동안 블로킹하였다. 정제된 항체를 PBS에서 연속적으로 희석하여 각 웰에 30μL씩 첨가하고 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 음성 대조군으로는, 정제된 항체 대신 PBS 60μL를 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 배양하였다.
PBS-T (PBS-0.05% Tween 20) 용액으로 플레이트를 4회 세척하고, 항-StrepMAB HRP (PBS에서 1:5,000으로 희석) 30μL를 첨가하여 실온에서 1시간 동안 배양하였다. PBS-T 용액으로 플레이트를 4회 세척하고 각 웰당 TMB 기질 시약을 30μL씩 첨가하여 실온에서 8분 동안 배양해 발색반응을 유도하였다. 웰당 2N H2SO4 30μL을 첨가하여 발색반응을 정지시킨 뒤 450nm에서의 흡광도 (O.D.)를 측정하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 3종 항체의 EC50 값은 MSLN3, MSLN6 및 MSLN10이 각각 145nM, 67nM 및 91nM으로, 3종 항체 중 MSLN3이 가장 높은 결합 친화도를 보임을 확인하였다 (하기 표 4 참조).
순위 MSLN 클론 R2 EC50 (nM)
1 3 0.999 145
2 10 0.988 91
3 6 0.988 67
이에 상기 MSLN3을 항-MSLN 항체 단편 생산을 위한 클론으로 최종 선별하고, MSLN3의 아미노산 서열을 확인하여 하기 표 5에 나타내었다. 구체적으로, MSLN3의 중쇄 CDR1-3 아미노산 서열을 각각 서열번호 1 내지 3에, 경쇄 CDR1-3 아미노산 서열을 각각 서열번호 4 내지 6에 나타내고, 중쇄 아미노산 서열 및 경쇄 아미노산 서열을 각각 서열번호 7 및 8에 나타내었다.
MSLN3 클론의 MSLN3의 중쇄 CDR1-3 및 경쇄 CDR1-3 아미노산 서열
영역 아미노산 서열 서열번호
HCDR1 DYAMS 1
HCDR2 AISSSGGTTYYADSVKG 2
HCDR3 EEEGEWREYFDV 3
LCDR1 RASQSISSYLN 4
LCDR2 ATSTLQS 5
LCDR3 QQSYTFPYT 6
VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISSSGGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKEEEGEWREYFDVWGQGTLVTVSS 7
VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYATSTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTFPYTFGQGTKVEIK 8
실시예 7: 항-MSLN 키메릭 항원 수용체 구축
상기 실시예 6에서 제조한 항-MSLN 항체 단백질 중 메소텔린이 과발현된 세포주와 높은 결합 특이성을 보인 MSLN3을 바탕으로 항-MSLN 키메릭 항원 수용체를 구축하였다 (항-MSLN-CAR).
7-1: 항-MSLN-CAR 렌티바이러스 벡터 클로닝
벡터로는 신약개발지원센터에서 보유한 2세대 CAR 렌티바이러스용 벡터 (pLV lentiviral vector) 시스템에 속하는 것으로, 상기 시스템은 gag/pol을 코딩하는 pMDLg/pRRE (addgene), Rev 단백질을 코딩하는 외피 (envelope) 플라스미드 pRSV-Rev (addgene) 및 VSV-G 단백질을 코딩하는 외피 플라스미드 pMD2.G (addgene)를 모두 포함한다.
먼저, 실시예 6에서 제조한 항-MSLN scFv (항원결합 도메인)에 대하여 유전자 클로닝을 실시하였다. MSLN3 각각의 항-MSLN scFv와 렌티바이러스 벡터를 XhoI (R0146S, NEB)과 EcoRI (R0101, NEB)로 37℃에서 2시간 동안 절단 (digestion)하고, 아가로즈 젤 전기영동한 후, 확인된 산물을 FavorPrep Gel/PCR purification Mini kit (Favorgen)를 사용하여 정제하였다. 정제된 각각의 항-MSLN scFv (100 ng)와 벡터(50 ng)를 2:1 의 비율로 16℃에서 16시간 동안 반응시켜 라이게이션 (ligation) 진행한 후, Stbl3 competent cell에 형질전환시켜 콜로니를 수득하였다. 상기 콜로니를 취해 LB 배지 (암피실린) 5mL에서 키워 DNA 플라스미드 미니프렙 (mini-prep)법을 이용하여 플라스미드 DNA를 얻었다. 상기 플라스미드 DNA를 XhoI, EcoRI로 절단하여 삽입시킨 각각의 항-MSLN scFv가 벡터 내에 잘 클로닝 되었는지 확인하였다. 이후 시퀀싱을 하여 최종적으로 DNA 서열을 확인하였다.
상기 항-MSLN scFv에 CD8 힌지 (hinge) 및 CD8 TM (transmembrane)을 막관통 영역으로, 4-1BB의 세포질 영역을 신호전달 도메인으로, CD3 제타 (CD3z)의 세포내 도메인을 T 세포 활성화 도메인으로 순차적으로 연결하여 항-MSLN-CAR를 구성하였다. 구체적으로, CD8 신호 서열 (Signal peptide, SP) (서열번호 10), 항-MSLN3 scFv (서열번호 11), CD8 힌지 영역 (서열번호 12), CD8 막관통 영역 (서열번호 13), 4-1BB 신호전달 도메인 (서열번호 14) 및 CD3 제타 신호전달 도메인 (서열번호 15)으로 구성된다. 상기 각 도메인을 각각의 제한효소를 이용하여 순차적으로 연결하였고, 각 도메인에 대응하는 구체적인 염기서열 정보를 하기 표 6에 정리하였다.
이름 염기서열 (5'-3') 서열번호
CD8 ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCG 10
MSLN3 scFv GAAGTACAGTTGGTCGAAAGTGGCGGTGGCCTCGTGCAACCGGGTGGTTCACTGCGTCTGAGCTGCGCCGCCTCGGGTTTTACTTTCTCTGATTATGCAATGTCTTGGGTTCGTCAGGCGCCGGGCAAGGGTCTCGAATGGGTTTCAGCAATCTCTTCTTCTGGTGGTACTACTTACTATGCCGATTCAGTGAAGGGTCGCTTTACCATTTCCCGTGACAACTCTAAGAATACTCTGTATCTGCAGATGAACTCGCTGCGTGCCGAAGACACGGCCGTCTATTATTGCGCCAAAGAAGAAGAAGGTGAATGGCGTGAATACTTCGATGTTTGGGGTCAGGGCACTTTAGTGACCGTCTCATCGGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGATCCGGCGGTGGCGGATCGGACATTCAAATGACGCAGAGTCCCTCCTCACTGAGTGCTAGCGTGGGCGATCGTGTGACAATTACTTGTCGCGCTAGCCAGTCTATCTCTTCTTACCTGAACTGGTATCAGCAGAAACCGGGCAAGGCGCCAAAATTGCTGATTTACGCAACTTCCACTCTGCAGTCTGGTGTACCGTCCCGTTTCTCTGGCAGCGGTTCTGGTACGGATTTTACCCTGACCATCTCAAGCCTCCAGCCTGAAGATTTTGCCACCTATTATTGTCAGCAATCTTACACTTTTCCGTACACGTTCGGGCAGGGAACTAAAGTGGAAATTAAAGCCAGCACC 11
CD8 hinge ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGAT 12
CD8 TM ATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGC 13
4-1BB AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG 14
CD3z AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACACAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC 15
7-2: 항-MSLN-CAR이 탑재된 렌티바이러스 생산
상기 실시예 7-1에서 제작한 재조합 벡터를 HEK293T 세포에 도입하여 항-MSLN-CAR 렌티바이러스를 생산하였다. MSLN 특이적 항원결합 도메인을 포함하는 일 양상에 따른 항-MSLN-CAR 발현 시스템의 모식도를 도 8에 나타내었다. 먼저, DNA 형질전환 하루 전날 100mm 조직배양 디쉬에 HEK293T 세포를 6 x 106 cells/디쉬로 시딩하였다. 다음 날 세포 밀도가 70~80%에 도달하였을 때, 시약 설명서에 따라 리포펙타민 3000 (Lipofectamine 3000, Thermofisher)으로 MSLN-CAR-pLV, pMDLg/pRRE (addgene), pRSV-Rev (addgene), pMD2.G (addgene)(5.5μg:3.5μg:1.5μg:2μg)의 형질전환을 진행하였다. 대조군으로는 CD19 (FMC63)를 사용하였다. 형질전환 수행 4시간 이후 3% FBS (Gibco)가 포함된 DMEM 배지로 교체하여 48시간 이후 바이러스 배양액을 수확하였다. 원심분리용 튜브에 20% 수크로스 용액 10mL를 넣고, 그 위에 수확한 바이러스 배양액 20mL를 조심스럽게 올린 다음, SW32T 로터에 장착하여 25,000rpm으로 4℃에서 90분간 초고속 원심분리를 실시하였다. 원심분리가 끝난 다음 튜브 바닥에 있는 바이러스 펠릿이 떨어지지 않게 조심하여 상층액을 버리고, RPMI1640 배지 (Gibco) 400μL를 넣고 냉장고에서 16시간 동안 배양한 후, 재부유시켜 100μL씩 분주하여 -80℃에서 보관하였다.
실시예 8: 항-MSLN-CAR이 도입된 세포의 제작
8-1: 렌티바이러스 형질도입 (transduction)
DPBS 5mL 에 항-CD3 (1μg/mL), 항-CD28 (3μg/mL) 항체를 각각 지정된 농도가 되도록 제조하고 볼텍싱 한 후, 24-웰 플레이트에 500μl/웰로 코팅하여 4℃냉장고에서 밤새 보관하였다. 다음 날, T 세포 배양액 (10% FBS + RPMI1640 + 200IU IL-2) 9mL에 PBMC (인간 일차 PBMC)를 녹여 1,500rpm으로 5분 동안 원심분리하였다. 이후, 상층액을 제거하고 배양액 1mL에 재부유시켜 셀 카운팅하고, 1 x 106 cells/mL로 희석하여 항체가 코팅된 24-웰 플레이트에 시딩한 뒤, 37℃, CO2 배양기에 넣어 배양하였다. 3일 후, PBMC 세포들을 모두 수확하여, 렌티바이러스 감염을 위해 5 x 105 cells/500μL에 렌티바이러스를 MOI (multiple of infection) 5가 되도록 맞춰주고 프로타민 황산염 (protamine sulfate) 10μg/mL를 첨가하여 새로운 24-웰 플레이트에 시딩하였다 (a). 상기 24-웰 플레이트를 300g, 32℃에서 90분 동안 원심분리한 후, 37℃, CO2 배양기에 넣어 배양하였다 (b). 다음 날, T 세포를 모두 수확하여 상기 (a), (b) 단계를 한 번 더 수행하였다. 그런 다음, T 세포를 모두 수확하여 1,500rpm으로 5분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하고, T 세포를 배양액에 재부유시켜 다시 배양하였다.
8-2: 항-MSLN-CAR의 발현 확인
상기 실시예 8-1에서 제조한 항-MSLN-CAR가 도입된 T 세포에서 CAR의 발현 유무를 확인하였다. T 세포의 렌티바이러스 형질도입 완료 5일 후, 일부 항-MSLN-CAR-T 세포를 수확하여 biotin-MSLN (Acrobiosystems 또는 Biolegend)을 넣고 20분간 얼음 위에서 배양한 후, 세포를 세척하고, PE-항-biotin 1μL을 첨가하여 20분간 얼음 위에서 배양하였다. 세포 세척 후, FACS Canto Ⅱ(BD)를 이용하여 CAR 발현율을 확인하였고, 이를 도 9A 및 표 7에 나타내었다. 또한, 항-MSLN-CAR-T를 14일 동안 배양하면서 최종적으로 분화된 T 세포 (CD3)의 발현을 FACS를 통해 분석하고, CD3 양성 T 세포 중에서 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 비율을 측정하였고, 결과를 도 9B에 나타내었다.
클론 CAR 발현 %
CD19 (FMC63) 50.8%
MSLN3 CAR scFv 30.6%
표 7 및 도 9에서 확인한 바와 같이, 제작된 CAR-T 의 CAR 발현율을 확인한 결과 대조군인 CD19(FMC63)-CAR-T은 50.8 %로 나타나는 것을 확인하였고, MSLN3-CAR-T 30.6 %의 발현율이 나타나는 것을 확인하였다.도 9에 나타낸 바와 같이, 형질도입 1회차 결과 CD4+:CD8+의 비율은 평균적으로 10%:80%으로 측정되었다.
실시예 9: 종양동물모델 기반 항-MSLN-CAR-T 세포의 암세포 사멸 효과 확인
9-1: 종양동물 기반 항-MSLN-CAR-T 세포의 투여
난소암 (OVCAR 3) 동물 모델에서 MSLN3-CAR T 세포 치료제의 유효성을 확인하는 실험을 수행하였다. 구체적으로 상기 실시예 9에서 확인한 항-MSLN3-CAR-T 세포의 암세포에 대한 세포사멸 효과를 기반으로 종양 난소암 동물모델을 구축하여 종양 살상능을 확인하였다.
본 시험에 6주령의 암컷 NOG (NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull) 계통의 특정병원균 부재 (SPF) 마우스를 사용하였으며 동물 입수 시 공급처에서 제공한 시험계의 헬스모니터링 성적서를 참고로 하여 입수 동물의 검수검역을 실시하였으며 일주일 순화 후 실험 진행하였다. 사육환경은 본 시험은 온도 22 ± 2℃, 상대습도 50 ± 10%, 환기횟수 10~20회/hr, 조명시간 12시간 (오전 8시 점등~오후 8시 소등) 및 조도 150~300Lux이며 칩타입 깔짚을 고압증기멸균 (121℃, 멸균시간 20분, 건조시간 5분)한 후 적량의 깔짚을 폴리카보네이트 사육상자 (W 278 (mm) x L 420 (mm) x H 230 (mm))에 담아 사육하였다. 실험에 공급된 사료는 방사선조사로 멸균한 실험동물용 고형사료 (+40 RMM-SP-10, U8239G10R, SAFE-DIETS, France)를 이용하였으며, 물은 RO수를 물병에 담아 고압멸균기로 멸균한 후, 자유롭게 섭취하도록 하였다.
난소암 동물모델에 사용된 세포는 Mycoplasma pneumoniae, Murine coronavirus (Mouse hepatitis virus, MHV), Murine respirovirus (Sendai virus, SeV) 검사를 진행하고 음성으로 확인된 후 사용하였다. RPMI 1640, 20% FBS, 1% P/S(페니실린/스트렙토마이신) 조성의 배지를 사용하여 CO2 배양기에서 37 ℃, 5% CO2 조건으로 배양하였다. RPMI 1640(LM01 51, Welgene) 배지를 사용하였다. 이식된 암세포 및 CAR-T 세포와 시험군의 구성을 하기 표 8에 나타내었다.
그룹 N수 세포주
(세포수/마리)		 투여 물질 투여
경로		 용량
(CAR-Ts/마리)		 부피
G1 6 OVCAR-3
(1x107)		 HBSS I.V - 200μL
G2 6 Mock -
G3 6 CD19-CAR-T 5 x 106
G4 6 항-MSLN3-CAR-T 5 x 106
각 세포는 PBS를 이용하여 세포 농도를 조절하고, 마우스에 200μL씩 피하 이식하였으며 종양 크기로 무작위 배분법에 의하여 군 분리를 실시하였으며 개체 식별은 시험기간 동안 ear-punch법을 사용하고, 사육상자에는 각 군별 식별카드를 부착하였다.
9-2: 종양동물 기반 항-MSLN-CAR-T 세포의 항암 효과의 확인
상기 실험군 분리 후 항-MSLN-CAR-T 세포를 미정맥으로 단회 투여하였으며, 시험군의 체중과 종양 크기, 종양 부피, 및 종양 무게는 투여 개시일부터 주 2회 측정하였다.
투여 개시일 체중을 기준으로 하고, 시험 종료일까지 체중 변화를 관찰하였다. 체중 증감 (%)은 아래의 공식을 사용하여 산출하였다.
체중증감(%)=(체중/day0에서의 체중) x 100 (수학식 1)
종양 부피 (mm3)는 캘리퍼스(calipers)를 이용체하여 종양의 단축 (A), 장축 (B)을 측정하고 다음의 공식을 이용하여 산출하였다.
종양 부피 (mm3)= 1/2 x [{A(mm)}2 x B(mm)] (수학식 2)
체중 및 종양 부피는 마지막 측정 후 난소암 종양 모델에서 각각의 HBSS 투여군과 항-MSLN-CAR-T 투여군을 비교하여 One-way ANOVA의 post-hoc Dunnett's test를 이용하여 통계분석을 진행하였다.
이후, 상기 체중의 변화를 투여 진행 후 날짜에 따라 확인한 결과를 도 10에, 종양 부피의 변화를 투여 진행 후 날짜에 따라 확인한 결과를 도 11에, CAR-T 투여 후 27일째의 종양 크기를 각 군마다 확인한 결과를 도 12에, CAR-T 투여 후 27일째의 마우스 모델에서 종양의 무게를 확인한 결과를 도 13에 나타내었다.
도 10에서 확인한 바와 같이, 난소암 종양 모델에서 부형제 투여(HBSS 투여) 대조군 G1군과 비교하여 항-MSLN3-CAR-T 세포 투여 군은 통계적으로 유의성 있는 체중변화가 확인되지 않았다. 다만, G3-4 개체는 투여 후 26일째에 체중 감소가 관찰되었고, 초기 체중의 80% 이하 되었으며 해당 개체는 부검 시 간 섬유화가 확인되는 것을 확인하였다.
도 11에서 확인한 바와 같이, 종양 부피를 측정한 결과 G1, G2 및 G3 군 대비 G4군인 항-MSLN3-CAR-T 투여군은 종양 부피가 투여한 날부터 거의 증가하지 않았고, 투여 후 8일부터 종양이 감소하는 경향이 나타나는 것을 확인하였다.
또한 도 12는 CAR-T 세포 투여 후 27일째 의 각 시험군 및 대조군의 종양 크기를 육안으로 확인한 것이며, 도 12에서 확인한 바와 같이, G1 대조군 대비 G4 군은 확연하게 종양 크기가 작은 것을 확인할 수 있었다.
도 13에서 확인한 바와 같이, 종양무게는 부형제 투여 대조군인 G1과 비교하여 G4군은 종양무게가 현저하게 감소하는 경향이 나타나는 것을 확인하였다.
종합하여 난소암 모델에서 항-MSLN3-CAR-T 세포의 종양 살상능 유효성을 평가한 결과, HBSS 투여군인 G1과 비교하여 CAR-T 투여 후부터 종양 무게가 증가하지 않고 종양의 부피, 종양 크기 및 종양의 무게 역시 현저하게 감소하는 것을 확인하여 메소텔린을 발현하는 난소암 동물모델에서 항-MSLN3-CAR-T 의 암세포 살상 효능을 확인할 수 있었다.
9-3: 종양동물 기반 항-MSLN-CAR-T 세포의 면역조직화학 염색을 통한 종양 내 침윤의 확인
실험군 분리 후, 항-MSLN-CAR-T 세포를 미정맥으로 단회 투여하였으며, 50mg/kg의 조레틸(Zoletil)TM과 10mg/kg의 자일라진(Xylazine) 을 복강 주사하여 마취를 유도하고 복강을 개복하여 복대정맥으로부터 채혈 후 방혈하여 안락사를 진행하였다. 이후 군당 3수를 임의로 선별하여 분리된 종양의 일부를 10% 중성 포르말린에 고정 후 슬라이드를 제작하고 hCD3ε (세포 신호전달, Cat. No 58061)에 대하여 면역조직화학염색(Immunohistochemistry:IHC)를 실시하였다. 이후 슬라이드는 PANNORAMIC SCAN II (3DHISTECH, Hungary) 을 이용하여 촬영하고 3DHISTECH software 를 이용하여 분석하였고, 각 군의 상기 면역염색을 5x의 배율로 확인한 결과 및 20x의 배율로 확인한 결과를 각각 도 14 및 15에 나타내었다.
도 14 및 15에서 확인한 바와 같이, G2, G3, G4군에서 종양 내 T 세포 침윤 infiltration) 이 확인되어, 제조된 MSLN-CAR-T 세포는 효과적으로 종양 내 T세포가 침윤되는 것이 확인되었다. 특히, G4-4 개체는 부검 시 종양이 매우 작은 상태임을 확인하여, 종양이 완전관해(Complete Response: CR)된 것을 확인할 수 있었다. 이외 G1 군 G3 군에서는 종양 내에 괴사(necrosis) 가 확인되었다. 따라서 종합적으로, MSLN-CAR-T 를 투여한 G4 군의 다수의 개체에서 종양 내 T 세포 침윤이 상대적으로 높게 관찰되는 것을 확인할 수 있었다.
전술한 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (16)

  1. 서열번호 1로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열번호 2로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2 및 서열번호 3으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및
    서열번호 4로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호 5로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 및 서열번호 6으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항-메소텔린 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 청구항 1에 있어서,
    서열번호 7로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 것인, 항-메소텔린 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 청구항 1에 있어서,
    서열번호 8로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 것인, 항-메소텔린 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 청구항 1에 있어서,
    서열번호 7로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 8로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 것인, 항-메소텔린 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 분리된 핵산.
  6. 청구항 5의 분리된 핵산을 포함하는 벡터.
  7. 청구항 6의 벡터로 형질전환된 분리된 숙주세포.
  8. 청구항 7의 숙주세포를 배양하여 항체를 발현시키는 단계를 포함하는 항-메소텔린 항체를 제조하는 방법.
  9. 항원 결합 도메인, 힌지 (hinge) 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메릭 항원 수용체로서,
    상기 항원 결합 도메인은 서열번호 1로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열번호 2로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2 및 서열번호 3으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및
    서열번호 4로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호 5로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 및 서열번호 6으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항-메소텔린 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 키메릭 항원 수용체.
  10. 청구항 9에 있어서,
    상기 항원 결합 도메인은 서열번호 7로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 8로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항-메소텔린 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 것인, 키메릭 항원 수용체.
  11. 청구항 9에 있어서,
    상기 항원 결합 단편은 scFv (single chain variable fragment)인 것인, 키메릭 항원 수용체.
  12. 청구항 9의 키메릭 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  13. 청구항 12의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  14. 청구항 13의 벡터로 형질전환된 분리된 세포.
  15. 청구항 14에 있어서,
    상기 세포는 T 세포, NK 세포, NKT 세포 또는 감마델타 T 세포 (gamma delta (γδ) T cells)인 것인, 분리된 세포.
  16. 청구항 15의 분리된 세포를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
PCT/KR2022/007425 2021-05-26 2022-05-25 항 메소텔린 scFv를 포함하는 키메릭 항원 수용체 및 이의 용도 Ceased WO2022250450A1 (ko)

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CN202280007899.2A CN116635406B (zh) 2021-05-26 2022-05-25 一种包括抗间皮素scFv的嵌合抗原受体及其用途
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