WO2022260403A1 - 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈 1 변이체 및 이를 이용한 글루타치온 또는 그 유도체의 생산방법 - Google Patents

슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈 1 변이체 및 이를 이용한 글루타치온 또는 그 유도체의 생산방법 Download PDF

Info

Publication number
WO2022260403A1
WO2022260403A1 PCT/KR2022/008016 KR2022008016W WO2022260403A1 WO 2022260403 A1 WO2022260403 A1 WO 2022260403A1 KR 2022008016 W KR2022008016 W KR 2022008016W WO 2022260403 A1 WO2022260403 A1 WO 2022260403A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
amino acid
microorganism
polypeptide
sequence
variant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/KR2022/008016
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
임영은
하철웅
양은빈
김연수
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
CJ CheilJedang Corp
Original Assignee
CJ CheilJedang Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to PH1/2023/553279A priority Critical patent/PH12023553279A1/en
Priority to CA3222066A priority patent/CA3222066A1/en
Priority to BR112023025683A priority patent/BR112023025683A2/pt
Priority to JP2023575360A priority patent/JP7657332B2/ja
Priority to US18/568,649 priority patent/US20240368662A1/en
Priority to AU2022288838A priority patent/AU2022288838C1/en
Priority to MX2023014486A priority patent/MX2023014486A/es
Priority to EP22820531.6A priority patent/EP4353820A4/en
Priority to CN202280041254.0A priority patent/CN117881780A/zh
Application filed by CJ CheilJedang Corp filed Critical CJ CheilJedang Corp
Publication of WO2022260403A1 publication Critical patent/WO2022260403A1/ko
Priority to ZA2023/11242A priority patent/ZA202311242B/en
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0089—Oxidoreductases (1.) acting on superoxide as acceptor (1.15)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y115/00—Oxidoreductases acting on superoxide as acceptor (1.15)
    • C12Y115/01—Oxidoreductases acting on superoxide as acceptor (1.15) with NAD or NADP as acceptor (1.15.1)
    • C12Y115/01001—Superoxide dismutase (1.15.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/85—Saccharomyces
    • C12R2001/865—Saccharomyces cerevisiae

Definitions

  • the present application relates to a superoxide dismutase 1 variant and a method for producing glutathione or a derivative thereof using the same.
  • Glutathione is an organic sulfur compound most commonly present in cells and is in the form of a tripeptide in which three amino acids, glycine, glutamate, and cysteine, are combined.
  • Glutathione exists in the body in two forms: reduced glutathione (GSH) and oxidized glutathione (GSSG).
  • GSH reduced glutathione
  • GSSG oxidized glutathione
  • Reduced glutathione (GSH) which exists in a relatively high proportion under normal circumstances, is mainly distributed in the liver and skin cells of the human body. It plays an important role such as whitening action that inhibits production.
  • Glutathione with such diverse functions is in the limelight as a material in various fields such as pharmaceuticals, health functional foods, and cosmetics, and is also used in the manufacture of taste materials, food and feed additives. It is known that glutathione has a great effect of increasing the taste of the raw material and maintaining the rich taste, and can be used alone or in combination with other substances as a kokumi flavor enhancer. In general, it is known that kokumi materials have a richer feeling than umami materials such as existing nucleic acid and MSG, and are produced by decomposition and aging of proteins.
  • glutathione is also converted to other gamma-glutamyl peptides (Sofyanovich OA et al, (2019) Multiple pathways for the formation of the ⁇ -glutamyl peptides ⁇ -glutamyl-valine and ⁇ -glutamyl-valylglycine in Saccharomyces cerevisiae. PLoS ONE 14 (5): e0216622).
  • Gamma-glutamyl peptide is a low-molecular compound having a gamma-carboxyl group of glutamic acid at the N-terminus of the molecule, and is known to be widely used as a flavor enhancer for kokumi.
  • An object to be solved by the present application is to provide a superoxide dismutase 1 variant and a method for producing glutathione or a derivative thereof using the same.
  • the present application provides a superoxide dismutase 1 mutant in which the amino acid corresponding to position 37 from the N-terminus of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with another amino acid.
  • the present application provides a polynucleotide encoding the variant, and a vector containing the same.
  • the present application provides a microorganism comprising any one or more of the above variant and a polynucleotide encoding the variant.
  • the present application provides a method for producing glutathione or a derivative thereof comprising culturing the microorganism.
  • novel superoxide dismutase 1 variant of the present application can be usefully used for high production of glutathione or its derivatives.
  • One aspect of the present application includes an amino acid substitution in a protein having superoxide dismutase 1 (SOD1) activity, wherein the substitution is performed by replacing the amino acid corresponding to position 37 from the N-terminus of SEQ ID NO: 1 with another amino acid.
  • SOD1 superoxide dismutase 1
  • Superoxide dismutase 1 variants, including substituted ones, can be provided.
  • the variant may be a protein variant in which the amino acid corresponding to position 37 from the N-terminus in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with another amino acid.
  • Superoxide dismutase 1 of the present application is an enzyme also referred to as “SOD1” or “Superoxide dismutase [Cu-Zn]". Superoxide dismutases are known to catalyze the following reactions:
  • the amino acid sequence of superoxide dismutase 1 is an amino acid sequence encoded by the sod1 gene, and may be referred to as "SOD1 protein".
  • the amino acid sequence constituting superoxide dismutase 1 of the present application can be obtained from GenBank of NCBI, a known database.
  • the superoxide dismutase 1 may be a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, but is not limited thereto.
  • the superoxide dismutase 1 may be derived from Saccharomyces cerevisiae, and in another example, the amino acid corresponding to position 37 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is glycine.
  • superoxide dismutase 1 of the present application has 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% or more homology to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or thereto.
  • it may be a protein comprising amino acid sequences having the same identity.
  • a protein having an amino acid sequence in which some sequences are deleted, modified, substituted, or added is also included within the scope of the protein subject to mutation of the present application is self-explanatory.
  • superoxide dismutase 1 in the present application, it is defined as a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, but meaningless sequence additions to the front and back of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, mutations that may occur naturally, or its It is apparent to those skilled in the art that, not excluding silent mutations, it corresponds to superoxide dismutase 1 of the present application if it has the same or corresponding activity as the protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • variants or modified polypeptide refers to the sequence recited above in which one or more amino acids have undergone conservative substitution and/or modification. ), but refers to a protein that retains the functions or properties of the protein.
  • the variant differs from the identified sequence by several amino acid substitutions, deletions or additions.
  • Such variants can generally be identified by modifying one or more amino acids in the amino acid sequence of the protein and evaluating the properties of the modified protein. That is, the ability of the mutant may be increased, unchanged, or reduced compared to the native protein.
  • some variants may include variant polypeptides in which one or more portions such as an N-terminal leader sequence or a transmembrane domain are removed.
  • Other variants may include variants in which portions are removed from the N- and/or C-terminus of the mature protein.
  • variant or “mutant polypeptide” may be used interchangeably with terms such as variant, modification, mutated protein, mutation (in English, modification, modified protein, mutant, mutein, divergent, variant, etc.) , the term is not limited thereto as long as it is used in a mutated meaning.
  • conservative substitution means the substitution of one amino acid with another amino acid having similar structural and/or chemical properties. Such variants may have, for example, one or more conservative substitutions while still retaining one or more biological activities. Such amino acid substitutions can generally occur based on similarities in polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity and/or amphipathic nature of the residues.
  • amino acids with electrically charged side chains positively charged (basic) amino acids are arginine, lysine, and histidine, and negatively charged (acidic) amino acids are glutamic acid and aspartic acid.
  • Amino acids with uncharged side chains are classified as including glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, methionine, phenylalanine, tryptophan, proline, serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine, and glutamine. can do.
  • Variants may also include deletions or additions of amino acids that have minimal impact on the secondary structure and properties of the polypeptide.
  • a polypeptide may be conjugated with a signal (or leader) sequence at the N-terminus of a protein that is involved in protein transfer either co-translationally or post-translationally.
  • the polypeptide may also be conjugated with other sequences or linkers to allow identification, purification, or synthesis of the polypeptide.
  • the mutant of the present application is a superoxide dismutase 1 mutant in which the amino acid corresponding to the 37th position from the N-terminus of SEQ ID NO: 1 is substituted with another amino acid among the above-described superoxide dismutase 1; It may be a mutant polypeptide having superoxide dismutase 1 activity.
  • the variants of the present application may also be described as "superoxide dismutase 1 variant", “a (mutant) polypeptide having superoxide dismutase 1 activity", and "SOD1 variant", and the protein before mutation, natural wild-type polypeptide Or it may be one that can increase glutathione production compared to the unmodified polypeptide, but is not limited thereto.
  • the mutant may be a superoxide dismutase 1 mutant in which the amino acid corresponding to position 37 from the N-terminus of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with another amino acid.
  • 'substitution with another amino acid' is not limited as long as it is an amino acid different from the amino acid before substitution.
  • it is expressed as 'a specific amino acid is substituted' in the present application, it is obvious that it is substituted with an amino acid different from the amino acid before substitution, even if it is not separately indicated that the amino acid is substituted with another amino acid.
  • the “other amino acid” may be an amino acid other than glycine.
  • the other amino acids are selected from alanine, valine, leucine, isoleucine, methionine, phenylalanine, tryptophan, proline, serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine, glutamine, aspartic acid, glutamic acid, lysine, arginine, and histidine. It may be an amino acid, but is not limited thereto.
  • corresponding position refers to an amino acid residue at a recited position in a protein or polypeptide, or an amino acid residue that is similar, identical, or homologous to a recited residue in a protein or polypeptide.
  • corresponding region generally refers to a similar or corresponding position in a related protein or reference protein.
  • specific numbering may be used for amino acid residue positions within proteins used in this application. For example, by aligning the target protein to be compared with the polypeptide sequence of the protein of the present application, it is possible to renumber the positions corresponding to the amino acid residue positions of the protein of the present application.
  • the superoxide dismutase 1 variant in which the amino acid corresponding to the 37th position from the N-terminus of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 of the present application is substituted with another amino acid, has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 80%, 85% , Among amino acid sequences having 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% or more homology or identity, the amino acid corresponding to position 37 of SEQ ID NO: 1 may be a protein in which another amino acid is substituted. have.
  • Such variants have at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% homology or identity with SEQ ID NO: 1 and less than 100% homology with SEQ ID NO: 1.
  • it may be a variant having the same identity, but is not limited thereto.
  • the superoxide dismutase 1 variant in which the amino acid corresponding to the 37th position from the N-terminus of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 of the present application is substituted with another amino acid, includes any one of SEQ ID NOs: 12 to 30 it may be Specifically, it may consist essentially of any one amino acid sequence of SEQ ID NOs: 12 to 30, and more specifically, it may consist of any one amino acid sequence of SEQ ID NOs: 12 to 30, but is limited thereto. It doesn't work.
  • the variant includes an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 12 to 30, or amino acid 37 in the amino acid sequence is fixed (ie, amino acid sequence 37 in the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 12 to 30 in the amino acid sequence of the variant)
  • the amino acid corresponding to the position is identical to the amino acid at position 37 in the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 12 to 30), and may include an amino acid sequence having 80% or more homology or identity thereto, but is not limited thereto.
  • the variant of the present application is at least 80%, 90%, 95%, 96%, 97% of the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 12 to 30 and the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 12 to 30 %, 98%, or 99% homology or identity, the amino acid corresponding to position 37 in the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 12 to 30 is an amino acid other than glycine, may include a polypeptide.
  • the term 'homology' or 'identity' refers to the degree of relatedness between two given amino acid sequences or nucleotide sequences and can be expressed as a percentage.
  • the terms homology and identity are often used interchangeably.
  • Sequence homology or identity of conserved polynucleotides or polypeptides can be determined by standard alignment algorithms, together with default gap penalties established by the program used. Substantially homologous or identical sequences are generally under moderate or high stringency conditions along at least about 50%, 60%, 70%, 80% or 90% of the entire or full-length sequence. It can hybridize under stringent conditions. It is obvious that hybridization also includes polynucleotides containing common codons or codons considering codon degeneracy in polynucleotides.
  • GAP program can define the total number of symbols in the shorter of the two sequences divided by the number of similarly arranged symbols (i.e., nucleotides or amino acids).
  • the default parameters for the GAP program are (1) a binary comparison matrix (containing values of 1 for identity and 0 for non-identity) and Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation , pp. 353-358 (1979), Gribskov et al (1986) Nucl. Acids Res. 14: weighted comparison matrix of 6745 (or EDNAFULL (EMBOSS version of NCBI NUC4.4) substitution matrix); (2) a penalty of 3.0 for each gap and an additional penalty of 0.10 for each symbol in each gap (or 10 gap opening penalty, 0.5 gap extension penalty); and (3) no penalty for end gaps.
  • Another aspect of the present application may provide a polynucleotide encoding the variant.
  • polynucleotide refers to a DNA or RNA strand of a certain length or longer as a polymer of nucleotides in which nucleotide monomers are connected in a long chain shape by covalent bonds.
  • the gene encoding superoxide dismutase 1 of the present application may be the sod1 gene.
  • the gene may be of yeast origin. Specifically, it may be derived from the genus Saccharomyces, more specifically from Saccharomyces cerevisiae. Specifically, it includes without limitation as long as it encodes a polypeptide having superoxide dismutase 1 activity derived from Saccharomyces cerevisiae, and in one embodiment, it may be a gene encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, As an embodiment, it may include the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3, but is not limited thereto.
  • the polynucleotide encoding the superoxide dismutase 1 variant of the present application may be included without limitation as long as it is a polynucleotide encoding the superoxide dismutase 1 variant of the present application and a polypeptide having an activity corresponding thereto.
  • Polynucleotides encoding superoxide dismutase 1 and variants thereof of the present application change the amino acid sequence of the polypeptide due to codon degeneracy or considering codons preferred in organisms to express the polypeptide Various modifications may be made to the coding region within a range not specified.
  • the polynucleotide encoding the superoxide dismutase 1 variant of the present application is a polynucleotide sequence encoding a protein variant in which the amino acid corresponding to position 37 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with another amino acid. can be included without
  • a polynucleotide encoding a protein variant of the present application is a polynucleotide encoding a protein variant of the present application, specifically, an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 12 to 30, or a polypeptide having homology or identity thereto.
  • the sequence encoding the amino acid corresponding to position 37 in any one of SEQ ID NOs: 12 to 30 may be a polynucleotide sequence encoding an amino acid other than glycine, but is not limited thereto.
  • the homology or identity is as described above.
  • polynucleotide encoding the protein variant of the present application is hybridized under stringent conditions with a probe that can be prepared from a known gene sequence, for example, a complementary sequence to all or part of the nucleotide sequence, and SEQ ID NO: 1 Any sequence encoding a protein variant in which the amino acid corresponding to position 37 in the amino acid sequence of is substituted with another amino acid may be included without limitation.
  • the "stringent condition” means a condition that allows specific hybridization between polynucleotides. Such conditions are specifically described in the literature (eg, J. Sambrook et al., 1989, ibid.). For example, polynucleotides with high homology or identity, 40% or more, specifically 90% or more, more specifically 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, more specifically 99% or more 60°C, 1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, which is a condition in which polynucleotides of the same identity or identity do not hybridize and polynucleotides having less homology or identity do not hybridize, or washing conditions of conventional southern hybridization.
  • Hybridization requires that two nucleic acids have complementary sequences, although mismatches between bases are possible depending on the stringency of hybridization.
  • complementary is used to describe the relationship between nucleotide bases that are capable of hybridizing to each other. For example, with respect to DNA, adenine is complementary to thymine and cytosine is complementary to guanine.
  • the polynucleotides of the present application may also include substantially similar nucleic acid sequences as well as isolated nucleic acid fragments complementary to the entire sequence.
  • polynucleotides having homology or identity can be detected using hybridization conditions including a hybridization step at a Tm value of 55° C. and using the above-described conditions.
  • the Tm value may be 60 ° C, 63 ° C or 65 ° C, but is not limited thereto and may be appropriately adjusted by those skilled in the art according to the purpose.
  • Appropriate stringency for hybridizing polynucleotides depends on the length of the polynucleotide and the degree of complementarity, parameters well known in the art (see Sambrook et al., 1989, supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8).
  • Another aspect of the present application may provide a vector including a polynucleotide encoding the protein variant.
  • the term "vector” refers to a polynucleotide containing a base sequence of a polynucleotide encoding the target polypeptide operably linked to a suitable expression control region (or expression control sequence) so as to express the target polypeptide in a suitable host.
  • a suitable expression control region or expression control sequence
  • the expression control region may include a promoter capable of initiating transcription, an arbitrary operator sequence for regulating such transcription, a sequence encoding a suitable mRNA ribosome binding site, and a sequence regulating termination of transcription and translation.
  • the vector After transformation into a suitable host cell, the vector can replicate or function independently of the host genome and can integrate into the genome itself.
  • a polynucleotide encoding a target protein in a chromosome can be replaced with a mutated polynucleotide through a vector for chromosomal insertion into a cell. Insertion of the polynucleotide into the chromosome may be performed by any method known in the art, for example, homologous recombination, but is not limited thereto. A selection marker for determining whether the chromosome is inserted may be further included.
  • Selectable markers are used to select cells transformed with a vector, that is, to determine whether a target nucleic acid molecule has been inserted, and to give selectable phenotypes such as drug resistance, auxotrophy, resistance to cytotoxic agents, or expression of surface proteins. markers may be used. In an environment treated with a selective agent, only cells expressing the selectable marker survive or exhibit other expression traits, so transformed cells can be selected.
  • Yeast expression vectors can be both integrative yeast plasmid (YIp) and extrachromosomal plasmid vectors.
  • the extrachromosomal plasmid vector may include an episomal yeast plasmid (YEp), a replicative yeast plasmid (YRp), and a yeast centromer plasmid (YCp).
  • YACs artificial yeast chromosomes
  • YACs artificial yeast chromosomes
  • available vectors are pESCHIS, pESC-LEU, pESC-TRP, pESC-URA, Gateway pYES-DEST52, pAO815, pGAPZ A, pGAPZ B, pGAPZ C, pGAP ⁇ A, pGAP ⁇ B, pGAP ⁇ C, pPIC3.5K , pPIC6 A, pPIC6 B, pPIC6 C, pPIC6 ⁇ A, pPIC6 ⁇ B, pPIC6 ⁇ C, pPIC9K, pYC2/CT, pYD1 Yeast Display Vector, pYES2, pYES2/CT, pYES2/NT A, pYES2/NT B, pYES2/NT C , pYES2/CT, pYES2.1, pYES-DEST52, pTEF1/Zeo, pFLD1, PichiaPinkTM, p4
  • the term "transformation” means introducing a vector containing a polynucleotide encoding a target protein into a host cell or microorganism so that the protein encoded by the polynucleotide can be expressed in the host cell.
  • the transformed polynucleotide can be expressed in the host cell, it may be inserted into and located in the chromosome of the host cell or located outside the chromosome.
  • the polynucleotide includes DNA and RNA encoding a target protein.
  • the polynucleotide may be introduced in any form as long as it can be introduced and expressed into a host cell.
  • the polynucleotide may be introduced into a host cell in the form of an expression cassette, which is a genetic construct containing all elements required for self-expression.
  • the expression cassette may include a promoter operably linked to the polynucleotide, a transcription termination signal, a ribosome binding site, and a translation termination signal.
  • the expression cassette may be in the form of an expression vector capable of self-replication.
  • the polynucleotide may be introduced into a host cell in its own form and operably linked to a sequence necessary for expression in the host cell, but is not limited thereto.
  • operably linked means that a promoter sequence that initiates and mediates transcription of a polynucleotide encoding a target polypeptide of the present application and the gene sequence are functionally linked.
  • the method of transforming the vector of the present application includes any method of introducing nucleic acid into a cell, and can be performed by selecting an appropriate standard technique as known in the art according to the host cell. For example, electroporation, calcium phosphate (CaPO4) precipitation, calcium chloride (CaCl2) precipitation, microinjection, polyethylene glycol (PEG) method, DEAE-dextran method, cationic liposomal method, and lithium acetate -DMSO method, etc., but is not limited thereto.
  • the present application may provide a microorganism containing at least one of superoxide dismutase 1 and a polynucleotide encoding the variant.
  • microorganism includes both wild-type microorganisms and microorganisms in which genetic modification has occurred naturally or artificially, and specific mechanisms are weakened due to causes such as insertion of external genes or enhancement or weakening of the activity of endogenous genes. It is a concept that includes all microorganisms that have been enhanced or enhanced.
  • the microorganism may be a microorganism that produces glutathione.
  • microorganisms producing glutathione may be used interchangeably with terms such as “glutathione-producing microorganisms”, “microorganisms having glutathione-producing ability,” “glutathione-producing strains”, and “strains having glutathione-producing ability”.
  • the microorganism may be a microorganism that produces a glutathione derivative.
  • the microorganism of the present application may include a vector containing a polynucleotide encoding superoxide dismutase 1.
  • Glutathione in the present application is used interchangeably with “glutathione” and “GSH”, and refers to a tripeptide composed of three amino acids: glutamate, cysteine, and glycine. Glutathione may be used as a raw material for pharmaceuticals, health functional foods, taste materials, food, feed additives, and cosmetics, but is not limited thereto.
  • glutathione or a derivative thereof may be collectively referred to as "gamma-glutamyl peptide".
  • Gamma-glutamyl peptide refers to a small molecule compound having a gamma-carboxyl group of glutamic acid at the N-terminus of the molecule.
  • the gamma-glutamyl peptide may be a compound represented by the following general formula 1:
  • X is cysteine, glutamic acid, tyrosine, methionine, valine, tryptophan, aspartic acid, isoleucine, leucine, asparagine, glutamine, or histidine. lysine, ornithine, arginine, S-methylcysteine or S-ethylcysteine;
  • Y is glycine, alanine, leucine, isoleucine, serine, threonine, methionine, cysteine, aspartic acid, asparagine, glutamine, lysine, ornithine, arginine, phenylalanine, tyrosine, proline, hydroxyproline, alpha-aminobutyric acid, or absent.
  • the gamma-glutamyl peptide is ⁇ -Glu-Cys-Gly (glutathione), ⁇ -Glu-Glu ( ⁇ -EF), ⁇ -Glu-Tyr ( ⁇ -EY), ⁇ -Glu-Met ( ⁇ -EM), ⁇ -Glu-Val ( ⁇ -EV), ⁇ -Glu-Trp ( ⁇ -EW), ⁇ -Glu-Asp ( ⁇ -ED), ⁇ -Glu-Ile ( ⁇ -EI), ⁇ -Glu-Leu ( ⁇ -EL), ⁇ -Glu-Cys-Gly ( ⁇ -ECG), ⁇ -Glu-Val-Gly ( ⁇ -EVG), ⁇ -glutamyl-S-methyl-cysteine ( ⁇ -E-S- methyl-C), ⁇ -glutamyl-S-ethenyl-cysteine ( ⁇ -E-S-ethenyl-C), and ⁇ -glutamyl-cysteinyl- ⁇ -alanine ( ⁇ -E
  • the gamma-glutamyl peptide may be glutathione. However, it is not limited thereto.
  • the microorganism of the present application may refer to a microorganism capable of producing an excessive amount of desired glutathione compared to a wild-type or unmodified microorganism, including superoxide dismutase 1.
  • the microorganism is not particularly limited as long as it can produce glutathione, but may be a microorganism of the genus Saccharomyces, specifically Saccharomyces cerevisiae, Not limited to this.
  • the parent strain of the glutathione-producing microorganism containing the mutant is not particularly limited as long as it is capable of producing glutathione.
  • the microorganism may further include mutations such as enhancement of the biosynthetic pathway to increase glutathione production capacity, release of feedback inhibition, decomposition pathway or gene inactivation that weakens the biosynthetic pathway, and these mutations do not exclude natural ones. .
  • the term "enhancement" of polypeptide activity means that the activity of the polypeptide is increased relative to the intrinsic activity.
  • the enhancement may be used interchangeably with terms such as activation, up-regulation, overexpression, and increase.
  • activation, enhancement, upregulation, overexpression, and increase may include those that exhibit an activity that was not originally possessed, or those that exhibit enhanced activity compared to intrinsic activity or activity before modification.
  • the "intrinsic activity” refers to the activity of a specific polypeptide originally possessed by a parent strain or unmodified microorganism before transformation when a character is changed due to genetic mutation caused by natural or artificial factors. This may be used interchangeably with “activation before transformation”.
  • “Enhancement”, “upregulation”, “overexpression” or “increase” of the activity of a polypeptide compared to the intrinsic activity means that the activity and/or concentration (expression amount) is improved.
  • the enhancement can be achieved by introducing a foreign polypeptide or by enhancing the activity and/or concentration (expression level) of an endogenous polypeptide. Whether or not the activity of the polypeptide is enhanced can be confirmed from an increase in the activity level, expression level, or amount of a product released from the corresponding polypeptide.
  • Enhancement of the activity of the polypeptide can be applied by various methods well known in the art, and is not limited as long as the activity of the target polypeptide can be enhanced compared to the microorganism before transformation. Specifically, it may be using genetic engineering and / or protein engineering, which is well known to those skilled in the art, which is a routine method of molecular biology, but is not limited thereto (e.g., Sitnicka et al. Functional Analysis of Genes. Advances in Cell Biology. 2010, Vol. 2. 1-16, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012, etc.).
  • modification of the polynucleotide sequence encoding the polypeptide to enhance the activity of the polypeptide eg, modification of the polynucleotide sequence of the polypeptide gene to encode the modified polypeptide to enhance the activity of the polypeptide
  • It may be a combination of two or more selected from 1) to 8), but is not particularly limited thereto.
  • the increase in the intracellular copy number of the polynucleotide encoding the polypeptide is achieved by introducing into the host cell a vector capable of replicating and functioning independently of the host, to which the polynucleotide encoding the corresponding polypeptide is operably linked. it may be Alternatively, it may be achieved by introducing one copy or two or more copies of a polynucleotide encoding the corresponding polypeptide into a chromosome of a host cell.
  • the introduction into the chromosome may be performed by introducing a vector capable of inserting the polynucleotide into the chromosome of the host cell into the host cell, but is not limited thereto.
  • the vector is as described above.
  • the expression control region may include a promoter, an operator sequence, a sequence encoding a ribosome binding site, and a sequence regulating termination of transcription and translation.
  • the original promoter may be replaced with a strong promoter, but is not limited thereto.
  • promoters known for eukaryotes include translation elongation factor 1 (TEF1), glycerol-3-phosphate dehydrogenase 1 (GPD1), 3-phosphoglycerate kinase or other glycolytic enzymes such as enolase, glycerol Aldehyde-3-phosphate dehydrogenase, hexokinase, pyruvate decarboxylase, phosphofructokinase, glucose-6-phosphate isomerase, 3-phosphoglycerate mutase, pyruvate kinase, triosephosphate
  • yeast promoters that may include promoters for isomerase, phosphoglucose isomerase, and glucokinase, and which are inducible promoters with the added benefit of transcription controlled by growth conditions, include alcohol dehydrogenase and There are promoters for the second, isocytochrome C, acid phosphatase, a digestive enzyme associated with nitrogen
  • Modification of the nucleotide sequence encoding the initiation codon or 5'-UTR region of the gene transcript encoding the polypeptide is, for example, a nucleotide sequence encoding another initiation codon with a higher polypeptide expression rate than the endogenous initiation codon. It may be substituted, but is not limited thereto.
  • Modification of the amino acid sequence or polynucleotide sequence of 4) and 5) above may include deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution of the amino acid sequence of the polypeptide or the polynucleotide sequence encoding the polypeptide to enhance the activity of the polypeptide.
  • the combination thereof may be a sequence mutation, or replacement with an amino acid sequence or polynucleotide sequence improved to have stronger activity, or an amino acid sequence or polynucleotide sequence improved to increase activity, but is not limited thereto.
  • the replacement may be specifically performed by inserting the polynucleotide into a chromosome by homologous recombination, but is not limited thereto.
  • the vector used at this time may further include a selection marker for checking whether the chromosome is inserted.
  • the selectable marker is as described above.
  • Introduction of a foreign polynucleotide exhibiting the activity of the polypeptide may be introduction of a foreign polynucleotide encoding a polypeptide exhibiting the same/similar activity as the polypeptide into a host cell.
  • the foreign polynucleotide is not limited in origin or sequence as long as it exhibits the same/similar activity as the polypeptide.
  • the method used for the introduction can be performed by appropriately selecting a known transformation method by a person skilled in the art, and expression of the introduced polynucleotide in a host cell can generate a polypeptide and increase its activity.
  • the codon optimization of the polynucleotide encoding the polypeptide is codon optimization of the endogenous polynucleotide to increase transcription or translation in the host cell, or optimization of the transcription or translation of the foreign polynucleotide in the host cell. It may be that the codons of this have been optimized.
  • Analyzing the tertiary structure of the polypeptide to select and modify or chemically modify the exposed site for example, by comparing the sequence information of the polypeptide to be analyzed with a database in which sequence information of known proteins is stored, depending on the degree of sequence similarity. It may be to determine a template protein candidate according to the method, confirm the structure based on this, and modify or modify an exposed portion to be chemically modified to be modified or modified.
  • Such enhancement of polypeptide activity is an increase in the activity or concentration of the corresponding polypeptide based on the activity or concentration of the polypeptide expressed in the wild-type or unmodified microbial strain, or an increase in the amount of the product produced from the corresponding polypeptide. It may be, but is not limited thereto.
  • Modification of some or all of the polynucleotides in the microorganism of the present application is (a) genome editing using homologous recombination or genetic scissors (engineered nuclease, e.g., CRISPR-Cas9) using a vector for chromosomal insertion into the microorganism and / or (b) It may be induced by light and/or chemical treatment, such as ultraviolet light and radiation, but is not limited thereto.
  • a method of modifying part or all of the gene may include a method using DNA recombination technology.
  • a part or all of a gene may be deleted by injecting a nucleotide sequence or vector containing a nucleotide sequence homologous to a target gene into the microorganism to cause homologous recombination.
  • the injected nucleotide sequence or vector may include a dominant selection marker, but is not limited thereto.
  • the term "attenuation" of a polypeptide is a concept that includes both decreased activity or no activity compared to intrinsic activity.
  • the attenuation may be used interchangeably with terms such as inactivation, deficiency, down-regulation, decrease, reduce, and attenuation.
  • the attenuation is when the activity of the polypeptide itself is reduced or eliminated compared to the activity of the polypeptide originally possessed by the microorganism due to mutation of the polynucleotide encoding the polypeptide, inhibition of gene expression of the polynucleotide encoding it, or translation into a polypeptide.
  • the overall level and/or concentration (expression level) of the polypeptide in the cell is lower than that of the native strain due to inhibition of translation, etc., when the polynucleotide is not expressed at all, and/or when the polynucleotide is expressed Even if there is no activity of the polypeptide, it may also be included.
  • the "intrinsic activity” refers to the activity of a specific polypeptide originally possessed by a parent strain, wild-type or unmodified microorganism before transformation when a character is changed due to genetic mutation caused by natural or artificial factors. This may be used interchangeably with “activation before transformation”. "Inactivation, depletion, reduction, downregulation, reduction, attenuation" of the activity of a polypeptide compared to its intrinsic activity means that it is lower than the activity of a specific polypeptide originally possessed by the parent strain or unmodified microorganism before transformation.
  • Attenuation of the activity of such a polypeptide may be performed by any method known in the art, but is not limited thereto, and may be achieved by applying various methods well known in the art (e.g., Nakashima N et al., Bacterial cellular engineering by genome editing and gene silencing. Int J Mol Sci. 2014;15(2):2773-2793, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012, etc.).
  • an antisense oligonucleotide eg, antisense RNA
  • an antisense oligonucleotide that binds complementarily to the transcript of the gene encoding the polypeptide
  • It may be a combination of two or more selected from 1) to 8), but is not particularly limited thereto.
  • Deletion of part or all of the gene encoding the polypeptide may include removal of the entire polynucleotide encoding the endogenous target polypeptide in the chromosome, replacement with a polynucleotide in which some nucleotides are deleted, or replacement with a marker gene.
  • modification of the expression control region is a deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution, or a combination thereof, resulting in mutations in the expression control region (or expression control sequence), or weaker It may be a replacement with an active sequence.
  • the expression control region includes, but is not limited to, a promoter, an operator sequence, a sequence encoding a ribosome binding site, and a sequence controlling termination of transcription and translation.
  • the 5) modification of the nucleotide sequence encoding the initiation codon or 5'-UTR region of the gene transcript encoding the polypeptide is, for example, a base encoding another initiation codon with a lower polypeptide expression rate than the endogenous initiation codon. It may be substituted with a sequence, but is not limited thereto.
  • the modification of the amino acid sequence or polynucleotide sequence of 3) and 4) above is a deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution of the amino acid sequence of the polypeptide or the polynucleotide sequence encoding the polypeptide to weaken the activity of the polypeptide.
  • a combination thereof may be a sequence mutation, or replacement with an amino acid sequence or polynucleotide sequence improved to have weaker activity or an amino acid sequence or polynucleotide sequence improved to have no activity, but is not limited thereto.
  • expression of a gene may be inhibited or attenuated by introducing a mutation in a polynucleotide sequence to form a stop codon, but is not limited thereto.
  • antisense oligonucleotide e.g., antisense RNA
  • antisense RNA complementary to the transcript of the gene encoding the polypeptide
  • Weintraub, H. et al. Antisense-RNA as a molecular tool. for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986].
  • the microorganism of the present application may include a mutation in the expression control region of glutamate-cysteine ligase (GSH1) to increase glutathione-producing ability.
  • GSH1 glutamate-cysteine ligase
  • These mutations are -250 (C ⁇ T), -252 (G ⁇ A), -398 (A ⁇ T), -399 (A ⁇ C), -407 (T ⁇ C) and -409 ( It may be any one or more mutations selected from T ⁇ C).
  • the microorganism may contain a mutation in which the 86th amino acid and/or the 653rd amino acid of glutamate-cysteine ligase (GSH1) is substituted with another amino acid.
  • GSH1 glutamate-cysteine ligase
  • mutations in which amino acid 86 is substituted with arginine and amino acid 653 is substituted with methionine may be included.
  • the microorganism may contain a mutation in which the activity of glutamate-cysteine ligase (GSH1) is enhanced.
  • GSH1 glutamate-cysteine ligase
  • a microorganism containing any one or more of the superoxide dismutase 1 variant of the present application and the polynucleotide encoding the variant is a superoxide in which the amino acid corresponding to position 37 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with another amino acid. It may be "a microorganism expressing oxide dismutase 1", but is not limited thereto.
  • the superoxide dismutase 1 and its variants are as described above.
  • the term “to be expressed” means a state in which a target protein is introduced into a microorganism or modified to be expressed in a microorganism.
  • the microorganism expressing the protein variant of the present application may be a microorganism modified to express the protein variant of the present application, and thus another aspect of the present application provides a method for producing a microorganism expressing the protein variant of the present application .
  • pre-transformation strain or "pre-transformation microorganism” does not exclude strains containing mutations that may occur naturally in microorganisms, and are wild-type strains or natural-type strains themselves, or caused by natural or artificial factors. It may mean a strain before the character is changed due to genetic mutation.
  • strain before transformation or “microorganism before transformation” may be used interchangeably with “non-transformation strain”, “non-transformation strain”, “non-transformation microorganism”, “non-transformation microorganism” or “reference microorganism”.
  • a polynucleotide containing or encoding the superoxide dismutase 1 variant, or a microorganism containing a vector containing the polynucleotide may be a recombinant microorganism, and the recombination may be a genetic modification such as transformation (genetically modification).
  • the recombinant microorganism may be a recombinant microorganism prepared by transformation with a vector containing the polynucleotide, but is not limited thereto.
  • the recombinant microorganism may be yeast, for example, it may be a microorganism of the genus Saccharomyces, and specifically, it may be Saccharomyces cerevisiae, but is not limited thereto.
  • Another aspect of the present application provides a method for producing glutathione or a derivative thereof comprising culturing the microorganism.
  • the microorganism, glutathione or a derivative thereof is as described above.
  • any medium and other culture conditions used for culturing the strain of the present application may be used without particular limitation as long as it is a medium used for the culture of common microorganisms of the genus Saccharomyces.
  • the strain of the present application may be used as a suitable carbon source, It can be cultured while controlling temperature, pH, etc. under aerobic or anaerobic conditions in a conventional medium containing a nitrogen source, phosphorus, inorganic compounds, amino acids and/or vitamins.
  • Examples of the carbon source in the present application include carbohydrates such as glucose, fructose, sucrose, and maltose; sugar alcohols such as mannitol and sorbitol; organic acids such as pyruvic acid, lactic acid, citric acid and the like; Amino acids such as glutamate, methionine, lysine, and the like may be included, but are not limited thereto.
  • natural organic nutritional sources such as starch hydrolysate, molasses, blackstrap molasses, rice winter, cassava, sorghum and corn steep liquor can be used, as well as glucose and pasteurized pretreated molasses (i.e., molasses converted to reducing sugars).
  • Carbohydrates such as may be used, and various other carbon sources in appropriate amounts may be used without limitation. These carbon sources may be used alone or in combination of two or more.
  • nitrogen source examples include inorganic nitrogen sources such as ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium acetate, ammonium phosphate, ammonium carbonate, and ammonium nitrate; Organic nitrogen sources such as amino acids, peptones, NZ-amines, meat extracts, yeast extracts, malt extracts, corn steep liquor, casein hydrolysates, fish or degradation products thereof, defatted soybean cakes or degradation products thereof, and the like can be used. These nitrogen sources may be used alone or in combination of two or more, but are not limited thereto.
  • inorganic nitrogen sources such as ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium acetate, ammonium phosphate, ammonium carbonate, and ammonium nitrate
  • Organic nitrogen sources such as amino acids, peptones, NZ-amines, meat extracts, yeast extracts, malt extracts, corn steep liquor, casein hydrolysates, fish or degradation products thereof,
  • the number of persons may include monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, or a sodium-containing salt corresponding thereto.
  • the inorganic compound sodium chloride, calcium chloride, iron chloride, magnesium sulfate, iron sulfate, manganese sulfate, calcium carbonate, and the like may be used.
  • amino acids, vitamins, and/or appropriate precursors may be included in the medium.
  • L-amino acids and the like may be added to the culture medium of the strain.
  • glycine, glutamate, and/or cysteine may be added, and if necessary, L-amino acids such as lysine may be further added, but it is not necessarily limited thereto.
  • the medium or precursor may be added to the culture in a batch or continuous manner, but is not limited thereto.
  • the pH of the culture can be adjusted by adding compounds such as ammonium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia, phosphoric acid, sulfuric acid, etc. to the culture in an appropriate manner during cultivation of the strain.
  • an antifoaming agent such as a fatty acid polyglycol ester.
  • oxygen or oxygen-containing gas may be injected into the culture, or nitrogen, hydrogen or carbon dioxide gas may be injected without injection of gas or gas to maintain the anaerobic and non-aerobic state.
  • the temperature of the culture may be 25 ° C to 40 ° C, more specifically, 28 ° C to 37 ° C, but is not limited thereto.
  • the culturing period may be continued until a desired production amount of a useful substance is obtained, and specifically may be 1 hour to 100 hours, but is not limited thereto.
  • the manufacturing method may further include an additional process after the culturing step.
  • the additional process may be appropriately selected depending on the use of glutathione or a derivative thereof.
  • the method for producing glutathione or a derivative thereof may include a step of recovering glutathione or a derivative thereof accumulated in a cell by the culturing step, for example, after the culturing step, the strain, its dried product, extract, A step of recovering glutathione or a derivative thereof from at least one material selected from cultured material and lysate may be included.
  • the method for preparing the glutathione derivative may include converting the glutathione into a derivative.
  • the method may further include a step of lysing the strain before or simultaneously with the recovery step. Lysis of the strain may be performed by a method commonly used in the art, for example, a lysis buffer, a sonicator, heat treatment, and a French press.
  • the lysis step may include, but is not limited to, enzyme reactions such as cell wall degrading enzymes, nucleic acid degrading enzymes, nucleic acid transferases, and proteolytic enzymes.
  • dry yeast may be used interchangeably with terms such as "dry strain”.
  • the dry yeast may be prepared by drying yeast cells in which glutathione is accumulated, and may be specifically included in a composition for feed, a composition for food, etc., but is not limited thereto.
  • yeast extract may be used interchangeably with terms such as "strain extract”.
  • the strain extract may refer to a material remaining after separating cell walls from cells of the strain. Specifically, it may refer to components obtained by lysing cells except for cell walls.
  • the strain extract includes glutathione or a derivative thereof, and other components may include one or more of proteins, carbohydrates, nucleic acids, and fibers, but are not limited thereto.
  • glutathione or a derivative thereof, which is a target substance may be recovered using a suitable method known in the art.
  • the recovery step may include a purification process.
  • the purification process may be to separate and purify only glutathione or a derivative thereof from the strain. Through the purification process, pure purified glutathione can be produced.
  • the method for preparing glutathione may further include a step of mixing a material selected from among strains obtained after the culturing step, their dried products, extracts, cultures, lysates, and glutathione recovered therefrom with an excipient.
  • Yeast extract mix powder may be prepared through the mixing step. The same can be applied to derivatives of glutathione.
  • excipients may be appropriately selected and used according to the intended use or form, and for example, starch, glucose, cellulose, lactose, glycogen, D-mannitol, sorbitol, lactitol, maltodextrin, calcium carbonate, synthetic aluminum silicate, Calcium monohydrogen phosphate, calcium sulfate, sodium chloride, sodium hydrogen carbonate, purified lanolin, dextrin, sodium alginate, methylcellulose, colloidal silica gel, hydroxypropyl starch, hydroxypropylmethylcellulose, propylene glycol, casein, calcium lactate , Primogel, and gum arabic, and specifically, may be one or more components selected from starch, glucose, cellulose, lactose, dextrin, glycogen, D-mannitol, and maltodextrin, but is not limited thereto.
  • the excipient may include, for example, a preservative, a wetting agent, a dispersing agent, a suspending agent, a buffer, a stabilizer, or an isotonic agent, but is not limited thereto.
  • CJ-5 strain (KR 10-2222210 B1), which is a glutathione-producing strain, deposited under Accession No. KCCM12568P, mutation was induced by the following method.
  • the CJ-5 strain After culturing the CJ-5 strain on a solid medium, it was inoculated into broth to obtain a culture medium, and the cells were irradiated with UV using a UV lamp. Thereafter, the UV-irradiated culture medium was plated on a plate medium to obtain only mutant strains that formed colonies, and strains with the most improved glutathione-producing ability were isolated.
  • the strain was named CC02-2816 and deposited with the Korea Microorganism Conservation Center, an entrusted institution under the Budapest Treaty, on December 8, 2020, and was given accession number KCCM12891P.
  • the CC02-2816 strain After culturing the CC02-2816 strain on a solid medium, it was inoculated into broth to obtain a culture solution, and the cells were irradiated with UV using a UV lamp. Thereafter, the UV-irradiated culture medium was plated on a plate medium to isolate and obtain only mutant strains forming colonies, and sequencing was performed.
  • Example 2 From the results of Example 2, it was determined that position 37 of the SOD1 protein would be important for glutathione production, and the wild-type S. cerevisiae CEN.PK2-1D and the CC02-2816 strain of Example 1 had a different amino acid position 37 of the SOD1 protein. It was designed to express a mutant protein substituted with an amino acid, and it was attempted to confirm whether the production of glutathione was increased.
  • PCR was performed as follows using the genomic DNA of the CJ-5 strain as a template. PCR was performed using the primers of SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 6 to obtain a partial sequence of SOD1 N-terminal including the N-terminal BamHI flanking sequence, the start codon of SOD1 ORF, and the G37R mutant coding sequence, and SEQ ID NO: 5 and sequence sequence Using the primer number 7, a partial SOD1 C-terminal sequence including the C-terminal XhoI flanking sequence, the SOD1 ORF stop codon, and the G37R mutant coding sequence was obtained.
  • PCR was performed using SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9 using the genomic DNA of the CJ-5 strain as a template to obtain a 500 bp fragment after the stop codon of the SOD1 ORF containing N-terminal SpeI and C-terminal NcoI restriction enzyme sequences. and treated with SpeI and NcoI restriction enzymes. Thereafter, the pWBR100-SOD1 vector was prepared by cloning into pWBR100 treated with the same restriction enzyme.
  • the previously prepared pWAL100-SOD1 (G37R) vector was used as a template, and the primers of SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 10 were used to contain the arginine-mutated coding sequence and a part of KlURA3.
  • each PCR product was obtained.
  • PCR was performed under conditions of 5 minutes of heat denaturation at 95 °C, 1 minute of conjugation at 53 °C, and 1 minute of polymerization at 72 °C. (6), 1425) was used as a modified lithium acetate method. Specifically O.D. After washing the yeast cells between 0.7 and 1.2 twice with lithium acetate/TE buffer, the PCR products and single stranded DNA (Sigma D-7656) were mixed together and incubated in lithium acetate/TE/40% PEG buffer for 30 minutes.
  • a strain capable of expressing SOD1 mutant protein substituted with an amino acid other than arginine also used a pair of primers in which the arginine coding sequence at No. 37 on the primer sequences of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 was substituted with a sequence encoding another amino acid. It was prepared in the same way except for .
  • the glutathione-producing ability can be increased by substituting amino acid 37 of the SOD1 protein with another amino acid, indicating that the SOD1 protein variant provided in the present application can be usefully used for the production of gamma-glutamyl peptides. Able to know.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 출원은 신규한 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈 1 변이체 및 이를 이용한 글루타치온 또는 그 유도체의 생산방법에 관한 것이다.

Description

슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈 1 변이체 및 이를 이용한 글루타치온 또는 그 유도체의 생산방법
본 출원은 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈 1 변이체, 및 이를 이용한 글루타치온 또는 그 유도체의 생산방법에 관한 것이다.
글루타치온(Glutathione, GSH)은 세포 내에서 가장 일반적으로 존재하는 유기 황화합물로 글리신(glycine), 글루타메이트(glutamate), 시스테인(cysteine)의 세 가지 아미노산들이 결합한 트리펩타이드(tripeptide) 형태이다.
글루타치온은 체내에서는 환원형 글루타치온(GSH)과 산화형 글루타치온(GSSG) 두 가지 형태로 존재한다. 일반적인 상황에서 상대적으로 높은 비율로 존재하는 환원형 글루타치온(GSH)은 인체의 간과 피부 세포에 주로 분포하며 활성산소를 분해·제거하는 항산화 기능, 독성물질과 같은 외인성 화합물의 제거 등 해독 작용, 멜라닌 색소 생성을 억제하는 미백작용 등 중요한 역할을 한다.
이와 같이 다양한 기능을 지닌 글루타치온은 제약, 건강기능식품, 화장품 등 다양한 분야의 소재로 각광받고 있으며 맛소재, 식품 및 사료 첨가제 제조에 이용되기도 한다. 글루타치온은 원물의 맛 상승과 풍부한 맛 지속성 유지효과가 크며, 단독으로 사용하거나 다른 물질과 배합하여 고쿠미(kokumi) 향미증진제로 사용 할 수 있음이 알려져 있다. 보통 고쿠미 소재는 기존 핵산, MSG 등의 우마미(umami) 소재보다 농후감을 가지며, 단백질이 분해 숙성되어 생성되는 것으로 알려져 있다. 또한, 글루타치온은 다른 감마-글루타밀 펩타이드로 전환되기도 한다(Sofyanovich OA et al,(2019) Multiple pathways for the formation of the γ-glutamyl peptides γ-glutamyl-valine and γ-glutamyl-valylglycine in Saccharomyces cerevisiae. PLoS ONE 14 (5): e0216622). 감마-글루타밀 펩타이드는 분자의 N-말단에 글루탐산의 감마-카복실 그룹을 가지는 저분자 화합물로, 고쿠미 향미증진제로도 널리 사용되는 것으로 알려져 있다.
그러나 이와 같이 다양한 분야에 사용할 수 있는 글루타치온 및 그 유도체에 대한 수요가 증가되고 있음에도 불구하고, 높은 생산 단가로 인해 효소 합성 공정은 아직 상용화가 되어 있지 않아, 글루타치온 및 그 유도체의 산업적 생산에 적지 않은 비용이 필요하기 때문에 시장이 크게 활성화되지 못하는 실정이다.
본 출원의 해결하고자 하는 과제는 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈 1 변이체, 및 이를 이용한 글루타치온 또는 그 유도체의 생산방법을 제공하는 것이다.
본 출원은 서열번호 1의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 37번째 위치에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈 1 변이체를 제공한다.
본 출원은 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 이를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 출원은 상기 변이체 및 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나 이상을 포함하는 미생물을 제공한다.
본 출원은 상기 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 글루타치온 또는 그 유도체의 생산 방법을 제공한다.
본 출원의 신규한 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈 1 변이체는 글루타치온 또는 그 유도체의 고생산에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1 및 도 2는 사카로마이세스 세레비지애 균주에 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈 1 변이체를 도입하여 글루타치온 생산수준을 확인한 결과이다.
설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 출원에 기재된 본 출원의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 출원에 포함되는 것으로 의도된다.
또한, 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 출원의 하나의 양태는, 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈 1(SOD1) 활성을 갖는 단백질에서 아미노산 치환을 포함하고, 상기 치환은 서열번호 1의 N-말단으로부터 37번째 위치에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것을 포함하는, 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈 1 변이체를 제공할 수 있다.
상기 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 37번째 위치에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 단백질 변이체일 수 있다.
본 출원의 "슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈 1(superoxide dismutase 1)"은 "SOD1" 또는 "Superoxide dismutase [Cu-Zn]"라고도 칭해지는 효소이다. 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈는 다음의 반응을 촉매하는 것으로 알려져 있다:
2 O2 - + 2 H+ → H2O2 + O2
본 출원에서 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈 1의 아미노산 서열은 sod1 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열로, "SOD1 단백질"로 지칭할 수 있다. 본 출원의 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈 1을 구성하는 아미노산 서열은 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank에서 그 서열을 얻을 수 있다. 상기 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈 1은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또 다른 일 예로, 상기 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈 1은 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 유래일 수 있고, 다른 예로, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 37번 위치에 상응하는 아미노산이 글리신인 것일 수 있다. 그러나 이에 제한되지 않으며 상기 아미노산 서열과 동일한 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈 1의 활성을 갖는 서열은 제한 없이 포함될 수 있다.
구체적인 예를 들어, 본 출원의 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈 1은 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원의 변이 대상이 되는 단백질의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
또한, 본 출원에서 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈 1의 일 예로, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질이라고 정의하였으나, 서열번호 1의 아미노산 서열 앞뒤로의 무의미한 서열 추가 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 혹은 이의 잠재성 돌연변이(silent mutation)를 제외하는 것이 아니며, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 서로 동일 또는 상응하는 활성을 가지는 경우라면 본 출원의 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈 1에 해당됨은 당업자에게 자명하다.
즉, 본 출원에서 '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드', '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드'라고 기재되어 있다 하더라도, 해당 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원에서 사용될 수 있음은 자명하다.
본 출원에서 용어, "변이체(variant)" 또는 "변이형 폴리펩티드(modified polypeptide)"는 하나 이상의 아미노산이 보존적 치환(conservative substitution) 및/또는 변형(modification)에 있어서 상기 열거된 서열(the recited sequence)과 상이하나, 상기 단백질의 기능(functions) 또는 특성(properties)이 유지되는 단백질을 지칭한다.
상기 변이체는 수 개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가에 의해 식별되는 서열(identified sequence)과 상이하다. 이러한 변이체는 일반적으로 상기 단백질의 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산을 변형하고, 상기 변형된 단백질의 특성을 평가하여 식별될 수 있다. 즉, 변이체의 능력은 본래 단백질(native protein)에 비하여 증가되거나, 변하지 않거나, 또는 감소될 수 있다. 또한, 일부 변이체는 N-말단 리더 서열 또는 막전이 도메인(transmembrane domain)과 같은 하나 이상의 부분이 제거된 변이형 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 다른 변이체는 성숙 단백질 (mature protein) 의 N- 및/또는 C-말단으로부터 일부분이 제거된 변이체를 포함할 수 있다. 상기 용어 "변이체" 또는 "변이형 폴리펩티드"는 변이형, 변형, 변이된 단백질, 변이 등의 용어(영문 표현으로는 modification, modified protein, mutant, mutein, divergent, variant 등)가 혼용되어 사용될 수 있으며, 변이된 의미로 사용되는 용어라면 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어 "보존적 치환(conservative substitution)"은 한 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 의미한다. 상기 변이체는 하나 이상의 생물학적 활성을 여전히 보유하면서, 예를 들어 하나 이상의 보존적 치환을 가질 수 있다. 이러한 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성(amphipathic nature)에서의 유사성에 근거하여 발생할 수 있다.
예를 들면, 전하를 띠는 곁사슬(electrically charged amino acid)을 갖는 아미노산 중 양으로 하전된 (염기성) 아미노산은 아르기닌, 라이신, 및 히스티딘을, 음으로 하전된 (산성) 아미노산은 글루탐산 및 아스파르트산을 포함하고; 전하를 띠지 않는 곁사슬(uncharged side chain)을 갖는 아미노산은 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 프롤린, 세린, 쓰레오닌, 시스테인, 타이로신, 아스파라긴, 글루타민을 포함하는 것으로 분류할 수 있다.
또한, 변이체는 폴리펩티드의 특성과 2차 구조에 최소한의 영향을 갖는 아미노산들의 결실 또는 부가를 포함할 수 있다. 예를 들면 폴리펩티드는 번역-동시에(co-translationally) 또는 번역-후에(post-translationally) 단백질의 이전(transfer)에 관여하는 단백질 N-말단의 시그널(또는 리더) 서열과 컨쥬게이트 할 수 있다. 또한 상기 폴리펩티드는 폴리펩티드를 확인, 정제, 또는 합성할 수 있도록 다른 서열 또는 링커와 컨쥬게이트 될 수 있다.
하나의 구현예로, 본 출원의 변이체는 전술한 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈 1 중, 서열번호 1의 N-말단으로부터 37번째 위치에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈 1 변이체 또는 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈 1 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드일 수 있다. 본 출원의 변이체는 "슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈 1 변이체" 는 " 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈 1 활성을 갖는 (변이형) 폴리펩티드", "SOD1 변이체"로도 기재될 수 있으며, 변이 전의 단백질, 천연의 야생형 폴리펩티드 또는 비변형 폴리펩티드에 비해 글루타치온 생산량을 증가시킬 수 있는 것일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
앞선 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 37번째 위치에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈 1 변이체 일 수 있다.
본 출원에서, '다른 아미노산으로 치환'은 치환 전의 아미노산과 다른 아미노산이면 제한되지 않는다. 한편, 본 출원에서 '특정 아미노산이 치환되었다'고 표현하는 경우, 다른 아미노산으로 치환되었다고 별도로 표기하지 않더라도 치환 전의 아미노산과 다른 아미노산으로 치환되는 것임은 자명하다.
앞선 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 "다른 아미노산"은 글리신을 제외한 아미노산일 수 있다. 구체적으로, 상기 다른 아미노산은 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 프롤린, 세린, 쓰레오닌, 시스테인, 타이로신, 아스파라긴, 글루타민, 아스파르트산, 글루탐산, 라이신, 아르기닌 및 히스티딘 중 선택되는 아미노산일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어 "상응하는 위치(corresponding position)"는, 단백질 또는 폴리펩티드에서 열거되는 위치의 아미노산 잔기이거나, 또는 단백질 또는 폴리펩티드에서 열거되는 잔기와 유사하거나 동일하거나 상동한 아미노산 잔기를 지칭한다. 본 출원에 사용된 "상응 영역"은 일반적으로 관련 단백질 또는 레퍼런스 단백질에서의 유사하거나 대응되는 위치를 지칭한다.
본 출원에서, 본 출원에 사용되는 단백질 내의 아미노산 잔기 위치에 특정 넘버링이 사용될 수 있다. 예를 들면, 비교하고자 하는 대상 단백질과 본 출원의 단백질의 폴리펩티드 서열을 정렬함으로써, 본 출원의 단백질의 아미노산 잔기 위치에 상응하는 위치에 대해 재넘버링 하는 것이 가능하다.
본 출원의 서열번호 1의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 37번째 위치에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈 1 변이체는, 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열 중, 서열번호 1의 37번째 위치에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 단백질일 수 있다.
이와 같은 변이체는 서열번호 1과 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지고, 서열번호 1과 100% 미만의 상동성 또는 동일성을 가지는 변이체일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 서열번호 1의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 37번째 위치에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈 1 변이체는, 서열번호 12 내지 30 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로 서열번호 12 내지 30 중 어느 하나의 아미노산 서열로 필수적으로 구성되는 (consisting essentially of) 것일 수 있고, 보다 구체적으로는 서열번호 12 내지 30 중 어느 하나의 아미노산 서열로 구성되는 것일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
또한 상기 변이체는 서열번호 12 내지 30 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 상기 아미노산 서열에서 37번 아미노산은 고정되고(즉, 변이체의 아미노산 서열에서 상기 서열번호 12 내지 30의 아미노산 서열에서 37번 위치에 상응하는 아미노산은 상기 서열번호 12 내지 30의 아미노산 서열에서 37번 위치의 아미노산과 동일하고), 이와 80% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로 본 출원의 상기 변이체는 서열번호 12 내지 30 중 어느 하나의 아미노산 서열 및 상기 서열번호 12 내지 30 중 어느 하나의 아미노산 서열의 아미노산 서열과 적어도 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성 또는 동일성을 가지고, 상기 서열번호 12 내지 30 중 어느 하나의 아미노산 서열에서 37번 위치에 상응하는 아미노산은 글리신 이외의 아미노산인, 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 변이체에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 37번 위치 이외에, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원의 범위에 포함됨은 자명하다.
본 출원에서 용어, '상동성 (homology)' 또는 '동일성 (identity)'은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.
보존된(conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나(homologous) 또는 동일한(identical) 서열은 일반적으로 서열 전체 또는 전체-길이의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%를 따라 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 일반 코돈 또는 코돈 축퇴성을 고려한 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드 역시 포함됨이 자명하다.
임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는, 예를 들어, Pearson et al (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다(GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO et al.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 상동성, 유사성 또는 동일성은, 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482 에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48:443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의할 수 있다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 이진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL (NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티 (또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다.
또한, 임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)으로 결정될 수 있다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공할 수 있다.
본 출원에서 용어, "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥을 의미한다.
본 출원의 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈 1을 코딩하는 유전자는 sod1 유전자일 수 있다.
상기 유전자는 효모 유래 일 수 있다. 구체적으로는 사카로마이세스(Saccharomyces) 속, 보다 구체적으로는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 유래일 수 있다. 구체적으로는 사카로마이세스 세레비지애 유래의 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈 1 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 것이면 제한없이 포함하고, 일 구현예로 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자일 수 있으며, 일 구현예로 서열번호 2 또는 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 것일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈 1 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 본 출원의 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈 1 변이체 및 이에 상응하는 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드라면 제한없이 포함될 수 있다.
본 출원의 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈 1 및 이의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 폴리펩티드를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다.
구체적으로, 본 출원의 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈 1 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 37번째 위치에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 단백질 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이라면 제한 없이 포함할 수 있다.
예를 들어, 본 출원의 단백질 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 본 출원의 단백질 변이체, 구체적으로는 서열번호 12 내지 30 중 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 이와 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열로서, 서열번호 12 내지 30 중 어느 하나의 아미노산 서열에서 37번 위치에 상응하는 아미노산을 코딩하는 서열은 글리신 이외의 아미노산을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 상동성 또는 동일성에 대해서는 전술한 바와 같다.
또한, 본 출원의 단백질 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 공지의 유전자 서열로부터 제조될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 염기 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이브리드화하여, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 37번 위치에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 단백질 변이체를 코딩하는 서열이라면 제한 없이 포함할 수 있다.
상기 "엄격한 조건(stringent condition)"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌(예컨대, J. Sambrook et al., 1989, 상동)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성 또는 동일성이 높은 폴리뉴클레오티드끼리, 40% 이상, 구체적으로 90% 이상, 보다 구체적으로 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 더욱 구체적으로 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성 또는 동일성이 낮은 폴리뉴클레오티드끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화(southern hybridization)의 세척 조건인 60℃, 1ХSSC, 0.1% SDS, 구체적으로 60℃, 0.1ХSSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로 68℃, 0.1ХSSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.
혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치(mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데닌은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55 ℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60℃, 63℃ 또는 65℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.
폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(Sambrook et al., 1989, supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조).
본 출원의 다른 하나의 양태는 상기 단백질 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공할 수 있다.
본 출원에서 사용된 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 폴리펩티드를 발현시킬 수 있도록 적합한 발현조절영역(또는 발현조절서열)에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 발현조절영역은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
일례로 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내에 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 변이된 폴리뉴클레오티드로 교체시킬 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 목적 핵산 분자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
본 출원에서 사용되는 벡터는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 효모 발현 벡터는 조합 효모 플라스미드(YIp: integrative yeast plasmid) 및 염색체 외 플라스미드 벡터(extrachromosomal plasmid vector)가 모두 가능하다. 상기 염색체 외 플라스미드 벡터는 에피솜 효모 플라스미드(YEp: episomal yeast plasmid), 복제 효모 플라스미드(YRp: replicative yeast plasmid) 및 효모 중심체 플라스미드(YCp: yeast centromer plasmid)를 포함할 수 있다. 또한, 인위적 효모 염색체들(YACs: artificial yeast chromosomes)도 본 출원의 벡터로 이용이 가능하다. 구체적인 예로서, 이용 가능한 벡터는 pESCHIS, pESC-LEU, pESC-TRP, pESC-URA, Gateway pYES-DEST52, pAO815, pGAPZ A, pGAPZ B, pGAPZ C, pGAPα A, pGAPα B, pGAPα C, pPIC3.5K, pPIC6 A, pPIC6 B, pPIC6 C, pPIC6α A, pPIC6α B, pPIC6α C, pPIC9K, pYC2/CT, pYD1 Yeast Display Vector, pYES2, pYES2/CT, pYES2/NT A, pYES2/NT B, pYES2/NT C, pYES2/CT, pYES2.1, pYES-DEST52, pTEF1/Zeo, pFLD1, PichiaPinkTM, p427-TEF, p417-CYC, pGAL-MF, p427-TEF, p417-CYC, PTEF-MF, pBY011, pSGP47, pSGP46, pSGP36, pSGP40, ZM552, pAG303GAL-ccdB, pAG414GAL-ccdB, pAS404, pBridge, pGAD-GH, pGAD T7, pGBK T7, pHIS-2, pOBD2, pRS408, pRS410, pRS418, pRS420, pRS428, yeast micron A form, pRS403, pRS404, pRS405, pRS406, pYJ403, pYJ404, pYJ405 및 pYJ406를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원에서 용어 "형질전환"은 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 혹은 미생물 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 목적 단백질을 코딩하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로도 도입될 수 있다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.
본 출원의 벡터를 형질전환 시키는 방법은 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 숙주세포에 따라 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌 글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원은 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈 1 및 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나 이상을 포함하는 미생물을 제공할 수 있다.
본 출원에서 용어 "미생물"은 야생형 미생물이나, 자연적 또는 인위적으로 유전적 변형이 일어난 미생물을 모두 포함하며, 외부 유전자가 삽입되거나 내재적 유전자의 활성이 강화되거나 약화되는 등의 원인으로 인해서 특정 기작이 약화되거나 강화된 미생물을 모두 포함하는 개념이다.
하나의 구현예로, 상기 미생물은 글루타치온을 생산하는 미생물일 수 있다. 본 출원에서 "글루타치온을 생산하는 미생물" 은 "글루타치온 생산 미생물", "글루타치온 생산능을 갖는 미생물, "글루타치온 생산 균주", "글루타치온 생산능을 갖는 균주" 등의 용어와 혼용되어 사용될 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 미생물은 글루타치온 유도체를 생산하는 미생물일 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 본 출원의 미생물은 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈 1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함할 수 있다.
본 출원의 "글루타치온(glutathione)"은 "글루타티온", "GSH"와 상호 교환적으로 사용되며, 글루타메이트(glutamate), 시스테인(Cysteine), 글리신(glycine) 의 세가지 아미노산으로 구성된 트리펩타이드를 의미한다. 글루타치온은 제약, 건강기능식품, 맛소재, 식품, 사료 첨가제, 화장품 등의 원료로 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 "글루타치온 유도체"는 글루타치온을 출발 물질로 하여 전환될 수 있는 물질이라면, 제한 없이 포함된다.
본 출원에서, 글루타치온 또는 그 유도체는 "감마-글루타밀 펩타이드"로 통칭될 수 있다. 감마-글루타밀 펩타이드는 분자의 N-말단에 글루탐산의 감마-카복실 그룹을 가지는 저분자 화합물을 지칭한다.
구체적으로, 감마-글루타밀 펩타이드는 하기 일반식 1로 표시되는 화합물일 수 있다:
[일반식 1]
γ-Glu - X - Y
상기 일반식 1에서, X는 시스테인, 글루탐산, 타이로신, 메티오닌, 발린, 트립토판, 아스파르트산, 이소류신, 류신, 아스파라긴, 글루타민, 히스티딘. 라이신, 오르니틴, 아르기닌, S-메틸시스테인(S-methylcysteine) 또는 S-에틸시스테인(S-ethylcysteine) 이고;
Y는 글리신, 알라닌, 류신, 이소류신, 세린, 쓰레오닌, 메티오닌, 시스테인, 아스파르트산, 아스파라긴, 글루타민, 라이신, 오르니틴, 아르기닌, 페닐알라닌, 타이로신 ,프롤린, 하이드록시프롤린, 알파-아미노뷰티르산, 또는 부존재함.
일 구현예로, 감마-글루타밀 펩타이드는 γ-Glu-Cys-Gly(글루타치온), γ-Glu-Glu(γ-EF), γ-Glu-Tyr (γ-EY), γ-Glu-Met (γ-EM), γ-Glu-Val (γ-EV), γ-Glu-Trp (γ-EW), γ-Glu-Asp (γ-ED), γ-Glu-Ile (γ-EI), γ-Glu-Leu (γ-EL), γ-Glu-Cys-Gly (γ-ECG), γ-Glu-Val-Gly (γ-EVG), γ-glutamyl-S-methyl-cysteine(γ-E-S-methyl-C), γ-glutamyl-S-ethenyl-cysteine (γ-E-S-ethenyl-C), 및 γ-glutamyl-cysteinyl-β-alanine (γ-E-C-β-A) 중에서 선택되는 것일 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 감마-글루타밀 펩타이드는 글루타치온일 수 있다. 그러나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 미생물은 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈 1을 포함하여, 야생형이나 비변형 미생물과 비교하여 목적하는 글루타치온을 과량으로 생산할 수 있는 미생물을 의미할 수 있다. 상기 미생물은 글루타치온 생산이 가능하다면 그 종류가 특별히 제한되지는 않으나, 사카로마이세스 속 (the genus Saccharomyces) 미생물일 수 있고, 구체적으로는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 변이체를 포함하는 글루타치온 생산 미생물의 모균주는, 글루타치온 생산이 가능한 것이면 특별히 제한되지 않는다. 상기 미생물은 추가로 글루타치온 생산능 증가를 위한 생합성경로 강화, 피드백 저해 해제, 분해경로 혹은 생합성 경로를 약화시키는 유전자 불활성화 등의 변이를 포함하는 것일 수 있고, 이러한 변이는 자연적인 것을 배제하는 것은 아니다.
본 출원에서 용어, 폴리펩티드 활성의 "강화"는, 폴리펩티드의 활성이 내재적 활성에 비하여 증가되는 것을 의미한다. 상기 강화는 활성화(activation), 상향조절(up-regulation), 과발현(overexpression), 증가(increase) 등의 용어와 혼용될 수 있다. 여기서 활성화, 강화, 상향조절, 과발현, 증가는 본래 가지고 있지 않았던 활성을 나타내게 되는 것, 또는 내재적 활성 또는 변형 전 활성에 비하여 향상된 활성을 나타내게 되는 것을 모두 포함할 수 있다. 상기 "내재적 활성"은 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드의 활성을 의미한다. 이는 "변형 전 활성"과 혼용되어 사용될 수 있다. 폴리펩티드의 활성이 내재적 활성에 비하여 "강화", "상향조절", "과발현" 또는 "증가"한다는 것은, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드의 활성 및/또는 농도(발현량)에 비하여 향상된 것을 의미한다.
상기 강화는 외래의 폴리펩티드를 도입하거나, 내재적인 폴리펩티드의 활성 강화 및/또는 농도(발현량)를 통해 달성할 수 있다. 상기 폴리펩티드의 활성의 강화 여부는 해당 폴리펩티드의 활성 정도, 발현량 또는 해당 폴리펩티드로부터 배출되는 산물의 양의 증가로부터 확인할 수 있다.
상기 폴리펩티드의 활성의 강화는 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용이 가능하며, 목적 폴리펩티드의 활성을 변형전 미생물보다 강화시킬 수 있는 한, 제한되지 않는다. 구체적으로, 분자생물학의 일상적 방법인 당업계의 통상의 기술자에게 잘 알려진 유전자 공학 및/또는 단백질 공학을 이용한 것일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다(예컨대, Sitnicka et al. Functional Analysis of Genes. Advances in Cell Biology. 2010, Vol. 2. 1-16, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012 등).
구체적으로, 본 출원의 폴리펩티드 활성의 강화는
1) 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 세포 내 카피수 증가;
2) 폴리펩티드를 코딩하는 염색체상의 유전자 발현조절영역을 활성이 강력한 서열로 교체;
3) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 염기서열의 변형;
4) 폴리펩티드 활성이 강화되도록 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열의 변형;
5) 폴리펩티드 활성이 강화도록 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형 (예를 들어, 폴리펩티드의 활성이 강화되도록 변형된 폴리펩티드를 코딩하도록 상기 폴리펩티드 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열의 변형);
6) 폴리펩티드의 활성을 나타내는 외래 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 외래 폴리뉴클레오티드의 도입;
7) 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화;
8) 폴리펩티드의 삼차구조를 분석하여 노출 부위를 선택하여 변형하거나 화학적으로 수식; 또는
9) 상기 1) 내지 8) 중 선택된 2 이상의 조합일 수 있으나, 이에, 특별히 제한되는 것은 아니다.
보다 구체적으로,
상기 1) 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 세포 내 카피수 증가는, 해당 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된, 숙주와 무관하게 복제되고 기능할 수 있는 벡터의 숙주세포 내로의 도입에 의해 달성되는 것일 수 있다. 또는, 해당 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내의 염색체 내에 1 카피 또는 2 카피 이상 도입에 의해 달성되는 것일 수 있다. 상기 염색체 내에 도입은 숙주세포 내의 염색체 내로 상기 폴리뉴클레오티드를 삽입시킬 수 있는 벡터가 숙주세포 내에 도입됨으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 벡터는 전술한 바와 같다.
상기 2) 폴리펩티드를 코딩하는 염색체상의 유전자 발현조절영역(또는 발현조절서열)을 활성이 강력한 서열로 교체는, 예를 들면, 상기 발현조절영역의 활성을 더욱 강화하도록 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이 발생, 또는 더욱 강한 활성을 가지는 서열로의 교체일 수 있다. 상기 발현조절영역은, 특별히 이에 제한되지 않으나 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 그리고 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등을 포함할 수 있다. 일 예로, 본래의 프로모터를 강력한 프로모터로 교체시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
진핵 생물에 대해 공지된 프로모터의 예에는 번역 신장 인자 1(TEF1), 글리세롤-3-인산 탈수소 효소 1(GPD1), 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 글리콜분해 효소, 예컨대 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카르복실라제, 포스포프룩토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제, 및 글루코키나제에 대한 프로모터를 포함할 수 있고, 성장 조건에 의해 제어되는 전사의 추가의 이점을 갖는 유도성 프로모터인 다른 효모 프로모터의 예에는 알콜 데히드로게나제 2, 이소사이토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사와 연관된 분해 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 및 말토스 및 갈락토스 이용을 담당하는 효소에 대한 프로모터가 있고, 숙주 세포가 효모인 경우 이용가능한 프로모터는 TEF1 프로모터, TEF2 프로모터, GAL10 프로모터, GAL1 프로모터, ADH1 프로모터, ADH2 프로모터, PHO5 프로모터, GAL1-10 프로모터, TDH3 프로모터(GPD 프로모터), TDH2 프로모터, TDH1 프로모터, PGK1 프로모터, PYK2 프로모터, ENO1 프로모터, ENO2 프로모터 및 TPI1 프로모터를 포함할 수 있으며, 효모 발현에 사용하기에 적합한 벡터 및 프로모터는 EP 073657에 추가로 기재되어 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 효모 인핸서도 효모 프로모터와 함께 유리하게 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 3) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 염기서열 변형은, 예를 들면, 내재적 개시코돈에 비해 폴리펩티드 발현율이 더 높은 다른 개시코돈을 코딩하는 염기 서열로 치환하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 4) 및 5)의 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은, 폴리펩티드의 활성을 강화하도록 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이 발생, 또는 더욱 강한 활성을 갖도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 활성이 증가하도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열로의 교체일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 교체는 구체적으로 상동재조합에 의하여 폴리뉴클레오티드를 염색체내로 삽입함으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이때 사용되는 벡터는 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커 (selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 선별 마커는 전술한 바와 같다.
상기 6) 폴리펩티드의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드의 도입은, 상기 폴리펩티드와 동일/유사한 활성을 나타내는 폴리펩티드를 코딩하는 외래 폴리뉴클레오티드의 숙주세포 내 도입일 수 있다. 상기 외래 폴리뉴클레오티드는 상기 폴리펩티드와 동일/유사한 활성을 나타내는 한 그 유래나 서열에 제한이 없다. 상기 도입에 이용되는 방법은 공지된 형질전환 방법을 당업자가 적절히 선택하여 수행될 수 있으며, 숙주 세포 내에서 상기 도입된 폴리뉴클레오티드가 발현됨으로써 폴리펩티드가 생성되어 그 활성이 증가될 수 있다.
상기 7) 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화는, 내재 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 전사 또는 번역이 증가하도록 코돈 최적화한 것이거나, 또는 외래 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 최적화된 전사, 번역이 이루어지도록 이의 코돈을 최적화한 것일 수 있다.
상기 8) 폴리펩티드의 삼차구조를 분석하여 노출 부위를 선택하여 변형하거나 화학적으로 수식하는 것은, 예를 들어 분석하고자 하는 폴리펩티드의 서열정보를 기지 단백질들의 서열정보가 저장된 데이터베이스와 비교함으로써 서열의 유사성 정도에 따라 주형 단백질 후보를 결정하고 이를 토대로 구조를 확인하여, 변형하거나 화학적으로 수식할 노출 부위를 선택하여 변형 또는 수식하는 것일 수 있다.
이와 같은 폴리펩티드 활성의 강화는, 상응하는 폴리펩티드의 활성 또는 농도 발현량이 야생형이나 변형 전 미생물 균주에서 발현된 폴리펩티드의 활성 또는 농도를 기준으로 하여 증가되거나, 해당 폴리펩티드로부터 생산되는 산물의 양의 증가되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 미생물에서 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전체의 변형은 (a) 미생물 내 염색체 삽입용 벡터를 이용한 상동 재조합 또는 유전자가위 (engineered nuclease, e.g., CRISPR-Cas9)을 이용한 유전체 교정 및/또는 (b) 자외선 및 방사선 등과 같은 빛 및/또는 화학물질 처리에 의해 유도될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 유전자 일부 또는 전체의 변형 방법에는 DNA 재조합 기술에 의한 방법이 포함될 수 있다. 예를 들면, 목적 유전자와 상동성이 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열 또는 벡터를 상기 미생물에 주입하여 상동 재조합(homologous recombination)이 일어나게 함으로써 유전자 일부 또는 전체의 결손이 이루어질 수 있다. 상기 주입되는 뉴클레오티드 서열 또는 벡터는 우성 선별 마커를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 용어, 폴리펩티드의 "약화"는 내재적 활성에 비하여 활성이 감소되거나 또는 활성이 없는 것을 모두 포함하는 개념이다. 상기 약화는 불활성화(inactivation), 결핍(deficiency), 하향조절(down-regulation), 감소(decrease), 저하(reduce), 감쇠(attenuation) 등의 용어와 혼용될 수 있다.
상기 약화는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 변이 등으로 폴리펩티드 자체의 활성이 본래 미생물이 가지고 있는 폴리펩티드의 활성에 비해 감소 또는 제거된 경우, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 유전자의 발현 저해 또는 폴리펩티드로의 번역(translation) 저해 등으로 세포 내에서 전체적인 폴리펩티드 활성 정도 및/또는 농도(발현량)가 천연형 균주에 비하여 낮은 경우, 상기 폴리뉴클레오티드의 발현이 전혀 이루어지지 않은 경우, 및/또는 폴리뉴클레오티드의 발현이 되더라도 폴리펩티드의 활성이 없는 경우 역시 포함할 수 있다. 상기 "내재적 활성"은 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주, 야생형 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드의 활성을 의미한다. 이는 "변형 전 활성"과 혼용되어 사용될 수 있다. 폴리펩티드의 활성이 내재적 활성에 비하여 "불활성화, 결핍, 감소, 하향조절, 저하, 감쇠"한다는 것은, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드의 활성에 비하여 낮아진 것을 의미한다.
이러한 폴리펩티드의 활성의 약화는, 당업계에 알려진 임의의 방법에 의하여 수행될 수 있으나 이로 제한되는 것은 아니며, 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용으로 달성될 수 있다(예컨대, Nakashima N et al., Bacterial cellular engineering by genome editing and gene silencing. Int J Mol Sci. 2014;15(2):2773-2793, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012 등).
구체적으로, 본 출원의 폴리펩티드 활성의 약화는
1) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전체 또는 일부의 결손;
2) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현이 감소하도록 발현조절영역(또는 발현조절서열)의 변형;
3) 폴리펩티드의 활성이 제거 또는 약화되도록 상기 폴리펩티드를 구성하는 아미노산 서열의 변형(예컨대, 아미노산 서열 상의 1 이상의 아미노산의 삭제/치환/부가);
4) 폴리펩티드의 활성이 제거 또는 약화되도록 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 서열의 변형 (예를 들어, 폴리펩티드의 활성이 제거 또는 약화되도록 변형된 폴리펩티드를 코딩하도록 상기 폴리펩티드 유전자의 핵산염기 서열 상의 1 이상의 핵산염기의 삭제/치환/부가);
5) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 염기서열의 변형;
6) 폴리펩티드를 코딩하는 상기 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(예컨대, 안티센스 RNA)의 도입;
7) 리보솜(ribosome)의 부착이 불가능한 2차 구조물을 형성시키기 위하여 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 사인-달가르노(Shine-Dalgarno) 서열 앞단에 사인-달가르노 서열과 상보적인 서열의 부가;
8) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 서열의 ORF(open reading frame)의 3' 말단에 반대 방향으로 전사되는 프로모터의 부가(Reverse transcription engineering, RTE); 또는
9) 상기 1) 내지 8) 중 선택된 2 이상의 조합일 수 있으나, 이에, 특별히 제한되는 것은 아니다.
예컨대,
상기 1) 폴리펩티드를 코딩하는 상기 유전자 일부 또는 전체의 결손은, 염색체 내 내재적 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 전체의 제거, 일부 뉴클레오티드가 결실된 폴리뉴클레오티드로의 교체 또는 마커 유전자로 교체일 수 있다.
또한, 상기 2) 발현조절영역(또는 발현조절서열)의 변형은, 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 발현조절영역(또는 발현조절서열) 상의 변이 발생, 또는 더욱 약한 활성을 갖는 서열로의 교체일 수 있다. 상기 발현조절영역에는 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 5) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 염기서열 변형은, 예를 들면, 내재적 개시코돈에 비해 폴리펩티드 발현율이 더 낮은 다른 개시코돈을 코딩하는 염기서열로 치환하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 3) 및 4)의 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은 폴리펩티드의 활성을 약화하도록 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이 발생, 또는 더욱 약한 활성을 갖도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 활성이 없도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열로의 교체일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 폴리뉴클레오티드 서열 내 변이를 도입하여 종결 코돈을 형성시킴으로써, 유전자의 발현을 저해하거나 약화시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 6) 폴리펩티드를 코딩하는 상기 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(예컨대, 안티센스 RNA)의 도입은 예를 들어 문헌 [Weintraub, H. et al., Antisense-RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986]을 참고할 수 있다.
상기 7) 리보솜(ribosome)의 부착이 불가능한 2차 구조물을 형성시키기 위하여 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 사인-달가르노(Shine-Dalgarno) 서열 앞단에 사인-달가르노 서열과 상보적인 서열의 부가는 mRNA 번역을 불가능하게 하거나 속도를 저하시키는 것일 수 있다.
상기 8) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자서열의 ORF(open reading frame)의 3' 말단에 반대 방향으로 전사되는 프로모터의 부가(Reverse transcription engineering, RTE)는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 전사체에 상보적인 안티센스 뉴클레오티드를 만들어 활성을 약화하는 것일 수 있다.
전술한 구현예 중의 어느 하나의 구현예로, 본 출원의 미생물은 글루타메이트-시스테인 리가아제(GSH1)의 발현조절영역에 글루타치온 생산능이 증가되도록 하는 변이를 포함하는 것일 수 있다. 상기 변이는 GSH1 ORF 상단의 -250(C→T), -252(G→A), -398(A→T), -399(A→C), -407(T→C) 및 -409(T→C) 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 변이일 수 있다.
전술한 구현예 중의 어느 하나의 구현예로, 상기 미생물은 글루타메이트-시스테인 리가아제(GSH1)의 86번째 아미노산 및/또는 653번째 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 변이를 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 86번 아미노산이 아르기닌으로, 653번 아미노산이 메티오닌으로 치환된 변이를 포함할 수 있다. 그러나, 이에 제한되지 않는다.
전술한 구현예 중의 어느 하나의 구현예로, 상기 미생물은 글루타메이트-시스테인 리가아제(GSH1)의 활성이 강화되는 변이를 포함하는 것일 수 있다. 그러나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈 1 변이체 및 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나 이상을 포함하는 미생물은, "서열번호 1의 아미노산 서열에서 37번째 위치에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈 1을 발현하는 미생물"일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈 1 및 이의 변이체에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 출원에서 용어, 단백질이 "발현되도록/되는"은 목적 단백질이 미생물 내에 도입되거나, 미생물 내에서 발현되도록 변형된 상태를 의미한다.
본 출원의 단백질 변이체를 발현하는 미생물은, 본 출원의 단백질 변이체를 발현하도록 변형된 미생물일 수 있고, 따라서 본 출원의 다른 하나의 양태는 본 출원의 단백질 변이체를 발현하는 미생물의 제조 방법을 제공한다.
본 출원에서 용어, "변형 전 균주" 또는 "변형 전 미생물"은 미생물에 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이를 포함하는 균주를 제외하는 것이 아니며, 야생형 균주 또는 천연형 균주 자체이거나, 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화되기 전 균주를 의미할 수 있다. 상기 "변형 전 균주" 또는 "변형 전 미생물"은 "비변이 균주", "비변형 균주", "비변이 미생물", "비변형 미생물" 또는 "기준 미생물"과 혼용될 수 있다.
본 출원에서 상기 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈 1 변이체를 포함하거나 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 미생물은, 재조합 미생물일 수 있고, 상기 재조합은 형질전환과 같은 유전적 변형(genetically modification)에 의해 이루어질 수 있다.
예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질전환에 의해 제조되는 재조합 미생물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 재조합 미생물은 효모일 수 있으며, 그 예로, 사카로마이세스 속 미생물일 수 있고, 구체적으로 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 상기 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 글루타치온 또는 그 유도체의 제조방법을 제공한다. 상기 미생물, 글루타치온 또는 그 유도체에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 출원의 균주의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 사카로마이세스속 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용될 수 있으며, 구체적으로는 본 출원의 균주를 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 또는 혐기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.
본 출원에서 상기 탄소원으로는 글루코오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스 등과 같은 탄수화물; 만니톨, 소르비톨 등과 같은 당 알코올, 피루브산, 락트산, 시트르산 등과 같은 유기산; 글루타메이트, 메티오닌, 라이신 등과 같은 아미노산 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 전분 가수분해물, 당밀, 블랙스트랩 당밀, 쌀겨울, 카사버, 사탕수수 찌꺼기 및 옥수수 침지액 같은 천연의 유기 영양원을 사용할 수 있으며, 글루코오스 및 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있고, 그 외의 적정량의 탄소원을 제한 없이 다양하게 이용할 수 있다. 이들 탄소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있다.
상기 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 질산암모늄 등과 같은 무기질소원; 아미노산, 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해 생성물 등과 같은 유기 질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 인원으로는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 또는 이에 대응되는 소디움-함유 염 등이 포함될 수 있다. 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있다.
그 외에 상기 배지에는 아미노산, 비타민 및/또는 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 구체적으로, 상기 균주의 배양 배지에는 L-아미노산 등이 첨가될 수 있다. 구체적으로는 글리신(glycine), 글루타메이트(glutamate), 및/또는 시스테인(cysteine) 등이 첨가될 수 있고, 필요에 따라서는 라이신(lysine) 등의 L-아미노산 이 더 첨가될 수 있으나 반드시 이에 제한되지 않는다.
상기 배지 또는 전구체는 배양물에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서, 균주의 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산, 황산 등과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배양물의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있다.
배양물의 온도는 25℃ 내지 40℃일 수 있으며, 보다 구체적으로는 28℃ 내지 37℃일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 배양 기간은 원하는 유용 물질의 생성량이 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 구체적으로는 1 시간 내지 100 시간일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 제조방법은, 상기 배양 단계 이후, 추가적인 공정을 더 포함할 수 있다. 상기 추가 공정은 글루타치온 또는 그 유도체의 용도에 따라 적절히 선택될 수 있다.
구체적으로, 상기 글루타치온 또는 그 유도체의 제조방법은 상기 배양 단계에 의해 균체 내에 축적된 글루타치온 또는 그 유도체를 회수하는 단계를 포함할 수 있고, 예를 들면 상기 배양 단계 이후 상기 균주, 이의 건조물, 추출물, 배양물, 파쇄물 중에서 선택된 하나 이상의 물질로부터 글루타치온 또는 그 유도체를 회수하는 단계를 포함할 수 있다. 다른 예로, 상기 글루타치온 유도체의 제조방법은 상기 글루타치온을 유도체로 전환하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 방법은 상기 회수 단계 이전, 혹은 동시에 균주를 용균시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 균주의 용균은 본 출원이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 방법, 예를 들어, 용균용 완충용액, 소니케이터, 열 처리 및 후렌치 프레서 등에 의해 실시할 수 있다. 또한 상기 용균 단계는 세포벽 분해 효소, 핵산 분해 효소, 핵산 전이 효소, 단백질 분해 효소 등 효소반응을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 제조방법을 통해 글루타치온 또는 그 유도체가 고함량으로 포함된 건조 효모(Dry yeast), 효모 추출물(yeast extract), 효모추출물 혼합 분말(yeast extract mix powder), 순수 정제된 글루타치온(pure glutathione) 또는 그 유도체를 제조할 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 목적하는 제품에 따라 적절하게 제조될 수 있다.
본 출원에서 건조 효모(dry yeast)는 "균주 건조물" 등의 용어와 교환적으로 사용될 수 있다. 상기 건조 효모는 글루타치온을 축적한 효모 균체를 건조시켜 제조할 수 있으며, 구체적으로 사료용 조성물, 식품용 조성물 등에 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 효모 추출물(yeast extract)은 "균주 추출물" 등의 용어와 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 상기 균주 추출물은, 상기 균주의 균체에서 세포벽을 분리하고 남은 물질을 의미할 수 있다. 구체적으로, 균체를 용균시켜 수득한 성분에서 세포벽을 제외한 나머지 성분을 의미할 수 있다. 상기 균주 추출물은 글루타치온 또는 그 유도체를 포함하며, 그 외의 성분으로는 단백질, 탄수화물, 핵산, 섬유질 중 하나 이상의 성분이 포함되어 있을 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 회수 단계는 당해 기술 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여, 목적 물질인 글루타치온 또는 그 유도체를 회수할 수 있다.
상기 회수 단계는 정제 공정을 포함할 수 있다. 상기 정제 공정은 균주로부터 글루타치온 또는 그 유도체만을 분리하여 순수 정제하는 것일 수 있다. 상기 정제 공정을 통해, 순수 정제된 글루타치온(pure glutathione)이 제조될 수 있다.
필요에 따라, 상기 글루타치온의 제조방법은, 상기 배양 단계 이후 수득된 균주, 이의 건조물, 추출물, 배양물, 파쇄물 및 이들로부터 회수된 글루타치온 중에서 선택된 물질과 부형제를 혼합하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 혼합 단계를 통해 효모추출물 혼합 분말(yeast extract mix powder)이 제조될 수 있다. 이는 글루타치온의 유도체에 대해서도 동일하게 적용될 수 있다.
상기 부형제는 목적하는 용도나 형태에 따라 적절히 선택하여 사용할 수 있으며, 예를 들어, 전분, 글루코오스, 셀룰로오스, 락토오스, 글리코겐, D-만니톨, 소르비톨, 락티톨, 말토덱스트린, 탄산칼슘, 합성규산알루미늄, 인산일수소칼슘, 황산칼슘, 염화나트륨, 탄산수소나트륨, 정제 라놀린, 덱스트린, 알긴산나트륨, 메틸셀룰로오스, 콜로이드성실리카겔, 하이드록시프로필스타치, 하이드록시프로필메틸셀루로오스, 프로필렌글리콜, 카제인, 젖산칼슘, 프리모젤, 아라비아 검 중에서 선택되는 것일 수 있으며, 구체적으로는 전분, 글루코오스, 셀룰로오스, 락토오스, 덱스트린, 글리코겐, D-만니톨, 말토덱스트린 중에서 선택되는 하나 이상의 성분일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 부형제는, 예를 들어, 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁화제, 완충제, 안정화제 또는 등장화제 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이하 본 출원을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 출원을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 출원의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 글루타치온 생산 균주 개량
기탁번호 KCCM12568P로 기탁된, 글루타치온 생산 균주인 CJ-5 균주(KR 10-2222210 B1)의 글루타치온 생산능을 추가적으로 개선하기 위해 다음과 같은 방법으로 돌연변이를 유도하였다.
CJ-5 균주를 고체배지에 배양한 후 broth에 접종하여 배양액을 수득하였으며, UV 램프를 이용하여 균체에 UV를 조사하였다. 이후, UV 조사된 배양액을 평판배지에 도말하여 콜로니를 형성한 변이 균주만을 분리 수득하였으며, 글루타치온 생산능이 가장 많이 향상된 균주를 분리하였다.
분리된 균주의 유전체를 확인해본 결과 GSH1 ORF 상단 -250(C→T), -252(G→A), -398(A→T), -399(A→C), -407(T→C), -409(T→C) 변이가 일어났으며, gsh1 유전자가 코딩하는 GSH1 단백질의 86번째 아미노산인 시스테인이 아르기닌으로, 653번째 아미노산(글리신)이 메티오닌으로 치환된 것을 확인하였다.
상기 균주를 CC02-2816으로 명명하고 부다페스트조약 하의 수탁기관인 한국미생물보존센터에 2020년 12월 8일자로 기탁하여 수탁번호 KCCM12891P를 부여받았다.
실시예 2: 균주 추가 개량실험
실시예 1의 CC02-2816 균주의 글루타치온 생산능을 추가적으로 개선하기 위해 다음과 같은 방법으로 돌연변이를 유도하였다.
CC02-2816 균주를 고체배지에 배양한 후 broth에 접종하여 배양액을 수득하였으며, UV 램프를 이용하여 균체에 UV를 조사하였다. 이후, UV 조사된 배양액을 평판배지에 도말하여 콜로니를 형성한 변이 균주만을 분리 수득하여 염기서열을 분석하였다.
실험 결과, 글루타치온 함량이 26% 향상된 균주의 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈 1을 코딩하는 sod1이 코딩하는 단백질인 SOD1(서열번호 1)의 37번째 아미노산(글리신)이 아르기닌으로 치환된 것을 확인하였다.
실시예 3: SOD1 단백질의 37번 잔기 변이 실험
상기 실시예 2의 결과로부터 SOD1 단백질의 37번 위치가 글루타치온 생산에 중요할 것이라고 판단하여, 야생형 S. cerevisiae CEN.PK2-1D 및 실시예 1의 CC02-2816 균주가 SOD1 단백질의 37번째 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 변이 단백질을 발현하도록 제작하여 글루타치온 생산량 증가 여부를 확인하고자 하였다.
사카로마이세스 세레비지애 효모의 SOD1 단백질의 37번 아미노산을 아르기닌으로 치환한 균주를 제작하기 위하여 Lee TH, et al.(J. Microbiol. Biotechnol. (2006), 16(6), 979-982) 논문에 개시된 내용을 참고로 하여 pWAL100 및 pWBR100 플라스미드를 이용하였다.
구체적으로 CJ-5 균주의 genomic DNA를 주형(template)으로 하여 다음과 같이 PCR을 수행하였다. 서열번호 4와 서열번호 6의 프라이머를 이용한 PCR을 수행하여 N-terminal BamHI flanking 서열, SOD1 ORF의 개시코돈 및 G37R 변이 암호화 서열을 포함하는 SOD1 N-terminal 일부 서열을 수득하고, 서열번호 5와 서열번호 7의 프라이머를 이용하여 C-terminal XhoI flanking 서열, SOD1 ORF 종결코돈 및 G37R 변이 암호화 서열을 포함하는 SOD1 C-terminal 일부 서열을 수득하였다. 이후 이 두 서열을 주형(template)으로 하여 서열번호 4와 서열번호 7을 이용하여 overlap PCR을 수행한 결과 37번째 아미노산이 아르기닌으로 치환된 SOD1 변이 단백질 암호화 서열, N-terminal BamHI, C-terminal XhoI 제한효소 서열을 포함하는 SOD1 ORF 절편을 수득하였다. 상기 ORF 절편은 BamHI 및 XhoI처리 후 동일한 효소로 처리한 pWAL100 벡터에 클로닝하여 pWAL100-SOD1(G37R))벡터를 제조하였다.
또한, CJ-5 균주의 genomic DNA를 template으로 하여 서열번호 8과 서열번호 9를 이용한 PCR을 수행하여 N-terminal SpeI, C-terminal NcoI 제한효소 서열을 포함하는 SOD1 ORF 종결코돈 이후 500bp 단편을 수득하고 SpeI, NcoI 제한효소를 처리하였다. 이후 동일한 제한효소를 처리한 pWBR100에 클로닝하여 pWBR100-SOD1벡터를 제조하였다.
최종적으로 효모에 도입할 DNA 절편을 제작하기 위해 앞서 제작한 pWAL100-SOD1(G37R) 벡터를 주형(template)으로 하여 서열번호 4와 서열번호 10의 프라이머를 이용하여 아르기닌 변이 암호화서열과 KlURA3 일부를 포함하는 PCR 산물을 획득하고 pWBR100-SOD1벡터를 주형(template)으로 하여 서열번호 11과 서열번호 9의 프라이머를 이용하여 KlURA3 일부와 SOD1 종결코돈 이후 500bp를 포함하는 PCR 산물을 획득한 후 각 PCR 산물을 동일한 몰비율로 S. cerevisiae CEN.PK2-1D 및 S. cerevisiae CC02-2816에 형질전환 하였다. PCR은 95°C에서 열변성 과정 5분, 53°C에서 결합과정 1분, 72°C에서 중합과정 1kb당 1분의 조건으로 수행하였으며 효모의 형질전환은 Geitz의 논문(Nucleic Acid Research, 20(6), 1425)을 변형한 리튬아세테이트 방법(Lithium acetate method)을 사용하였다. 구체적으로 O.D. 0.7 ~ 1.2 사이의 효모 세포를 리튬아세테이트/TE buffer로 2회 세척한 후, 상기 PCR산물들과 single stranded DNA (Sigma D-7656)을 함께 섞어 리튬아세테이트/TE/40 % PEG buffer에서 30분간 30°C, 42°C에서 15분간 정치배양한 후 cell들을 우라실(Uracil)이 포함되지 않은 SC (2% glucose) agar plate에서 콜로니가 보일 때까지 배양하여 SOD1 G37R 변이 암호화 서열과 KlURA3 유전자가 도입된 균주를 획득하였다. 이후 KlURA3를 제거하기 위하여 각 균주를 2ml의 YPD에 overnight 배양 후 1/100 희석하여 0.1%의 5-FOA가 포함된 SC (2% glucose) agar plate에 도말하여 우라실(Uracil)마커가 제거된 S. cerevisiae CEN.PK2-1D SOD1의 G37R 변이 균주 및 S. cerevisiae CC02-2816 SOD G37R 변이 균주를 제작하였다. 아르기닌 외에 다른 종류의 아미노산으로 치환된 SOD1 변이 단백질을 발현할 수 있는 균주도 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 서열상의 37번 아르기닌 코딩 서열을 다른 아미노산을 코딩하는 서열로 치환한 프라이머쌍을 이용한 점을 제외하고는 동일한 방식으로 제작하였다.
프라이머 5' -> 3' 서열
F_BamHI_SOD1(서열번호 4) GGTAGGATCC ATGGTTCAAGCAGTCGCAGTGTTAA
F_SOD1_G37R(서열번호 5) TTACGAGATCGCTCGCAACAGTCCT
R_SOD1_G37R(서열번호 6) AGGACTGTTGCGAGCGATCTCGTAA
R_XhoI_SOD1(서열번호 7) ATGACTCGAG TTAGTTGGTTAGACCAATGACACCA
F_SpeI_SOD1_DW(서열번호 8) TAGAACTAGT TGTTAATGATAATATACTTGAATA
R_NcoI_SOD1_DW(서열번호 9) GCTGCCATGG ACACTACTAGCTCCTGAAGACCAAG
R_AL killer(서열번호 10) GAGCAATGAACCCAATAACGAAATCTT
F_BR killer(서열번호 11) CTTGACGTTCGTTCGACTGATGAG
상기에서 제작된 각 균주를 26시간 배양하여 생산한 글루타치온 (GSH) 농도 및 함량을 측정한 결과를 하기 표 2, 3과 도 1, 2에 표기하였다.
S.cerevisiae CC02-2816
　 함량(fold) 농도(fold)
WT(야생형) 1.00 1.00
SOD1 G37A 1.25 1.16
SOD1 G37C 1.26 1.14
SOD1 G37D 1.25 1.11
SOD1 G37E 1.24 1.14
SOD1 G37F 1.18 0.90
SOD1 G37H 1.23 1.12
SOD1 G37I 1.31 1.16
SOD1 G37K 1.06 1.14
SOD1 G37L 1.28 1.17
SOD1 G37M 1.18 0.95
SOD1 G37N 1.28 1.14
SOD1 G37P 1.13 0.73
SOD1 G37Q 1.24 1.18
SOD1 G37R 1.26 1.18
SOD1 G37S 1.25 1.24
SOD1 G37T 1.22 1.22
SOD1 G37V 1.21 1.24
SOD1 G37W 1.16 0.69
SOD1 G37Y 1.21 1.21
S. cerevisiae CEN.PK2-1D
　 농도(fold) 함량(fold)
CEN.PK 1.00 1.00
SOD1 G37A 1.06 1.10
SOD1 G37C 1.05 1.08
SOD1 G37D 1.08 1.11
SOD1 G37E 1.07 1.12
SOD1 G37F 1.34 1.26
SOD1 G37H 1.24 1.11
SOD1 G37I 1.32 1.19
SOD1 G37K 1.19 1.13
SOD1 G37L 1.31 1.25
SOD1 G37M 1.18 1.07
SOD1 G37N 1.27 1.17
SOD1 G37P 1.12 1.12
SOD1 G37Q 1.26 1.17
SOD1 G37R 1.10 1.06
SOD1 G37S 1.26 1.21
SOD1 G37T 1.22 1.18
SOD1 G37V 1.18 1.12
SOD1 G37W 1.26 1.23
SOD1 G37Y 1.23 1.14
이를 통해, SOD1 단백질의 37번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환함으로써 글루타치온 생산능이 증대될 수 있음을 확인하였는바, 본 출원에서 제공하는 SOD1 단백질 변이체가 감마-글루타밀 펩타이드의 생산에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Figure PCTKR2022008016-appb-img-000001

Claims (10)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 37번째 위치에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈 1(SOD1) 변이체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 다른 아미노산은 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 프롤린, 세린, 쓰레오닌, 시스테인, 타이로신, 아스파라긴, 글루타민, 아스파르트산, 글루탐산, 라이신, 아르기닌 및 히스티딘 중 선택되는 아미노산인 것인, 변이체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 변이체는 서열번호 12 내지 30 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 변이체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈 1 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈 1 변이체; 및 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나 이상을 포함하는 미생물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 미생물은 글루타치온 또는 그 유도체를 생산하는 것인, 미생물.
  7. 제5항에 있어서, 상기 미생물은 사카로마이세스 속(Saccharomyces sp.)인, 미생물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 미생물은 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)인, 미생물.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈 1 변이체; 및 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나 이상을 포함하는 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 글루타치온 또는 그 유도체의 생산 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 방법은 상기 배양된 미생물, 상기 미생물의 건조물, 상기 미생물의 추출물, 상기 미생물의 배양물, 및 상기 미생물의 파쇄물 중에서 선택된 하나 이상의 물질로부터 글루타치온 또는 그 유도체를 회수하는 단계를 추가로 포함하는, 글루타치온 또는 그 유도체의 생산 방법.
PCT/KR2022/008016 2021-06-10 2022-06-07 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈 1 변이체 및 이를 이용한 글루타치온 또는 그 유도체의 생산방법 Ceased WO2022260403A1 (ko)

Priority Applications (10)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP22820531.6A EP4353820A4 (en) 2021-06-10 2022-06-07 SUPEROXIDE DISMUTASE-1 VARIANT AND METHOD FOR PRODUCING GLUTATHIONE OR DERIVATIVE THEREOF USING SAME
CA3222066A CA3222066A1 (en) 2021-06-10 2022-06-07 Superoxide dismutase 1 variant and method for producing glutathione or derivative thereof, using same
BR112023025683A BR112023025683A2 (pt) 2021-06-10 2022-06-07 Variante da superóxido dismutase 1 e método para a produção de glutationa ou seu derivado que a utiliza
JP2023575360A JP7657332B2 (ja) 2021-06-10 2022-06-07 スーパーオキシドディスムターゼ１変異体及びそれを用いたグルタチオン又はその誘導体の生産方法
US18/568,649 US20240368662A1 (en) 2021-06-10 2022-06-07 Superoxide dismutase 1 variant and method for producing glutathione or derivative thereof, using same
PH1/2023/553279A PH12023553279A1 (en) 2021-06-10 2022-06-07 Superoxide dismutase 1 variant and method for producing glutathione or derivative thereof, using same
MX2023014486A MX2023014486A (es) 2021-06-10 2022-06-07 Variante de superoxido dismutasa 1 y procedimiento para la produccion de glutation o derivado del mismo, mediante el uso de la misma.
AU2022288838A AU2022288838C1 (en) 2021-06-10 2022-06-07 Superoxide dismutase 1 variant and method for producing glutathione or derivative thereof, using same
CN202280041254.0A CN117881780A (zh) 2021-06-10 2022-06-07 超氧化物歧化酶1变体和使用其生产谷胱甘肽或其衍生物的方法
ZA2023/11242A ZA202311242B (en) 2021-06-10 2023-12-06 Superoxide dismutase 1 variant and method for producing glutathione or derivative thereof, using same

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2021-0075689 2021-06-10
KR1020210075689A KR102593542B1 (ko) 2021-06-10 2021-06-10 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈 1 변이체 및 이를 이용한 글루타치온 또는 그 유도체의 생산방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2022260403A1 true WO2022260403A1 (ko) 2022-12-15

Family

ID=84425298

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2022/008016 Ceased WO2022260403A1 (ko) 2021-06-10 2022-06-07 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈 1 변이체 및 이를 이용한 글루타치온 또는 그 유도체의 생산방법

Country Status (14)

Country Link
US (1) US20240368662A1 (ko)
EP (1) EP4353820A4 (ko)
JP (1) JP7657332B2 (ko)
KR (1) KR102593542B1 (ko)
CN (1) CN117881780A (ko)
AR (1) AR126122A1 (ko)
AU (1) AU2022288838C1 (ko)
BR (1) BR112023025683A2 (ko)
CA (1) CA3222066A1 (ko)
MX (1) MX2023014486A (ko)
PH (1) PH12023553279A1 (ko)
TW (1) TWI906519B (ko)
WO (1) WO2022260403A1 (ko)
ZA (1) ZA202311242B (ko)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4340675A (en) * 1979-05-17 1982-07-20 De Forenede Bryggerier A/S Process for recovering Cu,Zn-superoxide dismutase from yeast
EP0073657A1 (en) 1981-08-31 1983-03-09 Genentech, Inc. Preparation of hepatitis B surface antigen in yeast
US20110294190A1 (en) * 2010-06-01 2011-12-01 Workman Aron S Mutant human superoxide dismutase 1 variants
KR102222210B1 (ko) 2019-10-29 2021-03-05 씨제이제일제당 주식회사 글루타치온을 생산하는 효모 균주 및 이를 이용한 글루타치온 생산방법

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5506133A (en) * 1994-04-11 1996-04-09 Human Genome Sciences, Inc. Superoxide dismutase-4
CN101338305B (zh) * 2008-08-28 2010-12-22 新疆维吾尔自治区药物研究所 从动物血液中得到超氧化物歧化酶和还原型谷胱甘肽方法
KR20100095829A (ko) * 2009-02-23 2010-09-01 대한민국(농촌진흥청장) 글루타치온을 고농도로 생산하는 사카로마이세스 세레비시애의 돌연변이체 및 이를 배양하여 글루타치온을 대량 생산하는 방법
WO2017070065A1 (en) * 2015-10-20 2017-04-27 Massachusetts Institute Of Technology Strain and bioprocess engineering for high lipid production
CA3135056A1 (en) * 2019-04-05 2020-10-08 Novozymes A/S Redox enzymes in animal feed compositions

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4340675A (en) * 1979-05-17 1982-07-20 De Forenede Bryggerier A/S Process for recovering Cu,Zn-superoxide dismutase from yeast
EP0073657A1 (en) 1981-08-31 1983-03-09 Genentech, Inc. Preparation of hepatitis B surface antigen in yeast
US20110294190A1 (en) * 2010-06-01 2011-12-01 Workman Aron S Mutant human superoxide dismutase 1 variants
KR102222210B1 (ko) 2019-10-29 2021-03-05 씨제이제일제당 주식회사 글루타치온을 생산하는 효모 균주 및 이를 이용한 글루타치온 생산방법

Non-Patent Citations (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Atlas of Protein Sequence and Structure", 1979, NATIONAL BIOMEDICAL RESEARCH FOUNDATION, pages: 353 - 358
"Guide to Huge Computers", 1994, ACADEMIC PRESS
AI YU-ZHUO, DU YE-JIE, ZU YUAN-GANG, AN ZHI-GANG: "Inhibition effect of expression of Cu/Zn superoxide dismutase from rice on synthesis of Glutathione in Saccharomyces cerevisiae", JOURNAL OF FORESTRY RESEARCH, EDITORIAL BOARD OF JOURNAL OF FORESTRY RESEARCH, HARBIN, CN, vol. 19, no. 1, 1 March 2008 (2008-03-01), CN , pages 63 - 66, XP093013272, ISSN: 1007-662X, DOI: 10.1007/s11676-008-0011-x *
ATSCHUL, S. F. ET AL., J MOLEC BIOL, vol. 215, 1990, pages 403
CARILLO ET AL., SIAM J APPLIED MATH, vol. 48, 1988, pages 1073
DATABASE PROTEIN 30 June 2022 (2022-06-30), ANONYMOUS : "superoxide dismutase SOD1 [Saccharomyces cerevisiae S288C] ", XP093013132, retrieved from NCBI Database accession no. NP_012638.1 *
DEVEREUX, J. ET AL., NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 12, 1984, pages 387
GEITZS, NUCLEIC ACID RESEARCH, vol. 20, no. 6, pages 1425
GRIBSKOV ET AL., NUCL. ACIDS RES., vol. 14, 1986, pages 6745
J. SAMBROOK ET AL.: "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 1989, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS
LEE T. H. ET AL., J. MICROBIOL. BIOTECHNOL., vol. 16, no. 6, 2006, pages 979 - 982
NAKASHIMA N. ET AL.: "Bacterial cellular engineering by genome editing and gene silencing", INT J MOL SCI., vol. 15, no. 2, 2014, pages 2773 - 2793, XP055376889, DOI: 10.3390/ijms15022773
NEEDLEMAN ET AL., J MOL BIOL., vol. 48, 1970, pages 443
NEEDLEMANWUNSCH, J. MOL. BIOL., vol. 48, 1970, pages 443 - 453
PEARSON ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 85, 1988, pages 2444
RICE ET AL., TRENDS GENET., vol. 16, 2000, pages 276 - 277
SAMBROOK ET AL., MOLECULAR CLONING, 2012
See also references of EP4353820A4
SITNICKA ET AL., FUNCTIONAL ANALYSIS OF GENES. ADVANCES IN CELL BIOLOGY, vol. 2, 2010, pages 1 - 16
SMITHWATERMAN, ADV. APPL. MATH, vol. 2, 1981, pages 482
SOFYANOVICH, O. A. ET AL.: "Multiple pathways for the formation of the γ-glutamyl peptides γ-glutamyl-valine and γ-glutamyl-valyl glycine in Saccharomyces cerevisiae", PLOS ONE, vol. 14, no. 5, 2019, pages e0216622, XP055599481, DOI: 10.1371/journal.pone.0216622
WEINTRAUB, H. ET AL.: "Antisense-RNA as a molecular tool for genetic analysis", REVIEWS - TRENDS IN GENETICS, vol. 1, no. 1, pages 1986
YIBO ZHU ET AL: "Endogenic oxidatice stress response contributes to glutathione over-accumulation in mutant Saccharomyces cerevisiae Y518", APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, vol. 99, 1 January 2015 (2015-01-01), pages 7069 - 7078, XP002795227 *

Also Published As

Publication number Publication date
KR102593542B1 (ko) 2023-10-26
BR112023025683A2 (pt) 2024-02-27
CN117881780A (zh) 2024-04-12
AU2022288838C1 (en) 2026-01-22
US20240368662A1 (en) 2024-11-07
TW202306974A (zh) 2023-02-16
AU2022288838B2 (en) 2025-10-09
PH12023553279A1 (en) 2024-04-22
EP4353820A1 (en) 2024-04-17
AR126122A1 (es) 2023-09-13
CA3222066A1 (en) 2022-12-15
EP4353820A4 (en) 2025-04-23
JP7657332B2 (ja) 2025-04-04
JP2024520164A (ja) 2024-05-21
AU2022288838A1 (en) 2024-01-04
KR20220166665A (ko) 2022-12-19
TWI906519B (zh) 2025-12-01
MX2023014486A (es) 2023-12-15
ZA202311242B (en) 2025-07-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2019160301A1 (ko) 시트레이트 신타아제의 활성이 약화된 변이형 폴리펩타이드 및 이를 이용한 l-아미노산 생산방법
WO2019147059A1 (ko) L-아미노산을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 l-아미노산의 생산방법
WO2020218736A1 (ko) L-히스티딘 생산능이 강화된 미생물 및 이를 이용한 히스티딘 생산방법
WO2019164346A1 (ko) L-트립토판을 생산하는 재조합 코리네형 미생물 및 이를 이용한 l-트립토판을 생산하는 방법
WO2022216088A1 (ko) L-아르기닌을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 l-아르기닌 생산방법
WO2022145623A1 (ko) 글루타메이트-시스테인 리가아제 변이체 및 이를 이용한 글루타치온 생산방법
WO2022050671A1 (ko) L-발린 생산 미생물 및 이를 이용한 l-발린 생산 방법
WO2022215796A1 (ko) 신규한 전사 조절자 변이체 및 이를 이용한 l-발린 생산 방법
WO2023234739A1 (ko) L-오르니틴 생산능을 가지는 미생물 및 이를 이용한 l-오르니틴 생산방법
WO2022191633A1 (ko) 신규한 시트레이트 신타아제 변이체 및 이를 이용한 o-아세틸-l-호모세린 또는 l-메티오닌 생산 방법
WO2020067618A1 (ko) 알파-글루코시다제의 활성이 강화된 l-아미노산을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 l-아미노산 생산 방법
WO2023177253A1 (ko) 거짓쌀도둑거저리 유래 아스파테이트 1-디카복실레이스의 변이체 및 이를 포함하는 미생물
WO2021194243A1 (ko) 글루타메이트-시스테인 리가아제 변이체 및 이를 이용한 글루타치온 생산방법
WO2023287256A1 (ko) 신규한 베타-카로틴 15,15 -옥시게네이즈 변이체 및 이를 이용한 레티노이드 생산방법
WO2022239942A1 (ko) 신규 프로모터 및 이의 용도
WO2021177731A1 (ko) 글루타민 신테타아제 변이형 폴리펩티드 및 이를 이용한 l-글루타민 생산 방법
WO2024035191A1 (ko) 케톨산 리덕토아이소머라제 변이체 및 이를 이용한 l-발린 생산 방법
WO2021201643A1 (ko) 신규한 프로모터 및 이를 이용한 글루타치온 생산 방법
WO2023121055A1 (ko) L-이소루신 생산 미생물 및 이를 이용한 l-이소루신 생산 방법
WO2022108383A1 (ko) L-글루타민 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용한 l-글루타민 생산 방법
WO2022191630A1 (ko) 신규한 시트레이트 신타아제 변이체 및 이를 이용한 l-발린 생산 방법
WO2022191635A1 (ko) 신규한 시트레이트 신타아제 변이체 및 이를 이용한 l-아미노산 생산 방법
WO2023048343A1 (ko) 신규한 글루타민 가수분해 gmp 합성효소 변이체 및 이를 이용한 퓨린 뉴클레오티드의 생산방법
WO2023027284A1 (ko) 신규한 아세토하이드록시산 신타아제 소단위체 변이체 및 이를 이용한 l-발린 생산 방법
WO2021101000A1 (ko) 아세토하이드록시산 신타제 신규 변이체 및 이를 포함하는 미생물

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 22820531

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 12023553279

Country of ref document: PH

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: MX/A/2023/014486

Country of ref document: MX

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2023575360

Country of ref document: JP

Ref document number: 806336

Country of ref document: NZ

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2022288838

Country of ref document: AU

Ref document number: AU2022288838

Country of ref document: AU

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 202280041254.0

Country of ref document: CN

Ref document number: 3222066

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 202317085710

Country of ref document: IN

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01A

Ref document number: 112023025683

Country of ref document: BR

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2022288838

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20220607

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2022820531

Country of ref document: EP

Ref document number: 2023132566

Country of ref document: RU

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2022820531

Country of ref document: EP

Effective date: 20240110

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 112023025683

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20231206

WWG Wipo information: grant in national office

Ref document number: 2023132566

Country of ref document: RU