WO2023002890A1 - 針状体を利用した細胞内反応の制御手段 - Google Patents

針状体を利用した細胞内反応の制御手段 Download PDF

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    • C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation

Definitions

  • the present invention relates to a method for easily and efficiently introducing an intracellular introduction factor immobilized on a needle-shaped body into a large number of cells, and a means for controlling intracellular reactions using the method.
  • the present invention provides needle-shaped particles on which a conjugate capable of binding to an intracellular molecule is immobilized, which is used for controlling intracellular reactions, and a composite substrate for cell treatment comprising the needle-shaped particles, and methods for controlling intracellular reactions using them.
  • Patent Document 1 discloses a needle-shaped material for cell insertion in which an antibody against an intracellular or intercellular protein antigen is immobilized. By doing so, intracellular or intercellular proteins can be quantified, evaluated, etc. in living cells.
  • Patent Documents 2 and 3 disclose a cell insertion member in which a large number of nanoneedles are arranged on a support, which is formed using photolithography, dry etching, and wet etching.
  • a large number of nanoneedles are inserted into a large number of cells arranged on a substrate at the same time, and in a large number of cells , describes that the state of gene expression can be analyzed and target cells can be selectively lifted while the cells are alive.
  • An object of the present invention is to provide new techniques and methods for controlling intracellular reactions that enable introduction of a given factor into a large number of cells with simple and efficient manipulation.
  • the present invention provides a new technique for controlling intracellular reactions, which makes it possible to treat a large number of cells with simple manipulations and does not allow the introduced factors to remain in the cells after manipulation.
  • the purpose is to provide methods and methods.
  • a needle-shaped body on which an intracellularly-introduced factor is immobilized is brought into contact with a cell to which a weight is bound, and a part of the needle-shaped body is inserted into the cell to introduce the intracellularly-introduced factor. introducing into the cell, and extracting a portion of the needle-shaped body from the cell;
  • a method for producing a modified cell comprising: [2] The method of [1], wherein the weight is one or more substances selected from the group consisting of resins, metals, magnetic substances, and combinations thereof. [3] The method of [1] or [2], wherein the weight has a bead-like form.
  • [4] one or more selected from the group consisting of centrifugal force, magnetic force, water flow, water pressure, and electrostatic interaction in the step of inserting a portion of the needle-shaped body into the cell and/or extracting it from the cell;
  • the intracellularly-introduced factor is a conjugate capable of binding to an intracellular molecule, and the needle-like structure is extracted from the cell, and the intracellular molecule bound to the conjugate in the cell is transferred to the needle.
  • [6] The method of [5], wherein the conjugate is a nucleic acid, protein, peptide, or low-molecular-weight compound. [7] The method of [5] or [6], wherein the conjugate is an antibody or fragment thereof. [8] The method of [1] to [4], wherein the intracellularly-introduced factor is a physiologically active substance, and the needle-shaped body is extracted from the cell to allow the intracellularly-introduced factor to remain in the cell. either way.
  • the physiologically active substance includes nucleic acids, peptides, proteins, sugars, polysaccharides, fatty acids, cholesterol, lipids, signaling substances, ligand substances, hormone substances, cytokines, ions, metal particles, magnetic fine particles, inorganic compounds, and quantum dots. , one or more substances selected from the group consisting of organic compounds and drugs.
  • the method of [8] or [9], wherein the bond between the physiologically active substance and the needle-shaped structure is a bond that can be separated in cells.
  • the bond between the intracellularly introduced factor and the needle-shaped structure is an electrostatic bond, a bond due to hydrophobic interaction, a chelate bond, a covalent bond that is cleaved in cells, or a bond via a photocleavable linker.
  • the method of [10] which is at least one selected from the group consisting of binding via an enzyme-cleavable linker.
  • the method of [12], wherein the acicular portion of the acicular particles has a length of 1 to 50 ⁇ m.
  • the method of [12] or [13], wherein the acicular particles are zinc oxide.
  • [15] The method according to any one of [1] to [14], wherein the needle-like structure is immobilized on a substrate.
  • the substrate has a binder on its surface, and a portion of the needle-like structure is fixed to the substrate by the binder.
  • the binder is made of a protein non-adsorptive material.
  • the needle-like structure is manufactured using one or more selected from the group consisting of photolithography, dry etching, wet etching, and combinations thereof.
  • a method for analyzing the function of the intracellular factor comprising the step of analyzing the state of the modified cell produced by the method of any one of [1] to [19].
  • the step of analyzing the state of the modified cells analyzes one or more selected from the group consisting of cell growth rate, survival rate, metabolism, quantification of reactive oxygen species, and gene expression of [20] Method.
  • needle-shaped particles in which a conjugate capable of binding to an intracellular molecule is immobilized and a composite substrate for cell treatment comprising the needle-shaped particles
  • a composite substrate for cell treatment comprising the needle-shaped particles
  • the present invention is based on these new findings and includes the following inventions.
  • a composite base material for cell treatment comprising needle-like particles immobilized on a base material.
  • the composite base material for cell treatment of [6] wherein the acicular portion of the acicular particles has a length of 1 to 50 ⁇ m.
  • the composite substrate for cell treatment of [13], wherein the conjugate is a nucleic acid, protein, peptide, or low-molecular-weight compound.
  • [16] a step of inserting a portion of the acicular particles of any one of [1] to [5] or the acicular particles of the composite substrate for cell treatment of any one of [13] to [15] into cells; a step of binding an intracellular molecule with the conjugate immobilized on the acicular particles; and extracting the acicular particles from the cell together with the intracellular molecule bound via the conjugate; including, A method for producing a modified cell in which the function of the intracellular molecule is removed or reduced. [17] The method of [16], wherein the modified cell is used to analyze the function of the intracellular molecule.
  • the step of inserting a portion of the acicular particles into and/or withdrawing from the cell is one or more selected from the group consisting of centrifugal force, magnetic force, water flow, water pressure, and electrostatic interaction.
  • the method of [16] or [17] performed using an external force.
  • [20] a step of inserting a portion of the acicular particles of any one of [1] to [5] or the acicular particles of the composite substrate for cell treatment of any one of [13] to [15] into cells; the step of binding the intracellular molecule with the conjugate immobilized on the acicular particles; extracting the acicular particles from the cell together with the intracellular molecule bound via the conjugate; analyzing the state of the cell; including, A method for analyzing the function of the intracellular molecule.
  • the method of [20] wherein the step of analyzing the state of cells analyzes one or more selected from the group consisting of cell growth rate, viability, metabolism, quantification of reactive oxygen species, and gene expression.
  • the step of inserting a portion of the acicular particles into and/or extracting from the cell is one or more selected from the group consisting of centrifugal force, magnetic force, water flow, water pressure, and electrostatic interaction; The method of [20] or [21] performed using an external force. [23] The method according to any one of [20] to [22], wherein a spindle is bound to the cell.
  • This specification is the basis of the priority of this application, and the contents described in the specifications of Japanese Patent Application No. 2021-119463 and Japanese Patent Application No. 2021-119466 filed on July 20, 2021. contain. All publications, patents and patent applications cited herein are hereby incorporated by reference in their entirety.
  • INDUSTRIAL APPLICABILITY it is possible to provide new techniques and methods for controlling intracellular reactions that enable introduction of a given factor into a large number of cells with simple and efficient manipulation. .
  • a new method for controlling intracellular reactions which enables treatment of a large number of cells with a simple operation, and which does not allow the introduced factors to remain in the cells after the operation. technology and methods can be provided.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a method for producing a composite base material for cell treatment on which acicular particles are immobilized.
  • FIG. 2 is a photographic view of acicular particles (Panatetra) immobilized on the composite base material for cell treatment.
  • FIG. 3 is a graph showing the percentage of activated cells (CD25 + or CD137 + ) in PBMCs obtained by inserting and removing needles of Panatetra coated with anti-Cbl antibody. (A) shows the results 1 day after the start of culture, and (B) shows the results 3 days after the start of culture.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a method for producing a composite base material for cell treatment on which acicular particles are immobilized.
  • FIG. 2 is a photographic view of acicular particles (Panatetra) immobilized on the composite base material for cell treatment.
  • FIG. 3 is a graph showing the percentage of activated cells (CD25 + or CD137 + ) in PBMCs obtained by inserting and removing
  • FIG. 4 is a graph showing the viability of cells (that is, the efficiency of inserting needles of Pana-tetra into cells) when cells are subjected to repeated treatments with the composite base material for cell treatment.
  • FIG. 5 shows differentiated cells (neuronal cells with a CD56 + phenotype) in MSCs (mesenchymal stem cells) obtained by inserting and removing needle-like parts of Panatetra coated with anti-GSK3 ⁇ antibody. It is a graph showing the ratio of .
  • the "needle-shaped body” means a fine structure having at least one needle-shaped part.
  • the "needle-shaped part” has a shape that is long and narrow, has a sufficiently small tip and width, and causes little or no damage, preferably no damage, to the cell when inserted into the cell.
  • the needle-like part may have, for example, a cylindrical shape, a conical shape, a cylindrical shape (such as a prismatic shape), a pyramidal shape, etc. (but not limited to these), and the tip thereof is sharp. It may or may not be sharp. Cylindrical or conical shapes are preferred from the viewpoints of low invasiveness to cells and insertion efficiency.
  • the length of the acicular part is 0.5 to 100 ⁇ m, preferably 1 to 50 ⁇ m, more preferably 5 to 40 ⁇ m, still more preferably 10 to 30 ⁇ m (eg, 10 ⁇ m, 20 ⁇ m, etc.).
  • the aspect ratio of the needle-like portion is not particularly limited, but can be about 5:1 to 50:1, preferably 10:1 to 40:1.
  • the "needle” is made of a material that has little or no toxicity to cells, preferably no toxicity at all. , quartz, nickel oxide, silica, alumina, diamond, titania, zirconia, etc.), metals (e.g., gold, silver, copper, platinum, aluminum, etc.), metal crystals (e.g., tungsten, titanium, silicon crystals, zirconium, etc.), Glass, resin (e.g., polyethylene, polypropylene, cyclic polyolefin, cyclic olefin copolymer, polyester, polystyrene, polymethyl acrylate, polylactic acid, polyether ether ketone, fluororesin, etc.), silicon nitride, silicon, etc. (these include is not limited), needle-like solid materials can be preferably used.
  • quartz, nickel oxide, silica, alumina, diamond, titania, zirconia, etc. metals (e.g., gold, silver, copper, platinum,
  • the form of the "needle” is not particularly limited as long as it allows the needle to be inserted into the cell and then removed (also referred to as “withdrawal”).
  • the "needle-shaped body” can have a form of needle-shaped particles or immobilized on a substrate.
  • needle-like particles means fine grains with at least one needle-like part.
  • the needle-like particles have a shape in which one or more needle-like portions are arranged/bonded at the center, and may be, for example, rod-like, L-shaped, V-shaped, T-shaped, Y-shaped, or radial (for example, It can take a shape such as tripod, quattropod, tetrapod, etc., but is not limited to these.
  • each needle-like part may have the same shape and/or length, or may have a different shape and/or length.
  • the central portion may have a structure in which a plurality of needle-like portions are directly connected to each other, or may have a structure in which one or a plurality of needle-like portions are connected to a core member.
  • the size of the needle-like particles may vary depending on the length and number of needle-like portions provided, but may be of a size that fits in a sphere with a radius of 0.5 ⁇ m to 100 ⁇ m.
  • the acicular particles in the present invention are made of zinc oxide having a plurality of needle-like portions, and more preferably needle-like portions made of zinc oxide single crystals with a length of 10 to 20 ⁇ m are arranged in a tetrapod shape. It has a shape As such acicular particles, for example, Panatetra (registered trademark) WZ-0501 (manufactured by Amtech) and the like can be preferably used.
  • the “form fixed to the base material” means a base material having a plurality of needle-like bodies (or needle-like parts) on its surface.
  • the needle-shaped bodies or needle-shaped particles immobilized on the surface of the substrate mean a plurality of needle-shaped bodies or needle-shaped particles.
  • the “substrate” is not particularly limited as long as it can function as a support by immobilizing the needle-shaped structure on its surface.
  • LLDPE Linear Low Density Polyethylene
  • VLDPE Very Low Density Polyethylene/ULDPE, Ultra Low Density Polyethylene
  • LDPE Low Density Polypropylene
  • Polyethylene polyacrylonitrile, styrene-butadiene copolymer, (meth)acrylic acid ester polymer, fluorine resin, etc.), silica gel, crosslinked dextran, polysaccharide, polysaccharides such as agarose, glass, metal, magnetic substances, and combinations thereof etc.
  • the shape of the substrate is not particularly limited as long as it can immobilize the needle-shaped body. , tubes, microplates, microtubes, cells, cuvettes, dishes, flasks, bags), fibers, gels and the like. Specific examples include, but are not limited to, polyethylene films, polyethylene plates, magnetic beads, and the like.
  • the fixation of the needle-shaped body to the surface of the base material can be performed using any means as long as the binding between the two can be maintained even after the needle-shaped part is inserted into and removed from the cell.
  • the needle-shaped structure can be immobilized on the surface of the substrate by, for example, a physical adsorption method, a covalent bonding method, an ionic bonding method, embedding in the substrate, or using a binder (adhesive). It is not limited to these.
  • the "binder” that can be used in the present invention is not particularly limited as long as it can fix the needle-shaped structure to the surface of the base material.
  • -Hydroxyethyl methacrylate) Poly HEMA
  • polyvinylpyrrolidone polyvinylpyrrolidone
  • vinyl acetate resin urethane resin
  • vinyl chloride resin epoxy resin
  • vinyl chloride/vinyl acetate copolymer resin modified silicone resin
  • ethyl 2-cyanoacrylate polystyrene, chloroprene rubber, nitrile rubber, styrene-butadiene rubber, nitrocellulose, starch, dextrin, alginic acid, agarose, gelatinous proteins (gelatin, elastin, fibrin, etc.), etc., and a combination of one or more of these can be used.
  • the binder is applied to a predetermined region on the surface of the base material, and when the applied binder is solidified, the needle-like structure partly in contact with the binder, preferably partly embedded, is adhered to the binder. Immobilize on the surface of the substrate.
  • the binder has low binding property and adsorptivity to the "intracellularly introduced factor" described in detail below, and examples of such binders include PVA, Poly HEMA, and the like.
  • Binders can also include molecules that interact with cell surface proteins. Such molecules include, for example, fibronectin, laminin, collagen, cadherin, or fragments thereof, and the like, and combinations of one or more of these can be utilized. Such molecules may for example be pre-mixed with the binder component and then coated together on the substrate, or may be coated against the binder on the substrate and may be included in any convenient manner. . By using such a molecule, it is possible to suppress deterioration of the cell state due to a change from the normal culture environment when treating the cells.
  • the fixation of the needle-shaped structure to the surface of the base material can be performed by manufacturing the base material and the needle-like structure (or the needle-shaped part) by integral molding or integral processing.
  • the surface of the base material may have a fine uneven structure capable of accommodating cells together with the immobilized needle-shaped bodies.
  • the microrelief structure accommodates and retains cells by side walls (e.g., inner walls of recesses) and bottoms, restricts lateral movement of cells (e.g., horizontal movement relative to the surface of a substrate), and prevents cells from This can reduce or prevent spicule damage (eg, cutting, tearing, etc.) that can occur with lateral movement of the needle.
  • the shape of the "fine uneven structure” is not particularly limited as long as it is a shape capable of exhibiting the above effects. It has a concave shape (concave portion) such as a columnar shape, a prismatic shape, or the like.
  • a needle-shaped body is arranged and fixed at the bottom of the recess.
  • the size of the concave portion is not particularly limited as long as it is a size capable of exhibiting the above effects. can be done.
  • Each recess may accommodate a single cell or a plurality of cells.
  • needle-shaped bodies in a form "immobilized on a base material” may be referred to as a "composite base material for cell treatment”.
  • the "intracellular factor” is immobilized on the needle-shaped body.
  • intracellular factors include conjugates capable of binding intracellular molecules.
  • a "conjugate capable of binding to an intracellular molecule” is capable of binding, preferably selectively binding, more preferably specifically binding to a target intracellular molecule in the introduced cell to form a complex. It can be selected as appropriate according to the target intracellular molecule.
  • conjugates include nucleic acids (DNA, RNA, DNA-RNA hybrids, etc.), proteins (antibodies, antigens, enzymes, substrates, coenzymes, ligands, receptors, subunits of complexes, or fragments thereof).
  • the "conjugate capable of binding to an intracellular molecule” is preferably one that itself does not directly affect the expression of any gene.
  • “does not directly affect” means that any intracellular signal transduction pathway is not directly activated due to the introduction of the conjugate.
  • the "conjugate capable of binding to an intracellular molecule” is an antibody or fragment thereof capable of binding, preferably selectively binding, more preferably specifically binding to a target intracellular molecule. is.
  • “Fragments” of antibodies include Fab, Fab', F(ab') 2 , Fv, scFv, dsFv, diabodies, sc(Fv) 2 and the like, and multimers of these fragments (e.g., dimers, trimers, , tetramers, polymers) can also be utilized in the present invention.
  • intracellular factors include those that exhibit any function in the introduced cell, or those that are predicted to exhibit any function.
  • physiologically active substances include nucleic acids (DNA, RNA, DNA-RNA hybrids, etc.), plasmids, virus particles, chromosomes, etc.; proteins, amino acids, oligopeptides, polypeptides, multi-subunit proteins; saccharides, polysaccharides, one or more substances selected from the group consisting of fatty acids, cholesterol, lipids, signaling substances, ligand substances, hormone substances, cytokines, ions, metal particles, magnetic fine particles, inorganic compounds, quantum dots, organic compounds, drugs, etc. Examples include, but are not limited to.
  • the method of binding (immobilizing) the "needle” and the "intracellularly introduced factor” can be appropriately selected according to the type of "intracellularly introduced factor” to be used.
  • the "intracellular transfer factor” to be used is the above-described "conjugate capable of binding to an intracellular molecule”
  • the binding (immobilization) of the needle-shaped structure and the conjugate is performed by binding (immobilizing) the needle-shaped structure to the cell.
  • a method well known to those skilled in the art may be used as long as there is sufficient strength to maintain the bond even when it is inserted and then pulled out.
  • the bonding method examples include a physical adsorption method, a covalent bonding method, an ionic bonding method and the like, and the covalent bonding method is preferred.
  • the conjugate is a protein or peptide
  • the covalent bonding method is a functional group (e.g., hydroxy group, amino group, N-hydroxysuccinimidyl group, sulfhydryl group, epoxy group, vinyl group) on the surface of the needle. group, etc.) and the carboxy terminus of the protein or peptide to form an ester bond, an amide bond, or the like.
  • the surface of the needles can be treated to introduce functional groups such as polylysine, polyethyleneiminevinyltrialkoxysilane, 3-mercaptopropyltrialkoxysilane, aminoalkyltrialkoxysilane.
  • functional groups such as polylysine, polyethyleneiminevinyltrialkoxysilane, 3-mercaptopropyltrialkoxysilane, aminoalkyltrialkoxysilane.
  • Alkoxysilanes, epoxy-containing alkyltrialkoxysilanes, and the like can be used.
  • the binding (immobilization) between the needle-shaped particles and the conjugates capable of binding to intracellular molecules may be directly bound to each other, or may be indirectly bound via a linker.
  • the binding (immobilization) between the two is maintained at least until the needle-like portion is inserted into the cell. Bonds that are separated/cleaved within the nucleus and allow release of the factor into the cell are preferred.
  • binding methods include electrostatic binding; binding through hydrophobic interactions; chelate binding; intracellularly cleavable covalent bonds such as disulfide bonds (S—S bonds); Examples include (but are not limited to) binding via a linker (enzyme-cleavable linker) having an enzyme-recognition sequence such as esterase, and can be performed using a method well known to those skilled in the art (JP-A-2006-166884). publications, etc.).
  • All of the intracellularly introduced factors immobilized on one needle may be the same, or multiple different intracellularly introduced factors may be immobilized.
  • the same intracellular factor may be immobilized on all of the needle-shaped structures, or a different intracellular factor may be immobilized on each needle-shaped structure.
  • a predetermined intracellularly introduced factor may be previously immobilized on the needle-shaped body, or, when used, the desired intracellularly-introduced factor is immobilized on the needle-shaped body as described above. (That is, the needle-shaped structure at the time of provision may not have a predetermined intracellular transfer factor immobilized in advance).
  • the needle-shaped body on which intracellular factors are immobilized can be used to control intracellular reactions, and can be used in a method for producing modified cells in which intracellular reactions are controlled.
  • a needle means a plurality of needles.
  • This manufacturing method is Contacting the needle-shaped body on which the intracellularly introduced factor is immobilized with the cell to which the weight is bound, thereby inserting a portion of the needle-shaped body into a cell to introduce the intracellular factor into the cell; extracting a portion of the needle-shaped body from the cell; including.
  • Cells to be targeted in the present invention are not particularly limited, and may be either adherent cells or suspension cells.
  • the origin of the cells is not particularly limited, and mammalian cells such as human, mouse, rat, monkey, dog, pig, bovine, guinea pig, and hamster cells can be preferably used.
  • pluripotent stem cells refer to embryonic stem cells (ES cells) and similar pluripotent cells, that is, various tissues of the body (endoderm, mesoderm, ectoderm). refers to cells that potentially have the ability to differentiate into Cells having pluripotency similar to ES cells include "induced pluripotent stem cells” (sometimes referred to as “iPS cells”).
  • pluripotent stem cells are human pluripotent stem cells.
  • Induced pluripotent stem cells refer to reprogramming mammalian somatic cells or undifferentiated stem cells by introducing specific factors (nuclear reprogramming factors) such as Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-Myc.
  • pluripotent stem cells mean cells characterized by predetermined phenotypes and marker expression obtained by differentiation-inducing pluripotent stem cells.
  • Marker means a cell antigen or its gene that is specifically expressed by a given cell type, such as “marker protein” and “marker gene”.
  • cells may be cells collected from a living body, cultured cells, or freeze-thawed cells. It is preferable to use cells in a dissociated or dispersed state.
  • the cells are bound with spindles.
  • the weight of the cell is increased, which enhances the impact of contact between the cell and the spicule, facilitating the insertion of the spicule into the cell (i.e., insertion increase the probability).
  • the weight one or more selected from the group consisting of resins, metals, magnetic substances, combinations thereof, and the like can be used.
  • the shape of the weight is not particularly limited, it can be, for example, a bead shape.
  • magnetic beads such as Dynabeads (registered trademark, Veritas Co., Ltd.) can be suitably used as the "consumer” of cells. Binding of cells to spindles can be performed using methods well known to those skilled in the art, for example, using one or more of antibodies or fragments thereof, avidin-biotin, streptavidin-biotin, and the like.
  • the needle-shaped part of the needle-shaped body can be inserted into the cell by bringing the cell and the needle-shaped body into contact.
  • the contact between the cells and the needle-shaped bodies is achieved by adding the needle-shaped bodies (in the form of needle-shaped particles) to the cells (or by adding the cells to the needle-shaped bodies), or by immobilizing them on a substrate. It can be carried out by adding cells to a needle-shaped body (composite base material for cell treatment) in the form of a sliver. If necessary, an external force may be applied to the contact between the cells and the needle-like structure.
  • the "external force” means a force applied to cells and/or needle-shaped bodies, and includes centrifugal force, magnetic force, electrostatic interaction, water flow (water pressure), etc. One or more selected from these can be used. Centrifugation may be performed under conditions that do not damage the cells, for example, at 100 to 30000 g for 30 to 600 seconds. Water flow (water pressure) can be provided by a pipetting operation. By using an external force, it is possible to increase the impact at the time of contact between the cell and the spicule, thereby facilitating the insertion of the spicule of the spicule into the cell (that is, increasing the probability of insertion). can.
  • the insertion of the needle-shaped part of the needle-shaped particles into the cells may be performed in a culture medium, preferably in a cell culture environment.
  • the culture conditions are maintained at 37°C and 5% CO 2 . can be done while If the insertion time is short, it can be performed at room temperature or in an atmospheric environment.
  • the intracellularly introduced factor immobilized on the needle-shaped body is the above-mentioned "conjugate capable of binding to an intracellular molecule"
  • insertion of the needle-shaped part of the needle-shaped body into the cell is It is sufficient that the conjugate immobilized on the inserted needle-shaped body in the cell is maintained for a time sufficient for binding to the target intracellular molecule in the cell.
  • a person skilled in the art can appropriately set the time depending on the type of intracellular molecule to be used.
  • the needle-shaped portion is extracted from the cell together with the desired intracellular molecule bound to the conjugate, thereby reducing or eliminating the amount of the desired intracellular molecule within the cell.
  • a modified cell in which the function of the intracellular molecule is eliminated or reduced can be obtained.
  • the intracellular introduction factor immobilized on the needle-shaped body is the "physiologically active substance”
  • the insertion of the needle-shaped body into the cell is It is sufficient that the physiologically active substance immobilized in the body is maintained for a sufficient period of time to be released from the needle-shaped structure (the bond is severed if necessary), and this time is sufficient for the physiologically active substance, etc.
  • a person skilled in the art can appropriately set the time according to the type of binding, but the time can be, for example, about 1 to 120 minutes, preferably 5 to 60 minutes, more preferably about 30 minutes.
  • the needle-shaped portion is extracted from the cell, and the physiologically active substance is allowed to remain in the cell, thereby increasing the amount of the physiologically active substance in the cell, thereby introducing the function of the physiologically active substance. , or enhanced modified cells can be obtained.
  • the needle-shaped part can be extracted from the cell by applying an external force to separate the contacting cell and the needle-shaped body.
  • an external force can be used as defined above.
  • the steps of inserting the needle-shaped portion of the needle-shaped body into the cell and extracting the needle-shaped portion from the cell can be performed once or multiple times for the same cell.
  • “multiple times” means 2 or more times, 3 or more times, 4 or more times, or 5 or more times, and the upper limit is not particularly limited. 15 times or less, or 10 times or less is preferable from the viewpoint of maintaining good conditions.
  • the term “performed multiple times” as used herein means not only the case where the above steps are continuously performed multiple times, but also the case where the above steps are performed multiple times at regular time intervals.
  • the resulting modified cells vary depending on the function of the introduced intracellular factors.
  • the introduced intracellular factor is the above-mentioned "conjugate capable of binding to an intracellular molecule", for example, the intracellular molecule that binds to the above-mentioned conjugate is a factor that has the function of suppressing or inhibiting cell activation.
  • the function of the factor is removed , or by reducing it, a modified cell in which the intracellular reaction of the factor is controlled, that is, activated can be obtained.
  • the intracellular molecule that binds to the conjugate is a factor that has the function of suppressing or inhibiting differentiation induction of cells
  • removal or reduction of the function of the factor can reduce the effect of the factor on cells. It is possible to obtain modified cells whose internal reaction is controlled, that is, differentiation-induced (examples of modified cells are not limited to these).
  • the introduced intracellular factor is the aforementioned "physiologically active substance", for example, a factor having a function of promoting cell activation, by introducing or enhancing the function of the factor , it is possible to obtain modified cells in which the intracellular reaction of the factor is controlled, that is, in which activation is promoted.
  • the physiologically active substance is a factor having a function of promoting cell differentiation induction
  • the intracellular reaction of the factor is controlled by introducing or enhancing the function of the factor. That is, a modified cell induced to differentiate can be obtained (examples of modified cells are not limited to these).
  • the modified cells obtained can be used to analyze the function of the introduced intracellular factors.
  • Analysis of the function of the introduced intracellular factors can be performed by analyzing the state of the modified cells obtained by the above method.
  • the state of the modified cells to be analyzed includes, but is not limited to, cell growth rate, viability, metabolism, reactive oxygen species, gene expression, etc., and one or more selected from these Quantify and analyze the state.
  • the introduced intracellular factor is the above-mentioned "conjugate capable of binding to an intracellular molecule”
  • the growth rate, survival rate, metabolism, reactive oxygen species, or gene expression in the resulting modified cells When compared to unmodified cells, the conjugate has such a function, i.e., the intracellular molecule targeted by the conjugate, is reduced, inhibited, or abolished. , metabolism, reactive oxygen species, or maintenance or promotion of gene expression.
  • the conjugate when growth rate, viability, metabolism, reactive oxygen species, or gene expression is increased or induced in the resulting modified cells compared to unmodified cells has such a function, i.e., the intracellular molecule targeted by the conjugate has the function of suppressing or inhibiting growth rate, viability, metabolism, reactive oxygen species, or gene expression.
  • the introduced intracellular factor is the "physiologically active substance”
  • the growth rate, viability, metabolism, reactive oxygen species, or gene expression in the resulting modified cells are higher than those in unmodified cells. If the physiologically active substance is reduced, suppressed, or eliminated, the physiologically active substance has a function that contributes to the reduction, suppression, or elimination of cell growth rate, survival rate, metabolism, reactive oxygen species, or gene expression. Then you can judge.
  • the physiological activity Substances can be determined to have the ability to increase or induce growth rate, viability, metabolism, reactive oxygen species, or gene expression.
  • any gene to be analyzed and the protein encoded by it can be used. It is preferred that the molecule, the conjugate, and the physiologically active substance to be introduced are different.
  • the present invention provides acicular particles on which a conjugate capable of binding to an intracellular molecule is immobilized, and a composite for cell treatment comprising the acicular particles immobilized on a substrate It relates to the base material.
  • acicular particles on which a conjugate capable of binding to an intracellular molecule is immobilized
  • a composite for cell treatment comprising the acicular particles immobilized on a substrate It relates to the base material.
  • “needle-shaped particles”, “conjugates capable of binding to intracellular molecules”, “composite substrates for cell treatment” and various “immobilization” methods refer to those described above and are defined as above. It is.
  • the "needle particles" and the “composite substrate for cell treatment” may be provided in a form in which the predetermined conjugate is previously immobilized on the acicular particles, or Alternatively, the desired conjugate may be immobilized on the acicular particles as described above (that is, the desired conjugate may not be previously immobilized on the acicular particles at the time of provision).
  • needle-shaped particles on which a conjugate capable of binding to the intracellular molecule is immobilized and a complex for cell treatment comprising needle-shaped particles on which a conjugate capable of binding to the intracellular molecule is immobilized
  • Substrates can be used in methods for producing modified cells.
  • all needle-like particles mean a plurality of needle-like particles unless otherwise specified.
  • the manufacturing method includes the following steps: For cell treatment comprising needle-shaped particles on which a conjugate capable of binding to the intracellular molecule is immobilized, or needle-shaped particles to which a conjugate capable of binding to the intracellular molecule is immobilized. inserting the needle-shaped portion of the needle-shaped particles in the composite substrate into cells; binding the target intracellular molecule to the conjugate immobilized on the needle-shaped particles in the cell; withdrawing the needle from the cell together with the intracellular molecule bound via the conjugate.
  • the “cell”, the “insertion” of the acicular portion of the acicular particle into the cell, the “extraction” of the acicular portion from the cell, and various operations are as described above and are defined as above. It follows.
  • the insertion of the needle-like portion of the needle-like particles into the cell allows the conjugate immobilized on the needle-like portion inserted in the cell to bind to the desired intracellular molecule in the cell.
  • a sufficient period of time may be maintained, and this period of time can be appropriately set by those skilled in the art depending on the type of the conjugate and the target intracellular molecule. For example, 1 to 120 minutes, preferably It can be 5 to 60 minutes, more preferably about 30 minutes.
  • the needle-shaped portion is extracted from the cell together with the desired intracellular molecule bound to the conjugate, thereby reducing or eliminating the amount of the desired intracellular molecule within the cell.
  • a modified cell in which the function of the intracellular molecule is eliminated or reduced can be obtained. According to this embodiment, it is possible to treat a large number of cells with a simple operation, and to control intracellular reactions without the introduced factors remaining in the cells after the operation.
  • the above-described "consumer” may be bound to cells as necessary.
  • the weight of the cells increases, which enhances the impact of contact between the cells and the acicular particles, facilitating the insertion of the acicular part of the acicular particles into the cells (i.e., insertion increase the probability).
  • the resulting modified cell is as described above and conforms to the above definition, assuming that the introduced intracellular factor is a "conjugate capable of binding to an intracellular molecule".
  • the resulting modified cells can be used to analyze the functions of intracellular molecules of interest.
  • the analysis of the function of the intracellular molecule of interest can be performed by analyzing the state of the modified cell in which the function of the intracellular molecule is removed or reduced, obtained by the above method. .
  • the state of the modified cells to be analyzed includes, but is not limited to, cell growth rate, viability, metabolism, reactive oxygen species, gene expression, etc., and one or more selected from these The condition can be quantified and analyzed and determined as described above.
  • FIG. 1 shows an outline of the method for producing a composite substrate for cell treatment on which acicular particles are immobilized in this experiment.
  • a linear low-density polyethylene (LLDPE) film is covered with an LLDPE film (masking) with a hole of ⁇ 4 mm, and a water-soluble photosensitive resin (BIOSURFINE (registered trademark) AWP (manufactured by Toyo Gosei)) is applied. After adding the 1% aqueous solution, excess liquid was scraped out with a polystyrene cylinder.
  • LLDPE linear low-density polyethylene
  • AWP water-soluble photosensitive resin
  • Needle-shaped particles (Pana Tetra (registered trademark) WZ-0501 (manufactured by Amtech)) are attached to a sponge puff (107 (NBR) for Emulsion Pact (manufactured by Shiseido)), and a photosensitive resin is added to the substrate surface using this. Pana-tetra was coated by tapping multiple times.
  • the photosensitive resin was UV-crosslinked with a low-pressure mercury lamp (TUV15W/G15T8 (manufactured by Philips)), and the panatetra was adhered.
  • the UV irradiation conditions were 30 minutes at a distance of 12 cm. Then, it was washed with water to wash away excess panatetra with insufficient adhesion.
  • a ring-shaped member made of LDPE (inner diameter 4 mm) and a panatetra-coated portion ( ⁇ 4 mm) on the base material were aligned with each other, superimposed, and heat-sealed to produce a container-shaped composite base material for cell treatment.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells, manufactured by HameCare
  • ALyS505N-7 manufactured by Cell Science Laboratory
  • fetal bovine serum manufactured by Thermo Fisher
  • the cells were floated by pipetting, peeled off from the cell treatment composite substrate, collected in a 96-well plate, added with 150 ⁇ L of the medium, and cultured for 1 day or 3 days in a 37° C., 5% CO 2 environment ( Example 1).
  • a composite substrate for cell treatment prepared in the same manner as the above composite substrate for cell treatment, except that neither anti-Cbl antibody nor panatetra was coated, or panatetra was coated with anti-Cbl antibody.
  • Cells were treated in the same manner as above using a cell treatment composite base material prepared in the same manner as the cell treatment composite base material except that it was not coated (the former cell treatment composite base material was used). Cells treated with the substrate are referred to as “Comparative Example 1”, and cells treated with the latter composite substrate for cell treatment are referred to as “Comparative Example 2”).
  • each cell culture was collected and treated with anti-CD3 antibody (fluorescence: APC-Cy7, manufactured by Biolegend), anti-CD25 antibody (fluorescence: APC, manufactured by Biolegend). ) and anti-CD137 antibody (fluorescence: Brilliant Violet 421, manufactured by Biolegend), the staining intensity of each antibody was analyzed with a flow cytometer CytoFLES S (manufactured by Beckmancoulter). For the analysis, the CD3-positive population was sorted, and the positive rate of CD25 and/or CD137 was calculated therefrom. In addition, unstained cells were used as a criterion for positive/negative determination.
  • PBMC are known to be activated through an intracellular signaling cascade based on CD3 stimulation, and the expression of activation markers CD25 and CD137 is promoted (Endocrine Journal 2005, 52 (5) , 635-641; J Immunol Methods. 2008 Nov 30;339(1):23-37.).
  • part of the intracellular signaling cascade based on this CD3 stimulation is inhibited by the ubiquitin ligase Cbl and cell activation is suppressed, that is, the expression of CD25 and CD137 is suppressed (Science Signaling 05 Feb 2019: Vol.12, Issue 567, eaav4373).
  • Anti-Cbl antibody-coated panatetra needle insertion, removed cells showed less activated cells (CD25 ⁇ and CD137 ⁇ ) compared to Comparative Examples 1 and 2. and a significant increase in the percentage of activated cells exhibiting the active CD25 + and CD137 ⁇ , CD25 + and CD137 + , and CD25 + and CD137 ⁇ phenotypes, respectively. (Fig. 3).
  • Example 1 Comparative Example 1, and Comparative Example 2
  • the ratio of activated cells was higher after 3 days of culture than after 1 day of culture, and the ratio of activated cells in Example 1 was Since it is higher than Comparative Examples 1 and 2, it was confirmed that in Example 1, the progress of activation was faster than in Comparative Examples 1 and 2, and the strength was also increased (Fig. 3 (A) vs. (B)).
  • Experiment 2 Efficiency improvement of treatment with composite base material for cell treatment by binding spindles to cells 2-1.
  • Preparation of cells and binding of spindle Jurkat E6.1 (purchased from DS Pharma Biomedical) was cultured in ALyS505N-0 (manufactured by Cell Science Research Institute) supplemented with 2% fetal bovine serum (manufactured by Thermo Fisher).
  • the cells were suspended by pipetting and mixed with an equal amount of trypan blue solution (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries). The cells were set on a hemocytometer and observed under a microscope, and the stained cells were counted as dead cells and the unstained cells were counted as viable cells, and the viable cell rate was calculated from these values (Example E).
  • Example E the treatment was performed in the same manner as in Example E above, except that a composite substrate for cell treatment prepared in the same manner as the composite substrate for cell treatment was used, except that it was not coated with panatetra.
  • Cell viability (Comparative Example F) was used.
  • the survival rate is about the same as when cells that are bound to spindles are used. confirmed to be obtained.
  • the treatment efficiency may decrease in practice, which may not be preferable.
  • Experiment 3 Modification of Mesenchymal Stem Cells by Treatment with Composite Substrate for Cell Treatment 1-1.
  • Preparation of composite base material for cell treatment A linear low-density polyethylene (LLDPE) film was covered with an LLDPE film (masking) with ⁇ 4 mm holes, and a water-soluble photosensitive resin (BIOSURFINE (registered trademark) After adding a 2% aqueous solution of AWP (manufactured by Toyo Gosei), excess liquid was scraped out with a silicon spatula.
  • LLDPE linear low-density polyethylene
  • BIOSURFINE water-soluble photosensitive resin
  • a 5% ethanol dispersion of acicular particles (Pana-tetra (registered trademark) WZ-0501L (manufactured by Amtech); average needle length 20 ⁇ m) is dropped onto the above base material, and a bar coater (No. 20) is used to coat Pana-tetra. did the coating.
  • the photosensitive resin was UV-crosslinked with a low-pressure mercury lamp (TUV15W/G15T8 (manufactured by Philips)), and the panatetra was adhered.
  • the UV irradiation conditions were 30 minutes at a distance of 12 cm. Then, it was washed with water to wash away excess panatetra with insufficient adhesion.
  • a ring-shaped member made of LDPE (inner diameter 4 mm) and a panatetra-coated portion ( ⁇ 4 mm) on the base material were aligned with each other, superimposed, and heat-sealed to produce a container-shaped composite base material for cell treatment.
  • Antibody coating on composite base material for cell treatment 3-1 25 ⁇ L of an anti-GSK3 ⁇ antibody (manufactured by Biolegend) at a concentration of 40 ⁇ g/mL was added to the composite base material for cell treatment obtained in 1. and allowed to stand at 37° C. for 3 hours to coat panatetra with the antibody.
  • the obtained antibody-coated composite substrate for cell treatment was washed once with 60 ⁇ L of PBS (manufactured by Nacalai Tesque) and then used for the following cell treatment.
  • each cell culture was collected and stained with an anti-CD56 antibody (fluorescence: BV421, manufactured by Biolegend), followed by a flow cytometer CytoFLES S (manufactured by Beckmancoulter). Staining intensity was analyzed. In the analysis, the positive rate of CD56 was calculated. In addition, as a criterion for positive/negative determination, cells treated with an isotype antibody (fluorescence: BV421, manufactured by Biolegend) under the same conditions were used.

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Abstract

本発明は、簡便かつ効率的な操作で多数の細胞に対して所定の因子を導入することを可能とする、細胞内反応を制御するための新たな技術や手法を提供することを目的とするものであり、細胞内導入因子が固定化されている針状体と、細胞とを接触させ、前記針状体の一部分を前記細胞内に挿入して、前記細胞内導入因子を前記細胞内に導入する工程、ならびに、前記針状体の一部分を前記細胞より抜き出す工程、を含む、細胞内反応の制御方法を提供する。

Description

針状体を利用した細胞内反応の制御手段
　本発明は、針状体に固定化された細胞内導入因子を、多数の細胞内へ簡便かつ効率的に導入する方法、ならびにそれを利用する細胞内反応の制御手段に関する。
　また、本発明は、細胞内反応の制御に利用される、細胞内分子に結合可能な結合体が固定化されている針状粒子、及び、当該針状粒子を備える細胞処理用複合基材、ならびにそれらを利用する細胞内反応の制御方法に関する。
　今日、細胞内反応を制御するための様々な技術や手法が開発・報告されている。しかしながら、それらの多くは遺伝子組換え技術やゲノム編集技術を利用するものであり、これらは概ね煩雑な作業や、多大な費用等を伴うものであり、作業するものにとって大きな負担となっていた。また、遺伝子組換え技術やゲノム編集技術の過程で細胞内に導入された因子そのものが何らかの細胞内反応を引き起こす可能性や、このような因子が細胞内に残留する可能性等についても懸念される場合がある。このため、当該分野においては依然として、細胞内反応を制御するための新たな技術や手法が切望されていた。
　特許文献１には、細胞内又は細胞間タンパク質抗原に対する抗体を固定化した細胞挿入用針状材料が開示されており、当該針状材料を細胞に位置合わせし、上下動作を行って細胞に挿入することで、生きたままの細胞において、細胞内または細胞間タンパク質について定量、評価等が行えることが記載されている。
　特許文献２、３には、フォトリソグラフィーとドライエッチング及びウエットエッチング法を用いて成形された、支持体上に多数のナノニードルが配列した細胞挿入部材が開示されており、各ナノニードルに、遺伝子又は遺伝子発現に関与する物質等や抗体等のマーカー物質と結合する物質を固定化しておくことで、基板上の配列した多数の細胞に、同時に多数のナノニードルを挿入して、多数の細胞において、細胞が生きた状態で、遺伝子の発現状態を解析したり、標的細胞を選択的につり上げたりできることが記載されている。
　しかしながら、これらの針状材料やナノニードルは、細胞内等に挿入する際にその位置合わせや上下動作の操作が煩雑である場合があり、作業するものにとって大きな負担となる場合があり、また、針状材料やナノニードルに固定化される抗体等の物質が、針状材料やナノニードル以外の部分（支持体上）等にも結合して、これら物質のロス（無駄）を生じる場合があった。
特開２００６－２４６７３１号公報 特開２０１３－１８３７０６号公報 特開２００６－１６６８８４号公報
　本発明は、簡便かつ効率的な操作で多数の細胞に対して所定の因子を導入することを可能とする、細胞内反応を制御するための新たな技術や手法を提供することを目的とする。
　また、本発明は、簡便な操作で多数の細胞を処理することが可能であり、かつ導入された因子が操作後の細胞に残留することのない、細胞内反応を制御するための新たな技術や手法を提供することを目的とする。
　本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、錘を結合させた細胞と針状体とを接触させた場合に、錘を結合させていない細胞を接触させた場合と比べて、針状体の針状部が効率的に細胞内へと挿入されることを見出した。そして、細胞内導入因子を針状体に固定化し、これを錘を結合させた細胞と接触させることによって、当該導入因子を多数の細胞内へと簡便かつ効率的に導入することができ、細胞内反応を制御、分析等行えることを見出した。
　本発明は、これらの新規知見に基づくものであり、以下の発明を包含する。
［１］　細胞内導入因子が固定化されている針状体と、錘を結合させた細胞とを接触させ、前記針状体の一部分を前記細胞内に挿入して、前記細胞内導入因子を前記細胞内に導入する工程、ならびに、
　前記針状体の一部分を前記細胞より抜き出す工程、
を含む、改変細胞の製造方法。
［２］　前記錘が、樹脂、金属、磁性物質、及びそれらの組み合わせからなるから群から選択される一又は複数の物質である、［１］の方法。
［３］　前記錘がビーズ状の形態を有する、［１］又は［２］の方法。
［４］　前記針状体の一部分を細胞内へ挿入する、及び／又は細胞より抜き出す工程が、遠心力、磁力、水流、水圧、及び静電相互作用からなる群から選択される一又は複数の外力を用いて行われる、［１］～［３］のいずれかの方法。
［５］　前記細胞内導入因子が、細胞内分子に結合可能な結合体であり、前記針状体を前記細胞より抜き出して、前記細胞内において前記結合体に結合した細胞胞内分子を前記針状体と共に、前記細胞より抜き出すことを含む、［１］～［４］のいずれかの方法。
［６］　前記結合体が、核酸、タンパク質、ペプチド、又は低分子化合物である、［５］の方法。
［７］　前記結合体が抗体又はその断片である、［５］又は［６］の方法。
［８］　前記細胞内導入因子が生理活性物質であり、前記針状体を前記細胞より抜き出して、前記細胞内導入因子を前記細胞内に残留させることを含む、［１］～［４］のいずれかの方法。
［９］　前記生理活性物質が、核酸、ペプチド、タンパク質、糖類、多糖、脂肪酸、コレステロール、脂質、シグナル伝達物質、リガンド物質、ホルモン物質、サイトカイン、イオン、金属粒子、磁性微粒子、無機化合物、量子ドット、有機化合物及び薬剤からなる群から選択される一又は複数の物質である、［８］の方法。
［１０］　前記生理活性物質と前記針状体との間の結合が、細胞内で分離可能な結合である、［８］又は［９］の方法。
［１１］　前記細胞内導入因子と前記針状体との間の結合が、静電気的結合、疎水性相互作用による結合、キレート結合、細胞内で切断される共有結合、光切断リンカーを介した結合、酵素切断リンカーを介した結合からなる群より選択される少なくとも１種である、［１０］の方法。
［１２］　前記針状体が針状粒子である、［１］～［１１］のいずれかの方法。
［１３］　前記針状粒子の針状部の長さが１～５０μｍである、［１２］の方法。
［１４］　前記針状粒子が酸化亜鉛である、［１２］又は［１３］の方法。
［１５］　前記針状体が基材に固定化された形態を有する、［１］～［１４］のいずれかの方法。
［１６］　前記基材がその表面にバインダーを有し、前記針状体の一部分が前記バインダーにより前記基材に固定化されている、［１５］の方法。
［１７］　前記バインダーが、タンパク非吸着性材料からなる、［１６］の方法。
［１８］　前記針状体が、フォトリソグラフィー、ドライエッチング、ウェットエッチング、及びそれらの組み合わせからなるから群から選択される一又は複数を用いて製造されたものである、［１５］の方法。
［１９］　前記基材の前記針状体を有する面に、細胞を収容できる微細凹凸構造を有する、［１］～［１８］のいずれかの方法。
［２０］　［１］～［１９］のいずれかの方法により製造された改変細胞の状態を解析する工程を含む、前記細胞内導入因子の機能を解析する方法。
［２１］　前記改変細胞の状態を解析する工程が、細胞の増殖速度、生存率、代謝、活性酸素種の定量、遺伝子発現からなる群から選択される一又は複数について解析する、［２０］の方法。
　また、本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、細胞内分子に結合可能な結合体が固定化されている針状粒子、及び当該針状粒子を備える細胞処理用複合基材を利用することによって、その針状部を細胞に挿入して標的となる細胞内分子を引き抜くことが可能であり、これによって、簡便な操作で多数の細胞を処理することが可能であり、かつ導入された因子を操作後の細胞に残留させることなく、細胞内反応を制御、分析等行えることを見出した。
　本発明は、これらの新規知見に基づくものであり、以下の発明を包含する。
〔１〕　細胞内分子に結合可能な結合体が固定化されている針状粒子。
〔２〕　前記針状粒子の針状部の長さが１～５０μｍである、〔１〕の針状粒子。
〔３〕　前記針状粒子が酸化亜鉛である、〔１〕又は〔２〕の針状粒子。
〔４〕　前記結合体が、核酸、タンパク質、ペプチド、又は低分子化合物である、〔１〕～〔３〕のいずれかの針状粒子。
〔５〕　前記結合体が抗体又はその断片である、〔４〕の針状粒子。
〔６〕　針状粒子が基材に固定化されてなる細胞処理用複合基材。
〔７〕　前記針状粒子の針状部の長さが１～５０μｍである、〔６〕の細胞処理用複合基材。
〔８〕　前記針状粒子が酸化亜鉛である、〔６〕又は〔７〕の細胞処理用複合基材。
〔９〕　前記基材が樹脂からなる、〔６〕～〔８〕のいずれかの細胞処理用複合基材。
〔１０〕　前記基材がその表面にバインダーを有し、前記針状粒子の一部分が前記バインダーにより前記基材に固定化されている、〔６〕～〔９〕のいずれかの細胞処理用複合基材。
〔１１〕　前記バインダーが、タンパク非吸着性材料からなる、〔１０〕の細胞処理用複合基材。
〔１２〕　前記基材の前記針状粒子が固定化されている面に、細胞を収容できる微細凹凸構造が形成されている、〔６〕～〔１１〕のいずれかの細胞処理用複合基材。
〔１３〕　前記針状粒子に細胞内分子に結合可能な結合体が固定化されている、〔６〕～〔１２〕のいずれかの細胞処理用複合基材。
〔１４〕　前記結合体が、核酸、タンパク質、ペプチド、又は低分子化合物である、〔１３〕の細胞処理用複合基材。
〔１５〕　前記結合体が抗体又はその断片である、〔１４〕の細胞処理用複合基材。
〔１６〕　〔１〕～〔５〕のいずれかの針状粒子、又は〔１３〕～〔１５〕のいずれかの細胞処理用複合基材における針状粒子の一部分を細胞内に挿入する工程、
　細胞内分子と前記針状粒子に固定化されている前記結合体とを結合させる工程、ならびに、
　前記針状粒子を、前記結合体を介して結合している前記細胞内分子と共に、前記細胞より抜き出す工程、
を含む、
　前記細胞内分子の機能が除去、又は低減された改変細胞の製造方法。
〔１７〕　前記改変細胞が、前記細胞内分子の機能を解析するために用いられる、〔１６〕の方法。
〔１８〕　前記針状粒子の一部分を細胞内へ挿入する、及び／又は細胞より抜き出す工程が、遠心力、磁力、水流、水圧、及び静電相互作用からなる群から選択される一又は複数の外力を用いて行われる、〔１６〕又は〔１７〕の方法。
〔１９〕　前記細胞に錘が結合されている、〔１６〕～〔１８〕のいずれかの方法。
〔２０〕　〔１〕～〔５〕のいずれかの針状粒子、又は〔１３〕～〔１５〕のいずれかの細胞処理用複合基材における針状粒子の一部分を細胞内に挿入する工程、
　細胞内分子と前記針状粒子に固定化されている前記結合体とを結合させる工程、
　前記針状粒子を、前記結合体を介して結合している前記細胞内分子と共に、前記細胞より抜き出す工程、ならびに、
　前記細胞の状態を解析する工程、
を含む、
　前記細胞内分子の機能を解析する方法。
〔２１〕　細胞の状態を解析する工程が、細胞の増殖速度、生存率、代謝、活性酸素種の定量、遺伝子発現からなる群から選択される一又は複数について解析する、〔２０〕の方法。
〔２２〕　前記針状粒子の一部分を細胞内へ挿入する、及び／又は細胞より抜き出す工程が、遠心力、磁力、水流、水圧、及び静電相互作用からなる群から選択される一又は複数の外力を用いて行われる、〔２０〕又は〔２１〕の方法。
〔２３〕　前記細胞に錘が結合されている、〔２０〕～〔２２〕のいずれかの方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎である２０２１年７月２０日に出願された、日本国特許出願２０２１－１１９４６３号ならびに日本国特許出願２０２１－１１９４６６号の明細書等に記載される内容を包含する。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとりいれるものとする。
　本発明によれば、簡便かつ効率的な操作で多数の細胞に対して所定の因子を導入することを可能とする、細胞内反応を制御するための新たな技術や手法を提供することができる。
　また、本発明によれば、簡便な操作で多数の細胞を処理することが可能であり、かつ導入された因子が操作後の細胞に残留することのない、細胞内反応を制御するための新たな技術や手法を提供することができる。
図１は、針状粒子が固定化された細胞処理用複合基材の作製方法を示す概略図である。 図２は、細胞処理用複合基材に固定化されている針状粒子（パナテトラ）を観察した写真図である。 図３は、抗Ｃｂｌ抗体でコーティングされたパナテトラの針状部を挿入、抜去して得られたＰＢＭＣにおける、活性化された細胞（ＣＤ２５+又はＣＤ１３７+）の割合を示すグラフ図である。（Ａ）は培養開始から１日後、及び（Ｂ）は培養開始してから３日後の結果をそれぞれ示す。 図４は、細胞を細胞処理用複合基材による繰り返しの処理に付した場合の生細胞率（すなわち、細胞へのパナテトラの針部の挿入効率）を示すグラフ図である。 図５は、抗ＧＳＫ３β抗体でコーティングされたパナテトラの針状部を挿入、抜去して得られたＭＳＣ（間葉系幹細胞）における、分化した細胞（ＣＤ５６+の表現型で表される神経細胞）の割合を示すグラフ図である。
　本発明において「針状体」とは、少なくとも一つの針状部を備える微細な構造体を意味する。
　「針状部」は、細長く、先端、幅が十分に小さく、細胞に挿入した場合に、当該細胞に与えるダメージが小さいか、ほとんどなく、好ましくは全くダメージを与えない形状を有する。前記形状を有する限り、針状部は例えば、円筒形、円錐形、筒状（角柱状等）角錐形等（これらに限定はされない）の形状を有していてもよく、その先端は鋭利であってもよいし、鋭利でなくてもよい。細胞に対する低侵襲性や、挿入効率の観点から、好ましくは円筒形や円錐形が好ましい。針状部の長さは、０．５～１００μｍ、好ましくは１～５０μｍ、より好ましくは５～４０μｍ、さらに好ましくは１０～３０μｍ（例えば、１０μｍ、２０μｍ等）である。また、針状部のアスペクト比は特に限定されるものではないが、５：１～５０：１程度、好ましくは１０：１～４０：１とすることができる。
　「針状体」は、細胞に対して毒性が小さいか、ほとんどなく、好ましくは全く毒性のない材料からなり、このような材料としては、金属酸化物（例えば、酸化亜鉛等）、無機物（例えば、石英、酸化ニッケル、シリカ、アルミナ、ダイアモンド、チタニア、ジルコニア等）、金属（例えば、金、銀、銅、白金、アルミニウム等）、金属結晶（例えば、タングステン、チタン、シリコン結晶、ジルコニウム等）、ガラス、樹脂（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、環状ポリオレフィン、環状オレフィンコポリマー、ポリエステル、ポリスチレン、ポリアクリル酸メチル、ポリ乳酸、ポリエーテルエーテルケトン、フッ素樹脂等）、窒化シリコン、シリコン等が挙げられ（これらに限定はされない）、針状の固体材料を好適に用いることができる。
　「針状体」の形態は、細胞への針状部の挿入、その後の抜去（もしくは「引き抜き」ともいう）を可能とするものであればよく、特に限定されるものではないが、例えば、「針状体」は針状粒子や、基材に固定化された形態を有することができる。
　「針状体」の形態に関し「針状粒子」とは少なくとも一つの針状部を備える微細なつぶを意味する。針状粒子の形状は、中心部にて一又は複数の針状部が配置／結合されてなる形状を有し、例えば、棒状、Ｌ字形、Ｖ字形、Ｔ字形、Ｙ字形、放射状（例えば、トライポッド状、クワトロポッド状、テトラポッド状等）等の形状を取り得るが、これらに限定はされない。複数の針状部を備える場合、各針状部は同じ形状及び／又は長さを有するものであってもよいし、それぞれ異なる形状及び／又は長さを有するものであってもよい。中心部において、複数の針状部は互い直接連結した構造を有していてもよいし、核となる部材に一又は複数の針状部が連結した構造を有していてもよい。針状粒子の大きさは、備える針状部の長さや数に応じて変化し得るが、半径０．５μｍ～１００μｍの球体に収まる程度の大きさとすることができる。
　なお、本明細書において、「針状体」、「針状粒子」、及び「針状部」の大きさに関する数値は平均値で表される。
　好ましくは、本発明において針状粒子は、複数の針状部を備える酸化亜鉛からなり、より好ましくは長さ１０～２０μｍの酸化亜鉛の単結晶からなる針状部がテトラポッド状に配置されてなる形状を有する。このような針状粒子としては、例えば、パナテトラ（登録商標）ＷＺ－０５０１（アムテック製）等を好適に用いることができる。
　また、「針状体」の形態に関し「基材に固定化された形態」とは、針状体（もしくは針状部）をその表面に複数備える基材を意味する。以下、特に言及しない限り、基材の表面に固定化される針状体または針状粒子とは、複数の針状体または針状粒子を意味する。「基材」はその表面に針状体を固定化して支持体として機能できるものであればよく、特に限定されるものではないが、例えば、樹脂（ポリスチレン、ポリエチレン（例えば、直鎖状低密度ポリエチレン（ＬＬＤＰＥ，Ｌｉｎｅａｒ　Ｌｏｗ　Ｄｅｎｓｉｔｙ　Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ）、超低密度ポリエチレン（ＶＬＤＰＥ，Ｖｅｒｙ　Ｌｏｗ　Ｄｅｎｓｉｔｙ　Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ／ＵＬＤＰＥ，Ｕｌｔｒａ　Ｌｏｗ　Ｄｅｎｓｉｔｙ　Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ）、低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ，Ｌｏｗ　Ｄｅｎｓｉｔｙ　Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ）、又はこれらの組み合わせ）、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、スチレン－ブタジエン共重合体、（メタ）アクリル酸エステルポリマー、フッ素樹脂等）、シリカゲル、架橋デキストラン、ポリサッカライド、アガロース等の多糖類、ガラス、金属、磁性物質、ならびに、これらの組み合わせ等が挙げられる。基材の形状は針状体を固定化できるものであればよく特に限定されるものではないが、例えば、膜（フィルム又はメンブラン）、平板、トレー、粒子（ビーズ）、球、容器（試験管、チューブ、マイクロプレート、マイクロチューブ、セル、キュベット、ディッシュ、フラスコ、バッグ）、繊維、ゲル等の任意の形状とすることができる。具体的には例えば、ポリエチレンフィルム、ポリエチレンプレート、磁性ビーズ等が挙げられるが、これらに限定はされない。
　基材の表面への針状体の固定化は、細胞へその針状部を挿入、抜去した後も、両者の結合を維持することができる限り、任意の手段を用いて行うことができる。基材の表面への針状体の固定化は、例えば、物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法、基材への埋め込み、バインダー（接着剤）の利用等により行うことができるが、これらに限定はされない。
　本発明において利用可能な「バインダー」としては、基材の表面へ針状体を固定化できるものであればよく、特に限定されるものではないが、例えば、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）（Ｐｏｌｙ　ＨＥＭＡ）、ポリビニルピロリドン、酢酸ビニル樹脂、ウレタン樹脂、塩化ビニル樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル・酢酸ビニル共重合樹脂、変成シリコン樹脂、２－シアノアクリル酸エチル、ポリスチレン、クロロプレンゴム、ニトリルゴム、スチレン・ブタジエンゴム、ニトロセルロース、デンプン、デキストリン、アルギン酸、アガロース、ゲル状タンパク質（ゼラチン、エラスチン、フィブリン等）等が挙げられ、これらの一又は複数の組み合わせを利用することができる。バインダーは、基材の表面の所定の領域に塗布され、塗布されたバインダーが固化することで、当該バインダーにその一部分が接した、好ましくはその一部分が埋め込まれた針状体を接着して当該基材の表面に固定化する。好ましくは、バインダーは、下記に詳述する「細胞内導入因子」との結合性や吸着性が低いものが好ましく、このようなバインダーとしては、ＰＶＡ、Ｐｏｌｙ　ＨＥＭＡ等が挙げられる。このようなバインダーを利用することによって、基材に固定化された針状体に、細胞内導入因子を固定化しようとした場合に、細胞内導入因子の針状体以外の部分（例えば、基材）への結合や吸着を抑制することができ、針状体に固定化されない細胞内導入因子のロスを抑制することができる。また、バインダーには細胞表面タンパクと相互作用する分子を含ませることができる。このような分子として、例えば、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン、カドヘリン又はそれらの断片等が挙げられ、これらの一又は複数の組み合わせを利用することができる。このような分子は例えばバインダー成分と予め混合した後に基材上に一緒に塗布されてもよいし、あるいは基材上のバインダーに対して塗布されてもよく、簡便な方法で含ませることができる。このような分子を利用することによって、細胞を処理する際、通常の培養環境から変化することによる細胞の状態の悪化を抑制することができる。
　あるいは別の態様において、基材表面への針状体の固定化は、基材と針状体（もしくは針状部）を一体成形又は一体加工により製造することによって行うことができる。これは例えば、従来公知の手法（例えば、特開２００６－２４６７３１号公報、特開２０１３－１８３７０６号公報、特開２００６－１６６８８４号公報）に準じた、フォトリソグラフィー、ドライエッチング、ウェットエッチング、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される一又は複数の手法を用いて行うことができる。
　基材の表面には、固定化された針状体と共に細胞を収容することが可能な、微細凹凸構造が形成されていてもよい。微細凹凸構造は、細胞を収容して側壁（例えば、凹部の内壁）と底部により保持し、細胞の横方向への動き（例えば、基材の表面に対する水平方向の動き）を制限して、細胞の横方向への動きに伴い生じ得る、針状体による大きな損傷（例えば、切断、切り裂き等）を低減又は防止することができる。本発明において「微細凹凸構造」の形状は、前記効果を奏することが可能な形状であればよく特に限定されないが、例えば、球冠状、擂り鉢状（円錐状、角錐状）、筒状（円柱状、角柱状等）等の形状に窪んだ形状（凹部）を有する。この凹部の底部には、針状体が配置・固定化される。凹部の大きさは、前記効果を奏することが可能な大きさであればよく特に限定されないが、例えば、開口部の直径もしくは対角線の長さが１～５００μｍ、深さ１～５００μｍ程度とすることができる。各凹部には一個の細胞が収容されてもよいし、複数個の細胞が収容されてもよい。
　なお、本明細書中、「基材に固定化された形態」の針状体（針状粒子）を、「細胞処理用複合基材」と称する場合がある。
　本発明において針状体には、「細胞内導入因子」が固定化されている。
　本発明の一実施形態において、「細胞内導入因子」としては、細胞内分子に結合可能な結合体が挙げられる。「細胞内分子に結合可能な結合体」は、導入された細胞内において標的とする細胞内分子と結合、好ましくは選択的に結合、より好ましくは特異的に結合して複合体を形成可能なものであればよく、標的とする細胞内分子に応じて適宜選択することができる。このような結合体としては例えば、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド等）、タンパク質（抗体、抗原、酵素、基質、補酵素、リガンド、受容体、複合体のサブユニット、またはそれらの断片等）、ペプチド、低分子化合物等（例えば、Ｙ－２７６３２、Ｚ－ＶＡＤ－ＦＭＫ等）が挙げられるが、これらに限定はされない。本発明において「細胞内分子に結合可能な結合体」は、それ自体が任意の遺伝子の発現に直接影響を与えるものではないものが好ましい。ここで「直接影響を与えるものではない」とは、当該結合体の導入に起因して、細胞内の任意のシグナル伝達経路が直接活性化されないことを意味する。好ましくは、本発明において「細胞内分子に結合可能な結合体」は、標的とする細胞内分子と結合、好ましくは選択的に結合、より好ましくは特異的に結合することができる抗体又はその断片である。抗体の「断片」としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ジアボディー、ｓｃ（Ｆｖ）2等が挙げられ、これらフラグメントの多量体（例えば、ダイマー、トリマー、テトラマー、ポリマー）も本発明において利用することができる。
　本発明のまた別の態様において、「細胞内導入因子」としては、導入された細胞内において任意の機能を発揮するもの、又は任意の機能を発揮すると予測されるものが挙げられる。このような因子としては例えば、生理活性物質等が挙げられる。「生理活性物質」としては、例えば、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド等）、プラスミド、ウイルス粒子、染色体等；タンパク質、アミノ酸、オリゴペプチド、ポリペプチド、マルチサブユニットタンパク質；糖類、多糖、脂肪酸、コレステロール、脂質、シグナル伝達物質、リガンド物質、ホルモン物質、サイトカイン、イオン、金属粒子、磁性微粒子、無機化合物、量子ドット、有機化合物、薬剤等からなる群から選択される一又は複数の物質が挙げられるが、これらに限定はされない。
　本発明において「針状体」と「細胞内導入因子」との結合（固定化）方法は、用いる「細胞内導入因子」の種類に応じて、適宜選択することができる。用いる「細胞内導入因子」が、上述の「細胞内分子に結合可能な結合体」である場合には、針状体と前記結合体との結合（固定化）は、針状部を細胞へ挿入、その後引き抜いた際においても、当該結合が維持されている強度があればよく、当業者に周知の方法を用いて行うことができる。当該結合方法としては例えば、物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法等が挙げられるが、好ましくは共有結合法である。例えば、共有結合法は前記結合体がタンパク質やペプチドである場合、針状部の表面の官能基（例えば、ヒドロキシ基、アミノ基、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル基、スルフヒドリル基、エポキシ基、ビニル基等）とタンパク質やペプチドのカルボキシ末端とを化学的に反応させてエステル結合又はアミド結合等を形成させることにより行うことができる。必要に応じて、針状部の表面は官能基を導入するために処理することが可能であり、これは例えば、ポリリジン、ポリエチレンイミンビニルトリアルコキシシラン、３－メルカプトプロピルトリアルコキシシラン、アミノアルキルトリアルコキシシラン、エポキシ含有アルキルトリアルコキシシラン等を用いて行うことができる。
　針状粒子と細胞内分子に結合可能な結合体との結合（固定化）は、互いに直接結合されていてもよいし、あるいは、リンカーを介して間接的に結合されていてもよい。
　また、用いる「細胞内導入因子」が、上述の「生理活性物質」である場合には、少なくとも針状部を細胞へ挿入するまでは両者の結合（固定化）が維持される一方で、細胞内においては結合が分離／切断され、当該因子の細胞内への放出を可能とする結合が好ましい。このような結合方法としては例えば、静電気的結合；疎水性相互作用による結合；キレート結合；ジスルフィド結合（Ｓ－Ｓ結合）等の細胞内で切断され得る共有結合；光切断リンカーを介した結合；エステラーゼ等の酵素認識配列を有するリンカー（酵素切断リンカー）を介した結合等が挙げられ（これらに限定はされない）、当業者に周知の方法を用いて行うことができる（特開２００６－１６６８８４号公報等）。
　一つの針状体に固定化されている細胞内導入因子は全て同じものであってもよいし、複数種の異なる細胞内導入因子が固定化されていてもよい。また、複数の針状体について、全て同じ細胞内導入因子が固定化されていてもよいし、あるいは、針状体ごとに異なる細胞内導入因子が固定化されていてもよい。
　本発明において、針状体には予め所定の細胞内導入因子が固定化されていてもよいし、あるいは、使用に際して、針状体に所望の細胞内導入因子を上述のとおり固定化した後に用いてもよい（すなわち、提供時の針状体には予め所定の細胞内導入因子が固定化されていなくてもよい）。
　細胞内導入因子が固定化されている針状体は、細胞内反応を制御するために用いることができ、細胞内反応が制御された改変細胞の製造方法において使用することができる。以下、特に言及しない限り、針状体は複数の針状体を意味する。
　本製造方法は、
　細胞内導入因子が固定化されている針状体と、錘を結合させた細胞とを接触させること、
　それによって前記針状体の一部分を細胞内に挿入して、前記細胞内導入因子を細胞内に導入すること、その後、
　前記針状体の一部分を前記細胞より抜き出すこと、
を含む。
　本発明において対象となる細胞は特に限定されず、接着細胞、及び浮遊細胞のいずれであってもよく、その種類は例えば、多能性幹細胞もしくはその分化誘導細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、神経幹細胞、リンパ球、神経細胞、グリア細胞、神経節細胞、膵島細胞、副腎髄質細胞、心筋細胞、肝細胞、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、筋芽細胞、網膜上皮細胞、角膜幹細胞、骨芽細胞、破骨細胞、肝細胞等が挙げられるが、これらに限定はされない。細胞の由来は特に限定されず、例えば、ヒト、マウス、ラット、サル、イヌ、ブタ、ウシ、モルモット、ハムスター等の哺乳動物細胞を好ましく利用することができる。
　本発明において、「多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ）」とは、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）及びこれと同様の分化多能性、すなわち生体の様々な組織（内胚葉、中胚葉、外胚葉の全て）に分化する能力を潜在的に有する細胞を指す。ＥＳ細胞と同様の分化多能性を有する細胞としては、「人工多能性幹細胞」（「ｉＰＳ細胞」とも称される場合がある）が挙げられる。好ましくは、本発明において、多能性幹細胞とはヒト多能性幹細胞である。「人工多能性幹細胞」とは、哺乳動物体細胞又は未分化幹細胞に、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ－Ｍｙｃ等の特定の因子（核初期化因子）を導入して再プログラミングすることにより得られる細胞を指す。また、上述の多能性幹細胞の「分化誘導細胞」とは、多能性幹細胞を分化誘導して得られた所定の表現型やマーカーの発現により特徴付けられる細胞を意味する。「マーカー」とは、「マーカータンパク質」、「マーカー遺伝子」など、所定の細胞型により特異的に発現される細胞抗原又はその遺伝子を意味する。
　本発明において細胞は、生体より採取された細胞であってもよいし、培養細胞であってもよく、さらにこれら細胞を凍結融解した細胞であってもよい。細胞は、解離又は分散した状態のものを使用するのが好ましい。
　本態様において細胞には、錘を結合する。錘を結合することによって細胞の重量が増し、細胞と針状体との接触時の衝撃を高めて、針状体の針状部が細胞内へ挿入されるのを容易にする（すなわち、挿入確率を高める）ことができる。「錘」としては、樹脂、金属、磁性物質、及びそれらの組み合わせ等からなるから群から選択される一又は複数を用いることができる。錘の形態は特に限定されないが、例えばビーズ状の形態とすることができる。例えば、本発明においては、ダイナビーズ（登録商標、株式会社ベリタス）等の磁気ビーズを、細胞の「錘」として好適に利用することができる。細胞と錘との結合は、当業者に周知の方法を用いて行うことができ、例えば、抗体又はその断片、アビジン・ビオチン、ストレプトアビジン・ビオチン等の一又は複数を用いて行うことができる。
　細胞内への、針状体の針状部の挿入は、細胞と針状体とを接触させることにより行うことができる。この細胞と針状体との接触は、細胞に針状体（針状粒子の形態）を添加することによって（又は、針状体に細胞を添加することによって）、あるいは基材に固定化された形態の針状体（細胞処理用複合基材）に細胞を添加することによって行うことができる。必要に応じて、細胞と針状体との接触には、外力を加えてもよい。ここで「外力」とは、細胞及び／又は針状体に加えられる力を意味し、遠心力、磁力、静電相互作用、水流（水圧）等が挙げられ、これらより選択される一又は複数を用いることができる。遠心は細胞に損傷を与えない条件であればよく、例えば、１００～３００００ｇにて３０～６００秒行うことができる。水流（水圧）はピペッティング操作によりもたらすことができる。外力を用いることによって、細胞と針状体との接触時の衝撃を高めて、針状体の針状部が細胞内へ挿入されるのを容易にする（すなわち、挿入確率を高める）ことができる。
　細胞内への針状粒子の針状部の挿入は、培養培地中にて行えばよく、細胞培養環境下にて行うことが好ましく、例えば、３７℃、５％ＣＯ2の培養条件を維持しながら行うことができる。挿入時間が短い場合には、室温、大気環境下等で行うことも可能である。
　そして、針状体に固定化されている細胞内導入因子が、前記「細胞内分子に結合可能な結合体」である場合には、細胞内への針状体の針状部の挿入は、細胞内において挿入した針状体に固定化された前記結合体と、細胞内の目的とする細胞内分子とが結合するのに十分な時間維持されればよく、この時間は前記結合体や目的とする細胞内分子の種類に応じて、当業者が適宜設定することが可能であるが、例えば、１～１２０分間、好ましくは５～６０分間、より好ましくは３０分間程度とすることができる。
　その後、針状部を前記結合体に結合した目的とする細胞内分子と共に、細胞より抜き出すことによって、当該細胞内において目的とする細胞内分子の量を低減、又は消失させることができ、これにより当該細胞内分子の機能が除去、又は低減された改変細胞を得ることができる。
　また、針状体に固定化されている細胞内導入因子が、前記「生理活性物質」である場合には、細胞内への針状体の針状部の挿入は、細胞内において針状体に固定化された前記生理活性物質が針状体より放出されるのに十分な時間維持されればよく（必要に応じて、結合の切断処理を行う）、この時間は前記生理活性物質等や結合の種類に応じて、当業者が適宜設定することが可能であるが、例えば、１～１２０分間、好ましくは５～６０分間、より好ましくは３０分間程度とすることができる。
　その後、針状部を細胞より抜き出し、前記生理活性物質は細胞内に残留させることによって、当該細胞内において前記生理活性物質の量を増加させることができ、これにより当該生理活性物質の機能が導入、又は増強された改変細胞を得ることができる。
　細胞からの針状部の抜き出しは、外力を加えて、接触している細胞と針状体とを引き離すことによって行うことができる。ここで「外力」とは上記定義のものを用いることができる。
　本方法において、細胞内への針状体の針状部の挿入、及び細胞からの針状部の抜き出しの工程は、同一の細胞に対して一又は複数回行うことができる。ここで「複数回」とは、２回以上、３回以上、４回以上、又は５回以上であり、その上限は特に限定されないが、細胞の負担を低減し、その生存状態及び生理状態を良好に保つとの観点から、１５回以下、又は１０回以下が好ましい。また、ここで「複数回行う」とは、連続して前記工程を複数回行う場合だけでなく、一定の時間間隔をおいて前記工程を複数回行う場合も意味する。
　得られる改変細胞は、導入した細胞内導入因子の機能に応じて様々である。導入した細胞内導入因子が、前記「細胞内分子に結合可能な結合体」であり、例えば、前記結合体と結合する細胞内分子が細胞の活性化を抑制又は阻害する機能を有する因子である場合には（例えば、Ｔ細胞におけるＣＩＮ８５、Ｓｔｓ－２、Ｃｂｌ等のような因子（Ｍｅｉ　Ｓｕｅｎ　Ｋｏｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　０５　Ｆｅｂ　２０１９：Ｖｏｌ．１２，Ｉｓｓｕｅ　５６７，ｅａａｖ４３７３））、当該因子の機能を除去、又は低減することにより、当該因子の細胞内反応が制御された、すなわち、活性化された改変細胞を得ることができる。また、例えば、前記結合体と結合する細胞内分子が細胞の分化誘導を抑制又は阻害する機能を有する因子である場合には、当該因子の機能を除去、又は低減することにより、当該因子の細胞内反応が制御された、すなわち、分化誘導された改変細胞を得ることができる（改変細胞の例はこれらに限定はされない）。
　導入した細胞内導入因子が、前記「生理活性物質」であり、例えば、それが細胞の活性化を促進する機能を有する因子である場合には、当該因子の機能を導入、又は増強することにより、当該因子の細胞内反応が制御された、すなわち、活性化が促進された改変細胞を得ることができる。また、例えば、当該生理活性物質が、細胞の分化誘導を促進する機能を有する因子である場合には、当該因子の機能を導入、又は増強することにより、当該因子の細胞内反応が制御された、すなわち、分化誘導された改変細胞を得ることができる（改変細胞の例はこれらに限定はされない）。
　得られた改変細胞は、導入した細胞内導入因子の機能を解析するために用いることができる。
　導入した細胞内導入因子の機能の解析は、上記方法により得られた改変細胞の状態を解析することにより行うことができる。解析対象となる改変細胞の状態としては、例えば、細胞の増殖速度、生存率、代謝、活性酸素種、遺伝子発現等（これらに限定はされない）が挙げられ、これらより選択される一又は複数の状態を定量・解析する。
　例えば、導入した細胞内導入因子が前記「細胞内分子に結合可能な結合体」である場合に、得られた改変細胞において、増殖速度、生存率、代謝、活性酸素種、又は遺伝子発現が、未改変の細胞と比べて、低下、抑制、又は消失している場合には、前記結合体がそのような機能を有すること、すなわち前記結合体が標的とする細胞内分子が増殖速度、生存率、代謝、活性酸素種、又は遺伝子発現の維持又は促進に寄与する機能を有すると判断することができる。あるいは、例えば、得られた改変細胞において、増殖速度、生存率、代謝、活性酸素種、又は遺伝子発現が、未改変の細胞と比べて、増加、又は誘導されている場合には、前記結合体がそのような機能を有すること、すなわち前記結合体が標的とする細胞内分子が増殖速度、生存率、代謝、活性酸素種、又は遺伝子発現を抑制又は阻害する機能を有すると判断することができる。
　あるいは、導入した細胞内導入因子が前記「生理活性物質」である場合に、得られた改変細胞において、増殖速度、生存率、代謝、活性酸素種、又は遺伝子発現が、未改変の細胞と比べて、低下、抑制、又は消失している場合には、当該生理活性物質が細胞の増殖速度、生存率、代謝、活性酸素種、又は遺伝子発現の低下、抑制、又は消失に寄与する機能を有すると判断することができる。あるいは、例えば、得られた改変細胞において、増殖速度、生存率、代謝、活性酸素種、又は遺伝子発現が、未改変の細胞と比べて、増加、又は誘導されている場合には、当該生理活性物質が増殖速度、生存率、代謝、活性酸素種、又は遺伝子発現を増加、又は誘導する機能を有すると判断することができる。
　なお、改変細胞における遺伝子発現の解析においては、解析対象となる遺伝子及びそれにコードされるタンパク質は任意のものを用いることができるが、細胞の挙動が明確となるように、前記目的とする細胞内分子や前記結合体、及び導入される前記生理活性物質とは異なるものが好ましい。
　本発明の別の実施形態において、本発明は、細胞内分子に結合可能な結合体が固定化されている針状粒子、及び当該針状粒子が基材に固定化されてなる細胞処理用複合基材に関するものである。本実施形態に関し、「針状粒子」、「細胞内分子に結合可能な結合体」、「細胞処理用複合基材」ならびに各種「固定化」方法は、上記のものを指し、上記定義にしたがうものである。本実施形態において、「針状粒子」及び「細胞処理用複合基材」は、針状粒子に予め所定の前記結合体が固定化されている形態で提供されてもよいし、あるいは、使用に際して、針状粒子に所望の前記結合体を上述のとおり固定化した後に用いてもよい（すなわち、提供時には針状粒子に予め所定の前記結合体が固定化されていなくてもよい）。
　本実施形態に関し、前記細胞内分子に結合可能な結合体が固定化されている針状粒子、ならびに前記細胞内分子に結合可能な結合体が固定化された針状粒子を備える細胞処理用複合基材は、改変細胞の製造方法において使用することができる。以下、特に言及しない限り、いずれの針状粒子も、複数の針状粒子を意味する。
　本製造方法は、以下の工程：
　前記細胞内分子に結合可能な結合体が固定化されている針状粒子の針状部、又は、前記細胞内分子に結合可能な結合体が固定化されている針状粒子を備える細胞処理用複合基材における当該針状粒子の針状部を、細胞内に挿入すること、
　細胞内において目的とする細胞内分子と前記針状粒子に固定化されている前記結合体とを結合させること、その後、
　前記針状部を、前記結合体を介して結合している前記細胞内分子と共に細胞より抜き出すこと、を含む。
　本実施形態に関し、「細胞」、細胞内への針状粒子の針状部の「挿入」、及細胞からの針状部の「抜き出し」、ならびに各種操作は、上記したとおりであり上記定義にしたがうものである。特に、細胞内への針状粒子の針状部の挿入は、細胞内において挿入した針状部に固定化された前記結合体と、細胞内の目的とする細胞内分子とが結合するのに十分な時間維持されればよく、この時間は前記結合体や目的とする細胞内分子の種類に応じて、当業者が適宜設定することが可能であるが、例えば、１～１２０分間、好ましくは５～６０分間、より好ましくは３０分間程度とすることができる。その後、針状部を前記結合体に結合した目的とする細胞内分子と共に、細胞より抜き出すことによって、当該細胞内において目的とする細胞内分子の量を低減、又は消失させることができ、これにより当該細胞内分子の機能が除去、又は低減された改変細胞を得ることができる。本実施形態によれば、簡便な操作で多数の細胞を処理することが可能であり、かつ導入された因子が操作後の細胞に残留することなく、細胞内反応を制御することができる。
　本実施形態に関し、細胞には必要に応じて、上記した「錘」を結合させてもよい。錘を結合することによって細胞の重量が増し、細胞と針状粒子との接触時の衝撃を高めて、針状粒子の針状部が細胞内へ挿入されるのを容易にする（すなわち、挿入確率を高める）ことができる。
　本実施形態に関し、得られる改変細胞は、導入した細胞内導入因子が「細胞内分子に結合可能な結合体」である場合として、上記したとおりであり上記定義にしたがうものである。また、得られる改変細胞は、目的とする細胞内分子の機能を解析するために用いることができる。本実施形態に関し、目的とする細胞内分子の機能の解析は、上記方法により得られた、当該細胞内分子の機能が除去、又は低減された改変細胞の状態を解析することにより行うことができる。解析対象となる改変細胞の状態としては、例えば、細胞の増殖速度、生存率、代謝、活性酸素種、遺伝子発現等（これらに限定はされない）が挙げられ、これらより選択される一又は複数の状態を定量・解析し、上述のとおり判断することができる。
　以下、本発明を実施例により、更に詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実験１：細胞処理用複合基材の処理による細胞の改変
１－１．細胞処理用複合基材の作製
　本実験における、針状粒子が固定化された細胞処理用複合基材の作製方法の概要を図１に示す。直鎖状低密度ポリエチレン（ＬＬＤＰＥ）製フィルムの上に、φ４ｍｍの穴を開けたＬＬＤＰＥ製フィルム（マスキング）をかぶせ、水溶性の感光性樹脂（ＢＩＯＳＵＲＦＩＮＥ（登録商標）ＡＷＰ（東洋合成製））の１％水溶液を添加した後、ポリスチレン製の円筒で余剰液を掻き出した。
　スポンジパフ（エマルジョンパクト用１０７（ＮＢＲ）（資生堂製））に針状粒子（パナテトラ（登録商標）ＷＺ－０５０１（アムテック製））を付着させ、これを用いて感光性樹脂を添加した基材表面を複数回軽く叩くことで、パナテトラのコーティングを行った。
　マスキングを剥がし、低圧水銀ランプ（ＴＵＶ１５Ｗ／Ｇ１５Ｔ８（フィリップス製））で感光性樹脂をＵＶ架橋してパナテトラを接着した。ＵＶ照射条件は距離１２ｃｍにて３０分間とした。次いで、水で洗浄し、接着が不十分な余剰パナテトラを洗い流した。
　ＬＤＰＥ製のリング型部材（内径４ｍｍ）と基材上のパナテトラコーティング済みの箇所（φ４ｍｍ）の中心をそろえて重ね合わせ、ヒートシールして、容器状の細胞処理用複合基材を作製した。
　得られた細胞処理用複合基材について観察用に一部を取り出し、その底面を切り出して超深度マルチアングル顕微鏡（ＶＨＸ－Ｄ５００（キーエンス製））で観察したところ、水溶性感光性樹脂にその一部分が埋め込まれて固定化されている針状粒子状のパナテトラのコーティングが観察された（図２）。
１－２．細胞処理用複合基材への抗体のコーティング
　上記１－１．で得られた細胞処理用複合基材に１０μｇ／ｍＬの濃度にて５０μＬの抗Ｃｂｌ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ製）を入れ、３７℃にて２時間静置して、パナテトラを抗体でコーティングした。得られた抗体コーティング細胞処理用複合基材は、６０μＬのＰＢＳ（ナカライテスク製）で２回洗浄した後に、以下の細胞処理に用いた。
１－３．細胞の調製
　ＰＢＭＣ（末梢血単核細胞，ＨａｍｅＣａｒｅ製）を解凍し、１日培養した。培地はＡＬｙＳ５０５Ｎ－７（細胞科学研究所製）に１０％ウシ胎児血清（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ製）を添加したものを使用した。
　ＰＢＭＣの活性化を促すために、細胞数と同数のＤｙｎａｂｅａｄｓ　Ｈｕｍａｎ　Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ製）を細胞培養物に加えて、４℃にて１時間反応させ、ＰＢＭＣを刺激すると共に、細胞の表面にビーズ（錘）を結合した。
１－４．細胞処理用複合基材による細胞の処理及び評価
　上記１－２．で得られた抗体コーティング細胞処理用複合基材に、上記１－３．で刺激したＰＢＭＣを、培地と共に２．５×１０5細胞個加えて、遠心（２１８８０ｇ、２３℃、３分）し、抗Ｃｂｌ抗体でコーティングされたパナテトラの針状部を当該細胞に挿入して、そのまま２３℃にて３０分間静置した。
　細胞をピペッティング操作で浮かして、細胞処理用複合基材より剥がし、９６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに回収し、培地１５０μＬを追加して、３７℃、５％ＣＯ2環境で、１日間、又は３日間培養した（実施例１）。
　一方、比較例として、抗Ｃｂｌ抗体及びパナテトラのいずれもコーティングされていない点を除いて、上記細胞処理用複合基材と同様に調製された細胞処理用複合基材、又はパナテトラが抗Ｃｂｌ抗体でコーティングされていない点を除いて、上記細胞処理用複合基材と同様に調製された細胞処理用複合基材を用いて、上記と同様に処理された細胞を用いた（前者の細胞処理用複合基材で処理した細胞を「比較例１」、後者の細胞処理用複合基材で処理した細胞を「比較例２」と記載する）。
　９６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅでの培養を開始してから１日後、及び３日後に、各細胞培養物を回収して抗ＣＤ３抗体（蛍光：ＡＰＣ－Ｃｙ７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ製）、抗ＣＤ２５抗体（蛍光：ＡＰＣ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ製）及び抗ＣＤ１３７抗体（蛍光：Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ　Ｖｉｏｌｅｔ　４２１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ製）で染色した後、フローサイトメーターＣｙｔｏＦＬＥＳ　Ｓ（Ｂｅｃｋｍａｎ　ｃｏｕｌｔｅｒ製）で各抗体の染色強度を解析した。解析にあたっては、ＣＤ３陽性集団をソートし、その中からＣＤ２５及び／又はＣＤ１３７の陽性率を算出した。また、陽性陰性判定の基準は無染色の細胞を用いた。
１－５．結果
　一般的に、ＰＢＭＣはＣＤ３刺激に基づく細胞内シグナルカスケードを経て活性化され、活性化マーカーであるＣＤ２５及びＣＤ１３７の発現が促進されることが知られている（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　２００５，５２（５），６３５－６４１;Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００８　Ｎｏｖ　３０；３３９（１）：２３－３７．）。一方、このＣＤ３刺激に基づく細胞内シグナルカスケードの一部はユビキチンリガーゼであるＣｂｌにより阻害され細胞の活性化が抑制される、すなわちＣＤ２５及びＣＤ１３７の発現が抑制されることが知られている（Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　０５　Ｆｅｂ　２０１９：Ｖｏｌ．１２，Ｉｓｓｕｅ　５６７，ｅａａｖ４３７３）。
　抗Ｃｂｌ抗体でコーティングされたパナテトラの針状部の挿入、抜去された細胞（実施例１）においては、比較例１及び比較例２と比べて、活性化してない細胞（ＣＤ２５-かつＣＤ１３７-）の割合が低下し、活ＣＤ２５+かつＣＤ１３７-、ＣＤ２５+かつＣＤ１３７+、及びＣＤ２５+かつＣＤ１３７-の表現型で表される活性化された細胞の割合がそれぞれ顕著に増大したことが確認された（図３）。そして、実施例１、比較例１及び比較例２いずれも活性化された細胞の割合は培養１日後より３日後の方が大きくなっており、かつ実施例１の活性化された細胞の割合は比較例１及び比較例２より高いことから、実施例１においては比較例１及び比較例２と比べて活性化の進行が早くなり、その強度も上がっていることが確認された（図３の（Ａ）対（Ｂ））。
　これらの結果は、抗Ｃｂｌ抗体でコーティングされたパナテトラの針状部をＰＢＭＣに挿入、留置し針状部の抗Ｃｂｌ抗体と細胞内のＣｂｌとを結合させ、その後、針状部が抜去された際に、抗Ｃｂｌ抗体と結合しているＣｂｌが一緒に細胞外に抜き出されたために、ＣＤ３刺激に基づく細胞内シグナルカスケードにおけるＣｂｌの阻害が除去され、細胞の活性化が促進されたことを示唆する。また、当該処理によるＣｂｌの除去の影響は、一時的な効果ではなく、少なくとも３日間にわたる長期的な効果をもたらし得るものであることが確認された。
実験２：細胞に錘を結合することによる細胞処理用複合基材による処理の効率化
２－１．細胞の調製・錘の結合
　Ｊｕｒｋａｔ　Ｅ６．１（ＤＳファーマバイオメディカルより購入）を、に２％ウシ胎児血清（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ製）を添加したＡＬｙＳ５０５Ｎ－０（細胞科学研究所製）で培養した。
　細胞数と同数のＤｙｎａｂｅａｄｓ　Ｈｕｍａｎ　Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ製）を細胞培養物に加えて、４℃にて１時間反応させ、Ｊｕｒｋａｔの表面にビーズを結合させて錘とした。
２－２．細胞の遠心処理によるパナテトラ針部の挿入効率
　上記１－１．で得られた細胞処理用複合基材に、上記２－１．で調製した錘結合Ｊｕｒｋａｔを、培地（５０μＬ）と共に２．５×１０5細胞個加えた。これを遠心処理（２０００ｇ、２３℃、１分）してパナテトラの針状部を当該細胞に挿入、ピペッティングで剥がした後、再び遠心処理に付すという操作を繰り返した。遠心処理は合計で１０回行った。
　最後の（１０回目の）遠心処理の後、ピペッティングで細胞を懸濁し、等量のトリパンブルー溶液（富士フイルム和光純薬製）と混合した。血球計数盤にセットして顕微鏡で観察し、染色された細胞を死細胞、染色されなかった細胞を生細胞としてそれぞれ計数し、その値から生細胞率を算出した（実施例Ｅ）。
　一方、比較例として、パナテトラがコーティングされていない点を除いて、上記細胞処理用複合基材と同様に調製された細胞処理用複合基材を用いた以外は、上記実施例Ｅと同様に処理された細胞の生存率（比較例Ｆ）を用いた。
　また、錘を結合していないＪｕｒｋａｔを用いた以外は、上記実施例Ｅと同様に処理された細胞の生存率（比較例Ｃ）、錘を結合していないＪｕｒｋａｔを用いた以外は、上記比較例Ｆと同様に処理された細胞の生存率（比較例Ｄ）を用いた。
　さらに、加える細胞数を４倍に増やした以外は上記比較例Ｃと同様に処理された細胞の生存率（参考例Ａ）、加える細胞数を４倍に増やした以外は上記比較例Ｄと同様に処理された細胞の生存率（参考例Ｂ）を用いた。
２－３．結果
　繰り返しの遠心処理後の、各細胞の生存率を図４に示す。
　錘を結合させた細胞を遠心処理により細胞処理用複合基材と作用させた場合の細胞の生存率（実施例Ｅ、８１％）は、当該細胞をパナテトラがコーティングされていない細胞処理用複合基材と作用させた場合の生存率（比較例Ｆ、９５．９％）と比べて低いことが確認された。この生存率の低下は、繰り返しの遠心処理によりパナテトラの針状部が細胞に繰り返し挿入されたことによるものであるといえる。すなわち、当該生存率の低下は、細胞へのパナテトラの針状部の挿入が成功したことを示すものであり、当該生存率が低いほど、細胞へのパナテトラの針状部の挿入効率が高いことを意味する。
　一方、錘を結合させていない細胞を遠心処理により細胞処理用複合基材と作用させた場合の細胞の生存率（比較例Ｃ、９５．７％）は、当該細胞をパナテトラがコーティングされていない細胞処理用複合基材と作用させた場合の生存率（比較例Ｄ、９８．９％）と比べると低いものの、錘を結合させた細胞を用いた場合の生存率（実施例Ｅ、８１％）と比べると高いものであった。この結果は、細胞に錘を付けることによって、遠心処理により細胞をパナテトラの針状部へ押し付ける力を高め、当該針状部の細胞への挿入を容易にしたことが示唆される。
　また、錘を結合させていない細胞であってもその細胞数を増大させる場合には（参考例Ａ、８１．１％）、錘を結合させた細胞を用いた場合と同程度の生存率が得られることが確認された。ただし、細胞数が多い場合には、実用上は処理効率が下がることがあり、好ましくない場合がある。
実験３：細胞処理用複合基材の処理による間葉系幹細胞の改変
１－１．細胞処理用複合基材の作製
　直鎖状低密度ポリエチレン（ＬＬＤＰＥ）製フィルムの上に、φ４ｍｍの穴を開けたＬＬＤＰＥ製フィルム（マスキング）をかぶせ、水溶性の感光性樹脂（ＢＩＯＳＵＲＦＩＮＥ（登録商標）ＡＷＰ（東洋合成製））の２％水溶液を添加した後、シリコン製のヘラで余剰液を掻き出した。
　針状粒子（パナテトラ（登録商標）ＷＺ－０５０１Ｌ（アムテック製）；平均針長さ２０μｍ）の５％エタノール分散液を上記基材に滴下し、バーコーター（Ｎｏ．２０）を用いて、パナテトラのコーティングを行った。
　マスキングを剥がし、低圧水銀ランプ（ＴＵＶ１５Ｗ／Ｇ１５Ｔ８（フィリップス製））で感光性樹脂をＵＶ架橋してパナテトラを接着した。ＵＶ照射条件は距離１２ｃｍにて３０分間とした。次いで、水で洗浄し、接着が不十分な余剰パナテトラを洗い流した。
　ＬＤＰＥ製のリング型部材（内径４ｍｍ）と基材上のパナテトラコーティング済みの箇所（φ４ｍｍ）の中心をそろえて重ね合わせ、ヒートシールして、容器状の細胞処理用複合基材を作製した。
３－２．細胞処理用複合基材への抗体のコーティング
　上記３－１．で得られた細胞処理用複合基材に４０μｇ／ｍＬの濃度にて２５μＬの抗ＧＳＫ３β抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ製）を入れ、３７℃にて３時間静置して、パナテトラを抗体でコーティングした。得られた抗体コーティング細胞処理用複合基材は、６０μＬのＰＢＳ（ナカライテスク製）で１回洗浄した後に、以下の細胞処理に用いた。
３－３．細胞の準備
　ＭＳＣ（間葉系幹細胞、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ製）を解凍し、１５日間培養した。培地はＣｅｌｌａｒｔｉｓ（登録商標）　ＭＳＣ　Ｘｅｎｏ－Ｆｒｅｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｕｍ（タカラバイオ製）を使用した。
３－４．細胞処理用複合基材による間葉系幹細胞の処理及び評価
　上記３－２．で得られた抗体コーティング細胞処理用複合基材に、上記３－３．で用意したＭＳＣを、培地と共に１．０×１０5細胞個加えて、遠心（２０００ｇ、４℃、３分）し、抗ＧＳＫ３β抗体でコーティングされたパナテトラの針状部を当該細胞に挿入して、そのまま３７℃にて３０分間静置した。
　細胞をピペッティング操作で浮かして、細胞処理用複合基材より剥がし、４８ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに回収し、間葉系幹細胞神経細胞分化培地５００μＬに置換して、３７℃、５％ＣＯ2環境で、３日間培養した（実施例２）。
　一方、比較例として、抗ＧＳＫ３β抗体がコーティングされていない点を除いて、上記細胞処理用複合基材と同様に調製された細胞処理用複合基材を用いて処理した細胞を「比較例３」、パナテトラ及び抗ＧＳＫ３β抗体がコーティングされていない点及び基材上で遠心する際の培地に抗ＧＳＫ３β抗体を１μｇ相当添加した点を除いて、上記細胞処理用複合基材と同様に調製された細胞処理用複合基材を用いて、上記と同様に処理された細胞を「比較例４」、パナテトラ及び抗ＧＳＫ３β抗体がコーティングされていない点を除いて、上記細胞処理用複合基材と同様に調製された細胞処理用複合基材を用いて、上記と同様に処理された細胞を「比較例５」と記載する。
　４８ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅでの培養を開始してから３日後に、各細胞培養物を回収して抗ＣＤ５６抗体（蛍光：ＢＶ４２１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ製）、で染色した後、フローサイトメーターＣｙｔｏＦＬＥＳ　Ｓ（Ｂｅｃｋｍａｎ　ｃｏｕｌｔｅｒ製）で染色強度を解析した。解析にあたっては、ＣＤ５６の陽性率を算出した。また、陽性陰性判定の基準はアイソタイプ抗体（蛍光：ＢＶ４２１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ製）を同条件で作用した細胞を用いた。
３－５．結果
　詳細な機序は明確でないが、ＭＳＣは市販の神経細胞分化培地を用いることで神経細胞への分化が進行し、神経細胞マーカーであるＣＤ５６の発現が促進されることが知られている。一方、体性幹細胞の神経細胞分化に関わる細胞内シグナルカスケードの一部はＧＳＫ３βにより阻害され細胞の分化が抑制される、すなわちＣＤ５６の発現が抑制されることが知られている（Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　２０１２　３６，　９６７－９７２）。
　抗ＧＳＫ３β抗体でコーティングされたパナテトラの針状部の挿入、抜去された細胞（実施例２）においては、比較例３、比較例４及び比較例５と比べて、ＣＤ５６+の表現型で表される分化した細胞の割合が増大したことが確認された（図５）。
　これらの結果は、抗ＧＳＫ３β抗体でコーティングされたパナテトラの針状部をＭＳＣに挿入、留置し針状部の抗ＧＳＫ３β抗体と細胞内のＧＳＫ３βとを結合させ、その後、針状部が抜去された際に、抗ＧＳＫ３β抗体と結合しているＧＳＫ３βが一緒に細胞外に抜き出されたために、細胞内シグナルカスケードにおけるＧＳＫ３βの阻害が除去され、神経細胞への分化が促進されたことを示唆する。
　上述の実験１、２及び３の結果より、細胞内導入因子が固定化されている針状粒子を、鉛を結合させた細胞に接触させることにより、簡便かつ効率的な操作で多数の細胞に細胞内導入因子を導入・作用させることができ、細胞内反応を制御できることが確認された。

 

Claims (42)

  1. 　細胞内導入因子が固定化されている針状体と、錘を結合させた細胞とを接触させ、前記針状体の一部分を前記細胞内に挿入して、前記細胞内導入因子を前記細胞内に導入する工程、ならびに、
    　前記針状体の一部分を前記細胞より抜き出す工程、
    を含む、改変細胞の製造方法。
  2. 　前記錘が、樹脂、金属、磁性物質、及びそれらの組み合わせからなるから群から選択される一又は複数の物質である、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記錘がビーズ状の形態を有する、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　前記針状体の一部分を細胞内へ挿入する、及び／又は細胞より抜き出す工程が、遠心力、磁力、水流、水圧、及び静電相互作用からなる群から選択される一又は複数の外力を用いて行われる、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 　前記細胞内導入因子が、細胞内分子に結合可能な結合体であり、前記針状体を前記細胞より抜き出して、前記細胞内において前記結合体に結合した細胞胞内分子を前記針状体と共に、前記細胞より抜き出すことを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 　前記結合体が、核酸、タンパク質、ペプチド、又は低分子化合物である、請求項５に記載の方法。
  7. 　前記結合体が抗体又はその断片である、請求項５又は６に記載の方法。
  8. 　前記細胞内導入因子が生理活性物質であり、前記針状体を前記細胞より抜き出して、前記細胞内導入因子を前記細胞内に残留させることを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  9. 　前記生理活性物質が、核酸、ペプチド、タンパク質、糖類、多糖、脂肪酸、コレステロール、脂質、シグナル伝達物質、リガンド物質、ホルモン物質、サイトカイン、イオン、金属粒子、磁性微粒子、無機化合物、量子ドット、有機化合物及び薬剤からなる群から選択される一又は複数の物質である、請求項８に記載の方法。
  10. 　前記生理活性物質と前記針状体との間の結合が、細胞内で分離可能な結合である、請求項８又は９に記載の方法。
  11. 　前記細胞内導入因子と前記針状体との間の結合が、静電気的結合、疎水性相互作用による結合、キレート結合、細胞内で切断される共有結合、光切断リンカーを介した結合、酵素切断リンカーを介した結合からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１０に記載の方法。
  12. 　前記針状体が針状粒子である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 　前記針状粒子の針状部の長さが１～５０μｍである、請求項１２に記載の方法。
  14. 　前記針状粒子が酸化亜鉛である、請求項１２又は１３に記載の方法。
  15. 　前記針状体が基材に固定化された形態を有する、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 　前記基材がその表面にバインダーを有し、前記針状体の一部分が前記バインダーにより前記基材に固定化されている、請求項１５に記載の方法。
  17. 　前記バインダーが、タンパク非吸着性材料からなる、請求項１６に記載の方法。
  18. 　前記針状体が、フォトリソグラフィー、ドライエッチング、ウェットエッチング、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される一又は複数を用いて製造されたものである、請求項１５に記載の方法。
  19. 　前記基材の前記針状体を有する面に、細胞を収容できる微細凹凸構造を有する、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 　請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法により製造された改変細胞の状態を解析する工程を含む、前記細胞内導入因子の機能を解析する方法。
  21. 　前記改変細胞の状態を解析する工程が、細胞の増殖速度、生存率、代謝、活性酸素種の定量、遺伝子発現からなる群から選択される一又は複数について解析する、請求項２０に記載の方法。
  22. 　細胞内分子に結合可能な結合体が固定化されている針状粒子。
  23. 　前記針状粒子の針状部の長さが１～５０μｍである、請求項２２に記載の針状粒子。
  24. 　前記針状粒子が酸化亜鉛である、請求項２２又は２３に記載の針状粒子。
  25. 　前記結合体が、核酸、タンパク質、ペプチド、又は低分子化合物である、請求項２２～２４のいずれか一項に記載の針状粒子。
  26. 　前記結合体が抗体又はその断片である、請求項２５に記載の針状粒子。
  27. 　針状粒子が基材に固定化されてなる細胞処理用複合基材。
  28. 　前記針状粒子の針状部の長さが１～５０μｍである、請求項２７に記載の細胞処理用複合基材。
  29. 　前記針状粒子が酸化亜鉛である、請求項２７又は２８に記載の細胞処理用複合基材。
  30. 　前記基材が樹脂からなる、請求項２７～２９のいずれか一項に記載の細胞処理用複合基材。
  31. 　前記基材がその表面にバインダーを有し、前記針状粒子の一部分が前記バインダーにより前記基材に固定化されている、請求項２７～３０のいずれか一項に記載の細胞処理用複合基材。
  32. 　前記バインダーが、タンパク非吸着性材料からなる、請求項３１に記載の細胞処理用複合基材。
  33. 　前記基材の前記針状粒子が固定化されている面に、細胞を収容できる微細凹凸構造が形成されている、請求項２７～３２のいずれか一項に記載の細胞処理用複合基材。
  34. 　前記針状粒子に細胞内分子に結合可能な結合体が固定化されている、請求項２７～３３のいずれか一項に記載の細胞処理用複合基材。
  35. 　前記結合体が、核酸、タンパク質、ペプチド、又は低分子化合物である、請求項３４に記載の細胞処理用複合基材。
  36. 　前記結合体が抗体又はその断片である、請求項３５に記載の細胞処理用複合基材。
  37. 　請求項２２～２６のいずれか一項に記載の針状粒子、又は請求項３４～３６のいずれか一項に記載の細胞処理用複合基材における針状粒子の一部分を細胞内に挿入する工程、
    　細胞内分子と前記針状粒子に固定化されている前記結合体とを結合させる工程、ならびに、
    　前記針状粒子を、前記結合体を介して結合している前記細胞内分子と共に、前記細胞より抜き出す工程、
    を含む、
    　前記細胞内分子の機能が除去、又は低減された改変細胞の製造方法。
  38. 　前記改変細胞が、前記細胞内分子の機能を解析するために用いられる、請求項３７に記載の方法。
  39. 　前記針状粒子の一部分を細胞内へ挿入する、及び／又は細胞より抜き出す工程が、遠心力、磁力、水流、水圧、及び静電相互作用からなる群から選択される一又は複数の外力を用いて行われる、請求項３７又は３８に記載の方法。
  40. 　請求項２２～２６のいずれか一項に記載の針状粒子、又は請求項３４～３６のいずれか一項に記載の細胞処理用複合基材における針状粒子の一部分を細胞内に挿入する工程、
    　細胞内分子と前記針状粒子に固定化されている前記結合体とを結合させる工程、
    　前記針状粒子を、前記結合体を介して結合している前記細胞内分子と共に、前記細胞より抜き出す工程、ならびに、
    　前記細胞の状態を解析する工程、
    を含む、
    　前記細胞内分子の機能を解析する方法。
  41. 　細胞の状態を解析する工程が、細胞の増殖速度、生存率、代謝、活性酸素種の定量、遺伝子発現からなる群から選択される一又は複数について解析する、請求項４０に記載の方法。
  42. 　前記針状粒子の一部分を細胞内へ挿入する、及び／又は細胞より抜き出す工程が、遠心力、磁力、水流、水圧、及び静電相互作用からなる群から選択される一又は複数の外力を用いて行われる、請求項４０又は４１に記載の方法。

     
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