WO2023003025A1 - 網膜組織の製造方法 - Google Patents

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    • C12N2535/00—Supports or coatings for cell culture characterised by topography
    • C12N2535/10—Patterned coating
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2539/00—Supports and/or coatings for cell culture characterised by properties
    • C12N2539/10—Coating allowing for selective detachment of cells, e.g. thermoreactive coating

Definitions

  • the present disclosure includes methods of producing retinal tissue, retinal tissue produced by said method, compositions comprising said retinal tissue, and the like.
  • Serum-free Floating culture of Embryoid Body-like aggregates with quick reaggregation is a culture medium that does not contain components that inhibit neuronal differentiation, such as serum and transcription factors. It is a method of differentiating into cells of the central nervous system by culturing them in suspension for several days, and is also applied to the formation of retinal tissue from pluripotent stem cells.
  • the SFEBq method reproduces the process of ontogeny in vitro by utilizing self-organization by cells, and is capable of stably and reproducibly producing three-dimensional tissue.
  • the SFEBq method relies on self-organization of cells, the pattern formation process is not constant, and it is difficult to control the morphology and size of the tissue.
  • the thickness of the obtained cell mass due to the thickness of the obtained cell mass, it is difficult for the drug to permeate the cells inside, making it difficult to observe the cells inside.
  • the SFEBq method is considered unsuitable for automation. Therefore, there is a need for a more suitable method for stable supply and automated production of retinal tissue.
  • the present disclosure aims to provide a method for producing retinal tissue.
  • the present disclosure also aims to provide retinal tissue produced by said method and compositions comprising said retinal tissue.
  • the present disclosure provides a culture substrate having, on its surface, a region A having cell adhesiveness and a region B adjacent to at least a part of said region A and having lower cell adhesion than said region A.
  • area A it relates to a method for producing retinal tissue, including inducing differentiation of pluripotent stem cells into retinal tissue.
  • the present disclosure relates to retinal tissue produced by the method.
  • the present disclosure relates to a composition comprising said retinal tissue.
  • the present disclosure provides a method for producing retinal tissue, retinal tissue produced by the method, and a composition comprising the retinal tissue.
  • FIG. 1 shows an experimental scheme for retinal differentiation induction.
  • FIG. 2 shows gene ontology (GO) analysis of patterned cultured cells before addition of BMP4 (Day 8).
  • FIG. 3 shows GO analysis of cells not subjected to patterning culture before addition of BMP4 (Day 8).
  • FIG. 4 shows the time course of GFP (Rx::venus) expression in cells induced to differentiate into retina by patterning culture (top) and cells induced to differentiate into retina without patterning culture (bottom).
  • FIG. 5 shows Chx10 expression (upper) and GFP expression (lower) on Day 18 of patterned cultured cells (Patterning) and non-patterned cultured cells (All). The results of BMP4-added cells (BMP+) and BMP4-free cells (BMP-) are shown.
  • FIG. 6 shows the expression of GFP (Rx::venus) and Chx10 on Day 18 in cells induced to undergo retinal differentiation by patterning culture.
  • FIG. 7 shows the expression of GFP (Rx::venus), Recoverin, and Chx10 on Day 58 in cells induced to undergo retinal differentiation by patterning culture.
  • FIG. 8 shows the expression of GFP (Rx::venus) and FOXG1 on Day 18 in patterned cultured cells without BMP4 addition.
  • FIG. 9 shows differentiation induction efficiency of cells retinal differentiation induced by patterning culture.
  • FIG. 10 shows GFP expression on Day 20 of cells patterned and cultured in various sizes.
  • FIG. 11 shows Crx expression in Day40 tissues.
  • FIG. 12 shows induction of retinal differentiation by patterning culture using KthES11 cells.
  • FIG. 13 shows induction of retinal differentiation by patterned culture using 201B7 cells (top) and 253G1 cells (bottom). Expression of Crx and Chx10 on Day34 is shown.
  • FIG. 14 shows GFP expression on Day 11 when LDN-193189 was added (top) and when LDN-193189 was not added (bottom).
  • FIG. 15 shows Chx10 expression (upper) and GFP expression (lower) in patterned cultured cells (Patterning) and non-patterned cultured cells (All) with and without addition of LDN-193189. The results of Day 18 are shown.
  • FIG. 14 shows induction of retinal differentiation by patterned culture using 201B7 cells (top) and 253G1 cells (bottom). Expression of Crx and Chx10 on Day34 is shown.
  • FIG. 14 shows GFP expression on Day 11 when LDN-193189 was added (top) and when LDN-193189 was not added (bottom).
  • FIG. 15 shows Chx10 expression (upper) and GFP expression (lower) in patterned cultured
  • FIG. 16 shows GFP and Chx10 expression in patterned cultured cells (Patterning) and non-patterned cultured cells (All) with and without addition of LDN-193189. Scale bar indicates 1 mm. The results of Day 18 are shown.
  • FIG. 17 shows time course of retinal differentiation induction by patterning culture using MPC polymer.
  • a method for producing a retinal tissue of the present disclosure includes a culture substrate having, on its surface, a region A having cell adhesiveness and a region B adjacent to at least a part of said region A and having lower cell adhesion than said region A. In region A above, it involves inducing differentiation of pluripotent stem cells into retinal tissue.
  • Region A is a region where pluripotent stem cells can be maintained in adherent culture.
  • region B when pluripotent stem cells are seeded in region A, during induction of differentiation into retinal tissue (that is, the period until differentiation into retinal tissue can be confirmed), in region B adjacent to region A It is a region with lower cell adhesiveness than region A to the extent that cells do not spread.
  • pluripotent stem cells were seeded in an excess amount (for example, 5 ⁇ 10 5 to 10 ⁇ 10 5 cells/cm 2 ) with respect to the area and incubated at 37°C under 5% CO 2 for 24 hours. After culturing for a period of time, it can be performed by comparing the ratio of the area to which the cells adhere.
  • the cell adhesion is usually evaluated after removing the medium after culturing for 24 hours and washing the cells with medium or buffer to remove non-adherent cells.
  • pluripotent stem cells are seeded in an excess amount (for example, 5 ⁇ 10 5 to 10 ⁇ 10 5 cells/cm 2 ) with respect to the area, and incubated at 37° C. under 5% CO 2 for 24 hours. After culturing, it can be a region where cells adhere to 70% or more, 80% or more, or 90% or more of the area.
  • region B is a cell non-adhesive region.
  • a cell non-adhesive region means that it does not have sufficient cell adhesiveness to maintain pluripotent stem cells in adherent culture.
  • Cell-non-adhesive regions are seeded with an excess amount of pluripotent stem cells (eg, 5 ⁇ 10 5 to 10 ⁇ 10 5 cells/cm 2 ) with respect to the area, and treated at 37° C., 5% CO 2 . It can be an area where cells adhere to 30% or less, 20% or less, or 10% or less of the area after 24 hours of culture under the same conditions.
  • the culture substrate may be made of any material as long as it can form regions A and B on its surface.
  • culture substrates include inorganic materials such as metal, glass, and silicone; plastics (e.g., polystyrene resin, polyethylene resin, polypropylene resin, ABS resin, nylon, acrylic resin, fluororesin, polycarbonate resin, polyurethane resin, It can be an organic material such as resin, phenolic resin, melamine resin, epoxy resin, vinyl chloride resin, polytetrafluoroethylene tetrafluoroethylene resin).
  • the culture substrate is glass or plastic, especially polystyrene resin.
  • the culture substrate is not particularly limited as long as it has a shape that is generally used for cell culture.
  • the culture substrate can be, for example, culture vessels such as petri dishes, plates, bottles, chambers, multiwell plates (e.g., 6, 12, 24, 48, 96, or 384 well plates), films, or porous membranes.
  • a culture substrate typically has a region A and a region B on the surface (in the case of a culture vessel, on the bottom surface) horizontal to the direction of gravity.
  • Region A may be a region where the surface of the cell-adhesive culture substrate is exposed. It may be a region in which the surface of the culture substrate is coated with a cell-adhesive substance.
  • Cell adhesive substances include positively charged polymers such as poly-L-lysine and poly-L-ornithine; laminin; collagens such as type I collagen, type II collagen, type III collagen, type IV collagen, type V collagen and type VII collagen.
  • vitronectin elastin; entactin; sulfated glucosaminoglycans such as chondroitin sulfate, heparan sulfate, keratan sulfate, dermatan sulfate, and proteoglycans composed of core proteins; chondroitin sulfate, heparan glucosaminoglycans such as sulfuric acid, keratan sulfate, dermatan sulfate, hyaluronic acid; Synthemax (registered trademark, vitronectin derivative), Matrigel (registered trademark), and the like.
  • sulfated glucosaminoglycans such as chondroitin sulfate, heparan sulfate, keratan sulfate, dermatan sulfate, and proteoglycans composed of core proteins
  • region A is coated with laminin.
  • Laminin is a heterotrimeric molecule consisting of three subunit chains: ⁇ -chain, ⁇ -chain and ⁇ -chain. are known to have three types, ⁇ 1 to ⁇ 3, and each laminin isoform is represented by a number indicating the constituent subunits (for example, laminin 111 is composed of ⁇ 1, ⁇ 1, and ⁇ 1 chains).
  • Laminins include laminin 111, laminin 121, laminin 211, laminin 213, laminin 222, laminin 311 (laminin 3A11), laminin 332 (laminin 3A32), laminin 321 (laminin 3A21), laminin 3B32, laminin 411, laminin 421, laminin. 423, laminin 521, laminin 522, laminin 523, or fragments thereof.
  • Laminin fragments include E8 fragments that are integrin binding site fragments, such as laminin 211-E8, laminin 311-E8, laminin 411-E8, and laminin 511-E8.
  • the laminin is laminin 511 or a fragment thereof. In further embodiments, the laminin is the laminin 511-E8 fragment.
  • Commercial products such as iMatrix-511 (Nippi. Inc.) can also be used for coating with laminin.
  • iMatrix-511 (Nippi. Inc.) contains a laminin 511-E8 fragment.
  • Region B may be a region where the surface of the culture substrate with lower cell adhesion than region A is exposed. It may be a region coated with In one embodiment, region B is coated with a cell non-adhesive substance.
  • Cell non-adhesive substances include MPC (2-methacryloyloxyethylphosphorylcholine) polymer; celluloses such as methylcellulose, hydroxyethylcellulose, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, sodium carboxymethylcellulose; polyethylene oxide; carboxyvinyl polymer; polyvinylpyrrolidone; polyethylene glycol; polyamides such as polyacrylamide and poly N-isopropylacrylamide; polysaccharides such as chitin, chitosan, hyaluronic acid, alginic acid, starch, pectin, carrageenan, guar gum, gum arabic and dextran; albumin and derivatives thereof.
  • the cell non-adhesive material include M
  • region A is not particularly limited, and examples thereof include circular, elliptical, and polygonal (eg, triangular, quadrangular, pentagonal, hexagonal, octagonal, decagonal, dodecagonal, etc.).
  • area A is circular.
  • the term “circular” means any shape that is recognized as being substantially circular in the art, and is used in the sense of a substantially circular shape including a perfect circle.
  • the area of region A can be, for example, 0.01-100 cm 2 , 0.01-30 cm 2 , 0.01-10 cm 2 , 0.03-30 cm 2 , 0.03-10 cm 2 , or 0.1-10 cm 2 , which is not limited to In certain embodiments, the area of region A is 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, or 1 cm2 or more, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 , 2, or 1 cm 2 or less.
  • the area of region A can be 0.5-10 cm 2 , 0.7-10 cm 2 , 1-10 cm 2 , 0.5-5 cm 2 , 0.7-5 cm 2 , or 1-5 cm 2 .
  • Region A has a diameter of 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, or 1 cm or more, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, or 1 It can be circular or polygonal with the same area, cm or less.
  • area A is circular with a diameter of 0.1-10 cm, 0.1-5 cm, 0.1-3 cm or 0.2-1 cm. In further embodiments, area A is circular with a diameter of 1-10 cm, 1-5 cm, or 1-3 cm.
  • region A is adjacent to region B (ie, surrounded by region B) on its entire perimeter.
  • the distance between the two regions A sandwiching the region B is, but not limited to, about 1 mm or more, for example.
  • Region A and region B may be formed on the culture substrate surface by any method used for cell patterning. Region A and region B can be formed on the culture substrate surface by techniques such as soft lithography, photolithography, and 3D printing.
  • Region A and region B can be formed by treating a portion of the surface of the culture substrate so that the treated and untreated regions have different cell adhesiveness.
  • a layer of a cell-adhesive substance or a cell-non-adhesive substance may be formed on the culture substrate, and a portion thereof may be treated to change the cell adhesiveness.
  • the treated portion may be a portion where the surface of the culture substrate is exposed, or a portion where the property of the cell non-adhesive substance or cell adhesive substance is changed by the treatment.
  • a sheet with holes of the shape and size of region A is created using a template printed with a 3D printer, the surface of the culture substrate is covered with this sheet, and the surface not covered with the sheet is coated with a cell adhesive substance. , and then by removing the sheet, area A and area B can be formed on the culture substrate.
  • a sheet having the shape and size of region A is prepared, placed on the surface of the culture substrate, the surface not covered with the sheet is coated with a cell non-adhesive substance, and then the sheet is removed and covered with the sheet.
  • Region A and region B can also be formed on the culture substrate by coating the surface with a cell-adhesive substance.
  • Sheets can be formed from biocompatible materials such as polydimethylsiloxane (PDMS), polyethylene glycol hydrogels, or agarose gels. Coating can be performed, for example, by contacting the culture substrate with a solution of a cell-adhesive substance or a cell-non-adhesive substance and reacting at 37° C. or room temperature for a required time (eg, 1 hour or longer).
  • the concentrations of the cell-adhesive substance and the cell - non - adhesive substance can be appropriately determined by those skilled in the art. It can be cm2 .
  • the culture substrate may have projections (also referred to as pillars) on its surface, and region A on the upper surface of the projections.
  • the shape of the protrusions is not particularly limited, and may be cylindrical or prismatic.
  • the cylinder is used in the sense of a column having a substantially circular cross section, including a perfect circle, as long as the cross section has a shape that is recognized as substantially circular in the art.
  • the projections are cylindrical.
  • the height of the protrusion is, but not limited to, 0.1 mm to 10 mm, 0.1 mm to 5 mm, 1 mm to 5 mm, or 3 mm to 5 mm, such as 4 mm.
  • the material of the projections may be the same as or different from that of the culture substrate.
  • As the material of the projections in addition to those exemplified herein as the material of the culture substrate, polydimethylsiloxane (PDMS), polymethyl methacrylate (PMMA), polyethylene terephthalate (PET), polyamide (PA) and poly Methylglutarimide (PMGI), polyvinyl alcohol (PVA), polyethylene glycol (PEG), polyethylene vinyl acetate (PEVA), polyethylene oxide (PEO) and the like.
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • PMMA polymethyl methacrylate
  • PET polyethylene terephthalate
  • PA polyamide
  • PMGI poly Methylglutarimide
  • PVA polyvinyl alcohol
  • PEG polyethylene glycol
  • PEVA polyethylene vinyl acetate
  • PEO polyethylene oxide
  • Pluripotent stem cells are cells that have pluripotency that can differentiate into all cells that make up an adult, and cells that have self-renewal ability that can maintain pluripotency even after cell division. means. Pluripotent stem cells may be newly established or established lines. Pluripotent stem cells include embryonic pluripotent stem cells (ES cells), embryonic germ cells (EG cells), induced pluripotent stem cells (iPS cells). The species of pluripotent stem cells is not particularly limited, but preferably mammals (e.g., humans, monkeys, mice, rats, hamsters, guinea pigs, dogs, cats, pigs, cows, goats, horses, sheep, rabbits). .
  • mammals e.g., humans, monkeys, mice, rats, hamsters, guinea pigs, dogs, cats, pigs, cows, goats, horses, sheep, rabbits).
  • the pluripotent stem cells are rodent (eg, mouse, rat, hamster, guinea pig) or primate (eg, human, monkey), preferably primate.
  • the pluripotent stem cells are monkey or human pluripotent stem cells; monkey or human ES cells or iPS cells; or human iPS cells.
  • ES cells are pluripotent stem cells derived from early embryos and can be established from the inner cell mass of blastocysts or the epiblast of early post-implantation embryos.
  • ES cells may be established cells, for example, Kh-ES-1 cells, Kh-ES-2 cells, Kh-ES-13 cells, KthES11 cells (Kyoto University Institute for Frontier Medical Sciences) available from), etc.
  • the ES cells are ES cells other than ES cells established by methods involving destruction of human embryos.
  • iPS cells are cells derived from cells other than pluripotent stem cells such as somatic cells, and may be cells produced by any method.
  • iPS cells may also be established cells, for example, 201B7 cells, 201B7-Ff cells, 253G1 cells, 253G4 cells, 1201C1 cells, 1205D1 cells, 1210B2 cells, 1231A3 cells, Ff-I01 cells, Ff -I14 cells, QHJI01 cells (available from Kyoto University or iPS Academia Japan, Inc.), and the like.
  • iPS cells are somatic cells such as fibroblasts, skin cells, blood lineage cells (e.g., peripheral blood mononuclear cells or T cells, cord blood-derived cells), Oct3/4, Sox2, Klf4, Cells produced by introducing a combination of reprogramming factors selected from Myc (c-Myc, N-Myc, L-Myc), Glis1, Nanog, Sall4, lin28, and Esrrb.
  • Preferred reprogramming factor combinations include (1) Oct3/4, Sox2, Klf4 and Myc (c-Myc or L-Myc), (2) Oct3/4, Sox2, Klf4, Lin28 and L-Myc. be done.
  • Pluripotent stem cells are usually seeded on the culture substrate in such a number that the cells occupy 70% or more of the region A.
  • Cells may be seeded only in area A, or may be seeded over the entire culture substrate including area A and area B.
  • region B is a cell non-adhesive region, it can be seeded all over the culture substrate.
  • pluripotent stem cells can be seeded at 5 ⁇ 10 5 to 10 ⁇ 10 5 cells/cm 2 .
  • a cell suspension containing enzymes e.g.
  • Pluripotent stem cells are suspended in a desired medium and the resulting cell suspension is added onto the culture substrate.
  • chelating agents e.g. ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)
  • Pluripotent stem cells are suspended in a desired medium and the resulting cell suspension is added onto the culture substrate.
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • Commercially available products such as TrypLE TM Select (Thermo Fisher Scientific) and TrypLE TM Express (Thermo Fisher Scientific) may be used as the cell dispersion.
  • Differentiation of pluripotent stem cells into retinal tissue is induced by adherent culture on the culture substrate. After seeding the pluripotent stem cells onto a culture substrate and culturing them in a medium containing an undifferentiation maintenance factor for a certain period of time, the induction of differentiation of the pluripotent stem cells into retinal tissue may be initiated.
  • the time point at which the culture in the medium containing no undifferentiation maintenance factor is started is defined as the time point at which the induction of differentiation into retinal tissue is started.
  • induction of differentiation of pluripotent stem cells into retinal tissue may be performed by any method available to those skilled in the art.
  • inducing differentiation of pluripotent stem cells into retinal tissue comprises culturing pluripotent stem cells in medium containing a BMP signaling agent.
  • inducing differentiation of pluripotent stem cells into retinal tissue comprises the steps of: (1) culturing pluripotent stem cells in a medium containing a BMP signal inhibitor, and (2) culturing the cells obtained in step (1) in a medium containing a BMP signal agonist;
  • the present disclosure provides a method for producing retinal tissue, including steps (1) and (2).
  • the culture in steps (1) and (2) is preferably adherent culture.
  • the medium used in the method of the present disclosure can be prepared using a medium commonly used for culturing animal cells as a basal medium.
  • basal media include IMDM medium, DMEM medium, F-12 medium, DMEM/F12 medium, IMDM/F12 medium, BME medium, BGJb medium, CMRL 1066 medium, Glasgow MEM (GMEM) medium, and Improved MEM Zinc Option medium.
  • GMEM Glasgow MEM
  • Improved MEM Zinc Option medium 199 medium, Eagle MEM medium, ⁇ MEM medium, Ham's medium, RPMI 1640 medium, Fischer's medium, or mixed media thereof.
  • the medium contains serum, serum substitutes, growth factors, undifferentiated maintenance factors, proteins (e.g. cytokines, insulin), fatty acids, lipids, vitamins, amino acids (e.g. non-essential amino acids, retinoids, glutamine, taurine), antioxidants.
  • proteins e.g. cytokines, insulin
  • fatty acids lipids
  • vitamins amino acids (e.g. non-essential amino acids, retinoids, glutamine, taurine), antioxidants.
  • 2-mercaptoethanol, 1-thioglycerol antibiotics, buffers, and inorganic salts added to the basal medium, if necessary.
  • Serum substitutes include, for example, albumins such as bovine serum albumin (BSA), transferrin, fatty acids, collagen precursors, trace elements, 2-mercaptoethanol, 1-thioglycerol, and equivalents thereof and mixtures thereof. mentioned.
  • the medium was KnockOut TM Serum Replacement (Thermo Fisher Scientific), Chemically Defined Lipid Concentrate (Thermo Fisher Scientific), GlutaMAX TM Supplement (Thermo Fisher Scientific), Ham's F-12 Nutrient Mix, GlutaMAX TM Supplement (Thermo Fisher Scientific), B27 Supplement (Thermo Fisher Scientific), N2 Supplement (Thermo Fisher Scientific), ITS Supplement (Thermo Fisher Scientific), etc. may also be included.
  • the medium is a commercially available basal medium supplemented with the above components, such as Ham's F-12 Nutrient Mix, GlutaMAX TM Supplement (Thermo Fisher Scientific), DMEM/F-12, GlutaMAX TM supplement (Thermo Fisher Scientific). may be KnockOut TM Serum Replacement (Thermo Fisher Scientific), Chemically Defined Lipid Concentrate (Thermo Fisher Scientific), GlutaMAX TM Supplement (Thermo Fisher Scientific), Ham's F-12 Nutrient Mix, GlutaMAX TM Supplement (
  • the medium is preferably a serum-free medium.
  • Serum-free medium means a medium that does not contain unadjusted or unpurified serum, and a medium containing purified blood-derived or animal tissue-derived components is also free unless it contains unadjusted or unpurified serum. Contained in serum medium. Serum-free media may contain serum replacement.
  • Differentiation induction is preferably performed in the absence of feeder cells (also referred to as feeder-free conditions). Differentiation induction is also preferably performed under xeno-free conditions.
  • feeder-free means not containing a component derived from a biological species different from the biological species of cells to be cultured.
  • Factors for maintaining undifferentiation include FGF signaling agents, TGF ⁇ family signaling agents and insulin.
  • FGF signaling agents include FGFs (eg, bFGF, FGF4, FGF8).
  • TGF ⁇ family signal agonists include TGF ⁇ signal agonists and Nodal/Activin signal agonists.
  • TGF ⁇ signal agonists include TGF ⁇ 1 and TGF ⁇ 2.
  • Nodal/Activin signal agonists include Nodal, ActivinA and ActivinB.
  • the undifferentiated maintenance factor preferably comprises bFGF.
  • the concentration of the factor for maintaining undifferentiation may be any concentration that can maintain the undifferentiated state of pluripotent stem cells, and can be appropriately set by those skilled in the art.
  • bFGF is used for culturing human pluripotent stem cells
  • the concentration of bFGF can be 4 ng to 500 ng/mL, 10 ng to 200 ng/mL, or 30 ng to 150 ng/mL.
  • media containing undifferentiated maintenance factors include StemFit (registered trademark) AK02N (Ajinomoto Co., Inc.), StemFit (registered trademark) AK03N (Ajinomoto Co., Inc.), S-medium (DS Pharma Biomedical Co).
  • the medium containing undifferentiated maintenance factors is StemFit® AK02N (Ajinomoto Co., Inc.).
  • Culture in a medium containing an undifferentiated maintenance factor is not limited, for example, 1 to 10 days, 1 to 9 days, 1 to 8 days, 1 to 7 days, 1 to 6 days, 1 to 5 days, 1 to 4 days, 1-3 days, or 2-3 days.
  • the medium containing the undifferentiated maintenance factor may further contain a ROCK inhibitor.
  • ROCK inhibitors include Y-27632, Fasudil (HA1077) and H-1152.
  • the concentration of the ROCK inhibitor is appropriately determined according to the type of inhibitor, for example, 1 to 100 ⁇ M, 5 to 50 ⁇ M, or about 10 ⁇ M, or a concentration corresponding to the ROCK inhibitory activity of Y-27632 at the above concentrations. is.
  • the culture period in the medium further containing the ROCK inhibitor may be part or all of the culture period in the medium containing the factor for maintaining undifferentiation. For example, cells may be cultured in a medium containing an undifferentiation maintenance factor and a ROCK inhibitor for 1 to 2 days, followed by culturing in a medium containing an undifferentiation maintenance factor and no ROCK inhibitor for 1 to 2 days.
  • BMP bone morphogenetic protein
  • BMP4 BMP7
  • BMP12 BMP12
  • BMP signaling agonists and inhibitors may be agonists and inhibitors, respectively, of one or more of these BMPs.
  • BMP signal inhibitor means a substance that inhibits signal transduction by BMP, a substance that acts on BMP or its receptor, a substance that suppresses gene expression of BMP or its receptor, binding between BMP and its receptor contains substances that inhibit BMP signaling inhibitors include LDN-193189 (4-[6-(4-Piperazin-1-ylphenyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl]quinoline), Dorsomorphin (6- [4-[2-(1-Piperidinyl)ethoxy]phenyl]-3-(4-pyridinyl)-pyrazolo[1,5-a]pyrimidine) and DMH1 (4-(6-(4-isopropoxyphenyl)pyrazolo[ 1,5-a]pyrimidin-3-yl)quinoline).
  • the BMP signaling inhibitor is LDN-193189.
  • concentration of the BMP signal inhibitor is appropriately determined according to the type of inhibitor, but for example, 1 to 1000 nM, 10 to 500 nM, 30 to 300 nM, or about 100 nM, or the BMP of LDN-193189 at the above concentrations Concentration corresponding to inhibitory activity.
  • Culturing in a medium containing a BMP signal inhibitor is not limited, but is, for example, 1 to 10 days, 2 to 9 days, 3 to 7 days, 4 to 6 days, or about 5 days.
  • BMP signal agonist means a substance that activates signal transduction by BMP, a substance that acts on BMP or its receptor, a substance that enhances gene expression of BMP or its receptor, and a substance that enhances gene expression of BMP and its receptor Includes substances that facilitate binding.
  • BMP signaling agents include BMP2, BMP4, BMP7, BMP12 (GDF7) or fragments thereof, or anti-BMP receptor antibodies.
  • the BMP signaling agonist is BMP4.
  • the concentration of the BMP signal agonist is appropriately determined according to the type of agonist, for example, 0.01 to 1000 nM, 0.1 to 100 nM, 1 to 10 nM, 1 to 3 nM, or about 1.5 nM, or the concentration is the concentration corresponding to the activity of BMP4 in .
  • Culturing in a medium containing a BMP signal agonist is carried out for the period necessary for differentiation into retinal tissue.
  • the culture period is, but not limited to, for example, 1-30 days, 2-20 days, 3-15 days, 4-12 days, or 5-10 days (e.g., 5, 6, 7, 8, 9, or 10 days). days).
  • the concentration of BMP signaling agonist can be constant or varied during the culture period.
  • the concentration of the BMP signaling agonist may be decreased stepwise, at a rate of 40-60% reduction every 2-4 days.
  • a portion (e.g., half) of the medium may be replaced with medium lacking the BMP signaling agonist.
  • the concentration of BMP signaling agonist can be decreased stepwise.
  • the medium containing the BMP signal inhibitor or agonist is added to a 1:1 mixture of F-12 medium and IMDM medium with KnockOut TM Serum Replacement (Thermo Fisher Scientific) (e.g., 0.5% to 30%, 1%-20%, or 10%), Chemically Defined Lipid Concentrate (Thermo Fisher Scientific), BSA, and 1-Thioglycerol.
  • Thermo Fisher Scientific KnockOut TM Serum Replacement
  • the medium After culturing in a medium containing a BMP signal agonist, the medium may be replaced with one that does not contain a BMP signal agonist and culture may be continued.
  • the culture period is, but not limited to, for example 1-100 days, 10-90 days, 20-80 days, 30-70 days, 40-60 days, or about 50 days.
  • Cells may be cultured in a medium containing a Wnt signal inhibitor during part or all of the culture period after culturing in a medium containing a BMP signal agonist.
  • a Wnt signal inhibitor means a substance that inhibits signal transduction by Wnt, a substance that acts on Wnt or its receptor, a substance that suppresses gene expression of Wnt or its receptor, and a binding between Wnt and its receptor.
  • Wnt signal inhibitors contains substances that inhibit Wnt signal inhibitors include CKI-7 (N-(2-Aminoethyl)-5-chloro-8-isoquinolinesulfonamide), D4476 (4-(4-(2,3-Dihydrobenzo[1,4]dioxin-6- yl)-5-pyridin-2-yl-1H-imidazol-2-yl)benzamide), IWR-1-endo (IWR1e) (4-[(3aR,4S,7R,7aS)-1,3,3a, 4,7,7a-Hexahydro-1,3-dioxo-4,7-methano-2H-isoindol-2-yl]-N-8-quinolinylbenzamide), and IWP-2 (N-(6-methyl-2- benzothiazolyl)-2-[(3,4,6,7-tetrahydro-4-oxo-3-phenylthieno[3,2-d]pyrimidin-2-yl
  • the medium may be changed as appropriate during the culture period. For example, replace some or all of the medium every 1-4 days.
  • the entire medium may be replaced with medium containing that ingredient at the desired concentration, and a portion of the medium may be replaced to bring the ingredient to the desired final concentration. (eg half the medium can be replaced with medium at twice the final concentration).
  • the concentration of a particular component can be constant or varied during culture in media containing that component.
  • the induction of differentiation of pluripotent stem cells into retinal tissue comprises (1) culturing the pluripotent stem cells in a medium containing a BMP signal inhibitor for 4-6 days, and (2) including culturing the cells obtained in step (1) in a medium containing a BMP signaling agonist for 5-10 days;
  • inducing differentiation of pluripotent stem cells into retinal tissue comprises (1) culturing the pluripotent stem cells in a medium containing a BMP signal inhibitor for 4-6 days, and (2) culturing the cells obtained in step (1) in a medium containing a BMP signaling agonist for 5 to 10 days, and Prior to step (1), culturing the pluripotent stem cells in a medium containing an undifferentiated maintenance factor and a ROCK inhibitor for 1 to 2 days, and culturing for 1-100 days in free medium.
  • inducing differentiation of pluripotent stem cells into retinal tissue comprises (1) culturing the pluripotent stem cells in a medium containing a BMP signal inhibitor for 4-6 days, and (2) culturing the cells obtained in step (1) in a medium containing a BMP signaling agonist for 5 to 10 days, and Prior to step (1), the pluripotent stem cells are cultured in a medium containing an undifferentiation maintenance factor and a ROCK inhibitor for 1-2 days, followed by 1-2 days in a medium containing an undifferentiation maintenance factor and no ROCK inhibitor. culturing for days, and culturing the cells obtained in step (2) for 1 to 100 days in a medium not containing a BMP signaling agonist.
  • Culture conditions such as culture temperature and CO 2 concentration can be appropriately set.
  • the culture temperature is, for example, 30°C to 40°C, or about 37°C.
  • the CO 2 concentration is for example 1% to 10%, or about 5%.
  • Differentiation into retinal tissue can be confirmed by detecting the expression of cell markers in cells in the tissue.
  • the expression of the marker is, for example, 10 to 100 days after induction of differentiation (e.g., , 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, or 100) or later. In certain embodiments, the expression of the markers is confirmed at 18-22 days of induction of differentiation.
  • the living retina has a layered structure and contains photoreceptor cells, horizontal cells, bipolar cells, amacrine cells, retinal ganglion cells, retinal pigment epithelial cells, Müller cells, and their progenitor cells.
  • the cells that make up the retina are referred to as “retinal cells”, and the layers that make up the retina are referred to as “retinal layers”.
  • Retinal layers in mature retinal tissue include retinal pigment epithelial layer, photoreceptor layer, outer limiting membrane, outer nuclear layer, outer reticular layer, inner nuclear layer, inner reticular layer, ganglion cell layer, nerve fiber layer and inner border. membranes.
  • Retinal tissue at developmental stages prior to maturing retinal tissue may contain a layer of neuroblasts.
  • retinal progenitor cells refers to one or more types of mature cells selected from photoreceptor cells, horizontal cells, bipolar cells, amacrine cells, retinal ganglion cells, retinal pigment epithelial cells, and Muller cells. Refers to progenitor cells that can differentiate into retinal cells.
  • neural retinal progenitor cells refers to progenitors capable of differentiating into one or more types of mature retinal cells selected from photoreceptor cells, horizontal cells, bipolar cells, amacrine cells, and retinal ganglion cells. refers to cells. Typically, neural retinal progenitor cells do not differentiate into retinal pigment epithelial cells.
  • retinal layer-specific nerve cell means a nerve cell (neuron) that is a cell that constitutes the retinal layer and is specific to the retinal layer.
  • Retinal layer-specific neurons include photoreceptor cells (including rod and cone cells), horizontal cells, bipolar cells, amacrine cells, retinal ganglion cells.
  • Retinal cell markers include Rx (also called Rax), Pax6 and Chx10, which are expressed in retinal progenitor cells; Nkx2.1, which is expressed in progenitor cells of hypothalamic neurons but not in retinal progenitor cells; Examples include Sox1, which is not expressed in the retina, Crx, Blimp1, etc., which are expressed in photoreceptor progenitor cells.
  • Retinal layer-specific neuronal markers include Chx10, PKC ⁇ and L7 expressed in bipolar cells, Tuj1 and Brn3 expressed in retinal ganglion cells, Calretinin expressed in amacrine cells, Calbindin expressed in horizontal cells, and mature photoreceptors.
  • Rhodopsin and Recoverin expressed in rod cells Nrl and Rhodopsin expressed in rod cells, Rxr-gamma and S-Opsin expressed in cone cells, RPE65 and Mitf expressed in retinal pigment epithelial cells.
  • cell markers used in Examples can be used.
  • the retinal tissue produced by the method of the present disclosure has a percentage of Chx10-positive cells or a percentage of Chx10-positive and Rx-positive cells of 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more. , 85% or greater, 90% or greater, or 95% or greater.
  • the percentage of the marker-positive cells is 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, It can be the percentage on day 30 or later.
  • the retinal tissue has a percentage of Chx10 and Rx-positive cells on days 18 to 22 (e.g., day 20) of differentiation induction of 70% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, Or 95% or more.
  • the retinal tissue has a percentage of Chx10 and Rx positive cells of 90% or more or 95% or more at 18-22 days (eg, 20 days) of differentiation induction.
  • the retinal tissue produced by the methods of the present disclosure has a percentage of retinal cells of 50% or greater, 60% or greater, 70% or greater, 80% or greater, 85% or greater, 90% or greater, or 95% That's it.
  • the percentage of the cells is 20 to 100 days of differentiation induction (for example, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, or day 100), or the rate thereafter.
  • the retinal tissue preferably has a layered structure of cells.
  • the retinal tissue can be collected from the culture substrate by the usual method.
  • retinal tissue can be collected with an instrument such as forceps.
  • the culture substrate is coated with a stimulus-responsive polymer (eg, a temperature-responsive polymer or a photo-responsive polymer)
  • retinal tissue can be harvested by applying a corresponding stimulus.
  • a temperature-responsive polymer whose polymer property reversibly changes from cell-adhesive (hydrophobic) to cell-non-adhesive (hydrophilic) at a predetermined temperature
  • the culture substrate is Retinal tissue can be collected by subjecting it to temperature.
  • the collected retinal tissue can be maintained in a normal culture container, and may be transferred to a suitable storage container and cryopreserved.
  • the shape and size of the retinal tissue depend on the shape and size of area A.
  • the area of retinal tissue can be 0.01-100 cm 2 , 0.03-30 cm 2 , 0.1-10 cm 2 .
  • the area of retinal tissue is 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, or 1 cm2 or greater, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 , 2, or 1 cm 2 or less.
  • the area of retinal tissue can be 0.5-10 cm 2 , 0.7-10 cm 2 , 1-10 cm 2 , 0.5-5 cm 2 , 0.7-5 cm 2 , or 1-5 cm 2 .
  • the retinal tissue has a diameter of 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, or 1 cm or greater, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, Or it can be circular or polygonal with the same area, 1 cm or less.
  • the retinal tissue is circular with a diameter of 0.1-10 cm, 0.1-5 cm, 0.1-3 cm, or 0.2-1 cm.
  • the retinal tissue is circular with a diameter of 1-10 cm, 1-5 cm, or 1-3 cm.
  • the retinal tissue being circular or polygonal means having a shape similar to that of the retinal tissue produced by the method of the present disclosure using a culture substrate having a region A of the same shape. .
  • the area and diameter of the retinal tissue refer to the area within the perimeter of the retinal tissue and the line connecting any two points on the perimeter, which are measured based on images taken using a stereoscopic microscope. means the length of the longest straight line.
  • Retinal tissue is 500, 400, 300, 290, 280, 270, 260, 250, 240, 230, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, or 100 ⁇ m or greater in thickness. , 220, 210 or 220 ⁇ m or less. In certain embodiments, the retinal tissue is between 50 ⁇ m and 300 ⁇ m thick.
  • the entire retinal tissue does not need to have the same thickness, and when defining the thickness range of the retinal tissue, the thickness of any part of the retinal tissue may be within that range.
  • the retinal tissue obtained by the method of the present disclosure usually has up to about 30 cells in the perpendicular direction to the culture substrate or a thickness of 500 ⁇ m or less, and is also called a sheet-like retinal tissue or a retinal sheet. I can say Thus, in one aspect, the present disclosure provides sheet pluripotent stem cell-derived retinal tissue.
  • the retinal tissue produced by the method of the present disclosure can be used as a transplant material for the treatment of diseases, particularly diseases associated with retinal tissue or retinal cell damage or diseases caused by retinal tissue or retinal cell damage. That is, the present disclosure provides compositions for treating diseases involving the retinal tissue of the present disclosure and methods of treating the disease comprising transplanting the retinal tissue of the present disclosure into a subject.
  • Diseases accompanied by disorders of retinal tissue or retinal cells or diseases caused by disorders of retinal tissues or cells include retinal degeneration, retinitis pigmentosa, age-related macular degeneration, organic mercury poisoning, chloroquine retinopathy, glaucoma, Diabetic retinopathy, neonatal retinopathy, and the like.
  • the disease is retinitis pigmentosa.
  • the retinal tissue is preferably derived from pluripotent stem cells that have high histocompatibility with the subject (that is, the recipient) to which the retinal tissue is to be transplanted.
  • the retinal tissue is a pluripotent stem cell whose histocompatibility antigen (eg, HLA type) partially or entirely matches that of the subject, or a pluripotent stem cell established from the subject's cells.
  • the retinal tissue may be used for treatment as it is in shape and size after the completion of differentiation induction, or may be used after being cut to an appropriate size using means such as tweezers while maintaining the layered structure.
  • a composition comprising retinal tissue of the present disclosure may comprise a pharmaceutically acceptable carrier in addition to retinal tissue.
  • Pharmaceutically acceptable carriers include physiological aqueous solvents such as saline, buffers, serum-free media and the like.
  • the composition may further contain additives such as preservatives, stabilizers, reducing agents, tonicity agents and the like.
  • a composition comprising retinal tissue of the present disclosure may be cryopreserved, in which case the composition may comprise a suitable cryoprotectant.
  • the retinal tissue produced by the method of the present disclosure can also be used to evaluate the toxicity or efficacy of drugs on retinal tissue.
  • the retinal tissue of the present disclosure is used for toxicity evaluation or efficacy evaluation of a therapeutic agent for a disease associated with retinal tissue or retinal cell damage or a disease caused by retinal tissue or retinal cell damage.
  • the retinal tissue is preferably produced from pluripotent stem cells established from a subject suffering from the disease.
  • the retinal tissue produced by the method of the present disclosure has a structure suitable for transplantation or evaluation of toxicity and efficacy, and is used while maintaining the layered structure. ) to prepare a cell suspension and administer it to a subject, and are within the scope of this disclosure of methods of using such retinal tissue.
  • Pluripotent stem cells in a region A on a culture substrate having a region A having cell adhesiveness and a region B adjacent to at least a part of said region A and having lower cell adhesion than said region A on its surface A method of producing retinal tissue, comprising inducing differentiation of retinal tissue into retinal tissue.
  • [2] 2. The method according to 1 above, wherein the region A is coated with a cell adhesive substance.
  • [3] 3. The method according to 2 above, wherein the cell adhesive substance is laminin.
  • the induction of differentiation of pluripotent stem cells into retinal tissue comprises the following steps: (1) culturing pluripotent stem cells in a medium containing a BMP signal inhibitor, and (2) culturing the cells obtained in step (1) in a medium containing a BMP signal agonist; [11] 11. The method according to 9 or 10 above, wherein the cells are cultured in a medium containing a BMP signaling agonist for 5 to 10 days. [12] 12. The method according to any one of 9 to 11 above, wherein the BMP signal agonist is BMP4. [13] 13.
  • a method of manufacturing retinal tissue comprising the steps of: (1) culturing pluripotent stem cells in a medium containing a BMP signal inhibitor, and (2) culturing the cells obtained in step (1) in a medium containing a BMP signal agonist; [19] 19.
  • the BMP signaling agonist is BMP4.
  • 21 21.
  • the BMP signaling inhibitor is LDN-193189.
  • the pluripotent stem cells are human iPS cells or ES cells.
  • a composition comprising the retinal tissue according to any one of 26 to 29 above.
  • 31. A composition according to 30, for use in treating disease.
  • 32. The composition according to 31 above, wherein the disease is a disease associated with retinal tissue or retinal cell damage or a disease caused by retinal tissue or retinal cell damage.
  • 33. The composition according to 31 or 32 above, wherein the disease is retinitis pigmentosa.
  • 31. The composition according to 30 above, for use in toxicity evaluation or efficacy evaluation.
  • [35] 30 A method for treating a disease associated with retinal tissue or retinal cell damage or a disease caused by retinal tissue or retinal cell damage, wherein the retinal tissue according to any one of 26 to 29 above is applied to a subject in need of said treatment.
  • a method comprising porting a [36] 30.
  • [37] 30. Use of the retinal tissue according to any one of 26 to 29 above for the manufacture of a medicament for treating a disease associated with or caused by a retinal tissue or retinal cell disorder.
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • Fig. 1 shows the experimental scheme.
  • ⁇ Day0 Prepare the dish> procedure 1.
  • the prepared PDMS sheet was sterilized with 70% ethanol and placed on a dish ( ⁇ -Dish 35 mm, High, 81156, ibidi). 2.
  • 7 ⁇ L iMatrix-511 (Nippi. Inc.) was added to 500 ⁇ L PBS, and 200 ⁇ L was added within a circle (1 cm in diameter) of the PDMS sheet. 4.
  • Incubate at 37°C or room temperature (RT) for >1 hour.
  • KhES-1_Rx::Venus cells KhES-1 cells in which modified GFP Venus is knocked into the Rx locus, a retinal marker
  • PBS PBS
  • the required number of cells (5 ⁇ 10 5 cells per dish) was transferred to another tube and centrifuged at 1000 rpm and 20° C. for 5 minutes. 6. The supernatant was removed, and the cells were suspended in AK02N+Y at 5 ⁇ 10 5 cells/200 ⁇ L AK02N+Y. 7. The iMatrix coating solution in the PDMS sheet was removed with an aspirator, a cell suspension (5 ⁇ 10 5 cells/200 ⁇ L AK02N+Y) was added, and incubated at 37° C. for 30 minutes. 8. Using sterile tweezers, the PDMS sheet was removed from the dish. 9. 300 ⁇ L of AK02N+Y was additionally added and cultured at 37° C., 5% CO 2 .
  • AK02N+PS Medium change with AK02+PS> procedure 1.
  • Penicillin-Streptomycin (15070-062, Thermo Fisher Scientific) was added to AK02N and mixed well (without Y-27632, hereinafter referred to as AK02N+PS).
  • the medium was removed with an aspirator and 500 ⁇ L of AK02N+PS was added.
  • BMP4-containing gfCDM (10% KSR) final concentration 1.5 nM BMP4.
  • a BMP4-containing medium was prepared by adding a 1 ⁇ M BMP4 solution prepared by diluting 10 ⁇ g of BMP4 (R&D Systems) with 275 ⁇ L of 0.1% BSA to gfCDM (10% KSR).
  • ⁇ Day11, Day14 Half medium exchange> 1. 500 ⁇ L of medium was removed and 500 ⁇ L of gfCDM (10% KSR) was added (half volume exchange). Thereafter, half of the medium was replaced every 3 days.
  • control maturation medium > 1. Wash three times with 1 mL of control maturation medium (Table 3). 2. Add 1 mL of control maturation medium and incubate. Thereafter, the medium was changed once every 2-3 days.
  • Cells without patterning were cultured in microdishes ( ⁇ -Dish 35mm, High, 81156, ibidi) coated entirely with iMatrix-511 (Nippi. Inc.) (0.25 ⁇ g/cm 2 ) without using PDMS sheets. were cultured in the same manner.
  • RNA-seq Analysis method/RNA sequencing (RNA-seq) 1.
  • Total RNA was prepared from Day 8 samples of patterned cultured cells and non-patterned cultured cells using RNeasy Micro kit (QIAGEN).
  • QIAGEN RNeasy Micro kit
  • a sequence library was prepared using the Next Ultra II Directional RNA Library Prep Kit for illuminate E7760 (NEB), and sequence sequences were determined using a next-generation sequencer (NextSeq, illumina). 3.
  • RNA-seq ⁇ Single-cell RNA-seq (scRNA-seq) 1. Day 100 retinal tissue was dissociated into single cells using TrypLE TM Select (Thermo Fisher Scientific) supplemented with 150 ⁇ g/ml DNase I (Roche) for 5 min at 37°C, followed by 0.04% BSA. /Neutralized with PBS. 2. Pellet the dissociated cells, resuspend in 0.04% BSA/PBS and pass through a 35 ⁇ m filter to obtain a single cell suspension. 3. Using Chromium Single Cell 3' Reagent Kit v3 (10x, Genomics), a cDNA library derived from about 10000 single cells was prepared.
  • Sequences were determined using a paired-end 100 cycle kit (28+8+91) on an Illumina NovaSeq sequencer. 4. Mapping was performed using CellRanger (version3.0.2) and secondary analysis was performed using Seurat (version3.0). The following markers were used for each cell.
  • VAX1/PAX2 Retinal pigment epithelium RPE, retinal pigment epithelium
  • MITF/PMEL Amacrine cell AC, amacrine cell
  • ONECUT3/PRDM13 retinal ganglion cell RRC
  • POU4F2 Photoreceptor cell PR, photoreceptor cell
  • CRX/NEUROD4 Neural precursor cell NPC, Neural precursor cell
  • HES6/NEUROD1 Retinal progenitors CHX10/PAX6
  • GFP-expressing cells were observed using a Keyence all-in-one microscope BZ-X. After acquiring a phase-contrast image and a GFP fluorescence image with a 10X lens, a whole colony image was created by tiling processing.
  • Chx10, Recoverin, FOXG1, Crx, Tuj1, Zo-1, and Pax6 was evaluated by immunostaining using a primary antibody specific to each marker and a secondary antibody suitable for the primary antibody.
  • Retinal differentiation after BMP4 addition was evaluated by observing GFP (venus) expressed under the promoter of Rx, a retinal marker, over time. GFP expression was observed at an early stage in the patterned-cultured cells, indicating that the efficiency of differentiation induction was higher than in the cells not patterned-cultured (Fig. 4).
  • Chx10 a marker for bipolar cells and their progenitor cells, was evaluated. Expression with and without addition of BMP4 was evaluated for each of the patterned cultured cells and the non-patterned cultured cells. Chx10 expression was assessed by quantitative PCR (HPRT1 was used as an endogenous control) and immunostaining. As shown in FIG.
  • FIG. 6 shows a Day 18 photograph of cells induced to differentiate into the retina by patterning culture. Expression of Rx and Chx10 was confirmed in almost the entire surface, and 95% or more of the cells were thought to express these markers. On Day 58, expression of Recoverin, a retinal photoreceptor marker, was observed in cells induced to differentiate into the retina by patterning culture (Fig. 7). In the cells patterned and cultured to which BMP4 was not added, FOXG1, a telencephalic marker, was expressed on Day 18 (Fig. 8).
  • scRNA-seq Differentiation Efficiency scRNA-seq was performed on cells induced to undergo retinal differentiation in patterning culture on Day100. scRNA-seq showed that 97% or more of the cells were differentiated into retinal cells (FIG. 9, left). When GFP expression in Day74 cells was evaluated by FACS, more than 90% were GFP-positive (Fig. 9, right).
  • 201B7 and 253G1 iPS cell lines were used to induce retinal differentiation, and the expression of Crx and Chx10 was evaluated on Day 34. Expression of Crx and Chx10 was confirmed throughout the tissue, indicating that retinal differentiation was similarly induced in these iPS cells (Fig. 13). Furthermore, expression of Zo-1 and Chx10 in Day 41 tissue induced from 201B7 cells was evaluated by immunostaining. Zo-1 is a tight junction marker. The expression of Zo-1 and Chx10 was observed in a stratified manner, indicating that the tissue induced to differentiate had a layered structure of the retina (data not shown).
  • LDN-193189 a BMP signal inhibitor
  • GFP expression of cells to which LDN-193189 was not added from Day 3 to Day 8 in the patterning culture described above was compared to cells to which LDN-193189 was added on Day 11.
  • Uniform GFP expression was observed in cells to which LDN-193189 was added compared with cells to which LDN-193189 was not added (Fig. 14).
  • Patterning Culture Using Hydrophilic Polymer Patterning culture was performed by coating MPC (2-methacryloyloxyethylphosphorylcholine) polymer to form cell non-adhesive regions.
  • MPC 2-methacryloyloxyethylphosphorylcholine
  • a 1 cm circular PDMS sheet was attached to a dish ( ⁇ -Dish 35 mm, High, 81156, ibidi), coated with an ethanol solution containing MPC polymer at a concentration of 0.5 vol%, and then the PDMS sheet was removed. 7 ⁇ L iMatrix-511 (Nippi. Inc.) was added to 500 ⁇ L PBS and added to the dish.

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Abstract

本開示は、細胞接着性を有する領域Aと、前記領域Aの少なくとも一部に隣接する前記領域Aよりも細胞接着性の低い領域Bとをその表面に有する培養基材上の領域Aにおいて、多能性幹細胞の網膜組織への分化を誘導することを含む、網膜組織の製造方法、前記方法により製造される網膜組織および前記網膜組織を含む組成物などを含む。

Description

網膜組織の製造方法
　本出願は、日本国特許出願第２０２１－１２０１２８号について優先権を主張するものであり、ここに参照することによって、その全体が本明細書中へ組み込まれるものとする。
　本開示は、網膜組織の製造方法、前記方法により製造される網膜組織、前記網膜組織を含む組成物などを含む。
　移植や薬効評価のための試験管内での臓器形成にむけて、多能性幹細胞の培養操作が盛んに研究されている。無血清凝集浮遊培養法（Serum-free Floating culture of Embryoid Body-like aggregates with quick reaggregation、SFEBq法という）は、多能性幹細胞を血清や転写因子などの神経分化阻害効果のある成分を含まない培地中で数日浮遊培養することで中枢神経系の細胞に分化させる方法であり、多能性幹細胞からの網膜組織の形成にも応用されている。SFEBq法は、細胞による自己組織化を利用することにより試験管内で個体発生のプロセスを再現しており、三次元組織を安定に再現性よく作り出すことができる。一方、SFEBq法は、細胞の自己組織化に依存しているため、パターン形成過程が一定でなく、組織の形態やサイズの制御が困難である。また、得られる細胞塊の厚みにより、内部の細胞に薬剤が浸透しにくく、内部の細胞の観察も難しい。さらに、SFEBq法は自動化に適さないと考えられる。そこで、網膜組織の安定供給および自動製造により適した方法が求められている。
　本開示は、網膜組織の製造方法を提供することを目的とする。本開示はまた、前記方法により製造される網膜組織および前記網膜組織を含む組成物の提供を目的とする。
　ある態様において、本開示は、細胞接着性を有する領域Aと、前記領域Aの少なくとも一部に隣接する前記領域Aよりも細胞接着性の低い領域Bとをその表面に有する培養基材上の領域Aにおいて、多能性幹細胞の網膜組織への分化を誘導することを含む、網膜組織の製造方法に関する。
　さらなる態様において、本開示は、前記方法により製造される網膜組織に関する。
　さらなる態様において、本開示は、前記網膜組織を含む組成物に関する。
　本開示により、網膜組織の製造方法、前記方法により製造される網膜組織および前記網膜組織を含む組成物が提供される。
図１は、網膜分化誘導の実験スキームを示す。 図２は、パターニング培養した細胞のBMP4添加前（Day8）の遺伝子オントロジー（GO）解析を示す。 図３は、パターニング培養していない細胞のBMP4添加前（Day8）のGO解析を示す。 図４は、パターニング培養により網膜分化誘導した細胞（上）およびパターニング培養せずに網膜分化誘導した細胞（下）のGFP（Rx::venus）発現の経時変化を示す。 図５は、パターニング培養した細胞（Patterning）およびパターニング培養していない細胞（All）のDay18のChx10発現（上）およびGFP発現（下）を示す。それぞれBMP4を添加した細胞（BMP+）とBMP4非添加の細胞（BMP-)の結果を示す。 図６は、パターニング培養により網膜分化誘導した細胞のDay18のGFP（Rx::venus）およびChx10の発現を示す。 図７は、パターニング培養により網膜分化誘導した細胞のDay58のGFP（Rx::venus）、Recoverin、およびChx10の発現を示す。 図８は、パターニング培養したBMP4非添加の細胞のDay18のGFP (Rx::venus)およびFOXG1の発現を示す。 図９は、パターニング培養により網膜分化誘導した細胞の分化誘導効率を示す。 図１０は、様々なサイズでパターニング培養した細胞のDay20のGFP発現を示す。 図１１は、Day40の組織のCrx発現を示す。 図１２は、KthES11細胞を用いたパターニング培養による網膜分化誘導を示す。Day50のCrx、Chx10、およびTuj1の発現を示す。 図１３は、201B7細胞（上）および253G1細胞（下）を用いたパターニング培養による網膜分化誘導を示す。Day34のCrxおよびChx10の発現を示す。 図１４は、LDN-193189添加時（上）および非添加時（下）のDay11のGFP発現を示す。 図１５は、パターニング培養した細胞（Patterning）およびパターニング培養していない細胞（All）の、LDN-193189添加時および非添加時のChx10発現（上）およびGFP発現（下）を示す。Day18の結果を示す。 図１６は、パターニング培養した細胞（Patterning）およびパターニング培養していない細胞（All）の、LDN-193189添加時および非添加時のGFPおよびChx10発現を示す。スケールバーは1 mmを示す。Day18の結果を示す。 図１７は、MPCポリマーを用いたパターニング培養による網膜分化誘導の経時変化を示す。
　特に具体的な定めのない限り、本明細書で使用される用語は、有機化学、医学、薬学、分子生物学、微生物学等の分野における当業者に一般に理解されるとおりの意味を有する。以下にいくつかの本明細書で使用される用語についての定義を記載するが、これらの定義は、本明細書において、一般的な理解に優先する。
　本明細書では、数値が「約」の用語を伴う場合、その値の±10％の範囲を含むことを意図する。数値の範囲は、両端点の間の全ての数値および両端点の数値を含む。範囲に関する「約」は、その範囲の両端点に適用される。例えば、「約20～30」は「18％～33％」を含むものとする。
　本開示の網膜組織の製造方法は、細胞接着性を有する領域Aと、前記領域Aの少なくとも一部に隣接する前記領域Aよりも細胞接着性の低い領域Bとをその表面に有する培養基材上の領域Aにおいて、多能性幹細胞の網膜組織への分化を誘導することを含む。
　領域Aは、多能性幹細胞を接着培養で維持できる領域である。領域Bは、領域Aに多能性幹細胞を播種した場合に、網膜組織への分化誘導中に（すなわち、網膜組織への分化が確認できるまでの期間）、前記領域Aに隣接する領域Bに細胞が伸展しない程度に、領域Aよりも細胞接着性の低い領域である。細胞接着性の比較は、その面積に対して過剰量（例えば、5×105～10×105cells/cm2）の多能性幹細胞を播種し、37℃、5％CO2下で24時間培養後、細胞が接着する面積の割合を比較することにより行うことができる。前記の細胞接着性は、通常、24時間培養後に培地を除去し、培地または緩衝液で細胞を洗浄して、未接着の細胞を除去した後に評価する。
　領域Aは、例えば、その面積に対して過剰量（例えば、5×105～10×105cells/cm2）の多能性幹細胞を播種し、37℃、5％CO2下で24時間培養後、その面積の70％以上、80％以上、または90％以上に細胞が接着する領域でありうる。
　ある実施形態において、領域Bは、細胞非接着性の領域である。細胞非接着性の領域とは、多能性幹細胞を接着培養で維持するのに十分な細胞接着性を有さないことを意味する。細胞非接着性の領域は、例えば、その面積に対して過剰量（例えば、5×105～10×105cells/cm2）の多能性幹細胞を播種し、37℃、5％CO2下で24時間培養後、その面積の30％以下、20％以下、または10％以下に細胞が接着する領域でありうる。
　培養基材は、その表面に領域Aと領域Bとを形成することができれば、いずれの材質で形成されていてもよい。培養基材は、例えば、金属、ガラス、およびシリコーン等の無機材料、プラスチック（例えば、ポリスチレン樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ABS樹脂、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂、ポリテトラフルオロエチレン4フッ化エチレン樹脂）等の有機材料でありうる。ある実施形態において、培養基材は、ガラスまたはプラスチック、特にポリスチレン樹脂である。
　培養基材は、一般的に細胞培養に使用される形状であればよく、特に限定されない。培養基材は、例えば、シャーレ、プレート、ボトル、チャンバー、マルチウェルプレート（例えば、6、12、24、48、96、または384ウェルプレート）などの培養容器、フィルム、または多孔質膜でありうる。培養基材は、通常、重力の方向に対して水平方向の表面上（培養容器の場合、底部表面上）に領域Aおよび領域Bを有する。
　領域Aは、細胞接着性の培養基材の表面が露出した領域であってもよく、培養基材の表面に細胞接着性をもたせるため、または培養基材の表面の細胞接着性を高めるため、培養基材の表面を細胞接着性の物質でコーティングした領域であってもよい。細胞接着性物質としては、ポリL-リジンおよびポリL-オルニチンなどの正電荷ポリマー；ラミニン；I型コラーゲン、II型コラーゲン、III型コラーゲン、IV型コラーゲン、V型コラーゲン、VII型コラーゲン等のコラーゲン；テネイシン；フィブリリン；フィブロネクチン；ビトロネクチン（Vitronectin）；エラスチン；エンタクチン；コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸等の硫酸化グルコサミノグリカンと、コアタンパク質とから構成されるプロテオグリカン；コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸、ヒアルロン酸等のグルコサミノグリカン；Synthemax（登録商標、ビトロネクチン誘導体）、Matrigel（登録商標）などが挙げられる。
　ある実施形態において、領域Aは、ラミニンでコーティングされている。ラミニンは、α鎖、β鎖およびγ鎖の3本のサブユニット鎖からなるヘテロ三量体分子であり、α鎖はα1～α5の５種類、β鎖はβ1～β3の3種類、γ鎖はγ1～γ3の3種類が知られており、各ラミニンアイソフォームは構成サブユニットを示す数字で表される（例えば、ラミニン111は、α1鎖、β1鎖、およびγ1鎖から構成される）。ラミニンには、ラミニン111、ラミニン121、ラミニン211、ラミニン213、ラミニン222、ラミニン311（ラミニン3A11）、ラミニン332（ラミニン3A32）、ラミニン321（ラミニン3A21）、ラミニン3B32、ラミニン411、ラミニン421、ラミニン423、ラミニン521、ラミニン522、ラミニン523、またはこれらの断片が含まれる。ラミニンの断片としては、インテグリン結合部位の断片であるE8断片、例えば、ラミニン211-E8、ラミニン311-E8、ラミニン411-E8、ラミニン511-E8などが挙げられる。ある実施形態において、ラミニンは、ラミニン511またはその断片である。さらなる実施形態において、ラミニンは、ラミニン511-E8断片である。ラミニンによるコーティングのため、iMatrix-511（Nippi. Inc.）などの市販品を用いることもできる。iMatrix-511（Nippi. Inc.）はラミニン511-E8断片を含む。
　領域Bは、領域Aよりも細胞接着性の低い培養基材の表面が露出した領域であってもよく、領域Aよりも細胞接着性の低い領域とするため、培養基材の表面を何らかの物質でコーティングした領域であってもよい。ある実施形態において、領域Bは、細胞非接着性の物質によりコーティングされている。細胞非接着性物質としては、MPC（2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）ポリマー；メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等のセルロース類；ポリエチレンオキサイド；カルボキシビニルポリマー；ポリビニルピロリドン；ポリエチレングリコール；ポリアクリルアミド、ポリN-イソプロピルアクリルアミド等のポリアミド；キチン、キトサン、ヒアルロン酸、アルギン酸、デンプン、ペクチン、カラギーナン、グアーガム、アラビアゴム、デキストラン等の多糖類；アルブミンおよびこれらの誘導体などが挙げられる。ある実施形態において、細胞非接着性物質は、MPCポリマーである。
　領域Aの形状は、特に限定されず、例えば、円形、楕円形、および多角形（例えば、三角形、四角形、五角形、六角形、八角形、十角形、十二角形など）が挙げられる。ある実施形態において、領域Aは円形である。本明細書において、円形とは、当業界で実質的に円形と認識される形状であればよく、真円を含む略円形の意味で用いられる。領域Aの面積は、例えば、0.01～100 cm2、0.01～30 cm2、0.01～10 cm2、0.03～30 cm2、0.03～10 cm2、または0.1～10 cm2でありうるが、これに限定されない。ある実施形態において、領域Aの面積は、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、または1 cm2以上、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1 cm2以下である。例えば、領域Aの面積は、0.5～10 cm2、0.7～10 cm2、1～10 cm2、0.5～5 cm2、0.7～5 cm2、または1～5 cm2でありうる。
　領域Aは、直径が、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、または1 cm以上、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1 cm以下の、円形、またはこれと同面積の多角形でありうる。ある実施形態において、領域Aは、直径が、0.1～10 cm、0.1～5 cm、0.1～3 cmまたは0.2～1 cmの円形である。さらなる実施形態において、領域Aは、直径が、1～10 cm、1～5 cm、または1～3 cmの円形である。
　領域Aは、その少なくとも一部が領域Bに隣接する。ある実施形態において、領域Aは、その外縁全体が領域Bに隣接する（すわなち、領域Bに囲まれている）。領域Bを挟む2つの領域Aの間隔は、限定はされないが、例えば、約1 mmまたはこれ以上である。
　領域Aおよび領域Bは、細胞のパターニングに用いられるいずれの方法により培養基材表面に形成してもよい。領域Aおよび領域Bは、例えば、ソフトリソグラフィー、フォトリソグラフィー、3Dプリンティングなどの技術により培養基材表面に形成することができる。
　領域Aおよび領域Bは、培養基材の表面の一部を処理して処理領域と非処理領域の細胞接着性を異なるものとすることにより、形成することができる。例えば、培養基材の表面の一部をマスキングし、マスキングされてない領域を細胞接着性物質または細胞非接着性物質でコーティングすることが考えられる。あるいは、培養基材上に細胞接着性物質または細胞非接着性物質の層を形成し、その一部を処理して細胞接着性を変化させてもよい。処理した部分は、培養基材の表面が露出した部分、または細胞非接着性物質または細胞接着性物質の性質が前記処理により変化した部分でありうる。
　例えば、領域Aの形状およびサイズの穴を有するシートを3Dプリンターでプリントした鋳型により作成し、培養基材の表面をこのシートで覆い、シートで覆われていない表面を細胞接着性物質によりコーティングし、その後シートを取り除くことにより、培養基材上に領域Aおよび領域Bを形成することができる。あるいは、領域Aの形状およびサイズのシートを作成し、培養基材の表面に置き、シートで覆われていない表面を細胞非接着性物質によりコーティングした後、シートを取り除き、シートで覆われていた表面を細胞接着性物質でコーティングすることにより、培養基材上に領域Aおよび領域Bを形成することもできる。シートは、ポリジメチルシロキサン（PDMS）、ポリエチレングリコールハイドロゲル、またはアガロースゲルなどの生体適合性材料により形成することができる。コーティングは、例えば、培養基材を細胞接着性物質または細胞非接着性物質の溶液と接触させて37℃または室温で必要な時間（例えば、1時間以上）反応させることにより行うことができる。細胞接着性物質および細胞非接着性物質の濃度は、当業者が適宜決定しうるが、例えば、ラミニンの場合、0.1～1 μg/cm2、0.1～0.5 μg/cm2、または約0.25 μg/cm2でありうる。
　本開示において、培養基材は表面に凸部（ピラー（pillar）ともいう）を有し、その凸部上面に領域Aを有してもよい。凸部の形状は、特に限定されず、円柱または角柱であってもよい。本明細書において、円柱は、その断面が当業界で実質的に円形と認識される形状であればよく、断面が真円を含む略円形の柱の意味で用いられる。ある実施形態では、凸部が円柱状である。凸部の高さは、限定はされないが、例えば、0.1 mm～10 mm、0.1 mm～5 mm、1 mm～5 mm、または3 mm～5 mm、例えば4 mmである。凸部の材質は、培養基材と同じてあっても異なっていてもよい。凸部の材質としては、培養基材の材質として本明細書に例示されるものに加え、ポリジメチルシロキサン（PDMS）、ポリメチルメタクリレート（PMMA）、ポリエチレンテレフタレート（PET）、ポリアミド（PA）およびポリメチルグルタルイミド（PMGI）、ポリビニルアルコール（PVA）、ポリエチレングリコール（PEG）、ポリエチレン酢酸ビニル（PEVA）、ポリエチレンオキサイド（PEO）などが挙げられる。
　多能性幹細胞とは、成体を構成する全ての細胞に分化することができる多分化能（pluripotency）と、細胞分裂を経てもその多分化能を維持することができる自己複製能を有する細胞を意味する。多能性幹細胞は、新たに樹立したものでもよく、株化されたものであってもよい。多能性幹細胞には、胚性多能性幹細胞（ES細胞）、胚性生殖細胞（EG細胞）、人工多能性幹細胞（iPS細胞）が含まれる。多能性幹細胞の生物種は特に限定はされないが、好ましくは哺乳類（例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ウサギ）である。ある実施形態において、多能性幹細胞は、齧歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット）または霊長類（例えば、ヒト、サル）であり、好ましくは霊長類である。さらなる実施形態において、多能性幹細胞は、サルまたはヒト多能性幹細胞；サルまたはヒトES細胞またはiPS細胞；またはヒトiPS細胞である。
　ES細胞は、初期胚に由来する多能性幹細胞であり、胚盤胞の内部細胞塊または着床後の初期胚のエピブラストから樹立することができる。ES細胞は、株化された細胞であってもよく、例えば、Kh-ES-1細胞、Kh-ES-2細胞、Kh-ES-13細胞、KthES11細胞（京都大学ウイルス・再生医科学研究所から入手可能）などが挙げられる。ある実施形態では、ES細胞は、ヒト胚の破壊を伴う方法により樹立されたES細胞以外のES細胞である。
　iPS細胞は、体細胞などの多能性幹細胞以外の細胞から誘導された細胞であり、いかなる方法で製造された細胞であってもよく、例えば、WO2007/069666、WO2009/006930、ＷO2009/006997、WO2009/007852、WO2008/118820、Cell 126(4): 663-676 (2006)、Cell 131(5): 861-872 (2007)、Science 318(5858): 1917-1920 (2007)、Nature Biotechnology 26(1): 101-106 (2008)、Cell Stem Cell 3(5): 568-574 (2008) 、Cell Stem Cell 4(5): 381-384 (2009)、Nature 454: 646-650 (2008) 、Cell 136(3): 411-419 (2009) 、Nature Biotechnology 26: 1269-1275 (2008) 、Cell Stem Cell 3: 475-479 (2008) 、Nature Cell Biology 11: 197-203 (2009) 、Cell 133(2): 250-264 (2008)、Science, 2013, 341 pp. 651-654、Stem Cells 31: 458-466 (2013))などに記載の方法が挙げられる。iPS細胞はまた、株化された細胞であってもよく、例えば、201B7細胞、201B7-Ff細胞、253G1細胞、253G4細胞、1201C1細胞、1205D1細胞、1210B2細胞、1231A3細胞、Ff-I01細胞、Ff-I14細胞、QHJI01細胞（京都大学またはiPSアカデミアジャパン株式会社より入手可能）などが挙げられる。
　ある実施形態において、iPS細胞は、線維芽細胞、皮膚細胞、血球系細胞（例えば、末梢血単核球又はT細胞、臍帯血由来細胞）などの体細胞に、Oct3/4、Sox2、Klf4、Myc（c-Myc、N-Myc、L-Myc）、Glis1、Nanog、Sall4、lin28、およびEsrrbから選択される初期化因子の組合せを導入することにより製造された細胞である。好ましい初期化因子の組合せとしては、(1) Oct3/4、Sox2、Klf4、およびMyc（c-MycまたはL-Myc）、(2) Oct3/4、Sox2、Klf4、Lin28およびL-Mycが挙げられる。
　多能性幹細胞は、通常、細胞が領域Aの70％以上を占めるような細胞数で培養基材に播種される。細胞は、領域Aのみに播種しても、領域Aと領域Bとを含む培養基材上全体に播種してもよい。例えば、領域Bが細胞非接着性の領域である場合、培養基材上全体に播種することができる。例えば、多能性幹細胞は、5×105～10×105cells/cm2で播種されうる。典型的には、酵素（例えば、トリプシン、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼ、プロナーゼ、DNase、パパイン）および/またはキレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（EDTA））を含む細胞分散液を用いて回収および分散した多能性幹細胞を、所望の培地に懸濁し、得られた細胞懸濁液を培養基材上に加える。細胞分散液として、例えば、TrypLETM Select （Thermo Fisher Scientific）、TrypLETM Express （Thermo Fisher Scientific）などの市販品を用いてもよい。
　多能性幹細胞の網膜組織への分化誘導は、前記培養基材上で接着培養により行う。多能性幹細胞を培養基材へ播種後、未分化維持因子を含む培地で一定期間培養した後、多能性幹細胞の網膜組織への分化誘導を開始してもよい。本開示において、未分化維持因子を含まない培地での培養を開始した時点を、網膜組織への分化誘導を開始した時点とする。
　本開示において、多能性幹細胞の網膜組織への分化誘導は、当業者が利用可能ないずれの方法により行ってもよい。ある実施形態において、多能性幹細胞の網膜組織への分化誘導は、多能性幹細胞を、BMPシグナル作用薬を含む培地で培養することを含む。さらなる実施形態において、多能性幹細胞の網膜組織への分化誘導は、以下の工程を含む：
(1) 多能性幹細胞を、BMPシグナル阻害薬を含む培地で培養すること、および
(2) 工程(1)で得られた細胞を、BMPシグナル作用薬を含む培地で培養すること。
　BMPシグナル作用薬の添加に先立ち細胞をBMPシグナル阻害薬の存在下で培養すると、網膜組織への分化効率を高めることができる。すなわち、本開示は、ある態様において、前記工程(1)および(2)を含む網膜組織の製造方法を提供する。本態様において、工程(1)および(2)の培養は、接着培養であることが好ましい。
　本開示の方法で用いる培地は、動物細胞の培養に通常用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、IMDM培地、DMEM培地、F-12培地、DMEM/F12培地、IMDM/F12培地、BME培地、BGJb培地、CMRL 1066培地、Glasgow MEM (GMEM)培地、Improved MEM Zinc Option培地、Medium 199培地、Eagle MEM培地、αMEM培地、ハム培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、またはこれらの混合培地が挙げられる。
　培地は、血清、血清代替物、増殖因子、未分化維持因子、タンパク質（例えば、サイトカイン、インシュリン）、脂肪酸、脂質、ビタミン、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸、レチノイド類、グルタミン、タウリン）、抗酸化剤、2-メルカプトエタノール、1-チオグリセロール、抗生物質、緩衝剤、無機塩類から選択される1種以上の成分を、必要に応じて基礎培地に加えたものでありうる。血清代替物としては、例えば、ウシ血清アルブミン（BSA）などのアルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素、2－メルカプトエタノール、1-チオグリセロール、およびこれらの均等物、並びにこれらの混合物が挙げられる。培地は、KnockOutTM Serum Replacement (Thermo Fisher Scientific)、Chemically Defined Lipid Concentrate (Thermo Fisher Scientific)、GlutaMAXTM Supplement (Thermo Fisher Scientific)、Ham's F-12 Nutrient Mix, GlutaMAXTM Supplement (Thermo Fisher Scientific)、B27 Supplement (Thermo Fisher Scientific)、N2 Supplement (Thermo Fisher Scientific)、ITS Supplement (Thermo Fisher Scientific)などの市販の血清代替物を含んでもよい。培地は、基礎培地に上記の成分を添加した市販品、例えば、Ham's F-12 Nutrient Mix, GlutaMAXTM Supplement (Thermo Fisher Scientific)、DMEM/F-12, GlutaMAXTM supplement（Thermo Fisher Scientific）などであってもよい。
　培地は、好ましくは無血清培地である。無血清培地とは、無調整または未精製の血清を含まない培地を意味し、精製された血液由来成分や動物組織由来成分を含む培地も、無調整または未精製の血清を含まない限り、無血清培地に含まれる。無血清培地は、血清代替物を含んでもよい。
　分化誘導は、好ましくはフィーダー細胞の非存在下（フィーダーフリー条件下とも記載する）で行なわれる。分化誘導はまた、好ましくはゼノフリー条件で行われる。本開示において、ゼノフリーとは、培養対象の細胞の生物種とは異なる生物種由来の成分を含まないことを意味する。
　未分化維持因子としては、FGFシグナル作用薬、TGFβファミリーシグナル作用薬およびインシュリンが挙げられる。FGFシグナル作用薬としては、FGF（例えば、bFGF、FGF4、FGF8）が挙げられる。TGFβファミリーシグナル作用薬としては、TGFβシグナル作用薬およびNodal/Activinシグナル作用薬が挙げられる。TGFβシグナル作用薬としては、TGFβ1およびTGFβ2が挙げられる。Nodal/Activinシグナル作用薬としては、Nodal、ActivinAおよびActivinBが挙げられる。ヒト多能性幹細胞の場合、未分化維持因子は好ましくはbFGFを含む。未分化維持因子の濃度は、多能性幹細胞の未分化状態を維持可能な濃度であればよく、当業者が適宜設定することができるが、例えば、ヒト多能性幹細胞の培養にbFGFを用いる場合、bFGF の濃度は、4 ng～500 ng/mL、10 ng～200 ng/mL、または30 ng～150 ng/mLでありうる。未分化維持因子を含む培地として、例えば、StemFit (登録商標) AK02N（Ajinomoto Co., Inc.）、StemFit (登録商標) AK03N（Ajinomoto Co., Inc.）、S-medium（DS Pharma Biomedical Co）、StemProTM (Thermo Fisher Scientific)、mTeSR1TM (STEMCELL Technologies)、mTeSR2TM (STEMCELL Technologies)、TeSRTM-E8TM (STEMCELL Technologies)、hESF9 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008 Sep 9;105(36):13409-14）などを用いてもよい。ある実施形態では、未分化維持因子を含む培地は、StemFit (登録商標) AK02N（Ajinomoto Co., Inc.）である。
　未分化維持因子を含む培地での培養は、限定はされないが、例えば1～10日間、1～9日間、1～8日間、1～7日間、1～6日間、1～5日間、1～4日間、1～3日間、または2～3日間である。
　未分化維持因子を含む培地は、さらにROCK阻害薬を含んでもよい。ROCK阻害薬としては、Y-27632、ファスジル（Fasudil）（HA1077）およびH-1152などが挙げられる。ROCK阻害薬の濃度は、阻害薬の種類の応じて適宜決定されるが、例えば1～100μM、5～50 μM、もしくは約10 μM、または前記濃度のY-27632のROCK阻害活性に相当する濃度である。ROCK阻害薬をさらに含む培地での培養期間は、未分化維持因子を含む培地での培養期間の一部であっても全体であってもよい。例えば、未分化維持因子およびROCK阻害薬を含む培地で1～2日間培養した後、未分化維持因子を含みROCK阻害薬を含まない培地で1～2日間培養してもよい。
　BMP（bone morphogenetic protein）には、例えばBMP2、BMP4、BMP7、およびBMP12（GDF7）が含まれる。BMPシグナル作用薬および阻害薬はそれぞれ、これらBMPの1または複数に対する作用薬および阻害薬であってよい。
　BMPシグナル阻害薬とは、BMPによるシグナル伝達を阻害する物質を意味し、BMPまたはその受容体に作用する物質、BMPまたはその受容体の遺伝子発現を抑制する物質、BMPとその受容体との結合を阻害する物質が含まれる。BMPシグナル阻害薬としては、LDN-193189（4-[6-(4-Piperazin-1-ylphenyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl]quinoline）、ドルソモルフィン（Dorsomorphin）（6-[4-[2-(1-Piperidinyl)ethoxy]phenyl]-3-(4-pyridinyl)-pyrazolo[1,5-a]pyrimidine）、およびDMH1（4-(6-(4-isopropoxyphenyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl)quinoline）が挙げられる。ある実施形態において、BMPシグナル阻害薬は、LDN-193189である。BMPシグナル阻害薬の濃度は、阻害薬の種類の応じて適宜決定されるが、例えば1～1000 nM、10～500 nM、30～300 nM、もしくは約100 nMまたは前記濃度のLDN-193189のBMP阻害活性に相当する濃度である。
　BMPシグナル阻害薬を含む培地での培養は、限定はされないが、例えば1～10日間、2～9日間、3～7日間、4～6日間、または約5日間である。
　BMPシグナル作用薬とは、BMPによるシグナル伝達を活性化する物質を意味し、BMPまたはその受容体に作用する物質、BMPまたはその受容体の遺伝子発現を増強する物質、BMPとその受容体との結合を促進する物質が含まれる。BMPシグナル作用薬としては、BMP2、BMP4、BMP7、BMP12（GDF7）もしくはこれらの断片、または抗BMP受容体抗体が挙げられる。ある実施形態において、BMPシグナル作用薬は、BMP4である。BMPシグナル作用薬の濃度は、作用薬の種類の応じて適宜決定されるが、例えば0.01～1000 nM、0.1～100 nM、1～10 nM、1～3 nM、もしくは約1.5 nM、または前記濃度のBMP4の活性に相当する濃度である。
　BMPシグナル作用薬を含む培地での培養は、網膜組織への分化に必要な期間行われる。培養期間は、限定はされないが、例えば1～30日間、2～20日間、3～15日間、4～12日間、または5～10日間（例えば、5、6、7、8、9、または10日間）である。BMPシグナル作用薬の濃度は、培養期間中、一定としても変化させてもよい。例えば、2～4日につき40～60％減の割合で、段階的にBMPシグナル作用薬の濃度を低下させてもよい。例えば、BMPシグナル作用薬を含む培地での培養の開始後、2、3、または4日毎に培地の一部（例えば、半量）をBMPシグナル作用薬を含まない培地に交換することにより、培地中のBMPシグナル作用薬の濃度を段階的に低下させることができる。
　ある実施形態において、BMPシグナル阻害薬またはBMPシグナル作用薬を含む培地は、F-12培地とIMDM培地との1：1混合液に、KnockOutTM Serum Replacement (Thermo Fisher Scientific)（例えば、0.5％～30％、1％～20％、または10％）、Chemically Defined Lipid Concentrate (Thermo Fisher Scientific)、BSA、および1-チオグリセロールを加えた培地である。
　BMPシグナル作用薬を含む培地での培養後、培地をBMPシグナル作用薬を含まないものに交換し、培養を継続してもよい。この培養期間は、限定はされないが、例えば1～100日間、10～90日間、20～80日間、30～70日間、40～60日間、または約50日間である。
　BMPシグナル作用薬を含む培地での培養後の培養期間の一部また全体において、Wntシグナル阻害薬を含む培地で細胞を培養してもよい。Wntシグナル阻害薬とは、Wntによるシグナル伝達を阻害する物質を意味し、Wntまたはその受容体に作用する物質、Wntまたはその受容体の遺伝子発現を抑制する物質、Wntとその受容体との結合を阻害する物質が含まれる。Wntシグナル阻害薬としては、CKI-7（N-(2-Aminoethyl)-5-chloro-8-isoquinolinesulfonamide）、D4476（4-(4-(2,3-Dihydrobenzo[1,4]dioxin-6-yl)-5-pyridin-2-yl-1H-imidazol-2-yl)benzamide）、IWR-1-endo (IWR1e) （4-[(3aR,4S,7R,7aS)-1,3,3a,4,7,7a-Hexahydro-1,3-dioxo-4,7-methano-2H-isoindol-2-yl]-N-8-quinolinylbenzamide）、およびIWP-2（N-(6-methyl-2-benzothiazolyl)-2-[(3,4,6,7-tetrahydro-4-oxo-3-phenylthieno[3,2-d]pyrimidin-2-yl)thio]-acetamide）などが挙げられる。Wntシグナル阻害薬の濃度は、阻害薬の種類の応じて適宜決定されるが、例えば、0.1～100 μM、0.3～30 μM、または1 μM～10 μMである。
　培養期間中、適宜培地交換を行ってよい。例えば、1～4日おきに培地の一部または全部を交換する。特定の成分を含む培地での培養を開始する場合、培地全量をその成分を所望の濃度で含む培地に置き換えてもよく、その成分が所望の最終濃度となるように培地の一部を置き換えてもよい（例えば、培地半量を最終濃度の2倍の濃度の培地で置き換えうる）。また、BMPシグナル作用薬について記載したように、特定の成分を含む培地での培養期間中、その成分の濃度は一定としても変化させてもよい。
　ある実施形態において、多能性幹細胞の網膜組織への分化誘導は、
(1) 多能性幹細胞を、BMPシグナル阻害薬を含む培地で4～6日間培養すること、および
(2) 工程(1)で得られた細胞を、BMPシグナル作用薬を含む培地で5～10日間培養すること
を含む。
　さらなる実施形態において、多能性幹細胞の網膜組織への分化誘導は、
(1) 多能性幹細胞を、BMPシグナル阻害薬を含む培地で4～6日間培養すること、および
(2) 工程(1)で得られた細胞を、BMPシグナル作用薬を含む培地で5～10日間培養すること
を含み、さらに、
　工程(1)に先立ち、多能性幹細胞を未分化維持因子およびROCK阻害薬を含む培地で1～2日間培養すること、および
　工程(2)で得られた細胞を、BMPシグナル作用薬を含まない培地で1～100日間培養すること
を含む。
　さらなる実施形態において、多能性幹細胞の網膜組織への分化誘導は、
(1) 多能性幹細胞を、BMPシグナル阻害薬を含む培地で4～6日間培養すること、および
(2) 工程(1)で得られた細胞を、BMPシグナル作用薬を含む培地で5～10日間培養すること
を含み、さらに、
　工程(1)に先立ち、多能性幹細胞を未分化維持因子およびROCK阻害薬を含む培地で1～2日間培養し、その後、未分化維持因子を含みROCK阻害薬を含まない培地で1～2日間培養すること、および
　工程(2)で得られた細胞を、BMPシグナル作用薬を含まない培地で1～100日間培養すること
を含む。
　培養温度およびCO2濃度などの培養条件は適宜設定できる。培養温度は、例えば30℃～40℃、または約37℃である。CO2濃度は、例えば1%～10%、または約5%である。
　網膜組織への分化は、組織中の細胞における細胞マーカーの発現を検出することにより確認することができる。マーカーの発現は、例えば、分化誘導10～100日目（例えば、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、または100日目）、またはこれ以降に確認する。ある実施形態では、マーカーの発現は、分化誘導18～22日目に確認する。
　生体網膜は層状構造をとり、視細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、網膜神経節細胞、網膜色素上皮細胞、ミューラー細胞、およびこれらの前駆細胞を含む。本明細書において、網膜を構成する細胞を「網膜細胞」と称し、網膜を構成する各層を「網膜層」と称する。成熟した網膜組織における網膜層としては、網膜色素上皮層、視細胞層、外境界膜、外顆粒層、外網状層、内顆粒層、内網状層、神経節細胞層、神経線維層および内境界膜が挙げられる。成熟した網膜組織に至る前の発生段階の網膜組織は、神経芽細胞層を含みうる。
　本明細書において、「網膜前駆細胞」とは、視細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、網膜神経節細胞、網膜色素上皮細胞、およびミューラー細胞から選択される1種類または複数種類の成熟な網膜細胞に分化しうる前駆細胞をいう。本明細書において、「神経網膜前駆細胞」とは、視細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、および網膜神経節細胞から選択される1種類または複数種類の成熟な網膜細胞に分化しうる前駆細胞をいう。典型的には、神経網膜前駆細胞は、網膜色素上皮細胞へは分化しない。
　本明細書において、「網膜層特異的神経細胞」とは、網膜層を構成する細胞であって網膜層に特異的な神経細胞（ニューロン）を意味する。網膜層特異的神経細胞には、視細胞（桿体細胞および錐体細胞を含む）、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、網膜神経節細胞が含まれる。
　網膜細胞マーカーとしては、網膜前駆細胞で発現するRx（Raxとも言う）、Pax6およびChx10、視床下部ニューロンの前駆細胞では発現するが網膜前駆細胞では発現しないNkx2.1、視床下部神経上皮で発現し網膜では発現しないSox1、視細胞前駆細胞で発現するCrx、Blimp1などが挙げられる。網膜層特異的神経細胞のマーカーとしては、双極細胞で発現するChx10、PKCαおよびL7、網膜神経節細胞で発現するTuj1およびBrn3、アマクリン細胞で発現するCalretinin、水平細胞で発現するCalbindin、成熟視細胞で発現するRhodopsinおよびRecoverin、桿体細胞で発現するNrlおよびRhodopsin、錐体細胞で発現するRxr-gammaおよびS-Opsin、網膜色素上皮細胞で発現するRPE65およびMitfが挙げられる。その他にも実施例で使用する細胞マーカーを用いることができる。
　ある実施形態において、本開示の方法により製造される網膜組織は、Chx10陽性の細胞の割合またはChx10陽性およびRx陽性の細胞の割合が、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、85%以上、90%以上、または95%以上である。前記マーカー陽性細胞の割合は、分化誘導10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30日目、またはこれ以降における割合でありうる。ある実施形態において、網膜組織は、分化誘導18～22日目（例えば、20日目）の、Chx10およびRx陽性細胞の割合が、70%以上、80%以上、85%以上、90%以上、または95%以上である。さらなる実施形態において、網膜組織は、分化誘導18～22日目（例えば、20日目）の、Chx10およびRx陽性細胞の割合が、90%以上または95%以上である。
　ある実施形態において、本開示の方法により製造される網膜組織は、網膜細胞の割合が、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、85%以上、90%以上、または95%以上である。前記細胞の割合は、分化誘導20～100日目（例えば、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、または100日目）、またはこれ以降における割合でありうる。網膜組織は、好ましくは細胞が層構造を形成している。
　網膜組織は、通常の方法で、培養基材から回収することができる。例えば、網膜組織は、ピンセットなどの器具で回収することができる。あるいは、培養基材を刺激応答性ポリマー（例えば、温度応答性ポリマーまたは光応答性ポリマー）でコーティングした場合、対応する刺激を与えることにより、網膜組織を回収することができる。例えば、所定の温度を境にポリマーの性質が可逆的に細胞接着性（疎水性）から細胞非接着性（親水性）に変化する温度応答性ポリマーを使用した場合、培養基材をその所定の温度におくことで、網膜組織を回収することができる。
　回収した網膜組織は、通常の培養容器で維持することができ、好適な保存容器に移して凍結保存してもよい。
　網膜組織の形状およびサイズは、領域Aの形状およびサイズに依存する。網膜組織の面積は、0.01～100 cm2、0.03～30 cm2、0.1～10 cm2でありうる。ある実施形態において、網膜組織の面積は、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、または1 cm2以上、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1 cm2以下である。例えば、網膜組織の面積は、0.5～10 cm2、0.7～10 cm2、1～10 cm2、0.5～5 cm2、0.7～5 cm2、または1～5 cm2でありうる。また、網膜組織は、直径が、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、または1 cm以上、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1 cm以下の、円形、またはこれと同面積の多角形でありうる。ある実施形態において、網膜組織は、直径が、0.1～10 cm、0.1～5 cm、0.1～3 cmまたは0.2～1 cmの円形である。さらなる実施形態において、網膜組織は、直径が、1～10 cm、1～5 cm、または1～3 cmの円形である。本明細書において、網膜組織が円形または多角形であるとは、同形状の領域Aを有する培養基材を用いて本開示の方法により製造される網膜組織と同様の形状を有することを意味する。本明細書において、網膜組織の面積および直径とは、実体顕微鏡を用いて撮影された画像に基づいて測定した、網膜組織の外周内の面積および外周中の任意の２点を結んだ直線の中で最も長い直線の長さをそれぞれ意味する。網膜組織は、厚さが、10、20、30、40、50、60、70、80、90、または100 μm以上、500、400、300、290、280、270、260、250、240、230、220、210または220 μｍ以下でありうる。ある実施形態において、網膜組織は、厚さ50 μm～300 μmである。網膜組織は全体が同じ厚さである必要はなく、網膜組織の厚さの範囲を規定する場合、当該網膜組織の任意の箇所の厚さがその範囲内にあればよい。本開示の方法により得られる網膜組織は、通常、培養基材に対して垂直方向の細胞数が約30個まで、または厚さが500 μｍ以下であり、シート状の網膜組織またはまたは網膜シートともいうことができる。それゆえ、ある態様において本開示は、シート状多能性幹細胞由来網膜組織を提供する。
　本開示の方法により製造された網膜組織は、移植材料として、疾患、特に網膜組織または網膜細胞の障害を伴う疾患または網膜組織または網膜細胞の障害に起因する疾患の治療に用いることができる。すなわち、本開示は、本開示の網膜組織を含む疾患を治療するための組成物および本開示の網膜組織を対象に移植することを含む疾患の治療方法を提供する。
　網膜組織または網膜細胞の障害を伴う疾患または網膜組織または網膜細胞の障害に起因する疾患としては、網膜変性症、網膜色素変性症、加齢黄斑変性症、有機水銀中毒、クロロキン網膜症、緑内障、糖尿病性網膜症、および新生児網膜症などが挙げられる。ある実施形態において、疾患は、網膜色素変性症である。
　移植に用いる場合、網膜組織は、当該網膜組織を移植する対象（すなわち、レシピエント）と組織適合性が高い多能性幹細胞から誘導されたものであることが好ましい。ある実施形態において、網膜組織は、対象と組織適合性抗原（例えば、HLA型）の一部または全部が一致する多能性幹細胞、または当該対象の細胞から樹立した多能性幹細胞である。
　網膜組織は、分化誘導終了後の形状およびサイズのまま治療に用いてもよく、層構造を維持しつつピンセット等の手段を用いて適切な大きさに切断して用いてもよい。本開示の網膜組織を含む組成物は、網膜組織に加え、医薬上許容される担体を含んでもよい。医薬上許容される担体としては、生理食塩水、緩衝液、無血清培地等などの生理的な水性溶媒が挙げられる。組成物はさらに、保存剤、安定剤、還元剤、等張化剤等の添加剤を含んでもよい。本開示の網膜組織を含む組成物は凍結保存されてもよく、その場合、組成物は好適な凍結保護剤を含みうる。
　本開示の方法により製造された網膜組織は、網膜組織に対する薬剤の毒性または薬効の評価に用いることもできる。ある実施形態において、本開示の網膜組織は、網膜組織または網膜細胞の障害を伴う疾患または網膜組織または網膜細胞の障害に起因する疾患の治療薬の毒性評価または薬効評価に用いられる。この場合、網膜組織は、前記疾患を患う対象から樹立された多能性幹細胞から製造されたものであることが好ましい。
　本開示の方法により製造された網膜組織は、移植または毒性および薬効評価に適した構造を有し、層構造を維持した状態で用いるが、場合により、（例えば、タンパク質分解酵素やピペッティグなどの通常の手段により）分散して細胞懸濁液を調整し、これを対象に投与することもでき、そのような網膜組織の使用方法の本開示の範囲内である。
　本開示の例示的実施形態を以下に示す。
［１］
　細胞接着性を有する領域Aと、前記領域Aの少なくとも一部に隣接する前記領域Aよりも細胞接着性の低い領域Bとをその表面に有する培養基材上の領域Aにおいて、多能性幹細胞の網膜組織への分化を誘導することを含む、網膜組織の製造方法。
［２］
　領域Aが、細胞接着性物質でコーティングされている、前記１に記載の方法。
［３］
　細胞接着性物質が、ラミニンである、前記２に記載の方法。
［４］
　領域Aが、領域Bに囲まれている、前記１～３のいずれかに記載の方法。
［５］
　領域Aの面積が、0.03～10 cm2である、前記１～４のいずれかに記載の方法。
［６］
　領域Aが、直径0.1～3 cmの円形である、前記１～５のいずれかに記載の方法。
［７］
　領域Bが、細胞非接着性物質でコーティングされている、前記１～６のいずれかに記載の方法。
［８］
　細胞非接着性物質が、MPCポリマーである、前記７に記載の方法。
［９］
　多能性幹細胞の網膜組織への分化誘導が、多能性幹細胞をBMPシグナル作用薬を含む培地で培養することを含む、前記１～８のいずれかに記載の方法。
［１０］
　多能性幹細胞の網膜組織への分化誘導が、以下の工程を含む、前記１～９のいずれかに記載の方法：
(1) 多能性幹細胞を、BMPシグナル阻害薬を含む培地で培養すること、および
(2) 工程(1)で得られた細胞を、BMPシグナル作用薬を含む培地で培養すること。
［１１］
　BMPシグナル作用薬を含む培地で細胞を5～10日間培養する、前記９または１０に記載の方法。
［１２］
　BMPシグナル作用薬が、BMP4である、前記９～１１のいずれかに記載の方法。
［１３］
　BMPシグナル阻害薬を含む培地で細胞を4～6日間培養する、前記１０～１２のいずれかに記載の方法。
［１４］
　BMPシグナル阻害薬がLDN-193189である、前記１０～１３のいずれかに記載の方法。
［１５］
　多能性幹細胞がヒトiPS細胞またはES細胞である、前記１～１４のいずれかに記載の方法。
［１６］
　網膜組織への分化誘導に先立ち、多能性幹細胞を未分化維持因子を含む培地で培養することを含む、前記１～１５のいずれかに記載の方法。
［１７］
　未分化維持因子を含む培地がさらにROCK阻害薬を含む、前記１６に記載の方法。
［１８］
　網膜組織の製造方法であって、以下の工程を含む方法：
(1) 多能性幹細胞を、BMPシグナル阻害薬を含む培地で培養すること、および
(2) 工程(1)で得られた細胞を、BMPシグナル作用薬を含む培地で培養すること。
［１９］
　BMPシグナル作用薬を含む培地で細胞を5～10日間培養する、前記１８に記載の方法。
［２０］
　BMPシグナル作用薬がBMP4である、前記１８または１９に記載の方法。
［２１］
　BMPシグナル阻害薬を含む培地で細胞を4～6日間培養する、前記１８～２０のいずれかに記載の方法。
［２２］
　BMPシグナル阻害薬がLDN-193189である、前記１８～２１のいずれかに記載の方法。
［２３］
　多能性幹細胞がヒトiPS細胞またはES細胞である、前記１８～２２のいずれかに記載の方法。
［２４］
　工程(1)に先立ち、多能性幹細胞を未分化維持因子を含む培地で培養することを含む、前記１８～２３のいずれかに記載の方法。
［２５］
　未分化維持因子を含む培地がさらにROCK阻害薬を含む、前記２４に記載の方法。
［２６］
　前記１～１７のいずれかに記載の方法により製造される網膜組織。
［２７］
　前記１８～２５のいずれかに記載の方法により製造される網膜組織。
［２８］
　面積が0.5～10 cm2である、シート状多能性幹細胞由来網膜組織。
［２９］
　直径1～10 cmの円形である、シート状多能性幹細胞由来網膜組織。
［３０］
　前記２６～２９のいずれかに記載の網膜組織を含む組成物。
［３１］
　疾患の治療に用いるための、前記３０に記載の組成物。
［３２］
　疾患が、網膜組織または網膜細胞の障害を伴う疾患または網膜組織または網膜細胞の障害に起因する疾患である、前記３１に記載の組成物。
［３３］
　疾患が、網膜色素変性症である、前記３１または３２に記載の組成物。
［３４］
　毒性評価または薬効評価に用いるための、前記３０に記載の組成物。
［３５］
　網膜組織または網膜細胞の障害を伴う疾患または網膜組織または網膜細胞の障害に起因する疾患を治療する方法であって、前記治療を必要とする対象に前記２６～２９のいずれかに記載の網膜組織を移植することを含む、方法。
［３６］
　網膜組織または網膜細胞の障害を伴う疾患または網膜組織または網膜細胞の障害に起因する疾患を治療するための、前記２６～２９のいずれかに記載の網膜組織。
［３７］
　網膜組織または網膜細胞の障害を伴う疾患または網膜組織または網膜細胞の障害に起因する疾患を治療するための医薬の製造のための、前記２６～２９のいずれかに記載の網膜組織の使用。
　本発明を以下の実施例によりさらに説明するが、本発明は如何なる意味においてもこれら実施例に限定されるものではない。
I. パターニング培養
I-1. PDMSシートの作成
1. 3Dプリンター（Formlab3）で先端に目的の細胞接着領域の形状を持つ柱状の鋳型を作成した。
2. PDMS (ポリジメチルシロキサン)（SILPOT184 W/C, Dow Corning Toray Co.,Ltd.）を硬化剤（10:1）と混和し、真空脱気した。
3. 3Dプリンターで作成した鋳型をペトリディッシュ表面に置き、PDMSを流し込み、80℃で2時間硬化させた後、鋳型からPDMSシートを外して、余分な部分を切り取って目的のPDMSシートを得た。
I-2. 分化誘導
　以下の手順により網膜への分化誘導を行った。図１に実験スキームを示す。

＜Day0: ディッシュの準備＞
手順
1. 作製したPDMSシートを70%エタノールで消毒し、ディッシュ（μ-Dish 35mm, High, 81156, ibidi）上に置いた。
2. ディッシュの蓋を外し、60℃で5-10分間ヒートブロックにてインキュベートした。乾きにくい場合は60℃にセットした乾燥機で乾燥した。
3. 7μL iMatrix-511（Nippi. Inc.）を500μL PBSに加え、PDMSシートの円内（直径1 cm）に200μL添加した。
4. 1時間以上、37℃もしくは室温（RT）でインキュベートした。
＜Day0: ディッシュへの細胞播種＞
準備
・TrypLETM Select（1 mM EDTA含有）（Thermo Fisher Scientific）を等量の0.5 mM EDTA/PBSと混合し、0.5X TrypLETM Selectを調製した（最終濃度 0.75 mM EDTA)。
・StemFit (登録商標) AK02N（Ajinomoto Co., Inc.）（添付のA液、B液、C液を混合したもの、以下AK02Nと記載する）に培地の1/1000量の10 mM Y-27632（TOCRIS）を加えてよく混合した（最終濃度10 μM）（以下、AK02N+Yと記載する）。

手順
1. 至適なコンフルエントに達したKhES-1_Rx::Venus細胞（網膜マーカーであるRx遺伝子座に改変型GFPのVenusをノックインしたKhES-1細胞）から培地を除去し、PBS（-）1 mLで2回洗浄した。
2. 細胞に0.5X TrypLETM Selectを500 μL/well加え、37℃、5%CO2下でインキュベートした。
3. 0.5X TrypLETM Selectを除去し、2 mL/wellのPBS（-）を加え、PBS（-）を吹きかけて、細胞を剥がした。
4. 15 mLファルコンチューブに細胞を回収し、セルカウントを行った。
5. 必要な細胞数（ディッシュ1枚あたり5×105 cells）を別のチューブに移し、1000 rpm、20℃にて5分遠心した。
6. 上清を除去し、細胞をAK02N+Yに、5×105 cells/200μL AK02N+Yになるように懸濁した。
7. PDMSシート内のiMatrixコート液をアスピレーターで除去し、細胞懸濁液(5×105 cells/200μL AK02N+Y)を加え、37℃で30分間インキュベートした。
8. 殺菌したピンセットを使用し、PDMSシートをディッシュから除いた。
9. 300μLのAK02N+Yを追加で加え、37℃、5%CO2下で培養した。
＜Day1: AK02+PSで培地交換＞
手順
1. AK02NにPenicillin-Streptomycin（15070-062, Thermo Fisher Scientific）を加えてよく混合した（Y-27632不含、以下AK02N+PSと記載する）。
2. アスピレーターで培地を除去し、500μLのAK02N+PSを加えた。
＜Day2: 分化誘導開始＞
手順
1. 細胞を1 mLのgfCDM (10%KSR) （表１）で3回洗浄した。
2. 培地全量を1 mLのgfCDM (10%KSR) に交換した。

Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 *BSA (5g)に20 mLの細胞培養用水（W3500, Sigma Aldrich）を加え、数時間置いて溶解した。
＜Day3, Day6: BMP阻害薬添加＞
1. LDN-193189（04-0074-02, ReproCELL Inc.）（以下、LDNと記載）を含有するgfCDM (10%KSR) 1 mLにて培地全量を交換した（最終濃度100 nM LDN）。
＜Day8: BMP添加＞
1. 1 mLのgfCDM (10%KSR) で3回洗浄した。
2. 1 mLのBMP4含有gfCDM (10%KSR) で培地全量を交換した (終濃度1.5 nM BMP4)。
　BMP4含有培地は、10μgのBMP4（R&D Systems）を275μLの0.1%BSAで希釈して調製した1μM BMP4溶液をgfCDM (10%KSR) に添加して調製した。
＜Day11, Day14: 半量培地交換＞
1. 500 μLの培地を除き、500 μLのgfCDM (10%KSR) を加えた（半量交換）。
　以降、3日ごとに培地半量を交換した。
＜Day17: DMEM/F-12+N2で培地交換＞
1. 1 mL のDMEM/F-12, GlutaMAXTM supplement (10565-042, Thermo Fisher Scientific) で3回洗浄した。
2. DMEM/F-12+N2（表２）を1 mL加えた。

Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
3. Day20まで培養した。
＜Day20以降: コントロール成熟培地で培養＞
1. 1 mL のコントロール成熟培地（表３）で3回洗浄した。
2. コントロール成熟培地を1 mL加え、培養した。

Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　以降、2～3日に1回培地交換した。
　パターニング培養しない細胞は、PDMSシートを用いずにiMatrix-511（Nippi. Inc.）で全面をコーティング（0.25 μg/cm2）したマイクロディッシュ（μ-Dish 35mm, High, 81156, ibidi）を使用して同様に培養した。
II. パターニング培養の網膜分化への影響
II-1. 解析方法
・RNA sequencing (RNA-seq)
1. パターニング培養した細胞およびパターニング培養しない細胞のDay8のサンプルからRNeasy Micro kit (QIAGEN)を用いて total RNAを調製した。
2. Next Ultra II Directional RNA Library Prep Kit for illumine E7760 (NEB)を用いてシークエンスラーブラリーを調製し、次世代シーケンサー（NextSeq, illumina）を用いてシーケンス配列を決定した。
3. FastQC (v0.11.9)、TrimGalore (0.6.1)、cutadapt (1.18)、Bowtie2 (v2.4.19)を用いてシーケンスデータのクオリティチェックを行い、STAR (2.7.5a)、samtools (1.1)、SUBREAD(v2.0.1)にてマッピングを行った後に、R (version3.6.3)、edgeR (v.3.28.1)を用いて二次解析を行った
・遺伝子オントロジー（GO）解析
II-1.の二次解析により得た発現変動遺伝子のリストについてMetascapeを使用してGO Biological processesのエンリッチメント解析を行った。
・シングルセルRNA-seq（scRNA-seq）
1. Day100の網膜組織を、150 μg/mlのDNase I（Roche）を添加したTrypLETM Select（Thermo Fisher Scientific）を用いて、37℃で5分間かけて単細胞に解離させた後、0.04%BSA/PBSで中和した。
2. 解離した細胞をペレット化し、0.04%BSA/PBSで再懸濁し、35 μmのフィルターに通し、単細胞懸濁液を得た。
3. Chromium Single Cell 3' Reagent Kit v3 (10x, Genomics)を用いて約10000個の単一細胞由来のcDNAライブラリーを調製した。Illumina NovaSeqシーケンサーでペアエンド100サイクルキット（28+8+91）を用いてシーケンスを決定した。
4. CellRanger (version3.0.2)を用いてマッピングし、Seurat (version3.0)により二次解析を行った。
　各細胞について以下のマーカーを使用した。
茎細胞（Stalk）: VAX1/PAX2
網膜色素上皮細胞（RPE, retinal pigment epithelium): MITF/PMEL
アマクリン細胞（AC, amacrine cell): ONECUT3/PRDM13
網膜神経節細胞（RGC, retinal ganglion cell): POU4F2
光受容細胞（PR, photoreceptor cell): CRX/NEUROD4
神経前駆細胞（NPC, Neural precursor cell): HES6/NEUROD1
網膜前駆細胞（Retinal progenitors）: CHX10/PAX6
・GFP発現観察
　GFP発現細胞は、Keyenceオールインワン顕微鏡BZ-Xを用いて観察した。10Xレンズで位相差画像およびGFP蛍光画像を取得した後、タイリング処理によりコロニーの全体画像を作成した。
・免疫染色
　Chx10、Recoverin、FOXG1、Crx、Tuj1、Zo-1、およびPax6の発現は、各マーカーに特異的な一次抗体と、その一次抗体に適する二次抗体を用いた免疫染色により評価した。
II-2. パターニング培養での網膜分化誘導
　パターニング培養した細胞とパターニング培養していない細胞（全面播種）の遺伝子発現を比較した。BMP4添加前（Day8）の細胞を用いてRNA-seqおよびGO解析を行った。パターニング培養した細胞では、パターニング培養していない細胞と異なり、網膜分化を誘導するBMP4の添加前から神経分化が亢進していた（図２）。パターニング培養していない細胞ではBMPおよびHippoシグナルが亢進していた（図３）。
　BMP4添加後の網膜分化を、網膜マーカーであるRxのプロモーター下に発現するGFP（venus）を経時的に観察することにより評価した。パターニング培養した細胞では早期にGFP発現が観察され、パターニング培養していない細胞と比較して分化誘導効率がよいことが示された（図４）。また、Day18において、双極細胞およびその前駆細胞のマーカーであるChx10の発現を評価した。パターニング培養した細胞とパターニング培養していない細胞のそれぞれについて、BMP4添加時と非添加時の発現を評価した。Chx10の発現は定量的PCR（HPRT1を内在性コントロールとして使用）および免疫染色により評価した。図５に示すように、パターニング培養した細胞は、パターニング培養していない細胞と比較してChx10の発現が顕著に増加した。パターニング培養により網膜分化誘導した細胞のDay18の写真を図６に示す。ほぼ全面でRxおよびChx10の発現が確認され、95％以上の細胞がこれらのマーカーを発現すると考えられた。Day58において、パターニング培養により網膜分化誘導した細胞では、網膜視細胞マーカーのRecoverinの発現が観察された（図７）。パターニング培養しBMP4を添加しなかった細胞では、Day18において終脳マーカーであるFOXG1が発現していた（図８）。
II-2. 分化効率
　Day100のパターニング培養にて網膜分化誘導した細胞についてscRNA-seqを行った。scRNA-seqにより、97％以上の細胞が網膜細胞に分化していることが示された（図９左）。Day74の細胞のGFP発現をFACSにより評価したところ、90％以上がGFP陽性であった（図９右）。
II-3. パターニング培養のサイズ
　直径2 mm、5 mm、7 mm、および1 cmの円形の孔を有するPDMSシートを作成し、同様に網膜分化誘導を行った。Day20のGFP発現を評価したところ、いずれのサイズでも同様に分化誘導が確認された（図１０）。
II-4. 網膜組織の極性
　分化誘導した組織の極性（polarity）を評価した。Day40の網膜組織において、視細胞のマーカーであるCrxの発現を免疫染色により評価した。上面（apical）にCrxの発現が観察され、分化誘導した組織が網膜の極性を有することが示された（図１１）。
II-5. 他のESまたはiPS細胞株からの分化誘導
　KthES11細胞を用いて上記と同様にパターニング培養により網膜分化誘導を行い、Day50においてCrx、Chx10、および神経細胞マーカーであるTuj1の発現を免疫染色により評価した。組織全体でこれらマーカーの発現が確認され、KthES11細胞もKhES-1_Rx::Venus細胞と同様に網膜分化誘導されることが示された（図１２）。
　同様に、iPS細胞株である201B7細胞および253G1細胞を用いて網膜分化誘導を行い、Day34においてCrxおよびChx10の発現を評価した。組織全体でCrxおよびChx10の発現が確認され、これらiPS細胞でも同様に網膜分化誘導されることが示された（図１３）。さらに、201B7細胞から誘導したDay41の組織のZo-1およびChx10の発現を免疫染色により評価した。Zo-1はタイトジャンクションマーカーである。Zo-1およびChx10の発現は層状に観察され、分化誘導した組織が網膜の層構造を有することが示された（データ非提示）。
III. BMPシグナル阻害薬
　BMPシグナル阻害薬であるLDN-193189の分化誘導に対する効果を評価した。上記のパターニング培養においてDay3からDay8にLDN-193189を添加しなかった細胞のGFP発現を、LDN-193189を添加した細胞とDay11に比較した。LDN-193189を添加した細胞では、添加しなかった細胞を比較して均一なGFP発現が認められた（図１４）。
　さらに、パターニング培養した細胞およびパターニング培養しなかった細胞において、LDN-193189添加時および非添加時のGFPおよびChx10発現をDay18に評価した。Chx10の発現は定量的PCR（HPRT1を内在性コントロールとして使用）および免疫染色により評価した。パターニング培養しない場合でも、LDN-193189添加によりGFPおよびChx10の発現が増加し、網膜に誘導されやすくなることが示された（図１５、１６）。
IV. 親水性ポリマーを用いたパターニング培養
　MPC（2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）ポリマーをコーティングして細胞非接着性の領域を形成することによりパターニング培養を行った。1 cmの円形のPDMSシートをディッシュ（μ-Dish 35 mm, High, 81156, ibidi）に貼り付け、MPCポリマーを0.5 vol%の濃度で含むエタノール溶液でコーティングした後、PDMSシートを取り除いた。7μL iMatrix-511（Nippi. Inc.）を500μL PBSに加え、ディッシュに添加した。これにより、MPCポリマーでプレコートされた領域にはiMatrixは接着せず、PDMSシートで保護されていた1 cmの円形領域のみがiMatrixでコーティングされた。このディッシュを用いて、Day20からIwp2（REPROCELL）（2 μM）を加えたことを除き、上記と同様に網膜分化誘導を行った。
　MPCポリマーをコーティングして細胞非接着性の領域を形成した場合も、効率よく均一なGFP発現が観察された（図１７）。

Claims (16)

  1. 　細胞接着性を有する領域Aと、前記領域Aの少なくとも一部に隣接する前記領域Aよりも細胞接着性の低い領域Bとをその表面に有する培養基材上の領域Aにおいて、多能性幹細胞の網膜組織への分化を誘導することを含む、網膜組織の製造方法。
  2. 　領域Aが、細胞接着性物質でコーティングされている、請求項１に記載の方法。
  3. 　細胞接着性物質が、ラミニンである、請求項２に記載の方法。
  4. 　領域Aが、領域Bに囲まれている、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
  5. 　領域Bが、細胞非接着性物質でコーティングされている、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
  6. 　細胞非接着性物質が、MPCポリマーである、請求項５に記載の方法。
  7. 　多能性幹細胞の網膜組織への分化誘導が、以下の工程を含む、請求項１～６のいずれかに記載の方法：
    (1) 多能性幹細胞を、BMPシグナル阻害薬を含む培地で培養すること、および
    (2) 工程(1)で得られた細胞を、BMPシグナル作用薬を含む培地で培養すること。
  8. 　BMPシグナル作用薬がBMP4である、請求項７に記載の方法。
  9. 　BMPシグナル阻害薬がLDN-193189である、請求項７または８に記載の方法。
  10. 　網膜組織の製造方法であって、以下の工程を含む方法：
    (1) 多能性幹細胞を、BMPシグナル阻害薬を含む培地で培養すること、および
    (2) 工程(1)で得られた細胞を、BMPシグナル作用薬を含む培地で培養すること。
  11. 　請求項１～１０のいずれかに記載の方法により製造される網膜組織。
  12. 　直径1～10 cmの円形である、シート状多能性幹細胞由来網膜組織。
  13. 　請求項１１または１２に記載の網膜組織を含む組成物。
  14. 　疾患の治療に用いるための、請求項１３に記載の組成物。
  15. 　疾患が、網膜色素変性症である、請求項１４に記載の組成物。
  16. 　毒性評価または薬効評価に用いるための、請求項１３に記載の組成物。
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