WO2023037940A1 - 遊走細胞の遊走能の評価方法 - Google Patents

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    • G01N33/5029—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects on cell motility

Definitions

  • the present invention relates to a method for evaluating the migration ability of migratory cells such as cytotoxic T cells, and cell constructs used in the method.
  • mice and rats In vivo efficacy evaluations of candidate compounds for pharmaceuticals and their medicinal ingredients are conducted using animals such as mice and rats prior to evaluation in humans.
  • syngenic mice also referred to as allogeneic tumor-bearing mice
  • human-derived cells are three-dimensionally organized to use a cell structure simulating a human body for drug efficacy evaluation.
  • cytotoxic T cells that is, CTL
  • TIL tumor tissue-infiltrating lymphocytes
  • cancer immunotherapy is likely to be effective when CTLs are accumulated in the vicinity of cancer (eg, Non-Patent Documents 1 and 2). Therefore, the behavior of TILs has attracted attention as a target for determining whether immune checkpoint inhibitors are effective.
  • immune cells such as molecular targeted drugs and CAR-T (that is, chimeric antigen receptor-T cell) therapy used in cancer immunotherapy etc.
  • TIL has not been evaluated at the drug discovery stage.
  • Candidate compounds for these pharmaceuticals are mainly selected based solely on their affinity with target cancer cells, and then evaluated using syngenic mice.
  • Non-Patent Document 3 As a method for evaluating the migratory ability of migrating cells ex vivo, for example, a cell structure in which cancer cells are constructed in the form of spheroids is cultured in a culture medium containing CTL, whereby CTLs are introduced into the cell structure. There is an in vitro model that evaluates the invasion of cancer (Non-Patent Document 3).
  • Non-Patent Document 3 Since the cell structure described in Non-Patent Document 3 is a three-dimensional tissue that does not contain stromal cells, immune cells infiltrate the stromal tissue like in vivo and reach cancer cells. It is not possible to evaluate the manner in which
  • the problems to be solved by the present invention are to provide a method for evaluating the migration ability of migratory cells such as cytotoxic T cells, and a cell structure used in the method.
  • the present inventors have made intensive studies to solve the above problems, and found that the top surface of the stromal cell layer containing migratory cells and stromal cells does not contain migratory cells.
  • the migration ability of the migrating cells can be evaluated based on the position of the migrating cells in the cell structure after culturing, and the present invention was completed. came to.
  • the method for evaluating the migration ability of migratory cells comprises a stromal cell layer containing migratory cells and stromal cells, and the migratory cells on the top surface of the stromal cell layer.
  • the mobility of the migratory cell is the ratio of the height Hm of the migratory cell in the cell structure to the height Hs of the cell structure, and from the migratory cell to the cell structure
  • Pb be the intersection point between the bottom surface and the perpendicular line extending to the bottom surface of the cell structure
  • Pt be the intersection point of the straight line extending the perpendicular line to the top surface side of the cell structure and the top surface of the cell structure
  • the cell The height Hm of the migratory cell in the structure is the distance between the Pb and the migratory cell
  • the height Hs of the cell structure is the distance between the Pb and the Pt. It is a method of evaluating ability.
  • the cell structure according to the second aspect of the present invention has a migratory cell-free cell layer that does not contain the migratory cell on the top surface of the stromal cell layer, and the migratory cell-free cell layer is A cell structure containing migration target cells, wherein the migration target cells are cells that determine the migration direction of the migratory cells.
  • the cell structure according to the third aspect of the present invention has a migratory cell-free cell layer that does not contain the migratory cell on the top surface of the stromal cell layer, and the migratory cell-free cell layer is A cell structure that does not contain the target cell for migration.
  • migratory cells such as CTL are contained inside the cell structure composed of stromal cells, and the migratory cells migrate within the cell layer of the stromal cells. Therefore, the method for evaluating the migratory ability of migratory cells according to the present embodiment can more accurately evaluate the migratory ability of migratory cells in interstitial tissue by using the cell structure.
  • FIG. 1 is a diagram showing the relationship between the CTL mobility (%) of cell construct C and cell construct A and the relative survival rate (%) of cancer cells in Example 1.
  • FIG. 1 is a diagram showing the relationship between the CTL mobility (%) of cell construct C and cell construct A and the relative survival rate (%) of cancer cells in Example 1.
  • a "cell structure” is a three-dimensional structure in which multiple cell layers are laminated.
  • the term “cell layer” refers to a section image of a cross section in the thickness direction of a cell structure, when observed at a magnification that allows the cell nucleus to be recognized, that is, at a magnification that allows the entire thickness of the nuclear-stained section to be viewed. It is a layer composed of a group of cells and stroma that exist in the orthogonal direction and do not overlap with the cell nuclei in the thickness direction.
  • the term "layered” means that two or more different cell layers are stacked in the thickness direction.
  • a cell structure according to one embodiment of the present invention comprises a stromal cell layer containing migratory cells and stromal cells, and a top surface of the stromal cell layer containing no migratory cells. It is a three-dimensional structure having a cell layer.
  • cancer tissue is formed in contact with interstitial tissue, and migratory immune cells such as CTLs migrate through the interstitial tissue and reach the cancer tissue. Therefore, in order to evaluate the migratory ability in vivo, it is necessary to evaluate the manner in which migratory cells migrate in a three-dimensional tissue simulating interstitial tissue, as in the in vivo.
  • the cell structure according to this embodiment is a cell structure that mimics in vivo stromal tissue and cancer tissue, including migratory cells inside the stromal cell layer. Therefore, the cell structure is suitable as a cell model for evaluating the migration ability of migratory cells in vivo.
  • a cell structure according to one embodiment of the present invention comprises a stromal cell layer containing migratory cells and stromal cells, and a top surface of the stromal cell layer containing no migratory cells.
  • the migratory cell-free cell layer is preferably a three-dimensional structure located on the top surface of the cell structure.
  • the migratory cells used in this embodiment are not particularly limited as long as they are cells with migration ability.
  • Examples of migratory cells include immune cells such as lymphocytes and metastatic cancer cells. Lymphocytes include T cells, B cells, NK cells, macrophages, dendritic cells, and the like.
  • CTLs are particularly preferable because they play an important role in the efficacy of cancer immunotherapeutic drugs and immune cell drugs.
  • the migratory cells contained in the stromal cell layer of the cell structure according to this embodiment may be of one type, or may be of two or more types.
  • the migratory cell-free cell layer in the cell structure according to the present embodiment is included in the stromal cell layer, and is particularly limited as long as it is a cell layer that does not contain migratory cells to be evaluated for migration ability.
  • the cell layer not containing migration cells may be a cell layer containing target cells for migration (target cell layer for migration) or a cell layer not containing target cells for migration (layer not including target migration cells).
  • a cell structure in which the migratory cell-free cell layer is the migration target cell layer is referred to as a "first cell structure”
  • the migratory cell-free cell A cell structure whose layer does not contain migration target cells may be referred to as a "second cell structure”.
  • both the term "cell structure according to the present embodiment" are included.
  • migration target cells are cells that determine the migration direction of migrating cells.
  • cells to be migrated include cells that attract migratory cells and cells that repel migratory cells.
  • migration target cells include cancer cells (Non-Patent Documents 1 and 2), infected cells infected with viruses and bacteria (Non-Patent Documents 4 and 5), and cells that produce chemokines due to inflammation (Non-Patent Documents 6) and the like.
  • Cancer cells are cells that are derived from somatic cells and have acquired unlimited proliferative potential.
  • the migration target cell layer contained in the migration target cell layer of the cell structure according to the present embodiment may be of one type, or may be of two or more types.
  • the cancer cells when the cells to be migrated are cancer cells, the cancer cells may be established cultured cells or cancer cells collected from cancer patients.
  • Cancer cells collected from cancer patients may be cells that have been cultured and proliferated in advance. Specifically, primary cancer cells collected from cancer patients, artificially cultured cancer cells, iPS cancer stem cells, cancer stem cells, cancer treatment research and anticancer drug development. A prepared cancer cell line and the like can be mentioned. Moreover, it may be human-derived cancer cells, or non-human animal-derived cancer cells.
  • cells other than cancer cells collected from cancer patients may also be contained together with the cancer cells.
  • Cells other than cancer cells include, for example, one or more types of cells contained in solid tissue removed after surgery.
  • Cancers from which cancer cells to be included in the cell structure according to the present embodiment are derived include, for example, breast cancer (eg, invasive ductal carcinoma, non-invasive ductal carcinoma, inflammatory breast cancer, etc.), prostate Cancer (e.g., hormone-dependent prostate cancer and hormone-independent prostate cancer, etc.), pancreatic cancer (e.g., pancreatic ductal cancer, etc.), gastric cancer (e.g., papillary adenocarcinoma, mucinous adenocarcinoma and glandular squamous) epithelial cancer, etc.), lung cancer (e.g., non-small cell lung cancer, small cell lung cancer, malignant mesothelioma, etc.), colon cancer (e.g., gastrointestinal stromal tumor, etc.), rectal cancer (e.g., gastrointestinal stromal tumor, etc.), colorectal cancer (e.g., familial colorectal cancer, hereditary nonpolyposis colorectal cancer
  • the migration target cells contained in the first cell structure are cells that have an attraction property for migratory cells
  • the migratory cells in the cell structure migrate toward the migration target cell layer.
  • the migrating cells in the cell structure migrate in a direction away from the cell layer to be migrated, that is, toward the bottom surface of the stromal cell layer.
  • migratory cells in the cell structure randomly migrate inside the cell structure, so that migratory cells are present randomly throughout the cell structure after the culturing step.
  • stromal cells refer to “cells that constitute the stroma and are cells other than the migratory cells whose migration ability is to be evaluated".
  • Stromal cells contained in the cell structure according to this embodiment include, for example, fibroblasts, endothelial cells, pericytes, immune cells, inflammatory cells, and the like.
  • the stromal cells contained in the cell structure according to this embodiment may be of one type, or may be of two or more types.
  • the cell type of the stromal cells contained in the cell structure according to the present embodiment is not particularly limited. It can be selected as appropriate in consideration of the environment inside the body.
  • the stromal cells constituting the stromal cell layer of the cell structure according to the present embodiment are preferably one or more selected from the group consisting of fibroblasts, immune cells other than the migratory cells, and mast cells. In particular, it is preferable that at least fibroblasts are included, since the tissue environment in vivo can be more closely approximated.
  • the stromal cell layer of the cell structure according to the present embodiment may be a cell layer consisting only of fibroblasts and migratory cells, and may be composed of only two or more types of stromal cells including fibroblasts and migratory cells. It may be a cell layer consisting of one or more types of stromal cells including fibroblasts, migratory cells, and other cells.
  • the cell structure according to this embodiment may have a vascular network structure. That is, as the cell structure according to the present embodiment, a vascular network structure such as lymphatic vessels and/or blood vessels is constructed three-dimensionally inside the stromal cell layer to construct a tissue that is more similar to that in vivo. It is preferable to have In this embodiment and the specification of the present application, the term "vascular network structure" refers to a network structure such as a vascular network or a lymphatic network in a living tissue.
  • a vascular network structure can be formed by including endothelial cells that constitute vessels as interstitial cells.
  • the endothelial cells contained in the stromal cell layer of the cell structure according to this embodiment may be vascular endothelial cells or lymphatic endothelial cells. It may also contain both vascular endothelial cells and lymphatic endothelial cells.
  • the number of endothelial cells in the stromal cell layer of the cell structure according to this embodiment is not particularly limited as long as it is a sufficient number to form a vascular network structure. It can be appropriately determined in consideration of cell types other than cells and endothelial cells.
  • a vascular network structure was formed by setting the abundance ratio (cell number ratio) of endothelial cells to the total cells constituting the stromal cell layer of the cell structure according to the present embodiment to 0.1% or more.
  • a cell construct having a stromal cell layer can be prepared.
  • the number of endothelial cells in the cell structure according to this embodiment is preferably 0.1% or more of the number of fibroblasts, and 0.1 to 5.0. % is more preferred.
  • the total number of vascular endothelial cells and lymphatic endothelial cells is preferably 0.1% or more of the number of fibroblasts, and 0.1 More preferably ⁇ 5.0%.
  • the stromal cell layer of the cell structure according to this embodiment may contain one or more types of cells other than migratory cells and stromal cells.
  • the migration target cell layer of the first cell structure according to the present embodiment may contain one or more cells other than the migration target cell.
  • Other cells are not particularly limited as long as they do not affect the migratory properties of migrating cells in the stromal cell layer. Examples of such other cells include nerve cells, mast cells, epithelial cells, myocardial cells, smooth muscle cells, osteocytes, hepatocytes, spleen cells, pancreatic islet cells, pancreatic cells, alveolar epithelial cells and tissue stem cells. be done.
  • the other cells include cancer cells and inflammatory cells that do not have attracting or repelling properties for the migratory cells to be evaluated for migration ability, and migratory cells other than the migratory cells to be evaluated for migration ability. There may be.
  • the migration target cell-free layer of the second cell structure according to the present embodiment is composed of one or more of the other cells.
  • Cells including stromal cells, migratory cells, and migration target cells that constitute the cell structure according to the present embodiment are not particularly limited, and may be cells collected from animals. It may be a cultured cell, a cell obtained by subjecting a cell collected from an animal to various treatments, or a cultured cell line. In the case of cells collected from animals, the collection site is not particularly limited, and may be somatic cells derived from bones, muscles, internal organs, nerves, brains, bones, skin, blood, etc., or germ cells. It may well be an embryonic stem cell (ES cell).
  • ES cell embryonic stem cell
  • the biological species from which the cells constituting the cell structure according to the present embodiment are derived is not particularly limited. Cells can be used.
  • Cells obtained by culturing cells collected from animals may be primary cultured cells or subcultured cells.
  • examples of cells subjected to various treatments include induced pluripotent stem cells (iPS cells) and cells after induction of differentiation.
  • the cell structure according to the present embodiment may be composed only of cells derived from the same biological species, or may be composed of cells derived from a plurality of biological species.
  • the migratory cells in the cell structure according to this embodiment may be constructed so as to be uniformly dispersed throughout the stromal cell layer, or constructed to exist in a specific cell layer of the stromal cell layer. good too.
  • the cell structure according to the present embodiment preferably has migratory cells in a specific cell layer of the stromal cell layer, because the variation in mobility of each migratory cell in the cell structure is reduced.
  • a cell structure in which migratory cells are present in the range from the middle part to the bottom of the stromal cell layer is preferable because it is easy to reflect the level of migratory ability in the mobility. More preferred are cell structures in which migratory cells are present.
  • the cell structure according to the present embodiment is constructed by first forming a stromal cell layer on a base material such as a cell container and then forming a migratory cell-free cell layer on the top surface of the stromal cell layer.
  • the method for constructing the stromal cell layer and the migratory cell-free cell layer is not particularly limited. For example, a method of constructing one layer at a time and stacking them sequentially may be used, or a method of constructing two or more cell layers at once may be used. Both construction methods may be appropriately combined to construct multiple cell layers. It may be a method of construction. For example, a method of forming a layer for each cell type and sequentially stacking the cell layers may be used. It may be a method of constructing the structural cell structure at once.
  • a method of constructing one layer at a time and sequentially stacking and constructing for example, the method described in Japanese Patent No. 4919464, that is, the step of forming a cell layer and the ECM (that is, cell A method of continuously stacking cell layers by alternately repeating the step of contacting with a solution containing components of the outer matrix).
  • a cell mixture is prepared in advance by mixing all the cells that make up the cell structure, and each cell layer is formed with this cell mixture to construct the cell structure.
  • a cell structure can also be constructed by forming each cell layer for each cell type.
  • arginine-glycine-aspartic acid RGD
  • the coated cells are coated with a polymer containing the sequence and a polymer that interacts with the polymer containing the RGD sequence, and the coated cells coated with the adhesive film are placed in a cell culture vessel and then centrifuged to obtain the coated cells.
  • a method of constructing a cell structure composed of multiple cell layers by accumulating cells together can be mentioned.
  • a cell mixture is prepared in advance by mixing all the cells that constitute the cell structure, and the coated cells prepared by adding an adhesive component to this cell mixture are used.
  • a cell structure can be constructed by a single centrifugation process.
  • covering cells coated with endothelial cells and covering cells coated with fibroblasts are separately prepared, and after forming a multilayer consisting of covering cells of fibroblasts, the endothelial cells are formed thereon.
  • a cell structure with a vascular network structure sandwiched between thick fibroblast layers by stacking one layer of coating cells and further stacking multiple layers of fibroblast coating cells on top of it can be constructed.
  • the stromal cell layer and the migratory cell-free cell layer of the cell structure according to the present embodiment are a cell mixture in which cells are suspended in a solution containing at least a cationic buffer, an extracellular matrix component, and a polyelectrolyte. It can be easily constructed by a method of culturing after collecting on a substrate (International Publication No. 2017/183673, Japanese Patent No. 6427836).
  • step (C) it can be produced by a method comprising the following steps (A) to (C). After step (A) and step (B) are performed at least once, step (C) is performed. obtaining a mixture in which cells are suspended in a solution containing at least a cationic substance, an extracellular matrix component, and a polyelectrolyte; A step (B) of collecting the cells from the obtained mixture and forming a cell aggregate on a substrate; Step (C) of culturing the cell aggregate to obtain a cell structure.
  • cell aggregate means a group of cells.
  • Cell aggregates also include cell sediments (aggregates of cells formed by sedimenting cells) obtained by centrifugation, filtration, or the like.
  • the cell aggregate is a slurry-like viscous body.
  • slurry viscous material refers to Akihiro Nishiguchi et al. , Macromol Biosci. 2015 Mar;15(3):refers to a gel-like cell aggregate as described in 312-7.
  • a solution containing at least a cationic substance, an extracellular matrix component, and a polyelectrolyte contains cells used for constructing a cell structure. by suspending the The cell population to be suspended in the cell suspension solution may be all or part of the cells used for constructing the cell structure.
  • the cell suspension solution is prepared by dissolving cationic substances, extracellular matrix components, and polymer electrolytes in a solvent.
  • Solvents for preparing cell suspensions are not particularly limited as long as they are non-toxic to cells and do not impair growth or function, and water, buffer solutions, cell culture media, etc. are used. be able to.
  • the buffer include phosphate saline (PBS), HEPES, Hanks buffer, and the like.
  • Culture media include D-MEM, E-MEM, MEM ⁇ , RPMI-1640 and Ham's F-12.
  • Cationic substances include cationic buffers such as Tris-HCl buffer, Tris-Maleate buffer, Bis-Tris buffer, and HEPES, ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, polyvinylamine, polyallylamine, polylysine, polyhistidine, polyarginine, and the like.
  • the cationic substance used for producing the cell structure according to this embodiment is preferably a cationic buffer.
  • the concentration of the cationic substance is not particularly limited as long as it does not adversely affect cell growth and cell aggregate formation.
  • the concentration of the cationic substance in the cell suspension solution used in step (A) is preferably 10-100 mM, more preferably 20-90 mM, 30-80 mM, 40-70 mM, and 45-60 mM. , 50 mM.
  • the pH of the cationic buffer is not particularly limited as long as it does not adversely affect cell growth and cell aggregate formation.
  • the pH of the cationic buffer used as the cell suspension solution is preferably 6.0 to 8.0, more preferably 7.0 to 8.0, and 7.2 to 7.6. 1 is more preferred, and 7.4 is particularly preferred.
  • polyelectrolyte means a polymer having a dissociable functional group in the polymer chain. Any polymer electrolyte can be used as the polymer electrolyte used in the present embodiment as long as it does not adversely affect cell growth and cell structure formation.
  • Polyelectrolytes include glycosaminoglycans such as heparin, chondroitin sulfates (eg, chondroitin 4-sulfate, chondroitin 6-sulfate), heparan sulfate, dermatan sulfate, keratan sulfate, hyaluronic acid; Examples include, but are not limited to, carrageenan, polystyrene sulfonic acid, polyacrylamido-2-methylpropane sulfonic acid and polyacrylic acid.
  • the mixture prepared in step (A) may contain only one type of polymer electrolyte, or two or more types in combination.
  • glycosaminoglycans are preferably used, and heparin and/or dextran sulfate are more preferably used.
  • the amount of polyelectrolyte to be mixed with the cell suspension solution is not particularly limited as long as it does not adversely affect cell growth and cell structure production.
  • the concentration of the polyelectrolyte in the cell suspension solution may be more than 0 mg/mL, preferably 0.010 mg/mL or more, more preferably 0.020 mg/mL or more, and 0.025 mg/mL or more. is more preferable, and 0.05 mg/mL or more is even more preferable.
  • the concentration of the polyelectrolyte in the cell suspension solution is preferably less than 1.0 mg/mL, more preferably 0.75 mg/mL or less, further preferably 0.5 mg/mL or less, and 0.25 mg/mL. The following are more preferable, and 0.1 mg/mL or less is particularly preferable.
  • ECM extracellular matrix
  • Collagen laminin, fibronectin, vitronectin, elastin, tenascin, entactin, fibrillin, proteoglycan, glycosaminoglycan, or modifications or variants thereof.
  • Proteoglycans include chondroitin sulfate proteoglycans, heparan sulfate proteoglycans, keratan sulfate proteoglycans, dermatan sulfate proteoglycans, and the like.
  • Glycosaminoglycans include hyaluronic acid, chondroitin 4-sulfate, chondroitin 6-sulfate, dermatan sulfate, keratan sulfate, heparan sulfate and heparin.
  • the mixture prepared in step (A) may contain only one type of extracellular matrix component, or two or more types in combination.
  • the amount of the extracellular matrix component to be mixed with the cell suspension solution is not particularly limited as long as it does not adversely affect cell growth and cell structure production.
  • the concentration of the extracellular matrix component in the cell suspension solution may be more than 0 mg/mL, preferably 0.010 mg/mL or more, more preferably 0.020 mg/mL or more, and 0.025 mg/mL. 0.05 mg/mL or more is more preferable.
  • the concentration of the extracellular matrix component in the cell suspension solution is preferably less than 1.0 mg/mL, more preferably 0.75 mg/mL or less, even more preferably 0.5 mg/mL or less, and 0.25 mg/mL. mL or less is more preferable, and 0.1 mg/mL or less is particularly preferable.
  • the mixing ratio of the polyelectrolyte and the extracellular matrix component to be mixed in the cell suspension solution is 1:2 to 2:1.
  • the mixing ratio of the polyelectrolyte and the extracellular matrix component is preferably 1:1.5 to 1.5:1, preferably 1:1. more preferred.
  • step (C) is performed, specifically, after seeding the mixture prepared in step (A) as step (B), then laminating After preparing a mixture by performing step (A) using the cells to be treated, the mixture is seeded on the cell aggregate obtained in the previous step (B) as step (B). After repeating this for the required number of times, the step (C) can be performed to construct a cell structure with a sufficient thickness.
  • the cell composition of the mixture to be newly seeded on the cell aggregates obtained in step (B) may be the same as the cell composition that constitutes the already constructed cell aggregates. , can be different. Moreover, you may perform a process (A) collectively.
  • step (A) a mixture containing only fibroblasts is prepared as cells, and step (B) is performed to obtain a cell aggregate consisting of 10 fibroblast layers in a cell culture vessel.
  • step (A) a mixture containing only migratory cells is prepared as cells, and step (B) is performed to laminate one migratory cell layer on top of the ten fibroblast layers in the cell culture vessel.
  • step (B) a mixture containing only fibroblasts is prepared as cells, and step (B) is performed to stack 10 fibroblast layers on the migratory cell layer in the cell culture vessel.
  • a cell structure composed of stromal cell layers laminated in order for each cell type, such as 10 fibroblast layers, 1 migratory cell layer, and 10 fibroblast layers, can be constructed.
  • the thickness of the cell layer laminated in step (C) can be adjusted. The greater the number of cells seeded in step (B), the greater the number of cell layers laminated in step (C).
  • step (A) a mixture is prepared by mixing fibroblasts for 20 fibroblast layers and migratory cells for one migratory cell layer, and steps (B) and (C) are performed. , a cell structure having a thickness of 21 layers and in which migratory cells are scattered inside the structure.
  • a cell structure with a vascular network formed in the stromal cell layer is also similar to a cell structure with a vascular network formed only in a specific cell layer, and a cell structure with a vascular network formed in the interstitial cell structure.
  • Cellular structures can be constructed that are interspersed throughout the cell layer.
  • step (A) a mixture of all cells constituting the stromal cell layer, i.e., fibroblasts, vascular endothelial cells, and migratory cells, is prepared, and steps (b) and (c) are performed.
  • steps (b) and (c) are performed.
  • step (A) After step (A), (A'-1) removing the liquid portion from the resulting mixture to obtain cell aggregates, and (A'-2) suspending the cell aggregates in a solution. (B') precipitating the cells from the resulting suspension to form a cell pellet on the substrate.
  • step (A) the cells and the cell suspension solution may be mixed in a suitable container such as a dish, tube, flask, bottle, or plate. may be performed in The suspension in step (A'-2) may also be carried out in a suitable container such as a dish, tube, flask, bottle or plate, and carried out on the substrate used in step (B'). good too.
  • the liquid portion may be removed, for example by centrifugation or filtration. Conditions for centrifugation are not particularly limited as long as they do not adversely affect cell growth and formation of cell aggregates.
  • the liquid portion is removed by subjecting the microfuge tube containing the mixture to centrifugation at 400 xg for 1 minute at room temperature to separate the liquid portion from the cell aggregates.
  • the liquid portion may be removed after the cells have been collected by natural sedimentation.
  • step (A'-2) is not particularly limited as long as it does not adversely affect cell growth and cell aggregate formation.
  • cell culture media or buffers suitable for the cells used are used.
  • the substrate used in step (B) or (B') includes a culture vessel for use in culturing cells.
  • the culture vessel may be a vessel having a material and shape that are commonly used for culturing cells or microorganisms. Materials for the culture vessel include, but are not limited to, glass, stainless steel, and plastic. Culture vessels include, but are not limited to, dishes, tubes, flasks, bottles and plates.
  • the substrate is, for example, a material that is permeable to liquid but impermeable to cells in the liquid.
  • the substrate used in step (B) is preferably a permeable membrane.
  • Containers with such permeable membranes include cell culture inserts such as Transwell® inserts, Netwell® inserts, Falcon® cell culture inserts and Millicell® cell culture inserts, It is not limited to these.
  • step (B) or (B') Cells may be collected, for example, by centrifugation, magnetic separation, or filtration. Conditions for centrifugation are not particularly limited as long as they do not adversely affect cell growth. For example, cells are harvested by seeding the mixture or suspension into cell culture inserts and subjecting them to centrifugation at 400 xg for 1 minute at 10°C. Alternatively, cells may be collected by natural sedimentation.
  • a cell pellet may be formed on the substrate by removing the liquid portion from the suspension, for example by centrifugation or filtration. Alternatively, a sediment of cells may be formed on the substrate by spontaneous sedimentation.
  • the cell aggregate in step (B) or the cell sediment in step (B') may be layered.
  • Cultivation of cells in step (C) can be performed under culture conditions suitable for the cells to be cultured.
  • a person skilled in the art can select an appropriate medium according to the cell type and desired function.
  • Various conditions such as culture temperature and culture time can also be easily determined by those skilled in the art.
  • step (A) and step (B) are performed at least once using cells for constructing a stromal cell layer, and then step (C) is performed to construct a stromal cell layer.
  • step (A) and the step (B) are performed at least once on the constructed cell structure (that is, the stromal cell layer) using cells that construct a migratory cell-free cell layer
  • Step (C) is performed to construct a migratory cell-free cell layer on the top surface of the stromal cell layer.
  • step (C) When forming a vascular network structure in the stromal cell layer, after performing step (A) and step (B) at least once using cells that construct the stromal cell layer including vascular endothelial cells , in step (C), culture for a predetermined period, generally about 1 to 3 days. During this culture period, a vascular network is formed within the stromal cell layer. After that, the step (A) and the step (B) are performed at least once on the cell structure composed of the stromal cell layer, using cells that construct the migratory cell-free cell layer, and then the step (C ) to construct a migratory cell-free cell layer on the top surface of the stromal cell layer.
  • a cell structure having a vascular network structure formed in the stromal cell layer can be produced.
  • the migratory cells in the stromal cell layer are randomly generated during the culture period. wander to Therefore, in the case of the method, even if migratory cells exist only in a specific cell layer before step (C) is performed, the migratory cells are intermittent at the time of laminating the migratory cell-free cell layer. Randomly present in the cytoplasmic layer.
  • the size and shape of the cell structure according to this embodiment are not particularly limited as long as the migration ability of migrating cells can be evaluated.
  • the migration ability of migrating cells is evaluated based on the mobility in the cell construct, and the thickness of the cell construct is preferably 5 ⁇ m or more, and 10 ⁇ m or more, because the mobility of migrating cells can be easily measured. is more preferable, 50 ⁇ m or more is more preferable, and 100 ⁇ m or more is even more preferable.
  • the thickness of the cell structure is preferably 500 ⁇ m or less, more preferably 400 ⁇ m or less, and even more preferably 300 ⁇ m or less.
  • the upper limit and lower limit of the thickness of the cell structure can be combined arbitrarily.
  • the thickness of the cell structure is preferably 5 ⁇ m or more and 500 ⁇ m or less, more preferably 10 ⁇ m or more and 400 ⁇ m or less, even more preferably 50 ⁇ m or more and 300 ⁇ m or less, and even more preferably 100 ⁇ m or more and 300 ⁇ m or less.
  • the number of cell layers in the stromal cell layer of the cell structure according to this embodiment is preferably about 2 to 60 layers, more preferably about 5 to 60 layers, and even more preferably about 10 to 60 layers.
  • the cell layer of the migratory cell-free cell layer of the cell structure according to the present embodiment may be one layer, but two or more layers are preferable, and five or more layers are preferable because the migration ability of migratory cells can be evaluated more accurately. more preferred.
  • the number of cell layers in a cell structure is determined based on a slice image observed at a magnification that allows the cell nucleus to be recognized, that is, at a magnification that allows the entire thickness of the nuclear-stained section to be viewed. can be measured.
  • the section image when observed, the number of layers composed of a group of cells and stroma existing in a direction perpendicular to the thickness direction and having cell nuclei not overlapping in the thickness direction is counted. The number of layers thus counted is the number of cell layers of the cell structure.
  • the theoretical number of cell layers can be the number of cell layers of the cell structure.
  • a method for evaluating the migration ability of migratory cells according to one embodiment of the present invention comprises culturing the cell structure according to the present embodiment, and using the mobility of the migratory cells in the cell structure as an index to evaluate the migration ability of migratory cells. It is a method of evaluation. That is, the evaluation method according to this embodiment has the following steps: A culturing step of culturing a cell structure having a stromal cell layer containing migratory cells and stromal cells and a migratory cell-free cell layer containing no migratory cells on the top surface of the stromal cell layer. and, After the culturing step, an evaluation step of evaluating the migratory ability of the migratory cells based on the mobility of the migratory cells within the cell structure.
  • the mobility of migrating cells is the ratio (Hm/Hs) of the height Hm of migrating cells in the cell structure to the height Hs of the cell structure. Both Hs and Hm are measured based on a section image observed at a magnification that allows the cell nucleus to be recognized, that is, at a magnification that allows the entire thickness of the nuclear-stained section to be viewed. can do.
  • the section image first, the migrating cell whose mobility is to be measured is determined, the intersection of the perpendicular line extending from the migrating cell to the bottom surface of the cell structure and the bottom surface is Pb, and the perpendicular line is the cell structure.
  • the height Hm of the migrating cell in the cell structure is the distance between Pb and the migrating cell, and the height Hs of the cell structure is the distance between Pb and Pt. It is also preferable that the section of the cell structure is previously stained with migratory cells in addition to nuclear staining, and then the section image is obtained.
  • the culture time in the culture step is not particularly limited as long as the migrating cells inside the cell structure sufficiently migrate inside the cell structure. For example, it is preferably 12 hours or more, more preferably 1 day or more. Preferably, 1 to 3 days is more preferable.
  • Other culture conditions such as culture medium, culture temperature, etc. can be generally the same as those for culturing stromal cells.
  • the migratory cells in the cell structure migrate in random directions inside the cell structure, regardless of the level of the migratory cell's migratory ability. Therefore, the mobility of each migratory cell within the cell structure varies greatly.
  • the mobility of each migratory cell within the cell structure is less variable than when the second cell structure is used.
  • the migratory cells have sufficient migratory ability, almost all of the migrated cells in the cell structure are It migrates toward the migration target cell on the top surface of the cell structure. Therefore, the higher the migratory capacity of the migratory cells, the closer the mobility of the migratory cells to the maximum value of 100%.
  • the migratory cells within the cell structure will migrate more randomly through the stromal cell layer, so that the average mobility of the migratory cells within the cell structure will be lower than that of the migratory cells within the second cell structure. is only about the same as the average mobility of That is, the closer the average value of the mobility of the migrating cells in the cell structure to 100%, the higher the migratory ability of the migrating cells, and the smaller the average value, the lower the migratory ability of the migrating cells. do.
  • a migratory cell-free cell layer containing migration target cells is positioned on the top surface of the cell structure.
  • the mobility of the migratory cells becomes less than 100% when they migrate toward the migration target cells.
  • the migratory cells have sufficient migratory ability, the migratory cells in the cell structure are not affected by the migratory cells in the cell structure regardless of the distance between the migratory cells and the target cell at the start of culture. migrate toward target cells. Therefore, the higher the migratory ability of migratory cells, the higher the mobility of migratory cells, which corresponds to the position of the cell layer that does not contain migratory cells, and the smaller the variation in the mobility of migratory cells.
  • the evaluation method according to the present embodiment can evaluate not only the migratory ability of the migratory cells but also the degree of cell killing by the migratory cells against the migration target cells.
  • the degree of cell killing for migrating target cells is the ratio of the number of dead migrating target cells to the total number of migrating target cells in the cell structure.
  • the degree of cell killing for migrating target cells may be 1 minus the ratio of the number of live migrating target cells to the total number of migrating target cells in the cell structure.
  • the CTL In the case of using the first cell structure, when the average mobility is high and the cell-killing degree of migration target cells is also high, the CTL easily reaches target cancer cells in vivo, and Since they also have high attack power, they can be evaluated as highly effective migratory cells for cancer immunity. On the other hand, when the average mobility is high but the cell-killing ability of migration target cells is low, the CTL is evaluated as having high migration ability but low cytotoxicity.
  • the second cell structure if the degree of cell-killing of cells to be migrated is high, the CTL is evaluated as having high toxicity against non-target cells.
  • Example 1 Five types of cell structures with different presence/absence of CTL, positions of cancer cells and CTL within the structure, and presence/absence of a vascular network structure were produced, and the mobility and cell-killing degree of CTL were examined.
  • vascular endothelial cells human umbilical vein endothelial cells (also referred to as RFP-HUVEC) labeled with a fluorescent protein RFP (model number: cAP-0001RFP, manufactured by ANGIO-PROTEOMIE) were used, and as stromal cells, human neonatal cells were used.
  • RFP-HUVEC human umbilical vein endothelial cells labeled with a fluorescent protein RFP (model number: cAP-0001RFP, manufactured by ANGIO-PROTEOMIE) were used, and as stromal cells, human neonatal cells were used.
  • CTL-specific cancer cells that is, cancer cells that bind to CTL via HLA/neoantigen AKF9 and have toxic and attractive properties
  • human colon adenocarcinoma-derived cultured cell line HCT15 HCT15/ ⁇ 2m
  • HCT15 cells CTL non-specific cancer cells
  • HCT15 cells CTL non-specific cancer cells
  • Human colon adenocarcinoma-derived cultured cell line Colo320 Human colon adenocarcinoma-derived cultured cell line Colo320 (provided by Sapporo Medical University) was used as a cancer cell that is neither toxic, attractive nor repellent).
  • heparin sodium salt (model number: H3149-100KU, manufactured by Sigma) was used as the polymer electrolyte, and collagen (Collagen Type I, bovine skin, acid soluble) (model number : ASC-1-100-100, manufactured by NIP) and fibronectin (model number: F4759-5MG, manufactured by Sigma) were used.
  • DMEM medium (model number: 043-30085, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) containing 10% FBS and 1% antibiotic was used as a general-purpose medium, and EGM-2MV BulletKit medium was used as a medium for endothelial cells.
  • AIM-V medium model number: 0870112DK, manufactured by Gibco
  • P/S Penicillin-streptomycin
  • a culture vessel a Transwell culture insert (model number: 3470, manufactured by Corning) was used.
  • a 10% formalin buffer (model number: 062-01661, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used as a cell fixative.
  • Cell structure A A cell structure A including a cancer cell layer sandwiched between stromal cell layers and having a vascular network structure formed throughout the structure was produced and cultured in a medium containing CTL.
  • a cell suspension solution As a cell suspension solution, equal amounts of a 0.1 mg/mL heparin/50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) solution and a 0.1 mg/mL collagen/acetic acid solution (pH 3.7) were added. A mixed solution (ie, the final concentration of collagen and heparin was 0.05 mg/mL each) was prepared. Next, a cell population in which 1 ⁇ 10 6 NHDF and 1.5 ⁇ 10 4 RFP-HUVEC were mixed was suspended in the cell suspension solution to prepare a cell mixture. The cell mixture was then centrifuged at 1000 ⁇ g for 2 minutes at room temperature, the supernatant was removed, and 300 ⁇ L of universal medium was added to prepare a cell suspension.
  • Tris-HCl buffer (pH 7.4) solution As a cell suspension solution, equal amounts of a 0.1 mg/mL heparin/50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) solution and a 0.1 mg/mL collagen/acetic acid solution (p
  • the medium outside the culture vessel in which the stromal cell layer was formed was removed, and 1 mL of general purpose medium was added. After that, the medium in the insert of the culture vessel is removed, 1 ⁇ 10 3 cancer cells suspended in 100 ⁇ L of general-purpose medium are seeded, and placed in a CO 2 incubator (37° C., 5% CO 2 ). for 2 hours. As a result, a cancer cell layer was formed on the top surface of the stromal cell layer.
  • a cell population in which 1 ⁇ 10 6 NHDF and 1.5 ⁇ 10 4 RFP-HUVEC are mixed is suspended in the cell suspension solution to prepare a cell mixture, and the cell mixture is After centrifuging at room temperature at 1000 ⁇ g for 2 minutes and removing the supernatant, 200 ⁇ L of universal medium was added to prepare a cell suspension. 200 ⁇ L of the cell suspension was added to the insert of the culture vessel in which the cancer cell layer was formed, and the cells were seeded. , 5% CO 2 ) for 2 hours. After that, 1 mL of general-purpose medium was added to the outside of the culture vessel, and static culture was carried out in a CO 2 incubator (37°C, 5% CO 2 ) for 2 hours.
  • Cell construct A was cultured in culture medium supplemented with CTL. Specifically, after removing the medium outside the culture vessel and adding 1 mL of CTL medium, the medium in the culture vessel insert was removed and suspended in 300 ⁇ L of CTL medium. Three CTLs were added into the culture vessel insert and statically cultured in a CO 2 incubator (37° C., 5% CO 2 ) for 3 days.
  • Cell structure B A cell structure B having a stromal cell layer in which CTLs were uniformly dispersed throughout and a cancer cell layer on the top surface of the stromal cell layer was produced.
  • a cell population in which 2 ⁇ 10 6 NHDF and 3 ⁇ 10 4 RFP-HUVEC were mixed was suspended in the cell suspension solution to prepare a cell mixture.
  • the cell mixture was centrifuged at 1000 ⁇ g for 2 minutes at room temperature, the supernatant was removed, 300 ⁇ L of universal medium was added and suspended, and then 1 ⁇ 10 4 CTLs were added.
  • a cell suspension was prepared using
  • the medium outside the culture vessel in which the stromal cell layer was formed was removed, and 1 mL of general purpose medium was added.
  • the medium in the insert of the culture vessel is removed, and 1 ⁇ 10 4 or 3 ⁇ 10 4 cancer cells suspended in 300 ⁇ L of general-purpose medium are seeded, and placed in a CO 2 incubator (37° C., 5% CO 2 ) and statically cultured for 2 hours.
  • 1 mL of general-purpose medium was added to the outside of the culture vessel, and static culture was carried out for 1 day or 3 days in a CO 2 incubator (37° C., 5% CO 2 ).
  • a cell structure B was produced in which a cancer cell layer was formed on the top surface of the stromal cell layer.
  • Cell structure C Manufacture a cell structure C having a stromal cell layer formed so that CTLs are present in a specific cell layer located in the middle of the stromal cell layer and a cancer cell layer on the top surface of the stromal cell layer bottom.
  • a cell population in which 1 ⁇ 10 6 NHDF and 1.5 ⁇ 10 4 RFP-HUVEC were mixed was suspended in the cell suspension solution to prepare a cell mixture.
  • the cell mixture was then centrifuged at 1000 ⁇ g for 2 minutes at room temperature, the supernatant was removed, and 200 ⁇ L of universal medium was added to prepare a cell suspension.
  • a cell population in which 1 ⁇ 10 6 NHDF and 1.5 ⁇ 10 4 RFP-HUVEC are mixed is suspended in the cell suspension solution to prepare a cell mixture, and the cell mixture is After centrifuging at room temperature at 1000 ⁇ g for 2 minutes and removing the supernatant, 200 ⁇ L of universal medium was added to prepare a cell suspension. After seeding the cells by adding 200 ⁇ L of the cell suspension into the insert of the culture vessel in which the CTL layer was formed, the cells were centrifuged at 400 ⁇ g at room temperature for 2 minutes, and then placed in a CO 2 incubator (37° C., 5 % CO 2 ) for 2 hours.
  • a CO 2 incubator 37° C., 5 % CO 2
  • a cell population in which 2 ⁇ 10 6 NHDF and 3 ⁇ 10 4 RFP-HUVEC were mixed was suspended in the cell suspension solution to prepare a cell mixture.
  • the cell mixture was then centrifuged at 1000 ⁇ g for 2 minutes at room temperature, the supernatant was removed, and 200 ⁇ L of universal medium was added to prepare a cell suspension.
  • a cell structure E was manufactured which has a stromal cell layer in which CTLs are uniformly dispersed throughout and a vascular network is constructed throughout, and a cancer cell layer on the top surface of the stromal cell layer.
  • a cell population in which 2 ⁇ 10 6 NHDF and 3 ⁇ 10 4 RFP-HUVEC were mixed was suspended in the cell suspension solution to prepare a cell mixture.
  • the cell mixture was centrifuged at 1000 ⁇ g for 2 minutes at room temperature, the supernatant was removed, 300 ⁇ L of universal medium was added and suspended, and then 1 ⁇ 10 4 CTLs were added.
  • a cell suspension was prepared using
  • control cell structures B to E cell structures consisting only of a stromal cell layer before forming a cancer cell layer on the top surface are designated as control cell structures B to E, respectively. , and fixed in the same way.
  • a perpendicular line extending from the CTL to the bottom surface of the cell structure is drawn, and the intersection point Pb between the perpendicular line and the bottom surface of the cell structure, and the perpendicular line to the cell structure
  • the intersection point Pt between the straight line extending to the top surface and the top surface of the cell structure was determined, and the distance (Hm) between CTL and Pb and the distance (Hs) between Pt and Pb were measured.
  • CTL are CD8-positive cells
  • CTL in the cell structure are CD8-positive sites (sites immunostained with anti-CD8 antibody) in the image.
  • the mobility Hm/Hs was obtained by dividing the obtained Hs by Hm.
  • Cancer cells were detected by immunostaining (IF/ICC) using , and the ratio (confluence) was calculated.
  • the proportion of cancer cells in each cell structure was determined as the relative survival rate (%) when the proportion of cancer cells in the corresponding cell structure A containing no CTL was taken as 100%. 100-relative viability (%) is the cell killing rate (%).
  • Tables 1 and 2 show the results of the measured CTL mobility (%) and cancer cell relative survival rate (%) for cell constructs A to E and control cell constructs B to E.
  • Table 1 shows the results of cell structures that were cultured for 1 day with laminated cancer cell layers
  • Table 2 is the results of cell structures that were cultured for 3 days with laminated cancer cell layers.
  • the "cancer cell” column indicates the cell type of cancer cells used in the cell structure
  • the "seeding number” column indicates the number of cancer cells forming the cancer cell layer of the cell structure.
  • Cell constructs with "w/o" in the "cancer cell” column and "0" in the "number of seeding” column show the results of control cell constructs not laminated with a cancer cell layer.
  • Fig. 1 shows the relationship between the CTL mobility (%) of cell structure C and cell structure A and the relative survival rate (%) of cancer cells.
  • the plot is clearly divided into a group of CTL-specific cancer cell-containing cell constructs and a group of CTL non-specific cancer cell-containing cell constructs. The correlation between the cancer cell-killing ability of CTLs and the mobility of CTLs could be evaluated.
  • the plot is viewed by evaluation day, it was confirmed that the plot shifts to the left from the cell structure after culturing for 1 day to the cell structure after culturing for 3 days.
  • the cancer cell is not killed when the CTL and the cancer cell are separated, and the cancer cell is killed by the CTL only when the CTL migrates to the cancer cell and the two are sufficiently close to each other.
  • the plot showed changes in line with the prediction of changes over time, and it can be said that the model using the cell structure according to the present embodiment is a model that can evaluate the correlation between CTL mobility and killing ability.
  • migratory cells such as CTL are contained inside the cell structure composed of stromal cells, and the migratory cells migrate within the cell layer of the stromal cells. Therefore, the method for evaluating the migratory ability of migratory cells according to the present embodiment can more accurately evaluate the migratory ability of migratory cells in interstitial tissue by using the cell structure.

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Abstract

この遊走細胞の遊走能の評価方法は、遊走細胞と間質細胞とを含有する間質細胞層と、前記間質細胞層の天面に前記遊走細胞を含有していない遊走細胞不含細胞層とを有する細胞構造体を培養する培養工程と、前記培養工程後、前記細胞構造体内の前記遊走細胞の移動度に基づき、前記遊走細胞の遊走能を評価する評価工程とを有し、前記遊走細胞の移動度が、前記細胞構造体の高さＨｓに対する前記細胞構造体中の前記遊走細胞の高さＨｍの比であり、前記遊走細胞から前記細胞構造体の底面へ下した垂線と、前記底面との交点をＰｂとし、前記垂線を前記細胞構造体の天面側へ延長した直線と、前記細胞構造体の天面との交点をＰｔとし、前記細胞構造体中の前記遊走細胞の高さＨｍは、前記Ｐｂと前記遊走細胞との距離であり、前記細胞構造体の高さＨｓは、前記Ｐｂと前記Ｐｔとの距離である。

Description

遊走細胞の遊走能の評価方法
　本発明は、細胞障害性Ｔ細胞等の遊走細胞の遊走能を評価する方法、及び当該方法に使用される細胞構造体に関する。
　本願は、２０２１年９月１３日に日本に出願された特願２０２１－１４８８１７号について優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　医薬品やその薬効成分の候補化合物のin vivoにおける薬効評価は、ヒトでの評価の前に、マウスやラットなどの動物を用いた評価が行われている。例えば、製薬企業などで免疫薬剤の薬効を評価する場合には、一般的に、シンジェニックマウス（同種同系担癌マウスともいう）を用いて評価する。しかし、マウスとヒトには種差がある上、生き物のマウスで評価する場合には、個体間差の問題や倫理上の問題があり、多くの薬剤候補化合物を評価することは困難である。これらの点を解決するために、ヒト由来細胞を立体的に組織化させてヒトの生体を模した細胞構造体を、薬効評価に用いることが行われている。
　一方で、免疫細胞の中の細胞障害性Ｔ細胞（つまり、ＣＴＬ）は、血中からがん周辺の間質組織の中に浸潤し、腫瘍部に遊走する（腫瘍組織浸潤リンパ球、ＴＩＬともいう）。一般的には、ＣＴＬががんの近傍に集積している時に、がん免疫治療が奏功しやすいことが分かっている（例えば、非特許文献１及び２）。そのため、ＴＩＬの挙動は、免疫チェックポイント阻害剤が効くかどうか見極める対象として注目されている。このように、ヒト生体内のＴＩＬが重要視されているにもかかわらず、がん免疫治療などで用いられる分子標的薬やＣＡＲ－Ｔ（つまり、chimeric antigen receptor-T cell）療法などの免疫細胞薬では、創薬段階では、ＴＩＬに対する評価がなされていない。これらの医薬品の候補化合物は、対象のがん細胞との親和性のみを指標として選抜され、その後にシンジェニックマウスで評価を行うことが主流である。
　遊走細胞の遊走能をex vivoで評価する方法としては、例えば、がん細胞をスフェロイド状に構築した細胞構造体を、ＣＴＬを含む培養液中で培養することにより、当該細胞構造体内へのＣＴＬの浸潤を評価するin vitroのモデルがある（非特許文献３）。
Santoiemma and Powell, Cancer Biology & Therapy, 2015, vol. 16(6), p.807-820. Lin et al., Biomedicine ＆ Pharmacotherapy, 2020, vol.132, 110873 Herter et al., Cancer Immunology Immunotherapy, 2017, vol.66, p.129-140. Romo et al., Immunology, 2016, vol.148, p.125-139. Rouse and Sehrawat, NATURE REVIEWS, 2010, vol.10, p.515-526. Hughes and Nibbs, FEBS Journal, 2018, vol.285, p.2944-2971. Kochin, et al., Oncoimmunology, 2017, vol.6(4), e1293214.
　非特許文献３に記載される細胞構造体は、間質細胞が含まれていない三次元組織であるため、生体内のような、間質組織中を免疫細胞が浸潤してがん細胞へ到達する態様を評価することができない。
　創薬段階でＴＩＬに対する評価をより適切に行うことができれば、医薬品開発の効率化に資する。このために、ＴＩＬを評価するためにより適した細胞構造体の開発が望まれている。すなわち、本発明の解決すべき課題は、細胞障害性Ｔ細胞等の遊走細胞の遊走能を評価する方法、及び当該方法に使用される細胞構造体を提供すること等である。
　本発明者らは、上記課題を解決せんと鋭意研究を重ねたところ、遊走細胞と間質細胞とを含有する間質細胞層の天面に、当該遊走細胞を含有していない遊走細胞不含細胞層を積層させて構築した細胞構造体を培養することにより、培養後の細胞構造体中の遊走細胞の位置に基づき、当該遊走細胞の遊走能を評価し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
　本発明の第一態様に係る遊走細胞の遊走能の評価方法は、遊走細胞と間質細胞とを含有する間質細胞層と、前記間質細胞層の天面に前記遊走細胞を含有していない遊走細胞不含細胞層とを有する細胞構造体を培養する培養工程と、前記培養工程後、前記細胞構造体内の前記遊走細胞の移動度に基づき、前記遊走細胞の遊走能を評価する評価工程と、を有し、前記遊走細胞の移動度が、前記細胞構造体の高さＨｓに対する、前記細胞構造体中の前記遊走細胞の高さＨｍの比であり、前記遊走細胞から前記細胞構造体の底面へ下した垂線と、前記底面との交点をＰｂとし、前記垂線を前記細胞構造体の天面側へ延長した直線と、前記細胞構造体の天面との交点をＰｔとし、前記細胞構造体中の前記遊走細胞の高さＨｍは、前記Ｐｂと前記遊走細胞との距離であり、前記細胞構造体の高さＨｓは、前記Ｐｂと前記Ｐｔとの距離である、遊走細胞の遊走能の評価方法である。
　本発明の第二態様に係る細胞構造体は、前記間質細胞層の天面に前記遊走細胞を含有していない遊走細胞不含細胞層とを有し、前記遊走細胞不含細胞層が、遊走対象細胞を含有しており、前記遊走対象細胞は、前記遊走細胞の遊走方向を決定する細胞である、細胞構造体である。
　本発明の第三態様に係る細胞構造体は、前記間質細胞層の天面に前記遊走細胞を含有していない遊走細胞不含細胞層とを有し、前記遊走細胞不含細胞層が、前記遊走対象細胞を含有していない、細胞構造体である。
　本実施形態に係る細胞構造体は、ＣＴＬ等の遊走細胞が、間質細胞からなる細胞構造体の内部に含まれており、当該遊走細胞は、間質細胞の細胞層内を遊走する。このため、本実施形態に係る遊走細胞の遊走能の評価方法は、当該細胞構造体を用いることにより、間質組織内での遊走細胞の遊走能をより精度良く評価することができる。
実施例１において、細胞構造体Ｃと細胞構造体ＡのＣＴＬの移動度（％）とがん細胞の相対生存率（％）の関係を示した図である。
　本実施形態及び本願明細書において、「細胞構造体」とは、複数の細胞層が積層された３次元構造体である。「細胞層」とは、細胞構造体の厚み方向の断面の切片画像において、細胞核を認識できる倍率、つまり、核染色した切片の厚みの全体が視野に入る倍率で観察した際に、厚み方向と直交する方向に存在し、厚み方向に対して細胞核が重ならないで存在する一群の細胞および間質によって構成される層のことである。また、「層状」とは、異なる細胞層が厚み方向に２層以上重ねられているという意味である。
＜細胞構造体＞
　本発明の一実施形態に係る細胞構造体は、遊走細胞と間質細胞とを含有する間質細胞層と、前記間質細胞層の天面に前記遊走細胞を含有していない遊走細胞不含細胞層とを有する、立体構造体である。生体内では、がん組織は、間質組織に接して形成されており、ＣＴＬ等の遊走性の免疫細胞は、間質組織内を遊走してがん組織へ到達する。このため、生体内における遊走能を評価するためには、生体内と同様に間質組織を模した立体組織中を遊走細胞が遊走する態様を評価する必要がある。本実施形態に係る細胞構造体は、間質細胞層の内部に遊走細胞を含む、生体内の間質組織とがん組織を模した細胞構造体である。このため、当該細胞構造体は、生体内における遊走細胞の遊走能を評価するための細胞モデルとして好適である。
　本発明の一実施形態に係る細胞構造体は、遊走細胞と間質細胞とを含有する間質細胞層と、前記間質細胞層の天面に前記遊走細胞を含有していない遊走細胞不含細胞層とを有し、前記遊走細胞不含細胞層は、細胞構造体において最上面に位置する立体構造体であることが好ましい。
　本実施形態において用いられる遊走細胞としては、遊走能を有する細胞であれば、特に限定されるものではない。遊走細胞としては、例えば、リンパ球細胞等の免疫細胞及び転移性がん細胞等が挙げられる。リンパ球細胞としては、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ及び樹状細胞等が挙げられる。本発明において用いられる遊走細胞としては、特に、がん免疫治療薬や免疫細胞薬の薬効に重要な役割を果たすＣＴＬが好ましい。本実施形態に係る細胞構造体の間質細胞層に含まれる遊走細胞は、１種類であってもよく、２種類以上であってもよい。
　本実施形態に係る細胞構造体中の遊走細胞不含細胞層は、間質細胞層に含まれており、遊走能を評価する対象の遊走細胞を含有していない細胞層であれば、特に限定されるものではない。当該遊走細胞不含細胞層としては、遊走対象細胞を含有する細胞層（遊走対象細胞層）であってもよく、遊走対象細胞を含有していない細胞層（遊走対象細胞不含層）であってもよい。なお、以降において、本実施形態に係る細胞構造体のうち、遊走細胞不含細胞層が遊走対象細胞層である細胞構造体を、「第１の細胞構造体」といい、遊走細胞不含細胞層が遊走対象細胞不含層である細胞構造体を、「第２の細胞構造体」ということがある。また、特に記載なく「本実施形態に係る細胞構造体」という場合、第１の細胞構造体と第２の細胞構造体の両方を含む。
　本実施形態及び本願明細書において、遊走対象細胞とは、遊走細胞の遊走方向を決定する細胞である。遊走対象細胞としては、具体的には、遊走細胞に対する誘引性を有する細胞や、遊走細胞に対する忌避性を有する細胞である。例えば、遊走対象細胞としては、がん細胞（非特許文献１及び２）、ウイルスや細菌等に感染した感染細胞（非特許文献４及び５）及び炎症等によりケモカインを産生する細胞（非特許文献６）等が挙げられる。なお、がん細胞とは、体細胞から派生して無限の増殖能を獲得した細胞である。本実施形態に係る細胞構造体の遊走対象細胞層に含まれる遊走対象細胞は、１種類であってもよく、２種類以上であってもよい。
　本実施形態に係る細胞構造体において、遊走対象細胞ががん細胞である場合、当該がん細胞としては、株化された培養細胞であってもよく、がん患者から採取されたがん細胞であってもよい。がん患者から採取されたがん細胞は、予め培養して増殖させた細胞であってもよい。具体的には、がん患者から採取された初代がん細胞、人工培養がん細胞、ｉＰＳがん幹細胞、がん幹細胞及びがん治療の研究や抗がん剤の開発に利用するために予め準備されている株化がん細胞等が挙げられる。また、ヒト由来のがん細胞であってもよく、ヒト以外の動物由来のがん細胞であってもよい。なお、本実施形態に係る細胞構造体ががん患者から採取されたがん細胞を含む場合、がん患者から採取されたがん細胞以外の細胞も、がん細胞と共に含んでいてもよい。がん細胞以外の細胞としては、例えば、術後摘出した固形組織内に含まれる１種類以上の細胞が挙げられる。
　本実施形態に係る細胞構造体に含めるがん細胞の由来となるがんとしては、例えば、乳がん（例えば、浸潤性乳管がん、非浸潤性乳管がん及び炎症性乳がん等）、前立腺がん（例えば、ホルモン依存性前立腺がん及びホルモン非依存性前立腺がん等）、膵がん（例えば、膵管がん等）、胃がん（例えば、乳頭腺がん、粘液性腺がん及び腺扁平上皮がん等）、肺がん（例えば、非小細胞肺がん、小細胞肺がん及び悪性中皮腫等）、結腸がん（例えば、消化管間質腫瘍等）、直腸がん（例えば、消化管間質腫瘍等）、大腸がん（例えば、家族性大腸がん、遺伝性非ポリポーシス大腸がん及び消化管間質腫瘍等）、小腸がん（例えば、非ホジキンリンパ腫及び消化管間質腫瘍等）、食道がん、十二指腸がん、舌がん、咽頭がん（例えば、上咽頭がん、中咽頭がん及び下咽頭がん等）、頭頚部がん、唾液腺がん、脳腫瘍（例えば、松果体星細胞腫瘍、毛様細胞性星細胞腫、びまん性星細胞腫及び退形成性星細胞腫等）、神経鞘腫、肝臓がん（例えば、原発性肝がん及び肝外胆管がん等）、腎臓がん（例えば、腎細胞がん及び腎盂と尿管の移行上皮がん等）、胆嚢がん、胆管がん、膵臓がん、肝がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、卵巣がん（例、上皮性卵巣がん、性腺外胚細胞腫瘍、卵巣性胚細胞腫瘍及び卵巣低悪性度腫瘍等）、膀胱がん、尿道がん、皮膚がん（例えば、眼内（眼）黒色腫及びメルケル細胞がん等）、血管腫、悪性リンパ腫（例えば、細網肉腫、リンパ肉腫及びホジキン病等）、メラノーマ（悪性黒色腫）、甲状腺がん（例えば、甲状腺髄様がん等）、副甲状腺がん、鼻腔がん、副鼻腔がん、骨腫瘍（例えば、骨肉腫、ユーイング腫瘍、子宮肉腫及び軟部組織肉腫等）、転移性髄芽腫、血管線維腫、隆起性皮膚線維肉腫、網膜肉腫、陰茎癌、精巣腫瘍、小児固形がん（例えば、ウィルムス腫瘍及び小児腎腫瘍等）、カポジ肉腫、ＡＩＤＳに起因するカポジ肉腫、上顎洞腫瘍、線維性組織球腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、慢性骨髄増殖性疾患及び白血病（例えば、急性骨髄性白血病及び急性リンパ芽球性白血病等）等が挙げられ、これらに限定されない。
　第１の細胞構造体に含まれている遊走対象細胞が遊走細胞に対する誘引性を有する細胞である場合、当該細胞構造体内の遊走細胞は、遊走対象細胞層へ向かって遊走する。遊走対象細胞が遊走細胞に対する忌避性を有する細胞である場合、当該細胞構造体内の遊走細胞は、遊走対象細胞層から離間する方向へ、すなわち、間質細胞層の底面に向かって遊走する。一方で、第２の細胞構造体では、当該細胞構造体内の遊走細胞は、細胞構造体内部をランダムに遊走するため、培養工程後には、細胞構造体内部全体にランダムに遊走細胞が存在する。
　本実施形態及び本願明細書において、「間質細胞」とは、「間質を構成する細胞であって、遊走能を評価する対象の遊走細胞以外の細胞」をいう。本実施形態に係る細胞構造体に含まれる間質細胞としては、例えば、線維芽細胞、内皮細胞、周皮細胞、免疫細胞、炎症性細胞等が挙げられる。本実施形態に係る細胞構造体に含まれる間質細胞は、１種類であってもよく、２種類以上であってもよい。本実施形態に係る細胞構造体に含まれる間質細胞の細胞種としては、特に限定されなく、含有させる遊走細胞の種類、評価に使用される遊走対象細胞の種類、目的の遊走がなされる生体内の環境等を考慮して、適宜選択することができる。
　本実施形態に係る細胞構造体の間質細胞層を構成する間質細胞としては、線維芽細胞、前記遊走細胞以外の免疫細胞、及び肥満細胞からなる群より選択される１種以上が好ましい。特に、生体内の組織内環境とより近似させられることから、少なくとも線維芽細胞を含むことが好ましい。本実施形態に係る細胞構造体の間質細胞層としては、線維芽細胞と遊走細胞のみからなる細胞層であってもよく、線維芽細胞を含む２種類以上の間質細胞と遊走細胞のみからなる細胞層であってもよく、線維芽細胞を含む１種又は２種類以上の間質細胞と遊走細胞とその他の細胞とからなる細胞層であってもよい。
　血管網構造やリンパ管網構造は、遊走細胞の遊走や、生体内の環境を模するために重要である。このため、本実施形態に係る細胞構造体は、脈管網構造を備えていてもよい。すなわち、本実施形態に係る細胞構造体としては、間質細胞層の内部に、リンパ管及び／又は血管等の脈管網構造が三次元的に構築され、より生体内に近い組織を構築しているものが好ましい。なお、本実施形態及び本願明細書において、「脈管網構造」とは、生体組織における血管網やリンパ管網のような、網状の構造を指す。
　脈管網構造は、間質細胞として脈管を構成する内皮細胞を含むことにより形成させることができる。本実施形態に係る細胞構造体の間質細胞層に含まれる内皮細胞としては、血管内皮細胞であってもよく、リンパ管内皮細胞であってもよい。また、血管内皮細胞とリンパ管内皮細胞との両方を含んでいてもよい。
　本実施形態に係る細胞構造体の間質細胞層中の内皮細胞の数は、脈管網構造が形成されるのに充分な数であれば特に限定されなく、細胞構造体の大きさ、内皮細胞や内皮細胞以外の細胞の細胞種等を考慮して適宜決定することができる。例えば、本実施形態に係る細胞構造体の間質細胞層を構成する全細胞に対する内皮細胞の存在比（細胞数比）を０．１％以上にすることによって、脈管網構造が形成された間質細胞層を有する細胞構造体を調製できる。内皮細胞以外の細胞として線維芽細胞を用いる場合、本実施形態に係る細胞構造体における内皮細胞数は、線維芽細胞数の０．１％以上であることが好ましく、０．１～５.０％であることがより好ましい。内皮細胞として血管内皮細胞とリンパ管内皮細胞の両方を含む場合、血管内皮細胞及びリンパ管内皮細胞の総細胞数が、線維芽細胞数の０．１％以上であることが好ましく、０．１～５.０％であることがより好ましい。
　本実施形態に係る細胞構造体のうちの間質細胞層は、遊走細胞と間質細胞以外の細胞を１種又は２種以上含んでいてもよい。本実施形態に係る第１の細胞構造体のうちの遊走対象細胞層は、遊走対象細胞以外の細胞を１種又は２種以上含んでいてもよい。その他の細胞としては、間質細胞層内の遊走細胞の遊走性に影響を与えない細胞であれば特に限定されるものではない。当該他の細胞としては、例えば、神経細胞、肥満細胞、上皮細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、骨細胞、肝細胞、脾臓細胞、膵島細胞、膵細胞、肺胞上皮細胞及び組織幹細胞等が挙げられる。また、当該他の細胞としては、遊走能の評価対象である遊走細胞に対する誘引性や忌避性を有さないがん細胞や炎症性細胞、遊走能の評価対象である遊走細胞以外の遊走細胞であってもよい。本実施形態に係る第２の細胞構造体のうちの遊走対象細胞不含層は、１種又は２種以上の前記他の細胞からなる。
　本実施形態に係る細胞構造体を構成する間質細胞、遊走細胞及び遊走対象細胞を含む細胞は、特に限定されなく、動物から採取された細胞であってもよく、動物から採取された細胞を培養した細胞であってもよく、動物から採取された細胞に各種処理を施した細胞であってもよく、培養細胞株であってもよい。動物から採取された細胞の場合、採取部位は特に限定されず、骨、筋肉、内臓、神経、脳、骨、皮膚及び血液などに由来する体細胞であってもよく、生殖細胞であってもよく、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）であってもよい。また、本実施形態に係る細胞構造体を構成する細胞が由来する生物種は特に限定されなく、例えば、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウシ、マウス及びラット等の動物に由来する細胞を用いることができる。動物から採取された細胞を培養した細胞としては、初代培養細胞であってもよく、継代培養細胞であってもよい。また、各種処理を施した細胞としては、誘導多能性幹細胞細胞（つまりｉＰＳ細胞）や、分化誘導後の細胞が挙げられる。また、本実施形態に係る細胞構造体は、同種の生物種由来の細胞のみから構成されていてもよく、複数種類の生物種由来の細胞により構成されていてもよい。
　本実施形態に係る細胞構造体中の遊走細胞は、間質細胞層の全体に均一に分散させるように構築されてもよく、間質細胞層の特定の細胞層に存在するように構築されてもよい。細胞構造体中の各遊走細胞の移動度のばらつきが小さくなることから、本実施形態に係る細胞構造体としては、間質細胞層の特定の細胞層に遊走細胞が存在するものが好ましい。なかでも、遊走能の高低を移動度に反映させやすい点から、間質細胞層の中間部分から底部までの範囲内に遊走細胞が存在する細胞構造体が好ましく、間質細胞層の底部付近に遊走細胞が存在する細胞構造体がより好ましい。
　本実施形態に係る細胞構造体は、まず、細胞容器等の基材に間質細胞層を形成した後、当該間質細胞層の天面に、遊走細胞不含細胞層を形成することにより構築できる。間質細胞層や遊走細胞不含細胞層の構築方法は、特に限定されるものではない。例えば、一層ずつ構築して順次積層させて構築する方法であってもよく、２層以上の細胞層を一度に構築する方法であってもよく、両構築方法を適宜組み合わせて多層の細胞層を構築する方法であってもよい。例えば、細胞種毎に層を形成し、この細胞層を順次積層させることによって構築する方法であってもよく、複数種類の細胞を混合した細胞混合液を予め調製し、この細胞混合液から多層構造の細胞構造体を一度に構築する方法であってもよい。
　１層ずつ構築して順次積層させて構築する方法としては、例えば、特許第４９１９４６４号公報に記載されている方法、すなわち、細胞層を形成する工程と、形成された細胞層をＥＣＭ（つまり細胞外マトリックス）の成分を含有する溶液に接触させる工程と、を交互に繰り返すことにより、連続的に細胞層を積層する方法が挙げられる。例えば、当該方法を行うに際し、予め、細胞構造体を構成する全ての細胞を混合した細胞混合物を調製しておき、この細胞混合物によって各細胞層を形成することによって、細胞構造体が構築できる。また、各細胞層を、細胞種ごとに形成することによっても、細胞構造体が構築できる。
　２層以上の細胞層を一度に構築する方法としては、例えば、特許第５８５０４１９号公報に記載されている方法、すなわち、予め細胞の表面全体をインテグリンが結合するアルギニン－グリシン－アスパラギン酸（ＲＧＤ）配列を含む高分子と前記ＲＧＤ配列を含む高分子と相互作用をする高分子によって被覆しておき、この接着膜で被覆された被覆細胞を細胞培養容器に収容した後、遠心処理等によって被覆細胞同士を集積させることにより、多層の細胞層からなる細胞構造体を構築する方法が挙げられる。例えば、当該方法を行うに際し、予め、細胞構造体を構成する全ての細胞を混合した細胞混合物を調製しておき、この細胞混合物に接着性成分を添加することによって調製された被覆細胞を用いることにより、１度の遠心処理によって細胞構造体が構築できる。また、例えば、内皮細胞を被覆した被覆細胞と、線維芽細胞を被覆した被覆細胞とを、それぞれ別個に調製し、線維芽細胞の被覆細胞からなる多層を形成させた後、その上に内皮細胞の被覆細胞からなる１層を積層させ、さらにその上に線維芽細胞の被覆細胞からなる多層を積層させることにより、厚みのある線維芽細胞層に挟まれた脈管網構造を備える細胞構造体が構築できる。
　本実施形態に係る細胞構造体の間質細胞層と遊走細胞不含細胞層は、細胞を、カチオン性緩衝液、細胞外マトリックス成分、及び高分子電解質を少なくとも含む溶液に懸濁した細胞混合物を基材上に集めた後に培養する方法で、簡便に構築することができる（国際公開第２０１７／１８３６７３号、特許第６４２７８３６号公報）。
　具体的には、例えば、下記工程（Ａ）～工程（Ｃ）を有する方法で製造することができる。工程（Ａ）及び工程（Ｂ）を少なくとも１回行った後、工程（Ｃ）を行う。
　細胞が、カチオン性物質、細胞外マトリックス成分、及び高分子電解質を少なくとも含む溶液に懸濁されている混合物を得る工程（Ａ）と、
　得られた前記混合物から前記細胞を集め、基材上に細胞集合体を形成する工程（Ｂ）と、
　前記細胞集合体を培養し、細胞構造体を得る工程（Ｃ）。
　本実施形態及び本願明細書において、「細胞集合体」とは、細胞の集団を意味する。細胞集合体には、遠心分離や濾過などによって得られる細胞の沈殿体（細胞を沈殿させることにより形成された細胞の集合体）も含まれる。ある実施形態では、細胞集合体はスラリー状の粘稠体である。本明細書において、「スラリー状の粘稠体」とは、Ａｋｉｈｉｒｏ　Ｎｉｓｈｉｇｕｃｈｉ　ｅｔ  ａｌ．，　Ｍａｃｒｏｍｏｌ　Ｂｉｏｓｃｉ．　２０１５　Ｍａｒ；１５（３）：３１２－７に記載されるようなゲル様の細胞集合体を指す。
　工程（Ａ）は、カチオン性物質、細胞外マトリックス成分、及び高分子電解質を少なくとも含む溶液（以下、「細胞懸濁用溶液」ということがある。）に、細胞構造体の構築に使用する細胞を懸濁させることにより行う。細胞懸濁用溶液に懸濁させる細胞集団は、細胞構造体の構築に使用する全細胞であってもよく、その一部であってもよい。
　細胞懸濁用溶液は、カチオン性物質、細胞外マトリックス成分、及び高分子電解質を溶媒に溶解して調製する。細胞懸濁液を調製するための溶媒としては、細胞に対する毒性がなく、増殖性や機能を損なわないものであれば特に限定されるものではなく、水、緩衝液及び細胞の培養培地等を用いることができる。当該緩衝液としては、例えば、リン酸生理食塩水（ＰＢＳ）、ＨＥＰＥＳ、Ｈａｎｋｓ緩衝液等が挙げられる。培養培地としては、Ｄ－ＭＥＭ、Ｅ－ＭＥＭ、ＭＥＭα、ＲＰＭＩ－１６４０及びＨａｍ’ｓ　Ｆ－１２等が挙げられる。
　カチオン性物質としては、細胞の生育及び細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、任意の正電荷を有する物質を用いることができる。カチオン性物質には、トリス－塩酸緩衝液、トリス－マレイン酸緩衝液、ビス－トリス緩衝液、及びＨＥＰＥＳなどのカチオン性緩衝液や、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ポリビニルアミン、ポリアリルアミン、ポリリシン、ポリヒスチジン、及びポリアルギニン等が挙げられる。本実施形態に係る細胞構造体の製造に用いられるカチオン性物質は、カチオン性緩衝液であることが好ましい。
　カチオン性物質の濃度は、細胞の生育及び細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、特に限定されない。工程（Ａ）において用いられる細胞懸濁用溶液におけるカチオン性物質の濃度は、１０～１００ｍＭであることが好ましく、２０～９０ｍＭ、３０～８０ｍＭ、４０～７０ｍＭ、４５～６０ｍＭであることがより好ましく、５０ｍＭであることがさらに好ましい。
　カチオン性物質としてカチオン性緩衝液が用いられる場合、カチオン性緩衝液のｐＨは、細胞の生育及び細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、特に限定されない。細胞懸濁用溶液として用いられるカチオン性緩衝液のｐＨは６．０～８．０であることが好ましく、７．０～８．０であることがより好ましく、７．２～７．６であることがさらに好ましく、７．４であることが特に好ましい。
　本実施形態及び本願明細書において、「高分子電解質」とは、高分子鎖中に解離可能な官能基を有する高分子を意味する。本実施形態で用いられる高分子電解質としては、細胞の生育及び細胞構造体の形成に悪影響を及ぼさない限り、任意の高分子電解質を用いることができる。高分子電解質には、ヘパリン、コンドロイチン硫酸（例えば、コンドロイチン４－硫酸、コンドロイチン６－硫酸）、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヒアルロン酸等のグリコサミノグリカン；デキストラン硫酸、ラムナン硫酸、フコイダン、カラギナン、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリルアミド－２－メチルプロパンスルホン酸及びポリアクリル酸等が挙げられるが、これらに限定されない。工程（Ａ）において調製される混合物には、高分子電解質を１種類のみ混合させてもよく、２種類以上を組み合わせて混合させてもよい。本実施形態に係る細胞構造体の製造においては、グリコサミノグリカンを用いることが好ましく、ヘパリン及び／又はデキストラン硫酸を用いることがより好ましい。前記細胞懸濁用溶液に混合する高分子電解質の量は、細胞の生育及び細胞構造体の製造に悪影響を及ぼさない限り、特に限定されない。例えば、細胞懸濁用溶液中の高分子電解質の濃度は、０ｍｇ／ｍＬ超であればよく、０．０１０ｍｇ／ｍＬ以上が好ましく、０．０２０ｍｇ／ｍＬ以上がより好ましく、０．０２５ｍｇ／ｍＬ以上がさらに好ましく、０．０５ｍｇ／ｍＬ以上がよりさらに好ましい。また、細胞懸濁用溶液中の高分子電解質の濃度は、１．０ｍｇ／ｍＬ未満が好ましく、０．７５ｍｇ／ｍＬ以下がより好ましく、０．５ｍｇ／ｍＬ以下がさらに好ましく、０．２５ｍｇ／ｍＬ以下がよりさらに好ましく、０．１ｍｇ／ｍＬ以下が特に好ましい。
　細胞外マトリックス成分としては、細胞の生育及び細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、細胞外マトリックス（ＥＣＭともいう）を構成する任意の成分を用いることができる。コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、エラスチン、テネイシン、エンタクチン、フィブリリン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、又はこれらの改変体若しくはバリアント等が挙げられる。プロテオグリカンには、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ケラタン硫酸プロテオグリカン及びデルマタン硫酸プロテオグリカン等が挙げられる。グリコサミノグリカンには、ヒアルロン酸、コンドロイチン４－硫酸、コンドロイチン６－硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパラン硫酸及びヘパリン等が挙げられる。工程（Ａ）において調製される混合物には、細胞外マトリックス成分を１種類のみ混合させてもよく、２種類以上を組み合わせて混合させてもよい。本実施形態に係る細胞構造体の製造においては、コラーゲン、ラミニン、及びフィブロネクチンからなる群より選択される１種以上を用いることが好ましく、中でもコラーゲンであることが好ましい。前記細胞懸濁用溶液に混合する細胞外マトリックス成分の量は、細胞の生育及び細胞構造体の製造に悪影響を及ぼさない限り、特に限定されない。例えば、細胞懸濁用溶液中の細胞外マトリックス成分の濃度は、０ｍｇ／ｍＬ超であればよく、０．０１０ｍｇ／ｍＬ以上が好ましく、０．０２０ｍｇ／ｍＬ以上がより好ましく、０．０２５ｍｇ／ｍＬ以上がさらに好ましく、０．０５ｍｇ／ｍＬ以上がよりさらに好ましい。また、細胞懸濁用溶液中の細胞外マトリックス成分の濃度は、１．０ｍｇ／ｍＬ未満が好ましく、０．７５ｍｇ／ｍＬ以下がより好ましく、０．５ｍｇ／ｍＬ以下がさらに好ましく、０．２５ｍｇ／ｍＬ以下がよりさらに好ましく、０．１ｍｇ／ｍＬ以下が特に好ましい。
　前記細胞懸濁用溶液に混合する高分子電解質と細胞外マトリックス成分の配合比は、１：２～２：１である。本実施形態に係る細胞構造体の製造においては、高分子電解質と細胞外マトリックス成分の配合比が、１：１．５～１．５：１であることが好ましく、１：１であることがより好ましい。
　工程（Ａ）及び工程（Ｂ）を少なくとも１回行った後、工程（Ｃ）を行う、具体的には、工程（Ｂ）として工程（Ａ）で調製した混合物を播種した後、次に積層させる細胞を用いて工程（Ａ）を行って混合物を調製した後、工程（Ｂ）として当該混合物を、先の工程（Ｂ）で得られた細胞集合体に播種する。これを必要回数繰り替えした後、工程（Ｃ）を行うことにより、充分な厚みの細胞構造体を構築することができる。工程（Ａ）において、工程（Ｂ）で得られた細胞集合体の上に新たに播種する混合物の細胞組成は、既に構築されている細胞集合体を構成する細胞組成と同じであってもよく、異なっていてもよい。また、工程（Ａ）はまとめて行ってもよい。
　例えば、まず、工程（Ａ）において細胞としては線維芽細胞のみを含む混合物を調製し、工程（Ｂ）を行って細胞培養容器に１０層の線維芽細胞層からなる細胞集合体を得る。次いで、工程（Ａ）として細胞として遊走細胞のみを含む混合物を調製し、工程（Ｂ）を行って細胞培養容器内の１０層の線維芽細胞層の上に１層の遊走細胞層を積層させる。さらに、工程（Ａ）として細胞として線維芽細胞のみを含む混合物を調製し、工程（Ｂ）を行って細胞培養容器内の遊走細胞層の上に、１０層の線維芽細胞層を積層させる。これにより、線維芽細胞層１０層－遊走細胞層１層－線維芽細胞層１０層と細胞種毎に順番に層状に積層された間質細胞層からなる細胞構造体が構築できる。工程（Ｂ）において播種される細胞数を調節することにより、工程（Ｃ）において積層される細胞層の厚みを調整できる。工程（Ｂ）において播種される細胞数が多いほど、工程（Ｃ）において積層される細胞層の数が多くなる。また、工程（Ａ）において、線維芽細胞層２０層分の線維芽細胞と遊走細胞層１層分の遊走細胞を全て混合した混合物を調製し、工程（Ｂ）及び（Ｃ）を行うことにより、２１層分の厚みを有し、遊走細胞が構造体内部に散在している細胞構造体が構築できる。間質細胞層に脈管網が形成された細胞構造体も、同様にして、特定の細胞層にのみ脈管網が形成されている細胞構造体と、脈管網が細胞構造体の間質細胞層全体に散在している細胞構造体を構築できる。また、工程（Ａ）において、間質細胞層を構成する全細胞、すなわち、線維芽細胞と血管内皮細胞と遊走細胞の全てを混合した混合物を調製し、工程（ｂ）及び（ｃ）を行うことにより、遊走細胞と血管網構造の両方が間質細胞層内部にそれぞれ独立して散在している細胞構造体が構築できる。
　工程（Ａ）の後に、（Ａ’－１）得られた混合物から液体部分を除去し、細胞集合体を得る工程、及び（Ａ’－２）細胞集合体を溶液に懸濁する工程、を含み、かつ工程（Ｂ）に代えて、（Ｂ’）得られた懸濁液から細胞を沈殿し、基材上に細胞の沈殿体を形成する工程を含んでもよい。
　工程（Ａ）において、細胞と細胞懸濁用溶液との混合は、ディッシュ、チューブ、フラスコ、ボトル又はプレートなどの適当な容器中で行われてもよく、工程（Ｂ）において用いられる基材上で行われてもよい。工程（Ａ’－２）における懸濁もまた、ディッシュ、チューブ、フラスコ、ボトル又はプレートなどの適当な容器中で行われてもよく、工程（Ｂ’）において用いられる基材上で行われてもよい。
　工程（Ａ’－１）における液体部分を除去する手段として、当業者に公知の手法を用いることができる。例えば、遠心分離や濾過によって、液体部分を除去してもよい。遠心分離の条件は、細胞の生育及び細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、特に限定されない。例えば、混合物の入ったマイクロチューブを室温、４００×ｇで１分間の遠心分離に供して液体部分と細胞集合体とを分離することによって、液体部分を除去する。あるいは、自然沈降によって細胞を集めた後、液体部分を除去してもよい。
　工程（Ａ’－２）において用いられる溶液は、細胞の生育及び細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、特に限定されない。例えば、使用される細胞に適した細胞培養培地又は緩衝液が用いられる。
　工程（Ｂ）又は（Ｂ’）において用いられる基材には、細胞の培養に用いるための培養容器が挙げられる。培養容器は、細胞や微生物の培養に通常用いられている素材、形状を有する容器であってよい。培養容器の素材としては、ガラス、ステンレス及びプラスチックなどが挙げられるが、これらに限定されない。培養容器としては、ディッシュや、チューブ、フラスコ、ボトル及びプレートなどが挙げられるが、これらに限定されない。基材は、例えば、液体中の細胞を通過させず、液体を通すことが可能な材料である。
　工程（Ｂ）で用いられる基材は、透過膜であることが好ましい。かかる透過膜を有する容器としては、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）インサート、Ｎｅｔｗｅｌｌ（登録商標）インサート、Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）セルカルチャーインサート及びＭｉｌｌｉｃｅｌｌ（登録商標）セルカルチャーインサートなどのセルカルチャーインサートが挙げられるが、これらに限定されない。
　工程（Ｂ）又は（Ｂ’）における細胞を集める手段として、当業者に公知の手法を用いることができる。例えば、遠心分離、磁性分離、又は濾過によって、細胞を集めてもよい。遠心分離の条件は、細胞の生育に悪影響を及ぼさない限り、特に限定されない。例えば、混合物又は懸濁液をセルカルチャーインサートに播種し、１０℃、４００×ｇで１分間の遠心分離に供することで、細胞を集める。あるいは、自然沈降によって細胞を集めてもよい。工程（Ｂ’）では、例えば遠心分離や濾過によって懸濁液から液体部分を除去することで、基材上に細胞の沈殿体を形成してもよい。あるいは、自然沈降によって基材上に細胞の沈殿体を形成してもよい。工程（Ｂ）における細胞集合体又は工程（Ｂ’）における細胞の沈殿体は層状であってもよい。
　工程（Ｃ）における細胞の培養は、培養される細胞に適した培養条件下で行うことができる。当業者は、細胞の種類や所望の機能に応じて適切な培地を選択することができる。培養温度や培養時間等の諸条件もまた、当業者が容易に定めうる。
　例えば、まず、間質細胞層を構築する細胞を用いて、工程（Ａ）及び工程（Ｂ）を少なくとも１回行った後、工程（Ｃ）を行って間質細胞層を構築する。その後、構築された細胞構造体（つまり間質細胞層）に対して、遊走細胞不含細胞層を構築する細胞を用いて、工程（Ａ）及び工程（Ｂ）を少なくとも１回行った後、工程（Ｃ）を行って、当該間質細胞層の天面に遊走細胞不含細胞層を構築する。これにより、本実施形態に係る細胞構造体を製造することができる。
　間質細胞層に脈管網構造を形成させる場合には、脈管内皮細胞を含む間質細胞層を構築する細胞を用いて、工程（Ａ）及び工程（Ｂ）を少なくとも１回行った後、工程（Ｃ）において、所定期間、一般的には１～３日間程度、培養する。この培養期間中に、間質細胞層内で脈管網が形成される。その後、当該間質細胞層からなる細胞構造体に対して、遊走細胞不含細胞層を構築する細胞を用いて、工程（Ａ）及び工程（Ｂ）を少なくとも１回行った後、工程（Ｃ）を行って、当該間質細胞層の天面に遊走細胞不含細胞層を構築する。これにより、本実施形態に係る細胞構造体のうち、間質細胞層に脈管網構造が形成された細胞構造体を製造することができる。なお、脈管網を形成させるために、遊走細胞不含細胞層を積層する前に間質細胞層を所定期間培養した場合には、当該培養期間中に間質細胞層内の遊走細胞はランダムに遊走する。このため、当該方法の場合、工程（Ｃ）を行う前には特定の細胞層にのみ遊走細胞が存在していた場合でも、遊走細胞不含細胞層を積層させる時点では、遊走細胞は、間質細胞層内にランダムに存在する。
　本実施形態に係る細胞構造体の大きさや形状は、遊走細胞の遊走能が評価可能なものであれば、特に限定されるものではない。遊走細胞の遊走能は、細胞構築体内における移動度に基づいて評価されるが、遊走細胞の移動度をより測定しやすいことから、当該細胞構造体の厚さは、５μｍ以上が好ましく、１０μｍ以上がより好ましく、５０μｍ以上がさらに好ましく、１００μｍ以上がよりさらに好ましい。当該細胞構造体の厚さとしては、また、５００μｍ以下が好ましく、４００μｍ以下がより好ましく、３００μｍ以下がさらに好ましい。細胞構造体の厚さの上限値と下限値は、任意に組み合わせることができる。例えば、細胞構造体の厚さは　、５μｍ以上５００μｍ以下が好ましく、１０μｍ以上４００μｍ以下がより好ましく、５０μｍ以上３００μｍ以下がさらに好ましく、１００μｍ以上３００μｍ以下がよりさらに好ましい。本実施形態に係る細胞構造体の間質細胞層の細胞層の数としては、２～６０層程度が好ましく、５～６０層程度がより好ましく、１０～６０層程度がさらに好ましい。本実施形態に係る細胞構造体の遊走細胞不含細胞層の細胞層は、１層あればよいが、遊走細胞の遊走能がより精度良く評価できることから、２層以上が好ましく、５層以上がより好ましい。
　細胞構造体の細胞層数は、当該細胞構造体の厚み方向の断面を、細胞核を認識できる倍率、つまり、核染色した切片の厚みの全体が視野に入る倍率で観察される切片画像に基づいて測定することができる。当該切片画像において、観察した際に、厚み方向と直交する方向に存在し、厚み方向に対して細胞核が重ならないで存在する一群の細胞及び間質によって構成される層の数を計数する。この計数された層数が、当該細胞構造体の細胞層数である。
　また、本実施形態に係る細胞構造体においては、理論細胞層数を、当該細胞構造体の細胞層数とすることもできる。ここで、細胞構造体を構成する理論細胞層数は、当該細胞構造体を構成する細胞の総数を、１層当たりの細胞数（１層を構成するために必要な細胞数）で除することにより測定することができる。１層当たりの細胞数（ＮＳ）は、同種の基材に同種の細胞で細胞構造体を構築して得られた細胞構造体の細胞層数（Ｌ１）を測定し、細胞構造体を構築した総細胞数（ＮＡ）をこれで除する（ＮＳ＝ＮＡ／Ｌ１）ことによって求められる。
＜遊走細胞の遊走能の評価方法＞
　本発明の一実施形態に係る遊走細胞の遊走能の評価方法は、遊走細胞の遊走能を、本実施形態に係る細胞構造体を培養し、当該細胞構造体内における遊走細胞の移動度を指標として評価する方法である。すなわち、本実施形態に係る評価方法は、下記の工程を有する：
　遊走細胞と間質細胞とを含有する間質細胞層と、前記間質細胞層の天面に前記遊走細胞を含有していない遊走細胞不含細胞層とを有する細胞構造体を培養する培養工程と、
　前記培養工程後、前記細胞構造体内の前記遊走細胞の移動度に基づき、前記遊走細胞の遊走能を評価する評価工程。
　遊走細胞の移動度は、細胞構造体の高さＨｓに対する、細胞構造体中の遊走細胞の高さＨｍの比（Ｈｍ／Ｈｓ）である。ＨｓとＨｍは、いずれも、当該細胞構造体の厚み方向の断面を、細胞核を認識できる倍率、つまり、核染色した切片の厚みの全体が視野に入る倍率で観察される切片画像に基づいて測定することができる。当該切片画像において、まず、移動度を測定する対象の遊走細胞を決定し、当該遊走細胞から細胞構造体の底面へ下した垂線と底面との交点をＰｂとし、当該垂線を当該細胞構造体の天面側へ延長した直線と、当該細胞構造体の天面との交点をＰｔとする。当該細胞構造体中の遊走細胞の高さＨｍは、Ｐｂと遊走細胞との距離であり、細胞構造体の高さＨｓは、ＰｂとＰｔとの距離である。予め細胞構造体の切片は、核染色に加えて遊走細胞の染色処理を行った後に切片画像を取得することも好ましい。
　培養工程における培養時間は、細胞構造体内部の遊走細胞が、細胞構造体内部を充分に遊走する時間であれば特に限定されるものではなく、例えば、１２時間以上が好ましく、１日間以上がより好ましく、１～３日間がさらに好ましい。なお、培養培地、培養温度、等のその他の培養条件は、一般的に間質細胞を培養する培養条件と同様に行うことができる。
　第２の細胞構造体を用いた場合、遊走細胞の遊走能の高低にかかわらず、細胞構造体内の遊走細胞は、細胞構造体内部をランダムな方向へ遊走する。このため、細胞構造体内の各遊走細胞の移動度はばらつきが大きい。
　第１の細胞構造体を用いた場合、遊走細胞は細胞構造体の天面にある遊走対象細胞に誘引される。このため、細胞構造体内の各遊走細胞の移動度は、第２の細胞構造体を用いた場合よりもばらつきが小さい。また、遊走細胞の遊走能が十分である場合には、細胞構造体内の遊走細胞は、培養開始時点における遊走細胞と遊走対象細胞の距離にかかわらず、細胞構造体内の遊走細胞のほぼ全ては、細胞構造体の天面にある遊走対象細胞にむかって遊走する。このため、遊走細胞の遊走能が高いほど、遊走細胞の移動度は最大値である１００％に近くなる。遊走細胞の遊走能が低い場合、細胞構造体内の遊走細胞は、間質細胞層をよりランダムに遊走するため、細胞構造体内の遊走細胞の平均移動度が、第２の細胞構造体内の遊走細胞の平均移動度と同程度にしかならない。すなわち、細胞構造体内の遊走細胞の移動度の平均値が１００％に近いほど、当該遊走細胞の遊走能が高いと評価し、当該平均値が小さいほど、当該遊走細胞の遊走能が低いと評価する。
　なお、上記説明では、細胞構造体の天面に遊走対象細胞を含む遊走細胞不含細胞層が位置する例について説明している。遊走細胞不含細胞層が細胞構造体の天面に位置していない場合、遊走細胞が遊走対象細胞にむかって遊走すると、移動度は１００％より小さくなる。この場合であっても、遊走細胞の遊走能が十分である場合には、細胞構造体内の遊走細胞は、培養開始時点における遊走細胞と遊走対象細胞の距離にかかわらず、細胞構造体内の遊走細胞のほぼ全ては、遊走対象細胞にむかって遊走する。このため、遊走細胞の遊走能が高いほど、遊走細胞の移動度は遊走細胞不含細胞層の位置に対応した数値となり、遊走細胞の移動度のばらつきは小さくなる。
　遊走細胞がＣＴＬである場合、本実施形態に係る評価方法では、遊走細胞の遊走能に加えて、当該遊走細胞による遊走対象細胞に対する細胞殺傷度も評価することができる。遊走対象細胞に対する細胞殺傷度は、当該細胞構造体中の全遊走対象細胞の数に対する、死んだ遊走対象細胞の数の比率である。遊走対象細胞に対する細胞殺傷度は、１から、細胞構造体中の全遊走対象細胞の数に対する、生きている遊走対象細胞の数の比率を差し引いてもよい。
　第１の細胞構造体を用いた場合に、平均移動度が高く、かつ遊走対象細胞の細胞殺傷度も高い場合には、当該ＣＴＬは、生体内において標的のがん細胞に到達しやすく、かつ攻撃力も高いため、がん免疫等に効果の高い遊走細胞であると評価できる。一方で、平均移動度は高いものの、遊走対象細胞の細胞殺傷度が低い場合には、当該ＣＴＬは、遊走能は高いが、細胞障害能は低いと評価される。第２の細胞構造体を用いた場合に、遊走対象細胞の細胞殺傷度が高い場合には、当該ＣＴＬは、標的以外の細胞に対する傷害性が高いと評価される。
　以下に実施例を示して本発明をより詳細かつ具体的に説明するが、実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
［実施例１］
　ＣＴＬの有無、構造体内におけるがん細胞やＣＴＬの位置、血管網構造の有無が異なる５種類の細胞構造体を製造し、ＣＴＬの移動度や細胞殺傷度を調べた。
　脈管内皮細胞として、蛍光タンパク質ＲＦＰで標識されたヒト臍帯静脈内皮細胞細胞（ＲＦＰ－ＨＵＶＥＣともいう）（型番：ｃＡＰ－０００１ＲＦＰ、ＡＮＧＩＯ－ＰＲＯＴＥＯＭＩＥ社製）を用い、間質細胞として、ヒト新生児由来皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦともいう）（型番：ＣＣ－２５０９、Ｌｏｎｚａ社製）を用い、遊走細胞として、ＣＴＬ（札幌医科大学より提供、非特許文献７）を用い、ＣＴＬ特異的ながん細胞（すなわち、ＣＴＬに対してＨＬＡ／ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ　ＡＫＦ９を介して結合し、傷害性や誘引性を有するがん細胞）として、β２ｍを発現させたヒト結腸腺癌由来培養細胞株ＨＣＴ１５（ＨＣＴ１５／β２ｍ）（札幌医科大学より提供）に蛍光タンパク質ＧＦＰを発現させた細胞（以下、「ＨＣＴ１５細胞」）を用い、ＣＴＬ非特異的ながん細胞（すなわち、ＣＴＬに対してＨＬＡ／ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ　ＡＫＦ９を介して結合せず、傷害性や誘引性も忌避性も有さないがん細胞）として、ヒト結腸腺癌由来培養細胞株Ｃｏｌｏ３２０（札幌医科大学より提供）を用いた。
　細胞構造体を製造するにあたり、高分子電解質として、ヘパリンナトリウム塩（型番：Ｈ３１４９－１００ＫＵ、Ｓｉｇｍａ社製）を用い、細胞外マトリックス成分として、コラーゲン（Ｃｏｌｌａｇｅｎ　Ｔｙｐｅ　Ｉ，　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｋｉｎ，　Ａｃｉｄ　Ｓｏｌｕｂｌｅ）（型番：ＡＳＣ－１－１００－１００、ＮＩＰ社製）とフィブロネクチン（型番：Ｆ４７５９－５ＭＧ、Ｓｉｇｍａ社製）を用いた。汎用培地として、ＤＭＥＭ培地（型番：０４３－３００８５、和光純薬工業社製）に１０％のＦＢＳと１％の抗生物質を含有させた培地を用い、内皮細胞用培地として、ＥＧＭ－２ＭＶ　ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ培地（型番：ＣＣ－３２０２、Ｌｏｎｚａ社製）を用い、ＣＴＬ用培地として、ＡＩＭ－Ｖ培地（型番：０８７０１１２ＤＫ、Ｇｉｂｃｏ社製）に１％のＨＥＰＥＳと５５ｍＭの２－メルカプトエタノールと１％の抗生物質を含有させた培地を用いた。抗生物質としては、ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓともいう）（型番：１６８-２３１９１、和光純薬工業社製）を用いた。培養容器としては、トランズウェルカルチャーインサート（型番：３４７０、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）を用いた。細胞固定液としては、１０％ホルマリン緩衝液（型番：０６２-０１６６１、和光純薬工業社製）を用いた。
（１）細胞構造体Ａ
　間質細胞層で挟まれたがん細胞層を含み、構造体全体に血管網構造が形成された細胞構造体Ａを製造し、ＣＴＬを含む培地中で培養した。
　まず、細胞懸濁用溶液として、０．１ｍｇ／ｍＬのヘパリン／５０ｍＭ　トリス－塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）溶液と、０．１ｍｇ／ｍＬのコラーゲン／酢酸溶液（ｐＨ３．７）とを等量ずつ混合した溶液（すなわち、コラーゲン及びヘパリンの終濃度はそれぞれ０．０５ｍｇ／ｍＬであった）を調製した。次いで、当該細胞懸濁用溶液に、１×１０６個のＮＨＤＦと１．５×１０４個のＲＦＰ－ＨＵＶＥＣを混合した細胞集団を懸濁させ、細胞混合物を調製した。次いで、当該細胞混合物を、室温で１０００×ｇ、２分間遠心処理し、上清を除去した後、３００μＬの汎用培地を添加して細胞懸濁液を調製した。
　次いで、培養容器外側に１ｍＬの汎用培地を添加し、予め０．１ｍｇ／ｍＬのフィブロネクチンでコートした培養容器インサート内に、当該細胞懸濁液３００μＬを添加して細胞を播種した後、室温で４００×ｇ、２分間遠心処理した後、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で２時間静置培養した。その後、培養容器外側に１ｍＬの汎用培地を添加し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で一晩静置培養した。これにより、間質細胞層を形成させた。
　次いで、間質細胞層を形成させた培養容器の外側の培地を除去し、１ｍＬの汎用培地を添加した。その後、当該培養容器のインサート内の培地を除去し、１００μＬの汎用培地に懸濁させた１×１０３個のがん細胞を播種した後、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で２時間静置培養した。これにより、間質細胞層の天面にがん細胞層を形成させた。
　その後、前記細胞懸濁用溶液に、１×１０６個のＮＨＤＦと１．５×１０４個のＲＦＰ－ＨＵＶＥＣを混合した細胞集団を懸濁させ、細胞混合物を調製し、当該細胞混合物を、室温で１０００×ｇ、２分間遠心処理して上清を除去した後、２００μＬの汎用培地を添加して細胞懸濁液を調製した。がん細胞層を形成させた培養容器のインサート内に、当該細胞懸濁液２００μＬを添加して細胞を播種した後、室温で４００×ｇ、２分間遠心処理した後、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で２時間静置培養した。その後、培養容器外側に１ｍＬの汎用培地を添加し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で２時間静置培養した。その後、培養容器外側に１ｍＬの汎用培地を添加し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で３日間静置培養した。これにより、がん細胞層を間質細胞層で挟んだ細胞構造体Ａを製造した。
　細胞構造体Ａを、ＣＴＬを添加した培養培地で培養した。具体的には、培養容器外側の培地を除去して１ｍＬのＣＴＬ用培地を添加した後、当該培養容器インサート内の培地を除去し、３００μＬのＣＴＬ用培地に懸濁させた２．５×１０３個のＣＴＬを当該培養容器インサート内に添加して、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で３日間静置培養した。
　培養後の細胞構造体Ａを、ＰＢＳで２回洗浄した後、３００μＬの細胞固定液を培養容器インサート内に添加して、室温で１５分間以上静置した後に、ＰＢＳで３回洗浄した。
（２）細胞構造体Ｂ
　ＣＴＬが全体に均一に分散した間質細胞層と、当該間質細胞層の天面にがん細胞層を有する細胞構造体Ｂを製造した。
　まず、前記細胞懸濁用溶液に、２×１０６個のＮＨＤＦと３×１０４個のＲＦＰ－ＨＵＶＥＣを混合した細胞集団を懸濁させ、細胞混合物を調製した。次いで、当該細胞混合物を、室温で１０００×ｇ、２分間遠心処理し、上清を除去した後、３００μＬの汎用培地を添加して懸濁させた後、１×１０４個のＣＴＬを添加して細胞懸濁液を調製した。
　次いで、培養容器外側に１ｍＬの汎用培地を添加し、予め０．１ｍｇ／ｍＬのフィブロネクチンでコートした培養容器インサート内に、当該細胞懸濁液３００μＬを添加して細胞を播種した後、室温で４００×ｇ、２分間遠心処理した後、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で２時間静置培養した。その後、培養容器外側に１ｍＬの汎用培地を添加し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で一晩静置培養した。これにより、ＣＴＬを含有する間質細胞層を形成させた。
　次いで、間質細胞層を形成させた培養容器の外側の培地を除去し、１ｍＬの汎用培地を添加した。その後、当該培養容器のインサート内の培地を除去し、３００μＬの汎用培地に懸濁させた１×１０４個又は３×１０４個のがん細胞を播種した後、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で２時間静置培養した。その後、培養容器外側に１ｍＬの汎用培地を添加し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で１日間又は３日間静置培養した。これにより、間質細胞層の天面にがん細胞層を形成させた細胞構造体Ｂを製造した。
　培養後の細胞構造体Ｂを、ＰＢＳで２回洗浄した後、３００μＬの細胞固定液を培養容器インサート内に添加して、室温で１５分間以上静置した後に、ＰＢＳで３回洗浄した。
（３）細胞構造体Ｃ
　ＣＴＬが間質細胞層の中間に位置する特定の細胞層に存在するように形成させた間質細胞層と、当該間質細胞層の天面にがん細胞層を有する細胞構造体Ｃを製造した。
　まず、前記細胞懸濁用溶液に、１×１０６個のＮＨＤＦと１．５×１０４個のＲＦＰ－ＨＵＶＥＣを混合した細胞集団を懸濁させ、細胞混合物を調製した。次いで、当該細胞混合物を、室温で１０００×ｇ、２分間遠心処理し、上清を除去した後、２００μＬの汎用培地を添加して細胞懸濁液を調製した。
　次いで、培養容器外側に１ｍＬの汎用培地を添加し、予め０．１ｍｇ／ｍＬのフィブロネクチンでコートした培養容器インサート内に、当該細胞懸濁液２００μＬを添加して細胞を播種した後、室温で４００×ｇ、２分間遠心処理した後、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で２時間静置培養した。これにより、間質細胞層を形成させた。
　次いで、間質細胞層を形成させた培養容器のインサート内に、１００μＬの汎用培地に懸濁させた１×１０４個のＣＴＬを播種した後、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で２時間静置培養した。これにより、間質細胞層の天面にＣＴＬ層を形成させた。
　その後、前記細胞懸濁用溶液に、１×１０６個のＮＨＤＦと１．５×１０４個のＲＦＰ－ＨＵＶＥＣを混合した細胞集団を懸濁させ、細胞混合物を調製し、当該細胞混合物を、室温で１０００×ｇ、２分間遠心処理して上清を除去した後、２００μＬの汎用培地を添加して細胞懸濁液を調製した。ＣＴＬ層を形成させた培養容器のインサート内に、当該細胞懸濁液２００μＬを添加して細胞を播種した後、室温で４００×ｇ、２分間遠心処理した後、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で２時間静置培養した。その後、培養容器外側に１ｍＬの汎用培地を添加し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で２時間静置培養した。その後、培養容器外側に１ｍＬの汎用培地を添加し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で一晩静置培養した。これにより、中間にＣＴＬ層を有する間質細胞層を製造した。
　次いで、前記（２）と同様にして、当該間質細胞層の天面にがん細胞層を形成させた細胞構造体Ｃを製造し、固定した。
（４）細胞構造体Ｄ
　ＣＴＬが間質細胞層の底部の細胞層に存在するように形成させた間質細胞層と、当該間質細胞層の天面にがん細胞層を有する細胞構造体Ｄを製造した。
　まず、培養容器外側に１ｍＬの汎用培地を添加し、予め０．１ｍｇ／ｍＬのフィブロネクチンでコートした培養容器インサート内に、１００μＬの汎用培地に懸濁させた１×１０４個のＣＴＬを播種した後、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で２時間静置培養した。これにより、ＣＴＬ層を形成させた。
　また、前記細胞懸濁用溶液に、２×１０６個のＮＨＤＦと３×１０４個のＲＦＰ－ＨＵＶＥＣを混合した細胞集団を懸濁させ、細胞混合物を調製した。次いで、当該細胞混合物を、室温で１０００×ｇ、２分間遠心処理し、上清を除去した後、２００μＬの汎用培地を添加して細胞懸濁液を調製した。
　次いで、ＣＴＬ層を形成させた培養容器のインサート内に、当該細胞懸濁液２００μＬを添加して細胞を播種した後、室温で４００×ｇ、２分間遠心処理した後、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で２時間静置培養した。その後、培養容器外側に１ｍＬの汎用培地を添加し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で２時間静置培養した。その後、培養容器外側に１ｍＬの汎用培地を添加し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で一晩静置培養した。これにより、底部にＣＴＬ層を有する間質細胞層を製造した。
　次いで、前記（２）と同様にして、当該間質細胞層の天面にがん細胞層を形成させた細胞構造体Ｄを製造し、固定した。
（５）細胞構造体Ｅ
　ＣＴＬが全体に均一に分散しており、血管網が全体に構築された間質細胞層と、当該間質細胞層の天面にがん細胞層を有する細胞構造体Ｅを製造した。
　まず、前記細胞懸濁用溶液に、２×１０６個のＮＨＤＦと３×１０４個のＲＦＰ－ＨＵＶＥＣを混合した細胞集団を懸濁させ、細胞混合物を調製した。次いで、当該細胞混合物を、室温で１０００×ｇ、２分間遠心処理し、上清を除去した後、３００μＬの汎用培地を添加して懸濁させた後、１×１０４個のＣＴＬを添加して細胞懸濁液を調製した。
　次いで、培養容器外側に１ｍＬの汎用培地を添加し、予め０．１ｍｇ／ｍＬのフィブロネクチンでコートした培養容器インサート内に、当該細胞懸濁液３００μＬを添加して細胞を播種した後、室温で４００×ｇ、２分間遠心処理した後、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で２時間静置培養した。その後、培養容器外側に１ｍＬの汎用培地を添加し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で４日間静置培養した。これにより、均一にＣＴＬが分散されており、血管網が全体に構築された間質細胞層を形成させた。
　次いで、前記（２）と同様にして、当該間質細胞層の天面にがん細胞層を形成させた細胞構造体Ｅを製造し、固定した。
（６）対照細胞構造体
　細胞構造体Ｂ～Ｅについては、天面にがん細胞層を形成させる前の間質細胞層のみからなる細胞構造体を、それぞれ、対照細胞構造体Ｂ～Ｅとし、同様にして固定した。
（７）細胞構造体の切片標本の作製
　まず、各細胞構造体を、低毒性溶剤（製品名：Ｇ－Ｎｏｘ、ジェノスタッフ社製）とパラフィン包埋装置（製品名：ＣＴ－Pro２０、ジェノスタッフ社製）を用いて包埋した後、当該細胞構造体の厚み方向に平行に薄くスライスし、厚み６μＬの薄層切片を作製した。
　得られた薄層切片を、熱処理（Ｍｉｃｒｏｗａｖｅ，ＥＤＴＡ　ｂｕｆｆｅｒ　ｐＨ９）して抗原を賦活化させた後、０．２μｇ／ｍＬの抗ＣＤ８抗体（ＣＤ８　ｍｏｕｓｅ　ｍＡｂともいう）（型番：＃M７１０３、Ｄａｋｏ社製）で免疫組織化学染色（ＩＨＣ）を行った。
（８）移動度（％）の測定
　各細胞構造体のＩＨＣ済の切片標本（スライドガラス）を、光学顕微鏡（製品名：ＭＸ５１、オリンパス社製）を用いて、切片の厚みの全体が視野に入る倍率で観察し、画像を取得した。取得された細胞染色画像中の全てのＣＴＬについて、画像解析を行うことにより、Ｈｍ／Ｈｓを測定した。
　具体的には、切片画像において、各ＣＴＬについて、当該ＣＴＬから細胞構造体の底面へ下した垂線をひき、当該垂線と細胞構造体の底面との交点Ｐｂと、当該垂線を当該細胞構造体の天面側へ延長した直線と当該細胞構造体の天面との交点Ｐｔとを決定し、ＣＴＬとＰｂとの距離（Ｈｍ）と、ＰｔとＰｂとの距離（Ｈｓ）とを測定した。なお、ＣＴＬはＣＤ８陽性細胞であるため、細胞構造体中のＣＴＬは、画像中のＣＤ８陽性箇所（抗ＣＤ８抗体で免疫染色された箇所）である。得られたＨｓをＨｍで除することにより、移動度Ｈｍ／Ｈｓを求めた。
（９）相対生存率（％）の測定
　各細胞構造体について、顕微鏡システム（製品名「ＯｐｅｒｅｔｔａＣＬＳ」、PerkinElmer社製）を用いて、培養容器インサート内全体が入るように撮影し、得られた画像を解析することにより、インサート内を占めるがん細胞の割合を算出した。
　ＨＣＴ１５細胞を含有させた細胞構造体については、ＨＣＴ１５細胞に発現しているＧＦＰを検出することによってがん細胞の割合（Ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）を算出した。
　Ｃｏｌｏ３２０細胞を含有させた細胞構造体については、一次抗体として抗ＥｐＣＡＭ抗体（Ｄ４K８R、ｒａｂｂｉｔ、ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ、Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を、二次抗体としてＡｌｅｘａ　Ｆｌｏｕｒ　６４７抗体（Ａ２１２３６、ｔｈｅｒｍｏ　ｆｉｓｈｅｒ　ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いた免疫染色（ＩＦ／ＩＣＣ）によりがん細胞を検出し、その割合（Ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）を算出した。
　ＣＴＬを含有していない対応する細胞構造体Ａのがん細胞の割合を１００％とした場合の、各細胞構造体のがん細胞の割合を、相対生存率（％）として求めた。なお、１００－相対生存率（％）が細胞殺傷度（％）である。
　細胞構造体Ａ～Ｅ及び対照細胞構造体Ｂ～Ｅについて、測定されたＣＴＬの移動度（％）及びがん細胞の相対生存率（％）の結果を表１及び２に示す。表１は、がん細胞層を積層させて１日間培養した細胞構造体、表２は、がん細胞層を積層させて３日間培養した細胞構造体の結果である。表中、「がん細胞」欄は、細胞構造体に使用したがん細胞の細胞種を示し、「播種数」欄は細胞構造体のがん細胞層を構築するがん細胞の数を示す。「がん細胞」欄が「ｗ／ｏ」であり、「播種数」欄が「０」である細胞構造体は、がん細胞層を積層していない対照細胞構造体の結果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表１及び２に示すように、細胞構造体Ｂ～Ｅのいずれの細胞構造体でも、ＣＴＬ特異的がん細胞であるＨＣＴ１５のがん細胞層を有する細胞構造体では、ＣＴＬの大部分は移動度が１００％付近であったのに対して、対照細胞構造体では、移動度は０～１００％に広く分散していた。また、ＣＴＬ非特異的がん細胞であるＣｏｌｏ３２０のがん細胞層を有する細胞構造体では、対照細胞構造体と同様に移動度は０～１００％に広く分散しており、ＣＴＬ特異的がん細胞を含有させた細胞構造体と比べて、移動度に顕著な差が見られた。一方で、ＣＴＬを間質細胞層に含有させ、天面にがん細胞層を形成させた細胞構造体では、間質細胞層内のＣＴＬの配置位置や血管網構造の有無は、ＣＴＬの移動度に対して、顕著な影響を与えなかった。
　また、表２に示すように、ＣＴＬを細胞構造体には含有させなかった細胞構造体Ａでは、対照細胞構造体と、ＣＴＬ特異的がん細胞を含有した細胞構造体と、ＣＴＬ非特異的がん細胞を含有した細胞構造体とにおいて、ＣＴＬの移動度の分布に差がなく、この細胞構造体では、ＣＴＬの移動度に基づいてＣＴＬの遊走能の違いは評価できないことが確認された。
　また、細胞構造体Ｃと細胞構造体ＡのＣＴＬの移動度（％）とがん細胞の相対生存率（％）の関係を図１に示す。図に示すように、細胞構造体Ｃについては、プロットが明確に、ＣＴＬ特異的がん細胞含有細胞構造体の群と、ＣＴＬ非特異的がん細胞含有細胞構造体の群にわかれており、ＣＴＬによるがん細胞殺傷能とＣＴＬの移動度の相関が評価できた。また、プロットを評価日別にみると、１日培養後の細胞構造体から３日培養後の細胞構造体にかけて、プロットが左にシフトしていることが確認できた。この結果から、ＣＴＬとがん細胞が離れているとがん細胞は殺傷されず、ＣＴＬががん細胞へ遊走して両者が十分に近づいてはじめてＣＴＬによってがん細胞が殺傷される、という動きをすることが予想された。プロットは経時変化予想にそった変化をみせており、本実施形態に係る細胞構造体を用いたモデルは、ＣＴＬの移動度と殺傷能の相関が評価できるモデルであるといえた。
　本実施形態に係る細胞構造体は、ＣＴＬ等の遊走細胞が、間質細胞からなる細胞構造体の内部に含まれており、当該遊走細胞は、間質細胞の細胞層内を遊走する。このため、本実施形態に係る遊走細胞の遊走能の評価方法は、当該細胞構造体を用いることにより、間質組織内での遊走細胞の遊走能をより精度良く評価することができる。

Claims (13)

  1. 　遊走細胞と間質細胞とを含有する間質細胞層と、前記間質細胞層の天面に前記遊走細胞を含有していない遊走細胞不含細胞層とを有する細胞構造体を培養する培養工程と、
    　前記培養工程後、前記細胞構造体内の前記遊走細胞の移動度に基づき、前記遊走細胞の遊走能を評価する評価工程と、
    を有し、
    　前記遊走細胞の移動度が、前記細胞構造体の高さＨｓに対する、前記細胞構造体中の前記遊走細胞の高さＨｍの比であり、
    　前記遊走細胞から前記細胞構造体の底面へ下した垂線と、前記底面との交点をＰｂとし、
    　前記垂線を前記細胞構造体の天面側へ延長した直線と、前記細胞構造体の天面との交点をＰｔとし、
    　前記細胞構造体中の前記遊走細胞の高さＨｍは、前記Ｐｂと前記遊走細胞との距離であり、
    　前記細胞構造体の高さＨｓは、前記Ｐｂと前記Ｐｔとの距離である、
    遊走細胞の遊走能の評価方法。
  2. 　前記間質細胞が、線維芽細胞、前記遊走細胞以外の免疫細胞、及び肥満細胞からなる群より選択される１種以上である、請求項１に記載の遊走細胞の遊走能の評価方法。
  3. 　前記間質細胞層が、脈管内皮細胞を含有する、請求項１又は２に記載の遊走細胞の遊走能の評価方法。
  4. 　前記遊走細胞が、免疫細胞である、請求項１又は２に記載の遊走細胞の遊走能の評価方法。
  5. 　前記遊走細胞が、細胞障害性Ｔ細胞である、請求項４に記載の遊走細胞の遊走能の評価方法。
  6. 　前記遊走細胞不含細胞層が、遊走対象細胞を含有しており、
    　前記遊走対象細胞は、前記遊走細胞の遊走方向を決定する細胞である、請求項１又は２に記載の遊走細胞の遊走能の評価方法。
  7. 　前記遊走細胞不含細胞層が、遊走対象細胞を含有しておらず、
    　前記遊走対象細胞は、前記遊走細胞の遊走方向を決定する細胞である、請求項１又は２に記載の遊走細胞の遊走能の評価方法。
  8. 　前記細胞構造体として、前記遊走細胞不含細胞層が遊走対象細胞を含有している第１の細胞構造体と、前記遊走細胞不含細胞層が遊走対象細胞を含有していない第２の細胞構造体と、をそれぞれ用いて前記培養工程を行い、
    　前記評価工程において、前記第１の細胞構造体内の前記遊走細胞の移動度と、前記第２の細胞構造体内の前記遊走細胞の移動度とに基づき、前記遊走細胞の遊走能を評価し、
    　前記遊走対象細胞は、前記遊走細胞の遊走方向を決定する細胞である、請求項１又は２に記載の遊走細胞の遊走能の評価方法。
  9. 　前記遊走対象細胞に対する前記遊走細胞の細胞殺傷能も評価する、請求項６に記載の遊走細胞の遊走能の評価方法。
  10. 　前記遊走対象細胞が、がん細胞である、請求項６に記載の遊走細胞の遊走能の評価方法。
  11. 　前記細胞構造体の高さＨｓが、５０μｍ以上である、請求項１又は２に記載の遊走細胞の遊走能の評価方法。
  12. 　遊走細胞と間質細胞とを含有する間質細胞層と、前記間質細胞層の天面に前記遊走細胞を含有していない遊走細胞不含細胞層とを有し、
    　前記遊走細胞不含細胞層が、遊走対象細胞を含有しており、
    　前記遊走対象細胞は、前記遊走細胞の遊走方向を決定する細胞である、細胞構造体。
  13. 　遊走細胞と間質細胞とを含有する間質細胞層と、前記間質細胞層の天面に前記遊走細胞を含有していない遊走細胞不含細胞層とを有し、
    　前記遊走細胞不含細胞層が、遊走対象細胞を含有しておらず、
    　前記遊走対象細胞は、前記遊走細胞の遊走方向を決定する細胞である、細胞構造体。
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