WO2023043280A1 - 합성 비자연 염기를 포함하는 태그 올리고뉴클레오타이드를 이용한 타겟 핵산 서열의 검출 - Google Patents

합성 비자연 염기를 포함하는 태그 올리고뉴클레오타이드를 이용한 타겟 핵산 서열의 검출 Download PDF

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    • C12Q2525/10—Modifications characterised by
    • C12Q2525/179—Modifications characterised by incorporating arbitrary or random nucleotide sequences

Definitions

  • the present disclosure relates to the detection of target nucleic acid sequences using tagged oligonucleotides comprising synthetic non-natural bases.
  • a real-time detection method for detecting a target nucleic acid sequence while monitoring target amplification in a real-time manner is widely used.
  • Real-time detection methods generally use labeled probes or primers that specifically hybridize with a target nucleic acid sequence.
  • a method using hybridization between a labeled probe and a target nucleic acid sequence a Molecular beacon method using a dual-labeled probe having a hairpin structure (Tyagi et al., Nature Biotechnology v.14 MARCH 1996), a HyBeacon method (French DJ et al. al., Mol.
  • Examples of methods using labeled primers include the Sunrise primer method (Nazarenko et al, 2516-2521 Nucleic Acids Research, 1997, v.25 no.12, and U.S. Patent No. 6,117,635), the Scorpion primer method (Whitcombe et al, 804 -807, Nature Biotechnology v.17 AUGUST 1999 and US Pat. No. 6,326,145) and the TSG primer method (WO 2011/078441).
  • the real-time detection method using the aforementioned dimer and/or the real-time detection method using the double quenching assay uses a tagged oligonucleotide (eg, probe and tagging oligonucleotide (PTO), etc.).
  • the tag oligonucleotide is cleaved dependently on the presence of the target nucleic acid sequence to release fragments (eg, PTO fragments).
  • the method then utilizes hybridization between the fragment and a fragment-hybridizing oligonucleotide capable of hybridizing with the fragment (e.g., a capturing and templating oligonucleotide (CTO), a capturing and quenching oligonucleotide (CQO), etc.).
  • a fragment-hybridizing oligonucleotide capable of hybridizing with the fragment e.g., a capturing and templating oligonucleotide (CTO), a capturing and quenching oligonucleotide (CQO), etc.
  • CTO capturing and templating oligonucleotide
  • CQO capturing and quenching oligonucleotide
  • the fragment since the fragment is a part of the tag oligonucleotide and is relatively short compared to other oligonucleotides used in the target nucleic acid detection method, it may exhibit low hybridization efficiency with the fragment-hybridized oligonucleotide under specific reaction conditions.
  • the fragment is designed not to hybridize with a target nucleic acid sequence as well as a non-target nucleic acid sequence, it may unexpectedly hybridize with an unknown non-target nucleic acid sequence present in the sample.
  • a low hybridization efficiency between such a fragment and a fragment-hybridizing oligonucleotide may eventually lead to a decrease in a signal indicating the presence of a target nucleic acid sequence, and hybridization between a fragment and a non-target nucleic acid sequence may also consume the fragment or result in a fragment and a fragment-hybridizing oligonucleotide. interfering with hybridization of the liver, which in turn can lead to a decrease in the signal indicating the presence of the target nucleic acid sequence.
  • the present inventors have made intensive research efforts to improve signal detection in a method for detecting a target nucleic acid using a tag oligonucleotide and a fragment-hybridized oligonucleotide.
  • the present inventors improved the binding affinity or specificity between a target-dependent fragment released by cleavage depending on the presence of the target nucleic acid sequence and a fragment-hybridizing oligonucleotide capable of hybridizing with the target-dependent fragment, thereby improving the signal indicating the presence of the target nucleic acid sequence. tried to improve.
  • the present inventors found that the tagging site of the tag oligonucleotide involved in hybridization between the target-dependent fragment and the fragment-hybridizing oligonucleotide and the fragment-hybridizing oligonucleotide released by introducing a synthetic non-natural base pair into the fragment-hybridizing oligonucleotide It was confirmed that the binding affinity and/or specificity of liver can be increased.
  • the protocols of the present disclosure increase the signal indicative of the presence of a target nucleic acid sequence by improving the binding affinity or specificity of hybridization between a target-dependent fragment and a fragment-hybridizing oligonucleotide, and thus detect a plurality of target sequences with improved sensitivity. allows you to
  • an object of the present disclosure is to provide a method for detecting a target nucleic acid sequence.
  • Another object of the present disclosure is to provide a composition for detecting a target nucleic acid sequence.
  • the present disclosure provides a method of detecting a target nucleic acid sequence comprising the following steps:
  • the TO includes (i) a tagging region comprising a nucleotide sequence that does not hybridize to the target nucleic acid sequence and (ii) a targeting region comprising a nucleotide sequence that hybridizes to the target nucleic acid sequence, the tagging region comprising the tagging region contains a first synthetic non-natural base within 5 nucleotides from the 3'-end of, wherein the reaction is hybridization of the target nucleic acid sequence with the TO and cleavage of the TO dependent on the presence of the target nucleic acid sequence, followed by tagging of the TO release of a target-dependent fragment comprising a site or a partial sequence thereof, wherein the target-dependent fragment includes the first synthetic non-natural base, and cleavage of the TO is performed by an enzyme having nuclease activity;
  • the FHO comprises (i) a capturing site comprising a nucleotide sequence that hybridizes to the target-dependent fragment in 3' to 5' order and a nucleotide sequence that does not hybridize to the target-dependent fragment and the targeting site of the TO.
  • a first type of FHO comprising a templating site or (ii) a second type of FHO comprising a capturing site comprising a nucleotide sequence that hybridizes to the target-dependent fragment, wherein the capturing site of the FHO comprises the target a second synthetic unnatural base capable of base pairing with a first synthetic unnatural base in the dependent fragment;
  • the target-dependent fragment hybridizes to the capturing site of the FHO and is extended to generate an extended strand comprising an extended sequence complementary to the templating site of the FHO; This induces formation of a first dimer between the extended strand and the FHO, or (ii) when the FHO is a second type FHO, the target-dependent fragment hybridizes with the capturing site of the FHO to form a second dimer; and
  • the presence of the extended strand in the first dimer or the presence of the second dimer indicates the presence of the target nucleic acid sequence.
  • the present inventors have made intensive research efforts to improve signal detection in a method for detecting a target nucleic acid using a tag oligonucleotide and a fragment-hybridized oligonucleotide.
  • the present inventors improved the binding affinity or specificity between a target-dependent fragment released by cleavage depending on the presence of the target nucleic acid sequence and a fragment-hybridizing oligonucleotide capable of hybridizing with the target-dependent fragment, thereby improving the signal indicating the presence of the target nucleic acid sequence. tried to improve.
  • the present inventors found that the tagging site of the tag oligonucleotide involved in hybridization between the target-dependent fragment and the fragment-hybridizing oligonucleotide and the fragment-hybridizing oligonucleotide released by introducing a synthetic non-natural base pair into the fragment-hybridizing oligonucleotide It was confirmed that the binding affinity or specificity of liver can be increased.
  • the protocols of the present disclosure increase the signal indicative of the presence of a target nucleic acid sequence by improving the binding affinity or specificity of hybridization between a target-dependent fragment and a fragment-hybridizing oligonucleotide, and thus detect a plurality of target sequences with improved accuracy. allows you to
  • the first synthetic non-natural base is located at a site 2 to 5 nucleotides apart from the 3'-end of the tagging site of the TO.
  • the tagging site of the TO further includes 1 to 5 additional synthetic non-natural bases.
  • the first synthetic unnatural base and 1 to 5 additional synthetic unnatural bases are spaced 1 to 10 nucleotides apart from each other.
  • the first synthetic non-natural base is S, Z, V, K, Pa. Pn, Px, Q, MMO2, 5FM, NaM, B, P, J, X, Ds, Dss and 5SICS.
  • the first synthetic non-natural base is S-B base pair, Z-P base pair, V-J base pair, K-X base pair, Pa-Ds base pair, Pa-Q base pair, Pn-Ds base pair, Pn-Dss base pair, Px -Ds base pair, MMO2-5SICS base pair, 5FM-5SICS base pair and NaM-5SICS base pair selected from the group consisting of any one base.
  • the tagging portion of the TO has a length of 5 to 50 nucleotides.
  • the tagging portion of the TO has a length of 9 to 14 nucleotides.
  • the enzyme having nuclease activity is an enzyme having 5' nuclease activity.
  • the method is performed in the presence of an upstream primer comprising a nucleotide sequence that hybridizes to the target nucleic acid sequence, and the upstream primer is located upstream in the 5' direction of the TO.
  • the upstream primer is extended by a template-dependent nucleic acid polymerase to generate an extended strand, and the extended strand is regenerated by an enzyme having the nuclease activity. and a reaction of inducing cleavage of TO to release the target-dependent fragment including the tagging site of the TO or a partial sequence of the tagging site.
  • the template-dependent nucleic acid polymerase and the enzyme having the nuclease activity are the same enzyme.
  • the TO is a probe.
  • the method is performed in the presence of a downstream primer.
  • the first dimer comprises (i) at least one label linked to the target-dependent fragment and/or the first form of FHO, (ii) a label inserted into the first dimer during the extension reaction. providing a signal detectable by a label, (iii) a label incorporated into the first dimer during the extension reaction and at least one label linked to the FHO of the first form, or (iv) an intercalating label; , The presence of the extended strand in step (c) is detected by measuring a signal provided from the first dimer.
  • the first dimer includes a cleavage site cleaved by a nucleolytic enzyme, and the first dimer provides a detectable signal by cleavage at the cleavage site.
  • step (c) the presence of the extended strand is detected by measuring a signal provided from cleavage of the first dimer.
  • the method additionally uses a Signaling Oligonucleotide (SO) containing a label and a nucleotide sequence that hybridizes to the extended strand, and the dimer between the SO and the extended strand is detectable.
  • SO Signaling Oligonucleotide
  • a signal is provided, and in the step (c), the presence of the extended strand is detected by measuring a signal provided from the dimer between the SO and the extended strand.
  • the method additionally uses Signaling Oligonucleotide (SO) containing a nucleotide sequence hybridizing to the extended strand and a label, and the dimer between the SO and the extended strand is a nucleonucleotide sequence. It includes a cleavage site cleaved by a nucleolytic enzyme, the dimer between the SO and the extended strand provides a detectable signal by cleavage at the cleavage site, and the presence of the extended strand in step (c) is detected by measuring a signal provided from cleavage of the dimer between the SO and the extended strand.
  • SO Signaling Oligonucleotide
  • the method additionally uses a hybridizing nucleotide (HO) comprising an oligonucleotide sequence that hybridizes to the first type of FHO and a label, and the HO and the first type of FHO
  • HO hybridizing nucleotide
  • the dimer between the FHO provides a detectable signal
  • the presence of the extended strand in step (c) is detected by measuring the signal provided from the dimer between the HO and the FHO of the first form, and the HO and the first form
  • the presence of a signal from the dimer between FHO indicates the absence of the extended strand.
  • the method additionally uses an immobilizing oligonucleotide (IO) immobilized on a solid substrate containing a nucleotide sequence that hybridizes to the extended strand, and the extended strand is labeled.
  • IO immobilizing oligonucleotide
  • a signal detectable on the solid substrate is provided by a dimer between the extended strand and the IO
  • step (c) the presence of the extended strand is detected by measuring a signal provided from a dimer between the extended strand and the IO do.
  • step (c) includes the following steps: (c-1) hybridizing the extended strand with a third type of FHO, wherein the third type of FHO is 3' in 5' order (i) a capturing site comprising a nucleotide sequence hybridizing to the extended strand and (ii) a templating site comprising a nucleotide sequence non-hybridizing to the extended strand; the extended strand hybridizes with the capturing region of the third type FHO; (c-2) performing an extension reaction using template-dependent nucleic acid polymerase and the product of step (c-1), wherein the extended strand hybridized to the capturing site of the third form of FHO is further extending to generate a second extension strand comprising a second extension sequence complementary to the templating region of the third type FHO, thereby forming a third dimer between the second extension strand and the third type FHO; (c-3) detecting the presence of the second extended strand, wherein the presence of the second
  • the FHO of the first form or the FHO of the second form is immobilized on a solid substrate.
  • the method uses additional SO, HO or a third form of FHO immobilized on a solid substrate.
  • the 3'-end of the TO and/or the FHO is blocked to prevent extension.
  • the TO when the method forms the second dimer, the TO is a reporter molecule and a first quencher molecule are linked, and the second form of FHO is a second quencher molecule is linked
  • the TO is cleaved dependently on the presence of the target nucleic acid sequence during the reaction of step (a) to release a target-dependent fragment including the reporter molecule, and the reporter molecule included in the target-dependent fragment and the second form
  • the second quencher molecule linked to the FHO of provides a detectable signal by the formation and dissociation of the second dimer between the target-dependent fragment and the second form of FHO according to temperature, and of the second dimer in step (c) Presence is detected by measuring the signal provided from the second dimer.
  • the Tm value of the first dimer or the second dimer is such that the first synthetic non-natural base and the second synthetic non-natural base included in the first or second dimer are substituted with natural bases. 0.5 to 10 ° C. higher than the Tm value of the dimer.
  • all or part of the steps (a)-(c) are repeated including denaturation.
  • composition for detecting a target nucleic acid sequence comprising:
  • the TO includes (i) a tagging region comprising a nucleotide sequence that does not hybridize to the target nucleic acid sequence and (ii) a targeting region comprising a nucleotide sequence that hybridizes to the target nucleic acid sequence, the tagging region comprising the tagging region contains a first synthetic unnatural base within 5 nucleotides from the 3'-end of, and the TO is cleaved dependently on the presence of the target nucleic acid sequence to release a target-dependent fragment containing the tagging site of the TO or a partial sequence thereof. And, the target-dependent fragment comprises the first synthetic non-natural base,
  • the FHO comprises (i) a capturing site comprising a nucleotide sequence that hybridizes to the target-dependent fragment in 3' to 5' order and a nucleotide sequence that does not hybridize to the target-dependent fragment and the targeting site of the TO.
  • a first type of FHO comprising a templating site or (ii) a second type of FHO comprising a capturing site comprising a nucleotide sequence that hybridizes to the target-dependent fragment, wherein the capturing site of the FHO comprises the target a second synthetic unnatural base capable of base pairing with a first synthetic unnatural base in the dependent fragment;
  • the composition further includes an upstream primer comprising a nucleotide sequence that hybridizes to the target nucleic acid sequence, and the upstream primer is located upstream of the TO in a 5' direction.
  • the composition further comprises a template-dependent nucleic acid polymerase.
  • the composition further includes a downstream primer.
  • the length of the TO tagging region can be reduced while maintaining the Tm.
  • the tagging site of the reduced length TO maintains the binding affinity with the capturing site of FHO and hybridizes with the non-target nucleic acid sequence
  • the Tm is significantly lowered and the binding affinity is lowered. Therefore, the target-dependent fragment hybridizes with the non-target nucleic acid sequence. may cause an increase in a signal indicating the presence of the target nucleic acid sequence.
  • FIG. 1 schematically shows an example of a method for detecting a target nucleic acid using a TO including a synthetic non-natural base pair and a FHO of a first type.
  • FIG. 2 schematically shows an example of a method for detecting a target nucleic acid using TO including a synthetic non-natural base pair and a second type of FHO.
  • the present inventors improve the signal indicating the presence of a target nucleic acid sequence by improving the binding affinity or specificity between a target-dependent fragment released by cleavage depending on the presence of the target nucleic acid sequence and a fragment-hybridizing oligonucleotide capable of hybridizing with the target-dependent fragment.
  • the present inventors found that the tagging site of the tag oligonucleotide involved in hybridization between the target-dependent fragment and the fragment-hybridizing oligonucleotide and the fragment-hybridizing oligonucleotide released by introducing a synthetic non-natural base pair into the fragment-hybridizing oligonucleotide It was confirmed that the binding affinity or specificity of liver can be increased.
  • a method for detecting a target nucleic acid sequence comprising the steps of:
  • the TO comprises (i) a tagging site comprising a nucleotide sequence that does not hybridize to the target nucleic acid sequence and (ii) a targeting site comprising a nucleotide sequence that hybridizes to the target nucleic acid sequence,
  • the tagging site includes a first synthetic non-natural base within 5 nucleotides from the 3'-end of the tagging site,
  • the reaction comprises hybridization of the target nucleic acid sequence with the TO and cleavage of the TO dependent on the presence of the target nucleic acid sequence to release a target-dependent fragment comprising a tagging portion of the TO or a partial sequence thereof,
  • the target-dependent fragment comprises the first synthetic non-natural base
  • the cleavage of the TO is carried out by an enzyme having nuclease activity
  • the FHO comprises (i) a capturing site comprising a nucleotide sequence that hybridizes to the target-dependent fragment in 3' to 5' order and a nucleotide sequence that does not hybridize to the target-dependent fragment and the targeting site of the TO. a first type of FHO comprising a templating site or (ii) a second type of FHO comprising a capturing site comprising a nucleotide sequence that hybridizes to said target-dependent fragment;
  • the capturing site of the FHO comprises a second synthetic non-natural base capable of base pairing with the first synthetic non-natural base in the target-dependent fragment;
  • the target-dependent fragment hybridizes to the capturing site of the FHO and is extended to generate an extended strand comprising an extended sequence complementary to the templating site of the FHO; This induces the formation of the first dimer between the extended strand and the FHO, or
  • the presence of the extended strand in the first dimer or the presence of the second dimer indicates the presence of the target nucleic acid sequence.
  • first, second, A, B, (a), (b), (i), and (ii) may be used. These terms are only used to distinguish the component from other components, and the nature, order, or order of the corresponding component is not limited by the term.
  • a target nucleic acid sequence is reacted with a tag oligonucleotide (TO).
  • TO tag oligonucleotide
  • target nucleic acid refers to a sequence to be finally detected, which is annealed or hybridized with a primer or probe under specific hybridization, annealing or amplification conditions.
  • probe is a single-stranded nucleic acid molecule comprising a site or sites of hybridization to a target nucleic acid sequence.
  • primer refers to conditions in which synthesis of a primer extension product complementary to a target nucleic acid sequence (template) is induced, that is, in the presence of nucleotides and a polymerizing agent such as DNA polymerase, and under conditions of suitable temperature and pH. It may refer to an oligonucleotide that serves as a starting point for synthesis.
  • probes and primers are single-stranded deoxyribonucleotide molecules.
  • Probes or primers used in this disclosure may include naturally occurring dNMPs (ie, dAMP, dGMP, dCMP and dTMP), modified nucleotides or non-natural nucleotides.
  • the probe or primer may also contain ribonucleotides.
  • the primer should be of sufficient length to prime the synthesis of the extension product in the presence of a polymerization agent.
  • the appropriate length of the primer depends on a number of factors, such as temperature, application, and source of the primer.
  • annealing or “priming” refers to the apposition of an oligodeoxynucleotide or nucleic acid to a template nucleic acid, wherein the apposition is such that a polymerase polymerizes the nucleotides to form a nucleic acid molecule complementary to the template nucleic acid or portion thereof.
  • hybridization refers to the formation of double-strands through non-covalent linkage between complementary nucleotide sequences of two single-stranded polynucleotides under predetermined hybridization conditions or stringent conditions.
  • one oligonucleotide “comprises a nucleotide sequence that hybridizes” to another oligonucleotide means that all or part of said one oligonucleotide is complementary to all or part of another oligonucleotide necessary for mutual hybridization. It means that it contains a specific nucleotide sequence.
  • hybridization between a part of an oligonucleotide and another oligonucleotide may be expressed by considering the part as an individual oligonucleotide.
  • Hybridization occurs when there is a perfect match between the two nucleic acid sequences at the site where hybridization occurs (the site that forms the double-strand), or when there is a mismatch base (e.g., a mismatch of 1-4). ) can occur even if it exists.
  • the degree of complementarity required for hybridization may vary depending on hybridization reaction conditions, and may be particularly controlled by temperature.
  • the term “complementary” means sufficiently complementary that a primer or probe selectively hybridizes to a target nucleic acid sequence under predetermined annealing or stringent conditions, and includes “substantially complementary” and “completely “Perfectly complementary” has a catch-all meaning, and specifically means completely complementary.
  • non-complementary means sufficiently non-complementary that a primer or probe does not selectively hybridize to a specific sequence under predetermined annealing or stringent conditions
  • substantially non-complementary substantially non-complementary
  • perfectly non-complementary have a meaning encompassing both, and specifically mean completely non-complementary.
  • the TO includes (i) a tagging site comprising a nucleotide sequence that does not hybridize to the target nucleic acid sequence and (ii) a targeting site comprising a nucleotide sequence that hybridizes to the target nucleic acid sequence.
  • a 'tagging site' comprising a nucleotide sequence that does not hybridize to a target nucleic acid sequence is also referred to as a 'tag sequence', a 'flap sequence', or a 'tail sequence'.
  • a sequence may be selected arbitrarily as long as it does not hybridize to the target nucleic acid sequence.
  • the tagging site of the TO may be located at the 5' end, the 3' end, or the center of the targeting site of the TO. In a specific embodiment, the tagging site of the TO may be located at the 5' end of the targeting site of the TO.
  • the tagging site of the TO is a Watson-Crick generated between naturally occurring bases such as guanine (G), cytosine (C) adenine (A), thymine (T) and uracil (U). It may contain one or more synthetic unnatural bases that exhibit binding affinity different from Watson-Crick base-pairing.
  • the tagging site of the TO includes a first synthetic non-natural base within 5 nucleotides from the 3'-end of the tagging site.
  • the first synthetic non-natural base is S, Z, V, K, Pa. It may be selected from the group consisting of Pn, Px, Q, MMO2, 5FM, NaM, B, P, J, X, Ds, Dss and 5SICS, but is not limited thereto.
  • the first synthetic non-natural base may be located within 5 nucleotides from the 3'-end of the tagging site (specifically, the 5'-tagging site) of the TO. Specifically, it may be located within 5 nucleotides, 4 nucleotides, 3 nucleotides, or 2 nucleotides from the 3'-end of the TO tagging site.
  • the first synthetic non-natural base is located at a site 2 to 5 nucleotides apart from the 3'-end of the tagging site of the TO.
  • the first synthetic non-natural base is positioned 2 nucleotides apart from the 3'-end of the tagging portion of the TO in the order from 5' to 3' of the tagging portion. , indicates the n-1 nucleotide, and the position 5 nucleotides apart indicates the n-4 nucleotide.
  • the present inventors determined the location of the 1st nucleotide of the 3'-end of the tagging site (specifically, the 5'-tagging site) of the TO (that is, the nth nucleotide in the order from 5' to 3' among the tagging sites consisting of n nucleotides).
  • the synthetic non-natural base is included, the sensitivity for detection in step (c), in particular, the sensitivity for detection of the extended strand in the first dimer is lowered.
  • the first synthetic non-natural base is located at 2nd nucleotide to 5th nucleotide, 2nd nucleotide to 4th nucleotide, or 2nd nucleotide to 3rd nucleotide from the 3'-end of the tagging site of the TO. can do.
  • non-natural base refers to derivatives of natural bases such as adenine (A), guanine (G), thymine (T), cytosine (C) and uracil (U) capable of forming base pairs. do.
  • non-natural base includes a base having a different base-pairing pattern from a natural base as a mother compound, e.g., U.S. Pat. are listed in the issue. Base pairing between non-natural bases may involve two or three hydrogen bonds, similar to natural bases. Base pairs between non-natural bases are also formed in a specific way.
  • non-natural bases include base pair combinations of the following bases: iso-C/iso-G, iso-dC/iso-dG, K/X, H/J, M/N and 5FM-5SICS (Ref. US Patent No. 7,422,850).
  • the tagging site of the TO may further include 1 to 5 synthetic non-natural bases, and specifically, 1, 2, 3, 4 or 5 synthetic non-natural bases may be further included.
  • the additional synthetic non-natural base is a site other than the first nucleotide from the 3'-end of the tagging site. located in For example, when the tagging site of the TO consists of n nucleotides, the additional synthetic non-natural base cannot be located at the n-th nucleotide in the 5' to 3' order of the tagging site.
  • the first synthetic non-natural base and the additional synthetic non-natural base may be positioned consecutively.
  • the first synthetic non-natural base and the additional synthetic non-natural base are spaced 1 to 20 nucleotides apart from each other There may be, specifically, 1 to 15 nucleotides, 1 to 10 nucleotides, 1 to 5 nucleotides, 2 to 15 nucleotides, 2 to 10 nucleotides, or 2 to 5 nucleotides may be spaced apart, more specifically, 1 nucleotide, 2 nucleotides nucleotides, 3 nucleotides, 4 nucleotides or 5 nucleotides apart.
  • all or part of the first synthetic non-natural base and the additional synthetic non-natural base may be the same.
  • both the first synthetic unnatural base and the additional synthetic unnatural base may be the same unnatural base.
  • some of the first synthetic unnatural base and the additional synthetic unnatural bases may be of the same kind (eg, S) and others may be of a different kind of unnatural base (eg, Z).
  • both the first synthetic unnatural base and the additional synthetic unnatural base may be different.
  • the length of TO is 15 to 150 nucleotides, 15 to 100 nucleotides, 15 to 80 nucleotides, 15 to 60 nucleotides, 15 to 40 nucleotides, 20 to 150 nucleotides, 20 to 100 nucleotides, 20 to 80 nucleotides, 20 to 80 nucleotides 60 nucleotides, 20 to 50 nucleotides, 30 to 150 nucleotides, 30 to 100 nucleotides, 30 to 80 nucleotides, 30 to 60 nucleotides, 30 to 50 nucleotides, 35 to 100 nucleotides, 35 to 80 nucleotides, 35 to 60 nucleotides It may have a length of 50 nucleotides.
  • the TO may have any length, as long as the targeting portion of the TO specifically hybridizes to the target nucleic acid sequence.
  • the targeting site of the TO is 10 to 100 nucleotides, 10 to 80 nucleotides, 10 to 50 nucleotides, 10 to 40 nucleotides, 10 to 30 nucleotides, 15 to 100 nucleotides, 15 to 80 nucleotides, 15 to 50 nucleotides, 15 to 40 nucleotides, 15 to 30 nucleotides, 20 to 100 nucleotides, 20 to 80 nucleotides, 20 to 50 nucleotides, 20 to 40 nucleotides or 20 to 30 nucleotides in length.
  • the tagging site can be of any length as long as it specifically hybridizes and/or extends to the capturing site of the FHO.
  • the tagging portion of TO is 5 to 50 nucleotides, 5 to 40 nucleotides, 5 to 30 nucleotides, 5 to 20 nucleotides, 5 to 15 nucleotides, 10 to 50 nucleotides, 10 to 40 nucleotides, 10 to 30 nucleotides, 10 to 20 nucleotides, 10 to 15 nucleotides, 15 to 50 nucleotides, 15 to 40 nucleotides, 15 to 30 nucleotides or 15 to 20 nucleotides in length.
  • the tagging portion of the TO has a length of 9 to 14 nucleotides.
  • the TO may be a primer or a probe, and in a specific embodiment, the TO may be a probe.
  • the 3'-end of TO may have a 3'-OH terminal.
  • the 3'-end of TO may be "blocked" to prevent its extension.
  • Blocking can be achieved according to conventional methods. For example, blocking is accomplished by adding a chemical moiety such as biotin, a label, a phosphate group, an alkyl group, a non-nucleotide linker, a phosphorothioate or an alkane-diol moiety to the 3'-hydroxyl group of the last nucleotide. can be carried out. Alternatively, blocking can be performed by removing the 3'-hydroxyl group of the last nucleotide or using a nucleotide without a 3'-hydroxyl group, such as dideoxynucleotide.
  • a chemical moiety such as biotin, a label, a phosphate group, an alkyl group, a non-nucleotide linker, a phosphorothioate or an alkane-diol moiety
  • the reaction of step (a) is hybridization of the target nucleic acid sequence with the TO and cleavage of the TO dependent on the presence of the target nucleic acid sequence, comprising a tagging portion of the TO or a partial sequence thereof. and release of target-dependent fragments.
  • the TO is hybridized to the target nucleic acid sequence, and then the TO is cleaved depending on the presence of the target nucleic acid sequence, thereby tagging the TO or a partial sequence thereof.
  • hybridization of the target nucleic acid sequence and the TO may be performed under stringent conditions in which the targeting portion of the TO hybridizes to the target nucleic acid sequence and the tagging portion does not hybridize to the target nucleic acid sequence.
  • cleavage of the TO may be performed by an enzyme having nuclease activity.
  • the cleavage of the TO may be performed using a polymerase having nuclease activity or using a separate nuclease, but is not limited thereto.
  • the nuclease may be a naturally occurring, unmodified or modified nuclease.
  • the TO hybridized to the target nucleic acid sequence is cleaved by an enzyme having nuclease activity under conditions for cleavage of TO to release a target-dependent fragment including the tagging site of TO or a partial sequence thereof. do.
  • condition for cleavage of TO refers to conditions sufficient for cleavage of TO hybridized to a target nucleic acid sequence by an enzyme having nuclease activity, such as temperature, pH, ionic strength, buffer, oligonucleotide It refers to the length and sequence of nucleotides and enzymes.
  • an enzyme having nuclease activity such as temperature, pH, ionic strength, buffer, oligonucleotide It refers to the length and sequence of nucleotides and enzymes.
  • conditions for cleavage of TO include Tris-HCl buffer, KCl, MgCl 2 and temperature.
  • oligonucleotides including both single-stranded and double-stranded structures can be cleaved using enzymes having nuclease activity by various techniques known in the art.
  • the enzyme include 5'-nuclease and 3'-nuclease, particularly nucleic acid polymerase having 5'-nuclease activity, nucleic acid polymerase having 3'-nuclease activity, or FEN nuclease. Contains cleases.
  • the enzyme having nuclease activity may be an enzyme having 5' nuclease activity.
  • it may be a DNA polymerase or FEN nuclease having a 5' nuclease activity, and specifically, a thermostable DNA polymerase or FEN nuclease having a 5' nuclease activity.
  • the DNA polymerase having 5' nuclease activity is a thermostable DNA polymerase obtained from various bacterial species, which include Thermus aquaticus (Taq) , Thermus thermophilus (Tth) , Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, Thermus antranikianii, Thermus caldophilus, Thermus chliarophilus, Thermus flavus, Thermus igniterrae, Thermus lacteus, Thermus oshimai, Thermus ruber, Thermus rubens, Thermus scotoductus, Thermus silvanus, Thermus species Z05, Thermus species sps 17, Thermus thermophilus, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosipho africanus, Thermococcus litoralis, Thermococcus barossi, Thermoc
  • the present disclosure may use a DNA polymerase having a 5' nuclease activity that has been modified to have less polymerase activity.
  • the flap endonuclease (FEN) nuclease may be a 5' flap-specific nuclease.
  • FEN nucleases include FEN nucleases from various bacterial species , which include Sulfolobus solfataricus, Pyrobaculum aerophilum, Thermococcus litoralis, Archaeaglobus veneficus, Archaeaglobus profundus, Acidianus brierlyi, Acidianus ambivalens, Desulfurococcus amylolyticus, Desulfurococcus mobilis, Pyrodictium brockii , Thermococcus gorgonarius, Thermococcus zilligii, Methanopyrus kandleri, Methanococcus igneus, Pyrococcus horikoshii, Aeropyrum pernix and Archaeaglobus veneficus .
  • the step (a) may be performed in the presence of an upstream oligonucleotide comprising a nucleotide sequence that hybridizes to the target nucleic acid sequence.
  • the upstream oligonucleotide is located upstream in the 5' direction relative to the TO.
  • Upstream oligonucleotide refers to an oligonucleotide located upstream relative to TO.
  • an upstream oligonucleotide and TO are hybridized to one of the double-stranded strands, and TO is located downstream of the upstream oligonucleotide.
  • the upstream oligonucleotide hybridizes to a specific site in the 3'-direction compared to the site of the target nucleic acid strand to which the TO hybridizes.
  • step (a) may include a reaction of hybridizing an upstream oligonucleotide to a target nucleic acid sequence.
  • the upstream oligonucleotide induces cleavage of the TO by an enzyme having the nuclease activity, and the target-dependent cleavage comprising the tagging site of the TO or a partial sequence thereof. reactions that release fragments.
  • Induction of TO cleavage by upstream oligonucleotides can be achieved in two ways: (i) induction of upstream oligonucleotide extension-independent cleavage; and (ii) inducing upstream oligonucleotide extension-dependent cleavage.
  • an upstream oligonucleotide When an upstream oligonucleotide is positioned close enough to TO to induce cleavage of the TO by an enzyme having 5' nuclease activity, the enzyme bound to the upstream oligonucleotide cleaves TO without an extension reaction.
  • an enzyme having polymerase activity e.g., template-dependent polymerase
  • promotes extension of the upstream oligonucleotide e.g., upstream primer
  • 5 bound to the extension product e.g., upstream primer
  • upstream oligonucleotides can be positioned relative to TO in two ways.
  • the upstream oligonucleotide may be positioned in close enough proximity to the TO to induce cleavage of the TO in an extension-independent manner.
  • the upstream oligonucleotide may be positioned at a distance from TO sufficient to induce TO cleavage in an extension-dependent manner.
  • the term "adjacent" when referring to positions or locations with an upstream oligonucleotide is an upstream oligonucleotide positioned immediately adjacent to the targeting site of the TO to form a nick. means that Also, the term means that the upstream oligonucleotide is located 1 to 30 nucleotides, 1 to 20 nucleotides or 1 to 15 nucleotides apart from the targeting site of the TO.
  • distal when referring to a point or location with an upstream oligonucleotide includes any location or location sufficient for an extension reaction to occur.
  • the upstream oligonucleotide may be an upstream primer or an upstream probe.
  • Upstream primers are suitable for inducing extension-independent cleavage or extension-dependent cleavage
  • upstream probes are suitable for inducing extension-independent cleavage.
  • the upstream oligonucleotide when it is an upstream primer, it may also be referred to as a forward primer.
  • step (a) when cleavage of the TO is induced in an extension-dependent manner of the upstream oligonucleotide, step (a) hybridizes and extends the upstream oligonucleotide to the target nucleic acid sequence to generate an extended strand thereof reactions may be involved.
  • the extended strand of the upstream oligonucleotide may induce cleavage of the TO by an enzyme having nuclease activity to release the target-dependent fragment including the tagging site of the TO or a partial sequence thereof.
  • the reaction to generate the extended strand of the upstream oligonucleotide can be carried out by a template-dependent nucleic acid polymerase.
  • Hybridization of the TO and upstream oligonucleotides with the target nucleic acid sequence can be performed under suitable hybridization conditions generally determined by optimization procedures. Conditions such as temperature, concentration of components, number of hybridizations and washes, buffer components and their pH and ionic strength may vary depending on a variety of factors including the length and amount of GCs of the oligonucleotides (upstream oligonucleotides and TO) and the target nucleotide sequence. there is. For example, when using relatively short oligonucleotides, it is desirable to select low stringent conditions.
  • the upstream oligonucleotide is a sequence partially overlapping with the 5'-part of the 3'-targeting site of the TO ( partial-overlapped sequences).
  • the overlapping sequences are 1 to 10 nucleotides in length, specifically 1 to 5 nucleotides, more specifically 1 to 3 nucleotides.
  • the upstream primer induces cleavage of TO by an enzyme having 5' nuclease activity through its extended strand.
  • the cleavage site of TO varies depending on the type of upstream oligonucleotide (upstream probe or upstream primer), the hybridization site of the upstream oligonucleotide and the cleavage conditions (see U.S. Patent Nos. 5,210,015, 5,487,972, 5,691,142, 5,994,069 and 7,381,532 or US Application Publication No. 2008-0241838).
  • the cleavage position of the TO may vary depending on the location of the tagging site, eg, 5'-, 3'- or centrally of the targeting site.
  • the TO includes a 5'-tagging site and a 3'-targeting site, there may be three cleavage sites in the cleavage reaction.
  • the first cleavage site is the junction site between the hybridization site (3'-targeting site) and the non-hybridization site (5'-tagging site) of TO.
  • the second cleavage site is a position spaced by some nucleotides in the 3'-direction from the 3'-end of the TO tagging site.
  • the second cleavage site may be located at a part of the 5'-end of the 3'-targeting region of TO.
  • the third cleavage site is a position some nucleotides apart in the 5'-direction from the 3'-end of the 5'-tagging site of TO.
  • the cleavage site is (i) a hybridization site (5'-targeting site) and a non-hybridization site (3'-tagging site) of the TO.
  • a position some nucleotides apart in the 5'-direction from the 5'-end of the tagging site of TO i.e., a part of the 3'-end of the 5'-targeting site of TO) position
  • a position some nucleotides apart in the 3'-direction from the 5'-end of the 3'-tagging site of TO may be a position some nucleotides apart in the 3'-direction from the 5'-end of the 3'-tagging site of TO.
  • the method can be carried out in the presence of a downstream primer.
  • the downstream primer may also be referred to as a reverse primer.
  • the downstream primer hybridizes to another nucleic acid strand that is complementary to the target nucleic acid strand to which the upstream primer and TO hybridize.
  • the downstream primer hybridizes to a specific site in the 3'-direction compared to a site on the other nucleic acid strand that is complementary to the site on the target nucleic acid strand to which the TO hybridized.
  • Downstream primers enhance the detection sensitivity of the present invention by additionally generating a target nucleic acid sequence to which TO can hybridize.
  • a template-dependent nucleic acid polymerase when using an upstream primer and a downstream primer, may be additionally used for extension of the primer.
  • the template-dependent nucleic acid polymerase and the enzyme having the nuclease activity may be the same enzyme.
  • the template-dependent nucleic acid polymerase and the enzyme having the nuclease activity may be different from each other.
  • the target-dependent fragment released by the TO cleavage reaction includes the one or more synthetic non-natural bases.
  • target-dependent fragment comprising a TO tagging site or a partial sequence thereof used herein while referring to cleavage of TO by an enzyme having nuclease activity refers to (i) a tagging site, (ii) a tagging site part, (iii) 5'-tagging site and 5'-terminal part of 3'-targeting site, and (iv) 3'-end and 3'-tagging site of 5'-targeting site.
  • part when referring to TO or FHO, such as part of the tagging site of TO, part of the targeting site, and part of the capturing site of FHO, is 1 to 40, 1 to 30, 1 to 20, 1 to 15, 1 to 10, or 1 to 5 nucleotide sequences, and specific examples may be 1, 2, 3 or 4 nucleotides.
  • the target-dependent fragment cleaved and released from TO reacts with a fragment-hybridizing oligonucleotide (FHO) to form a dimer.
  • FHO fragment-hybridizing oligonucleotide
  • the FHO comprises (i) a capturing site comprising a nucleotide sequence that hybridizes to the target-dependent fragment in 3' to 5' order and non-hybridization to the target-dependent fragment and the targeting site of the TO. or (ii) a second type of FHO comprising a capturing site comprising a nucleotide sequence that hybridizes to the target-dependent fragment.
  • the capture site of the FHO of the first form or of the FHO of the second form comprises a second synthetic unnatural base capable of base pairing with the first synthetic unnatural base in the target-dependent fragment.
  • non-natural base pairs refer to base pairs formed between non-natural bases.
  • non-natural base-pairing as used in the present disclosure refers to non-natural base-pairing formed between synthetic non-natural bases exhibiting different binding affinity from Watson-Crick base-pairing.
  • the non-natural base pair formed between the synthetic non-natural bases used in the present disclosure has higher binding affinity than natural base pairs formed between natural bases (Zunyi Yang, et al., Nucleic Acids Research, Vol. 34, No. 21, 2006), whereby the binding affinity between the target-dependent fragment comprising the first synthetic non-natural base and the FHO of the first form or the FHO of the second form comprising the second synthetic non-natural base Mars increases.
  • the synthetic non-natural base can form a non-natural base pair with a synthetic non-natural base complementary thereto. It may also contain non-natural base pairs that do not follow the Watson-Crick pairing rules. For example, it may be used in a meaning including showing binding affinity different from natural base pairing by a binding method different from natural base pairing (eg, non-hydrogen bonding, etc.).
  • the Watson-Crick pairing rules govern (i) size complementarity (pairs of large purines and small pyrimidines) and (ii) hydrogen bond complementarity (of hydrogen bond donors and hydrogen bond acceptors). pair) follows the two complementarity rules (US 10,865,431).
  • a non-natural base-pair exhibits a different binding affinity than a Watson-Crick base-pair
  • a Watson-Crick base-pair refers to a Watson-Crick base-pairing generated between natural bases such as G-C and A-T(U). ), it means that the number of hydrogen bonds between the non-natural base pairs, the strength of hydrogen bonds, etc. are different, indicating a binding affinity different from that of natural base pairs.
  • the non-natural base-pair is synthetic, which exhibits a different binding affinity than Watson-Crick base-pairing generated between natural bases such as G-C and A-T (U). Includes Watson-Crick base pairs created between non-natural bases.
  • non-natural base pairs examples include four types of mutually exclusive pairs formed from eight types of non-natural bases presented in US 5,432,272, US 5,965,364 US 6,001,983, US 6,037,120, US 6,140,496, US 6,627,456 and US 6,617,106. ) may be included.
  • the eight types of non-natural bases are classified according to the heterocyclic ring system and hydrogen bonding pattern, pyAAD (S), pyDDA (Z), pyADD (V), pyDAD (K), puDDA (B), puAAD ( P), puDAA (J) and puADA (X).
  • py is a pyrimidine-like heterocyclic ring system
  • pu is a purine-like heterocyclic ring system
  • D is a hydrogen bond donor group
  • A is Means a hydrogen bond acceptor group.
  • C-G which is an example of a natural base pair
  • the four types of mutually exclusive pairs include pyAAD-puDDA(S-B) pairs, pyDDA-puAAD(Z-P) pairs, pyADD-puDAA(V-J) pairs and pyDAD-puADA(K-X) pairs.
  • the eight types of non-natural bases may include various structures as long as they satisfy the existence of a heterocyclic ring system (pyrimidine-like or purine-like) for each type and whether or not there is a hydrogen bond donor group and acceptor group.
  • a representative example of the S-B pair is isoC-isoG
  • isoC refers to isocytosine or dexoyisocytosine and has a structure of pyAAD
  • isoG refers to isoguanosine or deoxyisoguanosine and has a structure of puDDA.
  • a detailed description of isoC-isoG base pairing can be found in C. Y. Switzer, et al., Biochemistry, vol. 32, no. 39, p. 10489-10496, 1993; J. A. Piccirilli et al., Nature, vol. 343, no. 6253, pp. 6253; 33-37, 1990; M. J. Moser et al., Clinical Chemistry, vol. 49, no. 3, p. 407-414, 2003; Johnson SC et al., Nucleic Acids Res 2004, 32(6): 1937-1941.
  • Z-P may be 6-amino-5-nitro-3-(1'- ⁇ -D-2'-deoxyribofuranosyl)-2(1H)-pyridone
  • P is 2-amino-8- (2'-deoxy- ⁇ -D-erythro-pentofuranosyl)-imidazo[1,2-a]-1,3,5-triazin-4(8H)-one.
  • Z-P base pairing exhibits 99.8% unnatural base pair selectivity per copy and 0.2% misincorporation across natural bases per amplification in PCR using Taq DNA polymerase (Yang et al., 2007, 2011; Robert W. Molt. Jr. et al., Nucleic Acids Res.. 2017, 45(7): 3643-3653).
  • V-J is 6-aminopyrazin-2-one ring
  • J may be 2'-deoxy-5-aza7-deazaisoguanosine
  • K-X K is 2,4-diaminopyrimidine
  • X is 2 It can be '-deoxyxanthosine.
  • the non-natural base pairing may also include non-natural base pairing based on a non-hydrogen bond, different from Watson-Crick base pairing based on a hydrogen bond.
  • non-natural base pairs based on hydrophobic and shape complementary interaction e.g., Q-Pa, Ds-Pa, Ds-Pn, Dss-Pn
  • non-natural base pairs based on hydrophobic and packing interaction e.g., 5SICS-MMO2, 5SICS- 5FM, 5SICS-NaM.
  • the non-natural base pair is S-B base pair, Z-P base pair, V-J base pair, K-X base pair, Pa-Ds base pair, Pa-Q base pair, Pn-Ds base pair, Pn-Dss base pair, Px-Ds base pair, MMO2- It may be selected from the group consisting of 5SICS base pairs, 5FM-5SICS base pairs and NaM-5SICS base pairs.
  • Pa refers to pyrrole-2-carbaldehyde
  • Ds refers to 7-(2-thienyl)-imidazo[4,5-b]pyridine
  • Q refers to 9-methyl-1-H-imidzo[(4 ,5-b)]pyridine
  • Pn is 2-nitropyrrole
  • Dss is 7-(2,2-bithien-5-yl)-imidazo[4,5-b]pyridine
  • Px is 2-nitro-4-propynylpyrrole
  • MMO2 refers to 2-methoxy 4-methyl benzene
  • 5SICS refers to 5-Sulfo-isocarbostyril
  • 5FM refers to 5-fluoro-4-methyl-2-methoxybenzene
  • NaM refers to 2-methoxy naphthalene.
  • the first synthetic unnatural base is S-B base pair, Z-P base pair, V-J base pair, K-X base pair, Pa-Ds base pair, Pa-Q base pair, Pn-Ds base pair, Pn-Dss base pair, Px-Ds base pair , MMO2-5SICS base pair, 5FM-5SICS base pair, and NaM-5SICS base pair may be any one of base pairs selected from the group consisting of.
  • the first synthetic non-natural base is selected from two non-natural bases in consideration of the selectivity of an unnatural base pairing among the two non-natural bases constituting the non-natural base pair to be used. Any one of the bases may be selected as the first synthetic non-natural base. Specifically, a base having high selectivity for base pairing among non-natural base pairs (i.e., a base having a low frequency of forming bases with other bases including natural bases other than complementary non-natural bases) is used as the first synthetic non-natural base, , the remaining base can be used as a second synthetic non-natural base.
  • S-B base pairs S (eg, iso-C) having a relatively high selectivity is used as a first synthetic unnatural base
  • B eg, iso-G having a relatively low selectivity
  • the target-dependent fragment and the capturing site of the FHO may include one or more S-B base pairs.
  • the target-dependent fragment may include one or more S, and the capturing site of the FHO may include B, which is a complementary base of S, opposite the S.
  • the target-dependent fragment may include one or more B's, and the capturing site of the FHO may include S opposite the B's.
  • the capture site of the target-dependent fragment and FHO comprises one or more Z-P base pairs.
  • the target-dependent fragment may include one or more Zs, and the capturing site of the FHO may include P, which is a complementary base of Z, opposite the Z.
  • the target-dependent fragment may include one or more P's, and the capturing site of the FHO may include Z opposite the P's.
  • the capture site of the target-dependent fragment and FHO comprises one or more V-J base pairs.
  • the target-dependent fragment may include one or more V, and the capturing site of the FHO may include J, which is a complementary base of V, opposite the V.
  • the target-dependent fragment may include one or more Js, and the capturing site of the FHO may include a V opposite the J.
  • the capture site of the target-dependent fragment and FHO comprises one or more K-X base pairs.
  • the target-dependent fragment may include one or more K, and the capturing site of the FHO may include X, which is a complementary base of K, opposite the K.
  • the target-dependent fragment may include one or more X's, and the capturing site of the FHO may include K opposite the X's.
  • the capture site of the target-dependent fragment and FHO comprises one or more Ds-Px base pairs.
  • the Ds-Px base pair shows high efficiency and selectivity in PCR amplification (Michiko Kimoto et al., Journal of Nucleic Acids, Vol. 2012).
  • the selectivity of Ds-Px base pairs has been reported to be 99.77%-99.92% by exonuclease-proficient Deep Vent DNA polymerase (Rie Yamashige et al., Nucleic Acids Research,, 2011, 40(6):2793 -2806).
  • the target-dependent fragment includes one or more Ds and the capturing site of the FHO includes Px opposite the Ds.
  • the target-dependent fragment includes one or more Px and the capturing site of the FHO includes Ds opposite the Px.
  • the target-dependent fragment and the capturing site of the FHO include one or more 5SICS-MMO2 base pairs.
  • the 5SICS-MMO2 base pair shows 99.9% selectivity in PCR using OneTaq (a mixture of Taq and exonuclease-proficient Deep Vent DNA polymerase) (Malyshev et al., 2009, 2012).
  • the misincorporation rate of 5SICS-MMO2 base pairs is 0.01-0.1% per copy per base.
  • the target-dependent fragment comprises one or more 5SICS and the capturing site of the FHO comprises MMO2 opposite the 5SICS.
  • the target-dependent fragment comprises one or more MMO2 and the capturing site of the FHO comprises 5SICS opposite the MMO2.
  • the reaction of step (b) includes a reaction of hybridizing the target-dependent fragment to the capturing site of the FHO.
  • Hybridization of the target-dependent fragment with the FHO capturing site can be performed under suitable hybridization conditions generally determined by an optimization procedure.
  • the first synthetic non-natural base and/or the second synthetic non-natural base included in the target-dependent fragment and the capturing site of the FHO do not form a base pair with a natural base, and the first synthetic non-natural base and the second synthetic non-natural base form a base pair. It can be carried out under conditions that allow for base pairing between synthetic non-natural bases.
  • the introduction of the non-natural base pair into the tagging site of the TO and the capturing site of the FHO is effective for FHO of the target-dependent fragment.
  • the non-natural base pair included in the target-dependent fragment and the FHO capturing site increases the melting temperature of the hybrid between the target-dependent fragment and the FHO capturing site, that is, the target-dependent fragment and the FHO capturing site. improve the binding affinity between them.
  • a hybrid between a target-dependent fragment containing an unnatural base pair and the capturing site of FHO has a higher melting temperature compared to a hybrid between a target-dependent fragment not containing the non-natural base pair and the capturing site of FHO. and binding affinity.
  • the increased binding affinity between the target-dependent fragment containing the non-natural base pair and the capture site of FHO increases the extension efficiency of the target-dependent fragment hybridized to the capture site of FHO, which in turn produces a signal indicating the presence of the target nucleic acid sequence. increase and may lead to an increase in detection sensitivity.
  • introduction of non-natural base pairs into the tagging region of TO and the capturing region of FHO can reduce the length of the TO tagging region while maintaining the Tm. That is, the tagging site of the TO including the first synthetic non-natural base may have a shorter length than the tagging site of the conventional TO not including the synthetic non-natural base.
  • the length is The probability of hybridization of a short target-dependent fragment to a non-target nucleic acid sequence is lower than the probability of hybridization of a longer target-dependent fragment to a non-target nucleic acid sequence. Therefore, using a short TO tagging site may prevent hybridization with a non-target, which may lead to an increase in a signal indicating the presence of a target nucleic acid sequence.
  • the Tm value of the first dimer or the second dimer is a dimer in which the first synthetic non-natural base and the second synthetic non-natural base included in the first dimer or the second dimer are substituted with natural bases. 0.5 to 10 °C higher than the Tm value.
  • the reaction of step (b) may include an extension reaction by a template-dependent nucleic acid polymerase.
  • the target-dependent fragment is an extension sequence complementary to the templating portion of the FHO through hybridization and extension reaction to the capturing portion of the FHO of the first type. It is possible to generate an extended strand comprising a, and thus form a first dimer between the extended strand and the FHO of the first type.
  • the uncut TO hybridized to the capturing site of the FHO of the first form does not extend and thus does not form an extended strand.
  • the target-dependent fragment hybridized to the capturing site of the FHO of the first type may be extended by the activity of a template-dependent nucleic acid polymerase using the templating site of the FHO of the first type as a template.
  • the 3'-end of the TO and/or the FHO is blocked to prevent extension.
  • extended sequence extended sequence
  • extended strand extended strand
  • first dimer used in relation to the extension reaction of the target-dependent fragment
  • extended sequence refers to a sequence newly extended through an extension reaction from a target-dependent fragment hybridized to the capturing site of the FHO of the first form.
  • extended sequence refers to a portion excluding the target-dependent fragment from the extended strand to be described below.
  • extended strand refers to the sequence encompassing the target-dependent fragment and the extended sequence.
  • extended strand refers to a portion excluding the FHO of the first type in the first dimer described below.
  • first dimer refers to a hybrid or dimer (through complementarity between sequences) between the extended strand and the FHO of the first form.
  • first dimer refers to a dimer between the extended strand composed of the target-dependent fragment and the extended sequence and the FHO of the first type.
  • the template-dependent nucleic acid polymerase used in step (b) includes any nucleic acid polymerase, such as the “Klenow” fragment of Escherichia coli DNA polymerase I, thermostable DNA polymerase and bacteriophage T7 DNA polymerase.
  • template-dependent nucleic acid polymerases are thermostable DNA polymerases obtained from various bacterial species, including Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth) , Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, Thermus antranikianii, Thermus caldophilus , Thermus chliarophilus, Thermus flavus, Thermus igniterrae, Thermus lacteus, Thermus oshimai, Thermus ruber, Thermus rubens, Thermus scotoductus, Thermus silvanus, Thermus species Z05, Thermus species sps 17, Thermus thermophilus, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana and Thermosipho elitenus , Thermococcus litoralis, Thermococcus barossi, Thermococcus baros
  • the template-dependent nucleic acid polymerase comprises a reverse transcriptase.
  • the target-dependent fragment may hybridize with a capturing site of the second type of FHO to form a second dimer.
  • the method may form a second dimer by hybridization between the target-dependent fragment released by cleavage of the TO in step (a) and the second form of FHO.
  • the tagging site of the TO and the second form of FHO are first hybridized to form a double-stranded form, and then the TO is cleaved by an enzyme having nuclease activity to form a second form of FHO. can form dimers.
  • the FHO of the second form may be connected to the end of the tagging site of TO.
  • one oligonucleotide may include a tagging site of TO and a second form of FHO.
  • hybridization between the tagging region of TO and the second form of FHO can form a hairpin structure.
  • 'hairpin' refers to a structure of an oligonucleotide having a double-stranded 'stem' region and a single-stranded 'loop' region.
  • second dimer refers to a hybrid or dimer (via intersequence complementarity) between the target-dependent fragment and the capturing site of a second form of FHO.
  • a hybrid or dimer between the tagging site of the uncleaved TO and the capturing site of the FHO of the second form is not included in the second dimer.
  • the enzyme having nuclease activity used in step (a) (particularly, the enzyme having 5'nuclease activity), the template-dependent method for extending the upstream primer of step (a)
  • the nucleic acid polymerase and the template-dependent nucleic acid polymerase for extending the target-dependent fragment of step (b) may be all different, some identical, or all the same.
  • the presence of the extended strand in the first dimer or the presence of the second dimer is detected.
  • the presence of the extended strand in the first dimer or the presence of the second dimer indicates the presence of a target nucleic acid sequence.
  • the target nucleic acid sequence can be detected by detecting a signal indicating the presence of the target nucleic acid sequence.
  • the term "signal indicating the presence of a target nucleic acid sequence” means a signal having an intensity that exceeds the intensity of the background signal or the intensity of a signal that can be provided in the absence of the target nucleic acid, or from the intensity of a given signal. It means a signal having an intensity after subtracting the intensity of a background signal or the intensity of a signal that can be provided in the absence of a target nucleic acid sequence.
  • the signal indicating the presence of the target nucleic acid sequence includes any signal that can indicate the presence of the extended strand in a first duplex or the presence of a second duplex.
  • a signal indicating the presence of a target nucleic acid sequence may be a signal from a label (signal onset or disappearance), a change in signal from a label (signal increase or decrease), a melting curve, a melting pattern, and a melting temperature (or Tm value).
  • step (c) can be achieved by detecting a signal indicating the presence of an extended strand in the first dimer or a signal indicating the presence of the second dimer.
  • the method can provide a signal from the label in a manner dependent on formation of a dimer. By detecting the signal, the presence of the target nucleic acid sequence can be detected.
  • the dimer includes not only the first dimer or the second dimer, but also a third dimer formed depending on their presence.
  • the provision of the signal includes “signal generation or disappearance” and “signal increase or decrease” from the label.
  • duplex may be used to encompass a duplex in associated form and a duplex in dissociated form. That is, it may refer to two single-stranded nucleic acid molecules that contain sequences partially or wholly complementary to each other and thus hybridize to each other under hybridization conditions to form a dimer (hybridize) structure.
  • the dimer may exist as a dimer in a bound form, a dimer in a dissociated form, or a portion may exist as a dimer in a bound form and the remainder may exist in a dissociated form.
  • the method may provide a signal in a manner dependent on association or dissociation of the dimer, and may detect the presence of the target nucleic acid sequence by detecting the signal.
  • a dimer in a bound form quenches (or emits light) a signal
  • a dimer in a dissociated form emits (or quenches) a signal, using a dimer capable of providing different signals in the bound and dissociated states.
  • the presence of the target nucleic acid sequence can be detected.
  • association or dissociation has the same meaning as the term “hybridization or denaturation”.
  • the method can provide a signal in a manner dependent on cleavage of the dimer and, by detecting the signal, can detect the presence of the target nucleic acid sequence.
  • the dimer to be cleaved includes not only the first dimer or the second dimer, but also a third dimer formed depending on their presence.
  • the label can be a single label and/or an interactive label.
  • a fluorescence resonance energy transfer (FRET) labeling system includes a fluorescence reporter molecule (donor molecule) and a quencher molecule (acceptor molecule).
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • the energy donor is fluorescent, but the energy acceptor can be either fluorescent or non-fluorescent.
  • the energy donor is non-fluorescent, such as a chromophore, and the energy acceptor is fluorescent.
  • the energy donor is luminescent, eg bioluminescent, chemiluminescent or electrochemiluminescent and the acceptor is fluorescent.
  • Donor molecules and acceptor molecules may be described in this disclosure as reporter molecules and quencher molecules, respectively.
  • Interactive dual labels include pairs of labels that provide a detectable signal based on contact-mediated quenching (Salvatore et al., Nucleic Acids Research, 2002 (30) no.21 e122 and Johansson et al., J. AM CHEM.SOC 2002 (124) pp 6950-6956).
  • the interactive labeling system includes all cases inducing signal change by interaction between at least two molecules (eg, dyes).
  • Reporter molecules and quencher molecules useful as interactive-double labels can include any molecules known in the art. Examples include: Cy2TM (506), YO-PROTM-1 (509), YOYOTM-1 (509), Calcein (517), FITC (518), FluorXTM (519), AlexaTM ( 520), Rhodamine 110 (520), Oregon GreenTM 500 (522), Oregon GreenTM 488 (524), RiboGreenTM (525), Rhodamine GreenTM (527), Rhodamine 123 (529), Magnesium GreenTM (531) , Calcium GreenTM (533), TO-PROTM-1 (533), TOTO1 (533), JOE (548), BODIPY530/550 (550), Dil (565), BODIPY TMR (568), BODIPY558/568 ( 568), BODIPY564/570 (570), Cy3TM (570), AlexaTM 546 (570), TRITC (572), Magnesium OrangeTM (575), Phycoerythrin R&B (575), Rho
  • non-fluorescent black quencher molecules capable of quenching fluorescence of a broad wavelength or a specific wavelength can be used.
  • non-fluorescent black quencher molecules are BHQ and DABCYL.
  • the reporter includes the donor of FRET and the quencher includes the other partner (acceptor) of FRET.
  • fluorescein dye is used as a reporter and rhodamine dye is used as a quencher.
  • the label may be linked to TO and/or FHO via conventional methods. Specifically, the label is linked to TO and/or FHO via a spacer containing carbon atoms (eg, a 3-carbon spacer, a 6-carbon spacer, or a 12-carbon spacer).
  • a spacer containing carbon atoms eg, a 3-carbon spacer, a 6-carbon spacer, or a 12-carbon spacer.
  • the interactive label may comprise at least one reporter molecule and at least one quencher molecule.
  • it may be an interactive label comprising one reporter molecule and one quencher molecule or one reporter molecule and two quencher molecules.
  • the single label should be capable of providing different signals depending on whether the label is present on a double strand or a single strand.
  • the single label includes a fluorescent label, a luminescent label, a chemiluminescent label, an electrochemical label, and a metal label.
  • the single label includes a fluorescent label.
  • the single fluorescent label includes JOE, FAM, TAMRA, ROX and fluorescein-based labels.
  • the labeled nucleotide residue is preferably located at an internal nucleotide residue within the oligonucleotide rather than at the 5'-end or 3'-end.
  • a single fluorescent label useful in the present disclosure can be described with reference to the description of reporter and quencher molecules above.
  • a general fluorescent label can be used, and fluorescence signals of different intensities can be provided depending on whether the single label is present on a double strand or a single strand. No specific fluorescent label is required.
  • the target signal provided by the solid substrate is measured.
  • chemical labels eg biotin
  • enzymatic labels eg alkaline phosphate, peroxidase, ⁇ -galactosidase and ⁇ -glucosidase
  • the present disclosure is directed to measuring signals associated with formation of a first dimer or a second dimer to detect the presence of a target nucleic acid sequence.
  • the first or second dimer has a label whereby the first or second dimer provides a signal.
  • the detection of the presence of the extended strand in the first dimer or the presence of the second dimer in step (c) may be performed by various conventionally known methods.
  • the detection of the presence of the extended strand in the first dimer in the step (c) may be performed by various conventionally known methods. . Specifically, (i) measuring the signal from the first dimer at a predetermined temperature, or (ii) measuring the signal from the first dimer by melting analysis or hybridization analysis after melting.
  • melting analysis means a method of obtaining a signal indicating the presence of a dimer by melting the dimer, a method of measuring a signal at two different temperatures, a melting curve analysis, a melting pattern analysis, and melting peak analysis.
  • the melting analysis is a melting curve analysis.
  • hybridization analysis after melting refers to a method of obtaining a signal indicating the presence of a dimer by hybridization after melting the dimer.
  • the hybridization analysis after melting may be a hybridization curve analysis.
  • the melting curve or hybridization curve may be configured as a graphic plot or display of output signal change with respect to a parameter of hybridization stringency. The output signal can be directly plotted against hybridization parameters.
  • a melting curve or hybridization curve is plotted, for example, on the Y-axis an output signal representing the degree of dimer structure (ie, degree of hybridization), for example fluorescence, and on the X-axis a hybridization parameter.
  • fluorescence vs. A plot of the first derivative of temperature, i.e. fluorescence vs.
  • a plot of the rate of change with temperature (dF/dT vs. T) or (-dF/dT vs. T) gives the melting peak.
  • the detection method will be briefly described below.
  • the detection in step (c) is performed by measuring the signal from the first dimer between the extended strand and the first type of FHO at a predetermined temperature.
  • the presence of the extended strand is detected by measuring the signal from the first dimer at a predetermined temperature sufficient to maintain the double strands of the first dimer (i.e., the first dimer exists as a dimer in bound form). do.
  • the first dimer itself may provide a signal capable of distinguishing between formation and non-formation of the first dimer, which signal is detected at a predetermined temperature at which the first dimer maintains its double-stranded conformation, and thus The presence of the target nucleic acid sequence is determined by
  • the present disclosure is to measure a signal associated with first dimer formation in order to detect the presence of a target nucleic acid sequence.
  • the first dimer has a label whereby the first dimer provides a signal.
  • the basic working principle of the signal from the first dimer is as follows: (i) extension of the target-dependent fragment induces a signal change from the label to provide a signal; or (ii) hybridization of the target-dependent fragment and the first form of FHO induces a signal change from the label to provide a signal, and the first dimer formed by extension after the hybridization retains the signal.
  • the present disclosure detects multiple target nucleic acid sequences in a more effective manner.
  • the templating site of the immobilized FHO of the first form has a reporter molecule and a quencher molecule.
  • the reporter molecule and the quencher molecule are structurally close to each other such that the quencher molecule quenches the signal from the reporter molecule.
  • the quencher molecule quenches the signal from the reporter molecule.
  • the reporter molecule and the quencher molecule are structurally separated from each other, so that the quencher molecule unquenches the signal from the reporter molecule.
  • a signal indicative of the presence of the target nucleic acid sequence is provided in the extension step.
  • the tagging site (and target dependent fragment) of TO has a reporter molecule and a quencher molecule.
  • the reporter molecule and the quencher molecule are structurally close to each other such that the quencher molecule quenches the signal from the reporter molecule.
  • the TO hybridized to the target nucleic acid sequence is cleaved to release a target-dependent fragment comprising a tagging site with a reporter molecule and a quencher molecule, which hybridizes to the capturing site of the first form of FHO.
  • the reporter molecule and the quencher molecule are structurally separated from each other so that the quencher molecule unquenches the signal from the reporter molecule.
  • the signal is provided in the step of hybridization between the target-dependent fragment and the first form of FHO, and the first dimer retains the signal.
  • the dimer between the uncleaved TO and the first form of FHO also unquenches the signal from the reporter molecule like the quencher molecule of the first dimer.
  • the predetermined temperature ie, the temperature at which the signal is detected
  • a signal can be detected at a temperature at which all dimers between the uncleaved TO and the first form of FHO exist as dimers in a dissociated form, and some or all of the first dimers exist as dimers in a bonded form.
  • the detected signal is a signal indicating the presence of the target nucleic acid sequence provided from the first dimer.
  • a signal can be detected at a temperature at which some of the dimers between the uncut TO and the first form of FHO exist as a dimer in a bound form, and all of the first dimers exist as a dimer in a bound form. there is.
  • the detected signal is a signal indicating the presence of a target nucleic acid sequence provided from a dimer between uncut TO and FHO of the first form.
  • the amount of the dimer between the uncleaved TO and the FHO of the first form decreases as the first dimer is formed, and the signal provided from the dimer between the uncleaved TO and the FHO of the first form also decreases, and the A change (i.e., a decrease in signal) indicates the presence of the target nucleic acid sequence.
  • the temperature at which the signal is detected is further determined in consideration of the Tm value of the dimer.
  • the predetermined temperature is higher than the temperature obtained by subtracting 10° C. from the Tm value of the dimer (when two types of dimers are produced, the highest Tm value among the two types), specifically, 5° C. from the Tm value of the dimer. higher than the subtracted temperature, more specifically higher than the Tm value of the dimer, and even more specifically higher than the Tm value of the dimer plus 5°C.
  • the detection in step (c) is performed by measuring a signal from the first dimer between the extended strand and the first type of FHO by melting analysis or by hybridization analysis after melting.
  • the detection of the presence of the extended strands in step (c) is performed through melting analysis, in which the first dimer is melted at a temperature within a certain range to provide a signal indicating the presence of the extended strands.
  • detection of the presence of the extended strand in step (c) is performed through hybridization analysis after melting.
  • detection of the presence of the extended strands in step (c) is performed through hybridization analysis in which the first dimer is melted and the resulting product is hybridized at a certain temperature range to provide a target signal indicating the presence of the extended strands.
  • Detection of the first dimer at the aforementioned predetermined temperature and detection of the first dimer by melting analysis or hybridization analysis after melting may be performed according to various analysis methods as follows: A. detection of the first dimer; B. detection of cleavage of the first dimer; C. Detection of dimers between extended strands and signaling oligonucleotides; D. detection of cleavage of the dimer between the extended strand and the signaling oligonucleotide; E. detection of dimerization between the FHO of the first form and the hybridizing oligonucleotide; F. Detection of dimers between extended strands and immobilized immobilized oligonucleotides; and G. detection of a third dimer using a third form of FHO.
  • the detection in step (c) may be performed directly using a signal from the first dimer between the extended strand and the first form of FHO.
  • a signal from the first dimer between the extended strand and the first form of FHO For example, it can be performed based on PTOCE analysis (see WO 2012/096523).
  • the FHO of the first form, the target-dependent fragment and the first dimer can be obtained by PTOCE-based methods such as PTOCE, PCEC, PCE-SH, PCE-SC, PCE-NH, PCE-IH and PTOCE-E described above.
  • PTOCE-based methods such as PTOCE, PCEC, PCE-SH, PCE-SC, PCE-NH, PCE-IH and PTOCE-E described above.
  • PTO probing and tagging oligonucleotide
  • CTO capturing and templating oligonucleotide
  • PTO fragment ie, tagging portion of PTO
  • the first dimer comprises (i) at least one label linked to the target-dependent fragment and/or the FHO of the first form, (ii) a label incorporated into the first dimer during the extension reaction, ( iii) providing a signal detectable by at least one label linked to the FHO of the first form and a label incorporated into the first dimer during the extension reaction or (iv) an intercalating label;
  • the presence of the extended strand may be detected by measuring a signal provided from the first dimer.
  • the signal is provided by (i) at least one label linked to the target-dependent fragment and/or to the FHO of the first type.
  • the label includes an interactive dual label and a single label.
  • the signal indicating the presence of the first dimer is provided by an interactive labeling system, in particular by a FRET labeling system (i.e., an interactive dual labeling system).
  • an interactive labeling system in particular by a FRET labeling system (i.e., an interactive dual labeling system).
  • Embodiment 1 (intra-strand interactive-double labeling)
  • the target-dependent fragment or FHO has an interactive dual label comprising a reporter molecule and a quencher molecule; Depending on the positions of the reporter molecule and the quencher molecule, hybridization between the target-dependent fragment and the FHO of the first type, formation of a first dimer between the extended strand and the FHO of the first type, or melting of the first dimer, or Hybridization after melting results in a change in the signal from the interactive dual label to provide a detectable signal.
  • Embodiment 1 of the interactive dual label system is termed intrastrand interactive-double label.
  • Embodiment 1-1 Intra-strand interactive-double labeling on FHO of the first form
  • the FHO of the first type has an interactive dual label including a reporter molecule and a quencher molecule, and hybridization between the target-dependent fragment and the FHO of the first type, the extended strand and the first type Formation of a first dimer between one form of FHO, or melting of the first dimer, or hybridization after melting, results in a change in the signal from the interactive dual label to provide a detectable signal.
  • Embodiment 1-1 when the target-dependent fragment hybridizes to the FHO of the first type, when the target-dependent fragment hybridized to the FHO of the first type extends to form the first dimer, or when the first dimer Upon melting or hybridization after melting, a change is caused in the structural spacing between the reporter molecule and the quencher molecule to provide a signal (specifically, signal generation):
  • the reporter molecule and the quencher molecule on the FHO of the first type are brought into structural proximity with each other so that the quencher molecule quenches the signal from the reporter molecule.
  • the reporter molecule and the quencher molecule on the FHO of the first type are conformationally spaced apart so that the quencher molecule is separated from the reporter molecule. , thereby providing a signal (ie, a signal indicative of the presence of the target nucleic acid sequence).
  • the reporter molecule and the quencher molecule are structurally brought into close proximity to each other so that the quencher molecule quenches the signal from the reporter molecule, thereby providing a signal;
  • the reporter molecule and the quencher molecule are spaced apart again so that the quencher molecule unquenches the signal from the reporter molecule, thereby providing a signal.
  • reporter molecule and quencher molecule are structurally close means that the conformational structure of an oligonucleotide (eg, TO, target-dependent fragment or FHO, etc.), such as random coil (coli) and hairpin structure, is It means that the reporter molecule and the quencher molecule are three-dimensionally close to each other.
  • an oligonucleotide eg, TO, target-dependent fragment or FHO, etc.
  • FHO random coil
  • the expression "the reporter molecule and the quencher molecule are structurally spaced apart” means that the reporter molecule and the quencher molecule are three-dimensional means to be alienated.
  • the reporter molecule and the quencher molecule may be located at any position of the FHO of the first form.
  • both the reporter molecule and the quencher molecule are located at the templating site of the FHO of the first form.
  • At least one of the reporter molecule and the quencher molecule are located at the templating site of the FHO of the first form.
  • both the reporter molecule and the quencher molecule are located at the capturing site of the FHO of the first form.
  • the reporter molecule and the quencher molecule are located at the 5'-end and 3'-end of the FHO of the first form.
  • one of the reporter molecule and the quencher molecule is located at the 5'-end or 1 to 5 nucleotides away from the 5'-end of the FHO of the first form, and the other is located at the FHO of the first form. Depending on the conformation, it is positioned to quench and unquench the signal from the reporter molecule.
  • one of the reporter molecule and the quencher molecule is located at the 3'-end or 1 to 5 nucleotides away from the 3'-end of the FHO of the first form, and the other is located at the FHO of the first form. Depending on the conformation, it is positioned to quench and unquench the signal from the reporter molecule.
  • the reporter molecule and the quencher molecule are located at most 80 nucleotides, specifically at most 60 nucleotides, more specifically at most 30 nucleotides, and even more specifically at most 25 nucleotides apart from each other. In one embodiment, the reporter molecule and the quencher molecule are located at least 4 nucleotides apart, specifically at least 6 nucleotides apart, more specifically at least 10 nucleotides apart, and even more specifically at least 15 nucleotides apart.
  • the time point at which signals are generated may vary.
  • both the reporter molecule and the quencher molecule are located at the templating site of the FHO of the first form and the reporter and quencher molecules are spaced apart enough to unquench the signal from the reporter molecule upon formation of the double strand.
  • the formation of the first dimer in step (b) may result in a change in the signal from the interactive dual label to provide a detectable signal.
  • both the reporter molecule and the quencher molecule are located at the capturing site of the FHO of the first form and the reporter molecule and the quencher molecule are spaced apart enough that upon formation of the double strand the quencher molecule unquenches the signal from the reporter molecule.
  • hybridization between the target-dependent fragment and the first form of FHO results in a change in the signal from the interactive dual label to provide a detectable signal, and formation of the first dimer occurs at a temperature at which the signal is detected. hold the signal.
  • a dimer between the uncleaved TO and the first form of FHO is formed and a signal may be provided.
  • the signal of the first dimer and the signal of the dimer between the uncleaved TO and the FHO of the first form are (i) at a temperature at which the dimer between the uncleaved TO and the FHO of the first form dissociates, the signal (the first dimer) or (ii) as the first dimer is formed, the amount of the dimer between the uncleaved TO and the FHO of the first form decreases, thereby reducing the amount of the dimer between the uncleaved TO and the FHO of the first form. It can be distinguished by measuring the change in the signal provided from the dimer or (iii) measuring the difference between the Tm value of the first dimer and the Tm value of the dimer between the uncleaved TO and the FHO of the first form in melting
  • Embodiment 1-2 Intra-strand interactive-double labeling on TO
  • the target-dependent fragment has an interactive dual label including a reporter molecule and a quencher molecule, and hybridization between the target-dependent fragment and the FHO of the first form, melting of the first dimer, or Hybridization after melting results in a change in the signal from the interactive dual label to provide a detectable signal.
  • a signal is provided upon hybridization between the target-dependent fragment and the first form of FHO, and the signal is maintained at a temperature at which the signal is detected upon formation of the first dimer.
  • the reporter molecule and the quencher molecule on the TO are structurally brought into close proximity to each other so that the quencher molecule quenches the signal from the reporter molecule whereas;
  • the reporter molecule and the quencher molecule on the target-dependent fragment are structurally spaced apart so that the quencher molecule unquenches the signal from the reporter molecule, thereby providing a signal do.
  • the formation of the first dimer between the extended strand and the FHO of the first form maintains the signal. Then, when the first dimer is melted, the reporter molecule and the quencher molecule are structurally brought into close proximity to each other so that the quencher molecule quenches the signal from the reporter molecule, thereby providing a signal.
  • the reporter molecule and the quencher molecule can be located at any position of the target-dependent fragment.
  • one of the reporter molecule and the quencher molecule on the target-dependent fragment is located at its 5'-end or located 1 to 5 nucleotides apart from its 5'-end, and the other is in the form of a target-dependent fragment ( conformation) to quench and unquench the signal from the reporter molecule.
  • the reporter molecule and the quencher molecule are located at most 50 nucleotides, specifically at most 40 nucleotides, more specifically at most 30 nucleotides, and even more specifically at most 20 nucleotides apart from each other. According to one embodiment, the reporter molecule and the quencher molecule are located at least 4 nucleotides apart, specifically at least 6 nucleotides, more specifically at least 10 nucleotides, and even more specifically at least 15 nucleotides apart.
  • a signal may be provided by forming a dimer between uncut TO and FHO of the first form.
  • the signal of the first dimer and the signal of the dimer between the uncleaved TO and the FHO of the first form are (i) at a temperature at which the dimer between the uncleaved TO and the FHO of the first form dissociates, the signal (the first dimer) or (ii) as the first dimer is formed, the amount of the dimer between the uncleaved TO and the FHO of the first form decreases, thereby reducing the amount of the dimer between the uncleaved TO and the FHO of the first form.
  • It can be distinguished by measuring the change in the signal provided from the dimer or (iii) measuring the difference between the Tm value of the first dimer and the Tm value of the dimer between the uncleaved TO and the FHO of the first form in melting analysis.
  • Embodiment 2 (strand-to-strand interactive-double labeling)
  • the target-dependent fragment has one of the interactive dual labels including a reporter molecule and a quencher molecule
  • the FHO of the first form has the other one of the interactive dual labels
  • the reporter molecule on the first type of FHO is not quenched before the target-dependent fragment is hybridized to the first type of FHO.
  • the signal from the reporter molecule linked to the FHO of the first type is quenched by the quencher molecule linked to the target-dependent fragment, thereby generating a signal (specifically, signal quenching). to provide.
  • the formation of the first dimer between the extended strand and the FHO of the first form maintains the signal. Then, when the first dimer is melted, the reporter molecule and the quencher molecule are separated from each other so that the quencher molecule unquenches the signal from the reporter molecule, thereby providing a signal (specifically, signal generation).
  • the reporter molecule and the quencher molecule can be located at any position of the target-dependent fragment and FHO of the first form.
  • the quencher molecule and the reporter molecule are advantageously placed in close proximity to each other.
  • the reporter molecule or quencher molecule on the target-dependent fragment is located at its 5'-end or 5'-end region.
  • the reporter molecule or quencher molecule on the target-dependent fragment is located at its 3'-terminus or 3'-terminal region.
  • the reporter molecule or quencher molecule on the FHO of the first type is located at the capturing site of the FHO of the first type.
  • the reporter molecule or quencher molecule on the FHO of the first form is located at its 3'-end or located 1 to 5 nucleotides apart from its 3'-end.
  • a dimer between uncleaved TO and FHO of the first form may be formed to provide a signal (specifically, signal quenching).
  • the signal of the first dimer and the signal of the dimer between the uncleaved TO and the FHO of the first form are (i) at a temperature at which the dimer between the uncleaved TO and the FHO of the first form dissociates, the signal (the first dimer) or (ii) as the first dimer is formed, the amount of the dimer between the uncleaved TO and the FHO of the first form decreases, thereby reducing the amount of the dimer between the uncleaved TO and the FHO of the first form.
  • It can be distinguished by measuring the change in the signal provided from the dimer or (iii) measuring the difference between the Tm value of the first dimer and the Tm value of the dimer between the uncleaved TO and the FHO of the first form in melting analysis.
  • the present disclosure is best practiced using a single label system that provides a signal indicative of the presence of a target nucleic acid sequence.
  • the target-dependent fragment or FHO of the first type has a single label, hybridization between the target-dependent fragment and the FHO of the first type, and the first dimer between the extended strand and the FHO of the first type Formation, or melting or hybridization after melting of the first dimer results in a change in the signal from the single label to provide the detectable signal.
  • Embodiment 1 single label on FHO
  • the FHO of the first form has a single label, hybridization between the target-dependent fragment and the FHO of the first form, formation of a first dimer between the extended strand and the FHO of the first form, or the Melting or hybridization after melting of the first dimer results in a change in the signal from the single label to provide the detectable signal.
  • the fluorescence intensity from a single fluorescent label increases, thereby providing a signal (specifically, a signal change).
  • a single label on the FHO of the first form in a single-stranded state gives a low signal
  • the target-dependent fragment hybridized to the FHO of the first form is elongated to form a first dimer
  • a single label on the double-stranded first duplex provides an increased signal, thereby indicating the presence of a target nucleic acid sequence.
  • An indicating signal is provided.
  • the single label on the extended strand in the single-stranded state provides a reduced signal, thereby providing a signal indicating the presence of the target nucleic acid sequence;
  • the single label on the first duplex in the double-stranded state provides an increased signal, thereby providing a signal indicating the presence of the target nucleic acid sequence.
  • the single label is located at the templating or capturing site of the FHO of the first form.
  • the time point at which a signal is provided may vary.
  • formation of the first dimer may result in a change in signal from the single label to provide a detectable signal.
  • hybridization between the target-dependent fragment and the FHO of the first type results in a change in the signal from the single label to yield a detectable signal. and the formation of the first dimer maintains the signal at the temperature at which it is detected.
  • a dimer between the uncleaved TO and the first form of FHO may be formed to provide a signal.
  • the signal of the first dimer and the signal of the dimer between the uncleaved TO and the FHO of the first form are (i) at a temperature at which the dimer between the uncleaved TO and the FHO of the first form dissociates, the signal (the first dimer) or (ii) as the first dimer is formed, the amount of the dimer between the uncleaved TO and the FHO of the first form decreases, thereby reducing the amount of the dimer between the uncleaved TO and the FHO of the first form.
  • It can be distinguished by measuring the change in the signal provided from the dimer or (iii) measuring the difference between the Tm value of the first dimer and the Tm value of the dimer between the uncleaved TO and the FHO of the first form in melting analysis.
  • Embodiment 2 (single label on TO)
  • the target-dependent fragment has a single label, and hybridization between the target-dependent fragment and the FHO of the first form or hybridization after melting or melting of the first dimer causes a change in signal from the single label. resulting in a detectable signal.
  • Hybridization between the target-dependent fragment and the first form of FHO provides a signal, and formation of the first dimer maintains the signal at a temperature at which the signal is detected.
  • a single label on the TO i.e., a single label on the target-dependent fragment
  • a single label on the target-dependent fragment gives a low-intensity signal
  • a target-dependent fragment hybridizes with the capturing site of the first form of FHO
  • a single label on the target-dependent fragment provides a signal of increased intensity.
  • the formation of the first dimer between the extended strand and the FHO of the first form maintains the increased signal.
  • the single label provides a low signal, thereby providing a signal (specifically, a change in signal) indicating the presence of the target nucleic acid sequence.
  • hybridization between the target-dependent fragment and FHO of the fourth type, formation of the first dimer, melting, or hybridization after melting, as long as the signal intensity from the single label changes, the single label is the target-dependent fragment of the target-dependent fragment. It can be located in any position.
  • a dimer between uncleaved TO and FHO of the first form may be formed to provide a signal.
  • the signal of the first dimer and the signal of the dimer between the uncleaved TO and the FHO of the first form are (i) at a temperature at which the dimer between the uncleaved TO and the FHO of the first form dissociates, the signal (the first dimer) or (ii) as the first dimer is formed, the amount of the dimer between the uncleaved TO and the FHO of the first form decreases, thereby reducing the amount of the dimer between the uncleaved TO and the FHO of the first form. It can be distinguished by measuring the change in the signal provided from the dimer or (iii) measuring the difference between the Tm value of the first dimer and the Tm value of the dimer between the uncleaved TO and the FHO of the first form in melting analysis.
  • the present disclosure may use a label incorporated into the first dimer during the extension reaction in step (b) to provide a signal indicating the presence of the first dimer.
  • the first dimer can be successfully labeled using the label incorporated into the first dimer during the extension reaction in step (b).
  • the extension reaction of step (b) is carried out in the presence of a nucleotide having a single label, whereby a single label is inserted into the first dimer, and in step (b), the extended strand and the first dimer are inserted. Formation of the first dimer between forms of FHO, or melting or hybridization after melting of the first dimer, results in a change in the signal from the single label to provide the detectable signal.
  • a target-dependent fragment hybridizes to the capturing site of a first form of FHO immobilized on a solid substrate and extends in the presence of a nucleotide labeled with a single fluorescent label to form a first dimer.
  • a fluorescence signal from the first dimer can be detected on a spot of the solid substrate on which the first form of FHO is immobilized.
  • the first dimer is melted, the strand having the fluorescent label is released, and the fluorescent signal is no longer detected on the spot. Accordingly, a change in signal may be provided on the spot by melting of the first dimer. That is, a signal is provided indicating the presence of the extended strand in the first dimer, indicating the presence of the second dimer in step (c).
  • the nucleotide inserted during the extension reaction has a synthetic non-natural base
  • the FHO of the first form has a specific binding affinity for the synthetic non-natural base (i.e., the above A nucleotide having a complementary synthetic non-natural base capable of base pairing with a synthetic non-natural base.
  • the nucleotide having the synthetic non-natural base is located at any site of the templating site of the FHO of the first type.
  • a target-dependent fragment is hybridized to a first form of FHO comprising a nucleotide having a complementary synthetic non-natural base (eg iso-dC) to a particular synthetic non-natural base (eg iso-dG).
  • Extension is effected in the presence of a nucleotide with a specific synthetic non-natural base (eg, iso-dG) labeled with a single fluorescent label to form a first dimer.
  • a nucleotide with a specific synthetic non-natural base labeled with the single fluorescent label is inserted at a site opposite the nucleotide with its complementary synthetic non-natural base on the FHO of the first type.
  • the synthetic non-natural base labeled with the label incorporated into the first dimer during the extension reaction is S, Z, V, K, Pa. It may be selected from the group consisting of Pn, Px, Q, MMO2, 5FM, NaM, B, P, J, X, Ds, Dss and 5SICS.
  • the labeled synthetic non-natural base and its complementary synthetic non-natural base may form a non-natural base pair, for example, S-B base pair, Z-P base pair, V-J base pair, K-X base pair, Pa-Ds base pair, Pa-Q base pair, Pn- Ds base pair, Pn-Dss base pair, Px-Ds base pair, MMO2-5SICS base pair, 5FM-5SICS base pair or NaM-5SICS base pair.
  • a non-natural base pair for example, S-B base pair, Z-P base pair, V-J base pair, K-X base pair, Pa-Ds base pair, Pa-Q base pair, Pn- Ds base pair, Pn-Dss base pair, Px-Ds base pair, MMO2-5SICS base pair, 5FM-5SICS base pair or NaM-5SICS base pair.
  • the non-natural base pair generated during the extension reaction may be the same as or different from the non-natural base pair between the first synthetic non-natural base and the second synthetic non-natural base.
  • a fluorescent signal from the first dimer can be detected on the spot of the solid substrate with the immobilized FHO of the first form.
  • the strand having the fluorescent label is released, and the fluorescent signal is no longer detected on the spot. Accordingly, a change in signal may be provided on the spot by melting of the first dimer. That is, a signal indicative of the presence of the extended strand in the first dimer is provided indicating the presence of the first dimer in step (c).
  • the label When using the label inserted into the first dimer during the extension reaction, the label is not included in the dimer between the uncut TO and the first type FHO because the uncut TO hybridizes to the first type FHO and does not extend. Thus, the dimer between the uncleaved TO and FHO of the first form does not give a signal.
  • the present disclosure may utilize a labeling system that utilizes a combination of a label linked to the target-dependent fragment and/or FHO of the first form and a label incorporated into the first dimer during the extension reaction.
  • the label inserted into the first dimer during the extension reaction may be a label inserted into the extension sequence during an extension reaction in which the target-dependent fragment hybridizes to the FHO of the first type in step (b) and is extended.
  • the FHO of the first form has any one of the interactive dual labels including a reporter molecule and a quencher molecule
  • the extension reaction of step (b) is carried out by the other of the interactive dual labels carried out in the presence of a nucleotide having a label of, whereby the label is inserted into the extended sequence
  • step (b) the formation of the first dimer between the extended strand and the FHO of the first form, or melting of the first dimer or hybridization after melting results in a change in the signal from the interactive double label for detection. Provides possible signals.
  • the nucleotide inserted during the extension reaction has a synthetic unnatural base
  • the FHO of the first type has a nucleotide having a complementary synthetic unnatural base having a specific binding affinity for the synthetic unnatural base.
  • the FHO of the first form has a label of either a reporter molecule or an interactive dual label comprising a quencher molecule
  • the templating site of the FHO of the first form is a nucleotide having a synthetic unnatural base.
  • the extension reaction of step (b) comprises is carried out, whereby a label is inserted into the extended sequence;
  • step (b) formation of the first dimer between the extended strand and the FHO of the first form or melting of the first dimer or hybridization after melting results in a change in the signal from the interactive double label, which can be detected. provide a signal.
  • the reporter molecule and the quencher molecule are spaced apart from each other so that the quencher molecule unquenches the signal from the reporter molecule, thereby providing a signal.
  • the label site on the FHO of the first form and the insertion site of the label to be inserted are determined within the range in which the two labels act as an interactive dual label that induces a change in signal in the formation and melting steps of the first dimer. .
  • the templating site of FHOs of the first type has a reporter or quencher molecule and a nucleotide with a synthetic non-natural base.
  • the extension reaction in step (b) is carried out in the presence of a quencher or reporter molecule and a nucleotide having a complementary synthetic non-natural base having a specific binding affinity for the synthetic non-natural base in the FHO of the first type.
  • the two synthetic non-natural bases of the first dimer form a base pair and quench the signal from the reporter molecule by the quencher molecule to induce a change in signal, thereby providing a signal.
  • the target-dependent fragment has a reporter or quencher molecule, and the templating site of the FHO of the first type has nucleotides with synthetic non-natural bases.
  • the extension reaction in step (b) is carried out in the presence of a quencher or reporter molecule and a nucleotide having a complementary synthetic non-natural base having a specific binding affinity for the synthetic non-natural base in the FHO of the first type.
  • the two synthetic unnatural bases of the first dimer of step (b) form a base pair and induce a signal change from the reporter molecule by quenching, whereby a signal is provided.
  • a target-dependent fragment comprising a reporter or quencher molecule has a complementary synthetic non-natural base (eg isodC) that has a specific binding affinity for a specific synthetic non-natural base (eg iso-dG). It hybridizes to a first form of FHO comprising nucleotides.
  • Extension is effected in the presence of a nucleotide with a specific synthetic non-natural base (e.g., iso-dG) labeled with a quencher or reporter molecule, so that a first dimer is formed and the signal from the reporter molecule is quenched by the quencher molecule.
  • the nucleotide with the specific synthetic non-natural base eg iso-dG
  • the complementary synthetic non-natural base eg isodC
  • the reporter molecule and the quencher molecule are structurally close to each other so that the quencher molecule quenches the signal from the reporter molecule, thereby providing a signal;
  • the reporter molecule and the quencher molecule are structurally separated from each other so that the quencher molecule unquenches the signal from the reporter molecule, thereby providing a signal.
  • the label When using a label that is incorporated into the first dimer during the extension reaction, the label is not incorporated into the dimer between the uncleaved TO and the FHO of the first form, which means that the dimer between the uncleaved TO and the FHO of the first form is not extended. because it doesn't Thus, the dimer does not give a signal.
  • the present disclosure may use an intercalating label that provides a signal indicative of the presence of the first dimer. Since double-stranded nucleic acid molecules in the sample can provide signals, intercalating labels are more useful in solid phase reactions using immobilized FHO in the first form.
  • the signal is provided by an intercalating label, hybridization between the target-dependent fragment and the FHO of the first form in step (b), the extended strand and the FHO in step (b) Formation of a first dimer between FHOs of the first form, or melting or hybridization after melting of the first dimer, results in a change in the signal from the intercalating label to provide the detectable signal.
  • intercalating labels useful in the present invention are SYBRTM Green I, PO-PROTM-1, BO-PROTM-1, SYTOTM 43, SYTOTM 44, SYTOTM 45, SYTOXTM Blue, POPOTM- 1, POPOTM-3, BOBOTM-1, BOBOTM-3, LO-PROTM-1, JO-PROTM-1, YO-PROTM 1, TO-PROTM 1, SYTOTM 11, SYTOTM 13 , SYTOTM 15, SYTOTM 16, SYTOTM 20, SYTOTM 23, TOTOTM-3, YOYOTM 3, GelStarTM and thiazole orange.
  • Intercalating dyes provide a signal by specifically intercalating into a double-stranded nucleic acid molecule.
  • This embodiment can also be applied to other embodiments using melting analysis.
  • a target-dependent fragment is hybridized to the capturing site of a first form of FHO immobilized on a solid substrate.
  • Extension is effected in the presence of an intercalating dye (eg, SYBRTM Green) to create a first dimer comprising the intercalating dye.
  • an intercalating dye eg, SYBRTM Green
  • Fluorescent signals from the first dimer on the spot of the solid substrate with the immobilized first form of FHO can be detected using an intercalating fluorescent dye.
  • the intercalating fluorescent dye is released so that a fluorescent signal is no longer detected on the spot.
  • a signal is provided indicating the presence of the first dimer in step (c).
  • a dimer between uncleaved TO and FHO of the first form may be formed to provide a signal.
  • the signal of the first dimer and the signal of the dimer between the uncleaved TO and the FHO of the first form are (i) at a temperature at which the dimer between the uncleaved TO and the FHO of the first form dissociates, the signal (the first dimer) or (ii) as the first dimer is formed, the amount of the dimer between the uncleaved TO and the FHO of the first form decreases, thereby reducing the amount of the dimer between the uncleaved TO and the FHO of the first form. It can be distinguished by measuring the change in the signal provided from the dimer or (iii) measuring the difference between the Tm value of the first dimer and the Tm value of the dimer between the uncleaved TO and the FHO of the first form in melting analysis.
  • the detection in step (c) may be performed using a signal provided from cleavage of the first dimer between the extended strand and the first form of FHO.
  • a signal provided from cleavage of the first dimer between the extended strand and the first form of FHO.
  • it can be performed based on PCEC analysis (see WO 2012/134195).
  • the first dimer comprises a cleavage site cleaved by a nucleolytic enzyme, and the first dimer provides a detectable signal by cleavage at the cleavage site, In step (c), the presence of the extended strand is detected by measuring a signal provided from cleavage of the first dimer.
  • the first dimer comprises at least one label.
  • the label provides a detectable signal by cleavage of the first dimer.
  • a detectable signal includes (i) at least one label linked to the target-dependent fragment and/or FHO of the first form, (ii) a label incorporated into the first dimer during the extension reaction, ( iii) at least one label linked to the FHO of the first form and a label incorporated into the first dimer during the extension reaction, or (iv) an intercalating label.
  • the first dimer includes at least one label
  • the first dimer (i) includes a cleavage site that is cleaved by a cleavage enzyme and produces a signal detectable by cleavage at the cleavage site. or (ii) providing a detectable signal by sequential cleavage from the 5'-end of the first form of FHO in the first dimer by a 5'-3' exonuclease, wherein In step (c), the presence of the extended strand is detected by measuring a signal provided from cleavage of the first dimer.
  • the label can bind to any position of the first dimer.
  • the present disclosure can use a single label to provide a signal for the occurrence of a first dimer cleavage indicating the presence of a target nucleic acid sequence.
  • the FHO of the first form has a single label
  • cleavage of the first dimer forms a cleavage fragment including the single label
  • a signal from the single label before the first dimer is cleaved is the first dimer. Since the dimer is different from the signal from the single label after cleavage, the difference between these signals allows the occurrence of cleavage of the first dimer to be detected.
  • TO has a single label
  • cleavage of the first dimer forms a cleavage fragment containing the single label
  • a signal from the single label before cleavage of the first dimer is obtained after cleavage of the first dimer. differs from the signal from the single label of , such that the difference between these signals allows the occurrence of cleavage of the first dimer to be detected.
  • the single label that provides a different signal upon cleavage of the first dimer is a fluorescent terbium chelate or a single label that emits polarized fluorescence.
  • the single label is linked to the FHO of the first type, in particular the templating site of the FHO of the first type, more particularly the 5'-end of the templating site of the FHO of the first type.
  • a single label is linked to TO, in particular a tagging site of TO. Specifically, a single label is placed on TO so that target-dependent fragments have a single label.
  • the present disclosure when a single label is used in the present disclosure, the present disclosure may be performed in a solid phase using an immobilized first form of FHO.
  • a single label bound to TO or FHO of the first form can provide a signal indicating the occurrence of cleavage of the first dimer.
  • the FHO of the first form is immobilized on the solid substrate through its 5'-end or 3'-end.
  • the first form of FHO has a single label
  • the first dimer cleavage forms a cleavage fragment containing the single label
  • the cleavage fragment is released from the solid substrate, resulting in a change in signal on the solid substrate. to provide a signal indicating the occurrence of cleavage of the first dimer.
  • the first form of FHO is immobilized on a solid substrate through its 3'-end, TO has a single label, the first dimer cleavage forms a cleavage fragment containing the single label, and the cleavage fragment is Released from the solid substrate, it causes a change in the signal on the solid substrate to provide a signal indicating the occurrence of cleavage of the first dimer.
  • the single label is bound to the templating site of the FHO of the first form, and the cleavage site of the nucleic acid cleaving enzyme is 5' ⁇ 3' It can be the cleavage site of an exonuclease, restriction enzyme or ribonuclease.
  • the cleavage site of the 5' ⁇ 3' exonuclease is created
  • the first dimer is cleaved (specifically, sequentially cleaved from the 5'-end of the FHO of the first form) by cleavage of the 5' ⁇ 3' exonuclease at the cleavage site, resulting in fluorescence from the 5'-end of the FHO of the first form.
  • a reporter molecule is released.
  • fluorescence decreases or disappears at the spot containing the immobilized FHO of the first form.
  • the fluorescence does not decrease or disappear in the spot containing the immobilized FHO of the first form.
  • FHO in the first form is immobilized on the solid substrate through its 5'-end, TO has a single label, and the first dimer cleavage forms a cleavage fragment containing the single label, and the cleavage fragment is released from the solid substrate, causing a change in the signal on the solid substrate to provide a signal indicating the occurrence of cleavage of the first dimer.
  • the target-dependent fragment is hybridized to the FHO of the first form immobilized on the solid substrate (including the sequence recognized by the restriction enzyme at the templating site) via the 5'-end and extended to form the first dimer.
  • the cleavage site of the restriction enzyme is created.
  • a restriction enzyme cleaves the first dimer to release a fluorescent reporter molecule from the 3'-end of the first form of FHO.
  • the target-dependent fragment when hybridized to a first form of FHO (including an RNA molecule at the templating site) immobilized on a solid substrate through the 5'-end and extended to form a first dimer, RNase H A cutting position is created. RNase H cleaves the first dimer to release a fluorescent reporter molecule from the 3'-end of the first form of FHO.
  • FHO including an RNA molecule at the templating site
  • RNase H A cutting position is created.
  • RNase H cleaves the first dimer to release a fluorescent reporter molecule from the 3'-end of the first form of FHO.
  • fluorescence decreases or disappears at the spot containing the immobilized FHO of the first form. In the absence of the target nucleic acid sequence, the fluorescence does not decrease or disappear in the spot containing the immobilized FHO of the first form.
  • the single label is bound to the FHO or TO of the first form, and a nucleic acid cleaving enzyme such as a restriction enzyme or a ribonuclease It is preferable that the cutting position of is created.
  • a single label used in a solid phase reaction does not require specific characteristics.
  • any single label can be used. This is because a difference in signal according to the occurrence of cleavage of the first dimer can be induced by the presence or absence of a single label on the solid substrate after cleavage of the first dimer.
  • a single label can be bound to the first form of FHO or TO using conventional methods. Specifically, the label is bound to FHO or TO of the first form via a spacer comprising at least 3 carbon atoms (e.g., a 3-carbon spacer, a 6-carbon spacer or a 12-carbon spacer) .
  • a spacer comprising at least 3 carbon atoms (e.g., a 3-carbon spacer, a 6-carbon spacer or a 12-carbon spacer) .
  • the single label bound to the FHO of the first form is located at the 5'-end or 1 to 5 nucleotides apart therefrom.
  • the single label that binds to the FHO of the first form is at the 3'-end or at a position 1 to 5 nucleotides away from it.
  • the single label that binds TO is at the 5'-end or at a location 1 to 5 nucleotides away from it.
  • the present disclosure may use an interactive dual label to provide a signal for the occurrence of a first dimer cleavage indicating the presence of a target nucleic acid sequence.
  • the interactive dual label binds to the first form of FHO.
  • the cleavage site cleaved by the nucleic acid cleaving enzyme is located between the reporter molecule and the quencher molecule bound to the FHO of the first form, and before the first dimer is formed, the quencher molecule is separated from the reporter molecule. quenching the signal of the first dimer, cleavage of the first dimer separates the reporter molecule and the quencher molecule from each other, and the occurrence of cleavage of the first dimer is detected by measuring the signal from the label.
  • the interactive label system of the present disclosure is useful in liquid and solid phases.
  • the cleavage site generated in the first dimer may be a 5' ⁇ 3' exonuclease, restriction enzyme, or ribonuclease cleavage site.
  • a target-dependent fragment hybridizes to a first form of FHO and extends to form a first dimer, thereby creating a 5' to 3' exonuclease cleavage site.
  • the cleavage site of the 5' to 3' exonuclease is located between the reporter molecule and the quencher molecule bound to the FHO of the first form.
  • a quencher molecule is positioned in a position suitable for quenching the signal from the reporter molecule.
  • a 5' ⁇ 3' exonuclease cleaves the 5'-end of the first dimer (specifically, sequential cleavage) and releases a fluorescent reporter molecule, resulting in a signal change from the fluorescent reporter molecule.
  • the change in fluorescence signal is measured to detect the occurrence of cleavage of the first dimer, which determines the presence or absence of the target nucleic acid sequence.
  • the quencher molecule is fluorescent, it is preferable to measure using a signal from the quencher molecule.
  • a target-dependent fragment hybridizes to a first form of FHO and extends to form a first dimer, thereby creating a cleavage site for a restriction enzyme.
  • the cleavage site of the restriction enzyme is located between the reporter molecule and the quencher molecule bound to the FHO of the first form.
  • the restriction enzyme cleaves the cleavage site to cleave the first dimer and release the fluorescent reporter molecule, resulting in a change in signal from the fluorescent reporter molecule.
  • the change in fluorescence signal is measured to detect the occurrence of cleavage of the first dimer, which determines the presence or absence of the target nucleic acid sequence.
  • a target-dependent fragment hybridizes to a first form of FHO (which contains an RNA molecule at the templating site) and extends to form a first dimer, thereby creating a RNase cleavage site.
  • the cleavage site of the RNase is located between the reporter molecule and the quencher molecule bound to the first form of FHO.
  • RNase cleaves the first dimer by cleaving the cleavage site and releases the fluorescent reporter molecule, resulting in a change in the signal from the fluorescent reporter molecule.
  • the change in fluorescence signal is measured to detect the occurrence of cleavage of the first dimer, which determines the presence or absence of the target nucleic acid sequence.
  • At least one of the reporter molecule and the quencher molecule are linked to the templating site of the FHO of the first type, in particular at the 5'-end of the FHO of the first type.
  • both the reporter molecule and the quencher molecule are linked to the templating site of the FHO of the first form.
  • one of the reporter molecule and the quencher molecule is linked to the 5'-end and the other to the 3'-end of the FHO of the first form.
  • the reporter molecule or quencher molecule bound to the templating site of the FHO of the first form is located at its 5'-end or 1 to 5 nucleotides apart from its 5'-end.
  • the quencher molecule may be located 1 to 5 nucleotides from the 5'-end or 5'-end of the templating site of the FHO of the first form, and the reporter molecule may be located 5 to 50 nucleotides from the quencher molecule can be located in a given location.
  • the interactive double label is maintained when the first duplex is formed, the quenching state between the interactive double labels is maintained, and when the label is released by cleavage of the first duplex, the interactive double label is It is placed in a suitable position to become an unquenched state between the double-labeled liver.
  • the reporter molecule and the quencher molecule are positioned at a distance of at most 25 nucleotides from each other, specifically at most 20 nucleotides, more specifically at most 15 nucleotides, even more specifically at most 25 nucleotides. , up to 10 nucleotides.
  • the reporter molecule and the quencher molecule are located at least 3 nucleotides apart from each other, specifically, at least 4 nucleotides, more specifically, at least 5 nucleotides, and even more specifically, at least 6 nucleotides. am.
  • the reporter molecule and quencher molecule on the FHO of the first form can be structurally separated to allow the quencher molecule to unquench the signal from the reporter molecule. Cleavage of the first dimer can completely separate the reporter molecule from the quencher molecule, resulting in a greater change in signal resulting from unquenching.
  • cleavage fragment with a label eg, a reporter molecule
  • a label eg, a reporter molecule
  • more flexible or convenient conditions eg, high-stringency conditions or conditions after washing on a solid phase
  • one of the interactive dual labels bound to the immobilized first form of FHO remains on the solid substrate after cleavage of the first dimer.
  • the FHO of the first form immobilized on a solid substrate has an interactive dual label and uses a 5' ⁇ 3' exonuclease as a nucleic acid cleaving enzyme
  • the first form of the first dimer is obtained from the first dimer.
  • Interactive dual labeling after cleavage of the first dimer by imparting conditions suitable for fragments of FHO to be isolated or by conferring resistance to 5' ⁇ 3' exonuclease activity to the internal nucleotides of FHO of the first form One of them can be ensured to remain on the solid substrate.
  • resistance to 5' ⁇ 3' exonuclease activity is conferred by a nucleotide having a backbone having resistance to 5' ⁇ 3' exonuclease activity, and various phosphorothioates including linkages, phosphonate linkages, phosphoroamidate linkages and 2'-carbohydrate modifications, and more specifically, phosphorothioate linkages, alkyl phosphotriester linkages, aryl phosphotriester linkages, alkyl phosphotriester linkages Phonate linkages, aryl phosphonate linkages, hydrogen phosphonate linkages, alkyl phosphoroamidate linkages, aryl phosphoroamidate linkages, phosphoroserenate linkages, 2'-O-aminopropyl modifications, 2'-O -alkyl modifications, 2'-O-allyl modifications, 2'-O-butyl modifications, ⁇ -anomeric oligodeoxynucleotide and 1-(
  • Reporter molecules and quencher molecules that can be used in this disclosure are referred to those described in the PTOCE assay.
  • the first dimer is immobilized on a solid substrate through its 5'-end or 3'-end, an intercalating dye is used as a label, and the first dimer is cleaved to obtain an intercalating dye.
  • the cleavage fragment is released from the solid substrate, resulting in a change in the signal on the solid substrate to provide a signal indicating the occurrence of cleavage of the first dimer.
  • the cleaved fragments not immobilized on the solid substrate are dissociated from the solid substrate.
  • intercalating dyes useful in this disclosure see those disclosed in the PTOCE assay section.
  • the detection in step (c) may be performed using a signal provided from a dimer between the extended strand and the signaling oligonucleotide.
  • a signal provided from a dimer between the extended strand and the signaling oligonucleotide.
  • it can be performed based on PCE-SH analysis (see WO 2013/115442).
  • the method additionally uses a signaling oligonucleotide (SO) containing a hybridized nucleotide sequence and a label for the extended strand, and the dimer between the SO and the extended strand provides a detectable signal.
  • SO signaling oligonucleotide
  • step (c) the existence of the extended strand is detected by measuring a signal provided from the dimer between the SO and the extended strand.
  • the detectable signal is (i) a label linked to the SO, (ii) a combination of a label linked to the SO and a label linked to the target-dependent fragment, (iii) a label linked to the SO and step ( It may be provided by a combination of a label inserted into the extended strand during the extension reaction of b), or a combination of a label linked to the SO and an intercalating label (iv).
  • the present disclosure can provide a signal for the formation of extended strands indicating the presence of a target nucleic acid sequence using a single label.
  • a single label is bound to SO, and hybridization between the SO and an extended strand results in a change in signal from the single label to provide the detectable signal.
  • the single label on the SO is located at a distance of 1 to 15 nucleotides, 1 to 10 nucleotides, or 1 to 5 nucleotides from the 5'-end or 3'-end, specifically, at the center of the SO. Located.
  • the SO is coupled with an interactive double label including a reporter molecule and a quencher molecule, and hybridization between the SO and the extended strand results in a change in signal from the interactive double label, resulting in detectable provide a signal.
  • the reporter molecule and the quencher molecule on the SO are conformationally close to each other so that the quencher molecule quenches the signal from the reporter molecule, and when the SO is hybridized, the reporter molecule and the quencher molecule The molecules are structurally spaced so that the quencher molecule unquenches the signal from the reporter molecule, resulting in a signal change from the interactive dual label.
  • the reporter molecule and the quencher molecule are located at the 5'-end (or 3'-end) and 3'-end (or 5'-end) of the SO.
  • one of the reporter molecule and the quencher molecule bound to SO is located at a position 1 to 5 nucleotides away from the 5'-end or 5'-end, and the other is in the form of SO (conformation) position to quench and unquench the signal of the reporter molecule according to
  • one of the reporter molecule and the quencher molecule bound to SO is located at a position 1 to 5 nucleotides apart from the 3'-terminus or 3'-end, and the other is located at a position 1 to 5 nucleotides apart from the 3'-terminus, and the other is the signal of the reporter molecule according to the shape of the SO. It is located at the position of quenching and unquenching.
  • the reporter molecule and the quencher molecule are located within 80 nucleotides, specifically within 60 nucleotides, more specifically within 30 nucleotides, and even more specifically within 25 nucleotides apart from each other. According to one embodiment, the reporter molecule and the quencher molecule are at least 4 nucleotides apart, at least 6 nucleotides apart, at least 10 nucleotides apart, at least 15 nucleotides apart.
  • the extended strand has one of the interactive dulabels comprising a reporter molecule and a quencher molecule, and the SO has the other of the interactive dulabels.
  • the SO includes a label of one of the reporter molecule and the quencher molecule of the interactive dual label
  • the target-dependent fragment includes the label of the other of the reporter molecule and the quencher molecule
  • the extended strand contains a label derived from the target-dependent fragment
  • a label bound to SO may be a reporter molecule or a quencher molecule, and a label bound to a target-dependent fragment may be a quencher molecule or a reporter molecule.
  • the label By determining the location of the label on the TO in consideration of the cleavage site of the TO, the label can be present on the target-dependent fragment.
  • the label can bind to any position of the target-dependent fragment (eg, tagging site of TO) as long as it interacts with the label bound to SO to induce a signal change.
  • the label can bind to any position of SO (eg, the 5'-end of SO) as long as it interacts with the label bound to the target-dependent fragment and induces a signal change.
  • the SO includes a label of one of a reporter molecule and a quencher molecule of an interactive dual label
  • the templating site of the FHO of the first type includes a nucleotide with a synthetic non-natural base
  • the extension reaction of step (b) is carried out in the presence of a complementary synthetic non-natural base having a specific binding affinity to the synthetic non-natural base and a nucleotide having a label of the other of the reporter molecule and the quencher molecule, thereby A label is inserted into the extended strand; Hybridization between the SO and the extended strand results in a change in the signal from the interactive double label to provide a detectable signal.
  • the label inserted into the extended strand can bind to any position of the extended strand (eg, the 3'-end of the extended strand).
  • the label can bind to any position of SO (eg, the 5'-end of SO) as long as it interacts with the label inserted into the extended strand to induce a signal change.
  • the SO contains a label of one of the reporter molecule and the quencher molecule of the interactive dual label
  • the extension reaction of step (b) is performed on the nucleotide having the other label of the reporter molecule and the quencher molecule. carried out in the presence of, thereby inserting a label into the extended strand; Hybridization between the SO and the extended strand results in a change in the signal from the interactive double label to provide a detectable signal.
  • the method of the present invention additionally includes one more SO, the added SO includes a sequence complementary to the extended strand, and the two SOs are hybridized proximal to the extended strand;
  • the two SOs each contain a label of one of a reporter molecule and a quencher molecule of the interactive double label, and hybridization between the two SOs and the extended strand results in a change in signal from the interactive double label. to provide a detectable signal.
  • At least one SO among the two SOs includes a site that hybridizes with the extension sequence newly generated in the extension reaction of step (b).
  • the principle of the interactive double labeling using two SOs is as follows: the two SOs hybridize with the extended strand. In hybridization, since the two SOs hybridize with the extended strand in close proximity to each other, the reporter molecule and the quencher molecule in the two SOs are adjacent so that the quencher molecule quenches the signal from the reporter molecule and consequently interacts resulting in a change in signal from the red double label (e.g., an increase in signal from the reporter molecule). On the other hand, when there is no target nucleic acid sequence, the two SOs do not hybridize because the extended strand is not generated. The reporter molecule and the quencher molecule in the two unhybridized SOs are spaced apart from each other to provide a signal from the reporter molecule.
  • the two SOs can hybridize to any position of the extended strand, as long as they hybridize to the extended strand and allow the quencher molecule to quench the signal from the reporter molecule.
  • two SOs can be located immediately adjacent or 1 to 5 nucleotides apart.
  • the reporter molecule and the quencher molecule can bind to any position of the two SOs, as long as the quencher molecule is capable of quenching the signal from the reporter molecule.
  • a reporter molecule or a quencher molecule is bound to a position 1 to 5 nucleotides away from the 5'-end or 5'-end of one SO, and 1 to 5 nucleotides from the 3'-end or 3'-end of another SO.
  • a quencher molecule or reporter molecule may be coupled at a location 5 nucleotides apart.
  • the detection in step (c) may be performed using a signal provided from cleavage of the dimer between the extended strand of the first dimer and the signaling oligonucleotide.
  • a signal provided from cleavage of the dimer between the extended strand of the first dimer and the signaling oligonucleotide.
  • the method additionally uses a Signaling Oligonucleotide (SO) containing a hybridized nucleotide sequence and a label for the extended strand, and the dimer between the SO and the extended strand is a nucleolytic enzyme ( nucleolytic enzyme), the dimer between the SO and the extended strand provides a detectable signal by cleavage at the cleavage site, and the presence of the extended strand in step (c) indicates that the SO It is detected by measuring a signal provided from cleavage of the dimer between the extended strand and the extended strand.
  • SO Signaling Oligonucleotide
  • the dimer between the SO and the extended strand is an interactive double label or single label including a reporter molecule and a quencher molecule, and a 5' ⁇ 3' exonuclease, ribonuclease or restriction enzyme , and cleavage of the dimer between the SO and the extended strand may result in a signal change from the interactive double label or single label to provide the detectable signal.
  • the signal indicating the occurrence of cleavage of the dimer between the extended strand and the SO is provided by an interactive labeling system, in particular, a FRET labeling system (i.e., an interactive double label) system) is provided.
  • the SO has an interactive dual label comprising a reporter molecule and a quencher molecule, and the cleavage site for the nucleic acid cleavage enzyme is located between the reporter molecule and the quencher molecule linked to the SO, Cleavage of the SO in the dimer between the extended strand and SO separates the reporter molecule and the quencher molecule from each other, and the occurrence of a cleavage reaction of the dimer between the extended strand and SO against SO is detected by measuring a signal from the label do.
  • the quencher molecule prior to formation of the dimer between the extended strand and the SO, is positioned to quench a signal from the reporter molecule.
  • the interactive label system is used in liquid and solid phases.
  • the resulting cleavage site is a cleavage site for a 5' nuclease, restriction enzyme or ribonuclease.
  • the nucleic acid cleaving enzyme eg, 5' nuclease
  • the nucleic acid cleaving enzyme can release the reporter molecule by cleaving the 5'-terminal portion of the SO of the dimer between the extended strand and the SO, thereby causing a signal change from the reporter molecule. induce The occurrence of cleavage of the dimer between the extended strand and the SO can be detected by measuring a fluorescence signal for determining the presence of the target nucleic acid sequence.
  • At least one of the reporter molecule and the quencher molecule is linked to the 5'-end of the SO.
  • one of the reporter molecule and the quencher molecule is linked to the 5'-end and the other is linked to the 3'-end of the SO.
  • one of the reporter molecule and the quencher molecule is located 1 to 10 nucleotides apart from its 5'-end or its 5'-end, and the other is located prior to hybridization of the extended strand and the SO. positioned to quench the signal from the reporter molecule.
  • one of the reporter molecule and the quencher molecule is located 1 to 10 nucleotides apart from its 3'-end or its 3'-end, and the other is located prior to hybridization of the extended strand and the SO. positioned to quench the signal from the reporter molecule.
  • the reporter molecule may be located at a distance of 1 to 5 nucleotides from its 5'-end or its 5'-end, and the quencher molecule may be located at a distance of 5 to 80 nucleotides from the reporter molecule.
  • the interactive double label is located at a position sufficient to maintain the quenching phenomenon prior to formation of the dimer between the extended strand and SO, and unquenching according to cleavage of the dimer between the extended strand and SO induce
  • the reporter molecule and the quencher molecule are within 80 nucleotides, within 60 nucleotides, within 30 nucleotides, within 25 nucleotides, within 20 nucleotides, within 15 nucleotides, or within 10 nucleotides of each other. It may be spaced apart within a nucleotide.
  • the reporter molecule and the quencher molecule are at least 3 nucleotides, at least 4 nucleotides, at least 5 nucleotides, at least 6 nucleotides, at least 10 nucleotides or at least 15 nucleotides apart.
  • cleaved fragment bearing a label eg, a reporter molecule
  • the occurrence of cleavage of the dimer between the extended strand and SO is more flexible or under convenient conditions (eg, high stringency conditions or conditions after washing on a solid substrate).
  • Analysis can be performed by directly detecting a signal from a label linked to the cleaved fragment.
  • one of the interactive double labels linked to the immobilized SO remains on the solid substrate after cleavage of the dimer between the extended strand and SO.
  • the SO immobilized on a solid substrate has an interactive dual label and a 5' nuclease is used as a nucleic acid cleaving enzyme
  • an appropriate dissociation of the SO fragment from the dimer between the extended strand and the SO is performed.
  • Conditions are given or the internal nucleotide of the SO is resistant to 5' nuclease activity (e.g., 5' ⁇ 3' exonuclease activity or a backbone that is resistant to nucleotides having a label on its base) nucleotide), after cleavage of the dimer between the extended strand and SO, one of the interactive double labels can be guaranteed to remain on the solid substrate.
  • a reporter or quencher molecule may be positioned at the 5'-tagging site in consideration of the cleavage site.
  • the present disclosure is also best practiced using a single label system that provides a signal for the occurrence of dimerization between the extended strand and the SO, indicating the presence of a target nucleic acid sequence.
  • the SO has a single label
  • SO cleavage of the dimer between the extended strand and SO generates a fragment having a single label
  • SO cleavage of the dimer between the extended strand and SO occurs to generate the single labeled fragment. It is detected by detecting the emission of
  • the signal provided from the single label prior to cleavage of the SO is different from the signal provided from the single label after cleavage of the SO, and the difference in the signal can detect the occurrence of SO cleavage of the dimer between the extended strand and SO.
  • the single label is linked to the 5'-end or 3'-end of the SO.
  • the present disclosure is efficiently performed on solid phase using immobilized SO.
  • the SO is immobilized on a solid substrate through its 5'-end or 3'-end.
  • the SO is immobilized on the surface of the solid substrate through its 5'-end or 3'-end, the SO has a single label, and the SO cleavage of the dimer between the extended strand and SO is single A fragment with a label is generated, and the fragment is released on the solid substrate, thereby providing a signal change on the solid substrate to detect the occurrence of SO cleavage of the dimer between the extended strand and SO.
  • the single label is linked to the 5'-end of the SO, and the resulting cleavage site is 5'-nuclease, restriction enzyme or It is a cleavage site for ribonucleases.
  • the single label of the SO is located at the 5'-end or 1 to 5 nucleotides apart from the 5'-end.
  • the single label is located 1 to 5 nucleotides away from the 3'-end or 3'-end of the SO.
  • the detection in step (c) may be performed using a signal provided from a dimer between the FHO of the first form and the hybridized oligonucleotide.
  • a dimer between the FHO of the first form and the hybridized oligonucleotide For example, it can be carried out according to the PCE-NH assay (see WO 2014/104818).
  • the method further uses a hybridizing oligonucleotide (HO) containing a hybridization oligonucleotide sequence and a label for the FHO of the first type, and the dimer between the HO and the FHO of the first type Provides a detectable signal, and the presence of the extended strand in step (c) is detected by measuring a signal provided from the dimer between the HO and the FHO of the first type, the dimer between the HO and the FHO of the first type The presence of a signal from indicates the absence of the extended strand.
  • HO hybridizing oligonucleotide
  • the detectable signal is (i) a label linked to the HO, (ii) a label linked to the FHO of the first form, (iii) a label linked to the HO and the FHO of the first form It may be provided by a combination of labels, or (iv) an intercalating label.
  • the present disclosure can provide a signal indicating the absence of an extended strand by hybridizing a single labeled HO to a first type of FHO or by hybridizing a HO to a first type of single labeled FHO.
  • the detectable signal is provided by an interactive dual label linked to HO or FHO of the first form.
  • a target-dependent fragment is hybridized to a first form of FHO. Then, HO labeled with an interactive dual label comprising a reporter molecule and a quencher molecule is hybridized to the templating site of the FHO of the first form. Then, the target-dependent fragment is extended, and the extension induces cleavage of the HO to separate the reporter molecule from the quencher molecule, thereby providing a signal indicating the presence of the extended strand.
  • the change in signal between before and after HO cleavage can be used for signal detection.
  • the reporter molecule and the quencher molecule can be located at any site of the HO, as long as the cleaved HO and the uncleaved HO can provide distinct signals.
  • a reporter molecule and a quencher molecule are located at both ends of the HO, respectively.
  • a detectable signal is provided by an interactive dual label comprising a reporter molecule and a quencher molecule, one linked to the HO and the other to the FHO of the first type.
  • the reporter molecule and the quencher molecule are positioned on the HO and the FHO of the first form, such that when the HO hybridizes to the FHO of the first form, a signal from the reporter molecule is quenched by the quencher molecule. Cleavage of HO induced by extension of the target-dependent fragment releases HO from the first form of FHO and moves the reporter molecule away from the quencher molecule, allowing the quencher molecule to unquench the signal from the reporter molecule, thereby extending the length of the extended strand. Provides a signal indicating its presence.
  • the HO may be designed to have a hairpin structure.
  • one of the reporter molecule and the quencher molecule is linked to the 3'-end of the HO and the other is linked to the 5'-end of the FHO of the first form.
  • a labeling system such as an interactive-dual label using two HOs can be used in the method of the present disclosure using HOs.
  • An interactive-bilabel can be located at either site of the two HOs, as long as the cleaved and uncleaved HOs can give distinct signals.
  • the type and position of the label may be described with reference to the description of the SO.
  • a labeling system such as FRET using an intercalating dye can be used in the method of the present disclosure using HO.
  • the FRET label can be located at any site of the HO.
  • the detection in step (c) may be performed using a signal provided from a dimer between the extended strand and the immobilized oligonucleotide immobilized on the solid substrate.
  • a signal provided from a dimer between the extended strand and the immobilized oligonucleotide immobilized on the solid substrate.
  • it can be performed according to the PCE-IH assay (see WO 2015/008985).
  • the method additionally uses an immobilizing oligonucleotide (IO) immobilized on a solid substrate, including a nucleotide sequence hybridized to the extended strand, and the extended strand includes a label
  • IO immobilizing oligonucleotide
  • the dimer between the extended strand and the IO provides a detectable signal on the solid substrate
  • step (c) the presence of the extended strand is detected by measuring a signal provided from the dimer between the extended strand and the IO.
  • the detectable signal is (i) a label linked to the target-dependent fragment, (ii) a label inserted into the extended strand during the extension reaction of step (b), or (iii) the target-dependent fragment. It may be provided by a combination of a label linked to the fragment and a label inserted into the extended strand during the extension reaction of step (b).
  • the present invention can provide a signal for the presence of an extended strand indicating the presence of a target nucleic acid sequence by using a single label.
  • the target-dependent fragment labeled with a single label hybridizes to the FHO of the first type and extends on the FHO of the first type to form an extended strand, and the single label is included in the extended strand.
  • the extended strand is hybridized to the IO immobilized on the solid substrate to provide a detectable signal on the solid substrate, and then a signal indicating the presence of the extended strand is detected.
  • a single label on TO may be located at any site, as long as the target-dependent fragment released from TO contains a single label.
  • the single label on the TO may be located at any site of the tagging site, for example, at the 5'-end of the tagging site.
  • the label used in the present disclosure is a label inserted into the extended strand
  • the templating site of the FHO of the first form includes a nucleotide containing a synthetic non-natural base
  • the extension of step (b) above is carried out in the presence of a label and a nucleotide comprising a complementary synthetic non-natural base having a specific binding affinity for the synthetic non-natural base, thereby incorporating the label into the extended strand.
  • the extended strand is hybridized to the IO immobilized on the solid substrate to provide a detectable signal on the solid substrate, and a signal indicating the presence of the extended strand is detected.
  • the label used in the present disclosure is a combination of a single label bound to a target-dependent fragment and a label inserted into an extended strand during an extension reaction, and the single label and the inserted label are an acceptor and a donor. It is an interactive dual label containing a pair of (donor).
  • a TO comprising a tagging site labeled with a single fluorescent label (donor) is hybridized to a target nucleic acid sequence and then cleaved.
  • the target-dependent fragment containing the fluorescent single label (donor) is hybridized to a first form of FHO containing a synthetic non-natural base (eg, iso-dC) at the templating site, and the synthetic non-natural base labeled as an acceptor.
  • a synthetic non-natural base e.g., iso-dG
  • iso-dG complementary to is inserted on the opposite side of iso-dC during the extension reaction of the target-dependent fragment to introduce an acceptor into the extended strand, whereby the interactive double label on the extended strand is inserted.
  • the extended strand is hybridized to the IO immobilized on the solid substrate, and the donor is irradiated with excitation light to induce energy transfer from the donor to the acceptor, thereby changing the signal from the acceptor induction to provide a detectable signal on the solid substrate.
  • hybridization between the extended strand and IO is performed in the presence of an intercalating dye
  • the label included in the extended strand is an acceptor that receives a signal from the intercalating dye
  • a dimer between the extended strand and IO The signal from the intercalating dye incorporated into the receptor is transferred to the acceptor, and the acceptor provides a detectable signal.
  • a TO comprising a tagging site labeled with a fluorescent label (acceptor) is hybridized to a target nucleic acid sequence and then cleaved.
  • a target-dependent fragment containing a fluorescent label (acceptor) hybridizes to the FHO of the first form and is extended to form an extended strand.
  • the extended strand is hybridized to the IO immobilized on the solid substrate in the presence of an intercalating dye as a donor, and the intercalating dye is inserted into the hybrid.
  • an intercalating dye as a donor
  • hybridization between the extended strand and the IO may be performed in the presence of an intercalating dye, without using a label included in the extended strand, and the signal from the intercalating dye inserted into the dimer between the extended strand and the IO is obtained. Upon detection, the presence of the target nucleic acid sequence is analyzed.
  • the detection in step (c) may be performed using a signal provided from a dimer between the extended strand and an additional third type of FHO.
  • a signal provided from a dimer between the extended strand may be performed according to PTO cleavage and extension-dependent extension (PTOCE-E) analysis (see WO 2019/0666461).
  • the FHO and the third dimer of the third form of the present disclosure may respectively correspond to the second CTO and the second extended duplex in the PTOCE-E method described above.
  • the method performs the following steps instead of step (c):
  • (c-1) hybridizing the extended strand with a third type of FHO, wherein the third type of FHO is in 3' to 5' order (i) capturing a nucleotide sequence that hybridizes to the extended strand and (ii) a templating site comprising a nucleotide sequence that does not hybridize to the extended strand; the extended strand hybridizes with the capturing region of the third type FHO;
  • step (c-2) performing an extension reaction using template-dependent nucleic acid polymerase and the product of step (c-1), wherein the extended strand hybridized to the capturing site of the third form of FHO is further extending to generate a second extension strand comprising a second extension sequence complementary to the templating region of the third type FHO, thereby forming a third dimer between the second extension strand and the third type FHO;
  • the PTOCE-E assay is A. detection of the third dimer; B. detection of cleavage of the third dimer; C. Detection of dimerization between the second extended strand and the signaling oligonucleotide; D. detection of cleavage of the dimer between the second extended strand and the signaling oligonucleotide; E. detection of dimerization between the FHO of the third form and the hybridizing oligonucleotide; and detection of a dimer between the second extended strand and the immobilized immobilized oligonucleotide.
  • detection of the presence of the second dimer in step (c) may be performed by various conventionally known methods.
  • detection of the presence of the second dimer in step (c) may be performed using a double quenching assay combined with a melting assay (WO 2016/101959).
  • the TO when the method forms a second dimer, the TO is linked to a reporter molecule and a first quencher molecule, and the second form of FHO is linked to a second quencher molecule.
  • the TO is cleaved dependently on the presence of a target nucleic acid sequence during the reaction of step (a) to release a target-dependent fragment including the reporter molecule, and the reporter molecule and the FHO of the second type included in the target-dependent fragment
  • the second quencher molecule linked to may provide a detectable signal by formation and dissociation of a second dimer between the target-dependent fragment and the second form of FHO according to temperature.
  • the presence of the second dimer may be detected by measuring a signal provided from the second dimer.
  • the signal of the second dimer may be measured by melting analysis or by hybridization analysis after melting.
  • the detection of the presence of the second dimer in step (c) is performed through a melting assay after hybridization.
  • the detection of the second dimer in step (c) is performed through a melting analysis in which the second dimer is formed and the product is melted at a certain range of temperatures to provide a signal indicating the presence of the second dimer.
  • detection of the presence of the second dimer in step (c) is performed through hybridization analysis after melting.
  • the detection of the second dimer in step (c) is performed through a hybridization assay in which the second dimer is melted and the resulting product is hybridized over a range of temperatures to provide a signal indicating the presence of the second dimer.
  • the reporter molecule linked to the TO when the method forms a second dimer, may be linked to a position where it can be released together with the target-dependent fragment, and the first quencher molecule linked to the TO comprises the steps of: Before TO is cleaved in (a), the signal from the reporter molecule is quenched by being close to the reporter molecule linked to TO, but after TO is cleaved in step (a), it can be linked to a position where it is not released together with the target-dependent fragment. .
  • a reporter molecule may be linked to a tagging site of the TO, and a first quencher molecule may be linked to a targeting site of the TO.
  • the second quencher molecule linked to the second type of FHO may be linked to a position capable of quenching a signal from the reporter molecule when the second type of FHO forms a second dimer.
  • TO and FHO (first type FHO or second type FHO), and optionally SO, HO and IO, used in the methods of this disclosure may be composed of naturally occurring dNMPs.
  • TO and FHO, and optionally SO, HO and IO are modified nucleotides or non-natural nucleotides such as PNA (Peptide Nucleic Acid, see PCT Application No. WO 92/20702) and LNA (Locked Nucleic Acid, see PCT Application Nos. WO 98/22489, WO 98/39352 and WO 99/14226).
  • TO and FHO and third forms of FHO, and optionally SO, HO and IO, are deoxyinosine, inosine, 1-(2'-deoxy-beta-D-ribofuranosyl)-3-nitropyrrole and 5 -Can include universal bases such as nitroindole.
  • the term "universal base” means capable of base pairing with virtually no discrimination to each of the natural DNA/RNA bases.
  • the TO when TO includes a 5'-tagging portion and a 3'-targeting portion, the TO is spaced apart in the 3'-direction from the 3'-end of the 5'-tagging portion of the TO. can be cut at one location.
  • the cleavage site may be located at a part of the 5'-end of the 3'-targeting region of TO.
  • the position of the FHO that hybridizes to the portion of the 5'-end of the 3'-targeting portion is a universal base, a degenerate sequence or combinations thereof.
  • the '-terminal portion advantageously contains a universal base. If TO is cleaved at a position spaced 2 nucleotides in the 3'-direction from the 3'-end of the 5'-tagging site of TO, then the 5'-end of the capturing site of FHO contains a degenerate sequence. and the nucleotide adjacent to its 3'-direction advantageously contains a universal base.
  • the method of the present disclosure comprises repeatedly further performing steps (a)-(c) in whole or in part, including denaturation. These repetitions amplify the target nucleic acid sequence and/or signal.
  • the dimer (first dimer or second dimer) in step (b) is melted or hybridized after melting to provide a detectable signal. and detecting the signal to detect the presence of the extended strand in the first dimer or the presence of the second dimer once more.
  • Denaturation may be performed through known techniques including, but not limited to, heat, alkali, formamide, urea and glycoxal treatment, enzymatic methods (eg, helicase action) and binding proteins.
  • denaturation may be achieved by heat treatment in the temperature range of 80-105 °C.
  • a general method of the aforementioned denaturation is disclosed in Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001).
  • the method of the present disclosure is performed in the presence of a downstream primer, specifically, by a PCR method.
  • steps (a)-(c) are carried out in one reaction vessel or some of the steps (a)-(c) are carried out in separate reaction vessels.
  • target nucleic acid sequences to be detected and/or amplified have any particular sequence or length, including all DNA (gDNA and cDNA) and RNA molecules.
  • a reverse transcription step is essential before the annealing step, and details thereof are described in Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001); and Noonan, K. F. et al., Nucleic Acids Res. 16:10366 (1988).
  • random hexamers or oligonucleotide dT primers that hybridize to mRNA can be used.
  • Target nucleic acid sequences may be any naturally occurring prokaryotic nucleic acid, eukaryotic cell (e.g., protozoa and parasites, fungi, yeast, higher plants, lower animals, and mammals and humans). Higher animals including) nucleic acids, viral (eg, herpes virus, HIV, influenza virus, Epstein-Barr virus, hepatitis virus, poliovirus, etc.) nucleic acid or viroid nucleic acid.
  • prokaryotic nucleic acid eukaryotic cell
  • eukaryotic cell e.g., protozoa and parasites, fungi, yeast, higher plants, lower animals, and mammals and humans.
  • Higher animals including) nucleic acids, viral (eg, herpes virus, HIV, influenza virus, Epstein-Barr virus, hepatitis virus, poliovirus, etc.) nucleic acid or viroid nucleic acid.
  • viral eg, herpes virus, HIV, influenza virus, Epstein-Bar
  • the present disclosure is useful for detection of nucleotide variations.
  • the target nucleic acid sequence includes a nucleotide variation.
  • nucleotide variation refers to any single or multiple nucleotide substitution, deletion or insertion in a DNA sequence at a specific position in consecutive DNA segments or DNA segments with similar sequences. This contiguous DNA fragment contains a gene or some other region of a chromosome.
  • nucleotide variations may be mutant or polymorphic allele variations.
  • nucleotide variations detected in the present disclosure include single nucleotide polymorphisms (SNPs), mutations, deletions, insertions, substitutions, and translocations.
  • nucleotide mutations include various mutations in the human genome (eg, mutations in the methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) gene), mutations related to drug resistance of pathogens, and cancer-related mutations.
  • MTHFR methylenetetrahydrofolate reductase
  • nucleotide variation includes any variation at a specific position in a DNA molecule. That is, the term “nucleotide variation” includes the wild type and any variant thereof at a specific position in a DNA molecule.
  • the target nucleic acid sequence including the nucleotide variation is a matching template herein. (matching template).
  • the target nucleic acid sequence including the nucleotide variation is referred to herein as a mismatching template.
  • the 3'-end of an upstream primer can be designed to be positioned opposite the nucleotide variance site in the target nucleic acid sequence.
  • the 3'-end of the upstream primer has a sequence complementary to the nucleotide variation of the target nucleic acid sequence.
  • the 3'-end of the upstream primer having a sequence complementary to the nucleotide variation of the target nucleic acid sequence is annealed to the matching template and extended to induce TO cleavage.
  • the resulting target-dependent fragment hybridizes to the FHO to provide a signal.
  • the upstream primer when the 3'-end of the upstream primer is mismatched to a nucleotide variation in the mismatching template, even if the upstream primer hybridizes to the mismatching template, it is not extended under conditions where annealing of the 3'-end of the primer is essential for the extension reaction. and no signal is provided.
  • TO cleavage dependent on hybridization of a TO with a sequence complementary to a nucleotide variation in a target nucleic acid sequence can be used.
  • a TO having a sequence complementary to a nucleotide variation in a target nucleic acid sequence is hybridized to a matching template and then cleaved.
  • the resulting target-dependent fragment hybridizes to the FHO to provide the target signal.
  • TO does not hybridize to, and is not cleaved, to mismatching templates with non-complementary sequences at the site of the nucleotide variation.
  • the sequence complementary to the nucleotide variation of TO is located in the middle of the targeting site of TO.
  • a portion of the 5'-end of the 3'-targeting region of TO is located at the nucleotide variation of the target nucleic acid sequence, and a portion of the 5'-end of the 3'-targeting region of TO is located in the target nucleic acid sequence. It is preferred to have a sequence complementary to a nucleotide variation in the sequence.
  • the 5'-end of the 3'-targeting region of TO has a sequence complementary to the single nucleotide variance of the target nucleic acid sequence.
  • cleavage of TO hybridized to a matching template is immediately adjacent in the 3'-direction to the 5'-end of the 3'-targeting site of TO, for example, under the induction of upstream primer extension-dependent cleavage. It can be induced in one location.
  • the 3'-end of the target-dependent fragment has a nucleotide complementary to the single nucleotide variation.
  • the target-dependent fragment hybridizes to a first form of FHO having a capturing site comprising a sequence corresponding to the nucleotide variation and extends to form a first dimer, thereby providing a target signal.
  • the same TO hybridizes to a mismatching template that has the same sequence to the matching template except for a single nucleotide variation, it is 2 nucleotides in the 3'-direction from the 5'-end of the 3'-targeting region of the TO. Cleavage of the TO may occur at spaced apart locations.
  • the 3'-end of the target-dependent fragment has an additional cleaved nucleotide in addition to the nucleotide complementary to the single nucleotide variation.
  • the position of the FHO of the first type that hybridizes to the additionally cleaved nucleotide is designed to have a non-complementary sequence to the nucleotide to be additionally cleaved, the 3'-end of the target-dependent fragment hybridizes to the FHO of the first type. and, under controlled conditions, extended strands are not eventually generated. Even if the target-dependent fragment is extended to form a first dimer, the dimer has a different Tm value from a dimer resulting from hybridization between the TO and the mismatching template.
  • the cleavage position of TO having a sequence complementary to a nucleotide mutation at the 5'-terminal part of the 3'-targeting site of TO varies depending on hybridization with a matching template or mismatching template, whereby, the target-dependent fragments released from the two hybridization events have different sequences, specifically at their 3'-end part, more preferably at their 3'-end.
  • a matching template and a mismatching template can be distinguished by selecting the nucleotide sequence of the FHO of the first type in consideration of the difference in the 3'-terminal part of the target-dependent fragment.
  • the target nucleic acid sequence used in the present disclosure is a pre-amplified nucleic acid sequence.
  • the use of pre-amplified nucleic acid sequences significantly increases the sensitivity and specificity of target detection of the present disclosure.
  • the method is performed in the presence of a downstream primer.
  • An advantage of the present disclosure is that at least two target nucleic acid sequences can be simultaneously detected (multiplexed).
  • the method is performed to detect at least two target nucleic acid sequences (more specifically, at least three, and even more specifically at least five).
  • the method is performed to detect at least two target nucleic acid sequences (more specifically at least three, even more specifically at least five);
  • the upstream oligonucleotide comprises at least 2 kinds of oligonucleotides (more specifically at least 3 kinds, more specifically at least 5 kinds),
  • the TO comprises at least 2 kinds of TO (more specifically at least 3 kinds, more specifically at least 5 kinds) more specifically at least 5), and the TO contains at least 1 FHO (specifically at least 2, more specifically at least 3, even more specifically at least 5).
  • the SO, HO and/or IO may include at least 2 species (more specifically at least 3 species, and even more specifically at least 5 species).
  • the method provides at least two target signals corresponding to the at least two target nucleic acid sequences.
  • At least two tagging sites (eg, 5'-tagging sites or 3'-tagging sites) of at least two TOs may have identical sequences.
  • the tagging portion of the TO may have the same sequence.
  • one type of FHO (specifically, type 1 FHO) can be used for detection of multiple target nucleic acid sequences. For example, when TOs having the same sequence in a tagging region are used for screening a target nucleic acid sequence, one type of FHO can be used.
  • dimers (first dimer or second dimer) corresponding to at least two target nucleic acid sequences have different Tm values.
  • At least two signals corresponding to at least two target nucleic acid sequences are provided from different types of labels.
  • At least two types of signals corresponding to at least two types of target nucleic acid sequences are provided from the same type of label.
  • At least two types of target signals corresponding to at least two types of target nucleic acid sequences are provided from the same type of label; Dimers corresponding to at least two target nucleic acid sequences have different Tm values.
  • the term “different types of labels” refers to labels whose detectable signals have different characteristics. For example, FAM and TAMRA as fluorescent reporter labels are considered as different types of labels because their excitation and emission wavelengths are different from each other.
  • one type of label e.g., FAM
  • FAM FAM
  • a significant advantage of the present disclosure is that detection of target nucleic acid sequences is effective even on a solid phase such as a microarray.
  • the first form of FHO or the second form of FHO is immobilized on a solid substrate.
  • the FHO is immobilized on the solid substrate via its 5'-end or 3'-end.
  • the FHO is directly or indirectly (specifically, indirectly) immobilized on the surface of the solid-phase substrate through the 5'-end or the 3'-end (specifically, the 3'-end).
  • the FHO may be covalently or non-covalently immobilized on the surface of a solid substrate.
  • a suitable linker is used.
  • the linker used in the present disclosure may include any linker used to immobilize a probe on a solid substrate surface.
  • an alkyl or aryl compound having an amine group, or an alkyl or aryl compound having a thiol group can be used for FHO immobilization as a linker.
  • a poly (T) tail or a poly (A) tail may be used as a linker.
  • the solid-state substrate used in the present disclosure is a microarray.
  • any microarray known in the art may be used for providing a reaction environment. All processes of the present disclosure, ie, hybridization with a target nucleic acid sequence, cleavage, extension, hybridization, extension, fluorescence detection (or fluorescence detection during melting or hybridization after melting) are performed on a microarray.
  • the FHO immobilized on the microarray serves as a hybridizable array element.
  • Solid substrates for fabricating microarrays include metals (e.g., gold, alloys of gold and copper, aluminum), metal oxides, glass, ceramics, quartz, silicon, semiconductors, Si/SiO2 wafers, germanium, gallium arsenide, carbon, carbon nanotubes, polymers (eg, polystyrene, polyethylene, polypropylene, and polyacrylamide), sepharose, agarose, and colloids, but are not limited thereto.
  • a plurality of immobilized FHOs of the present disclosure may be immobilized on one addressable site or two or more addressable sites on a solid substrate, and the solid substrate includes 2-1,000,000 addressable sites. can do. Immobilized FHOs can be fabricated to produce arrays or arrays for specific applications through conventional fabrication techniques such as photolithography, ink-jetting, mechanical microspotting and the like.
  • the FHO immobilized on the surface of the solid phase substrate contains an interactive dual label.
  • a target-dependent fragment is generated by cleavage of a TO hybridized with a target nucleic acid, which generates an extended strand through hybridization and extension reaction on a first type of FHO and generates a first dimer or a second type of FHO. hybridizes to form a second dimer.
  • an additional fragment extensible on the FHO of the first form by an additional 5' nuclease cleavage reaction using an additional TO can provide.
  • a method of generating an additional fragment using the additional TO may be various.
  • the additional TO comprises (i) a 3'-targeting region comprising a hybridized nucleotide sequence complementary to the templating region of the FHO of the first form and (ii) a non-templating region of the FHO of the first form. and a 5'-tagging region comprising a complementary nucleotide sequence and comprising a sequence complementary to the capturing site of the FHO of the first form.
  • the additional TO is located downstream of the target-dependent fragment that hybridizes to the capturing site of the FHO of the first form. As the target-dependent fragment extends, it cleaves additional TOs, and the cleavage produces additional target-dependent fragments.
  • the method uses additional SO, HO or a third form of FHO immobilized on a solid substrate.
  • the present disclosure uses Signaling Oligonucleotide (SO), and the SO is immobilized on a solid substrate through its 5'-end or 3'-end.
  • SO Signaling Oligonucleotide
  • the present invention uses HO (Hybridizing Oligonucleotide), and the HO is immobilized on the solid substrate through its 5'-end or 3'-end.
  • HO Hybridizing Oligonucleotide
  • the present disclosure uses IO immobilized on a solid substrate and the FHO of the first form may be immobilized through the IO instead of being directly immobilized on the solid substrate.
  • the FHO of the first type additionally includes an IO-hybridization site comprising a nucleotide sequence hybridized to the IO.
  • the IO-hybridization site may be located at the 3'- or 5'-end of the FHO of the first form.
  • the FHO of the first form is a target-dependent fragment between the templating portion and the IO-hybridization portion of the FHO of the first form It may additionally include a blocker site that prevents the elongation reaction of
  • the present invention when carried out in a solid phase using a single label, the single label does not require specific characteristics.
  • any single label can be used.
  • the present disclosure provides a composition for detecting a target nucleic acid sequence comprising:
  • the TO comprises (i) a tagging site comprising a nucleotide sequence that does not hybridize to the target nucleic acid sequence and (ii) a targeting site comprising a nucleotide sequence that hybridizes to the target nucleic acid sequence,
  • the tagging site includes a first synthetic non-natural base within 5 nucleotides from the 3'-end of the tagging site,
  • the TO is cleaved dependently on the presence of the target nucleic acid sequence to release a target-dependent fragment comprising a tagging portion of the TO or a partial sequence thereof;
  • the target-dependent fragment comprises the first synthetic non-natural base
  • the FHO comprises (i) a capturing site comprising a nucleotide sequence that hybridizes to the target-dependent fragment in 3' to 5' order and a nucleotide sequence that does not hybridize to the target-dependent fragment and the targeting site of the TO. a first type of FHO comprising a templating site or (ii) a second type of FHO comprising a capturing site comprising a nucleotide sequence that hybridizes to said target-dependent fragment;
  • the capturing site of the FHO comprises a second synthetic non-natural base capable of base pairing with the first synthetic non-natural base in the target-dependent fragment;
  • composition for detecting a target nucleic acid sequence of the present disclosure is configured to implement the “method for detecting a target nucleic acid sequence", which is the first aspect of the present disclosure described above, common content between them is provided herein. In order to avoid excessive complexity of , its description is omitted.
  • the first synthetic non-natural base is located at a site 2 to 5 nucleotides apart from the 3'-end of the tagging site of the TO.
  • the tagging site of the TO further comprises 1 to 5 additional synthetic non-natural bases.
  • the first synthetic unnatural base and 1 to 5 additional synthetic unnatural bases are 1 to 10 nucleotides apart from each other.
  • the first synthetic non-natural base is S, Z, V, K, Pa. Pn, Px, Q, MMO2, 5FM, NaM, B, P, J, X, Ds, Dss and 5SICS.
  • the first synthetic unnatural base is S-B base pair, Z-P base pair, V-J base pair, K-X base pair, Pa-Ds base pair, Pa-Q base pair, Pn-Ds base pair, Pn-Dss base pair, Px-Ds base pair , MMO2-5SICS base pair, 5FM-5SICS base pair and NaM-5SICS base pair selected from the group consisting of any one base.
  • the tagging portion of the TO has a length of 5 to 50 nucleotides.
  • the tagging portion of the TO has a length of 9 to 14 nucleotides.
  • the enzyme having nuclease activity is an enzyme having 5' nuclease activity.
  • the target-dependent fragment hybridizes to the capturing site of the FHO and extends to form an extended strand comprising an extended sequence complementary to the templating site of the FHO. resulting in formation of the first dimer between the extended strand and the FHO.
  • the target-dependent fragment hybridizes with the capturing region of the FHO to form a second dimer.
  • the presence of the extended strand in the first dimer or the presence of the second dimer indicates the presence of the target nucleic acid sequence.
  • the composition further comprises an upstream primer comprising a nucleotide sequence that hybridizes to the target nucleic acid sequence, and the upstream primer is located upstream in the 5' direction of the TO.
  • the composition further comprises a template-dependent nucleic acid polymerase.
  • the template-dependent nucleic acid polymerase and the enzyme having the nuclease activity are the same enzyme.
  • the TO is a probe.
  • the composition further comprises a downstream primer.
  • compositions of the present disclosure may optionally include reagents necessary for conducting a target amplification PCR reaction (eg, PCR reaction) such as a buffer, a DNA polymerase cofactor, and deoxyribonucleotide-5-triphosphate.
  • a target amplification PCR reaction eg, PCR reaction
  • the compositions of the present disclosure may also include various polynucleotide molecules, reverse transcriptases, various buffers and reagents, and antibodies that inhibit DNA polymerase activity.
  • the composition may also include reagents necessary for carrying out the positive control and negative control reactions. Optimal amounts of reagents to be used in a particular reaction can be readily determined by one skilled in the art having the knowledge of the disclosure herein.
  • compositions of the present disclosure are packaged in separate packages or compartments containing the aforementioned ingredients.
  • the target nucleic acid detection method using TO and FHO containing synthetic non-natural base pairs according to the present disclosure exhibits superior sensitivity and specificity compared to the conventional target nucleic acid detection method using TO and FHO containing natural base pairs.
  • step (c) The detection of the dimer in step (c) was performed using the PTOCE assay (WO 2012/096523), which has 5' nuclease activity for extension of forward and reverse primers, cleavage of TO, and extension of target-dependent fragments. Taq DNA polymerase was used.
  • the target nucleic acid As the target nucleic acid, the gene of Enterococcus faecalis (EF) was used.
  • the target nucleic acid sequence is as follows:
  • Plasmid DNA was prepared by inserting the target nucleic acid sequence (SEQ ID NO: 1) of the Enterococcus faecalis (EF) gene into a vector plDTSMART-AMP (GenBank: MN689784.1). Subsequently, plasmid DNA at a concentration of 2.0 ⁇ 10 4 copies / ⁇ l was serially diluted 10-fold using TE buffer to obtain a total of 4 concentrations (concentration 1: 2.0 ⁇ 10 4 copies / ⁇ l, concentration 2: 2.0 ⁇ 10 3 copies / ⁇ l) , Concentration 3: 2.0 ⁇ 10 2 copies/ ⁇ L, and concentration 4: 2.0 ⁇ 10 1 copies/ ⁇ L) of plasmid DNA templates were prepared.
  • SEQ ID NO: 1 concentration of the Enterococcus faecalis
  • TO has a 3'-targeting portion having a nucleotide sequence that hybridizes to the target nucleic acid sequence, and a 5'-tagging portion comprising a nucleotide sequence that does not hybridize to the target nucleic acid sequence and a first synthetic non-natural base; It was designed with three synthetic non-natural bases.
  • the number and position of synthetic non-natural bases included in the 5'-tagging part of the TO were designed in various ways, and the first synthetic non-natural base was designed to be located within 5 nucleotides from the 3'-end of the 5'-tagging part. .
  • An FHO that hybridizes with a target-dependent fragment has a capturing site that has a nucleotide sequence that hybridizes to a target-dependent fragment released from the TO, and a templating site that is non-targeting to the 5'-tagging and 3'-targeting sites of the TO. It was designed to have a nucleotide sequence that hybridizes.
  • the target-dependent fragment includes a synthetic non-natural base derived from the 5'-tagging site of the TO, and the capturing site of the FHO includes a synthetic non-natural base (i.e., a first synthetic non-natural base) in the target-dependent fragment.
  • 1 to 3 synthetic non-natural bases including 1 to 3 synthetic non-natural bases that hybridize with (i.e., 1 to 3 synthetic non-natural bases, including a second synthetic non-natural base), 6-amino-5- It was designed to include nitro-3-(1'- ⁇ -D-2'-deoxyribofuranosyl)-2(1H)-pyridone (hereinafter referred to as Z).
  • Z 6-amino-5- It was designed to include nitro-3-(1'- ⁇ -D-2'-deoxyribofuranosyl)-2(1H)-pyridone (hereinafter referred to as Z).
  • Z 6-amino-5- It was designed to include nitro-3-(1'- ⁇ -D-2'-de
  • the 3'-terminus of the TO and FHO was blocked with a carbon spacer to prevent extension by DNA polymerase.
  • the sequences of TO and FHO including forward primers, reverse primers and synthetic non-natural base pairs used in this example are shown in Table 1 below.
  • the number "X-Y.Y” after TO and FHO means the number and position of synthetic non-natural bases included in the tagging site of the TO. Specifically, X represents the number of synthetic non-natural bases, and Y represents the position from the 3'-end of the 5'-tagging site.
  • TO 1-1 includes one synthetic non-natural base, and means that the synthetic non-natural base is included at the first nucleotide position from the 3'-end.
  • FHO 1-1 refers to an FHO that hybridizes with a target-dependent fragment released by cleavage of the TO 1-1.
  • TO 3-3.7.9 includes three synthetic non-natural bases, and means that the three synthetic non-natural bases are included at the 3rd, 7th, and 9th nucleotide positions from the 3'-end. do.
  • FHO 3-3.7.9 refers to an FHO that hybridizes with a target-dependent fragment released by cleavage of the TO 3-3.7.9.
  • each tube contained (i) 5 ⁇ l of the plasmid DNA template (concentration 1 to 4) prepared in Example 1-1, (ii) forward primer (SEQ ID NO: 2) and reverse primer (SEQ ID NO: 3) TO (SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12 or 14) and FHO (SEQ ID NO: 5, 7, 9) each containing 5 pmoles, (iii) a non-natural base pair (P-Z) , 11, 13 or 15) 4 pmoles each and (iv) 5 ⁇ l of EM 1 (Cat No.SD10245Z, Seegene, Inc.) to prepare a final 20 ⁇ l reaction mixture.
  • 24 types of reaction mixtures were prepared by combining (i) 4 concentrations of plasmid DNA and (iii) 6 types of TO and FHO pairs, and real-time PCR reaction was performed using the reaction mixture. did
  • the tube containing the reaction mixture was placed in a real-time thermocycler (CFX96, Bio-Rad).
  • the reaction mixture was denatured at 95°C for 15 minutes, and the process of 95°C for 10 seconds, 60°C for 60 seconds, and 72°C for 10 seconds was repeated 45 times. Detection of the signal was measured at 60 °C every cycle.
  • the Ct value was calculated by an auto calculated single threshold, and all experiments were repeated twice to obtain an average Ct value.
  • a comparative control reaction was also performed under the same conditions as above using TO (SEQ ID NO: 16) and FHO (SEQ ID NO: 17) containing natural base pairs instead of TO and FHO containing non-natural base pairs.
  • a negative control reaction was also conducted under the same conditions as above using a reaction mixture containing 5 ⁇ l of distilled water instead of the plasmid DNA template.

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Abstract

본 개시는 합성 비자연 염기를 포함하는 태그 올리고뉴클레오타이드를 이용한 타겟 핵산 서열의 검출에 관한 것이다. 본 개시의 프로토콜은 타겟 의존적 단편과 단편-혼성화 올리고뉴클레오타이드 간의 혼성화의 결합 친화성 또는 특이성을 개선함으로써 타겟 시그널을 증가시키고, 따라서 보다 개선된 민감도로 타겟 서열을 검출할 수 있다.

Description

합성 비자연 염기를 포함하는 태그 올리고뉴클레오타이드를 이용한 타겟 핵산 서열의 검출
본 개시는 합성 비자연 염기를 포함하는 태그 올리고뉴클레오타이드를 이용한 타겟 핵산 서열의 검출에 관한 것이다.
타겟 핵산 서열의 검출을 위해, 실시간 방식으로 타겟 증폭을 모니터링하면서 타겟 핵산 서열을 검출하는 실시간 검출 방법이 널리 사용되고 있다. 실시간 검출 방법은 일반적으로 타겟 핵산 서열과 특이적으로 혼성화되는 표지된 프로브 또는 프라이머를 사용한다. 표지된 프로브와 타겟 핵산 서열 간의 혼성화를 이용하는 방법의 예로서, 헤어핀 구조를 갖는 이중표지된 프로브를 이용한 Molecular beacon 방법(Tyagi et al., Nature Biotechnology v.14 MARCH 1996), HyBeacon 방법(French DJ et al., Mol. Cell Probes, 15(6):363-374(2001)), 공여체 및 수용체로 각각 표지된 2개의 프로브를 이용한 혼성화 프로브 방법(Bernad et al, 147-148 Clin Chem 2000; 46) 및 단일 표지된 올리고뉴클레오타이드를 이용한 Lux 방법(미국 특허 제7,537,886호)이 있다. 또한, 이중표지된 프로브와 DNA 폴리머라아제의 5'-뉴클레아제 활성에 의한 상기 프로브의 절단을 이용한 TaqMan 방법(미국 특허 제5,210,015호 및 제5,538,848호)이 본 기술분야에서 널리 이용되고 있다.
표지된 프라이머를 이용한 방법의 예로는 Sunrise 프라이머 방법(Nazarenko et al, 2516-2521 Nucleic Acids Research, 1997, v.25 no.12, 및 미국 특허 제6,117,635호), Scorpion 프라이머 방법(Whitcombe et al, 804-807, Nature Biotechnology v.17 AUGUST 1999 및 미국 특허 제6,326,145) 및 TSG 프라이머 방법(WO 2011/078441)이 있다.
대안적인 방법으로서, 타겟 핵산 서열의 존재 시 형성되는 이합체를 이용한 실시간 검출 방법이 제안되어왔다: Invader 분석(미국 특허 제5,691,142호, 제6,358,691호 및 제6,194,149호), PTOCE(PTO Cleavage and Extension) 방법(WO 2012/096523), PCEC(PTO Cleavage and Extension-dependent Cleavage) 방법(WO 2012/134195), PCE-SH(PTO Cleavage and Extension-dependent Signaling Oligonucleotide Hybridization) 방법(WO 2013/115442), PCE-SC(PTO Cleavage and Extension-dependent Signaling Oligonucleotide Cleavage) 방법(WO 2013/157821), PCE-NH(PTO Cleavage and Extension-dependent Non-Hybridization) 방법(WO 2014/104818), PCE-IH(PTO Cleavage and Extension-dependent Immobilized Oligonucleotide Hybridization) 방법(WO 2015/008985) 및 PTOCE-E(PTO Cleavage and Extension-dependent extension) 방법(WO 2019/0666461).
또 다른 방법으로, 멜팅 커브 분석과 조합된 이중 퀀칭 분석(dual quenching assay)을 이용한 실시간 검출 방법이 제안되었다 (WO 2016/101959).
전술한 이합체를 이용한 실시간 검출 방법 및/또는 이중 퀀칭 분석을 이용한 실시간 검출 방법은 태그 올리고뉴클레오타이드(예컨대, 프로브 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(PTO) 등)를 이용한다. 상기 태그 올리고뉴클레오타이드는 타겟 핵산 서열의 존재에 의존적으로 절단되어 단편(예컨대, PTO 단편)을 방출한다. 이어서, 상기 방법은 상기 단편과 상기 단편과 혼성화 가능한 단편-혼성화 올리고뉴클레오타이드(예컨대, 캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(CTO), 캡처링 앤드 퀀칭 올리고뉴클레오타이드(CQO) 등) 간의 혼성화를 이용한다. 상기 방법은 단편 및 단편-혼성화 올리고뉴클레오타이드의 서열을 타겟 핵산 서열의 고려없이 인위적으로 자유롭게 설계할 수 있는 장점이 있다.
하지만, 상기 단편은 태그 올리고뉴클레오타이드의 일부로서, 타겟 핵산 검출 방법에 사용되는 다른 올리고뉴클레오타이드와 비교하여 상대적으로 길이가 짧으므로 특정 반응 조건에서 단편-혼성화 올리고뉴클레오타이드와 낮은 혼성화 효율을 나타낼 가능성이 있다. 또한, 상기 단편은 타겟 핵산 서열뿐만 아니라 비타겟 핵산 서열과 혼성화되지 않도록 설계됨에도 불구하고, 예기치 않게 샘플 내에 존재하는 미지의 비타겟 핵산 서열과 혼성화될 수도 있다. 이러한 단편과 단편-혼성화 올리고뉴클레오타이드 간의 낮은 혼성화 효율은 결국 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널의 감소로 이어질 수 있고, 단편과 비타겟 핵산 서열 간의 혼성화 역시 단편을 소모시키거나 단편과 단편-혼성화 올리고뉴클레오타이드 간의 혼성화를 방해하여 결국 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널의 감소를 야기할 수 있다.
따라서, 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널을 증가시키기 위해, 방출된 단편과 단편-혼성화 올리고뉴클레오타이드 간의 결합 친화성 및/또는 특이성을 개선할 수 있는 새로운 방법의 개발이 요구된다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 인용문헌 및 특허 문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 문헌 및 특허의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 태그 올리고뉴클레오타이드 및 단편-혼성화 올리고뉴클레오타이드를 이용하는 타겟 핵산 검출 방법에 있어서, 신호 검출을 개선하고자 예의 연구 노력하였다. 특히, 본 발명자들은 타겟 핵산 서열의 존재에 의존적으로 절단되어 방출된 타겟 의존적 단편과 상기 타겟 의존적 단편과 혼성화 가능한 단편-혼성화 올리고뉴클레오타이드 간의 결합 친화성 또는 특이성을 개선함으로써 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널을 개선하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 상기 타겟 의존적 단편과 단편-혼성화 올리고뉴클레오타이드 간의 혼성화에 관여하는 태그 올리고뉴클레오타이드의 태깅 부위 및 단편-혼성화 올리고뉴클레오타이드에 합성 비자연 염기쌍을 도입함으로써 방출된 단편과 단편-혼성화 올리고뉴클레오타이드 간의 결합 친화성 및/또는 특이성을 증가시킬 수 있음을 확인하였다. 본 개시의 프로토콜은 타겟 의존적 단편과 단편-혼성화 올리고뉴클레오타이드 간의 혼성화의 결합 친화성 또는 특이성을 개선함으로써 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널을 증가시키고, 따라서 보다 개선된 민감도로 복수의 타겟 서열을 검출할 수 있게 해준다.
따라서, 본 개시의 목적은 타겟 핵산 서열을 검출하는 방법을 제공하는데 있다.
본 개시의 다른 목적은 타겟 핵산 서열을 검출하기 위한 조성물을 제공하는데 있다.
본 개시의 다른 목적 및 이점은 첨부한 청구범위와 함께 하기의 상세한 설명에 의해 보다 명확해질 것이다.
본 개시의 일 양태에 따르면, 본 개시는 다음의 단계를 포함하는, 타겟 핵산 서열을 검출하는 방법을 제공한다:
(a) 상기 타겟 핵산 서열을 태그 올리고뉴클레오타이드(Tag Oligonucleotide; TO)와 반응시키는 단계;
상기 TO는 (i) 상기 타겟 핵산 서열에 비-혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 태깅 부위 및 (ii) 타겟 핵산 서열에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 타겟팅 부위를 포함하며, 상기 태깅 부위는 상기 태깅 부위의 3'-말단으로부터 5 뉴클레오타이드 이내에 제1 합성 비자연 염기를 포함하고, 상기 반응은 상기 타겟 핵산 서열과 상기 TO의 혼성화 및 상기 타겟 핵산 서열의 존재에 의존적인 상기 TO의 절단으로 상기 TO의 태깅 부위 또는 이의 일부 서열을 포함하는 타겟 의존적 단편의 방출을 포함하고, 상기 타겟 의존적 단편은 상기 제1 합성 비자연 염기를 포함하며, 상기 TO의 절단은 뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의해 실시되고;
(b) 상기 타겟 의존적 단편과 단편-혼성화 올리고뉴클레오타이드(Fragment-Hybridizing Oligonucleotide; FHO)를 반응시켜 이합체를 형성하는 단계;
상기 FHO는 (i) 3'에서 5' 순서로 상기 타겟 의존적 단편에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 상기 타겟 의존적 단편 및 상기 TO의 타겟팅 부위에 대한 비-혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하는 제1 형태의 FHO이거나 또는 (ii) 상기 타겟 의존적 단편에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위를 포함하는 제2 형태의 FHO이고, 상기 FHO의 캡처링 부위는 상기 타겟 의존적 단편에서의 제1 합성 비자연 염기와 염기쌍을 이룰 수 있는 제2 합성 비자연 염기를 포함하며,
(i) 상기 FHO가 제1 형태의 FHO일 경우, 상기 타겟 의존적 단편은 상기 FHO의 캡처링 부위에 혼성화되고 연장되어 상기 FHO의 템플레이팅 부위와 상보적인 연장서열을 포함하는 연장가닥을 생성하고, 이로 인해 연장가닥과 FHO 간의 제1 이합체 형성을 유도하거나 또는 (ii) 상기 FHO가 제2 형태의 FHO일 경우, 상기 타겟 의존적 단편은 상기 FHO의 캡처링 부위와 혼성화되어 제2 이합체를 형성하고; 및
(c) 상기 제1 이합체에서의 상기 연장 가닥의 존재 또는 제2 이합체의 존재를 검출하는 단계;
상기 제1 이합체에서의 상기 연장 가닥의 존재 또는 제2 이합체의 존재는 상기 타겟 핵산 서열의 존재를 나타냄.
본 발명자들은 태그 올리고뉴클레오타이드 및 단편-혼성화 올리고뉴클레오타이드를 이용하는 타겟 핵산 검출 방법에 있어서, 신호 검출을 개선하고자 예의 연구 노력하였다.
특히, 본 발명자들은 타겟 핵산 서열의 존재에 의존적으로 절단되어 방출된 타겟 의존적 단편과 상기 타겟 의존적 단편과 혼성화 가능한 단편-혼성화 올리고뉴클레오타이드 간의 결합 친화성 또는 특이성을 개선함으로써 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널을 개선하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 상기 타겟 의존적 단편과 단편-혼성화 올리고뉴클레오타이드 간의 혼성화에 관여하는 태그 올리고뉴클레오타이드의 태깅 부위 및 단편-혼성화 올리고뉴클레오타이드에 합성 비자연 염기쌍을 도입함으로써 방출된 단편과 단편-혼성화 올리고뉴클레오타이드 간의 결합 친화성 또는 특이성을 증가시킬 수 있음을 확인하였다. 본 개시의 프로토콜은 타겟 의존적 단편과 단편-혼성화 올리고뉴클레오타이드 간의 혼성화의 결합 친화성 또는 특이성을 개선함으로써 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널을 증가시키고, 따라서 보다 개선된 정확성으로 복수의 타겟 서열을 검출할 수 있게 해준다.
본 개시의 일 구현예에 따르면, 상기 제1 합성 비자연 염기는 상기 TO의 태깅 부위의 3'-말단으로부터 2 내지 5 뉴클레오타이드가 이격된 사이트에 위치한다.
본 개시의 일 구현예에 따르면, 상기 TO의 태깅 부위는 1 내지 5개의 추가적인 합성 비자연 염기를 더 포함한다.
본 개시의 일 구현예에 따르면, 상기 제1 합성 비자연 염기 및 1 내지 5개의 추가적인 합성 비자연 염기들은 서로 1 내지 10 뉴클레오타이드 이격되어 있다.
본 개시의 일 구현예에 따르면, 제1 합성 비자연 염기는 S, Z, V, K, Pa. Pn, Px, Q, MMO2, 5FM, NaM, B, P, J, X, Ds, Dss 및 5SICS로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 개시의 일 구현예에 따르면, 상기 제1 합성 비자연 염기는 S-B 염기쌍, Z-P 염기쌍, V-J 염기쌍, K-X 염기쌍, Pa-Ds 염기쌍, Pa-Q 염기쌍, Pn-Ds 염기쌍, Pn-Dss 염기쌍, Px-Ds 염기쌍, MMO2-5SICS 염기쌍, 5FM-5SICS 염기쌍 및 NaM-5SICS 염기쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 염기쌍 중 어느 하나의 염기이다.
본 개시의 일 구현예에 따르면, 상기 TO의 태깅 부위는 5 내지 50 뉴클레오타이드의 길이를 가진다.
본 개시의 일 구현예에 따르면, 상기 상기 TO의 태깅 부위는 9 내지 14 뉴클레오타이드의 길이를 가진다.
본 개시의 일 구현예에 따르면, 상기 뉴클레아제 활성을 갖는 효소는 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 효소이다.
본 개시의 일 구현예에 따르면, 상기 방법은 상기 타겟 핵산 서열에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 업스트림 프라이머의 존재 하에서 실시되고, 상기 업스트림 프라이머는 상기 TO의 5'방향으로 업스트림에 위치한다.
본 개시의 일 구현예에 따르면, 상기 단계 (a)는 상기 업스트림 프라이머가 주형-의존적 핵산 중합효소에 의해 연장되어 연장가닥을 생성하고, 상기 연장가닥이 상기 뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의해 상기 TO의 절단을 유도하여, 상기 TO의 태깅 부위 또는 태깅 부위의 일부 서열을 포함하는 상기 타겟 의존적 단편을 방출하는 반응을 포함한다.
본 개시의 일 구현예에 따르면, 상기 주형-의존적 핵산 중합효소 및 상기 뉴클레아제 활성을 갖는 효소는 동일 효소이다.
본 개시의 일 구현예에 따르면, 상기 TO는 프로브이다.
본 개시의 일 구현예에 따르면, 상기 방법은 다운스트림 프라이머의 존재 하에서 실시된다.
본 개시의 일 구현예에 따르면, 상기 제1 이합체는 (i) 상기 타겟 의존적 단편 및/또는 제1 형태의 FHO에 연결된 최소 하나의 표지, (ii) 상기 연장반응 동안 상기 제1 이합체 내에 삽입된 표지, (iii) 상기 연장반응 동안 상기 제1 이합체 내에 삽입된 표지 및 상기 제1 형태의 FHO에 연결된 최소 하나의 표지 또는 (iv) 인터컬레이팅 표지(intercalating label)에 의해 검출가능한 시그널을 제공하고, 상기 단계 (c)에서 상기 연장 가닥의 존재는 상기 제1 이합체로부터 제공되는 시그널을 측정함으로써 검출된다.
본 개시의 일 구현예에 따르면, 상기 제1 이합체는 뉴클레오절단효소(nucleolytic enzyme)에 의해 절단되는 절단 위치를 포함하며, 상기 제1 이합체는 상기 절단 위치에서의 절단에 의해 검출가능한 시그널을 제공하고, 상기 단계 (c)에서 연장가닥의 존재는 상기 제1 이합체의 절단으로부터 제공되는 시그널을 측정함으로써 검출된다.
본 개시의 일 구현예에 따르면, 상기 방법은 상기 연장가닥에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열 및 표지를 포함하는 시그널링 올리고뉴클레오타이드(Signaling Oligonucleotide; SO)를 추가적으로 사용하고, 상기 SO와 상기 연장가닥 간의 이합체는 검출가능한 시그널을 제공하며, 상기 단계 (c)에서 연장가닥의 존재는 상기 SO와 상기 연장가닥 간의 이합체로부터 제공되는 시그널을 측정함으로써 검출된다.
본 개시의 일 구현예에 따르면, 상기 방법은 상기 연장가닥에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열 및 표지를 포함하는 시그널링 올리고뉴클레오타이드(Signaling Oligonucleotide; SO)를 추가적으로 사용하고, 상기 SO와 상기 연장가닥 간의 이합체는 뉴클레오절단효소(nucleolytic enzyme)에 의해 절단되는 절단 위치를 포함하며, 상기 SO와 상기 연장가닥 간의 이합체는 상기 절단 위치에서의 절단에 의해 검출가능한 시그널을 제공하고, 상기 단계 (c)에서 연장가닥의 존재는 상기 SO와 상기 연장가닥 간의 이합체의 절단으로부터 제공되는 시그널을 측정함으로써 검출된다.
본 개시의 일 구현예에 따르면, 상기 방법은 상기 제1 형태의 FHO에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드 서열 및 표지를 포함하는 혼성화 뉴클레오타이드(Hybridizing Oligonucleotide; HO)를 추가적으로 사용하며, 상기 HO와 상기 제1 형태의 FHO 간의 이합체는 검출가능한 시그널을 제공하고, 상기 단계 (c)에서 연장가닥의 존재는 상기 HO와 상기 제1 형태의 FHO 간의 이합체로부터 제공된 시그널을 측정함으로써 검출되며, 상기 HO와 상기 제1 형태의 FHO 간의 이합체로부터의 시그널의 존재는 상기 연장가닥의 부존재를 나타낸다.
본 개시의 일 구현예에 따르면, 상기 방법은 상기 연장가닥에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 고상 기질 상에 고정화된 고정화 올리고뉴클레오타이드(Immobilizing Oligonucleotide; IO)를 추가적으로 사용하고, 상기 연장가닥은 표지를 포함하며, 상기 연장가닥과 상기 IO 간의 이합체에 의해 상기 고상 기질 상에서 검출가능한 시그널을 제공하며, 상기 단계 (c)에서 연장가닥의 존재는 상기 연장가닥과 상기 IO 간의 이합체로부터 제공된 시그널을 측정함으로써 검출된다.
본 개시의 일 구현예에 따르면, 상기 단계 (c)는 하기 단계를 포함한다: (c-1) 상기 연장가닥과 제3 형태의 FHO를 혼성화시키는 단계로서, 상기 제3 형태의 FHO는 3'에서 5' 순서로 (i) 상기 연장가닥에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 연장가닥에 비-혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하며; 상기 연장가닥은 상기 제3 형태의 FHO의 캡처링 부위와 혼성화되고; (c-2) 주형-의존적 핵산 중합효소 및 상기 단계 (c-1)의 결과물을 이용하여 연장반응을 실시하는 단계로서, 상기 제3 형태의 FHO의 캡처링 부위에 혼성화된 연장가닥은 추가로 연장되어 상기 제3 형태의 FHO의 템플레이팅 부위와 상보적인 제2 연장서열을 포함하는 제2 연장가닥을 생성하고, 이에 따라 제2 연장가닥과 제3 형태의 FHO 간에 제3 이합체를 형성하며; (c-3) 상기 제2 연장가닥의 존재를 검출하는 단계로서, 상기 제2 연장가닥의 존재는 상기 연장 가닥의 존재를 나타낸다.
본 개시의 일 구현예에 따르면, 상기 제1 형태의 FHO 또는 제2 형태의 FHO는 고상 기질 상에 고정화되어 있다.
본 개시의 일 구현예에 따르면, 상기 방법은 고상 기질 상에 고정화된 추가적인 SO, HO 또는 제3 형태의 FHO를 사용한다.
본 개시의 일 구현예에 따르면, 상기 TO 및/또는 상기 FHO는 연장이 되지 않도록 그의 3'-말단이 블록킹되어 있다.
본 개시의 일 구현예에 따르면, 상기 방법이 상기 제2 이합체를 형성하는 경우, 상기 TO는 리포터 분자 및 제1 퀀처 분자가 연결되어 있고, 상기 제2 형태의 FHO는 제2 퀀처 분자가 연결되어 있으며, 상기 TO는 상기 단계 (a) 반응 동안 타겟 핵산 서열의 존재에 의존적으로 절단되어 상기 리포터 분자를 포함하는 타겟 의존적 단편을 방출하고, 상기 타겟 의존적 단편에 포함된 상기 리포터 분자와 상기 제2 형태의 FHO에 연결된 제2 퀀처 분자는 온도에 따른 상기 타겟 의존적 단편과 상기 제2 형태의 FHO 간의 제2 이합체의 형성 및 해리에 의해 검출가능한 시그널을 제공하고, 상기 단계 (c)에서 제2 이합체의 존재는 상기 제2 이합체로부터의 제공된 시그널을 측정함으로써 검출된다.
본 개시의 일 구현예에 따르면, 상기 제1 이합체 또는 제2 이합체의 Tm 값은 상기 제1 이합체 또는 제2 이합체에 포함된 제1 합성 비자연 염기 및 제2 합성 비자연 염기가 자연 염기로 치환된 이합체의 Tm 값 대비 0.5 내지 10℃ 이상 높다.
본 개시의 일 구현예에 따르면, 상기 단계 (a)-(c) 전체 또는 일부는 변성을 포함하여 반복된다.
본 개시의 다른 양태에 따르면, 다음을 포함하는, 타겟 핵산 서열을 검출하기 위한 조성물을 제공한다:
(a) 태그 올리고뉴클레오타이드(Tag Oligonucleotide; TO);
상기 TO는 (i) 상기 타겟 핵산 서열에 비-혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 태깅 부위 및 (ii) 타겟 핵산 서열에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 타겟팅 부위를 포함하며, 상기 태깅 부위는 상기 태깅 부위의 3'-말단으로부터 5 뉴클레오타이드 이내에 제1 합성 비자연 염기를 포함하고, 상기 TO는 상기 타겟 핵산 서열의 존재에 의존적으로 절단되어 상기 TO의 태깅 부위 또는 이의 일부 서열을 포함하는 타겟 의존적 단편을 방출하고, 상기 타겟 의존적 단편은 상기 제1 합성 비자연 염기를 포함하고,
(b) 단편-혼성화 올리고뉴클레오타이드(Fragment-Hybridizing Oligonucleotide; FHO);
상기 FHO는 (i) 3'에서 5' 순서로 상기 타겟 의존적 단편에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 상기 타겟 의존적 단편 및 상기 TO의 타겟팅 부위에 대한 비-혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하는 제1 형태의 FHO이거나 또는 (ii) 상기 타겟 의존적 단편에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위를 포함하는 제2 형태의 FHO이고, 상기 FHO의 캡처링 부위는 상기 타겟 의존적 단편에서의 제1 합성 비자연 염기와 염기쌍을 이룰 수 있는 제2 합성 비자연 염기를 포함하고,
(c) 뉴클레아제 활성을 갖는 효소.
본 개시의 일 구현예에 따르면, 상기 조성물은 상기 타겟 핵산 서열에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 업스트림 프라이머를 추가적으로 포함하고, 상기 업스트림 프라이머는 상기 TO의 5'방향으로 업스트림에 위치한다.
본 개시의 일 구현예에 따르면, 상기 조성물은 주형-의존적 핵산 중합효소를 추가적으로 포함한다.
본 개시의 일 구현예에 따르면, 상기 조성물은 다운스트림 프라이머를 추가적으로 포함한다.
본 개시의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 개시에 따르면, TO의 태깅 부위 및 FHO의 캡처링 부위에 비자연 염기쌍을 포함하는 TO 및 FHO를 사용하는 경우, 타겟 의존적 단편과 FHO 간의 혼성화물(이합체) 높은 Tm을 가지며 결합 친화성이 향상된다. 이는 FHO의 캡처링 부위에 혼성화된 타겟 의존적 단편의 연장 효율을 높여 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널의 증가를 야기할 수 있다.
(b) 본 개시에 따르면, TO의 태깅 부위 및 FHO의 캡처링 부위에 비자연 염기쌍을 포함하는 TO 및 FHO를 사용하는 경우, 타겟 의존적 단편과 FHO 간의 이합체의 결합 특이성이 향상된다. 이는 타겟 의존적 단편이 비타겟 핵산 서열과 혼성화되는 것을 방지하여 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널의 증가를 야기할 수 있다.
(c) 본 개시에 따르면, TO의 태깅 부위 및 FHO의 캡처링 부위에 비자연 염기쌍을 포함하는 경우, TO의 태깅 부위의 Tm을 유지하면서 길이를 축소시킬 수 있다. 길이가 축소된 TO의 태깅 부위는 FHO의 캡처링 부위와의 결합 친화성은 유지하면서 비타겟 핵산 서열과 혼성화시 Tm이 크게 낮아져 결합 친화성이 저하되며, 따라서 타겟 의존적 단편이 비타겟 핵산 서열과 혼성화되는 것을 방지하여 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널의 증가를 야기할 수 있다.
(d) 종래의 비자연 염기를 포함하지 않는 TO를 이용하는 방법은 복수의 타겟 핵산 서열을 검출하는 경우, 복수의 타겟 핵산 서열의 다양성에 의해, 복수의 TO의 태깅 부위가 모든 타겟 핵산 서열에 대한 비상보성을 확보하는데 어려움이 있었다. 그러나, 본 개시의 방법은 TO의 태깅 부위 및 FHO의 캡처링 부위에 비자연 염기쌍을 도입함으로써, 모든 타겟 핵산 서열과 무관하게 타겟 핵산 서열에 대한 비상보성을 획득할 수 있다는 이점이 있다.
도 1은 합성 비자연 염기쌍을 포함하는 TO 및 제1 형태의 FHO를 이용한 타겟 핵산 검출 방법의 일 예를 도식적으로 보여준다.
도 2는 합성 비자연 염기쌍을 포함하는 TO 및 제2 형태의 FHO를 이용한 타겟 핵산 검출 방법의 일 예를 도식적으로 보여준다.
도 3 및 도 4는 실시예 2의 실시간 PCR의 결과를 나타낸다.
본 발명자들은 타겟 핵산 서열의 존재에 의존적으로 절단되어 방출된 타겟 의존적 단편과 상기 타겟 의존적 단편과 혼성화 가능한 단편-혼성화 올리고뉴클레오타이드 간의 결합 친화성 또는 특이성을 개선함으로써 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널을 개선하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 상기 타겟 의존적 단편과 단편-혼성화 올리고뉴클레오타이드 간의 혼성화에 관여하는 태그 올리고뉴클레오타이드의 태깅 부위 및 단편-혼성화 올리고뉴클레오타이드에 합성 비자연 염기쌍을 도입함으로써 방출된 단편과 단편-혼성화 올리고뉴클레오타이드 간의 결합 친화성 또는 특이성을 증가시킬 수 있음을 확인하였다.
본 개시의 일 양태에서, 다음의 단계를 포함하는, 타겟 핵산 서열을 검출하는 방법을 제공한다:
(a) 상기 타겟 핵산 서열을 태그 올리고뉴클레오타이드(Tag Oligonucleotide; TO)와 반응시키는 단계;
상기 TO는 (i) 상기 타겟 핵산 서열에 비-혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 태깅 부위 및 (ii) 타겟 핵산 서열에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 타겟팅 부위를 포함하며,
상기 태깅 부위는 상기 태깅 부위의 3'-말단으로부터 5 뉴클레오타이드 이내에 제1 합성 비자연 염기를 포함하고,
상기 반응은 상기 타겟 핵산 서열과 상기 TO의 혼성화 및 상기 타겟 핵산 서열의 존재에 의존적인 상기 TO의 절단으로 상기 TO의 태깅 부위 또는 이의 일부 서열을 포함하는 타겟 의존적 단편의 방출을 포함하고,
상기 타겟 의존적 단편은 상기 제1 합성 비자연 염기를 포함하며,
상기 TO의 절단은 뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의해 실시되고;
(b) 상기 타겟 의존적 단편과 단편-혼성화 올리고뉴클레오타이드(Fragment-Hybridizing Oligonucleotide; FHO)를 반응시켜 이합체를 형성하는 단계;
상기 FHO는 (i) 3'에서 5' 순서로 상기 타겟 의존적 단편에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 상기 타겟 의존적 단편 및 상기 TO의 타겟팅 부위에 대한 비-혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하는 제1 형태의 FHO이거나 또는 (ii) 상기 타겟 의존적 단편에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위를 포함하는 제2 형태의 FHO이고,
상기 FHO의 캡처링 부위는 상기 타겟 의존적 단편에서의 제1 합성 비자연 염기와 염기쌍을 이룰 수 있는 제2 합성 비자연 염기를 포함하며,
(i) 상기 FHO가 제1 형태의 FHO일 경우, 상기 타겟 의존적 단편은 상기 FHO의 캡처링 부위에 혼성화되고 연장되어 상기 FHO의 템플레이팅 부위와 상보적인 연장서열을 포함하는 연장가닥을 생성하고, 이로 인해 연장가닥과 FHO 간의 제1 이합체 형성을 유도하거나 또는
(ii) 상기 FHO가 제2 형태의 FHO일 경우, 상기 타겟 의존적 단편은 상기 FHO의 캡처링 부위와 혼성화되어 제2 이합체를 형성하고; 및
(c) 상기 제1 이합체에서의 상기 연장 가닥의 존재 또는 제2 이합체의 존재를 검출하는 단계;
상기 제1 이합체에서의 상기 연장 가닥의 존재 또는 제2 이합체의 존재는 상기 타겟 핵산 서열의 존재를 나타냄.
본 개시의 구성 요소를 을 설명하는 데 있어서, 제1, 제2, A, B, (a), (b), (i), (ii) 등의 용어를 사용할 수 있다. 이러한 용어는 그 구성 요소를 다른 구성 요소와 구별하기 위한 것일 뿐, 그 용어에 의해 해당 구성 요소의 본질이나 차례 또는 순서 등이 한정되지 않는다.
본 개시를 각 단계에 따라 상세하게 설명하면 다음과 같다:
단계 (a) : 타겟 핵산 서열과 태그 올리고뉴클레오타이드의 반응
본 개시에 따르면, 우선, 타겟 핵산 서열을 태그 올리고뉴클레오타이드(Tag Oligonucleotide; TO)와 반응시킨다.
본원에서 사용된 용어 "타겟 핵산", "타겟 핵산 서열" 또는 "타겟 서열"은 최종적으로 검출하고자 하는 서열을 의미하며, 특정 혼성화, 어닐링 또는 증폭 조건에서 프라이머 또는 프로브와 어닐링 또는 혼성화된다.
본원에서 사용된 용어 "프로브"는 타겟 핵산 서열에 대한 혼성화 부위 또는 부위들을 포함하는 단일가닥 핵산 분자이다.
본원에서 사용된 용어 "프라이머"는 타겟 핵산 서열(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용하는 올리고뉴클레오타이드를 의미할 수 있다.
특히, 프로브 및 프라이머는 단일 가닥 데옥시리보뉴클레오타이드 분자이다. 본 개시에서 이용되는 프로브 또는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프로브 또는 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.
프라이머는 중합제의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도의 길이를 가져야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 다수의 요소, 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)에 따라 결정된다. 용어 "어닐링" 또는 "프라이밍"은 주형 핵산에 올리고데옥시뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 주형 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다.
본 명세서에서 용어 "혼성화"는 소정의 혼성화 조건 또는 엄격 조건하에 2개의 단일-가닥 폴리뉴클레오타이드가 상보적인 뉴클레오타이드 서열 간의 비공유 결합을 통해 이중-가닥을 형성하는 것을 지칭한다.
특히, 본원에서 하나의 올리고뉴클레오타이드가 다른 올리고뉴클레오타이드에 대한 "혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다"는 표현은 상기 하나의 올리고뉴클레오타이드의 전체 또는 일부가 다른 올리고뉴클레오타이드의 전체 또는 일부와의 상호 혼성화에 필요한 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다는 것을 의미한다.
또한, 본원에서 하나의 올리고뉴클레오타이드 내의 일부 부위와 다른 올리고뉴클레오타이드 간의 혼성화를 언급할 때, 상기 일부 부위를 개별적인 올리고뉴클레오타이드로 간주하여 다른 올리고뉴클레오타이드 간의 혼성화를 표현할 수 있다.
혼성화는 2개의 핵산 서열 간에 혼성화가 일어나는 부위(이중-가닥을 형성하는 부위)에서의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 미스매치(mismatch) 염기(예를 들어, 1-4의 미스매치)가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 반응 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다.
용어 "어닐링"과 "혼성화"는 차이가 없으며, 본 명세서에서 혼용된다.
본원에서 사용된 용어 "상보적"은 소정의 어닐링 또는 엄격조건하에서 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산 서열에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, "실질적으로 상보적(substantially complementary)" 및 "완전히 상보적(perfectly complementary)"인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 구체적으로, 완전히 상보적인 것을 의미한다.
반면, 본원에서 사용된 용어 "비-상보적"은 소정의 어닐링 또는 엄격조건 하에서 프라이머 또는 프로브가 특정 서열에 선택적으로 혼성화 되지 않을 정도로 충분히 비-상보적인 것을 의미하며, "실질적으로 비-상보적(substantially non-complementary)" 및 "완전히 비-상보적(perfectly noncomplementary)"인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 구체적으로, 완전히 비-상보적인 것을 의미한다.
상기 TO는 (i) 상기 타겟 핵산 서열에 비-혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 태깅 부위 및 (ii) 타겟 핵산 서열에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 타겟팅 부위를 포함한다.
타겟 핵산 서열에 비-혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 '태깅 부위'는 '태그 서열', '플랩 서열', 또는 '테일(tail) 서열'등으로도 불린다. 상기 TO의 태깅 부위는 타겟 핵산 서열에 비-혼성화하는 한 임의적으로 서열을 선택할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 TO의 태깅 부위는 상기 TO의 타겟팅 부위의 5'말단, 3'말단 또는 중앙에 위치할 수 있다. 구체적인 일 구현예에 있어서, 상기 TO의 태깅 부위는 상기 TO의 타겟팅 부위의 5'말단에 위치할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 TO의 태깅 부위는 구아닌(G), 시토신(C) 아데닌(A), 티민(T) 및 우라실(U)과 같은 자연적(naturally occurring) 염기들 간에 생성되는 왓슨-크릭 염기쌍(Watson-Crick base-pairing)과는 다른 결합 친화성(binding affinity)을 나타내는 하나 이상의 합성 비자연 염기(synthetic unnatural base)를 포함할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 TO의 태깅 부위는 상기 태깅 부위의 3'-말단으로부터 5 뉴클레오타이드 이내에 제1 합성 비자연 염기를 포함한다.
일 구현예에 있어서, 상기 제1 합성 비자연 염기는 S, Z, V, K, Pa. Pn, Px, Q, MMO2, 5FM, NaM, B, P, J, X, Ds, Dss 및 5SICS로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
일 구현예에 있어서, 상기 제1 합성 비자연 염기는 상기 TO의 태깅 부위(구체적으로, 5'-태깅 부위)의 3'-말단으로부터 5 뉴클레오타이드 이내에 위치할 수 있다. 구체적으로, 상기 TO의 태깅 부위의 3'-말단으로부터 5 뉴클레오타이드 이내, 4 뉴클레오타이드 이내, 3 뉴클레오타이드 이내, 2 뉴클레오타이드 이내에 위치할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 제1 합성 비자연 염기는 상기 TO의 태깅 부위의 3'-말단으로부터 2 내지 5 뉴클레오타이드가 이격된 사이트에 위치한다. 예컨대, 상기 TO의 태깅 부위가 n개의 뉴클레오타이드로 이루어진 경우, 상기 제1 합성 비자연 염기는 상기 TO의 태깅 부위의 3'-말단으로부터 2 뉴클레오타이드가 이격된 위치는 태깅부위의 5'에서 3' 순서로, n-1 번째 뉴클레오타이드를 가리키며, 5 뉴클레오타이드가 이격된 위치는 n-4 번째 뉴클레오타이드를 가르킨다.
본 발명자들은 상기 TO의 태깅 부위(구체적으로, 5'-태깅 부위)의 3'-말단의 1번째 뉴클레오타이드(즉, n개의 뉴클레오타이드로 이루어진 태깅 부위 중 5'에서 3' 순서로 n번째 뉴클레오타이드) 위치에 합성 비자연 염기를 포함하는 경우, 단계 (c)에서 검출에 대한 민감도, 특히, 제1 이합체 내의 연장가닥 검출에 대한 민감도가 낮아지는 결과를 얻었다. 이러한 결과는 3'-말단의 1번째 뉴클레오타이드 위치에 합성 비자연 염기가 존재하는 경우, (i) 뉴클레아제의 절단부위에 위치한 비자연 염기로 인해 절단 효율이 감소되는 현상, (ii) FHO와 혼성화된 타겟 의존적 단편의 3'-말단 즉, 중합효소의 연장 시작 부위에 위치한 비자연 염기가 중합효소의 연장 반응에 있어서 일반적인 기질로서 수월하게 인식되지 않음으로 인해 연장 효율이 감소되는 현상, (iii) 상기 3'-말단의 1번째 뉴클레오타이드 위치의 합성 비자연 염기가 맞은 편에 위치하는 타겟 핵산 서열 내의 자연 염기에 대하여 자연 염기 간의 반발력 보다 강한 반발력을 나타내어, 타겟팅 부위의 5'-말단까지 3'-태깅 부위와 함께 들려(즉, 타겟 핵산 서열에 혼성화하지 못함) 뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 TO의 절단위치가 달라지거나 타겟 의존적 단편의 3'말단의 서열이 달라져, FHO와 혼성화된 타겟 의존적 단편의 연장 효율이 감소되는 현상에 기인하는 것으로 추측된다.
일 구현예에 있어서, 상기 제1 합성 비자연 염기는 상기 TO의 태깅 부위의 3'-말단으로부터 2 번째 뉴클레오타이드 내지 5 번째 뉴클레오타이드, 2 번째 뉴클레오타이드 내지 4 번째 뉴클레오타이드 또는 2 번째 뉴클레오타이드 내지 3 번째 뉴클레오타이드에 위치할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "비자연 염기"는 염기쌍을 형성할 수 있는 아데닌(A), 구아닌(G), 티민(T), 시토신(C) 및 우라실(U)과 같은 자연적 염기의 유도체를 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "비자연 염기"는 모화합물(mother compound)로서 자연적 염기와 상이한 염기쌍 패턴을 갖는 염기를 포함하며, 예컨대, 미국 특허 제5,432,272호, 제5,965,364호, 제6,001,983호 및 제6,037,120호에 기재되어 있다. 비자연 염기들 간의 염기쌍은 자연적 염기와 유사하게 둘 또는 세 개의 수소결합을 포함할 수 있다. 또한, 비자연 염기들 간의 염기쌍은 특정한 방식으로도 형성된다.
비자연 염기의 특정한 예는 다음 염기들의 염기쌍 조합을 포함한다: iso-C/iso-G, iso-dC/iso-dG, K/X, H/J, M/N 및 5FM-5SICS (참조 미국특허 제7,422,850호).
일 구현예에 있어서, 상기 TO의 태깅 부위는 1 내지 5개의 합성 비자연 염기를 더 포함할 수 있으며, 구체적인 예로, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 합성 비자연 염기를 더 포함할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 TO의 태깅 부위가 제1 합성 비자연 염기 외에 추가적인 합성 비자연 염기를 포함하는 경우, 상기 추가적인 합성 비자연 염기는 태깅 부위의 3'-말단으로부터 첫 번째 뉴클레오타이드를 제외한 사이트에 위치한다. 예컨대, 상기 TO의 태깅 부위가 n개의 뉴클레오타이드로 이루어진 경우, 상기 추가적인 합성 비자연 염기는 태깅 부위 중 5'에서 3' 순서로 n번째 뉴클레오타이드에는 위치할 수 없다.
일 구현예에 있어서, 상기 TO의 태깅 부위가 제1 합성 비자연 염기 외에 추가적인 합성 비자연 염기를 포함하는 경우, 상기 제1 합성 비자연 염기 및 추가적인 합성 비자연 염기들은 연속적으로 위치할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 TO의 태깅 부위가 제1 합성 비자연 염기 외에 추가적인 합성 비자연 염기를 포함하는 경우, 상기 제1 합성 비자연 염기 및 추가적인 합성 비자연 염기들은 서로 1 내지 20 뉴클레오타이드 이격되어 있을 수 있으며, 구체적으로, 1 내지 15 뉴클레오타이드, 1 내지 10 뉴클레오타이드, 1 내지 5 뉴클레오타이드, 2 내지 15 뉴클레오타이드, 2 내지 10 뉴클레오타이드 또는 2 내지 5 뉴클레오타이드 이격되어 있을 수 있으며, 보다 구체적인 예로, 1 뉴클레오타이드, 2 뉴클레오타이드, 3 뉴클레오타이드, 4 뉴클레오타이드 또는 5 뉴클레오타이드 이격되어 있을 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 제1 합성 비자연 염기 및 추가적인 합성 비자연 염기는 모두 또는 일부가 동일할 수 있다. 예컨대, 제1 합성 비자연 염기 및 추가적인 합성 비자연 염기 모두가 동일한 비자연 염기일 수 있다. 다른 예로, 제1 합성 비자연 염기 및 추가적인 합성 비자연 염기 중 일부는 동일한 종류의 비자연 염기(예컨대, S)이고 나머지는 다른 종류의 비자연 염기(예컨대, Z)일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 제1 합성 비자연 염기 및 추가적인 합성 비자연 염기는 모두 상이할 수 있다.
TO는 어떠한 특정 길이도 요구하지 않는다. 예를 들어, TO의 길이는 15 내지 150 뉴클레오타이드, 15 내지 100 뉴클레오타이드, 15 내지 80 뉴클레오타이드, 15 내지 60 뉴클레오타이드, 15 내지 40 뉴클레오타이드, 20 내지 150 뉴클레오타이드, 20 내지 100 뉴클레오타이드, 20 내지 80 뉴클레오타이드, 20 내지 60 뉴클레오타이드, 20 내지 50 뉴클레오타이드, 30 내지 150 뉴클레오타이드, 30 내지 100 뉴클레오타이드, 30 내지 80 뉴클레오타이드, 30 내지 60 뉴클레오타이드, 30 내지 50 뉴클레오타이드, 35 내지 100 뉴클레오타이드, 35 내지 80 뉴클레오타이드, 35 내지 60 뉴클레오타이드 또는 35 내지 50 뉴클레오타이드의 길이를 가질 수 있다. TO의 타겟팅 부위가 타겟 핵산 서열에 특이적으로 혼성화되는 한, 어떠한 길이도 가질 수 있다. 예를 들어, TO의 타겟팅 부위는 10 내지 100 뉴클레오타이드, 10 내지 80 뉴클레오타이드, 10 내지 50 뉴클레오타이드, 10 내지 40 뉴클레오타이드, 10 내지 30 뉴클레오타이드, 15 내지 100 뉴클레오타이드, 15 내지 80 뉴클레오타이드, 15 내지 50 뉴클레오타이드, 15 내지 40 뉴클레오타이드, 15 내지 30 뉴클레오타이드, 20 내지 100 뉴클레오타이드, 20 내지 80 뉴클레오타이드, 20 내지 50 뉴클레오타이드, 20 내지 40 뉴클레오타이드 또는 20 내지 30 뉴클레오타이드의 길이를 가질 수 있다. 태깅 부위는 FHO의 캡처링 부위에 특이적으로 혼성화 및/또는 연장되는 한, 어떠한 길이도 가질 수 있다. 예를 들어, TO의 태깅 부위는 5 내지 50 뉴클레오타이드, 5 내지 40 뉴클레오타이드, 5 내지 30 뉴클레오타이드, 5 내지 20 뉴클레오타이드, 5 내지 15 뉴클레오타이드, 10 내지 50 뉴클레오타이드, 10 내지 40 뉴클레오타이드, 10 내지 30 뉴클레오타이드, 10 내지 20 뉴클레오타이드, 10 내지 15 뉴클레오타이드, 15 내지 50 뉴클레오타이드, 15 내지 40 뉴클레오타이드, 15 내지 30 뉴클레오타이드 또는 15 내지 20 뉴클레오타이드의 길이를 가질 수 있다.
특정 구현예에 있어서, 상기 상기 TO의 태깅 부위는 9 내지 14 뉴클레오타이드의 길이를 가진다.
일 구현예에 있어서, 상기 TO는 프라이머 또는 프로브일 수 있으며, 구체적인 구현예에 있어서, 상기 TO는 프로브일 수 있다.
일 구현예에 있어서, TO의 3'-말단은 3'-OH 터미널(terminal)을 가질 수도 있다.
일 구현예에 있어서, TO의 3'-말단은 "블록킹"되어 그의 연장이 방지될 수 있다.
블록킹은 종래 방법에 따라 달성될 수 있다. 예를 들면, 블록킹은 마지막 뉴클레오타이드의 3'-히드록실기에 바이오틴, 표지, 포스페이트기, 알킬기, 비-뉴클레오타이드 링커, 포스포로티오에이트 또는 알칸-디올 잔기와 같은 화학적 모이어티(moiety)를 추가하여 실시할 수 있다. 택일적으로, 블록킹은 마지막 뉴클레오타이드의 3'-히드록실기를 제거하거나 또는 다이디옥시뉴클레오타이드와 같이 3'-히드록실기가 없는 뉴클레오타이드를 이용하여 실시할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 단계 (a)의 반응은 상기 타겟 핵산 서열과 상기 TO의 혼성화 및 상기 타겟 핵산 서열의 존재에 의존적인 상기 TO의 절단으로 상기 TO의 태깅 부위 또는 이의 일부 서열을 포함하는 타겟 의존적 단편의 방출을 포함한다. 구체적인 구현예에 있어서, 상기 단계 (a)의 반응은 상기 타겟 핵산 서열에 상기 TO를 혼성화 시킨 다음, 상기 타겟 핵산 서열의 존재에 의존적으로 상기 TO를 절단하여, 상기 TO의 태깅 부위 또는 이의 일부 서열을 포함하는 타겟 의존적 단편을 방출하는 반응을 포함한다. 특히, 타겟 핵산 서열과 TO의 혼성화는 TO의 타겟팅 부위가 타겟 핵산 서열에 혼성화되고 태깅 부위는 타겟 핵산 서열에 혼성화되지 않는 엄격조건 하에서 실시될 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 TO의 절단은 뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의해 실시될 수 있다. 예컨대, 상기 TO의 절단은 뉴클레아제 활성을 갖는 중합 효소를 이용하여 실시되거나 또는 별도의 뉴클레아제를 이용하여 실시될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 뉴클레아제는 자연 발생, 비변형 또는 변형된 뉴클레아제 일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 타겟 핵산 서열에 혼성화된 TO는 TO의 절단을 위한 조건 하에서, 뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의하여 절단되어 TO의 태깅 부위 또는 이의 일부 서열을 포함하는 타겟 의존적 단편을 방출한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "TO의 절단을 위한 조건"은 뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의해 타겟 핵산 서열에 혼성화된 TO의 절단이 발생되는데 충분한 조건, 예컨대 온도, pH, 이온세기, 버퍼, 올리고뉴클레오타이드의 길이 및 서열 그리고 효소를 의미한다. 예를 들어, 5' 뉴클레아제 활성을 가지는 효소로서 Taq DNA 중합효소가 이용되는 경우, TO의 절단을 위한 조건은 Tris-HCl 버퍼, KCl, MgCl2 및 온도를 포함한다.
TO가 타겟 핵산 서열에 혼성화 되는 경우, TO의 타겟팅 부위는 혼성화에 포함되나, TO의 태깅 부위는 타겟 핵산 서열에 혼성화되지 않고 단일-가닥을 형성한다. 이와 같이, 단일-가닥 및 이중-가닥 구조 모두를 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 당업계에 알려진 다양한 기술에 의해 뉴클레아제 활성을 갖는 효소를 이용하여 절단할 수 있다. 예컨대, 상기 효소의 예는 5'-뉴클레아제 및 3'-뉴클레아제, 특히 5'-뉴클레아제 활성을 갖는 핵산 중합효소, 3'-뉴클레아제 활성을 갖는 핵산 중합효소 또는 FEN 뉴클레아제를 포함한다.
일 구현예에 있어서, 상기 뉴클레아제 활성을 갖는 효소는 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 효소일 수 있다. 예컨대, 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 중합효소 또는 FEN 뉴클레아제이며, 구체적으로, 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 열안정성 DNA 중합효소 또는 FEN 뉴클레아제일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 중합효소는 다양한 박테리아종으로부터 얻은 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, Thermus antranikianii, Thermus caldophilus, Thermus chliarophilus, Thermus flavus, Thermus igniterrae, Thermus lacteus, Thermus oshimai, Thermus ruber, Thermus rubens, Thermus scotoductus, Thermus silvanus, Thermus species Z05, Thermus species sps 17, Thermus thermophilus, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosipho africanus, Thermococcus litoralis, Thermococcus barossi, Thermococcus gorgonarius, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosiphoafricanus, Pyrococcus woesei, Pyrococcus horikoshii, Pyrococcus abyssi, Pyrodictium occultum, Aquifex pyrophilus 및 Aquifex aeolieus를 포함한다. 구체적으로, 열안정성 DNA 중합효소는 Taq 중합효소이다.
택일적으로, 본 개시는 중합효소 활성을 덜 갖도록 변형된, 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 중합효소를 사용할 수 있다.
일 구현예에 있어서, FEN(flap endonuclease) 뉴클레아제는 5'플랩-특이적 뉴클레아제(5'flap-specific nuclease)일 수 있다. 예컨대, FEN 뉴클레아제는 다양한 박테리아 종으로부터 얻은 FEN 뉴클레아제를 포함하며, 이는 Sulfolobus solfataricus, Pyrobaculum aerophilum, Thermococcus litoralis, Archaeaglobus veneficus, Archaeaglobus profundus, Acidianus brierlyi, Acidianus ambivalens, Desulfurococcus amylolyticus, Desulfurococcus mobilis, Pyrodictium brockii, Thermococcus gorgonarius, Thermococcus zilligii, Methanopyrus kandleri, Methanococcus igneus, Pyrococcus horikoshii, Aeropyrum pernix 및 Archaeaglobus veneficus를 포함한다.
일 구현예에 있어서, 상기 단계 (a)는 상기 타겟 핵산 서열에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 업스트림 올리고뉴클레오타이드의 존재 하에서 실시될 수 있다. 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 TO에 비해 5' 방향으로 업스트림에 위치한다.
본 개시에서 사용되는 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 TO를 기준으로 업스트림에 위치하는 올리고뉴클레오타이드를 지칭한다. 타겟 핵산 서열이 이중 가닥인 경우, 이중 가닥 중 한 가닥에 업스트림 올리고뉴클레오타이드 및 TO가 혼성화되고, 업스트림 올리고뉴클레오타이드의 다운스트림에 TO가 위치한다. 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 TO가 혼성화된 타겟 핵산 가닥의 부위와 비교하여 3'-방향에 있는 특정 부위에 혼성화된다.
일 구현예에 있어서, 상기 단계 (a)는 타겟 핵산 서열에 업스트림 올리고뉴클레오타이드를 혼성화시키는 반응을 포함할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 단계 (a)는 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드가 상기 뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 상기 TO의 절단을 유도하여, 상기 TO의 태깅 부위 또는 그의 일부 서열을 포함하는 상기 타겟 의존적 단편을 방출하는 반응을 포함할 수 있다.
업스트림 올리고뉴클레오타이드에 의한 TO 절단의 유도는 두 가지 방식으로 달성될 수 있다: (i) 업스트림 올리고뉴클레오타이드 연장-독립적 절단 유도; 및 (ii) 업스트림 올리고뉴클레오타이드 연장-의존적 절단 유도.
업스트림 올리고뉴클레오타이드가 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 상기 TO의 절단반응을 유도하는 데 충분할 정도로 TO에 근접하게 위치하는 경우, 업스트림 올리고뉴클레오타이드에 결합한 상기 효소는 연장반응 없이 TO를 절단한다. 반면, 업스트림 올리고뉴클레오타이드가 TO로부터 이격되어 있는 경우, 중합효소 활성을 갖는 효소(예컨대, 주형-의존적 중합효소)는 업스트림 올리고뉴클레오타이드(예컨대, 업스트림 프라이머)의 연장을 촉진시키고, 연장산물에 결합된 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 효소는 TO를 절단한다.
따라서, 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 두 가지 방식으로 TO에 대하여 상대적으로 위치할 수 있다. 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 연장-독립적인 방식으로 TO의 절단을 유도하는 데 충분할 정도로 TO에 근접한 위치에 위치할 수 있다. 택일적으로, 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 연장-의존적인 방식으로 TO 절단을 유도하는 데 충분할 정도로 TO로부터 이격된 위치에 위치할 수 있다.
본 명세서에서 업스트림 올리고뉴클레오타이드와 함께 지점(positions) 또는 위치(locations)를 언급하면서 사용되는 용어 "근접(adjacent)"은 업스트림 올리고뉴클레오타이드가 TO의 타겟팅 부위 바로 가까이에 위치하여 닉(nick)을 형성하는 것을 의미한다. 또한, 상기 용어는 업스트림 올리고뉴클레오타이드가 TO의 타겟팅 부위로부터 1 내지 30 뉴클레오타이드, 1 내지 20 뉴클레오타이드 또는 1 내지 15 뉴클레오타이드 이격되어 위치하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 업스트림 올리고뉴클레오타이드와 함께 지점 또는 위치를 언급하면서 사용되는 용어 "이격(distant)"은 연장반응이 일어나는데 충분할 정도의 어떠한 위치 또는 장소를 포함한다.
일 구현예에 있어서, 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 업스트림 프라이머 또는 업스트림 프로브일 수 있다. 업스트림 프라이머는 연장-독립적 절단 유도 또는 연장-의존적 절단에 적합하며, 업스트림 프로브는 연장-독립적 절단 유도에 적합하다. 특히, 업스트림 올리고뉴클레오타이드가 업스트림 프라이머인 경우, 이는 정방향(forward) 프라이머로도 지칭될 수 있다.
일 구현예에 있어서, 업스트림 올리고뉴클레오타이드의 연장-의존적 방식으로 상기 TO의 절단이 유도되는 경우, 상기 단계 (a)는 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드를 상기 타겟 핵산 서열에 혼성화 및 연장하여 그의 연장가닥을 생성하는 반응을 포함할 수 있다. 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드의 연장가닥은 뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의해 상기 TO의 절단을 유도하여, 상기 TO의 태깅 부위 또는 그의 일부 서열을 포함하는 상기 타겟 의존적 단편을 방출할 수 있다. 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드의 연장 가닥을 생성하는 반응은 주형-의존적 핵산 중합효소에 의해 실시될 수 있다.
TO 및 업스트림 올리고뉴클레오타이드와 타겟 핵산 서열의 혼성화는 최적화 절차에 의하여 일반적으로 결정되는 적합한 혼성화 조건 하에서 실시될 수 있다. 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 횟수, 버퍼 성분 및 이들의 pH 및 이온세기와 같은 조건은 올리고뉴클레오타이드(업스트림 올리고뉴클레오타이드 및 TO)의 길이 및 GC 양 및 타겟 뉴클레오타이드 서열을 포함한 다양한 인자에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 상대적으로 짧은 올리고뉴클레오타이드를 이용하는 경우, 낮은 엄격조건(stringent condition)을 선택하는 것이 바람직하다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 TO가 5'-태깅 부위 및 3'-타겟팅 부위를 포함하는 경우, 선택적으로, 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 TO의 3'-타겟팅 부위의 5'-일부와 부분적으로 겹치는 서열(partial-overlapped sequence)을 가질 수 있다. 예컨대, 겹치는 서열은 1 내지 10 뉴클레오타이드 길이이며, 구체적으로 1 내지 5 뉴클레오타이드, 보다 구체적으로 1 내지 3 뉴클레오타이드이다. 업스트림 올리고뉴클레오타이드가 TO의 3'-타겟팅 부위의 5'-일부와 부분적으로 겹치는 서열(partial-overlapped sequence)을 갖는 경우, 상기 TO의 절단 반응에서 3'-타겟팅 부위는 5'-태깅 부위와 함께 부분적으로 절단된다. 또한, 겹치는 서열은 3'-타겟팅 부위의 원하는 특정 위치가 절단되도록 한다.
일 구현예에 따르면, 업스트림 프라이머는 그의 연장가닥을 통하여 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 TO의 절단을 유도한다.
업스트림 올리고뉴클레오타이드가 타겟 핵산 서열에 혼성화된 TO의 절단을 유도하여 TO의 태깅 부위 또는 TO의 태깅 부위의 일부를 포함하는 타겟 의존적 단편이 방출되는 한, 업스트림 올리고뉴클레오타이드에 의한 절단반응 관련 종래 기술들은 본 개시에 적용될 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 제5,210,015호, 제5,487,972호, 제5,691,142호, 제5,994,069호, 제7,381,532호 및 미국 출원 공개번호 제2008-0241838호는 본 발명에 응용할 수 있다.
TO의 절단 위치는 업스트림 올리고뉴클레오타이드(업스트림 프로브 또는 업스트림 프라이머)의 종류, 업스트림 올리고뉴클레오타이드의 혼성화 위치 및 절단 조건에 따라 다양해진다(참조 미국 특허 제5,210,015호, 제5,487,972호, 제5,691,142호, 제5,994,069호 및 제7,381,532호 또는 미국 출원 공개번호 제2008-0241838호).
일 구현예에 있어서, TO의 절단 위치는 태깅 부위의 위치, 예컨대, 타겟팅 부의의 5'-, 3'- 또는 중앙에 위치하는지에 따라 다양해질 수 있다. 예컨대, 상기 TO가 5'-태깅 부위 및 3'-타겟팅 부위를 포함하는 경우, 절단 반응에서 세 가지 절단 위치가 있을 수 있다. 첫 번째 절단 위치는 TO의 혼성화 부위(3'-타겟팅 부위) 및 비-혼성화 부위(5'-태깅 부위) 간의 정션 위치(junction site)이다. 두 번째 절단 위치는 TO의 태깅 부위의 3'-말단으로부터 3'-방향으로 일부 뉴클레오타이드 이격된 위치이다. 두 번째 절단 위치는 TO의 3'-타겟팅 부위의 5'-말단 일부에 위치할 수 있다. 세 번째 절단 위치는 TO의 5'-태깅 부위의 3'-말단으로부터 5'-방향으로 일부 뉴클레오타이드 이격된 위치이다. 또 다른 예로, 상기 TO가 5'-타겟팅 부위 및 3'-태깅 부위를 포함하는 경우, 절단 위치는 (i) TO의 혼성화 부위(5'-타겟팅 부위) 및 비-혼성화 부위(3'-태깅 부위) 간의 정션 위치(junction site), (ii) TO의 태깅 부위의 5'-말단으로부터 5'-방향으로 일부 뉴클레오타이드 이격된 위치(즉, TO의 5'-타겟팅 부위의 3'-말단 일부에 위치) 및/또는 (iii) TO의 3'-태깅 부위의 5'-말단으로부터 3'-방향으로 일부 뉴클레오타이드 이격된 위치일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 방법은 다운스트림 프라이머의 존재 하에서 실시할 수 있다. 상기 다운스트림 프라이머는 역방향(reverse) 프라이머로도 지칭될 수 있다. 다운스트림 프라이머는 업스트림 프라이머 및 TO가 혼성화되는 타겟 핵산 가닥에 상보적인 다른 핵산 가닥에 혼성화된다. 특히, 다운스트림 프라이머는 TO가 혼성화된 타겟 핵산 가닥의 부위에 상보적인 다른 핵산 가닥의 부위와 비교하여 3'-방향에 있는 특정 부위에 혼성화된다. 다운스트림 프라이머는 TO가 혼성화될 수 있는 타겟 핵산 서열을 추가적으로 생성시켜 본 발명의 검출 민감도를 향상시킨다.
일 구현예에 있어서, 업스트림 프라이머 및 다운스트림 프라이머를 이용하는 경우, 프라이머의 연장을 위하여 추가적으로 주형-의존적 핵산 중합효소를 사용할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 주형-의존적 핵산 중합효소 및 상기 뉴클레아제 활성을 갖는 효소는 동일 효소일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 주형-의존적 핵산 중합효소 및 상기 뉴클레아제 활성을 갖는 효소는 서로 상이한 효소일 수 있다.
상기 TO의 절단 반응에 의해 방출된 타겟 의존적 단편은 상기 하나 이상의 합성 비자연 염기를 포함한다.
본 명세서에서 뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 TO의 절단을 언급하면서 사용하는 용어 "TO의 태깅 부위 또는 이의 일부 서열을 포함하는 타겟 의존적 단편"은 (i) 태깅 부위, (ii) 태깅 부위의 일부, (iii) 5'- 태깅 부위 및 3'-타겟팅 부위의 5'-말단 일부 및 (iv) 5'-타겟팅 부위의 3'-말단 및 3'-태깅 부위를 포함하는 의미로 사용된다.
본 명세서에서 TO의 태깅 부위의 일부, 타겟팅 부위의 일부 및 FHO의 캡처링 부위의 일부와 같이, TO 또는 FHO를 언급하면서 사용되는 용어 "일부(part)"는 1 내지 40, 1 내지 30, 1 내지 20, 1 내지 15, 1 내지 10 또는 1 내지 5 뉴클레오타이드로 구성된 뉴클레오타이드 서열을 의미하며, 구체적인 예로, 1, 2, 3 또는 4 뉴클레오타이드일 수 있다.
단계 (b) : 이합체의 형성
이어서, 상기 타겟 핵산 서열의 존재에 의존적으로 TO로부터 절단되어 방출된 타겟 의존적 단편은 단편-혼성화 올리고뉴클레오타이드(Fragment-Hybridizing Oligonucleotide; FHO)와 반응하여 이합체를 형성한다.
일 구현예에 있어서, 상기 FHO는 (i) 3'에서 5' 순서로 상기 타겟 의존적 단편에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 상기 타겟 의존적 단편 및 상기 TO의 타겟팅 부위에 대한 비-혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하는 제1 형태의 FHO이거나 또는 (ii) 상기 타겟 의존적 단편에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위를 포함하는 제2 형태의 FHO일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 제1 형태의 FHO 또는 제2 형태의 FHO의 캡처링 부위는 상기 타겟 의존적 단편에서의 제1 합성 비자연 염기와 염기쌍을 이룰 수 있는 제2 합성 비자연 염기를 포함한다.
본 개시에서 사용되는 비자연 염기쌍은 비자연 염기들 간에 형성된 염기쌍을 의미한다. 구체적으로, 본 개시에서 사용되는 비자연 염기쌍은 왓슨-크릭 염기쌍(Watson-Crick base-pairing) 과는 다른 결합 친화성(binding affinity)을 나타내는 합성 비자연 염기들 간에 형성된 비자연 염기쌍을 의미한다.
일 구현예에 있어서, 본 개시에서 사용되는 상기 합성 비자연 염기들 간에 형성된 비자연 염기쌍은 자연 염기들 간에 형성된 자연 염기쌍 보다 결합 친화성이 높으며(Zunyi Yang, et al., Nucleic Acids Research, Vol. 34, No. 21, 2006), 이로 인해, 상기 제1 합성 비자연 염기를 포함하는 타겟 의존적 단편과 상기 제2 합성 비자연 염기를 포함하는 제1 형태의 FHO 또는 제2 형태의 FHO 간의 결합 친화성이 증가한다. 소정의 혼성화 조건하에서, 상기 합성 비자연 염기는 이에 상보적인 합성 비자연 염기와 비자연 염기쌍을 형성할 수 있다. 또한, 왓슨-크릭 쌍 규칙을 따르지 않는 비자연 염기쌍을 포함할 수 있다. 예컨대, 자연 염기쌍과는 상이한 결합 방법(예컨대, 비-수소 결합 등)에 의해 자연 염기쌍과는 다른 결합 친화성을 나타내는 것을 포함하는 의미로 사용될 수 있다.
일반적으로, 왓슨-크릭 쌍 규칙(Watson-Crick pairing rules)은 (i) 크기 상보성(크기가 큰 퓨린과 크기가 작은 피리미딘 쌍) 및 (ii) 수소 결합 상보성(수소 결합 공여체와 수소 결합 수용체의 쌍)의 두 가지 상보성 규칙을 따른다 (US 10,865,431).
본원에서 사용되는 표현 "비자연 염기쌍은 왓슨-크릭 염기쌍과는 다른 결합 친화성을 나타낸다"는 것은 G-C 및 A-T(U)와 같은 자연적 염기들 간에 생성되는 왓슨-크릭 염기쌍(Watson-Crick base-pairing)과 비교하여, 상기 비자연 염기쌍 간의 수소 결합의 수, 수소 결합의 세기 등이 상이하여, 자연 염기쌍의 결합 친화성과는 상이한 결합 친화성을 나타내는 것을 의미한다.
일 구현예에 있어서, 상기 비자연 염기쌍은 G-C 및 A-T(U)와 같은 자연적 염기들 간에 생성되는 왓슨-크릭 염기쌍(Watson-Crick base-pairing)과는 다른 결합 친화성(binding affinity)을 나타내는 합성 비자연 염기들 간에 생성되는 왓슨-크릭 염기쌍을 포함한다.
상기 비자연 염기쌍의 예로는 US 5,432,272, US 5,965,364 US 6,001,983, US 6,037,120, US 6,140,496, US 6,627,456 및 US 6,617,106에서 제시한 8가지 유형의 비자연 염기로부터 형성되는 4가지 유형의 상호 독점적 쌍(mutually exclusive pair)을 포함할 수 있다. 상기 8가지 유형의 비자연 염기는 헤테로사이클 고리 시스템 및 수소 결합 패턴에 따라 구분되어지며, pyAAD(S), pyDDA(Z), pyADD(V), pyDAD(K), puDDA(B), puAAD(P), puDAA(J) 및 puADA(X)를 포함한다. 여기서, py는 피리미딘 유사(pyrimidine-like) 헤테로사이클 고리 시스템(heterocyclic ring system), pu는 퓨린 유사(purine-like) 헤테로사이클 고리 시스템, D는 수소 결합 공여체(hydrogen bond dornor) 그룹, A는 수소 결합 수용체(hydrogen bond acceptor) 그룹을 의미한다. 예컨대, 자연 염기쌍의 예인 C-G의 경우, pyDAA-puADD 쌍으로 표기할 수 있다. 상기 4가지 유형의 상호 독점적 쌍은 pyAAD-puDDA(S-B) 쌍, pyDDA-puAAD(Z-P) 쌍, pyADD-puDAA(V-J) 쌍 및 pyDAD-puADA(K-X) 쌍을 포함한다. 상기 8가지 유형의 비자연 염기는 각 유형별 헤테로사이클 고리 시스템(피리미딘 유사 또는 퓨린 유사)의 여부 및 수소 결합 공여체 그룹 및 수용체 그룹 여부를 만족하는 한 다양한 구조를 포함할 수 있다.
예컨대, 상기 S-B 쌍의 대표적인 예는 isoC-isoG가 있으며, isoC는 이소시토신(isocytosine) 또는 데옥시이소시토신(dexoyisocytosine)을 지칭하며, pyAAD 의 구조를 가진다. isoG는 이소구아노신(isoguanosine) 또는 데옥시이소구아노신(deoxyisoguanosine)을 지칭하며, puDDA 의 구조를 가진다. isoC-isoG 염기쌍에 관한 상세한 설명은 본원에 참고로 포함된 문헌[C. Y. Switzer, et al., Biochemistry, vol. 32, no. 39, pp. 10489-10496, 1993; J. A. Piccirilli et al., Nature, vol. 343, no. 6253, pp. 33-37, 1990; M. J. Moser et al., Clinical Chemistry, vol. 49, no. 3, pp. 407-414, 2003; Johnson SC et al., Nucleic Acids Res 2004, 32(6): 1937-1941]에서 확인될 수 있다.
Z-P의 대표적인 예로서, Z는 6-amino-5-nitro-3-(1'-β-D-2'-deoxyribofuranosyl)-2(1H)-pyridone일 수 있으며, P는 2-amino-8-(2'-deoxy-β-D-erythro-pentofuranosyl)-imidazo[1,2-a]-1,3,5-triazin-4(8H)-one일 수 있다. Z-P 염기쌍은 복제당 99.8%의 비자연 염기쌍 선택성을 나타내며, Taq DNA 중합효소를 사용한 PCR에서 증폭당 자연 염기 맞은편에 0.2%의 오혼입(misincorporation)을 나타낸다(Yang et al., 2007, 2011; Robert W. Molt. Jr. et al., Nucleic Acids Res.. 2017, 45(7): 3643-3653).
V-J의 대표적인 예로서, V는 6-aminopyrazin-2-one ring, J는 2'-deoxy-5-aza7-deazaisoguanosine일 수 있으며, K-X의 대표적인 예로서, K는 2,4-diaminopyrimidine, X는 2'-deoxyxanthosine일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 비자연 염기쌍은 수소 결합을 기반으로 하는 왓슨-크릭 염기쌍과는 다른, 비-수소 결합을 기반으로 하는 비자연 염기쌍도 포함할 수 있다. 예컨대, hydrophobic and shape complementary interaction에 기반한 비자연 염기쌍(예컨대, Q-Pa, Ds-Pa, Ds-Pn, Dss-Pn) 및 hydrophobic and packing interaction에 기반한 비자연 염기쌍(예컨대, 5SICS-MMO2, 5SICS-5FM, 5SICS-NaM)을 포함할 수 있다. 이에 관한 상세한 설명은 본원에 참고로 포함된 문헌[Filip Wojciechowski et al., Chem. Soc. Rev., 2011, 40, 5669-5679]에서 확인될 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 비자연 염기쌍은 S-B 염기쌍, Z-P 염기쌍, V-J 염기쌍, K-X 염기쌍, Pa-Ds 염기쌍, Pa-Q 염기쌍, Pn-Ds 염기쌍, Pn-Dss 염기쌍, Px-Ds 염기쌍, MMO2-5SICS 염기쌍, 5FM-5SICS 염기쌍 및 NaM-5SICS 염기쌍으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
본원에서 Pa는 pyrrole-2-carbaldehyde 을 지칭하고, Ds는 7-(2-thienyl)-imidazo[4,5-b]pyridine을 지칭하며, Q는 9-methyl-1-H-imidzo[(4,5-b)]pyridine, Pn은 2-nitropyrrole, Dss는 7-(2,2-bithien-5-yl)-imidazo[4,5-b]pyridine, Px는 2-nitro-4-propynylpyrrole, MMO2는 2-methoxy 4-methyl benzene, 5SICS는 5-Sulfo-isocarbostyril, 5FM은 5-fluoro-4-methyl-2-methoxybenzene, NaM는 2-methoxy naphthalene을 각각 지칭한다.
일 구현예에 있어서, 상기 제1 합성 비자연 염기는 S-B 염기쌍, Z-P 염기쌍, V-J 염기쌍, K-X 염기쌍, Pa-Ds 염기쌍, Pa-Q 염기쌍, Pn-Ds 염기쌍, Pn-Dss 염기쌍, Px-Ds 염기쌍, MMO2-5SICS 염기쌍, 5FM-5SICS 염기쌍 및 NaM-5SICS 염기쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 염기쌍 중 어느 하나의 염기일 수 있다.
일 구현에에 있어서, 제1 합성 비자연 염기는 사용하고자하는 비자연 염기쌍을 구성하는 2개의 비자연 염기 중에서 비자연 염기쌍에 대한 선택성(selectivity of an unnatural base pairing)을 고려하여, 2개의 비자연 염기 중 어느 하나를 제1 합성 비자연 염기로 선택할 수 있다. 구체적으로, 비자연 염기쌍 중 염기쌍에 대한 선택성이 높은 염기(즉, 상보적인 비자연 염기 이외의 자연 염기를 포함한 다른 염기와 염기쌍을 형성하는 빈도가 낮은 염기)를 제1 합성 비자연 염기로 사용하고, 나머지 염기를 제2 합성 비자연 염기로 사용할 수 있다. 예컨대, S-B 염기쌍 중 상대적으로 선택성이 높은 S(예컨대, iso-C)를 제1 합성 비자연 염기로 사용하고, 상대적으로 낮은 선택성을 가지는 B(예컨대, iso-G)를 제2 합성 비자연 염기로 사용할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 타겟 의존적 단편 및 FHO의 캡처링 부위는 하나 이상의 S-B 염기쌍을 포함할 수 있다.
일 예로서, 상기 타겟 의존적 단편은 하나 이상의 S를 포함하고, 상기 FHO의 캡처링 부위는 상기 S의 맞은편에 S의 상보적인 염기인 B를 포함할 수 있다. 다른 예로서, 상기 타겟 의존적 단편은 하나 이상의 B를 포함하고, 상기 FHO의 캡처링 부위는 상기 B의 맞은편에 S를 포함할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 타겟 의존적 단편 및 FHO의 캡처링 부위는 하나 이상의 Z-P 염기쌍을 포함한다.
일 예로서, 상기 타겟 의존적 단편은 하나 이상의 Z를 포함하고, 상기 FHO의 캡처링 부위는 상기 Z의 맞은편에 Z의 상보적인 염기인 P를 포함할 수 있다. 다른 예로서, 상기 타겟 의존적 단편은 하나 이상의 P를 포함하고, 상기 FHO의 캡처링 부위는 상기 P의 맞은편에 Z를 포함할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 타겟 의존적 단편 및 FHO의 캡처링 부위는 하나 이상의 V-J 염기쌍을 포함한다.
일 예로서, 상기 타겟 의존적 단편은 하나 이상의 V를 포함하고, 상기 FHO의 캡처링 부위는 상기 V의 맞은편에 V의 상보적인 염기인 J를 포함할 수 있다. 다른 예로서, 상기 타겟 의존적 단편은 하나 이상의 J를 포함하고, 상기 FHO의 캡처링 부위는 상기 J의 맞은편에 V를 포함할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 타겟 의존적 단편 및 FHO의 캡처링 부위는 하나 이상의 K-X 염기쌍을 포함한다.
일 예로서, 상기 타겟 의존적 단편은 하나 이상의 K를 포함하고, 상기 FHO의 캡처링 부위는 상기 K의 맞은편에 K의 상보적인 염기인 X를 포함할 수 있다. 다른 예로서, 상기 타겟 의존적 단편은 하나 이상의 X를 포함하고, 상기 FHO의 캡처링 부위는 상기 X의 맞은편에 K를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 타겟 의존적 단편 및 FHO의 캡처링 부위는 하나 이상의 Ds-Px 염기쌍을 포함한다.
Ds-Px 염기쌍은 제3 염기쌍으로서 PCR 증폭에서 높은 효율 및 선택성을 나타낸다(Michiko Kimoto et al., Journal of Nucleic Acids, Vol. 2012). Ds-Px 염기쌍의 선택성은 엑소뉴클레아제-능숙 Deep Vent DNA 중합효소에 의해, 99.77%-99.92%인 것으로 보고되었다(Rie Yamashige et al., Nucleic Acids Research,, 2011, 40(6):2793-2806).
일 예로서, 상기 타겟 의존적 단편은 하나 이상의 Ds를 포함하고 상기 FHO의 캡처링 부위는 상기 Ds의 맞은편에 Px를 포함한다. 다른 예로서, 상기 타겟 의존적 단편은 하나 이상의 Px를 포함하고 상기 FHO의 캡처링 부위는 상기 Px의 맞은편에 Ds를 포함한다.
일 구현예에서, 상기 타겟 의존적 단편 및 FHO의 캡처링 부위는 하나 이상의 5SICS-MMO2 염기쌍을 포함한다.
5SICS-MMO2 염기쌍은 OneTaq (Taq 및 엑소뉴클레아제-능숙 Deep Vent DNA 중합효소의 혼합물)을 사용한 PCR에서 99.9% 선택성을 나타낸다(Malyshev et al., 2009, 2012). 5SICS-MMO2 염기쌍의 오혼입 비율은 염기당 복제당 0.01-0.1%이다.
일 예로서, 상기 타겟 의존적 단편은 하나 이상의 5SICS를 포함하고 상기 FHO의 캡처링 부위는 상기 5SICS의 맞은편에 MMO2를 포함한다. 다른 예로서, 상기 타겟 의존적 단편은 하나 이상의 MMO2를 포함하고 상기 FHO의 캡처링 부위는 상기 MMO2의 맞은편에 5SICS를 포함한다.
일 구현예에 있어서, 상기 단계 (b)의 반응은 상기 타겟 의존적 단편을 상기FHO의 캡처링 부위에 혼성화시키는 반응을 포함한다.
상기 타겟 의존적 단편과 FHO의 캡처링 부위의 혼성화는 최적화 절차에 의하여 일반적으로 결정되는 적합한 혼성화 조건 하에서 실시될 수 있다. 특히, 상기 타겟 의존적 단편 및 FHO의 캡처링 부위에 포함된 제1 합성 비자연 염기 및/또는 제2 합성 비자연 염기가 자연적 염기와는 염기쌍을 형성하지 않고, 제1 합성 비자연 염기와 제2 합성 비자연 염기 간의 염기쌍을 형성하는 조건 하에서 실시될 수 있다.
상기 비자연 염기쌍을 구성하는 제1 합성 비자연 염기는 제2 합성 비자연 염기와만 혼성화되므로, 상기 TO의 태깅 부위 및 FHO의 캡처링 부위에 비자연 염기쌍의 도입은 타겟 의존적 단편의 FHO에 대한 결합 특이성을 증가시키고 타겟 의존적 단편이 FHO 이외의 비타겟 핵산 서열에 혼성화할 가능성을 낮춘다. 이는 결국 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널을 증가시킬 수 있고 검출 민감도를 증가시킬 수 있다.
또한, 타겟 의존적 단편 및 FHO의 캡처링 부위에 포함되어 있는 비자연 염기쌍은 상기 타겟 의존적 단편 및 FHO의 캡처링 부위 사이의 혼성화물의 멜팅 온도를 상승시키며, 즉 타겟 의존적 단편 및 FHO의 캡처링 부위 사이의 결합 친화성을 향상시킨다.
따라서, 비자연 염기쌍을 포함하는 타겟 의존적 단편 및 FHO의 캡처링 부위 사이의 혼성화물은 상기 비자연 염기쌍을 포함하지 않는 타겟 의존적 단편 및 FHO의 캡처링 부위 사이의 혼성화물과 비교하여 더 높은 멜팅 온도 및 결합 친화성을 갖는다.
상기 비자연 염기쌍을 포함하는 타겟 의존적 단편 및 FHO의 캡처링 부위 사이의 증가된 결합 친화성은 FHO의 캡처링 부위에 혼성화된 타겟 의존적 단편의 연장 효율을 높이고 이는 결국 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널의 증가 및 검출 민감도의 증가로 이어질 수 있다.
한편, 상기 TO의 태깅 부위 및 FHO의 캡처링 부위에 비자연 염기쌍의 도입은 TO의 태깅 부위의 Tm을 유지하면서 길이를 축소시킬 수 있다. 즉, 제1 합성 비자연 염기를 포함하는 TO의 태깅 부위는 합성 비자연 염기를 포함하지 않는 종래의 TO의 태깅 부위보다 더 짧은 길이를 가질 수 있다.
상기 길이가 축소된 TO의 태깅 부위와 비타겟 핵산 서열과의 혼성화 효율은 길이가 긴 TO의 태깅 부위와 비타겟 핵산 서열과의 혼성화 효율에 비해 미스매치로 인한 영향을 더 많이 받으므로, 길이가 긴 타겟 의존적 단편이 비타겟 핵산 서열에 혼성화할 확률보다 길이가 짧은 타겟 의존적 단편이 비타겟 핵산 서열에 혼성화할 확률이 더 낮다. 따라서, 길이가 짧은 TO의 태깅 부위를 사용하는 것은 비타겟과의 혼성화를 방지할 수 있고, 이는 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널의 증가로 이어질 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 제1 이합체 또는 제2 이합체의 Tm 값은 상기 제1 이합체 또는 제2 이합체에 포함된 제1 합성 비자연 염기 및 제2 합성 비자연 염기가 자연 염기로 치환된 이합체의 Tm 값 대비 0.5 내지 10℃ 이상 높다.
일 구현예에 있어서, 상기 단계 (b)의 반응은 주형-의존적 핵산 중합효소에 의한 연장 반응을 포함할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 FHO가 제1 형태의 FHO일 경우, 상기 타겟 의존적 단편은 상기 제1 형태의 FHO의 캡처링 부위에 혼성화 및 연장반응을 통하여 상기 FHO의 템플레이팅 부위와 상보적인 연장서열을 포함하는 연장가닥을 생성하고, 이에 따라 연장가닥과 제1 형태의 FHO 간의 제1 이합체를 형성할 수 있다. 상기 제1 형태의 FHO의 캡처링 부위에 혼성화된 비절단 TO는 연장되지 않고, 따라서 연장가닥을 형성하지 않는다.
상기 제1 형태의 FHO의 캡처링 부위에 혼성화된 타겟 의존적 단편은 제1 형태의 FHO의 템플레이팅 부위를 주형으로 하여 주형-의존적 핵산 중합효소의 활성에 의해 연장될 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 TO 및/또는 상기 FHO는 연장이 되지 않도록 그의 3'-말단이 블록킹되어 있다.
상기 타겟 의존적 단편의 연장반응과 관련하여 사용된 용어 "연장서열", "연장가닥" 및 "제1 이합체"는 다음의 의미를 갖는다:
본원에서 사용된 용어 "연장서열(extended sequence)"은 제1 형태의 FHO의 캡처링 부위에 혼성화된 타겟 의존적 단편으로부터 연장반응을 통해 새롭게 연장된 서열을 지칭한다. 또한, 상기 연장서열은 하기 설명할 연장가닥에서 타겟 의존적 단편을 제외한 부분을 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "연장가닥(extended strand)"은 상기 타겟 의존적 단편과 상기 연장서열을 포괄하는 서열을 지칭한다. 또한, 상기 연장가닥은 하기 설명할 제1 이합체에서 제1 형태의 FHO를 제외한 부분을 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "제1 이합체"는 상기 연장가닥과 상기 제1 형태의 FHO 간의 혼성화물 또는 이합체(서열간의 상보성을 통함)를 의미한다. 다시 말하면, 제1 이합체는 타겟 의존적 단편 및 연장서열로 구성된 연장가닥과 제1 형태의 FHO 간의 이합체를 의미한다.
단계 (b)에서 이용되는 주형-의존적 핵산 중합효소는 어떠한 핵산 중합효소도 포함되며, 예컨대, Escherichia coli DNA 중합효소 I의 "클레나우" 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 특히, 주형-의존적 핵산 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, Thermus antranikianii, Thermus caldophilus, Thermus chliarophilus, Thermus flavus, Thermus igniterrae, Thermus lacteus, Thermus oshimai, Thermus ruber, Thermus rubens, Thermus scotoductus, Thermus silvanus, Thermus species Z05, Thermus species sps 17, Thermus thermophilus, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana 및 Thermosipho africanus, Thermococcus litoralis, Thermococcus barossi, Thermococcus gorgonarius, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosiphoafricanus, Pyrococcus furiosus(Pfu), Pyrococcus woesei, Pyrococcus horikoshii, Pyrococcus abyssi, Pyrodictium occultum, Aquifex pyrophilus and Aquifex aeolieus를 포함한다. 보다 구체적으로, 주형-의존적 핵산 중합효소는 Taq 중합효소이다.
일 구현예에 있어서, 주형-의존적 핵산 중합효소는 역전사효소를 포함한다.
일 구현예에 있어서, 상기 FHO가 제2 형태의 FHO일 경우, 상기 타겟 의존적 단편은 상기 제2 형태의 FHO의 캡처링 부위와 혼성화되어 제2 이합체를 형성할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 방법은 상기 단계 (a)에서 상기 TO가 절단되어 방출된 타겟 의존적 단편과 제2 형태의 FHO 간의 혼성화에 의해 제2 이합체를 형성할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 방법은 상기 TO의 태깅 부위와 제2 형태의 FHO가 먼저 혼성화되어 이중-가닥 형태를 형성하고, 이어서 뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 TO의 절단반응을 통해 제2 이합체를 형성할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 제2 형태의 FHO는 TO의 태깅 부위의 말단에 연결되어 있는 형태일 수 있다. 예컨대, 하나의 올리고뉴클레오타이드가 TO의 태깅 부위 및 제2 형태의 FHO를 포함할 수 있다. 이러한 경우, TO의 태깅 부위 및 제2 형태의 FHO 간의 혼성화는 헤어핀 구조를 형성할 수 있다.
상기 용어 '헤어핀'은 이중-가닥의 '스템(stem)' 영역 및 단일 가닥의 '루프(loop)' 영역을 갖는 올리고뉴클레오타이드의 구조를 가리킨다.
본원에서 사용된 용어 "제2 이합체"는 상기 타겟 의존적 단편과 제2 형태의 FHO의 캡처링 부위 간의 혼성화물 또는 이합체(서열간의 상보성을 통함)를 의미한다. 비절단된 TO의 태깅부위와 제2 형태의 FHO의 캡처링 부위 간의 혼성화물 또는 이합체는 제2 이합체에 포함되지 않는다.
일 구현예에 있어서, 상기 단계 (a)에서 이용되는 뉴클레아제 활성을 갖는 효소(특히, 5'뉴클레아제 활성을 갖는 효소), 상기 단계 (a)의 업스트림 프라이머를 연장하기 위한 주형-의존적 핵산 중합효소 및 단계 (b)의 타겟 의존적 단편을 연장하기 위한 주형-의존적 핵산 중합효소는 전부 상이할 수 있거나, 일부 동일하거나, 전부 동일할 수 있다.
단계 (c) : 제1 이합체에서의 연장 가닥 또는 제2 이합체 존재의 검출
마지막으로, 제1 이합체에서의 상기 연장 가닥의 존재 또는 제2 이합체의 존재를 검출한다. 상기 제1 이합체에서의 상기 연장 가닥의 존재 또는 제2 이합체의 존재는 타겟 핵산 서열의 존재를 나타낸다.
일 구현예에 있어서, 상기 타겟 핵산 서열은 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널을 검출함으로써 검출할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널"은 백그라운드 시그널의 강도 또는 타겟 핵산의 부재시에 제공될 수 있는 시그널의 강도를 초과하는 강도를 갖는 시그널을 의미하거나, 제공된 시그널의 강도로부터 백그라운드 시그널의 강도 또는 타겟 핵산 서열의 부재시에 제공될 수 있는 시그널의 강도를 차감한 후의 강도를 갖는 시그널을 의미한다.
일 구현예에 있어서, 상기 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널은 제1 이합체에서의 상기 연장 가닥의 존재 또는 제2 이합체의 존재를 나타낼 수 있는 모든 시그널을 포함한다. 예를 들어, 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널은 표지로부터의 시그널(시그널 발생 또는 소멸), 표지로부터의 시그널의 변화(시그널 증가 또는 감소), 멜팅 커브, 멜팅 패턴 및 멜팅 온도(또는 Tm 값)를 포함한다.
일 구현예에 있어서, 단계 (c)는 제1 이합체에서의 연장 가닥의 존재를 나타내는 시그널 또는 제2 이합체의 존재를 나타내는 시그널을 검출함으로써 달성될 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 방법은 이합체의 형성에 의존적인 방식으로 표지로부터 시그널을 제공할 수 있다. 상기 시그널을 검출하여, 상기 타겟 핵산 서열의 존재를 검출할 수 있다. 상기 이합체는 제1 이합체 또는 제2 이합체 뿐만 아니라, 이들의 존재에 의존적으로 형성된 제3 이합체를 포함한다.
일 구현예에 따르면, 상기 시그널의 제공은 표지로부터 "시그널 발생 또는 소멸" 및 "시그널 증가 또는 감소"를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "이합체(duplex)"는 결합된 형태의 이합체(duplex in associated form) 및 해리된 형태의 이합체(duplex in dissociated form)를 포괄하는 의미로 사용될 수 있다. 즉, 부분적 또는 전체적으로 서로 상보적인 서열을 포함하고 있어 혼성화 조건하에서 서로 혼성화되어 이합체(혼성화물) 구조를 가질 수 있는 두 개의 단일-가닥 핵산 분자를 지칭할 수 있다. 예컨대, 상기 이합체는 온도에 따라, 결합된 형태의 이합체로 존재하거나, 해리된 형태의 이합체로 존재하거나, 또는 일부는 결합된 형태의 이합체로 존재하고 나머지는 해리된 형태의 이합체로 존재할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 방법은 이합체의 결합(association) 또는 해리(dissociation)에 의존적인 방식으로 시그널을 제공할 수 있으며, 상기 시그널을 검출하여, 상기 타겟 핵산 서열의 존재를 검출할 수 있다. 예컨대, 결합된 형태의 이합체는 시그널을 소광(또는 발광)시키고, 해리된 형태의 이합체는 시그널을 발광(또는 소광)시켜, 결합된 상태와 해리된 상태에서 상이한 시그널을 제공할 수 있는 이합체를 이용하여 타겟 핵산 서열의 존재를 검출할 수 있다.
용어 "결합(association) 또는 해리(dissociation)"는 용어 "혼성화 또는 변성"과 동일한 의미를 갖는다.
특정 구현예에 있어서, 상기 방법은 이합체의 절단에 의존적인 방식으로 시그널을 제공할 수 있으며, 상기 시그널을 검출하여, 상기 타겟 핵산 서열의 존재를 검출할 수 있다. 상기 절단되는 이합체는 제1 이합체 또는 제2 이합체 뿐만 아니라, 이들의 존재에 의존적으로 형성된 제3 이합체를 포함한다.
일 구현예에 있어서, 상기 표지는 단일 표지 및/또는 상호작용적 표지일 수 있다.
상호작용적 표지 시스템의 대표적 예로서, FRET(fluorescence resonance energy transfer) 표지 시스템은 형광 리포터 분자(공여체 분자) 및 퀀처 분자(수용체 분자)를 포함한다. FRET에서, 에너지 공여체는 형광성이나, 에너지 수용체는 형광성 또는 비-형광성일 수 있다. 상호작용적 표지 시스템의 다른 형태에서, 에너지 공여체는 비-형광성, 예컨대, 크로모포어(chromophore)이고 에너지 수용체는 형광성이다. 상호작용적 표지 시스템의 또 다른 형태에서, 에너지 공여체는 발광성(luminescent), 예컨대, 생물발광성, 화학발광성 또는 전기화학발광성이며 수용체는 형광성이다. 공여체 분자 및 수용체 분자는 본 개시에서 각각 리포터 분자 및 퀀처 분자로 기술될 수 있다. 상호작용적 이중표지는 접촉-매개된 퀀칭에 기초하여 검출가능한 시그널을 제공하는 표지 쌍을 포함한다(Salvatore 등., Nucleic Acids Research, 2002 (30) no.21 e122 및 Johansson 등., J. AM. CHEM. SOC 2002 (124) pp 6950-6956). 본 개시에서, 상기 상호작용적 표지 시스템은 최소 2개 분자들(예컨대, 염료들)간의 상호작용에 의한 시그널 변화를 유도하는 모든 경우들을 포함한다.
상호작용적-이중표지로서 유용한 리포터 분자 및 퀀처 분자는 당업계에 알려진 어떠한 분자도 포함할 수 있다. 그 예는 다음과 같다: Cy2™(506), YO-PRO™-1 (509), YOYO™-1 (509), Calcein (517), FITC (518), FluorX™ (519), Alexa™ (520), Rhodamine 110 (520), Oregon Green™ 500 (522), Oregon Green™ 488 (524), RiboGreen™ (525), Rhodamine Green™ (527), Rhodamine 123 (529), Magnesium Green™(531), Calcium Green™ (533), TO-PRO™-1 (533), TOTO1 (533), JOE (548), BODIPY530/550 (550), Dil (565), BODIPY TMR (568), BODIPY558/568 (568), BODIPY564/570 (570), Cy3™ (570), Alexa™ 546 (570), TRITC (572), Magnesium Orange™ (575), Phycoerythrin R&B (575), Rhodamine Phalloidin (575), Calcium Orange™(576), Pyronin Y(580), Rhodamine B (580), TAMRA (582), Rhodamine Red™ (590), Cy3.5™ (596), ROX (608), Calcium Crimson™ (615), Alexa™ 594 (615), Texas Red(615), Nile Red (628), YO-PRO™-3 (631), YOYO™-3 (631), Rphycocyanin (642), C-Phycocyanin (648), TO-PRO™-3 (660), TOTO3 (660), DiD DilC(5) (665), Cy5™(670), Thiadicarbocyanine (671), Cy5.5 (694), HEX (556), TET (536), Biosearch Blue (447), CAL Fluor Gold 540 (544), CAL Fluor Orange 560 (559), CAL Fluor Red 590 (591), CAL Fluor Red 610 (610), CAL Fluor Red 635 (637), FAM (520), Fluorescein (520), Fluorescein-C3 (520), Pulsar 650 (566), Quasar 570 (667), Quasar 670 (705) 및 Quasar 705 (610). 괄호의 숫자는 나노미터 단위로 표시한 최대 발광 파장이다. 구체적으로, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 JOE, FAM, TAMRA, ROX 및 플루오레세인-기반 표지를 포함한다.
적합한 리포터-퀀처 쌍은 다음과 같이 다양한 문헌에 개시되어 있다: Pesce 등, editors, Fluorescence Spectroscopy (Marcel Dekker, New York, 1971); White 등, Fluorescence Analysis: A Practical Approach (Marcel Dekker, New York, 1970); Berlman, Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules, 2nd Edition (Academic Press, New York, 1971); Griffiths, Color AND Constitution of Organic Molecules (Academic Press, New York, 1976); Bishop, editor, Indicators (Pergamon Press, Oxford, 1972); Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (Molecular Probes, Eugene, 1992); Pringsheim, Fluorescence and Phosphorescence (Interscience Publishers, New York, 1949); Haugland, R. P., Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 6th Edition (Molecular Probes, Eugene, Oreg., 1996); 미국 특허 제3,996,345호 및 제4,351,760호.
본 발명에서, 광범위 파장 또는 특정 파장의 형광을 퀀칭할 수 있는 비-형광 블랙 퀀처 분자가 이용될 수 있다는 것은 주목할 만하다. 비-형광 블랙 퀀처 분자의 예는 BHQ 및 DABCYL이다.
본 개시에 적용되는 FRET 표지에서, 리포터는 FRET의 공여체를 포함하고 퀀처는 FRET의 나머지 파트너(수용체)를 포함한다. 예를 들어, 플루오레세인 염료(fluorescein dye)는 리포터로 이용되고 로다민 염료(rhodamine dye)는 퀀처로 이용된다.
상기 표지는 종래의 방법을 통해 TO 및/또는 FHO에 연결될 수 있다. 구체적으로, 상기 표지는 탄소원자를 포함하는 스페이서(예컨대, 3-카본 스페이서, 6-카본 스페이서 또는 12-카본 스페이서)를 통해 TO 및/또는 FHO에 연결된다.
일 구현예에 있어서, 상기 상호작용적 표지는 최소 하나의 리포터 분자 및 최소 하나의 퀀처 분자를 포함할 수 있다. 예컨대, 하나의 리포터 분자 및 하나의 퀀처 분자를 포함하거나 또는 하나의 리포터 분자 및 두 개의 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 표지일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 단일 표지는 그 표지가 이중 가닥에 존재하는지 또는 단일 가닥에 존재하는지에 따라 상이한 시그널을 제공할 수 있어야 한다. 상기 단일 표지는 형광 표지, 발광 표지, 화학발광 표지, 전기화학 표지 및 금속 표지를 포함한다. 구체적으로, 상기 단일 표지는 형광 표지를 포함한다.
본 개시에서 사용되는 단일 형광 표지의 종류 및 바람직한 결합 사이트는 미국 특허 제7,537,886호 및 제7,348,141호에 개시되어 있으며, 그의 교시 사항은 본 명세서에 참조로서 포함된다. 구체적으로, 상기 단일 형광 표지는 JOE, FAM, TAMRA, ROX 및 플루오레세인-기반 표지를 포함한다. 표지된 뉴클레오타이드 잔기는 5'-말단 또는 3'-말단보다 올리고뉴클레오타이드 내의 내부 뉴클레오타이드 잔기에 위치하는 것이 바람직하다.
본 개시에서 유용한 단일 형광 표지는 상기 서술한 리포터 및 퀀처 분자에 대한 설명을 참조하여 설명될 수 있다.
특히, 상기 방법이 단일 표지를 이용하여 고상에서 실시되는 경우, 일반적인 형광 표지를 이용할 수 있으며, 단일 표지가 이중 가닥에 존재하는지 또는 단일 가닥에 존재하는지에 따라 상이한 강도의 형광 시그널을 제공할 수 있는 특정 형광 표지를 요구하지는 않는다. 고상 기질에서 제공되는 타겟 시그널이 측정된다.
고상 기질 상에 고정된 FHO를 이용하는 경우, 화학 표지(예컨대, 바이오틴) 또는 효소 표지(예컨대, 알카라인 포스페이트, 퍼록시다제, β-갈락토시다제 및 β- 글루코시다제)를 이용할 수 있다.
본 개시는 타겟 핵산 서열의 존재를 검출하기 위하여, 제1 이합체 또는 제2 이합체의 형성과 관련된 시그널을 측정하는 것이다.
일 구현예에 있어서, 제1 이합체 또는 제2 이합체는 표지를 가지며 이에 의해 상기 제1 이합체 또는 제2 이합체는 시그널을 제공한다.
상기 단계 (c)에서의 제1 이합체에서의 연장 가닥의 존재 또는 제2 이합체 존재의 검출은 종래 공지된 다양한 방법에 의해 실시될 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 방법이 상기 제1 이합체를 형성하는 경우, 상기 단계 (c)에서 상기 제1 이합체에서의 상기 연장가닥의 존재의 검출은, 종래 공지된 다양한 방법에 의해 실시될 수 있다. 구체적으로, (i) 미리 정해진 온도에서 제1 이합체로부터의 시그널을 측정하거나, 또는 (ii) 멜팅 분석 또는 멜팅 후 혼성화 분석에 의해 제1 이합체로부터의 시그널을 측정함으로써 실시될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "멜팅 분석(melting analysis)"은 이합체의 멜팅에 의해 이합체의 존재를 나타내는 시그널을 얻는 방법을 의미하며, 두 가지 상이한 온도에서 시그널을 측정하는 방법, 멜팅 커브 분석, 멜팅 패턴 분석, 및 멜팅 피크 분석을 포함한다. 구체적으로, 멜팅 분석은 멜팅 커브 분석이다.
본 명세서에서 사용된 용어 "멜팅 후 혼성화 분석"은 이합체를 멜팅한 후 혼성화에 의해 이합체의 존재를 나타내는 시그널을 얻는 방법을 의미한다. 예컨대, 멜팅 후 혼성화 분석은 혼성화 커브 분석일 수 있다.
멜팅 커브 또는 혼성화 커브는, 예컨대, 미국 특허 제6,174,670호 및 제5,789,167호, Drobyshev 등, Gene 188:45(1997); Kochinsky 및 Mirzabekov, Human Mutation 19:343(2002); Livehits 등, J. Biomol. Structure Dynam. 11:783(1994); 및 Howell 등, Nature Biotechnology 17:87(1999)에서 설명하는 바와 같은 종래의 기술들에 의해 얻을 수 있다. 예를 들어, 멜팅 커브 또는 혼성화 커브는 혼성화 엄격도(stringency)의 파라미터에 대한 아웃풋 시그널(output signal) 변화의 그래픽 플롯(graphic plot) 또는 디스플레이(display)로 구성될 수 있다. 아웃풋 시그널은 혼성화 파라미터에 대하여 직접적으로 플롯팅을 할 수 있다. 전형적으로, 멜팅 커브 또는 혼성화 커브는, 예를 들어, Y-축에는 이합체 구조의 정도(즉, 혼성화 정도)를 나타내는 아웃풋 시그널, 예를 들면 형광이 플롯팅되고, X-축에는 혼성화 파라미터가 플롯팅될 것이다.
형광 vs. 온도의 1차 도함수(derivative)의 플롯, 즉, 형광 vs. 온도(dF/dT vs. T) 또는 (-dF/dT vs. T)에서 변화율 플롯은 멜팅 피크를 제공한다.
상기 검출 방법을 하기에 개략적으로 설명하기로 한다.
미리 정해진 온도에서 제1 이합체의 검출
일 구현예에 있어서, 단계 (c)에서의 검출은 연장가닥과 제1 형태의 FHO 간의 제1 이합체로부터의 시그널을 미리 정해진 온도에서 측정함으로써 실시된다.
일 예로서, 연장가닥의 존재는 제1 이합체의 이중 가닥을 유지(즉, 상기 제1 이합체가 결합된 형태의 이합체로 존재)하기에 충분한 미리 정해진 온도에서 제1 이합체로부터의 시그널을 측정함으로써 검출된다.
제1 이합체는 그 자체가 제1 이합체의 형성과 비-형성을 구별할 수 있는 시그널을 제공할 수 있으며, 상기 시그널은 제1 이합체가 이중-가닥 형태를 유지하는 미리 정해진 온도에서 검출되고, 이에 의해 타겟 핵산 서열의 존재가 결정된다.
본 개시는 타겟 핵산 서열의 존재를 검출하기 위하여, 제1 이합체 형성과 관련된 시그널을 측정하는 것이다.
일 구현예에 있어서, 상기 제1 이합체는 표지를 가지며 이에 의해 상기 제1 이합체는 시그널을 제공한다.
제1 이합체로부터 나오는 시그널의 기본적인 작동 원리는 다음과 같다: (i) 타겟 의존적 단편의 연장은 표지로부터의 시그널 변화를 유도하여 시그널을 제공하며; 또는 (ii) 타겟 의존적 단편 및 제1 형태의 FHO의 혼성화는 표지로부터의 시그널 변화를 유도하여 시그널을 제공하고, 상기 혼성화 후 연장에 의해 형성된 제1 이합체는 시그널을 유지한다.
예를 들어, 고정화된 제1 형태의 FHO를 이용하는 경우, 본 개시는 보다 효과적인 방식으로 다수의 타겟 핵산 서열을 검출한다. 고정화된 제1 형태의 FHO의 템플레이팅 부위는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 갖는다. 리포터 분자 및 퀀처 분자는 구조적으로 서로 근접하여 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭한다. 타겟 의존적 단편이 제1 형태의 FHO의 캡처링 부위에 혼성화되는 경우, 퀀처 분자는 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭한다. 이후 타겟 의존적 단편이 연장되어 제1 이합체를 형성하는 경우 리포터 분자 및 퀀처 분자는 구조적으로 서로 이격하게 되어 퀀처 분자는 리포터 분자로부터의 시그널을 언퀀칭한다. 따라서, 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널은 상기 연장 단계에서 제공된다.
특정 구현예에서, TO의 태깅 부위(및 타겟 의존적 단편)는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 갖는다. 리포터 분자 및 퀀처 분자는 구조적으로 서로 근접하여 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭한다. 타겟 핵산 서열에 혼성화된 TO는 절단되어, 리포터 분자 및 퀀처 분자를 갖는 태깅 부위를 포함하는 타겟 의존적 단편을 방출하고, 상기 타겟 의존적 단편은 제1 형태의 FHO의 캡처링 부위에 혼성화된다. 상기 혼성화에 의하여, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 구조적으로 서로 이격하게 되어 퀀처 분자는 리포터 분자로부터의 시그널을 언퀀칭한다. 시그널은 타겟 의존적 단편과 제1 형태의 FHO 간의 혼성화 단계에서 제공되고, 제1 이합체는 시그널을 유지한다.
TO의 태깅 부위(및 타겟 의존적 단편)가 리포터 분자 및 퀀처 분자를 갖는 경우, 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체도 제1 이합체의 퀀처 분자처럼 리포터 분자로부터의 시그널을 언퀀칭한다. 이러한 경우, 상기 미리 정해진 온도(즉, 시그널을 검출하는 온도)는 상기 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체는 일부 또는 모두가 해리된 형태의 이합체로 존재하게 하고 상기 제1 이합체는 일부 또는 모두가 결합된 형태의 이합체로 존재하게 하는 온도 범위에서 결정할 수 있다. 예컨대, 상기 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체는 모두 해리된 형태의 이합체로 존재하게 하고, 상기 제1 이합체는 일부 또는 모두가 결합된 형태의 이합체로 존재하게 하는 온도에서 시그널을 검출할 수 있다. 이러한 경우, 상기 검출된 시그널은 제1 이합체로부터 제공되는 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널이다. 다른 예로, 상기 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체 중 일부는 결합된 형태의 이합체로 존재하게 하고, 상기 제1 이합체는 모두 결합된 형태의 이합체로 존재하게 하는 온도에서 시그널을 검출할 수 있다. 이러한 경우, 상기 검출된 시그널은 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체로부터 제공되는 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널이다. 구체적으로, 상기 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체의 양은 제1 이합체가 형성됨에 따라 감소하며, 상기 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체로부터 제공되는 시그널 또한 감소하고, 이러한 시그널의 변화(즉, 시그널의 감소)는 타겟 핵산 서열의 존재를 나타낸다.
일 구현예에 따르면, 상기 시그널을 검출하는 온도는 이합체의 Tm 값을 고려하여 추가 결정된다.
일 구현예에 따르면, 미리 정해진 온도는 이합체의 Tm 값(두 가지 유형의 이합체가 생성되는 경우, 상기 두 유형 중에서 높은 Tm 값)에서 10℃ 뺀 온도보다 높고, 구체적으로 이합체의 Tm 값에서 5℃ 뺀 온도보다 높으며, 보다 구체적으로 이합체의 Tm 값보다 높은 온도이고, 보다 더 구체적으로 이합체의 Tm 값에서 5℃ 더한 온도보다 높다.
멜팅 또는 멜팅 후 혼성화 분석에 의한 제1 이합체의 검출
일 구현예에 따르면, 단계 (c)에서의 검출은 연장가닥과 제1 형태의 FHO 간의 제1 이합체로부터의 시그널을 멜팅 분석에 의해 측정하거나 멜팅 후 혼성화 분석에 의해 측정함으로서 실시된다.
일 구현예에 따르면, 단계 (c)에서 연장가닥의 존재의 검출은 멜팅 분석을 통해 실시되며, 멜팅분석에서 제1 이합체는 일정 범위의 온도에서 멜팅되어 연장가닥의 존재를 나타내는 시그널을 제공한다.
일 구현예에 따르면, 단계 (c)에서 연장가닥의 존재의 검출은 멜팅 후 혼성화 분석을 통해 실시된다. 예컨대, 단계 (c)에서 연장가닥의 존재의 검출은, 제1 이합체가 멜팅되고 그 결과물이 일정 범위의 온도에서 혼성화되어 연장가닥의 존재를 나타내는 타겟 시그널을 제공하는 혼성화 분석을 통해 실시한다.
전술한 미리 정해진 온도에서 제1 이합체의 검출 및 멜팅 분석 또는 멜팅 후 혼성화 분석에 의한 제1 이합체의 검출은 다음과 같은 다양한 분석 방법에 따라 실시될 수 있다: A. 제1 이합체의 검출; B. 제1 이합체의 절단의 검출; C. 연장가닥과 시그널링 올리고뉴클레오타이드 간의 이합체의 검출; D. 연장가닥과 시그널링 올리고뉴클레오타이드 간의 이합체의 절단의 검출; E. 제1 형태의 FHO와 혼성화 올리고뉴클레오타이드 간의 이합체의 검출; F. 연장가닥과 고정화된 고정화 올리고뉴클레오타이드 간의 이합체의 검출; 및 G. 제3 형태의 FHO를 사용한 제3 이합체의 검출.
상기 분석 방법을 하기에 상세히 설명한다.
A. 제1 이합체의 검출
일 구현예에 따르면, 단계 (c)에서의 검출은 연장가닥과 제1 형태의 FHO 간의 제1 이합체로부터의 시그널을 직접 이용하여 실시될 수 있다. 예컨대, PTOCE 분석을 기반으로 실시될 수 있다(참조 WO 2012/096523).
본 개시의 TO, 제1 형태의 FHO, 타겟 의존적 단편 및 제1 이합체는 전술한 PTOCE, PCEC, PCE-SH, PCE-SC, PCE-NH, PCE-IH 및 PTOCE-E와 같은 PTOCE 기반의 방법에서의 PTO(프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드), CTO(캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드), PTO 단편(즉, PTO의 태깅 부위) 및 연장이합체에 각각 대응될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 제1 이합체는 (i) 상기 타겟 의존적 단편 및/또는 제1 형태의 FHO에 연결된 최소 하나의 표지, (ii) 상기 연장반응 동안 상기 제1 이합체 내에 삽입된 표지, (iii) 상기 제1 형태의 FHO에 연결된 최소 하나의 표지와 상기 연장반응 동안 상기 제1 이합체 내에 삽입된 표지 또는 (iv) 인터컬레이팅 표지(intercalating label)에 의해 검출가능한 시그널을 제공하고, 상기 단계 (c)에서 상기 연장 가닥의 존재는 상기 제1 이합체로부터 제공되는 시그널을 측정함으로써 검출 될 수 있다.
PTOCE 분석의 원리에 관한 세부사항은 본원에 참조로 포함된 국제공개 WO 2012/096523호를 참조한다.
상기 PTOCE 분석 기반의 표지 시스템은 다음과 같이 설명될 수 있다:
(i) 상기 타겟 의존적 단편 및/또는 제1 형태의 FHO에 연결된 최소 하나의 표지
일 구현예에 따르면, 상기 시그널은 (i) 상기 타겟 의존적 단편 및/또는 상기 제1 형태의 FHO에 연결된 최소 하나의 표지에 의하여 제공된다.
상기 표지는 상호작용적 이중표지 및 단일 표지를 포함한다.
(i-1) 상호작용적 이중표지
일 구현예에 있어서, 제1 이합체의 존재(즉, 타겟 핵산 서열의 존재)를 나타내는 시그널은 상호작용적 표지 시스템에 의하여 제공되며, 특히 FRET 표지 시스템(즉, 상호작용적 이중표지 시스템)에 의해 제공된다.
구현예 1 (가닥 내 상호작용적-이중표지)
상호작용적 이중표지 시스템의 구현예 1에서, 타겟 의존적 단편 또는 FHO는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중표지를 가지며; 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자의 위치에 따라, 상기 타겟 의존적 단편과 상기 제1 형태의 FHO 간의 혼성화, 상기 연장가닥과 상기 제1 형태의 FHO 간에 제1 이합체의 형성, 또는 상기 제1 이합체의 멜팅 또는 멜팅 후 혼성화는 상기 상호작용적 이중표지로부터의 시그널의 변화를 초래하여 검출가능한 시그널을 제공한다. 상호작용적 이중표지 시스템의 구현예 1은 가닥 내 상호작용적-이중표지로 명명된다.
구현예 1-1 (제1 형태의 FHO 상의 가닥 내 상호작용적-이중표지)
구현예 1-1에 따르면, 제1 형태의 FHO는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중표지를 가지며, 상기 타겟 의존적 단편과 상기 제1 형태의 FHO 간의 혼성화, 상기 연장가닥과 상기 제1 형태의 FHO 간에 제1 이합체의 형성, 또는 상기 제1 이합체의 멜팅 또는 멜팅 후 혼성화는 상기 상호작용적 이중표지로부터의 시그널의 변화를 초래하여 검출가능한 시그널을 제공한다.
상기 구현예 1-1에 따르면, 타겟 의존적 단편이 제1 형태의 FHO에 혼성화시에, 제1 형태의 FHO에 혼성화된 타겟 의존적 단편이 연장되어 제1 이합체를 형성시에, 또는 상기 제1 이합체의 멜팅 또는 멜팅 후 혼성화시에, 리포터 분자 및 퀀처 분자 간의 구조적 간격에 변화가 야기되어 시그널(구체적으로, 시그널 발생)이 제공된다:
예를 들어, 타겟 의존적 단편이 제1 형태의 FHO의 캡처링 부위에 혼성화되기 전에는, 제1 형태의 FHO 상의 리포터 분자 및 퀀처 분자가 구조적으로 서로 근접하게 되어 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭하는데 반해; 상기 제1 형태의 FHO에 혼성화된 상기 타겟 의존적 단편이 연장되어 제1 이합체가 형성되는 경우에는, 제1 형태의 FHO 상의 리포터 분자 및 퀀처 분자가 구조적(conformationally)으로 이격되어 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 언퀀칭하고, 이에 의해 시그널(즉, 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널)이 제공된다. 나아가, 상기 제1 이합체가 멜팅되는 경우, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 구조적으로 서로 근접하게 되어 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭하며, 이에 의해 시그널이 제공되고; 상기 멜팅 후에 다시 혼성화하는 경우 리포터 분자 및 퀀처 분자가 다시 이격되어 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 언퀀칭하고, 이에 의해 시그널이 제공된다.
본 명세서에서 사용되는 표현 "리포터 분자 및 퀀처 분자가 구조적으로 근접한다"는 것은 올리고뉴클레오타이드(예컨대, TO, 타겟 의존적 단편 또는 FHO 등)의 형태적 구조, 예컨대 랜덤 코일(coli) 및 헤어핀 구조에 의해 리포터 분자 및 퀀처 분자가 3차원적으로 서로 근접하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 표현 "리포터 분자 및 퀀처 분자가 구조적으로 이격된다"는 것은 이중 가닥의 형성시 타겟 의존적 단편 또는 제1 형태의 FHO의 형태적 구조의 변화에 의하여 리포터 분자 및 퀀처 분자가 3차원적으로 이격되는 것을 의미한다.
일 구현예에 있어서, 타겟 의존적 단편과 제1 형태의 FHO 간의 이합체, 제1 이합체의 형성, 멜팅 또는 멜팅 후 혼성화에 따라 리포터 분자로부터의 시그널이 퀀칭되거나 또는 언퀀칭되는 한, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 제1 형태의 FHO의 어떠한 위치에도 위치할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 리포터 분자 및 퀀처 분자 모두는 제1 형태의 FHO의 템플레이팅 부위에 위치한다.
일 구현예에 있어서, 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 적어도 하나는 제1 형태의 FHO의 템플레이팅 부위에 위치한다.
일 구현예에 있어서, 리포터 분자 및 퀀처 분자 모두는 제1 형태의 FHO의 캡처링 부위에 위치한다.
일 구현예에 있어서, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 제1 형태의 FHO의 5'-말단 및 3'-말단에 위치한다.
일 구현예에 있어서, 리포터 분자 및 퀀처 분자 중의 하나는 제1 형태의 FHO의 5'-말단에 위치하거나 또는 5'-말단으로부터 1 내지 5 뉴클레오타이드 이격되어 위치하고, 다른 하나는 제1 형태의 FHO의 형태에 따라 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭 및 언퀀칭하도록 위치한다.
일 구현예에 있어서, 리포터 분자 및 퀀처 분자 중의 하나는 제1 형태의 FHO의 3'-말단에 위치하거나 또는 3'-말단으로부터 1 내지 5 뉴클레오타이드 이격되어 위치하고, 다른 하나는 제1 형태의 FHO의 형태에 따라 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭 및 언퀀칭하도록 위치한다.
일 구현예에 있어서, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 서로 최대 80 뉴클레오타이드, 구체적으로, 최대 60 뉴클레오타이드, 보다 구체적으로, 최대 30 뉴클레오타이드, 보다 더 구체적으로, 최대 25 뉴클레오타이드 이격되어 위치한다. 일 구현예에 있어서, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 최소 4 뉴클레오타이드, 구체적으로, 최소 6 뉴클레오타이드, 보다 구체적으로, 최소 10 뉴클레오타이드, 보다 더 구체적으로, 최소 15 뉴클레오타이드 이격되어 위치한다.
리포터 분자 및 퀀처 분자의 제1 형태의 FHO 상에서의 위치에 따라 시그널이 생성되는(시그널 변화가 초래되는) 시점이 달라질 수 있다.
일 예로서, 리포터 분자 및 퀀처 분자 모두가 제1 형태의 FHO의 템플레이팅 부위에 위치하고 이중 가닥의 형성시 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 언퀀칭하기에 충분할 정도로 리포터 분자와 퀀처 분자가 이격되어 있는 경우, 상기 단계 (b)에서 제1 이합체의 형성은 상기 상호작용적 이중표지로부터의 시그널의 변화를 초래하여 검출가능한 시그널을 제공할 수 있다.
다른 예로서, 리포터 분자 및 퀀처 분자 모두가 제1 형태의 FHO의 캡처링 부위에 위치하고 이중 가닥의 형성시 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 언퀀칭하기에 충분할 정도로 리포터 분자와 퀀처 분자가 이격되어 있는 경우, 상기 타겟 의존적 단편과 상기 제1 형태의 FHO 간의 혼성화는 상기 상호작용적 이중표지로부터의 시그널의 변화를 초래하여 검출가능한 시그널을 제공하고, 상기 제1 이합체의 형성은 시그널을 검출하는 온도에서 상기 시그널을 유지시킨다.
상기 구현예 1-1에서, 제1 형태의 FHO의 캡처링 부위가 상호작용적 이중표지로 표지되는 경우, 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체가 형성되어 시그널이 제공될 수 있다. 이 경우, 제1 이합체의 시그널과 상기 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체의 시그널은 (i) 상기 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체가 해리되게 하는 온도에서 시그널(제1 이합체로부터 제공되는 시그널)을 측정하거나, (ii) 상기 제1 이합체가 형성됨에 따라, 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체의 양이 감소하고, 이로 인해 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체로부터 제공되는 시그널의 변화를 측정하거나, 또는 (iii) 멜팅 분석에서 제1 이합체의 Tm 값 및 상기 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체의 Tm 값의 차이를 측정함으로써 구별할 수 있다.
구현예 1-2 (TO 상의 가닥 내 상호작용적-이중표지)
구현예 1-2에 따르면, 타겟 의존적 단편은 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중표지를 가지며, 상기 타겟 의존적 단편과 상기 제1 형태의 FHO 간의 혼성화, 또는 상기 제1 이합체의 멜팅 또는 멜팅 후 혼성화는 상기 상호작용적 이중표지로부터의 시그널의 변화를 초래하여 검출가능한 시그널을 제공한다.
상기 타겟 의존적 단편과 상기 제1 형태의 FHO 간의 혼성화시 시그널이 제공되며, 제1 이합체의 형성시 시그널을 검출하는 온도에서 상기 시그널이 유지된다. 구체적으로, 타겟 의존적 단편이 제1 형태의 FHO의 캡처링 부위에 혼성화되기 전에는, TO 상의 리포터 분자 및 퀀처 분자가 구조적으로 서로 근접하게 되어 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭하는데 반해; 타겟 의존적 단편이 제1 형태의 FHO의 캡처링 부위와 혼성화되는 경우, 상기 타겟 의존적 단편 상의 리포터 분자 및 퀀처 분자가 구조적으로 이격되어 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 언퀀칭하고, 이에 의해 시그널이 제공된다. 또한, 상기 연장가닥과 상기 제1 형태의 FHO 간에 제1 이합체의 형성은 상기 시그널을 유지시킨다. 이후, 상기 제1 이합체가 멜팅되는 경우, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 구조적으로 서로 근접하게 되어 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭하며, 이에 의해 시그널이 제공된다.
일 구현예에 따르면, 타겟 의존적 단편과 제1 형태의 FHO 간의 혼성화 또는 멜팅에 따라 리포터 분자로부터의 시그널이 퀀칭되거나 또는 언퀀칭되는 한, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 타겟 의존적 단편의 어떠한 위치에도 위치할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 타겟 의존적 단편 상의 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 하나는 그의 5'-말단에 위치하거나 또는 그의 5'-말단으로부터 1 내지 5 뉴클레오타이드 이격되어 위치하고, 다른 하나는 타겟 의존적 단편의 형태(conformation)에 따라 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭 및 언퀀칭하도록 위치한다.
일 구현예에 따르면, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 서로 최대 50 뉴클레오타이드, 구체적으로, 최대 40 뉴클레오타이드, 보다 구체적으로, 최대 30 뉴클레오타이드, 보다 더 구체적으로, 최대 20 뉴클레오타이드 이격되어 위치한다. 일 구현예에 따르면, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 최소 4 뉴클레오타이드, 구체적으로, 최소 6 뉴클레오타이드, 보다 구체적으로, 최소 10 뉴클레오타이드, 보다 더 구체적으로, 최소 15 뉴클레오타이드만큼 이격되어 위치한다.
상기 구현예 1-2에서, 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체가 형성되어 시그널이 제공될 수 있다. 이 경우, 제1 이합체의 시그널과 상기 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체의 시그널은 (i) 상기 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체가 해리되게 하는 온도에서 시그널(제1 이합체로부터 제공되는 시그널)을 측정하거나, (ii) 상기 제1 이합체가 형성됨에 따라, 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체의 양이 감소하고, 이로 인해 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체로부터 제공되는 시그널의 변화를 측정하거나, 또는 (iii) 멜팅 분석에서 제1 이합체의 Tm 값 및 상기 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체의 Tm 값의 차이를 측정함으로써 구별할 수 있다.
구현예 2 (가닥간 상호작용적-이중표지)
구현예 2에 따르면, 타겟 의존적 단편은 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중표지 중 어느 하나의 표지를 갖고, 상기 제1 형태의 FHO는 상기 상호작용적 이중표지 중 나머지 하나를 가지며, 상기 타겟 의존적 단편과 상기 제1형태의 FHO 간의 혼성화, 또는 상기 제1 이합체의 멜팅 또는 멜팅 후 혼성화는 상기 상호작용적 이중표지로부터의 시그널의 변화를 초래하여 검출가능한 시그널을 제공한다.
예를 들어, 타겟 의존적 단편이 퀀처 분자를 갖고 제1 형태의 FHO가 리포터 분자를 갖는 경우, 상기 타겟 의존적 단편이 제1 형태의 FHO에 혼성화되기 전에는 제1 형태의 FHO 상의 리포터 분자가 퀀칭되지 않는 반면, 상기 타겟 의존적 단편이 제1 형태의 FHO에 혼성화시에, 타겟 의존적 단편에 연결된 퀀처 분자에 의하여 제1 형태의 FHO에 연결된 리포터 분자로부터의 시그널이 퀀칭되어 시그널(구체적으로, 시그널 소멸)을 제공한다. 또한, 상기 연장가닥과 상기 제1 형태의 FHO 간에 제1 이합체의 형성은 상기 시그널을 유지시킨다. 이후, 상기 제1 이합체가 멜팅되는 경우, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 서로 이격되어 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 언퀀칭하며, 이에 의해 시그널(구체적으로, 시그널 발생)이 제공된다.
제1 이합체에서 퀀처 분자에 의하여 리포터 분자로부터의 시그널이 퀀칭되는 한, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 타겟 의존적 단편 및 제1 형태의 FHO의 어떠한 위치에도 위치할 수 있다. 상기 타겟 의존적 단편과 제1 형태의 FHO가 혼성화시에 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭하는 것을 용이하게 하기 위해, 퀀처 분자와 리포터 분자는 서로 근접하여 위치하는 것이 유리하다.
일 구현예에 따르면, 타겟 의존적 단편 상의 리포터 분자 또는 퀀처 분자는 그의 5'-말단 또는 5'-말단 부위에 위치한다.
일 구현예에 따르면, 타겟 의존적 단편 상의 리포터 분자 또는 퀀처 분자는 그의 3'-말단 또는 3'-말단 부위에 위치한다.
일 구현예에 따르면, 제1 형태의 FHO 상의 리포터 분자 또는 퀀처 분자는 제1 형태의 FHO의 캡처링 부위에 위치한다.
일 구현예에 따르면, 제1 형태의 FHO 상의 리포터 분자 또는 퀀처 분자는 그의 3'-말단에 위치하거나 또는 그의 3'-말단으로부터 1 내지 5 뉴클레오타이드 이격되어 위치한다.
구현예 2에서, 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체가 형성되어 시그널(구체적으로, 시그널 소멸)이 제공될 수 있다. 이 경우, 제1 이합체의 시그널과 상기 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체의 시그널은 (i) 상기 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체가 해리되게 하는 온도에서 시그널(제1 이합체로부터 제공되는 시그널)을 측정하거나, (ii) 상기 제1 이합체가 형성됨에 따라, 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체의 양이 감소하고, 이로 인해 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체로부터 제공되는 시그널의 변화를 측정하거나, 또는 (iii) 멜팅 분석에서 제1 이합체의 Tm 값 및 상기 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체의 Tm 값의 차이를 측정함으로써 구별할 수 있다.
사용되는 표지들의 종류 및 특징은 상술한 본 발명에 적용 가능한 표지 시스템에 대한 설명을 참조하여 설명될 수 있다.
(i-2) 단일 표지
본 개시는 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널을 제공하는 단일 표지 시스템을 이용하여 우수하게 실시된다.
일 구현예에 따르면, 타겟 의존적 단편 또는 제1 형태의 FHO는 단일 표지를 가지며, 상기 타겟 의존적 단편과 상기 제1 형태의 FHO 간의 혼성화, 상기 연장가닥과 상기 제1 형태의 FHO 간에 제1 이합체의 형성, 또는 상기 제1 이합체의 멜팅 또는 멜팅 후 혼성화는 상기 단일 표지로부터의 시그널의 변화를 초래하여 상기 검출가능한 시그널을 제공한다.
구현예 1 (FHO 상의 단일 표지)
구현예 1에 따르면, 제1 형태의 FHO는 단일 표지를 가지며, 상기 타겟 의존적 단편과 상기 제1 형태의 FHO 간의 혼성화, 상기 연장가닥과 상기 제1 형태의 FHO 간에 제1 이합체의 형성, 또는 상기 제1 이합체의 멜팅 또는 멜팅 후 혼성화는 상기 단일 표지로부터의 시그널의 변화를 초래하여 상기 검출가능한 시그널을 제공한다.
상기 구현예에서, 타겟 의존적 단편이 제1 형태의 FHO에 혼성화시에, 제1 형태의 FHO에 혼성화된 타겟 의존적 단편이 연장되어 제1 이합체를 형성시에, 또는 상기 제1 이합체의 멜팅 또는 멜팅 후 혼성화시에 단일 형광 표지로부터 형광 강도가 증가하게 되고, 이에 의해 시그널(구체적으로, 시그널 변화)이 제공된다.
예를 들어, 타겟 의존적 단편이 제1 형태의 FHO의 캡처링 부위에 혼성화되기 전에는, 단일 가닥 상태의 제1 형태의 FHO 상의 단일 표지는 낮은 시그널을 제공하는데 반해; 상기 제1 형태의 FHO에 혼성화된 타겟 의존적 단편이 연장되어 제1 이합체가 형성되는 경우에는, 이중 가닥 상태의 제1 이합체 상의 단일 표지는 증가된 시그널을 제공하고, 이에 의해 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널이 제공된다. 나아가, 상기 제1 이합체가 멜팅되는 경우, 단일 가닥 상태의 연장가닥 상의 단일 표지는 감소된 시그널을 제공하고, 이에 의해 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널이 제공되고; 상기 멜팅 후에 다시 혼성화하는 경우 이중 가닥 상태의 제1 이합체 상의 단일 표지는 증가된 시그널을 제공하고, 이에 의해 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널이 제공된다.
일 구현예에 따르면, 타겟 의존적 단편과 제1 형태의 FHO 간의 혼성화, 제1 이합체의 형성, 멜팅 또는 멜팅 후 혼성화에 따라 단일 표지로부터의 시그널 강도가 변화되는 한, 상기 단일 표지는 제1 형태의 FHO의 어떠한 위치에도 위치할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 단일 표지는 제1 형태의 FHO의 템플레이팅 부위 또는 캡처링 부위에 위치한다.
단일 표지의 제1 형태의 FHO 상에서의 위치에 따라 시그널이 제공(시그널 변화가 초래)되는 시점이 달라질 수 있다.
일 예로서, 단일 표지가 제1 형태의 FHO의 템플레이팅 부위에 위치하는 경우, 제1 이합체의 형성이 상기 단일 표지로부터의 시그널의 변화를 초래하여 검출가능한 시그널을 제공할 수 있다.
다른 예로서, 단일 표지가 제1 형태의 FHO의 캡처링 부위에 위치하는 경우, 상기 타겟 의존적 단편과 상기 제1 형태의 FHO 간의 혼성화가 상기 단일 표지로부터의 시그널의 변화를 초래하여 검출가능한 시그널을 제공하고, 제1 이합체의 형성은 시그널을 검출하는 온도에서 상기 시그널을 유지시킨다.
구현예 1에서, 제1 형태의 FHO의 캡처링 부위가 단일 표지로 표지되는 경우, 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체가 형성되어 시그널이 제공될 수 있다. 이 경우, 제1 이합체의 시그널과 상기 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체의 시그널은 (i) 상기 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체가 해리되게 하는 온도에서 시그널(제1 이합체로부터 제공되는 시그널)을 측정하거나, (ii) 상기 제1 이합체가 형성됨에 따라, 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체의 양이 감소하고, 이로 인해 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체로부터 제공되는 시그널의 변화를 측정하거나, 또는 (iii) 멜팅 분석에서 제1 이합체의 Tm 값 및 상기 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체의 Tm 값의 차이를 측정함으로써 구별할 수 있다.
구현예 2 (TO 상의 단일 표지)
구현예 2에 따르면, 타겟 의존적 단편은 단일 표지를 가지며, 상기 타겟 의존적 단편과 상기 제1 형태의 FHO 간의 혼성화, 또는 상기 제1 이합체의 멜팅 또는 멜팅 후 혼성화는 상기 단일 표지로부터의 시그널의 변화를 초래하여 검출가능한 시그널을 제공한다.
상기 타겟 의존적 단편과 상기 제1 형태의 FHO 간의 혼성화시 시그널이 제공되며, 제1 이합체의 형성은 시그널을 검출하는 온도에서 상기 시그널을 유지시킨다. 구체적으로, 타겟 의존적 단편이 제1 형태의 FHO의 캡처링 부위에 혼성화되기 전에는, TO 상의 단일 표지(즉, 타겟 의존적 단편 상의 단일 표지)가 낮은 강도의 시그널을 제공하는데 반해; 타겟 의존적 단편이 제1 형태의 FHO의 캡처링 부위와 혼성화되는 경우, 상기 타겟 의존적 단편 상의 단일 표지가 증가된 강도의 시그널을 제공한다. 또한, 상기 연장가닥과 상기 제1 형태의 FHO 간에 제1 이합체의 형성은 상기 증가된 시그널을 유지시킨다. 이후, 상기 제1 이합체가 멜팅되는 경우, 단일 표지는 낮은 시그널을 제공하고, 이에 의해 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널(구체적으로, 시그널의 변화)이 제공된다.
일 구현예에 따르면, 타겟 의존적 단편과 제4 형태의 FHO 간의 혼성화, 제1 이합체의 형성, 멜팅 또는 멜팅 후 혼성화에 따라 단일 표지로부터의 시그널 강도가 변화되는 한, 상기 단일 표지는 타겟 의존적 단편의 어떠한 위치에도 위치할 수 있다.
구현예 2에서, 타겟 의존적 단편이 단일 표지로 표지되는 경우, 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체가 형성되어 시그널이 제공될 수 있다. 이 경우, 제1 이합체의 시그널과 상기 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체의 시그널은 (i) 상기 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체가 해리되게 하는 온도에서 시그널(제1 이합체로부터 제공되는 시그널)을 측정하거나, (ii) 상기 제1 이합체가 형성됨에 따라, 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체의 양이 감소하고, 이로 인해 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체로부터 제공되는 시그널의 변화를 측정하거나, 또는 (iii) 멜팅 분석에서 제1 이합체의 Tm 값 및 상기 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체의 Tm 값의 차이를 측정함으로써 구별할 수 있다.
(ii) 연장 반응 동안 제1 이합체에 삽입된 표지
본 개시는 제1 이합체의 존재를 나타내는 시그널을 제공하기 위하여, 단계 (b)에서의 연장반응 동안 제1 이합체 내에 삽입된 표지를 이용할 수 있다.
비록 타겟 의존적 단편 또는 제1 형태의 FHO가 표지를 갖지 않아도, 단계 (b)에서의 연장반응 동안 제1 이합체 내에 삽입된 표지를 이용하여 성공적으로 제1 이합체를 표지시킬 수 있다.
일 구현예에 따르면, 단계 (b)의 연장반응은 단일 표지를 갖는 뉴클레오타이드의 존재 하에 실시되며, 이에 의해 상기 제1 이합체 내에 단일 표지가 삽입되고 상기 단계 (b)에서 상기 연장가닥과 상기 제1 형태의 FHO 간의 제1 이합체의 형성, 또는 상기 제1 이합체의 멜팅 또는 멜팅 후 혼성화는 상기 단일 표지로부터의 시그널의 변화를 초래하여 상기 검출가능한 시그널을 제공한다.
예를 들어, 타겟 의존적 단편은 고상 기질 상에 고정화된 제1 형태의 FHO의 캡처링 부위에 혼성화되고 단일 형광 표지로 표지된 뉴클레오타이드의 존재 하에 연장되어 제1 이합체를 형성한다. 제1 이합체로부터의 형광 시그널은 제1 형태의 FHO가 고정화된 고상 기질의 스팟 상에서 검출할 수 있다. 또한, 제1 이합체가 멜팅되는 경우, 형광 표지를 갖는 가닥은 방출되고, 스팟 상에서는 더 이상 형광 시그널이 검출되지 않는다. 따라서, 시그널의 변화가 제1 이합체의 멜팅에 의하여 스팟 상에서 제공될 수 있다. 즉, 제1 이합체에서의 연장 가닥의 존재를 나타내는 시그널이 제공되어 단계 (c)에서 제2 이합체의 존재를 나타낸다.
일 구현예에 따르면, 연장반응 동안 삽입된 뉴클레오타이드는 합성 비자연 염기(non-natural base)를 가지며, 제1 형태의 FHO는 상기 합성 비자연 염기에 대하여 특이적 결합 친화성이 있는(즉, 상기 합성 비자연 염기와 염기쌍을 이룰 수 있는) 상보적 합성 비자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드를 갖는다. 구체적으로, 상기 합성 비자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드는 제1 형태의 FHO의 템플레이팅 부위의 어떠한 사이트에도 위치한다.
예를 들어, 특정 합성 비자연 염기(예컨대, iso-dG)에 대하여 상보적 합성 비자연 염기(예컨대, iso-dC)를 갖는 뉴클레오타이드를 포함하는 제1 형태의 FHO에 타겟 의존적 단편이 혼성화된다. 단일 형광 표지로 표지된 특정 합성 비자연 염기(예컨대, iso-dG)를 갖는 뉴클레오타이드의 존재 하에 연장이 실시되어, 제1 이합체를 형성한다. 연장반응에서, 상기 단일 형광 표지로 표지된 특정 합성 비자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드는 제1 형태의 FHO 상의 이의 상보적 합성 비자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드의 맞은편 사이트에 삽입된다.
일 구현예에 있어서, 상기 연장 반응 동안 제1 이합체에 삽입되는 표지로 표지된 합성 비자연 염기는 S, Z, V, K, Pa. Pn, Px, Q, MMO2, 5FM, NaM, B, P, J, X, Ds, Dss 및 5SICS로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 표지된 합성 비자연 염기 및 이의 상보적인 합성 비자연 염기는 비자연 염기쌍을 이룰 수 있으며, 예컨대, S-B 염기쌍, Z-P 염기쌍, V-J 염기쌍, K-X 염기쌍, Pa-Ds 염기쌍, Pa-Q 염기쌍, Pn-Ds 염기쌍, Pn-Dss 염기쌍, Px-Ds 염기쌍, MMO2-5SICS 염기쌍, 5FM-5SICS 염기쌍 또는 NaM-5SICS 염기쌍일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 연장반응 동안 생성되는 비자연 염기쌍은 상기 제1 합성 비자연 염기 및 제2 합성 비자연 염기 간의 비자연 염기쌍과 동일하거나 상이할 수 있다.
제1 이합체로부터 나오는 형광 시그널은 고정화된 제1 형태의 FHO가 있는 고상 기질의 스팟 상에서 검출될 수 있다. 또한, 제1 이합체가 멜팅되는 경우, 형광 표지를 갖는 가닥은 방출되고, 스팟 상에서는 더 이상 형광 시그널이 검출되지 않는다. 따라서, 시그널의 변화가 제1 이합체의 멜팅에 의하여 스팟 상에서 제공될 수 있다. 즉, 제1 이합체에서의 연장 가닥의 존재를 나타내는 시그널이 제공되어 단계 (c)에서 제1 이합체의 존재를 나타낸다.
연장반응 동안 제1 이합체 내에 삽입된 표지를 이용하는 경우, 비절단 TO는 제1 형태의 FHO에 혼성화하여 연장되지 않기 때문에, 표지는 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체 내에 포함되지 않는다. 따라서, 상기 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체는 시그널을 제공하지 않는다.
사용되는 단일 표지의 종류 및 특징은 본 명세서에서 상술한 "타겟 의존적 단편 및/또는 FHO에 연결된 표지"를 이용하는 표지 시스템에 대한 설명을 참조하여 설명될 수 있다.
(iii) 타겟 의존적 단편 또는 제1 형태의 FHO에 연결된 최소 하나의 표지와 상기 연장 반응 동안 제1 이합체 내에 삽입된 표지
본 개시는 타겟 의존적 단편 및/또는 제1 형태의 FHO에 연결된 표지 및 연장반응 동안 제1 이합체 내에 삽입된 표지의 조합을 이용하는 표지 시스템을 이용할 수 있다.
상기 연장 반응 동안 제1 이합체 내에 삽입되는 표지는 단계 (b)에서 상기 제1 형태의 FHO에 상기 타겟 의존적 단편이 혼성화되어 연장되는 연장 반응 동안 연장서열에 삽입되는 표지일 수 있다.
일 구현예에서, 제1 형태의 FHO는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중표지 중 어느 하나의 표지를 갖고, 상기 단계 (b)의 연장반응은 상기 상호작용적 이중표지 중 나머지 하나의 표지를 갖는 뉴클레오타이드의 존재 하에서 실시되며, 이에 의해 상기 연장서열에 표지가 삽입되고; 상기 단계 (b)에서 상기 연장가닥과 상기 제1 형태의 FHO 간의 제1 이합체의 형성, 또는 상기 제1 이합체의 멜팅 또는 멜팅 후 혼성화는 상기 상호작용적 이중표지로부터의 시그널의 변화를 초래하여 검출가능한 시그널을 제공한다.
특히, 연장반응 동안 삽입된 뉴클레오타이드는 합성 비자연 염기를 가지며, 제1 형태의 FHO는 상기 합성 비자연 염기에 대하여 특이적 결합 친화성이 있는 상보적 합성 비자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드를 갖는다.
특정 구현예에서, 제1 형태의 FHO는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중표지 중 어느 하나의 표지를 갖고, 상기 제1 형태의 FHO의 템플레이팅 부위는 합성 비자연적 염기를 갖는 뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 단계 (b)의 연장반응은 상기 합성 비자연 염기와 특이적 결합 친화성을 가지는 상보적 합성 비자연 염기 및 상기 상호작용적 이중표지 중 나머지 하나의 표지를 갖는 뉴클레오타이드의 존재 하에서 실시되며, 이에 의해 상기 연장서열에 표지가 삽입되고; 상기 단계 (b)에서 상기 연장가닥과 상기 제1 형태의 FHO 간의 제1 이합체의 형성 또는 상기 제1 이합체의 멜팅 또는 멜팅 후 혼성화는 상기 상호작용적 이중표지로부터의 시그널의 변화를 초래하여 검출가능한 시그널을 제공한다.
상기 제1 이합체가 멜팅되는 경우, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 서로 이격되어 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 언퀀칭하며, 이에 의해 시그널이 제공된다.
제1 형태의 FHO 상의 표지 사이트 및 삽입되는 표지의 삽입 사이트는, 제1 이합체의 형성 및 멜팅 단계에서 상기 2개의 표지가 시그널의 변화를 유도하는 상호작용적 이중표지로서 작용하는 범위 내에서 결정된다.
특히, 제1 형태의 FHO의 템플레이팅 부위는 리포터 또는 퀀처 분자 및 합성 비자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드를 갖는다.
상기 단계 (b)에서 연장반응은 퀀처 또는 리포터 분자 및 상기 제1 형태의 FHO 내의 합성 비자연 염기에 대하여 특이적 결합 친화성이 있는 상보적 합성 비자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드의 존재하에서 실시된다. 상기 단계 (b)에서 제1 이합체의 상기 2개의 합성 비자연 염기는 염기쌍을 형성하고 퀀처 분자에 의한 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭하여 시그널의 변화를 유도하며, 이에 의해 시그널이 제공된다. 택일적으로, 타겟 의존적 단편은 리포터 또는 퀀처 분자를 가지며, 제1 형태의 FHO의 템플레이팅 부위는 합성 비자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드를 갖는다. 상기 단계 (b)에서 연장반응은 퀀처 또는 리포터 분자 및 상기 제1 형태의 FHO 내의 합성 비자연 염기에 대하여 특이적 결합 친화성이 있는 상보적 합성 비자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드의 존재하에서 실시된다. 상기 단계 (b)의 제1 이합체의 상기 2개의 합성 비자연 염기는 염기쌍을 형성하고 퀀칭에 의한 리포터 분자로부터의 시그널 변화를 유도하며, 이에 의해 시그널이 제공된다.
또 다른 예로서, 리포터 또는 퀀처 분자를 포함하는 타겟 의존적 단편이 특정 합성 비자연 염기(예컨대, iso-dG)에 대하여 특이적 결합 친화성이 있는 상보적 합성 비자연 염기(예컨대, isodC)를 갖는 뉴클레오타이드를 포함하는 제1 형태의 FHO에 혼성화된다. 퀀처 또는 리포터 분자로 표지된 특정 합성 비자연 염기(예컨대, iso-dG)를 갖는 뉴클레오타이드의 존재하에 연장이 실시되어, 제1 이합체가 형성되며 리포터 분자로부터의 시그널이 퀀처 분자에 의해 퀀칭된다. 연장반응에서, 상기 특정 합성 비자연 염기(예컨대, iso-dG)를 갖는 뉴클레오타이드는 상기 상보적 합성 비자연 염기(예컨대, isodC)를 갖는 뉴클레오타이드의 맞은편 사이트에 삽입된다.
상기 단계 (b)에서 제1 이합체가 형성되는 경우, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 구조적으로 서로 근접하여 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭하고, 이에 의해 시그널이 제공되며; 상기 제1 이합체가 멜팅되는 경우, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 구조적으로 서로 이격되어 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 언퀀칭하고, 이에 의해 시그널이 제공된다.
연장반응 동안 제1 이합체 내에 삽입되는 표지를 이용하는 경우, 상기 표지는 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체 내에 삽입되지 않는데, 이는, 상기 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체는 연장되지 않기 때문이다. 따라서, 상기 이합체는 시그널을 제공하지 않는다.
(iv) 인터컬레이팅 표지(Intercalating label)
본 개시는 제1 이합체의 존재를 나타내는 시그널을 제공하는 인터컬레이팅 표지를 사용할 수 있다. 시료 내 이중-가닥 핵산 분자가 시그널을 제공할 수 있기 때문에, 고정화된 제1 형태의 FHO를 이용하는 고상 반응에서는 인터컬레이팅 표지가 보다 유용하다.
일 구현예에서, 시그널은 인터컬레이팅 표지(intercalating label)에 의해 제공되며, 상기 단계 (b)에서 상기 타겟 의존적 단편과 상기 제1 형태의 FHO 간의 혼성화, 상기 단계 (b)에서 상기 연장가닥과 상기 제1 형태의 FHO 간에 제1 이합체의 형성, 또는 상기 제1 이합체의 멜팅 또는 멜팅 후 혼성화는 상기 인터컬레이팅 표지로부터의 시그널의 변화를 초래하여 상기 검출가능한 시그널을 제공한다.
본 발명에서 유용한 인터컬레이팅 표지의 예는, SYBR™ Green I, PO-PRO™-1, BO-PRO™-1, SYTO™ 43, SYTO™ 44, SYTO™ 45, SYTOX™ Blue, POPO™-1, POPO™-3, BOBO™-1, BOBO™-3, LO-PRO™-1, JO-PRO™-1, YO-PRO™ 1, TO-PRO™ 1, SYTO™ 11, SYTO™ 13, SYTO™ 15, SYTO™ 16, SYTO™ 20, SYTO™ 23, TOTO™-3, YOYO™ 3, GelStar™ 및 thiazole orange를 포함한다. 인터컬레이팅 염료는 이중-가닥 핵산 분자 내에 특이적으로 끼어들어가서 시그널을 제공한다.
본 구현예는 멜팅 분석을 이용하는 다른 구현예들에도 적용할 수 있다.
예를 들어, 고상 기질 상에 고정화된 제1 형태의 FHO의 캡처링 부위에 타겟 의존적 단편이 혼성화된다. 인터컬레이팅 염료(예컨대, SYBR™ Green)의 존재 하에 연장을 실시하여 인터컬레이팅 염료를 포함하는 제1 이합체를 생성한다. 고정화된 제1 형태의 FHO가 있는 고상 기질의 스팟 상의 제1 이합체로부터 나오는 형광 시그널은 인터컬레이팅 형광 염료를 이용하여 검출될 수 있다. 또한, 제1 이합체가 멜팅되는 경우, 인터컬레이팅 형광 염료가 방출되어 스팟 상에서 더 이상 형광 시그널이 검출되지 않는다. 따라서, 시그널이 제공되어 단계 (c)에서 제1 이합체의 존재를 나타낸다.
인터컬레이팅 표지를 이용하는 경우, 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체가 형성되어 시그널이 제공될 수 있다. 이 경우, 제1 이합체의 시그널과 상기 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체의 시그널은 (i) 상기 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체가 해리되게 하는 온도에서 시그널(제1 이합체로부터 제공되는 시그널)을 측정하거나, (ii) 상기 제1 이합체가 형성됨에 따라, 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체의 양이 감소하고, 이로 인해 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체로부터 제공되는 시그널의 변화를 측정하거나, 또는 (iii) 멜팅 분석에서 제1 이합체의 Tm 값 및 상기 비절단 TO와 제1 형태의 FHO 간의 이합체의 Tm 값의 차이를 측정함으로써 구별할 수 있다.
B. 제1 이합체의 절단의 검출
일 구현예에 따르면, 단계 (c)에서의 검출은 연장가닥과 제1 형태의 FHO 간의 제1 이합체의 절단으로부터 제공되는 시그널을 이용여 실시될 수 있다. 예컨대, PCEC 분석에 기초하여 실시할 수 있다(참조 WO 2012/134195).
일 구현예에 있어서, 상기 제1 이합체는 뉴클레오절단효소(nucleolytic enzyme)에 의해 절단되는 절단 위치를 포함하며, 상기 제1 이합체는 상기 절단 위치에서의 절단에 의해 검출가능한 시그널을 제공하고, 상기 단계 (c)에서 연장가닥의 존재는 상기 제1 이합체의 절단으로부터 제공되는 시그널을 측정함으로써 검출된다.
일 구현예에 있어서, 상기 제1 이합체는 최소 하나의 표지를 포함한다. 상기 표지는 상기 제1 이합체의 절단에 의해 검출가능한 시그널을 제공한다. 예컨대, 상기 PCEC 분석에서, 검출가능한 시그널은 (i) 상기 타겟 의존적 단편 및/또는 제1 형태의 FHO에 연결된 최소 하나의 표지, (ii) 상기 연장반응 동안 상기 제1 이합체 내에 삽입된 표지, (iii) 상기 제1 형태의 FHO에 연결된 최소 하나의 표지와 상기 연장반응 동안 상기 제1 이합체 내에 삽입된 표지 또는 (iv) 인터컬레이팅 표지(intercalating label)에 의해 제공될 수 있다.
특정 구현예에 있어서, 상기 제1 이합체는 최소 하나의 표지를 포함하고, 상기 제1 이합체는 (i) 절단 효소에 의하여 절단되는 절단위치를 포함하여 상기 절단 위치에서의 절단에 의해 검출 가능한 시그널을 제공하거나, 또는 (ii) 5'-3' 엑소 뉴클레아제에 의해 상기 제1 이합체 중 제1 형태의 FHO의 5'-말단으로부터 순차적 절단(sequential cleavage)에 의해 검출 가능한 시그널을 제공하고, 상기 단계 (c)에서 연장가닥의 존재는 상기 제1 이합체의 절단으로부터 제공되는 시그널을 측정함으로써 검출된다.
일 구현예에 있어서, 상기 표지가 제1 이합체의 절단에 의해 시그널 변화를 유도하는 한, 상기 표지는 제1 이합체의 어떠한 위치에도 결합할 수 있다.
PCEC 분석의 원리에 관한 세부사항은 본원에 참조로 포함된 국제공개 WO 2012/134195호를 참조한다.
상기 PCEC 분석 기반의 표지 시스템은 다음과 같이 설명될 수 있다:
(i) 단일 표지
본 개시는 단일 표지를 이용하여 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 제1 이합체 절단 발생에 대한 시그널을 제공할 수 있다.
단일 표지의 종류 및 특성은 전술한 PTOCE 분석 섹션을 참조한다.
일 구현예에 따르면, 제1 형태의 FHO는 단일 표지를 갖고, 제1 이합체의 절단은 단일 표지를 포함하는 절단 단편을 형성하며, 제1 이합체가 절단되기 이전의 단일 표지로부터 나오는 시그널은 제1 이합체가 절단된 이후의 단일 표지로부터 나오는 시그널과 상이하여, 이러한 시그널들의 차이가 제1 이합체의 절단 발생이 검출되도록 한다.
일 구현예에 따르면, TO는 단일 표지를 갖고, 제1 이합체 절단은 단일 표지를 포함하는 절단 단편을 형성하며, 제1 이합체가 절단되기 이전의 단일 표지로부터 나오는 시그널은 제1 이합체가 절단된 이후의 단일 표지로부터 나오는 시그널과 상이하여, 이러한 시그널들의 차이가 제1 이합체의 절단 발생이 검출되도록 한다.
일 구현예에 따르면, 제1 이합체의 절단에 따라 상이한 시그널을 제공하는 단일 표지는 형광성 테르비움 킬레이트 또는 편광된 형광을 방출하는 단일 표지이다.
일 구현예에 따르면, 단일 표지는 제1 형태의 FHO에 연결되어 있고, 특히 제1 형태의 FHO의 템플레이팅 부위, 보다 특히 제1 형태의 FHO의 템플레이팅 부위의 5'-말단이다.
일 구현예에 따르면, 단일 표지는 TO에 연결되어 있고, 특히 TO의 태깅 부위이다. 구체적으로, 타겟 의존적 단편이 단일 표지를 가지도록 단일 표지가 TO 상에 위치한다.
일 구현예에 있어서, 본 개시에서 단일 표지를 이용하는 경우, 본 개시는 고정화된 제1 형태의 FHO를 이용하여 고상에서 실시할 수 있다. 본 개시에서 단일 표지를 이용하여 고상에서 실시하는 경우, TO 또는 제1 형태의 FHO에 결합된 단일 표지는 제1 이합체의 절단의 발생을 나타내는 시그널을 제공할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 제1 형태의 FHO는 그의 5'-말단 또는 3'-말단을 통하여 고상 기질 상에 고정화된다.
일 구현예에 따르면, 제1 형태의 FHO는 단일 표지를 갖고, 제1 이합체 절단은 단일 표지를 포함하는 절단 단편을 형성하며, 절단 단편은 고상 기질로부터 방출되어, 고상 기질 상에서 시그널의 변화를 초래하여 제1 이합체의 절단의 발생을 나타내는 시그널을 제공한다.
보다 특히, 제1 형태의 FHO는 그의 3'-말단을 통하여 고상 기질 상에 고정화되어 있고, TO는 단일 표지를 가지며, 제1 이합체 절단은 단일 표지를 포함하는 절단 단편을 형성하며, 절단 단편은 고상 기질로부터 방출되어, 고상 기질 상에서 시그널의 변화를 초래하여 제1 이합체의 절단의 발생을 나타내는 시그널을 제공한다.
제1 형태의 FHO가 3'-말단을 통하여 고정화되어 있고 단일 표지를 이용하는 경우, 단일 표지는 제1 형태의 FHO의 템플레이팅 부위에 결합되어 있고, 핵산 절단효소의 절단 위치는 5' → 3' 엑소뉴클레아제, 제한효소 또는 리보뉴클레아제의 절단 위치일 수 있다.
한 가지 예로서, 3'-말단을 통하여 고상 기질 상에 고정화된 제1 형태의 FHO에 타겟 의존적 단편이 혼성화되고 연장되어 제1 이합체가 형성되면 5' → 3' 엑소뉴클레아제의 절단 위치가 생성된다. 5' → 3' 엑소뉴클레아제가 절단위치를 절단함으로써 제1 이합체가 절단(구체적으로, 제1 형태의 FHO의 5'-말단으로부터 순차적 절단) 되어 제1 형태의 FHO의 5'-말단으로부터 형광 리포터 분자가 방출된다. 타겟 핵산 서열이 존재하는 경우, 고정화된 제1 형태의 FHO를 포함하는 스팟에서 형광이 감소하거나 소멸한다. 타겟 핵산 서열이 부존재하는 경우, 고정화된 제1 형태의 FHO를 포함하는 스팟에서 형광이 감소하거나 소멸하지 않는다.
택일적으로, 제1 형태의 FHO는 그의 5'-말단을 통하여 고상 기질 상에 고정화되어 있고, TO는 단일 표지를 가지며, 제1 이합체 절단은 단일 표지를 포함하는 절단 단편을 형성하며, 절단 단편은 고상 기질로부터 방출되어, 고상 기질 상에서 시그널의 변화를 초래하여 제1 이합체의 절단의 발생을 나타내는 시그널을 제공한다.
추가의 예로서, 5'-말단을 통하여 고상 기질 상에 고정화된 제1 형태의 FHO(템플레이팅 부위에 제한효소에 의하여 인식되는 서열을 포함)에 타겟 의존적 단편이 혼성화되고 연장되어 제1 이합체가 형성이 되면 제한효소의 절단 위치가 생성된다. 제한효소는 제1 이합체를 절단하여 제1 형태의 FHO의 3'-말단으로부터 형광 리포터 분자를 방출시킨다. 타겟 핵산 서열이 존재하는 경우, 고정화된 제1 형태의 FHO를 포함하는 스팟에서 형광이 감소하거나 소멸한다. 타겟 핵산 서열이 부존재하는 경우, 고정화된 제1 형태의 FHO를 포함하는 스팟에서 형광이 감소하거나 소멸하지 않는다.
추가의 예로서, 5'-말단을 통하여 고상 기질 상에 고정화된 제1 형태의 FHO(템플레이팅 부위에 RNA 분자를 포함)에 타겟 의존적 단편이 혼성화되고 연장되어 제1 이합체가 형성되면 RNase H의 절단 위치가 생성된다. RNase H는 제1 이합체를 절단하여 제1 형태의 FHO의 3'-말단으로부터 형광 리포터 분자를 방출시킨다. 타겟 핵산 서열이 존재하는 경우, 고정화된 제1 형태의 FHO를 포함하는 스팟에서 형광이 감소하거나 소멸한다. 타겟 핵산 서열이 부존재하는 경우, 고정화된 제1 형태의 FHO를 포함하는 스팟에서 형광이 감소하거나 소멸하지 않는다.
5'-말단을 통하여 고상 기질 상에 제1 형태의 FHO가 고정화되고 단일 표지를 이용하는 경우, 단일 표지는 제1 형태의 FHO 또는 TO에 결합되고, 제한효소 또는 리보뉴클레아제와 같은 핵산 절단효소의 절단 위치가 생성되는 것이 바람직하다.
고상 반응에 이용되는 단일 표지는 특정한 특징이 요구되지 않는다. 고상 반응을 위해서는, 어떠한 단일 표지도 이용될 수 있다. 이는, 제1 이합체의 절단 이후 고상 기질 상의 단일 표지의 존재 여부에 의하여 제1 이합체의 절단 발생에 따른 시그널의 차이가 유도될 수 있기 때문이다.
단일 표지는 종래 방법들을 이용하여 제1 형태의 FHO 또는 TO에 결합될 수 있다. 구체적으로, 표지는 최소 3개의 탄소 원자를 포함하는 스페이서(spacer)(예를 들어, 3-카본 스페이서, 6-카본 스페이서 또는 12-카본 스페이서)를 매개로 제1 형태의 FHO 또는 TO에 결합된다.
일 구현예에 따르면, 제1 형태의 FHO에 결합되는 단일 표지는 5'-말단 또는 그로부터 1 내지 5 뉴클레오타이드 이격된 위치에 있다. 택일적으로, 제1 형태의 FHO에 결합되는 단일 표지는 3'-말단 또는 그로부터 1 내지 5 뉴클레오타이드 이격된 위치에 있다.
특정 구현예에 따르면, TO에 결합되는 단일 표지는 5'-말단 또는 그로부터 1 내지 5 뉴클레오타이드 이격된 위치에 있다.
(ii) 상호작용적 이중표지
본 개시는 상호작용적 이중표지를 이용하여 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 제1 이합체 절단 발생에 대한 시그널을 제공할 수 있다.
상호작용적 이중표지의 종류 및 특성은 전술한 PTOCE 분석 섹션을 참조한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상호작용적 이중표지는 제1 형태의 FHO에 결합된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 핵산 절단효소에 의하여 절단되는 절단 위치는 제1 형태의 FHO에 결합된 리포터 분자 및 퀀처 분자 사이에 위치하고, 제1 이합체가 형성되기 이전에는 퀀처 분자는 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭하며, 제1 이합체의 절단은 리포터 분자와 퀀처 분자를 서로 분리시키고, 제1 이합체의 절단의 발생은 표지로부터의 시그널을 측정하여 검출된다.
본 개시의 상호작용적 표지 시스템은 액상 및 고상에서 유용하다.
상호작용적 표지 시스템을 이용하는 경우, 구체적으로는, 제1 이합체에서 생성되는 절단 위치는 5' → 3' 엑소뉴클레아제, 제한효소 또는 리보뉴클레아제의 절단 위치일 수 있다.
일 예로서, 타겟 의존적 단편이 제1 형태의 FHO에 혼성화되고 연장되어 제1 이합체가 형성되며, 이에 의해 5' → 3' 엑소뉴클레아제의 절단 위치가 생성된다. 5' → 3' 엑소뉴클레아제의 절단 위치는 제1 형태의 FHO에 결합된 리포터 분자 및 퀀처 분자 사이에 위치한다.
제1 이합체가 형성되기 전에, 퀀처 분자는 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭하기에 적합한 위치에 위치한다.
특히, 상기 두 개의 표지가 제1 형태의 FHO 상의 거리에 따라 근접하게 있거나 또는 랜덤 코일 (coli) 및 헤어핀 구조와 같은 입체적 구조(conformational structure) 를 형성하여 3차원적인 방식으로 근접하게 있는 경우, 퀀칭이 발생한다.
5' → 3' 엑소뉴클레아제는 제1 이합체의 5'-말단을 절단(구체적으로, 순차적 절단)하고 형광 리포터 분자를 방출시켜 형광 리포터 분자로부터의 시그널 변화를 초래한다. 형광 시그널 변화를 측정하여 제1 이합체의 절단 발생을 검출하며, 이는 타겟 핵산 서열의 존재 여부를 결정한다.
퀀처 분자가 형광성인 경우, 퀀처 분자로부터의 시그널을 이용하여 측정하는 것이 바람직하다.
다른 예로서, 타겟 의존적 단편이 제1 형태의 FHO에 혼성화되고 연장되어 제1 이합체가 형성되며, 이에 의해 제한효소의 절단 위치가 생성된다. 제한효소의 절단 위치는 제1 형태의 FHO에 결합된 리포터 분자 및 퀀처 분자 사이에 위치한다. 제한효소가 절단 위치를 절단함으로써 제1 이합체를 절단하고 형광 리포터 분자를 방출시켜 형광 리포터 분자로부터의 시그널의 변화를 초래한다. 형광 시그널 변화를 측정하여 제1 이합체의 절단 발생을 검출하며, 이는 타겟 핵산 서열의 존재 여부를 결정한다.
다른 예로서, 타겟 의존적 단편이 제1 형태의 FHO(템플레이팅 부위에 RNA 분자를 포함)에 혼성화되고 연장되어 제1 이합체가 형성되며, 이에 의해 RNase의 절단 위치가 생성된다. RNase의 절단 위치는 제1 형태의 FHO에 결합된 리포터 분자 및 퀀처 분자 사이에 위치한다. RNase가 절단 위치를 절단함으로써 제1 이합체를 절단하고 형광 리포터 분자를 방출시켜 형광 리포터 분자로부터의 시그널의 변화를 초래한다. 형광 시그널 변화를 측정하여 제1 이합체의 절단 발생을 검출하며, 이는 타겟 핵산 서열의 존재 여부를 결정한다.
일 구현예에 따르면, 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 최소 하나는 제1 형태의 FHO의 템플레이팅 부위에 결합되어 있으며, 특히 제1 형태의 FHO의 5'-말단이다.
일 구현예에 따르면, 리포터 분자 및 퀀처 분자 모두는 제1 형태의 FHO의 템플레이팅 부위에 결합되어 있다.
일 구현예에 따르면, 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 하나는 제1 형태의 FHO의 5'-말단에, 다른 하나는 3'-말단에 결합되어 있다.
일 구현예에 따르면, 제1 형태의 FHO의 템플레이팅 부위에 결합된 리포터 분자 또는 퀀처 분자는 그의 5'-말단 또는 5'-말단으로부터 1 내지 5 뉴클레오타이드 이격된 위치에 위치해 있다. 예를 들어, 퀀처 분자는 제1 형태의 FHO의 템플레이팅 부위의 5'-말단 또는 5'-말단으로부터 1 내지 5 이격된 위치에 위치할 수 있고, 리포터 분자는 퀀처 분자로부터 5 내지 50 뉴클레오타이드 이격된 위치에 위치할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상호작용적 이중표지는 제1 이합체가 형성되는 경우에는, 상호작용적 이중표지 간의 퀀칭 상태가 유지되고, 제1 이합체의 절단에 의하여 표지가 방출되는 경우에는, 상호작용적 이중표지 간의 언퀀칭 상태가 되는 적합한 위치에 위치한다.
제1 이합체의 절단 동안의 실시간 시그널 제공을 고려하여, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 최대 25 뉴클레오타이드만큼 서로 이격된 위치에 위치하며, 구체적으로, 최대 20 뉴클레오타이드, 보다 구체적으로, 최대 15 뉴클레오타이드, 보다 더 구체적으로, 최대 10 뉴클레오타이드이다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 최소 3 뉴클레오타이드만큼 서로 이격된 위치에 위치하며, 구체적으로, 최소 4 뉴클레오타이드, 보다 구체적으로, 최소 5 뉴클레오타이드, 보다 더 구체적으로, 최소 6 뉴클레오타이드이다.
제1 이합체가 형성되는 경우, 제1 형태의 FHO 상의 리포터 분자 및 퀀처 분자는 구조적으로 이격되어 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 언퀀칭하도록 할 수 있다. 제1 이합체의 절단은 리포터 분자를 퀀처 분자로부터 완전히 분리시켜, 언퀀칭되면서 초래되는 시그널의 변화를 보다 크게 할 수 있다.
또한, 표지(예를 들어, 리포터 분자)를 갖는 절단 단편이 생성되므로, 보다 유연하거나 편리한 조건(예를 들어, 고-엄격 조건 또는 고상에서 세척 후 조건)하에서, 절단 단편에 결합된 표지로부터의 시그널을 직접 검출하여 제1 이합체의 절단 발생을 분석할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 고정화된 제1 형태의 FHO에 결합된 상호작용적 이중표지 중 하나는, 제1 이합체의 절단 후 고상 기질 상에 잔류한다.
일 구현예에 따르면, 고상 기질 상에 고정화된 제1 형태의 FHO가 상호작용적 이중표지를 갖고 핵산 절단효소로서 5' → 3' 엑소뉴클레아제를 이용하는 경우, 제1 이합체로부터 제1 형태의 FHO의 단편이 분리되기에 적합한 조건을 부여하거나 또는 제1 형태의 FHO의 내부 뉴클레오타이드에 5' → 3' 엑소뉴클레아제 활성에 대한 내성을 부여함으로써, 제1 이합체의 절단 후 상호작용적 이중표지 중 하나가 고상 기질 상에 확실하게 잔류하도록 할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 5' → 3' 엑소뉴클레아제에 활성에 대한 내성은 5' → 3' 엑소뉴클레아제 활성에 대한 내성을 갖는 백본이 있는 뉴클레오타이드에 의하여 부여되며, 다양한 포스포로티오에이트 연결(linkage), 포스포네이트 연결, 포스포로아미데이트 연결 및 2'-카보하이드레이트 변형을 포함하고, 보다 구체적으로, 포스포로티오에이트 연결, 알킬 포스포트리에스테르 연결, 아릴 포스포트리에스테르 연결, 알킬 포스포네이트 연결, 아릴 포스포네이트 연결, 하이드로겐 포스포네이트 연결, 알킬 포스포로아미데이트 연결, 아릴 포스포로아미데이트 연결, 포스포로세레네이트 연결, 2'-O-아미노프로필 변형, 2'-O-알킬 변형, 2'-O-알릴 변형, 2'-O-부틸 변형, α-아노머릭 올리고데옥시뉴클레오타이드 및 1-(4'-티오-β-D-리보퓨라노실) 변형을 포함한다.
본 개시에 이용될 수 있는 리포터 분자 및 퀀처 분자는 PTOCE 분석에서 설명한 것을 참조한다.
(iii) 인터컬레이팅 표지(Intercalating label)
본 발명에서는 인터컬레이팅 표지(intercalating label)를 이용하여 제1 이합체의 절단반응과 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널의 제공을 연계시킬 수 있다.
시료 내 존재하는 이중-가닥 핵산 분자가 시그널을 제공할 수 있기 때문에, 고정화된 제1 이합체를 이용하는 고상 반응에서는 인터컬레이팅 표지가 보다 유용하다.
일 구현예에 따르면, 제1 이합체는 그의 5'-말단 또는 3'-말단을 통하여 고상 기질 상에 고정화되어 있고, 인터컬레이팅 염료가 표지로 이용되며, 제1 이합체 절단은 인터컬레이팅 염료를 포함하는 절단 단편을 형성하며, 절단 단편은 고상 기질로부터 방출되어, 고상 기질 상에서 시그널의 변화를 초래하여 제1 이합체의 절단의 발생을 나타내는 시그널을 제공한다. 이러한 경우, 제1 이합체의 절단 반응은 제한효소 또는 RNase를 이용하여 실시하는 것이 바람직하다.
일 구현예에 따르면, 고상 기질 상에 고정화되지 않은 절단 단편은 고상 기질로부터 해리된다.
본 개시에서 유용한 인터컬레이팅 염료의 예는 PTOCE 분석 섹션에 개시된 내용을 참조한다.
C. 연장가닥과 시그널링 올리고뉴클레오타이드 간의 이합체의 검출
일 구현예에 따르면, 단계 (c)에서의 검출은 연장가닥과 시그널링 올리고뉴클레오타이드 간의 이합체로부터 제공되는 시그널을 이용하여 실시될 수 있다. 예컨대, PCE-SH 분석에 기초하여 실시할 수 있다(참조 WO 2013/115442).
일 구현예에 따르면, 상기 방법은 상기 연장가닥에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열 및 표지를 포함하는 시그널링 올리고뉴클레오타이드(Signaling Oligonucleotide; SO)를 추가적으로 사용하고, 상기 SO와 상기 연장가닥 간의 이합체는 검출가능한 시그널을 제공하며, 상기 단계 (c)에서 연장가닥의 존재는 상기 SO와 상기 연장가닥 간의 이합체로부터 제공되는 시그널을 측정함으로써 검출된다.
상기 PCE-SH 분석에서, 검출가능한 시그널은 (i) 상기 SO에 연결된 표지, (ii) 상기 SO에 연결된 표지 및 상기 타겟 의존적 단편에 연결된 표지의 조합, (iii) 상기 SO에 연결된 표지 및 단계 (b)의 연장반응 동안 연장가닥에 삽입된 표지의 조합, 또는 (iv) 상기 SO에 연결된 표지 및 인터컬레이팅 표지(intercalating label)의 조합에 의해 제공될 수 있다.
PCE-SH 분석의 원리에 관한 세부사항은 본원에 참조로 포함된 국제공개 WO 2013/115442를 참조한다.
상기 PCE-SH 분석에 유용한 표지 시스템은 다음과 같이 설명될 수 있다:
(i) SO에 결합된 단일 표지
본 개시는 단일 표지를 이용하여 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 연장가닥 형성에 대한 시그널을 제공할 수 있다.
일 구현예에 따르면, SO는 단일 표지가 결합되어 있고 상기 SO와 연장가닥 사이의 혼성화는 상기 단일 표지로부터의 시그널의 변화를 초래하여 상기 검출가능한 시그널을 제공한다.
단일 표지의 종류 및 특징에 대해서는 PTOCE 분석 섹션에 개시된 내용을 참조한다.
일 구현예에 따르면, 상기 SO 상의 단일 표지는 5'-말단 또는 3'-말단으로부터 1 내지 15 뉴클레오타이드, 1 내지 10 뉴클레오타이드 또는 1 내지 5 뉴클레오타이드 이격된 위치에 있으며, 구체적으로, SO의 중앙 부위에 위치한다.
(ii) SO 가닥내(intrastrand) 상호작용적 이중표지
가닥내 상호작용적 이중표지의 종류 및 특징은 PTOCE 분석 섹션에 개시된 내용을 참조한다.
일 구현예에 따르면, SO는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중표지가 결합되어 있고, 상기 SO와 연장가닥 사이의 혼성화는 상호작용적 이중표지로부터의 시그널의 변화를 초래하여 검출가능한 시그널을 제공한다. 상기 SO가 혼성화되기 전에는 상기 SO 상의 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자는 구조적(conformational)으로 서로 근접하게 되어 상기 퀀처 분자가 상기 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭하며, 상기 SO가 혼성화되면, 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자는 구조적으로 이격되어 상기 퀀처 분자가 상기 리포터 분자로부터의 시그널을 언퀀칭하여, 상호작용적 이중표지로부터의 시그널 변화를 초래한다.
일 구현예에 따르면, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 SO의 5'-말단(또는 3'-말단) 및 3'-말단(또는 5'-말단)에 위치한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, SO에 결합된 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 하나는 5'-말단 또는 5'-말단으로부터 1 내지 5 뉴클레오타이드 이격된 위치에 위치하고, 나머지 하나는 SO의 형태 (conformation)에 따라 리포터 분자의 시그널을 퀀칭 및 언퀀칭하는 위치에 위치한다.
일 구현예에 따르면, SO에 결합된 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 하나는 3'-말단 또는 3'-말단으로부터 1 내지 5 뉴클레오타이드 이격된 위치에 위치하고, 나머지 하나는 SO의 형태에 따라 리포터 분자의 시그널을 퀀칭 및 언퀀칭하는 위치에 위치한다.
일 구현예에 따르면, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 서로 80 뉴클레오타이드 이내, 구체적으로, 60 뉴클레오타이드 이내, 보다 구체적으로, 30 뉴클레오타이드 이내, 보다 더 구체적으로, 25 뉴클레오타이드 이내에서 이격되어 위치한다. 일 구현예에 따르면, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 최소 4 뉴클레오타이드, 최소 6 뉴클레오타이드, 최소 10 뉴클레오타이드, 최소 15 뉴클레오타이드 이격된다.
(iii) 가닥 간(interstrand) 상호작용적 이중표지
가닥 간 상호작용적 이중표지를 사용하는 구현예에서, 연장가닥은 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중표지 중 하나를 가지며, SO는 상호작용적 이중표지 중 나머지 하나를 갖는다.
가닥 간 상호작용적 이중표지를 사용하는 구현예는 다음의 세 가지 방식에 따라 실시될 수 있다:
첫 번째 방식에 따르면, SO는 상호작용적 이중표지의 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 하나의 표지를 포함하고, 상기 타겟 의존적 단편은 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 나머지 하나의 표지를 포함하며, 상기 연장가닥은 상기 타겟 의존적 단편에서 유래된 표지를 포함하고; 상기 SO와 상기 연장가닥 사이의 혼성화는 상기 상호작용적 이중표지로부터의 시그널의 변화를 초래하여 검출가능한 시그널을 제공한다.
SO에 결합되는 표지는 리포터 분자 또는 퀀처 분자일 수 있고, 타겟 의존적 단편에 결합된 표지는 퀀처 분자 또는 리포터 분자일 수 있다.
TO의 절단위치를 고려하여 TO 상의 표지의 위치를 결정함으로써, 타겟 의존적 단편 상에 표지가 존재하게 할 수 있다.
SO와의 혼성화에서 SO에 결합된 표지와 상호작용하여 시그널 변화를 유도하는 한, 표지는 타겟 의존적 단편의 어떠한 위치(예컨대, TO의 태깅부위)에도 결합할 수 있다. 타겟 의존적 단편과의 혼성화에서 타겟 의존적 단편에 결합된 표지와 상호작용하여 시그널 변화를 유도하는 한, 표지는 SO의 어떠한 위치(예컨대, SO의 5'-말단)에도 결합할 수 있다.
두 번째 방식에 따르면, SO는 상호작용적 이중표지의 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 하나의 표지를 포함하고, 상기 제1 형태의 FHO의 템플레이팅 부위는 합성 비자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드를 포함하며, 상기 단계 (b)의 연장반응은 상기 합성 비자연 염기와 특이적 결합 친화성을 가지는 상보적 합성 비자연 염기 및 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 나머지 하나의 표지를 갖는 뉴클레오타이드의 존재 하에서 실시되며, 이에 의해 상기 연장가닥에 표지가 삽입되고; 상기 SO와 상기 연장가닥 사이의 혼성화는 상기 상호작용적 이중표지로부터의 시그널의 변화를 초래하여 검출가능한 시그널을 제공한다. SO와의 혼성화에서 SO에 결합된 표지와 상호작용하여 시그널 변화를 유도하는 한, 연장가닥에 삽입되는 표지는 연장가닥의 어떠한 위치(예컨대, 연장가닥의 3'-말단)에도 결합할 수 있다. 연장가닥과의 혼성화에서 연장가닥에 삽입된 표지와 상호작용하여 시그널 변화를 유도하는 한, 표지는 SO의 어떠한 위치(예컨대, SO의 5'-말단)에도 결합할 수 있다.
세 번째 방식에 따르면, SO는 상호작용적 이중표지의 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 하나의 표지를 포함하고, 단계 (b)의 연장반응은 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 나머지 하나의 표지를 갖는 뉴클레오타이드의 존재 하에서 실시되며, 이에 의해 상기 연장가닥에 표지가 삽입되고; 상기 SO와 상기 연장가닥 사이의 혼성화는 상기 상호작용적 이중표지로부터의 시그널의 변화를 초래하여 검출가능한 시그널을 제공한다.
(iv) 두 개의 SO를 이용한 상호작용적 이중표지
두 개의 SO를 이용한 상호작용적 이중표지의 구현예에서, 본 발명의 방법은 추가적으로 SO를 하나 더 포함하고, 상기 추가된 SO는 상기 연장가닥에 상보적인 서열을 포함하며, 상기 두 개의 SO는 상기 연장가닥에 근접하여 혼성화되고; 상기 두 개의 SO는 각각 상호작용적 이중표지의 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 하나의 표지를 포함하며, 상기 두 개의 SO와 상기 연장가닥 사이의 혼성화는 상기 상호작용적 이중표지로부터의 시그널의 변화를 초래하여 검출가능한 시그널을 제공한다.
구체적으로, 상기 두 개의 SO 중 최소한 하나의 SO는 단계 (b)의 연장반응에서 새롭게 생성된 연장서열과 혼성화되는 부위를 포함한다.
두 개의 SO를 이용한 상호작용적 이중표지의 원리는 다음과 같다: 두 개의 SO는 상기 연장가닥과 혼성화된다. 혼성화에서 두 개의 SO는 서로 근접하여 연장가닥과 혼성화되기 때문에, 두 개의 SO에 있는 리포터 분자 및 퀀처 분자는 인접하여 상기 퀀처 분자가 상기 리포터 분자로부터 나오는 시그널을 퀀칭(quenching)하도록 하여 결과적으로 상호작용적 이중표지로부터 시그널의 변화(예컨대, 리포터 분자로부터의 시그널 증가)를 초래한다. 한편, 타겟 핵산 서열이 없는 경우, 연장가닥이 생성되지 않기 때문에 두 개의 SO는 혼성화되지 않는다. 혼성화되지 않은 두 개의 SO에 있는 리포터 분자 및 퀀처 분자는 서로 이격되어 리포터 분자로부터 시그널을 제공한다.
일 구현예에 따르면, 연장가닥에 혼성화되어 퀀처 분자가 리포터 분자로부터 시그널을 퀀칭할 수 있도록 하는 한, 두 개의 SO는 연장가닥의 어떠한 위치에도 혼성화될 수 있다. 예를 들어, 두 개의 SO는 바로 인접하거나, 1 내지 5 뉴클레오타이드 이격되어 위치할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 두 개의 SO가 연장가닥에 인접하여 혼성화되는 경우, 퀀처 분자가 리포터 분자로부터 시그널을 퀀칭할 수 있도록 하는 한, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 두 개의 SO의 어떠한 위치에도 결합할 수 있다. 예를 들어, 하나의 SO의 5'-말단 또는 5'-말단으로부터 1 내지 5 뉴클레오타이드 이격된 위치에 리포터 분자 또는 퀀처 분자가 결합되고, 다른 SO의 3'-말단 또는 3'-말단으로부터 1 내지 5 뉴클레오타이드 이격된 위치에 퀀처 분자 또는 리포터 분자가 결합될 수 있다.
D. 연장가닥과 시그널링 올리고뉴클레오타이드 간의 이합체의 절단의 검출
일 구현예에 따르면, 단계 (c)에서의 검출은 상기 제1 이합체에서의 연장가닥과 시그널링 올리고뉴클레오타이드 간의 이합체의 절단으로부터 제공되는 시그널을 이용하여 실시될 수 있다. 예컨대, PCE-SC 분석에 따라 실시할 수 있다(참조 WO 2013/157821).
일 구현예에 따르면, 상기 방법은 상기 연장가닥에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열 및 표지를 포함하는 시그널링 올리고뉴클레오타이드(Signaling Oligonucleotide; SO)를 추가적으로 사용하고, 상기 SO와 상기 연장가닥 간의 이합체는 뉴클레오절단효소(nucleolytic enzyme)에 의해 절단되는 절단 위치를 포함하며, 상기 SO와 상기 연장가닥 간의 이합체는 상기 절단 위치에서의 절단에 의해 검출가능한 시그널을 제공하고, 상기 단계 (c)에서 연장가닥의 존재는 상기 SO와 상기 연장가닥 간의 이합체의 절단으로부터 제공되는 시그널을 측정함으로써 검출된다.
상기 PCE-SC 분석에서, 상기 SO 및 연장가닥 간의 이합체는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중표지 또는 단일 표지, 및 5'→3' 엑소뉴클레아제, 리보뉴클레아제 또는 제한효소에 의해 절단되는 절단 위치를 포함하고, 상기 SO 및 상기 연장가닥 간의 이합체의 절단은 상기 상호작용적 이중표지 또는 단일 표지로부터 시그널의 변화를 초래하여 상기 검출가능한 시그널을 제공할 수 있다.
PCE-SC 분석의 원리에 관한 세부사항은 본원에 참조로 포함된 국제공개 WO 2013/157821을 참조한다.
상기 PCE-SC 분석에 유용한 표지 시스템은 다음과 같이 설명될 수 있다:
(i) 상호작용적 이중표지
상호작용적 이중표지의 종류 및 특징은 PTOCE 분석 섹션에서 기재된 내용을 참고한다.
일 구현예에 따르면, 연장가닥과 SO 간의 이합체의 절단 발생(즉, 타겟 핵산 서열의 존재)을 나타내는 시그널은 상호작용적 표지 시스템에 의하여 제공되며, 특히 FRET 표지 시스템(즉, 상호작용적 이중표지 시스템)에 의하여 제공된다.
일 구현예에 따르면, 상기 SO는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중표지를 갖고, 상기 핵산절단 효소에 대한 절단 위치는 상기 SO에 연결된 상기 리포터 분자 및 상기 퀀처 분자 사이에 위치하며, 상기 연장가닥과 SO 간의 이합체에서 상기 SO의 절단은 상기 리포터 분자 및 상기 퀀처 분자를 서로 분리시키고, 상기 연장가닥과 SO 간의 이합체의 SO에 대한 절단반응의 발생은 상기 표지로부터의 시그널을 측정함으로써 검출한다.
특정 구현예에서, 상기 연장가닥과 SO 간의 이합체의 생성 전에 상기 퀀처 분자는 상기 리포터 분자로부터 시그널을 퀀칭할 수 있는 위치에 위치한다.
본 개시에서 상기 상호작용적 표지 시스템은 액상 및 고상에서 이용된다.
상기 상호작용적 표지 시스템이 이용될 경우, 생성되는 절단 위치는 5' 뉴클레아제, 제한효소 또는 리보뉴클레아제에 대한 절단 위치이다.
상기 핵산절단 효소(예컨대, 5' 뉴클레아제)는 상기 연장가닥과 SO 간의 이합체의 SO의 5'-말단 부위를 절단하여 상기 리포터 분자를 방출할 수 있으며, 그로 인해 상기 리포터 분자로부터 시그널 변화를 유도한다. 상기 연장가닥과 SO 간의 이합체의 절단 발생은 상기 타겟 핵산 서열의 존재 결정을 위한 형광 시그널을 측정함으로써 검출할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 최소 하나는 상기 SO의 5'-말단에 연결되어 있다. 특정 구현예에서, 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 하나는 상기 SO의 5'-말단에 연결되어 있고, 다른 하나는 3'-말단에 연결되어 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 SO 상에서 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 하나는 그의 5'-말단 또는 그의 5'-말단으로부터 1 내지 10 뉴클레오타이드 이격되어 위치하며, 다른 하나는 상기 연장가닥과 SO의 혼성화 전에는 상기 리포터 분자로부터 시그널을 퀀칭하도록 위치한다.
일 구현예에 따르면, 상기 SO 상에서 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 하나는 그의 3'-말단 또는 그의 3'-말단으로부터 1 내지 10 뉴클레오타이드 이격되어 위치하며, 다른 하나는 상기 연장가닥과 SO의 혼성화 전에는 상기 리포터 분자로부터 시그널을 퀀칭하도록 위치한다.
예를 들어, 상기 SO 상에서 상기 리포터 분자는 그의 5'-말단 또는 그의 5'-말단으로부터 1 내지 5 뉴클레오타이드 이격되어 위치할 수 있으며, 상기 퀀처 분자는 상기 리포터 분자로부터 5 내지 80 뉴클레오타이드 이격되어 위치할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 상호작용적 이중표지는 상기 연장가닥과 SO 간의 이합체의 형성에 앞서 퀀칭 현상을 유지하기에 충분한 위치에 위치하며, 상기 연장가닥과 SO 간의 이합체의 절단에 따라 언퀀칭을 유도한다.
상기 연장가닥과 SO 간의 이합체의 절단 동안 실시간 시그널 생성을 고려할 때, 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자는 서로 80 뉴클레오타이드 이내, 60 뉴클레오타이드 이내, 30 뉴클레오타이드 이내, 25 뉴클레오타이드 이내, 20 뉴클레오타이드 이내, 15 뉴클레오타이드 이내 또는 10 뉴클레오타이드 이내에서 이격되어 위치할 수 있다. 일 구현예에 따르면, 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자는 최소 3 뉴클레오타이드, 최소 4 뉴클레오타이드, 최소 5 뉴클레오타이드, 최소 6 뉴클레오타이드, 최소 10 뉴클레오타이드 또는 최소 15 뉴클레오타이드 이격된다.
또한, 표지(예컨대, 리포터 분자)를 갖는 절단된 단편이 생성되기 때문에, 상기 연장가닥과 SO 간의 이합체의 절단 발생은 보다 유연하거나 편리한 조건(예컨대, 고엄격 조건 또는 고상 기질 상에서 세척 후 조건) 하에서 상기 절단된 단편에 연결된 표지로부터 시그널을 직접적으로 검출함으로써 분석할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 고정화된 SO에 연결된 상호작용적 이중표지 중 하나는 상기 연장가닥과 SO 간의 이합체의 절단 후에 고상 기질 상에 남는다.
일 구현예에 따르면, 고상 기질상에 고정화된 상기 SO가 상호작용적 이중표지를 갖고, 5' 뉴클레아제가 핵산절단 효소로 사용되는 경우, 상기 연장가닥과 SO 간의 이합체로부터 SO 단편을 해리하는 적당한 조건을 부여하거나 상기 SO의 내부 뉴클레오타이드에 5' 뉴클레아제 활성에 대하여 내성(예컨대, 5' → 3' 엑소뉴클레아제 활성 또는 그의 염기 상에 표지를 갖는 뉴클레오타이드에 대하여 내성을 갖는 백본을 포함하는 뉴클레오타이드)을 부여함으로써, 상기 연장가닥과 SO 간의 이합체의 절단 후 상기 상호작용적 이중표지 중 하나는 고상 기질 상에 확실히 남아 있을 수 있다.
상기 SO가 상기 연장가닥에 비-상보적인 5'-태깅 부위를 포함하는 경우, 리포터 또는 퀀처 분자는 상기 절단 위치를 고려하여 상기 5'-태깅 부위에 위치할 수 있다.
(ii) 단일 표지
또한 본 개시는 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 연장가닥과 SO 간의 이합체의 발생에 대한 시그널을 제공하는 단일 표지 시스템을 이용하여 우수하게 실시된다.
단일 표지의 구체적인 종류 및 특징은 PTOCE 분석에 기재된 내용을 참조한다.
일 구현예에서, 상기 SO는 단일 표지를 가지고, 상기 연장가닥과 SO 간의 이합체의 SO 절단은 단일 표지를 갖는 단편을 생성하며, 상기 연장가닥과 SO 간의 이합체의 SO 절단 발생은 상기 단일 표지된 단편의 방출을 검출함으로써 검출한다. 이 경우, 상기 SO의 절단에 앞서 상기 단일 표지로부터 제공된 시그널은 상기 SO의 절단 후 상기 단일 표지로부터 제공된 시그널과 상이하고, 상기 시그널의 차이는 상기 연장가닥과 SO 간의 이합체의 SO 절단 발생을 검출할 수 있도록 한다.
일 구현예에 따르면, 상기 단일 표지는 상기 SO의 5'-말단 또는 3'-말단에 연결된다.
본 개시에서 단일 표지를 사용하는 경우, 본 개시는 고정화된 SO를 사용하여 고상에서 효율적으로 실시된다. 일 구현예에 따르면, 상기 SO는 그의 5'-말단 또는 3'-말단을 통해 고상 기질 상에 고정화된다.
일 구현예에 따르면, 상기 SO는 그의 5'-말단 또는 3'-말단을 통해 고상 기질의 표면 상에 고정화되고, 상기 SO는 단일 표지를 가지며, 상기 연장가닥과 SO 간의 이합체의 SO 절단은 단일 표지를 갖는 단편을 생성시키고, 상기 단편은 고상 기질 상에서 방출되며, 그로 인해 시그널 변화가 상기 고상 기질 상에서 제공되어 상기 연장가닥과 SO 간의 이합체의 SO 절단 발생을 검출한다.
상기 SO가 그의 3'-말단을 통해 상기 고상 기질 상에 고정화되는 경우, 상기 단일 표지는 상기 SO의 5'-말단에 연결되며, 생성되는 상기 절단 위치는 5'-뉴클레아제, 제한효소 또는 리보뉴클레아제에 대한 절단 위치이다.
특정 구현예에서, 상기 SO의 단일 표지는 5'-말단 또는 5'-말단으로부터 1 내지 5 뉴클레오타이드 이격되어 위치한다. 택일적으로, 상기 단일 표지는 상기 SO의 3'-말단 또는 3'-말단으로부터 1 내지 5 뉴클레오타이드 이격되어 위치한다.
E. 제1 형태의 FHO와 혼성화 올리고뉴클레오타이드 간의 이합체의 검출
일 구현예에 따르면, 단계 (c)에서의 검출은 제1 형태의 FHO와 혼성화 올리고뉴클레오타이드 간의 이합체로부터 제공되는 시그널을 이용하여 실시될 수 있다. 예컨대, PCE-NH 분석에 따라 실시할 수 있다(참조 WO 2014/104818).
일 구현예에 따르면, 상기 방법은 상기 제1 형태의 FHO에 대한 혼성화 올리고뉴클레오타이드 서열 및 표지를 포함하는 혼성화 뉴클레오타이드(Hybridizing Oligonucleotide; HO)를 추가적으로 사용하며, 상기 HO와 상기 제1 형태의 FHO 간의 이합체는 검출가능한 시그널을 제공하고, 상기 단계 (c)에서 연장가닥의 존재는 상기 HO와 상기 제1 형태의 FHO 간의 이합체로부터 제공된 시그널을 측정함으로써 검출되며, 상기 HO와 상기 제1 형태의 FHO 간의 이합체로부터의 시그널의 존재는 상기 연장가닥의 부존재를 나타낸다.
상기 PCE-NH 분석에서, 검출가능한 시그널은 (i) 상기 HO에 연결된 표지, (ii) 상기 제1 형태의 FHO에 연결된 표지, (iii) 상기 HO에 연결된 표지 및 상기 제1 형태의 FHO에 연결된 표지의 조합, 또는 (iv) 인터컬레이팅 표지(intercalating label)에 의해 제공될 수 있다.
PCE-NH 분석의 원리에 관한 세부사항은 본원에 참조로 포함된 국제공개 WO 2014/104818을 참조한다.
상기 PCE-NH 분석에 유용한 표지 시스템은 다음과 같이 설명될 수 있다:
(i) HO 또는 제1 형태의 FHO에 연결된 단일 표지
본 개시는 단일 표지가 있는 HO를 제1 형태의 FHO에 혼성화시킴으로써 또는 HO를 단일 표지가 있는 제1 형태의 FHO에 혼성화시킴으로써, 연장가닥의 부존재를 나타내는 시그널을 제공할 수 있다.
일 구현예에 따르면, HO와 제1 형태의 FHO 간의 혼성화가 가능한 온도에서 시그널을 검출하는 것이 필요하다.
(ii) HO 또는 제1 형태의 FHO에 연결된 상호작용적 이중표지
일 구현예에 따르면, 검출가능한 시그널은 HO 또는 제1 형태의 FHO에 연결된 상호작용적 이중표지에 의해 제공된다.
구체적으로, 타겟 의존적 단편이 제1 형태의 FHO에 혼성화된다. 이후, 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중표지로 표지된 HO가 제1 형태의 FHO의 템플레이팅 부위에 혼성화된다. 그리고 나서, 상기 타겟 의존적 단편이 연장되고, 상기 연장은 상기 HO의 절단을 유도하여 리포터 분자를 퀀처 분자로부터 분리시키고, 이에 의해 연장가닥의 존재를 나타내는 시그널이 제공된다.
이와 같은 구현예에서, 뉴클레오타이드에 연결된 상호작용적 이중표지가 서로 상대적으로 근접하는 경우, HO 절단 전과 절단 후 사이의 시그널 변화를 시그널 검출을 위해 이용할 수 있다.
뉴클레오타이드에 연결된 상호작용적 이중 표지가 서로 상대적으로 거리가 먼 경우, HO와 제1 형태의 FHO 간의 혼성화는 상호작용적 이중표지의 구조적 이격을 유도하여 HO가 절단되지 않는 경우에도 리포터 분자로부터의 시그널을 언퀀칭하며, 이에 의해 시그널의 변화를 제공한다. 이러한 경우, HO의 절단된 단편으로부터의 시그널은 HO와 제1 형태의 FHO 간의 혼성화를 방지할 수 있는 보다 높은 온도(예컨대, 95℃)에서 검출될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 절단된 HO 및 비절단된 HO가 구별되는 시그널을 제공할 수 있는 한, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 HO의 어떠한 사이트에도 위치할 수 있다.
특정 구현예에서, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 HO의 양 말단에 각각 위치한다.
(iii) HO 및 제1 형태의 FHO에 연결된 상호작용적 이중표지
일 구현예에 따르면, 하나는 HO에 연결되고 다른 하나는 제1 형태의 FHO에 연결된 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중표지에 의해 검출가능한 시그널이 제공된다.
특정 구현예에서, HO가 제1 형태의 FHO에 혼성화되는 경우 리포터 분자로부터의 시그널이 퀀처 분자에 의해 퀀칭되도록, 리포터 분자 및 퀀처 분자가 HO 및 제1 형태의 FHO 상에 위치한다. 타겟 의존적 단편의 연장에 의해 유도된 HO의 절단은 제1 형태의 FHO로부터 HO를 방출시키고 리포터 분자를 퀀처 분자로부터 이격시켜, 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 언퀀칭하게 하며, 이에 의해 연장가닥의 존재를 나타내는 시그널을 제공한다.
일 구현예에 따르면, HO와 제1 형태의 FHO간의 혼성화가 가능한 온도에서 시그널을 검출하는 것이 필요하다.
일 구현예에 따르면, 상기 HO는 헤어핀 구조를 갖도록 디자인될 수 있다.
특정 구현예에서, 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 하나는 HO의 3'-말단에 연결되고 다른 하나는 제1 형태의 FHO의 5'-말단에 연결된다.
일 구현예에 따르면, 2개의 HO를 사용한 상호작용적-이중표지와 같은 표지 시스템을 HO를 이용하는 본 개시의 방법에 이용할 수 있다. 절단된 HO 및 비절단된 HO가 구별되는 시그널을 제공할 수 있는 한, 상호작용적-이중표지는 2개의 HO의 어떠한 사이트에도 위치할 수 있다. 표지의 종류 및 위치는 상기 SO의 설명을 참고하여 설명될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 인터컬레이팅 염료를 사용한 FRET과 같은 표지 시스템을 HO를 이용하는 본 개시의 방법에 이용할 수 있다. 절단된 HO 및 비절단된 HO가 인터컬레이팅 염료의 존재하에서 구별되는 시그널을 제공할 수 있는 한, FRET 표지는 HO의 어떠한 사이트에도 위치할 수 있다.
F. 연장가닥과 고정화된 고정화 올리고뉴클레오타이드 간의 이합체의 검출
일 구현예에 따르면, 단계 (c)에서의 검출은 연장가닥과 고상 기질 상에 고정화된 고정화 올리고뉴클레오타이드 간의 이합체로부터 제공되는 시그널을 이용하여 실시될 수 있다. 예컨대, PCE-IH 분석에 따라 실시할 수 있다(참조 WO 2015/008985).
일 구현예에 따르면, 상기 방법은 상기 연장가닥에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 고상 기질 상에 고정화된 고정화 올리고뉴클레오타이드(Immobilizing Oligonucleotide; IO)를 추가적으로 사용하고, 상기 연장가닥은 표지를 포함하며, 상기 연장가닥과 상기 IO 간의 이합체에 의해 상기 고상 기질 상에서 검출가능한 시그널을 제공하며, 상기 단계 (c)에서 연장가닥의 존재는 상기 연장가닥과 상기 IO 간의 이합체로부터 제공된 시그널을 측정함으로써 검출된다.
상기 PCE-IH 분석에서, 상기 검출가능한 시그널은 (i) 상기 타겟 의존적 단편에 연결된 표지, (ii) 상기 단계 (b)의 연장반응 동안 상기 연장가닥에 삽입되는 표지, 또는 (iii) 상기 타겟 의존적 단편에 연결된 표지 및 상기 단계 (b)의 연장반응 동안 상기 연장가닥에 삽입되는 표지의 조합에 의해 제공될 수 있다.
PCE-IH 분석의 원리에 관한 세부사항은 본원에 참조로 포함된 국제공개 WO WO 2015/008985를 참조한다.
상기 PCE-IH 분석에 유용한 표지 시스템은 다음과 같이 설명될 수 있다:
(i) 타겟 의존적 단편에 결합된 단일 표지
본 발명은 단일 표지를 이용함으로써 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 연장가닥의 존재에 대한 시그널을 제공할 수 있다. 단일 표지로 표지된 타겟 의존적 단편은 제1 형태의 FHO에 혼성화되고 제1 형태의 FHO 상에서 연장되어 연장가닥을 생성하며, 상기 단일 표지는 상기 연장가닥에 포함된다. 이어, 상기 연장가닥이 고상 기질에 고정된 IO에 혼성화되어 고상 기질 상에 검출가능한 시그널을 제공한 후, 연장가닥의 존재를 나타내는 시그널이 검출된다.
상기 방법에서 사용될 수 있는 단일 표지의 종류 및 특징은 PTOCE 분석 섹션에 개시된 내용을 참고한다.
일 구현예에 따르면, TO로부터 방출된 타겟 의존적 단편이 단일 표지를 포함하도록 하는 한, 상기 TO 상의 단일 표지는 어떠한 사이트에도 위치할 수 있다. 일 구현예에 따르면, 상기 TO 상의 단일 표지는 태깅 부위의 어떠한 사이트에도 위치할 수 있으며, 예컨대 태깅 부위의 5'-말단에 위치할 수 있다.
(ii) 연장 반응 동안 연장가닥에 삽입되는 표지
일 구현예에 따르면, 본 개시에서 사용되는 표지는 연장가닥에 삽입되는 표지이고, 제1 형태의 FHO의 템플레이팅 부위는 합성 비자연 염기를 포함하는 뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 단계 (b)의 연장 반응은 표지 및 상기 합성 비자연 염기에 대하여 특이적 결합 친화성을 갖는 상보적 합성 비자연 염기를 포함하는 뉴클레오타이드의 존재하에서 실시되며, 이에 의해 상기 연장가닥에 표지가 삽입된다. 이어, 상기 연장가닥이 고상 기질 상에 고정된 IO에 혼성화되어 고상 기질 상에 검출가능한 시그널을 제공하며, 연장가닥의 존재를 나타내는 시그널이 검출된다.
(iii) 타겟 의존적 단편의 단일 표지 및 연장가닥에 삽입되는 표지의 조합
일 구현예에 따르면, 본 개시에서 사용되는 표지는 타겟 의존적 단편에 결합된 단일 표지 및 연장 반응 동안 연장가닥에 삽입되는 표지의 조합이고, 상기 단일 표지 및 상기 삽입된 표지는 수용자(acceptor) 및 공여자(donor)의 쌍을 포함하는 상호작용적 이중표지이다.
일 예로서, 형광 단일 표지(공여자)로 표지된 태깅 부위를 포함하는 TO는 타겟 핵산 서열에 혼성화된 다음 절단된다. 상기 형광 단일 표지(공여자)를 포함하는 타겟 의존적 단편은 템플레이팅 부위에 합성 비자연 염기(예컨대, iso-dC)를 포함하는 제1 형태의 FHO에 혼성화되며, 수용자로 표지된 상기 합성 비자연 염기에 대한 상보적 합성 비자연 염기(예컨대, iso-dG)가 타겟 의존적 단편의 연장 반응 동안 iso-dC의 반대쪽에 삽입되어 연장가닥에 수용자가 도입되며, 이에 의해 연장가닥 상에 상호작용적 이중표지가 형성된다. 이어, 상기 연장가닥은 고상 기질 상에 고정된 IO에 혼성화되고, 공여자에 대한 여기 광(excitation light)을 이용하여 조사시켜 공여자로부터 수용자로의 에너지 전이를 유발하며, 이에 의해 수용자로부터의 시그널 변화를 유도하여 고상 기질 상에 검출가능한 시그널을 제공한다.
(iv) 인터컬레이팅 염료
일 구현예에 따르면, 연장가닥과 IO 간의 혼성화는 인터컬레이팅 염료의 존재하에서 실시하며, 연장가닥에 포함된 표지는 상기 인터컬레이팅 염료로부터의 시그널을 받는 수용자이고, 상기 연장가닥 및 IO 간의 이합체에 삽입된 인터컬레이팅 염료로부터의 시그널은 상기 수용자로 전이되며, 상기 수용자는 검출가능한 시그널을 제공한다.
예를 들어, 형광 표지(수용자)로 표지된 태깅 부위를 포함하는 TO가 타겟 핵산 서열에 혼성화된 다음 절단된다. 형광 표지(수용자)를 포함하는 타겟 의존적 단편이 제1 형태의 FHO에 혼성화되고, 연장되어 연장가닥을 형성한다. 이어, 상기 연장가닥은 공여자로서의 인터컬레이팅 염료의 존재하에서 고상 기질 상에 고정된 IO에 혼성화되어 상기 혼성화물 내로 인터컬레이팅 염료가 삽입된다. 공여자에 대한 여기 광을 이용하여 조사 후, 공여자로부터 수용자로의 에너지 전이가 유발되고, 이에 의해 수용자로부터의 시그널 변화를 유도하여 고체 기질 상에 검출가능한 시그널을 제공한다.
택일적으로, 연장가닥에 포함되는 표지의 사용 없이, 연장가닥과 IO 간의 혼성화는 인터컬레이팅 염료의 존재하에서 실시될 수 있으며, 연장가닥 및 IO 간의 이합체에 삽입된 인터컬레이팅 염료로부터의 시그널을 검출하여, 타겟 핵산 서열의 존재를 분석한다.
G. 제3 형태의 FHO를 사용한 제3 이합체의 검출
일 구현예에 따르면, 단계 (c)에서의 검출은 연장가닥과 추가적인 제3 형태의 FHO 간의 이합체로부터 제공되는 시그널을 이용하여 실시될 수 있다. 예컨대, PTOCE-E(PTO cleavage and extension-dependent extension) 분석에 따라 실시될 수 있다(참조 WO 2019/0666461)
본 개시의 제3 형태의 FHO 및 제3 이합체는 전술한 PTOCE-E 방법에서의 제2 CTO, 제2 연장이합체에 각각 대응될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 방법은 단계 (c) 대신에 하기 단계를 수행한다:
(c-1) 상기 연장가닥과 제3 형태의 FHO를 혼성화시키는 단계로서, 상기 제3 형태의 FHO는 3'에서 5' 순서로 (i) 상기 연장가닥에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 연장가닥에 대한 비-혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하며; 상기 연장가닥은 상기 제3 형태의 FHO의 캡처링 부위와 혼성화되고;
(c-2) 주형-의존적 핵산 중합효소 및 상기 단계 (c-1)의 결과물을 이용하여 연장반응을 실시하는 단계로서, 상기 제3 형태의 FHO의 캡처링 부위에 혼성화된 연장가닥은 추가로 연장되어 상기 제3 형태의 FHO의 템플레이팅 부위와 상보적인 제2 연장서열을 포함하는 제2 연장가닥을 생성하고, 이에 따라 제2 연장가닥과 제3 형태의 FHO 간에 제3 이합체를 형성하며;
(c-3) 상기 제2 연장가닥의 존재를 검출하는 단계로서, 상기 제2 연장가닥의 존재는 상기 타겟 핵산 서열의 존재를 나타낸다.
상기 PTOCE-E 분석은 A. 제3 이합체의 검출; B. 제3 이합체의 절단의 검출; C. 제2 연장가닥과 시그널링 올리고뉴클레오타이드 간의 이합체의 검출; D. 제2 연장가닥과 시그널링 올리고뉴클레오타이드 간의 이합체의 절단의 검출; E. 제3 형태의 FHO와 혼성화 올리고뉴클레오타이드 간의 이합체의 검출; 및 제2 연장가닥과 고정화된 고정화 올리고뉴클레오타이드 간의 이합체의 검출과 같은 다양한 분석 방법에 따라 실시될 수 있다.
PTOCE-E 분석의 원리에 관한 세부사항은 본원에 참조로 포함된 국제공개 WO 2019/0666461를 참조한다.
일 구현예에 있어서, 상기 방법이 상기 제2 합체를 형성하는 경우, 상기 단계 (c)에서의 제2 이합체 존재의 검출은 종래 공지된 다양한 방법에 의해 실시될 수 있다. 예컨대, 상기 방법이 상기 제2 이합체를 형성하는 경우, 상기 단계 (c)에서 제2 이합체 존재의 검출은, 멜팅 분석과 조합된 이중 퀀칭 분석(WO 2016/101959)을 이용하여 실시할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 방법이 제2 이합체를 형성하는 경우, 상기 TO는 리포터 분자 및 제1 퀀처 분자가 연결되어 있고, 상기 제2 형태의 FHO는 제2 퀀처 분자가 연결되어 있다. 상기 TO는 상기 단계 (a) 반응 동안 타겟 핵산 서열의 존재에 의존적으로 절단되어 상기 리포터 분자를 포함하는 타겟 의존적 단편을 방출하고, 상기 타겟 의존적 단편에 포함된 상기 리포터 분자와 상기 제2 형태의 FHO에 연결된 제2 퀀처 분자는 온도에 따른 상기 타겟 의존적 단편과 상기 제2 형태의 FHO 간의 제2 이합체의 형성 및 해리에 의해 검출가능한 시그널을 제공할 수 있다. 상기 단계 (c)에서 제2 이합체의 존재는 상기 제2 이합체로부터 제공되는 시그널을 측정함으로써 검출될 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 제2 이합체의 시그널은 멜팅 분석에 의해 측정하거나 멜팅 후 혼성화 분석에 의해 측정함으로써, 실시될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 단계 (c)에서 제2 이합체의 존재의 검출은 혼성화 후 멜팅 분석을 통해 실시된다. 예컨대, 단계 (c)에서 제2 이합체의 검출은, 제2 이합체가 형성되고 그 결과물이 일정 범위의 온도에서 멜팅되어 제2 이합체의 존재를 나타내는 시그널을 제공하는 멜팅 분석을 통해 실시한다.
일 구현예에 따르면, 단계 (c)에서 제2 이합체의 존재의 검출은 멜팅 후 혼성화 분석을 통해 실시된다. 예컨대, 단계 (c)에서 제2 이합체의 검출은, 제2 이합체가 멜팅되고 그 결과물이 일정 범위의 온도에서 혼성화되어 제2 이합체의 존재를 나타내는 시그널을 제공하는 혼성화 분석을 통해 실시한다.
일 구현예에 있어서, 상기 방법이 제2 이합체를 형성하는 경우, 상기 TO에 연결된 리포터 분자는 상기 타겟 의존적 단편과 함께 방출될 수 있는 위치에 연결될 수 있으며, 상기 TO에 연결된 제1 퀀처 분자는 단계 (a)에서 TO가 절단되기 전에는 TO에 연결된 리포터 분자에 근접하여 리포터 분자로부터 시그널을 퀀칭시키되, 단계 (a)에서 TO가 절단된 이후에는 상기 타겟 의존적 단편과 함께 방출되지 않는 위치에 연결될 수 있다. 예컨대, 리포터 분자는 상기 TO의 태깅 부위에 연결되고, 제1 퀀처 분자는 상기 TO의 타겟팅 부위에 연결될 수 있다. 상기 제2 형태의 FHO에 연결된 제2 퀀처 분자는 상기 제2 형태의 FHO가 제2 이합체를 형성한 경우, 상기 리포터 분자로부터 시그널을 퀀칭시킬 수 있는 위치에 연결될 수 있다.
본 개시의 방법에 사용된 TO 및 FHO(제1 형태의 FHO 또는 제2 형태의 FHO), 및 선택적으로 SO, HO 및 IO는 자연(naturally occurring) dNMPs로 구성될 수 있다. 택일적으로, TO 및 FHO, 및 선택적으로 SO, HO 및 IO는 변형 뉴클레오타이드 또는 비자연 뉴클레오타이드, 예컨대, PNA(Peptide Nucleic Acid, 참조 PCT 출원 제WO 92/20702호) 및 LNA(Locked Nucleic Acid, 참조 PCT 출원 제WO 98/22489호, 제WO 98/39352호 및 제WO 99/14226호)를 포함할 수 있다. TO 및 FHO 및 제3 형태의 FHO, 및 선택적으로 SO, HO 및 IO는 데옥시이노신, 이노신, 1-(2'-데옥시-베타-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤 및 5-니트로인돌과 같은 유니버설 염기를 포함할 수 있다. 용어 "유니버설 염기"는 자연 DNA/RNA 염기들 각각에 대하여 거의 구별없이 염기 쌍을 형성할 수 있는 것을 의미한다.
상술한 바와 같이, 일 구현예에서, TO가 5'-태깅 부위 및 3'-타겟팅 부위를 포함하는 경우, 상기 TO는 TO의 5'-태깅 부위의 3'-말단으로부터 3'-방향으로 이격된 한 위치에서 절단될 수 있다. 절단 위치는 TO의 3'-타겟팅 부위의 5'-말단 일부에 위치할 수 있다. 타겟 의존적 단편이 TO의 3'-타겟팅 부위의 5'-말단 일부를 포함하는 경우, 3'-타겟팅 부위의 5'-말단 일부에 혼성화되는 FHO의 위치는 유니버설 염기, 축퇴성 서열(degenerate sequence) 또는 그들의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들면, TO가 TO의 5'-태깅 부위의 3'-말단으로부터 3'-방향으로 하나의 뉴클레오타이드만큼 이격된 한 위치에서 절단된다면, 상기 뉴클레오타이드와의 혼성화를 위하여 FHO의 캡처링 부위의 5'-말단 일부는 유니버설 염기를 포함하는 것이 유리하다. 만일, TO가 TO의 5'-태깅 부위의 3'-말단으로부터 3'-방향으로 2 개의 뉴클레오타이드만큼 이격된 한 위치에서 절단된다면, FHO의 캡처링 부위의 5'-말단은 축퇴성 서열을 포함하고, 그의 3'-방향으로 인접한 뉴클레오타이드는 유니버설 염기를 포함하는 것이 유리하다. 이와 같이, 3'-타겟팅 부위의 5'-말단 일부의 다양한 위치에서 TO의 절단이 일어나는 경우, FHO에 유니버설 염기 및 축퇴성 서열을 이용하는 것이 유용하다. 또한, 업스트림 프라이머 연장-의존적 절단 유도 하에서, 동일한 5'-태깅 부위를 갖는 TO를 복수의 타겟 핵산 서열 스크리닝에 이용하는 경우, 3'-타겟팅 부위의 5'-말단 일부가 서로 다른 타겟 의존적 단편들을 생성할 수 있다. 이러한 경우, 유니버설 염기 및 축퇴성 서열은 FHO에 유용하게 사용된다. FHO에 유니버설 염기 및 축퇴성 서열을 이용하는 전략은 복수의 타겟 핵산 서열의 스크리닝을 위해서 한 타입의 FHO 또는 최소한의 타입의 FHO를 사용하도록 한다.
일 구현예에 따르면, 본 개시의 방법은 단계 (a)-(c) 전체 또는 일부를 변성을 포함하여 반복적으로 추가 실시하는 것을 포함한다. 이러한 반복은 타겟 핵산 서열 및/또는 시그널을 증폭시킨다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 개시의 방법은 상기 단계 (c) 후에 단계 (b)에서의 이합체(제1 이합체 또는 제2 이합체)를 멜팅시키거나 또는 멜팅 후 혼성화시켜 검출가능한 시그널을 제공하는 단계를 추가적으로 포함하며, 상기 시그널을 검출하여 제1 이합체에서의 연장가닥의 존재 또는 제2 이합체의 존재를 한 번 더 검출한다.
변성은 열, 알칼리, 포름아미드, 우레아 및 글리콕살 처리, 효소적 방법 (예, 헬리카아제 작용) 및 결합 단백질을 포함하는 공지된 기술을 통해 실시할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 변성은 80-105℃의 온도범위에서 열처리하여 달성될 수 있다. 상술한 변성의 일반적인 방법은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001)에 개시되어 있다.
상기 반복 과정에서 업스트림 올리고뉴클레오타이드로서 업스트림 프라이머가 사용되는 경우, 본 개시의 방법은 다운스트림 프라이머의 존재 하에서 실시하며, 구체적으로, PCR 방법에 의하여 실시한다.
일 구현예에 따르면, 상기 단계 (a)-(c)는 하나의 반응용기에서 실시하거나 또는 상기 단계 (a)-(c) 중 일부는 별도의 반응용기에서 실시된다.
본 개시는 검출 및/또는 증폭하고자 하는 타겟 핵산 서열이 모든 DNA(gDNA 및 cDNA) 및 RNA 분자를 포함하여 어떠한 특정 서열 또는 길이를 가지도록 요구하지 않는다.
mRNA를 초기 물질로 이용하는 경우, 어닐링 단계 실시 이전에 역전사 단계가 필수적이며, 이의 상세한 내용은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및Noonan, K. F. 등, Nucleic Acids Res. 16:10366 (1988)에 개시되어 있다. 역전사 반응을 위해서는, 랜덤 헥사머 또는 mRNA에 혼성화되는 올리고뉴클레오타이드 dT 프라이머가 이용될 수 있다.
본 개시에서 검출 및/또는 증폭할 수 있는 타겟 핵산 서열은 어떠한 자연(naturally occurring) 원핵세포 핵산, 진핵세포(예컨대, 원생동물과 기생동물, 균류, 효모, 고등 식물, 하등 동물 및 포유동물과 인간을 포함하는 고등동물) 핵산, 바이러스(예컨대, 헤르페스 바이러스, HIV, 인플루엔자 바이러스, 엡스타인-바 바이러스, 간염 바이러스, 폴리오바이러스 등) 핵산 또는 비로이드 핵산도 모두 포함한다.
또한, 본 개시는 뉴클레오타이드 변이의 검출에 유용하다. 구체적으로, 타겟 핵산 서열은 뉴클레오타이드 변이를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "뉴클레오타이드 변이"는 연속적 DNA 세그먼트들 또는 서열이 유사한 DNA 세그먼트들에서 특정 위치의 DNA 서열에서의 모든 단일 또는 복수의 뉴클레오타이드 치환, 결실 또는 삽입을 의미한다. 이러한 연속적 DNA 단편은 하나의 유전자 또는 하나의 염색체의 어떤 다른 부위를 포함한다. 이러한 뉴클레오타이드 변이는 돌연변이(mutant) 또는 다형성 대립유전자 변이(polymorphic allele variations)일 수 있다. 예를 들어, 본 개시에서 검출되는 뉴클레오타이드 변이는 SNP(single nucleotide polymorphism), 돌연변이(mutation), 결실, 삽입, 치환 및 전좌를 포함한다. 뉴클레오타이드 변이의 예는, 인간 지놈에 있는 다양한 변이(예컨대, MTHFR(methylenetetrahydrofolate reductase) 유전자의 변이), 병원체의 약제 내성과 관련된 변이 및 암 발생-관련 변이를 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "뉴클레오타이드 변이"는 DNA 분자의 특정 위치에서의 어떠한 변이를 포함한다. 즉, 용어 "뉴클레오타이드 변이"는 DNA 분자의 특정 위치에서의 야생형 및 그것의 어떠한 변이형을 포함한다.
타겟 핵산 서열의 뉴클레오타이드 변이를 검출하는 본 개시에서, 사용되는 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산 서열의 상기 뉴클레오타이드 변이에 대하여 상보적인 서열을 갖는 경우, 상기 뉴클레오타이드 변이를 포함하는 타겟 핵산 서열은 본 명세서에서 매칭 주형(matching template)으로 기재된다. 사용되는 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산 서열의 뉴클레오타이드 변이에 대하여 비-상보적인 서열을 갖는 경우, 상기 뉴클레오타이드 변이를 포함하는 타겟 핵산 서열은 본 명세서에서 미스매칭 주형(mismatching template)으로 기재된다.
뉴클레오타이드 변이의 검출을 위하여, 업스트림 프라이머의 3'-말단은 타겟 핵산 서열에서의 뉴클레오타이드 변이 위치의 맞은편에 위치하도록 디자인할 수 있다. 일 구현예에 따르면, 업스트림 프라이머의 3'-말단은 타겟 핵산 서열의 뉴클레오타이드 변이에 대하여 상보적인 서열을 갖는다. 타겟 핵산 서열의 뉴클레오타이드 변이에 대하여 상보적인 서열을 갖는 업스트림 프라이머의 3'-말단은 매칭 주형에 어닐링되고 연장되어 TO 절단을 유도한다. 결과물로서 타겟 의존적 단편은 FHO에 혼성화되어 시그널을 제공한다. 반대로, 업스트림 프라이머의 3'-말단이 미스매칭 주형에서 뉴클레오타이드 변이에 미스매치되는 경우, 업스트림 프라이머가 미스매칭 주형에 혼성화되더라도, 연장반응을 위해서 프라이머의 3'-말단의 어닐링이 필수적인 조건하에서는 연장되지 않으며, 이에 시그널이 제공되지 않는다.
택일적으로, 타겟 핵산 서열의 뉴클레오타이드 변이에 대하여 상보적인 서열을 갖는 TO의 혼성화에 의존적인 TO 절단을 이용할 수 있다. 예를 들어, 조절된 조건 하에서, 타겟 핵산 서열의 뉴클레오타이드 변이에 대하여 상보적인 서열을 갖는 TO는 매칭 주형에 혼성화된 후 절단된다. 결과물로서 타겟 의존적 단편은 FHO에 혼성화되어 타겟 시그널을 제공한다. 반면, 조절된 조건하에서, TO는 뉴클레오타이드 변이 위치에 비-상보적인 서열을 갖는 미스매칭 주형에는 혼성화되지 않으며, 절단되지 않는다. 이러한 경우, 구체적으로 TO의 뉴클레오타이드 변이에 대한 상보적인 서열은 TO의 타겟팅 부위의 중간에 위치한다.
택일적으로, 뉴클레오타이드 변이의 검출을 위하여, TO의 3'-타겟팅 부위의 5'-말단 일부가 타겟 핵산 서열의 뉴클레오타이드 변이에 위치하고, TO의 3'-타겟팅 부위의 5'-말단 일부는 타겟 핵산 서열의 뉴클레오타이드 변이에 대하여 상보적인 서열을 갖는 것이 바람직하다.
단일 뉴클레오타이드 변이의 검출을 위한 일 구현예에서, TO의 3'-타겟팅 부위의 5'-말단은 타겟 핵산 서열의 단일 뉴클레오타이드 변이에 대하여 상보적인 서열을 갖는다. 상술한 바와 같이, 매칭 주형에 혼성화된 TO의 절단은 예컨대, 업스트림 프라이머 연장-의존적 절단 유도 하에서, TO의 3'-타겟팅 부위의 5'-말단에 3'-방향으로 바로 근접(immediately adjacent)한 한 위치에서 유도될 수 있다. 타겟 의존적 단편의 3'-말단은 단일 뉴클레오타이드 변이에 대하여 상보적인 뉴클레오타이드를 갖는다. 타겟 의존적 단편은, 뉴클레오타이드 변이에 해당하는 서열을 포함하는 캡처링 부위를 갖는 제1 형태의 FHO에 혼성화되고 연장되어 제1 이합체를 형성하여, 타겟 시그널을 제공한다.
만일, 동일한 TO가, 단일 뉴클레오타이드 변이를 제외하고는 매칭 주형에 대하여 동일한 서열을 갖는 미스매칭 주형에 혼성화된다면, TO의 3'-타겟팅 부위의 5'-말단으로부터 3'-방향으로 2개의 뉴클레오타이드만큼 이격된 위치에서 TO의 절단이 발생될 수 있다. 타겟 의존적 단편의 3'-말단은 단일 뉴클레오타이드 변이에 상보적인 뉴클레오타이드 이외에 추가적으로 절단되는 뉴클레오타이드를 갖는다. 추가적으로 절단된 뉴클레오타이드에 혼성화되는 제1 형태의 FHO의 위치가, 상기 추가적으로 절단되는 뉴클레오타이드에 대하여 비-상보적인 서열을 갖도록 디자인된 경우, 타겟 의존적 단편의 3'-말단은 제1 형태의 FHO에 혼성화되지 않으며, 조절된 조건에서 결국 연장가닥이 생성되지 않는다. 만일 타겟 의존적 단편이 연장되어 제1 이합체를 형성하여도, 상기 이합체는, TO 및 미스매칭 주형 간의 혼성화에 의한 이합체와는 상이한 Tm 값을 갖는다.
일 구현예에 따르면, TO의 3'-타겟팅 부위의 5'-말단 일부에 뉴클레오타이드 변이에 대하여 상보적인 서열을 가지는 TO의 절단 위치는, 매칭 주형 또는 미스매칭 주형과의 혼성화에 의존적으로 달라지며, 이에 의해 상기 두 혼성화 이벤트로부터 방출되는 타겟 의존적 단편들은 상이한 서열을 가지며, 구체적으로 그의 3'-말단 일부, 보다 바람직하게는 그의 3'-말단에서 상이한 서열을 갖는다.
일 구현예에 따르면, 타겟 의존적 단편의 3'-말단 일부의 차이를 고려한 제1 형태의 FHO의 뉴클레오타이드 서열의 선택으로 매칭 주형과 미스매칭 주형을 구별할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 본 개시에 이용되는 타겟 핵산 서열은 전-증폭된 핵산서열이다. 전-증폭된 핵산서열의 이용은 본 개시의 타겟 검출의 민감도 및 특이성을 상당히 높게 증가시킨다.
일 구현예에 따르면, 상기 방법은 다운스트림 프라이머의 존재 하에 실시된다.
본 개시의 장점은 최소 2종의 타겟 핵산 서열을 동시에 검출(멀티플렉스)할 수 있다는 것이다.
일 구현예에 따르면, 상기 방법은 최소 2종의 타겟 핵산 서열을 검출하기 위해 실시된다(보다 구체적으로, 최소 3종, 보다 더 구체적으로 최소 5종).
일 구현예에 따르면, 상기 방법은 최소 2종의 타겟 핵산 서열을 검출하기 위해 실시되고(보다 구체적으로 최소 3종, 보다 더 구체적으로 최소 5종); 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 최소 2종의 올리고뉴클레오타이드를 포함하며(보다 구체적으로 최소 3종, 보다 더 구체적으로 최소 5종), TO는 최소 2종의 TO를 포함하고(보다 구체적으로 최소 3종, 보다 더 구체적으로 최소 5종), TO는 최소 1종의 FHO를 포함한다(구체적으로 최소 2종, 보다 구체적으로 최소 3종, 보다 더 구체적으로 5종). 선택적으로, SO, HO 및/또는 IO가 사용되는 경우, 상기 SO, HO 및/또는 IO는 최소 2종(보다 구체적으로 최소 3종, 보다 더 구체적으로 최소 5종)을 포함할 수 있다. 상기 최소 2종의 타겟 핵산 서열이 존재하는 경우, 상기 방법은 최소 2종의 타겟 핵산 서열에 해당하는 최소 2종의 타겟 시그널을 제공한다.
최소 2개의 TO의 태깅 부위(예컨대, 5'-태깅 부위 또는 3'-태깅 부위)는 서로 동일한 서열을 가질 수 있다. 예를 들면, 본 개시가 타겟 핵산 서열의 스크리닝에 실시되는 경우, TO의 태깅 부위는 동일한 서열을 가질 수 있다.
더욱이, 한 종류의 FHO(구체적으로, 제1 형태의 FHO)를 다수의 타겟 핵산 서열의 검출에 이용할 수 있다. 예를 들면, 태깅 부위에 동일한 서열을 갖는 TO들을 타겟 핵산 서열의 스크리닝에 이용하는 경우, 한 종류의 FHO를 이용할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 최소 2종의 타겟 핵산 서열에 해당하는 이합체(제1 이합체 또는 제2 이합체)는 서로 상이한 Tm 값을 갖는다.
일 구현예에 따르면, 최소 2종의 타겟 핵산 서열에 해당하는 최소 2종의 시그널은 서로 상이한 종류의 표지로부터 제공된다.
일 구현예에 따르면, 최소 2종의 타겟 핵산 서열에 해당하는 최소 2 종의 시그널은 서로 동일한 종류의 표지로부터 제공된다.
일 구현예에 따르면, 최소 2종의 타겟 핵산 서열에 해당하는 최소 2종의 타겟 시그널은 서로 동일한 종류의 표지로부터 제공되며; 최소 2종의 타겟 핵산 서열에 해당하는 이합체는 서로 상이한 Tm 값을 갖는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "상이한 종류의 표지"는 검출가능한 시그널이 상이한 특징을 갖는 표지를 의미한다. 예를 들면, 형광 리포터 표지로서의 FAM 및 TAMRA를 상이한 종류의 표지로써 고려되는데 이는 이들의 여기(excitation) 및 방출 파장이 서로 상이하기 때문이다.
멜팅 커브 분석에 의하여 최소 2종의 타겟 핵산 서열을 동시적으로 검출하기 위해 본 개시를 실시하여 최소 2종의 타겟 핵산 서열에 해당하는 이합체가 서로 상이한 Tm 값을 갖는 경우, 한 종류의 표지(예컨대, FAM)를 이용하더라도 최소 2종의 타겟 핵산 서열을 검출할 수 있다.
고상에 고정화된 올리고뉴클레오타이드를 이용한 타겟 검출
본 개시의 두드러진 이점은 마이크로어레이와 같은 고상에서도 타겟 핵산 서열의 검출이 효과적이라는 것이다.
일 구현에에 있어서, 상기 제1 형태의 FHO 또는 제2 형태의 FHO는 고상 기질 상에 고정화되어있다.
고상 방법의 일 구현예에 따르면, FHO는 그의 5'-말단 또는 3'-말단을 통해 고상 기질 상에 고정된다.
고상 반응을 위해, FHO는 5'-말단 또는 3'-말단(구체적으로, 3'-말단)을 통하여 고상 기질의 표면에 직접적 또는 간접적(구체적으로, 간접적)으로 고정화된다. 또한, 상기 FHO는 공유 또는 비-공유결합 방식으로 고상 기질 표면 상에 고정화될 수 있다. 상기 고정화된 FHO가 고상 기질 상에 간접적으로 고정화되는 경우, 적당한 링커가 이용된다. 본 개시에서 사용되는 링커는 고상 기질 표면 상에 프로브를 고정화하는데 이용하는 어떠한 링커도 포함할 수 있다. 예를 들어, 아민기를 갖는 알킬 또는 아릴 화합물, 또는 티올기를 갖는 알킬 또는 아릴 화합물이 링커로써 FHO 고정화에 이용될 수 있다. 또한, 폴리 (T) 테일 또는 폴리 (A) 테일이 링커로 이용될 수 있다.
고상 방법의 일 구현예에 따르면, 본 개시에서 사용되는 고상 기질은 마이크로어레이이다. 본 개시에서 반응 환경을 제공하는 마이크로어레이는 당업계에 공지되어 있는 어떠한 것도 이용할 수 있다. 본 개시의 모든 과정, 즉, 타겟 핵산 서열과의 혼성화, 절단, 연장, 혼성화, 연장, 형광 검출(또는 멜팅 또는 멜팅 후 혼성화시의 형광 검출)은 마이크로어레이에서 실시된다. 마이크로어레이 상에 고정화된 상기 FHO는 혼성화 가능한 어레이 요소(hybridizable array element)의 역할을 한다. 마이크로어레이를 제작하기 위한 고상 기질은, 금속(예컨대, 금, 금과 구리의 합금, 알루미늄), 금속 옥사이드, 유리, 세라믹, 석영, 실리콘, 반도체, Si/SiO2 웨이퍼, 게르마늄, 갈륨 아르세나이드, 카본, 탄소나노 튜브, 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 및 폴리아크릴아미드), 세파로스, 아가로스 및 콜로이드를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 개시의 다수의 고정화된 FHO는 고상 기질 상의 하나의 어드레서블(addressable) 부위 또는 두 개 또는 그 이상의 어드레서블 부위에 고정화 될 수 있으며, 고상 기질은 2-1,000,000 개의 어드레서블 부위를 포함할 수 있다. 포토리토그래피, 잉크-젯팅, 기계적 마이크로스팟팅 및 이의 유사방법과 같은 종래 제작 기술을 통해 어레이 또는 특정 응용을 위한 어레이를 생산하기 위하여 고정화된 FHO가 조립(fabricate)될 수 있다.
고상 방법의 일 구현예에 따르면, 고상 기질의 표면상에 고정화된 FHO는 상호작용적 이중표지를 포함한다.
본 개시에서 타겟 의존적 단편은 타겟 핵산과 혼성화된 TO의 절단에 의해 생성되며, 이는 제1 형태의 FHO 상에 혼성화 및 연장반응을 통해 연장 가닥을 생성하고 제1 이합체를 생성하거나 제2 형태의 FHO 상에 혼성화되어 제2 이합체를 생성한다.
일 구현예에서, 본 개시가 제1 형태의 FHO를 이용하는 경우, 연장가닥의 수를 증가시키기 위해서, 추가적인 TO를 이용한 추가적인 5' 뉴클레아제 절단 반응에 의하여 제1 형태의 FHO 상에서 연장 가능한 추가적인 단편을 제공할 수 있다. 상기 추가적인 TO를 사용하여 추가적인 단편을 생성하는 방식은 다양할 수 있다.
일 구현예에서, 추가적인 TO는 (i) 제1 형태의 FHO의 템플레이팅 부위에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3'-타겟팅 부위 및 (ii) 제1 형태의 FHO의 템플레이팅 부위에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 제1 형태의 FHO의 캡처링 부위에 상보적인 서열을 포함하는 5'-태깅 부위를 포함한다. 상기 구현예에서, 상기 추가적인 TO는 상기 제1 형태의 FHO의 캡처링 부위에 혼성화되는 타겟 의존적 단편의 다운스트림에 위치한다. 상기 타겟 의존적 단편은 연장되면서 추가적인 TO를 절단시키고, 상기 절단은 추가적인 타겟 의존적 단편을 생성한다.
일 구현예에 있어서, 상기 방법은 고상 기질 상에 고정화된 추가적인 SO, HO 또는 제3 형태의 FHO를 사용한다.
고상 방법의 일 구현예에 따르면, 본 개시는 SO(Signaling Oligonucleotide)를 사용하고, 상기 SO는 그의 5'-말단 또는 3'-말단을 통해 고상 기질 상에 고정된다.
고상 방법의 일 구현예에 따르면, 본 발명은 HO(Hybridizing Oligonucleotide)를 사용하고, 상기 HO는 그의 5'-말단 또는 3'-말단을 통해 고상 기질 상에 고정된다.
고상 방법의 일 구현예에 따르면, 본 개시는 고상 기질 상에 고정된 IO를 사용하고 제1 형태의 FHO는 고상 기질에 직접 고정화되지 않고 상기 IO를 통해 고정화될 수 있다. 이 경우, 제1 형태의 FHO는 상기 IO에 대한 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 IO-혼성화 부위를 추가적으로 포함한다. 상기 구현예에서, IO-혼성화 부위는 제1 형태의 FHO의 3'- 또는 5'-말단에 위치할 수 있다. 또한, 상기 IO-혼성화 부위가 상기 제1 형태의 FHO의 5'-말단에 위치하는 경우, 상기 제1 형태의 FHO는 제1 형태의 FHO의 템플레이팅 부위와 IO-혼성화 부위 사이에 타겟 의존적 단편의 연장 반응을 방지하는 블록커 부위를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 IO-혼성화 부위를 추가적으로 포함하는 제1 형태의 FHO를 사용하는 구현예의 세부사항은 본원에 참고로 포함된 국제공개 제WO 2015/057008호를 참조한다.
특히, 본 발명이 단일 표지를 이용하여 고상에서 실시되는 경우, 상기 단일 표지는 특정한 특징이 요구되지 않는다. 고상 반응을 위해서는, 어떠한 단일 표지도 이용될 수 있다.
본 개시의 다른 양태에 있어서, 본 개시는 다음을 포함하는, 타겟 핵산 서열을 검출하기 위한 조성물을 제공한다:
(a) 태그 올리고뉴클레오타이드(Tag Oligonucleotide; TO);
상기 TO는 (i) 상기 타겟 핵산 서열에 비-혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 태깅 부위 및 (ii) 타겟 핵산 서열에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 타겟팅 부위를 포함하며,
상기 태깅 부위는 상기 태깅 부위의 3’-말단으로부터 5 뉴클레오타이드 이내에 제1 합성 비자연 염기를 포함하고,
상기 TO는 상기 타겟 핵산 서열의 존재에 의존적으로 절단되어 상기 TO의 태깅 부위 또는 이의 일부 서열을 포함하는 타겟 의존적 단편을 방출하고,
상기 타겟 의존적 단편은 상기 제1 합성 비자연 염기를 포함하고,
(b) 단편-혼성화 올리고뉴클레오타이드(Fragment-Hybridizing Oligonucleotide; FHO);
상기 FHO는 (i) 3'에서 5' 순서로 상기 타겟 의존적 단편에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 상기 타겟 의존적 단편 및 상기 TO의 타겟팅 부위에 대한 비-혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하는 제1 형태의 FHO이거나 또는 (ii) 상기 타겟 의존적 단편에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위를 포함하는 제2 형태의 FHO이고,
상기 FHO의 캡처링 부위는 상기 타겟 의존적 단편에서의 제1 합성 비자연 염기와 염기쌍을 이룰 수 있는 제2 합성 비자연 염기를 포함하고,
(c) 뉴클레아제 활성을 갖는 효소.
본 개시의 "타겟 핵산 서열을 검출하기 위한 조성물"은 상기 설명된 본 개시의 첫 번째 양태인 "타겟 핵산 서열을 검출하는 방법"을 실시할 수 있도록 구성된 것이므로, 이 들 사이의 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
일 구현예에 있어서, 상기 제1 합성 비자연 염기는 상기 TO의 태깅 부위의 3'-말단으로부터 2 내지 5 뉴클레오타이드가 이격된 사이트에 위치한다.
일 구현예에 있어서, 상기 TO의 태깅 부위는 1 내지 5개의 추가적인 합성 비자연 염기를 더 포함한다.
일 구현예에 있어서, 상기 제1 합성 비자연 염기 및 1 내지 5개의 추가적인 합성 비자연 염기들은 서로 1 내지 10 뉴클레오타이드 이격되어 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 제1 합성 비자연 염기는 S, Z, V, K, Pa. Pn, Px, Q, MMO2, 5FM, NaM, B, P, J, X, Ds, Dss 및 5SICS로 구성된 군으로부터 선택된다.
일 구현예에 있어서, 상기 제1 합성 비자연 염기는 S-B 염기쌍, Z-P 염기쌍, V-J 염기쌍, K-X 염기쌍, Pa-Ds 염기쌍, Pa-Q 염기쌍, Pn-Ds 염기쌍, Pn-Dss 염기쌍, Px-Ds 염기쌍, MMO2-5SICS 염기쌍, 5FM-5SICS 염기쌍 및 NaM-5SICS 염기쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 염기쌍 중 어느 하나의 염기이다.
일 구현예에 있어서, 상기 TO의 태깅 부위는 5 내지 50 뉴클레오타이드의 길이를 가진다.
일 구현예에 있어서, 상기 상기 TO의 태깅 부위는 9 내지 14 뉴클레오타이드의 길이를 가진다.
일 구현예에 있어서, 상기 뉴클레아제 활성을 갖는 효소는 5’ 뉴클레아제 활성을 갖는 효소이다.
일 구현예에 있어서, 상기 FHO가 제1 형태의 FHO일 경우, 상기 타겟 의존적 단편은 상기 FHO의 캡처링 부위에 혼성화되고 연장되어 상기 FHO의 템플레이팅 부위와 상보적인 연장서열을 포함하는 연장가닥을 생성하고, 이로 인해 연장가닥과 FHO 간의 제1 이합체 형성을 유도한다.
일 구현예에 있어서, 상기 FHO가 제2 형태의 FHO일 경우, 상기 타겟 의존적 단편은 상기 FHO의 캡처링 부위와 혼성화되어 제2 이합체를 형성한다.
일 구현예에 있어서, 상기 제1 이합체에서의 상기 연장 가닥의 존재 또는 제2 이합체의 존재는 상기 타겟 핵산 서열의 존재를 나타낸다.
일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 상기 타겟 핵산 서열에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 업스트림 프라이머를 추가적으로 포함하고, 상기 업스트림 프라이머는 상기 TO의 5'방향으로 업스트림에 위치한다.
일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 주형-의존적 핵산 중합효소를 추가적으로 포함한다.
일 구현예에 있어서, 상기 주형-의존적 핵산 중합효소 및 상기 뉴클레아제 활성을 갖는 효소는 동일 효소이다.
일 구현예에 있어서, 상기 TO는 프로브이다.
일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 다운스트림 프라이머를 추가적으로 포함한다.
본 명세서에서 상술한 본 개시의 모든 조성물은 버퍼, DNA 중합효소 조인자 및 데옥시리보뉴클레오타이드-5-트리포스페이트와 같은 타겟 증폭 PCR 반응(예컨대, PCR 반응)을 실시하는데 필요한 시약을 선택적으로 포함할 수 있다. 선택적으로, 본 개시의 조성물은 또한 다양한 폴리뉴클레오타이드 분자, 역전사효소, 다양한 버퍼 및 시약, 및 DNA 중합효소 활성을 억제하는 항체를 포함할 수 있다. 또한 조성물은 양성 대조군 및 음성 대조군 반응을 실시하는 데 필수적인 시약을 포함할 수 있다. 특정 반응에서 사용되는 시약의 최적량은, 본 명세서에 개시사항을 습득한 당업자에 의해서 용이하게 결정될 수 있다. 전형적으로, 본 개시의 조성물은 앞서 언급된 구성성분들을 포함하는 별도의 포장 또는 컴파트먼트(compartment)로 제작된다.
본 명세서에서 달리 정의되어 있지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 의미와 동일한 의미를 갖는다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 첨부된 청구항에 제시된 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 명백할 것이다.
실시예
실시예 : 비자연 염기쌍을 포함하는 TO 및 FHO를 이용한 타겟 핵산 서열의 검출
본 개시에 따른 합성 비자연 염기쌍을 포함하는 TO 및 FHO를 이용한 타겟 핵산 검출 방법이 종래 자연 염기쌍을 포함하는 TO 및 FHO를 이용한 타겟 핵산 검출 방법 대비 우수한 민감도 및 특이도를 나타내는지 확인하였다.
단계 (c)의 이합체의 검출은 PTOCE 분석(WO 2012/096523)을 이용하여 실시하였으며, 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머의 연장, TO의 절단 및 타겟 의존적 단편의 연장을 위해 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 Taq DNA 중합효소를 사용하였다.
1. 타겟 핵산 서열 및 올리고뉴클레오타이드의 준비
타겟 핵산은 Enterococcus faecalis(EF)의 유전자를 사용하였다. 타겟 핵산 서열은 하기와 같다 :
타겟 핵산 서열 :
5'-CCACAAGTACCATTCGTGCCAGTTTTAAGAAGTGACTGGAAAGGAAATCCAAAAGAAGTCTTTGAAAAATGTGAAGGTTCTTTAATTTATCCGGTCTTTGTTAAACCTGCCAATATGGGTTCTAGTGTCGGAATTAGCAAAGCGGAAAATCGTGAAGAATTGCAAGAAGCATTGGAAGAAGCTTTCCGTTATGATGCCCGAGCAATTGTTGAACA-3'
(서열번호: 1)
상기 Enterococcus faecalis(EF) 유전자의 타겟 핵산 서열(서열번호: 1)을 벡터 plDTSMART-AMP(GenBank: MN689784.1)에 삽입하여 플라스미드 DNA를 제조하였다. 이어서, 2.0×104 copies/㎕ 농도의 플라스미드 DNA를 TE 버퍼를 이용하여 10배씩 연속 희석하여 총 4가지 농도(농도 1: 2.0×104 copies/㎕, 농도 2: 2.0×103 copies/㎕, 농도 3: 2.0×102 copies/㎕, 및 농도 4: 2.0×101 copies/㎕ )의 플라스미드 DNA 주형을 준비하였다.
TO는 3'-타겟팅 부위가 상기 타겟 핵산 서열에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 가지고, 및 5'-태깅 부위가 타겟 핵산 서열에 대한 비-혼성화하는 뉴클레오타이드 서열 및 제1 합성 비자연 염기를 포함하여 1 내지 3개의 합성 비자연 염기를 갖도록 디자인하였다. 상기 TO의 5’-태깅 부위에 포함되는 합성 비자연 염기의 개수 및 위치는 다양하게 디자인하였으며, 제1 합성 비자연 염기는 5'-태깅 부위의 3'-말단으로부터 5 뉴클레오타이드 이내에 위치하도록 디자인하였다. 상기 5'-태깅 부위에 포함되는 합성 비자연 염기로는 2-amino-8-(2′-deoxy-β-D-erythro-pentofuranosyl)-imidazo[1,2-a]-1,3,5-triazin-4(8H)-one(이하, P)을 이용하였다.
타겟 의존적 단편과 혼성화되는 FHO는 캡처링 부위가 상기 TO로부터 방출된 타겟 의존적 단편에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 갖고, 템플레이팅 부위가 상기 TO의 5'-태깅 부위 및 3'-타겟팅 부위에 대한 비-혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 갖도록 디자인하였다.
상기 타겟 의존적 단편은 상기 TO의 5'-태깅 부위로부터 유래된 합성 비자연 염기를 포함하며, 상기 FHO의 캡처링 부위는 상기 타겟 의존적 단편 내의 합성 비자연 염기(즉, 제1 합성 비자연 염기를 포함하여 1 내지 3개의 합성 비자연 염기)의 맞은 편에 이와 혼성화하는 합성 비자연 염기(즉, 제2 합성 비자연 염기를 포함하여 1 내지 3개의 합성 비자연 염기), 6-amino-5-nitro-3-(1'-β-D-2'-deoxyribofuranosyl)-2(1H)-pyridone(이하, Z)를 포함하도록 디자인되었다. 또한, FHO의 템플레이팅 부위에 퀀처 분자(BHQ-1) 및 형광 리포터 분자(FAM)를 표지하였다.
상기 TO 및 FHO는 DNA 중합효소에 의한 연장을 막기 위해 3'-말단을 카본 스페이서(carbon spacer)로 블록킹하였다.
본 실시예에서 사용된 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 합성 비자연 염기쌍을 포함하는 TO 및 FHO의 서열은 하기 [표 1] 과 같다. TO 및 FHO 뒤의 숫자 "X-Y.Y"는 상기 TO의 태깅 부위에 포함된 합성 비자연 염기의 개수 및 위치를 의미한다. 구체적으로, X는 합성 비자연 염기의 개수를 나타내고, Y는 5'-태깅 부위의 3'-말단으로부터의 위치를 나타낸다. 예컨대, TO 1-1은 1개의 합성 비자연 염기를 포함하며, 3'-말단으로부터 첫 번째 뉴클레오타이드 위치에 상기 합성 비자연 염기가 포함되어 있는 것을 의미한다. FHO 1-1은 상기 TO 1-1이 절단되어 방출된 타겟 의존적 단편과 혼성화하는 FHO를 의미한다. 또 다른 예로, TO 3-3.7.9 는 3개의 합성 비자연 염기를 포함하며, 3'-말단으로부터 3 번째, 7번째, 9번째 뉴클레오타이드 위치에 상기 3개의 합성 비자연 염기가 포함되어 있는 것을 의미한다. FHO 3-3.7.9는 상기 TO 3-3.7.9가 절단되어 방출된 타겟 의존적 단편과 혼성화하는 FHO를 의미한다.
올리고뉴클레오타이드의 서열
서열
번호		 올리고명 서열 (5' to 3')
2 정방향 프라이머 CCACAAGTACCATTCGTGCC
3 역방향 프라이머 TGTTCAACAATTGCTCGRGC
4 TO 1-1 CGCATTCTCGT P CGTGAAGAATTGCAAGAAGCATTGGA
5 FHO 1-1 [BHQ-1]ACGTCGATTCGCCGCGTCGA[FAM-T]AGACGZACGAGAATGCG
6 TO 1-2 CGCATTCTCG P ACGTGAAGAATTGCAAGAAGCATTGGA
7 FHO 1-2 [BHQ-1]ACGTCGATTCGCCGCGTCGA[FAM-T]AGACGTZCGAGAATGCG
8 TO 2-2.7 CGCAT P CTCG P ACGTGAAGAATTGCAAGAAGCATTGGA
9 FHO 2-2.7 [BHQ-1]ACGTCGATTCGCCGCGTCGA[FAM-T]AGACGTZCGAGZATGCG
10 TO 2-3.8 CGCA P TCTC P TACGTGAAGAATTGCAAGAAGCATTGGA
11 FHO 2-3.8 [BHQ-1]ACGTCGATTCGCCGCGTCGA[FAM-T]AGACGTAZGAGAZTGCG
12 TO 3-2.5.9 CGC P TTC P CG P ACGTGAAGAATTGCAAGAAGCATTGGA
13 FHO 3-2.5.9 [BHQ-1]ACGTCGATTCGCCGCGTCGA[FAM-T]AGACGTZCGZGAAZGCG
14 TO 3-3.7.9 CGC P T P CTC P TACGTGAAGAATTGCAAGAAGCATTGGA
15 FHO 3-3.7.9 [BHQ-1]ACGTCGATTCGCCGCGTCGA[FAM-T]AGACGTAZGAGZAZGCG
16 TO 자연염기 CGCATTCTCGTACGTGAAGAATTGCAAGAAGCATTGGA
17 FHO 자연염기 [BHQ-1]ACGTCGATTCGCCGCGTCGA[FAM-T]AGACGTACGAGAATGCG
(밑줄 친 문자는 TO의 5’-태깅 부위를 가리키며, 볼드체 문자는 합성 비자연 염기를 가리킨다.)
2. 실시간 PCR
먼저, 24개의 튜브를 준비하고, 각 튜브에 (i) 상기 실시예 1-1에서 준비한 플라스미드 DNA 주형(농도 1 내지 농도 4) 5 ㎕, (ii) 정방향 프라이머(서열번호: 2) 및 역방향 프라이머 (서열번호: 3) 각각 5 pmole, (iii) 비자연 염기쌍(P-Z)을 포함하는 TO (서열번호: 4, 6, 8, 10, 12 또는 14) 및 FHO (서열번호: 5, 7, 9, 11, 13 또는 제 15) 각각 4 pmole 및 (iv) EM 1(Cat No.SD10245Z, Seegene, Inc.) 5 ㎕를 포함하여 최종 20 ㎕의 반응 혼합물을 제조하였다. 상기 반응 혼합물은 (i) 총 4가지 농도의 플라스미드 DNA 및 (iii) 총 6 종류의 TO 및 FHO 쌍의 조합을 통해 24 종류의 반응 혼합물이 준비되었으며, 상기 반응 혼합물을 이용하여 실시간 PCR 반응을 실시하였다.
상기 반응 혼합물을 함유하고 있는 튜브를 실시간 열순환기(CFX96, Bio-Rad)에 위치시켰다. 상기 반응 혼합물을 95℃에서 15분간 변성시키고 95℃에서 10 초, 60℃에서 60 초, 72℃에서 10 초 과정을 45 회 반복하였다. 시그널의 검출은 매 사이클 마다 60℃에서 측정하였다. Ct 값은 Auto calculated single threshold에 의해 계산되었으며, 모든 실험은 2회씩 반복 실험하여 평균 Ct값을 얻었다.
상기 비자연 염기쌍을 포함하는 TO 및 FHO 대신 자연 염기쌍을 포함하는 TO(서열번호: 16) 및 FHO(서열번호: 17)를 이용하여 상기와 동일한 조건으로 비교 대조군 반응도 함께 실시하였다.
상기 플라스미드 DNA 주형 대신 증류수 5 ㎕를 넣은 반응 혼합물을 이용하여 상기와 동일한 조건으로 음성 대조군 반응도 함께 실시하였다.
그 결과, 도 3 및 도 4에 나타난 바와 같이, TO의 5'-태깅 부위의 3'-말단으로부터 2번째 내지 5번째 뉴클레오타이드 이내에 하나 이상의 합성 비자연 염기를 포함하는 경우, 자연 염기만을 포함하는 TO보다 더 낮은 농도의 타겟 핵산 서열을 검출할 수 있음을 확인하였다. 또한, 동일 농도의 타겟 해산 서열을 검출할 경우, 3.2 내지 7.2 만큼의 Ct가 당겨지는 효과를 확인하였다. 이러한 결과는 TO의 3’-말단으로부터 2번째 내지 5번째 뉴클레오타이드 이내에 하나 이상의 합성 비자연 염기를 포함하는 경우, 민감도 및 특이도가 향상된 것을 의미한다.
반면, TO의 3'-말단으로부터 1번째 뉴클레오타이드 위치에 합성 비자연 염기를 포함하는 경우, 자연 염기를 포함하는 TO보다 낮은 민감도 및 Ct 값이 밀리는 결과를 얻었다.
이러한 결과는 3'-말단의 1번째 뉴클레오타이드 위치에 합성 비자연 염기가 존재하는 경우, (i) 뉴클레아제의 절단부위에 위치한 비자연 염기로 의해 절단 효율이 감소되는 현상, (ii) FHO와 혼성화된 타겟 의존적 단편의 3'-말단 즉, 중합효소의 연장 시작 부위에 위치한 비자연 염기가 중합효소의 연장 반응에 있어서 일반적인 기질로서 수월하게 인식되지 않음으로 인해 연장 효율이 감소되는 현상, (iii) 상기 3'-말단의 1번째 뉴클레오타이드 위치의 합성 비자연 염기가 맞은 편에 위치하는 타겟 핵산 서열 내의 자연 염기에 대하여 자연 염기 간의 반발력 보다 강한 반발력을 나타내어, 타겟팅 부위의 5'-말단까지 3'-태깅 부위와 함께 들려(즉, 타겟 핵산 서열에 혼성화하지 못함) 뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 TO의 절단위치가 달라지거나 타겟 의존적 단편의 3'말단의 서열이 달라져, FHO와 혼성화된 타겟 의존적 단편의 연장 효율이 감소되는 현상에 기인하는 것으로 추측된다.
한편, 음성 대조군 반응에서는 어떠한 시그널도 확인 되지 않는 것을 확인하였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (44)

  1. 다음의 단계를 포함하는, 타겟 핵산 서열을 검출하는 방법:
    (a) 상기 타겟 핵산 서열을 태그 올리고뉴클레오타이드(Tag Oligonucleotide; TO)와 반응시키는 단계;
    상기 TO는 (i) 상기 타겟 핵산 서열에 비-혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 태깅 부위 및 (ii) 타겟 핵산 서열에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 타겟팅 부위를 포함하며,
    상기 태깅 부위는 상기 태깅 부위의 3'-말단으로부터 5 뉴클레오타이드 이내에 제1 합성 비자연 염기를 포함하고,
    상기 반응은 상기 타겟 핵산 서열과 상기 TO의 혼성화 및 상기 타겟 핵산 서열의 존재에 의존적인 상기 TO의 절단으로 상기 TO의 태깅 부위 또는 이의 일부 서열을 포함하는 타겟 의존적 단편의 방출을 포함하고,
    상기 타겟 의존적 단편은 상기 제1 합성 비자연 염기를 포함하며,
    상기 TO의 절단은 뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의해 실시되고;
    (b) 상기 타겟 의존적 단편과 단편-혼성화 올리고뉴클레오타이드(Fragment-Hybridizing Oligonucleotide; FHO)를 반응시켜 이합체를 형성하는 단계;
    상기 FHO는 (i) 3'에서 5' 순서로 상기 타겟 의존적 단편에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 상기 타겟 의존적 단편 및 상기 TO의 타겟팅 부위에 대한 비-혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하는 제1 형태의 FHO이거나 또는 (ii) 상기 타겟 의존적 단편에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위를 포함하는 제2 형태의 FHO이고,
    상기 FHO의 캡처링 부위는 상기 타겟 의존적 단편에서의 제1 합성 비자연 염기와 염기쌍을 이룰 수 있는 제2 합성 비자연 염기를 포함하며,
    (i) 상기 FHO가 제1 형태의 FHO일 경우, 상기 타겟 의존적 단편은 상기 FHO의 캡처링 부위에 혼성화되고 연장되어 상기 FHO의 템플레이팅 부위와 상보적인 연장서열을 포함하는 연장가닥을 생성하고, 이로 인해 연장가닥과 FHO 간의 제1 이합체 형성을 유도하거나 또는
    (ii) 상기 FHO가 제2 형태의 FHO일 경우, 상기 타겟 의존적 단편은 상기 FHO의 캡처링 부위와 혼성화되어 제2 이합체를 형성하고; 및
    (c) 상기 제1 이합체에서의 상기 연장 가닥의 존재 또는 제2 이합체의 존재를 검출하는 단계;
    상기 제1 이합체에서의 상기 연장 가닥의 존재 또는 제2 이합체의 존재는 상기 타겟 핵산 서열의 존재를 나타냄.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 제1 합성 비자연 염기는 상기 TO의 태깅 부위의 3'-말단으로부터 2 내지 5 뉴클레오타이드가 이격된 사이트에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 TO의 태깅 부위는 1 내지 5개의 추가적인 합성 비자연 염기를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 제1 합성 비자연 염기 및 1 내지 5개의 추가적인 합성 비자연 염기들은 서로 1 내지 10 뉴클레오타이드 이격되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 제1 합성 비자연 염기는 S, Z, V, K, Pa. Pn, Px, Q, MMO2, 5FM, NaM, B, P, J, X, Ds, Dss 및 5SICS로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 제1 합성 비자연 염기는 S-B 염기쌍, Z-P 염기쌍, V-J 염기쌍, K-X 염기쌍, Pa-Ds 염기쌍, Pa-Q 염기쌍, Pn-Ds 염기쌍, Pn-Dss 염기쌍, Px-Ds 염기쌍, MMO2-5SICS 염기쌍, 5FM-5SICS 염기쌍 및 NaM-5SICS 염기쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 염기쌍 중 어느 하나의 염기인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 TO의 태깅 부위는 5 내지 50 뉴클레오타이드의 길이를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 상기 TO의 태깅 부위는 9 내지 14 뉴클레오타이드의 길이를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 뉴클레아제 활성을 갖는 효소는 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 효소인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 상기 타겟 핵산 서열에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 업스트림 프라이머의 존재 하에서 실시되고, 상기 업스트림 프라이머는 상기 TO의 5'방향으로 업스트림에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 단계 (a)는 상기 업스트림 프라이머가 주형-의존적 핵산 중합효소에 의해 연장되어 연장가닥을 생성하고, 상기 연장가닥이 상기 뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의해 상기 TO의 절단을 유도하여, 상기 TO의 태깅 부위 또는 태깅 부위의 일부 서열을 포함하는 상기 타겟 의존적 단편을 방출하는 반응을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 주형-의존적 핵산 중합효소 및 상기 뉴클레아제 활성을 갖는 효소는 동일 효소인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1 항에 있어서, 상기 TO는 프로브인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 다운스트림 프라이머의 존재 하에서 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 1 항에 있어서, 상기 제1 이합체는 (i) 상기 타겟 의존적 단편 및/또는 제1 형태의 FHO에 연결된 최소 하나의 표지, (ii) 상기 연장반응 동안 상기 제1 이합체 내에 삽입된 표지, (iii) 상기 연장반응 동안 상기 제1 이합체 내에 삽입된 표지 및 상기 제1 형태의 FHO에 연결된 최소 하나의 표지 또는 (iv) 인터컬레이팅 표지(intercalating label)에 의해 검출가능한 시그널을 제공하고, 상기 단계 (c)에서 상기 연장 가닥의 존재는 상기 제1 이합체로부터 제공되는 시그널을 측정함으로써 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 1 항에 있어서, 상기 제1 이합체는 뉴클레오절단효소(nucleolytic enzyme)에 의해 절단되는 절단 위치를 포함하며, 상기 제1 이합체는 상기 절단 위치에서의 절단에 의해 검출가능한 시그널을 제공하고, 상기 단계 (c)에서 연장가닥의 존재는 상기 제1 이합체의 절단으로부터 제공되는 시그널을 측정함으로써 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 상기 연장가닥에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열 및 표지를 포함하는 시그널링 올리고뉴클레오타이드(Signaling Oligonucleotide; SO)를 추가적으로 사용하고, 상기 SO와 상기 연장가닥 간의 이합체는 검출가능한 시그널을 제공하며, 상기 단계 (c)에서 연장가닥의 존재는 상기 SO와 상기 연장가닥 간의 이합체로부터 제공되는 시그널을 측정함으로써 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 상기 연장가닥에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열 및 표지를 포함하는 시그널링 올리고뉴클레오타이드(Signaling Oligonucleotide; SO)를 추가적으로 사용하고, 상기 SO와 상기 연장가닥 간의 이합체는 뉴클레오절단효소(nucleolytic enzyme)에 의해 절단되는 절단 위치를 포함하며, 상기 SO와 상기 연장가닥 간의 이합체는 상기 절단 위치에서의 절단에 의해 검출가능한 시그널을 제공하고, 상기 단계 (c)에서 연장가닥의 존재는 상기 SO와 상기 연장가닥 간의 이합체의 절단으로부터 제공되는 시그널을 측정함으로써 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 상기 제1 형태의 FHO에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드 서열 및 표지를 포함하는 혼성화 뉴클레오타이드(Hybridizing Oligonucleotide; HO)를 추가적으로 사용하며, 상기 HO와 상기 제1 형태의 FHO 간의 이합체는 검출가능한 시그널을 제공하고, 상기 단계 (c)에서 연장가닥의 존재는 상기 HO와 상기 제1 형태의 FHO 간의 이합체로부터 제공된 시그널을 측정함으로써 검출되며, 상기 HO와 상기 제1 형태의 FHO 간의 이합체로부터의 시그널의 존재는 상기 연장가닥의 부존재를 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 상기 연장가닥에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 고상 기질 상에 고정화된 고정화 올리고뉴클레오타이드(Immobilizing Oligonucleotide; IO)를 추가적으로 사용하고, 상기 연장가닥은 표지를 포함하며, 상기 연장가닥과 상기 IO 간의 이합체에 의해 상기 고상 기질 상에서 검출가능한 시그널을 제공하며, 상기 단계 (c)에서 연장가닥의 존재는 상기 연장가닥과 상기 IO 간의 이합체로부터 제공된 시그널을 측정함으로써 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (c)는 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (c-1) 상기 연장가닥과 제3 형태의 FHO를 혼성화시키는 단계로서, 상기 제3 형태의 FHO는 3'에서 5' 순서로 (i) 상기 연장가닥에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 연장가닥에 비-혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하며; 상기 연장가닥은 상기 제3 형태의 FHO의 캡처링 부위와 혼성화되고;
    (c-2) 주형-의존적 핵산 중합효소 및 상기 단계 (c-1)의 결과물을 이용하여 연장반응을 실시하는 단계로서, 상기 제3 형태의 FHO의 캡처링 부위에 혼성화된 연장가닥은 추가로 연장되어 상기 제3 형태의 FHO의 템플레이팅 부위와 상보적인 제2 연장서열을 포함하는 제2 연장가닥을 생성하고, 이에 따라 제2 연장가닥과 제3 형태의 FHO 간에 제3 이합체를 형성하며;
    (c-3) 상기 제2 연장가닥의 존재를 검출하는 단계로서, 상기 제2 연장가닥의 존재는 상기 연장 가닥의 존재를 나타낸다.
  22. 제 1 항에 있어서, 상기 제1 형태의 FHO 또는 제2 형태의 FHO는 고상 기질 상에 고정화되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 고상 기질 상에 고정화된 추가적인 SO, HO 또는 제3 형태의 FHO를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 1 항에 있어서, 상기 TO 및/또는 상기 FHO는 연장이 되지 않도록 그의 3'-말단이 블록킹되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 1 항에 있어서, 상기 방법이 상기 제2 이합체를 형성하는 경우, 상기 TO는 리포터 분자 및 제1 퀀처 분자가 연결되어 있고, 상기 제2 형태의 FHO는 제2 퀀처 분자가 연결되어 있으며, 상기 TO는 상기 단계 (a) 반응 동안 타겟 핵산 서열의 존재에 의존적으로 절단되어 상기 리포터 분자를 포함하는 타겟 의존적 단편을 방출하고, 상기 타겟 의존적 단편에 포함된 상기 리포터 분자와 상기 제2 형태의 FHO에 연결된 제2 퀀처 분자는 온도에 따른 상기 타겟 의존적 단편과 상기 제2 형태의 FHO 간의 제2 이합체의 형성 및 해리에 의해 검출가능한 시그널을 제공하고, 상기 단계 (c)에서 제2 이합체의 존재는 상기 제2 이합체로부터 제공된 시그널을 측정함으로써 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 1 항에 있어서, 상기 제1 이합체 또는 제2 이합체의 Tm 값은 상기 제1 이합체 또는 제2 이합체에 포함된 제1 합성 비자연 염기 및 제2 합성 비자연 염기가 자연 염기로 치환된 이합체의 Tm 값 대비 0.5 내지 10℃ 이상 높은 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)-(c) 전체 또는 일부는 변성을 포함하여 반복되는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 다음을 포함하는, 타겟 핵산 서열을 검출하기 위한 조성물:
    (a) 태그 올리고뉴클레오타이드(Tag Oligonucleotide; TO);
    상기 TO는 (i) 상기 타겟 핵산 서열에 비-혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 태깅 부위 및 (ii) 타겟 핵산 서열에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 타겟팅 부위를 포함하며,
    상기 태깅 부위는 상기 태깅 부위의 3'-말단으로부터 5 뉴클레오타이드 이내에 제1 합성 비자연 염기를 포함하고,
    상기 TO는 상기 타겟 핵산 서열의 존재에 의존적으로 절단되어 상기 TO의 태깅 부위 또는 이의 일부 서열을 포함하는 타겟 의존적 단편을 방출하고,
    상기 타겟 의존적 단편은 상기 제1 합성 비자연 염기를 포함하고,
    (b) 단편-혼성화 올리고뉴클레오타이드(Fragment-Hybridizing Oligonucleotide; FHO);
    상기 FHO는 (i) 3'에서 5' 순서로 상기 타겟 의존적 단편에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 상기 타겟 의존적 단편 및 상기 TO의 타겟팅 부위에 대한 비-혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하는 제1 형태의 FHO이거나 또는 (ii) 상기 타겟 의존적 단편에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위를 포함하는 제2 형태의 FHO이고,
    상기 FHO의 캡처링 부위는 상기 타겟 의존적 단편에서의 제1 합성 비자연 염기와 염기쌍을 이룰 수 있는 제2 합성 비자연 염기를 포함하고,
    (c) 뉴클레아제 활성을 갖는 효소.
  29. 제 28 항에 있어서, 상기 제1 합성 비자연 염기는 상기 TO의 태깅 부위의 3'-말단으로부터 2 내지 5 뉴클레오타이드가 이격된 사이트에 위치하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  30. 제 28 항에 있어서, 상기 TO의 태깅 부위는 1 내지 5개의 추가적인 합성 비자연 염기를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  31. 제 30 항에 있어서, 상기 제1 합성 비자연 염기 및 1 내지 5개의 추가적인 합성 비자연 염기들은 서로 1 내지 10 뉴클레오타이드 이격되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
  32. 제 28 항에 있어서, 상기 제1 합성 비자연 염기는 S, Z, V, K, Pa. Pn, Px, Q, MMO2, 5FM, NaM, B, P, J, X, Ds, Dss 및 5SICS로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  33. 제 28 항에 있어서, 상기 제1 합성 비자연 염기는 S-B 염기쌍, Z-P 염기쌍, V-J 염기쌍, K-X 염기쌍, Pa-Ds 염기쌍, Pa-Q 염기쌍, Pn-Ds 염기쌍, Pn-Dss 염기쌍, Px-Ds 염기쌍, MMO2-5SICS 염기쌍, 5FM-5SICS 염기쌍 및 NaM-5SICS 염기쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 염기쌍 중 어느 하나의 염기인 것을 특징으로 하는 조성물.
  34. 제 28 항에 있어서, 상기 TO의 태깅 부위는 5 내지 50 뉴클레오타이드의 길이를 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
  35. 제 34 항에 있어서, 상기 상기 TO의 태깅 부위는 9 내지 14 뉴클레오타이드의 길이를 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
  36. 제 28 항에 있어서, 상기 뉴클레아제 활성을 갖는 효소는 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 효소인 것을 특징으로 하는 조성물.
  37. 제 28 항에 있어서, 상기 FHO가 제1 형태의 FHO일 경우, 상기 타겟 의존적 단편은 상기 FHO의 캡처링 부위에 혼성화되고 연장되어 상기 FHO의 템플레이팅 부위와 상보적인 연장서열을 포함하는 연장가닥을 생성하고, 이로 인해 연장가닥과 FHO 간의 제1 이합체 형성을 유도하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  38. 제 28 항에 있어서, 상기 FHO가 제2 형태의 FHO일 경우, 상기 타겟 의존적 단편은 상기 FHO의 캡처링 부위와 혼성화되어 제2 이합체를 형성하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  39. 제 37 항 또는 제 38 항에 있어서, 상기 제1 이합체에서의 상기 연장 가닥의 존재 또는 제2 이합체의 존재는 상기 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 것을 특징으로 하는 조성물.
  40. 제 28 항에 있어서, 상기 조성물은 상기 타겟 핵산 서열에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 업스트림 프라이머를 추가적으로 포함하고, 상기 업스트림 프라이머는 상기 TO의 5’방향으로 업스트림에 위치하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  41. 제 28 항에 있어서, 상기 조성물은 주형-의존적 핵산 중합효소를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  42. 제 41 항에 있어서, 상기 주형-의존적 핵산 중합효소 및 상기 뉴클레아제 활성을 갖는 효소는 동일 효소인 것을 특징으로 하는 조성물.
  43. 제 28 항에 있어서, 상기 TO는 프로브인 것을 특징으로 하는 조성물.
  44. 제 28 항에 있어서, 상기 조성물은 다운스트림 프라이머를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
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