WO2023058637A1 - 改良型β－フルクトフラノシダーゼ - Google Patents

改良型β－フルクトフラノシダーゼ Download PDF

Info

Publication number
WO2023058637A1
WO2023058637A1 PCT/JP2022/037083 JP2022037083W WO2023058637A1 WO 2023058637 A1 WO2023058637 A1 WO 2023058637A1 JP 2022037083 W JP2022037083 W JP 2022037083W WO 2023058637 A1 WO2023058637 A1 WO 2023058637A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
fructofuranosidase
amino acid
improved
acid sequence
fos
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2022/037083
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
俊一 田中
真実子 矢野
慶一 上野
拓未 宮武
諭 高杉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Meiji Co Ltd
Kyoto Prefectural PUC
Original Assignee
Meiji Co Ltd
Kyoto Prefectural PUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Meiji Co Ltd, Kyoto Prefectural PUC filed Critical Meiji Co Ltd
Priority to EP22878505.1A priority Critical patent/EP4424831A4/en
Priority to CN202280067418.7A priority patent/CN118076740A/zh
Priority to US18/692,604 priority patent/US20240384317A1/en
Priority to JP2023552891A priority patent/JPWO2023058637A1/ja
Publication of WO2023058637A1 publication Critical patent/WO2023058637A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2431—Beta-fructofuranosidase (3.2.1.26), i.e. invertase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01026—Beta-fructofuranosidase (3.2.1.26), i.e. invertase

Definitions

  • the present invention relates to improved ⁇ -fructofuranosidase.
  • the present invention also relates to a polynucleotide encoding the improved ⁇ -fructofuranosidase, a vector comprising the polynucleotide, and a transformant obtained by introducing the polynucleotide or the vector into a host.
  • the present invention further relates to a method for producing improved ⁇ -fructofuranosidase, a method for producing fructo-oligosaccharides, and a method for producing 1-kestose crystals.
  • Prebiotics are indigestible food ingredients that selectively promote the growth and activity of specific beneficial microorganisms such as bifidobacteria that live in the intestinal environment. Unlike probiotics that alter the microbiota, it is known to be a more practical and efficient method for manipulating the intestinal microbiota because the target bacteria are already commensal in the gut (non-patented). Reference 1).
  • Fructo-oligosaccharides have a high function as prebiotics, and among these, trisaccharide FOS, which is a combination of sucrose and one fructose, is particularly useful.
  • Trisaccharide FOS is known to have a higher growth-promoting effect on bifidobacteria than FOS with tetrasaccharide or more, and short-chain FOS (with fewer bound fructose) is degraded by microorganisms living in the intestines. It is considered to be easy to use and suitable as a nutrient source, and as a result, contributes to a healthy composition of the intestinal flora (Non-Patent Document 2).
  • FOS produced by ⁇ -fructofuranosidase can contain not only trisaccharide FOS but also tetrasaccharide FOS, mixtures containing multiple kinds of FOS (especially those containing tetrasaccharide or more FOS) mixture) has properties of poor crystallinity and high hygroscopicity. Therefore, it is required to increase the production ratio of a single type of FOS and improve the crystallinity. In addition, it is expected to increase the production ratio of trisaccharide FOS as a prebiotic with higher functionality. On the other hand, separating, removing and reducing tetrasaccharide or higher FOS from a mixture containing multiple types of FOS required a great deal of labor and time.
  • An object of the present invention is to provide a novel improved ⁇ -fructofuranosidase to solve such problems.
  • the present inventors have found that by substituting different amino acids for amino acids at specific positions in the amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) of the wild-type ⁇ -fructofuranosidase from Aspergillus fijiensis , the trisaccharide FOS The inventors have found an improved ⁇ -fructofuranosidase having a high production ratio of FOS of tetrasaccharides or more and a low production ratio of FOS having four or more sugars. The present invention is based on this finding.
  • ⁇ -fructofuranosidase has 60% or more sequence identity with the amino acid sequence of wild-type ⁇ -fructofuranosidase shown in SEQ ID NO: 1, and has ⁇ -fructofuranosidase activity
  • the amino acid corresponding to the 81st position from the amino terminus is aspartic acid (D), glutamic acid (E), phenylalanine (F), histidine (H), isoleucine (I), lysine (K), leucine (L) ), methionine (M), asparagine (N), glutamine (Q), arginine (R), serine (S), valine (V), tryptophan (W) and tyrosine (Y).
  • D aspartic acid
  • E glutamic acid
  • F histidine
  • isoleucine (I) isoleucine
  • K lysine
  • L leucine
  • M methionine
  • N asparagine
  • glutamine Q
  • arginine R
  • S serine
  • V valine
  • W tryptophan
  • Y tyrosine
  • the amino acid corresponding to the 141st position from the amino terminus is alanine (A), aspartic acid (D), phenylalanine (F), glycine (G), isoleucine (I), lysine (K), asparagine (N ), glutamine (Q), arginine (R), serine (S), threonine (T), tryptophan (W) and tyrosine (Y) substituted with an amino acid selected from the group consisting of [1] to [ 4], the improved ⁇ -fructofuranosidase according to any one of [6] A polypeptide comprising an enzymatically active portion of the amino acid sequence of the improved ⁇ -fructofuranosidase according to any one of [1] to [5] above and having ⁇ -fructofuranosidase activity.
  • [7] A polynucleotide encoding the improved ⁇ -fructofuranosidase of any one of [1] to [5] above or the polypeptide of [6] above.
  • An expression vector comprising the polynucleotide of [7] above.
  • a transformant obtained by introducing the polynucleotide of [7] above or the expression vector of [8] above into a host.
  • the transformant of [9] above, wherein the host is selected from the group consisting of bacteria, yeast, fungi and filamentous fungi.
  • a method for producing improved ⁇ -fructofuranosidase comprising the step of obtaining improved ⁇ -fructofuranosidase from the culture of the transformant of [9] or [10] above.
  • the improved ⁇ -fructofuranosidase of any one of [1] to [5] above, the polypeptide of [6] above, or the transformant of [9] or [10] above A method for producing fructo-oligosaccharides, comprising the step of contacting the culture of and sucrose.
  • a method for producing 1-kestose crystals comprising the steps of producing fructooligosaccharides by carrying out the production method described in [12] above, and crystallizing the fructooligosaccharides.
  • the improved ⁇ -fructofuranosidase of the present invention can suppress the production of FOS having tetrasaccharides or more, which is advantageous in that it can produce FOS with improved crystallinity and hygroscopicity.
  • the improved ⁇ -fructofuranosidase of the present invention can produce 3-saccharide FOS while suppressing the production of 4- or more saccharide FOS, which is advantageous in that it can provide prebiotics with higher functionality. is.
  • FIG. 1 shows the production ratio of FOS at each reaction time by wild-type ⁇ -fructofuranosidase (WT) (monosaccharide: glucose and fructose, disaccharide: sucrose, trisaccharide: trisaccharide FOS, tetrasaccharide or more: tetrasaccharide above FOS).
  • FIG. 2 shows a mutant ⁇ -fructofurano in which glycine (Gly81), which is the 81st amino acid from the amino terminal (N-terminal) of the wild-type ⁇ -fructofuranosidase (WT) amino acid sequence (SEQ ID NO: 1), is mutated.
  • Gly81 glycine
  • the production ratio of FOS by sidase-Gly81 (AfBFFase-Gly81) (monosaccharide:glucose and fructose, disaccharide:sucrose, trisaccharide:trisaccharide FOS, tetrasaccharide or more:tetrasaccharide or more FOS) is shown.
  • the letters on the horizontal axis indicate amino acids substituted for Gly81, and the parentheses indicate the reaction time (hours).
  • FIG. 3 shows mutant ⁇ -fructofuranosidase (WT) amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) 141 leucine (Leu141) from the amino terminus (N-terminus) mutated ⁇ -fructofuranosidase-Leu141
  • Fig. 3 shows the production ratio of FOS by (AfBFFase-Leu141) (monosaccharide: glucose and fructose: disaccharide: sucrose, trisaccharide: trisaccharide FOS, tetrasaccharide or more: tetrasaccharide or more FOS).
  • the alphabet on the horizontal axis indicates the amino acid substituted for Leu141, and the parenthesis indicates the reaction time (hour).
  • FOS fructose
  • FOS includes 1-kestose (sometimes referred to herein as "GF2" or “trisaccharide FOS”) in which one molecule of fructose is ⁇ -2,1-linked to the fructose residue of sucrose, Nystose in which two fructose molecules are ⁇ -2,1-linked (herein sometimes referred to as “GF3” or “tetrasaccharide FOS”), 1 in which three fructose molecules are ⁇ -2,1-linked to the fructose residue of sucrose -fructofuranosyl-D-nystose (sometimes referred to herein as “GF4" or "pentasaccharide FOS”).
  • FOS is synthesized by ⁇ -fructofuranosidase.
  • ⁇ -fructofuranosidase refers to the GH family (glycoside hydrolase family; a group of homologous proteins with high sequence similarity among enzymes that hydrolyze glycosidic bonds of sugars) of sucrose.
  • An enzyme belonging to the GH32 family with hydrolytic activity The enzymatic reaction by ⁇ -fructofuranosidase starts with the entry of sucrose into the substrate-binding pocket to which sugar binds. A saccharolytic reaction occurs, and the glycosidic bond between glucose and fructose is cleaved at the central site of the catalyst, liberating glucose.
  • the fructose moiety forms an acyl enzyme intermediate with the catalytic group of the active center moiety.
  • fructose when water binds to the intermediate, fructose is released, but when the sugar concentration is high, transglycosylation activity takes precedence, and fructose forms a glycosidic bond with sucrose, which serves as an acceptor, to form a trisaccharide FOS, which binds to the substrate. Release from pocket. Also, when the sugar serving as the acceptor is trisaccharide FOS, it forms a glycosidic bond with fructose to form a tetrasaccharide FOS, which is released from the pocket. Via such an enzymatic reaction, FOS with various lengths such as 3-, 4-, and 5-saccharides are produced depending on the type of sugar that serves as an acceptor.
  • ⁇ -fructofuranosidase includes “ ⁇ -fructofuranosidase”, “fructosyltransferase”, “fructosyltransferase”, “saccharase”, “ ⁇ -D-fructofuranosidase”, “ ⁇ - The terms “D-fructofuranosidase”, “invertase”, “invertase” or “invertin” are sometimes used interchangeably and are synonymous.
  • the improved ⁇ -fructofuranosidase of the present invention is obtained from an amino acid sequence in which either or both of the amino acids at two specific positions are substituted with other amino acids in the amino acid sequence of the ⁇ -fructofuranosidase to be improved. It will be.
  • the amino acid at a specific position to be substituted in the amino acid sequence of ⁇ -fructofuranosidase is obtained by appropriately aligning the amino acid sequence of ⁇ -fructofuranosidase to be improved with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. can be specified.
  • amino acid sequence of ⁇ -fructofuranosidase to be improved is aligned with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 using the homology search software or program described later, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is 81 from the amino terminus.
  • the amino acid corresponding to the 1-th position and the amino acid corresponding to the 141-th position from the amino terminus of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 can be used as the amino acid at the specific position to be substituted.
  • the improved ⁇ -fructofuranosidase of the present invention comprises an amino acid corresponding to the 81st position from the amino terminus of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 1 in the amino acid sequence of the ⁇ -fructofuranosidase to be improved. It consists of an amino acid sequence in which one or both of the amino acids corresponding to the 141st position from the amino terminus of the amino acid sequence shown in 2 are substituted with amino acids different from the original amino acid.
  • the amino acid at the 81st position from the amino terminus of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is glycine (G), and the amino acid at the 141st position from the amino terminus of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is leucine (L).
  • the amino acid corresponding to the 81st position from the amino terminus of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is typically glycine (G), and corresponds to the 141st position from the amino terminus of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid is typically leucine (L).
  • amino acid sequence of ⁇ -fructofuranosidase to be improved is the amino acid shown in SEQ ID NO: 1
  • amino acid corresponding to the 81st position from the amino terminus is glycine (G)
  • the 141st amino acid from the amino terminus is glycine (G)
  • the amino acid corresponding to the th position is leucine (L).
  • the amino acid corresponding to the 81st position from the amino terminus of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 consists of 18 amino acids other than glycine (G) and cysteine (C) (alanine (A), aspartic acid (D), glutamic acid (E ), phenylalanine (F), histidine (H), isoleucine (I), lysine (K), leucine (L), methionine (M), asparagine (N), glutamine (Q), arginine (R), serine (S ), valine (V), tryptophan (W), tyrosine (Y), proline (P) and threonine (T)); -Glycine (G), cysteine (C), alanine (A), proline (P), and 15 amino acids other than threonine (T) (aspartic acid (D), glutamic acid (E), phenylalanine (F), histidine (H), isoleucine (
  • Phenylalanine (F), histidine (H), isoleucine from the viewpoint of increasing the production ratio of 3-saccharide FOS and reducing the production ratio of tetra- or more FOS compared to the wild-type ⁇ -fructofuranosidase shown in SEQ ID NO: 1 (I), lysine (K), leucine (L), methionine (M), asparagine (N), glutamine (Q), arginine (R), serine (S), valine (V), tryptophan (W) and tyrosine It is more preferable to substitute with an amino acid selected from the group consisting of (Y), and from the viewpoint of increasing the production ratio of trisaccharide FOS to more than 50% and making the production ratio of tetrasaccharide or higher FOS to less than 10%, lysine ( K), leucine (L), tryptophan (W) and tyrosine (Y), which is more preferably substituted with an amino acid selected from the group
  • the amino acid corresponding to the 141st position from the amino terminus of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 includes 18 amino acids other than leucine (L) and cysteine (C) (alanine (A), aspartic acid (D), glutamic acid (E ), phenylalanine (F), glycine (G), histidine (H), isoleucine (I), lysine (K), methionine (M), asparagine (N), glutamine (Q), arginine (R), serine (S ), threonine (T), valine (V), tryptophan (W), tyrosine (Y) and proline (P)); - leucine (L), cysteine (C), glutamic acid (E), histidine (H), from the viewpoint of increasing the production ratio of 3-saccharide FOS or reducing the production ratio of tetra- or more FOS relative to fructofuranosidase, 13 amino acids other than methionine (
  • alanine (A), aspartic acid (D), from the viewpoint of increasing the production ratio of trisaccharide FOS and reducing the production ratio of tetrasaccharide or more FOS compared to the wild-type ⁇ -fructofuranosidase shown in SEQ ID NO: 1, from phenylalanine (F), glycine (G), isoleucine (I), lysine (K), asparagine (N), arginine (R), serine (S), threonine (T), tryptophan (W) and tyrosine (Y) more preferably substituted with an amino acid selected from the group consisting of alanine (A), from the viewpoint of increasing the production ratio of trisaccharide FOS to more than 47% and reducing the production ratio of tetrasaccharide or more FOS to less than 16%; Substitution with an amino acid selected from the group consisting of aspartic acid (D), isoleucine (I), lysine (
  • the ⁇ -fructofuranosidase to be improved has an amino acid sequence of 60% or more (preferably 65% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more) of the wild-type ⁇ -fructofuranosidase shown in SEQ ID NO: 1. , 85% or greater, 90% or greater, 93% or greater, 95% or greater, 98% or greater, or 99% or greater) sequence identity.
  • identity is, for example, the degree of identity when the sequences to be compared are properly aligned (aligned), and means the occurrence rate (%) of exact amino acid matches between the sequences. .
  • BLAST Basic local alignment search tool
  • FASTA Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)
  • FASTA Altschul et al., Methods in Enzymology 183:63-69 (1990)
  • Smith-Waterman Methodh. Enzym., 164, 765 (1988)
  • the identity can be calculated using, for example, a publicly available homology search program such as those described above, for example, the homology algorithm BLAST (https: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) by using the default parameters.
  • BLAST https: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
  • the ⁇ -fructofuranosidase to be improved also has 60% or more sequence identity with the amino acid sequence of the wild-type ⁇ -fructofuranosidase shown in SEQ ID NO: 1, and amino acids having ⁇ -fructofuranosidase activity. It consists of arrays.
  • "having ⁇ -fructofuranosidase activity” means that the amino acid sequence is a wild-type ⁇ -fructofuranosidase having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 under conditions of temperature 50 to 55 ° C. and pH 5.5.
  • ⁇ -fructofuranosidase activity can be measured, for example, by mixing a solution containing a protein or polypeptide to be measured and a solution containing sucrose, incubating the mixture, and measuring the amount of glucose produced by the enzymatic reaction by high-performance liquid chromatography (HPLC), thin layer chromatography (TLC), various glucose quantification kits, etc., and can be evaluated from the value obtained here and the amount of enzyme used in the reaction.
  • HPLC high-performance liquid chromatography
  • TLC thin layer chromatography
  • various glucose quantification kits etc.
  • the ⁇ -fructofuranosidase to be improved is typically a wild-type enzyme and can be derived from any organism, such as microorganisms, fungi, plants, etc., preferably belonging to the genus Aspergillus. It can be of microbial origin. However, this does not preclude the use of ⁇ -fructofuranosidase into which an artificial mutation has been introduced in the present invention.
  • Examples of ⁇ -fructofuranosidases derived from microorganisms belonging to the genus Aspergillus include those shown in Table 1.
  • Table 1 the amino acid sequence of ⁇ -fructofuranosidase shown in Table 1, the amino acid corresponding to the 81st position from the amino terminus of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and the amino acid sequence from the amino terminus of SEQ ID NO: 1 The presence of an amino acid corresponding to the 141st position was confirmed.
  • a preferred embodiment of the present invention provides an improved ⁇ -fructofuranosidase consisting of the amino acid sequence of either a) or b) described in [3] above.
  • the amino acids to be substituted in the amino acid sequence of a) and the types of amino acids after substitution are as described above.
  • the amino acid sequence of b) has a modification selected from the group consisting of deletion, substitution, insertion and addition at one or more amino acids other than glycine (G) at position 81 and leucine (L) at position 141.
  • the number of amino acids to be modified can be, for example, 1 to 65, 1 to 50, 1 to 40, 1 to 30 or 1 to 20, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 6, particularly preferably 1 to several, 1 to 4, 1 to 3, 1 to 2 or 1.
  • the number of amino acids to be modified can also be the number of mutations produced by known methods such as site mutagenesis, or the number of mutations produced naturally.
  • the modification may also be multiple homologous modifications (e.g., multiple substitutions) or multiple heterologous modifications (e.g., a combination of one or more deletions and one or more substitutions), good too.
  • the amino acid sequence of b) also has a sequence identity of 80% or more (preferably 85% or more, 90% or more, 93% or more, 95% or more, 98% or more or 99% or more) with the amino acid sequence of a) and having ⁇ -fructofuranosidase activity.
  • having a modification selected from the group consisting of deletion, substitution, insertion and addition in one or more amino acids other than glycine (G) at position 81 and leucine (L) at position 141 Become.
  • the amino acid alterations in the amino acid sequence of b) may be conservative alterations (eg, conservative mutations).
  • a “conservative modification” or “conservative mutation” means modifying or mutating one or more amino acids so as not to substantially alter the function of the protein.
  • the amino acid substitutions may also be conservative substitutions.
  • a “conservative substitution” refers to the replacement of one or more amino acids with another amino acid and/or amino acid derivative that does not substantially alter the function of the protein.
  • the substituted amino acid and the substituted amino acid are preferably similar in properties and/or functions, for example. Specifically, it is preferred that the indices of hydrophobicity and hydrophilicity, chemical properties such as polarity and charge, or physical properties such as secondary structure are similar.
  • nonpolar amino acids include alanine, valine, isoleucine, leucine, proline, tryptophan, phenylalanine, methionine, and the like.
  • Polar amino acids include glycine, serine, threonine, tyrosine, glutamine, asparagine, cysteine and the like.
  • positively charged amino acids basic amino acids
  • negatively charged amino acids acidic amino acids
  • the amino acid sequence of b) also has modifications selected from the group consisting of deletions, substitutions, insertions and additions at one or more amino acids other than glycine (G) at position 81 and leucine (L) at position 141. and an amino acid sequence having ⁇ -fructofuranosidase activity.
  • "having ⁇ -fructofuranosidase activity” means that the amino acid sequence is a ⁇ -fructofuranosidase consisting of the amino acid sequence of a) under conditions of a temperature of 50 to 55 ° C. and pH 5.5. It can be defined as having about 90% or more activity, about 95% or more activity, about 98% or more activity, or about 100% or more activity.
  • ⁇ -fructofuranosidase activity can be measured in the same manner as described above.
  • the improved ⁇ -fructofuranosidase of the present invention can be obtained, for example, by chemical synthesis or genetic recombination technology.
  • the method of chemical synthesis for example, based on amino acid sequence information, the present invention is performed according to chemical synthesis methods such as Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method), tBoc method (t-butyloxycarbonyl method), and cell-free protein synthesis method.
  • Improved ⁇ -fructofuranosidases of the invention can be synthesized.
  • the improved ⁇ -fructofuranosidase of the present invention can also be synthesized using a commercially available peptide synthesizer.
  • the improved ⁇ -fructofuranosidase of the present invention can be produced by culturing genetically modified microorganisms capable of producing it.
  • a polynucleotide encoding the improved ⁇ -fructofuranosidase of the present invention is introduced into a suitable host to obtain a transformant, the transformant is cultured, and the improved ⁇ -fructofuranosidase is extracted from the culture. It can be obtained by extracting furanosidase. Specifically, it can be obtained according to the description of Examples (for example, Example 1 (1) a and b) below.
  • Polynucleotides encoding the improved ⁇ -fructofuranosidase of the present invention can be synthesized using various commercially available polynucleotide synthesizers, and as shown in Examples 1 and 2 below, It can also be obtained by site-directed mutagenesis using inverse polymerase chain reaction (PCR).
  • PCR inverse polymerase chain reaction
  • polynucleotide includes DNA and RNA, and further includes modified forms thereof and artificial nucleic acids, preferably DNA.
  • DNA includes cDNA, genomic DNA and chemically synthesized DNA.
  • the present invention provides a polypeptide comprising an enzymatically active portion of the amino acid sequence of the improved ⁇ -fructofuranosidase of the present invention and having ⁇ -fructofuranosidase activity.
  • the amino acid sequence of the polypeptide of the present invention typically contains at least a site (region) having ⁇ -fructofuranosidase activity.
  • the site having ⁇ -fructofuranosidase activity in the improved ⁇ -fructofuranosidase of the present invention includes, for example, the 20th to 654th positions from the amino terminus of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (including the signal sequence on the N-terminal side).
  • polypeptide of the present invention can be obtained by a method similar to that for obtaining the improved ⁇ -fructofuranosidase of the present invention.
  • a polynucleotide encoding improved ⁇ -fructofuranosidase etc. and vector containing the same>> According to the invention, there is provided a polynucleotide encoding an improved ⁇ -fructofuranosidase of the invention or a polypeptide of the invention.
  • the polynucleotide of the present invention can be obtained using the polynucleotide synthesis method described in the method for obtaining the improved ⁇ -fructofuranosidase of the present invention.
  • the present invention also provides a recombinant vector containing a polynucleotide encoding an improved ⁇ -fructofuranosidase.
  • the recombinant vector of the present invention can be obtained by operably linking a polynucleotide encoding the improved ⁇ -fructofuranosidase of the present invention to the vector.
  • Polynucleotides can be ligated to vectors according to conventional methods. It can be done by Examples of vectors include phage vectors, plasmid vectors, cosmids, phagemids, and the like, and can be appropriately selected according to the host, operability, and the like.
  • the recombinant vector of the present invention also contains selectable marker genes for transformants such as drug resistance marker genes and auxotrophic marker genes; It may contain transcriptional control signals such as promoters, transcription initiation signals, ribosome binding sites, translation termination signals, transcription termination signals, translational control signals, and the like, which are necessary for the expression of type ⁇ -fructofuranosidase.
  • transformants capable of producing the improved ⁇ -fructofuranosidase of the present invention or the polypeptide of the present invention are provided.
  • the transformant of the present invention can be obtained by introducing the improved ⁇ -fructofuranosidase of the present invention, a polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention, or the recombinant vector of the present invention into a host.
  • the host include bacteria such as Escherichia coli and Bacillus subtilis, yeast, fungi, and filamentous fungi, and can be appropriately selected according to the type and operability of the recombinant vector.
  • Introduction (transformation) of DNA or a recombinant vector into a host can be carried out according to a conventional method.
  • a homologous recombination method or the like can be used to introduce the target DNA directly into the chromosome of the host.
  • the transformant of the present invention is cultured in a medium suitable for culturing the transformant, and in some cases, the improved ⁇ -fructofuranosidase of the present invention is obtained from the culture obtained by culturing. Alternatively, it can be carried out by collecting the polypeptide.
  • the medium used for culture is not particularly limited as long as it is a nutrient medium in which the transformed microorganism can grow and the improved ⁇ -fructofuranosidase of the present invention or the polypeptide of the present invention can be produced. Either In addition, culture conditions such as time and temperature can be selected as appropriate for the microorganisms to be cultured.
  • the culture obtained by culturing the transformant may be directly obtained as the improved ⁇ -fructofuranosidase of the present invention or the polypeptide of the present invention.
  • the improved ⁇ -fructofuranosidase or the polypeptide of the invention can also be isolated and purified.
  • the expressed protein may be present on the cell surface or inside the cell of the transformant.
  • the polynucleotide or recombinant vector is designed to be expressed, the culture is subjected to centrifugation to collect the transformant, which is directly used for the improved ⁇ -fructofuranosidase of the present invention or the polypeptide of the present invention.
  • the recovered transformant can be disrupted to obtain the improved ⁇ -fructofuranosidase of the present invention or the polypeptide of the present invention.
  • a polynucleotide or a recombinant agent is used so that the expressed protein is secreted to the outside of the transformant. It can be performed by designing a vector, subjecting the culture to centrifugation, and collecting the culture supernatant.
  • the polynucleotide or recombinant vector is designed so that the expressed protein is expressed inside the transformant, the culture is subjected to centrifugation to collect the precipitated transformant, and this is placed in a buffer solution.
  • the polypeptides of the invention can be purified.
  • Other purification methods include heat treatment, salt precipitation, solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, ion-exchange chromatography, and affinity chromatography for the culture supernatant or crushed product. Examples include a method of subjecting it to photography, hydrophobic chromatography, reversed-phase chromatography, isoelectric focusing, and the like.
  • a method for producing an improved fructo-oligosaccharide comprises a step of contacting the culture of the improved ⁇ -fructofuranosidase of the present invention, the polypeptide of the present invention or the transformant of the present invention with sucrose.
  • the improved ⁇ -fructofuranosidase or the like of the present invention is contacted with sucrose, for example, by adding the improved ⁇ -fructofuranosidase or the like to a solution containing sucrose and incubating. It can be done by The incubation conditions are, for example, a temperature of 20 to 60° C., preferably 25 to 55° C., more preferably 30 to 50° C., still more preferably 40 to 50° C., and a time of 1 to 20 hours, preferably can be from 1 to 8 hours, more preferably from 2 to 4 hours.
  • a culture obtained by culturing the transformant of the present invention may be brought into contact with sucrose in the same manner.
  • the culture of the present invention can be processed by crushing, trituration, suspension in buffer, freeze-thaw, sonication, centrifugation, heat treatment, salt precipitation, solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, SDS.
  • It may or may not be subjected to any treatment such as polyacrylamide gel electrophoresis, ion exchange chromatography, affinity chromatography, hydrophobic chromatography, reverse phase chromatography, isoelectric focusing.
  • the method for producing fructo-oligosaccharides of the present invention can also include any additional steps, for example, a step of separating fructo-oligosaccharides by chromatography, a crystallization step, a drying step, a washing step, a filtration step, a sterilization step, and food addition. any or a combination of some or all of these.
  • a method for producing 1-kestose crystals is provided.
  • the method for producing 1-kestose of the present invention is characterized by using the fructo-oligosaccharide produced by the method for producing fructo-oligosaccharide of the present invention.
  • the method for producing 1-kestose crystals of the present invention comprises bringing the improved ⁇ -fructofuranosidase of the present invention, the polypeptide of the present invention, or the culture of the transformant of the present invention into contact with sucrose to produce fructo-oligosaccharides. and crystallizing the fructooligosaccharide.
  • the step of producing fructo-oligosaccharides can be carried out according to the descriptions of the improved ⁇ -fructofuranosidase of the present invention, the production method thereof, and the production method of fructo-oligosaccharides.
  • the step of crystallizing fructo-oligosaccharides can be carried out according to a conventional method.
  • Example 1 Study of wild-type ⁇ -fructofuranosidase
  • wild-type ⁇ -fructofuranosidase was used to study FOS production.
  • PCR A restriction enzyme site was added to the WT-AfBFFase gene using the PCR method.
  • Table 3 shows the primers used
  • Table 4 shows the PCR composition
  • Table 5 shows the PCR conditions.
  • the template DNA the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 from which the portion corresponding to the signal sequence (1st to 19th amino acids, underlined portion of the amino acid sequence shown in Table 2) was removed was used.
  • the concentrate was plated on an LB medium plate (containing kanamycin (50 ⁇ g/mL)) and cultured overnight at 37°C. Colonies grown by transformation were inoculated into 2XYT liquid medium (containing kanamycin (50 ⁇ g/mL)) and cultured overnight. Plasmids were extracted from the culture medium using FastGene Plasmid Mini Kit (Nippon Genetics). The integration of the WT-AfBFFase gene into the pHFT2 vector was confirmed by DNA sequencing service (Eurofins).
  • His Trap A buffer NaCl (500 mM), Tris-HCl (20 mM), imidazole (20 mM), pH 8.0
  • His Trap B buffer imidazole (500 mM), NaCl (500 mM)
  • Tris- HCl buffer 50 mM, pH 8.0
  • the eluted protein solution of interest was concentrated to 2.5 mL at 4000 ⁇ g using a 50 kDa Vivaspin Turbo 30 centrifugal ultrafiltration filter.
  • Example 2 Examination of improved ⁇ -fructofuranosidase (1)
  • glycine (Gly81) which is the 81st amino acid from the amino terminal (N-terminus) of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) of wild-type ⁇ -fructofuranosidase (WT-AfBFFase) of Example 1, and leucine at 141st (Leu141) respectively mutated ⁇ -fructofuranosidase-Gly81 (herein sometimes referred to as "AfBFFase-Gly81") and mutant ⁇ -fructofuranosidase-Leu141 (herein “AfBFFase- Leu141”) was used to examine the amount of FOS produced.
  • Method a Preparation of improved ⁇ -fructofuranosidase plasmids AfBFFase-Gly81 and AfBFFase-Leu141 plasmids were prepared by the following procedure.
  • PCR Inverse PCR was performed using the pHFT2_WT-AfBFFase prepared in Example 1 as a template.
  • Tables 9 and 10 show primer base sequences for substituting the 81st and 141st amino acids with different amino acids, respectively.
  • the PCR composition and PCR conditions were the same as in Tables 4 and 5 of Example 1.
  • AfBFFase-Gly81 replaces glycine (G) at position 81 with 18 amino acids other than glycine (G) and cysteine (C) (alanine (A), aspartic acid (D), glutamic acid (E), phenylalanine (F), histidine (H), isoleucine (I), lysine (K), leucine (L), methionine (M), asparagine (N), glutamine (Q), arginine (R), serine (S), valine (V), tryptophan (W), tyrosine (Y), proline (P) and threonine (T)), and the amount of FOS produced was measured.
  • mutants 15 types of mutants excluding alanine (A), proline (P) and threonine (T) increased the production ratio of 3-sugar FOS or reduced the production ratio of tetra- or more FOS. A decrease was confirmed.
  • phenylalanine (F) histidine (H), isoleucine (I), lysine (K), leucine (L), methionine (M), asparagine (N), glutamine (Q), arginine (R), serine (S ), valine (V), tryptophan (W) or tyrosine (Y)
  • F phenylalanine
  • H histidine
  • I isoleucine
  • K lysine
  • M leucine
  • M methionine
  • N glutamine
  • Q arginine
  • S serine
  • V valine
  • W tryptophan
  • Y tyrosine
  • AfBFFase-Leu141 replaces leucine (L) at position 141 with 18 amino acids other than leucine (L) and cysteine (C) (alanine (A), aspartic acid (D), glutamic acid (E), phenylalanine (F), glycine (G), histidine (H), isoleucine (I), lysine (K), methionine (M), asparagine (N), glutamine (Q), arginine (R), serine (S), threonine (T), valine (V), tryptophan (W), tyrosine (Y), and proline (P)), and the amount of FOS produced was measured.
  • mutants excluding glutamic acid (E), histidine (H), methionine (M), valine (V) and proline (P), showed a trisaccharide FOS to WT-AfBFFase. or a decrease in the production ratio of FOS with 4 or more sugars was confirmed.
  • mutants with substitutions of alanine (A), aspartic acid (D), isoleucine (I), lysine (K), arginine (R), threonine (T), or tryptophan (W) produced trisaccharide FOS. The ratio was confirmed to exceed 47%. The ratio of trisaccharide FOS production was highest in the lysine (K) mutant (50.4%), followed by the tryptophan (W) mutant (49.7%).
  • Example 3 Examination of improved ⁇ -fructofuranosidase (2)
  • improved ⁇ -fructose by double mutation in which both the 81st glycine (Gly81) and the 141st leucine (Leu141) from the N-terminus of the WT-AfBFFase amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) were mutated Furanosidase (which may be referred to herein as "AfBFFase-Gly81-Leu141”) was used to examine the amount of FOS produced.
  • AfBFFase-Gly81-Leu141 consumes a disaccharide compared to WT-AfBFFase when glycine (G) at position 81 and leucine (L) at position 141 are replaced with tyrosine (Y) or tryptophan (W), respectively.
  • G glycine
  • L leucine
  • W tryptophan

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本発明は、改良型β－フルクトフラノシダーゼおよびその製造方法の提供を目的とする。本発明によれば、β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列において、配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ末端から８１番目の位置に相当するアミノ酸および１４１番目の位置に相当するアミノ酸のいずれかまたは両方が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなる改良型β－フルクトフラノシダーゼとその製造方法が提供される。本発明の改良型β－フルクトフラノシダーゼは、４糖以上のＦＯＳの産生を抑制しつつ、３糖ＦＯＳを産生できるため、結晶性および吸湿性を改善したＦＯＳを産生できる点で有利であり、より高い機能性を有するプレバイオティクスを提供できる点でも有利である。

Description

改良型β－フルクトフラノシダーゼ 関連出願の参照
　本願は、先行する日本国出願である特願２０２１－１６３４８９（出願日：２０２１年１０月４日）の優先権の利益を享受するものであり、その開示内容全体は引用することにより本明細書の一部とされる。
　本発明は、改良型β－フルクトフラノシダーゼに関する。本発明はまた、改良型β－フルクトフラノシダーゼをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含んでなるベクター、該ポリヌクレオチドまたは該ベクターを宿主に導入してなる形質転換体に関する。本発明はさらに、改良型β－フルクトフラノシダーゼの製造方法およびフラクトオリゴ糖の製造方法ならびに１－ケストース結晶の製造方法に関する。
　腸内細菌叢は、ヒトの健康に大きな影響を与えるため、腸内細菌叢を形成している微生物バランスを改善することで健康増進作用が発揮される。プレバイオティクスとは腸内環境に生息するビフィズス菌などの特定の有益な微生物の増殖および活性を選択的に促進させる難消化性食品成分のことをいい、外因性微生物を摂取することで腸内細菌叢を変化させるプロバイオティクスとは異なり、標的細菌がすでに腸内に共生しているため、腸内細菌叢を操作するためのより実用的で効率的な方法として知られている（非特許文献１）。
　フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）はプレバイオティクスとしての機能が高く、このうち特にスクロースに１個のフルクトースが結合した３糖ＦＯＳが有用である。３糖ＦＯＳは４糖以上のＦＯＳよりもビフィズス菌の増殖促進効果が高いことが知られており、腸内に生息する微生物は短鎖ＦＯＳ（結合するフルクトースの数が少ない）の方が分解されやすく栄養源として適しており、結果として腸内細菌叢を健康的な構成とすることに寄与すると考えられている（非特許文献２）。一方で、ＦＯＳを産生するβ－フルクトフラノシダーゼは、植物、微生物、真菌類などで広く存在しており、その種によって酵素活性の強さも様々であり、それに伴い産生されるＦＯＳの長さや産生比率も異なる（非特許文献３および４）。これまでに、３糖ＦＯＳを産生するβ－フルクトフラノシダーゼとしては、例えば、特許文献１や特許文献２において開示されている。
国際公開２０１５－９９１６６公報 国際公開２０１６－１４３８７３公報
Gibson GR, et al., J Nutr. 1995;125(6):1401-1412. Tochio T, et al., Foods. 2018;7(9):140. Hidaka H, et al., Agric Biol Chem. 1988;52(5):1181-1187. Yanai K, et al., Biosci Biotechnol Biochem. 2001;65(4):766-773.
　β－フルクトフラノシダーゼにより産生されるＦＯＳは３糖ＦＯＳ以外に４糖以上のＦＯＳも含まれうることが知られているところ、複数種のＦＯＳを含む混合物（特に４糖以上のＦＯＳを含む混合物）は結晶性に乏しく、吸湿性が高いという性質を有する。そのため、単一種のＦＯＳの産生比率を高め、結晶性を向上させることが求められている。また、より高い機能性を有するプレバイオティクスとして、３糖ＦＯＳの産生比率を高めることが期待されている。一方で、複数種のＦＯＳを含む混合物から４糖以上のＦＯＳを分離、除去して低減するには大きな手間と時間を要するものであった。本発明は、このような問題点を解決するための新規な改良型β－フルクトフラノシダーゼを提供することを目的とする。
　本発明者らは、アスペルギルス・フィジエンシス（Aspergills fiijiensis）由来の野生型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（配列番号１）の特定の位置のアミノ酸を異なるアミノ酸に置換することにより、３糖ＦＯＳの産生比率が高く、４糖以上のＦＯＳの産生比率が低い特性を有する改良型β－フルクトフラノシダーゼを見出した。本発明はこの知見に基づくものである。
　本発明によれば以下の発明が提供される。
［１］β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列において、配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ末端から８１番目の位置に相当するアミノ酸および１４１番目の位置に相当するアミノ酸のいずれかまたは両方が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなる、改良型β－フルクトフラノシダーゼ。
［２］β－フルクトフラノシダーゼが、配列番号１に示す野生型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有し、かつ、β－フルクトフラノシダーゼ活性を有するアミノ酸配列からなる、上記［１］に記載の改良型β－フルクトフラノシダーゼ。
［３］下記ａ）およびｂ）のいずれかのアミノ酸配列からなる、上記［１］または［２］に記載の改良型β－フルクトフラノシダーゼ：
ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列において、アミノ末端から８１番目の位置に相当するアミノ酸（グリシン（Ｇ））および１４１番目の位置に相当するアミノ酸（ロイシン（Ｌ））のいずれかまたは両方が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列
ｂ）上記ａ）のアミノ酸配列において、８１番目のグリシン（Ｇ）および１４１番目のロイシン（Ｌ）以外の１または複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、β－フルクトフラノシダーゼ活性を有するアミノ酸配列。
［４］アミノ末端から８１番目の位置に相当するアミノ酸が、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、リシン（Ｋ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、バリン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）およびチロシン（Ｙ）からなる群から選択されるアミノ酸に置換された、上記［１］～［３］のいずれかに記載の改良型β－フルクトフラノシダーゼ。
［５］アミノ末端から１４１番目の位置に相当するアミノ酸が、アラニン（Ａ）、アスパラギン酸（Ｄ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、イソロイシン（Ｉ）、リシン（Ｋ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）およびチロシン（Ｙ）からなる群から選択されるアミノ酸に置換された、上記［１］～［４］のいずれかに記載の改良型β－フルクトフラノシダーゼ。
［６］上記［１］～［５］のいずれかに記載の改良型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列の酵素活性部分を含み、かつ、β－フルクトフラノシダーゼ活性を有する、ポリペプチド。
［７］上記［１］～［５］のいずれかに記載の改良型β－フルクトフラノシダーゼまたは上記［６］に記載のポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
［８］上記［７］に記載のポリヌクレオチドを含んでなる、発現ベクター。
［９］上記［７］に記載のポリヌクレオチドまたは上記［８］に記載の発現ベクターを宿主に導入してなる、形質転換体。
［１０］宿主が細菌、酵母、カビおよび糸状菌からなる群から選択される、上記［９］に記載の形質転換体。
［１１］上記［９］または［１０］に記載の形質転換体の培養物から改良型β－フルクトフラノシダーゼを得る工程を含む、改良型β－フルクトフラノシダーゼの製造方法。
［１２］上記［１］～［５］のいずれかに記載の改良型β－フルクトフラノシダーゼ、上記［６］に記載のポリペプチドまたは上記［９］もしくは［１０］に記載の形質転換体の培養物と、スクロースとを接触させる工程を含む、フラクトオリゴ糖の製造方法。
［１３］上記［１２］に記載の製造方法を実施してフラクトオリゴ糖を製造する工程と、前記フラクトオリゴ糖を結晶化する工程とを含む、１－ケストース結晶の製造方法。
　本発明の改良型β－フルクトフラノシダーゼによれば、４糖以上のＦＯＳの産生を抑制することができるため、結晶性および吸湿性を改善したＦＯＳを産生できる点で有利である。本発明の改良型β－フルクトフラノシダーゼによればまた４糖以上のＦＯＳの産生を抑制しつつ、３糖ＦＯＳを産生できるため、より高い機能性を有するプレバイオティクスを提供できる点で有利である。
図１は、野生型β－フルクトフラノシダーゼ（ＷＴ）による各反応時間におけるＦＯＳの産生比率（１糖：グルコースおよびフルクトース、２糖：スクロース、３糖：３糖ＦＯＳ、４糖以上：４糖以上のＦＯＳ）を示す。 図２は、野生型β－フラクトフラノシダーゼ（ＷＴ）のアミノ酸配列（配列番号１）のアミノ末端（Ｎ末端）から８１番目のアミノ酸であるグリシン（Ｇｌｙ８１）を変異させた変異型β－フラクトフラノシダーゼ－Ｇｌｙ８１（ＡｆＢＦＦａｓｅ－Ｇｌｙ８１）によるＦＯＳの産生比率（１糖：グルコースおよびフルクトース、２糖：スクロース、３糖：３糖ＦＯＳ、４糖以上：４糖以上のＦＯＳ）を示す。なお、横軸のアルファベットはＧｌｙ８１を置換したアミノ酸を示し、括弧内は反応時間（時間）を示す。 図３は、野生型β－フラクトフラノシダーゼ（ＷＴ）のアミノ酸配列（配列番号１）のアミノ末端（Ｎ末端）から１４１番目のロイシン（Ｌｅｕ１４１）を変異させた変異型β－フラクトフラノシダーゼ－Ｌｅｕ１４１（ＡｆＢＦＦａｓｅ－Ｌｅｕ１４１）によるＦＯＳの産生比率（１糖：グルコースおよびフルクトース：、２糖：スクロース、３糖：３糖ＦＯＳ、４糖以上：４糖以上のＦＯＳ）を示す。なお、横軸のアルファベットはＬｅｕ１４１を置換したアミノ酸を示し、括弧内は反応時間（時間）を示す。 図４は、野生型β－フラクトフラノシダーゼ（ＷＴ）のアミノ酸配列（配列番号１）のＮ末端から８１番目のグリシン（Ｇｌｙ８１）と１４１番目のロイシン（Ｌｅｕ１４１）の双方を変異させた二重変異の改良型β－フルクトフラノシダーゼ（ＡｆＢＦＦａｓｅ－Ｇｌｙ８１－Ｌｅｕ１４１）によるＦＯＳの産生比率（１糖：グルコースおよびフルクトース、２糖：スクロース、３糖：３糖ＦＯＳ、４糖以上：４糖以上のＦＯＳ）を示す。なお、横軸のアルファベット２文字のうち左がＧｌｙ８１を置換したアミノ酸、右がＬｅｕ１４１を置換したアミノ酸をそれぞれ示し、括弧内は反応時間（時間）を示す。
発明の具体的説明
＜＜定義＞＞
　本発明において、「フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ；fructooligosaccharides、本明細書中「ＦＯＳ」ということがある）」は、スクロースにフルクトースを１～３分子結合させたオリゴ糖をいう。ＦＯＳには、スクロースのフルクトース残基にフルクトース１分子がβ－２，１結合した１－ケストース（本明細書中「ＧＦ２」または「３糖ＦＯＳ」ということがある）、スクロースのフルクトース残基にフルクトース２分子がβ－２，１結合したニストース（本明細書中「ＧＦ３」または「４糖ＦＯＳ」ということがある）、スクロースのフルクトース残基にフルクトース３分子がβ－２，１結合した１－フラクトフラノシル－Ｄ－ニストース（本明細書中「ＧＦ４」または「５糖ＦＯＳ」ということがある）がある。ＦＯＳは、β－フルクトフラノシダーゼによって合成される。
　本発明において、「β－フルクトフラノシダーゼ」は、ＧＨファミリー（グリコシドヒドロラーゼファミリー；糖のグリコシド結合を加水分解する酵素のうち配列類似性が高い相同タンパク質の一群のことをいう）のうちスクロースの加水分解活性をもつＧＨ３２ファミリーに属する酵素をいう。β－フルクトフラノシダーゼによる酵素反応は、糖が結合する基質結合ポケットにスクロースが入り込むことから開始する。糖分解反応が起こり、触媒中心部位でグルコースとフルクトースとのグリコシド結合が切断され、グルコースが遊離する。フルクトース部分は活性中心部分の触媒基とアシル酵素中間体を形成する。その後中間体に水が結合するとフルクトースは遊離されるが、糖高濃度下の場合、糖転移活性が優先されて、フルクトースがアクセプターとなるスクロースとグリコシド結合をして、３糖ＦＯＳとなり、基質結合ポケットから遊離する。また、アクセプターとなる糖が３糖ＦＯＳの場合、フルクトースとグリコシド結合をして４糖ＦＯＳとなりポケットから遊離する。このような酵素反応を介して、アクセプターとなる糖の種類によって３、４、５糖といった多様な長さのＦＯＳが産生される。なお、「β－フルクトフラノシダーゼ」は、「β－フラクトフラノシダーゼ」、「フルクトシルトランスフェラーゼ」、「フラクトシルトランスフェラーゼ」、「サッカラーゼ」、「β－Ｄ－フルクトフラノシダーゼ」、「β－Ｄ－フラクトフラノシダーゼ」、「インベルターゼ」、「インバーターゼ」または「インベルチン」という用語で交換可能に用いられることがあり、いずれも同義である。
＜＜改良型β－フルクトフラノシダーゼ＞＞
　本発明の改良型β－フルクトフラノシダーゼは、改良対象のβ－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列において、特定の２つの位置のアミノ酸のいずれかまたは両方が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるものである。β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列における置換対象となる特定位置のアミノ酸は、改良対象のβ－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列を、配列番号１のアミノ酸配列と適切に整列（アライメント）させることにより特定することができる。すなわち、改良対象のβ－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列を、後述の相同性検索ソフトウェアまたはプログラムなどを用いて配列番号１のアミノ酸配列と整列させ、配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ末端から８１番目の位置に相当するアミノ酸および配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ末端から１４１番目の位置に相当するアミノ酸をそれぞれ置換対象となる特定位置のアミノ酸とすることができる。
　本発明の改良型β－フルクトフラノシダーゼは、改良対象のβ－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列において、配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ末端から８１番目の位置に相当するアミノ酸および配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ末端から１４１番目の位置に相当するアミノ酸のいずれかまたは両方を元のアミノ酸とは異なるアミノ酸に置換したアミノ酸配列からなるものである。配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ末端から８１番目の位置のアミノ酸はグリシン（Ｇ）であり、配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ末端から１４１番目の位置のアミノ酸はロイシン（Ｌ）であるから、配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ末端から８１番目の位置に相当するアミノ酸は典型的にはグリシン（Ｇ）であり、配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ末端から１４１番目の位置に相当するアミノ酸は典型的にはロイシン（Ｌ）である。すなわち、改良対象のβ－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列が配列番号１に示すアミノ酸である場合には、アミノ末端から８１番目の位置に相当するアミノ酸はグリシン（Ｇ）であり、アミノ末端から１４１番目の位置に相当するアミノ酸はロイシン（Ｌ）である。
　配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ末端から８１番目の位置に相当するアミノ酸は、グリシン（Ｇ）およびシステイン（Ｃ）以外のアミノ酸１８種（アラニン（Ａ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、リシン（Ｋ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、バリン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、プロリン（Ｐ）およびトレオニン（Ｔ））からなる群から選択されるアミノ酸に置換することができ、配列番号１に示す野生型β－フルクトフラノシダーゼに対して３糖ＦＯＳの産生比率を高めるあるいは４糖以上のＦＯＳの産生比率を低減させる観点からグリシン（Ｇ）、システイン（Ｃ）、アラニン（Ａ）、プロリン（Ｐ）およびトレオニン（Ｔ）以外のアミノ酸１５種（アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、リシン（Ｋ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、バリン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）およびチロシン（Ｙ））からなる群から選択されるアミノ酸に置換することが好ましく、配列番号１に示す野生型β－フルクトフラノシダーゼに対して３糖ＦＯＳの産生比率を高めかつ４糖以上のＦＯＳの産生比率を低減させる観点からフェニルアラニン（Ｆ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、リシン（Ｋ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、バリン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）およびチロシン（Ｙ）からなる群から選択されるアミノ酸に置換することがより好ましく、３糖ＦＯＳの産生比率を５０％超に高めかつ４糖以上のＦＯＳの産生比率を１０％未満とする観点からリシン（Ｋ）、ロイシン（Ｌ）、トリプトファン（Ｗ）およびチロシン（Ｙ）からなる群から選択されるアミノ酸に置換することがより一層好ましく、３糖ＦＯＳの産生比率を５５％超に高めかつ４糖以上のＦＯＳの産生比率を８％未満とする観点からトリプトファン（Ｗ）またはチロシン（Ｙ）に置換することが特に好ましい。ここで、３糖ＦＯＳあるいは４糖以上の産生比率とは、酵素反応後の反応サンプルに含まれる全糖に対して占める比率をいい、後記実施例の例１（１）ウ(i)および（２）の記載に従って評価することができる（以下、本明細書において同様）。
　配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ末端から１４１番目の位置に相当するアミノ酸は、ロイシン（Ｌ）およびシステイン（Ｃ）以外のアミノ酸１８種（アラニン（Ａ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、リシン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）およびプロリン（Ｐ））からなる群から選択されるアミノ酸に置換することができ、配列番号１に示す野生型β－フルクトフラノシダーゼに対して３糖ＦＯＳの産生比率を高めるあるいは４糖以上のＦＯＳの産生比率を低減させる観点からロイシン（Ｌ）、システイン（Ｃ）、グルタミン酸（Ｅ）、ヒスチジン（Ｈ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）およびプロリン（Ｐ）以外のアミノ酸１３種（アラニン（Ａ）、アスパラギン酸（Ｄ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、イソロイシン（Ｉ）、リシン（Ｋ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）およびチロシン（Ｙ））からなる群から選択されるアミノ酸に置換することが好ましく、配列番号１に示す野生型β－フルクトフラノシダーゼに対して３糖ＦＯＳの産生比率を高めかつ４糖以上のＦＯＳの産生比率を低減させる観点からアラニン（Ａ）、アスパラギン酸（Ｄ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、イソロイシン（Ｉ）、リシン（Ｋ）、アスパラギン（Ｎ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）およびチロシン（Ｙ）からなる群から選択されるアミノ酸に置換することがより好ましく、３糖ＦＯＳの産生比率を４７％超に高めかつ４糖以上のＦＯＳの産生比率を１６％未満に低減させる観点からアラニン（Ａ）、アスパラギン酸（Ｄ）、イソロイシン（Ｉ）、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、トレオニン（Ｔ）およびトリプトファン（Ｗ）からなる群から選択されるアミノ酸に置換することがより一層好ましく、３糖ＦＯＳの産生比率を４９％超に高めかつ４糖以上のＦＯＳの産生比率を１３％未満に低減する観点からリシン（Ｋ）またはトリプトファン（Ｗ）に置換することが特に好ましい。
　改良対象のβ－フルクトフラノシダーゼは、配列番号１に示す野生型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列と６０％以上（好ましくは、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９８％以上または９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるものとすることができる。ここで「同一性」は、例えば、比較する配列同士を適切に整列（アライメント）させたときの同一性の程度であり、前記配列間のアミノ酸の正確な一致の出現率（％）を意味する。同一性の算出にあたっては、例えば、配列におけるギャップの存在およびアミノ酸の性質が考慮される（Wilbur, Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:726-730（1983））。前記アライメントは、例えば、任意のアルゴリズムの利用により行うことができ、具体的には、ＢＬＡＳＴ（Basic local alignment search tool)（Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990））、ＦＡＳＴＡ（Peasron et al., Methods in Enzymology 183:63-69 (1990）)、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ（Meth. Enzym., 164, 765 (1988））などの公に利用可能な相同性検索ソフトウェアを使用することができる。また、同一性の算出は、例えば、前記のような公に利用可能な相同性検索プログラムを用いて行うことができ、例えば、米国国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）において、デフォルトのパラメーターを用いることによって算出することができる。
　改良対象のβ－フルクトフラノシダーゼはまた、配列番号１に示す野生型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するとともに、β－フルクトフラノシダーゼ活性を有するアミノ酸配列からなるものである。この場合において「β－フルクトフラノシダーゼ活性を有する」とは、当該アミノ酸配列が、温度５０～５５℃、ｐＨ５．５の条件下において、配列番号１に示すアミノ酸配列からなる野生型β－フルクトフラノシダーゼの約７０％以上の活性、約８０％以上の活性、約９０％以上の活性、約９５％以上の活性または約１００％以上の活性を有するものと定義することができる。β－フルクトフラノシダーゼ活性は、例えば、測定対象タンパク質またはポリペプチドを含む溶液とスクロースを含む溶液とを混合し、該混合液をインキュベートし、酵素反応により生成するグルコース量を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、各種グルコース定量キットなどを用いて測定し、ここで得られた値と、反応に用いた酵素量から評価することができる。
　改良対象のβ－フルクトフラノシダーゼは典型的には野生型酵素であり、例えば、微生物、真菌類、植物などのいずれの生物に由来するものとすることができ、好ましくは、アスペルギルス属に属する微生物に由来するものとすることができる。但し、本発明において人為的な変異が導入されたβ－フルクトフラノシダーゼを改良対象として使用することを妨げるものではない。
　アスペルギルス属に属する微生物に由来するβ－フルクトフラノシダーゼとしては、例えば、表１に示すものが挙げられる。なお、表１に示すβ－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列においては、配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ末端から８１番目の位置に相当するアミノ酸と、配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ末端から１４１番目の位置に相当するアミノ酸の存在を確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　本発明の好ましい態様によれば、前記［３］に記載のａ）およびｂ）のいずれかのアミノ酸配列からなる、改良型β－フルクトフラノシダーゼが提供される。ａ）のアミノ酸配列における置換対象のアミノ酸と、置換後のアミノ酸の種類は前記の通りである。ｂ）のアミノ酸配列では、８１番目のグリシン（Ｇ）および１４１番目のロイシン（Ｌ）以外の１または複数個のアミノ酸において欠失、置換、挿入および付加からなる群から選択される改変を有していてもよい。改変されるアミノ酸の個数は、例えば、１～６５個、１～５０個、１～４０個、１～３０個または１～２０個とすることができ、好ましくは１～１０個、より好ましくは１～６個、特に好ましくは１～数個、１～４個、１～３個、１～２個または１個である。改変されるアミノ酸の個数はまた、部位突然変異誘発法などの公知の方法により生じる程度の変異数、あるいは、天然に生じる程度の変異数とすることができる。前記改変はまた、複数の同種の改変（例えば、複数の置換）であってもよいし、複数の異種の改変（例えば、１個以上の欠失と１個以上の置換の組合せ）であってもよい。
　ｂ）のアミノ酸配列はまた、ａ）のアミノ酸配列に対して８０％以上（好ましくは８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９８％以上または９９％以上）の配列同一性を有し、かつ、β－フルクトフラノシダーゼ活性を有するアミノ酸配列とすることもできる。但しこの場合においても、８１番目のグリシン（Ｇ）および１４１番目のロイシン（Ｌ）以外の１または複数個のアミノ酸において欠失、置換、挿入および付加からなる群から選択される改変を有することになる。
　ｂ）のアミノ酸配列におけるアミノ酸の改変は保存的改変（例えば、保存的変異）であってもよい。「保存的改変」または「保存的変異」は、タンパク質の機能を実質的に改変しないように、１個または複数個のアミノ酸を改変し、または変異させることを意味する。前記アミノ酸の置換はまた、保存的置換であってもよい。「保存的置換」は、タンパク質の機能を実質的に改変しないように、１個または複数個のアミノ酸を、別のアミノ酸および／またはアミノ酸誘導体に置換することを意味する。保存的置換において、置換されるアミノ酸と置換後のアミノ酸とは、例えば、性質および／または機能が類似していることが好ましい。具体的には、疎水性および親水性の指標、極性、電荷などの化学的性質、あるいは二次構造などの物理的性質が類似していることが好ましい。このように、性質および／または機能が類似するアミノ酸またはアミノ酸誘導体は、当該技術分野において公知である。例えば、非極性アミノ酸（疎水性アミノ酸）としては、例えば、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性アミノ酸（中性アミノ酸）は、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷を有するアミノ酸（塩基性アミノ酸）は、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられ、負電荷を有するアミノ酸（酸性アミノ酸）は、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
　ｂ）のアミノ酸配列はまた、８１番目のグリシン（Ｇ）および１４１番目のロイシン（Ｌ）以外の１または複数個のアミノ酸において欠失、置換、挿入および付加からなる群から選択される改変を有するとともに、β－フルクトフラノシダーゼ活性を有するアミノ酸配列からなるものである。この場合において「β－フルクトフラノシダーゼ活性を有する」とは、当該アミノ酸配列が、温度５０～５５℃、ｐＨ５．５の条件下において、ａ）のアミノ酸配列からなるβ－フルクトフラノシダーゼの約９０％以上の活性、約９５％以上の活性、約９８％以上の活性または約１００％以上の活性を有するものと定義することができる。β－フルクトフラノシダーゼ活性の測定は前記と同様に行うことができる。
　本発明の改良型β－フルクトフラノシダーゼは、例えば、化学合成する方法や、遺伝子組換え技術により得ることができる。化学合成する方法では、例えば、アミノ酸配列情報に基づいて、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ－ブチルオキシカルボニル法）、無細胞タンパク質合成法などの化学合成法に従って本発明の改良型β－フルクトフラノシダーゼを合成することができる。本発明の改良型β－フルクトフラノシダーゼはまた、市販のペプチド合成機を利用して合成することもできる。
　本発明の改良型β－フルクトフラノシダーゼは、その産生能を有する遺伝子組換え微生物を培養することにより製造することができる。例えば、本発明の改良型β－フルクトフラノシダーゼをコードするポリヌクレオチドを適当な宿主に導入して形質転換体を得て、該形質転換体を培養し、培養物から改良型β－フルクトフラノシダーゼを抽出することにより得ることができる。具体的には、後記の実施例（例えば、例１（１）アおよびイ）の記載に従って得ることができる。
　本発明の改良型β－フルクトフラノシダーゼをコードするポリヌクレオチドは、市販されている種々のポリヌクレオチド合成機を用いて合成することができるほか、後記の例１や例２に示すように、インバースポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いた部位特異的変異導入により得ることもできる。ここで、「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡおよびＲＮＡが含まれ、さらには、これらの修飾体や人工核酸が含まれるが、好ましくはＤＮＡである。また、ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび化学合成ＤＮＡが含まれる。
＜＜改良型β－フルクトフラノシダーゼの酵素活性部分を含むポリペプチド＞＞
　本発明によれば、本発明の改良型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列の酵素活性部分を含み、かつ、β－フルクトフラノシダーゼ活性を有するポリペプチドが提供される。本発明のポリペプチドのアミノ酸配列は、典型的には少なくともβ－フルクトフラノシダーゼ活性を有する部位（領域）を含むものである。本発明の改良型β－フルクトフラノシダーゼにおいてβ－フルクトフラノシダーゼ活性を有する部位としては、例えば、配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ末端から２０～６５４番目（Ｎ末端側のシグナル配列を除いた領域）の位置に相当する部位、配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ末端から５０～５５８番目（グリコシルヒドロラーゼファミリー３２に属する酵素に特徴的な領域）の位置に相当する部位、配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ末端から５９～４２８番目（グリコシルヒドロラーゼファミリー３２に属する酵素のＮ末端側配列に特徴的な領域）の位置に相当する部位、配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ末端から６０番目（触媒中心アミノ酸Ａｓｐ６０）の位置に相当する部位、配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ末端から１９１番目（触媒中心アミノ酸Ａｓｐ１９１）の位置に相当する部位および配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ末端から２９２番目（触媒中心アミノ酸Ｇｌｕ２９２）の位置に相当する部位が挙げられる。本発明のポリペプチドは、本発明の改良型β－フルクトフラノシダーゼを得る方法と同様の方法により得ることができる。
＜＜改良型β－フルクトフラノシダーゼ等をコードするポリヌクレオチドおよびそれを含むベクター＞＞
　本発明によれば、本発明の改良型β－フルクトフラノシダーゼまたは本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。本発明のポリヌクレオチドは、本発明の改良型β－フルクトフラノシダーゼを得る方法に記載したポリヌクレオチドの合成方法などを用いて得ることができる。
　本発明によればまた、改良型β－フルクトフラノシダーゼをコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターが提供される。
　本発明の組換えベクターは、本発明の改良型β－フルクトフラノシダーゼをコードするポリヌクレオチドをベクターに作動可能に連結することにより得ることができる。ポリヌクレオチドのベクターへの連結は常法に従って行うことができ、例えば、後記実施例（例１（１）ア）に記載されるように、ポリヌクレオチドと線状化したベクターのポリヌクレオチドとをライゲーションすることにより行うことができる。ここで、ベクターとしては、例えば、ファージベクターやプラスミドベクター、コスミド、ファージミドなどを挙げることができ、宿主や操作性などに応じて適宜選択することができる。また、本発明の組換えベクターは、本発明の改良型β－フルクトフラノシダーゼをコードするポリヌクレオチドのほかに、薬剤耐性マーカー遺伝子や栄養要求マーカー遺伝子などの形質転換体の選択マーカー遺伝子、改良型β－フルクトフラノシダーゼの発現に必要なプロモーター、転写開始信号、リボゾーム結合部位、翻訳停止シグナル、転写終結信号などの転写調節信号や翻訳調節信号などを含むものであってもよい。
＜＜形質転換体＞＞
　本発明によれば、本発明の改良型β－フルクトフラノシダーゼまたは本発明のポリペプチドを産生することができる形質転換体が提供される。本発明の形質転換体は、本発明の改良型β－フルクトフラノシダーゼまたは本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは本発明の組換えベクターを宿主に導入して得ることができる。ここで、宿主としては、例えば、大腸菌や枯草菌などの細菌、酵母、カビ、糸状菌などを挙げることができ、組換えベクターの種類や操作性などに応じて適宜選択することができる。ＤＮＡや組換えベクターの宿主への導入（形質転換）は常法に従って実施することができる。また、宿主の染色体に直接目的のＤＮＡを導入するには、相同組換え法などを用いることができる。
＜＜改良型β－フルクトフラノシダーゼの製造方法＞＞
　本発明によれば、本発明の改良型β－フルクトフラノシダーゼまたは本発明のポリペプチドの製造方法が提供される。本発明の製造方法は、本発明の形質転換体を当該形質転換体の培養に適した培地で培養し、場合によっては培養して得られる培養物から本発明の改良型β－フルクトフラノシダーゼまたはポリペプチドを採取することにより実施することができる。培養に使用する培地は、形質転換微生物が生育でき、本発明の改良型β－フルクトフラノシダーゼまたは本発明のポリペプチドを産生しうる栄養培地であれば特に限定されず、合成培地および天然培地のいずれでもよい。また、時間、温度などの培養条件は、培養する微生物に適した条件を適宜選択することができる。
　本発明の製造方法においては、形質転換体を培養して得られる培養物をそのまま本発明の改良型β－フルクトフラノシダーゼまたは本発明のポリペプチドとして得てもよく、培養物から本発明の改良型β－フルクトフラノシダーゼまたは本発明のポリペプチドを単離・精製することもできる。
　形質転換体を培養して得られる培養物をそのまま本発明の改良型β－フルクトフラノシダーゼまたは本発明のポリペプチドとして得るには、例えば、発現タンパク質が形質転換体の細胞表面あるいは細胞内部に発現されるようにポリヌクレオチドまたは組換えベクターを設計し、培養物を遠心分離に供して形質転換体を回収し、これをそのまま本発明の改良型β－フルクトフラノシダーゼまたは本発明のポリペプチドとして得ることができ、あるいは、回収した形質転換体を破砕して、これを本発明の改良型β－フルクトフラノシダーゼまたは本発明のポリペプチドとして得ることもできる。
　培養物から本発明の改良型β－フルクトフラノシダーゼまたは本発明のポリペプチドを単離・精製するには、例えば、発現タンパク質が形質転換体の外部に分泌されるようにポリヌクレオチドまたは組換えベクターを設計し、培養物を遠心分離に供して培養上清を回収することにより行うことができる。また、発現タンパク質が形質転換体の内部に発現されるようにポリヌクレオチドまたは組換えベクターを設計し、培養物を遠心分離に供して沈殿させた形質転換体を回収し、これを、緩衝液中に懸濁、凍結融解、超音波処理または磨砕するなどして形質転換体を破砕した後、遠心分離に供して上清を回収することにより本発明の改良型β－フルクトフラノシダーゼまたは本発明のポリペプチドを精製することができる。その他、精製する方法としては、培養液の上清または破砕処理物を熱処理、塩沈澱、溶媒沈澱、透析、限外ろ過、ゲルろ過、ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、等電点電気泳動などに供する方法が挙げられる。
＜＜改良型フラクトオリゴ糖の製造方法＞＞
　本発明によれば、改良型フラクトオリゴ糖の製造方法が提供される。本発明のフラクトオリゴ糖の製造方法は、本発明の改良型β－フルクトフラノシダーゼ、本発明のポリペプチドまたは本発明の形質転換体の培養物とスクロースとを接触させる工程を含んでなる。
　本発明のフラクトオリゴ糖の製造方法において、本発明の改良型β－フルクトフラノシダーゼ等とスクロースとの接触は、例えば、改良型β－フルクトフラノシダーゼ等をスクロースを含む溶液に添加し、インキュベートすることにより行うことができる。インキュベートの条件は、例えば、温度は２０～６０℃、好ましくは２５～５５℃、より好ましくは３０～５０℃、さらに好ましくは４０～５０℃とすることができ、時間は１～２０時間、好ましくは１～８時間、より好ましくは２～４時間とすることができる。本発明の形質転換体を培養して得られる培養物とスクロースとの接触についても同様に行うことができる。ここで、本発明の培養物は、破砕、磨砕、緩衝液への懸濁、凍結融解、超音波処理、遠心分離、熱処理、塩沈澱、溶媒沈澱、透析、限外ろ過、ゲルろ過、ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、等電点電気泳動などの何らかの処理に供したものでもよく、処理に供していないものでもよい。
　本発明のフラクトオリゴ糖の製造方法は、追加の任意の工程を含むこともでき、例えば、クロマトグラフィーによるフラクトオリゴ糖の分離工程、結晶化工程、乾燥工程、洗浄工程、濾過工程、殺菌工程、食品添加物を添加する工程のいずれかまたはこれらの一部もしくは全部の組合せを含むことができる。
＜＜１－ケストース結晶の製造方法＞＞
　本発明によれば、１－ケストース結晶の製造方法が提供される。本発明の１－ケストースの製造方法は、本発明のフラクトオリゴ糖の製造方法により製造されたフラクトオリゴ糖を用いることを特徴とする。本発明の１－ケストース結晶の製造方法は、本発明の改良型β－フルクトフラノシダーゼ、本発明のポリペプチド、または本発明の形質転換体の培養物と、スクロースとを接触させてフラクトオリゴ糖を製造する工程と、前記フラクトオリゴ糖を結晶化する工程とを含むものである。フラクトオリゴ糖を製造する工程は、本発明の改良型β－フルクトフラノシダーゼおよびその製造方法ならびにフラクトオリゴ糖の製造方法の記載に従って実施することができる。フラクトオリゴ糖を結晶化する工程は、常法に従って実施することができる。
　以下の例に基づき本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
例１：野生型β－フルクトフラノシダーゼの検討
　例１では、野生型β－フラクトフラノシダーゼを用いてＦＯＳ産生量について検討した。
（１）方法
ア　野生型β－フルクトフラノシダーゼのプラスミド作製
　アスペルギルス・フィジエンシス（Aspergillus fiijiensis ATCC20611）由来の野生型β－フルクトフラノシダーゼ（本明細書中「ＷＴ－ＡｆＢＦＦａｓｅ」あるいは「ＷＴ」ということがある）の遺伝子を挿入したプラスミドの作製を次の手順で行った。ＷＴ－ＡｆＢＦＦａｓｅのアミノ酸配列（配列番号１）は表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（i）ＰＣＲ
　ＰＣＲ法を用いてにＷＴ－ＡｆＢＦＦａｓｅ遺伝子に制限酵素処理部位を付加した。表３は使用したプライマー、表４はＰＣＲ組成、表５はＰＣＲ条件をそれぞれ示す。なお、鋳型ＤＮＡには配列番号１に示すアミノ酸配列のうちシグナル配列（１～１９番目のアミノ酸、表２に示すアミノ酸配列の下線部分）に対応する部位を除去したものを用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
（ii）ＰＣＲ産物のゲル抽出
　上記（i）で増幅したＰＣＲ産物とMidori Green Direct（日本ジェネティクス）を５：１の割合で混合し、１％アガロースゲル（０．５×ＴＡＥ緩衝液：Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（２０ｍＭ）、酢酸（１０ｍＭ）、ＥＤＴＡ（０．５ｍＭ）、ｐＨ８．０）で電気泳動を行った。電気泳動後、緑色発光ＬＥＤをゲルに当て目的バンドを切り出した。そして、FastGene Gel/PCR Extraction Kit（日本ジェネティクス）を用いてＤＮＡを抽出した。
（iii）制限酵素処理
　Gilbreth RN et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2011; 108(19): 7751-6.、Koide A et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2007; 104(16):6632-7.の記載に従って、ｐＥＴ２８ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）をもとにｐＨＦＴ２ベクターを作製した。ｐＨＦＴ２ベクターはカナマイシン耐性であり、Ｎ末端配列には１０×ＨｉｓおよびＴＥＶプロテアーゼ切断部位が付加されている。次に、ｐＨＦＴ２ベクターを表６に示す組成にて制限酵素処理した。また、上記（ii）でゲル抽出したＤＮＡは表７に示す組成にて制限酵素処理した。制限酵素処理はいずれも３７℃、１時間、静置の条件下で行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
（iv）制限酵素処理したベクターとインサートＤＮＡのゲル抽出
　上記（iii）で制限酵素処理したベクターとインサートＤＮＡは、上記（ii）の記載と同様にしてゲル抽出した。
（v）ライゲーション
　上記（iv）で得られたベクターとインサートＤＮＡのモル比が１：８となるように混合し、その混合液５μＬにLigation-Convenience Kit（ニッポンジーン）５μＬを加え、１６℃、１５分で反応させた。
（vi）大腸菌ＪＭ１０９の形質転換
　上記（v）で反応させたライゲーション溶液１０μＬを大腸菌ＪＭ１０９（ニッポンジーン）（コンピテントセル）に加えて、氷上で静置した。その後、４２℃で４５～５０秒インキュベートし、すぐに氷上に静置した。３分経過後、ＳＯＣ培地を１０培希釈になるように加え、３７℃、１２０ｒｐｍで１時間回復培養を行った。培養後、培養液を５，０００×ｇで３０秒間遠心を行い、上清を取り除き、１００μＬにまで濃縮した。濃縮液をＬＢ培地プレート（カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含む）に播いて、３７℃で一晩培養した。形質転換で生えたコロニーを２ＸＹＴ液体培地（カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含む）に植菌して、一晩培養した。培養液をFastGene Plasmid Mini Kit（日本ジェネティクス）を用いてプラスミド抽出をした。ｐＨＦＴ２ベクターにＷＴ－ＡｆＢＦＦａｓｅ遺伝子が組み込まれていることをＤＮＡシーケンスサービス（Eurofins）により確認した。
イ　タンパク質発現と精製
（i）大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換と培養
　上記（１）アで作製したＷＴ－ＡｆＢＦＦａｓｅ遺伝子が組み込まれたプラスミド（本明細書中「ｐＨＦＴ２＿ＷＴ－ＡｆＢＦＦａｓｅ」ということがある）２μＬを用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換を行い、カナマイシンプレートに播いた。形質転換は、上記（１）ア（vi）の記載と同様にして行った。３７℃で一晩培養後、プレート上のシングルコロニーを５ｍＬのＬＢ液体培地（カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含む）に植菌し、３７℃、１２０ｒｐｍで１６時間培養した。そして、５００ｍＬの２ＸＹＴ培地（カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含む）に前培養液５ｍＬを植菌し、濁度が０．３～０．５になるまで３７℃で培養した。その後、ＩＰＴＧ（終濃度０．２ｍＭ）を添加して、１８℃で１６時間振盪培養した。培養液を８０００ｇで１０分遠心分離して集菌した。集菌後、菌体をＮａＣｌ（１５０ｍＭ）により懸濁して洗浄し、もう一度遠心分離を行い、沈殿した菌体を－３０℃で冷凍保存した。
（ii）アフィニティークロマトグラフィーによる精製
　沈殿した菌体に対して１５ｍＬの破砕緩衝液（ＮａＣｌ（５００ｍＭ）、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（２０ｍＭ）、イミダゾール（２０ｍＭ）、ｐＨ８．０）で懸濁して、超音波破砕を行った。３０秒間破砕を行った後、１分間の氷冷を１セットとして、これを計１０セット行った。破砕溶液を１８００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離を行い、０．４５μｍ滅菌フィルターで濾過することにより、無細胞抽出液を得た。終濃度２０ｍＭになるように抽出液にイミダゾールを加えて、Ｈｉｓ　Ｔｒａｐ　ＨＰ　カラムに供した。Ｈｉｓ　ＴｒａｐＡ緩衝液（ＮａＣｌ（５００ｍＭ）、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（２０ｍＭ）、イミダゾール（２０ｍＭ）、ｐＨ８．０）により洗浄し、続いて、Ｈｉｓ　ＴｒａｐＢ緩衝液（イミダゾール（５００ｍＭ）、ＮａＣｌ（５００ｍＭ）、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（５０ｍＭ）、ｐＨ８．０）を４～１００％の濃度勾配で溶出した。溶出した目的のタンパク質溶液を、５０ｋＤａのビバスピンターボ３０遠心式限外ろ過フィルターを用いて、４０００×ｇで２．５ｍＬにまで濃縮した。
（iii）ゲル濾過クロマトグラフィーによる精製
　Ｈｉｓ　Ｔｒａｐ　ＨＰ　カラムで分離できなかった凝集物を除くため、ゲル濾過クロマトグラフィーによる精製を行った。ゲル濾過緩衝液（ＮａＣｌ（１５０ｍＭ）、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（５０ｍＭ）ｐＨ８．０）を使用し、ＨｉＬｏａｄ　１６／６０　Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　２００　ｐｒｅｐ　ｇｒａｄ　カラム（１２０ｍＬ、ＧＥヘルスケア）にタンパク質溶液を供した。各タンパク質を含む画分を回収し、５０ｋＤａのビバスピンターボ３０１０遠心式限外ろ過フィルターを用いて濃縮し、精製溶液として４℃で保存した。精製溶液の濃度は吸光度２８０ｎｍで測定した。また、ＷＴ－ＡｆＢＦＦａｓｅの吸光度係数（Ａｂｓ０．１％（＝１ｇ／Ｌ））は１．７４７である。
（iv）ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
　精製タンパク質溶液を作製した１０％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲルにアプライして電気泳動を行った。分子量マーカーは、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｗｅｉｇｈｔ　Ｍａｒｋｅｒ　Ｂｒｏａｄ（タカラバイオ）を用いた。これにより、目的タンパク質が精製されていることを確認した。
ウ　ＦＯＳ産生量の評価
（i）酵素反応
　反応は、基質溶液（１Ｍスクロース）と精製タンパク質溶液（分析緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．５）で調製した上記（１）イで得られたＷＴ－ＡｆＢＦＦａｓｅ（１μｇ）を含む）とを混合することにより開始した。サンプルを５０℃で反応させて、０、１時間、１．５時間、２時間、２．５時間、３時間、３．５時間、４時間、６時間、８時間毎に回収し、１５分間煮沸して反応を停止した。各反応時間で同じ操作を３回行った。反応後のサンプル液は－２０℃で保存した。
（ii）液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析
　単糖、二糖、およびＦＯＳの産生量は、疎水性相互作用クロマトグラフィーによって分析した。ＨＰＬＣ（ＬＣ－２０ＡＤ、島津製作所）のＵＬＴＲＯＮ　ＡＦ－ＨＩＬＩＣ－ＣＤ　カラム（島津製作所）を使用して測定した。また、分析緩衝液には７４．１％アセトニトリルを用いた。糖鎖が長くなるにつれて疎水性度が上がるため、保持時間が長くなる。この保持時間の違いを利用して示差屈折率検出器（ＲＩＤ）で検出した。糖の長さによって溶出される時間が異なり、ピーク面積から産生量を算出できるため、既知の糖を用いて検量線を作成した。この検量線を用いて、ＦＯＳ産出量を算出した。
（２）結果
　結果は、表８および図１に示す通りであった。酵素反応によって、反応前は２糖（スクロース）が全体の１００％を占めているが、反応時間の経過とともに２糖が消費され全体を占める割合が減っていることが確認された。この結果と、産業利用上は、３糖ＦＯＳが多く存在し、４糖以上のＦＯＳが少なく、かつ、２糖が効率よく消費される反応時間が望ましいことを考慮し、２糖が１０～１５％にまで消費された時点におけるＦＯＳ産生量でβ－フルクトフラノシダーゼの機能評価を行うことが妥当であると考えられた。そこで、例２以降の改良型β－フルクトフラノシダーゼの検討では、２糖が１０～１５％にまで消費された時点におけるＦＯＳ産生量で評価を行うこととした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
例２：改良型β－フルクトフラノシダーゼの検討（１）
　例２では、例１の野生型β－フラクトフラノシダーゼ（ＷＴ－ＡｆＢＦＦａｓｅ）のアミノ酸配列（配列番号１）のアミノ末端（Ｎ末端）から８１番目のアミノ酸であるグリシン（Ｇｌｙ８１）および１４１番目のロイシン（Ｌｅｕ１４１）をそれぞれ変異させた変異型β－フラクトフラノシダーゼ－Ｇｌｙ８１（本明細書中「ＡｆＢＦＦａｓｅ－Ｇｌｙ８１」ということがある）および変異型β－フラクトフラノシダーゼ－Ｌｅｕ１４１（本明細書中「ＡｆＢＦＦａｓｅ－Ｌｅｕ１４１」ということがある）を用いてＦＯＳ産生量について検討した。
（１）方法
ア　改良型β－フルクトフラノシダーゼのプラスミド作製
　ＡｆＢＦＦａｓｅ－Ｇｌｙ８１およびＡｆＢＦＦａｓｅ－Ｌｅｕ１４１の各プラスミド作製は次の手順で行った。
（i）ＰＣＲ
　例１で作製したｐＨＦＴ２＿ＷＴ－ＡｆＢＦＦａｓｅを鋳型としてインバースＰＣＲを行った。表９および１０に８１番目のアミノ酸および１４１番目のアミノ酸をそれぞれ別のアミノ酸に置換させるためのプライマー塩基配列を示す。ＰＣＲ組成およびＰＣＲの条件は例１の表４と表５と同様とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
（ii）制限酵素処理
　大腸菌由来の鋳型ＤＮＡはメチル化されている一方で、ＰＣＲによって増幅したＤＮＡはメチル化されていないため、ＤｐｎＩ（制限酵素）により鋳型ＤＮＡを分解し取り除くことができる。そこで、増幅した各ＰＣＲ産物にＤｐｎＩを１μＬ加え、３７℃、１時間、静置の条件下で制限酵素処理した。その後、例１（１）ア（iii）の記載と同様にゲル抽出を行った。
（iii）リン酸化
　上記（ii）でゲル抽出したＤＮＡの５’末端をリン酸化した。リン酸化の組成および条件は表１１および１２にそれぞれ示した。リン酸化後、FastGene Gel/PCR Extraction Kit（日本ジェネティクス）を用いて２０μＬでＰＣＲ産物の溶出を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
（iv）ライゲーション
　ＰＣＲ産物の溶出液５μＬに、同量のLigation-Convenience Kit（日本ジェネティクス）５μＬを加え、１６℃、１５分で反応させた。
（v）大腸菌ＪＭ１０９の形質転換
　例１（１）ア（vi）の記載と同様に、上記（iv）で反応させたライゲーション溶液を用いて大腸菌ＪＭ１０９の形質転換を行い、プラスミドの目的の場所に変異が導入されていることをＤＮＡシーケンスサービスにより確認した（本明細書中、このプラスミドを「ｐＨＦＴ２＿ＡｆＢＦＦａｓｅ－Ｇ８１」ということがある）。
イ　タンパク質発現と精製
（i）大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換と培養
　例１（１）イ（i）の記載と同様に、ｐＨＦＴ２＿ＡｆＢＦＦａｓｅ－Ｇ８１を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換と培養を行った。
（ii）アフィニティークロマトグラフィーによる精製
　例１（１）イ（ii）の記載と同様に、アフィニティークロマトグラフィーによる精製を行った。
（iii）ゲル濾過クロマトグラフィーによる精製
　例１（１）イ（iii）の記載と同様に、ゲル濾過クロマトグラフィーによる精製を行った。
（iv）ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
　例１（１）イ（iv）の記載と同様に、ＳＤＳを行い、目的タンパク質が精製されていることを確認した。
ウ　ＦＯＳ産生量の評価
（i）酵素反応
　反応時間を０、１時間、２時間、４時間としたこと以外は、例１（１）ウ（i）の記載と同様に酵素反応を行った。
（ii）液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析
　例１（１）ウ（ii）の記載と同様に、ＨＰＬＣ分析によりＦＯＳ産生量を算出した。
（２）結果
　結果は、表１３、表１４、図２および図３に示す通りであった。
　ＡｆＢＦＦａｓｅ－Ｇｌｙ８１は、８１番目のグリシン（Ｇ）を、グリシン（Ｇ）およびシステイン（Ｃ）以外のアミノ酸１８種（アラニン（Ａ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、リシン（Ｋ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、バリン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、プロリン（Ｐ）およびトレオニン（Ｔ））に置換し、ＦＯＳ産生量を測定した。１８種類の変異体のうち、アラニン（Ａ）、プロリン（Ｐ）およびトレオニン（Ｔ）を除く１５種類の変異体は３糖ＦＯＳの産生比率の増加、あるいは、４糖以上のＦＯＳの産生比率の低下が確認された。中でも、フェニルアラニン（Ｆ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、リシン（Ｋ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、バリン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）またはチロシン（Ｙ）に置換した場合に、ＷＴ－ＡｆＢＦＦａｓｅに対して、３糖の産生比率が増加することが確認された。また、アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）に置換した場合には、４糖以上の産生比率が顕著に低下することが確認された。３糖ＦＯＳの産生比率は、トリプトファン（Ｗ）変異体が最も高く（５８．５％）、次いで、チロシン（Ｙ）変異体が高値を示した（５５．７％）。
　ＡｆＢＦＦａｓｅ－Ｌｅｕ１４１は、１４１番目のロイシン（Ｌ）を、ロイシン（Ｌ）およびシステイン（Ｃ）以外のアミノ酸１８種（アラニン（Ａ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、リシン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、および、プロリン（Ｐ））に置換し、ＦＯＳ産生量を測定した。１８種類の変異体うち、グルタミン酸（Ｅ）、ヒスチジン（Ｈ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）およびプロリン（Ｐ）を除く１３種類の変異体は、ＷＴ－ＡｆＢＦＦａｓｅに対して、３糖ＦＯＳの産生比率の増加、あるいは、４糖以上のＦＯＳの産生比率の低下が確認された。特に、アラニン（Ａ）、アスパラギン酸（Ｄ）、イソロイシン（Ｉ）、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、トレオニン（Ｔ）、またはトリプトファン（Ｗ）に置換した変異体では、３糖ＦＯＳの産生比率が４７％を超えることが確認された。３糖ＦＯＳの産生比率は、リシン（Ｋ）変異体が最も高く（５０．４％）、次いで、トリプトファン（Ｗ）変異体が高値を示した（４９．７％）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
例３：改良型β－フルクトフラノシダーゼの検討（２）
　例３では、ＷＴ－ＡｆＢＦＦａｓｅのアミノ酸配列（配列番号１）のＮ末端から８１番目のグリシン（Ｇｌｙ８１）と１４１番目のロイシン（Ｌｅｕ１４１）の双方を変異させた二重変異による改良型β－フルクトフラノシダーゼ（本明細書中「ＡｆＢＦＦａｓｅ－Ｇｌｙ８１－Ｌｅｕ１４１」ということがある）を用いてＦＯＳ産生量について検討した。
（１）方法
ア　改良型β－フルクトフラノシダーゼ（二重変異）のプラスミド作製
　ｐＨＦＴ２＿ＡｆＢＦＦａｓｅ－Ｇ８１ＹおよびｐＨＦＴ２＿ＡｆＢＦＦａｓｅ－Ｇ８１Ｗのプラスミドを鋳型とし、Ｌｅｕ１４１ＹおよびＬｅｕ１４１Ｗのプライマーを用いてインバースＰＣＲを行い、ｐＨＦＴ２＿ＡｆＢＦＦａｓｅ－Ｇ８１Ｙ－Ｌ１４１Ｙ、ｐＨＦＴ２＿ＡｆＢＦＦａｓｅ－Ｇ８１Ｙ－Ｌ１４１Ｗ、ｐＨＦＴ２＿ＡｆＢＦＦａｓｅ－Ｇ８１Ｗ－Ｌｅｕ１４１Ｙ、ｐＨＦＴ２＿ＡｆＢＦＦａｓｅ－Ｇ８１Ｗ－Ｌ１４１Ｗの４つのプラスミドを作製した。ＰＣＲの組成や条件、制限酵素処理、リン酸化、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換は、例２（１）アの記載と同様にして行った。
イ　タンパク質発現と精製
　大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換と培養、アフィニティークロマトグラフィーによる精製、ゲル濾過クロマトグラフィーによる精製は、例２（１）イの記載と同様にして行った。
ウ　ＦＯＳ産生量の評価
　酵素反応、ＨＰＬＣ分析は、例２（１）ウの記載と同様にして行った。
（２）結果
　結果は、表１５および図４に示す通りであった。
　ＡｆＢＦＦａｓｅ－Ｇｌｙ８１－Ｌｅｕ１４１は、８１番目のグリシン（Ｇ）と１４１番目のロイシン（Ｌ）をチロシン（Ｙ）またはトリプトファン（Ｗ）にそれぞれ置換した場合に、ＷＴ－ＡｆＢＦＦａｓｅに対して、２糖を消費する時間が長くかかったものの、３糖ＦＯＳの産生比率が高く、４糖以上のＦＯＳの産生比率が低いことが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015

Claims (13)

  1. 　β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列において、配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ末端から８１番目の位置に相当するアミノ酸および１４１番目の位置に相当するアミノ酸のいずれかまたは両方が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなる、改良型β－フルクトフラノシダーゼ。
  2. 　β－フルクトフラノシダーゼが、配列番号１に示す野生型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有し、かつ、β－フルクトフラノシダーゼ活性を有するアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の改良型β－フルクトフラノシダーゼ。
  3. 　下記ａ）およびｂ）のいずれかのアミノ酸配列からなる、請求項１または２に記載の改良型β－フルクトフラノシダーゼ：
    ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列において、アミノ末端から８１番目の位置に相当するアミノ酸（グリシン（Ｇ））および１４１番目の位置に相当するアミノ酸（ロイシン（Ｌ））のいずれかまたは両方が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列
    ｂ）上記ａ）のアミノ酸配列において、８１番目のグリシン（Ｇ）および１４１番目のロイシン（Ｌ）以外の１または複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、β－フルクトフラノシダーゼ活性を有するアミノ酸配列。
  4. 　アミノ末端から８１番目の位置に相当するアミノ酸が、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、リシン（Ｋ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、バリン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）およびチロシン（Ｙ）からなる群から選択されるアミノ酸に置換された、請求項１または２に記載の改良型β－フルクトフラノシダーゼ。
  5. 　アミノ末端から１４１番目の位置に相当するアミノ酸が、アラニン（Ａ）、アスパラギン酸（Ｄ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、イソロイシン（Ｉ）、リシン（Ｋ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）およびチロシン（Ｙ）からなる群から選択されるアミノ酸に置換された、請求項１または２に記載の改良型β－フルクトフラノシダーゼ。
  6. 　請求項１または２に記載の改良型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列の酵素活性部分を含み、かつ、β－フルクトフラノシダーゼ活性を有する、ポリペプチド。
  7. 　請求項１または２に記載の改良型β－フルクトフラノシダーゼをコードする、ポリヌクレオチド。
  8. 　請求項７に記載のポリヌクレオチドを含んでなる、発現ベクター。
  9. 　請求項７に記載のポリヌクレオチドを宿主に導入してなる、形質転換体。
  10. 　宿主が細菌、酵母、カビおよび糸状菌からなる群から選択される、請求項９に記載の形質転換体。
  11. 　請求項９に記載の形質転換体の培養物から改良型β－フルクトフラノシダーゼを得る工程を含む、改良型β－フルクトフラノシダーゼの製造方法。
  12. 　請求項１または２に記載の改良型β－フルクトフラノシダーゼと、スクロースとを接触させる工程を含む、フラクトオリゴ糖の製造方法。
  13. 　請求項１２に記載の製造方法を実施してフラクトオリゴ糖を製造する工程と、前記フラクトオリゴ糖を結晶化する工程とを含む、１－ケストース結晶の製造方法。
PCT/JP2022/037083 2021-10-04 2022-10-04 改良型β－フルクトフラノシダーゼ Ceased WO2023058637A1 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP22878505.1A EP4424831A4 (en) 2021-10-04 2022-10-04 IMPROVED BETA-FRUCTOFURANOSIDASE
CN202280067418.7A CN118076740A (zh) 2021-10-04 2022-10-04 改良型β-呋喃果糖苷酶
US18/692,604 US20240384317A1 (en) 2021-10-04 2022-10-04 IMPROVED ß-FRUCTOFURANOSIDASE
JP2023552891A JPWO2023058637A1 (ja) 2021-10-04 2022-10-04

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2021-163489 2021-10-04
JP2021163489 2021-10-04

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2023058637A1 true WO2023058637A1 (ja) 2023-04-13

Family

ID=85803485

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2022/037083 Ceased WO2023058637A1 (ja) 2021-10-04 2022-10-04 改良型β－フルクトフラノシダーゼ

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20240384317A1 (ja)
EP (1) EP4424831A4 (ja)
JP (1) JPWO2023058637A1 (ja)
CN (1) CN118076740A (ja)
WO (1) WO2023058637A1 (ja)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005085447A1 (ja) * 2004-03-04 2005-09-15 Meiji Seika Kaisha, Ltd. β-フルクトフラノシダーゼ変異体
JP2010273580A (ja) * 2009-05-27 2010-12-09 Meiji Seika Kaisha Ltd １−ケストースの結晶化母液の調製方法
WO2015099166A1 (ja) 2013-12-27 2015-07-02 物産フードサイエンス株式会社 改良型β－フルクトフラノシダーゼ
WO2016143873A1 (ja) 2015-03-11 2016-09-15 物産フードサイエンス株式会社 改良型β－フルクトフラノシダーゼ

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005085447A1 (ja) * 2004-03-04 2005-09-15 Meiji Seika Kaisha, Ltd. β-フルクトフラノシダーゼ変異体
JP2010273580A (ja) * 2009-05-27 2010-12-09 Meiji Seika Kaisha Ltd １−ケストースの結晶化母液の調製方法
WO2015099166A1 (ja) 2013-12-27 2015-07-02 物産フードサイエンス株式会社 改良型β－フルクトフラノシダーゼ
WO2016143873A1 (ja) 2015-03-11 2016-09-15 物産フードサイエンス株式会社 改良型β－フルクトフラノシダーゼ

Non-Patent Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALTSCHU ET AL., J. MOL. BIOL., vol. 215, 1990, pages 403 - 410
DATABASE UniprotKB 12 August 2020 (2020-08-12), "Full=Glycosyl hydrolase family 32 C-terminal domain-containing protein {ECO:0000256|Google:ProtNLM}; GN ORFNames=ATNIH1004_007897 {ECO:0000313|EMBL:KAA8646464.1}", XP093055711, retrieved from Uniprot Database accession no. A0A5M9MM14 *
DATABASE UniprotKB 31 July 2019 (2019-07-31), ANONYMOUS : "Full=Glycosyl hydrolase family 32 N-terminal domain-containing protein {ECO:0000256|Google:ProtNLM}; GN ORFNames=EYZ11_000312 {ECO:0000313|EMBL:THD00262.1}", XP093055710, retrieved from Uniprot Database accession no. A0A4S3JXJ4 *
FUJII TADASHI, TOCHIO TAKUMI, HIRANO KATSUAKI, TAMURA KEISUKE, TONOZUKA TAKASHI: "Rapid evaluation of 1-kestose producing β-fructofuranosidases from Aspergillus species and enhancement of 1-kestose production using a PgsA surface-display system", BIOSCIENCE, BIOTECHNOLOGY, AND BIOCHEMISTRY, JAPAN SOCIETY FOR BIOSCIENCE, BIOTECHNOLOGY, AND AGROCHEMISTRY, JP, vol. 82, no. 9, 2 September 2018 (2018-09-02), JP , pages 1599 - 1605, XP093055707, ISSN: 0916-8451, DOI: 10.1080/09168451.2018.1480347 *
GIBSON GR ET AL., J NUTR., vol. 125, no. 6, 1995, pages 1401 - 1412
GILBRETH RN ET AL., PROC NATL ACAD SCI USA., vol. 108, no. 19, 2011, pages 7751 - 6
HIDAKA H ET AL., AGRIC BIOL CHEM, vol. 52, no. 5, 1988, pages 1181 - 1187
KOIDE A ET AL., PROC NATL ACAD SCI USA., vol. 104, no. 16, 2007, pages 6632 - 7
PEASRON ET AL., METHODS IN ENZYMOLOGY, vol. 183, 1990, pages 63 - 69
See also references of EP4424831A4
SMITH-WATERMAN, METH. ENZYM., vol. 164, 1988, pages 765
TOCHIO T ET AL., FOODS, vol. 7, no. 9, 2018, pages 140
WILBUR, NATL. ACAD. SCI. U.S.A., vol. 80, 1983, pages 726 - 730
YANAI K ET AL., BIOSCI BIOTECHNOL BIOCHEM., vol. 65, no. 4, 2001, pages 766 - 773

Also Published As

Publication number Publication date
US20240384317A1 (en) 2024-11-21
EP4424831A1 (en) 2024-09-04
CN118076740A (zh) 2024-05-24
EP4424831A4 (en) 2025-11-19
JPWO2023058637A1 (ja) 2023-04-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103201380B (zh) 新岩藻糖基转移酶及它们的应用
US7264955B2 (en) α1-6 fucosyltransferase
JP2023506154A (ja) アルロースエピマー化酵素変異体、その製造方法及びそれを利用したアルロースの製造方法
JP6657177B2 (ja) 改良型β−フルクトフラノシダーゼ
CN106604991A (zh) 修饰型β‑半乳糖苷酶
JP7535192B2 (ja) 熱安定性に優れたアルロースエピマー化酵素変異体、その製造方法およびこれを用いたアルロースの製造方法
JP6068671B2 (ja) 改良型β−フルクトフラノシダーゼ
US7655449B2 (en) β-fructofuranosidase variants
JP6023392B2 (ja) 改良型β−フルクトフラノシダーゼ
JP5660271B2 (ja) グルコースデヒドロゲナーゼおよびその製造方法
WO2023058637A1 (ja) 改良型β－フルクトフラノシダーゼ
JPWO2020179714A1 (ja) ３’，３’−ｃＧＡＭＰの実践的酵素合成法
CN118240791A (zh) 糖基转移酶突变体及其在Reb D合成中的应用
KR20200072098A (ko) 과당으로부터 타가토스로의 전환 활성이 향상된 헥수론산 c4-에피머화 효소 변이체
CN115044568B (zh) 高稳定型的蔗糖磷酸化酶突变体及其应用
JP3487711B2 (ja) 環状イソマルトオリゴ糖合成酵素、該酵素の遺伝子、組み換え体ｄｎａ及び該酵素の製造法
JP3508871B2 (ja) クレアチニンデイミナーゼ活性を有する蛋白質の遺伝情報を有するｄｎａ並びにクレアチニンデイミナーゼの製造法
CN102695793A (zh) 具有改进的产品特异性的蔗糖变位酶
KR20180135425A (ko) 글루코실글리세롤 생산 활성을 가지는 신규한 폴리펩티드 및 이를 이용한 글루코실글리세롤 제조방법
KR20050051055A (ko) 더머스 칼도필러스 ｇｋ24 균주 유래의 알파-글루칸포스포릴라제, 재조합 균주를 이용한 상기 효소의제조방법 및 상기 효소를 이용한알파--디-포도당-1-인산염의 합성방법
WO2024154813A1 (ja) フラクトシル化マルチトールおよびその製造方法
CN105112388A (zh) 对胰蛋白酶抗性提高的β-1,4-内切木聚糖酶及其制备方法与用途
CN117683750A (zh) 重组α-葡萄糖苷酶及其制备方法
CA2542576A1 (en) Transgenic organisms with lower growth temperature
JP2004024189A (ja) 耐熱性ケラタナーゼをコードするｄｎａ

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 22878505

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 18692604

Country of ref document: US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2023552891

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 202280067418.7

Country of ref document: CN

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2022878505

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2022878505

Country of ref document: EP

Effective date: 20240506