WO2023080137A1 - 標的物質の検出方法 - Google Patents

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    • C12Q2561/109—Invader technology

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting target substances. More particularly, the present invention relates to a target substance detection method, a complex, and a target substance detection kit.
  • This application claims priority to Japanese Patent Application No. 2021-180020 filed in Japan on November 4, 2021, the content of which is incorporated herein.
  • the sample solution is divided into an extremely large number of minute solutions. Then, the signal from each minute solution is binarized, only whether or not the target substance exists is determined, and the number of molecules of the target substance is counted. Digital measurement can dramatically improve detection sensitivity and quantification compared to conventional ELISA, real-time PCR, and the like.
  • Non-Patent Document 1 describes a microwell array having channels for supplying microwells and reagents, and describes that digital ELISA was performed using the microwell array.
  • Patent Document 1 Non-Patent Documents 2 and 3 report Proximity Ligation Assay (PLA) and Proximity Extension Assay (PEA), which are methods for detecting proteins using antibodies modified with oligonucleotides. . These methods utilize the PCR method for detection.
  • PHA Proximity Ligation Assay
  • PEA Proximity Extension Assay
  • Kan C. W., et al. Isolation and detection of single molecules on paramagnetic beads using sequential fluid flows in microfabricated array polymer assemblies., Lab on a Chip, 12 (5), 977-985, 2012.
  • Mohammed H., et al. Approaches for Assessing and Discovering Protein Interactions in Cancer., Mol Cancer Res, 11 (11), 1295-1302, 2013.
  • Assarsson E., et al. Homogenous 96-Plex PEA Immunoassay Exhibiting High Sensitivity, Specificity, and Excellent Scalability., PLoS One, 9 (4), e95192, 2014.
  • Non-Patent Document 1 PSA to be detected is bound to magnetic beads, then the beads are washed, then the beads are reacted with a biotin-labeled antibody, and then the beads are washed. followed by reacting the beads with a solution containing streptavidin- ⁇ -galactosidase, washing the beads, then suspending the beads in a buffer containing the substrate, and then introducing the beads into the well array. It is described that it was detected by Thus, complicated pretreatment may be required to detect target substances by digital ELISA. SUMMARY OF THE INVENTION Accordingly, an object of the present invention is to provide a technique for detecting a target substance without performing a washing step.
  • the present invention includes the following aspects.
  • a method for detecting a target substance in a sample wherein the sample, a first specific binding substance for the target substance labeled with a first single-stranded nucleic acid fragment, and a second A second specific binding substance for the target substance labeled with a single-stranded nucleic acid fragment of is introduced, so that when the target substance is present in the sample, the target substance A complex containing the specific binding substance and the second specific binding substance is formed, and at least a portion of the first single-stranded nucleic acid fragment and at least a portion of the second single-stranded nucleic acid fragment hybridize.
  • Methodhod. The method according to [1], wherein the volume of the well is 10 fL to 100 pL.
  • the first specific binding substance recognizes the first binding site of the target substance
  • the second specific binding substance recognizes the second binding site of the target substance
  • the distance between the first binding site and the second binding site is such that at least a portion of the first single-stranded nucleic acid fragment and at least a portion of the second single-stranded nucleic acid fragment
  • the method of [3] which is a distance that allows hybridization.
  • [5] The method according to any one of [1] to [4], wherein each of the first single-stranded nucleic acid fragment and the second single-stranded nucleic acid fragment has a base length of 10 to 200 bases.
  • [6] further comprising the step of sealing the opening of the well after introducing the sample, the first specific binding substance, and the second specific binding substance into the well, [1 ] to [5].
  • the first specific binding substance that does not bind to the target substance and/or the second specific binding that does not bind to the target substance in the well whose opening is sealed The method of [6], comprising the substance. [8] of [1] to [7], wherein the target substance is one selected from the group consisting of proteins, sugar chains, nucleic acids, lipid membrane structures, bacteria, viruses and cells, or a composite substance thereof; Any method described. [9] Each of the first specific binding substance and the second specific binding substance is one selected from the group consisting of antibodies, lectins and substances that bind to lipid membranes, [1 ] to [8].
  • a target substance, a first specific binding substance for the target substance labeled with a first single-stranded nucleic acid fragment, and a second single-stranded nucleic acid fragment for the target substance labeled comprising a second specific binding substance, wherein at least a portion of the first single-stranded nucleic acid fragment and at least a portion of the second single-stranded nucleic acid fragment hybridized to form a double-stranded nucleic acid; Complex.
  • a target substance detection kit comprising a well array having a plurality of wells, a first specific binding substance for the target substance labeled with a first single-stranded nucleic acid fragment, and a second comprising a second specific binding substance for said target substance labeled with a single-stranded nucleic acid fragment of [13]
  • the kit according to [12] further comprising a sealing liquid that seals the opening of the well.
  • FIG. 1 is a schematic diagram illustrating a method for detecting a target substance.
  • FIG. 2 is a schematic cross-sectional view showing an example of a fluidic device.
  • FIG. 3 is a schematic cross-sectional view showing an example of a fluidic device.
  • FIG. 4 is a schematic cross-sectional view showing an example of a fluidic device.
  • FIG. 5 is a schematic cross-sectional view showing an example of a fluidic device.
  • FIG. 6 is a schematic cross-sectional view showing an example of a fluidic device.
  • FIG. 7 is a schematic cross-sectional view showing an example of a fluidic device.
  • FIG. 8 is a schematic diagram illustrating an example of the Invasive Cleavage Assay (ICA) method.
  • ICA Invasive Cleavage Assay
  • FIG. 9 is a graph showing the results of Experimental Example 1.
  • FIG. 10 is a graph showing the results of Experimental Example 1.
  • FIG. 11 is a graph showing the results of Experimental Example 1.
  • FIG. 12 is a microscope image showing the results of Experimental Example 2.
  • FIG. 13 is a graph showing the results of Experimental Example 2.
  • FIG. 14 is a graph showing the average value ⁇ standard deviation of the brightness of the wells when each concentration of the target substance was detected in Experimental Example 2.
  • FIG. FIG. 15 is a graph showing the number of wells exhibiting luminance equal to or higher than the set value when target substances of various concentrations were detected in Experimental Example 2.
  • FIG. 16 is a graph showing the results of immuno-ICA reaction using oligonucleotide-modified antibodies bound to DNA1 and DNA2 in Experimental Example 3.
  • FIG. 17 is a graph showing the results of immuno-ICA reaction using oligonucleotide-modified antibodies bound to DNA2 and DNA3 in Experimental Example 3.
  • FIG. 18 is a graph showing the results of immunoICA reaction using oligonucleotide-modified antibodies to which DNA2 and DNA4 were bound in Experimental Example 3.
  • FIG. 19 is a graph showing the results of immuno-ICA reaction using oligonucleotide-modified antibodies bound to DNA2 and DNA5 in Experimental Example 3.
  • FIG. 20 is a graph showing the results of immuno-ICA reaction using oligonucleotide-modified antibodies to which DNA2 and DNA5 were bound in Experimental Example 4.
  • the present invention provides a method for detecting a target substance in a sample, wherein the well contains the sample, a first single-stranded nucleic acid fragment labeled with a first specific binding to the target substance.
  • a method is provided for indicating the presence of a target substance.
  • FIG. 1 is a schematic diagram explaining the method of this embodiment.
  • a sample a first specific binding substance 120 labeled with a first single-stranded nucleic acid fragment 121, and a second single-stranded nucleic acid
  • a second specific binding substance 130, labeled with fragment 131 is introduced into the wells.
  • target substance 110 is present in the sample, complex 100 including target substance 110, first specific binding substance 120 and second specific binding substance 130 is formed.
  • double-stranded nucleic acid 140 is detected. If the formation of double-stranded nucleic acid 140 is detected, then target material 110 is said to be present.
  • the method of this embodiment may be applied to samples that do not contain the target substance 110, in which case the formation of the double-stranded nucleic acid 140, ie the presence of the target substance 110, is not detected. Detection of formation of double-stranded nucleic acid 140 will be described later.
  • first specific binding substance 120 recognizes first binding site 111 of target substance 110 .
  • Second specific binding substance 130 also recognizes second binding site 112 of target substance 110 .
  • first binding site 111 and second binding site 112 may be different binding sites.
  • the target substance is a protein
  • samples include biological samples and environmental samples.
  • Biological samples are not particularly limited, and include serum, plasma, urine, cell culture medium, and the like.
  • environmental samples include river water and industrial wastewater.
  • the target substance 110 may be one selected from the group consisting of proteins, sugar chains, nucleic acids, lipid membrane structures, bacteria, viruses and cells, or a composite substance thereof.
  • the protein may be a glycoprotein or a membrane protein.
  • a protein may be a complex substance. Complex substances include, for example, glycoproteins in which sugar chains and proteins are bound, fusion proteins in which multiple proteins are fused, and the like.
  • Lipid membrane structures include vesicles composed of artificial or natural lipids, such as liposomes, exosomes and intracellular organelles. In detecting lipid membrane structures, bacteria, viruses and cells, proteins, sugar chains, nucleic acids, etc. present in these target molecules may be detected.
  • the distance between the first binding site 111 and the second binding site 112 is at least part of the first single-stranded nucleic acid fragment 121 and at least one of the second single-stranded nucleic acid fragment 131.
  • the distance is such that the moieties can hybridize.
  • the hybridizable distance is preferably a distance close to a position where the first single-stranded nucleic acid fragment 121 and the second single-stranded nucleic acid fragment 131 can hybridize.
  • the distance between the first binding site 111 and the second binding site 112 is preferably 3-10 nm, more preferably 3.5-9 nm. is more preferable.
  • the angle between the first binding site 111 and the second binding site 112 with respect to the center of the target substance 110 is 30 to 120°.
  • the distance between the first binding site 111 and the second binding site 112 is between 4.14 and 8.66 nm.
  • the distance between the first binding site 111 and the second binding site 112 is defined as the shortest distance between the first binding site 111 and the second binding site 112 along the surface of the target substance 110. .
  • the base length of the first single-stranded nucleic acid fragment 121 may be 10 to 200 bases.
  • the base length of the second single-stranded nucleic acid fragment 131 may also be 10 to 200 bases.
  • the length of the double-stranded nucleic acid 140 formed by hybridizing at least part of the first single-stranded nucleic acid fragment 121 and at least part of the second single-stranded nucleic acid fragment 131 is 7 to 30. It may be about a base, or it may be 7 to 20 bases.
  • the hybridizing regions of the first single-stranded nucleic acid fragment 121 and the second single-stranded nucleic acid fragment 131 may include the ends of each single-stranded nucleic acid fragment.
  • the hybridizing region of the first single-stranded nucleic acid fragment 121 and the second single-stranded nucleic acid fragment 131 may not include the end of the single-stranded nucleic acid fragment. It may be located at ⁇ 13 bases. From the viewpoint of increasing detection sensitivity, the hybridizing regions of the first single-stranded nucleic acid fragment 121 and the second single-stranded nucleic acid fragment 131 preferably include the ends of the respective single-stranded nucleic acid fragments.
  • the method of this embodiment is suitable for detection of target substances by digital measurement.
  • the wells form a well array in which a plurality of wells are arranged.
  • the well array is preferably arranged within the channel of the fluidic device.
  • FIG. 2 is a schematic cross-sectional view showing an example of a fluidic device.
  • the fluidic device 200 includes a substrate 210 and a lid member 220 arranged to face the substrate 210 .
  • the lid member 220 has a convex portion 221 and the tip of the convex portion 221 is in contact with the substrate 210 .
  • well array 240 is formed integrally with substrate 210 on one surface of substrate 210 .
  • the surface of substrate 210 on which well array 240 is molded faces lid member 220 .
  • Well array 240 has a plurality of wells 241 .
  • the lid member 220 may be welded or adhered to the substrate 210 .
  • the well 241 is open on the surface of the substrate 210.
  • the shape, size, and arrangement of the wells 241 are not particularly limited, but one target substance is preferably introduced into one well 241 .
  • the well 241 is preferably a microwell with a small volume.
  • the volume of one well 241 may be on the order of 10 fL to 100 pL.
  • a plurality of wells 241 of the same shape and size form a well array 240 .
  • the same shape and same size means that they have the same shape and the same capacity to the extent required for performing digital measurement, and variations to the extent of manufacturing error are allowed.
  • the diameter of the well 241 may be, for example, approximately 1 to 10 ⁇ m.
  • the well 241 may have a depth of about 1 to 10 ⁇ m, for example.
  • the arrangement of the wells 241 is not particularly limited, and may be, for example, arranged in a triangular lattice, may be arranged in a square lattice, or may be arranged at random.
  • a space is formed between the well array 240 and the lid member 220 due to the presence of the protrusions 221 .
  • the space constitutes the channel 230 .
  • the channel 230 functions as a path for feeding a liquid in which a target substance, a first specific binding substance, a second specific binding substance, etc. are dispersed, and a sealing liquid, which will be described later.
  • the shape, structure, capacity, and the like of the channel 230 are not particularly limited, but the height of the channel 230 (that is, the surface of the substrate 210 facing the cover member 220 and not formed with the well array, The distance between the surface of the lid member 220 facing the substrate 210) may be, for example, 500 ⁇ m or less, may be, for example, 300 ⁇ m or less, may be, for example, 200 ⁇ m or less, or may be, for example, 100 ⁇ m. It may be below.
  • the convex portion 221 may be formed integrally with the lid member 220 .
  • the lid member 220 can be molded into a plate-like shape having the protrusions 221 by molding a thermoplastic resin fluid using a molding die, for example.
  • the lid member 220 may be formed with a reagent introduction port 222 and a reagent discharge port 223 .
  • the lid member 220 When the lid member 220 has the protrusions 221, the lid member 220 and the substrate 210 are overlapped so that the protrusions 221 are in contact with the surface of the substrate 210 on which the wells 241 are opened. As a result, the space between the lid member 220 and the substrate 210 becomes the channel 230 .
  • the lid member 220 and the substrate 210 may be welded by laser welding or the like.
  • FIG. 5 is a schematic cross-sectional view showing an example of a fluidic device.
  • fluidic device 500 includes substrate 210 and wall member 510 .
  • well array 240 is formed integrally with substrate 210 on one surface of substrate 210 .
  • Well array 240 has a plurality of wells 241 .
  • the fluidic device 500 mainly differs from the above-described fluidic device 200 in that it does not have a lid member 220 . Therefore, the fluidic device 500 does not have flow channels.
  • the lid member 220 and the convex portion 221 are integrally molded.
  • the lid member 220 and the projection 221 may be formed separately.
  • the well array 240 is formed integrally with the substrate 210 on one surface of the substrate 210 .
  • the well array does not have to be integrally molded with substrate 210 .
  • a well array 240 molded separately from the fluidic device may be placed on the substrate 210 of the fluidic device.
  • a resin layer may be laminated on the surface of the substrate 210 and a well array may be formed in the resin layer by etching or the like.
  • the substrate 210 is formed using resin, for example.
  • resin for example.
  • the type of resin is not particularly limited, it is preferably a resin that is resistant to reagents and sealing liquids.
  • the signal to be detected is fluorescence, it is preferable to use a resin with little autofluorescence.
  • resins include, but are not limited to, cycloolefin polymers, cycloolefin copolymers, silicon, polypropylene, polycarbonate, polystyrene, polyethylene, polyvinyl acetate, fluororesins and amorphous fluororesins.
  • a plurality of wells 241 may be formed on one surface of the substrate 210 in the plate thickness direction.
  • Methods of forming wells using resin include injection molding, thermal imprinting, optical imprinting, and the like.
  • a well array may be formed by laminating a fluororesin on the substrate 210 and processing the fluororesin by etching or the like.
  • a fluorine resin for example, CYTOP (registered trademark) (Asahi Glass) or the like can be used.
  • the material of the lid member 220 is preferably a resin with low autofluorescence, and may be, for example, a thermoplastic resin such as cycloolefin polymer or cycloolefin copolymer.
  • the lid member 220 may be made of a material that does not transmit light having a wavelength in the vicinity of the wavelength detected during fluorescence observation of the signal, or may be made of a material that completely does not transmit light.
  • the lid member 220 may be made of thermoplastic resin to which carbon, metal particles, or the like is added.
  • the method of the present embodiment is a method for detecting a target substance in a sample, and a well 241 contains a first specific binding substance 120 for a target substance 110 labeled with a sample and a first single-stranded nucleic acid fragment 121.
  • a target substance can be detected without performing a washing step.
  • the reagent liquid L210 is introduced from the introduction port 222 of the fluidic device 200 and sent to the channel 230.
  • Reagent liquid L210 is a liquid in which a sample, first specific binding substance 120 and second specific binding substance 130 are dispersed, and also contains a reagent for detecting formation of double-stranded nucleic acid 140.
  • FIG. The reagent solution L210 is a reagent for detecting the formation of the first specific binding substance 120, the second specific binding substance 130, the target substance 110, and the double-stranded nucleic acid 140 when the target substance 110 is contained in the sample. including.
  • the reagent liquid L210 sent to the channel 230 contacts the well array 240.
  • a reagent solution L210 is accommodated inside the well 241 . This results in wells 241 containing first specific binding substance 120, second specific binding substance 130 and, if present, target substance 110, and reagents for detecting the formation of double-stranded nucleic acid 140. is introduced.
  • the reagent solution L210 can be prepared by the first method below.
  • the sample, the first specific binding substance 120 and the second specific binding substance 130 are mixed, and the target substance 110 that may be contained in the sample and the first specific binding substance 120 and the second specific binding substance 130 are combined.
  • Antigen-antibody reaction is performed.
  • the antigen-antibody reaction is carried out, for example, at 25-37° C. for 30-180 minutes.
  • a reagent for detecting the formation of double-stranded nucleic acid 140 is added, and ICA reaction is performed.
  • the ICA reaction is carried out, for example, at 60-70° C. for 10-60 minutes.
  • the mixed liquid after completion of the ICA reaction can be used as the reagent liquid L210.
  • the reagent solution L210 can be prepared by the second method below.
  • a sample, first specific binding substance 120 and second specific binding substance 130 are mixed to prepare an antigen-antibody reaction solution.
  • a reagent for detecting the formation of the double-stranded nucleic acid 140 is added to the antigen-antibody reaction solution to prepare a mixed solution. This mixture is maintained at, for example, 25-37° C. for 30-180 minutes and then at 60-70° C. for 10-60 minutes to complete the ICA reaction.
  • the mixed liquid after completion of the ICA reaction can be used as the reagent liquid L210.
  • the number of target substances 110 introduced into one well 241 is not particularly limited, preferably one or less, that is, zero or one target substance 110 is introduced into one well 241 .
  • detection of the target substance 110 can be performed in units of one, that is, digital measurement is possible. Also, it is not necessary to introduce the target substance 110 into all wells of the well array.
  • the means for introducing the target substance 110 into the well is not particularly limited, and an appropriate means can be selected according to the selected target substance 110.
  • an appropriate means can be selected according to the selected target substance 110.
  • the target substance 110 is sedimented within the fluidic device (which may be within the channel) by its own weight and distributed to the wells.
  • a substance that captures the target substance 110 also referred to as a captured substance
  • the liquid may be fed.
  • the step of binding the captured substance to the target substance 110 can be performed at any point in the method of the present embodiment. For example, this step may be performed by contacting the target substance 110 with the capture in the sample tube prior to the step of introducing the target substance 110 into the wells 241 .
  • the target substance 110 may be introduced into the well after the capture substance is introduced into the well 241, and the capture substance and the target substance 110 may be brought into contact within the well.
  • a captured substance is a substance that can capture the target substance 110 .
  • the capture may be, for example, a conjugate between a solid phase and a specific binding substance for target substance 110 .
  • Solid phases include particles, films and substrates.
  • the number of specific binding substances for the target substance 110 may be one, or two or more. For example, there may be three types, four types, or five or more types.
  • the particles are not particularly limited, and include polymer particles, magnetic particles, glass particles, and the like. Particles are preferably surface-treated particles to avoid non-specific adsorption. Particles having a functional group such as a carboxyl group on the surface are preferred for immobilizing a specific binding substance. More specifically, JSR's product name "Magnosphere LC300" or the like can be used.
  • cells to which the virus can adhere may be used as traps.
  • Specific binding substances in the first specific binding substance 120, the second specific binding substance 130, and the captured substance include antibodies, antibody fragments, aptamers, and the like.
  • antibody fragments include Fab, F(ab') 2 , Fab', single-chain antibodies (scFv), disulfide-stabilized antibodies (dsFv), dimerized V region fragments (diabody), peptides containing CDRs, and the like. be done.
  • Antibodies may be monoclonal antibodies or polyclonal antibodies. Alternatively, it may be a commercially available antibody.
  • the specific binding substance when the target substance 110 contains a sugar chain, the specific binding substance may be a lectin. Moreover, when the target substance 110 includes a lipid membrane, the specific binding substance may be a substance that has binding properties to the lipid membrane. Substances that bind to lipid membranes include, for example, hydrocarbons such as hexanediol and membrane proteins such as transmembrane proteins. Membrane proteins include, for example, ⁇ -hemolysin.
  • Examples of methods for labeling specific binding substances with single-stranded nucleic acid fragments include methods using cross-linking agents.
  • a single-stranded nucleic acid fragment may be labeled with a specific binding substance via a linker molecule.
  • the linker is not particularly limited, and examples thereof include polyethylene chains, hydrocarbon chains, peptides, and the like.
  • a single-stranded nucleic acid fragment may be DNA or RNA. It may also contain artificial nucleic acids such as BNA and LNA.
  • the method for immobilizing the specific binding substance on the particle surface is not particularly limited, and includes a method using physical adsorption, a method using chemical binding, a method using avidin-biotin binding, and binding of protein G or protein A to an antibody. and the like.
  • Physical adsorption methods include methods in which a specific binding substance is immobilized on the particle surface through hydrophobic interaction or electrostatic interaction.
  • Methods using chemical bonding include a method using a cross-linking agent. For example, when the surface of a particle has a hydroxyl group, the carboxyl group of the specific binding substance is reacted with a cross-linking agent to form an active ester, and then the hydroxyl group is reacted with the ester group to convert the specific binding substance into the particle. It can be immobilized on a surface. In addition, it is preferable to provide a spacer between the specific binding substance and the particle surface so as not to inhibit the ability of the specific binding substance to recognize the target molecule.
  • the target substance 110 when the target substance 110 is introduced into the well 241 using the capture substance, the combined body of the capture substance and the target substance 110 is obtained under the condition that 0 or 1 target substance 110 is captured by one capture substance. is preferably formed. Furthermore, one well 241 is preferably configured to introduce 0 or 1 trapped substance. This enables digital measurement.
  • a complex 100 containing them is formed, and at least part of the first single-stranded nucleic acid fragment 121 and At least a portion of second single-stranded nucleic acid fragment 131 hybridizes to form double-stranded nucleic acid 140 .
  • the formation of complexes 100 may occur in the sample tube before the sample, first specific binding substance 120 and second specific binding substance 130 are introduced into the wells, or may occur in wells 241. may be broken.
  • the target substance may consist of two molecules and may be detected using a nucleic acid-labeled specific binding substance specific to each molecule. In this case, it can be determined whether the two molecules are in a bound state. Further, when the two molecules form a homodimer, the nucleic acid-labeled first specific binding substance and the nucleic acid-labeled second specific binding substance have the same epitope may be recognized.
  • a step of sealing the opening of the well 241 may be performed.
  • the method of sealing the opening of the well 241 is not particularly limited as long as the liquid contained in one well 241 and the liquid contained in another well 241 do not mix with each other.
  • the well 241 may be sealed by covering the opening of the well 241 with a sealing liquid.
  • the opening of the well 241 may be sealed by laminating a plate-like member such as a glass plate.
  • the sealing liquid L220 is sent from the introduction port 222 of the lid member 220 to the channel 230 between the substrate 210 and the lid member 220.
  • the sealing liquid L220 sent to the channel 230 contacts the well array 240.
  • the sealing liquid L220 pushes away and replaces the reagent liquid L210 not contained in the well 241 among the reagent liquid L210 sent to the channel 230 .
  • the sealing liquid L220 individually seals the plurality of wells 241 containing the reagent liquid L210 containing the target substance 110, and the wells 241 become independent reaction spaces (micropartitions 242).
  • FIG. 4 shows that all of the wells 241 of the well array 240 are sealed with a sealing liquid L220 to form sealed wells (ie, microcompartments) 242.
  • FIG. 4 shows that all of the wells 241 of the well array 240 are sealed with a sealing liquid L220 to form sealed wells (ie, microcompartments) 242.
  • Lipids forming a lipid bilayer membrane include, for example, 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DOPG) and Examples thereof include, but are not limited to, mixtures thereof.
  • DOPE 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
  • DOPG 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol
  • Wells 242 sealed by any of the sealing methods described above contain first specific binding substance 120 not bound to target substance 110 and/or second specific binding substance 120 not bound to target substance 110 . It may also contain a binding substance 130 .
  • the sealing liquid is a liquid capable of forming droplets (also called minute droplets) by individually sealing the liquids introduced into the plurality of wells 241 so that they do not mix with each other.
  • the sealing liquid is preferably an oily solution, more preferably an oil.
  • oil fluorine-based oil, silicone-based oil, hydrocarbon-based oil, or a mixture thereof can be used. More specifically, the product name "FC-40" manufactured by Sigma can be used.
  • FC-40 (CAS number: 86508-42-1) is a fluorinated aliphatic compound with a specific gravity of 1.85 g/mL at 25°C.
  • Detection process Subsequently, the formation of double-stranded nucleic acid 140 is detected. Detection of the formation of double-stranded nucleic acid 140 is preferably performed using a signal amplification reaction.
  • Signal amplification reactions include, for example, Invasive Cleavage Assay (ICA).
  • the ICA reaction is related to the principle that signal amplification proceeds through a cycle of two reactions: (1) complementary binding between nucleic acids and (2) recognition and cleavage of the triplex structure by an enzyme.
  • the ICA reaction is less affected by reaction cycle inhibition by contaminants. Therefore, by using the ICA reaction, the target substance 110 can be detected with high accuracy.
  • the reagent liquid L210 (the liquid containing the target substance 110, the first specific binding substance 120 and the second specific binding substance 130) contains reaction reagents necessary for the ICA reaction. .
  • Reaction reagents necessary for the ICA reaction include ICA reaction reagents such as flap probes, flap endonuclease (FEN), and fluorescent substrates.
  • a flap probe is a nucleic acid fragment designed to hybridize to the first single-stranded nucleic acid fragment 121 or the second single-stranded nucleic acid fragment 131 to form a double-stranded nucleic acid 140 and a flap structure.
  • FIG. 8 is a schematic diagram explaining an example of the ICA method.
  • a double-stranded nucleic acid 140 formed by hybridizing at least a portion of the first single-stranded nucleic acid fragment 121 and at least a portion of the second single-stranded nucleic acid fragment 131 by the ICA method. to detect
  • the flap probe is hybridized to the first single-stranded nucleic acid fragment 121 or the second single-stranded nucleic acid fragment 131.
  • flap probe 810 hybridizes to first single-stranded nucleic acid fragment 121 .
  • a first flap portion 811 is formed.
  • the first flap site 811 is reacted with FEN, the first flap site 811 is cleaved and a nucleic acid fragment 811 is generated. Nucleic acid fragment 811 then hybridizes to a fluorescent substrate (nucleic acid fragment 820 ) to form second flap region 821 .
  • a fluorescent substance F is bound to the 5' end of the nucleic acid fragment 820, and a quenching substance Q is bound several bases 3' from the 5' end of the nucleic acid fragment 820.
  • the second flap site 821 is reacted with FEN, the second flap site 821 is cleaved and a nucleic acid fragment 821 is produced.
  • the fluorophore F is separated from the quencher Q, generating a fluorescence signal. Formation of the double-stranded nucleic acid 140 can be detected by detecting this fluorescence signal.
  • the reagent liquid L210 a common liquid used in biochemical analysis performed using a fluidic device can be used, preferably an aqueous solution. Further, the reagent liquid L210 may contain a surfactant or the like to make it easier to enclose the liquid in the well.
  • the isothermal enzymatic reaction causes the fluorescent substance F to be liberated from the quenching substance Q and respond to the excitation light. to emit a predetermined fluorescence signal.
  • a known appropriate method can be selected according to the type of signal to be detected. For example, when observing a fluorescence signal, excitation light corresponding to a fluorescent substance is applied to the minute compartment 242, and fluorescence emitted by the fluorescent substance is observed. For example, as shown in FIG. 4, a given reaction is performed within microcompartment 242 and the signal generated is observed. Microcompartment 242R is the well in which signal was detected and microcompartment 242 is the well in which no signal was detected.
  • a reagent liquid L210 is introduced into the fluidic device 500 as shown in FIG.
  • Reagent solution L210 is a liquid in which target substance 110, first specific binding substance 120, and second specific binding substance 130 are dispersed, and also contains a reagent for detecting formation of double-stranded nucleic acid 140.
  • concentration of the target substance 110 in the reagent solution L210 is adjusted so that one molecule or less of the target substance enters the wells 241 per well.
  • a sealing liquid L220 is introduced into the fluidic device 500.
  • the specific gravity of the sealing liquid L220 is greater than that of the reagent liquid L210. Therefore, the sealing liquid L220 sinks below the reagent liquid L210 that is not contained in the wells 241 among the reagent liquids L210 and contacts the well array 240 . Then, the sealing liquid L220 individually seals the plurality of wells 241 containing the reagent liquid L210 containing the target substance to form independent reaction spaces (that is, minute compartments 242).
  • Microcompartment 242R is the well in which signal was detected and microcompartment 242 is the well in which no signal was detected.
  • the present invention provides a target substance 110, a first specific binding substance 120 to the target substance 110 labeled with the first single-stranded nucleic acid fragment 121, and a second single-stranded nucleic acid fragment. a second specific binding substance 130 to the target substance 110 labeled with 131, wherein at least a portion of the first single-stranded nucleic acid fragment 121 and at least a portion of the second single-stranded nucleic acid fragment 131 are hybridized; Composite 100 is provided that has been lysed to form double-stranded nucleic acid 140 .
  • a flap probe may further hybridize to the first single-stranded nucleic acid fragment 121 or the second single-stranded nucleic acid fragment 131.
  • the target substance can be detected without performing a washing step.
  • the present invention provides a kit for detecting a target substance 110, comprising a well array 240 having a plurality of wells 241, a first single-stranded nucleic acid fragment 121 labeled with a first and a second specific binding substance 130 to the target substance 110 labeled with a second single-stranded nucleic acid fragment 131.
  • the method for detecting the target substance described above can be suitably performed. Therefore, in the kit of the present embodiment, the well 241 contains the target substance 110, the first specific binding substance 120 for the target substance 110 labeled with the first single-stranded nucleic acid fragment 121, and the second one. A second specific binding substance 130 for a target substance 110 labeled with a single-stranded nucleic acid fragment 131 is introduced, resulting in a target substance 110, a first specific binding substance 120 and a second specific binding substance 130.
  • a step of forming a complex 100 containing and detecting the formation of the double-stranded nucleic acid 140, wherein the detection of the formation of the double-stranded nucleic acid 140 is for use in a method of indicating the presence of the target substance 110. can.
  • the well array may be arranged inside the fluidic device described above.
  • the target substance, the first single-stranded nucleic acid fragment, the first specific binding substance, the second single-stranded nucleic acid fragment, and the second specific binding substance are those described above. is similar to
  • the kit of this embodiment may further include a sealing liquid L220 that seals the opening of the well 241.
  • the sealing liquid L220 is the same as described above.
  • the kit of this embodiment detects a double-stranded nucleic acid 140 formed by hybridizing at least a portion of the first single-stranded nucleic acid fragment 121 and at least a portion of the second single-stranded nucleic acid fragment 131. Reagents may also be included.
  • reagents examples include the reagents for the ICA reaction described above, specifically flap probes, flap endonucleases (FEN), fluorescent substrates, and the like.
  • DNA1 (5'-TTTGTCACTGTTCCTCCTTTTGTTTTCCTTTCTGTGAGCAATTTCACCCAA-3', SEQ ID NO: 1) and DNA2 (5'-GCATGGTTCCAATTTGGGTGAT-3', SEQ ID NO: 2), which are oligonucleotides with an amino group modification at the 5' end, were bound respectively.
  • the length of the double-stranded nucleic acid formed by hybridization of DNA1 and DNA2 is 9 bases.
  • a target substance PSA antigen
  • the two types of oligonucleotide-modified antibodies described above, and a blocking buffer were mixed to prepare a mixed solution.
  • the volume of each mixture was 10 ⁇ L each.
  • the target substances were prepared to have final concentrations of 0 nM, 0.294 nM, 2.94 nM, 14.7 nM and 29.4 nM, respectively.
  • two types of oligonucleotide-modified antibodies were prepared to a final concentration of 8.56 nM, respectively.
  • As a blocking buffer Tris-buffered saline (TBS) containing 1% bovine serum albumin (BSA) was used. Subsequently, each mixture was allowed to react at 37° C. for 30 minutes.
  • ICA reaction reagent 1 An ICA reaction reagent for detection was prepared in order to carry out an ICA reaction using the oligonucleotide modified to the above antibody.
  • the ICA reaction reagents in this experimental example are 0.25 ⁇ M allele probe (5′-CGCGCCGAGGAATTGCTCACAGAAAGGA-3′) (Fasmac, SEQ ID NO: 3), 2 ⁇ M FRET cassette 1 (fluorescent substrate, Alexa488-BHQ: X-TTCT-Y -AGCCGGTTTTCCGGCTGAGACCTCGGCGCG, X: Alexa488 + AminoC6, Y: Black hole quencher (BHQ) 1-dT) (Nippon Bio Service Co., SEQ ID NO: 4), 0.81 ⁇ M flap endonuclease (FEN)-1, 50 mM Tris-HCl (pH 8. 5), 20 mM MgCl2 , and 0.0
  • FIG. 9 shows the results of immunoICA reaction using 0 nM, 0.294 nM, 2.94 nM, 14.7 nM and 29.4 nM of PSA antigen as target substances.
  • the vertical axis indicates the fluorescence intensity (relative value) of Alexa488, and the horizontal axis indicates the time (seconds) after the start of the ICA reaction.
  • the fluorescence intensity when the antigen concentration is 0 nM is N (noise), the fluorescence intensity at each other concentration is S (signal), and the signal-to-noise ratio (S/N ratio ) is a graph showing the calculation results.
  • the vertical axis indicates the S/N ratio
  • the horizontal axis indicates the time (seconds) after initiation of the ICA reaction.
  • the S/N ratio at an antigen concentration of 14.7 nM was 10.0 at 1080 seconds from the start of the reaction.
  • the S/N ratio at an antigen concentration of 29.4 nM was 5.6 at 1080 seconds from the start of the reaction.
  • the S/N ratio at an antigen concentration of 2.94 nM was 4.6 at 1380 seconds from the start of the reaction.
  • FIG. 11 is a graph showing the relationship between the antigen concentration (nM) and the S/N ratio 18 minutes after the start of the reaction.
  • the vertical axis indicates the S/N ratio
  • the horizontal axis indicates the antigen concentration (nM).
  • the highest S/N ratio was about 10 when the antigen concentration was 14.7 nM.
  • a fluorescence image of each well in the fluidic device was taken with a fluorescence microscope BZ-710 (KEYENCE) using a 10x objective lens.
  • the exposure time was 2 seconds using a GFP fluorescence filter.
  • Bright field images were also taken with a microscope BZ-710 using a 10x objective after sealing the wells.
  • the upper left of FIG. 12 is a bright field image at an antigen concentration of 0 pM.
  • the upper right of FIG. 12 is a fluorescence image at an antigen concentration of 0 pM.
  • the lower left of FIG. 12 is a bright field image at an antigen concentration of 14.7 nM.
  • the bottom right of FIG. 12 is a fluorescence image at an antigen concentration of 14.7 nM.
  • FIG. 13 is a graph showing the number of wells in which fluorescence was observed and the brightness when each concentration of target substance was detected.
  • the vertical axis indicates the number of wells in which fluorescence was observed
  • the horizontal axis indicates the luminance (relative value).
  • FIG. 14 is a graph showing the average value ⁇ standard deviation of luminance when target substances of each concentration are detected.
  • the vertical axis indicates luminance (relative value), and the horizontal axis indicates antigen concentration.
  • FIG. 15 is a graph showing the number of wells exhibiting brightness equal to or higher than the brightness threshold, which was temporarily set to 6000 in this experimental example, when a target substance of each concentration was detected. As a result, it was found that at an antigen concentration of 2.94 nM or more, approximately 3.7 times as many wells as those without antigen showed luminance above the threshold.
  • the length of the double-stranded nucleic acid formed by hybridizing DNA2 and DNA3 is 3 bases.
  • the length of the double-stranded nucleic acid formed by hybridizing DNA2 and DNA4 is 12 bases.
  • the length of the double-stranded nucleic acid formed by hybridization of DNA2 and DNA5 is 15 bases.
  • a mixture was prepared by mixing a target substance (PSA antigen), an oligonucleotide-modified antibody bound to DNA1 and DNA2, and a blocking buffer. The volume of each mixture was 10 ⁇ L each.
  • the target substance was prepared to have a final concentration of 0 nM or 2.94 nM.
  • two types of oligonucleotide-modified antibodies were prepared to a final concentration of 8.56 nM, respectively.
  • As a blocking buffer TBS containing 1% BSA was used. Subsequently, each mixture was allowed to react at 37° C. for 30 minutes.
  • modified oligonucleotide antibodies instead of the above combinations, a combination of oligonucleotide-modified antibodies bound to DNA2 and DNA3, respectively, a combination of oligonucleotide-modified antibodies bound to DNA2 and DNA4, respectively, and DNA2 and DNA5.
  • Mixtures were prepared in the same manner except that a combination of conjugated oligonucleotide-modified antibodies was used, and reactions were carried out under the same conditions.
  • ICA reaction reagent 2 An ICA reaction reagent for detection was prepared in order to carry out an ICA reaction using the oligonucleotide modified to the above antibody.
  • the ICA reaction reagents in this experimental example are 0.25 ⁇ M allele probe (5′-CGCGCCGAGGAATTGCTCACAGAAAGGA-3′) (Fasmac, SEQ ID NO: 3), 4 ⁇ M FRET cassette 1 (fluorescent substrate, Alexa488-BHQ: X-TTCT-Y -AGCCGGTTTTCCGGCTGAGACCTCGGCGCG, X: Alexa488 + AminoC6, Y: Black hole quencher (BHQ) 1-dT) (Nippon Bio Service Co., SEQ ID NO: 4), 0.81 ⁇ M flap endonuclease (FEN)-1, 50 mM Tris-HCl (pH 8. 5), 20 mM MgCl2 , and 0.05% Tween20.
  • FIG. 17 shows the results of immunoICA reaction using oligonucleotide-modified antibodies to which DNA2 and DNA3 were respectively bound.
  • FIG. 18 shows the results of immunoICA reaction using oligonucleotide-modified antibodies to which DNA2 and DNA4 were respectively bound.
  • FIG. 19 shows the results of immuno-ICA reaction using oligonucleotide-modified antibodies to which DNA2 and DNA5 were conjugated, respectively.
  • a mixed solution was prepared by mixing the target substance (PSA antigen), the oligonucleotide-modified antibody bound to DNA2 and DNA5, and the blocking buffer.
  • the volume of the mixture was 10 ⁇ L.
  • the target substance in the mixture was prepared to have a final concentration of 0 nM or 2.94 nM.
  • two types of oligonucleotide-modified antibodies were prepared to a final concentration of 8.56 nM, respectively. 10 ⁇ L of this mixture was mixed with 10 ⁇ L of the ICA reaction reagent prepared by the method described in ⁇ Preparation of ICA reaction reagent 2>>.
  • the final concentration of the target substance in the resulting mixture was 0 nM or 1.47 nM, and the final concentrations of the two types of oligonucleotide-modified antibodies were 4.28 nM, respectively.
  • This mixture was held at 37°C for 30 minutes for antigen-antibody reaction, then held at 66°C for 1 hour for immunoICA reaction, and Alexa488 fluorescence was detected using Rotor-Gene Q (QIAGEN). (Hereinafter referred to as reaction type II).
  • Fig. 20 shows the results of reaction type I and reaction type II. Even when compared with the method of mixing the ICA reaction solution after the antigen-antibody reaction as in Reaction Type I, there was no significant difference in immuno-ICA reaction intensity and background reaction intensity in Reaction Type II. From these results, it was found that the ICA reaction reagent does not attenuate the antigen-antibody reaction during the antigen-antibody reaction, and that the antigen-antibody reaction reagent does not attenuate the ICA reaction during the ICA reaction.
  • the antigen-antibody reaction and the immuno-ICA reaction can be performed successively, which simplifies the process, but it cannot be predicted that the immuno-ICA reaction can be detected with high sensitivity. It is an effect.

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Abstract

この検出方法は、試料中の標的物質（１１０）の検出方法であって、ウェルに、試料、第１の一本鎖核酸断片（１２１）で標識された、標的物質（１１０）に対する第１の特異的結合物質（１２０）、及び、第２の一本鎖核酸断片（１３１）で標識された、標的物質（１１０）に対する第２の特異的結合物質（１３０）を導入し、その結果、試料中に標的物質（１１０）が存在する場合に、標的物質（１１０）、第１の特異的結合物質（１２０）及び第２の特異的結合物質（１３０）を含む複合体（１００）が形成され、第１の一本鎖核酸断片（１２１）の少なくとも一部及び第２の一本鎖核酸断片（１３１）の少なくとも一部がハイブリダイズして二本鎖核酸（１４０）を形成する工程と、二本鎖核酸（１４０）の形成を検出する工程と、を含み、二本鎖核酸（１４０）の形成が検出されたことが、標的物質（１１０）の存在を示す、方法である。

Description

標的物質の検出方法
　本発明は、標的物質の検出方法に関する。より詳細には、本発明は、標的物質の検出方法、複合体及び標的物質の検出用キットに関する。
　本願は、２０２１年１１月４日に日本に出願された特願２０２１－１８００２０号について優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　生体試料中の標的物質を定量的に検出することにより、疾患の早期発見や投薬の効果予測が行われている。従来、タンパク質の定量は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）等により行われ、核酸の定量はリアルタイムＰＣＲ法等により行われてきた。
　近年、疾患をより早期に発見する等の目的で、標的物質をより精度よく検出するニーズが高まっている。標的物質を精度よく検出する手法として、多数の微小区画内で酵素反応を行う技術が検討されている。これらの手法は、デジタル計測と呼ばれている。デジタル計測には、デジタルＥＬＩＳＡ及びデジタルＰＣＲ等が存在する。
　デジタル計測では、試料溶液を極めて多数の微小溶液に分割する。そして、各微小溶液からの信号を２値化し、標的物質が存在するか否かのみを判別して、標的物質の分子数を計測する。デジタル計測によれば、従来のＥＬＩＳＡやリアルタイムＰＣＲ法等と比較して、検出感度及び定量性を格段に向上させることができる。
　例えば、非特許文献１には、微小ウェル及び試薬等を供給する流路を有する微小ウェルアレイが記載されており、当該微小ウェルアレイを用いてデジタルＥＬＩＳＡを行ったことが記載されている。
　また、特許文献１、非特許文献２及び３には、オリゴヌクレオチドを修飾した抗体を用いてタンパク質を検出する方法である、Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ａｓｓａｙ（ＰＬＡ）及びＰｒｏｘｉｍｉｔｙ　Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ　Ａｓｓａｙ（ＰＥＡ）が報告されている。これらの方法は、検出にＰＣＲ法を利用している。
国際公開第２０１２－１６００８３号
Kan C. W., et al., Isolation and detection of single molecules on paramagnetic beads using sequential fluid flows in microfabricated polymer array assemblies., Lab on a Chip, 12 (5), 977-985, 2012. Mohammed H., et al., Approaches for Assessing and Discovering Protein Interactions in Cancer., Mol Cancer Res, 11 (11), 1295-1302, 2013. Assarsson E., et al., Homogenous 96-Plex PEA Immunoassay Exhibiting High Sensitivity, Specificity, and Excellent Scalability., PLoS One, 9 (4), e95192, 2014.
　ＥＬＩＳＡでは、標的物質と抗体を反応させた後、未反応の抗体を洗浄する工程が必要である。しかしながら、デジタル計測用のデバイスでは、標的物質や抗体がウェルやドロップレット内に封入されるため、洗浄工程を行うことが困難である。
　このため、非特許文献１では、まず、検出対象であるＰＳＡを磁性ビーズに結合させ、続いて、ビーズを洗浄し、続いて、ビーズをビオチン標識抗体と反応させ、続いて、ビーズを洗浄し、続いて、ビーズをストレプトアビジン－β－ガラクトシダーゼを含む溶液と反応させ、続いて、ビーズを洗浄し、続いて、ビーズを、基質を含むバッファーに懸濁し、その後、ビーズをウェルアレイに導入して検出したことが記載されている。このように、デジタルＥＬＩＳＡにより標的物質を検出するためには煩雑な前処理が必要な場合がある。そこで本発明は、洗浄工程を行わずに標的物質を検出する技術を提供することを目的とする。
　本発明は以下の態様を含む。
［１］試料中の標的物質の検出方法であって、ウェルに、前記試料、第１の一本鎖核酸断片で標識された、前記標的物質に対する第１の特異的結合物質、及び、第２の一本鎖核酸断片で標識された、前記標的物質に対する第２の特異的結合物質を導入し、その結果、前記試料中に前記標的物質が存在する場合に、前記標的物質、前記第１の特異的結合物質及び前記第２の特異的結合物質を含む複合体が形成され、前記第１の一本鎖核酸断片の少なくとも一部及び前記第２の一本鎖核酸断片の少なくとも一部がハイブリダイズして二本鎖核酸を形成する工程と、前記二本鎖核酸の形成を検出する工程と、を含み、前記二本鎖核酸の形成が検出されたことが、前記標的物質の存在を示す、方法。
［２］前記ウェルの容積が１０ｆＬ～１００ｐＬである、［１］に記載の方法。
［３］前記第１の特異的結合物質は、前記標的物質の第１の結合部位を認識し、前記第２の特異的結合物質は、前記標的物質の第２の結合部位を認識し、前記第１の結合部位と前記第２の結合部位が異なるものである、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］前記第１の結合部位及び前記第２の結合部位の間の距離が、前記第１の一本鎖核酸断片の少なくとも一部及び前記第２の一本鎖核酸断片の少なくとも一部がハイブリダイズすることができる距離である、［３］に記載の方法。
［５］前記第１の一本鎖核酸断片及び前記第２の一本鎖核酸断片の塩基長が、それぞれ１０～２００塩基である、［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
［６］前記ウェルに、前記試料、前記第１の特異的結合物質、及び、前記第２の特異的結合物質を導入した後、前記ウェルの開口部を封止する工程を更に含む、［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［７］開口部を封止された前記ウェルが、前記標的物質に結合していない前記第１の特異的結合物質、及び／又は、前記標的物質に結合していない前記第２の特異的結合物質を含む、［６］に記載の方法。
［８］前記標的物質が、タンパク質、糖鎖、核酸、脂質膜構造体、細菌、ウイルス及び細胞からなる群より選択される１種又はこれらの複合物質である、［１］～［７］のいずれかに記載の方法。
［９］前記第１の特異的結合物質及び前記第２の特異的結合物質のそれぞれが、抗体、レクチン及び脂質膜に結合性を有する物質からなる群より選択される１種である、［１］～［８］のいずれかに記載の方法。
［１０］前記二本鎖核酸の形成を検出する工程が、Ｉｎｖａｓｉｖｅ　Ｃｌｅａｖａｇｅ　Ａｓｓａｙにより行われる、［１］～［９］のいずれかに記載の方法。
［１１］標的物質、第１の一本鎖核酸断片で標識された、前記標的物質に対する第１の特異的結合物質、及び、第２の一本鎖核酸断片で標識された、前記標的物質に対する第２の特異的結合物質を含み、前記第１の一本鎖核酸断片の少なくとも一部及び前記第２の一本鎖核酸断片の少なくとも一部がハイブリダイズして二本鎖核酸を形成した、複合体。
［１２］標的物質の検出用キットであって、複数のウェルを有するウェルアレイ、第１の一本鎖核酸断片で標識された、前記標的物質に対する第１の特異的結合物質、及び、第２の一本鎖核酸断片で標識された、前記標的物質に対する第２の特異的結合物質を含む、キット。
［１３］前記ウェルの開口部を封止する封止液を更に含む、［１２］に記載のキット。
［１４］前記第１の一本鎖核酸断片の少なくとも一部及び前記第２の一本鎖核酸断片の少なくとも一部がハイブリダイズして形成された二本鎖核酸を検出する試薬を更に含む、［１２］又は［１３］に記載のキット。
　本発明によれば、洗浄工程を行わずに標的物質を検出する技術を提供することができる。
図１は、標的物質の検出方法を説明する模式図である。 図２は、流体デバイスの一例を示す模式断面図である。 図３は、流体デバイスの一例を示す模式断面図である。 図４は、流体デバイスの一例を示す模式断面図である。 図５は、流体デバイスの一例を示す模式断面図である。 図６は、流体デバイスの一例を示す模式断面図である。 図７は、流体デバイスの一例を示す模式断面図である。 図８は、Ｉｎｖａｓｉｖｅ　Ｃｌｅａｖａｇｅ　Ａｓｓａｙ（ＩＣＡ）法の一例を説明する模式図である。 図９は、実験例１の結果を示すグラフである。 図１０は、実験例１の結果を示すグラフである。 図１１は、実験例１の結果を示すグラフである。 図１２は、実験例２の結果を示す顕微鏡画像である。 図１３は、実験例２の結果を示すグラフである。 図１４は、実験例２において、各濃度の標的物質を検出した場合のウェルの輝度の平均値±標準偏差を示すグラフである。 図１５は、実験例２において、各濃度の標的物質を検出した場合に設定値以上の輝度を示したウェル数を示すグラフである。 図１６は、実験例３において、ＤＮＡ１及びＤＮＡ２を結合させたオリゴヌクレオチド修飾抗体を用いたイムノＩＣＡ反応の結果を示すグラフである。 図１７は、実験例３において、ＤＮＡ２及びＤＮＡ３を結合させたオリゴヌクレオチド修飾抗体を用いたイムノＩＣＡ反応の結果を示すグラフである。 図１８は、実験例３において、ＤＮＡ２及びＤＮＡ４を結合させたオリゴヌクレオチド修飾抗体を用いたイムノＩＣＡ反応の結果を示すグラフである。 図１９は、実験例３において、ＤＮＡ２及びＤＮＡ５を結合させたオリゴヌクレオチド修飾抗体を用いたイムノＩＣＡ反応の結果を示すグラフである。 図２０は、実験例４において、ＤＮＡ２及びＤＮＡ５を結合させたオリゴヌクレオチド修飾抗体を用いたイムノＩＣＡ反応の結果を示すグラフである。
　以下、場合により図面を参照しつつ、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお、図面中、同一又は相当部分には同一又は対応する符号を付し、重複する説明は省略する。なお、各図における寸法比は、説明のため誇張している部分があり、必ずしも実際の寸法比とは一致しない。
［標的物質の検出方法］
　１実施形態において、本発明は、試料中の標的物質の検出方法であって、ウェルに、前記試料、第１の一本鎖核酸断片で標識された、前記標的物質に対する第１の特異的結合物質、及び、第２の一本鎖核酸断片で標識された、前記標的物質に対する第２の特異的結合物質を導入し、その結果、前記試料中に前記標的物質が存在する場合に、前記標的物質、前記第１の特異的結合物質及び前記第２の特異的結合物質を含む複合体が形成され、前記第１の一本鎖核酸断片の少なくとも一部及び前記第２の一本鎖核酸断片の少なくとも一部がハイブリダイズして二本鎖核酸を形成する工程と、前記二本鎖核酸の形成を検出する工程と、を含み、前記二本鎖核酸の形成が検出されたことが、前記標的物質の存在を示す、方法を提供する。
　図１は、本実施形態の方法を説明する模式図である。図１に示すように、本実施形態の方法では、まず、試料、第１の一本鎖核酸断片１２１で標識された、第１の特異的結合物質１２０、及び、第２の一本鎖核酸断片１３１で標識された、第２の特異的結合物質１３０をウェルに導入する。その結果、試料中に標的物質１１０が存在する場合に、標的物質１１０、第１の特異的結合物質１２０及び第２の特異的結合物質１３０を含む複合体１００が形成される。第１の一本鎖核酸断片１２１の少なくとも一部及び第２の一本鎖核酸断片１３１の少なくとも一部はハイブリダイズして二本鎖核酸（二本鎖核酸領域ともいう）１４０を形成する。
　続いて、二本鎖核酸１４０の形成を検出する。二本鎖核酸１４０の形成が検出された場合、標的物質１１０が存在するということができる。本実施形態の方法は、標的物質１１０を含まない試料に適用してもよく、その場合には、二本鎖核酸１４０の形成、すなわち、標的物質１１０の存在は検出されない。二本鎖核酸１４０の形成の検出については後述する。
　図１に示すように、第１の特異的結合物質１２０は、標的物質１１０の第１の結合部位１１１を認識する。また、第２の特異的結合物質１３０は、標的物質１１０の第２の結合部位１１２を認識する。このように、第１の結合部位１１１と第２の結合部位１１２は異なる結合部位であってもよい。例えば、標的物質がタンパク質である場合、第１の結合部位１１１及び第２の結合部位１１２は、それぞれ第１のエピトープ１１１及び第２のエピトープ１１２であるということもできる。
　試料としては、生体試料及び環境試料等が挙げられる。生体試料としては、特に制限されず、血清、血漿、尿及び細胞培養液等が挙げられる。また、環境試料としては、例えば、河川の水及び工場排水等が挙げられる。標的物質１１０は、タンパク質、糖鎖、核酸、脂質膜構造体、細菌、ウイルス及び細胞からなる群より選択される１種又はこれらの複合物質であってもよい。
　タンパク質は、糖タンパク質であってもよいし、膜タンパク質であってもよい。タンパク質は、複合物質であってもよい。複合物質としては、例えば、糖鎖とタンパク質が結合した糖タンパク質、及び複数のタンパク質を融合させた融合タンパク質等が挙げられる。脂質膜構造体としては、人工の又は天然の脂質で構成された小胞が挙げられ、例えば、リポソーム、エクソソーム及び細胞内小器官等が挙げられる。脂質膜構造体、細菌、ウイルス及び細胞の検出においては、これらの標的分子に存在するタンパク質、糖鎖及び核酸等を検出してもよい。
　標的物質１１０において、第１の結合部位１１１及び第２の結合部位１１２の間の距離は、第１の一本鎖核酸断片１２１の少なくとも一部及び第２の一本鎖核酸断片１３１の少なくとも一部がハイブリダイズすることができる距離であることが好ましい。ここで、ハイブリダイズすることができる距離とは、第１の一本鎖核酸断片１２１と第２の一本鎖核酸断片１３１とがハイブリダイズできる位置まで近接する距離であることが好ましい。
　例えば、標的物質１１０が直径１０ｎｍの球であると仮定した場合、第１の結合部位１１１と第２の結合部位１１２の距離は、３～１０ｎｍであることが好ましく、３．５～９ｎｍであることがより好ましい。一例として、標的物質１１０が直径１０ｎｍの球であると仮定し、標的物質１１０の中心を基準としたときの第１の結合部位１１１と第２の結合部位１１２との角度が３０～１２０°である場合、第１の結合部位１１１と第２の結合部位１１２の距離は、４．１４～８．６６ｎｍである。ここで、第１の結合部位１１１と第２の結合部位１１２の距離とは、標的物質１１０の表面に沿った第１の結合部位１１１と第２の結合部位１１２の最短距離であると定義する。
　具体的には、例えば、第１の一本鎖核酸断片１２１の塩基長は、１０～２００塩基であってもよい。同様に、第２の一本鎖核酸断片１３１の塩基長も１０～２００塩基であってもよい。また、第１の一本鎖核酸断片１２１の少なくとも一部及び第２の一本鎖核酸断片１３１の少なくとも一部がハイブリダイズして形成された二本鎖核酸１４０の長さは、７～３０塩基程度であってもよく、７～２０塩基であってもよい。第１の一本鎖核酸断片１２１及び第２の一本鎖核酸断片１３１のハイブリダイズする領域は、各一本鎖核酸断片の末端を含んでいてもよい。第１の一本鎖核酸断片１２１及び第２の一本鎖核酸断片１３１のハイブリダイズする領域は、一本鎖核酸断片末端を含まなくてもよく、例えば各一本鎖核酸断片の末端から７～１３塩基に位置してもよい。検出感度を高める観点から、第１の一本鎖核酸断片１２１及び第２の一本鎖核酸断片１３１のハイブリダイズする領域は、それぞれの一本鎖核酸断片の末端を含んでいることが好ましい。
（ウェル）
　本実施形態の方法は、デジタル計測による標的物質の検出に適している。本実施形態の方法をデジタル計測で行う場合、ウェルは、複数のウェルが配置されたウェルアレイを構成していることが好ましい。また、ウェルアレイは、流体デバイスの流路内に配置されていることが好ましい。
（流体デバイス）
　図２は、流体デバイスの一例を示す模式断面図である。図２に示すように、流体デバイス２００は、基板２１０と、基板２１０に対向して配置される蓋部材２２０とを備えている。蓋部材２２０は凸部２２１を有しており、凸部２２１の先端は基板２１０に接している。流体デバイス２００においては、ウェルアレイ２４０は基板２１０の一方面上に基板２１０と一体成形されている。基板２１０のウェルアレイ２４０が成型されている面は、蓋部材２２０と対向している。ウェルアレイ２４０は、複数のウェル２４１を有する。蓋部材２２０は、基板２１０に溶着又は接着されていてもよい。
　ウェル２４１は、基板２１０の表面に開口している。ウェル２４１の形状、寸法、及び配置は特に限定されないが、１つのウェル２４１に１個の標的物質が導入されることが好ましい。ウェル２４１は、容積が小さい微小ウェルであることが好ましい。例えば、１つのウェル２４１の容積は、１０ｆＬ～１００ｐＬ程度であってもよい。流体デバイス２００では、同形同大の複数のウェル２４１がウェルアレイ２４０を構成している。同形同大とは、デジタル計測を行うために要求される程度に同一の形状で同一の容量であればよく、製造上の誤差程度のばらつきであれば許容される。
　ウェル２４１の直径は、例えば１～１０μｍ程度であってもよい。ウェル２４１の深さは、例えば１～１０μｍ程度であってもよい。また、ウェル２４１の配置は、特に制限されず、例えば三角格子状に整列していてもよいし、正方格子状も整列していてもよいし、ランダムに配置されていてもよい。
　流体デバイス２００では、凸部２２１の存在により、ウェルアレイ２４０と蓋部材２２０との間に空間が形成されている。当該空間は、流路２３０を構成している。流路２３０は、標的物質、第１の特異的結合物質、第２の特異的結合物質等が分散した液体及び後述する封止液を送液するための経路として機能する。流路２３０の形状、構造及び容量等は、特に限定されないが、流路２３０の高さ（即ち基板２１０の蓋部材２２０と対向する面であってウェルアレイが形成されていない部分の表面と、蓋部材２２０の基板２１０と対向する面との間の距離）は、例えば５００μｍ以下であってもよいし、例えば３００μｍ以下であってもよいし、例えば２００μｍ以下であってもよいし、例えば１００μｍ以下であってもよい。
　凸部２２１は、蓋部材２２０と一体に成形されていてもよい。蓋部材２２０は、例えば、熱可塑性樹脂の流動体を、成形型を用いて成形することで、凸部２２１を有する板状に成形することができる。また、蓋部材２２０には試薬の導入ポート２２２及び排出ポート２２３が形成されていてもよい。
　蓋部材２２０が凸部２２１を有する場合、基板２１０のウェル２４１が開口する面に凸部２２１が接するように、蓋部材２２０と基板２１０とが重ねられる。この結果、蓋部材２２０と基板２１０との間の空間が流路２３０となる。蓋部材２２０と基板２１０とは、レーザー溶着等により溶着されてもよい。
（流体デバイスの変形例１）
　本実施形態の方法に用いられる流体デバイスは上述した流体デバイス２００に限られない。図５は、流体デバイスの一例を示す模式断面図である。図５に示すように、流体デバイス５００は、基板２１０と、壁部材５１０とを備えている。流体デバイス５００においては、ウェルアレイ２４０は、基板２１０の一方面上に基板２１０と一体成形されている。ウェルアレイ２４０は、複数のウェル２４１を有する。
　流体デバイス５００は、蓋部材２２０を有していない点で上述した流体デバイス２００と主に異なっている。このため、流体デバイス５００は、流路を有していない。
（流体デバイスの変形例２）
　上述した流体デバイス２００においては、蓋部材２２０と凸部２２１は、一体成形されている。しかしながら、蓋部材２２０と凸部２２１は別体として成形されていてもよい。
　また、上述した流体デバイス２００及び流体デバイス５００においては、ウェルアレイ２４０は、基板２１０の一方面上に基板２１０と一体成形されている。しかしながら、ウェルアレイは、基板２１０と一体成形されていなくてもよい。例えば、流体デバイスとは別体として成形されたウェルアレイ２４０を、流体デバイスの基板２１０上に配置してもよい。あるいは、基板２１０の表面に樹脂層を積層し、エッチング等により、樹脂層にウェルアレイを形成してもよい。
（流体デバイスの材質）
　基板２１０は、例えば樹脂を用いて形成される。樹脂の種類は特に限定されないが、試薬及び封止液に対して耐性のある樹脂であることが好ましい。また、検出するシグナルが蛍光である場合には、自家蛍光が少ない樹脂であることが好ましい。樹脂としては、例えば、シクロオレフィンポリマー、シクロオレフィンコポリマー、シリコン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリ酢酸ビニル、フッ素樹脂及びアモルファスフッ素樹脂等が挙げられるがこれらに限定されない。
　基板２１０の板厚方向の一方面に複数のウェル２４１が形成されていてもよい。樹脂を用いたウェルの形成方法としては、射出成形、熱インプリント及び光インプリント等が挙げられる。
　あるいは、例えば、基板２１０の上にフッ素樹脂を積層し、当該フッ素樹脂をエッチング等により加工してウェルアレイを形成してもよい。フッ素樹脂としては、例えばＣＹＴＯＰ（登録商標）（旭硝子）等を用いることができる。
　また、流体デバイスが蓋部材２２０を有する場合、蓋部材２２０の材質は、自家蛍光の少ない樹脂であることが好ましく、例えば、シクロオレフィンポリマー及びシクロオレフィンコポリマー等の熱可塑性樹脂であってもよい。
　また、蓋部材２２０は、シグナルを蛍光観察する際に検出される波長の近傍の波長の光を透過しない材料から形成されていてもよく、完全に光を透過しない材料から形成されていてもよい。例えば、蓋部材２２０は、カーボンや金属粒子等を添加した熱可塑性樹脂から形成されていてもよい。
（本実施形態の方法）
　続いて、場合により図２～４を参照しながら、流体デバイス２００を用いた場合を例に、本実施形態の方法について説明する。本実施形態の方法は、試料中の標的物質の検出方法であり、ウェル２４１に、試料、第１の一本鎖核酸断片１２１で標識された、標的物質１１０に対する第１の特異的結合物質１２０、及び、第２の一本鎖核酸断片１３１で標識された、標的物質１１０に対する第２の特異的結合物質１３０を導入し、その結果、試料中に標的物質１１０が存在する場合に、標的物質１１０、第１の特異的結合物質１２０及び第２の特異的結合物質１３０を含む複合体１００が形成され、第１の一本鎖核酸断片１２１の少なくとも一部及び第２の一本鎖核酸断片１３１の少なくとも一部がハイブリダイズして二本鎖核酸１４０を形成する工程と、二本鎖核酸１４０の形成を検出する工程と、を含み、二本鎖核酸１４０の形成が検出されたことが、標的物質１１０の存在を示す。本実施形態の方法によれば、洗浄工程を行わずに標的物質を検出することができる。
《導入工程》
　まず、図２に示すように、流体デバイス２００の導入ポート２２２から試薬液Ｌ２１０を導入し、流路２３０に送液する。試薬液Ｌ２１０は、試料、第１の特異的結合物質１２０及び第２の特異的結合物質１３０が分散した液体であり、二本鎖核酸１４０の形成を検出するための試薬も含む。試薬液Ｌ２１０は、試料に標的物質１１０が含まれる場合、第１の特異的結合物質１２０、第２の特異的結合物質１３０、標的物質１１０及び二本鎖核酸１４０の形成を検出するための試薬を含む。
　流路２３０に送液された試薬液Ｌ２１０は、ウェルアレイ２４０に接触する。そして、ウェル２４１の内部に試薬液Ｌ２１０が収容される。この結果、ウェル２４１に第１の特異的結合物質１２０、第２の特異的結合物質１３０、及び、存在する場合には標的物質１１０、並びに、二本鎖核酸１４０の形成を検出するための試薬が導入される。
　試薬液Ｌ２１０は、以下の第１の方法で調製することができる。試料、第１の特異的結合物質１２０及び第２の特異的結合物質１３０を混合し、試料に含まれ得る標的物質１１０と第１の特異的結合物質１２０及び第２の特異的結合物質１３０との抗原抗体反応を行う。抗原抗体反応は、例えば２５～３７℃で３０～１８０分間行う。その後、二本鎖核酸１４０の形成を検出するための試薬を添加し、ＩＣＡ反応を行う。ＩＣＡ反応は、例えば６０～７０℃で１０～６０分間行う。ＩＣＡ反応完了後の混合液を、試薬液Ｌ２１０として使用することができる。
　試薬液Ｌ２１０は、以下の第２の方法で調製することができる。試料、第１の特異的結合物質１２０及び第２の特異的結合物質１３０を混合し、抗原抗体反応溶液を調製する。抗原抗体反応溶液に二本鎖核酸１４０の形成を検出するための試薬を添加し、混合液を調製する。この混合液を、例えば２５～３７℃で３０～１８０分間で保持した後、６０～７０℃で１０～６０分間で保持し、ＩＣＡ反応を完了させる。ＩＣＡ反応完了後の混合液を、試薬液Ｌ２１０として使用することができる。
　１つのウェル２４１に導入される標的物質１１０の数は特に制限されないが、好ましくは、１つのウェル２４１に１つ以下、すなわち、０個又は１個の標的物質１１０が導入される。これにより、標的物質１１０の検出を１個単位で行うことができ、すなわちデジタル計測が可能となる。また、ウェルアレイの全てのウェルに標的物質１１０が導入される必要はない。
　標的物質１１０をウェルに導入する手段は、特に制限されず、選択した標的物質１１０に応じた適切な手段を選択することができる。例えば、標的物質１１０を自重により流体デバイス内（流路内であってよい）で沈降させ、ウェルに分配する方法が挙げられる。あるいは、標的物質１１０を捕捉する物質（捕捉物ともいう）を利用し、自重で沈降しにくい標的物質１１０に捕捉物を結合させて送液してもよく、予めウェルに捕捉物を固定化させておき、送液された標的物質１１０を捕捉させることで、標的物質１１０のウェルへの導入効率を向上させることもできる。
　捕捉物を標的物質１１０に結合させる工程は、本実施形態の方法の任意の時点で行うことができる。例えば、この工程は、ウェル２４１に標的物質１１０を導入する工程の前に、サンプルチューブ内で標的物質１１０と捕捉物を接触させることにより行ってもよい。あるいは、捕捉物をウェル２４１に導入した後に、標的物質１１０をウェルに導入し、ウェル内で捕捉物と標的物質１１０とを接触させてもよい。
　捕捉物は、標的物質１１０を捕捉することができる物質である。捕捉物は、例えば、固相と標的物質１１０に対する特異的結合物質との結合体であってもよい。
　固相としては、粒子、膜及び基板等が挙げられる。また、標的物質１１０に対する特異的結合物質は１種類でもよいし、２種類以上であってもよい。例えば３種類であってもよいし、４種類であってもよいし、５種類以上であってもよい。
　粒子としては、特に制限されず、ポリマー粒子、磁気粒子及びガラス粒子等が挙げられる。粒子は、非特異的な吸着を避けるための表面処理が施された粒子が好ましい。また、特異的結合物質を固定化するために、表面にカルボキシル基等の官能基を有する粒子が好ましい。より具体的には、ＪＳＲ社製の商品名「Ｍａｇｎｏｓｐｈｅｒｅ　ＬＣ３００」等を用いることができる。
　あるいは、例えば標的物質１１０としてウイルスを用いる場合、ウイルスが付着することができる細胞（すなわち、ウイルス受容体を有する細胞）を、捕捉物として用いてもよい。
　第１の特異的結合物質１２０、第２の特異的結合物質１３０及び捕捉物における特異的結合物質としては、抗体、抗体断片及びアプタマー等が挙げられる。抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド安定化抗体（ｄｓＦｖ）、２量化体Ｖ領域断片（Ｄｉａｂｏｄｙ）及びＣＤＲを含むペプチド等が挙げられる。抗体は、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよい。また、市販の抗体であってもよい。
　また、標的物質１１０が糖鎖を含む場合、特異的結合物質は、レクチンであってもよい。また、標的物質１１０が脂質膜を含む場合、特異的結合物質は、脂質膜に結合性を有する物質であってもよい。脂質膜に結合性を有する物質としては、例えば、ヘキサンジオール等の炭化水素及び膜貫通タンパク質等の膜タンパク質が挙げられる。膜タンパク質としては、例えばα－ヘモリシン等が挙げられる。
　一本鎖核酸断片で特異的結合物質を標識する方法としては、架橋剤を使用する方法が挙げられる。一本鎖核酸断片は、リンカーである分子を介して特異的結合物質に標識されてもよい。リンカーとしては、特に限定されず、例えば、ポエリエチレン鎖、炭化水素鎖及びペプチド等が挙げられる。一本鎖核酸断片は、ＤＮＡであってもよいし、ＲＮＡであってもよい。また、ＢＮＡ及びＬＮＡ等の人工核酸を含んでいてもよい。
　特異的結合物質を粒子表面に固定化する方法としては、特に制限されず、物理吸着による方法、化学結合による方法、アビジン－ビオチンの結合を利用する方法及びプロテインＧ又はプロテインＡと抗体との結合を利用する方法等が挙げられる。物理吸着による方法としては、疎水的相互作用又は静電的相互作用により、特異的結合物質を粒子表面に固定化する方法が挙げられる。化学結合による方法としては、架橋剤を使用する方法が挙げられる。例えば、粒子の表面が水酸基を有する場合、特異的結合物質が有するカルボキシル基に架橋剤を反応させて活性エステル化した後、水酸基とこのエステル基とを反応させることにより、特異的結合物質を粒子表面に固定化させることができる。また、特異的結合物質による標的分子の認識能を阻害しないよう、特異的結合物質と粒子表面との間にスペーサーを設けることが好ましい。
　上述したように、捕捉物を用いて標的物質１１０をウェル２４１に導入する場合、捕捉物１個に標的物質１１０が０個又は１個捕捉される条件で捕捉物と標的物質１１０との結合体を形成することが好ましい。さらに、１つのウェル２４１には、捕捉物が０個又は１個導入されるように構成されることが好ましい。これによりデジタル計測が可能となる。
　標的物質１１０、第１の特異的結合物質１２０及び第２の特異的結合物質１３０を接触させると、これらを含む複合体１００が形成され、第１の一本鎖核酸断片１２１の少なくとも一部及び第２の一本鎖核酸断片１３１の少なくとも一部がハイブリダイズして二本鎖核酸１４０を形成する。複合体１００の形成は、試料、第１の特異的結合物質１２０及び第２の特異的結合物質１３０がウェルに導入される前にサンプルチューブ内で行われてもよいし、ウェル２４１内で行われてもよい。
　標的物質は、２個の分子から成っていてもよく、それぞれの分子に特異的な、核酸標識された特異的結合物質を用いて検出してもよい。この場合、上記２個の分子が結合状態であるか否かを測定することができる。また、上記２個の分子がホモ二量体を形成するものである場合、核酸標識された第１の特異的結合物質、及び、核酸標識された第２の特異的結合物質は、同一のエピトープを認識するものであってもよい。
《封入工程》
　ウェル２４１に、試料、第１の特異的結合物質１２０、及び、第２の特異的結合物質１３０を導入した後、ウェル２４１の開口部を封止する工程を実施してもよい。
　ウェル２４１の開口部を封止する方法は、あるウェル２４１の内部に収容された液体が、別のウェル２４１の内部に収容された液体と互いに混合しない状態にすることができる限り特に限定されず、例えば、封止液でウェル２４１の開口部を覆うことにより封止してもよい。あるいは、ウェル２４１の開口部にガラス板等の板状部材を積層することにより封止してもよい。
　例えば、図３に示すように、蓋部材２２０の導入ポート２２２から、基板２１０と蓋部材２２０との間の流路２３０に、封止液Ｌ２２０を送液する。流路２３０に送液された封止液Ｌ２２０は、ウェルアレイ２４０に接触する。そして、封止液Ｌ２２０は、流路２３０に送液された試薬液Ｌ２１０のうち、ウェル２４１に収容されていない試薬液Ｌ２１０を押し流して置換する。これにより、封止液Ｌ２２０が、標的物質１１０を含む試薬液Ｌ２１０を収容した複数のウェル２４１をそれぞれ個別に封止し、ウェル２４１は、独立した反応空間（微小区画２４２）となる。流路２３０が封止液Ｌ２２０で満たされると、余分な封止液Ｌ２２０は排出ポート２２３から排出される。図４は、ウェルアレイ２４０のウェル２４１の全てが封止液Ｌ２２０で封止され、封止されたウェル（つまり微小区画）２４２が形成された状態を示す。
　また、試薬液Ｌ２１０に脂質を溶解させておき、封止液Ｌ２２０を流路２３０に送液した後、再び脂質を含む液体を送液することにより、ウェル２４１の開口部に脂質二重膜を形成し、当該脂質二重膜によって複数のウェル２４１をそれぞれ個別に封止し、封止されたウェル２４２を形成することもできる。脂質二重膜を形成する脂質としては、例えば、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホグリセロール（ＤＯＰＧ）及びこれらの混合物等が挙げられるがこれらに限定されない。
　上述したいずれかの封止方法により封止されたウェル２４２は、標的物質１１０に結合していない第１の特異的結合物質１２０、及び／又は、標的物質１１０に結合していない第２の特異的結合物質１３０を含んでいてもよい。
　封止液は、複数のウェル２４１に導入された液体同士を互いに混合しないように個別に封止して液滴（微小液滴ともいう）を形成することができる液である。封止液は、好ましくは油性溶液であり、より好ましくはオイルである。オイルとしては、フッ素系オイル、シリコーン系オイル、炭化水素系オイル又はこれらの混合物等を使用することができる。より具体的には、シグマ社製の商品名「ＦＣ－４０」等を用いることができる。ＦＣ－４０（ＣＡＳ番号：８６５０８－４２－１）はフッ素化脂肪族化合物であり、２５℃における比重が１．８５ｇ／ｍＬである。
《検出工程》
　続いて、二本鎖核酸１４０の形成を検出する。二本鎖核酸１４０の形成の検出は、シグナル増幅反応を用いて行うことが好ましい。シグナル増幅反応としては、例えば、Ｉｎｖａｓｉｖｅ　Ｃｌｅａｖａｇｅ　Ａｓｓａｙ（ＩＣＡ）が挙げられる。
　ＩＣＡ反応は、（１）核酸同士の相補的結合と、（２）酵素による三重鎖構造の認識及び切断との２つの反応のサイクルによってシグナル増幅が進行するという原理に関連する。
　ＩＣＡ反応は、夾雑物による反応サイクル阻害の影響が小さい。したがって、ＩＣＡ反応を用いることにより、標的物質１１０を精度よく検出することができる。シグナル増幅反応にＩＣＡ反応を用いる場合、試薬液Ｌ２１０（標的物質１１０、第１の特異的結合物質１２０及び第２の特異的結合物質１３０を含む液体）は、ＩＣＡ反応に必要な反応試薬を含む。
　ＩＣＡ反応に必要な反応試薬としては、フラッププローブ、フラップエンドヌクレアーゼ（ＦＥＮ）及び蛍光基質等のＩＣＡ反応試薬が挙げられる。フラッププローブは、第１の一本鎖核酸断片１２１又は第２の一本鎖核酸断片１３１にハイブリダイズして二本鎖核酸１４０とフラップ構造を形成するように設計された核酸断片である。
　図８は、ＩＣＡ法の一例を説明する模式図である。図８の例では、ＩＣＡ法により、第１の一本鎖核酸断片１２１の少なくとも一部及び第２の一本鎖核酸断片１３１の少なくとも一部がハイブリダイズして形成された二本鎖核酸１４０を検出する。
　まず、第１の一本鎖核酸断片１２１又は第２の一本鎖核酸断片１３１にフラッププローブをハイブリダイズさせる。図８の例では、フラッププローブ８１０は、第１の一本鎖核酸断片１２１にハイブリダイズする。その結果、第１フラップ部位８１１が形成される。
　続いて、第１フラップ部位８１１にＦＥＮを反応させると、第１フラップ部位８１１が切断され、核酸断片８１１が生成される。続いて、核酸断片８１１は、蛍光基質（核酸断片８２０）にハイブリダイズして第２フラップ部位８２１を形成する。
　図８の例では、核酸断片８２０の５’末端には蛍光物質Ｆが結合されており、核酸断片８２０の５’末端から数塩基３’側に消光物質Ｑが結合されている。続いて、第２フラップ部位８２１にＦＥＮを反応させると、第２フラップ部位８２１が切断され、核酸断片８２１が生成される。その結果、蛍光物質Ｆが消光物質Ｑから離れ、蛍光シグナルを発生する。この蛍光シグナルを検出することにより、二本鎖核酸１４０の形成を検出することができる。
　試薬液Ｌ２１０としては、流体デバイスを用いて行われる生化学分析において使用される一般的な液体を用いることができ、好ましくは水性溶液である。また、試薬液Ｌ２１０に界面活性剤等を含ませることにより、ウェル内に液体を封入しやすくしてもよい。
　二本鎖核酸１４０の形成の検出にＩＣＡ反応を用いる場合、二本鎖核酸１４０が存在する場合には、等温反応による酵素反応によって、蛍光物質Ｆが消光物質Ｑから遊離し、励起光に対応して所定の蛍光シグナルを発する。
　二本鎖核酸１４０の形成の検出は、検出するシグナルの種類に応じて公知の適切な方法を選択することができる。例えば、蛍光シグナルを観察する場合は、蛍光物質に対応する励起光を微小区画２４２に照射し、蛍光物質が発する蛍光を観察する。例えば、図４に示すように、微小区画２４２内で所定の反応を行い、発生したシグナルを観察する。微小区画２４２Ｒはシグナルが検出されたウェルであり、微小区画２４２はシグナルが検出されなかったウェルである。
　続いて、図５～図７を参照しながら、流体デバイス５００を用いた場合を例に、本実施形態の方法について説明する。
　まず、図５に示すように、流体デバイス５００の内部に試薬液Ｌ２１０を導入する。試薬液Ｌ２１０は、標的物質１１０、第１の特異的結合物質１２０、及び、第２の特異的結合物質１３０が分散した液体であり、二本鎖核酸１４０の形成を検出するための試薬も含む。試薬液Ｌ２１０において、標的物質１１０の濃度は、ウェル２４１に１ウェルあたり１分子以下の標的物質が入る濃度に調整されていることが好ましい。
　続いて、図６に示すように、流体デバイス５００の内部に封止液Ｌ２２０を導入する。封止液Ｌ２２０の比重は、試薬液Ｌ２１０よりも大きい。このため、封止液Ｌ２２０は、試薬液Ｌ２１０のうち、ウェル２４１に収容されていない試薬液Ｌ２１０よりも下に沈み、ウェルアレイ２４０に接する。そして、封止液Ｌ２２０は、標的物質を含む試薬液Ｌ２１０を収容した複数のウェル２４１をそれぞれ個別に封止し、独立した反応空間（つまり微小区画２４２）となる。
　続いて、図７に示すように、微小区画２４２内で所定の反応を行い、発生したシグナルを観察する。微小区画２４２Ｒは、シグナルが検出されたウェルであり、微小区画２４２は、シグナルが検出されなかったウェルである。
［複合体］
　１実施形態において、本発明は、標的物質１１０、第１の一本鎖核酸断片１２１で標識された、標的物質１１０に対する第１の特異的結合物質１２０、及び、第２の一本鎖核酸断片１３１で標識された、標的物質１１０に対する第２の特異的結合物質１３０を含み、第１の一本鎖核酸断片１２１の少なくとも一部及び第２の一本鎖核酸断片１３１の少なくとも一部がハイブリダイズして二本鎖核酸１４０を形成した、複合体１００を提供する。
　複合体１００において、第１の一本鎖核酸断片１２１又は第２の一本鎖核酸断片１３１にフラッププローブが更にハイブリダイズしていてもよい。
　上述したように、本実施形態の複合体を利用することにより、洗浄工程を行わずに標的物質を検出することができる。
［キット］
　１実施形態において、本発明は、標的物質１１０の検出用キットであって、複数のウェル２４１を有するウェルアレイ２４０、第１の一本鎖核酸断片１２１で標識された、標的物質１１０に対する第１の特異的結合物質１２０、及び、第２の一本鎖核酸断片１３１で標識された、標的物質１１０に対する第２の特異的結合物質１３０を含む、キットを提供する。
　本実施形態のキットにより、上述した標的物質の検出方法を好適に行うことができる。したがって、本実施形態のキットは、ウェル２４１に、標的物質１１０、第１の一本鎖核酸断片１２１で標識された、標的物質１１０に対する第１の特異的結合物質１２０、及び、第２の一本鎖核酸断片１３１で標識された、標的物質１１０に対する第２の特異的結合物質１３０を導入し、その結果、標的物質１１０、第１の特異的結合物質１２０及び第２の特異的結合物質１３０を含む複合体１００が形成され、第１の一本鎖核酸断片１２１の少なくとも一部及び第２の一本鎖核酸断片１３１の少なくとも一部がハイブリダイズして二本鎖核酸１４０を形成する工程と、二本鎖核酸１４０の形成を検出する工程と、を含み、二本鎖核酸１４０の形成が検出されたことが、標的物質１１０の存在を示す方法に用いるためのものであるということもできる。
　ウェルアレイは、上述した流体デバイスの内部に配置されていてもよい。また、本実施形態のキットにおいて、標的物質、第１の一本鎖核酸断片、第１の特異的結合物質、第２の一本鎖核酸断片及び第２の特異的結合物質については上述したものと同様である。
　本実施形態のキットは、ウェル２４１の開口部を封止する封止液Ｌ２２０を更に含んでいてもよい。封止液Ｌ２２０については、上述したものと同様である。
　本実施形態のキットは、第１の一本鎖核酸断片１２１の少なくとも一部及び第２の一本鎖核酸断片１３１の少なくとも一部がハイブリダイズして形成された二本鎖核酸１４０を検出する試薬を更に含んでいてもよい。
　このような試薬としては、上述したＩＣＡ反応用の試薬が挙げられ、具体的には、フラッププローブ、フラップエンドヌクレアーゼ（ＦＥＮ）及び蛍光基質等が挙げられる。
［材料及び方法］
（ｐｒｏｓｔａｔｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＳＡ）の検出）
《抗体へのオリゴヌクレオチド修飾１》
　抗体－オリゴヌクレオチドコンジュゲーションツールを用いて、２種類の抗ヒトＰＳＡマウスモノクローナル抗体（クローン５Ａ６及び１Ｈ１２、ＨｙＴｅｓｔ社）に、それぞれ異なるオリゴヌクレオチド（ファスマック社）を結合させた。５’末端にアミノ基修飾をしたオリゴヌクレオチドである、ＤＮＡ１（5’-TTTGTCACTGTTCCTCCTTTTGTTTTCCTTTCTGTGAGCAATTTCACCCAA-3’、配列番号１）、及び、ＤＮＡ２（5’-GCATGGTTCCAATTTGGGTGAT-3’、配列番号２）をそれぞれ結合させた。ＤＮＡ１とＤＮＡ２とがハイブリダイズして形成される二本鎖核酸の長さは９塩基である。
《抗原抗体反応１》
　標的物質（ＰＳＡ抗原）、上記の２種類のオリゴヌクレオチド修飾抗体、及び、ブロッキングバッファーを混合し、混合液を調製した。各混合液の用量は、それぞれ１０μＬであった。標的物質は、終濃度がそれぞれ０ｎＭ、０．２９４ｎＭ、２．９４ｎＭ、１４．７ｎＭ、２９．４ｎＭとなるように調製した。また、２種類のオリゴヌクレオチド修飾抗体は、終濃度がそれぞれ８．５６ｎＭとなるように調製した。また、ブロッキングバッファーとしては、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）を使用した。続いて、各混合液を３７℃で３０分間反応させた。
《Ｉｎｖａｓｉｖｅ　Ｃｌｅａｖａｇｅ　Ａｓｓａｙ（ＩＣＡ）反応試薬の調製１》
　上記の抗体に修飾したオリゴヌクレオチドを用いてＩＣＡ反応を行うため、検出用ＩＣＡ反応試薬を調製した。本実験例におけるＩＣＡ反応試薬は、０．２５μＭアレルプローブ（5’-CGCGCCGAGGAATTGCTCACAGAAAGGA-3’）（ファスマック社、配列番号３）、２μＭ　ＦＲＥＴカセット１（蛍光基質、Ａｌｅｘａ４８８－ＢＨＱ：X-TTCT-Y-AGCCGGTTTTCCGGCTGAGACCTCGGCGCG，Ｘ：Ａｌｅｘａ４８８＋ＡｍｉｎｏＣ６，Ｙ：ブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ）１－ｄＴ）（日本バイオサービス社、配列番号４）、０．８１μＭフラップエンドヌクレアーゼ（ＦＥＮ）－１、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、２０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、及び０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０を含んでいた。なお、これらのＩＣＡ反応試薬における各成分の濃度は、実験例における終濃度である。
［実験例１］
（チューブ内での標的物質（ＰＳＡ）の検出）
　上記の抗原抗体反応後の混合液１０μＬと上記のＩＣＡ反応試薬１０μＬを混合し、Ｒｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ　Ｑ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて６６℃、１時間反応させ、Ａｌｅｘａ４８８の蛍光を検出した。以下、この反応を「イムノＩＣＡ反応」という場合がある。
　図９～１１は、実験例１の結果を示すグラフである。図９は、標的物質として、０ｎＭ、０．２９４ｎＭ、２．９４ｎＭ、１４．７ｎＭ、２９．４ｎＭのＰＳＡ抗原を用いて、イムノＩＣＡ反応を行った結果である。図９中、縦軸は、Ａｌｅｘａ４８８の蛍光強度（相対値）を示し、横軸は、ＩＣＡ反応開始後の時間（秒）を示す。その結果、ＰＳＡ抗原が２．９４ｎＭ以上の条件で、抗原の有無を検出することができることが明らかとなった。
　図１０は、図９の結果において、抗原濃度が０ｎＭの時の蛍光強度をＮ（ノイズ）とし、その他の各濃度での蛍光強度をＳ（シグナル）とし、シグナル・ノイズ比（Ｓ／Ｎ比）を算出した結果を示すグラフである。図１０中、縦軸は、Ｓ／Ｎ比を示し、横軸は、ＩＣＡ反応開始後の時間（秒）を示す。その結果、抗原濃度が１４．７ｎＭの条件におけるＳ／Ｎ比は、反応開始から１０８０秒において１０．０であった。また、抗原濃度が２９．４ｎＭの条件におけるＳ／Ｎ比は、反応開始から１０８０秒において５．６であった。また、抗原濃度が２．９４ｎＭの条件におけるＳ／Ｎ比は、反応開始から１３８０秒において４．６であった。
　図１１は、抗原濃度（ｎＭ）と反応開始から１８分後におけるＳ／Ｎ比の関係を示すグラフである。図１１中、縦軸はＳ／Ｎ比を示し、横軸は抗原濃度（ｎＭ）を示す。その結果、抗原濃度１４．７ｎＭの時が一番Ｓ／Ｎ比が高く、約１０であった。
［実験例２］
（流体デバイスを用いた標的物質（ＰＳＡ）の検出）
　上記の抗原抗体反応後の混合液１０μＬと上記のＩＣＡ反応試薬１０μＬを混合し、そのうち１０μＬを流体デバイスに送液した。続いて、封止液としてＦＣ－４０（Ｓｉｇｍａ社）を送液し、各ウェルを封止した。続いて、流体デバイスをホットプレート上にセットし、６６℃で２０分間反応させた。
　続いて、蛍光顕微鏡ＢＺ－７１０（ＫＥＹＥＮＣＥ社）で１０倍の対物レンズを用いて流体デバイスにおける各ウェルの蛍光画像を撮影した。露光時間は、それぞれ、ＧＦＰの蛍光フィルターを用いて２秒間とした。また、ウェルの封止後、顕微鏡ＢＺ－７１０で１０倍の対物レンズを用いて明視野画像も撮影した。
　図１２左上は、抗原濃度０ｐＭにおける明視野画像である。図１２右上は、抗原濃度０ｐＭにおける蛍光画像である。図１２左下は、抗原濃度１４．７ｎＭにおける明視野画像である。図１２右下は、抗原濃度１４．７ｎＭにおける蛍光画像である。その結果、抗原が存在するウェルにおいて、標的物質（ＰＳＡ）由来の蛍光シグナルを観察することができた。
　図１３は、各濃度の標的物質を検出した場合において、蛍光が観察されたウェル数及び輝度を示すグラフである。図１３中、縦軸は、蛍光が観察されたウェル数を示し、横軸は輝度（相対値）を示す。その結果、抗原濃度の増加に依存して、蛍光が観察されたウェル数及び輝度が増加したことが明らかとなった。
　図１４は、各濃度の標的物質を検出した場合の輝度の平均値±標準偏差を示すグラフである。図１４中、縦軸は、輝度（相対値）を示し、横軸は、抗原濃度を示す。図１５は、各濃度の標的物質を検出した場合において、輝度の閾値を仮設定し（本実験例では６０００に設定した。）、当該輝度以上の輝度を示すウェル数を示すグラフである。その結果、抗原濃度２．９４ｎＭ以上において、抗原がない場合と比較して約３．７倍の数のウェルが、閾値以上の輝度を示すことが明らかとなった。
《抗体へのオリゴヌクレオチド修飾２》
　抗体－オリゴヌクレオチドコンジュゲーションツールを用いて、２種類の抗ヒトＰＳＡマウスモノクローナル抗体（クローン５Ａ６及び１Ｈ１２、ＨｙＴｅｓｔ社）に、それぞれ異なるオリゴヌクレオチド（ファスマック社）を結合させた。５’末端にアミノ基修飾をしたオリゴヌクレオチドである、ＤＮＡ３（5’-TTTGTCACTGTTCCTCCTTTTGTTTTCCTTTCTGTGAGCAATTTC-3’、配列番号５）、ＤＮＡ４（5’-TTTGTCACTGTTCCTCCTTTTGTTTTCCTTTCTGTGAGCAATTTCACCCAAATT-3’、配列番号６）、及び、ＤＮＡ５（5’-TTTGTCACTGTTCCTCCTTTTGTTTTCCTTTCTGTGAGCAATTTCACCCAAATTGGA-3’、配列番号７）をそれぞれ結合させた。ＤＮＡ２とＤＮＡ３とがハイブリダイズして形成される二本鎖核酸の長さは３塩基である。ＤＮＡ２とＤＮＡ４とがハイブリダイズして形成される二本鎖核酸の長さは１２塩基である。ＤＮＡ２とＤＮＡ５とがハイブリダイズして形成される二本鎖核酸の長さは１５塩基である。
《抗原抗体反応２》
　標的物質（ＰＳＡ抗原）、それぞれＤＮＡ１及びＤＮＡ２を結合させたオリゴヌクレオチド修飾抗体、及び、ブロッキングバッファーを混合し、混合液を調製した。各混合液の用量は、それぞれ１０μＬであった。標的物質は、終濃度が０ｎＭ又は２．９４ｎＭとなるように調製した。また、２種類のオリゴヌクレオチド修飾抗体は、終濃度がそれぞれ８．５６ｎＭとなるように調製した。また、ブロッキングバッファーとしては、１％ＢＳＡを含むＴＢＳを使用した。続いて、各混合液を３７℃で３０分間反応させた。２種類のオリゴヌクレオチド修飾抗体として、上記の組み合わせの代わりにそれぞれＤＮＡ２及びＤＮＡ３を結合させたオリゴヌクレオチド修飾抗体の組み合わせ、それぞれＤＮＡ２及びＤＮＡ４を結合させたオリゴヌクレオチド修飾抗体の組み合わせ、及びＤＮＡ２及びＤＮＡ５を結合させたオリゴヌクレオチド修飾抗体の組み合わせを用いた以外は同じ方法で混合液を調製し、同一の条件で反応を行った。
《ＩＣＡ反応試薬の調製２》
　上記の抗体に修飾したオリゴヌクレオチドを用いてＩＣＡ反応を行うため、検出用ＩＣＡ反応試薬を調製した。本実験例におけるＩＣＡ反応試薬は、０．２５μＭアレルプローブ（5’-CGCGCCGAGGAATTGCTCACAGAAAGGA-3’）（ファスマック社、配列番号３）、４μＭ　ＦＲＥＴカセット１（蛍光基質、Ａｌｅｘａ４８８－ＢＨＱ：X-TTCT-Y-AGCCGGTTTTCCGGCTGAGACCTCGGCGCG，Ｘ：Ａｌｅｘａ４８８＋ＡｍｉｎｏＣ６，Ｙ：ブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ）１－ｄＴ）（日本バイオサービス社、配列番号４）、０．８１μＭフラップエンドヌクレアーゼ（ＦＥＮ）－１、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、２０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、及び０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０を含んでいた。なお、これらのＩＣＡ反応試薬における各成分の濃度は、実験例における終濃度である。
［実験例３］
（ハイブリダイズして形成される二本鎖核酸長の影響）
　上記の抗原抗体反応後の混合液１０μＬと《ＩＣＡ反応試薬の調製２》に記載の方法で調整されたＩＣＡ反応試薬１０μＬを混合し、Ｒｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ　Ｑ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて６６℃、１時間反応させ、Ａｌｅｘａ４８８の蛍光を検出した。それぞれＤＮＡ１及びＤＮＡ２を結合させたオリゴヌクレオチド修飾抗体を用いたイムノＩＣＡ反応の結果を図１６に示す。それぞれＤＮＡ２及びＤＮＡ３を結合させたオリゴヌクレオチド修飾抗体を用いたイムノＩＣＡ反応の結果を図１７に示す。それぞれＤＮＡ２及びＤＮＡ４を結合させたオリゴヌクレオチド修飾抗体を用いたイムノＩＣＡ反応の結果を図１８に示す。それぞれＤＮＡ２及びＤＮＡ５を結合させたオリゴヌクレオチド修飾抗体を用いたイムノＩＣＡ反応の結果を図１９に示す。
　図１６～１９の結果から、ハイブリダイズして形成される二本鎖核酸が長いほど反応性が向上することが分かった。一方で、ハイブリダイズして形成される二本鎖核酸が長いほどバックグラウンド反応のシグナルも大きくなった。但し、ハイブリダイズして形成される二本鎖核酸が９ｂｐである場合（図１６）では反応開始から３６００秒においてＳ／Ｎ比が７．４であり、ハイブリダイズして形成される二本鎖核酸が１２ｂｐである場合（図１８）では反応開始から１４４０秒においてＳ／Ｎ比が５．７であり、ハイブリダイズして形成される二本鎖核酸が１５ｂｐである場合（図１９）では反応開始から２８８秒においてＳ／Ｎ比が７．５であった。したがって、ハイブリダイズして形成される二本鎖核酸が１２～１５ｂｐであり、バックグラウンド反応の信号が比較的高い場合であっても十分な感度で標的物質の検出が行えることが分かった。
［実験例４］
（抗原抗体反応液及びＩＣＡ反応溶液の混合の影響）
　混合溶液における標的物質（ＰＳＡ抗原）の終濃度を０ｎＭ又は２．９４ｎMとし、それぞれＤＮＡ２及びＤＮＡ５を結合させたオリゴヌクレオチド修飾抗体の終濃度を８．５６ｎＭとした以外は、実験例３と同じ手順で抗原抗体反応後の混合液１０μＬとＩＣＡ反応試薬１０μＬを混合し、イムノＩＣＡ反応を行った（以降、反応型Ｉとする）。
　標的物質（ＰＳＡ抗原）、それぞれＤＮＡ２及びＤＮＡ５を結合させたオリゴヌクレオチド修飾抗体、及び、ブロッキングバッファーを混合し、混合液を調製した。混合液の用量は、１０μＬであった。混合液における標的物質は、終濃度が０ｎＭ又は２．９４ｎＭとなるように調製した。また、２種類のオリゴヌクレオチド修飾抗体は、終濃度がそれぞれ８．５６ｎＭとなるように調製した。この混合液１０μＬと《ＩＣＡ反応試薬の調製２》に記載の方法で調整されたＩＣＡ反応試薬１０μＬを混合した。得られた混合液における標的物質の終濃度は、０ｎＭ又は１．４７ｎＭ、２種類のオリゴヌクレオチド修飾抗体の終濃度は、それぞれ４．２８ｎＭであった。この混合液を３７℃で３０分間保持して抗原抗体反応を行い、その後６６℃で１時間保持してイムノＩＣＡ反応を行い、Ｒｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ　Ｑ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてＡｌｅｘａ４８８の蛍光を検出した（以降、反応型ＩＩとする）。
　反応型Ｉと反応型ＩＩの結果を図２０に示す。反応型Ｉのように抗原抗体反応後にＩＣＡ反応溶液を混合する方法と比較しても、反応型ＩＩのイムノＩＣＡ反応強度及びバックグラウンド反応強度に大きな差がなかった。この結果から、抗原抗体反応時にＩＣＡ反応試薬が抗原抗体反応を減弱させたり、ＩＣＡ反応時に抗原抗体反応試薬がＩＣＡ反応を減弱させたりすることがないことが分かった。抗原抗体反応溶液とＩＣＡ反応試薬とを混合した後、抗原抗体反応とイムノＩＣＡ反応を続けて行えるという点で工程が簡便になるにもかかわらず、イムノＩＣＡ反応を高感度に検出できることは予測できない効果である。
　本発明によれば、洗浄工程を行わずに標的物質を検出する技術を提供することができる。
　１００…複合体、１１０…標的物質、１１１…第１の結合部位、１１２…第２の結合部位、１２０…第１の特異的結合物質、１２１…第１の一本鎖核酸断片、１３０…第２の特異的結合物質、１３１…第２の一本鎖核酸断片、１４０…二本鎖核酸、２００，５００…流体デバイス、２１０…基板、２２０…蓋部材、２２１…凸部、２２２…導入ポート、２２３…排出ポート、２３０…流路、２４０…ウェルアレイ、２４１…ウェル、２４２…封止されたウェル（微小区画）、Ｌ２１０…試薬液、Ｌ２２０…封止液、２４２Ｒ…シグナルが検出されたウェル、５１０…壁部材、８１０…フラッププローブ、８１１…第１フラップ部位（核酸断片）、８２１…第２フラップ部位（核酸断片）、８２０，８２０’…核酸断片、Ｆ…蛍光物質、Ｑ…消光物質。

Claims (14)

  1. 　試料中の標的物質の検出方法であって、
    　ウェルに、前記試料、第１の一本鎖核酸断片で標識された、前記標的物質に対する第１の特異的結合物質、及び、第２の一本鎖核酸断片で標識された、前記標的物質に対する第２の特異的結合物質を導入し、その結果、前記試料中に前記標的物質が存在する場合に、前記標的物質、前記第１の特異的結合物質及び前記第２の特異的結合物質を含む複合体が形成され、前記第１の一本鎖核酸断片の少なくとも一部及び前記第２の一本鎖核酸断片の少なくとも一部がハイブリダイズして二本鎖核酸を形成する工程と、
    　前記二本鎖核酸の形成を検出する工程と、
    　を含み、前記二本鎖核酸の形成が検出されたことが、前記標的物質の存在を示す、方法。
  2. 　前記ウェルの容積が１０ｆＬ～１００ｐＬである、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記第１の特異的結合物質は、前記標的物質の第１の結合部位を認識し、前記第２の特異的結合物質は、前記標的物質の第２の結合部位を認識し、前記第１の結合部位と前記第２の結合部位が異なるものである、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　前記第１の結合部位及び前記第２の結合部位の間の距離が、前記第１の一本鎖核酸断片の少なくとも一部及び前記第２の一本鎖核酸断片の少なくとも一部がハイブリダイズすることができる距離である、請求項３に記載の方法。
  5. 　前記第１の一本鎖核酸断片及び前記第２の一本鎖核酸断片の塩基長が、それぞれ１０～２００塩基である、請求項１又は２記載の方法。
  6. 　前記ウェルに、前記試料、前記第１の特異的結合物質、及び、前記第２の特異的結合物質を導入した後、前記ウェルの開口部を封止する工程を更に含む、請求項１又は２に記載の方法。
  7. 　開口部を封止された前記ウェルが、前記標的物質に結合していない前記第１の特異的結合物質、及び／又は、前記標的物質に結合していない前記第２の特異的結合物質を含む、請求項６に記載の方法。
  8. 　前記標的物質が、タンパク質、糖鎖、核酸、脂質膜構造体、細菌、ウイルス及び細胞からなる群より選択される１種又はこれらの複合物質である、請求項１又は２に記載の方法。
  9. 　前記第１の特異的結合物質及び前記第２の特異的結合物質のそれぞれが、抗体、レクチン及び脂質膜に結合性を有する物質からなる群より選択される１種である、請求項１又は２に記載の方法。
  10. 　前記二本鎖核酸の形成を検出する工程が、Ｉｎｖａｓｉｖｅ　Ｃｌｅａｖａｇｅ　Ａｓｓａｙにより行われる、請求項１又は２に記載の方法。
  11. 　標的物質、第１の一本鎖核酸断片で標識された、前記標的物質に対する第１の特異的結合物質、及び、第２の一本鎖核酸断片で標識された、前記標的物質に対する第２の特異的結合物質を含み、前記第１の一本鎖核酸断片の少なくとも一部及び前記第２の一本鎖核酸断片の少なくとも一部がハイブリダイズして二本鎖核酸を形成した、複合体。
  12. 　標的物質の検出用キットであって、
    　複数のウェルを有するウェルアレイ、
    　第１の一本鎖核酸断片で標識された、前記標的物質に対する第１の特異的結合物質、及び、
    　第２の一本鎖核酸断片で標識された、前記標的物質に対する第２の特異的結合物質
    　を含む、キット。
  13. 　前記ウェルの開口部を封止する封止液を更に含む、請求項１２に記載のキット。
  14. 　前記第１の一本鎖核酸断片の少なくとも一部及び前記第２の一本鎖核酸断片の少なくとも一部がハイブリダイズして形成された二本鎖核酸を検出する試薬を更に含む、請求項１２又は１３に記載のキット。
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