WO2023080154A1 - 有害事象リスクの判定方法 - Google Patents

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bacteria
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崇 朝原
卓弥 杉本
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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    • G01N33/56911—Bacteria
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    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Definitions

  • the present invention relates to a method for determining the risk of adverse events during multimodal therapy.
  • Non-Patent Document 1 the development of febrile neutropenia by having patients take synbiotics during DCF therapy (three-drug combination therapy of docetaxel, cisplatin and 5-fluorouracil), which is preoperative chemotherapy for esophageal cancer and severe diarrhea are reported to be remarkably alleviated.
  • preventive measures such as consideration of the amount of anticancer drugs to be used and concomitant use of synbiotics can be considered in advance.
  • Anaerostipes hadrus is one of the dominant bacteria in the intestine, and is known as a bacterium that uses lactic acid and acetic acid in the intestine to produce butyric acid.
  • A. Deletion of hadrus inositol catabolism/butyrate biosynthetic pathway has been reported to be associated with increased host body weight and metabolic disease risk (Non-Patent Document 2).
  • Non-Patent Document 2 A.I. The relationship between hadrus and adverse events during treatments such as chemotherapy is unknown.
  • Motoori M et al. Clin Nutr, 2017, 36: 93-99 Zeevi D, et al. Nature, 2019, 568: 43-48
  • an object of the present invention is to provide a method for determining the risk of adverse events during multimodal therapy.
  • Anaerostipes hadrus which is a type of intestinal bacteria, and the occurrence or severity of adverse events during treatment.
  • Anaerostipes hadrus as an index, it was found that the risk of adverse events during combined modality therapy can be determined.
  • the present invention provides the following [1] to [12].
  • [1] A method for determining the risk of adverse events during combined modality therapy, including measuring Anaerostipes hadrus in a specimen collected from a subject.
  • [2] The method of [1], wherein the adverse event risk is the risk of onset or aggravation of an adverse event.
  • [3] The method of [1] or [2], wherein the multimodal therapy is a therapy selected from drug therapy, surgical therapy, radiation therapy, and a combination thereof.
  • [4] The method of any one of [1] to [3], wherein the multidisciplinary treatment is drug therapy.
  • [5] The method of any one of [1] to [4], wherein the adverse event is at least one selected from the group consisting of febrile neutropenia and diarrhea.
  • [6] The method of any one of [1] to [5], wherein the specimen is a stool specimen from a subject.
  • [7] Comparing the number of Anaerostipes hadrus bacteria in the specimen with a reference value, and determining that the risk of adverse events during combined modality treatment is high when the number of bacteria is equal to or less than the reference value, [1 ] to [6].
  • the present invention it is possible to easily determine the risk of developing adverse events or the risk of aggravation during multidisciplinary therapy. This makes it possible to take measures against adverse events, such as selection of treatment to be implemented, adjustment of drug dosage, and preventive measures for adverse events, according to the level of risk, and selection of the appropriate treatment regimen for each individual patient. It becomes possible.
  • Gr. 0 refers to patients who did not develop febrile neutropenia
  • Gr. 3 indicates a patient who developed febrile neutropenia.
  • Baseline indicates before the DCF therapy, and Day 8 indicates the 8th day of the first course of the DCF therapy. *p ⁇ 0.05, **p ⁇ 0.01.
  • Gr. 0 refers to patients who did not develop febrile neutropenia; Gr.
  • Anaerostipes hadrus (Eubacterium hadrum) is a Gram-positive bacterium and a type of human intestinal bacterium. As used herein, “Anaerostipes hadrus” means bacteria belonging to Anaerostipes hadrus.
  • multimodal therapy includes drug therapy using agents such as anticancer drugs, surgical therapy such as surgery, radiotherapy, and combinations thereof.
  • surgical therapy such as surgery, radiotherapy, and combinations thereof.
  • at the time of treatment includes both during and after treatment.
  • the term "adverse event” refers to an undesirable or unintended sign, symptom, or illness that occurs in a patient during or after treatment, regardless of whether or not it is causally related to the treatment.
  • adverse events and their severity for example, Common Terminology Criteria for Adverse Events (CTCAE) v4.0 published by the National Cancer Institute (NCI) Adverse events included and their grades are listed.
  • Grade 1 mild; no symptoms or mild symptoms; clinical or laboratory findings only; no treatment required.
  • Grade 2 Moderate; minimal/local/non-invasive treatment required; age-appropriate limitation of activities of daily living except self care.
  • Grade 3 Severe or medically significant, but not immediately life-threatening; hospitalization or extended hospitalization required; inactivity/incapacity; limitation of self-care activities of daily living.
  • Grade 4 life-threatening; urgent treatment required.
  • Grade 5 Death due to adverse events. In the present specification, no onset is defined as grade 0.
  • adverse event risk refers to the risk of developing an adverse event or the risk of aggravating an adverse event.
  • Adverse event risk refers to the possibility of developing an adverse event. That is, that an individual belongs to a high-risk group means that the individual is expected to have a high probability of developing an adverse event, and that an individual belongs to a low-risk group means that the individual has an adverse event It means that it is expected that the possibility of developing
  • adjuvantavation risk refers to the possibility of an adverse event being aggravated. That is, when an individual belongs to a high-risk group, it means that the individual is expected to develop an adverse event and the adverse event is likely to be severe, and the individual belongs to a low-risk group. By is meant that the individual is unlikely to develop an adverse event or, if the individual does develop an adverse event, the adverse event is expected to be unlikely to be severe.
  • determination includes the concepts of “detection”, “examination”, “measurement”, “prediction” or “diagnosis”, but does not include medical practice such as diagnosis by a doctor .
  • Anaerostipes hadrus in the specimen is used as an index.
  • the method detects the presence of A. Including measuring hadrus. Specifically, the method detects A. including measuring the number of S. hadrus.
  • the method comprises determining the amount of A. in total bacteria in a specimen taken from a subject. Including measuring hadrus occupancy.
  • the occupancy rate of A. hadrus is the total number of bacteria in the sample. means the ratio of the number of A. hadrus bacteria in the intestinal flora of the subject from whom the specimen was derived. This value corresponds to the occupancy rate of hadrus.
  • Subjects are not particularly limited, but those that require assessment of adverse event risk during combined modality therapy, such as patients scheduled to receive combined modality therapy, patients receiving combined modality therapy, etc. .
  • Examples of the specimen include biological samples derived from a subject, such as intestinal juice, feces, and other gastrointestinal tract contents.
  • the means for measuring the number of A. hadrus bacteria is not particularly limited, but A. hadrus is preferably used. Based on the nucleotide sequence of the 16S rRNA gene of hadrus, for example, RT-PCR method, sequencing method, etc., can be used for measurement, and among these, RT-PCR method is more preferable.
  • the analysis method using the RT-PCR method includes, for example, (1) a step of extracting RNA of intestinal bacteria in a sample, (2) synthesizing cDNA from the extracted RNA by reverse transcription; It can be performed by a step of performing PCR using a nucleic acid fragment (primer) that hybridizes to hadrus-derived cDNA, and (3) a step of detecting the DNA fragment amplified in step (2).
  • amplification reaction By performing an amplification reaction by combining the above nucleic acid fragment with template cDNA derived from a sample, A.
  • a DNA fragment (PCR product) specific to H. hadrus can be obtained.
  • A It becomes possible to quantify the number of bacteria of Hadrus.
  • Observation of the amplified PCR product over time can be performed by labeling the PCR product with an intercalating fluorescent dye such as SYBR (registered trademark) Green I and measuring the fluorescence intensity at each PCR step.
  • Intercalating dyes have the property of increasing fluorescence intensity by intercalating with double-stranded nucleic acids. PCR products generated by PCR reaction from hadrus cDNA can be accurately measured, and SYBR Green I is particularly preferably used.
  • Cq value the number of PCR cycles
  • DNA amount the number of PCR cycles
  • Cq value the number of PCR cycles
  • Molecular Beacon or the like labeled with a fluorescent dye
  • TaqMan probes and Molecular Beacons are probes in which a fluorescent dye and a quencher are bound to an oligonucleotide having homology to the internal sequence of the region amplified by PCR, and are used together in the PCR reaction. Since the fluorescent dye bound to the probe interacts with the quencher to emit fluorescence corresponding to the PCR amplification reaction, the amplified PCR product can be observed over time by measuring the fluorescence intensity at each PCR step. can.
  • the number of hadrus bacteria can be obtained from a calibration curve of the logarithmic value of the number of bacteria measured by the DAPI counting method, the culture method, or the like, and the Cq value. That is, A. A standard curve was prepared in advance by plotting the logarithm of the number of A. hadrus bacteria on the horizontal axis and the Cq value on the vertical axis. Hadrus counts are measured.
  • A.A. in the specimen In the measurement of the number of A. hadrus bacteria, A. A. hadrus on the 16S rRNA gene. It is conserved within the species A. hadrus. Primers that can specifically hybridize and amplify regions that are not conserved in species other than hadrus may be used. A. Primers for counting hadrus bacteria are not limited to these, but for example, the primers of SEQ ID NOs: 3 and 4 can be used.
  • the means for measuring the occupancy rate of hadrus is not particularly limited, but preferable examples include means for measuring by RT-PCR method, sequencing method, etc., based on the nucleotide sequence of the 16S rRNA gene of enterobacteria. Of these, it is more preferable to measure by a sequencing method (eg, 16S rRNA gene amplicon analysis).
  • 16S rRNA gene amplicon analysis includes, for example, (1) a step of extracting the genomic DNA of the intestinal bacterium in the specimen, (2) using the extracted genomic DNA as a template, a nucleic acid that hybridizes to the 16S rRNA gene of the intestinal bacterium. (3) determining the base sequence of the DNA fragment amplified in step (2); and (4) analyzing the sequence data obtained in step (3). It can be performed according to the process.
  • a DNA fragment (PCR product) derived from the 16S rRNA gene of intestinal bacteria can be obtained by combining the nucleic acid fragment with template genomic DNA derived from a specimen and performing an amplification reaction.
  • the sequence data is compiled as an amplicon sequence variant (ASV), and compared with a known database to assign phylogenetic information to each ASV.
  • ASV amplicon sequence variant
  • the region of the intestinal bacterium 16S rRNA gene amplified by PCR is a region amplified using primers that hybridize to a conserved region that is universally conserved among bacterial species, and It is preferably a region containing a variable region that is not conserved among bacterial strains and is rich in variation.
  • the variable region includes at least one of the V1 to V9 regions of the 16s rRNA gene, preferably a region containing V1 and V2 or a region containing V3 and V4.
  • the primers may optionally contain adapter sequences for sequencing and/or index sequences for sample identification. Examples of such primers include universal primers for amplifying bacterial 16S rRNA genes that are commonly used in this field. For example, the primers of SEQ ID NOS: 1 and 2 can be used.
  • the base sequence of the amplified PCR product can be determined by a known method, but can be rapidly sequenced using a next-generation sequencer such as the MiSeq platform (Illumina). Sequence data analysis can be performed using analysis software such as QIIME2 (Quantitative Insights Into Microbial Ecology 2), and sequence errors can be removed using QIIME2's DADA2 (Divisive Amplicon Denoising Algorithm 2) plug-in. can be done. The obtained sequence data can be classified into ASVs based on sequence identity, and the attribution of each ASV to a bacterial species can be determined with reference to known databases such as SILVA and Greengenes. From the abundance ratio corresponding to each ASV species determined in this way and the number of sequence reads, A. . The hadrus occupancy can be calculated.
  • Non-Patent Document 1 Lacticaseibacillus paracasei strain Shirota ( LcS) and Bifidobacterium breve strain Yakult (BbrY) (Bifidobacterium breve YIT 12272 (FERM BP-11320)) using galacto-oligosaccharides as prebiotics.
  • LcS is Lactobacillus casei YIT9029 (FERM BP-1366 ), and was deposited on January 12, 1981 at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Organism Depositary Center (currently the National Institute of Technology and Evaluation, Patent Microorganism Depositary Center).
  • A. hadrus can be used as an index for determining the risk of adverse events not only during drug therapy such as DCF therapy but also during combined modality therapy.
  • Multimodality therapy includes drug therapy, surgical therapy, radiation therapy, and combinations thereof, preferably drug therapy, more preferably drug therapy using an anticancer agent, still more preferably docetaxel, Drug therapy (DCF therapy) using cisplatin and 5-fluorouracil.
  • DCF therapy is known as one of the therapeutic methods for esophageal cancer.
  • the adverse events subject to risk assessment are not particularly limited, and examples include blood and lymphatic disorders, heart disorders, ear and labyrinth disorders, endocrine disorders, eye disorders, gastrointestinal disorders, general/systemic disorders, and administration site disorders.
  • the method of the present invention is preferably used to determine the risk of at least one type of adverse event selected from the group consisting of blood and lymphatic disorders and gastrointestinal disorders, specifically febrile neutropenia and diarrhea At least one risk determination selected from the group consisting of, that is, at least one risk determination selected from the group consisting of febrile neutropenia risk and diarrhea risk.
  • the severity of febrile neutropenia is classified into the following grades according to CTCAE v4.0.
  • Grade 1 - (not defined)
  • Grade 2 - (not defined)
  • Grade 3 Fever of ⁇ 38.0°C with absolute neutrophil count ⁇ 1,000/mm 3 and >38.3°C at any one time or lasting >1 hour.
  • Grade 4 life-threatening; urgent treatment required.
  • Grade 5 Death According to CTCAE v4.0, the severity of diarrhea is classified into the following grades.
  • the baseline refers to the defecation habit (number of defecations) in daily life.
  • Grade 1 ⁇ 4 stools/day increase over baseline; mild increase in colostomy output over baseline.
  • Grade 2 4-6 stools/day increase over baseline; moderate increase in colostomy output over baseline.
  • Grade 3 7 or more stools/day increase over baseline; fecal incontinence; hospitalization required; highly increased colostomy output over baseline; limitation of self-care activities of daily living.
  • Grade 4 life-threatening; urgent treatment required.
  • Grade 5 Death
  • the risk of adverse events during combined modality therapy is determined by the amount of A.
  • the number of hadrus bacteria may be used as an index for determination. Specifically, the amount of A. The lower the number of A. hadrus bacteria, the higher the risk of adverse events during combined modality therapy. It can be determined that the greater the number of hadrus bacteria, the lower the risk of adverse events during combined modality therapy. Such risk determination is based on the presence of A. It is preferable to compare the number of hadrus bacteria with a preset reference value (cutoff value) according to the level of risk. For example, the reference value is set in advance by A.
  • ROC Receiver Operating Characteristic
  • the risk of developing adverse events during combined modality therapy is determined by the amount of A.
  • the number of hadrus bacteria may be used as an index for determination. Specifically, the amount of A. The lower the number of A. hadrus bacteria, the higher the risk of developing adverse events during multidisciplinary treatment. It can be determined that the greater the number of hadrus bacteria, the lower the risk of developing adverse events during combined modality therapy. Such risk determination is based on the presence of A. It is preferable to compare the number of hadrus bacteria with a preset reference value according to the level of risk. The reference value can be appropriately set by those skilled in the art as described above. A.
  • the number of hadrus bacteria When the number of hadrus bacteria is equal to or less than the reference value, it can be determined that the risk of developing adverse events during combined modality therapy is high. On the other hand, A. When the number of hadrus bacteria is greater than the reference value, it can be determined that the risk of developing adverse events during combined modality therapy is low. In one example, if the adverse event is febrile neutropenia, the amount of A. When the number of A. hadrus bacteria is 10 7.7 or less per 1 g of the sample, it can be determined that the risk of developing febrile neutropenia during combined modality therapy is high. When the number of hadrus bacteria is more than 10 7.7 per 1 g of the specimen, it can be determined that the risk of developing febrile neutropenia during combined modality therapy is low.
  • the amount of A if the adverse event is diarrhea, the amount of A.
  • the number of A. hadrus bacteria per 1 g of the specimen is 10 7.6 or less, it can be determined that the risk of developing diarrhea during multidisciplinary treatment is high.
  • the number of hadrus bacteria is more than 10 7.6 per 1 g of the sample, it can be determined that the risk of developing diarrhea during combined modality therapy is low. Determination of the risk of developing adverse events during combined modality therapy is particularly suitably applied when the adverse event is febrile neutropenia.
  • the risk of aggravation of adverse events during combined modality therapy is determined by the amount of A.
  • the number of hadrus bacteria may be used as an index for determination. Specifically, the amount of A. The lower the number of A. hadrus bacteria, the higher the risk of aggravation of adverse events during multidisciplinary treatment. It can be determined that the greater the number of hadrus bacteria, the lower the risk of aggravation of adverse events during combined modality therapy. Such risk determination is based on the presence of A. It is preferable to compare the number of hadrus bacteria with a preset reference value according to the level of risk. The reference value can be appropriately set by those skilled in the art as described above. A.
  • the number of hadrus bacteria When the number of hadrus bacteria is equal to or less than the reference value, it can be determined that the risk of aggravation of adverse events during combined modality therapy is high. On the other hand, A. When the number of hadrus bacteria is greater than the reference value, it can be determined that the risk of aggravation of adverse events during combined modality therapy is low. In one example, if the adverse event is febrile neutropenia, the amount of A. When the number of A. hadrus bacteria is 10 7.7 or less per 1 g of the specimen, it can be determined that the risk of aggravation of febrile neutropenia during combined modality therapy is high, and A. hadrus bacteria in the specimen is high.
  • the number of hadrus bacteria is more than 10 7.7 per 1 g of the sample, it can be determined that the risk of aggravation of febrile neutropenia during combined modality therapy is low. More specifically, the amount of A. If the number of hadrus bacteria is 10 7.7 or less per 1 g of the specimen, it can be determined that febrile neutropenia during combined modality treatment is likely to be equivalent to grade 3 above, and A . When the number of hadrus bacteria is more than 10 7.7 per 1 g of the specimen, it can be determined that febrile neutropenia during combined modality treatment is highly likely to correspond to grade 0 above. In another example, if the adverse event is diarrhea, the amount of A. When the number of A.
  • hadrus bacteria per 1 g of the specimen is 10 7.6 or less, it can be judged that the risk of severe diarrhea during multimodal treatment is high, and the A. hadrus bacteria count in the specimen is high. When the number of hadrus bacteria per 1 g of the specimen is more than 10 7.6 , it can be determined that the risk of severe diarrhea during multimodality therapy is low. More specifically, the amount of A. If the number of hadrus bacteria is 10 7.6 or less per 1 g of the specimen, it can be determined that the diarrhea during multimodal treatment is likely to be equivalent to grade 3 or higher, for example, grade 3 to 4. A.
  • the risk of adverse events during combined modality therapy is determined by A.
  • the hadrus occupancy rate may be used as an index for determination. Specifically, the A. The lower the occupancy of hadrus, the higher the risk of adverse events during combined modality therapy, and the higher the risk of A. It can be determined that the higher the hadrus occupancy, the lower the risk of adverse events during combined modality therapy. Such risk determination is based on the A. It is preferable to compare the occupancy rate of hadrus with a preset reference value according to the level of risk. The reference value is, for example, previously determined by the total bacterial A.
  • ROC Receiver Operating Characteristic
  • the risk of developing adverse events during multimodal therapy is determined by the amount of A.
  • the occupancy rate of hadrus may be used as an index for determination. Specifically, the A. The lower the occupancy of hadrus, the higher the risk of developing adverse events during multimodal therapy, and the higher the risk of developing adverse events during multimodal therapy, and the higher the A. It can be determined that the higher the occupancy rate of hadrus, the lower the risk of developing adverse events during combined modality therapy. Such risk determination is based on the A. It is preferable to compare the occupancy rate of hadrus with a preset reference value according to the level of risk. The reference value can be appropriately set by those skilled in the art as described above. A. in total bacteria in the specimen.
  • the occupancy rate of hadrus When the occupancy rate of hadrus is equal to or less than the reference value, it can be determined that the risk of developing adverse events during combined modality therapy is high. On the other hand, A. in the total bacteria in the specimen When the hadrus occupancy rate is higher than the reference value, it can be determined that the risk of developing adverse events during combined modality therapy is low. In one example, if the adverse event is febrile neutropenia, A. When the occupancy rate of hadrus was 0.25% or less, the risk of developing febrile neutropenia during combined modality therapy was high, and A. When the occupancy rate of hadrus is higher than 0.25%, it can be determined that the risk of developing febrile neutropenia during combined modality therapy is low.
  • the total bacteria in the specimen are A.
  • the occupancy rate of hadrus was 0.084% or less, the risk of developing diarrhea during multimodal treatment was high, and A.
  • the occupancy rate of hadrus is higher than 0.084%, it can be determined that the risk of developing diarrhea during combined modality therapy is low. Determination of the risk of developing adverse events during combined modality therapy is particularly suitably applied when the adverse event is febrile neutropenia.
  • the risk of aggravation of adverse events during multimodal therapy is determined by the total bacteria in the sample.
  • the occupancy rate of hadrus may be used as an index for determination. Specifically, the A. The lower the occupancy of hadrus, the higher the risk of exacerbation of adverse events during combined modality therapy, and the higher the risk of aggravation of adverse events during combined modality treatment, and the higher the risk of A. It can be determined that the higher the occupancy rate of hadrus, the lower the risk of exacerbation of adverse events during combined modality therapy. Such risk determination is based on the A. It is preferable to compare the occupancy rate of hadrus with a preset reference value according to the level of risk.
  • the reference value can be appropriately set by those skilled in the art as described above.
  • the occupancy rate of hadrus When the occupancy rate of hadrus is higher than 0.25%, it can be determined that the risk of aggravation of febrile neutropenia during combined modality therapy is low. More specifically, A . When the occupancy rate of hadrus is 0.25% or less, it can be determined that febrile neutropenia during combined modality treatment is likely to be equivalent to Grade 3, and A. When the occupancy rate of hadrus is higher than 0.25%, it can be determined that febrile neutropenia during combined modality treatment is highly likely to correspond to Grade 0 above. In another example, if the adverse event is diarrhea, the total bacteria in the specimen are A. When the occupancy rate of hadrus is 0.084% or less, it can be determined that the risk of diarrhea aggravation during multimodal treatment is high, and A.
  • the occupancy rate of hadrus is higher than 0.084%, it can be determined that the risk of aggravation of diarrhea during combined modality therapy is low. More specifically, A .
  • the occupancy rate of hadrus is 0.084% or less, it can be determined that the diarrhea during multimodal treatment is likely to be equivalent to grade 3 or higher, for example grade 3 to 4, and the total bacteria in the specimen A.
  • the occupancy rate of hadrus is higher than 0.084%, it can be determined that diarrhea during multimodal therapy is highly likely to correspond to grade 0 to 2 above. Determination of the risk of exacerbation of adverse events is particularly preferably applied when the adverse event is diarrhea.
  • the method of the present invention is preferably carried out before combined modality therapy or at the beginning of combined modality therapy (for example, during one course of multimodal therapy including multiple courses or after completion of one course), and before combined modality therapy It is more preferable to implement
  • the risk of adverse events during multidisciplinary treatment can be determined early, especially before treatment, so that it is possible to make a more appropriate treatment plan for each individual patient, and thus the patient's It leads to improvement of quality of life and treatment effect.
  • Patients determined to have a low risk of adverse events during combined modality therapy according to the method of the present invention can be administered planned combined modality therapy, and adverse events during combined modality therapy can be Patients determined to be at high risk can be treated to prevent or alleviate adverse events, such as reducing drug doses and concomitant use of synbiotics.
  • kits containing a protocol for measuring hadrus are used.
  • the kit includes A. Reagents and protocols for measuring A. hadrus (methods for measuring A. hadrus, criteria for judging the risk of adverse events during combined modality therapy, factors affecting measurement results and the extent of their effects, etc. are described) included. Such criteria can be used to determine as in the method described above.
  • the "variation in the number of bacteria" used as an index means that A.C.
  • the number of A. hadrus bacteria increased, the number of A.
  • the increase in the number of A. hadrus bacteria was promoted, A.
  • This concept includes the case where the decrease in the number of hadrus bacteria is suppressed. That is, in vitro or in vivo, A.
  • a test substance that increases the number of hadrus bacteria, promotes an increase in the number of bacteria, or suppresses a decrease in the number of bacteria is judged to have the effect of reducing the risk of adverse events during multimodal therapy.
  • the "variation in occupancy rate" used as an index means that the A.D.
  • a test substance that increases hadrus occupancy, promotes an increase in occupancy, or inhibits a decrease in occupancy is judged to have an effect of reducing the risk of adverse events during combined modality therapy.
  • a test substance is administered to a human or an experimental animal such as a mouse, rat or rabbit, and compared with an unadministered human or experimental animal. Determine whether or not to change the number of hadrus bacteria or the occupancy rate.
  • the test substance is A.
  • the test substance was treated as an agent for reducing the risk of adverse events during multimodal therapy.
  • the test substance is A.
  • the test substance was treated as an agent for reducing the risk of adverse events during multimodality therapy. available as
  • Example 1 1. Method (1) Subjects for analysis Eighty-one patients with esophageal cancer between the ages of 20 and 80 who were scheduled to receive preoperative chemotherapy were enrolled in the study. Of these, 73 subjects (38 in the prophylactic antibiotic administration group and 35 in the synbiotics administration group) whose feces were collected both at the time of registration and on the 8th day after the start of DCF therapy were analyzed. Consent to participate in the study was obtained by consent form prior to participation from all patients who participated in the study.
  • Lacol NF-containing enteral liquid (Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.) to 600 mL per day, 3 days before the start of chemotherapy 1 course Lacticaseibacillus paracasei strain Shirota (Lacticaseibacillus paracasei YIT 9029: LcS) as a probiotic until the end of chemotherapy (Lactobacillus casei YIT 902 before the 2020 Lactobacillus reclassification) 9 (FERM BP-1366)) and Bifidobacterium breve strain Yakult ( BbrY) (Bifidobacterium breve YIT 12272 (FERM BP-11320)) containing 3 ⁇ 10 8 cells or more of each of the viable bacteria Yakult BL antiflatulent drug (Yakult Honsha Co., Ltd.) 3 g per day, Oligomate S- as a prebiotic 15 mL
  • RNA extraction 40 ⁇ L of fecal suspension was transferred to a new 2 mL tube containing 1 mL PBS, centrifuged (4° C., 13,000 ⁇ g, 5 minutes), and the supernatant was removed by decantation. bottom. This pellet was stored at -80°C until RNA extraction.
  • 200 ⁇ L of suspension was transferred to a new 2 mL tube with 1 mL of PBS and vortexed. After centrifugation (4° C., 13,000 ⁇ g, 5 minutes), 1 mL of the supernatant was removed. After adding 1 mL of PBS again, suspending and centrifuging (4° C., 13,000 ⁇ g, 5 minutes), 1 mL of the supernatant was removed. The resulting 200 ⁇ L suspension was stored at ⁇ 30° C. until DNA extraction.
  • 16S rRNA gene amplicon analysis by next-generation sequencer DNA was extracted from stool samples using QIAamp DNA Stool Mini Kit (QIAGEN GmbH) according to the manual. 16S rRNA gene amplicon analysis was performed as follows. The V1-V2 region of the 16S rRNA gene of each sample was amplified with the ABI 7500 Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific) using 27Fmod2 forward and 338R reverse primers (SEQ ID NOs: 1 and 2).
  • PCR reaction solution 50 ⁇ L
  • 2 ⁇ SYBR Premix Ex Taq II 50 ⁇ L, Takara Bio
  • Nuclease-Free Water 22 ⁇ L
  • each primer 100 nM, 1 ⁇ L
  • template DNA 10 ng/mL, 1 ⁇ L
  • the PCR reaction was carried out under the conditions of 25 cycles of 95°C for 5 seconds, 55°C for 30 seconds, and 72°C for 40 seconds.
  • Amplification products were purified with the AMPure XP Kit (Beckman Coulter Genomics) and quantified with the Quant-iT PicoGreen dsDNA Kit (Invitrogen).
  • a primer set (SEQ ID NOs: 3 and 4) was designed consisting of an AH7F forward primer and an AH1R reverse primer specific for the hadrus 16S rRNA gene. Using the primer set, cultured A . Quantitative RT-PCR was performed using RNA extracted from hadrus as a template. Qiagen OneStep RT-PCR kit (Qiagen) was used for quantitative RT-PCR.
  • PCR reaction solution (10 ⁇ L), 1 ⁇ Qiagen Onestep RT-PCR Buffer (2 ⁇ L), 0.5 ⁇ Q-solution (2 ⁇ L), dNTP Mixture (400 ⁇ M each), 100,000-fold diluted SYBR Green I (Molecular Probes ), Qiagen OneStep RT-PCR enzyme mix (0.4 ⁇ L), AH7F forward primer and AH1R reverse primer (0.6 ⁇ M), and template RNA (5 ⁇ L) were mixed.
  • the RT-PCR reaction was heated at 50°C for 30 minutes to perform reverse transcription, heated at 95°C for 15 minutes for initial denaturation, and 40 seconds at 94°C for 5 seconds, 55°C for 30 seconds, and 72°C for 50 seconds.
  • AGPC acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction
  • the A. Species-specific primers SEQ ID NOS: 3 and 4
  • Threshold cycle (Cq) values in the linear range of the assay were imputed into the standard curve to determine the corresponding bacterial counts in each sample. From this, the number of bacteria in each sample was determined.
  • the standard curve is for the standard strain A. spp., which has already been counted by Cq value and DAPI staining.
  • a dilution series of hadrus YIT10092 T DSM3319 T ) was used.
  • the limit of detection (LOD) was the smallest number of bacteria in the standard curve (10 -2 cells/reaction).
  • RT-qPCR products (10 ⁇ L) were purified by MultiScreen® Filter Plate (Merck Millipore). Cycle sequencing reactions were performed using the BigDye® Terminator version 3.1 Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems) according to the manufacturer's manual. Amplification products were purified by ethanol precipitation, dissolved in formamide (1 ⁇ L), denatured, and sequenced using an ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Comparison of the resulting rRNA sequences for assignment to specific species was performed using NCBI's BLAST program (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
  • A. Changes in A. hadrus counts A. hadrus in feces before DCF therapy. There was no significant difference in the number of hadrus bacteria between the Antibiotics group and the Synbiotics group. Eight days after the start of DCF therapy, A.C. A tendency toward a decrease in the number of A. hadrus bacteria (p 0.11) was observed, but in the Synbiotics group, A. hadrus bacteria decreased after DCF therapy. No decrease in the number of Hadrus bacteria was observed. With DCF therapy and administration of prophylactic antibiotics, A. Although the number of hadrus bacteria decreased, such a decrease in the number of bacteria was suppressed by oral administration of synbiotics.
  • the cut-off value for the number of hadrus bacteria was calculated by receiver operating characteristic (ROC) analysis.
  • ROC receiver operating characteristic
  • the cut-off value was 10 7.7 per 1 g of specimen.
  • A. Hadrus can be used to determine the risk of adverse events during multimodality therapy, particularly during drug therapy.

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Abstract

集学的治療時の有害事象リスクの判定方法を提供する。被験者より採取した検体中のＡｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ　ｈａｄｒｕｓを測定することを含む、集学的治療時の有害事象リスクの判定方法。

Description

有害事象リスクの判定方法
　本発明は、集学的治療時の有害事象リスクの判定方法に関する。
　進行性食道がんの治療において、術前化学療法と手術を組み合わせた治療が有望な治療戦略の一つとなっているが、術前化学療法においては、下痢、発熱性好中球減少症などの深刻な有害事象が発生する。こうした有害事象の発症は、抗がん剤の中止や減量につながり、十分な抗腫瘍効果を得ることが難しくなることに加えて、免疫能の低下や栄養状態の悪化を引き起こし、患者の生活の質（ｑｕａｌｉｔｙ　ｏｆ　ｌｉｆｅ；ＱＯＬ）の低下を招く要因となることから、化学療法における有害事象の軽減は重要な課題である。
　これまでに、食道がん術前化学療法であるＤＣＦ療法（ドセタキセル、シスプラチン及び５－フルオロウラシルの３剤併用療法）施行時に患者にシンバイオティクスを摂取させることにより、発熱性好中球減少症の発症や重篤な下痢が顕著に軽減されることが報告されている（非特許文献１）。一方、有害事象が起きることを治療前に予測できれば、使用する抗がん剤の量の検討やシンバイオティクスの併用といった予防措置を事前に検討できる。
　Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ　ｈａｄｒｕｓは、腸内の優勢菌の一種であり、腸内の乳酸や酢酸を利用して酪酸を産生する菌として知られている。また、健常人において、Ａ．ｈａｄｒｕｓのイノシトール異化・酪酸生合成経路の欠失は、宿主の体重や代謝性疾患のリスクの増加に関連することが報告されている（非特許文献２）。しかしながら、Ａ．ｈａｄｒｕｓと化学療法などの治療時の有害事象との関連については知られていない。
Motoori M, et al. Clin Nutr, 2017, 36: 93-99 Zeevi D, et al. Nature, 2019, 568: 43-48
　疾患の効果的な治療のためには、治療時の有害事象の発症や重症化のリスクを判定して治療を開始することが望ましい。よって、本発明は、集学的治療時の有害事象リスクの判定方法を提供することを課題とする。
　本発明者らは、腸内細菌に着目し検討を重ねた結果、腸内細菌の１種であるＡｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ　ｈａｄｒｕｓと治療時の有害事象の発症の有無又は重症度との間に相関性があり、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ　ｈａｄｒｕｓを指標として、集学的治療時の有害事象リスクを判定することが可能であることを見出した。
　すなわち、本発明は、以下の〔１〕～〔１２〕を提供するものである。
〔１〕被験者より採取した検体中のＡｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ　ｈａｄｒｕｓを測定することを含む、集学的治療時の有害事象リスクの判定方法。
〔２〕有害事象リスクが有害事象の発症リスク又は重症化リスクである、〔１〕記載の方法。
〔３〕集学的治療が薬物療法、外科療法、放射線治療、及びその組み合わせから選択される治療である、〔１〕又は〔２〕記載の方法。
〔４〕集学的治療が薬物療法である、〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕有害事象が発熱性好中球減少症及び下痢からなる群より選択される少なくとも１種である、〔１〕～〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔６〕検体が被験者の糞便検体である、〔１〕～〔５〕のいずれかに記載の方法。
〔７〕検体中のＡｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ　ｈａｄｒｕｓの菌数を基準値と比較し、菌数が基準値以下である場合に、集学的治療時の有害事象リスクが高いと判定することをさらに含む、〔１〕～〔６〕のいずれかに記載の方法。
〔８〕検体中の総細菌におけるＡｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ　ｈａｄｒｕｓの占有率を基準値と比較し、占有率が基準値以下である場合に、集学的治療時の有害事象リスクが高いと判定することをさらに含む、〔１〕～〔６〕のいずれかに記載の方法。
〔９〕検体中のＡｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ　ｈａｄｒｕｓの菌数が、検体１ｇあたり、１０7.7個以下であるか、検体中の総細菌におけるＡｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ　ｈａｄｒｕｓの占有率が０．２５％以下である場合に、集学的治療時の発熱性好中球減少症リスクが高いと判定することをさらに含む、〔１〕～〔６〕のいずれかに記載の方法。
〔１０〕検体中のＡｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ　ｈａｄｒｕｓの菌数が、検体１ｇあたり、１０7.6個以下であるか、検体中の総細菌におけるＡｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ　ｈａｄｒｕｓの占有率が０．０８４％以下である場合に、集学的治療時の下痢リスクが高いと判定することをさらに含む、〔１〕～〔６〕のいずれかに記載の方法。
〔１１〕検体中のＡｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ　ｈａｄｒｕｓの測定試薬及びプロトコールを含む、〔１〕～〔１０〕のいずれかに記載の方法を実施するためのキット。
〔１２〕Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ　ｈａｄｒｕｓの菌数又は占有率を指標とする、集学的治療時の有害事象リスクの低減剤のスクリーニング方法。
　本発明によれば、集学的治療時の有害事象の発症リスク又は重症化リスクを簡便に判定することができる。これにより、リスクの高低に応じて、実施する治療の選択、薬剤量の調整、有害事象の予防措置などの有害事象対策を講じることができ、個々の患者に合わせた適切な治療レジメンの選択が可能となる。
発熱性好中球減少症の発症の有無によるＡ．ｈａｄｒｕｓの菌数の比較を示す図。Ｇｒ．０（グレード０）は発熱性好中球減少症を発症しなかった患者を、Ｇｒ．３（グレード３）は発熱性好中球減少症を発症した患者を示す。ＢａｓｅｌｉｎｅはＤＣＦ療法前を、Ｄａｙ８はＤＣＦ療法１コース８日目を示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。 シンバイオティクス投与群における発熱性好中球減少症の発症の有無によるＡ．ｈａｄｒｕｓの菌数の比較を示す図。Ｇｒ．０（グレード０）は発熱性好中球減少症を発症しなかった患者を、Ｇｒ．３（グレード３）は発熱性好中球減少症を発症した患者を示す。ＢａｓｅｌｉｎｅはＤＣＦ療法前を、Ｄａｙ８はＤＣＦ療法１コース８日目を示す。 下痢の重症度によるＡ．ｈａｄｒｕｓの菌数の比較を示す図。Ｇｒ．０－２（グレード０～２）は下痢の重症度が比較的低かった患者を、Ｇｒ．３－４（グレード３～４）は下痢の重症度が極めて高かった患者を示す。ＢａｓｅｌｉｎｅはＤＣＦ療法前を、Ｄａｙ８はＤＣＦ療法１コース８日目を示す。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。 シンバイオティクス投与群における下痢の重症度によるＡ．ｈａｄｒｕｓの菌数の比較を示す図。Ｇｒ．０－２（グレード０～２）は下痢の重症度が比較的低かった患者を、Ｇｒ．３－４（グレード３～４）は下痢の重症度が極めて高かった患者を示す。ＢａｓｅｌｉｎｅはＤＣＦ療法前を、Ｄａｙ８はＤＣＦ療法１コース８日目を示す。＊ｐ＜０．０５。
　「Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ　ｈａｄｒｕｓ（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｈａｄｒｕｍ）」は、グラム陽性細菌であり、ヒトの腸内細菌の１種である。本明細書において、「Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ　ｈａｄｒｕｓ」は、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ　ｈａｄｒｕｓに属する細菌を意味する。
　本明細書において、「集学的治療」とは、抗がん剤などの薬剤を用いる薬物療法、外科手術などの外科療法、放射線治療、及びこれらの組み合わせを包含する。
　本明細書において、「治療時」には治療中及び治療後を包含する。
　本明細書において、「有害事象」とは、治療中又は治療後に患者に生じる好ましくないもしくは意図しない兆候、症状又は病気のことをいい、該治療との因果関係の有無は問わない。有害事象とその重症度としては、例えば、米国国立がん研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ；ＮＣＩ）が公表する有害事象共通用語基準ｖ４．０（Ｃｏｍｍｏｎ　Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ　Ｃｒｉｔｅｒｉａ　ｆｏｒ　Ａｄｖｅｒｓｅ　Ｅｖｅｎｔｓ（ＣＴＣＡＥ）　ｖ４．０）に含まれる有害事象とそのグレードが挙げられる。
　有害事象の重症度は、ＣＴＣＡＥ　ｖ４．０によれば、以下のグレード１～５又はその一部に分類されている。
　グレード１：軽症；症状がない、又は軽度の症状がある；臨床所見又は検査所見のみ；治療を要さない。
　グレード２：中等症；最小限／局所的／非侵襲的治療を要する；年齢相応の身の回り以外の日常生活動作の制限。
　グレード３：重症又は医学的に重大であるが、ただちに生命を脅かすものではない；入院又は入院期間の延長を要する；活動不能／動作不能；身の回りの日常生活動作の制限。
　グレード４：生命を脅かす；緊急処置を要する。
　グレード５：有害事象による死亡。
　尚、本明細書において、発症なしをグレード０と定義する。
　本明細書において、「有害事象リスク」とは、有害事象発症リスク又は有害事象重症化リスクを指す。
　「有害事象発症リスク」とは、有害事象を発症する可能性をいう。すなわち、ある個体が高リスク群に属するとは、該個体が有害事象を発症する可能性が高いと予想されることを意味し、ある個体が低リスク群に属するとは、該個体が有害事象を発症する可能性が低いと予想されることを意味する。
　また、「有害事象重症化リスク」とは、有害事象が重症化する可能性をいう。すなわち、ある個体が高リスク群に属するとは、該個体が有害事象を発症し、該有害事象が重症化する可能性が高いと予想されることを意味し、ある個体が低リスク群に属するとは、該個体が有害事象を発症する可能性が低いか、該個体が有害事象を発症したとしても該有害事象が重症化する可能性は低いと予想されることを意味する。
　本明細書において、「判定」には、「検出」、「検査」、「測定」、「予測」又は「診断」の概念を包含するが、医師による診断などの医療行為を包含するものではない。
　本発明の集学的治療時の有害事象リスクの判定方法においては、検体中のＡｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ　ｈａｄｒｕｓを指標とする。当該方法は、検体中のＡ．ｈａｄｒｕｓを測定することを含む。具体的には、当該方法は、被験者から採取された検体中のＡ．ｈａｄｒｕｓの菌数を測定することを含む。あるいは、当該方法は、被験者から採取された検体中の総細菌におけるＡ．ｈａｄｒｕｓの占有率を測定することを含む。ここで、検体中の総細菌におけるＡ．ｈａｄｒｕｓの占有率とは、検体中の総菌数に対するＡ．ｈａｄｒｕｓの菌数の割合を意味し、検体が由来する被験者の腸内細菌叢におけるＡ．ｈａｄｒｕｓの占有率に相当する値である。
　被験者は特に限定されないが、集学的治療時の有害事象リスクの判定を必要とするもの、例えば、集学的治療を受ける予定のある患者、集学的治療を受けている患者などが挙げられる。検体としては、被験者由来の生体試料、例えば腸液、糞便などの消化管内容物が挙げられるが、被験者に対する負担が少ない点で糞便が好ましい。
　検体中のＡ．ｈａｄｒｕｓの菌数を測定する手段は、特に限定されないが、好適には、Ａ．ｈａｄｒｕｓの１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に基づいて、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ法、シーケンス法などにより測定する手段が挙げられ、このうちＲＴ－ＰＣＲ法で測定することがより好ましい。
　ここで、ＲＴ－ＰＣＲ法について説明する。ＲＴ－ＰＣＲ法を用いる分析方法は、例えば、（１）検体中の腸内細菌のＲＮＡを抽出する工程、（２）抽出したＲＮＡより逆転写によりｃＤＮＡを合成し、Ａ．ｈａｄｒｕｓ由来のｃＤＮＡにハイブリダイズする核酸断片（プライマー）を用いてＰＣＲを行う工程、及び（３）工程（２）により増幅されたＤＮＡ断片を検出する工程により行うことができる。検体由来の鋳型ｃＤＮＡに上記核酸断片を組み合わせ、増幅反応を行うことにより、Ａ．ｈａｄｒｕｓに特異的なＤＮＡ断片（ＰＣＲ産物）を得ることができる。ＰＣＲ産物を経時的に観察し、一定のＤＮＡ量に達した時のＰＣＲサイクル数を特定することにより、検体中のＡ．ｈａｄｒｕｓの菌数を定量することが可能となる。
　増幅されるＰＣＲ産物の経時的な観察は、ＰＣＲ産物をＳＹＢＲ（登録商標）　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ等のインターカレーター性蛍光色素により標識し、各ＰＣＲ段階での蛍光強度を測定することにより行うことができる。インターカレーター性色素は二本鎖核酸にインターカレーションすることで蛍光強度が増加する性質を有することから、Ａ．ｈａｄｒｕｓのｃＤＮＡからＰＣＲ反応により生成するＰＣＲ産物を正確に測定することができ、特にＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉが好適に用いられる。
　任意に設定された一定の蛍光強度（ＤＮＡ量）に達した時のＰＣＲサイクル数（以下Ｃｑ値とする）を特定することにより、検体中のＡ．ｈａｄｒｕｓの定量が可能となる。また、蛍光色素により標識したＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブやＭｏｌｅｃｕｌｅｒ　Ｂｅａｃｏｎ等を使用することもできる。ＴａｑＭａｎプローブやＭｏｌｅｃｕｌｅｒ　Ｂｅａｃｏｎは、ＰＣＲにより増幅される領域の内部配列と相同性を有するオリゴヌクレオチドに蛍光色素とクエンチャーを結合させたプローブであり、ＰＣＲ反応に共存させて用いる。プローブに結合した蛍光色素とクエンチャーの相互作用でＰＣＲ増幅反応に応じた蛍光を発するため、各ＰＣＲ段階での蛍光強度を測定することにより増幅されるＰＣＲ産物の経時的な観察を行うことができる。
　検体中のＡ．ｈａｄｒｕｓの菌数は、ＤＡＰＩカウント法や培養法等により計測した菌数の対数値とＣｑ値の検量線により求めることができる。すなわち、Ａ．ｈａｄｒｕｓの菌数の対数値を横軸に、Ｃｑ値を縦軸にプロットした検量線を予め作成し、ＰＣＲ反応の結果得られたＣｑ値を該検量線に適用して、検体中のＡ．ｈａｄｒｕｓの菌数の測定を行う。
　検体中のＡ．ｈａｄｒｕｓの菌数の測定にあたっては、上記ＰＣＲ反応において、Ａ．ｈａｄｒｕｓの１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子上のＡ．ｈａｄｒｕｓ種内で保存されており、Ａ．ｈａｄｒｕｓ以外の種では保存されていない領域に特異的にハイブリダイズし、増幅することができるプライマーを用いればよい。Ａ．ｈａｄｒｕｓの菌数測定のためのプライマーとしては、これらに限定されるものではないが、例えば、配列番号３及び４のプライマーを用いることができる。
　検体中の総細菌におけるＡ．ｈａｄｒｕｓの占有率を測定する手段は、特に限定されないが、好適には、腸内細菌の１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に基づいて、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ法、シーケンス法などにより測定する手段が挙げられ、このうちシーケンス法（例えば、１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子アンプリコン解析）で測定することがより好ましい。
　ここで、１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子アンプリコン解析について説明する。１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子アンプリコン解析は、例えば、（１）検体中の腸内細菌のゲノムＤＮＡを抽出する工程、（２）抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、腸内細菌の１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子にハイブリダイズする核酸断片（プライマー）を用いてＰＣＲを行う工程、（３）工程（２）により増幅されたＤＮＡ断片の塩基配列を決定する工程、及び（４）工程（３）により得られたシーケンスデータを解析する工程により行うことができる。検体由来の鋳型ゲノムＤＮＡに上記核酸断片を組み合わせ、増幅反応を行うことにより、腸内細菌の１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子由来のＤＮＡ断片（ＰＣＲ産物）を得ることができる。さらに、ＰＣＲ産物の配列決定を行い、エラー配列を除去した後、シーケンスデータをアンプリコンシーケンスバリアント（ａｍｐｌｉｃｏｎ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｖａｒｉａｎｔ；ＡＳＶ）として纏め、公知のデータベースと照会して各ＡＳＶに系統情報をアサインすることにより、検体に含まれる腸内細菌の種類と存在比を解析できる。得られた情報を基に、総腸内細菌に対するＡ．ｈａｄｒｕｓの占有率を算出することが可能となる。
　上記ＰＣＲで増幅される腸内細菌の１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子の領域は、菌種間で普遍的に保存されている保存領域にハイブリダイズするプライマーを用いて増幅される領域であって、該領域内に菌種間で保存されていない変化に富む可変領域を含む領域であることが好ましい。該可変領域としては、１６ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子のＶ１～Ｖ９領域の少なくとも１つの領域が挙げられ、好ましくはＶ１及びＶ２を含む領域又はＶ３及びＶ４を含む領域である。該プライマーには、必要に応じて、シーケンスのためのアダプター配列及び／又はサンプル識別のためのインデックス配列を含んでいてもよい。斯かるプライマーとしては、本分野で通常用いられる細菌の１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子増幅用のユニバーサルプライマーが挙げられ、例えば、配列番号１及び２のプライマーを用いることができる。
　増幅されたＰＣＲ産物の塩基配列は、公知の方法により決定することができるが、次世代シーケンサー、例えば、ＭｉＳｅｑ　ｐｌａｔｆｏｒｍ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）などを用いることで迅速に配列決定することができる。シーケンスデータの解析は、ＱＩＩＭＥ２（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　Ｉｎｓｉｇｈｔｓ　Ｉｎｔｏ　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｅｃｏｌｏｇｙ　２）などの解析ソフトを用いて行うことができ、シーケンスエラーは、ＱＩＩＭＥ２のＤＡＤＡ２（Ｄｉｖｉｓｉｖｅ　Ａｍｐｌｉｃｏｎ　Ｄｅｎｏｉｓｉｎｇ　Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ　２）プラグインなどを用いて除去することができる。取得されたシーケンスデータは、配列同一性に基づいてＡＳＶに分類し、ＳＩＬＶＡ、Ｇｒｅｅｎｇｅｎｅｓなどの公知のデータベースを参照して各ＡＳＶの菌種への帰属を決定することができる。斯くして決定された各ＡＳＶの菌種とそのシーケンスリード数に対応する存在比から、総腸内細菌に対するＡ．ｈａｄｒｕｓの占有率を算出することができる。
　後記実施例に示すように、食道がん患者に対するドセタキセル、シスプラチン及び５－フルオロウラシルの３剤併用療法（ＤＣＦ療法）施行後の腸内細菌叢におけるＡ．ｈａｄｒｕｓの占有率と、発熱性好中球減少症の重症度又は下痢の重症度との間に有意な負の相関が認められた（表２）。
　また、ＤＣＦ療法施行中に発熱性好中球減少症を発症しなかった患者では、発熱性好中球減少症を発症した患者に比して、治療前後ともにＡ．ｈａｄｒｕｓの菌数が有意に高値を示した（図１）。ＤＣＦ療法に加え、シンバイオティクス療法を受けた群のみの解析でも、該療法施行中に発熱性好中球減少症を発症しなかった患者では、発熱性好中球減少症を発症した患者に比して、治療前後ともにＡ．ｈａｄｒｕｓの菌数が高い傾向がみられた（図２）。ここで、シンバイオティクス療法は、ＤＣＦ療法による発熱性好中球減少症や重篤な下痢を顕著に軽減することが報告されており（非特許文献１）、プロバイオティクスとしてＬａｃｔｉｃａｓｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐａｒａｃａｓｅｉ　ｓｔｒａｉｎ　Ｓｈｉｒｏｔａ（ＬｃＳ）とＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｒｅｖｅ　ｓｔｒａｉｎ　Ｙａｋｕｌｔ（ＢｂｒＹ）（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｒｅｖｅ　ＹＩＴ　１２２７２（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１３２０））とを、プレバイオティクスとしてガラクトオリゴ糖を用いるものである。尚、ＬｃＳは、２０２０年のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌の再分類（Zheng J et al. Int J Syst Evol Microbiol. 2020 Apr; 70(4): 2782-2858）以前には、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃａｓｅｉ　ＹＩＴ９０２９（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１３６６）として知られていた菌株であり、昭和５６年１月１２日、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（現在は、独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センター）に寄託されている。ロジスティック解析の結果から、ＤＣＦ療法前のＡ．ｈａｄｒｕｓの菌数及び占有率の低さは、発熱性好中球減少症発症のリスク因子となることが示唆された。
　さらに、ＤＣＦ療法施行中に下痢を発症しなかった又は下痢の重症度が低かった患者（ベースラインと比べて排便回数増加が６回／日以下）では、極めて重度の下痢を発症した患者（ベースラインと比べて７回以上／日の排便回数増加、便失禁あり、入院もしくは緊急処置を要する）に比して、治療前後ともにＡ．ｈａｄｒｕｓの菌数が有意に高値を示した（図３）。ＤＣＦ療法に加え、シンバイオティクス療法を受けた群のみの解析でも、該療法施行中に下痢を発症しなかった又は下痢の重症度が低かった患者では、極めて重度の下痢を発症した患者に比して、治療前後ともにＡ．ｈａｄｒｕｓの菌数が高い傾向がみられた（図４）。ロジスティック解析の結果から、ＤＣＦ療法前のＡ．ｈａｄｒｕｓの菌数及び占有率の低さは、下痢重症化のリスク因子となることが示唆された。
　一方、ＤＣＦ療法のような薬物療法だけでなく、外科療法、放射線治療、及びこれらの組み合わせを含む集学的治療では、一般的に消化管粘膜、特に腸管粘膜が障害を受ける。さらに、宿主の免疫機能のダメージも伴って、腸内の細菌が生体内に移行する、いわゆるバクテリアルトランスロケーションが生じる。このことが、有害事象の原因となることや、感染性合併症の原因になることが知られている。
　したがって、検体中のＡ．ｈａｄｒｕｓは、ＤＣＦ療法のような薬物療法時だけでなく集学的治療時における有害事象リスクの判定のための指標として使用することができる。
　集学的治療としては、薬物療法、外科療法、放射線治療、及びこれらの組み合わせが包含され、好ましくは薬物療法であり、より好ましくは抗がん剤を用いる薬物療法であり、さらに好ましくはドセタキセル、シスプラチン、及び５－フルオロウラシルを用いる薬物療法（ＤＣＦ療法）である。ＤＣＦ療法は、食道がんに対する治療法の１つとして知られている。
　また、リスク判定対象となる有害事象は、特に限定されず、例えば、血液及びリンパ系障害、心臓障害、耳及び迷路障害、内分泌障害、眼障害、胃腸障害、一般・全身障害及び投与部位の障害、肝胆道系障害、免疫系障害、代謝及び栄養障害、筋骨格系及び結合組織障害、神経系障害、精神障害、腎及び尿路障害、生殖系及び乳房障害、呼吸器、胸郭及び縦隔障害、皮膚及び皮下組織障害、血管障害などが挙げられる。本発明の方法は、有害事象として血液及びリンパ系障害並びに胃腸障害からなる群より選択される少なくとも１種のリスク判定に好適に用いられ、具体的には、発熱性好中球減少症及び下痢からなる群より選択される少なくとも１種のリスク判定、つまり、発熱性好中球減少症リスク及び下痢リスクからなる群より選択される少なくとも1種のリスク判定により好適に用いられる。
　発熱性好中球減少症の重症度は、ＣＴＣＡＥ　ｖ４．０によれば、以下のグレードに分類されている。
　グレード１：－（定義なし）
　グレード２：－（定義なし）
　グレード３：好中球絶対数＜１，０００／ｍｍ3で、かつ１回でも３８．３℃を超える、又は１時間を超えて持続する３８．０℃以上の発熱。
　グレード４：生命を脅かす；緊急処置を要する。
　グレード５：死亡
　また、下痢の重症度は、ＣＴＣＡＥ　ｖ４．０によれば、以下のグレードに分類されている。なお、ベースラインとは日常生活における排便習慣（排便回数）をさす。
　グレード１：ベースラインと比べて＜４回／日の排便回数増加；ベースラインと比べて人工肛門からの排泄量が軽度に増加。
　グレード２：ベースラインと比べて４～６回／日の排便回数増加；ベースラインと比べて人工肛門からの排泄量が中等度増加。
　グレード３：ベースラインと比べて７回以上／日の排便回数増加；便失禁；入院を要する；ベースラインと比べて人工肛門からの排泄量が高度に増加；身の回りの日常生活動作の制限。
　グレード４：生命を脅かす；緊急処置を要する。
　グレード５：死亡
　本発明の方法において、集学的治療時の有害事象リスクは、検体中のＡ．ｈａｄｒｕｓの菌数を指標として判定すればよい。具体的には、検体中のＡ．ｈａｄｒｕｓの菌数が少ないほど集学的治療時の有害事象リスクが高く、検体中のＡ．ｈａｄｒｕｓの菌数が多いほど集学的治療時の有害事象リスクが低いと判定することができる。斯かるリスク判定は、検体中のＡ．ｈａｄｒｕｓの菌数を、リスクの高低の段階に応じて予め設定した基準値（カットオフ値）と比較することによって行うのが好ましい。基準値は、例えば、予めＡ．ｈａｄｒｕｓの菌数を確認した複数の被験者について、集学的治療時の有害事象の発症の有無及び／又は重症化の程度を追跡調査した結果を、統計学的解析手法を用いて解析することにより設定することができる。統計学的解析手法の例としては、受信者動作特性（ＲＯＣ）分析等が挙げられ、例えば、有害事象高リスク群を識別可能な値を基準値とすることができる。検体中のＡ．ｈａｄｒｕｓの菌数が該基準値以下の場合に、集学的治療時の有害事象リスクが高いと判定できる。一方、検体中のＡ．ｈａｄｒｕｓの菌数が該基準値より多い場合に、集学的治療時の有害事象リスクが低いと判定できる。
　本発明の方法において、集学的治療時の有害事象の発症リスクは、検体中のＡ．ｈａｄｒｕｓの菌数を指標として判定すればよい。具体的には、検体中のＡ．ｈａｄｒｕｓの菌数が少ないほど集学的治療時の有害事象発症リスクが高く、検体中のＡ．ｈａｄｒｕｓの菌数が多いほど集学的治療時の有害事象発症リスクが低いと判定することができる。斯かるリスク判定は、検体中のＡ．ｈａｄｒｕｓの菌数を、リスクの高低の段階に応じて予め設定した基準値と比較することによって行うのが好ましい。基準値は、上記のように当業者が適宜設定できる。検体中のＡ．ｈａｄｒｕｓの菌数が該基準値以下の場合に、集学的治療時の有害事象発症リスクが高いと判定できる。一方、検体中のＡ．ｈａｄｒｕｓの菌数が該基準値より多い場合に、集学的治療時の有害事象発症リスクが低いと判定できる。一例において、有害事象が発熱性好中球減少症であれば、検体中のＡ．ｈａｄｒｕｓの菌数が、検体１ｇあたり、１０7.7個以下の場合に、集学的治療時の発熱性好中球減少症発症リスクが高いと判定でき、検体中のＡ．ｈａｄｒｕｓの菌数が、検体１ｇあたり、１０7.7個より多い場合に、集学的治療時の発熱性好中球減少症発症リスクが低いと判定できる。別の一例において、有害事象が下痢であれば、検体中のＡ．ｈａｄｒｕｓの菌数が、検体１ｇあたり、１０7.6個以下の場合に、集学的治療時の下痢発症リスクが高いと判定でき、検体中のＡ．ｈａｄｒｕｓの菌数が、検体１ｇあたり、１０7.6個より多い場合に、集学的治療時の下痢発症リスクが低いと判定できる。集学的治療時の有害事象の発症リスクの判定は、有害事象が発熱性好中球減少症の場合に特に好適に適用される。
　また、本発明の方法において、集学的治療時の有害事象の重症化リスクは、検体中のＡ．ｈａｄｒｕｓの菌数を指標として判定すればよい。具体的には、検体中のＡ．ｈａｄｒｕｓの菌数が少ないほど集学的治療時の有害事象重症化リスクが高く、検体中のＡ．ｈａｄｒｕｓの菌数が多いほど集学的治療時の有害事象重症化リスクが低いと判定することができる。斯かるリスク判定は、検体中のＡ．ｈａｄｒｕｓの菌数を、リスクの高低の段階に応じて予め設定した基準値と比較することによって行うのが好ましい。基準値は、上記のように当業者が適宜設定できる。検体中のＡ．ｈａｄｒｕｓの菌数が該基準値以下の場合に、集学的治療時の有害事象重症化リスクが高いと判定できる。一方、検体中のＡ．ｈａｄｒｕｓの菌数が該基準値より多い場合に、集学的治療時の有害事象重症化リスクが低いと判定できる。一例において、有害事象が発熱性好中球減少症であれば、検体中のＡ．ｈａｄｒｕｓの菌数が、検体１ｇあたり、１０7.7個以下の場合に、集学的治療時の発熱性好中球減少症重症化リスクが高いと判定でき、検体中のＡ．ｈａｄｒｕｓの菌数が、検体１ｇあたり、１０7.7個より多い場合に、集学的治療時の発熱性好中球減少症重症化リスクが低いと判定できる。より具体的には、検体中のＡ．ｈａｄｒｕｓの菌数が、検体１ｇあたり、１０7.7個以下の場合に、集学的治療時の発熱性好中球減少症が上記グレード３相当となる可能性が高いと判定でき、検体中のＡ．ｈａｄｒｕｓの菌数が、検体１ｇあたり、１０7.7個より多い場合に、集学的治療時の発熱性好中球減少症が上記グレード０相当となる可能性が高いと判定できる。別の一例において、有害事象が下痢であれば、検体中のＡ．ｈａｄｒｕｓの菌数が、検体１ｇあたり、１０7.6個以下の場合に、集学的治療時の下痢重症化リスクが高いと判定でき、検体中のＡ．ｈａｄｒｕｓの菌数が検体１ｇあたり、１０7.6個より多い場合に、集学的治療時の下痢重症化リスクが低いと判定できる。より具体的には、検体中のＡ．ｈａｄｒｕｓの菌数が検体１ｇあたり、１０7.6個以下の場合に、集学的治療時の下痢が上記グレード３以上相当、例えばグレード３～４相当となる可能性が高いと判定でき、検体中のＡ．ｈａｄｒｕｓの菌数が検体１ｇあたり、１０7.6個より多い場合に、集学的治療時の下痢が上記グレード０～２相当となる可能性が高いと判定できる。有害事象の重症化リスクの判定は、有害事象が下痢の場合に特に好適に適用される。
　あるいは、本発明の方法において、集学的治療時の有害事象リスクは、検体中の総細菌におけるＡ．ｈａｄｒｕｓの占有率を指標として判定してもよい。具体的には、検体中の総細菌におけるＡ．ｈａｄｒｕｓの占有率が低いほど集学的治療時の有害事象リスクが高く、検体中の総細菌におけるＡ．ｈａｄｒｕｓの占有率が高いほど集学的治療時の有害事象リスクが低いと判定することができる。斯かるリスク判定は、検体中の総細菌におけるＡ．ｈａｄｒｕｓの占有率を、リスクの高低の段階に応じて予め設定した基準値と比較することによって行うのが好ましい。基準値は、例えば、予め総細菌におけるＡ．ｈａｄｒｕｓの占有率を確認した複数の被験者について、集学的治療時の有害事象の発症の有無及び／又は重症化の程度を追跡調査した結果を、統計学的解析手法を用いて解析することにより設定することができる。統計学的解析手法の例としては、受信者動作特性（ＲＯＣ）分析等が挙げられ、例えば、有害事象高リスク群を識別可能な値を基準値とすることができる。検体中の総細菌におけるＡ．ｈａｄｒｕｓの占有率が該基準値以下の場合に、集学的治療時の有害事象リスクが高いと判定できる。一方、検体中の総細菌におけるＡ．ｈａｄｒｕｓの占有率が該基準値より高い場合に、集学的治療時の有害事象リスクが低いと判定できる。
　本発明の方法において、集学的治療時の有害事象の発症リスクは、検体中の総細菌におけるＡ．ｈａｄｒｕｓの占有率を指標として判定すればよい。具体的には、検体中の総細菌におけるＡ．ｈａｄｒｕｓの占有率が低いほど集学的治療時の有害事象発症リスクが高く、検体中の総細菌におけるＡ．ｈａｄｒｕｓの占有率が高いほど集学的治療時の有害事象発症リスクが低いと判定することができる。斯かるリスク判定は、検体中の総細菌におけるＡ．ｈａｄｒｕｓの占有率を、リスクの高低の段階に応じて予め設定した基準値と比較することによって行うのが好ましい。基準値は、上記のように当業者が適宜設定できる。検体中の総細菌におけるＡ．ｈａｄｒｕｓの占有率が該基準値以下の場合に、集学的治療時の有害事象発症リスクが高いと判定できる。一方、検体中の総細菌におけるＡ．ｈａｄｒｕｓの占有率が該基準値より高い場合に、集学的治療時の有害事象発症リスクが低いと判定できる。一例において、有害事象が発熱性好中球減少症であれば、検体中の総細菌におけるＡ．ｈａｄｒｕｓの占有率が０．２５％以下の場合に、集学的治療時の発熱性好中球減少症発症リスクが高く、検体中の総細菌におけるＡ．ｈａｄｒｕｓの占有率が０．２５％より高い場合に、集学的治療時の発熱性好中球減少症発症リスクが低いと判定できる。別の一例において、有害事象が下痢であれば、検体中の総細菌におけるＡ．ｈａｄｒｕｓの占有率が０．０８４％以下の場合に、集学的治療時の下痢発症リスクが高く、検体中の総細菌におけるＡ．ｈａｄｒｕｓの占有率が０．０８４％より高い場合に、集学的治療時の下痢発症リスクが低いと判定できる。集学的治療時の有害事象の発症リスクの判定は、有害事象が発熱性好中球減少症の場合に特に好適に適用される。
　また、本発明の方法において、集学的治療時の有害事象の重症化リスクは、検体中の総細菌におけるＡ．ｈａｄｒｕｓの占有率を指標として判定すればよい。具体的には、検体中の総細菌におけるＡ．ｈａｄｒｕｓの占有率が低いほど集学的治療時の有害事象重症化リスクが高く、検体中の総細菌におけるＡ．ｈａｄｒｕｓの占有率が高いほど集学的治療時の有害事象重症化リスクが低いと判定することができる。斯かるリスク判定は、検体中の総細菌におけるＡ．ｈａｄｒｕｓの占有率を、リスクの高低の段階に応じて予め設定した基準値と比較することによって行うのが好ましい。基準値は、上記のように当業者が適宜設定できる。検体中の総細菌におけるＡ．ｈａｄｒｕｓの占有率が該基準値以下の場合に、集学的治療時の有害事象重症化リスクが高いと判定できる。一方、検体中の総細菌におけるＡ．ｈａｄｒｕｓの占有率が該基準値より高い場合に、集学的治療時の有害事象重症化リスクが低いと判定できる。一例において、有害事象が発熱性好中球減少症であれば、検体中の総細菌におけるＡ．ｈａｄｒｕｓの占有率が０．２５％以下の場合に、集学的治療時の発熱性好中球減少症重症化リスクが高いと判定でき、検体中の総細菌におけるＡ．ｈａｄｒｕｓの占有率が０．２５％より高い場合に、集学的治療時の発熱性好中球減少症重症化リスクが低いと判定できる。より具体的には、検体中の総細菌におけるＡ．ｈａｄｒｕｓの占有率が０．２５％以下の場合に、集学的治療時の発熱性好中球減少症が上記グレード３相当となる可能性が高いと判定でき、検体中の総細菌におけるＡ．ｈａｄｒｕｓの占有率が０．２５％より高い場合に、集学的治療時の発熱性好中球減少症が上記グレード０相当となる可能性が高いと判定できる。別の一例において、有害事象が下痢であれば、検体中の総細菌におけるＡ．ｈａｄｒｕｓの占有率が０．０８４％以下の場合に、集学的治療時の下痢重症化リスクが高いと判定でき、検体中の総細菌におけるＡ．ｈａｄｒｕｓの占有率が０．０８４％より高い場合に、集学的治療時の下痢重症化リスクが低いと判定できる。より具体的には、検体中の総細菌におけるＡ．ｈａｄｒｕｓの占有率が０．０８４％以下の場合に、集学的治療時の下痢が上記グレード３以上相当、例えばグレード３～４相当となる可能性が高いと判定でき、検体中の総細菌におけるＡ．ｈａｄｒｕｓの占有率が０．０８４％より高い場合に、集学的治療時の下痢が上記グレード０～２相当となる可能性が高いと判定できる。有害事象の重症化リスクの判定は、有害事象が下痢の場合に特に好適に適用される。
　本発明の方法は、集学的治療前又は集学的治療初期（例えば複数コースを含む集学的治療の１コース中又は１コース終了後）に実施することが好ましく、集学的治療前に実施するのがより好ましい。
　本発明の方法によれば、集学的治療時の有害事象リスクを早期に、特に治療前に判定できるので、個々の患者に対してより適切な治療計画を立てることが可能となり、ひいては患者の生活の質や治療効果の向上につながる。
　本発明の方法により、集学的治療時の有害事象リスクが低いと判定された患者に対しては、予定されている集学的治療を実施することができ、集学的治療時の有害事象リスクが高いと判定された患者に対しては、薬剤量の低減や、シンバイオティクスの併用等の有害事象の予防又は軽減のための処置を行うことができる。
　本発明の方法を実施するには、検体中のＡ．ｈａｄｒｕｓを測定するためのプロトコールを含むキットを用いるのが好ましい。当該キットには、Ａ．ｈａｄｒｕｓの測定試薬及びプロトコール（Ａ．ｈａｄｒｕｓの測定方法、集学的治療時の有害事象リスクを判定するための基準、測定結果に影響を与える要因とその影響の程度等が記載されたもの）が含まれる。当該基準を用いて前記方法のように判定することができる。ここで、Ａ．ｈａｄｒｕｓの測定試薬としては、前述の腸内細菌数測定用試薬、ＲＮＡ検出用試薬、ＤＮＡ検出用試薬、Ａ．ｈａｄｒｕｓを特異的に検出できるプライマー、腸内細菌を検出できるプライマー等が挙げられる。
　さらに上記より、Ａ．ｈａｄｒｕｓの菌数又は占有率の変動、好ましくは菌数の変動を指標とすれば、集学的治療時の有害事象リスクの低減剤がスクリーニングできると考えられる。ここで、指標とする「菌数の変動」とは、被検物質を投与した後にＡ．ｈａｄｒｕｓの菌数が増加した場合、投与前後を対比してＡ．ｈａｄｒｕｓの菌数の増加が促進された場合、投与前後を対比してＡ．ｈａｄｒｕｓの菌数の低下が抑制された場合を含む概念である。すなわち、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ又はｉｎ　ｖｉｖｏにおいてＡ．ｈａｄｒｕｓの菌数を増加させた、菌数の増加を促進した、菌数の低下を抑制した被検物質は、集学的治療時の有害事象リスク低減作用を有するものと判断する。また、指標とする「占有率の変動」とは、被検物質を投与した後にＡ．ｈａｄｒｕｓの占有率が増加した場合、投与前後を対比してＡ．ｈａｄｒｕｓの占有率の増加が促進された場合、投与前後を対比してＡ．ｈａｄｒｕｓの占有率の低下が抑制された場合を含む概念である。すなわち、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ又はｉｎ　ｖｉｖｏにおいてＡ．ｈａｄｒｕｓの占有率を増加させた、占有率の増加を促進した、占有率の低下を抑制した被検物質は、集学的治療時の有害事象リスク低減作用を有するものと判断する。
　例えば、ヒトや、マウス、ラット又はウサギ等の実験動物に被検物質を投与して、未投与のヒトや実験動物と比較し、当該被検物質が検体中のＡ．ｈａｄｒｕｓの菌数又は占有率を変動させるか否かを判定する。当該被検物質がＡ．ｈａｄｒｕｓの菌数を増加させた、菌数の増加を促進した、菌数の低下を抑制した物質と判定された際には、当該被検物質を集学的治療時の有害事象リスクの低減剤として利用できる。あるいは、当該被検物質がＡ．ｈａｄｒｕｓの占有率を増加させた、占有率の増加を促進した、占有率の低下を抑制した物質と判定された際には、当該被検物質を集学的治療時の有害事象リスクの低減剤として利用できる。
　次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は何らこれらに限定されるものではない。
実施例１
１．方法
（１）解析対象
　術前化学療法が予定されている２０歳から８０歳までの食道がん患者８１名が試験に登録された。そのうち、登録時、及びＤＣＦ療法開始後８日目ともに糞便が採取された７３名（予防的抗生剤投与群３８名、シンバイオティクス投与群３５名）を解析対象とした。本試験に参加した全ての患者から、参加前に同意書による試験参加の同意を得た。
（２）治療
　ＤＣＦ療法は、ドセタキセル　７０ｍｇ／ｍ2とシスプラチン　７０ｍｇ／ｍ2をＤａｙ１に点滴で、５－フルオロウラシル　７００ｍｇ／ｍ2をＤａｙ１からＤａｙ５に持続点滴で投与した。基本的に、化学療法は３週間間隔を空けて２コース行った。予防的抗生剤投与群の患者は、化学療法各コースのＤａｙ５からＤａｙ１５まで、レボフロキサシン　５００ｍｇを１日１回内服した。シンバイオティクス投与群の患者は、化学療法各コースの開始３日前からＤａｙ１２まで、ラコールＮＦ配合経腸用液（株式会社大塚製薬工場）を１日６００ｍＬに加えて、化学療法１コース開始３日前から化学療法終了まで、プロバイオティクスとしてＬａｃｔｉｃａｓｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐａｒａｃａｓｅｉ　ｓｔｒａｉｎ　Ｓｈｉｒｏｔａ（Ｌａｃｔｉｃａｓｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐａｒａｃａｓｅｉ　ＹＩＴ ９０２９：ＬｃＳ）（２０２０年のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌の再分類以前のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃａｓｅｉ　ＹＩＴ ９０２９（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１３６６））とＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｒｅｖｅ　ｓｔｒａｉｎ　Ｙａｋｕｌｔ（ＢｂｒＹ）（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｒｅｖｅ　ＹＩＴ １２２７２（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１３２０））の生菌をそれぞれ３×１０8ｃｅｌｌｓ以上含むヤクルトＢＬ整腸薬（株式会社ヤクルト本社）を１日３ｇ、プレバイオティクスとしてオリゴメイトＳ－ＨＰ（ヤクルト薬品工業株式会社）を１日１５ｍＬ（ガラクトオリゴ糖を５ｇ含む）内服した。
（３）化学療法由来の毒性の評価
　化学療法の有害事象である発熱性好中球減少症及び下痢の毒性は、米国国立がん研究所（ＮＣＩ）が公表する有害事象共通用語基準ｖ４．０（ＣＴＣＡＥ　ｖ４．０）のクライテリアを用いて評価した。
（４）糞便検体の採取
　試験登録時及び化学療法１コース目のＤａｙ８に、約１．０ｇの新鮮便を２ｍＬのＲＮＡｌａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ）とφ５ｍｍジルコニアビーズを入れた予め秤量済みのチューブに採取スプーンにて採取した。振とうして懸濁した後、その後の操作まで４℃で保存した。核酸抽出に用いる糞便サンプルの一次処理は以下の方法で行った。糞便サンプルの重量を測定した後、１０倍容になるようにＲＮＡＬａｔｅｒを添加した。これをＳｈａｋｅＭａｓｔｅｒ　Ａｕｔｏ（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて１，０４８ｒｐｍで１０分間振とうした。ＲＮＡ抽出用として、４０μＬの糞便懸濁液を１ｍＬ　ＰＢＳが添加された新たな２ｍＬチューブに移し、遠心分離（４℃，１３，０００×ｇ，５分間）した後、デカンテーションにより上清を除去した。このペレットをＲＮＡ抽出まで－８０℃で保存した。ＤＮＡ抽出用として、２００μＬの懸濁液を１ｍＬのＰＢＳが添加された新たな２ｍＬチューブに移し、ボルテックスで攪拌した。これを遠心分離（４℃，１３，０００×ｇ，５分間）した後、上清１ｍＬを除いた。再度１ｍＬのＰＢＳを添加し、懸濁、遠心分離（４℃，１３，０００×ｇ，５分間）した後、上清１ｍＬを除いた。得られた２００μＬの懸濁液をＤＮＡ抽出まで－３０℃で保存した。
（５）次世代シーケンサーによる１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子アンプリコン解析
　糞便サンプルからのＤＮＡの抽出はＱＩＡａｍｐ　ＤＮＡ　Ｓｔｏｏｌ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ　ＧｍｂＨ）を用いて、マニュアルに従って行った。１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子アンプリコン解析は以下のようにして行った。各サンプルの１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子のＶ１－Ｖ２領域を２７Ｆｍｏｄ２フォワードプライマー及び３３８Ｒリバースプライマー（配列番号１及び２）を用いて、ＡＢＩ　７５００　Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により増幅した。ＰＣＲ反応液（５０μＬ）として、２×ＳＹＢＲ　Ｐｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　Ｔａｑ　ＩＩ（５０μＬ，Ｔａｋａｒａ　Ｂｉｏ）、Ｎｕｃｌｅａｓｅ－Ｆｒｅｅ　Ｗａｔｅｒ（２２μＬ）、各プライマー（１００ｎＭ，１μＬ）、及び鋳型ＤＮＡ（１０ｎｇ／ｍＬ，１μＬ）を混合した。ＰＣＲ反応は９５℃で３０秒加熱して初期変性した後、９５℃で５秒、５５℃で３０秒、７２℃で４０秒を２５サイクルの条件で行った。増幅産物をＡＭＰｕｒｅ　ＸＰ　Ｋｉｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）で精製し、Ｑｕａｎｔ－ｉＴ　ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ　ｄｓＤＮＡ　Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で定量した。各々のサンプル中の増幅産物を等量となるように混合してライブラリーを作製し、ＭｉＳｅｑ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔｓ　ｖ２（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて、ＭｉＳｅｑ　ｐｌａｔｆｏｒｍ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）でシーケンスを行った。結果として、２，６２１，４７６のアンプリコンシーケンスリード（サンプル当たり９，１５８～３６，００３リード）が得られた。
（６）１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子シーケンスデータの処理
　シーケンスデータの処理にはＱＩＩＭＥ２（ｖｅｒ．２０１９．１０，https://qiime2.org/）を用いた。ＤＡＤＡ２プラグインを用いてシーケンスデータのクオリティコントロールを実施した後、シーケンスデータをＡＳＶ（ａｍｐｌｉｃｏｎ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｖａｒｉａｎｔ）へと纏め、被験者ごとの各ＡＳＶの占有率を算出した。系統情報のアサインにはＳＩＬＶＡ　１３８　ｄａｔａｂａｓｅ（https://www.arb-silva.de/）をデータベースとして使用した。
（７）Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ　ｈａｄｒｕｓ種特異的プライマーの設計と検証
　ＤＤＢＪ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ　ｄａｔａｂａｓｅより得た１６Ｓ　ｒＲＮＡ配列を用いて、Ａ．ｈａｄｒｕｓ及び近縁種のマルチプルアラインメントをＣｌｕｓｔａｌＸにより構築した。このアラインメントに基づき、Ｐｒｉｍｅｒ３ｐｌｕｓ　ｓｏｆｔｗａｒｅ（http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi）を用いてＡ．ｈａｄｒｕｓの１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子に特異的なＡＨ７Ｆフォワードプライマー及びＡＨ１Ｒリバースプライマーからなるプライマーセット（配列番号３及び４）を設計した。該プライマーセットを用いて、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ　１２Ｋ　Ｆｌｅｘ　Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ）により、培養したＡ．ｈａｄｒｕｓより抽出したＲＮＡを鋳型として定量的ＲＴ－ＰＣＲを行った。定量的ＲＴ－ＰＣＲにはＱｉａｇｅｎ　ＯｎｅＳｔｅｐ　ＲＴ－ＰＣＲ　ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いた。ＰＣＲ反応液（１０μＬ）として、１×Ｑｉａｇｅｎ　Ｏｎｅｓｔｅｐ　ＲＴ―ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ（２μＬ）、０．５×Ｑ－ｓｏｌｕｔｉｏｎ（２μＬ）、ｄＮＴＰ　Ｍｉｘｔｕｒｅ（各々４００μＭ）、１００，０００倍希釈したＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ）、Ｑｉａｇｅｎ　ＯｎｅＳｔｅｐ　ＲＴ－ＰＣＲ　ｅｎｚｙｍｅ　ｍｉｘ（０．４μＬ）、ＡＨ７Ｆフォワードプライマー及びＡＨ１Ｒリバースプライマー（０．６μＭ）、鋳型ＲＮＡ（５μＬ）を混合した。ＲＴ－ＰＣＲ反応は５０℃で３０分加熱して逆転写反応を行い、９５℃で１５分加熱して初期変性し、９４℃で５秒、５５℃で３０秒、７２℃で５０秒を４０サイクルの条件で行った結果、Ａ．ｈａｄｒｕｓの基準株であるＹＩＴ１００９２T（ＤＳＭ３３１９T）から抽出したＲＮＡを用いた際に増幅産物が得られることを確認した。また、Ｐｒｉｍｅｒ－Ｂｌａｓｔ　ｐｒｏｇｒａｍ（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）を用いて、設計したプライマーによる非特異的な増幅産物が既存のデータベース中に存在しないことを確認した。さらに、設計したプライマーの特異性をＹａｋｕｌｔ　Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　Ｆｌｏｒａ－ＳＣＡＮ（ＹＩＦ－ＳＣＡＮ（登録商標））の標準菌株である腸内細菌叢の主要構成細菌２３種から抽出したＲＮＡ（１０5ｃｅｌｌｓ相当）を用いて上記の条件で定量的ＲＴ－ＰＣＲを実施して検証した結果、いずれの菌種にも交差性を示さないことを確認した。
（８）ＲＴ－ｑＰＣＲによるＡ．ｈａｄｒｕｓの菌数の定量
　糞便サンプルからのｔｏｔａｌ　ＲＮＡの抽出は、ＡＧＰＣ（ａｃｉｄ　ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ　ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ－ｐｈｅｎｏｌ－ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）法を改良して行った。解凍したサンプルを３４６．５μＬのＲＬＴ　Ｂｕｆｆｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）、３．５μＬのβ―ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、および１００μＬのＴｒｉｓ－ＥＤＴＡ　ｂｕｆｆｅｒを混合した溶液に再懸濁した。ガラスビーズ（０．１ｍｍ，３００ｍｇ，ＢｉｏＳｐｅｃ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を加えて、ＳｈａｋｅＭａｓｔｅｒ　Ａｕｔｏ（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて１，０４８ｒｐｍで５分間振とうした。水飽和フェノール（５００μＬ）を加えて、６０℃で１０分インキュベーションした後、ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ－ｉｓｏａｍｙｌ　ａｌｃｏｈｏｌ（２４：１，１００μＬ）を加えて攪拌し、遠心分離（４℃，１４，０００×ｇ，５分間）した。上清４７０μＬを分取し、同量のｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ－ｉｓｏａｍｙｌ　ａｌｃｈｏｌ（２４：１）を加えて攪拌した。上清４００μＬを分取し、イソプロパノール沈殿によりＲＮＡを沈殿させて回収した後、２００μＬのｎｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ）に溶解した。サンプル中のＡ．ｈａｄｒｕｓの定量には、定量的ＲＴ－ＰＣＲ法（ＲＴ－ｑＰＣＲ）を基本原理とするＹＩＦ－ＳＣＡＮ（登録商標）を用いた。ＲＴ－ｑＰＣＲには、上述のＡ．ｈａｄｒｕｓに対する１６Ｓ　ｒＲＮＡを標的とした菌種特異的プライマー（配列番号３及び４）と反応条件を用いた。アッセイの線形範囲のｔｈｒｅｓｈｏｌｄ　ｃｙｃｌｅ（Ｃｑ）値を標準曲線に代入して、各サンプル中の対応する菌数を求めた。ここから、各サンプル中の菌数を決定した。標準曲線は、Ｃｑ値とＤＡＰＩ染色により菌数決定済みの標準株Ａ．ｈａｄｒｕｓ　ＹＩＴ１００９２T（ＤＳＭ３３１９T）の希釈系列を使用して作成した。検出限界値（ＬＯＤ）は標準曲線中の最も小さな菌数とした（１０-2ｃｅｌｌｓ／ｒｅａｃｔｉｏｎ）。
　上記（５）、（７）及び（８）で用いたプライマーの配列を下記表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（９）ＲＴ－ｑＰＣＲ増幅産物のシーケンス
　増幅産物が標的微生物由来のものかを確認するため、ＲＴ－ｑＰＣＲにより増幅された菌種をシーケンス解析により推定した。ＲＴ－ｑＰＣＲ産物（１０μＬ）をＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ（登録商標）　Ｆｉｌｔｅｒ　Ｐｌａｔｅ（Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により精製した。サイクルシーケンス反応をＢｉｇＤｙｅ（登録商標）　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｖｅｒｓｉｏｎ　３．１　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて製造元のマニュアルに従って行った。増幅産物をエタノール沈殿により精製し、ホルムアミド（１μＬ）に溶解して変性させ、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　３１３０　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によりシーケンスを行った。特定の種へのアサインを行うための得られたｒＲＮＡ配列の比較は、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ　ｐｒｏｇｒａｍ（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）を用いて行った。
（１０）統計解析
　統計解析にはＲ（ｖｅｒ　３．６．０）（https://www.r-project.org/）を用いた。連続変数は中央値（四分位範囲）で表した。２群間の差の検定は、ｎｏｎ－ｐａｒａｍｅｔｒｉｃ　Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ　Ｕ　ｔｅｓｔを用いた。群間での腸内細菌叢のＡＳＶの組成の違いは、有心対数比変換データによるＡＮＯＶＡ－Ｌｉｋｅ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＡＬＤＥｘ）解析で評価した。ＡＬＤＥｘ解析にはａｌｄｅｘ関数（ＡＬＤＥｘ２パッケージ）を用いた。ＲＴ－ｑＰＣＲ解析結果について、定量下限値以下であった検体については定量下限値の半値を代入して解析に用いた。いずれの解析においても、ｐ＜０．０５を有意差ありと判断した。
２．結果
（１）有害事象の発症及び重症度によるＤＣＦ療法後の腸内細菌叢の比較
　予防的抗生剤投与群（Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ群）及びシンバイオティクス投与群（Ｓｙｎｂｉｏｔｉｃｓ群）においてＤＣＦ療法開始後８日目に検出されたＡＳＶ（ａｍｐｌｉｃｏｎ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｖａｒｉａｎｔ）の組成を、ＤＣＦ療法の有害事象である発熱性好中球減少症の重症度により比較した。ＤＣＦ療法１コース中に発熱性好中球減少症を発症しなかった患者（グレード０）では、発熱性好中球減少症を発症した患者（グレード３）と比較してＡＳＶ１５の占有率が有意に高かった。参照データベースとしてＳＩＬＶＡを用いたアサインの結果、ＡＳＶ１５はＡｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ　ｈａｄｒｕｓと推定された。
　有害事象との関連が示唆されたＡＳＶ１５の占有率と発熱性好中球減少症及び下痢の重症度の相関を解析し、スピアマンの相関係数を求めた結果、ＡＳＶ１５は発熱性好中球減少症及び下痢の重症度との間に有意な負の相関が認められた（表２）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（２）ＤＣＦ療法によるＡ．ｈａｄｒｕｓの菌数の変化
　ＤＣＦ療法前の糞便中のＡ．ｈａｄｒｕｓの菌数は、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ群及びＳｙｎｂｉｏｔｉｃｓ群の間に有意な差は認められなかった。ＤＣＦ療法開始後８日目に、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ群ではＤＣＦ療法前と比較してＡ．ｈａｄｒｕｓの菌数が低下する傾向（ｐ＝０．１１）が認められたが、Ｓｙｎｂｉｏｔｉｃｓ群ではＤＣＦ療法後のＡ．ｈａｄｒｕｓの菌数の低下は認められなかった。ＤＣＦ療法及び予防的抗生剤の投与によりＡ．ｈａｄｒｕｓの菌数は低下するが、シンバイオティクスの内服により、そのような菌数の低下が抑制されていた。
（３）発熱性好中球減少症の発症の有無によるＡ．ｈａｄｒｕｓの菌数の比較
　Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ群及びＳｙｎｂｉｏｔｉｃｓ群において、ＤＣＦ療法１コース中に発熱性好中球減少症を発症しなかった患者（グレード０）では、発熱性好中球減少症を発症した患者（グレード３）と比較して、ＤＣＦ療法前後ともにＡ．ｈａｄｒｕｓの菌数が有意に高値を示した（図１）。Ｓｙｎｂｉｏｔｉｃｓ群のみの解析においても、発熱性好中球減少症を発症しなかった患者（グレード０）では、発熱性好中球減少症を発症した患者（グレード３）と比較して、Ａ．ｈａｄｒｕｓの菌数はＤＣＦ療法前後ともに高い傾向がみられた（図２）。よって、治療前から、腸内のＡ．ｈａｄｒｕｓの菌数が高い患者では、発熱性好中球減少症が軽減されることが示唆された。
（４）下痢の重症度によるＡ．ｈａｄｒｕｓの菌数の比較
　Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ群及びＳｙｎｂｉｏｔｉｃｓ群において、ＤＣＦ療法１コース中に極めて重度の下痢を発症した患者（グレード３～４：ベースラインと比べて７回以上／日の排便回数増加；便失禁あり；入院もしくは緊急処置を要する）と下痢の重症度が低かった患者（グレード０～２：発症なしもしくはベースラインと比べて＜６回／日の排便回数増加）とを比較した場合、ＤＣＦ療法前後ともに重症度が低い患者においてＡ．ｈａｄｒｕｓの菌数が有意に高値を示した（図３）。Ｓｙｎｂｉｏｔｉｃｓ群のみの解析でも、下痢の重症度が低かった患者（グレード０～２）では、極めて重度の下痢を発症した患者（グレード３～４）と比較して、Ａ．ｈａｄｒｕｓの菌数はＤＣＦ療法前後ともに高い傾向が認められた（図４）。よって、治療前から、腸内のＡ．ｈａｄｒｕｓの菌数が高い患者では、下痢が軽減されることが示唆された。
（５）シンバイオティクスによるＤＣＦ療法後の発熱性好中球減少症の抑制作用における、ＤＣＦ療法前の腸内のＡ．ｈａｄｒｕｓの菌数の重要性
　Ｓｙｎｂｉｏｔｉｃｓ群の発熱性好中球減少症の発症の有無でベースライン特性を比較したところ、患者の性別にわずかに差がある傾向が認められたものの、患者の年齢、ＢＭＩ、ｄｙｓｐｈａｇｉａ　ｓｃｏｒｅ、腫瘍位置、ステージ、白血球数、好中球数、総リンパ球数、及び血清アルブミンに有意な差は認められなかった。そこで、シンバイオティクス療法下でのＤＣＦ療法における有害事象のリスク因子を検討するため、患者の性別及びＡ．ｈａｄｒｕｓの菌数を用いてロジスティック回帰を行った。結果を表３に示す。表３中、ＣＩは信頼区間を、ＯＲはオッズ比を示し、Ａ．ｈａｄｒｕｓの菌数のカットオフ値は、受信者動作特性（ＲＯＣ）分析により算出した値である。単変量解析において、ＤＣＦ療法施行前のＡ．ｈａｄｒｕｓの菌数は、発熱性好中球減少症の発症リスクの減少と有意に関連した（ＯＲ，０．１３；９５％ＣＩ，０．０２－０．６６，ｐ＝０．０２３）。さらに、患者の性別を加えた多変量解析においても、ＤＣＦ療法施行前のＡ．ｈａｄｒｕｓの菌数は、発熱性好中球減少症の発症リスクの減少と有意に関連した（ＯＲ，０．１１；９５％ＣＩ，０．０１－０．６０，ｐ＝０．０１９）。また、カットオフ値は、検体１ｇあたり、１０7.7個であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
（６）シンバイオティクスによるＤＣＦ療法後の発熱性好中球減少症の抑制作用における、ＤＣＦ療法前の腸内のＡ．ｈａｄｒｕｓの占有率の重要性
　シンバイオティクス療法下でのＤＣＦ療法における有害事象のリスク因子を検討するため、患者の性別及びＡ．ｈａｄｒｕｓの占有率を用いてロジスティック回帰を行った。結果を表４に示す。表４中、ＣＩは信頼区間を、ＯＲはオッズ比を示し、Ａ．ｈａｄｒｕｓの占有率のカットオフ値は、受信者動作特性（ＲＯＣ）分析により算出した値である。単変量解析において、ＤＣＦ療法施行前のＡ．ｈａｄｒｕｓの占有率は発熱性好中球減少症の発症リスクの減少と関連する傾向があった（ＯＲ，０．２４；９５％ＣＩ，０．０５－１．０２，ｐ＝０．０６０）。さらに、患者の性別を加えた多変量解析においても、ＤＣＦ療法施行前のＡ．ｈａｄｒｕｓの占有率は発熱性好中球減少症の発症リスクの減少と関連する傾向があった（ＯＲ，０．２０；９５％ＣＩ，０．０３－０．９５，ｐ＝０．０５１）。また、カットオフ値は、０．２５％であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
（７）シンバイオティクスによるＤＣＦ療法後の下痢の抑制作用における、ＤＣＦ療法前の腸内のＡ．ｈａｄｒｕｓの菌数の重要性
　Ｓｙｎｂｉｏｔｉｃｓ群の下痢の重症度の軽重でベースライン特性を比較したところ、患者の年齢、性別、ＢＭＩ、ｄｙｓｐｈａｇｉａ　ｓｃｏｒｅ、腫瘍位置、ステージ、白血球数、好中球数、総リンパ球数、及び血清アルブミンに有意な差は認められなかった。そこで、シンバイオティクス療法下でのＤＣＦ療法における有害事象のリスク因子を検討するため、Ａ．ｈａｄｒｕｓの菌数を用いてロジスティック回帰を行った。結果を表５に示す。表５中、ＣＩは信頼区間を、ＯＲはオッズ比を示し、Ａ．ｈａｄｒｕｓの菌数のカットオフ値は、受信者動作特性（ＲＯＣ）分析により算出した値である。単変量解析において、ＤＣＦ療法施行前のＡ．ｈａｄｒｕｓの菌数は、下痢の重症化リスクの減少と関連する傾向があった（ＯＲ，０．１４；９５％ＣＩ，０．０１－１．１３，ｐ＝０．１１）。また、カットオフ値は、検体１ｇあたり、１０7.6個であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
（８）シンバイオティクスによるＤＣＦ療法後の下痢の抑制作用における、ＤＣＦ療法前の腸内のＡ．ｈａｄｒｕｓの占有率の重要性
　シンバイオティクス療法下でのＤＣＦ療法における有害事象のリスク因子を検討するため、Ａ．ｈａｄｒｕｓの占有率を用いてロジスティック回帰を行った。結果を表６に示す。表６中、ＣＩは信頼区間を、ＯＲはオッズ比を示し、Ａ．ｈａｄｒｕｓの占有率のカットオフ値は、受信者動作特性（ＲＯＣ）分析により算出した値である。単変量解析において、ＤＣＦ療法施行前のＡ．ｈａｄｒｕｓの占有率は下痢の重症化リスクの減少と関連する傾向があった（ＯＲ，０．０５；９５％ＣＩ，０．００－０．４２，ｐ＝０．０１４）。また、カットオフ値は、０．０８４％であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　以上より、Ａ．ｈａｄｒｕｓは、集学的治療時、特に薬物療法時の有害事象リスクの判定に利用することができる。

Claims (12)

  1. 　被験者より採取した検体中のＡｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ　ｈａｄｒｕｓを測定することを含む、集学的治療時の有害事象リスクの判定方法。
  2. 　有害事象リスクが有害事象の発症リスク又は重症化リスクである、請求項１記載の方法。
  3. 　集学的治療が薬物療法、外科療法、放射線治療、及びその組み合わせから選択される治療である、請求項１又は２記載の方法。
  4. 　集学的治療が薬物療法である、請求項１～３のいずれか１項記載の方法。
  5. 　有害事象が発熱性好中球減少症及び下痢からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１～４のいずれか１項記載の方法。
  6. 　検体が被験者の糞便検体である、請求項１～５のいずれか１項記載の方法。
  7. 　検体中のＡｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ　ｈａｄｒｕｓの菌数を基準値と比較し、菌数が基準値以下である場合に、集学的治療時の有害事象リスクが高いと判定することをさらに含む、請求項１～６のいずれか１項記載の方法。
  8. 　検体中の総細菌におけるＡｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ　ｈａｄｒｕｓの占有率を基準値と比較し、占有率が基準値以下である場合に、集学的治療時の有害事象リスクが高いと判定することをさらに含む、請求項１～６のいずれか１項記載の方法。
  9. 　検体中のＡｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ　ｈａｄｒｕｓの菌数が、検体１ｇあたり、１０7.7個以下であるか、検体中の総細菌におけるＡｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ　ｈａｄｒｕｓの占有率が０．２５％以下である場合に、集学的治療時の発熱性好中球減少症リスクが高いと判定することをさらに含む、請求項１～６のいずれか１項記載の方法。
  10. 　検体中のＡｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ　ｈａｄｒｕｓの菌数が、検体１ｇあたり、１０7.6個以下であるか、検体中の総細菌におけるＡｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ　ｈａｄｒｕｓの占有率が０．０８４％以下である場合に、集学的治療時の下痢リスクが高いと判定することをさらに含む、請求項１～６のいずれか１項記載の方法。
  11. 　検体中のＡｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ　ｈａｄｒｕｓの測定試薬及びプロトコールを含む、請求項１～１０のいずれか１項記載の方法を実施するためのキット。
  12. 　Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ　ｈａｄｒｕｓの菌数又は占有率を指標とする、集学的治療時の有害事象リスクの低減剤のスクリーニング方法。
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